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Redox Consultoria e Remediao

Ambiental LTDA.
JUNHO - 2012
PROTOCOLO ANALTICO
Determinao de substncias fenlicas em amostras
de efluentes industriais
INTERESSADA: RESITEC Indstria Qumica LTDA.

2

Sumrio
1 INTRODUO ........................................................................................................................ 5
2 EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES ......................................................................... 5
2.1 Equipamentos ............................................................................................................... 5
2.2 Vidraria e materiais ....................................................................................................... 5
2.3 Reagentes ...................................................................................................................... 6
3 MANUSEIO E PRESERVAO DA AMOSTRA .......................................................................... 6
4 PREPARO DAS SOLUES ...................................................................................................... 6
4.1 Soluo de cido fosfrico 1:9 (v:v) .............................................................................. 6
4.2 Soluo de sulfato de cobre (100 g L
-1
) ......................................................................... 7
4.3 Soluo tampo NH
4
Cl/NH
4
OH ..................................................................................... 7
4.4 Soluo de 4-aminoantipirina (20 g L
-1
) ........................................................................ 7
4.5 Soluo de ferricianeto de potssio (80 g L
-1
) ............................................................... 7
4.6 Soluo-me (ou estoque) de fenol (1000 mg L
-1
) ........................................................ 8
4.7 Soluo de trabalho A de fenol (10 mg L
-1
) ................................................................ 8
4.8 Soluo de trabalho B de fenol (1 mg L
-1
) .................................................................. 8
4.9 Soluo de sulfato ferroso amoniacal (1,1 g L
-1
) ........................................................... 9
5 REMOO DE INTERFERENTES ............................................................................................. 9
5.1 Amostras passveis de degradao microbiolgica ....................................................... 9
5.2 Amostras contendo agentes oxidantes ......................................................................... 9
5.3 Amostras contendo leos e alcatro............................................................................. 9
6 PROCEDIMENTO ANALTICO ............................................................................................... 10

3

6.1 Destilao da amostra ................................................................................................. 10
6.2 Preparo das solues padres de fenol para calibrao ............................................. 11
6.2.1 Curva analtica 1 (50-1.000 g L
-1
) ....................................................................... 11
6.2.2 Curva analtica 2 (1-50 mg L
-1
) ............................................................................. 11
6.3 Determinao espectrofotomtrica ............................................................................ 12
7 CLCULOS ............................................................................................................................ 12
7.1 Construo das curvas analticas (calibrao) ............................................................. 12
7.2 Clculo da concentrao de fenol nas amostras ......................................................... 14
8 CONTROLE DE QUALIDADE ................................................................................................. 14
8.1 Calibrao instrumental .............................................................................................. 14
8.2 Anlise em triplicata .................................................................................................... 15
8.3 Branco do mtodo ....................................................................................................... 15
8.4 Testes de recuperao ................................................................................................ 15
9 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................................... 16








4



















ATENO
Esse protocolo no especfico para a determinao
do composto fenol, mas sim para todas as
substncias que reagem com o composto 4-
aminoantipirino produzindo cor, sendo denominadas
como substncias fenlicas, compostos fenlicos,
fenis totais ou simplesmente fenis.

5

1 INTRODUO
O protocolo analtico para determinao de fenis aqui desenvolvido foi
baseado nos mtodos oficiais da Agncia Brasileira de Normas Tcnicas (ABNT, norma
10740), da Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos (do ingls, USEPA,
mtodo 420.1), da ASTM (antigamente American Society for Testing and Materials,
mtodo D1783-01) e do SMWW (do ingls, Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater, mtodo 5530). Esse protocolo baseado na reao entre os
fenis com o 4-aminoantipirino (4-AA) na presena de ferricianeto de potssio, reao
que produz uma soluo colorida cuja intensidade determinada
espectrofotometricamente.
Esse protocolo foi desenvolvido para a Resitec, baseado nos interferentes
presentes em suas amostras de efluente e na faixa de concentrao de fenis
rotineiramente determinadas em suas amostras. A Redox se exime de
responsabilidade caso o mtodo analtico seja utilizado em cenrios diferentes para os
quais ele foi desenvolvido. Esse mtodo dever substituir ou servir como referncia ao
mtodo analtico atualmente empregado nas determinaes de fenis na Resitec.
2 EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES
2.1 Equipamentos
1. pHmetro
2. Espectrofotmetro UV-VIS
3. Sistema de destilao completo com manta de aquecimento, bales de 500 mL e
condensador de Graham
2.2 Vidraria e materiais
1. Funil de vidro
2. Papel de filtro
3. Membrana de filtrao
4. Funis de separao (500 mL)
5. Tubo de Nessler ou cubetas para espectrofotometria na regio do visvel

6

6. Prolas de vidro ou porcelana para destilao
7. Bales volumtricos de 100, 250, 500 e 1000 mL
2.3 Reagentes
1. cido fosfrico 85% P.A. (H
3
PO
4
)
2. Sulfato de cobre P.A. (CuSO
4
)
3. Cloreto de amnio P.A. (NH
4
Cl)
4. Hidrxido de amnio concentrado (NH
4
OH)
5. 4-aminoantipirina
6. Ferricianeto de potssio (K
3
Fe(CN)
6
)
7. Fenol P.A.
8. Clorofrmio (CHCl
3
)
9. Sulfato ferroso amoniacal (Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
)
3 MANUSEIO E PRESERVAO DA AMOSTRA
1. Substncias fenlicas esto sujeitas degradao qumica ou biolgica. Caso
haja interferentes na amostra, seguir o procedimento de eliminao descrito
no item 5 antes da preservao da amostra.
2. Amostras de efluentes devem ser preservadas atravs da acidificao da
amostra com H
3
PO
4
, HCl ou H
2
SO
4
a valores de pH entre 0,5 e 2,0.
3. Conservar as amostras em frascos de vidro e em temperaturas entre 2C e 4C
por, no mximo, 28 dias.
4 PREPARO DAS SOLUES
4.1 Soluo de cido fosfrico 1:9 (v:v)
Transferir 10 mL de soluo de H
3
PO
4
85% utilizando pipeta volumtrica para
um balo volumtrico de 100 mL, completando-o com gua destilada. Aps o preparo,
transferir a soluo para um frasco de vidro com tampa, devidamente rotulado.

7

4.2 Soluo de sulfato de cobre (100 g L
-1
)
Dissolver 10 g de CuSO
4
.5H
2
O em cerca de 15 mL de gua destilada utilizando
um bquer. Aps dissolvido, transferir o volume para um balo volumtrico de 100 mL.
Lavar o bquer com cerca de 10 mL de gua destilada, transferindo esse volume para o
mesmo balo volumtrico contendo a soluo de sulfato de cobre. Repetir esse
procedimento de lavagem do bquer mais duas vezes. Completar o volume do balo
do volumtrico com gua destilada. Aps o preparo, transferir a soluo para um
frasco de vidro com tampa, devidamente rotulado.
4.3 Soluo tampo NH4Cl/NH4OH
Dissolver 16,9 g de NH
4
Cl em 143 mL de NH
4
OH concentrado em um bquer.
Transferir essa soluo do bquer em que foi preparada para um balo volumtrico de
250 mL, completando o volume. Lavar o bquer com cerca de 10 mL de gua destilada,
transferindo esse volume para o mesmo balo volumtrico contendo a soluo
tampo. Repetir esse procedimento de lavagem do bquer mais duas vezes. Completar
o volume do balo do volumtrico com gua destilada. Aps o preparo, transferir a
soluo para um frasco de plstico com tampa, devidamente rotulado.
4.4 Soluo de 4-aminoantipirina (20 g L
-1
)
Dissolver 2 g de 4-AA em cerca de 40 mL de gua destilada utilizando um
bquer. Aps dissolvido, transferir o volume para um balo volumtrico de 100 mL.
Lavar o bquer com cerca de 10 mL de gua destilada, transferindo esse volume para o
mesmo balo volumtrico contendo a soluo de 4-AA. Repetir esse procedimento de
lavagem do bquer mais duas vezes. Completar o volume do balo do volumtrico
com gua destilada. Aps o preparo, transferir a soluo para um frasco de vidro com
tampa, devidamente rotulado.
4.5 Soluo de ferricianeto de potssio (80 g L
-1
)
Dissolver 8 g de K
3
Fe(CN)
6
em cerca de 40 mL de gua destilada utilizando um
bquer. Aps dissolvido, transferir o volume para um balo volumtrico de 100 mL.
Lavar o bquer com cerca de 10 mL de gua destilada, transferindo esse volume para o

8

mesmo balo volumtrico contendo a soluo de K
3
Fe(CN)
6
. Repetir esse
procedimento de lavagem do bquer mais duas vezes. Completar o volume do balo
do volumtrico com gua destilada. Aps o preparo, transferir a soluo para um
frasco de vidro com tampa, devidamente rotulado.
4.6 Soluo-me (ou estoque) de fenol (1000 mg L
-1
)
Dissolver aproximadamente 0,5000 g de fenol em cerca de 150 mL de gua
destilada previamente fervida e resfriada utilizando um bquer. Aps dissolvido,
transferir o volume para um balo volumtrico de 500 mL. Lavar o bquer com cerca
de 50 mL de gua destilada, transferindo esse volume para o mesmo balo
volumtrico contendo a soluo de fenol. Repetir esse procedimento de lavagem do
bquer mais duas vezes. Completar o volume do balo do volumtrico com gua
destilada. Aps o preparo, transferir a soluo para um frasco de vidro com tampa,
devidamente rotulado com a concentrao exata da soluo (massa exata pesada
dividido por 0,5 L).
4.7 Soluo de trabalho A de fenol (10 mg L
-1
)
Transferir 5 mL da soluo-me de fenol (1.000 mg L
-1
) utilizando uma pipeta
volumtrica para um balo volumtrico de 500 mL. Completar o volume do balo com
gua destilada previamente fervida e fria. Aps o preparo, transferir a soluo para um
frasco de vidro com tampa, devidamente rotulado com a concentrao exata da
soluo (a concentrao exata da soluo A 100 vezes menor que a concentrao
exata da soluo-me).
4.8 Soluo de trabalho B de fenol (1 mg L
-1
)
Transferir 5 mL da soluo de trabalho A de fenol (10 mg L
-1
) utilizando uma
pipeta volumtrica para um balo volumtrico de 500 mL. Completar o volume do
balo com gua destilada previamente fervida e fria. Aps o preparo, transferir a
soluo para um frasco de vidro com tampa, devidamente rotulado com a
concentrao exata da soluo (a concentrao exata da soluo B 10 vezes menor
que a concentrao exata da soluo A).

9

4.9 Soluo de sulfato ferroso amoniacal (1,1 g L
-1
)
Dissolver 0,55 g de Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
em 250 mL de gua destilada contendo 0,5
mL de H
2
SO
4
concentrado utilizando um bquer. Aps dissolvido, transferir o volume
para um balo volumtrico de 500 mL. Lavar o bquer com cerca de 50 mL de gua
destilada, transferindo esse volume para o mesmo balo volumtrico contendo a
soluo de Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
. Repetir esse procedimento de lavagem do bquer mais
duas vezes. Completar o volume do balo do volumtrico com gua destilada. Aps o
preparo, transferir a soluo para um frasco de vidro com tampa, devidamente
rotulado.
5 REMOO DE INTERFERENTES
5.1 Amostras passveis de degradao microbiolgica
A degradao biolgica dos fenis inibida a partir da adio de Cu
2+

amostra. Para cada 100 mL de amostra, adicionar 1 mL da soluo de CuSO
4
100 g L
-1
e
acidificar com soluo de cido fosfrico 1:9 (v:v) at um valor de pH menor que 4.
Esse procedimento deve ser executado para as amostras da sada do reator biolgico e
somente para quelas que no forem analisadas imediatamente.
5.2 Amostras contendo agentes oxidantes
Para cada 100 mL de amostra, adicionar 1 mL da soluo 1,1 g L
-1
de
Fe(NH
4
)
2
(SO
4
)
2
. Esse procedimento deve ser executado para as amostras coletadas em
qualquer ponto entre a sada do reator da reao de Fenton e a entrada do reator
biolgico e somente para quelas que no forem analisadas imediatamente.
5.3 Amostras contendo leos e alcatro
Elevar o pH do amostra para um valor entre 12 e 12,5 com NaOH em pastilhas
ou soluo concentrada de NaOH. Esse procedimento deve ser executado para as
amostras da entrada e da sada do reator da reao de Fenton.

10

NOTA: Os procedimentos oficiais sugerem a extrao da poro oleosa com 50 mL
CHCl
3
ou CCl
4
. No entanto, esse procedimento remove os fenis presentes na amostra
fornecendo um resultado menor que o verdadeiro.
6 PROCEDIMENTO ANALTICO
6.1 Destilao da amostra
Transfirir 250 mL de amostra para um bquer e ajustar o pH para cerca de 4
atravs da adio de soluo de H
3
PO
4
1:9 (v:v). Monitorar a variao de pH a cada
adio por meio de um pHmetro. Caso a amostra j apresentar pH inferior a esse valor,
pular essa etapa. Transferir a amostra para um balo de fundo redondo de 500 mL e
conect-lo ao sistema de destilao.
Transferir 200 mL de gua destilada para outro balo de fundo redondo (ou
fundo chato) de 500 mL. Marcar com caneta na parte externa do balo o nvel dgua.
Adicionar mais 50 mL de gua destilada e marcar o novo nvel dgua. Descartar a gua
destilada e conectar o balo sada do destilador. O sistema de destilao deve ser em
circuito fechado, como mostrado na Figura 1.

Figura 1 Sistema de destilao em circuito fechado.
Destilar cerca de 200 mL de amostra, desligar o aquecimento e, quando a
ebulio tiver cessado, adicionar 50 mL de gua destilada ao balo contendo a amostra
1
2
3
4
5 6
7
8
9
1 10
2
3
4
5 6
7
8
9
11

11

em processo de destilao. Continuar a destilao at completar a marca de 250 mL no
balo contendo o destilado.
Caso o destilado apresente-se turvo, repetir o processo de destilao desde a
etapa de acidificao da amostra. Caso o destilado continue turvo, filtrar em
membrana de acetato de celulose com dimetro de poro de 0,45 m.
6.2 Preparo das solues padres de fenol para calibrao
6.2.1 Curva analtica 1 (50-1.000 g L
-1
)
Transferir os volumes mostrados na Tabela 1 da soluo de trabalho A de fenol
para balo volumtrico de 100 mL. Completar o volume do balo volumtrico com
gua destilada.
Tabela 1 Concentrao dos padres a serem preparados e volume da soluo de trabalho
A de fenol a ser utilizado na preparao.
Nmero do padro Concentrao do padro
(g L
-1
)
Volume da soluo A de fenol
(mL)
1 50 0,5
2 100 1,0
3 200 2,0
4 500 5,0
5 800 8,0
6 1.000 10,0
6.2.2 Curva analtica 2 (1-50 mg L
-1
)
Transferir os volumes mostrados na Tabela 2 da soluo-me de fenol para balo
volumtrico de 100 mL. Completar o volume do balo volumtrico com gua destilada.
Tabela 2 Concentrao dos padres a serem preparados e volume da soluo-me de fenol a
ser utilizado na preparao.
Nmero do padro Concentrao do padro
(mg L
-1
)
Volume da soluo-me de fenol
(mL)
7 5 0,5
8 10 1,0
9 20 2,0
10 50 5,0
11 100 10,0

12

6.3 Determinao espectrofotomtrica
Transferir 100 mL do destilado (ou do padro) para um bquer e adicionar 2 mL
da soluo-tampo NH
4
Cl/NH
4
OH. Aps misturar bem, medir o pH. Caso o pH no
esteja entre os valores de 9,8 e 10,2, ajustar adicionando soluo de NaOH. Adicionar 2
mL da soluo de 4-AA e misturar bem. Adicionar 2 mL da soluo de K
3
Fe(CN)
6
e
misturar. Aps 15 minutos de espera, transferir uma alquota da soluo para uma
cubeta espectrofotomtrica e medir a absorbncia da soluo a 510 nm.
7 CLCULOS
7.1 Construo das curvas analticas (calibrao)
Aps a determinao da absorbncia de cada padro analtico, deve-se gerar as
curvas analticas (ou de calibrao). Tais curvas so construdas com o intuito de se
obter uma equao de 1 grau que correlacione a resposta analtica (absorbncia) com
a concentrao de fenol. A curva analtica construda plotando-se os valores obtidos
em um grfico em que as concentraes de fenol esto no eixo das abscissas (eixo x)
e as absorbncias esto no eixo das ordenadas (eixo y). A partir do grfico contendo
os pontos experimentais, obtm-se uma equao de 1 grau que melhor representa a
linearidade do conjunto de repostas instrumentais em funo da concentrao de
fenol.
Para a construo da curva, deve-se empregar qualquer software matemtico
(Excel, Origin, etc.). O procedimento nesse protocolo foi desenvolvido para o software
Excel 2010. Digitar em cada linha de uma coluna as concentraes exatas de cada um
dos 11 padres de fenol preparados. Em seguida, digitar na coluna ao lado e, nas
respectivas linhas, a absorbncia medida para cada padro.
Devem ser construdas duas curvas analticas, sendo que uma deve compreender
a faixa de concentrao entre 50 g L
-1
e 1 mg L
-1
e a outra a faixa de concentrao
entre 1 e 100 mg L
-1
. Para a construo da primeira curva, selecionar as seis primeiras
linhas das duas colunas do conjunto de dados. Clicar sobre o menu Inserir, depois
clicar no boto Disperso localizado na rea Grficos e finalizar clicando na opo

13

Disperso somente com marcadores. Dever ser obtido um grfico como o mostrado
na Figura 2.

Figura 2 Modelo de curva analtica para a faixa de concentrao compreendida entre 50 e
1.000 g L
-1
. Os valores de absorbncia so arbitrrios.
Para obter a equao de 1 grau da reta que melhor se ajusta aos pontos do
grfico, deve-se clicar com o boto direito do mouse sobre qualquer ponto da srie (no
caso do exemplo da Figura 2, os pontos da srie so os quadrados azuis). No menu que
surgir, escolher a opo Adicionar linha de tendncia.... Na janela intitulada
Formatar linha de tendncia que surgir, clicar na opo Linear, e selecionar as
opes Exibir equao no grfico e Exibir valor de R-quadrado no grfico e, em
seguida, clicar no boto Fechar. Dever ser obtido um grfico como o mostrado na
Figura 3.
A equao da reta obtida relaciona a absorbncia (y) com a concentrao (x). O
coeficiente de linearidade deve ser maior que 0,99 para que a curva analtica possa ser
empregada. Caso um valor maior que esse no seja obtido, analisar qual o padro que
apresenta maior erro (que est mais distante da reta, refaz-lo e submet-lo
reao com 4-AA novamente).
Repetir todo esse procedimento para os padres compreendidos na faixa entre 1
e 100 mg L
-1
.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Srie1

14


Figura 3 - Modelo de curva analtica para a faixa de concentrao compreendida entre 50 e
1.000 g L
-1
mostrando a regresso linear, a equao da reta obtida pela regresso linear e o
coeficiente de linearidade (R
2
). Os valores de absorbncia so arbitrrios.
7.2 Clculo da concentrao de fenol nas amostras
A concentrao de fenol em uma amostra obtida seguindo a equao fornecida
pelas curvas analticas e a absorbncia medida para a amostra. Substituir o termo y
da equao obtida para a curva analtica obtida para as concentraes 0,05 e 1 mg L
-1
.
Resolver a equao de 1 grau, determinando o termo x (concentrao de fenis na
amostra). Caso a concentrao calculada seja maior que 1 mg L
-1
, desconsiderar esse
valor e recalcular empregando a equao da curva analtica obtida para a faixa de
trabalho compreendida entre 1 e 100 mg L
-1
. Caso o valor seja maior que 100 mg L
-1
,
diluir o destilado e refazer todo o procedimento analtico a partir da reao com o 4-
AA. Para esse caso, a concentrao obtida pela curva analtica deve ser multiplicada
pelo fator de diluio aplicado.
8 CONTROLE DE QUALIDADE
8.1 Calibrao instrumental
A curva analtica deve ser construda semanalmente conforme descrito
anteriormente. A calibrao instrumental deve ser avaliada diariamente atravs da
y = 0,4064x + 0,0018
R = 0,9987
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Srie1
Linear (Srie1)

15

anlise de um padro de 20 mg L
-1
de fenol (soluo 9, Tabela 2) submetido reao
com 4-AA.
8.2 Anlise em triplicata
O cenrio ideal recomenda que um resultado analtico seja obtido atravs de
anlises realizadas, no mnimo, em triplicata. No entanto, isso demanda bastante
tempo e recurso financeiro. Recomenda-se que, pelo menos a cada 10 amostras
analisadas, uma seja feita em triplicata para verificar a performance do mtodo
analtico. Para essa amostra, calcular a concentrao mdia e o desvio padro, o qual
no deve ultrapassar o valor de 3,9% (ASTM, 2008). Deve-se variar a amostra que ser
quantificada em triplicata a cada determinao.
8.3 Branco do mtodo
Analisar uma amostra de gua destilada semanalmente. O resultado obtido para
essa amostra deve ser menor que o limite de deteco do mtodo. Caso seja maior,
refazer essa anlise visando identificar a possvel fonte de contaminao. Caso no
seja encontrada a fonte de contaminao, os resultados das amostras analisadas nesse
perodo devem conter a indicao de que no esto dentro dos parmetros de
qualidade.
8.4 Testes de recuperao
Inicialmente, recomenda-se que sejam analisadas 10 amostras preparadas em
laboratrio contendo 100 mg L
-1
de fenol (soluo padro nmero 11). Analisar essas
solues como se fossem amostras desconhecidas. Com o resultado final, calcular a
porcentagem de recuperao da amostra seguindo a equao 1.
% =

100 (Equao 1)
A partir dos valores de recuperao, calcular a mdia e o desvio padro dos
resultados de recuperao. A ASTM aceita recuperaes entre 87% e 113% com desvio

16

padro de 2 mgL
-1
(ASTM, 2008). J a EPA aceita desvio padro de 1,58 mg L-1 (USEPA,
1978).
9 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ABNT, NBR 10740 gua Determinao de fenol total, ABNT, Rio de Janeiro, Brasil,
1989, 6 p.
APHA, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th Ed.,
Method 5530, 1999.
ASTM, Standard Test Methods for Phenolics Compounds in Water, Method D1783-01,
EUA, 2008, 8 p.
USEPA, Phenolics (Spectrophotometric, Manual 4-AA with Distillation), Method 420-1,
1978, 4p.




_____________________________
Marco A. F. Locatelli
Responsvel tcnico
CRQ-IV 72.514