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Ricardo Tostes Gazzinelli
Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1985), doutorado em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1989) e pós-doutorado pelo National Institutes Of Health, Estados Unidos (1994). Livre
Docência pela Universidade Federal de São Paulo, Brasil (1996). Atualmente, é pesquisador
titular da Fundação Oswaldo Cruz (CPqRR) e professor titular da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG). Atuação na área de Bioquímica, com ênfase em Bioquímica dos
Microorganismos.
Participação no projeto
Caracterização da resposta imune e parasitológica induzida pela imunização durante os
estudos de Fase I em camundongos e Fase II em cães.
Coordenação científica e da equipe de pesquisadores e técnicos envolvidos no estudo de
Fase II em cães.
Redação dos artigos científicos e da patente. Orientação de estudantes de mestrado e
doutorado envolvidos com os projetos de pesquisa.
Delineamento, acompanhamento, avaliação e análise e interpretação de resultados dos
testes de Fase I e II.
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Pesquisadores Hertape Calier
Christiane de Freitas Abrantes
Mestre em Microbiologia com ênfase em Biologia Molecular pela
UFMG, atua na Gerência de Produção e Desenvolvimento de
Vacinas Recombinantes da Hertape Calier Saúde Animal.
Atuou na definição e implantação do processo de produção industrial e
forneceu subsídios técnicos para o desenvolvimento do Projeto da Unidade
de Produção de Vacinas Recombinantes NB-2, hoje certificada e apta a
produzir em larga escala produtos a partir de Organismos Geneticamente
Modificados do nível 2 de biossegurança atendendo às normas de Boas
Práticas de Fabricação.
Participação no projeto
Avaliação do antígeno existente em testes na UFMG.
Determinação da formulação vacinal.
Viabilidade para transferência de tecnologia para a Hertape Calier.
Determinação e implantação do processo produtivo.
Determinação dos controles de qualidade necessários à fabricação.
Coordenação logística e científica de teste clínico de Fase II.
Depósito de patente – participação na formulação, processo produtivo e
estabilidade.
Produção da vacina.
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Vinícius Junqueira Hermont
Possui graduação em Medicina Veterinária pela Pontifícia Universidade Católica de Minas
Gerais – Unidade Betim (2006). Coordenador e responsável do Laboratório pela elaboração
e execução dos testes Fase II, Fase III e dos Trabalhos de Campo realizados com a vacina.
Atualmente, é o gerente de produto - Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose
Visceral Canina e o responsável técnico / comercial da Hertape Calier pela vacina.
Participação no projeto
Integrante da equipe responsável pelo delineamento e execução do projeto Fase II,
referentes ao desenvolvimento e testes da vacina Leish-Tec® - Vacina Recombinante
contra Leishmaniose Visceral Canina. Responsável pela documentação e procedimentos
necessários para implantação e execução dos testes, a fim de trabalhar dentro de parâmetros
adequados regidos pelo Ministério da Agricultura, Ministério da Saúde e COBEA e pela
manutenção da interface empresa/pesquisadores.
Determinação e aquisição de materiais para a execução dos testes, assim como seleção e
treinamento dos profissionais (equipe) envolvidos nas atividades.
Aquisição, preparação e manutenção clínica dos animais, análise de resultados e execução
dos procedimentos realizados nos animais durante o experimento.
Responsável pelo delineamento e execução do Trabalho de Campo realizado com a vacina
e coordenador da equipe envolvida.
Colaboração no delineamento e execução da Fase III.
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Agradecimentos
Eloísa de Freitas
Veterinária.
Participação no projeto
Avaliação clínica dos animais.
Testes sorológicos para diagnóstico da leishmaniose.
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Wagner Luiz Tafuri
Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Viçosa (1989), título
de Mestre em Ciências pelo Curso de Patologia (área de Concentração Patologia Geral) da
Universidade Federal de Minas Gerais (1992), e título de Doutor em Ciências pelo Curso
de Parasitologia (área de concentração Protozoologia) da Universidade Federal de Minas
Gerais (1995). Realizou um pós-doutoramento na Universidade de Temple, Philadelphia,
USA, sob a supervisão do Prof. Dr. David Mosser. Atualmente, é professor associado II do
Departamento de Patologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais. Tem experiência na área de Patologia Geral, atuando, principalmente,
nos seguintes temas: patologia e alguns aspectos imunológicos da leishmaniose visceral
canina e leishmaniose experimental murino.
Participação no projeto
Avaliação clínica dos animais ao longo de todas as etapas do teste.
Avaliação anatomopatológica dos animais.
Participação na condução dos testes imunocitoquímicos para diagnóstico de leishmaniose
e discussão e interpretação dos resultados do teste de Fase II.
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Leishmanioses
Introdução
As leishmanioses constituem um grupo de doenças parasitárias de caráter zoonótico
de ampla distribuição geográfica, causadas por uma variedade de espécies de
protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. A leishmaniose é considerada
a segunda principal doença causada por protozoário, perdendo somente
para a Malária em incidência e é considerada a quinta maior endemia
mundial, segundo a Organização Mundial de Saúde. A leishmaniose visceral
é uma doença de grande importância médico-veterinária e é transmitida
no Brasil pela picada da fêmea de Lutzomyia longipalpis, popularmente
conhecida como flebotomíneo, mosquito-palha ou birigui, infectada. Um
importante aspecto epidemiológico consiste no fato de que as fêmeas destes
flebotomíneos possuem caráter oportunista, no qual uma ampla variedade de
vertebrados faz parte de sua alimentação no meio ambiente, parasitando roedores,
carnívoros, marsupiais, edentados, insetívoros e, principalmente, cães e humanos,
sendo caracterizada em ambos por lesões na pele (leishmaniose tegumentar) ou
envolvimento visceral generalizado (leishmaniose visceral). Devido à elevada
prevalência de infecção canina, o cão é considerado o principal reservatório da
doença em ambientes domésticos.
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Classificação e agentes etiológicos
Diversas espécies de Leishmania causam diferentes aspectos clínicos da doença, sendo
classificadas em:
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Morfologia e ciclo biológico
O ciclo biológico (Figura 1) do parasita Leishmania compreende duas formas
morfologicamente distintas: amastigota e promastigota.
Forma amastigota: forma arredondada, aflagelada e com aproximadamente, 5µm de
diâmetro. É responsável pelo desenvolvimento da doença no hospedeiro vertebrado.
Parasita intracelular obrigatório, sendo encontrado no interior de células fagocíticas,
como monócitos e macrófagos, do hospedeiro mamífero.
Forma promastigota: forma alongada que possui um núcleo central e um longo
flagelo. É encontrada no hospedeiro invertebrado, vetor da doença (Ashford, 2000).
O parasita é transmitido ao homem após a picada do inseto vetor infectado, que injeta,
na pele do hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas metacíclicas. Cabe ressaltar
que apenas os vetores fêmeas são capazes de transmitir o parasita, pois apenas eles são
hematófagos. As formas promastigotas, na sua maioria, são fagocitadas pelos macrófagos,
formando-se organelas denominadas de fagolisossomos. Dentro dos fagolisossomos, elas
se transformam nas formas amastigotas que se replicam por divisão binária. Macrófagos
infectados podem então ser ingeridos por insetos vetores sadios durante o repasto
sanguíneo. No intestino dos vetores, as formas amastigotas são então liberadas após a lise
dos macrófagos. Os parasitas liberados se transformam rapidamente em promastigotas
procíclicas, não infectivas. Essas formas se multiplicam rapidamente e se aderem à parede
do intestino. Enquanto migram para a porção anterior do órgão, elas se diferenciam nas
formas promastigotas metacíclicas, não replicativas, mas altamente infectivas, que podem
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ser transmitidas após a picada do inseto durante o seu repasto sanguíneo, completando o
ciclo biológico do parasita (Matlashewski, 2001 e Sacks & Noben-Trauth, 2002).
4 1
VL 8 CL
5
7
Fig. 1 - Ciclo biológico do parasita Leishmania: 1 - Macrófagos infectados podem ser ingeridos por insetos
vetores fêmeas durante a refeição. 2 - No intestino do inseto vetor, as formas amastigotas se diferenciam até
promastigotas metacíclicas, que migram para a porção anterior do intestino e são transmitidas após a picada do
vetor. 3 - Fagocitose das formas promastigotas metacíclicas pelos macrófagos. 4 - Lise do macrófago, liberando
formas amastigotas que podem infectar outros macrófagos. 5 - Hospedeiros vertebrados. 6 - Hospedeiros
invertebrados (inseto vetor fêmea do gênero Lutzomyia, em países do Novo Mundo, e do gênero Phlebotomus,
em países do Velho Mundo). 7 - Manifestação clínica da leishmaniose tegumentar. 8 - Manifestação clínica da
leishmaniose visceral.
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Epidemiologia e distribuição geográfica
A leishmaniose visceral e cutânea possui larga distribuição em áreas tropicais e subtropicais,
estendendo-se desde a América Central e do Sul até os países mediterrâneos como África,
Ásia Central, Índia e China, conforme demonstrado no mapa abaixo.
30.000
25.000
15
20.000
15.000 10
10.000
5
5.000
0 0
1985 1988 1991 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Nº de Casos 13.654 25.153 28.450 35.103 35.748 30.030 31.303 21.801 32.439 33.720 37.713 34.156 31.379 28.712 24.291
Incidência 11,60 21,37 19,43 22,85 21,62 19,34 19,61 14,67 20,50 15,48 17,79 21,47 17,71 15,79 13,19
4.000 2
3.000 1,5
2.000 1
1.000 0,5
0 0
1985 1988 1991 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Nº de Casos 2.224 816 1.510 3.426 3.885 3.246 2.570 1.977 3.624 4.858 3.646 3.102 2905 3418 3481
Incidência 1,89 0,69 1,03 2,23 2,49 2,09 1,61 1.33 2,29 2,23 1,72 1,95 1,64 1,88 1,89
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Diagnóstico
O diagnóstico da leishmaniose visceral canina apresenta-se dificultado por vários fatores,
principalmente devido à presença de manifestações clínicas variadas e à ausência de
lesões características (patognomônicas) da doença.
O médico veterinário conta com uma série de métodos de diagnóstico para
auxiliá-lo na conclusão da suspeita clínica da doença. São eles:
Métodos sorológicos
São utilizados no diagnóstico da leishmaniose visceral e visam à
detecção de anticorpos específicos ao parasita. Em geral, as técnicas
mais utilizadas são a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI),
a Análise de Imunoadsorção por Ligação Enzimática (ELISA), o Teste
de Aglutinação Direta e o Western Blot, pois apresentam sensibilidade e
especificidade que alcançam entre 80 e 100%. Cabe ressaltar que, geralmente,
nos estágios iniciais da doença os cães são soronegativos, portanto, deve-se
estar atento quando exames sorológicos forem utilizados no diagnóstico da
doença.
Métodos parasitológicos
São métodos confirmativos por terem especificidade de 100% para o
diagnóstico da leishmaniose visceral, porém apresentam sensibilidade
relativamente baixa, em torno de 60 a 80%. Através deles, faz-se a
detecção do parasita a partir de biópsias de tecidos ou aspirados
de líquidos corporais.
O teste parasitológico mais simples e mais utilizado pelos veterinários
é a identificação microscópica das formas amastigotas, a partir da
confecção em lâminas de esfregaços de aspirados da medula óssea ou
de linfonodos, coradas com Giemsa (Deane e Deane, 1955). Esse teste
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é rápido, barato e de alta especificidade, entretanto, exibe baixa sensibilidade, pois
estudos demonstram ser a sensibilidade menor que 60% em aspirados de medula
óssea e menor que 30% nos linfonodos.
Análises histológicas da pele e linfonodos também são técnicas freqüentemente
utilizadas para o diagnóstico da leishmaniose visceral, entretanto, deve-se procurar
dissociar as alterações histopatológicas, como inflamação ou granuloma de um
diagnóstico positivo da doença (Tafuri et al., 1996 e Tafuri et al., 2001). Este deverá
ser confirmado pela presença das formas amastigotas do parasita. Entretanto,
na maioria dos casos de leishmaniose visceral, poucas formas amastigotas estão
presentes, o que dificulta a avaliação. Nessas situações, a análise histológica deve
ser associada à imuno-histoquímica, que apresenta elevada sensibilidade e detecta o
parasita em cortes de tecidos, através do uso de anticorpos específicos (Bourdoiseau
et al., 1997 e Tafuri et al., 2004).
Outra forma de diagnóstico corresponde ao isolamento do parasito através de cultura,
in vitro ou pela inoculação de aspirados em animais de laboratório, como hamster
(Sundar e Rai, 2002).
Métodos moleculares
Com o avanço da tecnologia biomédica, técnicas moleculares vêm sendo também
empregadas no diagnóstico da leishmaniose visceral. A detecção do DNA do parasita,
pela técnica da PCR, é realizada através da coleta de amostra de vários tipos, como
aspirados de medula óssea, sangue, linfonodos e tecidos. Essa técnica, apesar do
custo elevado, apresenta alta sensibilidade e especificidade em torno de 100% e é
a mais utilizada em pacientes humanos (Mathis & Deplazes, 1995 e Reithinger &
Davies, 2002).
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Prevenção e controle
O controle da leishmaniose visceral tem como objetivo principal interromper a cadeia de
transmissão da doença em uma população. Essa medida é de difícil execução, por exigir
uma perfeita integração das ações direcionadas ao ambiente e aos animais que nele
vivem.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda o diagnóstico precoce
e tratamento dos casos humanos, diagnóstico e sacrifício dos animais
soropositivos e a identificação e eliminação do vetor como medidas de
controle da doença. Os cães são considerados infectados ao apresentar
resultados soropositivos em testes de diagnóstico sorológico, ELISA e RIFI,
conforme preconizado no Programa Nacional de Controle de Leishmaniose
Visceral no Brasil.
Dentre as medidas profiláticas contra a leishmaniose, o controle do vetor tem
se mostrado eficaz na prevenção da doença. Diversas ações podem ser adotadas,
visando a esse controle no animal ou no ambiente.
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Imunoprofilaxia: é considerada a forma mais eficaz no controle da leishmaniose
visceral canina por proteger o animal da doença e impedir que se torne um reservatório
potencial do parasita, servindo como fonte de infecção dos vetores. É recomendado
associar a outros métodos preventivos contra o vetor.
Resposta Imune
O desenvolvimento dos sintomas clínicos da leishmaniose visceral em animais infectados,
assim como a progressão da doença, está diretamente relacionado à fase atual da doença,
ao estado físico e ao sistema imune de cada indivíduo.
Em animais saudáveis e sem outras doenças intercorrentes, o aparecimento dos sintomas
clínicos pode demorar longos períodos. Em contrapartida, animais debilitados estão mais
sujeitos a apresentar sintomatologia clínica da doença mais rapidamente e de forma mais
grave. Estudos em animais infectados com Leishmania mostram que a resistência ou a
susceptibilidade à doença estão associadas ao desenvolvimento de uma resposta imune
Th1 (resposta imune celular) ou Th2 (resposta imune humoral), respectivamente (Tabela
1).
O desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 é essencial para resistência e proteção
à infecção por Leishmania chagasi. A produção de níveis elevados de IFN-γ é fundamental
e constitui um marcador desse tipo de resposta. Níveis de IgG2 específicos contra
antígenos do parasita correlacionam também com esse tipo de resposta que é favorável
para o combate da doença no organismo. Na resposta Th1, citocinas como interferon-
gama (IFN-γ), interleucina 2 (IL-2), interleucina 12 (IL-12) e o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) são produzidas e atuam combatendo o parasita invasor. A elevação dos níveis
de IgG2 também está associada a proteção, sendo encontrada em animais resistentes
à infecção (Oliveira da Silva et al., 2001). Sendo, assim, esse o perfil imunológico ideal
favorável à proteção do animal.
Por outro lado, a resposta Th2 está envolvida com um aumento na produção de citocinas
como interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10)
e interleucina 13 (IL-13), as quais favorecem o desenvolvimento da doença em animais
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infectados e com o aumento de anticorpos do subtipo IgG1, sendo assim desfavorável para
o controle da leishmaniose visceral (Heinzel et al., 1989; Heinzel et al., 1993; Scharton &
Scott, 1993; Sypek et al.; Belkaid et al., 2001; Jones et al., 2002 e Ji et al., 2003).
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Vacinas recombinantes
As atuais estratégias utilizadas para o controle da leishmaniose visceral consistem na
detecção dos cães infectados, seguida do seu sacrifício, no controle do vetor e no tratamento
dos casos humanos. Entretanto, tais medidas não têm se mostrado eficazes. Dessa forma,
o desenvolvimento de vacinas caninas surge como uma estratégia importante no controle
da doença (Tesh, 1995).
As vacinas convencionais, em sua maioria, são compostas por partículas íntegras de
microrganismos, contendo inúmeras proteínas não relacionadas com a resposta imune ou
até mesmo relacionadas à imunossupressão do indivíduo.
Enormes vantagens foram trazidas pela Tecnologia do DNA Recombinante. As vacinas
recombinantes são derivadas de modificações genéticas em microrganismos. Elas podem
ser compostas por proteína ou por vírus recombinante e apresentam a vantagem de
permitir uma avaliação detalhada da resposta imune induzida pela imunização. Outra
vantagem das vacinas recombinantes está associada ao fato de que é possível empregar
antígenos extremamente bem caracterizados, em que todas as propriedades imunogênicas
(epítopos) das diferentes porções da molécula possam ser identificadas e caracterizadas.
Com isso, resolvem-se os inconvenientes das vacinas constituídas por porções purificadas
diretamente do parasita e da presença de epítopos que possam estar associados a
mecanismos supressores da resposta imune e de evasão típicos do microrganismo. Em
ambos os casos, tem-se a eliminação do patógeno para dar lugar a um ativo que não tem
relação com a doença, tornando o produto altamente seguro e capaz de induzir resposta
imune protetora.
Diversas preparações vacinais têm sido estudadas em camundongos e/ou cães contra a
infecção com Leishmania, incluindo formas promastigotas mortas, promastigotas vivas
atenuadas ou irradiadas (revisto por HANDMAN, 2001). Estudos recentes têm empregado
antígenos na forma de vacinas recombinantes. Dentre os antígenos que têm sido avaliados,
encontra-se o antígeno A2, que atualmente é considerado o antígeno de Leishmania melhor
caracterizado, capaz de induzir uma resposta imune protetora contra leishmaniose visceral
canina. Esse antígeno é um fator de virulência de Leishmania, associado à capacidade de
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visceralização dos parasitas.
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A proteína A2
O antígeno A2 é uma proteína específica do estágio amastigota de várias espécies
de Leishmania e foi identificado inicialmente na espécie L. donovani por Charest &
Matlashewski (1994). Análises cariotípicas realizadas por Southern-blot de várias espécies
de Leishmania revelaram que os genes A2 são conservados nas espécies L. donovani, L.
infantum, L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana, o que é importante para indução da
proteção cruzada entre espécies diferentes (Ghedin et al., 1997).
A vacina é composta pelo ativo A2 (proteína recombinante), adjuvante e excipiente. A
proteína recombinante foi obtida a partir de gene de Leishmania donovani e sua identidade
foi confirmada por meio de testes laboratoriais, frente à proteína existente na forma
amastigota nativa. Esta comprovação é importante, uma vez que se pretende utilizar esta
proteína como antígeno em imunizações contra leishmaniose visceral canina e é sabido
que a forma amastigota é a mantida pelo protozoário no hospedeiro mamífero.
Vários estudos demonstraram que o antígeno A2, específico do estágio amastigota de Leish-
mania, tem grande potencial como antígeno vacinal, pois anticorpos anti-A2 foram detectados
em amostras de soro de pacientes e cães acometidos pela leishmaniose visceral, mostrando
que a proteína A2 é altamente antigênica (Ghedin et al., 1997 e Carvalho et al., 2002).
A proteína A2 representa o primeiro fator de virulência amastigota-específico identificado
em L. donovani (Zhang & Matlashewski,1997). Ao avaliarem a infecção de macrófagos in
vitro e de camundongos BALB/c por amastigotas deficientes na produção da proteína A2
(obtidas pela inibição da expressão do gene A2), observaram que houve uma diminuição na
proliferação dos parasitas no interior dos macrófagos e da carga parasitária avaliada pela
LDU, através de esfregaços por aposição do fígado dos animais infectados. A introdução
do gene A2 de L. donovani em L. major resultou num aumento significativo do tamanho
do baço e do número de parasitas neste órgão (LDU) nos camundongos estudados. Esse
achado pode estar relacionado com a diferença que existe na estrutura do gene A2 entre
as espécies causadoras da infecção visceral e cutânea. Essa diferença na estrutura do
gene pode ser uma possível explicação para o variado tropismo entre as espécies (Zhang
& Matlashewski, 2001).
36
Alguns trabalhos foram realizados utilizando o antígeno A2 como candidato à vacina. Em
geral, esses antígenos são testados primeiramente em camundongos e posteriormente em
cães.
Estudos conduzidos pela equipe de pesquisadores da UFMG permitiram identificar nesse
antígeno o epítopo responsável pela indução da produção de anticorpos em
camundongos vacinados e, talvez mais importante, os epítopos associados
à indução de resposta celular e que, nesse antígeno, estão associados à
indução de resposta do tipo Th1 e, portanto, proteção.
A imunização com o antígeno A2 foi capaz de induzir proteção significativa
contra a infecção por L. donovani e L. amazonensis e L. chagasi em
camundongos (estudos de Fase I) e em cães (estudos de Fase II e trabalhos
de campo). Os níveis de proteção observados foram associados à resposta
imune Th1, caracterizada por altos níveis de IFN-γ específica à proteína A2,
bem como reduzida produção de IL-4 e IL-10 em animais imunizados. Além disso,
apresentaram redução significativa da carga parasitária, quando comparados aos
grupos controle (Ghosh et al, 2001; Ghosh et al., 2002; COELHO et al., 2003; COELHO,
2004).
Portanto, o antígeno A2 recombinante induziu uma resposta imune protetora e se
mostrou eficaz contra a leishmaniose visceral canina.
Proteína A2 codificada
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Espaço científico
Publicações sobre a proteína A2
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 94, p. 8807–8811, (Aug) 1997 Loss of virulence in Leishmania
donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2 Wen-Wei Zhang e Greg
Matlashewski.
Molecular and Biochemical Parasitology,v. 78, p.79-90, (Mar) 1996 Identification and
overexpression of the A2 amastigote-specific protein in Leishmania donovani Wen-
Wei Zhang, Hugues Charest, Elodie Ghedin e Greg Matlashewski.
BMC Infectious Diseases, v. 5, n. 18, (Mar) 2005 A2 gene of Old World cutaneous
Leishmania is a single highly conserved functional gene Yves JF Garin, Pascale
Meneceur, Francine Pratlong, Jean-Pierre Dedet, Francis Derouin e Frédéric Lorenzo
The Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 37, p. 35508–35515, (Sep) 2003 Comparison
of the A2 gene locus in Leishmania donovani and Leishmania major and its control
over cutaneous infection Wen-Wei Zhang, Susana Mendez, Anirban Ghosh, Peter Myler,
Al Ivens, Joachim Clos, David L. Sacks e Greg Matlashewski
Infection and immunity, v. 74, n. 12, p. 6940–6948, (Dec) 2006 Leishmania chagasi T-cell
antigens identified through a double library screen Daniella R. A. Martins, Selma M.
B. Jeronimo, John E. Donelson, e Mary E. Wilson
Vaccine, v. 20, p. 59–66, (Jul) 2002 Immunization with A2 protein results in a mixed
Th1/Th2 and a humoral response which protects mice against Leishmania donovani
infections Anirban Ghosh, Wen Wei Zhang e Greg Matlashewski
38
Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 101, n. 3, p. 203-211, (Nov) 2006. REVIEW
- Immunogenic and allergenic potentials of natural and recombinant innocuous
proteins Tsukasa Matsuda, Takeski Matsubara e Shingo Hino
Infect Immun., v. 71, n. 7, p. 3988–3994, (Jul) 2003. Immune responses induced by the
Leishmania (Leishmania) donovani A2 Antigen, but not by the LACK antigen, are
protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection
Eduardo Antonio Ferraz Coelho, Carlos Alberto Pereira Tavares, Fernando Aécio Amorim
Carvalho, Karina Figueiredo Chaves, Kadima Nayara Teixeira, Rafaela Chitarra Rodrigues,
Hugues Charest, Greg Matlashewski, Ricardo Tostes Gazzinelli, e Ana Paula Fernandes
Vaccine, v.26, p.4585 - 4593, 2008. Epitope mapping and protective immunity elicited by
adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation
with IFN-g and cytolytic activity by CD8+ T cells. RESENDE, D. M., CAETANO, B,
DUTRA, M., BRUNA-ROMERO, O, FERNANDES, A. P., GAZZINELLI, R. T.
Immune responses induced by Leishmania (L.) donovani A2, but not by LACK
antigen, are protective against experimental Leishmania (L.) amazonensis
infection. COELHO, E.A.F.; FERNANDES, A.P.S.M.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.;
TEIXEIRA, K.N.; TAVARES, C.A.P. XXX ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS
DISEASE. XIX MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 10 a
12/11/2003.
41
Desenvolvimento da Leish-Tec® - Fase I
Para o desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose, é exigida pelo Ministério da
Agricultura, Abastecimento e Pecuária a realização de testes para a comprovação de
resultados.
Introdução
As propriedades imunogênicas do antígeno A2 recombinante foram demonstradas no
trabalho de Fase I, tendo como resultado a capacidade de conferir proteção em camundongos
BALB/c contra a infecção desafio com L. donovani, L. chagasi e L. amazonensis. A proteção
foi associada à elevada resposta imune Th1, específica ao parasita e caracterizada pela
grande produção de IFN-γ.
Descrição do experimento
Estudos conduzidos pelos doutores Ricardo Tostes Gazzinelli e Ana Paula Fernandes
realizados na Universidade Federal de Minas Gerais.
Foi avaliada a proteção conferida pela imunização com o antígeno A2 vacinal em
camundongos BALB/c como modelo experimental.
Grupos de animais utilizados como controle negativo e positivo da doença e o grupo
vacinado.
Desafio via endovenosa ou subcutânea com elevada carga de protozoários.
Relato
Em nossos estudos, realizamos a clonagem em plasmídeos de expressão em células
eucariotas e procariotas do gene codificador do antígeno A2 e avaliamos a proteção
conferida pela imunização com esse antígeno, sob a forma de proteína recombinante
associada à adjuvante de resposta imune Th1 ou de DNA, contra a infecção desafio com
42
L. amazonensis, em camundongos BALB/c. A imunização com o antígeno A2, tanto sob a
forma de proteína quanto de DNA, foi capaz de conferir proteção contra o desafio com
L. amazonensis. Os animais vacinados apresentaram níveis significativamente
maiores de IFN-γ e menores de IL-4 e IL-10 quando comparados aos animais-
controles infectados. Observaram-se baixos níveis de anticorpos específicos
ao parasita (Coelho et al., 2003) e também a presença de anticorpos IgG2
específicos à proteína A2.
Os resultados indicaram, portanto, o potencial de utilização da proteína
A2 como candidata à vacina contra leishmaniose, principalmente, contra
espécies que apresentam seus genes conservados, como L. donovani, L.
infantum, L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana.
Resultados
Fígado Baço
9 9
Log of parasite numbers
Log of parasite numbers
8 8
7 7
6 6
5 5
PBS
4 4
DNA pCDNA3
3 3 DNA A2
2 2
1 1
0 0
As setas indicam a redução de carga parasitária, determinada pelo método de diluição limitante, em camundon-
gos BALB/c vacinados com DNA A2 e desafiados com Leishmania chagasi. Como controles, animais receberam
apenas DNA controles (DNA pCDNA3) ou solução salina.
43
Redução de parasitos na pele de camundongos BALB/c
vacinados com DNA A2
e infectados com Leishmania amazonensis
10
7
6
5
4
3
2
1
0
PBS rIL-12 rA2 rA2/rIL-12 rA2/ C. DNA A2 DNA A2/
parvum DNA IL-12
Redução do número de parasitos na pele de camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 ou com proteína recombinante A2,
associados a Corynebacterium parvum ou interleucina-12 (rIL-12) e infectados com Leishmania amazonensis.
9000
8000
IFN-gamma (pg/mL)
7000
6000
5000
4000 PBS
rIL-12
3000
rA2
2000 rA2/rIL-12
rA2/ C. parvum
1000
DNA A2
0 DNA A2/ DNA IL-12
Meio A2 SLA LLa
Níveis de IFN-γ produzidos por esplenócitos de camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 ou proteína A2, associados a Coryne-
bacterium parvum ou interleucina-12 (rIL-12) em resposta ao estímulo com A2 ou com extrato total de antígenos de Leishmania.
44
Níveis de anticorpos IgG no soro de animais imunizados, antes e após a
infecção, que reagem em ELISA com extrato de antígenos totais do parasita.
1,2
0,8 PBS
Abs 492 nm
rlL-12
0,6 rA2
rA2/rIL-12
0,4 C. parvum
rA2/C. parvum
0,2 SLA/rIL-12
0
Antes do desafio Após o desafio
Níveis de anticorpos IgG no soro de animais imunizados, antes e após a infecção, que reagem em ELISA com ex-
trato de antígenos totais do parasita. Neste teste, camundongos BALB/c receberam vacinas contendo a proteína A2
em associação ao Corynebacterium parvum (C. parvum) ou interleucina 12 (rIL-12) como adjuvantes. Como controles,
camundongos BALB/c receberam solução salina (PBS) ou somente C. parvum ou rIL-12 ou ainda extrato total de antí-
genos de formas promastigotas de Leishmania associado a IL-12 (SLA/rIL-12). Anticorpos IgG foram dosados no soro dos
animais antes e após a infecção.
Resultados e discussão
a) Nos testes apresentados, é bem definida a resposta Th2 em
camundongos que desenvolveram a doença.
b) Todos os controles positivos infectados desenvolveram a doença e
apresentaram níveis elevados de parasitas em órgãos como fígado,
baço e pele.
c) Os camundongos vacinados apresentaram redução expressiva da
carga parasitária e a resposta imune desenvolvida por estes tem perfil
Th1.
d) Os elevados níveis de IFN-γ foram encontrados em animais
vacinados.
e) Os camundongos mantiveram, após vacinação, sorologia não reativa
contra anticorpos de antígeno total do parasita.
45
Conclusões
a) A imunização com o antígeno A2-HIS foi capaz de conferir proteção contra o desafio
com L. amazonensis e L. chagasi.
b) Os animais vacinados apresentaram níveis significativamente maiores de IFN-γ e
menores de IL-4 e IL-10, quando comparados aos animais controles infectados.
c) Observaram-se baixos níveis de anticorpos específicos ao parasita (Coelho et al.,
2003), reafirmando a manutenção da soronegatividade para leishmaniose dos animais
vacinados.
d) Observada a presença de anticorpos IgG2 específicos à proteína A2, caracterizando a
resposta Th1 protetora.
Infect Immun., v. 71, n. 7, p. 3988–3994, (Jul) 2003. Immune responses induced by the
Leishmania (Leishmania) donovani A2 Antigen, but not by the LACK antigen, are
protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection
Eduardo Antônio Ferraz Coelho, Carlos Alberto Pereira Tavares, Fernando Aécio Amorim
Carvalho, Karina Figueiredo Chaves, Kadima Nayara Teixeira, Rafaela Chitarra Rodrigues,
Hugues Charest, Greg Matlashewski, Ricardo Tostes Gazzinelli e Ana Paula Fernandes.
Microbes and Infection., v.9, p.1070 - 1077, 2007. Evaluation of Immune Responses
and Protection Induced by A2 and Nucleoside Hydrolase (NH) DNA vaccines
Against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis Experimental
Infections. .ZANIN, F. H. C., COELHO, E. A. F., MARQUES-DA-SILVA, E., REZENDE,
S. A., COSTA, M. M. S., TAVARES, C. A. P., GAZZINELLI, R. T., FERNANDES, A. P.
46
Desenvolvimento da Leish-Tec® - Fase II
Objetivo geral
Avaliar a imunogenicidade da proteína recombinante A2-HIS, sob a forma da vacina
comercial Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral
Canina na proteção de cães da raça Beagle contra a infecção desafio com L.
chagasi.
Objetivos específicos
a) Imunizar grupos de cães com a vacina Leish-Tec® - Vacina
Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina e grupos controle
com PBS e com adjuvantes.
b) Avaliar a resposta imune humoral através dos níveis de anticorpos IgG
total e dos isotipos IgG1 e IgG2 específicos à proteína A2 recombinante e ao
extrato solúvel do parasita (LcPA) em amostras de soro dos animais antes e após
as imunizações e após a infecção desafio com L. chagasi.
c) Avaliar a resposta imune celular através da dosagem de IFN-gama, por
ELISA de captura, após a coleta e cultivo de PBMC (Peripheral blood
mononuclear cells) e o estímulo com a proteína A2-HIS e com o extrato
solúvel dos parasitos, antes da infecção desafio com L. chagasi.
Descrição do experimento
a) Executado em canil experimental da Hertape Calier em parceria
com a UFMG.
b) Utilizados cães da raça Beagle, mantidos por doze meses nos canis.
Durante esse período, os animais, foram submetidos a um programa
de vermifugação e imunização de rotina (vacinas contra parvovirose,
47
cinomose, hepatite infecciosa canina, parinfluenza, coronavirose e leptospiroses).
Foram também investigados por meio de exames laboratoriais a respeito de seu
perfil imunológico geral, clínico e soro-negatividade para leishmaniose.
c) Os animais receberam três doses de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra
Leishmaniose Visceral Canina, com intervalos de 21 dias entre elas, conforme
programa vacinal previsto.
d) Grupos de cães utilizados:
f vacinados e desafiados;
f vacinados e não desafiados;
f adjuvante e desafiados;
f placebo e desafiados;
f placebo e não desafiados.
e) Os cães foram monitorados mensalmente por meio de exames laboratoriais, com
o objetivo de verificar o estado geral do cão e a evolução sorológica distinta entre
grupo vacinado e não vacinado. Exames executados:
f hemograma completo;
f dosagem da taxa de uréia;
f dosagem da taxa de creatinina;
f proteínas totais e frações;
f relação albumina/globulina;
f exames sorológicos, ELISA e RIFI, contra antígeno total do parasita (SLA) e
contra o antígeno vacinal A2 recombinante.
f) O perfil da resposta imune humoral e celular nos animais vacinados e/ou desafiados
por L. chagasi.
f Avaliados através da produção de anticorpos e citocinas específicas,
respectivamente, para a proteína A2-HIS e ao extrato solúvel de L. chagasi.
f As dosagens sorológicas e de citocinas foram conduzidas antes e após a
48
infecção desafio.
f A avaliação sorológica dos cães foi realizada através de reação de
imunofluorescência (RIFI) e ELISA.
f Nas reações de ELISA foram utilizados como antígenos o extrato solúvel de L.
chagasi ou a proteína A2-HIS com amostras de soro dos cães coletadas
antes das imunizações, após cada dose das vacinas e periodicamente
após a infecção desafio.
f Foram determinados os níveis dos anticorpos IgG total e dos
isotipos IgG1 e IgG2, que se correlacionam com a resposta celular
do tipo Th2 e Th1, respectivamente.
f A resposta celular das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-10, foi avaliada em
amostras de RNA extraídas de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear
Cells) dos cães imunizados, antes e após o desafio, conforme descrito
por Ramiro et al. (2003).
f Análises por ELISA de captura das citocinas também foram realizadas
através da coleta do sangue e da separação e cultura de PBMC, com posterior
estímulo com a proteína A2-HIS ou com o extrato solúvel de L. chagasi.
49
Resultados IgG Total Anti-A2
Resposta Humoral
RESPOSTA HUMORAL
IgG Total Anti-A2
1,8 ANTI-A2
1,6
1,4
Abs (492 nm)
1,2 VI
1 VNI
0,8
I
0,6
0,4 AD
0,2
0 1ª Dose
1º Mês
2ª Dose
6º Mês
3ª Dose
8º Mês
Antes da
Imunização
2 ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE
ANTIGENIC EXTRACT
1,8
1,6
VI
Abs (492 nm)
1,4
1,2 VNI
1
0,8 I
0,6
AD
0,4
0,2
0
1ª Dose
1º Mês
2ª Dose
6º Mês
3ª Dose
8º Mês
Antes da
Imunização
VI
Abs (492 nm)
1,5
VNI
1
I
0,5 AD
0
1ª Dose
1º Mês
2ª Dose
6º Mês
3ª Dose
8º Mês
Antes da
Imunização
0,8
0,7
0,6 VNI
0,5 I
0,4
0,3 AD
0,2
0,1
0
1ª Dose
1º Mês
2ª Dose
6º Mês
3ª Dose
8º Mês
Antes da
Imunização
51
IgG 1 Total Anti-A2
IgG 1 total Anti-A2
1 ANTI-A2
0,9
0,8
VI
Abs (492 nm) 0,7
0,6 VNI
0,5
0,4 I
0,3 AD
0,2
0,1
0
1ª Dose
1º Mês
2ª Dose
6º Mês
3ª Dose
8º Mês
Antes da
Imunização
0,6
0,5 VNI
0,4 I
0,3
0,2 AD
0,1
0
1ª Dose
1º Mês
2ª Dose
6º Mês
3ª Dose
8º Mês
Antes da
Imunização
52
Resposta Celular
7000
6000
5000 Control
4000 rA2
3000
2000
1000
Vaccinated PBS
Produção de IFN-γ por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a
vacina Leish-Tec®, antes da infecção desafio por L. chagasi.
4000
3500
3000
IFN-g(pg/mL)
Medium
2500
rA2
2000
LcPA
1500
1000
500
0
Vaccinated/Infected Infected
Produção de IFN-γ por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com
a vacina Leish-Tec®, após a infecção desafio por L. chagasi.
53
300
250
200
A2
150 LcPa
100 ConA
50 Medium
0
Vaccinatedand Infected Infected
Produção de IL-10 por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a vacina
Leish-Tec®, após a infecção desafio por L. chagasi.
Conclusões
a) Os dados obtidos através dos marcadores de resposta imune empregados (dosagem
de anticorpos IgG total, IgG1 e IgG2 e das citocinas IFN-γ e IL-10) indicam que essa
formulação vacinal é capaz de induzir resposta imune do tipo Th 1 (níveis elevados
de IgG2 e IFN-gama) e, portanto, associada com desenvolvimento de proteção em
todos os animais vacinados, antes da infecção desafio.
b) Animais imunizados com a vacina Leish-Tec® apresentaram elevada produção de
IFN-γ antes da infecção desafio em cultivo de PBMC estimulados com a proteína
recombinante A2, quando comparados aos grupos de cães tratados com PBS
(“Controle”) e Adjuvante, sob o mesmo estímulo.
c) No grupo de cães imunizados com a vacina Leish-Tec®, houve aumento significativo
na produção de anticorpos específicos à proteína recombinante A2 quando
comparados ao grupo “Adjuvante”, após a segunda e terceira doses da vacina, e,
quando comparados aos grupos “Adjuvante” e “Controle”, após a infecção desafio.
d) A produção de anticorpos anti-LcPA mostrou-se significativamente maior somente
após a infecção desafio, nos grupos “Controle” e “Vacinado”, quando comparados à
produção que ocorreu após as imunizações.
54
e) Os animais do grupo “Vacinado” apresentaram uma produção significativamente
maior de IgG2, específico à A2, quando comparado à IgG1, antes e após a infecção
desafio com L. chagasi.
f) Animais vacinados mantêm sorologia negativa, frente aos testes de rotina, por RIFI
ou por ELISA, onde é empregado o SLA como antígeno de captura.
g) A vacina mostrou-se inócua nos testes referenciados em Relatório
Técnico submetido ao MAPA: em modelo animal e na espécie a que se
destina, uma vez que animais vacinados permanecem soronegativos
após a imunização.
55
Canil de Experimentação 1 Lateral externa
Área externa Canil de Experimentação 1
1
Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmacy, Federal University
of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
2
Department of Biochemistry and Immunology, Institute of Biological Sciences Federal
University of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
3
Department of Parasitology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas
Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
4
Department of Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas
Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
5
Hertape-Calier Saúde Animal – Juatuba, MG, Brazil
6
René Rachou Research Center, Oswaldo Cruz Foundation – Belo Horizonte, MG, Brazil
7
Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester,
Massachusetts, USA
57
Produção da Leish-Tec® Christiane de Freitas Abrantes, bióloga
Biossegurança
As primeiras normas são ditadas pela Lei de Biossegurança no 11.105, de
março de 2005. Esta lei, em conjunto com suas Instruções Normativas e
outras normatizações, rege os critérios a serem adotados em toda e qualquer
manipulação de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), incluindo
as estruturas da área de fabricação.
A unidade produtiva de vacinas recombinantes foi projetada e construída de forma a atender
esses critérios, sendo hoje uma moderna unidade de produção.
A premissa para áreas biosseguras é garantir que o OGM não possa escapar para o
meio ambiente e que os colaboradores não tenham contato direto com o microrganismo
manipulado, eliminando riscos. Assim, a
unidade de produção possui características
especiais:
f 14 diferentes sistemas de ar, segregados por
dutos e filtros absolutos, impedindo qualquer
tipo de liberação ou contaminação;
f diferentes pressões de ar aplicadas às salas
que possuem níveis maiores ou menores de
risco de acordo com o processo executado;
f autoclaves de fronteira (equipamento que
descontamina e esteriliza por calor úmido),
garantindo que todo o material que deixar
58
a área biossegura está descontaminado,
inclusive a paramentação utilizada pelos
colaboradores;
f a rede de efluentes, coletora de
resíduos líquidos provenientes das salas de
manipulação de OGM, está segregada da
rede coletora de efluentes do restante do
prédio. A tubulação proveniente da área viva
é designada à ETE. É importante ressaltar que
todo o efluente é descontaminado no interior
das salas da área biossegura, antes de ser descartado na rede de efluentes
específica;
f o acesso a essa área se faz por meio de vestiário interno, masculino e feminino.
Cada um possui entrada e saída segregadas fisicamente, para paramentação adequada
e diferenciada, de uso exclusivo;
f equipamentos dotados de automação para certificar que, durante o processo,
todos os passos sejam seguidos corretamente e, ainda, que qualquer tipo de
acidente ou escape seja registrado;
f treinamentos constantes em biossegurança são ministrados à equipe de
vacinas recombinantes;
f vistoria semestral por Comissão Interna de Biossegurança (CIBio).
Dessa forma, é assegurado que todas as normas estejam sendo aplicadas à
produção.
O principal propósito da biossegurança é assegurar que os processos que
envolvem OGMs sejam executados sem que exista risco de contaminação
para o meio ambiente. A Hertape Calier cuida para que essas normas sejam
praticadas em sua totalidade.
59
Todos os critérios que regulamentam a biossegurança em OGMs são normatizados por um
órgão governamental denominado Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).
Este tem poderes para liberar ou interditar uma produção, de acordo com a legislação.
É preciso obter certificados para fabricar produtos à base de OGMs. A Hertape Calier já
possui as certificações necessárias, uma vez que a área produtiva foi fiscalizada e aprovada
pelo órgão competente.
A seguir, o caminho percorrido para a área produtiva ser certificada para a produção
utilizando OGMs:
OGM
CQB
nção
Exte QB
de C
-up
Scale
aixa
ta b
Plan ayout
eL
de
idas
Med enção l
co n t oria
Mem ritivo
Desc
Processo produtivo
A Produção de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina
envolve o cultivo de bactérias Escherichia coli modificadas geneticamente em suas
características próprias e pela inserção de parte de um gene de Leishmania. Essas bactérias
foram geradas em laboratório e, dessa forma, são únicas. Não existem sementes para serem
adquiridas no mercado. A semente utilizada
na confecção de cada lote é produzida pela
Hertape Calier. Utilizando-se de modernas
técnicas em biologia molecular, as sementes
produzidas são testadas e armazenadas a
baixas temperaturas. Um roteiro de produção,
de testes e de documentações é seguido, de
forma a garantir que a semente produzida
possua qualidade e, o mais importante, que
preserve todas as características da primeira
bactéria gerada. São clones idênticos em
diversas gerações. A produção certificada
de sementes é cuidadosamente executada
62
por profissionais treinados e assegurada por
técnicos “expertises” em biotecnologia.
A implantação do processo produtivo da
linha Leish-Tec® - Vacina Recombinante
contra Leishmaniose Visceral
Canina no formato moderno em
que se encontra foi viabilizada
pela visão empreendedora do
Hertape Calier. A metodologia
de obtenção de proteínas
recombinantes pelo cultivo de
E. coli é de domínio científico,
mas em nossa produção alguns
passos foram alterados, objetivando reduzir etapas químicas do processo e
melhorar a qualidade do produto final obtido.
É importante reduzir o número de reagentes químicos adicionados durante a fabricação
de um produto. Tem-se melhor qualidade e maior pureza com menor número de etapas.
É uma melhoria importante, pois sempre que um agente químico é adicionado,
o ideal é que este seja retirado do produto final e testes comprobatórios
são indispensáveis. No caso de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra
Leishmaniose Visceral Canina, foi implantada em sua linha produtiva um
equipamento que substitui uma etapa química de produção. Essa forma de
trabalho é amplamente divulgada em indústrias européias e, no Brasil, somos
a primeira indústria farmacêutica a utilizar esse processo. Outras importantes
otimizações foram implantadas com sucesso ao longo do desenvolvimento
produtivo. Temos o orgulho de poder dizer que a linha de produção de Leish-
Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina é moderna,
utiliza tecnologia avançada mesmo no que tange à biotecnologia e é executada
com o aconselhamento de grandes “expertises”. Todo o sistema trabalha em
regime de contenção, utiliza válvulas e tubulações de padrão farmacêutico e
63
obedecendo a normas de biocontenção.
Outro diferencial importante diz respeito às parcerias firmadas, pois, através dessas
relações, temos acesso fácil a novas tecnologias de mercado e podemos testar sua
implantação no desenvolvimento. Atualmente, a linha produtiva está pronta, mas testes
de qualidade sempre são bem-vindos. Quanto mais puder controlar sua produção, melhor
a qualidade do produto final obtido.
O sistema de produção de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral
Canina é muito tranqüilo. Uma vez entendido que a bactéria E. coli é nossa biofábrica,
entende-se que ela produzirá a proteína, antígeno para essa vacina. Pensando em linhas
gerais, é importante que seja fornecida todas as
Produção da proteína condições ideais de crescimento para que nossa
recombinante A2 bactéria cresça e expresse a proteína-alvo. Após
Formas amastigotas de
Inserção do gene A2
ao plasmídio vetor
outros nutrientes importantes ao desenvolvimento
celular. Para tanto, diversos estudos foram
Inserção do plasmídio vetor
65
Protocolo de vacinação/informações comerciais
Indicação: Imunização contra leishmanio- duas doses com intervalo de 21 dias entre
se visceral canina. as aplicações. Prazo superior a 15 dias,
Observações: Não é indicado para animais iniciar novamente todo o protocolo vacinal
portadores de leishmaniose por não ter ca- proposto.
ráter curativo. Como no uso de todos os produtos biológi-
A Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra cos, podem surgir reações de hipersensibili-
Leishmaniose Visceral Canina será comer- dade, que deverão ser imediatamente trata-
cializada exclusivamente para médicos ve- das de acordo com a orientação do médico
terinários. veterinário.
A vacina deverá ser aplicada em cães acima A vacinação não é o único instrumento de
de 4 meses de idade. prevenção e controle dessa enfermidade.
A vacinação deverá ser precedida de um Outras medidas também devem ser adota-
minucioso exame clínico realizado por um das, conforme normatização do Ministério
médico veterinário. da Saúde.
A vacina deverá ser aplicada somente em Os animais vacinados que apresentarem si-
cães assintomáticos com resultados so- nais clínicos de leishmaniose visceral, rea-
rológicos negativos para leishmaniose ções sorológicas positivas estarão passíveis
visceral canina. de adoção das medidas sanitárias vigentes.
Via de administração: subcutânea. O médico veterinário deverá, obrigatoria-
mente, manter sob sua guarda, durante no
Posologia: três doses com intervalo de 21 mínimo 3 (três) anos após a última dose da
dias entre as aplicações. Em caso de atraso, vacina, cadastro e registro contendo nome
iniciar novo protocolo. do produto, data de fabricação, data de va-
O animal apresentará a resposta imunológi- lidade, nº de partida, nº de doses; o ende-
ca 21 dias após a terceira dose. reço completo e identificação completa do
Revacinação anual a partir da primeira dose. animal vacinado, do responsável civil pelo
Em caso de atraso até 15 dias, administrar animal e datas de vacinação.
66
A Hertape Calier Saúde Animal S.A. deve: Comercialização: Embalagem individual
manter obrigatoriamente, durante 3 (três) (kit). Cada kit é constituído por 1 frasco com
anos após a data de distribuição do produto, uma dose vacinal de 1 mL acompanhado de
informações completas sobre os médicos seringa e agulha descartáveis.
veterinários responsáveis pela aplicação da Venda sob prescrição e aplicação
vacina. obrigatória do médico veteri-
Em casos de animais vacinados com outra nário.
vacina contra leishmaniose visceral canina, Produto licenciado no Ministé-
diferente da Leish-Tec® - Vacina Recombinante rio da Agricultura sob nº 9270
contra Leishmaniose Visceral Canina, o em 24/01/2007.
proprietário deverá assinar uma declaração Proprietário e Fabricante
específica e cumprir todo o protocolo proposto Hertape Calier Saúde Animal
da Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra S.A.
Leishmaniose Visceral Canina para imunização Rodovia MG 050, nº 2001
do animal. O atestado de vacinação anterior Distrito Industrial, Juatuba - MG.
deverá ser mantido anexo ao atual pelo fato CEP: 35675-000
da imunização com a Leish-Tec® - Vacina CNPJ 07.086.487/0001-16
Recombinante contra Leishmaniose Visceral Indústria Brasileira.
Canina não ter o condão de reverter uma www.hertapecalier.com.br
eventual sorologia positiva decorrente da Responsável Técnico:
vacinação anterior do cão com produto distinto Dr. Eduardo Souto Bernardez
desta vacina. CRMV-MG 4339
Estocagem: entre 2ºC e 8ºC. INDÚSTRIA BRASILEIRA
Validade: 12 meses.
Composição: Cada 1 mL contém:
Proteína recombinante (A2-HIS) .... 0,10 mg
Saponina ........................................ 0,50 mg
Timerosal 1:10.000 .......................... 0,01mL
Solução salina tamponada q.s.p. .. 1,00 mL
67
Certificado de Vacinação
(Consulte as orientações para preenchimento contidas no verso.)
®
Nome:
Raça:
Nascimento: Sexo: M F Pelagem:
Caso o animal tenha sido vacinado com outra vacina contra a leishmaniose e por este motivo esteja soropositivo, assine a declaração abaixo:
Declaração
O proprietário, abaixo qualificado, declara que o animal acima qualificado foi vacinado em data anterior à presente, com vacina contra a “leishmaniose visceral canina” diferente da Leish-
Tec®. Declaro, ainda, que me foi esclarecido, quando da compra/administração da Leish-Tec®, que a vacinação anterior de meu animal, em razão da forma de indução de imunidade pelo
produto então utilizado, faz com que exame sorológico eventualmente feito em meu cão, ainda hoje, possa indicar um resultado positivo para a doença que a vacina visa a prevenir, mesmo
que o animal não esteja doente.
Declaro, por fim, que me foi esclarecido que a vacina Leish-Tec® não tem o condão (capacidade) de modificar a eventual sorologia positiva decorrente da vacinação anterior do cão com
produto distinto desta vacina, devendo os testes pertinentes, que permitam diferenciar sorologia positiva por infecção e sorologia positiva por vacinação, ser desenvolvidos na forma, por
quem e no prazo definidos pela Instrução Normativa Interministerial n.º 31/2007.
Comprador/Proprietário_________________________________
Dados do Proprietário
Nome Completo:
RG CPF
Endereço Residencial:
Bairro: CEP -
Cidade: UF
Tel.: e-mail
Dados da Clínica
Nome da Clínica
RG CPF
Endereço da Clínica:
Bairro: CEP -
Cidade: UF
Tel.: e-mail
Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de
vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior
Carimbo e assinatura do médico veterinário Carimbo e assinatura do médico veterinário Carimbo e assinatura do médico veterinário Carimbo e assinatura do médico veterinário
responsável pela vacinação em todas as vias responsável pela vacinação em todas as vias responsável pela vacinação em todas as vias responsável pela vacinação em todas as vias
Obs.: caso a segunda e/ou terceira doses ocorram em clínica(s) distinta(s), preencha novo formulário, enviando a terceira via para a Hertape Calier S.A. - Não é necessário selar.
68
Descrevemos a seguir as exigências da Instrução Normativa Interministerial Nº 31, de 09 de julho de 2007,
publicada no Diário Oficial da União de 10 de julho de 2007, Seção 1, Pág. 1, que prevê no seu art.:
Art. 6º O conteúdo e o uso da vacina fora das áreas de risco 2ª Dose - Quando a aplicação da dose seguinte for executada
delimitadas pelo Ministério da Saúde não exime as empresas e pelo mesmo médico veterinário, é importante, antes de
os profissionais de responsabilidade. colar o selo do frasco vacinal, escrever os dados nos campos
§ 1º Os municípios nos quais a leishmaniose visceral canina é sombreados, verificando sua leitura na segunda e terceira vias.
endêmica, segundo o Ministério da Saúde, só poderão utilizar Neste caso, NÃO será necessário enviar a informação para a
vacinas que permitam diferenciar cães vacinados de cães Hertape Calier. Oportunamente, será destinado espaço no site
infectados. www.hertapecalier.com.br para a atualização do Certificado.
§ 2º Para realizar a comercialização de vacinas que permitem No caso da 2ª dose ser executada por outro médico veterinário,
a diferenciação entre cães vacinados e cães infectados nos o novo profissional deverá, obrigatoriamente, abrir NOVO
municípios indenes, deverá haver disponibilidade de kits para FORMULÁRIO, indicando no campo destacado o número do
diagnóstico registrados no MAPA para tal fim. formulário que o antecedeu. Indique no campo apropriado a
§ 3º A indicação de uso do produto deverá ser atribuição data prevista para a 3ª dose. Importante - carimbe e assine todas
exclusiva de um médico veterinário, salvo casos de interesse as vias do Certificado de Vacinação.
público conforme normatização do Ministério da Saúde.
§ 4º O médico veterinário deverá emitir atestado ou preencher Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª
cartão de vacinação que contenha todos os dados sobre a via em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer
identificação do animal, sobre o responsável civil pelo animal, agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar
inclusive endereço completo, e informações completas do produto - o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.
(nome, data de fabricação, data de validade, nº de partida, nº Oriente o proprietário do animal a mantê-lo junto com o
de doses). Essas informações devem ficar armazenadas por 5 Certificado de Vacinação anterior.
(cinco) anos.
§ 5º O proprietário do registro do produto deve manter
obrigatoriamente, durante, no mínimo, 3 (três) anos após a data 3ª Dose - Quando a aplicação da 3ª dose for executada pelo
de distribuição do produto, informações completas sobre os mesmo médico veterinário que executou a 2ª dose, é importante,
médicos veterinários responsáveis pela aplicação da vacina. antes de colar o selo do frasco vacinal, escrever os dados nos
§ 6º O fabricante deverá encaminhar para o Ministério da campos sombreados, verificando sua leitura na segunda e terceira
Agricultura, Pecuária e Abastecimento relatórios trimestrais vias. Neste caso, NÃO será necessário enviar a informação para
de produção, distribuição e os municípios nos quais o produto a Hertape Calier. Oportunamente, será destinado espaço no site
esteja sendo comercializado, como também o número de doses www.hertapecalier.com.br para a atualização do Certificado.
vendidas por município. Cabe ao Ministério da Agricultura, INDIQUE NO CAMPO APROPRIADO, NA ÚLTIMA LINHA DO
Pecuária e Abastecimento remeter trimestralmente os dados ao CERTIFICADO, A DATA DE REVACINAÇÃO ANUAL.
Ministério da Saúde. No caso da 3ª dose ser executada por médico
§ 7º A vacina deverá ser usada somente em cães com diagnóstico veterinário distinto do que efetuou o procedimento da
sorológico negativo para leishmaniose visceral, utilizando kits 2ª dose, o profissional que a estiver executando deverá,
para diagnóstico registrados no MAPA. obrigatoriamente, abrir NOVO FORMULÁRIO, indicando no
campo destacado o número do formulário que o antecedeu.
ORIENTAÇÕES PARA PREENCHIMENTO DO CERTIFICADO Importante - carimbe e assine todas as vias do Certificado de
Vacinação.
DE VACINAÇÃO
Dados do Animal, Dados do Proprietário, Dados da Clínica -
Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª
Preencher com letra de forma, legível e observando a qualidade
via em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer
nas cópias da segunda e terceira vias - se necessário, coloque o agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar
formulário sobre uma superfície dura. - o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.
Sorologia - Anote os dados do atestado obtido junto ao Oriente o proprietário do animal a mantê-lo junto com o
laboratório que o executou. Certificado de Vacinação anterior.
Oriente o proprietário do animal a guardar em local seguro o Certificado de
Vacinação. Com o objetivo de cumprimento das normas previstas para a realização
da quarta fase de desenvolvimento da vacina Leish-Tec®, a Hertape
1ª Dose - Após a aplicação da vacina Leish-Tec®, escreva nos Calier Saúde Animal terá assegurado o direito de acesso aos dados
campos reticulados os dados contidos na etiqueta do frasco da contidos nos Certificados de Vacinação, sendo que a mesma garante
vacina, assegurando sua leitura nas outras vias e, somente após ao responsável toda a segurança quanto a sua confidencialidade
este procedimento, cole-o no local indicado.Indique no campo para usos distintos àqueles destinados à pesquisa científica.
“próxima vacinação” as datas previstas da segunda e terceira A Hertape Calier Saúde Animal S.A. declara que a veracidade das
doses. informações contidas no Certificado de Vacinação deverá ser
Importante - Carimbe e assine todas as vias do Certificado de atribuída ao proprietário do animal que as forneceu e ao médico
Vacinação. veterinário responsável pelo preenchimento do mesmo.
1ª via: Proprietário
69
Referências bibliográficas
ABRANCHES, P., SILVA-PEREIRA, M.C.D., CONCEIÇÃO-SILVA, D.; CARVALHO, E. M.; ROCHA, H.; TEIXEIRA, R.; JOHNSON Jr,
F.M., SANTOS GOMES, G.M., JANZ, J.G. Canine leishmaniasis: W.D.A.; Prospective Study of visceral leishmaniasis in an ende-
pathological and ecological factors influencing transmission of mic area of Brazil. The Journal of Infectious Diseases, v. 154, n.
infection. J. Parasitol., 77(4): 557-561, 1991a. 4, p. 639-649, 1986c.
ALENCAR, J.E. Calazar canino. Contribuição para o estudo da BELKAID Y, HOFFMANN KF, MENDEZ S, KAMHAWI S, UDEY MC,
epidemiologia do calazar no Brasil. Tese, Imprensa oficial, For- WYNN TA, SACKS DL. The role of interleukin (IL)-10 in the per-
taleza, Ceará, Brasil, 342 pg., 1959. sistence of Leishmania major in the skin after healing and the
therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile
ALENCAR, J.E. Profilaxia do calazar no Ceará. Brazil. Revista do cure. J Exp Med. 2001 Nov 19;194(10):1497-506.
Instituto de Medicina Tropical de São Paulo 3: 175-180. 1961.
BEYRODT, C.G.; PINTO, A.R.; FREYMULLER, E.; BARBIERI, C.L.
ALMEIDA-SILVA, L. Estudo prospectivo de indivíduos com testes Characterization of an antigen from Leishmania amazonensis
imunológicos e reação em cadeia da polimerase para calazar amastigotes able to elicit protective responses in a murine mo-
em Porteirinha, Minas Gerais, Brasil. Tese (Mestrado em Medici- del. Infect. Immun., 65:2052-9, 1997.
na Tropical e Infectologia). Faculdade de Medicina do Triângulo
Mineiro-Uberaba-Minas Gerais, 128 p. 2002. BOURDOISEAU G, MARCHAL T, MAGNOL JP. Immunohistoche-
mical detection of Leishmania infantum in formalin-fixed, para-
ALVAR J, JIMÉNEZ M. Could infected drug-users be potential ffin-embedded sections of canine skin and lymph nodes. J Vet
Leishmania infantum reservoirs? AIDS. 1994 Jun;8(6):854. Diagn Invest. 1997 Oct;9(4):439-40.
ALVAR J, MOLINA R, SAN ANDRÉS M, TESOURO M, NIETO J, BRENER Z.- Calazar canino em Minas Gerais. Tese (Fac. Med.
VITUTIA M, GONZÁLEZ F, SAN ANDRÉS MD, BOGGIO J, RODRI- Univ. Minas Gerais), Belo Horizonte, 90 pg., 1957.
GUEZ F, et al. Canine leishmaniasis: clinical, parasitological and
entomological follow-up after chemotherapy. Ann Trop Med Pa- CABRAL, M., O’GRADY, J., ALEXANDER, J. Demonstration of
rasitol. 1994 Aug;88(4):371-8. Leishmania specific cell mediated and humoral immunity in
asymptomatic dogs. Parasite Immunol, 14: 531-539. 1992.
ARIAS, J.; et. al. Epidemiologia y control de la leishmaniasis em
las Américas por país o território. OPAS/CUADERNO TÉCNICO CAMARGO, M.E. Efeito da prevalência da doença sobre a acurá-
no.44, 52p., 1996. cia dos exames sorológicos em levantamentos soro-epidemio-
lógicos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical,
ASHFORD, D.A. et. al. Studies on the control of visceral leishma- vol. 27 supl. IV, 1994.
niasis. Validation of the Falcon Assay Screening Teste-Enzyme-
Linked Immunosorbant Assay (FAST-ELISA for field diagnosis of CARVALHO, F.A.A.; CHAREST, H.; TAVARES, C.A.P.; MATLA-
canine visceral leishmaniasis. American Journal Tropical Medi- SHEWSKI, G.; VALENTE, E.P.; RABELLO, A.; GAZZINELLI, R.T.;
cine Hygiene; 48:1-8. 1993. FERNANDES, A.P. Diagnosis of american visceral leishmaniasis
in humans and dogs using the recombinant Leishmania donova-
ASHFORD, R. W. Leishmaniasis reservoirs and their significance ni A2 antigen. Diag. Microbiol. Infect. Dis., 43: 289-95, 2002.
in control. Clinics in Dermatology. V.14, no.5, p. 523-532, 1996.
CERQUEIRA EJ, SHERLOCK I, GUSMÃO A, BARBOSA JÚNIOR
ASHFORD, R.W.; PALMER, S.R.; SOULSBY, L.; SIMPSON, D.I.H.; ADE A, NAKATANI M. CIARAMELLA P, OLIVA G, LUNA RD, GRA-
In: The Leishmaniases: Zoonoses Biology, Clinical Practice, and DONI L, AMBROSIO R, CORTESE L, SCALONE A, PERSECHINO
Public Health Control. 1 ed. Oxford University Press, 1998, 527- A.A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150
543p. dogs naturally infected by Leishmania infantum. Vet Rec. 1997
BADARÓ, R.; JONES, T. C.; LORENÇO, R.; CERF, B. J.; SAMPAIO, Nov 22;141(21):539-43.
70
COELHO, E.A.F. Avaliação dos níveis de proteção induzidos pela CHAREST H, MATLASHEWSKI G. Developmental gene expres-
imunização com os antígenos A2 e LACK contra a infecção ex- sion in Leishmania donovani: differential cloning and analysis
perimental por L. (L.) major e L.(L.) amazonensis. Belo Horizonte: of an amastigote-stage-specific gene. Mol. Cell. Biol. 1994
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. 2004. 166 p. (TESE, May;14(5):2975-84.
Doutorado em Imunologia).
CHAREST, H., AND MATLASHEWSKI, G. (1994)
COELHO, E.A.F.; TAVARES, C.A.P.; CARVALHO, F.A.A.; CHAVES, Mol. Cell. Biol. 14, 2975-2984.
K.F.; TEIXEIRA, K.N.; RODRIGUES, R.C.; CHAREST, H.; MATLA-
SHEWSKI, G.; GAZZINELLI, R.T.; FERNANDES, A.P. Immune DA SILVA,V. O.; BORJA-CABRERA, G.P.;
response induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 PONTES, N.N.C.; DE SOUZA, E.P.; LUZ,
antigen, but not by the LACK antigen, are protective against K.G.; PALATNIK, M.; DE SOUSA, C.B.P. A
experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection. phase III trial of efficacy of the FML vacci-
Infect. Immun., 71: 3988-94, 2003. ne against canine kala-azar in an endemic
area of Brazil (Sao Goncalo do Amaranto,
CORREDOR, A.; GALLEGO, J. F.; TESH, R. B.; MORALES, A.; CAR- RN). Vaccine, n. 19, p.1082-92, 2001.
RASQUILLA, C. F.; YOUNG, D. G.; KREUTZER, R. D.; BOSHELL,
J.; PALAU, M. T.; CACERES, E.; PALAEZ, D. Epidemiology of vis- DEANE L.M., DEANE M.P. Sobre a biologia do
ceral leishmaniasis in Colombia. The American Journal of Tropi- Phlebotomus longipalpis transmissor de leish-
cal Medicine and Hygiene, v. 40, n.5, p. 480-486, 1989. maniose visceral, em área endêmica do Ceará. I.
Distribuição, predominância e variação estacional.
COSTA VAL AP, CAVALCANTE RR, GONTIJO NF, MICHALICK Revista Brasileira de Biologia 15:83-95. 1955b.
MSM, MELO MN. Leishmaniose visceral canina: relação entre
estado clínico, resposta imune humoral (IGG) e infecção de DEANE, L. M. Leishmaniose visceral no Brasil. Estudos so-
Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis. XVII Congresso Brasileiro de bre reservatórios e transmissores realizados no Estado
Parasitologia. p. 288, 2003. do Ceará. Tese, (Fac. Med. Univ. S. Paulo), Brasil, Ed.
S.N.E.S., Rio de Janeiro, 162 p., 1956.
COSTA VAL, A.P.; GENARO, o.; CUNHA, H.C.; In: Leishmaniose.
Curso da Associação Nacional de Clínicos Veterinários de Pe- DEANE, L.M. & DEANE, M.P. Visceral leish-
quenos Animais – Regional Minas Gerais, Belo Horizonte, 16 e maniasis in Brazil. Geographical distribution
17 de outubro de 1995 and transmission. Rev. Instituto de Medicina
Tropical de São Paulo, 4:149-212,1962.
COSTA, C.A.; GENARO, O.; LANA, M.; MAGALHÃES, P.A.; DIAS,
M.; MICHALICK, M.S.M.; MELO, M.N.; COSTA, R.T.; MAGA- DESJEUX P. Leishmaniasis. Nat Rev Micro-
LHÃES-ROCHA, N.M.; MAYRINK, W. Leishmaniose Visceral Ca- biol. 2004 Sep;2(9):692.
nina: avaliação da metodologia sorológica utilizada em inquéri- DESJEUX P. Leishmaniasis. Public health
tos epidemiológicos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 24:21-25, 1991. aspects and control. Clin Dermatol. 1996
COSTA-SILVA, J.; VIEIRA, E.P.;RABELO,L.S.S.; COSTA, Sep-Oct;14(5):417-23.
R.T.;FRANÇA-SILVA, J.C.; MAYRINK, W. & GENARO, O. Epide- DESJEUX, P. Information on the Epidemiolo-
miologia e controle da leishmaniose visceral no Estado de Mi- gy and control of Leishmaniases by country
nas Gerais, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina or territory. WHO/LEIS/91.30. 47p. 1991.
Tropical, 33(suplemento I ): 32, 2000.
DIETZE R, BARROS GB, TEIXEIRA L, HARRIS J,
CHAMIZO, C.; MORENO, J; ALVAR, J. Veter. Imm. Immunopathol. MICHELSON K, FALQUETO A et al. Clin Infect Dis
103: 67–75, 2005. 1997; 25: 1240-2.
71
DOWLATI Y. Cutaneous leishmaniasis: clinical aspect. Clin Der- ral leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol. 1997 Sep;4(5):530-
matol. 1996 Sep-Oct; 14(5):425-31. 5.
DUNAN, S.; FROMEL, D.; MONJOUR, L.; OGUNKOLADE, B.W.; GHEDIN, E.; CHAREST, H.; MATLASHEWSKI, G. A2 rel: a cons-
CRUZ, A.; QUILICI, M. The phocean veterinary study group on titutively expressed Leishmania gene linked to an amastigote-
visceral leishmaniasis. Vaccination trial against canine visceral stage-specific gene. Mol. Biochem. Parasitol., 93: 23-9, 1998.
leishmaniasis. Parasite Immunol., 11: 397-492, 1989.
GHOSH A, LABRECQUE S, MATLASHEWSKI G. Protection against
CUNHA & CHAGAS. Experimental infection of Equus asinus with Leishmania donovani infection by DNA vaccination: increased
Leishmania chagasi (1937). Rev Soc Bras Med Trop. 2003 Nov- DNA vaccination efficiency through inhibiting the cellular p53
Dec; 36(6):695-701. Portuguese. response. Vaccine. 2001 Apr 30;19(23-24):3169-78.
FERNANDES, A.P.; CARVALHO, F.A.A.; TAVARES, C.A.P.; SAN- GHOSH, A.; ZHANG, W.W.; MATLASHEWSKI, G. Immunization
TIAGO, H.C.; CASTRO, G.A.; TAFURI, W.L.; FERREIRA, L.A.M.; with A2 protein results in a mixed Th1/Th2 and a humoral res-
GAZZINELLI, R.T. Combined interleukin-12 and topical chemo- ponse which protects mice against Leishmania donovani infec-
therapy for established leishmaniasis drastically reduces tissue tions. Vaccine, 20: 59-66, 2002.
parasitism and relapses in susceptible mice. J. Infect. Dis., nº
183, p. 1646 – 1652, 1997. GONTIJO, B.; CARVALHO, M.L.R. Leishmaniose tegumentar
americana. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 36, n.1, 2003, p. 71
FERRER, L.; ALSA, M.J.; ROURA, X.; PORTÚS, M.; In: Serological – 80, 2003.
diagnosis and treatment of canine leishmaniasis. Veterinary Re-
cord, v. 136, n. 3, 1995, 514-516p. GRADONI, L.; FOGLIA MANZILLO V.; PAGANO A. et al. Vaccine
23: 5245-5251, 2005.
FERRER, L.; In: Conferência – Leishmaniose Visceral Canina –
Aspectos Clínicos, Diagnóstico e Tratamento. XXIV Congresso GRADONI, L. The diagnosis of canine leishmaniasis. Proceedin-
Brasileiro da Anclivepa – Associação Nacional de Clínicos Vete- gs of the Second International Canine Leishmaniasis Forum. ,7-
rinários de Pequenos Animais, Minascentro, Belo Horizonte, 16 14, 2002.
a 20 de agosto de 2003. GRIMALDI G JR, TESH RB. Leishmaniases of the New World: cur-
FERRER, L.; In: Leishmaniasis: update in diagnosis and therapy. rent concepts and implications for future research. Clin Micro-
ESVD CONGRESS PISA. Proceedings, 1997. biol Rev. 1993 Jul; 6(3):230-50.
FERRER, L.; In: Leishmanioses – Avances em Dermatologia Ca- HANDMAN, E. Leishmaniasis: current status of vaccine develop-
nina. Pulso Ediciones SA, Fascículo VII, 1994. 143-168p. ment. Clin. Micro. Rev., v.14, n. 2, p. 229 – 243, 2001.
FRANÇA-SILVA, J.C.; DA COSTA, R.; SIQUEIRA, A.; MACHADO- HEINZEL FP, RERKO RM, HATAM F, LOCKSLEY RM. IL-2 is neces-
COELHO, G.; DA COSTA,C.; MAYRINK, W.; VIEIRA, E.; COSTA, J.; sary for the progression of leishmaniasis in susceptible murine
GENARO, O & NASCIMENTO, E. Epidemiology of canine visceral hosts. J Immunol. 1993 May 1; 150(9):3924-31.
leishmaniosis in the endemic area of Montes Claros Municipa- HEINZEL FP, SCHOENHAUT DS, RERKO RM, ROSSER LE, GA-
lity, Minas Gerais State, Brasil. Veterinary Parasitology, 111:161- TELY MK. Recombinant interleukin 12 cures mice infected with
173, 2003. Leishmania major. J Exp Med. 1993 May 1; 177(5):1505-9.
FUJIWARA, R.T. Aspectos da imunidade celular e humoral da HEINZEL FP. Infections in patients with humoral immunodefi-
vacinação experimental na leishmaniose visceral canina. Belo ciency. Hosp Pract (Off Ed). 1989 Sep 15;24(9):99-103, 106-111
Horizonte: Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. 2003. 201 passim.
p. (TESE, Doutorado em Parasitologia).
HOMMEL, M. et. al. The micro-ELISA technique in the sero-
GHEDIN E, ZHANG WW, CHAREST H, SUNDAR S, KENNEY RT, diagnosis of visceral leishmaniasis. Ann. Trop. Med. Parasitol.,
MATLASHEWSKI G. Antibody response against a Leishmania do- 72:213-218, 1978.
novani amastigote-stage-specific protein in patients with visce-
72
HOMMEL, M.; JAFFE, C.L..; TRAVI, B.; MILON, G. Experimental Inst. Oswaldo Cruz, 80: 349-57, 1985.
models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vacci-
nes. Ann. Trop. Med. Parasitol., v. 89, p. 55 – 73, 1995. MATHIS A, DEPLAZES P. PCR and in vitro cultivation for detec-
tion of Leishmania spp. in diagnostic samples from humans and
JI, J.; SUN, J.; QI, H.; SOONG, L. Analysis of T helper cell respon- dogs. J Clin Microbiol. 1995 May;33(5):1145-9.
ses during infection with Leishmania amazonensis. A. J. Trop.
Med. Hyg., v. 66, p. 338 - 345, 2002. MAYRINK, W. Contribuição ao diagnóstico parasitológico da
leishmaniose visceral. Tese, Belo Horizonte, 112 pg,
JI, J.; SUN, J.; QI, H.; SOONG, L. Analysis of T helper cell respon- 1967.
ses during infection with Leishmania amazonensis. A. J. Trop.
Med. Hyg., v. 66, p. 338 - 345, 2002. MAYRINK, W.; COSTA, C.A.; MAGALHÃES,
A.P.; MELO, M.N.; DIAS, M.; OLIVEIRA-LI-
JONES, D.E.; BUXBAUM, L.U.; SCOTT, P. IL-4-independent inhi- MA, A.; MICHALICK, M.S.M.; WILLIANS, P.
bition of IL-12 responsiveness during Leishmania amazonensis A field trial of a vaccine against American
infection. J. Immunol., v. 165, p. 364 - 372, 2000. Dermal Leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop.
Med. Hyg.; v. 73, p. 385 – 391, 1979.
LAISON, R.; SHAW, J.J. Evolution, classification and geogra-
phical distribution. In: PETTERS, W & KILLICK-KENDRICK, R. MENDES, C.O.; PARAGUAI-DE-SOUZA, E.;
The leishmaniasis in Biology and Medicine. London: Academic BORJA-CABRERA, G.P.; BATISTA, L.M.M.;
Press, 1987. p. 1 – 120. DOS SANTOS, M.A.; PARRA, L.E.; MENZ, I.;
PALATNIK, M.; PALATNIK-DE-SOUSA, C.B.
LANOTTE G, RIOUX JA, PERIERES J, VOLLHARDT Y. Ecolo- IgG1/IgG2 antibody dichotomy in sera of vaccina-
gy of leishmaniasis in the south of France. 10. Developmental ted or naturally infected dogs with visceral leishma-
stages and clinical characterization of canine leishmaniasis in niosis. Vaccine, v. 21, p. 2589 – 2597, 2003.
relation to epidemiology. Ann Parasitol Hum Comp. 1979 May-
Jun;54(3):277-95. French. MENDES, W. S.; TROVÃO, J. R.; SILVA, A. A. M. Urbanização
da leishmaniose visceral humana em São Luís – MA. Revis-
Lymphocyte subset abnormalities in canine leishmaniasis. Vet ta da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 33,
Immunol Immunopathol. 1997 May;56(3-4):345-51. supl. 1, p. 58-59, 2000.
MANCIANTI, F. et. al. Studies on canine leishmaniais control. I. MICHALICK, M. S. M. ; RIBEIRO, V. M. ; MELO,
Evolution of infection of different clinical forms of canine leish- M. N. ; VAL, A. P. C. . Avaliação da Medotologia
maniasis following antimonial treatment. Trans. R. Soc. Trop. de Controle de Segurança na Transmissão
Med. Hyg. 82:566-567, 1988. de Leishmaniose Visceral Canina no Ca-
MANSON-BAHR P. E. C. Diagnosis. “In” Peters W, Killick- nil do ICB - UFMG de 1984 a 2002. In: XII
Kendrick, eds. The leishmaniasis in biology and medicine. II. Congresso Brasileiro de Parasitologia Vete-
Clinical Aspects and Controire, Academic Press, London, 1987. rinária, 2002, Rio de Janeiro. XII Congresso
Brasileiro de Parasitologia Veterinária. Rio
MARZOCHI, M. C. A.; TOLEDO, L. M.; MARZOCHI, K. B. F.; COU- de Janeiro : Colégio Brasileiro de Parasito-
TINHO, S. G.; TRAMONTANO, N. C. Leishmaniose visceral no Rio logia Veterinária, 2002.
de Janeiro. Aspectos epidemiológicos humanos. In: CONGRES-
SO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA TROPICAL, 19, MICHALICK, M. S. M.; Atualização em
1983, Rio de Janeiro. Anais...Rio de Janeiro, p.60.1983. Leishmaniose Canina. Curso, Associação
Nacional de Clínicos Veterinários de Peque-
MARZOCHI, M.C.A.; COUTINHO, S.G.; SOUZA, W.J.S.; TOLEDO, nos Animais – Regional Minas Gerais, 31 de
L.M.; GRIMALDI, Jr.; MOMEN, H.; PACHECO, R.S.; SABROZA, março a 01 de abril de 1992.
P.C.; SOUZA. M.A.; RANGEL, Jr.; F.B.; TRAMONTANO, N. Canine
visceral leishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil. Clinical, para- MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA DE VIGI-
sitological, therapeutical and epidemiological findings. Mem. LÂNCIA EM SAÚDE. DEPARTAMENTO DE VIGI-
73
LÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA. In: Manual de Vigilância e Controle Leishmania braziliensis braziliensis in an endemic area of Rio de
da Leishmaniose Visceral. Brasília / DF: Ministério da Saúde, Janeiro, Brazil. - Am. J. Trop. Med. Hyg., 38:41-47, 1988.
2003. 120p.
RAMIRO, M.J.; ZÁRATE, J.J; HANKE, T.; RODRIGUEZ, D.; RO-
MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚ- DRIGUEZ, J.R.; ESTEBAN, M.; LUCIENTES, J.; CASTILLO, J.A.;
DE. FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE. In: Manual de Controle LARRAGA, V. Protection in dogs against visceral leishmaniasis
da Leishmaniose Tegumentar Americana. Brasília/DF, 2000, caused by Leishmania infantum is achieved by immunization
62p. with a heterologous prime-boost regime using DNA and vacci-
nia recombinant vectors expressing LACK. Vaccine, 21: 2474-84,
MONTEIRO, P. S. Leishmaniose visceral no Brasil: perspectivas 2003.
de controle. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropi-
cal, v. 35, supl. 1, p. 335, 2002. RANQUE, J.; DEPIEDS, R. & CABASSU, H. - Diagnostic de la-
boratoire du kala-azar méditerranéen chez c’homme et chez le
MS (MINISTÉRIO DA SAÚDE); FNS (FUNDAÇÃO NACIONAL DA chien. Valeur comparée des divers procédes d’exploration utili-
SAÚDE) & CENEPI (CENTRO NACIONAL DE EPIDEMIOLOGIA), zés actuellement. J. Méd. Bordeaux, 128:262-266, 1951.
Informe Epidemiológico do SUS, 1:30-33, 1992.
REED, S.G. Diagnosis of leishmaniasis. Clinics in Dermatology,
MUIGAI R, GITHURE JI, GACHIHI GS, WERE JB, LEEUWENBURG v.14, n.5 p.471-478, 1996.
J, PERKINS PV. Cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania
major in Baringo District, Kenya. Trans R Soc Trop Med Hyg. REED, S.G. et al. An improved serodiagnostic procedure for vis-
1987; 81(4):600-2. ceral leishmaniasis. American Jounal Tropical Medicine Hygie-
ne. 43:632-639, 1990.
NOORMOHAMMADI AH, HOCHREIN H, CURTIS JM, BALDWIN
TM, HANDMAN E. Paradoxical effects of IL-12 in leishmaniasis in REIS, A,B. et al. Aspectos clínicos e parasitológicos em cães
the presence and absence of vaccinating antigen. Vaccine. 2001 infectados naturalmente por Leishmania, na área urbana de
Jul 16; 19(28-29):4043-52. Montes Claros, MG. Anais do XV Congresso Brasileiro de Parasi-
tologia, Salvador, Bahia, Brasil, outubro 1997.
NUZUM, E.; WHITE III, F.; THAKUR, C.; DIETZE, R.; WAGES, J.;
GROGLBERMAN, J. Diagnosis of symptomatic visceral leishma- REIS, A.B. Avaliação de parâmetros laboratoriais e imunológicos
niasis by use of the Polymerase Chain Reaction on patient blood, de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania)
J. Infec. Dis. 4:171-175, 1994. chagasi, portadores de diferentes formas clínicas da infecção.
Tese de Doutorado, Depto. de Parasitologia, ICB, UFMG, 2001.
OLIVEIRA DA SILVA, V.; BORJA-CABRERA, G.P.; PONTES, N.N.C.;
SOUZA, E.P.; LUZ, K.G.; PALATNIK, M.; SOUZA, C.B.P. A phase III REITHINGER R, DAVIES CR. Canine leishmaniasis: novel strate-
trial of efficacy of the FML-vaccine against canine kalazar in an gies for control. Trends Parasitol. 2002 Jul;18(7):289-90.
endemic area of Brazil (São Gonçalo do Amaranto, RN). Vaccine,
19: 1082-92, 2001. REY, L. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do ho-
mem nas Américas e na África. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara
OLIVEIRA, C.L.; ASSUNÇÃO, R.M.; REIS,I.ª& PROIETI, F.A. Dis- Koogan, 2001. p.214 – 266.
tribuição espacial da leishmaniose visceral humana e canina
em Belo Horizonte, Estado de Minas Gerais, Brasil,1994-1997. RIOUX JA, LANOTTE G, MAAZOUN R, PERELLO R, PRATLONG F.
Cadernos de Saúde Pública, Rio de Janeiro, 17(5): 1231-1239, Leishmania infantum Nicolle, 1908, the agent of the autochtho-
2001. nous oriental sore. Apropos of the biochemical identification of
2 strains isolated in the eastern Pyrenees. C R Seances Acad Sci
PINELLI, E et. al. Cellular and humoral immune responses in D. 1980 Oct 27;291(8):701-3. French.
dogs experimentally infected with Leishmania infantum. Infec-
tion Immunity, 62 (1), 229-235.(1994). RIOUX, J.A. et al. Écologie des Leishmanioses dans le Sud de
la France. 11. La leishmaniose viscérale canine: succès de la
PIRMEZ, C. et. al. Canine american cutaneous leishmaniasis: a transmissions expérimentale “Chien-Phléboteme-Chien”par la
clinical and immunological study in dogs naturally infected with piqûre de Phlebotomus ariasi Tonnoir, 1921. Ann. Parasitologie,
74
54:401-407, 1979. Specific IgG1 and IgG2 antibody and lymphocyte subset levels
in naturally Leishmania infantum-infected treated and untreated
RODRIGUES, M.M.; BOSCARDIN, S.B.; VASCONCELOS, J.R.; dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1997 Oct 6;59(1-2):21-30.
HIYANE, M.I.; SALAY, G.; SOARES, I.S. Importance of CD8 T
cell-mediated immune response during intracellular parasitic SUNDAR, S.; RAI, M. Laboratory diagnosis of visceral leishma-
infections and its implications for the development of effective niasis. Clin. Diag. Lab. Immunol., v. 9, n. 5, p. 951 – 958, 2002.
vaccines. An. Acad. Bras. Cienc¸ v. 75, n. 2, p. 443 – 468, 2003.
SYPEK JP, CHUNG CL, MAYOR SE, SUBRAMANYAM JM,
RODRIGUEZ, N.; GUZMAN, B. & RODAS, A et al. Diagnosis of GOLDMAN SJ, SIEBURTH DS, WOLF SF, SCHAUB
cutaneous leishmaniasis and species discrimination of parasites RG. Resolution of cutaneous leishmaniasis:
by PCR and hybridization. J. Clin Microbiol, 32: 2246-52. 1994 interleukin 12 initiates a protective T helper
type 1 immune response. J Exp Med. 1993
SACKS D, NOBEN-TRAUTH N. The immunology of susceptibility Jun 1;177(6):1797-802.
and resistance to Leishmania major in mice. Nat Rev Immunol.
2002 Nov;2(11):845-58. TAFURI WL, SANTOS RL, ARANTES RM,
GONÇALVES R, DE MELO MN, MICHALICK
SCHARTON TM, SCOTT P. Natural killer cells are a source of MS, An alternative immunohistochemical
interferon gamma that drives differentiation of CD4+ T cell sub- method for detecting Leishmania amastigo-
sets and induces early resistance to Leishmania major in mice. J tes in paraffin-embedded canine tissues. J
Exp Med. 1993 Aug 1;178(2):567-77. Immunol Methods. 2004 Sep;292(1-2):17-23.
SEN GUPTA PC, BHATTACHARJEE B, RAY HN. The cytology of TAFURI, W. L. ; XAVIER, S. C. ; ARANTES, R. M. E. ;
Leishmania donovani (Laveran & Mesnil, 1903) Ross, 1903. J In- MICHALICK, M. S. M. ; RIBEIRO, V. M. . Diagnóstico
dian Med Assoc. 1953 May;22(8):305-8. imunohistoquímico para leishmaniose visceral canina.
SILVA, AR. et al. Leishmaniose visceral (calazar) na Ilha de São In: XXIV Congresso Brasileiro da ANCLIVEPA, 2003, Belo
Luiz, Maranhão, Brasil: evolução e perspectivas. Revista da So- Horizonte. XXIV Congresso Brasileiro da ANCLIVEPA Asso-
ciedade Brasileira de Medicina Tropical. 30(5): 359-368 1997. ciação Nacional de Clínicos Veterinários de Pequenos
Animais 16 a 20 de agosto de 2003 Minascentro - Belo
SILVA, E. S.; GONTIJO, C. M. F.; PACHECO, R. S.; FIUZA, V. O. P.; Horizonte - MG. Belo Horizonte : CD, 2003.
BRAZIL, R. P. Visceral leishmaniasis in the metropolitan region
of Belo Horizonte, State of Minas Gerais, Brazil. Memórias do TAVARES, L. M. S. A. Avaliação do processo
Instituto Oswaldo Cruz, v. 96, n. 3, p. 285-291, Apr. 2001. de urbanização da leishmaniose visceral no
município de Aracaju – Sergipe. Revista da
SIMPLÍCIO, A. C. R.; FURTADO, J. B. V.; MONTEIRO, P. S.; GAR- Sociedade Brasileira de Medicina Tropical,
RETT, D. Leishmaniose visceral no Brasil: análise epidemioló- v. 33, supl. 1, p. 37, 2000.
gica nos últimos 16 anos. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, v. 35, supl. 1, p. 298, 2002. TESH, R.B. Control of zoonotic visceral
Leishmaniasis: is it time to change strate-
SKEIKY, Y.A.W.; KENNEDY, M.; KAUFMAN, D.; BORGES, M.M.; gies? Am. J. Trop. Med. Hyg., 52: 287-92,
GUDERIAN, J.A.; SCHOLLER, J.K.; OVENDALE, P.J.; PICHA, 1995.
K.S.; MORRISSEY, P.J.; GRABSTEIN, K.H.; CAMPOS-NETO, A.;
REED, S.G. LeIf: a recombinant Leishmania protein that induces VIEIRA, J. B. F.; COELHO, G. E. Leishmanio-
an IL-12-mediated Th1 cytokine profile. J. Immunol., 161: 6171-9, se visceral ou calazar: aspectos epidemio-
1998. lógicos e de controle. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, v. 31, supl. 2,
SOONG, L.; CHANG, C.H.; SUN, J.; LONGLEY, B.D,JR.; RUDDLE, p. 85-92, 1998.
N.H.; FLAVELL, R.A.; MCMAHON-PRATT, D. Role of CD4+ T cells
in pathogenesis associated with Leishmania amazonensis infec- WEBB, J.R.; CAMPOS-NETO, A.; OVENDALE,
tion. J. Immunol., v. 158, n. 11, p. 5374 – 5383, 1997. P.J.; MARTIN, T.I.; STROMBERG, E.J.; BADA-
75
RO, R.; REED, S.G. Human and murine immune responses to
a novel Leishmania major recombinant protein encoded by
members of a multicopy gene family. Infect. Immun., 66:
3279-89, 1998.
WEIGLE K, SARAVIA N. G. Natural history, clinical evolution,
and the host-parasite interaction in New World cutaneous
Leishmaniasis. Clin Dermatol. 1996 Sep-Oct;14(5):433-50.
ZANIN, F. H. C., COELHO, E. A. F., MARQUES-DA-SILVA, E.,
REZENDE, S. A., COSTA, M. M. S., TAVARES, C. A. P., GAZZI-
NELLI, R. T., FERNANDES, A. P. Evaluation of Immune Res-
ponses and Protection Induced by A2 and Nucleoside Hydro-
lase (NH) DNA vaccines Against Leishmania chagasi and
Leishmania amazonensis Experimental Infections. Microbes
and Infection. , v.9, p.1070 - 1077, 2007.
ZHANG WW, MATLASHEWSKI G. Characterization of the A2-
A2rel gene cluster in Leishmania donovani: involvement of
A2 in visceralization during infection. Mol Microbiol. 2001
Feb;39(4):935-48.
ZHANG, W.W., MATLASHEWSKI, G. Loss of virulence in Leish-
mania donovani deficient in an amastigote-specific protein,
A2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, n.94,p. 8807-8811, 1997.
ZHANG, W.W.; CHAREST, H.; GHEDIN, E.; MATLA-
SHEWSKI, G. Identification and overexpression of
the A2 amastigote-specific protein in Leishmania do-
novani. Mol. Biochem. Parasitol., 78: 79-90, 1996.
76
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