Ttulo

Microvasculopatia cerebral em Ratos induzida por doena de chagas aguda

Resumo

Cardiomiopatia a principal forma clnica da doena de Chagas (DC); no entanto, as
manifestaes cerebrais, tais como a meningoencefalite, acidente vascular cerebral isqumico
e disfuno cognitiva, tambm podem ocorrer. O objetivo do presente estudo foi investigar
alteraes microvasculares funcionais e estresse oxidativo no crebro de ratos em CD aguda.
CD aguda foi induzida em camundongos Swiss Webster (SWM) com a cepa Y de Trypanosoma
cruzi (T. cruzi). Cerebral densidade capilar funcional (o nmero de capilares perfundidos
espontaneamente), rolamento e adeso de leuccitos ea endothelialdependent microvascular
resposta foram analisados durante um perodo de 15 dias, utilizando vdeo-microscopia
intravital. Tambm avaliamos estresse oxidativo cerebral com o mtodo TBARS cido
tiobarbitrico espcies reativas. Em comparao com o no-infectado grupo, CD aguda
induzida significativamente alteraes microvasculares funcionais cerebrais, incluindo (i)
capilar funcional rarefao, (ii) aumento da laminagem e adeso de leuccitos, (iii) a formao
de agregados de plaquetas-microvasculares leuccitos, e (iv) a alterao da resposta endotelial
a acetilcolina. Alm disso, o stress oxidativo cerebral aumentada em infectada animais.
Concluiu-se que em ratinhos CD aguda induzida microvasculopatia cerebral, caracterizado por
uma incidncia reduzida de capilares perfundidos, um elevado nmero de microvasculares
agregados de plaquetas-leuccitos, um aumento acentuado no leukocyteendothelium
interaes e disfuno endotelial arteriolar crebro associada com o estresse oxidativo. Estes
resultados sugerem o envolvimento de alteraes na microcirculao cerebral nas
manifestaes neurolgicas da CD

Introduo

. CD aguda ressurgiu em surtos de transmisso oral em pases onde a transmisso do vector ter
sido controladas [9]. Durante CD aguda, a resposta inflamatria perifrica caracterizado pela
presena de macrfagos [10], as clulas NK e intensa ativao policlonal de linfcitos. Essa
resposta seguido pela sntese sistmica de pr-inflamatria citocinas [13], o xido ntrico
(NO) [14] e espcies reativas de oxignio [15]. Alteraes microvasculares foram implicados na
patognese da cardiomiopatia chagsica e incluem vascular constries, microaneurismas,
dilataes e agregao plaquetria, resultando na formao de trombos oclusivos transientes.
Estas alteraes contribuir para necrose miocitoltica seguido pela infiltrado inflamatrio e
fibrose intersticial. Alm disso, substncias vasoactivas, incluindo endotelina-1, e de
tromboxanoesto envolvidos na modulao de respostas vasculares durante T. cruzi, que
contribui para a agregao de plaquetas, microvascular espasmos e disfuno
endotelialUsando vdeo-microscopia intravital (IM), nosso grupo de pesquisa recentemente
demonstraram que microvascular funcional cerebral alteraes so fisiopatologicamente
relevantes em modelos de sistmica sndromes infecciosas graves, como septicemia e malria
em camundongos . Alm disso, IM tem sido utilizada como uma ferramenta importante com
que para avaliar a microcirculao durante a infeco por T. cruzi, por exemplo, utilizando a
bolsa jugal do hamster e modelos do msculo cremaster
Em modelos experimentais de CD, apesar de relatos de que clulas inflamatrias migram para
o tecido cerebral, em um VLA-Forma dependente da VCAM-1-[22] e o T. cruzi infecta clulas
endoteliais cerebrais [23], nenhum estudo tem diretamente caracterizada a microcirculao
cerebral funcional durante T. cruzi. Neste artigo, apresentamos os resultados de anlises das
consequncias do CD aguda na microcirculao cerebral em ratinhos. Apresentamos
evidncias de que a infeco aguda pelo T. cruzi aumenta o estresse oxidativo no crebro e
provoca grave vasculopatia cerebral, o que pode contribuir para o neurolgica manifestaes
de CD

Mtodos

Animais
Utilizamos camundongos machos Swiss Webster outbred (SWM) (idade 6 a 8
semanas), o peso de 18 a 20 g), obtido a partir do Oswaldo Cruz Fundao Animais
Facilities (Cecal, Rio de Janeiro, Brasil). Os animais foram alojados durante, pelo
menos, 1 semana antes do parasita infeco em condies de luz controlada (12:12 h
claro-escuro ciclo) e temperatura (2261uC).
Os grupos experimentais
Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: um no infectado
(NI) grupo controle (n = 5/experiment) e um T. cruzi (Y grupo experimental tenso)-
infectados (n = 15/experiment). infeco foi realizada por injeco intra-peritoneal de
104 sangue formas tripomastigotas de T. cruzi. , Os camundongos no infectado
pareados por idade Foram mantidos sob condies idnticas. Duas a trs experincias
independentes foram realizados de acordo com o procedimento

Parasitemia, peso corporal e mortalidade
A parasitemia foi avaliada individualmente usando o Pizzi-Brenermtodo por contagem
microscpica direta do parasito em 5 ml de cauda sangue. O peso corporal ea
mortalidade foram monitorados regularmente para 22 dias ps-infeco (dpi) em trs
experimentos independentes (n = 15 animais / experimento

Vdeo-microscopia intravital nos crebros de camundongos
Ns anestesiados os animais do controle NI e T. cruzi-infectados grupos de 8 e 15 dpi,
por injeco intraperitoneal, com uma mistura de xilazina (10 mg / kg) e cloridrato de
cetamina (75 mg / kg). o animais foram traqueostomizados e ventilados artificialmente
com ar ambiente.
Ns canulada a veia jugular para permitir a injeco de fluorescente traadores. A
temperatura do corpo foi mantida a 37uC com um homeotrmicos sistema de
cobertor. Os animais foram imobilizados numa estereotxico quadro, e uma janela
craniana foi criado por craniotomia com uma alta velocidade perfurar a expor a
microcirculao cerebral [24]. os animais
Foram, em seguida, colocado sobre um palco fixo na posio vertical de um
microscpio intravital com uma lmpada de mercrio (Olympus BX51/WI, EUA) ligada
a uma cmara CCD sistema de cmera de vdeo digital. O campo microscpico foi
continuamente superfundidos com fluido cerebrospinal artificial em 37uC, pH 7,35 por
um bomba de infuso (Harvard mais aparelhos, EUA) ligada a cateteres fixo sobre a
janela craniana aberta. O superfusate foi continuamente arejadas com 10% O2, 6% de
CO2 e 84% de N2 a manter tenso e uma composio de gs comparvel ao pH
fisiolgico e evitar inflammation.

Avaliao da densidade capilar funcional

Aps a administrao intravenosa de 0,1 ml de 5% FITClabeled
imagens de dextrano, microscpico da microcirculao cerebral
foram adquiridas por Arquimedes 3.7.0 software (Microvision, Evry,
Frana) para a contagem de linha de capilares usando software Saisam
(Microvision, Evry, Frana). A densidade capilar funcional, ou o
nmero total de capilares perfundidos espontaneamente (ou seja, vasos com
dimetros inferiores a 10 mm) por mm quadrado de superfcie (1 mm2),
foi determinada por contagem de cada ramo capilar em quatro campos ao longo de
um
perodo de 4 minutos, como previamente descrito em detalhe [25]. o
capilares medidos cerca de 5 a 10 mm de dimetro,
conectado arterolas para as vnulas e continha um nico fluxo coluna
de clulas vermelhas do sangue [26]. Estas clulas so clulas em forma bicncavos
com-
membranas altamente deformveis, o que permite que as clulas de atravessar
passagens estreitas, com dimetros pequenos (por exemplo, capilares).

Rolamento de leuccitos e anlise de aderncia
Ns rotulados leuccitos circulantes, injetando os ratos com
intravenosa rodamina 6G (0,3 mg / kg), o que tambm coradas circulantes
plaquetas [17]. Os leuccitos fluorescentes foram tornados visveis pela epiillumination
atravs da janela craniana. Observamos cinco aleatoriamente
venulares segmentos seleccionados (30 a 100 mmin de dimetro e 100 mm de
comprimento)
durante 60 segundos em cada preparao. Interaes leuccito-endotlio
foram avaliados atravs da determinao do nmero de leuccitos (i) de rolamento,
definidas como clulas que cruza o segmento venular (100 mm) a uma velocidade
menor
do que a dos glbulos vermelhos circulantes (apresentadas como o nmero de
cells/min/100 mm), e (ii) de leuccitos que aderiu por pelo menos
30 segundos a parede venular. Considerando-se que a rodamina-6G
manchado ambos plaquetas e leuccitos, tambm investigou a
percentagem de microvasos expositoras agregados de plaquetas-leuccitos
(PLAs) [27] em cinco campos microscpicos por animal.
Avaliao do estresse oxidativo
Para caracterizar o estresse oxidativo no crebro de ratos, que
mediram os nveis de espcies reativas do cido tiobarbitricoso apresentados como
o malondialdedo (e = 1,566105 M21 CM21) per
miligrama de protena (ensaio BCA). Realizamos dois independentes
experincias (n = 4 animais / teste). Os crebros de NI e T. cruzi-camundongos
infectados foram homogeneizadas
em um tampo de fosfato frio, pH 7,4, com 2,6-bis (1,1-dimetiletil) -
4-metilfenol (BHT, concentrao final 0,2%). Resumidamente, o so apresentados
como o malondialdedo (e = 1,566105 M21 CM21) per miligrama de protena (ensaio
BCA). Realizamos dois independentes experincias (n = 4 animais / teste).








Respostas vasodilatadoras dependentes do endotlio cerebral
Foram avaliadas as respostas vasodilatadoras para a aplicao tpica de
endotlio-dependente vasodilatador acetilcolina (Ach; 1,026 M)
em arterolas cerebrais de ambos os grupos de animais. A janela craniana
estava impregnado de Ach por cinco minutos, eo arteriolar
dimetros foram medidos antes e depois da exposio a
substncia vasoativas. A resposta vascular so expressas como o
por cento (%) mudana da linha de base.

A anlise estatstica
Ns expressa os resultados como a mdia SEM 6 para cada grupo, e
comparaes entre os grupos foram realizadas usando testes t no pareado
ou a anlise de varincia (ANOVA) seguido por mltiplos de Bonferroni
teste de comparao. Diferenas com valores de p inferiores a 0,05 foram
considerado estatisticamente significant.We utilizado um disponvel comercialmente,
pacote estatstico baseado em computador (GraphPad InStat 5.0, GraphPad
Software Inc., La Jolla, CA, EUA) para todos os clculos

Resultados
DPI ( DAYS POST INFECTION)
Caracterizao da doena aguda experimental Chagas em camundongos,
A anlise das formas tripomastigotas de T. cruzi no sangue de animais revelou que o
pico da parasitemia ocorreu em 8 dpi. Figura 1A

Infeco aguda T. cruzi induz mudanas na cerebral
microvasculatura perfuso
A visualizao de dextrano marcado com FITC por videomicroscopia intravital
revelaram que a 15 dpi, T. cruzi, os ratos infectados
apresentaram colapso da microcirculao cerebral, caracterizado por um
alterao significativa no padro de perfuso microvascular
(Figura 2C), em comparao com o grupo NI (Figura 2A). este colapso
no foi observado em animais expostos a 8 dpi (Figura 2B). o
quantificao de capilares perfundidos mostrou que a 15 dpi, o
grupo infectado apresentou uma reduo significativa de perfundidos
capilares (405.631,4 capillaries/mm2) em comparao com o NI
controles (514.611 capillaries/mm2; p, 0,05) e os infectados
animais em 8 dpi (535.631,2 capillaries/mm2, p, 0,01, Figura 2D