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1 - INTRODUCCIN
La acumulacin de metales pesados en slidos,
sedimentos y tejidos vegetales, bien sea por adsorcin
y/o coprecipitacin u otras formas de asociacin natu-
ral, incluida la bioacumulacin, constituyen un modo
de minimizar su transporte y propagacin. Esto puede
acarrear a largas consecuencias negativas para el en-
torno ecolgico; variaciones del medio circundante a
los slidos y sedimentos pueden producir la lixiviacin
de cantidades significativamente elevadas de especies
txicas y con ello se hacen accesibles a los sistemas
acuosos y seres vivos. Su acumulacin en tejidos vege-
tales puede llegar a producir daos genotxicos en sus
clulas y de esta forma, se incorporan al hombre por
la cadena alimentaria [11].
DAOS TXICOS EN TEJIDOS VEGETALES, PRODUCIDOS POR AGUAS
CONTAMINADAS CON ARSNICO EN ZIMAPN, HIDALGO, MXICO
1
Francisco Prieto GARCA
2,
*, Mara de los ngeles Lechuga VARGAS
2
, Mara Aurora Mndez MARZO
3
,
Enrique Barrado ESTEBAN
4
, Juan Carlos Ggaytn OYARZN
5
1
Recebido para publicao em 1/12/2004. Aceito para publicao em
23/1/2006 (001446)
2
Centro de Investigaciones Qumicas
3
Centro de Investigaciones de Materiales y Metalurgia
4
Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Ciencias, Universidad
de Valladolid, Valladolid, Espaa
5
Centro de Investigaciones Biolgicas, Universidad Autnoma del Estado
de Hidalgo, Carretera Pachuca-Tulancingo, km 4,5, C.P. 42076, Pachuca,
Hidalgo Mxico
*
A quem a correspondncia deve ser enviada
RESUMO
DANOS TXICOS EM TECIDOS VEGETAIS, PRODUZIDOS POR GUAS CONTAMINADAS COM ARSNIO EM ZIMAPN, HIDALGO,
MXICO. Estudos feitos no perodo de 1992-1998 nas guas dos poos da municipalidade de Zimapn, estado do Hidalgo, Mxico,
demostram o aumento na concentrao de arsnio ultrapassando os limites mximos permissveis pela norma ocial mexicana. A
determinao de arsnio nas amostras de gua foi feita por absoro atmica (AA), por meio do gerador de hidruros (GH). Neste
estudo, o Vicia faba foi usado como bioensaio para avaliar os danos genotxicos com o teste da induo dos microncleos pela
exposio gua de Zimapn, contaminada com arsnio em clulas de razes. Como controle, foi usada uma gua com similares
caractersticas, do municpio de Pachuca, mas com ndices abaixo dos limites de deteco. Os resultados mostraram que a gua
desta regio apresenta altas concentraes de arsnico e que os efeitos genotxicos manifestam-se pela induo dos microncleos
nas clulas meristemticas de raizes de tecidos vegetais sensveis.
Palavras-chave: arsnico, bioensaios, Vicia faba, toxicidade.
RESUMEN
Segn estudios realizados en el periodo de 1992-1998 en las aguas de los pozos, norias y manantiales, del municipio de Zimapn,
Estado de Hidalgo, Mxico, se corrobor que exista un incremento en el contenido de arsnico rebasando los lmites mximos
permisibles por la Norma Ocial Mexicana. La determinacin de arsnico en las muestras de aguas se realiz por absorcin atmica
(AAS), mediante generador de hidruros (GH). En este estudio se utiliz el Vicia faba como un bioensayo para evaluar el dao genotxico
con la prueba de induccin de microncleos por exposicin al agua de Zimapn, contaminada con As en clulas de races. Se utiliz
como ensayo de control un agua de pozo de similares caractersticas del municipio de Pachuca, pero con contenidos de As por debajo
de los lmites de deteccin. Los resultados mostraron que el agua de esta regin presenta altas concentraciones de arsnico y que
puede provocar efectos genotxicos que se maniestan por la induccin de microncleos en las clulas meristemticas de races de
tejidos vegetales sensible.
Palabras clave: arsnico, bioensayos, Vicia faba, toxicidad.
La Gerencia Estatal de la Comisin Nacional del Agua en
Hidalgo tiene conocimiento de la presencia de altos contenidos
de arsnico en el agua que es suministrada por los pozos a
la poblacin de la ciudad de Zimapn. Un estudio sobre los
contenidos de este elemento durante el periodo marzo 92-
marzo 93, conrm que dichos pozos estn contaminados
con arsnico [2] y que rebasan los lmites mximos permisi-
bles por la Normativa Mexicana [9] (0,050 mg.L
-1
, en aquel
entonces). Se realizaron monitoreos de dicho elemento hasta
1998, llegando a la conclusin de cerrar algunos pozos ya que
presentaban concentraciones de hasta 1,5 mg/L
-1
.
Uno de los sistemas para evaluar el dao citogentico
que ha demostrado ser verstil y eciente, es el de las clulas
meristemticas de la raz de haba (Vicia faba), debido a que
es de fcil manejo, de mantenimiento relativamente econ-
mico y que tienen pocos cromosomas [13]. Los cromosomas
presentes en haba tienen buen tamao para realizar un
estudio citolgico, se distinguen con claridad a un aumento
de 40X en su anlisis al microscpico; otra de las ventajas
para su estudio es que se conocen perfectamente los tiem-
pos de cada una de las etapas de su ciclo celular, siendo la
duracin total de stas 19 h y 30 min a 19C; aunado a que
en los meristemos apicales hay una gran cantidad de clulas
indiferenciadas en divisin, lo que favorece los estudios de
citotoxicidad [5]. El dao genotxico puede ser de dos tipos,
espontneo e inducido (por factores externos), el primero
Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(1): 94-97, jan.-mar. 2006
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ocurre en los procesos de transmisin y sntesis del DNA
para ser expresado como aberraciones, se le denomina S-
independiente, pudiendo ser las alteraciones provocadas
del tipo cromatdico y cromosmico; mientras que las
alteraciones que requieren pasar por una etapa de sntesis
para poder expresarse se les denomina S-dependientes, y
son alteraciones del tipo sub-cromatdico. En este trabajo
se estudi el dao genotxico que puede producir como
factor externo el arsnico presente en suelos y aguas en la
regin de Zimapn, utilizando el bioensayo de las clulas
meristemticas de la raz de haba.
2 - MATERIAL Y MTODOS
2.1 - Muestras de aguas
La caracterizacin sicoqumica de las aguas se realiz
mediante muestreos sistemticos y representativos durante
un ao, para evaluar los niveles medios de concentracin
de arsnico, recolectada de los diferentes pozos de la pobla-
cin y tambin del Distribuidor General. El agua utilizada
para analizar los daos genotxicos en Haba fue colectada
directamente del Distribuidor General de abastecimiento
de la poblacin de Zimapn.
2.2 - Determinacin de arsnico en absorcin
atmica por generacin de hidruros
En un matraz aforado de 25 mL, se adicion 1 mL de
yoduro de potasio 5% (m/m) y 1 mL de cido ascrbico
5% (m/m) para evitar la oxidacin del KI a I
2
y se agit,
posteriormente se adicion 1 mL de HCl concentrado y
10 mL de la muestra de las digestiones y se afor. Para la
generacin de hidruros se prepar una solucin de NaBH
4

al 0.6% (m/m) en NaOH al 0.5% (m/m). Para la curva de
calibracin del equipo se prepararon soluciones de arsnico
partiendo de un estndar de As de 1000 ppm diluido a
100 mL (cdigo 571, marca Solutions, Plus Inc.).
2.3 - Determinacin del efecto genotxico
del arsnico en las races de Vicia faba
Se utiliz al haba como un bioensayo para determinar
el potencial genotxico del agua muestreada en Zimapn
a travs de la induccin de microncleos (MNs). Se utiliz
haba comercial (Vicia faba variedad minor). Se trataron
bajo condiciones especicas para su germinacin (hume-
dad, sin luz, y protegidas de polvo).
Se eligieron 20 habas grandes, de tamao similar y
se sumergieron en agua corriente durante 24 horas con el
objetivo de reblandecer la testa, al trmino de este tiem-
po se observaron las habas un poco ms grandes por la
hidratacin. Se colocaron las habas entre dos capas de
algodn en una charola de aluminio, y se humedecieron
con agua corriente, sin luz, sin contaminantes (polvo), y
lo sucientemente hmedas para favorecer su crecimiento
hasta que aparecieron las radculas, posteriormente se
quit la testa para evitar la contaminacin por hongos [6].
Cuando las races alcanzaron de 4 a 5 cm de longitud (entre
2 y 3 das) se separaron en 2 lotes, un lote control y el lote
problema para su tratamiento. Se eligieron las habas con
races grandes y se colocaron en la supercie de un vaso
de precipitado de 250 mL, cubierto de papel aluminio para
evitar la luz, se le hicieron oricios para sumergir slo las
races en agua del Distribuidor de abastecimiento de la
poblacin de Zimapn, y se dejaron en reposo durante 6
h [7]. Para el lote control negativo se utiliz agua del Muni-
cipio de Pachuca. Una vez que ya se trataron las races se
procedi a la preparacin de las laminillas [7, 13]:
Se cortaron 2 mm del meristemo apical y se jaron en
una solucin de etanol cido actico (3:1). Se proce-
di a la tincin, colocando los meristemos apicales en
etanol 70% (v/v) durante 15 min para deshidratar las
clulas de la raz y facilitar que penetre mejor el HCl
durante la hidrlisis, la cual fue realizada con HCl 5M
durante 30 min. Para eliminar el exceso de HCl y poder
teir las clulas, se decant el HCl y se lav 3 veces con
agua destilada. La tincin se realiz con aceto-orcena
por 40 min y se agreg a los meristemos cido actico
al 45% (v/v) con la nalidad de eliminar el exceso de
colorante. El aplastamiento en monocapa se realiz luego
de la tincin para lo cual se coloc un cubreobjetos y se
presion ligeramente; esto permite que las clulas no
estn unas sobre otras queden lo ms dispersas posible
para facilitar la observacin al microscpico.
La observacin al microscopio se realiz en campos
al azar contando 1.000 clulas en interfase para el grupo
experimental y para el control. Se determin por conteos la
incidencia de microncleos, que muestra el dao genotxico
inducido a travs de los rompimientos cromosmicos y
cromosomas con el centrmero inactivado y se compar
con un grupo control, analizando las diferencias a travs
de una prueba de diferencia de proporciones [10].
Para evaluar si el compuesto es ms txico que mu-
tgeno, se evalu el dao a travs de un ndice mittico,
discriminando el nmero de clulas en divisin entre
el numero total de clulas de un conjunto de 1.000 y se
compar con un grupo control, analizando las diferencias
a travs de una prueba de X
2
[12].
3 - RESULTADOS Y DISCUSIN
El efecto genotxico del Arsnico fue evaluado en las
races de Vicia faba, tomando este cultivo como un sistema
de bioensayo para analizar aberraciones cromosmicas a
travs de la prueba de microncleos, en donde se expusieron
las races al agua de Zimapn debido a su alto contenido de
Arsnico (0,480 mg/L) para los lotes experimentales, y para
los lotes testigos se expusieron bajo las mismas condiciones
al agua de Pachuca (sin presencia de As, < 0,008 mg/L).
Los MNs son alteraciones observables en anafase, que
se originan a travs de rompimientos cromosmicos y/o
por la falta de segregacin de cromosomas debido a una
inactivacin de su centrmero. En la Figura 1 se muestra un
rompimiento de un cromosoma anafsico en haba, inducido
Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(1): 94-97, jan.-mar. 2006
Aguas contaminadas con arsnico: daos txicos, Garca et al.
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El resultado anterior pudiera sugerir que no existe
un dao genotxico muy marcado, lo cual puede deberse
a que el compuesto sea ms txico que mutgeno, en
donde el efecto mutagnico estuviera encubierto por el
efecto txico. Para discernir si no hay un efecto genotxi-
co o hay un efecto citotxico que encubre la capacidad
mutagnica del Arsnico, se evalu un ndice mittico,
que se obtuvo dividiendo el nmero de clulas en divi-
sin entre el total de clulas observadas y sacando una
frecuencia por cada mil clulas observadas, evalundo-
se a travs de la prueba de X
2
[12]. El ndice mittico
constituye un criterio para evaluar el dao fisiolgico
que provoca los diversos agentes xenobiticos. Se ha
demostrado que algunas sustancias qumicas pueden
producir inhibicin de la divisin celular, debido a un
efecto citotxico [1, 3, 4, 8, 13].
De seis preparaciones obtenidas por el grupo control
se analiz el nmero de clulas en divisin en mil clulas
por cada una y se promedi dicho resultado. Para el gru-
po experimental en donde se utiliz el agua de Zimapn,
la cual sobrepasa los lmites permisibles de Arsnico, se
obtuvieron veintin muestras, de las cuales tambin se
analizaron mil clulas en cada una y se promedi igual que
al grupo control el numero de clulas en divisin entre el
total de clulas observadas (Tabla 2).
por el tratamiento con el agua de Zimapn a las clulas
meristemticas de la raz, el cual es el mecanismo con que
el arsnico induce la formacin de microncleos.
En la Figura 2A se muestra la aparicin de microncleos
inducidos por la presencia de As en las aguas de Zimapn;
y como se puede observar al compararlos con la gura 2B,
es evidente la disminucin y/o ausencia de stos en el grupo
control. Estos resultados concuerdan con los encontrados por
otros autores [6, 13] al evaluar la induccin de microncleos
en tejidos vegetales por presencia de agentes xenobiticos
como el cromo o insecticidas del tipo carbmicos.
En la Tabla 1 se presenta la frecuencia de clulas en
divisin, la distribucin de stas por etapa del ciclo celular
y el nmero de MNs encontrados en las muestras control
y experimentales. Se puede ver en la tabla y en las micro-
fotografas 2A y 2B, que la frecuencia de microncleos en
los grupos experimentales diere ligeramente con respecto
al grupo control, presentando pequeas diferencias signi-
cativas desde el punto vista estadstico.
FIGURA 1 Fragmento cromosmico observable en una anafase
de haba el cual se transformar en un MN en telofase
FIGURA 2A Microfotografa de formacin de microncleos en
races de Vicia faba que fueron germinadas en aguas con As.
Observados a aumento 40X
FIGURA 2B Microfotografa de races de Vicia faba que fueron
germinadas en aguas sin As. Se puede apreciar la no presencia
de microncleos. Observado a aumento 40X
TABLA 1 Frecuencias de clulas en divisin y los micron-
cleos encontrados en las muestras del grupo control y en el
experimental
Frecuencias
de clulas
en divisin
Clulas en divisin por
etapa del ciclo celular
Microncleos
I P M A T
Control (sin As) 55/1000 15
a
19
a
1
a
15
a
4
a
1
a
Experimental
(con As)
37/1000 7
a
7
a
4
a
4
b
4
a
11
b
I=Interfase, P=Profase, M=Metafase, A=Anafase y T=Telofase.
Letras diferentes indican diferencias signicativas (p<0,05)
Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(1): 94-97, jan.-mar. 2006
Aguas contaminadas con arsnico: daos txicos, Garca et al.
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Se encontr una reduccin de 9,6 veces en la divisin
celular de las muestras tratadas con agua que contiene altas
concentraciones de Arsnico con respecto a las muestras del
grupo control, como se observa dicha reduccin es positiva
estadsticamente y capaz de encubrir al efecto mutagnico.
Efectos de una sensible reduccin en la divisin celular
fueron encontrados igualmente por otros autores [1, 3, 4,
8], en estos casos evaluando la incidencia de radiaciones
gamma y/o X o el efecto de aplicaciones de insecticidas
[13]. Para determinar si existen diferencias en cuanto a las
etapas del ciclo celular observadas en el grupo control y
experimental, partiendo de la base de que se ha detectado
un efecto citotxico signicativo, se desglos la frecuencia
de aparicin de cada una de las sub-etapas de una divisin
y se sac la frecuencia por cada mil clulas para tener un
ndice de comparacin.
Como se puede ver en la Tabla 3, no hay diferencias
signicativas desde el punto de vista estadstico entre el
grupo control y el experimental, inicialmente se puede ob-
servar que en ambos la mayora de las clulas en divisin
estn en interfase y profase, existiendo un segundo pico
de expresin en anafase, lo que sugiere un comportamien-
to similar entre los dos grupos y que estn coordinadas
independientemente del tratamiento. Por ello no se puede
saber por el momento, en que lugar al ciclo celular est
actuando el efecto citotxico.
aguas de Zimapn, a diferencia de la ausencia de estos en
el grupo control; as tambin, se observaron las pequeas
diferencias signicativas desde el punto vista estadstico.
Se encontr adems, una reduccin de 9,6 veces la divisin
celular de las muestras tratadas con agua que contiene altas
concentraciones de arsnico con respecto a las muestras
del grupo control, resultando dicha reduccin, positiva es-
tadsticamente y capaz de encubrir al efecto mutagnico.
5 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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del Estado de Hidalgo (UAEH), Pachuca, Hidalgo,
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faba, UNAM, Disertacin Tesis de Maestra
e Biologa, Universidad Nacional Autnoma de
Mxico, Mxico, 1992.
TABLA 2 Frecuencia de clulas meristemticas de Haba en divi-
sin tratadas con y sin agua contaminada por Arsnico
Clulas Totales
Clulas en
divisin
Frecuencia
observada
Control (sin As) 6000 278 46/1000
Experimental (con As) 21000 363 17/1000
+
Positivo (+) , segn la prueba de X
2
, con un 95 % de conabilidad
TABLA 3 Frecuencia observada de clulas meristemticas de
haba con respecto a cada una de las etapas del ciclo celular
en grupos tratados con y sin Arsnico
Frecuencias
de clulas
en divisin
Interfase Profase Metafase Anafase Telofase
Control
(sin As)
46/1000 15 20 1 9 1
Experimental
(con As)
17/1000
+
4 6 0 6 1
Positivo (+) , segn la prueba de X
2
, con un 95 % de conabilidad
Se realiz el anlisis estadstico por medio de X
2
y se en-
contr igual nmero de clulas en etapas de interfase, profase
y anafase para ambos casos, de acuerdo a su proporcin.
4 - CONCLUSIONES
El efecto genotxico del arsnico en las races de Vicia
faba, se pudo apreciar desde el inicio al observarse el
rompimiento de un cromosoma anafsico y la aparicin
de microncleos inducidos por la presencia de As en las
Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(1): 94-97, jan.-mar. 2006
Aguas contaminadas con arsnico: daos txicos, Garca et al.