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3.

Cintica Enzimtica
3.1. Introduo Cintica
Qumica
A cin
A cin

tica qu
tica qu

mica
mica

a disciplina que estuda as


a disciplina que estuda as
leis que regem a velocidade das reac
leis que regem a velocidade das reac

es
es
A velocidade de uma reaco pode ser calculada
medindo-se a variao da concentrao dos produtos
ou dos reagentes por unidade de tempo
A B
A velocidade deve ser medida no incio da reaco
velocidade inicial, v
0
Zona de linearidade
v
0
= d[C
4
H
9
Cl] / dt
v = (0,09-0,1) / (100-0)
= 0,0001 M/s
As velocidades das reaces esto relacionadas com
as concentraes dos reagentes atravs das leis
diferenciais de velocidade
Leis diferenciais de velocidade
Leis diferenciais de velocidade
v
0
= k [R
1
]
x
[R
2
]
y
[R
3
]
z

Velocidade especfica da reaco


Ordens da reaco
As ordens da
reaco no so
factores
estequiomtricos e
tm de ser
determinadas
experimentalmente!
2 NH
3
N
2
+ 3 H
2
v
0
= k [NH
3
]
x
Neste caso, x
diferente de 2!
Leis integrais de velocidade
Leis integrais de velocidade
A integrao das equaes diferenciais de velocidade
permite conhecer a relao entre a concentrao do
reagente e o tempo
Cintica de 1 ordem Cintica de 2 ordem
v
0
= k [R]
1
v
0
= k [R]
2
ln (C/C
0
) = -kt 1/C 1/C
0
) = kt
t

= ln2 / k t

= - 1 / k.C
0
Eq. diferencial
Eq. integrada
Tempo de
semivida
Cintica de
1 ordem
Cintica de
2 ordem
Reac
Reac

es elementares
es elementares
Nas reaces elementares, as molculas colidem directamente
umas com as outras. Nesses casos, as ordens da reaco so
idnticas aos factores estequiomtricos
Reaco unimolecular
Reaco bimolecular
Reaco trimolecular
O
3
O
2
+ O
O + O
3
2 O
2
3 O
2
2 O
3
v
0
= k [O
3
]
v
0
= k [O
3
] [O]
v
0
= k [O
2
]
3
Contudo, ordens da reaco iguais aos factores estequiomtricos
no obriga a que as reaces sejam elementares
A nvel molecular, todas as reaces so elementares!
C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
6 CO
2
+ 6 H
2
O
Gliclise + ciclo de Krebs + fosforilao oxidativa
uma reaco global!
A velocidade global da reaco depende muitas vezes
de uma ou mais das reaces elementares que a
constituem
O conhecimento do conjunto das reaces elementares
constitui o mecanismo da reaco
Os catalisadores foram a reaco a seguir um
mecanismo diferente, onde as reaces elementares
so mais rpidas, apesar da reaco global ser idntica
A catlise enzimtica mais complexa em
consequncia da natureza da enzima. As leis que regem
a cintica enzimtica so por isso distintas das leis da
cintica qumica apesar de se basearem nos mesmo
princpios.
3. Cintica Enzimtica
3.2. Factores que afectam as
reaces enzimticas
Efeito da concentra
Efeito da concentra

o da enzima
o da enzima
U - Unidade de enzima
quantidade de enzima que cataliza a transformao de 1mol
de substrato por minuto a 25C em condies definidas
A velocidade directamente
proporcional concentrao de enzima,
pelo que uma cintica de 1 ordem
v
0
= k [E]
Efeito do substrato
Efeito do substrato
Curva hiperblica Curva sigmoidal
v
0
=
[S] + b
a [S]
v
0
=
[S]
n
+ b
a [S]
n
(Michaelis-Menten) (Hill)
Efeito de inibidores e
Efeito de inibidores e
activadores
activadores
Os inibidores e
activadores vo
modificar as
curvas v = f([S]
para cada par
enzima
substrato,
afectando de
forma especfica
os parmetros
a, b e n
Efeito do pH
Efeito do pH
Sobre a reaco
O H
+
pode intervir directamente como substrato ou
produto, pelo que a alterao do pH pode afectar o
equilbrio e a velocidade da reaco
O pH ou a concentrao hidrogeninica, [H
+
] actua
na catlise enzimtica a trs nveis
NAD
+
+ AH
2
NADH + A + H
+
Sobre o substrato ou o produto
O H
+
pode alterar o estado de ionizao do substrato
ou do produto, transformando-o numa molcula
diferente com uma afinidade diferente para a enzima
CH
3
COOH
CH
3
COO
-
Afinidades diferentes para a
enzima de transporte
membranar de pequenos
cidos
Sobre a enzima
O H
+
vai alterar o estado de ionizao dos resduos
de aminocidos que constituem a enzima, o que
conduz a alteraes nas conformaes das enzimas
e modificao das suas estruturas.
Dissociao em subunidades
Alterao do centro activo (com ganho ou perda de
actividade)
Perda de estruturas tercirias e/ou secundrias
Em casos extremos, desnaturao da enzima
Em consequncia, a maioria das enzimas possui uma
faixa estreita de pH onde possui actividade cataltica,
com um pH ptimo de actividade
Efeito da temperatura
Efeito da temperatura
A temperatura afecta vrios parmetros da
catlise enzimtica, como
A estabilidade da enzima
A velocidade da reaco catalisada
A afinidade entre o substrato e a enzima
A ionizao de grupos importantes para a catlise ou
para a estabilidade da enzima
A afinidade entre inibidores ou activadores e a
enzima
O equilbrio da reaco
Etc
Efeito sobre a estabilidade
O aumento da temperatura provoca na enzima
alteraes na sua estabilidade conformacional, que em
casos extremos conduzem desnaturao
Perda da actividade enzimtica
Diminuio da velocidade da reaco
Efeito sobre a velocidade da reaco
A velocidade de qualquer reaco qumica depende da
Energia de activao, Ea, e da temperatura, T
substrato
produto
C
C H
3
O
S
CH
3
OPP
RH
H
N
C
C H
3
O
A equao que relaciona a Energia de activao com a
temperatura a equao de Arrhenius
k =
Ea
1
RT
e
O aumento de Ea
diminui a velocidade k
O aumento de T
aumenta a velocidade k
Efeito da catlise
Efeito da temperatura
Assim, a temperatura tem dois efeitos antagnicos
Aumenta a velocidade
da reaco de um
modo directo
Diminui a velocidade
da reaco por afectar
a estabilidade do
catalisador
enzimtico, levando a
um aumento da Ea
Em consequncia, h
igualmente uma
temperatura ptima
de actividade
enzimtica
3. Cintica Enzimtica
3.3. Cinticas de Michaelis-Menten
3.3.1. A equao de Michaelis-Menten
v
[S] 1
k
v
0
= k [S]
v
0
=
[S] + b
a [S]
S P
1 ordem
Ordem 0
1 > Ordem > 0
Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten postularam que
este comportamento cintico poderia ser explicado
assumindo-se a formao rpida de um complexo enzima-
substrato, que se converteria lentamente em produto
Michaelis
Menten
rpido lento
k
-1
>> k
2
Para Michaelis e Menten, a reaco que limita a velocidade
do processo a que forma o produto, pelo que a enzima e
o substrato estariam permanentemente em equilbrio com o
complexo enzima-substrato durante a reaco enzimtica
v
0
= k
2
[ES]
K
M
=
[ES]
[E] [S]
(Os bioqumicos consideram sempre a dissociao)
=
k
-1
k
1
[E]
T
K
M
=
[ES]
[E] [S]
[E] = [E]
T
- [ES]
K
M
=
[ES]
([E]
T
- [ES]) [S]
[ES] =
K
M
+ [S]
[E]
T
[S]
f
v
0
= k
2
[ES]
[ES] =
K
M
+ [S]
[E]
T
[S]
v
0
=
K
M
+ [S]
k
2
[E]
T
[S]
Mas quando a enzima est saturada,
[E]
T
= [ES]
V
max
= k
2
[E]
T
V
max
Equa Equa o de o de
Michaelis Michaelis- -Menten Menten
Em 1925,
G.E.Briggs e
James Haldane
modificaram a
teoria que conduz
deduo da
equao de
Michaelis-Menten
(mas no a sua
forma final!)
introduzindo o
conceito de estado
estacionrio
3.3.2. A modificao de Briggs-Haldane
Estado pr-estacionrio
d[ES] / dt ~ 0 [ES] ~ constante
O conceito de estado estacionrio universal
v
1
v
2
Estado estacionrio
(Quando v
1
= v
2
)
Na forma mais simples da deduo de Briggs e Haldane,
assume-se que o complexo enzima substrato s
formado a partir da enzima+substrato, mas no da
enzima mais produto
k
-2
v
0
= k
2
[ES]
Ento, da mesma forma,
Mas, segundo Briggs e Haldane, no h um equilbrio
E + S ES, mas um estado estacionrio para ES,
quando as suas velocidades de formao e
decomposio forem iguais
Velocidade de formao Velocidade de decomposio
[E] = [E]
T
- [ES] k
1
[E] [S] = k
-1
[ES] + k
2
[ES]
k
1
([E]
T
- [ES]) [S] = k
-1
[ES] + k
2
[ES]
k
1
[E]
T
[S] - k
1
[ES] [S] = k
-1
[ES] + k
2
[ES]
k
1
[E]
T
[S] = k
-1
[ES] + k
2
[ES] + k
1
[ES] [S]
k
1
[E]
T
[S] = [ES] ( k
-1
+ k
2
+ k
1
[S] )
k
1
[E]
T
[S]
k
-1
+ k
2
+ k
1
[S]
= [ES]
k
1
[E]
T
[S]
k
-1
+ k
2
= [ES]
k
1
+ [S]
[E]
T
[S]
= [ES]
k
-1
+ k
2
k
1
+ [S]
= K
M
K
M
v
0
= k
2
[ES]
Equa Equa o de o de
Michaelis Michaelis- -Menten Menten
v
0
=
K
M
+ [S]
k
2
[E]
T
[S] V
max
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
[S] << K
M
[S] >> K
M
K
M
+ [S] ~ K
M
K
M
+ [S] ~ [S]
v
0
=
K
M
V
max
[S]
Cintica de 1 ordem
v
0
= V
max
Cintica de ordem zero
Velocidade m
Velocidade m

xima
xima
A velocidade mxima o limite de velocidade
de actuao da enzima e uma medida do seu
turnover.
O seu valor depende:
do pH, temperatura, inibidores, etc
da quantidade de enzima presente
Por isso, pode por vezes ser usada como uma medida da
quantidade de enzima presente
V
max
= k
cat
[E]
T
V
max
= k
cat
[E]
T
k
cat
= V
max
/ [E]
T
N N mero de mero de turnover turnover
Constante de
Constante de
Michaelis
Michaelis
-
-
Menten
Menten
K
M
=
[ES]
[E] [S]
=
k
-1
k
1
Segundo Michaelis-Menten
k
-1
+ k
2
k
1
K
M
=
Segundo Briggs-Haldane
k
-1
>> k
2
Quanto menor o K
M
, mais
extensa seria a extenso do
equilbrio no sentido de ES
logo, maior seria a
afinidade da enzima pelo
substrato!
J no uma medida real da
afinidade, mas da estabilidade
de ES podem-se obter K
M
elevados se a transformao em
produto for eficiente
S se podem comparar enzimas
da mesma famlia ou que
catalisem o mesmo substrato!
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
[S] = K
M
v
0
=
2
V
max
Ao contrrio da V
max
, o K
M
no depende da quantidade
de enzima presente
O K
M
igual concentrao de substrato, [S], para a
qual a enzima atinge metade da sua velocidade mxima
(ou para a qual metade dos centros activos esto
ocupados)
Constitui assim uma medida da concentrao de substrato
necessria para que ocorra uma actividade significativa
Para muitas enzimas, o K
M
uma aproximao da
concentrao de substrato in vivo
Eficincia catal
Eficincia catal

tica
tica
Quando [S] >> K
M
, a eficincia pode ser medida pelo
nmero de turnover, k
cat
Para [S] mais baixas, a eficincia cataltica melhor
caracterizada pela razo entre k
cat
e K
M
Eficincia = Eficincia =
K
M
k
cat
K
M
V
max
(quando k
cat
no conhecido
mas [E
T
] mantida constante )
3.3.3. Transformaes lineares das equaes cinticas
K
M
Os parmetros KM
e Vmax podem ser
determinados
graficamente
atravs dos dados
experimentais
A curva
hiperblica de
Michaelis-Menten
pode ser
directamente
usada, mas s
com a ajuda de
programas de
computador
Contudo, o uso manual requer a linearizao
da equao de Michaelis-Menten.
Equa
Equa

o de
o de
Lineweaver
Lineweaver
-
-
Burk
Burk
Equa
Equa

o de
o de
Hanes
Hanes
-
-
Woolf
Woolf
x [S]
Equa
Equa

o de
o de
Eadie
Eadie
-
-
Hofstee
Hofstee
v(KM+ [S]) = Vmax[S]
vKM+ v[S] = Vmax[S]
(v/[S]) KM + v = Vmax
v = -KM ( v/[S]) + Vmax
Nem todas as linearizaes respondem de igual forma
s variaes dos dados
Michaelis-Menten
Lineweaver-Burk
Hanes-Woolf
Eadie-Hofstee
3.3.3. Reaces com dois ou mais substratos
A anlise cintica do estado estacionrio no permite
estabelecer um mecanismo de catlise no ambguo
A equao de Michaelis-Menten pode tornar-se mais complexa
quando o mecanismo difere do pressuposto inicial
_V
f
max
[S]_ _ _V
r
max[
P]_
K
M
S
K
M
P
v =
1 + _[S]_ + _ [P]_
K
M
S
K
M
P
E + S ES E + P
E + S ES EP E + P
Contudo, quando todas as condies excepto uma se
mantm constantes, todas as equaes se transformam
na equao simples de Michaelis-Menten
Uma das alteraes mais importantes ocorre quando a
enzima possui dois ou mais substratos
uma situao que acontece em mais de 60% das reaces
bioqumicas.
As cinticas, mais complexas, tornam-se mais simples quando
todos excepto um dos substratos so mantidos em
concentraes saturantes
Os dois substratos podem formar um complexo ternrio,
EAB, com a enzima
De uma forma ordenada
De uma forma aleatria
Os dois substratos podem formar apenas complexos
binrios, EA e EB
Com forma Com forma o de complexo tern o de complexo tern rio rio
Reaco sequencial ordenada
Reaco sequencial aleatria
= + + +
1
v
1
V
max
V
max
[A] V
max
[B] V
max
[A][B]
K
M
A
K
M
B
K
M
A
K
M
B
= + + +
1
v
1
V
max
V
max
K
S
B
[A] V
max
[B] V
max
[A][B]
K
S
A
K
M
B
K
M
B
K
S
A
K
M
B
Sem forma Sem forma o de complexo tern o de complexo tern rio rio
Reaco de Ping-Pong
= + +
1
v
1
V
max
V
max
[A] V
max
[B]
K
M
A
K
M
B
3. Cintica Enzimtica
3.4. Inibio enzimtica
3.4.1. Inibies irreversveis
As inibies irreversveis podem ocorrer
quando:
A enzima irreversivelmente desnaturada p.ex.,
por calor ou pH
Quando h uma associao irreversvel entre uma
molcula o inibidor e a enzima. Inibidores
irreversveis podem ser subdivididos em:
Inibidores especficos de grupos funcionais
Anlogos de substratos
Inibidores suicidas
Uma inibio irreversvel afecta a V
max
porque
afecta directamente a [E
T
], mas no afecta o K
M
Inibidores espec Inibidores espec ficos de grupos funcionais ficos de grupos funcionais
quimotripsina
Os inibidores
especficos de grupos
funcionais reagem com
grupos radicais
especficos de
aminiocidos,
formando uma ligao
covalente estvel
Por exemplo, o
diisopropilfosfofluoridrato
(DIPF) reage com o
grupo lcool de serina
acessveis, que se
pertencerem ao centro
activo da enzima levam
sua inactivao
irreversvel
An An logos de substratos logos de substratos
Os inibidores anlogos so molculas estruturalmente
semelhantes ao substrato que modificam
covalentemente a enzima.
So, por isso, mais especficos para o local anterior do que os
inibidores de grupos funcionais
Inibidores suicidas Inibidores suicidas
Os inibidores suicidas (ou inibidores baseados no
mecanismo) so substratos modificados que permitem
meios mais especficos de actuao, j que se baseiam
no mecanismo de actuao da enzima, e no tanto da
sua especificidade de reconhecimento
So relativamente inertes enquanto molculas qumicas
Ligam-se especificamente ao local activo de uma enzima
So metabolizados por essa enzima at um intermedirio
extremamente reactivo que se combina irreversivelmente com a
enzima
3.4.2. Inibies reversveis
K
I
=
[EI]
[E] [I]
K
I
=
[ESI]
[ES] [I]
K
I
0 a inibio irreversvel
K
I
no h inibio
Inibi Inibi o competitiva o competitiva
Numa inibio competitiva, o inibidor s se liga enzima
livre
O inibidor diminui a [ES], com o efeito aparente da diminuio
da afinidade da enzima pelo substrato logo, o K
M
aumenta
O aumento da [S] desloca o equilbrio no sentido do aumento de
ES e da diminuio de EI, pelo que a elevadas [S], a V
max
aparente ser a mesma
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
Devido semelhana com
os reais, os parmetros K
M
e V
max
obtidos com a
inibio so aparentes
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
= 1 +
K
I
[ I ]
o grau de inibio:
se [ I ] > 0 ento > 1
Curva aparente
Deduo a partir
dos valores reais
K
M
= K
M
K
M
aumenta
V
max
= V
max
V
max
igual

Lineweaver-Burk da
inibio competitiva
Os inibidores
competitivos so
normalmente
anlogos estruturais
dos substratos
substrato
inibidor
Inibi Inibi o o incompetitiva incompetitiva
Numa inibio incompetitiva, o inibidor s se liga
enzima com substrato
O inibidor estabiliza a ligao ES, com o efeito aparente do
aumento da afinidade da enzima pelo substrato logo, o K
M
diminui
O inibidor diminui a [ES], pelo que a V
max
diminui
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
Curva aparente
Deduo a partir
dos valores reais
K
M
= K
M
/ K
M
diminui
V
max
= V
max
/ V
max
diminui
Lineweaver-Burk da
inibio incompetitiva

Reaco sequencial ordenada
I
I
Inibidores incompetitivos so inibidores
competitivos de segundos substratos
substrato B que sigam reaces
sequenciais ordenadas!
Inibi Inibi o o no no- -competitiva competitiva
Numa inibio no-competitiva, o inibidor no afecta a
ligao da enzima ao substrato
O inibidor no afecta a afinidade da enzima pelo substrato
logo, o K
M
mantm-se
O inibidor diminui a [ES], pelo que a V
max
diminui
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
Curva aparente
Deduo a partir
dos valores reais
K
M
= K
M
K
M
igual
V
max
= V
max
/ V
max
diminui
Lineweaver-Burk da
inibio no competitiva

Reaco sequencial aleatria
Inibidores no-competitivos so
inibidores competitivos de segundos
substratos substrato B que sigam
reaces sequenciais aleatrias!
I I
I I
Inibi Inibi o mista o mista
A inibio mista
difere da inibio
no-competitiva
porque afecta a
afinidade da
enzima pelo
substrato,
embora no
impea a ligao
deste
Numa inibio mista, o inibidor liga-se enzima com ou
sem substrato, mas afecta a ligao deste enzima
O inibidor normalmente diminui a afinidade da enzima pelo
substrato logo, o K
M
aumenta
O inibidor diminui a [ES], pelo que a V
max
diminui
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
v
0
=
K
M
+ [S]
V
max
[S]
Curva aparente
Deduo a partir
dos valores reais
K
M
= K
M
/ K
M
aumenta (porque > )
V
max
= V
max
/ V
max
diminui
Lineweaver-Burk da
inibio mista

3. Cintica Enzimtica
3.5. Alosterismo e cooperatividade
3.5.1. Moduladores alostreos
Ligandos so molculas que se ligam reversivelmente a
protenas:
A ligao ocorre em locais especficos da protena, ditos stios
de ligao
A ligao implica normalmente uma alterao conformacional da
protena, que geralmente permite uma melhor associao ao
ligando trata-se assim de uma interaco alostrea
Numa protena com vrias subunidades quaternria a
mudana de conformao numa das subunidades geralmente
afecta a forma das outras subunidades
Podem ser qualquer tipo de molculas, incluindo outras
protenas
Substratos
Inibidores
Moduladores / efectores / modificadores
Moduladores so assim ligandos alostreos cuja ligao
ao seu stio especfico stio alostreo vai influenciar
a ligao de outro ligando num outro local da protena
apresentam cooperatividade
Se ambos os ligandos so idnticos, tem-se um efeito
homotrpico
Se ambos os ligando so diferentes, tem-se um efeito
heterotrpico
Se a afinidade do ligando protena aumenta por efeito do
modulador, tem-se um efeito positivo (+), e o modulador
considerado um activador apresenta cooperatividade positiva
Se a afinidade do ligando protena diminui por efeito do
modulador, tem-se um efeito negativo (-), e o modulador
considerado um inibidor - apresenta cooperatividade negativa
Inibidores alostreos no so inibidores incompetitivos
ou no competitivos
Em consequncia das interaces entre os stios activos
e os stios alostreos, uma enzima com comportamento
alostreo apresenta tipicamente uma cintica sigmoidal
A quase totalidade das
enzimas com
comportamento
alostreo so
protenas quaternrias,
embora teoricamente
pudessem existir
enzimas alostreas
monomricas.
Nestas enzimas,
no se pode falar de
K
M
, mas sim de K
0,5
,
como sendo o valor
de [S] para o qual
v = V
max
Normalmente, as enzimas alostereas dividem-se em
duas classes, baseadas no efeito do modulador sobre o
K
0,5
ou sobre a V
max
Classe K Classe V
-
+
3.5.2. A equao de Hill
Archibald Hill, Nobel Medicina 1922
Em 1911, Hill procurou
explicar a cooperatividade
observada na ligao do O
2
hemoglobina assumindo
uma cooperatividade infinita
na ligao de n ligandos
protena
E + n S ES
n
K =
[ES
n
]
[E] [S]
n
Ys =
([E] [S]
n
) / K
E + n S ES
n
Ys =
[E] + [ES
n
]
[ES
n
]
[E
T
]
[ES
n
]
=
[E] + ([E] [S]
n
) / K
Ys =
K + [S]
n
[S]
n
Equa Equa o de o de Hill Hill
V
max
v
Ys =
K + [S]
n
[S]
n
1-Ys = 1-
K + [S]
n
[S]
n
=
K + [S]
n
K
=
K
[S]
n
1-Ys
Ys
Lineariza Lineariza o o da equa da equa o de o de Hill Hill
1-Ys
Ys
= n log [S] log K log
Linearizao da equao de Hill
V
max
- v
v
log [Ys/(1-Ys)]
n
- log K
log [S]
(log K) / n
1-Ys
Ys
= n log [S] log K log
Numa cooperatividade
infinita, n o nmero de
subunidade da enzima e
o grfico apresenta uma
recta
Contudo, a
cooperatividade infinita
uma impossibilidade
fsica, pelo que o grfico
nunca uma recta!
Ainda assim, o
parmetro n a
constante de Hill -
representa o grau de
cooperatividade da
enzima
n = 1 no coop.
n > 1 coop. positiva
n < 1 coop. negativa
Mioglobina Mioglobina e Hemoglobina e Hemoglobina
Presso venosa Presso arterial
0,40
0,25
A mioglobina est saturada, a hemoglobina no
O rendimento da
hemoglobina
maior com um
comportamento
alostreo do que
com um
comportamento
hiperblico
1-Y
O
2
Y
O
2
= n log pO
2
log K log
K=30 K=0,3
Gr Gr fico de fico de Hill Hill
A hemoglobina tem um
comportamento no
cooperativo na entrada
do primeiro e do ltimo
oxignio
Contudo, tem afinidades
diferentes para cada
oxignio (K= 0,3 30)
Na meia saturao, a
cooperatividade muito
elevada, mas no
infinita (3,0 < 4)
Valores menores que
2,8 indiciam patologias
3.5.2. A equao de Adair
Em 1924, Adair modificou a teoria de Hill assumindo
que a ligao do ligando protena sequencial
E + S ES
ES + S ES
2
ES
2
+ S ES
3
ES
3
+ S ES
4

K
1
= [E] [S] / [ES] = k
1
K
2
= [ES] [S] / [ES
2
] = 2/3 k
2
K
3
= [ES
2
] [S] / [ES
3
] = 3/2 k
3
K
4
= [ES
3
] [S] / [ES
4
] = 4 k
4
Constantes
macroscpicas
ou aparentes
Constantes
microscpicas
ou intrnsecas
ES
2
ES + S
K
2
=
[ES
2
]
[ES] [S]
= +
[ES
2
*] = 2 [ES
2
]
= + [ES*] = 3 [ES] +
1
k
2
=
[ES
2
*]
[ES*] [S]
=
3 [ES
2
]
2 [ES] [S]
= 2/3 K
2
Ys =
k
1
[S]
+
k
1
k
2
3 [S]
2
+
k
1
k
2
k
3
3 [S]
3
+
k
1
k
2
k
3
k
4
[S]
4
k
1
4 [S]
+
k
1
k
2
6 [S]
2
+
k
1
k
2
k
3
4 [S]
3
+
k
1
k
2
k
3
k
4
[S]
4
1 +
Equa Equa o de o de Adair Adair (para a hemoglobina (para a hemoglobina ) )
k
1
= 8,8 torr
k
2
= 6,1 torr
k
3
= 0,85 torr
k
4
= 0,25 torr
Valores para a hemoglobina:
3.5.3. Modelo de simetria de Monod-Wyman-Changeau
Jacques Monod, Nobel Medicina 1965
Em 1965, Jacques Monod,
Jeffries Wyman e Jean-Pierre
Changeux apresentaram um
modelo que procurava
explicar como que a ligao
de ligandos a uma subunidade
afectava a afinidade da
ligao a outras subunidades
o Modelo de Simetria
De facto, a equao de Adair
no permite compreender
porque as constantes intrnsecas
diferem entre si apenas
constata que o so
O modelo parte de quatro pressupostos
1. As protenas so constitudas por subunidades simetricamente relacionadas
Aspartato transcarbomoilase
2. Cada subunidade pode existir em dois estados conformacionais que esto
em equilbrio entre si
3. A simetria mantida durante a mudana conformacional, pelo que uma
protena no pode possuir em simultneo subunidades em estados
conformacionais diferentes
4. O ligando pode ligar-se a qualquer um dos estados, mas os estados
possuem diferentes afinidades pelo ligando
Convencionalmente, o substrato liga-se preferencialmente ao estado R
Modelo de simetria (ou concertado)
T T
R R
L =
[R]
[T]
Se L >> 1, o estado T muito favorvel
c =
k
T
k
R
Se c << 1, o substrato liga-se preferencialmente a R
A equao deduzida :
Ys =
(1+ )
n-1
+ Lc (1+ c)
n-1
(1+ )
n
+ L (1+ c)
n
=
k
R
[S]
a [S] normalizada
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10 12

Y
s
L=1
L=10
L=100
L=1000
L=10000
Efeito do L
c = 0
Com c=0, o ligando s se liga ao estado relaxado, R
A adio do ligando fora a passagem de T a R, o que favorece a ligao
do segundo ligando efeito cooperativo
A cooperatividade tanto maior quanto maior for L quantas mais
molculas de enzima estiverem inicialmente na forma tensa, T
Se a enzima preferir a forma R L baixo a cooperatividade pode
perder-se, e a enzima pode apresentar um comportamento hiperblico
Com L=1000, a enzima est preferencialmente no estado tenso, T
A cooperatividade tanto maior quanto menor for c quanto mais difcil for
molcula ligar-se forma T da enzima, maior o efeito cooperativo
Se molcula se permitir a ligao forma T c aumenta a
cooperatividade pode perder-se, e a enzima pode apresentar um
comportamento hiperblico
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 2 4 6 8 10 12

Y
s
c=0
c=0,04
c=0,10
L = 1000
Efeito do c
Efeito de activadores e inibidores
O activador estabiliza o estado R, enquanto o inibidor estabiliza o estado T
Em consequncia, o inibidor aumenta o
efeito cooperativo, enquanto o activador o
atenua, podendo mesmo conduzir a
enzima a um comportamento hiperblico
Na hemoglobina, o 2,3-BPG um
inibidor, mas a sua presena
necessria para o correcto
funcionamento fisiolgico da protena
3.5.4. Modelo sequencial de Koshland-Nemeth-Filmen
Daniel Koshland
Em 1966, Daniel Koshland,
Nemeth e Filmen apresentaram
um novo modelo para explicar
o comportamento alostreo de
enzimas, baseado no modelo
de encaixe induzido o Modelo
de Sequencial
De facto, o modelo sequencial no
explica por exemplo, a existncia
de efeitos homotrpicos
negativos, nem a existncia de
conformaes hbridas o modelo
sequencial tem o seu principio
baseado no modelo de chave-e-
fechadura deFischer
No modelo sequencial, a ligao de um ligando a uma subunidade produz
uma mudana conformacional nessa subunidade que se propaga a
subunidades vizinhas.
Modelo sequencial
Se a mudana induzir um aumento da cooperatividade, o efeito positivo
Se a mudana induzir uma diminuio da cooperatividade, o efeito
negativo
A induo depende do grau da ligao mecnica entre as subunidades
Se as ligaes forem muito fortes, as alteraes podem ser concertadas,
aproximando-se o efeito do modelo de simetria
Se as ligaes forem muito fracas, as alteraes no se propagam e a enzima
comporta-se como uma enzima hiperblica
O modelo permite uma racionalizao fsica para as constantes de
dissociao microscpicas da equao de Adair, ao contrrio do modelo de
simetria, mais prximo do conceito de Hill
O modelo
sequencial , de
certo modo, uma
extenso do
modelo
concertado, no
sentido em que
permite a
existncia dos
estados
intermedirios