S. Sol, T. Pedro, H. Ferreira, C. M. P.

Rodrigues
Centro de Patognese Molecular
Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa
Av. das Foras Armadas
1600-083 Lisboa

Editado por Rui Gomes e Cristina Bastos

Conceitos gerais
A apoptose ou morte celular programada um acontecimento comum,
tanto em situaes patolgicas, contribuindo para fenmenos de
inflamao e de disfuno orgnica, como em situaes fisiolgicas, no
decurso de processos de embriognese e metamorfose.
As caspases so proteases que desempenham um papel central na
apoptose e, consequentemente, constituem alvos farmacologicamente
atractivos para a inibio e/ou potenciao da apoptose.
A activao das caspases durante a apoptose ocorre por um de dois
mecanismos: i) activao de receptores de morte celular; ii) perturbao
mitocondrial.
A inibio da apoptose poder ajudar a combater doenas inflamatrias,
do tipo agudo ou crnico, enquanto que a induo da apoptose em clulas
T auto-reactivas, poder proteger de doenas auto-imunes. Por fim, a
induo selectiva da apoptose em clulas malignas constituir uma
estratgia excelente para o tratamento de doenas cancergenas.

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A nica certeza da vida a morte! De facto, os mecanismos fisiolgicos de morte celular so

essenciais como estratgia defensiva para remover clulas mutadas ou infectadas, como reposta a
fenmenos de citotoxicidade ou, ainda, para um desenvolvimento embrionrio normal. Nesta
batalha entre a vida e a morte, a remoo de clulas indesejveis nos organismos multicelulares
ocorre por um de dois processos

a necrose ou a apoptose

ou, mesmo por ambos. Se no passado

os especialistas acreditavam que estes processos ocorriam independentemente um do outro, so

agora reconhecidos como co-existindo em muitas situaes de sade ou de doena, sendo por vezes
difcil dissoci-los. Esta dificuldade emergiu no s porque existem algumas caractersticas comuns
aos dois tipos de morte celular, mas tambm porque frequente a ocorrncia de necrose e apoptose,
em simultneo, na mesma clula. Torna-se, por isso, muitas vezes ambguo e problemtico
distinguir com exactido estes dois processos, apesar da existncia de algumas caractersticas
morfolgicas e bioqumicas diferenciadoras (Tabela 1).

Tabela 1 Caractersticas morfolgicas, bioqumicas e fisiolgicas que distinguem a necrose da apoptose

Caractersticas

NECROSE
Perda da integridade membranar
Lise total da clula

Morfolgicas

No h formao de vesculas
Desintegrao dos organitos celulares

APOPTOSE
No h perda da integridade membranar
Agregao e marginalizao da cromatina
Diminuio do volume citoplasmtico e condensao
do ncleo
Fragmentao da clula em corpos apoptticos
Aumento da permeabilidade mitocondrial
Processo altamente regulado, envolvendo activao

Perda da regulao da homeostasia inica

Bioqumicas

No requer energia
Digesto aleatria do DNA

enzimtica
Dependente de ATP
Digesto no aleatria do DNA
Libertao de vrios factores mitocondriais
Activao da cascata de caspases
Alteraes na assimetria da membrana plasmtica

Fisiolgicas

Afecta grupos de clulas

Afecta clulas individuais

Iniciada por estmulos no fisiolgicos

Induzida por estmulos fisiolgicos

Fagocitose por macrfagos

Fagocitose por clulas adjacentes ou por macrfagos

Resposta inflamatria

Sem resposta inflamatria

Necrose ou apoptose: quando e porqu?

De um modo geral, a necrose ocorre quando existe um colapso da homeostasia celular, isto ,
sempre que a clula sofre variaes extremas das suas condies fisiolgicas, como a hipotermia ou
a hipxia, sendo acompanhada por lise da membrana celular e subsequente libertao de
componentes intracelulares para o exterior. Como consequncia deste processo catastrfico, a
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necrose provoca quase sempre inflamao. Pelo contrrio, a apoptose um processo de morte
celular activo, mas silencioso, que ocorre em condies fisiolgicas, de resposta a uma variedade de
estmulos fisiolgicos ou patolgicos e em que a clula participa na sua prpria destruio.
Normalmente, como no h perda da integridade membranar, a apoptose no acompanhada de
reaces inflamatrias drsticas.
A apoptose , assim, a forma mais generalizada de morte celular, com especial relevncia para
o perodo de desenvolvimento embrionrio, onde participa activamente nos processos de
organognese e de involuo. Est, tambm, envolvida em processos de metamorfose relacionados
com metaplasias, em quadros de alterao hormonal, como na menopausa, envolvendo clulas
endometriais, nos tumores em fase de regresso ou de intensa proliferao e em muitas doenas
virais. Por exemplo, quando ocorrem leses no DNA, que podem no s interromper o
desenvolvimento embrionrio como ainda induzir a transformao de clulas normais, os nveis de
expresso da protena p53, indutora de apoptose e, por isso, anti-tumoral, so imediatamente
aumentados, desencadeando a eliminao das clulas lesadas. No entanto, e apesar do seu
importante papel, a apoptose em nveis elevados pode ser tambm responsvel pelo aparecimento
de inmeras situaes patolgicas, como a colestase, as doenas neurodegenerativas, o enfarte de
miocrdio e o envelhecimento precoce, entre outras. Pelo contrrio, a apoptose muito reduzida em
doenas auto-imunes e no cancro. Este tipo de morte celular exige, por isso, um processo de
regulao muito fino, onde o destino de viabilidade ou de morte determinado pelo balano entre
as protenas anti e pro-apoptticas. A percentagem de erro na regulao da apoptose dever ser,
ento, igual a zero, para que a clula no siga o caminho indesejado.

Como decorre o processo apopttico?

A apoptose, por vezes tambm designada de morte celular programada, caracteriza-se pela
ocorrncia de vrias alteraes morfolgicas nas clulas afectadas, nomeadamente ao nvel da
simetria dos folhetos fosfolipdicos da membrana, condensao e agregao da cromatina e
fragmentao nuclear, terminando com a formao de corpos apoptticos. Estas alteraes
morfolgicas so o reflexo de uma sucesso de acontecimentos bioqumicos que culminaram na
activao de uma famlia de proteases de cistena, conhecidas como caspases, as quais possuem
especificidade para resduos de cido asprtico. As caspases, uma vez activadas, clivam uma
variedade de protenas e substratos importantes para a viabilidade celular, numa funo considerada
de execuo, sendo as proteases envolvidas designadas de caspases executoras.

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As caspases residem na clula sob pro-formas inactivas, sendo, na maioria dos casos,
activadas por clivagem proteoltica. Esta activao consiste na remoo do pro-domnio aminoterminal e na clivagem do polipptido restante, resultando numa subunidade grande e numa
subunidade pequena, que constituiro a enzima funcional. A via maioritria de activao das
caspases executoras processa-se segundo a aco de outras proteases, designadas de caspases
iniciadoras, requerendo estas a ajuda de protenas adaptadoras, as quais se ligam aos motivos de
interaco proteica localizados ao nvel dos pro-domnios. A ligao do adaptador promove, assim,
a activao das caspases iniciadoras que, de seguida, podem clivar e activar as caspases
executoras. As molculas adaptadoras estabelecem, deste modo, a ponte entre os eventos de
sinalizao e a activao das caspases, definindo duas vias gerais para a apoptose

a via

mitocondrial e a via dos receptores de morte (ver Figura 1 e Caixa).

Estmulo apopttico
(ligando)
Receptor de morte

Estmulo apopttico
Membrana plasmtica

Bax

Bcl-2 ou Bcl-xL

Adaptador
Mitocndria

Pro-caspase-8

Clivagem da Bid
Citocromo c
Caspase-8

Apaf-1

Caspase-9

Pro-caspase-9

Pro-caspase-3

Caspase-3
Clivagem da polimerase
poli(ADP-ribose)

Apoptose

Figura 1 Apoptose mediada pela via mitocondrial, pela via dos receptores de morte ou, ainda, pela
convergncia de ambas.

Exemplos de doenas que resultam de elevados nveis de apoptose

Doenas Hepticas
Numa grande variedade de doenas hepticas, como os carcinomas ou as doenas virais e
imunolgicas, foram observadas alteraes morfolgicas e bioqumicas caractersticas de um
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processo de morte celular por apoptose. Parece, tambm, claro que a acumulao de cidos biliares
hidrfobos no interior do hepatocito poder desempenhar um papel central nas leses hepticas
durante a colestase, a qual ocorre em muitas doenas hepticas crnicas incluindo a cirrose biliar
primria, a obstruo maligna e iatrognica dos ductos biliares e a atrsia biliar.
A toxicidade induzida pelos cidos biliares hidrfobos foi durante muito tempo caracterizada
pelo aumento de volume do hepatocito, destruio da membrana plasmtica e libertao dos
constituintes celulares, tendo tal poder citotxico sido atribudo capacidade detergente daqueles
compostos. Hoje, acredita-se que os cidos biliares hidrfobos, essenciais para a absoro intestinal
de gorduras, so tambm capazes de induzir a morte celular por apoptose no tecido heptico in vivo,
bem como em culturas primrias de hepatocitos de rato e em linhas celulares de hepatoma humano.
A induo da apoptose pelos cidos biliares hidrfobos parece envolver a libertao de
citocromo c, como resultado de stress oxidativo, o qual por sua vez aumenta a actividade de
caspases especficas, resultando na fragmentao de DNA. Esta activao das capases pode, ainda,
estar associada induo da protease cistena catepsina B, que tem um papel importante como
enzima efectora durante a apoptose. Foi tambm recentemente descrita uma via dependente da
activao do Fas, onde os cidos biliares hidrfobos parecem actuar como indutores importantes.
Contrariamente aco txica dos cidos biliares hidrfobos, o cido ursodeosoxiclico um forte
inibidor da apoptose, por prevenir a libertao mitocondrial de citocromo c, inibindo a subsequente
activao das caspases e a clivagem da polimerase poli-(ADP-ribose).
A famlia de protenas Bcl-2 tambm expressa no fgado. A este nvel, a Bcl-2 capaz de
inibir a apoptose por prevenir a oxidao dos constituintes celulares como o DNA, para alm de
impedir a maturao e libertao de corpos apoptticos suprimindo a activao das caspases. Por
outro lado, a protena Bax pode ligar-se ao megaporo de transio da permeabilidade mitocondrial,
juntamente com o translocador do nucletido adenina, aumentando a permeabilidade da membrana
da mitocndria e desencadeando a morte celular.
Doenas Neurodegenerativas
A morte prematura de clulas neuronais tem sido muitas vezes associada ao aparecimento de
doenas neurodegenerativas, como as doenas de Alzheimer, de Parkinson e de Huntington. No
crebro de um doente de Alzheimer encontram-se mltiplas placas senis, que contm um ncleo de
substncia amilide predominantemente constitudo pelo pptido -amilide, rodeado por clulas
mortas. Segundo muitos investigadores, a deposio de

-amilide no crebro desencadeia a

apoptose por activao de uma caspase iniciadora, conduzindo leso cerebral que est na
origem dos sinais e sintomas da doena. Na doena de Parkinson, por outro lado, ocorre um
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decrscimo progressivo do nmero de clulas que constituem uma estrutura nervosa designada por
substncia negra e que produzem dopamina. Estas clulas morrem naturalmente em todas as
pessoas, mas terminam o seu ciclo de vida a um ritmo muito mais acelerado nos doentes
parkinsnicos, manifestando-se a doena quando apenas restam 20% das clulas iniciais. Muitos
investigadores constataram que a doena de Parkinson tambm est associada a elevados nveis de
apoptose, onde o stress oxidativo e a mitocndria parecem estar envolvidos. Esta doena pode, em
alguns casos, ser hereditria ou pode, ainda, ser o resultado da aco txica de substncias que
existem no ambiente e que entram na composio de colas, tintas, petrleos, entre outros. Esta
ltima convico assenta na descoberta do xenobitico MPTP, com uma estrutura semelhante ao
paraquat presente nos herbicidas e pesticidas, o qual provoca, quer in vitro quer in vivo, morte
celular por apoptose e sintomas semelhante aos da doena de Parkinson. Por ltimo, na doena de
Huntington ocorre uma perda progressiva de neurnios especficos na regio do estriado, com
correspondente decrscimo das capacidades motoras e cognitivas do indivduo. Neste caso a
sequncia expandida de poliglutamina presente na protena huntingtina, sintetizada pelos doentes,
que parece induzir alteraes mitocondriais, stress oxidativo e apoptose, responsveis pela
patognese da doena. A fragmentao do DNA tambm tem sido observada nas clulas do estriado
destes doentes sugerindo, novamente, que os elevados nveis de apoptose podero estar na origem
da doena. Por outro lado, a administrao a ratos de cido 3-nitropropinico provoca apoptose no
estriado, induzindo alteraes neuroqumicas e anatmicas caractersticas da doena de Huntington.
Utilizando este modelo animal tem sido possvel demonstrar o envolvimento da mitocndria no
processo apopttico desencadeado na doena de Huntington.

Qual a estratgia a seguir para controlar nveis desajustados de apoptose?

Actualmente, existem vrios estudos em curso na rea da apoptose, cujo objectivo a
identificao de molculas alvo sobre as quais se dever actuar farmacologicamente, no sentido de
impedir o processo de doena. Uma das ideias ser a de utilizar os antagonistas dos receptores de
morte, assim como os inibidores de capases, na expectativa de prevenir a apoptose em doenas
inflamatrias ou destrutivas. Pela sua pequena toxicidade e pelas propriedades inibidoras da
apoptose que apresenta, o cido ursodesoxiclico a que acima nos referimos, poder ser um meio
teraputico poderoso no tratamento de doenas hepticas, neurodegenerativas ou outras, cuja
patognese esteja associada a elevados nveis de apoptose. Outra via de investigao diz respeito
potenciao da apoptose em clulas cancerosas, por recurso a ligandos dos receptores de morte,
bem como a inibidores da expresso de protenas anti-apoptticas. Assim, este mecanismo de morte
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celular, em primeira instncia considerado anti-natura, poder tambm ser utilizado pelo
organismo para impedir o crescimento de clulas que se tornaram imortais.

Apoptose mediada pela via mitocondrial

A via mitocondrial envolve membros pro-apoptticos da famlia Bcl-2 e, mais precisamente, elementos da sub-famlia BH3
(Figura 1). Estas protenas, que incluem a Bid, a Bim, a Harakiri, a Noxa, entre outras, possuem apenas um dos domnios de
homologia (o BH 3) caractersticos da famlia Bcl-2. Em resposta a um estmulo, comprometem um outro conjunto de membros proapoptticos, a sub-famlia da Bax, que inclui a Bax, a Bak e, provavelmente, a Bok, que normalmente se encontram fracamente
associados membrana externa da mitocndria, prevalecendo maioritariamente no citosol. A interaco entre protenas das subfamlias BH3 e Bax leva oligomerizao dos elementos do ltimo grupo, seguida de insero na membrana externa da
mitocndria. Estas molculas passam, ento, a constituir canais de sada de protenas intermembranares desde a mitocndria at
ao citoplasma, incluindo o citocromo c e o factor indutor da apoptose. O citocromo c, uma vez libertado, activa uma protena
citoplasmtica designada de Apaf-1, a qual recruta e activa a pro-caspase-9, constituindo um complexo proteico denominado de
apoptossoma. A caspase-9, na sua funo de caspase iniciadora, ir requerer e activar a caspase-3 executora, a qual
degradar protenas importantes para a viabilidade celular e, tambm, outras caspases.
As protenas Bcl-2 e Bcl-XL, membros anti-apoptticos da famlia Bcl-2, bloqueiam a morte celular por prevenirem a libertao
das protenas intermembranares da mitocndria. No entanto, uma vez ultrapassada a fase de morte celular que envolve este
organito, as protenas anti-apoptticas deixam de ter qualquer efeito na inibio da apoptose. As protenas pro-apoptticas e as
anti-apoptticas pertencentes famlia Bcl-2, podem interactuar entre si atravs dos domnios de homologia BH, formando homo e
heterodmeros e regular, assim, reciprocamente, as suas funes. Por outro lado, a funo das caspases executoras tambm
pode ser modulada por um outro tipo de protenas, as IAPs (inhibitor of apoptosis proteins), que se podem ligar caspase-9 e inibir
a sua actividade de protease, bloqueando a este nvel o processo apopttico. Contudo, tambm a actividade destas protenas pode
ser regulada por uma outra protena de nome duplo Smac/DIABLO, a qual, juntamente com o citocromo c, libertada do espao
intermembranar da mitocndria durante a apoptose. A Smac/DIABLO associa-se s IAPs e inibe a sua aco, permitindo a
activao da caspase-9 a partir do complexo Apaf-1 e, consequentemente, favorecendo a apoptose.

Apoptose mediada pela via dos receptores de morte

Paralelamente via mitocondrial, ocorre tambm a via dos receptores de morte, que vo desencadear a activao das
caspases a partir de diferentes tipos de apoptossomas (Figura 1). Existem muitos receptores de morte, sendo os mais conhecidos,
o receptor para o factor de necrose tumoral, o receptor para o ligando Fas/CD95 e, ainda, o receptor DR3. Esta via exige, sempre,
que um determinado ligando interaja com o seu receptor atravs de protenas adaptadoras, como por exemplo a protena FADD
(Fas associated death domain). Estas protenas adaptadoras requerem a presena de pro-caspases, em particular a pro-caspases8 e a pro-caspase-10, que quando clivadas activam as caspases executoras, podendo ocorrer a apoptose. Na via mediada pelos
receptores de morte, a activao das caspases tambm pode ser inibida pelas IAPs.

Convergncia das duas vias

Apesar da via dos receptores de morte no exigir o envolvimento da famlia de protenas Bcl-2 ou da mitocndria, alguns
investigadores apontam para que a Bcl-2 possa inibir a apoptose desencadeada por receptores de morte. O mecanismo ligado
sinalizao do receptor de morte e via de inibio pela Bcl-2 surgiu com a descoberta da clivagem da protena Bid pela caspase8 a qual, por sua vez, activada a partir dos receptores de morte. Neste mecanismo, a forma truncada de Bid (tBid), que constitui a
sua forma activa, direcciona-se para a membrana mitocondrial externa, constituindo ela prpria um poro e, simultaneamente,
desencadeia a oligomerizao de Bax, permitindo tambm a sua insero na membrana externa da mitocndria. A protena Bax,
tal como a Bid, pode formar um poro permevel a factores intermembranares. A via maioritria de apoptose ir, ento, depender
no s do tipo celular, como tambm do estmulo apopttico, observando-se, muitas vezes simultaneamente, diferentes vias
apoptticas na mesma clula .

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Bibliografia geral
Beal MF. 2000. Energetics in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 23, 298-304.
Green DR, Reed JC. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science 281, 1309 12.
Green DR. 2000. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell 102: 1 4.
Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging
implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26, 239 57.
Mehmet H. 2000. Caspases find a new place to hide. Nature 403, 29 30.
Patel T, Roberts LR, Jones BA, Gores GJ. 1998. Dysregulation of apoptosis as a mechanism of liver disease:
an overview. Semin. Liver Dis. 18, 105 14.
Rodrigues CMP, Steer CJ. 1999. Bile acids and hepatocyte apoptosis: living/leaving life in the Fas lane.
Gastroenterology 117, 732 6.
Rodrigues CMP, Steer CJ. 2000. Mitochondrial membrane perturbations in cholestasis. J. Hepatol. 32,
135 41.

Bibliografia especfica
Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. 2000. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome cdependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102, 33 42.
Eskes R, Desagher S, Antonsson B, Martinou JC. 2000. Bid induces the oligomerization and insertion of Bax
into the outer mitochondrial membrane. Mol. Cell Biol. 20, 929 35.
Rodrigues CMP, Fan G, Ma X, Kren BT, Steer CJ. 1998. A novel role for ursodeoxycholic acid in inhibiting
apoptosis by modulating mitochondrial membrane perturbation. J. Clin. Invest. 101, 2790 9.
Rodrigues CMP, Linehan-Stieers C, Keene CD, Ma X, Kren BT, Low WC, Steer CJ. 2000.
Tauroursodeoxycholic acid partially prevents apoptosis induced by 3-nitropropionic acid: evidence for a
mitochondrial pathway independent of the permeability transition. J. Neurochem. 75, 2368 79.
Rodrigues CMP, Ma X, Linehan-Stieers C, Fan G, Kren BT, Steer CJ. 1999. Ursodeoxycholic acid prevents
cytochrome c release in apoptosis by inhibiting mitochondrial membrane depolarization and channel
formation. Cell Death Differ. 6, 842 54.
Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, Debatin KM, Krammer PH, Peter ME.
1998. Two CD95 (Apo-1/Fas) signaling pathways. EMBO J. 17, 1675 87.

Biologias, 2, Fevereiro de 2001

Biologias http://www.ordembiologos/Biologias/N2.html

Verhagen A, Ekert PG, Pakusch M, Silke J, Connolly LM, Reid GE, Moritz RL, Simpson RJ, Vaux DL.
2000. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and
antagonizing IAP proteins. Cell 102, 43 53.

Biologias, 2, Fevereiro de 2001