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DESEMPENHO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DE FUNGOS PRESENTES EM
AMBIENTES DE PRODUÇÃO DE ALIMENTOS

MÁRCIO ADRIANI GAVA

Dissertação apresentada à Escola Superior
Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo, para obtenção
do título de Mestre em Ciências, Área de
Concentração: Microbiologia Agrícola.

PIRACICABA
Estado de São Paulo - Brasil
Fevereiro - 2002

DESEMPENHO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA
UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DE FUNGOS PRESENTES EM
AMBIENTES DE PRODUÇÃO DE ALIMENTOS

MÁRCIO ADRIANI GAVA
Biólogo

Orientador: Prof. Dr. CLÁUDIO ROSA GALLO

Dissertação apresentada à Escola Superior
Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo, para obtenção
do título de Mestre em Ciências, Área de
Concentração: Microbiologia Agrícola.

PIRACICABA
Estado de São Paulo - Brasil
Fevereiro – 2002

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP

Gava, Márcio Adriani
Desempenho de diferentes meios de cultura utilizando na avaliação de
fungos presentes em ambientes de produção de alimentos / Márcio
Adriani Gava. - - Piracicaba, 2002.
50 p. : il.
Dissertação (mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, 2002.
Bibliografia.
1. Contaminação de alimento 2. Meio ambiente 3. Microbiologia de
alimentos 4. Processamento de alimento I. Título
CDD 614.3

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

Aos Professores Dr. Márcia Regina de Camargo Ranzani pelo apoio laboratorial e sugestões. Luiz Eduardo Gutierrez. Cláudio Rosa Gallo pela orientação. . À Engenheira Florestal Izabel Christina Gava de Souza pela colaboração nas análises estatísticas e sugestões. Dra Marília Oetterer e Dra Silene Bruder Sarmento pelas correções e sugestões. A todos que de uma forma ou de outra contribuíram na realização deste trabalho. À BIOAGRI LABORATÓRIOS LTDA pelo financiamento da pesquisa. Ao Marcos Favarim no auxílio na coleta de amostras. À Dra. apoio e ensinamentos. À Camila Frutoso no auxílio laboratorial.AGRADECIMENTOS Ao Professor Dr.

.................................….......................................2..….......1 Identificação dos fungos presentes............................................................…………………….......... 17 3................2.....................................2 Avaliação dos meios de cultivo e identificação dos fungos fungos patogênicos e toxigênicos e estudo de bactérias...............2...............................................................................2 Incubação..........................................………………………………..1 Amostrador microbiológico de ar... 4 2..................................... 11 3..................... 12 3..............2...... xii 1 INTRODUÇÃO.2 Métodos para avaliar a qualidade do ar................. 11 3..2.......SUMÁRIO Página LISTA DE QUADROS ........1........................ 18 3........................................................................... 4 2....................................... iv RESUMO ......………………........................................................ 9 3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................... 19 ......5............ v SUMMARY.............................2 Meios de Cultura................................ 1 2 REVISÃO DE LITERATURA..1 Material.....................1.................5 Avaliação qualitativa dos resultados ......2............ 16 3.......5........……….......3 Contagem de unidades formadoras de colônias de fungos e bactérias.............2......................... 18 3......2 Métodos..........................…. 17 3..1 Qualidade microbiológica do ar em ambientes interiores............. 11 3............................................................. 16 3..............4 Avaliação estatística dos resultados de contagem........1 Coleta das amostras. 18 3..........................................

.........v 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................ 27 4............................................................ 37 4................... 40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......4 Avaliação ambiental das instalações amostradas... 20 4................... 20 4......3 Avaliação da contagem total de bactérias...................................................................................................................................................... 47 ..............................2 Avaliação qualitativa ......... 38 5 CONCLUSÕES .......................................................................................1 Avaliação quantitativa........... 42 APÊNDICES..........

................ nos ambientes de empacotamento e de produção de embutidos...................................... nos ambientes de produção de doce de leite e de amendoim....................................... 26 5 Unidades formadoras de colônias/m3 (valores médios de cinco repetições) nos meios Sabourand............ 26 .............. em diferentes meios de cultura envolvendo todos os ambientes e épocas de coleta.......................... nos ambientes de produção de doce de leite e de amendoim.................... 22 2 Unidades formadoras de colônias/m3 (valores médios) em diferentes meios de cultura... de nos ambientes de cultura DRBC e empacotamento e de produção de embutidos...................... de fungos........................... 23 3 Contagem em ufc/m3....... 24 4 Unidades formadoras de colônias/m3 (valores médios de cinco repetições) nos meios de cultura DRBC e Sabourand...............LISTA DE QUADROS Página 1 Unidades formadoras de colônias/m3 (valores médios) em diferentes meios de cultura.........................................

.......................................... 34 13 Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus flavus ao longo do período de incubação................................................................................................... 33 11 Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus fumigatus ao longo do período de incubação......................... 29 8 Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente empacotamento de embutidos.. 31 10 Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus parasiticus ao longo do período de incubação.......................................... 34 14 Diâmetro e cor das colônias de Fusarium verticulloides ao longo do período de incubação............ 28 7 Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produção de amendoim....................................................................................vii 6 Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produção de doce de leite...... 35 15 Diâmetro e cor das colônias de Fusarium moniliforme ao longo do período de incubação............. 33 12 Diâmetro e cor das colônia de Aspergillus niger ao longo do período de incubação......................... 30 9 Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produção de embutidos......... 35 .............................................................................................

............... 36 17 Diâmetro e cor das colônias de Histoplasma capsulatum ao longo do período de incubação.. 37 19 Correção estatística “Feller”............................................................................................................................... 48 ....viii 16 Diâmetro e cor das colônias de Stachybotrys chartarum ao longo do período de incubação................................ 36 18 Unidades formadoras de colônias/m3 (valores médios) de bactérias nos diferentes ambientes amostrados (médias de três repetições)......................................................................

O ambiente de duas áreas foi utilizado para a pesquisa. Batata Dextrose Ágar (BDA) e “Oxytetracycline Glucose Yeast . outra. “Dichloran 18% Glycerol Ágar” (DG 18).CLÁUDIO ROSA GALLO RESUMO O presente estudo foi dividido em duas fases. “Sabouraud Dextrose a 4% Ágar”. na Região de Piracicaba (SP). Os meios de cultura utilizados foram: “Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Ágar” (DRBC). a primeira visou avaliar o desempenho de diversos meios de cultura.Dr. “Malt Extract Agar – Yeast and Molds” (MEAYM). através da resposta de contagem e identificação dos gêneros que podem conter espécies indesejáveis.DESEMPENHO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DE FUNGOS PRESENTES EM AMBIENTES DE PRODUÇÃO DE ALIMENTOS Autor: MÁRCIO ADRIANI GAVA Orientador: Prof. para fungos. produção de doce de leite e doce de amendoim. “Malt Ágar” (MA). uma indústria de embutidos. na Cidade de Ribeirão Preto (SP) e. também foi avaliada a condição ambiental juntamente com a contagem total de bactérias. uma indústria de doces. no ar de ambientes de produção de alimentos. nos setores de empacotamento e produção. “Plate Count Ágar-Cloranfenicol” (PCA-Cloranfenicol).

“Sabouraud Dextrose a 4% Ágar” selecionados da primeira fase. Fusarium verticulloides. Aspergillus niger. para a contagem de bactérias foi utilizado o meio “Plate Count Agar” (PCA). Aspergillus parasiticus.x Agar” (OGY). A segunda fase do projeto avaliou os meios de cultura “Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Ágar” (DRBC). sendo necessária a elaboração de um padrão referencial para o monitoramento da indústria alimentícia em nosso país. que permaneceram os mesmos da primeira fase. No geral foi observado um número elevado de unidades formadoras de colônias de fungos e bactérias/m3 durante as amostragens. O meio de Extrato de Malte diferenciou estatisticamente dos demais e teve o menor desempenho para a quantificação desses microrganismos no ar. foram. Novas coletas foram realizadas amostrando cinco repetições em cada um dos pontos. com exceção do PCA- Cloranfenicol que apresentou baixa diversidade de gêneros. sendo considerado reprovado. Fusarium moniliforme. a 28ºC. De acordo com os resultados obtidos. para servir de parâmetro de comparação com as coletas de ar realizadas no mesmo período. Cada um dos pontos foi amostrado em triplicata utilizando um amostrador de impactação linear. a fim de se verificar se algum desses fungos indesejáveis estaria presente nas amostras de ar. Histoplasma capsulatum e Stachybotrys chartarum. apresentando um maior número de unidades formadoras de colônias/m3. melhores que os demais meios testados. inoculando os dois meios selecionados e avaliando o desenvolvimento desses fungos ao longo do período de incubação de sete dias. estatisticamente. Aspergillus fumigatus. Em paralelo foram utilizadas culturas puras de Aspergillus flavus. A avaliação quali-quantitativa dos ambientes estudados sugere que esses não se encontram em condições adequadas. A recomendação do melhor meio para identificação de fungos no ar de indústrias alimentícias não foi conclusiva. os meios DRBC e Sabouraud Dextrose a 4% Ágar. O amostrador utilizado nas coletas .

por ser um equipamento que permite calibração em seu sistema de aspiração de ar.xi promoveu rapidez nas coletas e proporcionou a expressão dos resultados em medidas confiáveis. .

through the results of counting and identifying genders that may contain undesirable species. an industry which produces sweets made from milk or peanuts. The present work took place in two different places. in Ribeirao Preto city (SP) and. “Plate Count Agar – Chloramphenicol Chloramphenicol)”. “Potato and . “Malt Extract Agar – Yeast and Molds (MEAYM)”.PERFORMANCE OF DIFFERENT CULTURE MEDIA USED IN THE EVALUATION OF FUNGI FOUND IN FOOD PRODUCTION ENVIRONMENTS Author: MÁRCIO ADRIANI GAVA Adviser: Prof.Dr. The culture media used were: “Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)”. ”Sabouraud Dextrose 4% Agar (MA)”. The first one aimed at evaluating the performance of different culture media for fungi found in the air of food production environments. in the packing and production sections of a meat encased products industry located in Piracicaba region (SP). The environmental condition was also evaluated along with a total bacteria counting. Dextrose “Dichloran 18% Glycerol Agar Agar (BDA)” (PCA- (DG 18)”.CLÁUDIO ROSA GALLO SUMMARY The present study consisted of two phases.

The Malt Extract medium was statistically different from the others and showed the worse performance as to the quantification of microorganisms present in the air. The development of these fungi was evaluated throughout a 7-day-incubation period. Fusarium verticulloides. New sample collections (five replicates) were carried out for each of the spots selected. Histoplasma capsulatum and Stachybotrys chartarum were employed to inoculate the two selected media. In a parallel manner. There was no conclusive recommendation as to the best medium for the identification of fungi found in the air of food industries. The qualitative-quantitative evaluation of the environments studied suggests that they do not present adequate conditions. at 28ºC. evidencing the need for the establishment of a referential standard in order to monitor food industries in our country. selected during the first phase of this study: “Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC)” and “Sabouraud Dextrose 4% Agar”. The medium used for the bacteria counting was “Plate Count Agar (PCA)”. The second phase of this project evaluated the following culture media. Aspergillus parasiticus. According to the results obtained. a high number of fungi and bacteria colony forming units/m3 was observed during the sampling procedures. Fusarium moniliforme. In general. The sampled spots were the same for both phases. Three replicates of each sampled spot were obtained by using a linear impacting sampler. The sampler used in this work allowed a quick sample . except for PCA-Chloramphenicol. to function as a comparative reference for the air samples obtained in the same period in order to verify if any of these undesirable fungi was present in the air samples. presenting a higher number of colony forming units/m3.xiii “Oxytetracycline Glucose Yeast Agar (OGY)”. which showed low diversity of genders and was discarded. Aspergillus niger. DRBC and Sabouraud Dextrose 4% Agar media were statistically superior than the others. pure cultures of Aspergillus flavus. Aspergillus fumigatus.

xiv collection and a reliable expression of results. . as this equipment enables the calibration of its air intake system.

Considerando a preocupação mundial com a qualidade do ar de ambientes climatizados e a ampla e crescente utilização de sistemas de ar condicionado no país. bem como. estabeleceu critérios para monitoramento sobre a qualidade do ar interior em ambientes climatizados artificialmente. Ministro Sérgio Motta. o seu monitoramento. Ágar Batata Dextrose ou outro. despertou discussão sobre o assunto. o Ministério da Saúde propõe.1 INTRODUÇÃO A contaminação microbiológica do ar tem sido pouco enfatizada na comunidade científica brasileira. e métodos analíticos. e indicado os seguintes meios de cultivo: Ágar Extrato de Malte. além de recomendações para controle. química e física. que sejam determinados padrões de qualidade do ar em ambientes climatizados. definindo a identificação das fontes poluentes de natureza biológica. em abril de 1998. a Resolução RE n o 176 de 24 de outubro de 2000. Para coleta foi adotado um amostrador de ar de impactação com acelerador linear. Para padrões biológicos é estabelecido um limite máximo de 750 unidades formadoras de colônias por m3 (ufc/m3) para fungos. presentes no ar de seu gabinete. desde que não ocorram espécies patogênicas e toxigênicas. em função das condições climáticas. .523/GM de 28 de agosto de 1998. desde que cientificamente validado. Ágar Sabouraud Dextrose a 4%. O falecimento do Sr. Recentemente. uma vez que se suspeitou de infecção generalizada induzida por microrganismos de risco à saúde. através da portaria n0 3.

bactérias e outros microrganismos. A preocupação com a sanidade dos alimentos tem sido cada vez mais colocada em destaque. sarampo. significativamente. varicela e outras doenças. relata que a contaminação microbiológica. umidificadores e desumidificadores podem promover o crescimento de fungos. verifica-se uma média normal de 5 a 10 dias/ano de restrição de atividade per capita. em ambientes interiores de edifícios. como lotação e recirculação de ar podem. devida à infecções agudas e episódios alérgicos. aparelhos de ar condicionado. Alguns fatores referentes à arquitetura das edificações. Além de reações de irritações e alergias aos ocupantes. também. que na população em geral. . A manipulação de alimentos em ambientes sem controle dos contaminantes pode se tornar potencial de risco. Componentes dos sistemas de ventilação como torres de refrigeração. promover a dissiminação de patógenos pelo ar. podem interferir na qualidade do produto final. nos casos de ambientes de manipulação de alimentos. Relata. com o controle dos contaminantes. o que poderia ocasionar interpretações distintas das condições de um mesmo ambiente. os quais poderiam ser reduzidos. ainda. A World Health Organization (1988) discutindo sobre a qualidade do ar de ambiente interno.2 Observa-se que em termos de meios de cultura indicados a resolução é inconsistente. é tida como responsável substancial nas faltas ao trabalho. devido à contaminação propagar-se através dos produtos. quando emitidos pelos ocupantes que sofrem de tuberculose. Estudos quanto à comparação dos meios de cultura recomendados para contagem e identificação de fungos citados acima e outros meios de importância tornam-se necessários. pelo fato de não haver uma especificação de um meio padrão. Estes microrganismos podem atingir patamares elevados de crescimento quando o ambiente proporciona condições de umidade e temperatura ideais.

as condições ambientais onde ocorre a manipulação de alimentos nas indústrias. em relação à resposta de contagem e identificação dos gêneros que podem conter espécies indesejáveis. esta pesquisa visa contribuir para o controle de contaminantes microbiológicos do ar na área alimentícia. . incluindo os meios recomendados pela Resolução do Ministério da Saúde. Os objetivos desta pesquisa foram: a) aferir o desempenho de diversos meios de cultura para o crescimento de fungos. tendo como produtosbase derivados do leite. do amendoim e embutidos cárneos da indústria frigorífica.3 Baseado em especificações de monitoramento de áreas comuns. b) expressar dentro de um campo amostral.

apresentando-se em curva .2 REVISÃO DE LITERATURA 2. o número de pessoas que ocupam o ambiente. Lacaz (1970) cita que. ar De desempenham acordo com papel importante Feldman (1995). Segundo Pelczar et al. em 1924. Van Leewen estudou as relações clínicas entre asma e clima na Holanda. Kulcsar Neto & Siqueira (1998) citam os microrganismos como cohabitantes. Como componentes biológicos do ar em ambientes internos. tais como as taxas de ventilação. como um elementos programa de monitoramento para contaminantes do ar como poeira.1 Qualidade microbiológica do ar em ambientes interiores Os efeitos na saúde associados aos microrganismos presentes nos ambientes interiores têm mostrado a necessidade de monitoramento do ar de interiores e motivado as pesquisas de métodos de detecção e identificação de microrganismos. (1981) o grau de contaminação do ar interno é influenciado por fatores. atribuindo grande importância etiológica aos esporos de fungos e bactérias do ar como agentes extrínsecos causadores da chamada “asma climática”. esporos de Aspergillus fumigatus e endotoxinas pode ser um instrumento valioso na saúde pública e ambiental. O autor revisando sobre os contaminantes biológicos do ar verificou que numerosos fungos na poeira e no alergizantes. aclimatados artificialmente. a natureza e o grau de atividade exercida por esses indivíduos.

os autores recomendam a adoção de parâmetros qualitativos e quantitativos que permitam uma interpretação científica sobre a qualidade do ar de ambientes interiores e a correta tomada de decisão quanto à intervenção. e de aureus. Neisseria Actinomyces thermophilia. Bacillus sp. mais especificamente. Pseudomonas aeruginosa. levando à perda de concentração. Flavobacterium sp. Kulcsar Neto & Siqueira (1998) citam que os padrões referenciais para analisar os resultados de qualidade microbiológica do ar de interiores são classificados em relativos. Segundo Padrão Referencial Brasileiro Microbiológico (1998). como: Mycobacterium pneumoniae e Paracoccidioides brasiliensis. Staphylococcus meningitidis. irritação e sensação de secura nas membranas dos olhos. Streptococcus fungos. qualitativos/quantitativos e ocupacionais. Segundo Brickus & Aquino Neto (1999) a baixa qualidade do ar de interiores tem sido relacionada com efeitos adversos à saúde humana.5 exponencial de crescimento. como: Legionella pneumophila. Os autores mostram que há prevalência de bactérias. letargia e cansaço generalizado. qualitativos. Cladosporium sp e Fusarium sp. quantitativos. com relação a sistemas de ar condicionado. Histoplasma capsulatum. Penicillium sp. ventilação e aquecimento. Os sintomas decorrentes da síndrome podem estar ligados a poluentes de origem química ou biológica. desidratação e irritação da pele. dor de cabeça. irritação e secura na garganta. que têm permanência prolongada nestes ambientes. o Conselho Científico da Brasindoor (Sociedade Brasileira de Meio Ambiente . Aspergillus sp. Com base nesta extensa revisão e considerando a necessidade de serem implantados procedimentos que visem minimizar o risco potencial à saúde dos ocupantes. Cephalosporium sp. tuberculosis. sendo eles: irritação e obstrução nasal. levando a Organização Mundial de Saúde (OMS) a classificar a Síndrome do Edifício Doente (SED) como um problema de saúde pública.

6 e de Qualidade do Ar de Interiores) aprovou. materiais de isolação acústica e fibra de vidro térmica usados no aquecimento.5. O valor máximo relativo é dado pela seguinte expressão: Ar ambiental Interior(I) = Ar ambiental Exterior(E). ciclohexano. Acremonium obclavatum e Cladosporium herbarum produziu odores voláteis. e benzeno.5. c)Relativo: Classificação dos ambientes dentro dos valores máximos aceitáveis. o seguinte referencial brasileiro para ambientes: a) Qualitativo: não são admitidos nos ambientes interiores: -Fungos - Histoplasma Paracoccidioides capsulatum. principalmente Aspergillus versicolor. o ciclohexano e 2-etil hexanol são conhecidos como irritantes dos olhos e da pele. Este estudo demonstrou que fungos nos sistemas de aquecimento.5-2. b) Ambientes em regulares condições I/E = 1. fumigatus. A mistura de fungos. incluindo 2-etil hexanol. em laboratório. então os ambientes são classificados em: a) Ambientes em boas condições I/E < 1. e c) Ambiente em más condições I/E > 2. -Bactérias – Legionella pneumophila b)Quantitativo: Valor Máximo Aceitável=750ufc/m3 de ar. Stachybotrys atra e Fusarium moniliforme. brasiliensis. neoformans. Macneil et al. Aspergillus Cryptococcus parasiticus.1. ventilação e sistemas de ar condicionados.(1994) colonizaram com fungo. ventilação e ar condicionado podem desempenhar um papel significativo nos problemas de saúde nos ocupantes de edifícios com essas características.0.0. o benzeno é classificado como um composto químico perigoso pela “Environmental Protection Agency e “Occupational Safety and Health Administration”.(1995) revisam métodos moleculares na detecção de fungos e bactérias comuns no ar de interiores. em 1998. Ezeonu et al. Segundo os autores as técnicas moleculares para detecção e identificação de bactérias estão . Segundo o autor. A. flavus. A.

(1996) estudaram a presença de fungos no ar interno de doze escolas na Espanha durante dois anos. efeito da fumigação na redução de fungos. Poucos estudos sobre o monitoramento microbiológico do ambiente de indústrias alimentícias têm sido observados na literatura. efeito de desinfetantes aerossóis nos microrganismos transportados pelo ar nos ambientes fechados. Dos 91 gêneros identificados. Das colônias isoladas 38% pertenciam a patogênicos capazes de causar infecções ou doenças de hipersensibilidade. a qual foi mais abundante entre os meses de abril e outubro. Angulo-Romero et al. os mais freqüentes foram Alternaria. pois vários gêneros comuns no ar de interiores não são detectados por essas técnicas. .7 desenvolvidas e disponíveis para uma variedade de espécies. Para a detecção e identificação de fungos tem sido tratada com limites. Foram avaliados: o efeito da limpeza das mãos e utensílios na carga microbiológica nas superfícies de trabalho. nível de higiene do ar em ambientes críticos como enchimento estéril e empacotamento de yogurt. Aspergillus e várias espécies de Penicillium. Foram utilizados o amostrador de ar “SAS” e o método Agar contact plate. e efeito da variação da umidade relativa na qualidade microbiana do ar. Foram coletadas 456 amostras usando um aspirador de pó e analisadas para cultura de fungos. Os autores observaram que. para obter melhores resultados é importante que os empregados tenham boa vontade e entendam as razões dos procedimentos específicos de higiene. Ligugnana e Fung (1990) desenvolveram um programa de amostragem para mostrar o impacto das atividades dos trabalhadores e da higiene do local na qualidade microbiana do ar e superfícies no ambiente de trabalho na indústria de alimentos. Os autores observaram também que a maioria destes fungos apresentou variações sazonais na concentração. detecção de microrganismos específicos pelo meio seletivo.

Kurata (1994) cita que a qualidade do ar em áreas de empacotamento é um fator crítico no processamento de alimentos deterioráveis e. e os meios de cultura agar HS (rose bengal agar) e DG18 (dichloran 18% glycerol). O autor propõe a seguinte classificação para a qualidade do ar em áreas de processamento e empacotamento de alimentos de acordo com o número de unidades formadoras de colônias de fungos (ufc/m3): Categoria ufc/m3 I . entretanto. o que torna estudos em nossas condições ambientais indispensáveis. O trabalho de Kurata (1994) define padrões que podem servir de base para elaboração de padrões nacionais. métodos de monitoramento do ar deverão ser estabelecidos com limites apropriados de níveis viáveis de microrganismos. portanto.50 III .100 IV – condição ruim do ambiente interior > 100 Padrões brasileiros para qualidade microbiológica do ambiente de indústrias alimentícias não existem em legislação.condição microbiológica sub-limpa 11 .8 Sveum et al (1992) citam que o ar ambiente em áreas de empacotamento de alimentos é tido como um ponto crítico de controle. devemos considerar nossas condições ambientais tropicais. Os amostradores do ar são “Brotest RCS” e o “RCS Plus”. . O autor apresenta um plano de monitoramento de microrganismos transportados pelo ar em ambientes interiores de empacotamento na indústria alimentícia.condição microbiológica limpa 0 .10 II .condição normal do ambiente interior 51 .

meio de cultura utilizado e a identificação dos fungos. os mais utilizados são os de sedimentação e impactação em superfícies sólidas. os autores ressaltam que a amostragem volumétrica do ar. Entretanto. micotoxinas e outros materiais biológicos. Já o método de impactação. impactação em superfícies sólidas. tempo de permanência dos esporos no ar entre as coletas. ressalta que os métodos de amostragem para pólen. centrifugação e precipitação eletrostática (Pelczar et al. . quando comparada com outros métodos quantitativos. muitos trabalhos têm sido publicados sobre a presença de fungos no ar de interiores e relatam o número de “unidades formadores de colônias” (cfu/m3 de ar). Fusarium e Penicillium. Os métodos de sedimentação possuem várias desvantagens. através de um equipamento de impactação. Este fato permanece nos dias atuais. Pitt & Hocking (1997) citam que o método mais simples para amostragem do ar é o da sedimentação.. alguns relatam sobre gêneros e poucos sobre a identificação de espécies. incluindo a quantificação de microrganismos no ar. Sveum et al. no que se refere à qualidade do ar de ambiente interno. com baixa correlação. Dentre estes. bactérias específicas e vírus estão próximos da padronização. possibilitando a quantificação por m3. é um indicador mais confiável da qualidade do ar. o número de partículas viáveis/m3 de ar.. Os microrganismos viáveis do ar podem ser determinados por uma série de métodos como: sedimentação. especialmente de gêneros mais complexos como Aspergillus.9 2. filtração. o que não ocorre para fungos. A World Health Organization (1988). 1981. 1992). Os autores ressaltam que atenção insuficiente tem sido dada com relação ao desempenho do amostrador.2 Métodos para avaliar a qualidade do ar Segundo Flannigan & Miller (1994). ou seja. permite que sejam coletados volumes conhecidos de amostras.

A importância do método de amostragem. Quantidades conhecidas de esporos de Penicillium chrysogenum foram produzidas e inoculadas em uma área fechada. é que o mesmo permita reduzir ao mínimo as variáveis da coleta. chrysogenum. Buttner & Stetzenbach (1993). Dentre os métodos mais utilizados o de impactação proporciona coletas pontuais e rápidas com volumes definidos. seguido de coletas com diferentes equipamentos impactadores. como: volume amostrado e tempo de coleta. como: “Andersen six –stage”. conduziram um experimento em laboratório para determinar a recuperação desses microrganismos utilizando um marcador biológico como controle. “Burkart” e “Depositional”. Os amostradores “Andersen” e “Burkard” recuperaram o mais alto número de esporos comparados com a medida padrão de P. elevando a confiança dos dados obtidos. seja para buscar padrões ambientais ou selecionar meios de cultivo. . “Surface Air System”.10 Visando estabelecer padronização na amostragem de microrganismos transportados pelo ar.

50. A escolha esteve em função da contaminação esperada nos ambientes estudados. 200. sendo que a maioria das coletas foi efetuada em 250L. níveis de volumes de amostras de ar pré-definidos: 10. níveis de volumes de amostras de ar usados nas coletas: variaram de 100 a 500L. .5%. que aspira o ar através de uma placa perfurada. 500. Características do equipamento: taxa nominal do fluxo de ar = 100 L/min ± 2. o volume de ágar na placa de Petri ou variação no diâmetro da mesma. atinge diretamente a superfície de uma placa de Petri de 90 mm. 250. De qualquer forma.1 Amostrador microbiológico de ar Empregou-se um amostrador microbiológico de ar da marca MERCK denominado MAS-100 (Figura 1). 100. que contém as partículas presentes no ar ambiente. um instrumento do tipo impactador. 20. que após o ciclo de coleta ter-se completado é incubada e as colônias são contadas e expressas como unidades formadoras de colônias (ufc/m3). 750 e 1000 litros.1. O equipamento compensa para os fatores que podem interferir no fluxo de ar escolhido tais como. O ar aspirado.1 Material 3. as coletas por amostrador de ar tipo impactador não devem exceder 10 minutos sob pena de secagem do meio de cultura.3 MATERIAL E MÉTODOS 3.

...... propiciam a detecção de outros propágulos de fungos e leveduras....................5 mL Dicloran (2...............6-dicloro-4-nitroanilina) (solução 0.......................................... 1997) Glicose....................10...........2 Meios de Cultura Os meios de cultura foram elaborados conforme especificado a seguir: A) “Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar” (DRBC) (Food and drug administration........ efetivamente.....0..... esfriado em banho maria a 50ºC e distribuído em placa (15 a 20 mL por placa) sob condições assépticas....1 g Água destilada................ monobásico.......... p/v)..1 L Ágar..............5...................... O DRBC é um meio especialmente indicado para analisar amostras contendo fungos que se espalham como Mucor e Rhyzopus...................................................0 mL Cloranfenicol........1....6 Os ingredientes foram misturados............. Pitt & Hocking....................................................1................ heptahidratado.........................................................12 3. 1998.......p/v................0 g Peptona Bacteriológica............0 g pH final 5...............0 g Fosfato de Potássio......5 g Rosa bengala (solução 5%..... pois...................... em etanol)........ ............. completando o volume para 1000mL e esterilizado em autoclave a 121ºC por 15 minutos...................0 g Sulfato de Magnésio........................... diminuem o crescimento dos fungos de crescimento rápido e.........................2%............. que têm menor taxa de crescimento.0......................15........... o meio foi aquecido até dissolução do ágar..........1......0............... o dichloran e a rosa bengala.....

...................................... resfriado e adicionado de 100 mg de cloranfenicol por .........0 g Sulfato de magnésio heptahidratado.........................................................................0 g Ágar................ Foi submetido a resfriamento a 50ºC e distribuído em placas de Petri sob condições assépticas......220........................ 1997) Triptona........15......... Adicionou-se 220 g de glicerol e o meio foi esterilizado a 121ºC por 15 min.... 1997) Glicerol...5..............10...0 g Glicose…................ Pitt & Hocking................................................................0 g Cloranfenicol.................................................. C) “Plate Count Agar” (PCA) (Food and drug administration.1.....5 g Dextrose.0 g Fosfato de potássio monobásico...................... p/v..................................0 ± 0..... em etanol).1..................... Pitt & Hocking....................0 g Água destilada........13 B) “Dichloran 18% Glycerol Agar” (DG18) (Food and drug administration.......................... 1998....................... 1998................5...............................................................................................................................................1 L pH final 5.....................0..1 g Água destilada..............2......................................................1 L pH final 7............................................................................................................................................................................0........….1...... A baixa atividade de água desse meio reduz interferência de bactérias e fungos de crescimento rápido...................5 g Dicloran (0....................6 Os ingredientes acima foram misturados e fervidos até dissolução do ágar.....2 Os ingredientes foram dissolvidos e o meio aquecido até dissolução do ágar...............0 g Peptona.2%.........................................................................................................0 mL Ágar.............................. e em seguida o volume acertado para 1000 mL com água destilada.................................................0 g Extrato de levedura.................15.....................................

........ fervidos para dissolução do ágar e o meio foi esterilizado a 121ºC por 15 minutos................................................................................ fervidos para dissolução do ágar e o meio foi esterilizado a 121ºC por 15 minutos........... 1998...........................20...................................................... sem antibiótico para contagem de bactérias mesófilas aeróbias. Pitt & Hocking.......................0 g Glicose........................................................ Em seguida foi autoclavado a 121ºC por 15 minutos...20. e.................... D) “Malt Agar” (MA) (Food and drug administration...........20.................. Em seguida foi esfriado a 50ºC e distribuído em placas de Petri sob condições assépticas......................20..1 L pH final 5........ 1997) Extrato de malte...... .......... 1998...................4 Os ingredientes foram misturados...............Yeast and Molds” (MEAYM) (Food and drug administration............................................. 1997) Extrato de malte............................................0 g Ágar........... Em seguida foi resfriado a 50ºC e distribuído em placas de Petri sob condições assépticas............ resfriado a 50ºC e distribuído em placas de Petri sob condições assépticas.............0 g Água destilada.................. em pó................... E) “Malt Extract Agar . (Esse meio é recomendado para Aspergillus e Penicillium)..... para detecção de fungos e leveduras............. em pó...........................1 L Os ingredientes foram misturados..14 litro..........................................0 g Peptona................0 g Água destilada............................................20.. Pitt & Hocking.................1.....0 g Ágar......................

..............10.........0 g Ágar.....................................................0 g Água destilada....... H) “Oxytetracycline Glucose Yeast Agar” (OGY) (Pitt & Hocking..........20..............5..........................0 g Extrato de Levedura...........0 – 4........20..................................................................................15........ .....................0 g Água destilada.............15...0 g Dextrose.........................1 L Os ingredientes foram misturados............................................................ foi adicionado de 10 mL de oxitetraciclina esterilizada por filtração e....................1 L pH final 5......1 L pH final 4......5 ± 0............................................ 1997) Glucose........................20..................................15 F) “Batata Dextrose Agar” (BDA) (Food and drug administration...........0 g Ágar.............0 g Água destilada............ Esfriado a 50ºC........................................ 1998)..................................... 1997) Infusão de batata.....................................0 g Ágar.....40.... a fim de se obter pH 4.....6 ± 0..........2 Meio normalmente indicado no cultivo e identificação de fungos patogênicos (Lacaz et al............................................................... Após esterilização foi adicionado cerca de 1 mL de solução de ácido tartárico a 10%......... fervidos para dissolução do ágar e o meio foi esterilizado a 121ºC por 15 minutos.................... em seguida distribuído em placas de Petri sob condições assépticas............. G) “Sabouraud Dextrose a 4% Agar” (Food and drug administration........................................................... Pitt & Hocking.................................2 O meio foi preparado e esterilizado conforme indicação do fabricante.......................................... 1998) Polipeptona ou neopeptona.. para cada 100 mL de meio....4............. 1998......................................................................................0-4.........0 g Dextrose.........................5.............................................................................

3.1 Coleta das Amostras A amostragem foi realizada em dois locais distintos de processamento de alimentos. flavus. Stachybotrys atra e Fusarium moniliforme. A primeira fase propôs avaliar o desempenho dos meios de cultura. Também foi avaliada a presença de bactérias totais mesófilas aeróbias. Cryptococcus neoformans e Paracoccidiodes brasiliensis. através de parâmetros utilizados para a escolha de um meio potencialmente melhor. A.2 Métodos A metodologia descrita está distribuída em duas fases de execução. De acordo com Padrão Referencial Brasileiro Microbiológico (1998). Em paralelo foi avaliado nesses meios o crescimento de algumas espécies patogênicas e toxigênicas durante a fase de incubação estipulada de cinco a sete dias. entre os fungos patogênicos não admitidos nos ambientes estão: Histoplasma capsulatum. fornecer dados para uma possível relação com o desenvolvimento de fungos nos meios estudados. Entre os fungos toxigênicos não admitidos nos ambientes estão: Aspergillus fumigatus. ainda. parasiticus. visando conhecer as condições do ambiente em relação a esse grupo de microrganismos e. A segunda fase foi realizada utilizando os dois meios estatisticamente eleitos como os melhores.2. a ser utilizado na enumeração total e a presença de interferentes (fungos de crescimento rápido). a saber: indústria de doces (produção de doce de leite e de doce de amendoim) e frigorífico (empacotamento e produção de embutidos cárneos).16 3. Na primeira fase foram realizadas . A. em Plate Count Agar (PCA).

17 coletas periódicas em diferentes épocas: indústria de doces entre maio de 2000 e janeiro de 2001. frigorífico entre setembro de 2000 e janeiro de 2001. 3. Coletou-se de cada ambiente três placas para cada meio de cultura mencionado no item 3. Já na segunda fase foram realizadas coletas entre junho e julho de 2001 nos mesmos locais da primeira fase.1.2. em seguida calculou-se o número de ufc/m3. O método de correção estatística baseia-se no seguinte princípio: quanto maior a quantidade de microrganismos em cada amostragem.2.2. 3. as placas foram incubadas em estufa tipo BOD. Para a contagem total de fungos e a avaliação do crescimento de espécies toxigênicas e patogênicas empregou-se a temperatura de 28±1ºC por cinco a sete dias.). Foi utilizada uma tabela de conversão para cálculo. .2 Incubação Após as coletas. na contagem total de bactérias mesófilas a temperatura de 36±1ºC por 24-48 horas. maior a probabilidade de que vários microrganismos entrem pelo mesmo orifício da placa perfurada.3 Contagem de unidades formadoras de colônias de fungos e bactérias O número de unidades formadoras de colônias foi contado em cada placa e o resultado foi corrigido com a ajuda de uma tabela de correção estatística "Feller" (Quadro 19) e.d. aplicando-se a fórmula Feller citado por MERCK (s. porém utilizando-se somente os dois meios selecionados. Sabouraud e DRBC. coletando-se cinco placas para cada meio de cultura em cada um dos pontos amostrados.

1 Identificação dos fungos presentes Seguiu-se a identificação direta nos meios utilizados. A análise da variância foi realizada no esquema do delineamento inteiramente casualizado.5.4 Avaliação estatística dos resultados de contagem Os dados de ufc/m3 (unidades formadoras de colônias por m3) foram submetidos a teste diagnóstico.2. Detectada a significância do Teste F. Diante dos resultados obtidos nesta análise. ti = é o efeito do i-ésimo tratamento. após o período de incubação estabelecido. visando verificar a homogeneidade de variância. As colônias foram observadas em estereomicroscópio para observação do tipo e local das estruturas . eij = erro aleatório atribuído à observação Yij.2. u = é a média geral dos valores observados. por ambiente avaliado. 3. e considerando todos os ambientes. sendo: Yij= é o valor observado no i-ésimo meio de cultura da j-ésima repetição.18 3. segundo o modelo matemático: Yij = u + ti + eij .5 Avaliação qualitativa dos resultados 3. As análises foram realizadas através dos procedimentos estatísticos SAS (Statistical Analysis System). segundo Nogueira (1991). os dados foram transformados em ufc / m 3 .2. as médias dos tratamentos foram comparadas através do Teste de Tukey (5% de significância).

niger.5. Histoplasma capsulatum e Stachybotrys chartarum. em paralelo. Durante as coletas da segunda fase foi conduzida. F. . Pitt & Hocking (1997). fumigatus. Esses dados foram comparados às chaves de classificação dadas por Barnett & Hunter (1972). As placas foram incubadas durante sete dias em estufas separadas daquelas das coletas e monitoradas com relação ao crescimento e características morfológicas dos fungos durante o período de incubação. Esse acompanhamento teve como objetivos facilitar a identificação de uma possível presença destes fungos nos ambientes avaliados e certificar o crescimento dos mesmos nos meios DRBC e Sabouraud. a inoculação das placas contendo os meios DRBC e Sabouraud com culturas puras de Aspergillus flavus. cor e textura) do conidióforo e conídios/ esporângios e esporangióforos e estruturas de resistência (clamidosporos) ou estruturas contendo esporos como clestotécio. parasiticus. levando parte do micélio e das estruturas de frutificação. Para o exame microscópico foram preparadas lâminas em água e/ou coradas com lactofenol com pequenos pedaços das bordas das colônias. estrutura (tamanho. (1998). A. Lacaz et al. verticulloides. A. 3. A.2 Avaliação dos meios de cultivo e identificação dos fungos patogênicos e toxigênicos e estudo de bactérias Foram adquiridas culturas puras das espécies de fungos patogênicas e toxigênicas. Fusarium moniliforme. para observação das características morfológicas: tipo de micélio (septado ou não).2.19 esporulantes.

DG18. MEAYM e BDA aparecem significativamente. porém não houve diferença estatística com o DG18 na área de produção de doce de amendoim. tendo como meio de menor contagem de fungos o Extrato de Malte.1 Avaliação quantitativa De acordo com os resultados obtidos. Na indústria de doces. área de produção de leite e amendoim (Quadro 1). Duas amostragens foram conduzidas com os meios acima. Na necessidade de trabalhar com um número maior de meios de cultura. Desta forma foram conduzidas amostragens com os seguintes meios: DRBC. com exceção dos pontos produção de doce de leite da terceira coleta (Quadro 1) e empacotamento de embutidos da primeira coleta (Quadro 2).4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4. A primeira amostragem aponta o meio DRBC com melhor desempenho na indústria de doces nos dois pontos amostrados. observa-se que houve diferença significativa na maioria dos locais amostrados entre os meios utilizados (Quadros 1 e 2). MA e MEAYM. BDA. optou-se por utilizar meios reconhecidos na área de alimentos. Os meios MA. uma correspondente à primeira coleta da área frigorífica (Quadro 2) e uma outra representando a segunda. como os de menor performance quando testados em ambientes de produção de doces em geral (Quadro 1). PCA-Cloranfenicol. da indústria de doces (Quadro 1). . o meio DRBC foi o que apresentou melhor desempenho.

como os principais meios para amostragem de ar. não difere estatisticamente do meio Sabouraud Dextrose a 4% Ágar na área de produção de embutidos. Já nas coletas da área frigorífica. MA e MEAYM (Quadro 2). . aquele meio foi incorporado nas demais coletas. indicado juntamente com BDA e MA. concluiu-se que era importante a inclusão do meio Sabouraud Dextrose a 4% Ágar. sendo os de menor desempenho o PCACloranfenicol. Portanto. BDA. embora apareça como o melhor na segunda coleta na área de empacotamento de embutidos. o meio DRBC. O comportamento desses meios na indústria de doces apresentou diferença significativa apenas na área de amendoim.21 Quando a Resolução – RE n0 176 de 24 de outubro e 2000 do Ministério da Saúde do Brasil foi publicada. indicando o meio de MA e BDA como os de menor desempenho (Quadro 1).

nos ambientes de produção de doce de leite e de amendoim.22 ufc/m 3 Data De coleta Ambiente Meio de Cultura Mai/00 Produção de DRBC 1170 a Doce de Leite Produção de Doce de Amendoim Ago/00 Produção de Doce de Leite Jan/01 1 BDA 680 b OGY 652 b MA 440 b DRBC 1030 a BDA 872 ab OGY 860 ab MA 536 b DRBC 6926 DG18 4611 b PCA-Clor 4315 b BDA 3510 bc MA 2961 bc MEAYM 2385 c Produção de DRBC 5080 a Doce de Amendoim DG18 4238 ab PCA-Clor 3696 abc BDA 2698 bcd MEAYM 2141 cd Produção de Doce de Leite Produção de Doce de Amendoim MA SABOURAUD PCA-Clor DRBC MEAYM BDA DG18 MA DRBC SABOURAUD PCA-Clor DG18 MEAYM MA BDA 1931 1196 1033 883 770 740 673 613 1270 1106 1070 1036 893 596 380 d a a a a a a a a a a ab ab bc c Quadro 1 – Unidades formadoras de colônias/m 3 (valores médios) em diferentes meios de cultura. 1 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ( 5% de significância) .

Unidades formadoras de colônias/m 3 (valores médios) em diferentes meios de cultura.23 ufc/m 3 Data De coleta Ambiente Meio de cultura Set/00 Empacotamento de Embutidos MEAYM DG18 DRBC PCA-Clor BDA MA MEAYM BDA PCA-Clor DRBC DG18 MA DRBC DG18 SABOURAUD BDA MEAYM MA PCA-Clor SABOURAUD DRBC DG18 MEAYM MA BDA PCA-Clor SABOURAUD DRBC PCA-Clor MA MEAYM 563 530 523 470 383 230 2300 1573 1210 1003 910 390 2246 1130 1126 1106 906 656 623 5703 5696 3040 2456 2143 1876 1503 1410 510 473 453 366 a a a a a a a ab b b b c a b b b b b b a ab bc c c c c a b b b b BDA DG18 SABOURAUD DRBC MEAYM PCA-Clor MA BDA DG18 336 300 2550 1023 866 796 730 523 490 b b a ab b b b b b Produção de Embutidos Dez/00 Empacotamento de Embutidos Produção de Embutidos Jan/01 Empacotamento de Embutidos Produção de Embutidos 1 Quadro 2 . nos ambientes de empacotamento e de produção de embutidos. 1 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ( 5% de significância) .

significativamente. envolvendo todos os ambientes e épocas de coleta.Contagem em ufc/m . em ufc/m3. Meio de Cultura Número de repetições DRBC 36 2280 a1 SABOURAUD 18 2182 a DG18 30 1696 ab PCA-Clor 30 1519 ab MEAYM 30 1365 ab BDA 36 1223 ab Média em ufc/m3 MA 36 973 b Média Geral 1564 Coeficiente de Variação em % 43. como o menos indicado para o mesmo propósito. Por outro lado. o meio de Malte mostrou-se. podendo observar que os meios DRBC e Sabouraud Dextrose a 4% Ágar se apresentam como os melhores para a realização de contagem de fungos no ar. de fungos.92 Teste F 3. em diferentes meios de cultura envolvendo todos os ambientes e épocas de coleta. 1 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ( 5% de significância) .54** 3 Quadro 3 .24 O Quadro 3 apresenta as contagens obtidas para os diferentes meios de cultura.

motivo pelo qual este meio foi adotado pelos principais guias de microbiologia de alimentos (Acuff. De modo geral os meios não diferiram estatisticamente durante as amostragens nas indústrias de doces e frigorífico. proporcionando melhor desenvolvimento dos fungos. Mucor e Rhizopus microrganismos que têm crescimento rápido. Crysonilia. restringindo o tamanho das colônias e o Chloramphenicol como inibidor de bactérias. Tal fato pode estar relacionado com a peculiaridade do meio em restringir o crescimento de bactérias. Estes resultados eram esperados devido à sua composição. foi verificada durante a primeira fase do projeto (Quadro 18). uma vez que certos gêneros como. o meio MA tenha tido o menor desempenho. crescendo descontroladamente e dificultando o desenvolvimento de outros gêneros presentes. 1992. em termos numéricos. . como nos desenvolvidos por King et al..25 O meio DRBC teve o mesmo desempenho em outros estudos. O meio DRBC apresentou melhor desempenho em duas coletas na área de empacotamento de embutidos e em uma coleta na área de produção de doce de leite.1998). uma vez que uma alta incidência de bactérias principalmente na área de produção de embutidos. Esses fatos podem estar justificando que.(1979). estiveram presentes. que tem como inibidores a Rosa Bengala e o Dichloran. Os resultados obtidos na segunda fase do projeto com os meios DRBC e Sabouraud estão apresentados nos Quadros 4 e 5. Tournas et al.

1 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ( 5% de significância) Data de Coleta 20/06/01 Ambiente Empacotamento de Embutidos Produção de Embutidos 27/06/01 Empacotamento de Embutidos Produção de Embutidos 04/07/01 Empacotamento de Embutidos Produção de Embutidos Meio de Cultura DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD ufc/m 442 282 512 518 498 466 722 475 1654 828 1454 1068 3 1 a b a a a a a a a b a a Quadro 5 .Unidades formadoras de colônias/m 3 (valores médios de cinco repetições) nos meios de cultura DRBC e Sabouraud. 1 Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ( 5% de significância) .Unidades formadoras de colônias/m3 (valores médios de cinco repetições) nos meios de cultura DRBC e Sabouraud.26 Data de Coleta 20/06/01 Ambiente Produção de doce de amendoim Produção de doce de leite 27/06/01 Produção de doce de amendoim Produção de doce de leite 04/07/01 Produção de doce de amendoim Produção de doce de leite Meio de cultura DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD DRBC SABOURAUD ufc/m 3 1 370 408 412 432 440 452 658 460 1210 903 688 588 a a a a a a a b a a a a Quadro 4 . nos ambientes de empacotamento e de produção de embutidos. nos ambientes de produção de doce de leite e de amendoim.

Dos gêneros encontrados nos períodos de avaliação. esses não puderam ser detectados em nenhum dos meios empregados no período de avaliação considerado.27 4. isto é. Quanto ao outro gênero toxigênico citado. foram identificados somente aqueles que apresentaram suas estruturas de frutificação necessárias para sua identificação. as características morfológicas necessárias à sua . Assim. O gênero Cladosporium. comum em ambientes interiores que não apresentam problemas de saúde (Lacaz. 1998). 1998). o Stachybotrys e os patogênicos dos gêneros Histoplasma. não apresentaram identificação. Padrão Referencial Brasileiro Microbiológico. os Quadros de 6 a 9 apresentam os gêneros de fungos encontrados nos meios avaliados. Cryptococcus e Paracoccidioides. apenas dois deles podem conter espécies toxigênicas indesejáveis para qualquer ambiente (Padrão Referencial Brasileiro Microbiológico.2 Avaliação qualitativa A avaliação qualitativa visou na primeira fase. identificar os gêneros de maior ocorrência e presentes no período estipulado de incubação. 1970. porque se estiveram presentes. foi encontrado nos ambientes avaliados crescendo em 100% dos meios testados. a saber: Aspergillus e Fusarium.

Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produção de doce de leite. 2 %C/TC = % de coletas onde ocorreu a presença do gênero em relação ao número total de coletas realizadas. 2 .MEIOS DE CULTURA % M/G 1 %C/TC GÊNEROS MA MEAYM BDA DRBC DG18 PCA-Clor SABOURAUD Aspergillus 2 2 3 2 1 1 1 100 75 Cladosporium 2 2 2 3 2 2 1 100 87 Chrysonilia 1 1 1 3 2 1 0 86 56 Trichoderma 1 2 2 1 1 0 1 86 50 Mucor 2 1 2 0 0 0 0 43 31 Penicillium 0 2 2 1 2 1 1 86 56 Paecilomyces 0 0 1 0 0 0 0 14 6 Rhizopus 0 0 1 0 0 0 0 14 6 Total de Coleta/Meio 3 2 3 3 2 2 1 Quadro 6 . 1 %M/G = % de meios de cultura que permitiu o crescimento do gênero em relação ao número total de meios de cultura testados.

Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produção de doce de amendoim.MEIOS DE CULTURA % M/G 1 %C/TC 2 GÊNEROS MA MEYAM BDA DRBC DG18 PCA-Clor SABOURAUD Aspergillus 3 2 3 2 2 1 1 100 88 Cladosporium 3 2 3 3 2 2 1 100 100 Chrysonilia 1 0 1 1 2 0 0 57 31 Trichoderma 3 1 1 0 2 0 1 71 50 Mucor 1 1 1 0 1 1 0 71 31 Penicillium 2 2 3 2 1 0 0 71 62 Paecilomyces 0 0 0 1 0 0 0 14 6 Rhizopus 1 1 1 1 0 0 1 71 31 Fusarium 0 0 1 0 0 0 0 14 6 Aerobasidium 0 0 1 0 0 0 0 14 6 Total de Coleta/Meio 3 2 3 3 2 2 1 Quadro 7 . 1 %M/G =% de meios de cultura que permitiu o crescimento do gênero em relação ao número total de meios de cultura testados. . 2 %C/TC = % de coletas onde ocorreu a presença do gênero em relação ao número total de coletas realizadas.

2 %C/TC =% de coletas onde ocorreu a presença do gênero em relação ao número total de coletas realizadas.Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de empacotamento de embutidos.MEIOS DE CULTURA % M/G 1 %C/TC 2 GÊNEROS MA MEAYM BDA DRBC DG18 PCA-Clor SABOURAUD Aspergillus 0 1 1 0 0 2 0 43 22 Cladosporium 3 3 2 3 3 3 1 100 100 Chrysonilia 2 1 0 2 1 1 0 71 39 Trichoderma 1 1 0 0 0 0 0 28 11 Alternaria 1 1 0 0 0 0 0 28 11 Mucor 1 0 0 0 1 0 0 28 11 Penicillium 1 1 2 1 3 0 1 86 50 Paecilomyces 0 0 0 0 1 0 0 14 5 Rhizopus 0 0 0 1 0 0 0 14 5 Curvularia 2 0 0 1 0 1 0 43 22 Total de Coleta/Meio 3 3 2 3 3 3 1 Quadro 8 . 1 %M/G = % de meios de cultura que permitiu o crescimento do gênero em relação ao número total de meios de cultura testados. .

.Gêneros de fungos desenvolvidos em diferentes meios de cultura no ambiente de produção de embutidos. 2 %C/TC = % de coletas onde ocorreu a presença do gênero em relação ao número total de coletas realizadas. 1 %M/G =% de meios de cultura que permitiu o crescimento do gênero em relação ao número total de meios de cultura testados.MEIOS DE CULTURA % M/G 1 %C/TC 2 GÊNEROS MA MEAYM BDA DRBC DG18 PCA-Clor SABOURAUD Aspergillus 1 2 1 0 1 0 0 57 28 Cladosporium 3 3 2 3 3 3 1 100 100 Chrysonilia 0 0 0 2 0 0 1 28 17 Trichoderma 0 1 0 0 1 0 0 28 11 Alternaria 1 1 1 0 1 0 0 57 22 Mucor 0 0 0 1 0 0 0 14 5 Penicillium 2 3 2 1 3 1 1 100 72 Paecilomyces 1 1 0 1 1 0 0 57 22 Rhizopus 0 1 0 0 0 0 0 14 5 Curvularia 1 1 0 1 0 1 0 57 22 Total de Coleta/Meio 3 3 2 3 3 3 1 Quadro 9 .

fumigatus. Fusarium moniliforme. Para a identificação de fungos. niger. F. Os Quadros de 10 a 17 mostram que espécies indesejáveis como Aspergillus flavus. . isto quando inoculadas sem a presença de outros gêneros de fungos. Histoplasma capsulatum e Stachybotrys chartarum podem crescer nos meios Sabourand e DRBC. 1992). devido ao grande valor das características morfológicas/culturais na identificação dos mesmos. Na segunda fase. A. torna-se difícil afirmar qual meio seria o mais indicado para o isolamento de determinado gênero de fungo.32 Face à diversidade de gêneros identificados em cada um dos meios utilizados. parasiticus. a espécie Aspergillus flavus foi isolada a partir do meio Sabouraud no ambiente da indústria de alimentos. A. na área de processamento de doces de amendoim. A. verticulloides. é de grande importância se conhecer a ocorrência de diferentes cores e tonalidades das colônias em cada meio de cultivo. Somente em termos quantitativos é que este trabalho permite identificar meios melhores para o isolamento de fungos. sendo identificada no meio Aspergillus Flavus Parisiticus Ágar (Vanderzant & Splittstoesser.

16cm rosa branco branco SABOURAUD 3º 4º 5º 6º 2.33cm tomou a placa branco branco branco amarelo amarelo Quadro 10 .5mm 1.43cm 5.08cm 2.8cm branco 7º 3.8mm branco 2º 2.0cm branco 6º 7º tomou a placa branco 1º 0 . 2º 0 .41cm 6.0mm 2.Espécie Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia cor Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia cor 1º 4.6cm .12cm amarelo amarelo amarelo amarelo marrom claro claro SABOURAUD 3º 4º 5º 6º 7º 4.63cm branco Aspergillus parasiticus DRBC 3º 4º 5º 6º 7º 2. branco branco branco branco branco Quadro 11 .Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus fumigatus ao longo do período de incubação.83cm 4.51cm branco branco 1º 8. .1cm 3.33cm 5.1cm 2.0cm 3.8cm 3.Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus parasiticus ao longo do período de incubação. Espécie Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia cor Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia cor Aspergillus fumigatus DRBC 3º 4º 5º 5.2mm 2º 1. 1º 2º 0 8.

0cm amarelo amarelo preto claro claro SABOURAUD 3º 4º 5º 6.52cm 3.0cm 7.0cm amarelo amarelo amarelo claro claro Quadro 13 .5mm amarelo claro Aspergillus flavus DRBC 3º 4º 5º 1.74cm 5.06cm marrom marrom 6º 4.7mm cor branco Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia 1º 9.35cm 2.17cm amarelo amarelo amarelo claro claro SABOURAUD 3º 4º 5º 2.1cm 3.64cm cor branco branco 2º 8.71cm centro centro amarelo amarelo com pontos com pontos preto pretos e pretos e borda borda branca branca 6º 7º tomou a placa preto preto 6º tomou a placa 7º preto preto 6º 4.45cm 3. Espécie Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia 1º 3. .95cm marrom marrom Quadro 12 .0mm 2º 3.Espécie Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia 1º 5.1mm cor branco Meio de Cultura Incubação em dias diâmetro da colônia 1º 5.Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus niger ao longo do período de incubação.25cm amarelo claro Aspergillus niger DRBC 3º 4º 5º 2.48cm 4.06cm 7º 4.95cm 7º 4.5mm 2º 1.Diâmetro e cor das colônias de Aspergillus flavus ao longo do período de incubação.1cm cor branco amarelo claro 2º 1.

Espécie
Meio de Cultura
Incubação em dias
diâmetro da colônia
cor
Meio de Cultura
Incubação em dias


3,0mm
branco


6,7mm
branco

diâmetro da colônia

3,0mm

1,67cm

2,89cm

3,91cm

4,45cm

4,72cm

cor

branco

branco

rosa claro

rosa claro

rosa claro

Fusarium verticulloides
DRBC



1,2cm
1,76cm
2,04cm
rosa claro rosa claro rosa claro
SABOURAUD



2,55cm
lilás


3,43cm
lilás

lilás


tomou a
placa
lilás


3,31cm


3,93cm

amarelo
claro

amarelo

Quadro 14 - Diâmetro e cor das colônias de Fusarium verticulloides ao longo do período de incubação.

Fusarium moniliforme
DRBC



1,84cm
2,37cm
2,52cm
centro
centro
centro
branco e
branco e
branco e
borda rosa borda rosa borda rosa
SABOURAUD


Espécie
Meio de Cultura
Incubação em dias
diâmetro da colônia


3,0mm


1,1cm

cor

branco

branco

Meio de Cultura
Incubação em dias

diâmetro da colônia

4,2mm

2,47cm

4,1cm

5,76cm

6,95cm

7,52cm

cor

branco

branco

branco

branco

branco

amarelo
claro

Quadro 15 - Diâmetro e cor das colônias de Fusarium moniliforme ao longo do período de incubação.


tomou a
placa
amarelo
claro

Espécie
Meio de Cultura
Incubação em dias
diâmetro da colônia
cor
Meio de Cultura
Incubação em dias
diâmetro da colônia
cor


1,6mm
levemente
marrom


4,3mm
levemente
marrom


1,6mm
levemente
marrom


4,0mm
levemente
marrom

Stachybotrys chartarum
DRBC



6,1mm
6,5mm
6,5mm
marrom
marrom
marrom
claro
claro
claro
SABOURAUD



6,4mm
7,9mm
7,9mm
marrom
marrom
marrom
claro
claro
claro


8,87mm


8,87mm

marrom

marrom


10,17mm


10,17mm

marrom

marrom

Quadro 16 - Diâmetro e cor das colônias de Stachybotrys chartarum ao longo do período de incubação.

Espécie
Meio de Cultura
Incubação em dias
diâmetro da colônia


1,9mm


6,1mm

Histoplasma capsulatum
DRBC



1,4cm
1,59cm
1,89cm

cor

branco

branco

branco

branco

branco

Meio de Cultura
Incubação em dias
diâmetro da colônia


3,4mm


6,85mm


1,15cm

SABOURAUD

2cm


2,31cm

cor

branco

branco

branco

branco

branco


1,89cm
levemente
verde


2,0cm
levemente
verde


2,31cm
levemente
verde


2,7cm
levemente
verde

Quadro 17- Diâmetro e cor das colônias de Histoplasma capsulatum ao longo do período de incubação.

37

4.3 Avaliação da contagem total de bactérias

Tendo em vista, que poucos pesquisadores no mundo sugeriram
padrões referenciais em relação à qualidade microbiológica do ar, para
estruturas bacterianas, a presente pesquisa, coletou dados que podem vir
a ser úteis, por ocasião de estudos para estabelecimento de padrões
nacionais.
Segundo Padrão Referencial Brasileiro Microbiológico (1998), os
ambientes não apresentam situações problemáticas, quando bactérias
Gram-positivas, como Micrococcus sp, Streptococcus sp e Staphylococcus
sp predominarem no ambiente, em populações abaixo de 200 ufc/ m3.
Apesar de não ter sido realizado o teste Gram, os ambientes avaliados
apresentaram populações de bactérias que merecem atenção especial
pelos altos valores observados.
No Quadro 18 são apresentadas as contagens de bactérias
(ufc/m3) nos ambientes estudados.

Data de

Ambientes

coleta

Doce de leite

Doce de amendoim

Mai/00

622

645

Ago/00

331

223

Jan/01

426

446

Data de

Ambientes

coleta

Produção de Embutidos

Empacotamento de Embutidos

Set/00

820

906

Dez/00

2380

2926

Jan/01

3946

2456
3

Quadro 18 - Unidades formadoras de colônias/m (valores médios) de bactérias
nos diferentes ambientes amostrados (médias de três repetições).

a relação ambiental externo/interno não foi considerada. se apresentar valor de contagem igual ou menor que 750 ufc/m3 e não houver espécies toxigênicas e ou patogênicas (Resolução no 176). flavus torna o ambiente de risco para os produtos e manipuladores. em valores absolutos. a ocorrência de A. Os dados encontrados sugerem que novos estudos sejam realizados. As altas contagens de fungos encontradas constituem-se em fato preocupante. pois quando se consideram as contagens em DRBC e Sabouraud Dextrose a 4% Agar. esses mesmos ambientes tornam-se passíveis de avaliação quanto à fonte de contaminação e preocupação quanto à possibilidade de ocorrência de patógenos indesejáveis. A presença do gênero Aspergillus na área de produção de doces.4 Avaliação ambiental das instalações amostradas O parâmetro empregado na avaliação ambiental restringiu-se aos resultados de contagem de propágulos de fungos. pois. considerando-se que um ambiente está em boas condições.38 Nos ambientes estudados foram encontrados médias. Devido ao fato destes ambientes não serem totalmente climatizados. de 449 e 2239 ufc de bactérias/m3. entre as três coletas. respectivamente. os meios de cultura que apresentaram baixa contagem estariam na maioria dos casos avaliando os ambientes amostrados como em boas condições (Quadros 1 e 2). o que de fato não é o real. apesar de muitos não pertencerem a gêneros com potencial de patogenicidade e/ou toxicidade. principalmente na área de produção do doce . no sentido de caminhar para um padrão referencial que possa ser utilizado no monitoramento dos ambientes de processamento de alimentos. para indústria de doces e frigorífico. Partindo deste princípio. e a preocupação ainda mais relevante. 4.

relatada na indução do câncer de fígado. tornase preocupante pelo fato de que os esporos e fragmentos de micélio podem conter altas concentrações de toxinas. Ainda. a arquitetura das instalações deve ser revista. como econômicos que este quadro pode representar. encontradas nos meios MA e DRBC. circuladores de ar ajudam a dispersar as fontes poluentes por toda a fábrica. sendo a inalação desses na colheita do milho e do amendoim. tanto na indústria de doces como no frigorífico. torna-se necessário que padrões brasileiros de contaminação biológica em ambientes industriais sejam estabelecidos para seu monitoramento. flavus esteve presente. Além disso. respectivamente. com soluções principalmente para pequenas e médias empresas dentro da realidade do nosso país. De acordo com os padrões de Kurata (1994) os ambientes estudados estariam altamente comprometidos. pois classificou os ambientes de processamento e empacotamento de alimento como ruins acima de 100 ufc/m3. onde a espécie toxigênica A. . visando minimizar tanto os efeitos nocivos à saúde. além de toxicidade aguda (World Health Organization. Os ambientes estudados não apresentam um fluxograma que proporcione condições satisfatórias no processamento e empacotamento dos produtos. 1988). ou no trabalho em plantas de processamento.39 de amendoim. Considerando as condições dos ambientes estudados no presente trabalho. ou seja. As contagens de fungos no presente trabalho variaram de 230 a 6926 ufc/m3. Na indústria de doces o recebimento da matéria-prima para o doce de amendoim. Já no frigorífico. a alta umidade faz desenvolver fontes de contaminação microbiana pelo teto e parte das paredes que não possuem revestimento apropriado. o amendoim em grãos é recebido e processado na mesma planta em que os doces são processados e empacotados.

5 CONCLUSÕES De acordo com os resultados obtidos. pois o mesmo se apresentou como o de menor desempenho dentre todos os meios avaliados. reprova-se o PCA. estudos na área molecular. Assim. no ar. de ambientes interiores. no entanto. “Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar” (DRBC) e “Sabouraud Dextrose a 4% Agar” devem ser recomendados para a avaliação quantitativa de fungos. principalmente em situações de alta concentração de bactérias e fungos de crescimento rápido que podem comprometer a avaliação. A necessidade de caminhar para um padrão referencial nacional para monitoramento microbiológico de ambientes de processamento e . Sugere-se que a Resolução 176 de 28 de outubro de 2000 seja revista quanto à recomendação do meio de Malte para coletas ambientais. uma vez que. Ainda. pode-se recomendar o meio DRBC. respostas para medidas corretivas de controle devem ser imediatas. A dificuldade na identificação dos gêneros e espécies presentes em tempo reduzido é problemática. Dentre os meios estudados não foi possível concluir sobre o melhor para a identificação de fungos.cloranfenicol que apresentou a mais baixa diversidade de gêneros. pode-se concluir que entre os meios utilizados para quantificação de fungos no ar. tornam-se uma ferramenta indispensável para auxiliar o monitoramento dos ambientes. como desenvolvimento de primers específicos para a identificação de fungos de interesse à saúde.

como separar as áreas de recebimento de matériaprima. as instalações estudadas devem ajustar o fluxograma do processo industrial. quanto à contaminação microbiana. principalmente nas áreas de produção e empacotamento que não apresentam nenhum tipo de barreira física e revestimento de paredes e pisos que promovam a melhoria na qualidade microbiológica do ar. No geral. . O amostrador de impactação utilizado promoveu rapidez e proporcionou a expressão dos resultados em medidas confiáveis. por ser um equipamento que permite calibração em seu sistema de aspiração de ar. processamento e empacotamento. A arquitetura destes ambientes deve ser revista. pois não apresentam condições satisfatórias que permitam evitar a contaminação cruzada.41 empacotamento de alimentos é indispensável e urgente. uma vez que a avaliação quali-quantitativa dos ambientes estudados mostrou que estes não se encontram em boas condições ambientais.

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APÊNDICES .

r = Número de unidades formadoras de colônias em 90 mm Petridish.48 APÊNDICE 1 R Pr R Pr r Pr r Pr r Pr r Pr R 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 37 38 39 40 41 42 43 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 54 56 57 58 59 60 61 63 64 65 66 67 68 70 71 72 73 74 76 77 78 79 80 82 83 84 85 87 88 89 90 92 93 94 95 97 98 99 101 102 103 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 116 118 119 120 122 123 124 126 127 128 130 131 133 134 135 137 138 140 141 142 144 145 147 148 150 151 153 154 156 157 158 160 161 163 164 166 167 169 171 172 174 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 189 191 193 194 196 197 199 201 202 204 206 207 209 211 212 214 216 218 219 221 223 224 226 228 230 232 233 235 237 239 241 242 244 246 248 250 252 254 255 257 259 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 279 281 283 285 287 289 291 293 295 297 299 301 304 306 308 310 312 314 317 319 321 323 325 328 330 332 335 337 339 342 344 346 349 351 353 356 358 361 363 366 368 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 394 397 400 402 405 408 411 413 416 419 422 425 428 431 433 436 439 442 445 449 452 455 458 461 464 467 471 474 477 480 484 487 491 494 497 501 504 508 511 515 519 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 33 334 335 336 337 338 339 340 341 Quadro 19 – Correção estatística “Feller”. Pr = Probabilidade estatística total. Pr 557 561 565 569 573 578 582 586 591 595 599 604 608 613 618 622 627 636 637 642 647 652 657 662 667 673 678 684 689 695 701 706 712 718 724 730 737 743 749 756 763 r Pr 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 836 844 853 861 870 879 888 897 907 917 927 937 947 958 969 981 992 1005 1017 1030 1043 1057 1071 1086 1102 1118 1134 1152 1170 1189 1209 1230 1252 1276 1301 1327 1356 1387 1420 1456 1496 .

r = Número de unidades formadoras de colônias em 90 mm Petridish. 342 343 344 345 346 347 348 349 350 769 776 783 791 798 805 813 820 828 392 393 394 395 396 397 398 399 400 1541 1591 1648 1715 1795 1895 2028 2228 2628 . Pr = Probabilidade estatística total.49 42 43 44 45 46 47 48 49 50 44 45 47 48 49 50 51 52 53 92 93 94 95 96 97 98 99 100 104 106 107 108 110 111 112 114 115 142 143 144 145 146 147 148 149 150 175 177 178 180 181 183 185 149 188 192 193 194 195 196 197 198 199 200 261 263 265 267 269 271 273 275 277 242 243 244 245 246 247 248 249 250 371 373 376 378 381 384 386 389 391 292 293 294 295 296 297 298 299 300 522 526 530 534 537 541 545 549 553 Quadro 19 – Correção estatística “Feller”.

.50 APÊNDICE 2 Figura 1 .Amostrador microbiológico de ar da marca MERCK denominado MAS-100.