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COMPLEXOS DE FERRO

Introdução

Complexos

Também designados por compostos de coordenação, são a espécie MLn que se forma quando um átomo ou ião M (metálico) se une a um ou mais ligandos.

O átomo ou ião metálico é o elemento central, enquanto que os iões ou moléculas que se lhe ligam são os ligandos.

Define-se o elemento central com o estado de oxidação formal (obtém-se somando a carga de todos os ligandos e subtraindo à carga do complexo) e a configuração electrónica.

Os ligandos são moléculas ou iões que se ligam ao elemento central que têm de ter

pares de eletrões não partilhados ou orbitais moleculares ocupadas, cujos eletrões possam ser

doados ao átomo central.

Conforme o modo de coordenação ao metal podem ser monodentados (coordenam-se por um só átomo) ou bi-…, tri-…, polidentados (coordenam-se por 2, 3 ou mais átomos respectivamente).

Os ligandos polidentados podem tamém ser designados quelantes, pois forma-se um

anel de quelação que engloba o metal, um dos átomos doadores do ligando, a sua cadeia

respectiva e um outro átomo doador do ligando, sucessivo.

Existem também ligandos ambidentados, ou seja, ligandos que têm mais que um possível átomo doador, mas só podem usar um deles de cada vez (pelo menos para o mesmo metal).

O número de átomos que se liga directamente ao metal define o número de

coordenação.

Consoante este número os complexos têm diferentes tipos de geometria: linear (NC=2), geometria em T, Y ou triangular (NC=3), tetraédrica ou quadrangular plana (NC=4), pirâmide quadrangular ou bipirâmide trigonal (NC=5), octaédrica, prisma trigonal ou hexagonal (NC=6), entre outras para números de coordenação elevados (7,8 e 9).

O número de coordenação 6 é dos mais frequentes, sendo a geometria mais comum a octaédrica, pois é a preferida do ponto de vista electrónico e estereoquímico.

Quanto ao isomerismo, trata-se da existência de complexos com a mesma fórmula molecular, mas que diferem entre si de várias formas possíveis. Existem vários tipos de isomerismo:

o

Geométrico: Diferem no arranjo dos ligandos;

o

Óptico: Fazem rodar o plano da luz polarizada em direcções opostas um dos isómeros é a imagem no espelho do outro;

 

o

Ionização: Os produtos sólidos têm a mesma estequiometria, mas originam diferentes iões ao serem dissolvidos;

o

Coordenação: O arranjo dos ligandos à volta do elemento central é diferente;

o

Ligação: Um ou mais dos ligandos coordenam-se por diferentes átomos doadores.

Ferro

Os metais de transição são moderadamente reactivos, combinando-se muitas vezes com enxofre, oxigénio e hidrogénio quando aquecidos.

O ferro é um metal de transição cujo número atómico é o 26 e a configuração electrónica [Ar]3d 6 4s 2 .

Apresenta diversos estados de oxidação, +6,+3 e +2. É um elemento muito reactivo no seu estado puro e forma complexos com relativa facilidade.

É essencial para a maioria dos seres vivos e sabe-se que num ser humano adulto (massa de 70kg) existem 4,2 mg de Ferro. Devemos ingerir entre 12 a 18 mg de ferro por dia, no entanto só parte é que é absorvida.

Por falta de ferro podem surgir doenças, nomeadamente anemia, mas também por acumulução deste metal (hemocromatose).

Algumas das funções do ferro nos elementos biológicos são: funções catalítica, por exemplo em reacções de oxi-redução, (há enzimas activados pelo ferro através de uma fraca ligação), metaloenzimas (enzimas com ligações fortes a metais como o Ferro ou complexos de metais), transporte de oxigénio no sangue (Hemoglobina), armazenamento de oxigénio no sangue (Mioglobina e Ferritina).

Para resumir estas e outras funções do ferro apresenta-se o seguninte esquema que identifica e classifica as metalobiomoléculas de ferro, mostrando também os principais exemplos.

Estas

biomoléculas

de

ferro,

proteínas

ou

importantes funções na maioria dos seres vivos.

1. Moléculas não proteicas

não,

que

desempenham

diversas

e

Sideróforos - O ferro é essencial para todos os organismos vivos mas está pouco diponível por se encontrar maioritariamnte no estado de oxidação 3 em compostos químicos pouco soluveis em agua; por isso os seres vivos desenvolveram técnicas para solubilizar e transportar o Fe 3+ para o seu uso.

Na realidade esta stecnicas são ligandos que formam complexos deste ião com constantes de estabilidade elevadas; Esses ligandos são agentes complexantes não proteicos para capturar ferro libertados para o exterior pelas bacterias.

A transferência do ferro complexado para o microorganismo requer o reconhecimento de sideroforos.

Como muitos desses microorganismos são patogénicos e precisam de ferro para se propagarem vão buscá-lo ao hospedeiro. Para evitar essa captura o hospedeiro impede a sintese de sideroforos, sendo ujjma das estrategias adoptadas a subida da temperatura corporal, pois a produçao daqueles ligandos diminui para temperaturas de 37 graus.

2.

Proteínas -De transporte e armazenamento

a) Transferencia electronica

- Proteínas Fe-S

Estas proteínas estão envolvidas em processos de transferência electrónica e são agregados com a composição FenSm onde n =m = 2=4, ocorrendo nalguns casos o sistema Fe3S4. São sistemas

A ferredoxina é um exemplo de um sistema ferro enxofre. Ferredoxina do tipo cloroplasto, F2S2.

- Citocromos

São estruturas químicas de grupos heme presentes em todos os seres vivos que, tal como as proteínas de ferro-enxofre, também são responsáveis por transferirem electrões.

O processo de transferencia de electrões envolve a variação do estado de oxidaçao do ferro no centro hémico.

Estão envolvidos na respiraçao anaerobia e aerobia, fotossíntese das plantas e cianobactérias, redução da meta hemoglobina nos eritrócitos para regenerar a forma funcional da hemoglobina.

Citocromo c- transferencia electrónica do citocromo c1 para a oxidase do citocromo c no processo finsal de fosforilaçao oxidativa (imagem)

b) Coordenação com moléculas não metálicas

-Hemeritrina: Hemeritrina- Embora a sobrevivencia da maioria dos organismos dependa da difusao de O2 e CO2 entre as celulas e o exterior, outros seres vivos necessitam de metalobiomoléculas para o transporte e armazenamento de O2.

Um exemplo é a biomolécula hemeritrina que ocorre no sangue de invertebrados marinhos geralmente na forma octaedrica. São proteinas não hemicas, em que a captura do O2 é acompanhada pela oxidaçao dos centros metalicos e formaçao de OOH-.

- Hemoglobina: a hemoglobina está presente nos glóbulos vermelhos, capta o O2 nos pulmões e transporta-o no sangue arterial para os pulmões. Nos musculos vermelhos o O2 é transferido da hemoglobina para a mioglobina, que, ao ter maior afinidade para o O2 consegue armazená-lo e /ou transportá-lo para os mitocondrios.

A hemoglobina desoxigenada e parcialmente oxigenada tem diferenças estruturais, estado tenso e relaxado respectivamente; o estado relaxado tem maior afinidade pelo O2, explicando o conhecido efeito de cooperatividade, pois aumenta a afinidade para o O2 das subunidades desoxigenadas.

Em ambas as formas o estado de oxidação do ferro é +2, sendo que o ferro se ajusta mais ao anel de porfirina na forma oxigenada, pois o numero de coordenaçao é 6 e a estrutura octaedrica.

c) Coordenação com iões metálicos

-Ferritina: Como o ferro não está muito disponível para os seres vivos, existem proteínas como a ferritina que armazenam o ferro no organismo de modo a ficar acessivel e não ter efeitos tóxicos. Em bacterias podem ainda ter fosfato e ferro hémico e chamam-se bacterioferritinas.

Existem ainda proteínas transportadoras de ferro, as transferrinas, de várias classes que o transportam a vários tecidos.

Enzimas

É comum a presença de ferro em enzimas como Oxidorredutases (catalisam reacções de transferência de electrões) e Liases (adiçao de grupos a duplas ligações ou formaçao de duplas ligações por remoçao de grupos)

Por exemplo, a regulação do enzima acotinase, que participa no TCA, é feita através da adição de um ferro ao centro de ferro-enxofre, convertendo uma forma inactiva (três ferros) numa forma activa (quatro ferros).

Em

resumo,

o

ferro

está

presente

nos

vários

organismos

em

várias

formas

desempenhando papeis importantes para manter as funções de algumas biomoléculas.

Complexo Tris(oxalato) ferrato(III) de potássio

É um complexo de ferro com 3 ligandos bidentados, o oxalato, C 2 O 4 2- .

Desta forma este complexo assume a estrutura octaédrica, visto que o seu número de coordenação é 6.

Uma das suas propriedades é o paramagnetismo.

Aplicações:

Pode ser utilizado como catalisador ou estabilizador em processos e

produtos químicos, como revestimento para vidro, para processos sintéticos de acrílicos, adesivos acrílicos, resinas de epóxido,poliuretanas, combustíveis, borrachas de silicone, entre

outros, processos de polimerização, oligomerização e transesterificação de olefinas.

Procedimento

Para a realização desta actividade experimental utilizou-se o sulfato ferroso amoniacal que é um sal duplo (2 catiões). Escolheu-se este sal porque é solúvel em água e mais barato que o sulfato de ferro. Para além disso este sal tem menos tendência a ser oxidado ao ar a Ferro (III). A oxidação de soluções de Ferro (II) é muito dependente do pH, ocorrendo mais rapidamente a pH elevado. Os iões de amónio fazem com que a solução fique ligeiramente acídica, o que desacelera o processo de oxidação.

O primeiro passo do procedimento consistiu na dissolução de sulfato ferroso amoniacal em água quente acidificada com ácido sulfúrico diluído. O aumento da temperatura facilitou a dissolução do sal e a água acidificada favoreceu o equilíbrio de OH - e H + , impedindo a formação de precipitado (hidróxido de ferro).

Seguidamente adicionou-se uma solução quente de ácido oxálico em água, para formar oxalato de ferro (FeC 2 O 4 .2H 2 O ). Aqueceu-se a mistura até ferver e deixou-se precipitar o sólido amarelo (oxalato de ferro).

Lavou-se o precipitado repetidamente com água, com o objectivo de retirar o excesso de ácido e sais.

Adicionou-se oxalato de potássio monohidratado em água, que levou à desacidificação do meio para que os grupos OH - resultantes da adição de peróxido de hidrogénio se ligassem ao ferro (passo seguinte). A adição excessiva de ácido oxálico levaria a uma acidificação do meio, o que impossibilitaria a oxidação do ferro, uma vez que este só

se oxida em pH neutro.

Gota a gota, adicionou-se peróxido de hidrogénio agitando continuamente a solução e mantendo a temperatura abaixo dos 40 0 C. A adição de peróxido de hidrogénio oxidou

o Ferro II a Ferro III. A temperatura foi mantida abaixo dos 40 0 C para evitar a formação de óxidos por decomposição do peróxido.

Após ter sido adicionado todo o peróxido de hidrogénio, aqueceu-se a mistura até quase à fervura, o que levou à formação de um precipitado castanho de hidróxido férrico indesejado.

Adicionou-se, então, gota a gota, uma solução saturada de ácido oxálico para redissolver o precipitado formado. A contínua adição do ácido levou à formação do complexo. Redissolveu o precipitado de hidróxido de ferro que se formou durante a adição de peróxido de hidrogénio.

Filtrou-se a solução quente e adicionou-se etanol, que diminuiu a solubilidade do sal, levando à estabilização do complexo.

Deixou-se cristalizar o complexo no escuro, pois este complexo é fotossensível.

Filtraram-se os cristais verdes e lavaram-se os mesmos com acetona, que eliminou o etanol anteriormente adicionado e ajudou a secar rapidamente os cristais.

Deixaram-se secar os cristais ao ar e no escuro.

Determinou-se o rendimento.

Seguidamente realizaram-se diversas reacções com os iões Fe(II) e Fe(III) e outros reagentes como o hidróxido de sódio, amónia, tiocianato de amónio e oxalato de sódio e observou-se a cor das soluções e se havia ou não precipitado.

Realizaram-se também reacções com hexacianoferrato (II) e (III) e observaram-se os resultados.

Adicionaram-se reagentes como tiocianato de amónio e hidróxido de sódio a complexos de fluoreto de ferro e observou-se se houve mudança de cor e/ou formação de precipitado.

Por fim fizeram-se reacções com iodeto.

Resultados

Síntese do complexo tris (oxalato) ferrato (II) de potássio

1)

Dissolução de sulfato ferroso amoniacal

Após este passo e até nova indicação consideramos que o ferro em solução é ferro (II).

2)

Adição de ácido oxálico

O precipitado amarelo é o complexo oxalato de ferro (II) dihidratado.

3)

Adição de oxalato de potássio

Considera-se que as águas que rodeavam o complexo estão agora dispersas no meio. O precipitado laranja é o complexo tris (oxalato) ferrato (II).

4)

Adição gota-a-gota de peróxido de hidrogénio

Obteve-se o complexo tris(oxalato) ferrato (III) e, devido à oxidação do peróxido de hidrogénio obteve-se também hidróxido de ferro (III).

Reacções redox

5)

Adição de ácido oxálico saturado

Adição de solução saturada de ácido oxálico de forma a redissolver o precipitado de hidróxido de ferro que se formou durante a adição de peróxido de hidrogénio.

O complexo de tris(oxalato)ferrato (III), em que o ferro está ligado a três oxalatos apresentando isómeros ópticos.

Cálculo do reagente limitante

Massa Molecular

(g/mol)

Reagente

Massa (g)

Estequiometria

Número de moles

Sulfato de ferro amoniacal

1

0,0386

15,15 392,14

Ácido oxálico

7,54

126,07

1

0,0838

Oxalato de

potássio

2

0,0273

10,06 184,24

Peróxido de

hidrogénio

0,02 dm 3

1,667 mol/dm 3

0,5

0,08335

Uma concentração de peroxide de hidrogénio 20 volumes é equivalente a 1.667 mol/dm 3 . Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm 3 ).

Isto prova que o reagente limitante é o oxalato de potássio;

O oxalato de potássio doa iões oxalato, tal como o ácido oxálico, que posteriormente é adicionado na forma concentrada não há controlo sobre a quantidade de iões oxalato (a quantidade de iões oxalato pode advir de várias espécies, sendo mais impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante);

Para maior precisão, no cálculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal.

Cálculo do rendimento

Reacções características dos iões ferro (II) e ferro (III)

1)

Reacções dos iões ferro (II) e ferro (III)

NaOH - Verifica presença de ferro em solução e qual a espécie

Tiocianato - Providencia um teste extremamente sensível para iões de Ferro (III)

Reagente

Fe (II)

Fe(III)

Cor

Precipitado

Cor

Precipitado

NaOH

Verde escuro*

Sim

Laranja

Sim

Excesso NaOH

Verde escuro*

Não dissolve

Laranja + escuro

Não dissolve

Amónia

Verde sujo

Sim

Laranja escuro

Sim

Excesso amónia

Verde sujo

Não dissolve

Laranja escuro

Não dissolve

Tiocianato de amónio

-

-

Vermelho sangue

Não

Oxalato de potássio

-

-

Amarelo esverdeado

Não

+ tiocianato de amónio

-

-

Amarelo esverdeado

Não

* este composto é branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxigénio

(produto maioritário)

Como o ligando é ambidentado pode gerar complexos do tipo

Nada acontece com a adição de mais tiocianato de amónio, já que o complexo formado (tris(oxalato) ferrato (III)) é muito estável (a sua formação é favorável). Não se consegue deslocar a esfera de coordenação do ferro. Existem algumas justificações para o facto do tiocianato não conseguir substituir o oxalato na ligação ao ferro.

9

De acordo com as posições relativas dos ligandos na série espectroquímica, pode inferir-se que o ligando C 2 O 4 2- forma uma ligação mais estável que o SCN - , uma vez que é um ligando mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os dois ligandos isto é confirmado.

 

Força

 

Ligando

iónica

log (K) (25ºC)

C

2 O 4

2-

0,5

7,53 ± 0,1

SCN -

0

0,9 ± 0,1

 

F

-

0

6,0

OH -

 

0

11,81 ± 0,03

Sendo o oxalato bidentado, também está favorecida a ligação do “segundo” átomo de oxigénio ao ferro efeito entrópico.

2)

Reacções com

Reagente

Fe (II)

Fe(III)

Cor

Precipitado

Cor

Precipitado

Sim

Dissolveu

K 4 [Fe(CN) 6 ]

Azul escuro*

Não

(mas deveria ter

precipitado)**

Azul escuro ++

(azul da Prússia)

K

3 [Fe(CN) 6 ]

Azul escuro +

(azul de Turnbull)***

sim

Amarelo

(amarelo da Prússia)

*este composto é branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxigénio

**não se terá observado precipitado por não se ter adicionado quantidade suficiente de reagente

***com o tempo este azul transforma-se em azul da Prússia

10

Amarelo da Prússia é um oxidante poderoso.

K 4 [Fe(CN) 6 ] - ferrocianeto de potássio, gera iões Fe 2+

Após oxidação do ferro, formou-se ferrocianeto férrico (azul da Prússia), a partir de ferrocianeto ferroso.

Forma-se o complexo ferrocianeto férrico.

K 3 [Fe(CN) 6 ] ferricianeto de potássio, gera iões Fe 3+

Primeiro formou-se um complexo azul, muito instável, conhecido como azul de Turnbull (Turnbull’s Blue) – ferricianeto ferroso. Este complexo é rapidamente convertido em ferrocianeto férrico (azul da Prússia).

Forma-se um complexo chamado amarelo da Prússia, ferricianeto férrico.

3)

Complexo de fluoreto com ferro (III)

Reagente

Fe(III)

Cor

Precipitado

NaF

Transparente

Não

+ tiocianato de amónio

Laranja escuro

Não

+ NaOH

Laranja

Sim

NaF:

Obteve-se hexafluoro ferrato(III).

+SCN-:

não reage

A cor laranja registada (quando a solução se deveria ter mantido incolor) deve-se ao facto de algum do fluor não ter reagido com o ferro formando o complexo, reagindo antes com o tiocianato.

+NaOH:

A adição de NaOH leva à formação de precipitado (hidróxido de ferro (III)) e leva o meio a ficar de novo incolor.

O meio fortemente básico, devido à presença de NaOH, tem a capacidade de “destruir” o complexo formado.

De acordo com as posições relativas dos ligandos na série espectroquímica, pode-se inferir que o ligando OH - possui a capacidade de substituir o F - , formando um complexo mais estável, sendo um ligando mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os dois ligandos isto é confirmado.

 

Força

 

Ligando

iónica

log (K) (25ºC)

C

2 O 4

2-

0,5

7,53 ± 0,1

SCN -

 

0

0,9 ± 0,1

F

-

0

6,0

OH -

 

0

11,81 ± 0,03

4)

Reacção com o iodeto

Reagente

Fe(III)

Cor

Precipitado

KI

Laranja

Não

CHCl 3

2 fases: aquosa superior amarela, orgânica inferior roxa

Sim (fase orgânica)

NaF + KI

Incolor

Não

CHCl 3

Incolor (evidência de separação por fases)

Não

Reacções redox

Fe(III)+KI+CHCl 3 :

não reagiu

A adição de CHCl 3 provoca uma separação por fases, distinguindo-se uma fase aquosa superior e uma fase orgânica inferior;

Extraiu-se o iodo para a fase orgânica pois este é apolar - ocorre formação de precipitado na solução violeta da fase orgânica, correspondente ao iodo;

Em fase aquosa, observa-se o aparecimento de uma cor amarelo torrado diferente da característica do Fe(III), que corresponde à forma aquosa do Iodo molecular (I 3 - ).

Adição de Fe(III)+NaF+KI+CHCl 3 :

Em primeiro lugar, o flúor liga-se ao ferro formando um complexo incolor e muito

estável (

);

A modificação do estado de complexação do ferro faz com que se crie uma resistência à redução: é modificado o potencial de redução do ferro, aumentando-o para superior ao do iodeto e assim o iodeto não consegue reduzir o Fe 3+ .

Conclusão

Cálculo do reagente limitante

Massa Molecular

(g/mol)

Reagente

Massa (g)

Estequiometria

Número de moles

Sulfato de ferro amoniacal

1

0,0386

15,15 392,14

Ácido oxálico

7,54

126,07

1

0,0838

Oxalato de

potássio

2

0,0273

10,06 184,24

Peróxido de

hidrogénio

0,02 dm 3

1,667 mol/dm 3

0,5

0,08335

Uma concentração de peroxide de hidrogénio 20 volumes é equivalente a 1.667 mol/dm 3 . Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm 3 ).

Isto prova que o reagente limitante é o oxalato de potássio;

O oxalato de potássio doa iões oxalato, tal como o ácido oxálico, que posteriormente é adicionado na forma concentrada não há controlo sobre a quantidade de iões oxalato (a quantidade de iões oxalato pode advir de várias espécies, sendo mais impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante);

Para maior precisão, no cálculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal.

Cálculo do rendimento

Composto modelo

A estrutura do complexo sintetizado pode de certa forma ser um modelo para simulação das propriedades do ferro em sistemas biológicos, dado que o complexo está coordenado com oxigénios (ambiente idêntico ao que rodeia as moléculas transportadoras de oxigénio). Encontram-se semelhanças entre o complexo sintetizado e os sideróforos.

A formação de complexos de Ferro está dependente da força dos ligandos (posição na série espectroquímica)

Quanto mais elevada a constante de estabilidade do complexo com dado ligando mais favorecida é a sua formação.

MIOGLOBINA: EXTRACÇÃO, PURIFICAÇÃO E DOSEAMENTO DE PROTEÍNA

Introdução:

Proteína em estudo:

Mioglobina:

Proteína hémica monomérica (uma só cadeia polipeptídica);

Massa molecular de 16,7 kDa;

A sua estrutura secundária consiste maioritariamente em hélices α (cerca de 70%);

Encontra-se no músculo cardíaco e esquelético;

Função primária armazenamento de oxigénio (O 2 ) e fornecimento do mesmo em caso de necessidade energética;

Possui 153 aminoácidos e um único grupo hémico (protoporfirina IX de ferro), que consiste na associação de uma porfirina com um átomo de ferro. Grupo heme:

o

O heme é um grupo prostético contendo um átomo de ferro, componente de muitas proteínas.

o

O grupo heme é constituído por uma parte orgânica (protoporfirina) e por um átomo de ferro. A protoporfirina é constituída por 4 anéis pirrólicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel tetrapirrólico. O átomo de ferro liga-se à protoporfirina através de interacções com os átomos de azoto dos anéis pirrólicos.

o

Em condições normais, o ferro encontra-se no estado de oxidação 2+, podendo formar duas ligações extra, uma de cada lado do plano do grupo heme (5ª e 6ª posições de coordenação). Na mioglobina, a 5ª posição de coordenação vai ser ocupada pelo anel imidazole de um resíduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptídica (proximal histidine) e a 6ª posição pode garantir a ligação ao oxigénio.

In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),

« sem oxigénio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). Fora de um sistema biológico, a

forma oxi-Mb (Fe 2+ -O 2 -Mb) pode ser convertida a met-Mb (Fe 3+ -H 2 O-Mb), através da

libertação de uma molécula de O 2 e ligação de H 2 O.

Objectivo: Extrair e purificar a mioglobina a partir de tecido animal. Calcular a quantidade de

mioglobina no tecido de partida.

Técnicas utilizadas:

Centrifugação

Uso da força centrífuga para sapara partículas por sedimentação;

Partículas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;

Espectroscopia UV-Visível

Trata-se da espectroscopia de absorção em que são utilizados comprimentos de onda da região do ultra violeta à região do visível.

Este método consiste na medição da quantidade de radiação absorvida, traduzindo-se esta medição em valores de absorvência. A maior aplicação deste método é a determinação de concentrações de compostos, e para esse efeito, é utilizada a lei de Lambert-Beer, que nos dá a concentração da substância em função da absorvência num determinado intervalo de linearidade (A=εlc).

Cromatografia de exclusão molecular

Separação dos agentes redox da mioglobina;

Separação de moléculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das moléculas;

Uso do Gel Sephadex G-25;

Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.

Método de Lowry

Usado para a determinação da concentração proteica, através da construção de rectas de calibração;

O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre(II), e produz um composto com absorção máxima em 750nm.

É um método muito sensível.

Procedimento:

Colocar 10 g de carne picada e 20 mL de tampão fosfatos (20mM pH 5,6) num tubo de centrífuga

mL de tampão fosfatos (20mM pH 5,6) num tubo de centrífuga Misturar com uma vareta, durante

Misturar com uma vareta, durante cerca de

1 minuto.

Misturar com uma vareta, durante cerca de 1 minuto. Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos

Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos (Rotor JA-

20)

Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos (Rotor JA- 20) Ler Abs a 635, 580, 542

Ler Abs a 635, 580, 542 e 505 nm. O restante

sobrenadante é

dividido em duas

partes

nm. O restante sobrenadante é dividido em duas partes Traçar espectro UV/Vis (250-800 nm) de S,

Traçar espectro

UV/Vis (250-800 nm) de S, diluindo S 1:3

com o tampão inicial

(250-800 nm) de S, diluindo S 1:3 com o tampão inicial Remover e guardar o sobrenadante

Remover e guardar

o sobrenadante (S) com uma pipeta de

Pasteur.

1.

Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertação da mioglobina. Deve

evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar ácidos gordos e/ou ácidos nucleicos, o que é indesejável

2.

A

centrifugação separa as partículas por sedimentação; devem equilibrar-se cada dois

tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar.

3.

Não pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que não interessa aproveitar.

4.

Os picos de absorção para os complexos de mioglobina são para a 635 e 505 nm (para

a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina reduzida), na região do visível.

505 nm (para a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina
505 nm (para a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina
Resultados: Tubos   Absorvências BSA Proteína ( diluída 1:20) F1+F2* 1 0,810 0,431 1,007

Resultados:

Tubos

 

Absorvências

BSA

Proteína ( diluída 1:20)

F1+F2*

1

0,810

0,431

1,007

2

0,742

0,383

0,902

3

0,539

0,310

0,608

4

0,327

0,258

0,341

*Fracções recolhidas da coluna de filtração em gel.

1. Cálculo da massa de proteína total na carne

Massa da carne: 10,07g

[BSA] = 0,5 mg/mL

BSA

1-

200 µL de BSA [] = 0,5 mg/mL Massa = 100 µg

2-

150 µL de BSA + 50 µL de água [] = 0,375 mg/mL Massa = 75 µg

3-

100 µL de BSA + 100 µL de água [] = 0,25 mg/mL Massa = 50 µg

19

4-

50 µL de BSA + 150 µL de água [] = 0,125 mg/mL Massa = 25 µg

TOTAL: 200 µL + 2 mL de reagente C + 200 µL de reagente D = 2,4 mL

Ex. Cálculo da massa do tubo 2:

Curva de calibração:

Curva de calibração - BSA

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 y = 0.0081x + 0.0766 R² = 0.9525
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
y = 0.0081x + 0.0766
R² = 0.9525
0.3
0.2
0.1
0
0
20
40
60
80
100
120
Abs

Massa (mg)

Através da recta de calibração calcula-se a massa de proteína:

Diluições:

1

2

3

4

Média dos valores de concentração calculados: (0,219 + 0,252 + 0,288 + 0,448) / 4 = 0,3 mg/mL

calculados: (0,219 + 0,252 + 0,288 + 0,448) / 4 = 0,3 mg/mL Na cuvette colocou-se

Na cuvette colocou-se 1 mL de uma solução anterior com 2,4 mL. Calculou-se então a massa de proteína nessa solução:

0,3 mg 1 mL

X 2,4 mL

X = 0,72 mg de proteína.

0,1 mL da solução de 2,4 mL foram retirados do sobrenadante diluído, que tinha 20 mL. Assim, no sobrenadante diluído tem-se:

0,72 mg 0,1 mL

Y 20 mL

Y = 14,4 mg de proteína.

O sobrenadante tinha sofrido uma diluição de 1:20, logo a massa de proteína no sobrenadante é:

14,4 mg 1 mL

Z 20 mL

Z = 288 mg de proteína no sobrenadante.

2.

Cálculo da massa de mioglobina

No cálculo da massa de mioglobina, considera-se que toda a mioglobina que se aplicou na coluna cromatográfica foi oxidada, logo a mioglobina oxidada equivale à mioglobina total presente.

Massa de proteína na cuvette:

Diluições:

1

2

3

4

Média dos valores de concentração calculados: (0,574 + 0,68 + 0,656 + 0,652) / 4 = 0,64 mg/mL

Na cuvette colocou-se 1 mL de uma solução anterior com 2,4 mL. Calculou-se então a

Na

cuvette colocou-se 1 mL de uma solução anterior com 2,4 mL. Calculou-se então a massa

de

mioglobina nessa solução:

0,64 mg 1 mL

X 2,4 mL

X = 1,536 mg

0,2 mL da solução de 2,4 mL foram retirados de uma solução de 10 mL. Assim, tem-se:

1,536 mg 0,2 mL

Y 10 mL

Y = 76,8 mg

Na coluna inseriu-se 1mL de sobrenadante diluído, da qual se retiraram 2 mL, pelo que a massa de proteína no sobrenadante diluído é:

O sobrenadante

sobrenadante é:

tinha

sofrido

uma

76,8 mg 1 mL

Z 2 mL

Z = 152,4 mg

diluição

de

1:20,

logo

a

massa

de

mioglobina

no

Conclusões:

152,4 mg 1 mL

W 20 mL

W = 3048 mg de mioglobina.

Massa de proteína em 10g de carne: 288 mg

Massa de mioglobina em 10g de carne: 3048 mg

O resultado obtido não é coerente, o que pode dever-se a erros experimentais e ao facto de nenhum valor de absorvência da mioglobina estar contido na recta de calibração com BSA, podendo estar o valor da massa de mioglobina sobrestimado.

Dado que ocorreram erros experimentais e os valores das massas obtidos não são correctos, nada se pode concluir a partir do grau de pureza.

MIOGLOBINA: ESPECTROSCOPIA UV-VISÍVEL

Introdução:

Proteína em estudo:

Mioglobina:

Proteína hémica monomérica (uma só cadeia polipeptídica);

Massa molecular de 16,7 kDa;

A sua estrutura secundária consiste maioritariamente em hélices α;

Encontra-se no músculo cardíaco e esquelético;

Função primária armazenamento de oxigénio (O 2 ) e fornecimento do mesmo em caso de necessidade energética;

Possui 153 aminoácidos e um único grupo hémico (protoporfirina IX de ferro), que consiste na associação de uma porfirina com um átomo de ferro. Grupo heme:

o

O heme é um grupo prostético contendo um átomo de ferro, componente de muitas proteínas.

o

O grupo heme é constituído por uma parte orgânica (protoporfirina) e por um átomo de ferro. A protoporfirina é constituída por 4 anéis pirrólicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel tetrapirrólico. O átomo de ferro liga-se à protoporfirina através de interacções com os átomos de azoto dos anéis pirrólicos. Em condições normais, o ferro encontra-se no estado de oxidação 2+, podendo formar duas ligações extra, uma de cada lado do plano do grupo heme (5ª e 6ª posições de coordenação). Na mioglobina, a 5ª posição de coordenação vai ser ocupada pelo anel imidazole de um resíduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptídica (proximal histidine).

In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),

sem oxigénio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). No primeiro estado, a 6ª posição de

coordenação do ferro do heme encontra-se desocupada sendo que a ligação de uma

molécula de O 2 causa uma ligeira alteração conformacional, alterando o estado da

mioglobina para oxi-Mb. Fora de um sistema biológico, a forma oxi-Mb (Fe 2+ -O 2 -Mb)

pode ser convertida a met-Mb (Fe 3+ -H 2 O-Mb), através da libertação de uma molécula

de O 2 e ligação de H 2 O.

Oxi e Met Mioglobina

Oxi-Mb

Forma reduzida de Mb;

Presente na superfície da carne fresca - cor vermelha;

O O 2 liga-se na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme;

Apresenta picos a 542 nm e 580 nm

Na região de Soret os picos são a 417nm e 348nm.

Met-Mb

Forma oxidada de Mb;

Presente na carne mais “envelhecida” – cor castanha;

O H 2 O liga-se na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme;

Forma-se nas zonas com baixa concentração de O 2 ;

Apresenta picos a 504 nm e 635 nm;

Na região de Soret o pico é a 409nm.

Os picos da região de Soret permitem encontrar a razão oxi-Mb/met-Mb.

Reacções redox

Pode ocorrer interconversão das formas Oxi a Met, por acção de agentes oxidantes (1), numa reacção onde um electrão do ferro é doado ao agente oxidante, ou de Met a Oxi por acção de agentes redutores (2), que doam um electrão ao ferro.

de agentes redutores (2), que doam um electrão ao ferro. Objectivo: Extrair e identificar a oxi-Mb

Objectivo: Extrair e identificar a oxi-Mb e a met-Mb através das suas propriedades espectrais. Estudo da reacção redox de interconversão.

Técnicas utilizadas:

Centrifugação

Uso da força centrífuga para sapara partículas por sedimentação;

Partículas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;

Espectroscopia UV-Visível

Trata-se da espectroscopia de absorção em que são utilizados comprimentos de onda da região do ultra violeta à região do visível.

Este método consiste na medição da quantidade de radiação absorvida, traduzindo-se esta medição em valores de absorvência. A maior aplicação deste método é a determinação de concentrações de compostos, e para esse efeito, é utilizada a lei de Lambert-Beer: A=εlc, que nos dá a concentração da substância em função da absorvência num determinado intervalo de linearidade.

Cromatografia de exclusão molecular

Separação dos agentes redox da mioglobina;

Separação de moléculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das moléculas;

Uso do Gel Sephadex G-25;

Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.

Procedimento:

Colocar 10 g de carne picada e 20 mL de tampão fosfatos (20mM pH 5,6) num tubo de centrífuga

mL de tampão fosfatos (20mM pH 5,6) num tubo de centrífuga Misturar com uma vareta, durante

Misturar com uma vareta, durante cerca de 1 minuto.

Misturar com uma vareta, durante cerca de 1 minuto. Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos

Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos (Rotor JA-

20)

Centrifugar a 5000 rpm, durante 60 minutos (Rotor JA- 20) Ler Abs a 635, 580, 542

Ler Abs a 635, 580, 542 e 505 nm. O restante

sobrenadante é

dividido em duas

partes

nm. O restante sobrenadante é dividido em duas partes Traçar espectro UV/Vis (250-800 nm) de S,

Traçar espectro

UV/Vis (250-800 nm)

de S, diluindo S 1:3 com o tampão inicial

(250-800 nm) de S, diluindo S 1:3 com o tampão inicial Remover e guardar o sobrenadante

Remover e guardar

o sobrenadante (S)

com uma pipeta de Pasteur.

5.

Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertação da mioglobina. Deve evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar ácidos gordos e/ou ácidos nucleicos, o que é indesejável

6.

A

centrifugação separa as partículas por sedimentação; devem equilibrar-se cada dois

tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar.

7.

Não pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que não interessa aproveitar.

8.

Os picos de absorção para os complexos de mioglobina são para a 635 e 505 nm (para

a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina reduzida), na região do visível.

28
28
Resultados: Espectro experimental da mioglobina: • Os picos 33, 35 e 36 são característicos da

Resultados:

Espectro experimental da mioglobina:

Os picos 33, 35 e 36 são característicos da forma reduzida da mioglobina, Oxi-Mb, sendo que pico 33 corresponde à zona de Soret.

O pico 34 é caracteristico da forma oxidada da Mioglobina, Met-Mb, correspondendo ao seu pico na zona de Soret.

Espectro experimental da mioglobina oxidada (Met-Mb):

Os picos observados, 405, 575 e 623, são os correspondentes aos teóricos nos comprimentos de onda 409, 504 e 635.

Foi ainda medida a absorvência a 409 nm, correspondente ao pico teórico da zona de Soret da Met-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,945.

Espectro experimental da mioglobina reduzida (Oxi-Mb):

Os picos observados, 411, 539 e 577, são os correspondentes aos teóricos nos comprimentos de onda 417, 542 e 580.

Foi ainda medida a absorvência a 417 nm, correspondente ao pico teórico da zona de Soret da Oxi-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,386.

Comprimento de onda

Abs sobrenadante

Abs Oxi-Mb

Abs Met-Mb

409

1,870

1,392

1,945

417

1,848

1,386

1,412

505

0,455

0,215

0,332

542

0,488

0,244

0,272

546

-

0,239

0,266

580

0,451

0,221

0,222

635

0,311

0,109

0,194

Cálculo da concentração de Oxi-Mb e Met-Mb na amostra inicial

Primeiro foram calculadas as concentrações para a Oxi-Mb e Met-Mb que foram isoladas a partir da cromatografia de exclusão molecular. Os valores de para a Oxi-Mb e de para a Met-Mb foram retirados do protocolo experimental.

[Oxi-Mb] a 417 nm

Como se realizou previamente uma diluição 1:3, a concentração de Met-Mb na amostra inicial será então três vezes a calculada acima

[Met-Mb] a 409 nm

Como se realizou previamente uma diluição 1:3, a concentração de Met-Mb na amostra inicial será então três vezes a calculada acima

[Oxi-Mb] e [Met-Mb] na amostra inicial (sobrenadante)

Valores de ε a

Oxi-Mb

e

nm para os dois estados da mio lobina

Os valores utilizados são correspondentes à absorvência da Oxi-Mb a 409 nm e à [Oxi- Mb] calculada anteriormente.

Met-Mb

Os valores utilizados são correspondentes à absorvência da Met-Mb a 417 nm e à [Met-Mb] calculada anteriormente.

Cálculo das concentrações na amostra inicial

Valores de absorvência do sobrenadante a 409 e 417 nm.

Valores de absorvência do sobrenadante a 409 e 417 nm. Como se realizou previamente uma diluição

Como se realizou previamente uma diluição 1:3, as concentrações na amostra inicial serão então três vezes a calculada acima

Razão Oxi-Mb/Met-Mb

A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma molécula de O 2 se liga na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme.

Conclusões:

A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma molécula de O 2 se liga na posição 6 de coordenação do ferro do grupo heme.

Pelos espectros obtidos verificou-se um sucesso parcial da extracção da mioglobina reduzida e oxidada;

No espectro da mioglobina oxidada os picos de absorção são aos comprimentos de onda 575 e 623 nm e deveriam ser a 504 e 635 nm;

No espectro da mioglobina reduzida os picos de absorção são aos comprimentos de onda 539 e 577 nm e deveriam ser a 542 e 580 nm;

Os picos das bandas de Soret da mioglobina oxidada são: Teórico - 409, prático 405;

Os picos das bandas de Soret da mioglobina reduzida são: Teórico - 417, prático 411;

Apesar dos valores não corresponderem exactamente , verificou-se para o espectro da Met-Mb o desaparecimento dos picos de absorção da Oxi-Mb e vice-versa, revelando que não há contaminação das fracções obtidas.

FTIR E FLUORESCÊNCIA

Introdução:

Luminescência: Emissão de luz a partir de uma substância que ocorre a partir de estados excitados. É formalmente dividida em duas categorias Fosforescência e Fluorescência dependendo da natureza do estado excitado.

A fosforescência é a emissão de luz a partir da excitação de um electrão para um estado de tripleto excitado. O electrão excitado tem o mesmo spin que o seu par da orbital do estado fundamental. As transições para o estado fundamental são proibidas - não tem “permissão” de spin - e as taxas de emissão são muito lentas, por isso os tempos de vida da fosforescência são tipicamente entre milissegundos e segundos.

A fluorescência é a emissão de luz a partir da excitação de um electrão para um estado de singuleto excitado. O electrão excitado tem spin oposto do seu par do estado fundamental. Consequentemente, o regresso ao estado fundamental é permitido “permissão” de spin – e ocorre rapidamente pela emissão de um fotão. As taxas de emissão são tipicamente de 10 8 s -1 , pelo que o tempo de vida típico da fluorescência é cerca de 10 ns (10 x 10 -9 s).

da fluorescência é cerca de 10 ns (10 x 10 - 9 s). Fluorescência  Serve

Fluorescência

Serve para o estudo de moléculas biológicas (estado das membranas biológicas, vesículas, proteínas células vivas, etc.).

É um processo com grande sensibilidade de detecção, sendo possível trabalhar

a muito baixas concentrações.

Quando comparado com o doseamento espectrofotométrico é mais sensível já que reflecte as propriedades do microambiente da molécula no estado excitado sendo que este é influenciado pelo pH, temperatura, pressão, ligações de hidrogénio.

A

fluorescência ocorre tipicamente a partir de compostos aromáticos, como os

apresentados na figura abaixo.

O processo que ocorre entre a absorção e emissão de luz é usualmente descrito pelo

O processo que ocorre entre a absorção e emissão de luz é usualmente descrito pelo diagrama de Jablonski:

de luz é usualmente descrito pelo diagrama de Jablonski: S 0 , S 1 e S

S 0 , S 1 e S 2 correspondem respectivamente ao estado fundamental, primeiro e segundo níveis de energia. Em cada um destes níveis electrónicos os fluoróforos (molécula ou parte de uma molécula que emite fluorescência seguindo a excitação com a luz) podem existir em diferentes níveis de energia vibracionais (0, 1, 2, etc.). As transições entre estados são representadas como linhas verticais. Um fluoróforo é geralmente excitado para níveis vibracionais elevados de S 1 ou S 2 . Com algumas excepções, as moléculas são rapidamente relaxadas para o estado vibracional mais baixo de S 1 . Este processo é denominado conversão interna e ocorre em cerca de 10 -12 s ou menos. Como os tempos de vida da fluorescência são geralmente cerca de 10 -8 s, a conversão interna é completada antes da emissão.

O regresso ao estado fundamental ocorre tipicamente de um estado excitado vibracional baixo de S 1 para os níveis vibracionais altos de S 0 , com a emissão de fotões. Rapidamente o electrão passa para os níveis vibracionais baixos de S 0 , voltando ao estado fundamental.

As moléculas do estado S 1 podem sofrer uma conversão de spin para o primeiro estado tripleto (T 1 ). A emissão a partir de T 1 é a fosforescência. A conversão de S 1 para T 1 é denominada cruzamento inter-sistemas (ocorre entre dois estados vibracionais isoenergéticos pertencentes a estados electrónicos com diferentes multiplicidades).

Características da Fluorescência:

Efeito da polaridade do solvente A polaridade do solvente e o microambiente têm profundos efeitos nos espectros de emissão dos fluoróforos.

o Desvio de Stokes

Geralmente o comprimento de onda de emissão é maior do que o de excitação. Uma causa habitual para o desvio de Stokes é o rápido decaimento para o nível vibracional mais baixo de S1. Os fluoróforos geralmente passam para os níveis vibracionais mais elevados de S0, resultando numa posterior perda de energia de excitação. Para além destes efeitos, os fluoróforos podem sofrer desvios de Stokes devido a efeitos dos solventes, reacções do estado excitado, formações de complexos e transferência de energia.

Os efeitos do solvente diminuem a energia de emissão devido à estabilização do estado excitado pelas moléculas do solvente polar. O fluoróforo tem um maior momento dipolar no estado excitado (μ E ) do que no estado fundamental (μ G ). Depois da excitação os dipolos do solvente podem reorientar-se ou sofrer relaxação à volta de μ E , o que diminui a energia do estado excitado. À medida que a polaridade do solvente aumenta, este efeito é também aumentado, resultando numa emissão a menor energia. Por esta razão, quando se altera a polaridade do solvente, os espectros de emissão sofrem desvios. Em geral, apenas fluoróforos que são polares têm uma grande sensibilidade a solventes polares. Os fluoróforos apolares não sofrem desvios de Stokes com a variação da polaridade do solvente. O tempo de vida de fluorescência é geralmente muito maior do que o tempo necessário para a relaxação do solvente. Por esta razão, as moléculas do solvente reorientam- se à volta do dipolo do fluoróforo, e dão-se desvios nos espectros de emissão. Assim, estes espectros são muito mais sensíveis ao ambiente e à polaridade do solvente do que os espectros de absorção/excitação. A absorção/excitação ocorre a uma velocidade muito grande, pelo que não há tempo para que as moléculas do solvente se reorganizem, não havendo desvios nos espectros que se obtêm.

 Excepções à Regra da Imagem no Espelho Geralmente os espectros de absorção e emissão

Excepções à Regra da Imagem no Espelho

Geralmente os espectros de absorção e emissão são a imagem um do outro no espelho. No entanto, existem várias excepções a regra que se devem aos seguintes factores:

o

A emissão dá-se a partir duma espécie diferente da espécie que absorveu o fotão (isto é, dá-se uma reacção no estado excitado). A emissão dá-se sempre a partir da espécie protonada, logo, no caso desta excepção, a espécie protonada não é a que recebeu o fotão;

o

A emissão dá-se a partir dum estado diferente daquele que resultou da absorção (a emissão dá-se geralmente a partir de S1, logo, neste caso, a molécula pode ter sido excitada para S2);

o

O espectro de absorção corresponde a duas transições quase iso-energéticas (como por exemplo o caso do Triptofano, em que ocorre transição entre dois estados singuletos excitados de baixa energia).

por exemplo o caso do Triptofano, em que ocorre transição entre dois estados singuletos excitados de
 Tempos de vida de Fluorescência e Rendimento Quântico O tempo de vida (tempo que

Tempos de vida de Fluorescência e Rendimento Quântico O tempo de vida (tempo que a molécula passa no estado excitado antes de regressar ao estado fundamental) e o rendimento quântico (número de fotões emitidos por número de fotões absorvidos) são características muito importantes de um fluoróforo. Substâncias com maiores rendimentos quânticos têm maiores emissões (mais brilhantes). O tempo de vida determina o tempo disponível para o fluoróforo interagir ou difundir-se no meio e por isso fornece informação sobre a sua emissão.

Espectrofluorímetro

Com a maior parte dos espectrofluorímetros é possível registar os espectros de emissão e excitação. Estes espectros podem ser apresentados em escalas de comprimentos de onda ou de números de onda.

Para a maior parte dos fluoróforos os rendimentos quânticos e os espectros de emissão são independentes do comprimento de onda de excitação.

Num caso ideal, os espectros de excitação e emissão devem representar a intensidade relativa de fotões por intervalo de comprimento de onda. Para obter tal espectro “correcto” os componentes individuais devem ter as seguintes características:

A fonte de luz deve produzir uma emissão constante de fotões a todos os comprimentos de onda;

O monocromador deve passar fotões de todos os comprimentos de onda com a mesma eficiência;

A eficiência do monocromador deve ser independente da polarização;

O detector (tubo fotomultiplicador) deve detectar fotões de todos os comprimentos de onda com igual eficácia.

Espectros de excitação e emissão O espectro de fluorescência é geralmente apresentado como espectro de

Espectros de excitação e emissão

O espectro de fluorescência é geralmente apresentado como espectro de emissão (intensidade de fluorescência vs. número de onda). Este espectro varia muito e depende da estrutura química do fluoróforo e do solvente no qual se dissolve.

Espectro de emissão

Representa a frequência de fotões emitidos ou energia emitida a cada comprimento de onda.

Para o traçar, é escolhido um comprimento de onda de excitação fixo, e de seguida é percorrido toda a gama de comprimento de onda pelo monocromador de excitação.

Razões de distorção do espectro:

o

Dependência da eficiência da emissão da energia por parte do monocromador de emissão e do fotomultiplicador;

o

Absorção de radiação por parte da amostra.

Espectro de excitação

Representa a emissão relativa do fluoróforo a cada comprimento de onda de excitação.

Para o traçar, o monocromador de emissão é calibrado ao comprimento de onda de emissão máximo da amostra, e faz-se correr a gama de comprimentos de onda pelo monocromador de excitação.

Razões de distorção do espectro:

o

A intensidade da luz da fonte de excitação está dependente da gama de comprimentos de onda;

o

A eficiência da transmissão do monocromador de excitação deve-se também à gama de comprimento de onda;

o

A substância pode ter absorvência superior.

Fluorescência de proteínas - O triptofano como composto modelo

Nas proteínas há três aminoácidos fluorescentes: fenilalanina, tirosina e triptofano. Estes aminoácidos são relativamente raros nas proteínas. O triptofano é o fluoróforo intrínseco dominante. O número reduzido de resíduos de triptofano é provavelmente o resultado do custo metabólico da sua síntese. Uma proteína pode ter apenas um ou alguns resíduos de triptofano, o que facilita a interpretação dos dados do espectro.

o que facilita a interpretação dos dados do espectro. Um factor importante é a sensibilidade do

Um factor importante é a sensibilidade do triptofano ao seu microambiente. Alterações no espectro de emissão do triptofano ocorrem frequentemente devido a modificações conformacionais, ligação a substratos ou desnaturação. Este resíduo é sensível a ligações de hidrogénio e sofre frequentemente “quenching” (extinção) por algumas cadeias laterais.

Um factor que complica a interpretação da fluorescência das proteínas é a presença dos vários aminoácidos fluorescentes na maioria das proteínas. No entanto os espectros de emissão das proteínas são dominados pelo triptofano que absorve e emite a maiores comprimentos de onda e numa gama de comprimentos de onda maior. O triptofano tem um maior coeficiente de absortividade molar. A energia absorvida pela fenilalanina e tirosina é muitas vezes transferida para os resíduos de triptofano da mesma proteína. A excitação das proteínas geralmente ocorre a um máximo próximo de 280 nm. Consequentemente, a fenilalanina não é excitada nesta experiência, e como o seu rendimento quântico é muito pequeno, a emissão deste resíduo é raramente observada para proteínas. A absorção de proteínas a 280 nm deve-se aos resíduos de tirosina e triptofano. A comprimentos de onda de 295 nm ou superior, a absorção deve-se principalmente ao triptofano. Este resíduo pode ser selectivamente excitado a comprimentos de onda entre 295 e 305 nm. Por esta

razão, efectuou-se a excitação da mioglobina a 295 nm e não no máximo de excitação do triptofano, evitando-se a excitação da tirosina e da fenilalanina (os outros resíduos fluorescentes). Assim, a 295 nm apenas o triptofano emite e por isso evita-se coalescência de espectros. Há, no entanto, um problema quando existem vários resíduos de triptofano em solução: os espectros de emissão dos diferentes resíduos ficam sobrepostos, cada um com um microambiente único.

ficam sobrepostos, cada um com um microambiente único. Fluorescência da Mioglobina A mioglobina é uma proteína
ficam sobrepostos, cada um com um microambiente único. Fluorescência da Mioglobina A mioglobina é uma proteína

Fluorescência da Mioglobina A mioglobina é uma proteína com dois resíduos de triptofano (Trp-7 e Trp-14) que se encontram no interior hidrófobo da proteína. Quando a proteína é desnaturada, estes resíduos são expostos ao solvente e como são fluoróforos polares, sofrem desvio de Stokes, havendo desvios nos espectros de emissão da mioglobina quando esta se encontra no estado nativo e desnaturado.

FTIR

FTIR - técnica

Apesar de existirem técnicas que fornecem informação mais detalhada sobre a estrutura de proteínas (como a cristalografia de raios X), estas muitas vezes não podem ser aplicadas visto que as proteínas nem sempre formam um cristal de qualidade suficiente para análise. A técnica de FTIR dá também informação sobre a estrutura secundária, enquanto que a cristalografia de raios X e outras técnicas fornecem informações sobre a estrutura terciária.

FTIR (Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier) é uma técnica que realiza a medição do comprimento de onda e da intensidade de absorção em infravermelho

por uma amostra. Compostos diferentes têm bandas de absorção características no espectro

IV.

Um monocromador é desnecessário, pois faz-se uso de um interferómetro que encripta todas as frequências da radiação IV num sinal único. A radiação incidente é divida em dois feixes (beamsplitter) e o espelho móvel provoca a alteração da distância percorrida que leva à interferência entre os dois feixes. A radiação infravermelha passa pela amostra, com alguma a ser absorvida e outra a ser transmitida. O interferograma resultante representa todas as frequências medidas simultaneamente e todos os seus pontos têm informação codificada.

Por fim, aplica-se a transformada de Fourier no interferograma final, obtendo-se o

espectro.

Bandas do espectro

As bandas observadas nos espectros IV devem-se aos movimentos vibracionais dos átomos nas moléculas que façam variar o seu momento dipolar permanente, μ.

Existem várias bandas características de aminoácidos específicos, no entanto as mais importantes referentes às ligações peptídicas e que permitem um estudo da estrutura secundária são a Amida I e a Amida II, pois relacionam-se com as ligações por pontes de hidrogénio estabelecidas.

A banda amida I deve-se às vibrações stretching (elongamento) da ligação C dupla O do grupo amida; o número de onda dos fotões absorvidos é 1600-1690 cm -1

A banda amida II - deve-se às vibrações bending (dobramento) da ligação NH ; o número de onda dos fotões absorvidos é 1480-1575 cm -1

Ambos os grupos estão envolvidos em ligações por pontes de hidrogénio, que ocorrem entre diferentes elementos de estrutura secundária. Assim, a existência deste tipo de bandas e sua posterior análise em certos números de onda específicos indicam que tipo de estrutura secundária está presente.

Amida I vs Amida II

A região do espectro mais sensível à estrutura secundária das proteínas é a banda da Amida I (1700-1600 cm -1 ), resultante inteiramente do stretching da ligação C=O das ligações peptídicas. As frequências dos componentes estão relacionados com cada tipo de motivo estrutural secundário.

Por outro lado, a banda Amida II deriva maioritariamente do bending da ligação no plano NH e da vibração do stretching do CN, o que mostra muito menos sensibilidade à conformação proteica.

Métodos de melhoramento dos espectros Há dificuldades na análise da banda de amida I para identificação de estruturas secundárias, devido às diferenças de frequência serem muito pequenas em relação à largura da banda; assim obtém-se um só pico irregular em vez de vários para cada tipo de estrutura secundária. Têm vindo a ser desenvolvidos métodos para melhorar este aspecto como o método de desconvolução de Fourier e o das segundas derivadas.

FTIR e mioglobina e γ-globulina

Nesta actividade experimental pretendia-se identificar as bandas da Amida I que permitissem identificar as estruturas secundárias da mioglobina e comparar com as da γ- globulina.

A mioglobina é uma proteína cuja estrutura secundária é constituída maioritariamente por hélices α, portanto, no espectro de FTIR é esperado que o mínimo de absorção seja para número de onda 1656 cm -1 (número de onda atribuído à estrutura de hélices α em H 2 O).

A γ-globulina é uma proteína cuja estrutura secundária é constituída maioritariamente por folhas β; no espectro de FTIR é esperado que os valores mínimos de absorção sejam para números de onda: 1624, 1627, 1633, 1638, 1642, 1691 e 1696 cm -1 e 1642 (números de onda atribuídos à estrutura de folhas β em H 2 O).

Procedimento:

Espectros de excitação e emissão de fluorescência do triptofano e da mioglobina

43
43
Resultados: Espectros de fluorescência do triptofano Não se observaram diferenças significativas nos espectros de
Resultados: Espectros de fluorescência do triptofano Não se observaram diferenças significativas nos espectros de

Resultados:

Espectros de fluorescência do triptofano

Não se observaram diferenças significativas nos espectros de excitação do triptofano.

O espectro de emissão do triptofano em etanol tem um máximo a 335 nm e o do

triptofano em tampão fosfatos a 350 nm. Estes espectros sofrem o efeito de relaxação do

solvente.

A relaxação do solvente consiste na estabilização das moléculas no estado excitado

por interacção com as moléculas do solvente, sendo este efeito maior quanto maior for a

polaridade do composto em causa. Como o tampão de fosfatos é mais polar que o etanol o

estado excitado do triptofano em tampão é menos energético e por isso o espectro de

emissão é a comprimentos de onda maiores, sendo o do etanol a comprimentos de onda

menores.

Isto só acontece porque o momento dipolar da molécula no estado excitado é maior

do que no estado fundamental.

Por a emissão em fluorescência ser mais lenta que a excitação, pode dizer-se que os

espectros de emissão são mais sensíveis ao ambiente, permitindo, por exemplo, a

reorientação do solvente (efeito de relaxação do solvente).

Espectros de fluorescência da mioglobina

No intervalo de comprimentos de onda utilizado, apenas o triptofano (dos três aminoácidos aromáticos) é fluorescente - causa a fluorescência da mioglobina.

O máximo da mioglobina nativa é semelhante ao máximo de triptofano em etanol,

pois quando a proteína se encontra no estado nativo os resíduos de triptofano (os dois que a mioglobina possui) estão num microambiente relativamente apolar, no interior da proteína.

O espectro de emissão da mioglobina desnaturada é semelhante ao do triptofano em

tampão, pois ocorre desnaturação da mioglobina, ficando os resíduos de triptofano sujeitos a

um microambiente polar, semelhante ao triptofano em tampão.

Variação da intensidade de fluorescência da mioglobina com o pH

Existe um máximo de intensidade de fluorescência em redor do pH 4, um mínimo de intensidade de fluorescência em redor de pH 6 e a partir daí uma nova subida da intensidade.

pH 3.5: a diminuição da fluorescência pode dever-se à protonação de um carboxilo próximo, já que os dados não indicam que ocorram mudanças conformacionais;

pH 4: máximo de fluorescência

pH 6: mínimo de fluorescência porque o pKa da histidina é próximo de 6 e a este pH

a cadeia lateral do resíduo é protonada; quando isto ocorre a intensidade da fluorescência é diminuída;

pH 7 : estabilização devido à desprotonação de outros resíduos de aminoácidos;

Diminuindo o pH: aumento da fluorescência, devido ao desenrolamento da proteína, que leva ao afastamento dos resíduos de histidina e triptofano; os resíduos de triptofano ficam mais expostos, havendo um aumento da intensidade de fluorescência.

Comparação com gráfico para a apomioglobina

As observações feitas na aula são semelhantes às obtidas por Irace e colaboradores, embora no artigo de Irace se tenha usado apomioglobina.

Comparação com gráfico de Gryczynski e colaboradores

O gráfico de Gryczynski e colaboradores foi feito para a mioglobina de coração de

cavalo

O desvio que se observa entre os espectros de pH 7 e pH 4,5 na zona do IV prova o desenrolamento da proteína, verificado também para o gráfico de Gryczynski .

Ao dar-se o desenrolamento, os resíduos ficam mais expostos, havendo um aumento na intensidade de fluorescência.

FTIR

Ftir mioglobina

 

Número de onda (

Banda característica

1536.99

Amida II

1656.56

Amida I (hélice α)

3299.92

Amida A

Ftir globulina

Número de onda (

Banda característica

615,18

Amida V

1236.15

Amida III

1531.21

Amida II

1643.06

Amida I (folha β)

3286.12

Amida A

Comparação da estrutura secundária das proteínas obtida através de FTIR e de cristalografia de raio-X

A

γ-globulina

é

uma

imunoglobulina

imunoglobulina G para comparação.

pelo

que

foi

usada

a

informação

relativa

à

Os resultados obtidos por FTIR estão consistentes com a tabela apresentada, no entanto não se encontraram folhas β na mioglobina

Conclusão:

A γ-globulina é uma imunoglobulina pelo que foi usada a informação relativa à imunoglobulina G para comparação;

Os resultados obtidos por FTIR estão consistentes com a tabela apresentada, no entanto não se encontraram folhas β na mioglobina.

As técnicas de fluorescência e de FTIR complementam-se;

A primeira fornece informação acerca da constituição em resíduos de aminoácidos da proteína e o microambiente onde se encontram inseridos;

A segunda garante uma visão sobre a estrutura secundária da proteína, conseguindo assim através da utilização destas duas técnicas uma visão única sobre a estrutura tridimensional da proteína em estudo.

RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL RAZÃO ADP/O E RAZÃO DE CONTROLO RESPIRATÓRIO

1.

Introdução

Transporte electrónico e fosforilação oxidativa

A fosforilação oxidativa é uma via metabólica que utiliza a oxidação final de glúcidos, lípidos e proteínas (e a energia libertada nestas reacções de oxidação-redução) para produzir ATP, através da fosforilação de ADP. Este processo ocorre nos mitocôndrios. Nesta via ocorre transferência de electrões a partir de doadores electrónicos até aceitadores electrónicos finais, como o oxigénio transporte electrónico.

A cadeia respiratória pode ser separada em 4 complexos enzimáticos:

NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I)

Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II)

Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III)

Citocromo c Oxidase (Complexo IV)

Em plantas, são ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais complexos da cadeia respiratória duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada à zona interna da membrana interna e outra à zona externa da membrana interna) e uma actividade alternativa de oxidase.

Estes complexos, na presença de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidação aeróbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferência electrónica para a ubiquinona a partir de dois doadores de electrões diferentes: NADH (complexo I) e sucinato (complexo II). O complexo III leva electrões da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o complexo IV completa a sequencia transferindo os electrões do citocromo c para o O 2 .

Fosforilação oxidativa o acoplamento do transporte electrónico com a síntese de

ATP Os complexos I, III e IV são centros de acoplamento de energia. Nestes centros de acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrónico é conservada através da sua conversão numa força motriz protónica utilizada para bombear protões para fora da matriz mitocondrial (espaço intermembranar), ocorrendo assim uma translocação vectorial de

protões e a formação de um potencial electroquímico protónico de membrana, podendo então essa energia ser usada para a síntese do ATP. Esta síntese é catalisada por um complexo multienzimático, Complexo V ou ATPsintase.

Inibidores e desacopladores

A fosforilação oxidativa pode ser inibida directamente por uma série de agentes químicos. Uma classe destes compostos (caso do antibiótico oligomicina) inibe a fosforilação oxidativa e

a respiração. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilo-

hidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibição da fosforilação por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respiração e fluxo de electrões mas não ocorre síntese de ATP (há inibição da fosforilação oxidativa mas não da respiração). Uma terceira

classe inclui os inibidores específicos da cadeia de transporte electrónico (rotenona, antimicina

A, cianeto).

transporte electrónico (rotenona, antimicina A, cianeto).  Controlo respiratório O sistema de fosforilação

Controlo respiratório O sistema de fosforilação oxidativa exerce um efeito regulador na velocidade de respiração. Com efeito, as concentrações de ADP e de fosfato limitam a velocidade de transporte electrónico. Uma vez que na maioria das células o fosfato inorgânico se encontra presente em excesso, é o ADP que controla a velocidade de respiração. Nos organismos intactos, existe um alto grau de controlo respiratório e os mitocôndrios dizem-se fortemente acoplados. Quando ocorre dano estrutural no mitocôndrio perde-se este controlo.

RC (respiratory control) refere-se à razão entre as velocidades de consumo de O2 no estado e no estado 4.

O controlo respitatório pode ser ilustrado por uma série de cinco estados que se podem

O controlo respitatório pode ser ilustrado por uma série de cinco estados que se podem repetir ciclicamente.

estado 1 mitocôndrios sozinhos (na presença de Pi)

estado 2 - adição de substrato, respiração baixa devido à falta de ADP (não há reentrada de protões através do ATP sintase e qualquer respiração deve-se à fuga de protões através da membrana)

estado 3 uma quantidade limitada de ADP é adicionada, permitindo uma respiração rápida

estado 4 - todo o ADP foi convertido em ATP (fosforilação) e a respiração torna-se lenta

estado 5 anoxia (ausência de O 2 ) Se a quantidade de ADP adicionado for conhecida então a captação de oxigénio durante o estado 3 pode ser quantificada permitindo o cálculo de uma razão P/O.

Razão ADP/O

A razão ADP/O é o número de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electrões fluindo por um segmento da transferência electrónica para o oxigénio. No cálculo desta razão

o oxigénio é o terminal aceitador. Razões P/O podem ser determinadas através da extensão do estado três acelerado, obtido por adição de ADP no estado 2. Quase todo o ADP é fosforilado a ATP: a razão ATP:ADP é normalmente de 100:1 quando o estado 4 é atingido e a razão moles de ADP adicionado/moles de O2 consumido pode ser calculada.

 Técnicas O eléctrodo de oxigénio Este eléctrodo consiste num eléctrodo de referência de Ag/AgCl

Técnicas

O eléctrodo de oxigénio Este eléctrodo consiste num eléctrodo de referência de Ag/AgCl e um eléctrodo de Pt, ambos imersos em KCl aquoso e separados da câmara onde se inserem as amostras apenas através de uma membrana permeável a O 2 . Este é reduzido a H 2 O no eléctrodo de Pt, gerando uma voltagem referente ao eléctrodo de Ag/AgCl que é proporcional à [O 2 ] na câmara reaccional.

Cátodo:

O 2 + 4e - Ânodo:

2H 2 O

4Ag + + 4Cl -

4AgCl + 4e -

à [O 2 ] na câmara reaccional. Cátodo: O 2 + 4e - Ânodo: 2H 2

Objectivos:

1. A extensão da fosforilação obtida com diferentes substratos (razão ADP/O)

2. O grau de controlo respiratório

3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrónico

2.

Procedimento

Isolamento dos mitocôndrios de batata

É importante ter em conta que, sendo uma experiência em que se pretende manter a actividade mitocondrial, todas as operações devem ser feitas entre 0 e 4ºC e o processo não deve demorar mais que 1h.

Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de batata, começando por se pesar 300g de batata e cortá-la em cubos pequenos.

De seguida efectuou-se a homogeneização em 250 mL de meio de isolamento num batedor eléctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de actividade.

Procedeu-se à filtração num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior centrifugação.

Após a 1ªcentrifugação aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a 8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em meio de lavagem, juntando-se o conteúdo de diferentes tubos (dos vários grupos). Centrifugou-se novamente nas mesmas condições, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em meio de ressuspensão e prosseguiu-se à última centrifugação também a 8000g, 4 graus e durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio de ressuspensão.

Obteve-se assim a fracção mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte.

Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspensão. Estes meios contêm alguns componentes com concentrações adequadas para manter a actividade mitocondrial.

O pH 6,5 é o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manutenção da osmoralidade

do meio, a cisteína previne a oxidação de produtos fenólicos prejudiciais ao mitocôndrio, a BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratório pelo ADP e o EDTA remove metais catalisadores de reacções indesejáveis, mas inibe a respiração induzida pela cisteína,

pelo que é adicionado em concentração baixa.

Determinação das razões ADP/O

Para determinar as razões ADP/O prepararam-se várias soluções: meio recacional, substratos, ADP e o inibidor CCP.

Procedeu-se à calibração do eléctrodo de oxigénio à temperatura ambiente. De seguida saturou-se o meio de reacção com ar, num agitador magnético a 20 graus.

Depois deste processo adicionou-se à câmara reaccional 1,6 mL do meio reaccional e 0,2 mL de suspensão mitocondrial. Colocou-se de seguida a tampa para que o tampão subisse 1cm no canal de injecção e iniciou-se o registo até obtenção de uma linha de base estacionária.

Iniciou-se o primeiro ensaio com a adição de 20 μL de succinato de sódio (substrato), registou-se uns minutos e adicionou-se 20 μL ADP, prosseguindo com o registo até o seu consumo, quando se adiciona novamente 20 μL ADP. Regista-se mais um minuto e adiciona-se CCP (inibidor). Por fim removeu-se a mistura da câmara por aspiração, limpando e enchendo a câmara com água desionizada.

No ensaio seguinte o processo é o mesmo mas com a adição de + 20 μL de ascorbato de sódio+ 20 μL de citocromo c 10 mg/mL como substratos.

3.

Resultados

Calibração do eléctrodo

Calibrou-se o eléctrodo de oxigénio e determinaram-se as concentrações de oxigénio correspondentes a 0% e 100% de O 2 . Foi calibrado a 100% com o meio reaccional oxigenado por agitação e a 0% com o reagente ditionito de sódio.

No protocolo é fornecida uma tabela que nos dá informação sobre conteúdo em O 2 de água saturada com ar:

Tabela 1 - Conteúdo em O 2 de água saturada com ar.

Temperatura ( o C)

O 2 (ppm)

O 2 (μmol/mL)

0

14,16

0,442

5

14,37

0,386

10

10,92

0,341

15

9,76

0,305

20

8,84

0,276

25

8,11

0,253

30

7,52

0,230

35

7,02

0,219

100% O 2 0% O 2
100% O 2
0% O 2

Sabendo que a temperatura ambiente é aproximadamente 25 0 C, a concentração de O 2 na câmara reaccional é 0,253 μmol/mL. O volume da câmara é 2 mL, pelo que é possível calcular o número de moles de O 2 :

Contam-se 77 quadrículas entre o ponto equivalente a 100% de O 2 e o ponto equivalente a 0%. Assim sabe-se que 77 quadrículas equivalem a 506 nmol de O 2 , logo, uma quadrícula corresponde a 506/77 nmol = 6,57 nmol.

Quadrículas

n (O 2 ) /nmol

77

506

1

6,57

Razão ADP/O

1. Ensaio do Succinato (Complexo II)

Razão ADP/O 1. Ensaio do Succinato (Complexo II) 1. 2. Como se quer calcular a razão

1.

2.

Como se quer calcular a razão ADP/O, é necessário calcular as moles de O consumidas, pelo que se tem de multiplicar por dois o número de moles calculado para O 2 :

1. 59,13 x 2 = 118,26 nmol de O consumidas.

2. 32,85 x 2 = 65,7 nmol de O consumidas.

A solução preparada de ADP tinha uma concentração de 10 mM (0,01M = 0,01 mol/L = 10 -8 mol/μL). Adicionaram-se 20 μL, logo pode calcular-se o número de moles:

1.

2.

a

a

o

o

2.

Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sódio (Complexo IV)

Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sódio (Complexo IV) 91,98 x 2 = 183,96

91,98 x 2 = 183,96 nmol de O consumidas

a

o

 

Razão ADP/O

Razão ADP/O

Substrato

experimental

teórica*

Succinato (1)

1,7

1,6

Citocromo c + Ascorbato

1,1

1

*Valores apresentados nos slides de Processos de Oxidação-Redução em Bioquímica fornecidos pela professora da cadeira.

Observou-se que quando se adicionou ADP a um substrato ocorreu sempre consumo de O 2 , pelo que se pode concluir que houve respiração. Os valores obtidos da razão ADP/O são muito semelhantes aos valores teóricos, pelo que se pode admitir que a experiência foi bem sucedida.

Ao adicionar CCP continuou a haver respiração porque, sendo este um desacoplador, provoca a inibição da fosforilação por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respiração e fluxo de electrões mas não ocorre síntese de ATP.

A razão ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque ao longo da cadeia são transportados para fora da matriz menos protões, havendo menos energia disponível para a síntese de ATP. Assim, para que esta não seja diminuída, a actividade da cadeia transportadora de electrões aumenta, levando ao aumento do consumo de O 2 .

No complexo II não ocorre transporte de protões, pelo que não há contribuição para o gradiente electroquímico, o que leva a que a razão ADP/O seja pequena.

No complexo IV a razão ADP/O é inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai ser necessário um maior consumo de oxigénio para produzir a mesma quantidade de ATP (consumir a mesma quantidade de ADP).

Controlo Respiratório

• Regulação da velocidade de transporte electrónico pelo ADP; • Razão entre as velocidades de consumo de O 2 no estado 3 e no estado 4.

o Estado 3 – Uma quantidade limitada de ADP é adicionada, permitindo uma respiração rápida;
o
Estado 3 – Uma quantidade limitada de ADP é adicionada, permitindo uma respiração
rápida;
o
Estado 4 – Todo o ADP foi convertido em ATP e a respiração torna-se lenta.
ontrolo
espirat rio
1.
Ensaio do Succinato (Complexo II)
Cada quadrícula (horizontal) do gráfico equivale a 1 cm e a velocidade a que o

Cada quadrícula (horizontal) do gráfico equivale a 1 cm e a velocidade a que o papel corre é 1cm/min, logo, sabendo que passa um tempo equivalente a 4 quadrículas na presença de ADP (4 min) e equivalente a 2,8 quadrículas na ausência de ADP pode calcular-se a velocidade de consumo de O 2 com e sem ADP. Como há dois declives correspondentes a cada caso (dois declives para presença e ausência de ADP) é necessário fazer a média dos dois valores obtidos para calcular a razão de controlo respiratório neste ensaio.

RC médio: (6,23 + 3,6)/2 = 4,92

min

min

2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sódio (Complexo IV)

min Esta razão permite determinar a extensão do acoplamento dos mitocôndrios assim como a sua

min

Esta razão permite determinar a extensão do acoplamento dos mitocôndrios assim como a sua integridade funcional.

Para esta parte do trabalho não foi possível encontrar valores teóricos, mas, no entanto, sabe-se que se RC>1, os mitocôndrios estão acoplados, não tendo sofrido alterações na sua funcionalidade. Nos ensaios observa-se que todos os resultados são maiores que 1, pelo que se conclui que os mitocôndrios estavam acoplados.

4. Conclusão

A razão ADP/O é o número de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electrões fluindo por um segmento da transferência electrónica para o oxigénio.

A razão ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque ao longo da cadeia são transportados para fora da matriz menos protões, havendo menos energia disponível para a síntese de ATP, o que faz com que a actividade da cadeia transportadora de electrões aumente, levando ao aumento do consumo de O 2 .

No complexo II não ocorre transporte de protões, pelo que não há contribuição para o gradiente electroquímico, o que leva a que a razão ADP/O seja pequena.

No complexo IV a razão ADP/O é inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai ser necessário um maior consumo de oxigénio para produzir a mesma quantidade de ATP (consumir a mesma quantidade de ADP).

Uma vez que na maioria das células o fosfato inorgânico se encontra presente em excesso, é o ADP que controla a velocidade de respiração. Nos organismos intactos, existe um alto grau de controlo respiratório e os mitocôndrios dizem-se fortemente acoplados. Quando ocorre dano estrutural no mitocôndrio perde-se este controlo.

A razão de controlo respiratório permite determinar a extensão do acoplamento dos mitocôndrios assim como a sua integridade funcional.

Como RC>1, os mitocôndrios estavam acoplados, não tendo sofrido alterações na sua funcionalidade.

RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL SEQUENCIAÇÃO DA CADEIA RESPIRATÓRIA

1.

Introdução

Transporte electrónico e fosforilação oxidativa

A fosforilação oxidativa é uma via metabólica que utiliza a oxidação final de glúcidos, lípidos e proteínas (e a energia libertada nestas reacções de oxidação-redução) para produzir ATP, através da fosforilação de ADP. Este processo ocorre nos mitocôndrios. Nesta via ocorre transferência de electrões a partir de doadores electrónicos até aceitadores electrónicos finais, como o oxigénio transporte electrónico.

A cadeia respiratória pode ser separada em 4 complexos enzimáticos:

NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I)

Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II)

Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III)

Citocromo c Oxidase (Complexo IV)

Em plantas, são ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais complexos da cadeia respiratória duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada à zona interna da membrana interna e outra à zona externa da membrana interna) e uma actividade alternativa de oxidase.

Estes complexos, na presença de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidação aeróbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferência electrónica para a ubiquinona a partir de dois doadores de electrões diferentes: NADH (complexo I) e sucinato (complexo II). O complexo III leva electrões da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o complexo IV completa a sequencia transferindo os electrões do citocromo c para o O 2 .

Fosforilação oxidativa o acoplamento do transporte electrónico com a síntese de

ATP Os complexos I, III e IV são centros de acoplamento de energia. Nestes centros de acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrónico é conservada através da sua conversão numa força motriz protónica utilizada para bombear protões para fora da matriz

mitocondrial (espaço intermembranar), ocorrendo assim uma translocação vectorial de protões e a formação de um potencial electroquímico protónico de membrana, podendo então essa energia ser usada para a síntese do ATP. Esta síntese é catalisada por um complexo multienzimático, Complexo V ou ATPsintase.

Inibidores e desacopladores

A fosforilação oxidativa pode ser inibida directamente por uma série de agentes químicos. Uma classe destes compostos (caso do antibiótico oligomicina) inibe a fosforilação oxidativa e

a respiração. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilo-

hidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibição da fosforilação por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respiração e fluxo de electrões mas não ocorre síntese de ATP (há inibição da fosforilação oxidativa mas não da respiração). Uma terceira

classe inclui os inibidores específicos da cadeia de transporte electrónico (rotenona, antimicina

A, cianeto).

Técnicas

(rotenona, antimicina A, cianeto).  Técnicas O eléctrodo de oxigénio Este eléctrodo consiste num

O eléctrodo de oxigénio Este eléctrodo consiste num eléctrodo de referência de Ag/AgCl e um eléctrodo de Pt, ambos imersos em KCl aquoso e separados da câmara onde se inserem as amostras apenas através de uma membrana permeável a O 2 . Este é reduzido a H 2 O no eléctrodo de Pt, gerando uma voltagem referente ao eléctrodo de Ag/AgCl que é proporcional à [O 2 ] na câmara

reaccional.

Cátodo:

O 2 + 4e - Ânodo:

2H 2 O

4Ag + + 4Cl -

4AgCl + 4e -

4Ag + + 4Cl - 4AgCl + 4e - Objectivos: 1. A extensão da fosforilação obtida

Objectivos:

1. A extensão da fosforilação obtida com diferentes substratos (razão ADP/O)

2. O grau de controlo respiratório

3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrónico

2.

Procedimento

Isolamento dos mitocôndrios de batata

É importante ter em conta que, sendo uma experiência em que se pretende manter a actividade mitocondrial, todas as operações devem ser feitas entre 0 e 4ºC e o processo não deve demorar mais que 1h.

Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de batata, começando por se pesar 300g de batata e cortá-la em cubos pequenos.

De seguida efectuou-se a homogeneização em 250 mL de meio de isolamento num batedor eléctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de actividade.

Procedeu-se à filtração num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior centrifugação.

Após a 1ªcentrifugação aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a 8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em meio de lavagem, juntando-se o conteúdo de diferentes tubos (dos vários grupos). Centrifugou-se novamente nas mesmas condições, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em

meio de ressuspensão e prosseguiu-se à última centrifugação também a 8000g, 4 graus e durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio de ressuspensão.

Obteve-se assim a fracção mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte.

Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspensão. Estes meios contêm alguns componentes com concentrações adequadas para manter a actividade mitocondrial.

O pH 6,5 é o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manutenção da osmoralidade

do meio, a cisteína previne a oxidação de produtos fenólicos prejudiciais ao mitocôndrio, a BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratório pelo ADP e o EDTA remove metais catalisadores de reacções indesejáveis, mas inibe a respiração induzida pela cisteína,

pelo que é adicionado em concentração baixa.

Efeito de inibidores

Pretende-se agora sequenciar a cadeia respiratório usando vários inibidores da mesma, sendo que os ensaios devem ser adequados para calcular a actividade do oxidase alternativo/respiração não inibida pelo KCN.

Começou-se por adicionar na camara reaccional 1,4 mL de meio de reacção + 200 μL de mitocôndrios + 20 μL de succinato + 50 μL de ADP obtendo-se o registo do eléctrodo. Adicionou-se + 10 μL de oligomicina antes que o ADP se esgotasse e +20 μL de malonato quando começa a haver declive. A oligomicina inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protões, que é necessário para a fosforilação oxidativa de ADP para ATP (produção de energia). A inibição da síntese de ATP pára também a cadeia transportadora de electrões. O malonato é um inibidor do complexo II e a oligomicina do complexo ATP sintase. Adiciona-se agora 20 μL de malato + 20 μL de glutamato (complexo I) para verificar se a respiração retoma ou não, confirmando-se pelo registo; adiciona-se rotenona que inibe o complexo I.

Adicionou-se NADH, registando-se, e + 20 μL antimicina A (para assegurar que está inibido); colocou-se na camara reaccional + 20 μL de citocromo c + 20 μL de ascorbato de sódio (substratos), registando-se e 40 μL de KCN, 20 de cada vez.

Adicionou-se + 20 μL de ADP, registou-se e mais + 20 μL de succinato, que estava inibido devido ao KCN. Começa-se então um novo registo com adição de 1,4 mL de meio de reacção + 300 μL de mitocôndrios + 20 μL de succinato + 20 μL de ADP, registando-se. Adicionou-se + 20 μL de rotenona, substrato do complexo II e inibidor do complexo I. Registou- se e adicionou-se +20 μL de malonato (inibidor do complexo II).

Adicionou-se + 20 μL de citocromo c + 20 μL de ascorbato de sódio, registou-se, adicionou-se + 20 μL de anticimina A, que é um substrato para o complexo IV e inibidor do III. Registou-se e adicionou-se 40 μL de KCN (inibidor do complexo V), 20 de cada vez.

3.

Resultados

A utilização de inibidores causa a interrupção do fluxo electrónico, fazendo com que os complexos fiquem reduzidos e incapazes de aceitar electrões dos que o antecedem. O resultado prático traduz-se numa redução do consumo de oxigénio.

Complexo I - NADH ubiquinona oxirredutase / NADH desidrogenase

Catalisa

a

transferência

de

2

electrões

do

NADH

(dador

de

electrões)

para

a

ubiquinona. A este processo está associada a translocação vectorial de 4 protões.

Substrato: Glutamato + Malato

Utiliza-se este substrato por possuir um sistema de transporte próprio para o interior da matriz mitocondrial, ao contrário do NADH uma vez que este não consegue atravessar a membrana interna mitocondrial.

Inibidor: Rotenona

Inibidor do complexo I Inibe a transferência de electrões do NADH para a ubiquinona (o consumo de O 2 pára) ao bloquear a oxidação de NADH a NAD + .

Complexo II Succinato: Ubiquinona oxirredutase / Succinato desidrogenase

Catalisa a transferência de 1 electrão do succinato (dador de electrões) para a ubiquinona.

Substrato: Succinato

Inibidor: Malonato

Inibidor do complexo II Inibe competitivamente o succinato desidrogenase impedindo a transferência electrões do succinato para a ubiquinona.

Complexo III Ubiquinol: Citocromo c oxirretudase / Citocromo bc 1

Transporte de 2 electrões do ubiquinol (ubiquinona reduzida) para o citocromo c. A este processo está associada a translocação vectorial de 4 protões.

Substrato: Não é utilizado substrato para este complexo.

Inibidor: Antimicina A

Inibidor do complexo III Inibe a transferência de electrões do ubiquinol para o citocromo c pois liga-se ao centro de redução da quinona no complexo citocromo bc 1 .

Complexo IV Ferrocitocromo c: oxigenorredutase / Citocromo c oxidase

Transferência de 1 electrão de cada uma de quatro moléculas de citocromo c para o O 2 , reduzindo-o a duas moléculas de H 2 O.

Substrato: Ascorbato + Citocromo c

Inibidor: Cianeto

Inibidor do complexo IV Inibe a transferência de electrões do citocromo c oxidase para o O 2 devido ao facto de se ligar ao ferro do enzima. A partir daqui a cadeia não pode ser retomada pelo que o cianeto é fatal.

Ensaio 1

Succinato (Substrato do complexo II) + Malonato (Inibidor complexo II)

Malato + Glutamato (Substrato do complexo I) + Rotenona (Inibidor complexo I)

Ensaio 1 (2) Antimicina A (Inibidor complexo III – Para certificar que estava inibido) +

Ensaio 1 (2)

Antimicina A (Inibidor complexo III Para certificar que estava inibido) + Citocromo c com ascorbato de sódio (Substrato complexo IV) + KCN (Inibidor complexo IV).

Na presença de Antimicina A ocorre respiração quando adicionado o substrato do complexo IV. Ocorre inibição quando é adicionado KCN - Inibe mas continua a haver consumo de O 2 devido à presença de citocromo c oxidase alternativo.

Ensaio 1 (3) Succinato (Substrato complexo II) – Estava inibido devido ao KCN, pelo que

Ensaio 1 (3)

Succinato (Substrato complexo II) Estava inibido devido ao KCN, pelo que se começou uma nova reacção.

Ensaio 2 Succinato (Substrato complexo II) + Rotenona (Inibidor complexo I) + Malonato (Inibidor complexo

Ensaio 2

Succinato (Substrato complexo II) + Rotenona (Inibidor complexo I) + Malonato (Inibidor complexo II) + Citocromo c com ascorbato de sódio (Substrato complexo IV) + Antimicina A (Inibidor complexo III) + KCN (Inibidor complexo IV Inibe mas continua a haver consumo de O 2 devido à presença de citocromo c oxidase alternativo).

Inicialmente adicionou-se Oligomicina que inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protões,

Inicialmente adicionou-se Oligomicina que inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protões, que é necessário para a fosforilação oxidativa de ADP para ATP (produção de energia). A inibição da síntese de ATP pára também a cadeia transportadora de electrões. Seria de esperar que não ocorresse respiração, o que não é observado, pelo que a solução deve estar mal preparada. Através do Ensaio 1 é possível concluir que o Malonato inibe o Succinato, pelo que é o inibidor do complexo II. Adicionando seguidamente Malato + Glutamato (substratos do complexo I) observa-se a ocorrência de consumo de oxigénio mas em muito pouca quantidade. Pode concluir-se que o Malonato não inibiu então o complexo I, pois ao adicionar substratos do mesmo continuou a haver respiração, mas como foi muito pouco intensa, pode levar a considerar que houve erros experimentais na preparação de soluções. Estes resultados indicam que os complexos I e II funcionam em paralelo.

Adicionando Rotenona deixa de haver respiração, pelo que se sabe que é um inibidor do complexo I. Adicionou-se depois NADH que é substrato do complexo I e das actividades alternativas do NADH desidrogenase, não se registando consumo de O 2 , por o complexo I estar inibido, o que confirma que a Rotenona é inibidor do complexo I.

Pelo Ensaio 1 (2) pode concluir-se que a Antimicina A não inibe o complexo IV. Adicionou-se Citocromo c + Ascorbato e observou-se um aumento da respiração, pelo que o complexo IV não é inibido pela Antimicina A. O facto de haver consumo de O 2 depois da adição destes substratos, demonstra que o inibidor do complexo III não afecta o complexo IV, portanto o complexo III é anterior ao IV na cadeia respiratória. Com a adição de KCN o complexo IV é inibido pelo que se espera que continue a haver consumo de oxigénio devido à

presença de citocromo c oxidase alternativo. No entanto o consumo de O 2 aumenta, pelo que se pode concluir que a solução estava mal preparada.

Adicionou-se ainda Succinato (substrato para o complexo II), mas não houve respiração, uma vez que estava inibido devido à presença de KCN. A actividade do complexo II pára com a adição deste inibidor, porque ao inibir o complexo IV não vai haver consumo de oxigénio. Assim pode concluir-se que o complexo IV se situa mais à frente que o complexo II na cadeia respiratória.

Começou-se então uma nova reacção, onde se adicionou Succinato, ocorrendo respiração, seguido da adição de Rotenona, não havendo diminuição da respiração, pelo que o complexo II não foi inibido pela Rotenona. Adicionando seguidamente Malonato já se observa inibição, pelo que se confirma que é inibidor do complexo II (como se já tinha observado anteriormente). Adicionou-se Citocromo c com Ascorbato de sódio (substratos do complexo IV) sendo retomada a respiração, pelo que o Malonato não inibe o complexo IV. Assim demonstra-se que os inibidores dos complexos I e II não afectam o complexo IV, ou seja, o complexo IV é posterior na cadeia respiratória aos complexos I e II. Adicionando Antimicina A nada acontece, confirmando-se que não é um inibidor deste complexo, mas, por fim, adicionando KCN já ocorre inibição, apesar de haver ainda consumo de oxigénio devido à actividade alternativa do complexo IV. Após adição de cianeto de potássio o declive das rectas voltou a aumentar, o que se deve provavelmente a uma má preparação da solução.

Quadro resumo

Substrato

Inibidor

Rotenona

Malonato

Antimicina A

KCN

Glutamato + Malato

Succinato

Ascorbato +

Citocromo

c

Apesar do KCN inibir apenas o complexo IV, não vai haver respiração quando se adiciona o mesmo. Isto acontece porque pára o consumo de oxigénio ao ser adicionado este inibidor.

4.

Conclusão

É possível comprovar que a Rotenona inibe o complexo I, o Malonato o complexo II, a Antimicina A o complexo III, e o KCN o complexo IV;

A ordem dos complexos na cadeia respiratória é complexo I, II, III e IV;

Após se inibir o complexo IV não é possível retomar o fluxo de electrões pelo que se pode comprovar que este se situa no final da cadeia transportadora de electrões;

Os complexos I e II são independentes um do outro, transferindo ambos os seus electrões para o complexo III.

INCHAMENTO MITOCONDRIAL

1.

Introdução

Os mitocôndrios incham se forem suspensos num meio que não seja isotónico com a matriz. O mesmo acontece se forem colocados numa solução em que o principal soluto é permeável à membrana interna. Assim, aumentando a concentração de solutos dentro da matriz mitocondrial, favorece-se a entrada de água, havendo um aumento da pressão osmótica que leva ao inchamento do mitocôndrio.

As suspensões mitocondriais dispersam a luz. Esta dispersão é principalmente função da diferença entre o índice de refracção do conteúdo da matriz e do meio de suspensão, logo, quando esta diferença diminui, a dispersão de luz também diminui.

Quando o mitocôndrio incha devido à entrada de um soluto permeável ocorre uma diminuição da dispersão de luz (diminui a absorvência medida no espectrofotómetro) à medida que o índice de refracção da matriz se aproxima do índice de refracção do meio de suspensão.

Os mitocôndrios são adequados para esta técnica porque as suas matrizes podem sofrer um grande aumento de volume sem rebentarem através do abrir das cristas da membrana interna.

Pode, então, estudar-se o efeito de vários compostos no inchamento dos mitocôndrios, seguindo a dispersão de luz com a utilização de um espectrofotómetro UV- Visível. A extensão do inchamento é medida pela diminuição da absorvência.

Factores que influenciam o inchamento mitocondrial:

1. Necessidade de manter a neutralidade eléctrica.

2. O gradiente electroquímico (ΔpH + ΔΨ) promove:

Sistemas de transporte que impliquem a entrada de H+ ou saída de OH- da matriz (ΔpH).

Movimento de iões em resposta ao ΔΨ(dissipando o potencial).

Estratégias para o transporte de metabolitos e iões através da membrana

Para que ocorra inchamento mitocondrial:  Tanto o catião como o anião do principal componente

Para que ocorra inchamento mitocondrial:

Tanto o catião como o anião do principal componente osmótico do meio têm de ser permeáveis;

Tem de ser mantido o equilíbrio de cargas através da membrana (neutralidade eléctrica).

Propriedades de permeabilidade da membrana mitocondrial (Brian Chappel - Inchamento mitocondrial na presença de sais de amónio de ácidos fracos ou metabolitos):

Os mitocôndrios comportam-se como osmómetros perfeitos; Respondem a mudanças na pressão osmótica do meio de suspensão contraindo-se ou inchando conforme a água flui através da membrana para compensar a diferença de actividade quando os osmólitos são adicionados (ou removidos) do meio externo.

A membrana mitocondrial é impermeável a pequenos iões (ex: H + , K + , Na + , NH 4 + , Cl - , NO 3 - , etc.).

A membrana mitocondrial é permeável a moléculas pequenas sem carga (ex: O 2 , CO 2 , N 2 , glúcidos com 3 ou 4C, etc.).

Embora a membrana seja impermeável a pequenos iões, e portanto impermeável ao acetato (CH 3 COO - ) e NH4 + , é permeável ao ácido acético (CH 3 COOH) e ao NH 3 , que são pequenas moléculas neutras.

Técnicas utilizadas: Centrifugação • Uso da força centrífuga para saparar partículas por sedimentação; •

Técnicas utilizadas:

Centrifugação

Uso da força centrífuga para saparar partículas por sedimentação;

Partículas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes.

Espectroscopia UV-Visível

Trata-se da espectroscopia de absorção em que são utilizados comprimentos de onda da região do ultra violeta à região do visível;

Este método consiste na medição da quantidade de radiação absorvida, traduzindo-se esta medição em valores de absorvência. A maior aplicação deste método é a determinação de concentrações de compostos, e para esse efeito, é utilizada a lei de Lambert-Beer, que nos dá a concentração da substância em função da absorvência num determinado intervalo de linearidade (A=εlc).

Objectivo:

Utilizar a técnica de inchamento mitocondrial (utilizando mitocôndrios de batata), observado por medidas de dispersão de luz, para verificar os processos de transporte através da membrana mitocondrial interna.

2.

Procedimento

Isolamento dos mitocôndrios de batata

2. Procedimento Isolamento dos mitocôndrios de batata Meios utilizados Meio de isolamento Meio de lavagem Meio

Meios utilizados

Meio de isolamento

Meio de lavagem

Meio de

ressuspensão

Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; EDTA 0,001 M; Cisteína 0,002 M; BSA (fracção V) 0,1% (m/v)

Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; Cisteína 0,002 M; BSA (fracção V) 0,1% (m/v)

Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; BSA(fracção V) 0,1% (m/v)

Tampão fosfato 0,01M pH 6,5; Manitol 0,7M; BSA(fracção V) 0,1% (m/v)

Observações:

pH=6,5 é o mais adequado;

O manitol mantém a osmolaridade do meio, sendo 0,7 M a concentração mais adequada;

A cisteína previne a oxidação de produtos fenólicos prejudiciais ao mitocôndrio;

A BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratório pelo ADP;

O EDTA remove metais catalisadores de reacções indesejáveis, mas inibe a respiração induzida pela cisteína é adicionado em concentração baixa.

Procedimento

Reproduzir os resultados das experiências indicadas nas figuras;

Realizar leituras espectrofotométricas: 520 nm, volume total 2,5 mL, T=30ºC.

espectrofotométricas: 520 nm, volume total 2,5 mL, T=30ºC. Preparação das soluções para os ensaios

Preparação das soluções para os ensaios espectrofotométricos

Ensaios

Constituintes

1

H 2 O + mitocôndrios

2

KCl + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios

3

NH 4 Cl + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios

4

NH 4 CH 3 COO + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios

5

(NH 4 ) 3 PO 4 + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios

6

Malato de Amónio + + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios + rotenona + (Na) 3 PO 4

7

Citrato de Amónio + tampão Tris HCl com EDTA + mitocôndrios + rotenona + (Na) 3 PO 4 + malato de potássio

3.

Resultados

Ensaio 1

NH 4 Cl Ensaio de declive menor - ausência de swelling
NH 4 Cl
Ensaio de declive
menor -
ausência de
swelling

Resultado previsto: membrana impermeável a iões

Ensaio 2

Declive > declive controlo Swelling

Resultado previsto: Mitocôndrios incham

H 2 O
H 2 O

Ensaio 3

Declive > declive controlo Swelling

Resultado incorrecto: membrana impermeável a iões

KCl
KCl

Ensaio 4

Declive > declive controlo Swelling

Resultado previsto: iões atravessam a membrana na forma neutra.

A membrana é impermeável aos iões NH 4 + e CH 3 COO

-

Formam-se moléculas neutras que atravessam a membrana

No interior da membrana regressam à forma iónica

Ocorre desequilíbrio osmótico e inchamento massivo

NH 4 CH 3 COO
NH 4 CH 3 COO

Ensaio 5

Declive > declive controlo Swelling

Resultado previsto: iões atravessam a membrana na forma neutra e o PO 4 3-p passa através do transportador de H 2 PO 4 - por antiporte com OH - ou simporte com H + .

No interior da membrana as espécies regressam à forma iónica

Ocorre desequilíbrio osmótico e inchamento mitocondrial

(NH 4 ) 3 PO 4
(NH 4 ) 3 PO 4

Ensaio 6

1. Declive > declive controlo Swelling

2. Declives semelhantes Ausência de swelling

Resultado incorrecto: Os iões do malato de amónio só atravessam a membrana depois da adição de (Na) 3 PO 4 , devido ao transportador por antiporte malato/ HPO 4

2-

Inicialmente o NH 4 + e malato 2- não atravessam a membrana, porque são iões e o NH 4 + apesar de pode ser convertido à forma neutra não atravessa a membrana por inexistência de equilíbrio de cargas através da mesma.

Ao adicionar-se rotenona impede-se o gasto do malato pelo complexo I, visto que a rotenona é um inibidor do complexo I.

Ao ser adicionado (Na) 3 PO 4 o fosfato pode entrar pelo transportador de fosfato, o que leva àq entrada do malato por simporte. Com isto já ocorre um equilíbrio de cargas na membrana, pelo que o NH 4 + já pode entrar na forma neutra, gerando-se assim swelling.

(Na) 3 PO 4 Malato de Amónio + Rotenona
(Na) 3 PO 4
Malato de
Amónio
+ Rotenona
o NH 4 + já pode entrar na forma neutra, gerando-se assim swelling. (Na) 3 PO

Ensaio 7

1. Declive > declive controlo Swelling

2. Declives semelhantes Ausência de swelling

3. Declives semelhantes Ausência de swelling

Resultado incorrecto: os iões de citrato de amónio só atravessam a membrana depois da adição de (Na) 3 PO 4 e malato, devido aos transportadores antiporte malato/HPO 4 2- e simporte malato/citrato.

NH 4 + e citrato 3- não atravessam a membrana

Prevê-se inexistência de swelling

(Na) 3 PO 4 não leva a swelling até o malato estar presente

Adição do malato em presença de (Na) 3 PO 4 em quantidades catalíticas

rápido do transportador e entrada de malato

turnover

O transportador citrato permite a sua entrada por troca com o malato

O NH 4 + entrou como molécula neutra prevê-se inchamento mitocondrial

Citrato de Amónio + Rotenona (Na) 3 PO 4 Malato de potássio
Citrato de Amónio
+ Rotenona
(Na) 3 PO 4
Malato de potássio

Possíveis erros experimentais:

Preparação incorrecta das soluções de KCl, rotenona, malato de amónio e citrato de amónio;

pH das soluções não coincidente com o do protocolo.

4.

Conclusão

Apesar de a membrana ser impermeável a pequenos iões, ocorre inchamento com acetato de amónio porque o NH 4 + atravessa a membrana como NH 3 neutro e o Ac - como ácido acético, ambos através de difusão simples. Isso leva a que as concentrações de NH 4 + e de CH 3 COO - na matriz sejam iguais às do meio de suspensão. Assim não existe desequilíbrio de carga ou de pH durante o transporte e ocorre inchamento, uma vez que a matriz se expande para atingir equilíbrio osmótico com o meio de suspensão.

Quando os mitocôndrios são colocados em soluções de fosfato de amónio incham rapidamente mas não noutros sais de NH 4 . Ao se adicionarem quantidades catalíticas de fosfato de potássio ao meio contendo malato ou citrato, observa-se um inchamento rápido dos mitocôndrios.

A presença de um transportador de fosfato permitiu ao H 2 PO 4 - fazer um antiporte com o OH - ou simporte com o H + , o que fez com que o fosfato passe a membrana como se fosse uma espécie neutra. O transportador malato 2- -HPO 4 2- permite ao malato entrar, mas apenas quando uma quantidade catalítica de fosfato externo estava presente para permitir um turnover rápido do transportador de fosfato. O transportador de citrato permitiu ao H-citrato 2- entrar por troca com o malato 2- , mas este processo só ocorre rapidamente se houver malato e fosfato externo suficientes para permitir um turnover dos seus transportadores.