Experimental II Resumos

COMPLEXOS DE FERRO
Introduo
Complexos
Tambm designados por compostos de coordenao, so a espcie MLn que se forma

quando um tomo ou io M (metlico) se une a um ou mais ligandos.
O tomo ou io metlico o elemento central, enquanto que os ies ou molculas que
se lhe ligam so os ligandos.
Define-se o elemento central com o estado de oxidao formal (obtm-se somando a
carga de todos os ligandos e subtraindo carga do complexo) e a configurao electrnica.
Os ligandos so molculas ou ies que se ligam ao elemento central que tm de ter
pares de eletres no partilhados ou orbitais moleculares ocupadas, cujos eletres possam ser
doados ao tomo central.
Conforme o modo de coordenao ao metal podem ser monodentados (coordenam-se
por um s tomo) ou bi-, tri-, polidentados (coordenam-se por 2, 3 ou mais tomos
respectivamente).
Os ligandos polidentados podem tamm ser designados quelantes, pois forma-se um
anel de quelao que engloba o metal, um dos tomos doadores do ligando, a sua cadeia
respectiva e um outro tomo doador do ligando, sucessivo.
Existem tambm ligandos ambidentados, ou seja, ligandos que tm mais que um
possvel tomo doador, mas s podem usar um deles de cada vez (pelo menos para o mesmo
metal).
O nmero de tomos que se liga directamente ao metal define o nmero de
coordenao.
Consoante este nmero os complexos tm diferentes tipos de geometria: linear
(NC=2), geometria em T, Y ou triangular (NC=3), tetradrica ou quadrangular plana (NC=4),
pirmide quadrangular ou bipirmide trigonal (NC=5), octadrica, prisma trigonal ou hexagonal
(NC=6), entre outras para nmeros de coordenao elevados (7,8 e 9).
O nmero de coordenao 6 dos mais frequentes, sendo a geometria mais comum a
octadrica, pois a preferida do ponto de vista electrnico e estereoqumico.
Quanto ao isomerismo, trata-se da existncia de complexos com a mesma frmula
molecular, mas que diferem entre si de vrias formas possveis. Existem vrios tipos de
isomerismo:
o
o
Geomtrico: Diferem no arranjo dos ligandos;

ptico: Fazem rodar o plano da luz polarizada em direces opostas um dos
ismeros a imagem no espelho do outro;
o
o
o
Ionizao: Os produtos slidos tm a mesma estequiometria, mas originam

diferentes ies ao serem dissolvidos;
Coordenao: O arranjo dos ligandos volta do elemento central diferente;
Ligao: Um ou mais dos ligandos coordenam-se por diferentes tomos
doadores.
Ferro
Os metais de transio so moderadamente reactivos, combinando-se muitas vezes

com enxofre, oxignio e hidrognio quando aquecidos.
O ferro um metal de transio cujo nmero atmico o 26 e a configurao
electrnica [Ar]3d64s2.
Apresenta diversos estados de oxidao, +6,+3 e +2. um elemento muito reactivo no
seu estado puro e forma complexos com relativa facilidade.
essencial para a maioria dos seres vivos e sabe-se que num ser humano adulto
(massa de 70kg) existem 4,2 mg de Ferro. Devemos ingerir entre 12 a 18 mg de ferro por dia,
no entanto s parte que absorvida.
Por falta de ferro podem surgir doenas, nomeadamente anemia, mas tambm por
acumuluo deste metal (hemocromatose).
Algumas das funes do ferro nos elementos biolgicos so: funes cataltica, por
exemplo em reaces de oxi-reduo, (h enzimas activados pelo ferro atravs de uma fraca
ligao), metaloenzimas (enzimas com ligaes fortes a metais como o Ferro ou complexos de
metais), transporte de oxignio no sangue (Hemoglobina), armazenamento de oxignio no
sangue (Mioglobina e Ferritina).
Para resumir estas e outras funes do ferro apresenta-se o seguninte esquema que
identifica e classifica as metalobiomolculas de ferro, mostrando tambm os principais
exemplos.
Estas biomolculas de ferro, protenas ou no, que desempenham diversas e
importantes funes na maioria dos seres vivos.
1. Molculas no proteicas
Siderforos - O ferro essencial para todos os organismos vivos mas est pouco diponvel
por se encontrar maioritariamnte no estado de oxidao 3 em compostos qumicos pouco
soluveis em agua; por isso os seres vivos desenvolveram tcnicas para solubilizar e transportar
o Fe 3+ para o seu uso.
Na realidade esta stecnicas so ligandos que formam complexos deste io com constantes
de estabilidade elevadas; Esses ligandos so agentes complexantes no proteicos para
capturar ferro libertados para o exterior pelas bacterias.
A transferncia do ferro complexado para o microorganismo requer o reconhecimento de
sideroforos.
Como muitos desses microorganismos so patognicos e precisam de ferro para se
propagarem vo busc-lo ao hospedeiro. Para evitar essa captura o hospedeiro impede a
sintese de sideroforos, sendo ujjma das estrategias adoptadas a subida da temperatura
corporal, pois a produao daqueles ligandos diminui para temperaturas de 37 graus.
2. Protenas
-De transporte e armazenamento
a) Transferencia electronica
- Protenas Fe-S
Estas protenas esto envolvidas em processos de transferncia electrnica e so
agregados com a composio FenSm onde n =m = 2=4, ocorrendo nalguns casos o sistema
Fe3S4. So sistemas
A ferredoxina um exemplo de um sistema ferro enxofre. Ferredoxina do tipo
cloroplasto, F2S2.
- Citocromos
So estruturas qumicas de grupos heme presentes em todos os seres vivos que, tal
como as protenas de ferro-enxofre, tambm so responsveis por transferirem electres.
O processo de transferencia de electres envolve a variao do estado de oxidaao do
ferro no centro hmico.
Esto envolvidos na respiraao anaerobia e aerobia, fotossntese das plantas e
cianobactrias, reduo da meta hemoglobina nos eritrcitos para regenerar a forma funcional
da hemoglobina.
Citocromo c- transferencia electrnica do citocromo c1 para a oxidase do citocromo c no
processo finsal de fosforilaao oxidativa (imagem)
b) Coordenao com molculas no metlicas

-Hemeritrina: Hemeritrina- Embora a sobrevivencia da maioria dos organismos
dependa da difusao de O2 e CO2 entre as celulas e o exterior, outros seres vivos necessitam de
metalobiomolculas para o transporte e armazenamento de O2.
3
Um exemplo a biomolcula hemeritrina que ocorre no sangue de invertebrados

marinhos geralmente na forma octaedrica. So proteinas no hemicas, em que a captura do
O2 acompanhada pela oxidaao dos centros metalicos e formaao de OOH-.
- Hemoglobina: a hemoglobina est presente nos glbulos vermelhos, capta o
O2 nos pulmes e transporta-o no sangue arterial para os pulmes. Nos musculos vermelhos o
O2 transferido da hemoglobina para a mioglobina, que, ao ter maior afinidade para o O2
consegue armazen-lo e /ou transport-lo para os mitocondrios.
A hemoglobina desoxigenada e parcialmente oxigenada tem diferenas estruturais,
estado tenso e relaxado respectivamente; o estado relaxado tem maior afinidade pelo O2,
explicando o conhecido efeito de cooperatividade, pois aumenta a afinidade para o O2 das
subunidades desoxigenadas.
Em ambas as formas o estado de oxidao do ferro +2, sendo que o ferro se ajusta
mais ao anel de porfirina na forma oxigenada, pois o numero de coordenaao 6 e a estrutura
octaedrica.
c) Coordenao com ies metlicos

-Ferritina: Como o ferro no est muito disponvel para os seres vivos, existem
protenas como a ferritina que armazenam o ferro no organismo de modo a ficar acessivel e
no ter efeitos txicos. Em bacterias podem ainda ter fosfato e ferro hmico e chamam-se
bacterioferritinas.
Existem ainda protenas transportadoras de ferro, as transferrinas, de vrias classes
que o transportam a vrios tecidos.
Enzimas
comum a presena de ferro em enzimas como Oxidorredutases (catalisam reaces

de transferncia de electres) e Liases (adiao de grupos a duplas ligaes ou formaao de
duplas ligaes por remoao de grupos)
Por exemplo, a regulao do enzima acotinase, que participa no TCA, feita atravs da
adio de um ferro ao centro de ferro-enxofre, convertendo uma forma inactiva (trs ferros)
numa forma activa (quatro ferros).
Em resumo, o ferro est presente nos vrios organismos em vrias formas
desempenhando papeis importantes para manter as funes de algumas biomolculas.
Complexo Tris(oxalato) ferrato(III) de potssio

um complexo de ferro com 3 ligandos bidentados, o oxalato, C2O42- .
4
Desta forma este complexo assume a estrutura octadrica, visto que o seu nmero de
coordenao 6.
Uma das suas propriedades o paramagnetismo.
Aplicaes:
Pode ser utilizado como catalisador ou estabilizador em processos e
produtos qumicos, como revestimento para vidro, para processos sintticos de acrlicos,
adesivos acrlicos, resinas de epxido,poliuretanas, combustveis, borrachas de silicone, entre
outros, processos de polimerizao, oligomerizao e transesterificao de olefinas.
Procedimento
Para a realizao desta actividade experimental utilizou-se o sulfato ferroso amoniacal

que um sal duplo (2 caties). Escolheu-se este sal porque solvel em gua e mais
barato que o sulfato de ferro. Para alm disso este sal tem menos tendncia a ser
oxidado ao ar a Ferro (III). A oxidao de solues de Ferro (II) muito dependente do
pH, ocorrendo mais rapidamente a pH elevado. Os ies de amnio fazem com que a
soluo fique ligeiramente acdica, o que desacelera o processo de oxidao.
O primeiro passo do procedimento consistiu na dissoluo de sulfato ferroso

amoniacal em gua quente acidificada com cido sulfrico diludo. O aumento da
temperatura facilitou a dissoluo do sal e a gua acidificada favoreceu o equilbrio de
OH- e H+, impedindo a formao de precipitado (hidrxido de ferro).
Seguidamente adicionou-se uma soluo quente de cido oxlico em gua, para

formar oxalato de ferro (FeC2O4.2H2O ). Aqueceu-se a mistura at ferver e deixou-se
precipitar o slido amarelo (oxalato de ferro).
Lavou-se o precipitado repetidamente com gua, com o objectivo de retirar o excesso

de cido e sais.
Adicionou-se oxalato de potssio monohidratado em gua, que levou desacidificao

do meio para que os grupos OH- resultantes da adio de perxido de hidrognio se
ligassem ao ferro (passo seguinte). A adio excessiva de cido oxlico levaria a uma
acidificao do meio, o que impossibilitaria a oxidao do ferro, uma vez que este s
se oxida em pH neutro.
Gota a gota, adicionou-se perxido de hidrognio agitando continuamente a soluo e

mantendo a temperatura abaixo dos 40 0C. A adio de perxido de hidrognio oxidou
o Ferro II a Ferro III. A temperatura foi mantida abaixo dos 40 0C para evitar a
formao de xidos por decomposio do perxido.
Aps ter sido adicionado todo o perxido de hidrognio, aqueceu-se a mistura at

quase fervura, o que levou formao de um precipitado castanho de hidrxido
frrico indesejado.
5
Adicionou-se, ento, gota a gota, uma soluo saturada de cido oxlico para
redissolver o precipitado formado. A contnua adio do cido levou formao do
complexo. Redissolveu o precipitado de hidrxido de ferro que se formou durante a
adio de perxido de hidrognio.
Filtrou-se a soluo quente e adicionou-se etanol, que diminuiu a solubilidade do sal,

levando estabilizao do complexo.
Deixou-se cristalizar o complexo no escuro, pois este complexo fotossensvel.
Filtraram-se os cristais verdes e lavaram-se os mesmos com acetona, que eliminou o

etanol anteriormente adicionado e ajudou a secar rapidamente os cristais.
Deixaram-se secar os cristais ao ar e no escuro.
Determinou-se o rendimento.
Seguidamente realizaram-se diversas reaces com os ies Fe(II) e Fe(III) e outros

reagentes como o hidrxido de sdio, amnia, tiocianato de amnio e oxalato de sdio
e observou-se a cor das solues e se havia ou no precipitado.
Realizaram-se tambm reaces com hexacianoferrato (II) e (III) e observaram-se os

resultados.
Adicionaram-se reagentes como tiocianato de amnio e hidrxido de sdio a

complexos de fluoreto de ferro e observou-se se houve mudana de cor e/ou
formao de precipitado.
Por fim fizeram-se reaces com iodeto.
Resultados
Sntese do complexo tris (oxalato) ferrato (II) de potssio
1) Dissoluo de sulfato ferroso amoniacal
Aps este passo e at nova indicao consideramos que o ferro em soluo ferro (II).
2) Adio de cido oxlico
O precipitado amarelo o complexo oxalato de ferro (II) dihidratado.

6
3) Adio de oxalato de potssio
Considera-se que as guas que rodeavam o complexo esto agora dispersas no meio.
O precipitado laranja o complexo tris (oxalato) ferrato (II).
4) Adio gota-a-gota de perxido de hidrognio
Obteve-se o complexo tris(oxalato) ferrato (III) e, devido oxidao do perxido de

hidrognio obteve-se tambm hidrxido de ferro (III).
Reaces redox
5) Adio de cido oxlico saturado
Adio de soluo saturada de cido oxlico de forma a redissolver o precipitado de

hidrxido de ferro que se formou durante a adio de perxido de hidrognio.
O complexo de tris(oxalato)ferrato (III), em que o ferro est ligado a trs oxalatos
apresentando ismeros pticos.
Clculo do reagente limitante

Reagente
Sulfato de ferro
amoniacal
cido oxlico
Oxalato de
potssio
Massa (g)
Massa Molecular
(g/mol)
Estequiometria
Nmero de moles
15,15
392,14
0,0386
7,54
126,07
0,0838
10,06
184,24
0,0273
Perxido de
hidrognio
0,02 dm3
1,667 mol/dm3
0,5
0,08335
Uma concentrao de peroxide de hidrognio 20 volumes equivalente a

1.667 mol/dm3. Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm3).
Isto prova que o reagente limitante o oxalato de potssio;
O oxalato de potssio doa ies oxalato, tal como o cido oxlico, que posteriormente
adicionado na forma concentrada no h controlo sobre a quantidade de ies
oxalato (a quantidade de ies oxalato pode advir de vrias espcies, sendo mais
impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante);
Para maior preciso, no clculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal.
Clculo do rendimento
Reaces caractersticas dos ies ferro (II) e ferro (III)

1) Reaces dos ies ferro (II) e ferro (III)
NaOH - Verifica presena de ferro em soluo e qual a espcie
Tiocianato - Providencia um teste extremamente sensvel para ies de Ferro (III)
Reagente
Fe (II)
Fe(III)
Cor
Precipitado
Cor
Precipitado
NaOH
Verde escuro*
Sim
Laranja
Sim
Excesso NaOH
Verde escuro*
No dissolve
Laranja + escuro
No dissolve
Amnia
Verde sujo
Sim
Laranja escuro
Sim
Excesso amnia
Verde sujo
No dissolve
Laranja escuro
No dissolve
Tiocianato de amnio
Vermelho sangue
No
Oxalato de potssio
Amarelo esverdeado
No
+ tiocianato de amnio
Amarelo esverdeado
No
* este composto branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxignio
(produto maioritrio)
Como o ligando ambidentado pode gerar complexos do tipo
Nada acontece com a adio de mais tiocianato de amnio, j que o complexo formado
(tris(oxalato) ferrato (III)) muito estvel (a sua formao favorvel). No se consegue
deslocar a esfera de coordenao do ferro.
Existem algumas justificaes para o facto do tiocianato no conseguir substituir o oxalato
na ligao ao ferro.
9
De acordo com as posies relativas dos ligandos na srie espectroqumica, pode inferir-se
que o ligando C2O42- forma uma ligao mais estvel que o SCN-, uma vez que um ligando
mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os dois ligandos isto
confirmado.
Fora
inica
Ligando
log (K) (25C)
C2O42-
0,5
7,53 0,1
SCN-
0,9 0,1
F-
6,0
OH-
11,81 0,03
Sendo o oxalato bidentado, tambm est favorecida a ligao do segundo tomo de

oxignio ao ferro efeito entrpico.
2) Reaces com
Reagente
Fe (II)
Cor
Fe(III)
Precipitado
No
K4[Fe(CN)6]
Azul escuro*
(mas deveria ter

precipitado)**
K3[Fe(CN)6]
Azul escuro +
(azul de Turnbull)***
sim
Cor
Precipitado
Azul escuro ++
Sim
(azul da Prssia)
Amarelo
(amarelo da Prssia)
*este composto branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxignio

**no se ter observado precipitado por no se ter adicionado quantidade suficiente de
reagente
***com o tempo este azul transforma-se em azul da Prssia
10
Dissolveu
Amarelo da Prssia um oxidante poderoso.

K4[Fe(CN)6] - ferrocianeto de potssio, gera ies Fe2+
Aps oxidao do ferro, formou-se ferrocianeto frrico (azul da Prssia), a partir de

ferrocianeto ferroso.
Forma-se o complexo ferrocianeto frrico.
K3[Fe(CN)6] ferricianeto de potssio, gera ies Fe3+
Primeiro formou-se um complexo azul, muito instvel, conhecido como azul de

Turnbull (Turnbulls Blue) ferricianeto ferroso. Este complexo rapidamente convertido em
ferrocianeto frrico (azul da Prssia).
Forma-se um complexo chamado amarelo da Prssia, ferricianeto frrico.
3) Complexo de fluoreto com ferro (III)
Reagente
Fe(III)
Cor
Precipitado
NaF
Transparente
No
+ tiocianato de amnio
Laranja escuro
No
+ NaOH
Laranja
Sim
NaF:
11
Obteve-se hexafluoro ferrato(III).

+SCN-:
no reage
A cor laranja registada (quando a soluo se deveria ter mantido incolor) deve-se ao
facto de algum do fluor no ter reagido com o ferro formando o complexo, reagindo antes com
o tiocianato.
+NaOH:
A adio de NaOH leva formao de precipitado (hidrxido de ferro (III)) e leva o meio a
ficar de novo incolor.
O meio fortemente bsico, devido presena de NaOH, tem a capacidade de destruir o
complexo formado.
De acordo com as posies relativas dos ligandos na srie espectroqumica, pode-se inferir
que o ligando OH- possui a capacidade de substituir o F-, formando um complexo mais estvel,
sendo um ligando mais forte. Comparando as constantes de estabilidade do complexo com os
dois ligandos isto confirmado.
Ligando
Fora
inica
log (K) (25C)
C2O42-
0,5
7,53 0,1
SCN-
0,9 0,1
F-
6,0
OH-
11,81 0,03
4) Reaco com o iodeto
12
Fe(III)
Reagente
Cor
Precipitado
KI
Laranja
No
CHCl3
2 fases: aquosa superior amarela, orgnica inferior roxa
Sim (fase orgnica)
NaF + KI
Incolor
No
CHCl3
Incolor (evidncia de separao por fases)
No
Reaces redox
no reagiu
Fe(III)+KI+CHCl3:
A adio de CHCl3 provoca uma separao por fases, distinguindo-se uma fase aquosa
superior e uma fase orgnica inferior;
Extraiu-se o iodo para a fase orgnica pois este apolar - ocorre formao de
precipitado na soluo violeta da fase orgnica, correspondente ao iodo;
Em fase aquosa, observa-se o aparecimento de uma cor amarelo torrado diferente da

caracterstica do Fe(III), que corresponde forma aquosa do Iodo molecular (I3-).
Adio de Fe(III)+NaF+KI+CHCl3:
Em primeiro lugar, o flor liga-se ao ferro formando um complexo incolor e muito

estvel (
);
A modificao do estado de complexao do ferro faz com que se crie uma resistncia
reduo: modificado o potencial de reduo do ferro, aumentando-o para superior
ao do iodeto e assim o iodeto no consegue reduzir o Fe3+.
13
Concluso
Clculo do reagente limitante
Massa (g)
Massa Molecular
(g/mol)
Estequiometria
Nmero de moles
15,15
392,14
0,0386
7,54
126,07
0,0838
Oxalato de
potssio
10,06
184,24
0,0273
Perxido de
hidrognio
0,02 dm3
1,667 mol/dm3
0,5
0,08335
Reagente
Sulfato de ferro
amoniacal
cido oxlico
Uma concentrao de peroxide de hidrognio 20 volumes equivalente a

1.667 mol/dm3. Foram adicionados 20 mL deste reagente (0,002 dm3).
Isto prova que o reagente limitante o oxalato de potssio;
O oxalato de potssio doa ies oxalato, tal como o cido oxlico, que posteriormente
adicionado na forma concentrada no h controlo sobre a quantidade de ies
oxalato (a quantidade de ies oxalato pode advir de vrias espcies, sendo mais
impreciso calcular o rendimento com o reagente limitante);
Para maior preciso, no clculo do rendimento utilizou-se o sulfato de ferro amoniacal.
Clculo do rendimento
Composto modelo
14
A estrutura do complexo sintetizado pode de certa forma ser um modelo para

simulao das propriedades do ferro em sistemas biolgicos, dado que o complexo est
coordenado com oxignios (ambiente idntico ao que rodeia as molculas transportadoras de
oxignio). Encontram-se semelhanas entre o complexo sintetizado e os siderforos.
A formao de complexos de Ferro est dependente da fora dos ligandos (posio na
srie espectroqumica)
Quanto mais elevada a constante de estabilidade do complexo com dado ligando mais
favorecida a sua formao.
15
MIOGLOBINA: EXTRACO, PURIFICAO E DOSEAMENTO DE PROTENA

Introduo:
Protena em estudo:
Mioglobina:
Protena hmica monomrica (uma s cadeia polipeptdica);
Massa molecular de 16,7 kDa;
A sua estrutura secundria consiste maioritariamente em hlices (cerca de 70%);
Encontra-se no msculo cardaco e esqueltico;
Funo primria armazenamento de oxignio (O2) e fornecimento do mesmo em
caso de necessidade energtica;
Possui 153 aminocidos e um nico grupo hmico (protoporfirina IX de ferro), que
consiste na associao de uma porfirina com um tomo de ferro.
Grupo heme:
o O heme um grupo prosttico contendo um tomo de ferro,
componente de muitas protenas.
o O grupo heme constitudo por uma parte orgnica (protoporfirina) e
por um tomo de ferro. A protoporfirina constituda por 4 anis
pirrlicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel
tetrapirrlico. O tomo de ferro liga-se protoporfirina atravs de
interaces com os tomos de azoto dos anis pirrlicos.
o Em condies normais, o ferro encontra-se no estado de oxidao 2+,
podendo formar duas ligaes extra, uma de cada lado do plano do
grupo heme (5 e 6 posies de coordenao). Na mioglobina, a 5
posio de coordenao vai ser ocupada pelo anel imidazole de um
resduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptdica
(proximal histidine) e a 6 posio pode garantir a ligao ao oxignio.
In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),
sem oxignio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). Fora de um sistema biolgico, a
forma oxi-Mb (Fe2+-O2-Mb) pode ser convertida a met-Mb (Fe3+-H2O-Mb), atravs da
libertao de uma molcula de O2 e ligao de H2O.
Objectivo: Extrair e purificar a mioglobina a partir de tecido animal. Calcular a quantidade de
mioglobina no tecido de partida.
Tcnicas utilizadas:
Centrifugao
Uso da fora centrfuga para sapara partculas por sedimentao;

Partculas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;
Espectroscopia UV-Visvel
16
Trata-se da espectroscopia de absoro em que so utilizados comprimentos de onda

da regio do ultra violeta regio do visvel.
Este mtodo consiste na medio da quantidade de radiao absorvida, traduzindo-se
esta medio em valores de absorvncia. A maior aplicao deste mtodo a
determinao de concentraes de compostos, e para esse efeito, utilizada a lei de
Lambert-Beer, que nos d a concentrao da substncia em funo da absorvncia
num determinado intervalo de linearidade (A=lc).
Cromatografia de excluso molecular
Separao dos agentes redox da mioglobina;

Separao de molculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das
molculas;
Uso do Gel Sephadex G-25;
Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.
Mtodo de Lowry
Usado para a determinao da concentrao proteica, atravs da construo de rectas

de calibrao;
O princpio do mtodo baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido
fosfrico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com
protenas, na presena do catalisador cobre(II), e produz um composto com absoro
mxima em 750nm.
um mtodo muito sensvel.
Procedimento:
Colocar 10 g de carne
picada e 20 mL de
tampo fosfatos
(20mM pH 5,6) num
tubo de centrfuga
Ler Abs a 635, 580, 542
e 505 nm. O restante
sobrenadante
dividido em duas
partes
Misturar com
uma vareta,
durante cerca de
1 minuto.
Traar espectro
UV/Vis (250-800 nm)
de S, diluindo S 1:3
com o tampo inicial
Centrifugar a 5000
rpm, durante 60
minutos (Rotor JA20)
Remover e guardar
o sobrenadante (S)
com uma pipeta de
Pasteur.
17
1. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertao da mioglobina. Deve

evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar cidos gordos e/ou
cidos nucleicos, o que indesejvel
2. A centrifugao separa as partculas por sedimentao; devem equilibrar-se cada dois
tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar.
3. No pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que
no interessa aproveitar.
4. Os picos de absoro para os complexos de mioglobina so para a 635 e 505 nm (para
a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina
reduzida), na regio do visvel.
18
Resultados:
Absorvncias
BSA
Protena ( diluda 1:20)
1
0,810
0,431
2
0,742
0,383
3
0,539
0,310
4
0,327
0,258
*Fraces recolhidas da coluna de filtrao em gel.
Tubos
F1+F2*
1,007
0,902
0,608
0,341
1. Clculo da massa de protena total na carne

Massa da carne: 10,07g
[BSA] = 0,5 mg/mL
BSA
1- 200 L de BSA [] = 0,5 mg/mL Massa = 100 g
2- 150 L de BSA + 50 L de gua [] = 0,375 mg/mL Massa = 75 g
19

TOTAL: 200 L + 2 mL de reagente C + 200 L de reagente D = 2,4 mL
Ex. Clculo da massa do tubo 2:
Curva de calibrao:
Abs
Curva de calibrao - BSA

1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
y = 0.0081x + 0.0766
R = 0.9525
20
40
60
80
100
120
Massa (mg)
Atravs da recta de calibrao calcula-se a massa de protena:
Diluies:
1
2
20
Mdia dos valores de concentrao calculados: (0,219 + 0,252 + 0,288 + 0,448) / 4 = 0,3 mg/mL
Na cuvette colocou-se 1 mL de uma soluo anterior com 2,4 mL. Calculou-se ento a massa
de protena nessa soluo:
0,3 mg 1 mL
X 2,4 mL
X = 0,72 mg de protena.
0,1 mL da soluo de 2,4 mL foram retirados do sobrenadante diludo, que tinha 20 mL. Assim,
no sobrenadante diludo tem-se:
0,72 mg 0,1 mL
Y 20 mL
Y = 14,4 mg de protena.
O sobrenadante tinha sofrido uma diluio de 1:20, logo a massa de protena no sobrenadante
:
14,4 mg 1 mL
Z 20 mL
Z = 288 mg de protena no sobrenadante.
21
2. Clculo da massa de mioglobina

No clculo da massa de mioglobina, considera-se que toda a mioglobina que se aplicou na
coluna cromatogrfica foi oxidada, logo a mioglobina oxidada equivale mioglobina total
presente.
Massa de protena na cuvette:
Diluies:
1
2
Mdia dos valores de concentrao calculados: (0,574 + 0,68 + 0,656 + 0,652) / 4 = 0,64 mg/mL
22
Na cuvette colocou-se 1 mL de uma soluo anterior com 2,4 mL. Calculou-se ento a massa
de mioglobina nessa soluo:
0,64 mg 1 mL
X 2,4 mL
X = 1,536 mg
0,2 mL da soluo de 2,4 mL foram retirados de uma soluo de 10 mL. Assim, tem-se:
1,536 mg 0,2 mL
Y 10 mL
Y = 76,8 mg
Na coluna inseriu-se 1mL de sobrenadante diludo, da qual se retiraram 2 mL, pelo que a
massa de protena no sobrenadante diludo :
76,8 mg 1 mL
Z 2 mL
Z = 152,4 mg
O sobrenadante tinha sofrido uma diluio de 1:20, logo a massa de mioglobina no

sobrenadante :
23
152,4 mg 1 mL
W 20 mL
W = 3048 mg de mioglobina.
Concluses:
Massa de protena em 10g de carne: 288 mg
Massa de mioglobina em 10g de carne: 3048 mg
O resultado obtido no coerente, o que pode dever-se a erros experimentais e ao facto de
nenhum valor de absorvncia da mioglobina estar contido na recta de calibrao com BSA,
podendo estar o valor da massa de mioglobina sobrestimado.
Dado que ocorreram erros experimentais e os valores das massas obtidos no so correctos,
nada se pode concluir a partir do grau de pureza.
24
MIOGLOBINA: ESPECTROSCOPIA UV-VISVEL

Introduo:
Protena em estudo:
Mioglobina:
Protena hmica monomrica (uma s cadeia polipeptdica);
Massa molecular de 16,7 kDa;
A sua estrutura secundria consiste maioritariamente em hlices ;
Encontra-se no msculo cardaco e esqueltico;
Funo primria armazenamento de oxignio (O2) e fornecimento do mesmo em
caso de necessidade energtica;
Possui 153 aminocidos e um nico grupo hmico (protoporfirina IX de ferro), que
consiste na associao de uma porfirina com um tomo de ferro.
Grupo heme:
o O heme um grupo prosttico contendo um tomo de ferro,
componente de muitas protenas.
o O grupo heme constitudo por uma parte orgnica (protoporfirina) e
por um tomo de ferro. A protoporfirina constituda por 4 anis
pirrlicos, ligados por pontes de metano, para formar um anel
tetrapirrlico. O tomo de ferro liga-se protoporfirina atravs de
interaces com os tomos de azoto dos anis pirrlicos. Em
condies normais, o ferro encontra-se no estado de oxidao 2+,
podendo formar duas ligaes extra, uma de cada lado do plano do
grupo heme (5 e 6 posies de coordenao). Na mioglobina, a 5
posio de coordenao vai ser ocupada pelo anel imidazole de um
resduo de histidina (His-93) presente na cadeia polipeptdica
(proximal histidine).
In vivo, a Mb existe maioritariamente em duas formas: desoxi-Mb (desoximioglobina),
sem oxignio ligado, e oxi-Mb (oximioglobina). No primeiro estado, a 6 posio de
coordenao do ferro do heme encontra-se desocupada sendo que a ligao de uma
molcula de O2 causa uma ligeira alterao conformacional, alterando o estado da
mioglobina para oxi-Mb. Fora de um sistema biolgico, a forma oxi-Mb (Fe2+-O2-Mb)
pode ser convertida a met-Mb (Fe3+-H2O-Mb), atravs da libertao de uma molcula
de O2 e ligao de H2O.
Oxi e Met Mioglobina

Oxi-Mb
Forma reduzida de Mb;

Presente na superfcie da carne fresca - cor vermelha;
O O2 liga-se na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme;
Apresenta picos a 542 nm e 580 nm
25
Na regio de Soret os picos so a 417nm e 348nm.
Met-Mb
Forma oxidada de Mb;
Presente na carne mais envelhecida cor castanha;
O H2O liga-se na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme;
Forma-se nas zonas com baixa concentrao de O2 ;
Apresenta picos a 504 nm e 635 nm;
Na regio de Soret o pico a 409nm.
Os picos da regio de Soret permitem encontrar a razo oxi-Mb/met-Mb.
Reaces redox
Pode ocorrer interconverso das formas Oxi a Met, por aco de agentes
oxidantes (1), numa reaco onde um electro do ferro doado ao agente
oxidante, ou de Met a Oxi por aco de agentes redutores (2), que doam um
electro ao ferro.
Objectivo: Extrair e identificar a oxi-Mb e a met-Mb atravs das suas propriedades espectrais.
Estudo da reaco redox de interconverso.
Tcnicas utilizadas:
Centrifugao
Uso da fora centrfuga para sapara partculas por sedimentao;

Partculas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes;

da regio do ultra violeta regio do visvel.
Lambert-Beer: A=lc, que nos d a concentrao da substncia em funo da
absorvncia num determinado intervalo de linearidade.
26
Cromatografia de excluso molecular
Separao dos agentes redox da mioglobina;

Separao de molculas tendo por base o tamanho (Mr) e a forma (raio de Stokes) das
molculas;
Uso do Gel Sephadex G-25;
Em primeiro lugar elui a Oxi-Mb e a Met-Mb e depois o agente oxidante ou redutor.
Procedimento:
Colocar 10 g de carne
picada e 20 mL de
tampo fosfatos
(20mM pH 5,6) num
tubo de centrfuga
Ler Abs a 635, 580, 542
e 505 nm. O restante
sobrenadante
dividido em duas
partes
Misturar com
uma vareta,
durante cerca de
1 minuto.
Traar espectro
UV/Vis (250-800 nm)
de S, diluindo S 1:3
com o tampo inicial
Centrifugar a 5000
rpm, durante 60
minutos (Rotor JA20)
Remover e guardar
o sobrenadante (S)
com uma pipeta de
Pasteur.
5. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertao da mioglobina. Deve

evitar-se uma mistura agressiva ou prolongada pois pode libertar cidos gordos e/ou
cidos nucleicos, o que indesejvel
6. A centrifugao separa as partculas por sedimentao; devem equilibrar-se cada dois
tubos diametralmente opostos antes de se por a centrifugar.
7. No pipetar a camada superior acumulada, caso exista, pois trata-se de gordura que
no interessa aproveitar.
8. Os picos de absoro para os complexos de mioglobina so para a 635 e 505 nm (para
a Met-Mb ou mioglobina oxidada) e 580, 542 (para a Oxi-Mb ou mioglobina
reduzida), na regio do visvel.
27
28
Resultados:
Espectro experimental da mioglobina:
Os picos 33, 35 e 36 so caractersticos da forma reduzida da mioglobina, Oxi-Mb,
sendo que pico 33 corresponde zona de Soret.
O pico 34 caracteristico da forma oxidada da Mioglobina, Met-Mb, correspondendo

ao seu pico na zona de Soret.
Espectro experimental da mioglobina oxidada (Met-Mb):
Os picos observados, 405, 575 e 623, so os correspondentes aos tericos nos
comprimentos de onda 409, 504 e 635.
Foi ainda medida a absorvncia a 409 nm, correspondente ao pico terico da zona de
Soret da Met-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,945.
Espectro experimental da mioglobina reduzida (Oxi-Mb):
Os picos observados, 411, 539 e 577, so os correspondentes aos tericos nos
comprimentos de onda 417, 542 e 580.
Foi ainda medida a absorvncia a 417 nm, correspondente ao pico terico da zona de
Soret da Oxi-Mb, tendo sido obtido o valor de 1,386.
29
Comprimento de onda
409
417
505
542
546
580
635
Abs sobrenadante
1,870
1,848
0,455
0,488
0,451
0,311
Abs Oxi-Mb
1,392
1,386
0,215
0,244
0,239
0,221
0,109
Abs Met-Mb
1,945
1,412
0,332
0,272
0,266
0,222
0,194
Clculo da concentrao de Oxi-Mb e Met-Mb na amostra inicial

Primeiro foram calculadas as concentraes para a Oxi-Mb e Met-Mb que foram
isoladas a partir da cromatografia de excluso molecular. Os valores de
para a Oxi-Mb e
de
para a Met-Mb foram retirados do protocolo experimental.
[Oxi-Mb] a 417 nm
Como se realizou previamente uma diluio 1:3, a concentrao de Met-Mb na

amostra inicial ser ento trs vezes a calculada acima
[Met-Mb] a 409 nm
Como se realizou previamente uma diluio 1:3, a concentrao de Met-Mb na

amostra inicial ser ento trs vezes a calculada acima
[Oxi-Mb] e [Met-Mb] na amostra inicial (sobrenadante)

Valores de a
nm para os dois estados da mio lobina
Oxi-Mb
30
Os valores utilizados so correspondentes absorvncia da Oxi-Mb a 409 nm e [OxiMb] calculada anteriormente.

Met-Mb
Os valores utilizados so correspondentes absorvncia da Met-Mb a 417 nm e

[Met-Mb] calculada anteriormente.
Clculo das concentraes na amostra inicial

Valores de absorvncia do sobrenadante a 409 e 417 nm.
Como se realizou previamente uma diluio 1:3, as concentraes na amostra inicial

sero ento trs vezes a calculada acima
31
Razo Oxi-Mb/Met-Mb
A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma

molcula de O2 se liga na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme.
Concluses:
A mioglobina encontra-se maioritariamente na sua forma reduzida, Oxi-Mb, onde uma

molcula de O2 se liga na posio 6 de coordenao do ferro do grupo heme.
Pelos espectros obtidos verificou-se um sucesso parcial da extraco da mioglobina

reduzida e oxidada;
No espectro da mioglobina oxidada os picos de absoro so aos comprimentos de
onda 575 e 623 nm e deveriam ser a 504 e 635 nm;
No espectro da mioglobina reduzida os picos de absoro so aos comprimentos de
onda 539 e 577 nm e deveriam ser a 542 e 580 nm;
Os picos das bandas de Soret da mioglobina oxidada so: Terico - 409, prtico 405;
Os picos das bandas de Soret da mioglobina reduzida so: Terico - 417, prtico 411;
Apesar dos valores no corresponderem exactamente , verificou-se para o espectro da
Met-Mb o desaparecimento dos picos de absoro da Oxi-Mb e vice-versa, revelando
que no h contaminao das fraces obtidas.
32
FTIR E FLUORESCNCIA
Introduo:
Luminescncia: Emisso de luz a partir de uma substncia que ocorre a partir de estados
excitados. formalmente dividida em duas categorias Fosforescncia e Fluorescncia
dependendo da natureza do estado excitado.
A fosforescncia a emisso de luz a partir da excitao de um electro para um

estado de tripleto excitado. O electro excitado tem o mesmo spin que o seu par da
orbital do estado fundamental. As transies para o estado fundamental so proibidas
- no tem permisso de spin - e as taxas de emisso so muito lentas, por isso os
tempos de vida da fosforescncia so tipicamente entre milissegundos e segundos.
A fluorescncia a emisso de luz a partir da excitao de um electro para um estado
de singuleto excitado. O electro excitado tem spin oposto do seu par do estado
fundamental. Consequentemente, o regresso ao estado fundamental permitido h
permisso de spin e ocorre rapidamente pela emisso de um foto. As taxas de
emisso so tipicamente de 108 s-1, pelo que o tempo de vida tpico da fluorescncia
cerca de 10 ns (10 x 10-9 s).
Fluorescncia
Serve para o estudo de molculas biolgicas (estado das membranas

biolgicas, vesculas, protenas clulas vivas, etc.).
um processo com grande sensibilidade de deteco, sendo possvel trabalhar
a muito baixas concentraes.
Quando comparado com o doseamento espectrofotomtrico mais sensvel j
que reflecte as propriedades do microambiente da molcula no estado
excitado sendo que este influenciado pelo pH, temperatura, presso,
ligaes de hidrognio.
A fluorescncia ocorre tipicamente a partir de compostos aromticos, como os
apresentados na figura abaixo.
33
O processo que ocorre entre a absoro e emisso de luz usualmente descrito pelo
diagrama de Jablonski:
S0, S1 e S2 correspondem respectivamente ao estado fundamental, primeiro e segundo

nveis de energia. Em cada um destes nveis electrnicos os fluorforos (molcula ou parte de
uma molcula que emite fluorescncia seguindo a excitao com a luz) podem existir em
diferentes nveis de energia vibracionais (0, 1, 2, etc.). As transies entre estados so
representadas como linhas verticais.
Um fluorforo geralmente excitado para nveis vibracionais elevados de S1 ou S2.
Com algumas excepes, as molculas so rapidamente relaxadas para o estado vibracional
mais baixo de S1. Este processo denominado converso interna e ocorre em cerca de 10-12s
ou menos. Como os tempos de vida da fluorescncia so geralmente cerca de 10-8s, a
converso interna completada antes da emisso.
O regresso ao estado fundamental ocorre tipicamente de um estado excitado
vibracional baixo de S1 para os nveis vibracionais altos de S0, com a emisso de fotes.
Rapidamente o electro passa para os nveis vibracionais baixos de S0, voltando ao estado
fundamental.
34
As molculas do estado S1 podem sofrer uma converso de spin para o primeiro estado
tripleto (T1). A emisso a partir de T1 a fosforescncia. A converso de S1 para T1
denominada cruzamento inter-sistemas (ocorre entre dois estados vibracionais isoenergticos
pertencentes a estados electrnicos com diferentes multiplicidades).
Caractersticas da Fluorescncia:
Efeito da polaridade do solvente

A polaridade do solvente e o microambiente tm profundos efeitos nos espectros de
emisso dos fluorforos.
o Desvio de Stokes
Geralmente o comprimento de onda de emisso maior do que o de excitao.
Uma causa habitual para o desvio de Stokes o rpido decaimento para o nvel
vibracional mais baixo de S1. Os fluorforos geralmente passam para os nveis vibracionais
mais elevados de S0, resultando numa posterior perda de energia de excitao. Para alm
destes efeitos, os fluorforos podem sofrer desvios de Stokes devido a efeitos dos solventes,
reaces do estado excitado, formaes de complexos e transferncia de energia.
Os efeitos do solvente diminuem a energia de emisso devido estabilizao do
estado excitado pelas molculas do solvente polar. O fluorforo tem um maior momento
dipolar no estado excitado (E) do que no estado fundamental (G). Depois da excitao os
dipolos do solvente podem reorientar-se ou sofrer relaxao volta de E, o que diminui a
energia do estado excitado. medida que a polaridade do solvente aumenta, este efeito
tambm aumentado, resultando numa emisso a menor energia. Por esta razo, quando se
altera a polaridade do solvente, os espectros de emisso sofrem desvios. Em geral, apenas
fluorforos que so polares tm uma grande sensibilidade a solventes polares. Os fluorforos
apolares no sofrem desvios de Stokes com a variao da polaridade do solvente.
O tempo de vida de fluorescncia geralmente muito maior do que o tempo
necessrio para a relaxao do solvente. Por esta razo, as molculas do solvente reorientamse volta do dipolo do fluorforo, e do-se desvios nos espectros de emisso. Assim, estes
espectros so muito mais sensveis ao ambiente e polaridade do solvente do que os
espectros de absoro/excitao.
A absoro/excitao ocorre a uma velocidade muito grande, pelo que no h tempo
para que as molculas do solvente se reorganizem, no havendo desvios nos espectros que se
obtm.
35
Excepes Regra da Imagem no Espelho
Geralmente os espectros de absoro e emisso so a imagem um do outro no

espelho. No entanto, existem vrias excepes a regra que se devem aos seguintes factores:
o
A emisso d-se a partir duma espcie diferente da espcie que absorveu o foto (isto
, d-se uma reaco no estado excitado). A emisso d-se sempre a partir da espcie
protonada, logo, no caso desta excepo, a espcie protonada no a que recebeu o
foto;
o
A emisso d-se a partir dum estado diferente daquele que resultou da absoro (a
emisso d-se geralmente a partir de S1, logo, neste caso, a molcula pode ter sido
excitada para S2);
o
O espectro de absoro corresponde a duas transies quase iso-energticas (como
por exemplo o caso do Triptofano, em que ocorre transio entre dois estados
singuletos excitados de baixa energia).
36
Tempos de vida de Fluorescncia e Rendimento Quntico

O tempo de vida (tempo que a molcula passa no estado excitado antes de regressar
ao estado fundamental) e o rendimento quntico (nmero de fotes emitidos por nmero de
fotes absorvidos) so caractersticas muito importantes de um fluorforo. Substncias com
maiores rendimentos qunticos tm maiores emisses (mais brilhantes). O tempo de vida
determina o tempo disponvel para o fluorforo interagir ou difundir-se no meio e por isso
fornece informao sobre a sua emisso.
Espectrofluormetro
Com a maior parte dos espectrofluormetros possvel registar os espectros de
emisso e excitao. Estes espectros podem ser apresentados em escalas de comprimentos de
onda ou de nmeros de onda.
Para a maior parte dos fluorforos os rendimentos qunticos e os espectros de
emisso so independentes do comprimento de onda de excitao.
Num caso ideal, os espectros de excitao e emisso devem representar a intensidade
relativa de fotes por intervalo de comprimento de onda. Para obter tal espectro correcto os
componentes individuais devem ter as seguintes caractersticas:
A fonte de luz deve produzir uma emisso constante de fotes a todos os

comprimentos de onda;
O monocromador deve passar fotes de todos os comprimentos de onda com a
mesma eficincia;
A eficincia do monocromador deve ser independente da polarizao;
O detector (tubo fotomultiplicador) deve detectar fotes de todos os comprimentos
de onda com igual eficcia.
37
Espectros de excitao e emisso

O espectro de fluorescncia geralmente apresentado como espectro de emisso
(intensidade de fluorescncia vs. nmero de onda). Este espectro varia muito e depende da
estrutura qumica do fluorforo e do solvente no qual se dissolve.
Espectro de emisso
Representa a frequncia de fotes emitidos ou energia emitida a cada

comprimento de onda.
Para o traar, escolhido um comprimento de onda de excitao fixo, e de
seguida percorrido toda a gama de comprimento de onda pelo
monocromador de excitao.
Razes de distoro do espectro:
o Dependncia da eficincia da emisso da energia por parte do
monocromador de emisso e do fotomultiplicador;
o Absoro de radiao por parte da amostra.
Espectro de excitao
Representa a emisso relativa do fluorforo a cada comprimento de onda de

excitao.
38
Para o traar, o monocromador de emisso calibrado ao comprimento de

onda de emisso mximo da amostra, e faz-se correr a gama de comprimentos
de onda pelo monocromador de excitao.
Razes de distoro do espectro:
o A intensidade da luz da fonte de excitao est dependente da gama
de comprimentos de onda;
o A eficincia da transmisso do monocromador de excitao deve-se
tambm gama de comprimento de onda;
o A substncia pode ter absorvncia superior.
Fluorescncia de protenas - O triptofano como composto modelo

Nas protenas h trs aminocidos fluorescentes: fenilalanina, tirosina e triptofano.
Estes aminocidos so relativamente raros nas protenas. O triptofano o fluorforo
intrnseco dominante. O nmero reduzido de resduos de triptofano provavelmente o
resultado do custo metablico da sua sntese. Uma protena pode ter apenas um ou alguns
resduos de triptofano, o que facilita a interpretao dos dados do espectro.
Um factor importante a sensibilidade do triptofano ao seu microambiente.

Alteraes no espectro de emisso do triptofano ocorrem frequentemente devido a
modificaes conformacionais, ligao a substratos ou desnaturao. Este resduo sensvel a
ligaes de hidrognio e sofre frequentemente quenching (extino) por algumas cadeias
laterais.
Um factor que complica a interpretao da fluorescncia das protenas a presena
dos vrios aminocidos fluorescentes na maioria das protenas. No entanto os espectros de
emisso das protenas so dominados pelo triptofano que absorve e emite a maiores
comprimentos de onda e numa gama de comprimentos de onda maior. O triptofano tem um
maior coeficiente de absortividade molar. A energia absorvida pela fenilalanina e tirosina
muitas vezes transferida para os resduos de triptofano da mesma protena.
A excitao das protenas geralmente ocorre a um mximo prximo de 280 nm.
Consequentemente, a fenilalanina no excitada nesta experincia, e como o seu rendimento
quntico muito pequeno, a emisso deste resduo raramente observada para protenas. A
absoro de protenas a 280 nm deve-se aos resduos de tirosina e triptofano. A comprimentos
de onda de 295 nm ou superior, a absoro deve-se principalmente ao triptofano. Este resduo
pode ser selectivamente excitado a comprimentos de onda entre 295 e 305 nm. Por esta
39
razo, efectuou-se a excitao da mioglobina a 295 nm e no no mximo de excitao do

triptofano, evitando-se a excitao da tirosina e da fenilalanina (os outros resduos
fluorescentes). Assim, a 295 nm apenas o triptofano emite e por isso evita-se coalescncia de
espectros.
H, no entanto, um problema quando existem vrios resduos de triptofano em
soluo: os espectros de emisso dos diferentes resduos ficam sobrepostos, cada um com um
microambiente nico.
Fluorescncia da Mioglobina
A mioglobina uma protena com dois resduos de triptofano (Trp-7 e Trp-14) que se
encontram no interior hidrfobo da protena. Quando a protena desnaturada, estes resduos
so expostos ao solvente e como so fluorforos polares, sofrem desvio de Stokes, havendo
desvios nos espectros de emisso da mioglobina quando esta se encontra no estado nativo e
desnaturado.
FTIR
FTIR - tcnica
Apesar de existirem tcnicas que fornecem informao mais detalhada sobre a
estrutura de protenas (como a cristalografia de raios X), estas muitas vezes no podem ser
aplicadas visto que as protenas nem sempre formam um cristal de qualidade suficiente para
anlise. A tcnica de FTIR d tambm informao sobre a estrutura secundria, enquanto que
a cristalografia de raios X e outras tcnicas fornecem informaes sobre a estrutura terciria.
40
FTIR (Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier) uma tcnica que

realiza a medio do comprimento de onda e da intensidade de absoro em infravermelho
por uma amostra. Compostos diferentes tm bandas de absoro caractersticas no espectro
IV.
Um monocromador desnecessrio, pois faz-se uso de um interfermetro que encripta
todas as frequncias da radiao IV num sinal nico. A radiao incidente divida em dois
feixes (beamsplitter) e o espelho mvel provoca a alterao da distncia percorrida que leva
interferncia entre os dois feixes.
A radiao infravermelha passa pela amostra, com alguma a ser absorvida e outra a ser
transmitida. O interferograma resultante representa todas as frequncias medidas
simultaneamente e todos os seus pontos tm informao codificada.
Por fim, aplica-se a transformada de Fourier no interferograma final, obtendo-se o
espectro.
Bandas do espectro
As bandas observadas nos espectros IV devem-se aos movimentos vibracionais dos tomos
nas molculas que faam variar o seu momento dipolar permanente, .
Existem vrias bandas caractersticas de aminocidos especficos, no entanto as mais
importantes referentes s ligaes peptdicas e que permitem um estudo da estrutura
secundria so a Amida I e a Amida II, pois relacionam-se com as ligaes por pontes de
hidrognio estabelecidas.
A banda amida I deve-se s vibraes stretching (elongamento) da ligao C dupla O do
grupo amida; o nmero de onda dos fotes absorvidos 1600-1690 cm-1
A banda amida II - deve-se s vibraes bending (dobramento) da ligao NH ; o nmero
de onda dos fotes absorvidos 1480-1575 cm-1
Ambos os grupos esto envolvidos em ligaes por pontes de hidrognio, que ocorrem
entre diferentes elementos de estrutura secundria. Assim, a existncia deste tipo de bandas e
sua posterior anlise em certos nmeros de onda especficos indicam que tipo de estrutura
secundria est presente.
Amida I vs Amida II
A regio do espectro mais sensvel estrutura secundria das protenas a banda da
Amida I (1700-1600 cm-1), resultante inteiramente do stretching da ligao C=O das ligaes
peptdicas. As frequncias dos componentes esto relacionados com cada tipo de motivo
estrutural secundrio.
41
Por outro lado, a banda Amida II deriva maioritariamente do bending da ligao no

plano NH e da vibrao do stretching do CN, o que mostra muito menos sensibilidade
conformao proteica.
Mtodos de melhoramento dos espectros

H dificuldades na anlise da banda de amida I para identificao de estruturas
secundrias, devido s diferenas de frequncia serem muito pequenas em relao largura
da banda; assim obtm-se um s pico irregular em vez de vrios para cada tipo de estrutura
secundria. Tm vindo a ser desenvolvidos mtodos para melhorar este aspecto como o
mtodo de desconvoluo de Fourier e o das segundas derivadas.
FTIR e mioglobina e -globulina

Nesta actividade experimental pretendia-se identificar as bandas da Amida I que
permitissem identificar as estruturas secundrias da mioglobina e comparar com as da globulina.
A mioglobina uma protena cuja estrutura secundria constituda maioritariamente por
hlices , portanto, no espectro de FTIR esperado que o mnimo de absoro seja para
nmero de onda 1656 cm-1 (nmero de onda atribudo estrutura de hlices em H2O).
A -globulina uma protena cuja estrutura secundria constituda maioritariamente por
folhas ; no espectro de FTIR esperado que os valores mnimos de absoro sejam para
nmeros de onda: 1624, 1627, 1633, 1638, 1642, 1691 e 1696 cm -1 e 1642 (nmeros de onda
atribudos estrutura de folhas em H2O).
Procedimento:
Espectros de excitao e emisso de fluorescncia do triptofano e da mioglobina
42
43
Resultados:
Espectros de fluorescncia do triptofano
No se observaram diferenas significativas nos espectros de excitao do triptofano.
44
O espectro de emisso do triptofano em etanol tem um mximo a 335 nm e o do

triptofano em tampo fosfatos a 350 nm. Estes espectros sofrem o efeito de relaxao do
solvente.
A relaxao do solvente consiste na estabilizao das molculas no estado excitado
por interaco com as molculas do solvente, sendo este efeito maior quanto maior for a
polaridade do composto em causa. Como o tampo de fosfatos mais polar que o etanol o
estado excitado do triptofano em tampo menos energtico e por isso o espectro de
emisso a comprimentos de onda maiores, sendo o do etanol a comprimentos de onda
menores.
Isto s acontece porque o momento dipolar da molcula no estado excitado maior
do que no estado fundamental.
Por a emisso em fluorescncia ser mais lenta que a excitao, pode dizer-se que os
espectros de emisso so mais sensveis ao ambiente, permitindo, por exemplo, a
reorientao do solvente (efeito de relaxao do solvente).
Espectros de fluorescncia da mioglobina

No intervalo de comprimentos de onda utilizado, apenas o triptofano (dos trs
aminocidos aromticos) fluorescente - causa a fluorescncia da mioglobina.
O mximo da mioglobina nativa semelhante ao mximo de triptofano em etanol,
pois quando a protena se encontra no estado nativo os resduos de triptofano (os dois que a
mioglobina possui) esto num microambiente relativamente apolar, no interior da protena.
O espectro de emisso da mioglobina desnaturada semelhante ao do triptofano em
tampo, pois ocorre desnaturao da mioglobina, ficando os resduos de triptofano sujeitos a
um microambiente polar, semelhante ao triptofano em tampo.
Variao da intensidade de fluorescncia da mioglobina com o pH
Existe um mximo de intensidade de fluorescncia em redor do pH 4, um mnimo de

intensidade de fluorescncia em redor de pH 6 e a partir da uma nova subida da
intensidade.
45
pH 3.5: a diminuio da fluorescncia pode dever-se protonao de um carboxilo

prximo, j que os dados no indicam que ocorram mudanas conformacionais;
pH 4: mximo de fluorescncia
pH 6: mnimo de fluorescncia porque o pKa da histidina prximo de 6 e a este pH

a cadeia lateral do resduo protonada; quando isto ocorre a intensidade da
fluorescncia diminuda;
pH 7 : estabilizao devido desprotonao de outros resduos de aminocidos;
Diminuindo o pH: aumento da fluorescncia, devido ao desenrolamento da protena,

que leva ao afastamento dos resduos de histidina e triptofano; os resduos de
triptofano ficam mais expostos, havendo um aumento da intensidade de
fluorescncia.
Comparao com grfico para a apomioglobina
As observaes feitas na aula so semelhantes s obtidas por Irace e colaboradores,

embora no artigo de Irace se tenha usado apomioglobina.
Comparao com grfico de Gryczynski e colaboradores
O grfico de Gryczynski e colaboradores foi feito para a mioglobina de corao de

cavalo
O desvio que se observa entre os espectros de pH 7 e pH 4,5 na zona do IV prova o

desenrolamento da protena, verificado tambm para o grfico de Gryczynski .
Ao dar-se o desenrolamento, os resduos ficam mais expostos, havendo um aumento

na intensidade de fluorescncia.
FTIR
Ftir mioglobina
Nmero de onda (
Banda caracterstica
1536.99
Amida II
1656.56
Amida I (hlice )
3299.92
Amida A
Ftir globulina
Nmero de onda (
615,18
Banda caracterstica
Amida V
46
3286.12
1236.15
Amida III
1531.21
Amida II
1643.06
Amida I (folha )
Amida A
Comparao da estrutura secundria das protenas obtida atravs de FTIR e de cristalografia

de raio-X
A -globulina uma imunoglobulina pelo que foi usada a informao relativa
imunoglobulina G para comparao.
Os resultados obtidos por FTIR esto consistentes com a tabela apresentada, no entanto
no se encontraram folhas na mioglobina
Concluso:
A -globulina uma imunoglobulina pelo que foi usada a informao relativa

imunoglobulina G para comparao;
Os resultados obtidos por FTIR esto consistentes com a tabela apresentada, no

entanto no se encontraram folhas na mioglobina.
As tcnicas de fluorescncia e de FTIR complementam-se;
A primeira fornece informao acerca da constituio em resduos de aminocidos da

protena e o microambiente onde se encontram inseridos;
A segunda garante uma viso sobre a estrutura secundria da protena, conseguindo

assim atravs da utilizao destas duas tcnicas uma viso nica sobre a estrutura
tridimensional da protena em estudo.
47
RESPIRAO MITOCONDRIAL RAZO ADP/O E RAZO DE CONTROLO RESPIRATRIO
1. Introduo
Transporte electrnico e fosforilao oxidativa
A fosforilao oxidativa uma via metablica que utiliza a oxidao final de glcidos,
lpidos e protenas (e a energia libertada nestas reaces de oxidao-reduo) para produzir
ATP, atravs da fosforilao de ADP. Este processo ocorre nos mitocndrios. Nesta via ocorre
transferncia de electres a partir de doadores electrnicos at aceitadores electrnicos finais,
como o oxignio transporte electrnico.
A cadeia respiratria pode ser separada em 4 complexos enzimticos:

NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I)
Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II)
Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III)
Citocromo c Oxidase (Complexo IV)
Em plantas, so ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais

complexos da cadeia respiratria duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada
zona interna da membrana interna e outra zona externa da membrana interna) e uma
actividade alternativa de oxidase.
Estes complexos, na presena de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidao

aerbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferncia electrnica para
a ubiquinona a partir de dois doadores de electres diferentes: NADH (complexo I) e sucinato
(complexo II). O complexo III leva electres da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o
complexo IV completa a sequencia transferindo os electres do citocromo c para o O2.
Fosforilao oxidativa o acoplamento do transporte electrnico com a sntese de
ATP
Os complexos I, III e IV so centros de acoplamento de energia. Nestes centros de
acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrnico conservada atravs da sua
converso numa fora motriz protnica utilizada para bombear protes para fora da matriz
mitocondrial (espao intermembranar), ocorrendo assim uma translocao vectorial de
48
protes e a formao de um potencial electroqumico protnico de membrana, podendo

ento essa energia ser usada para a sntese do ATP. Esta sntese catalisada por um complexo
multienzimtico, Complexo V ou ATPsintase.
Inibidores e desacopladores
A fosforilao oxidativa pode ser inibida directamente por uma srie de agentes qumicos.
Uma classe destes compostos (caso do antibitico oligomicina) inibe a fosforilao oxidativa e
a respirao. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilohidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibio da fosforilao por
desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respirao e fluxo de electres mas no ocorre
sntese de ATP (h inibio da fosforilao oxidativa mas no da respirao). Uma terceira
classe inclui os inibidores especficos da cadeia de transporte electrnico (rotenona, antimicina
A, cianeto).
Controlo respiratrio
O sistema de fosforilao oxidativa exerce um efeito regulador na velocidade de
respirao. Com efeito, as concentraes de ADP e de fosfato limitam a velocidade de
transporte electrnico. Uma vez que na maioria das clulas o fosfato inorgnico se encontra
presente em excesso, o ADP que controla a velocidade de respirao. Nos organismos
intactos, existe um alto grau de controlo respiratrio e os mitocndrios dizem-se fortemente
acoplados. Quando ocorre dano estrutural no mitocndrio perde-se este controlo.
RC (respiratory control) refere-se razo
entre as velocidades de consumo de O2 no
estado e no estado 4.
49
O controlo respitatrio pode ser ilustrado por uma srie de cinco estados que se
podem repetir ciclicamente.
estado 1 mitocndrios sozinhos (na presena de Pi)
estado 2 - adio de substrato, respirao baixa devido falta de ADP (no h reentrada
de protes atravs do ATP sintase e qualquer respirao deve-se fuga de protes atravs
da membrana)
estado 3 uma quantidade limitada de ADP adicionada, permitindo uma respirao

rpida
estado 4 - todo o ADP foi convertido em ATP (fosforilao) e a respirao torna-se lenta
estado 5 anoxia (ausncia de O2)

Se a quantidade de ADP adicionado for conhecida ento a captao de oxignio
durante o estado 3 pode ser quantificada permitindo o clculo de uma razo P/O.
Razo ADP/O
A razo ADP/O o nmero de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electres
fluindo por um segmento da transferncia electrnica para o oxignio. No clculo desta razo
o oxignio o terminal aceitador.
Razes P/O podem ser determinadas atravs da extenso do estado trs acelerado,
obtido por adio de ADP no estado 2. Quase todo o ADP fosforilado a ATP: a razo ATP:ADP
normalmente de 100:1 quando o estado 4 atingido e a razo moles de ADP
adicionado/moles de O2 consumido pode ser calculada.
50
Tcnicas
O elctrodo de oxignio
Este elctrodo consiste num elctrodo de referncia de Ag/AgCl e um elctrodo de Pt,
ambos imersos em KCl aquoso e separados da cmara onde se inserem as amostras apenas
atravs de uma membrana permevel a O2. Este reduzido a H2O no elctrodo de Pt, gerando
uma voltagem referente ao elctrodo de Ag/AgCl que proporcional [O2] na cmara
reaccional.
Ctodo:
O2 + 4e-
2H2O
nodo:
+
4Ag + 4Cl-
4AgCl + 4e-
51
Objectivos:
1. A extenso da fosforilao obtida com diferentes substratos (razo ADP/O)
2. O grau de controlo respiratrio
3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrnico
2. Procedimento
Isolamento dos mitocndrios de batata
importante ter em conta que, sendo uma experincia em que se pretende manter a
actividade mitocondrial, todas as operaes devem ser feitas entre 0 e 4C e o processo no
deve demorar mais que 1h.
Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de
batata, comeando por se pesar 300g de batata e cort-la em cubos pequenos.
De seguida efectuou-se a homogeneizao em 250 mL de meio de isolamento num
batedor elctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de
actividade.
Procedeu-se filtrao num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior
centrifugao.
Aps a 1centrifugao aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a
8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em
meio de lavagem, juntando-se o contedo de diferentes tubos (dos vrios grupos).
Centrifugou-se novamente nas mesmas condies, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em
meio de ressuspenso e prosseguiu-se ltima centrifugao tambm a 8000g, 4 graus e
durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio
de ressuspenso.
Obteve-se assim a fraco mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte.
Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspenso. Estes meios
contm alguns componentes com concentraes adequadas para manter a actividade
mitocondrial.
O pH 6,5 o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manuteno da osmoralidade
do meio, a cistena previne a oxidao de produtos fenlicos prejudiciais ao mitocndrio, a BSA
(soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratrio pelo ADP e o EDTA remove
metais catalisadores de reaces indesejveis, mas inibe a respirao induzida pela cistena,
pelo que adicionado em concentrao baixa.
52
Determinao das razes ADP/O

Para determinar as razes ADP/O prepararam-se vrias solues: meio recacional,
substratos, ADP e o inibidor CCP.
Procedeu-se calibrao do elctrodo de oxignio temperatura ambiente. De
seguida saturou-se o meio de reaco com ar, num agitador magntico a 20 graus.
Depois deste processo adicionou-se cmara reaccional 1,6 mL do meio reaccional e
0,2 mL de suspenso mitocondrial. Colocou-se de seguida a tampa para que o tampo subisse
1cm no canal de injeco e iniciou-se o registo at obteno de uma linha de base
estacionria.
Iniciou-se o primeiro ensaio com a adio de 20 L de succinato de sdio (substrato),
registou-se uns minutos e adicionou-se 20 L ADP, prosseguindo com o registo at o seu
consumo, quando se adiciona novamente 20 L ADP. Regista-se mais um minuto e adiciona-se
CCP (inibidor). Por fim removeu-se a mistura da cmara por aspirao, limpando e enchendo a
cmara com gua desionizada.
No ensaio seguinte o processo o mesmo mas com a adio de + 20 L de ascorbato
de sdio+ 20 L de citocromo c 10 mg/mL como substratos.
53
3. Resultados
Calibrao do elctrodo
Calibrou-se o elctrodo de oxignio e determinaram-se as concentraes de oxignio
correspondentes a 0% e 100% de O2. Foi calibrado a 100% com o meio reaccional oxigenado
por agitao e a 0% com o reagente ditionito de sdio.
No protocolo fornecida uma tabela que nos d informao sobre contedo em O2 de
gua saturada com ar:
Tabela 1 - Contedo em O2 de gua saturada com ar.
Temperatura (oC)
0
5
10
15
20
25
30
35
100% O2
O2 (ppm)
14,16
14,37
10,92
9,76
8,84
8,11
7,52
7,02
O2 (mol/mL)
0,442
0,386
0,341
0,305
0,276
0,253
0,230
0,219
Sabendo que a temperatura ambiente aproximadamente

25 C, a concentrao de O2 na cmara reaccional 0,253 mol/mL.
O volume da cmara 2 mL, pelo que possvel calcular o nmero
de moles de O2:
0
0% O2
Contam-se 77 quadrculas entre o ponto equivalente a

100% de O2 e o ponto equivalente a 0%. Assim sabe-se que 77
quadrculas equivalem a 506 nmol de O2, logo, uma quadrcula
corresponde a 506/77 nmol = 6,57 nmol.
Quadrculas
77
1
n (O2) /nmol
506
6,57
54
Razo ADP/O
1. Ensaio do Succinato (Complexo II)
1.
2.
Como se quer calcular a razo ADP/O, necessrio calcular as moles de O consumidas,
pelo que se tem de multiplicar por dois o nmero de moles calculado para O2:
1. 59,13 x 2 = 118,26 nmol de O consumidas.
2. 32,85 x 2 = 65,7 nmol de O consumidas.
A soluo preparada de ADP tinha uma concentrao de 10 mM (0,01M = 0,01 mol/L =

10 mol/L). Adicionaram-se 20 L, logo pode calcular-se o nmero de moles:
-8
1.
2.
a o
a o
55
2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sdio (Complexo IV)
91,98 x 2 = 183,96 nmol de O consumidas

a o
Substrato
Razo ADP/O
experimental
Razo ADP/O
terica*
Succinato (1)
1,7
1,6
Citocromo c + Ascorbato
1,1
*Valores apresentados nos slides de Processos de Oxidao-Reduo em Bioqumica fornecidos pela professora da cadeira.
Observou-se que quando se adicionou ADP a um substrato ocorreu sempre consumo

de O2, pelo que se pode concluir que houve respirao. Os valores obtidos da razo ADP/O so
muito semelhantes aos valores tericos, pelo que se pode admitir que a experincia foi bem
sucedida.
Ao adicionar CCP continuou a haver respirao porque, sendo este um desacoplador,
provoca a inibio da fosforilao por desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respirao
e fluxo de electres mas no ocorre sntese de ATP.
A razo ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque
ao longo da cadeia so transportados para fora da matriz menos protes, havendo menos
energia disponvel para a sntese de ATP. Assim, para que esta no seja diminuda, a actividade
da cadeia transportadora de electres aumenta, levando ao aumento do consumo de O2.
No complexo II no ocorre transporte de protes, pelo que no h contribuio para o
gradiente electroqumico, o que leva a que a razo ADP/O seja pequena.
56
No complexo IV a razo ADP/O inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai
ser necessrio um maior consumo de oxignio para produzir a mesma quantidade de ATP
(consumir a mesma quantidade de ADP).
Controlo Respiratrio
Regulao da velocidade de transporte electrnico pelo ADP;
Razo entre as velocidades de consumo de O2 no estado 3 e no estado 4.
o
o
Estado 3 Uma quantidade limitada de ADP adicionada, permitindo uma respirao

rpida;
Estado 4 Todo o ADP foi convertido em ATP e a respirao torna-se lenta.
ontrolo espirat rio
1. Ensaio do Succinato (Complexo II)
57
Cada quadrcula (horizontal) do grfico equivale a 1 cm e a velocidade a que o papel

corre 1cm/min, logo, sabendo que passa um tempo equivalente a 4 quadrculas na presena
de ADP (4 min) e equivalente a 2,8 quadrculas na ausncia de ADP pode calcular-se a
velocidade de consumo de O2 com e sem ADP. Como h dois declives correspondentes a cada
caso (dois declives para presena e ausncia de ADP) necessrio fazer a mdia dos dois
valores obtidos para calcular a razo de controlo respiratrio neste ensaio.
min
min
RC mdio: (6,23 + 3,6)/2 = 4,92
2. Ensaio do Citocromo c e do Ascorbato de sdio (Complexo IV)
58
min
Esta razo permite determinar a extenso do acoplamento dos mitocndrios assim

como a sua integridade funcional.
Para esta parte do trabalho no foi possvel encontrar valores tericos, mas, no
entanto, sabe-se que se RC>1, os mitocndrios esto acoplados, no tendo sofrido alteraes
na sua funcionalidade. Nos ensaios observa-se que todos os resultados so maiores que 1, pelo
que se conclui que os mitocndrios estavam acoplados.
4. Concluso
A razo ADP/O o nmero de moles de ADP fosforiladas a ATP por cada dois electres
fluindo por um segmento da transferncia electrnica para o oxignio.
A razo ADP/O vai diminuindo do complexo I para o complexo IV. Isto acontece porque
ao longo da cadeia so transportados para fora da matriz menos protes, havendo menos
energia disponvel para a sntese de ATP, o que faz com que a actividade da cadeia
transportadora de electres aumente, levando ao aumento do consumo de O2.
No complexo II no ocorre transporte de protes, pelo que no h contribuio para o
gradiente electroqumico, o que leva a que a razo ADP/O seja pequena.
No complexo IV a razo ADP/O inferior. Isto acontece porque, ao longo da cadeia, vai
ser necessrio um maior consumo de oxignio para produzir a mesma quantidade de ATP
(consumir a mesma quantidade de ADP).
59
Uma vez que na maioria das clulas o fosfato inorgnico se encontra presente em
excesso, o ADP que controla a velocidade de respirao. Nos organismos intactos, existe um
alto grau de controlo respiratrio e os mitocndrios dizem-se fortemente acoplados. Quando
ocorre dano estrutural no mitocndrio perde-se este controlo.
A razo de controlo respiratrio permite determinar a extenso do acoplamento dos
mitocndrios assim como a sua integridade funcional.
Como RC>1, os mitocndrios estavam acoplados, no tendo sofrido alteraes na sua
funcionalidade.
60
RESPIRAO MITOCONDRIAL SEQUENCIAO DA CADEIA RESPIRATRIA
1. Introduo
Transporte electrnico e fosforilao oxidativa
A fosforilao oxidativa uma via metablica que utiliza a oxidao final de glcidos,
lpidos e protenas (e a energia libertada nestas reaces de oxidao-reduo) para produzir
ATP, atravs da fosforilao de ADP. Este processo ocorre nos mitocndrios. Nesta via ocorre
transferncia de electres a partir de doadores electrnicos at aceitadores electrnicos finais,
como o oxignio transporte electrnico.
A cadeia respiratria pode ser separada em 4 complexos enzimticos:

NADH-Ubiquinona Redutase (Complexo I)
Succinato-Ubiquinona Redutase (Complexo II)
Ubiquinol-citocromo c Redutase (Complexo III)
Citocromo c Oxidase (Complexo IV)
Em plantas, so ainda encontradas algumas actividades alternativas aos principais

complexos da cadeia respiratria duas actividades de NADH desidrogenase (uma associada
zona interna da membrana interna e outra zona externa da membrana interna) e uma
actividade alternativa de oxidase.
Estes complexos, na presena de ubiquinona e de citocromo c, catalisam a oxidao

aerbia do NADH e do sucinato - os complexos I e II catalisam a transferncia electrnica para
a ubiquinona a partir de dois doadores de electres diferentes: NADH (complexo I) e sucinato
(complexo II). O complexo III leva electres da ubiquinona reduzida ao citocromo c e o
complexo IV completa a sequencia transferindo os electres do citocromo c para o O2.
Fosforilao oxidativa o acoplamento do transporte electrnico com a sntese de

ATP
Os complexos I, III e IV so centros de acoplamento de energia. Nestes centros de
acoplamento, a energia libertada durante o transporte electrnico conservada atravs da sua
converso numa fora motriz protnica utilizada para bombear protes para fora da matriz
61
mitocondrial (espao intermembranar), ocorrendo assim uma translocao vectorial de

protes e a formao de um potencial electroqumico protnico de membrana, podendo
ento essa energia ser usada para a sntese do ATP. Esta sntese catalisada por um complexo
multienzimtico, Complexo V ou ATPsintase.
Inibidores e desacopladores
A fosforilao oxidativa pode ser inibida directamente por uma srie de agentes qumicos.
Uma classe destes compostos (caso do antibitico oligomicina) inibe a fosforilao oxidativa e
a respirao. Uma segunda classe de agentes (caso do m-clorocarbonilocianetofenilohidrazona (CCP) e 2,4-dinitrofenol (DNP)) provoca a inibio da fosforilao por
desacoplamento, ou seja, continua a ocorrer respirao e fluxo de electres mas no ocorre
sntese de ATP (h inibio da fosforilao oxidativa mas no da respirao). Uma terceira
classe inclui os inibidores especficos da cadeia de transporte electrnico (rotenona, antimicina
A, cianeto).
Tcnicas
O elctrodo de oxignio
Este elctrodo consiste num elctrodo de referncia de Ag/AgCl e um elctrodo de Pt,
ambos imersos em KCl aquoso e separados da cmara onde se inserem as amostras apenas
atravs de uma membrana permevel a O2. Este reduzido a H2O no elctrodo de Pt, gerando
uma voltagem referente ao elctrodo de Ag/AgCl que proporcional [O2] na cmara
reaccional.
Ctodo:
O2 + 4e-
2H2O
nodo:
62
4Ag+ + 4Cl-
4AgCl + 4e-
Objectivos:
1. A extenso da fosforilao obtida com diferentes substratos (razo ADP/O)
2. O grau de controlo respiratrio
3. O efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia de transporte electrnico
2. Procedimento
importante ter em conta que, sendo uma experincia em que se pretende manter a
actividade mitocondrial, todas as operaes devem ser feitas entre 0 e 4C e o processo no
deve demorar mais que 1h.
Nesta actividade experimental a primeira parte foi o isolamento dos mitocondrios de
batata, comeando por se pesar 300g de batata e cort-la em cubos pequenos.
De seguida efectuou-se a homogeneizao em 250 mL de meio de isolamento num
batedor elctrico, durante apenas 2 segundos para evitar danificar estruturas e perda de
actividade.
Procedeu-se filtrao num funil de Buckner com uma camada de gaze e posterior
centrifugao.
Aps a 1centrifugao aproveitou-se o sobrenadante e voltou-se a centriguar a
8000g durante 10 minutos e a 4 graus. Desta vez aproveitou-se o pellet, ressuspendendo-o em
meio de lavagem, juntando-se o contedo de diferentes tubos (dos vrios grupos).
Centrifugou-se novamente nas mesmas condies, aproveitou-se o pellet, ressuspendeu-se em
63
meio de ressuspenso e prosseguiu-se ltima centrifugao tambm a 8000g, 4 graus e

durante 10 minutos. Retirou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o pellet em 4-5 mL de meio
de ressuspenso.
Obteve-se assim a fraco mitocondrial a ser usada no procedimento seguinte.
Os meios utilizados foram os de isolamento, lavagem e ressuspenso. Estes meios
contm alguns componentes com concentraes adequadas para manter a actividade
mitocondrial.
O pH 6,5 o mais adequado, o manitol 0,7 M permite a manuteno da osmoralidade
do meio, a cistena previne a oxidao de produtos fenlicos prejudiciais ao mitocndrio, a BSA
(soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratrio pelo ADP e o EDTA remove
metais catalisadores de reaces indesejveis, mas inibe a respirao induzida pela cistena,
pelo que adicionado em concentrao baixa.
Efeito de inibidores
Pretende-se agora sequenciar a cadeia respiratrio usando vrios inibidores da
mesma, sendo que os ensaios devem ser adequados para calcular a actividade do oxidase
alternativo/respirao no inibida pelo KCN.
Comeou-se por adicionar na camara reaccional 1,4 mL de meio de reaco + 200 L
de mitocndrios + 20 L de succinato + 50 L de ADP obtendo-se o registo do elctrodo.
Adicionou-se + 10 L de oligomicina antes que o ADP se esgotasse e +20 L de malonato
quando comea a haver declive.
A oligomicina inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal de protes, que necessrio
para a fosforilao oxidativa de ADP para ATP (produo de energia). A inibio da sntese de
ATP pra tambm a cadeia transportadora de electres.
O malonato um inibidor do complexo II e a oligomicina do complexo ATP sintase.
Adiciona-se agora 20 L de malato + 20 L de glutamato (complexo I) para verificar se a
respirao retoma ou no, confirmando-se pelo registo; adiciona-se rotenona que inibe o
complexo I.
Adicionou-se NADH, registando-se, e + 20 L antimicina A (para assegurar que est
inibido); colocou-se na camara reaccional + 20 L de citocromo c + 20 L de ascorbato de sdio
(substratos), registando-se e 40 L de KCN, 20 de cada vez.
Adicionou-se + 20 L de ADP, registou-se e mais + 20 L de succinato, que estava
inibido devido ao KCN. Comea-se ento um novo registo com adio de 1,4 mL de meio de
reaco + 300 L de mitocndrios + 20 L de succinato + 20 L de ADP, registando-se.
Adicionou-se + 20 L de rotenona, substrato do complexo II e inibidor do complexo I. Registouse e adicionou-se +20 L de malonato (inibidor do complexo II).
64
Adicionou-se + 20 L de citocromo c + 20 L de ascorbato de sdio, registou-se,

adicionou-se + 20 L de anticimina A, que um substrato para o complexo IV e inibidor do III.
Registou-se e adicionou-se 40 L de KCN (inibidor do complexo V), 20 de cada vez.
65
3. Resultados
A utilizao de inibidores causa a interrupo do fluxo electrnico, fazendo com que os

complexos fiquem reduzidos e incapazes de aceitar electres dos que o antecedem. O
resultado prtico traduz-se numa reduo do consumo de oxignio.
Complexo I - NADH ubiquinona oxirredutase / NADH desidrogenase
Catalisa a transferncia de 2 electres do NADH (dador de electres) para a

ubiquinona. A este processo est associada a translocao vectorial de 4 protes.
Substrato: Glutamato + Malato
Utiliza-se este substrato por possuir um sistema de transporte prprio para o interior da matriz
mitocondrial, ao contrrio do NADH uma vez que este no consegue atravessar a membrana
interna mitocondrial.
Inibidor: Rotenona
Inibidor do complexo I Inibe a transferncia de electres do NADH para a ubiquinona (o
consumo de O2 pra) ao bloquear a oxidao de NADH a NAD+.
Complexo II Succinato: Ubiquinona oxirredutase / Succinato desidrogenase
Catalisa a transferncia de 1 electro do succinato (dador de electres) para a ubiquinona.

Substrato: Succinato
Inibidor: Malonato
Inibidor do complexo II Inibe competitivamente o succinato desidrogenase impedindo a
transferncia electres do succinato para a ubiquinona.
Complexo III Ubiquinol: Citocromo c oxirretudase / Citocromo bc1
Transporte de 2 electres do ubiquinol (ubiquinona reduzida) para o citocromo c. A este

processo est associada a translocao vectorial de 4 protes.
Substrato: No utilizado substrato para este complexo.
Inibidor: Antimicina A
Inibidor do complexo III Inibe a transferncia de electres do ubiquinol para o citocromo c
pois liga-se ao centro de reduo da quinona no complexo citocromo bc1.
66
Complexo IV Ferrocitocromo c: oxigenorredutase / Citocromo c oxidase
Transferncia de 1 electro de cada uma de quatro molculas de citocromo c para o O2,

reduzindo-o a duas molculas de H2O.
Substrato: Ascorbato + Citocromo c
Inibidor: Cianeto
Inibidor do complexo IV Inibe a transferncia de electres do citocromo c oxidase para o O2
devido ao facto de se ligar ao ferro do enzima. A partir daqui a cadeia no pode ser retomada
pelo que o cianeto fatal.
Ensaio 1
Succinato (Substrato do complexo II) + Malonato (Inibidor complexo II)
Malato + Glutamato (Substrato do complexo I) + Rotenona (Inibidor complexo I)
67
Ensaio 1 (2)
Antimicina A (Inibidor complexo III Para certificar que estava inibido) + Citocromo c com
ascorbato de sdio (Substrato complexo IV) + KCN (Inibidor complexo IV).
Na presena de Antimicina A ocorre respirao quando adicionado o substrato do

complexo IV. Ocorre inibio quando adicionado KCN - Inibe mas continua a haver
consumo de O2 devido presena de citocromo c oxidase alternativo.
68
Ensaio 1 (3)
Succinato (Substrato complexo II) Estava inibido devido ao KCN, pelo que se comeou uma
nova reaco.
69
Ensaio 2
Succinato (Substrato complexo II) + Rotenona (Inibidor complexo I) + Malonato (Inibidor
complexo II) + Citocromo c com ascorbato de sdio (Substrato complexo IV) + Antimicina A
(Inibidor complexo III) + KCN (Inibidor complexo IV Inibe mas continua a haver consumo de
O2 devido presena de citocromo c oxidase alternativo).
70
Inicialmente adicionou-se Oligomicina que inibe o ATP sintase ao bloquear o seu canal
de protes, que necessrio para a fosforilao oxidativa de ADP para ATP (produo de
energia). A inibio da sntese de ATP pra tambm a cadeia transportadora de electres. Seria
de esperar que no ocorresse respirao, o que no observado, pelo que a soluo deve
estar mal preparada.
Atravs do Ensaio 1 possvel concluir que o Malonato inibe o Succinato, pelo que o
inibidor do complexo II. Adicionando seguidamente Malato + Glutamato (substratos do
complexo I) observa-se a ocorrncia de consumo de oxignio mas em muito pouca quantidade.
Pode concluir-se que o Malonato no inibiu ento o complexo I, pois ao adicionar substratos
do mesmo continuou a haver respirao, mas como foi muito pouco intensa, pode levar a
considerar que houve erros experimentais na preparao de solues. Estes resultados
indicam que os complexos I e II funcionam em paralelo.
Adicionando Rotenona deixa de haver respirao, pelo que se sabe que um inibidor do
complexo I. Adicionou-se depois NADH que substrato do complexo I e das actividades
alternativas do NADH desidrogenase, no se registando consumo de O2, por o complexo I estar
inibido, o que confirma que a Rotenona inibidor do complexo I.
Pelo Ensaio 1 (2) pode concluir-se que a Antimicina A no inibe o complexo IV.
Adicionou-se Citocromo c + Ascorbato e observou-se um aumento da respirao, pelo que o
complexo IV no inibido pela Antimicina A. O facto de haver consumo de O2 depois da adio
destes substratos, demonstra que o inibidor do complexo III no afecta o complexo IV,
portanto o complexo III anterior ao IV na cadeia respiratria. Com a adio de KCN o
complexo IV inibido pelo que se espera que continue a haver consumo de oxignio devido
71
presena de citocromo c oxidase alternativo. No entanto o consumo de O2 aumenta, pelo que

se pode concluir que a soluo estava mal preparada.
Adicionou-se ainda Succinato (substrato para o complexo II), mas no houve
respirao, uma vez que estava inibido devido presena de KCN. A actividade do complexo II
pra com a adio deste inibidor, porque ao inibir o complexo IV no vai haver consumo de
oxignio. Assim pode concluir-se que o complexo IV se situa mais frente que o complexo II na
cadeia respiratria.
Comeou-se ento uma nova reaco, onde se adicionou Succinato, ocorrendo
respirao, seguido da adio de Rotenona, no havendo diminuio da respirao, pelo que o
complexo II no foi inibido pela Rotenona. Adicionando seguidamente Malonato j se observa
inibio, pelo que se confirma que inibidor do complexo II (como se j tinha observado
anteriormente). Adicionou-se Citocromo c com Ascorbato de sdio (substratos do complexo
IV) sendo retomada a respirao, pelo que o Malonato no inibe o complexo IV. Assim
demonstra-se que os inibidores dos complexos I e II no afectam o complexo IV, ou seja, o
complexo IV posterior na cadeia respiratria aos complexos I e II. Adicionando Antimicina A
nada acontece, confirmando-se que no um inibidor deste complexo, mas, por fim,
adicionando KCN j ocorre inibio, apesar de haver ainda consumo de oxignio devido
actividade alternativa do complexo IV. Aps adio de cianeto de potssio o declive das rectas
voltou a aumentar, o que se deve provavelmente a uma m preparao da soluo.
Quadro resumo
Inibidor
Substrato
Rotenona
Malonato
Antimicina A
KCN
Glutamato + Malato
Succinato
Ascorbato +
Citocromo c
Apesar do KCN inibir apenas o complexo IV, no vai haver respirao quando se adiciona o
mesmo. Isto acontece porque pra o consumo de oxignio ao ser adicionado este inibidor.
4. Concluso
possvel comprovar que a Rotenona inibe o complexo I, o Malonato o complexo II, a
Antimicina A o complexo III, e o KCN o complexo IV;
A ordem dos complexos na cadeia respiratria complexo I, II, III e IV;
72
Aps se inibir o complexo IV no possvel retomar o fluxo de electres pelo que se

pode comprovar que este se situa no final da cadeia transportadora de electres;
Os complexos I e II so independentes um do outro, transferindo ambos os seus
electres para o complexo III.
73
INCHAMENTO MITOCONDRIAL
1. Introduo
Os mitocndrios incham se forem suspensos num meio que no seja isotnico com a
matriz. O mesmo acontece se forem colocados numa soluo em que o principal soluto
permevel membrana interna. Assim, aumentando a concentrao de solutos dentro da
matriz mitocondrial, favorece-se a entrada de gua, havendo um aumento da presso
osmtica que leva ao inchamento do mitocndrio.
As suspenses mitocondriais dispersam a luz. Esta disperso principalmente funo
da diferena entre o ndice de refraco do contedo da matriz e do meio de suspenso, logo,
quando esta diferena diminui, a disperso de luz tambm diminui.
Quando o mitocndrio incha devido entrada de um soluto permevel ocorre uma
diminuio da disperso de luz (diminui a absorvncia medida no espectrofotmetro)
medida que o ndice de refraco da matriz se aproxima do ndice de refraco do meio de
suspenso.
Os mitocndrios so adequados para esta tcnica porque as suas matrizes podem
sofrer um grande aumento de volume sem rebentarem atravs do abrir das cristas da
membrana interna.
Pode, ento, estudar-se o efeito de vrios compostos no inchamento dos
mitocndrios, seguindo a disperso de luz com a utilizao de um espectrofotmetro UVVisvel. A extenso do inchamento medida pela diminuio da absorvncia.
Factores que influenciam o inchamento mitocondrial:
1. Necessidade de manter a neutralidade elctrica.
2. O gradiente electroqumico (pH + ) promove:
Sistemas de transporte que impliquem a entrada de H+ ou sada de OH- da
matriz (pH).
Movimento de ies em resposta ao (dissipando o potencial).
Estratgias para o transporte de metabolitos e ies atravs da membrana
74
Para que ocorra inchamento mitocondrial:
Tanto o catio como o anio do principal componente osmtico do meio tm

de ser permeveis;
Tem de ser mantido o equilbrio de cargas atravs da membrana (neutralidade
elctrica).
Propriedades de permeabilidade da membrana mitocondrial (Brian Chappel Inchamento mitocondrial na presena de sais de amnio de cidos fracos ou metabolitos):
Os mitocndrios comportam-se como osmmetros perfeitos; Respondem a mudanas
na presso osmtica do meio de suspenso contraindo-se ou inchando conforme a
gua flui atravs da membrana para compensar a diferena de actividade quando os
osmlitos so adicionados (ou removidos) do meio externo.
A membrana mitocondrial impermevel a pequenos ies (ex: H+, K+, Na+, NH4+, Cl-,
NO3-, etc.).
A membrana mitocondrial permevel a molculas pequenas sem carga (ex: O2, CO2,
N2, glcidos com 3 ou 4C, etc.).
Embora a membrana seja impermevel a pequenos ies, e portanto impermevel ao
acetato (CH3COO-) e NH4+, permevel ao cido actico (CH3COOH) e ao NH3, que so
pequenas molculas neutras.
75
Tcnicas utilizadas:
Centrifugao
Uso da fora centrfuga para saparar partculas por sedimentao;

Partculas de tamanhos diferentes sedimentam a velocidades diferentes.

da regio do ultra violeta regio do visvel;
Lambert-Beer, que nos d a concentrao da substncia em funo da absorvncia
num determinado intervalo de linearidade (A=lc).
Objectivo:
Utilizar a tcnica de inchamento mitocondrial (utilizando mitocndrios de batata),
observado por medidas de disperso de luz, para verificar os processos de transporte atravs
da membrana mitocondrial interna.
76
2. Procedimento
Meios utilizados
Meio de isolamento
Tampo fosfato 0,01M pH 6,5;

Manitol 0,7M;
EDTA 0,001 M;
Cistena 0,002 M;
BSA (fraco V) 0,1% (m/v)
Meio de lavagem

Manitol 0,7M;
Cistena 0,002 M;
BSA (fraco V) 0,1% (m/v)
Meio de
ressuspenso

Manitol 0,7M;
BSA(fraco V) 0,1% (m/v)
Observaes:
pH=6,5 o mais adequado;

O manitol mantm a osmolaridade do meio, sendo 0,7 M a concentrao mais
adequada;
A cistena previne a oxidao de produtos fenlicos prejudiciais ao mitocndrio;
A BSA (soro de albumina bovina) leva a maior controlo respiratrio pelo ADP;
77
O EDTA remove metais catalisadores de reaces indesejveis, mas inibe a

respirao induzida pela cistena adicionado em concentrao baixa.
Procedimento
Reproduzir os resultados das experincias indicadas nas figuras;

Realizar leituras espectrofotomtricas: 520 nm, volume total 2,5 mL, T=30C.
Preparao das solues para os ensaios espectrofotomtricos

Ensaios
Constituintes
H2O + mitocndrios
KCl + tampo Tris HCl com EDTA + mitocndrios
NH4Cl + tampo Tris HCl com EDTA + mitocndrios
NH4CH3COO + tampo Tris HCl com EDTA + mitocndrios
(NH4)3PO4 + tampo Tris HCl com EDTA + mitocndrios
Malato de Amnio + + tampo Tris HCl com EDTA + mitocndrios +

rotenona + (Na)3PO4
Citrato de Amnio + tampo Tris HCl com EDTA + mitocndrios +

rotenona + (Na)3PO4 + malato de potssio
78
3. Resultados
Ensaio 1
NH Cl
4
Ensaio de declive
menor ausncia de
swelling
Resultado previsto: membrana impermevel a ies
Ensaio 2
Declive > declive controlo Swelling
Resultado previsto: Mitocndrios incham
HO
2
Ensaio 3
Resultado incorrecto: membrana impermevel a ies
79
KCl
Ensaio 4
Resultado previsto: ies atravessam a membrana na forma neutra.
+
A membrana impermevel aos ies NH
Formam-se molculas neutras que atravessam a membrana
No interior da membrana regressam forma inica
Ocorre desequilbrio osmtico e inchamento massivo
e CH COO
3
NH CH COO
4
Ensaio 5
Resultado previsto: ies atravessam a membrana na forma neutra e o PO43-p passa atravs do
transportador de H2PO4- por antiporte com OH- ou simporte com H+.
80
No interior da membrana as espcies regressam forma inica
Ocorre desequilbrio osmtico e inchamento mitocondrial
(NH4)3PO4
Ensaio 6
1. Declive > declive controlo Swelling
2. Declives semelhantes Ausncia de swelling
Resultado incorrecto: Os ies do malato de amnio s atravessam a membrana depois da
adio de (Na)3PO4, devido ao transportador por antiporte malato/ HPO42Inicialmente o NH4+ e malato2- no atravessam a membrana, porque so ies e o NH4+ apesar
de pode ser convertido forma neutra no atravessa a membrana por inexistncia de
equilbrio de cargas atravs da mesma.
Ao adicionar-se rotenona impede-se o gasto do malato pelo complexo I, visto que a rotenona
um inibidor do complexo I.
Ao ser adicionado (Na)3PO4 o fosfato pode entrar pelo transportador de fosfato, o que leva q
entrada do malato por simporte. Com isto j ocorre um equilbrio de cargas na membrana,
pelo que o NH4+ j pode entrar na forma neutra, gerando-se assim swelling.
(Na)3PO4
Malato de
Amnio
+ Rotenona
81
Ensaio 7
1. Declive > declive controlo Swelling
Resultado incorrecto: os ies de citrato de amnio s atravessam a membrana depois da
adio de (Na)3PO4 e malato, devido aos transportadores antiporte malato/HPO42- e simporte
malato/citrato.
+
3-
NH e citrato no atravessam a membrana
Prev-se inexistncia de swelling
(Na)3PO4 no leva a swelling at o malato estar presente
Adio do malato em presena de (Na) PO em quantidades catalticas
turnover
rpido do transportador e entrada de malato
O transportador citrato permite a sua entrada por troca com o malato
O NH4 entrou como molcula neutra prev-se inchamento mitocondrial
Citrato de Amnio
+ Rotenona
(Na)3PO4
Malato de potssio
Possveis erros experimentais:
Preparao incorrecta das solues de KCl, rotenona, malato de amnio e citrato de

amnio;
pH das solues no coincidente com o do protocolo.
82
4. Concluso
Apesar de a membrana ser impermevel a pequenos ies, ocorre inchamento com
acetato de amnio porque o NH4+ atravessa a membrana como NH3 neutro e o Ac- como cido
actico, ambos atravs de difuso simples. Isso leva a que as concentraes de NH4+ e de
CH3COO- na matriz sejam iguais s do meio de suspenso. Assim no existe desequilbrio de
carga ou de pH durante o transporte e ocorre inchamento, uma vez que a matriz se expande
para atingir equilbrio osmtico com o meio de suspenso.
Quando os mitocndrios so colocados em solues de fosfato de amnio incham
rapidamente mas no noutros sais de NH4. Ao se adicionarem quantidades catalticas de
fosfato de potssio ao meio contendo malato ou citrato, observa-se um inchamento rpido
dos mitocndrios.
A presena de um transportador de fosfato permitiu ao H2PO4- fazer um antiporte com
o OH ou simporte com o H+, o que fez com que o fosfato passe a membrana como se fosse
uma espcie neutra. O transportador malato2--HPO42- permite ao malato entrar, mas apenas
quando uma quantidade cataltica de fosfato externo estava presente para permitir um
turnover rpido do transportador de fosfato. O transportador de citrato permitiu ao H-citrato2entrar por troca com o malato2-, mas este processo s ocorre rapidamente se houver malato e
fosfato externo suficientes para permitir um turnover dos seus transportadores.
-
Observando a estequiometria possvel concluir que a acumulao de H2PO4-

acompanhada pela entrada de um proto; a do malato pela entrada de dois protes e a do
citrato pela entrada de trs protes.
Solues com KCl e NH4Cl no causam swelling. Na presena de ionforos especficos
seria possvel a entrada de K+ na matriz mitocondrial, mas apenas na ausncia de Cl-.
83
Ocorrncia de swelling
Ausncia de swelling
gua
Acetato de amnio (NH4CH3COO)
Fosfato de amnio ((NH4)3PO4 )
Malato de amnio
Citrato de amnio
Cloreto de potssio (KCl)

Cloreto de amnio (NH4Cl)
84
FOTOSSNTESE
1. Introduo
A fotossntese um processo fsico-qumico pelo qual as plantas, algas e bactrias
fotossintticas usam a energia luminosa para sintetizar compostos orgnicos.
Durante o processo fixam CO2 e usam gua para formar compostos orgnicos e
produzir energia (ATP), ocorrendo em simultneo a libertao de O2.
Organizao intracelular de sistemas fotossintticos algas e plantas superiores

Ambas as reaces fotossintticas (dependentes e independentes) da luz ocorrem nos
cloroplastos, no caso de algas e plantas superiores.
Estes contm no seu interior vesculas, os tilacides, que possuem nas suas
membranas pigmentos fotossintticos, que por sua vez absorvem radiao visvel a
comprimentos de onda caractersticos.
O pigmento mais importante a clorofila. Esta associa-se a protenas de ligao
especficas formando light harvesting complexes LHC, complexos antena ou de colheita de
luz.
Fotossistemas
Os pigmentos fotossintticos organizam-se em fotossistemas, existindo os
fotossistemas I e II, PSI e PSII. Estes possuem: complexos antena ou de colheita de luz LHC- e
o centro reaccional fotossinttico.
Todas as molculas podem absorver fotes, mas apenas um conjunto de molculas de
clorofila associadas ao centro da reaco qumica transformam a energia da luz em energia
qumica centro reaccional. Os outros pigmentos do fotossistema chamam-se complexos de
colheita de luz e absorvem energia a partir da luz transmitindo-a eficientemente para o centro
da reaco, por transferncia de excitao.
A clorofila do centro reaccional fica com um electro a menos, que substitudo por
outro electro (de menor energia) dado por uma molcula dadora de electres (a H2O) ficando
esta positivamente carregada. O processo causa assim uma separao de cargas e inicia-se a
cadeia de oxidao reduo.
Reaces nos fotossistemas

O Fotossistema II um sistema do tipo feofitina-quinona. A excitao do centro de
reaco P680 leva transferncia de um electro para a feofitina (clorofila sem o io central
Mg2+), que por sua vez o doa quinona a, quinona b (que se difunde) e por fim ao complexo
citocromo b6f. Simultaneamente ocorre o movimento de protes atravs da membrana dos
tilacides.
85
A protena solvel que transporta os electres entre um sistema e o outro a

plastocianina (semelhante ao cyt c do mitocndrio).
O fotossistema I tem um centro reaccional designado por P700 que passa electres
para a ferredoxina (protena Fe-S) e consequentemente para o NADP+, produzindo assim
NADPH.
Para substituir o electro que se movimentou do PSII para o PSI estes seres oxidam
gua a O2 fotossntese oxignea.
Este conjunto reaccional designa-se esquema em Z, devido sua forma geral.
O elo de ligao entre os dois fotossistemas o complexo citocromo b6f e a protena
solvel plastocianina; o fluxo de electres atravs do complexo leva passagem de protes do
estroma para o lmen dos tilacides, gerando um gradiente protnico que uma fora
poderosa para a sntese de ATP pelo ATP sintase. o processo designado por fotofosforilao.
Reaces s escuras ciclo de Calvin

Nesta fase, o ATP e o NADPH resultantes das reaces luminosas so utilizados para
fixar o CO2.
O processo de fixao do CO2 e converso a glcidos ocorre no ciclo de Calvin
(elucidado por Melvin Calvin em 1950) em trs passos fundamentais. O primeiro a
condensao do CO2 com o aceitador de 5 carbonos Ribulose 1,5-bifosfato, formando duas
molculas de 3 fosfoglicerato (catalisado pelo enzima rubisco).
No segundo passo do ciclo O ATP e o NADPH resultantes das reaces luminosas do
entrada no ciclo neste passo reduzindo o 3-P glicerato a 3-P gliceraldedo com libertao de
um Pi.
Por fim, no terceiro passo, 5 molculas de 3-P gliceraldedo e uma de ATP regeneram
1,5 bifosfato de Ribulose e a outra molcula de 3-P gliceraldedo formada usa-se para formar
hexoses, como a glucose e a sacarose que podem ser usadas como energia pelo organismo
fotossinttico.
Devido ao gasto de molculas de ATP estas tm de ser regeneradas, o que sucede pelo
transporte do fosfato de dihidroxiacetona gerado no estroma para o citosol e o transporte
simultneo de Pi do citosol para o estroma (antiporte). O Pi que regressa ao estroma assim
usado na fotofosforilao.
Nesta actividade experimental pretendia-se, a partir do isolamento de cloroplastos de

espinafres:
Medir a actividade fotoqumica dos PSI e PSII atravs da reaco de Hill;
Medir o transporte electrnico fotossinttico usando o violognio de metilo como

aceitador terminal de electres;
Realizar o ensaio espectrofotomtrico da reaco de Hill:

Determinar o contedo de clorofila dos cloroplastos.
86
2. Procedimento
1. Isolamento dos cloroplastos das folhas de espinafres
Remover as nervuras de
100 g de folhas de
espinafres e cort-las em
pequenos pedaos (aprox.
5 cm).
Colocar os pedaos das folhas

em gua gelada sob forte
iluminao cerca de 30min e
ento homogenizar com 100 mL
de meio de isolamento num
misturador "waring blender".
Filtrar a suspenso atravs de

vrias camadas de gaze e
centrifugar o filtrado a 2000 g
no frio durante 30 s.
Ressuspender o sedimento em
2,5 mL de meio de ensaio e
guarde em gelo.
Desprezar o sobrenadante e
lavar o sedimento
cuidadosamente com meio de
isolamento e centrifugar a 2000
g durante 1 min.
Apesar de ser o NADP o aceitador final de electres, no o vamos usar porque a

ferredoxina, que o aceitador anterior, se perde no isolamento dos cloroplastos.
2. Libertao de dioxignio pelos cloroplastos isolados usando oxidantes de Hill

Acertar o zero do elctrodo
de oxignio com ditionito de
sdio e acertar o 100% de
oxignio (com 1 mL de meio
de reaco e 1 mL de gua) a
70% do papel de registo com
o boto de ajuste fino do
output, pois vai-se medir a
libertao de oxignio.
Registar a velocidade e
a quantidade de total
de O2 libertado.
Repetir todo o
processo com
quantidades crescentes
de DCPIP.
Antes de efectuar as
adies ao elctrodo,
envolv-lo com folha
de alumnio para que
estas se efectuem no
escuro.
Fazer incidir uma

lmpada de 100 watt
sobre a cmara de
reaco do elctrodo
interpondo um frasco
com gua.
Proceder do mesmo
modo com o
ferricianeto.
Iniciar cada experincia

adicionando 1 mL de meio
de ensaio ao elctrodo, e
cloroplastos de modo a
obter uma suspenso com
uma cor verde ma, (cerca
de 100 L).
Adicionar 50 L de
DCPIP e gua destilada
at perfazer um
volume final de 2 mL.
Finalmente adicionar uma

quantidade suficiente de
DCPIP (80 l) para
assegurar a libertao de
O2 durante um certo
tempo e verificar o efeito
da adio de 50 L 87
de
DCMU.
Reagentes de Hill: DCPIP e ferricianeto (FeCN).

DCMU
Bloqueia a plastoquinona impedindo o fluxo de electres para o PS I; PS II

inibido;
Diminui o rendimento energtico do processo.
Dador (e aceitador) artificial de electres (azul quando oxidado/ incolor quando

reduzido);
Pode substituir o NADP+.
DCPIP
3. Violognio de Metilo como aceitador terminal de electres
Consumo de dioxignio com violognio de metilo como aceitador de electres
Adicionar na cmara do
elctrodo 1 mL de meio de
reaco, 100 L de
cloroplastos, 100 L de
violognio de metilo e 0,8
mL de gua destilada
(volume final 2 mL).
Medir a velocidade de consumo

de oxignio.
Repetir o ensaio adicionando

tambm 50 L de azeto de
sdio para inibir o catalase.
Observar o efeito da adio de

quantidades variveis (25, 50 e
100 L) de violognio de metilo
e comentar os resultados.
Caso a preparao esteja

contaminada com catalase fazer
os ensaios seguintes na
presena de azeto de sdio.
Violognio de metilo No necessita da ferredoxina.
Aceitador final de electres Consome dioxignio;

Permite o seguimento do transporte electrnico no processo da fotossntese.
Inibidor do catalase.
NaN3
88
Observa-se o consumo de dioxignio. Se a soluo estiver contaminada com

peroxissomas, o catalase est presente, havendo uma diferena no consumo de dioxignio.
Assim tem de se adicionar um inibidor do catalase (NaN3).
Actividade do PS I medida com violognio de metilo
Adicionar cmara do
elctrodo 1 mL de meio de
reaco, 50 L de
cloroplastos, 50 L de MV
e 900 L de H2O e medir a
velocidade de consumo do
dioxignio.
Adicionar 50Lde DCMU para

bloquear a actividade do PS II e
notar o que acontece.
Adicionar 25 L de ascorbato e
80 L de DCPIP de modo a que
a cor azul desaparea.
Comentar os resultados e
discutir o que acontece em
cada fase da experincia.
Medir a velocidade de consumo

do dioxignio e comparar as
duas velocidades de consumo
de dioxignio.
Ascorbato
Dador de electres (aco conjunta com o DCPIP);

Antioxidante (dador de electres para O2-).
4. Ensaio espectrofotomtrico da reaco de Hill
Adicionar a uma cuvette de

espectrofotmetro, 1,5 mL de meio de
reaco, 20 L de suspenso de
cloroplastos, 1,4 mL de gua destilada
e 50 L de DCPIP. NOTA: envolver
previamente a cuvette com papel de
alumnio.
Medir espectrofotometricamente a
600 nm a velocidade de reduo do
DCPIP expondo a cuvette a periodos
sucessivos de 5 s ou 10 s de
iluminao.
Pode ser usada para medir a actividade fotoqumica, quer do PS I e PS II actuando em

srie, quer s do PS I. A actividade fotoqumica do PS I pode ser medida se a actividade do PS II
89
for bloqueada pelo DCMU e se o fluxo de electres for fornecido por um dador electrnico
artificial.
Enquanto no elctrodo de oxignio, 1 molcula de O2 libertada leva reduo de 2
molculas de reagente de Hill, no caso do espectrofotmetro, 1 molcula de DCPIP reduzida
leva a meia molcula de O2 libertada.
5. Determinao do contedo de clorofila dos cloroplastos
Adicionar 0,2 mL da
suspenso de cloroplastos
a 10 mL da soluo de
acetona contida num tubo
de ensaio.
Agitar vigorosamente e filtrar

atravs de papel de filtro
Whatman n1 para um balo
volumtrico de 25 mL.
Lavar o tubo com mais 5 mL de

acetona aquosa e use os
mesmos 5 mL para lavar o papel
de filtro.
Ler a absorvncia a 652 nm

usando como branco a soluo
de acetona ( = 34,5 mg-1
mL.cm-1).
Repetir a lavagem e perfazer os

25 mL com o solvente.
3. Resultados
Reaco de Hill
Hill fez a descoberta da existncia das duas fases da fotossntese. Iluminando extractos
de cloroplastos na presena de aceitadores artificiais de electres como o ferricianeto ou o
corante reduzvel 2,6- diclorofenolindofenol (DCPIP), verificou que os cloroplastos libertavam
oxignio e reduziam o receptor de electres, o que se traduz nesta reco designada reaco
de Hill:
, sendo A o receptor de electres e a
H2O o dador de electres.
Verifica-se assim que o CO2 no necessrio reaco. Nos sistemas biolgicos o
aceitador de electres o NADP.
90
O processo descrito permite assim medir a actividade fotoqumica de ambos os

fotossistemas ou s do PSI. No caso de ambos os sistemas, os electres ao flurem do PS II para
o PS I ou da ferredoxina para o NADP+, podem ser interceptados por aceitadores electrnicos
artificiais. Para se seguir o fluxo de electres apenas do PSI bloqueia-se a actividade do PSII
(pelo herbicida 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilureia ou DCMU) e o fluxo de electres
fornecido por um dador electrnico artificial, sendo que o DCMU compete com a
plastoquinona pelo local onde esta se liga no PSII.
Libertao de dioxignio pelos cloroplastos isolados usando oxidantes de Hill
Calibrao do elctrodo de O2
[O2] = 51 quadriculas
[O2]soluo saturada = 0,253 mol/mL (a 25C)
Vtotal = 2mL
n (O2) = 0,506 mol
1 quadrcula
0,00992 mol de O2
Ensaios
91
Ensaio 1 (DCPIP)
Ensaio 2 (ferricianato de potssio)
Estes so os nossos resultados. O sistema de eixos funciona para localizar no espao os

nossos resultados, obtendo assim uma espcie de grfico. Aps cada adio o aumento da [O 2]
92
foi quantificado. Os tringulos azuis ajudam a fazer uma estimativa do declive enquanto que
dentro das linhas verdes se encontra a zona de linearidade (zona de interesse).
Velocidade de libertao do dioxignio
1 quadrcula
0,00992 mol de O2
velocidade papel
1 cm/min
Assim, para o ensaio 1-A temos que 8 quadrculas e 0,4 cm.
Ou seja, a velocidade de libertao de O2 aquando da adio de 20L de DCPIP

0,19825 mol/min.
Para os restantes ensaios o raciocnio anlogo, sendo que os valores registados e
calculados se encontram numa tabela apresentada mais frente.
Na ltima coluna, velocidade por mg de clorofila equivale medio do nmero de
moles de O2 por tempo por quantidade de clorofila. A quantidade de clorofila pode ser medida
atravs de um ensaio espectrofotomtrico da seguinte forma.
Determinao do contedo de clorofila dos cloroplastos
Usamos 0,2 mL de extracto com cloroplastos para um volume de 25 mL de

acetona. Assim
93
Esta massa equivale a um extracto com cloroplastos de 0,2 mL. Assim a nossa
concentrao de clorofila ser
Para estes ensaios utilizamos um volume de cloroplastos de 100 L o que

equivale a uma massa de clorofila de 0,16875 mg.
Assim para o ensaio 1-A temos por exemplo
Ensaio
Reagente
de Hill
1C
1A
1B
2A
2C
2B
DCPIP
DCPIP
DCPIP
FeCN
FeCN
FeCN
Volume
(L)
(quadriculas)
(mol)
(cm/min)
Velocidade
(mol/min)
10
20
40
20
30
40
2
7
8
4,5
9,5
21
0,0198
0,0694
0,0794
0,0446
0,0942
0,208
0,43
0,41
0,5
0,8
3,925
4,6
0,046
0,17
0,159
0,056
0,024
0,045
Velocidade por
mg de clorofila
(mol/min.mg)
0,273
1
0,94
0,33
0,14
0,26
Pela anlise do quadro resumo, verifica-se que quanto maior a quantidade de reagente
de Hill adicionada, maior a quantidade de O2 libertado. No entanto verifica-se que tanto o
DCPIP como o ferricianeto de potssio funcionam como aceitadores de electres artificiais.
Verificmos ainda que o ferricianeto de potssio no funciona no escuro, porque um
aceitador final de electres na fase luminosa da fotossntese; deste modo, sem iluminao no
ocorre excitao da clorofila nem fluxo de electres gerado a partir da, pelo que no existem
electres que o ferricianeto de potssio possa aceitar.
As nossas velocidades no fazem sentido pois no apresentam nenhuma relao
aparente com o volume. Comparativamente a outros grupos com o mesmo elctrodo e
melhores resultados verificamos que as zonas de lineariedade foram diferentes, podendo advir
dai os nossos erros.
94
Efeito da adio de um inibidor do PSII (DCMU)

Reagente
Volume
de Hill
(L)
(quadriculas)
1C
DCPIP
10
1A
DCPIP
20
1B
DCPIP
Ensaio
DCMU +
1D
DCPIP
Velocidade por
Velocidade
(cm/min)
(mol/min)
0,0198
0,43
0,046
0,273
0,0694
0,41
0,17
40
0,0794
0,5
0,159
0,94
50 + 40
3,5
0,0496
0,18
0,248
1,47
(mol)
mg de clorofila
(mol/min.mg)
De novo, os nossos resultados no fazem sentido, tendo-se registado para outros grupos uma
inibio por parte do DCMU, embora apenas parcial pois continuou a existir livertao de O2.
No nosso caso a velocidade de libertao de oxignio aumentou em vez de diminuir, o que nos
leva de novo a concluir que os nossos resultados esto errados.
Quanto ao seguimento desta reaco espectrofotometricamente, usa-se o aceitador

DCPIP visto que um composto corado. medida que vai sendo reduzido, isto , quando os
electres esto a fluir entre fotossistemas ou apenas no PSI, torna-se um composto incolor,
absorvendo menos.
No caso do elctrodo de oxignio, por cada molcula de O2 libertada, 2 molculas do
reagente de Hill so reduzidas. Portanto, no espectrofotmetro, uma molcula de DCPIP
reduzida significa que metade de uma molcula de O2 foi libertada.
Libertao de dioxignio pelos cloroplastos isolados atravs de ensaios

espectrofotomtricos
Ensaio espectrofotomtrico da reaco de Hill
Foram feitas medies espectrofotomtricas da reduo do DCPIP a 600 nm.
Tempo (s)
Abs ensaio 1
Abs ensaio 2
Abs ensaio 3
Mdia Abs
1.92
1.84
1.895
1.885
1.69
1.69
1.738
1.706
10
1.495
1.495
1.53
1.506667
15
1.327
1.345
1.36
1.344
95
20
1.17
1.2
1.208
1.192667
25
1.04
1.078
1.046
1.054667
30
0.95
0.975
0.938
0.954333
35
0.845
0.88
0.838
0.854333
40
0.85
0.814
0.807
0.823667
45
0.79
0.79
Dos trs ensaios representados graficamente em baixo calculmos uma mdia dos
declives, que ser a nossa variao de absorvncia por segundo. Numa aplicao directa da lei
de Lambert-Beer, uma diviso deste valor pelo dar-nos- a concentrao de DCPIP em funo
do tempo, a partir da qual podemos calcular a quantidade de DCPIP em funo do tempo.
Aps este passo queremos transformar esta quantidade na de O2 libertado, para comparar
Ensaio 1
2.5
Absorvncia
y = -0.035x + 1.878
R = 0.9905
1.5
1
0.5
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (s)
posteriormente com os resultados obtidos atravs do elctrodo de oxignio.
96
Ensaio 2
2
y = -0.031x + 1.8292
R = 0.9953
Absorvncia
1.5
0.5
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tempo (s)
Ensaio 3
2
y = -0.0343x + 1.8918
R = 0.9978
Absorvncia
1.5
1
0.5
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (s)
97
Variao de absorvncia em funo do tempo (mdia dos declives) = 0,03343

DCPIP=16000 M-1 cm-1.
[DCPIP]/s =
Vcuvette = 3 mL
H2O + DCPIP DCPIPreduzido + O2

1 mol DCPIP - O2
mol x
mol
x = 3,15
mol/s
velocidade de formao de O2 3,15
Comparao da velocidade de formao de O2

Para efectuarmos esta comparao, os resultados obtidos em ambos os mtodos vo
ser convertidos em mol/min.mg, e o volume de DCPIP ser 50 L.
Elctrodo de oxignio
Como no foi efectuada nenhuma medio com 50 L de DCPIP foi necessrio criar
uma recta com a velocidade de formao do O2 em funo do volume de DCPIP e extrapolar
este valor. Assim, de acordo com a nossa equao da recta a velocidade em mol/min.mg de
formao de O2 0,2115. No entanto temos de ter em conta que esta recta no possui muita
significncia estatstica pelo que este resultado algo duvidoso.
0.2
velocidade de formao de O2
0.18
0.16
0.14
y = 0.0032x + 0.0515
R = 0.4915
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
10
15
20
25
30
35
40
volume (L)
98
45
v = 0,2215 mol/min
A quantidade de cloroplastos adicionados foi 20 L e a concentrao de clorofila (j
determinada)
. Assim a quantidade de clorofila ter sido 0,03375
mg.
Assim a velocidade de formao de O2 por mg de clorofila ser 6,56
mol/min.mg
Espectrofotometria
velocidade de formao de O2 = 3,15
mol/s = 0,189 mol/min
Aplicando a quantidade de clorofila calculada acima, a velocidade de formao de O2

por mg de clorofila ser 5,6 mol/min.mg.
Elctrodo de oxignio 6,56 mol min-1 mg-1

Ensaio espectrofotomtrico 5,6 mol min-1 mg-1
Embora o elctrodo de oxignio seja um mtodo mais sensvel e preciso que o
espectrofotmetro os valores obtidos pelos dois mtodos no registam uma grande diferena.
A pequena diferena pode ainda assim dever-se nossa extrapolao da recta (como j
referimos a nossa recta no era muito fivel) ou a erros experimentais.
Reaces com o violognio de metilo

Um dos mtodos de medir o transporte electrnico fotossinttico utiliza a autoxidao
de um aceitador terminal de electres, o violognio de metilo. Este aceita electres do PS I
ficando reduzido, formando-se O2 com a estequiometria normal da reaco de Hill (O2/2e-=.
)
No entanto, o O2 consumido simultaneamente com duas vezes esta estequiometria
atravs da combinao da reaco de autoxidao do violognio de metilo, com a dismutao
do radical superxido, pelo que a equao geral conta com a soma das trs equaes:
Transporte electrnico
Autoxidao do VM2+
Dismutao do radical superxido

99
, sendo conhecida por reaco de Mehler, com a

estequiometria de consumo de O2 de (O2/2e- = ).
Assim, 0,5 mol de O2 so consumidas por par de electres transferidos, sendo que
esta estequiometria pode ser alterada por:
- Presena de agentes redutores como o ascorbato e os ies Mn2+, que iro interferir
com a dismutao do radical superxido
- Adio do enzima superxido dismutase.
- Actividade endgena de catlase presente na preparao de cloroplastos; para evitar
isto pode inibir-se a catalase usando azeto de sdio para impedir a libertao de O2 a partir do
H2O2 atravs da reaco:
2 H2O2 H2O + O2
Para medir apenas o PS I necessrio medir o consumo de O2 ou a reduo do
aceitador terminal, uma vez que no ocorre libertao de O2 e necessrio adicionar um
dador artificial de electres em vez de se usar gua. Deve-se tambm eliminar qualquer
actividade do PS II, para no afectar os resultados.
Assim, um meio de ensaio simples para o transporte electrnico atravs do PS I
contm violognio de metilo, azeto de sdio, DCMU para inibir o PS II e DCPIP e ascorbato
como par dador de electres. Um bloqueamento do PS II ir dar uma menor velocidade inicial
de consumo de O2 (PS I + PS II), mas no de consumo de O2 devida apenas ao PS I.
Violognio de Metilo como aceitador terminal de electres

Consumo de dioxignio com violognio de metilo como aceitador de electres
Ensaio 1
100
Ensaio 2
101
Ensaio 3
102
O raciocnio seguido para esta parte do trabalho foi o mesmo da anterior, exceptuando
que em vez da velocidade de libertao do O2 calculamos a velocidade de consumo.
Relembrar que
1 quadrcula
0,00992 mol de O2
velocidade papel
1 cm/min
Assim na tabela seguinte encontram-se resumidos os nossos resultados.
Ensaio
Reagentes
Volume
VM (L)
1A
2A
VM
VM
100
50
(quadriculas)
17
17
(mol)
(cm/min)
Velocidade
(mol/min)
0,169
0,169
1,37
1,36
0,123
0,124
Velocidade por
mg de clorofila
(mol/min.mg)
0,729
0,735
103
3A
1B
2B
3B
VM
VM + NaN3
VM + NaN3
VM + NaN3
25
100 + 50
50 + 50
25 + 50
14
18
23
4
0,139
0,179
0,228
0,04
4,29
3,04
2,6
4,09
0,0324
0,059
0,088
0,01
0,192
0,35
0,52
0,059
Note-se que o volume de cloroplastos aplicado nestes ensaios foi 100 L pelo que a
quantidade de clorofila ser a mesma que j foi calculada anteriormente para os ensaios do
elctrodo de oxignio com os oxidantes de Hill 0,16875 mg.
Teoricamente com o aumento do volume de VM2+ sem NaN3, deve diminuir a
velocidade de consumo de O2, j que existe uma maior formao deste. Com a adio de NaN3
e com o aumento de volume de VM2+ normal que aumente o consumo j que existe cada vez
mais VM2+ que origina o radical superxido atravs da autoxidao deste.
Os nossos resultados nada permitem concluir, pois no existe um padro de

aumento ou diminuio da velocidade de consumo de O2 ou do nmero de moles
consumidos relativamente ao volume adicionado.
Actividades do PSI medida com violognio de metilo
104
Ensaio
Reagentes
C
D
VM
DCMU
Ascorbato +
DCPIP
Volume
VM (L)
(quadriculas)
(mol)
(cm/min)
Velocidade
(mol/min)
50
50
25 + 80
23
12
0,23
0,12
1,1
2,75
0,21
0,044
14
0,14
0,82
0,17
Velocidade por
mg de clorofila
(mol/min.mg)
1,24
0,261
1
Teoricamente devia verificar-se neste ltimo ensaio algo deste gnero
Teoricamente devia verificar-se neste ltimo ensaio algo deste gnero. No

entanto tal como se pode verificar o DCMU funcionou como inibidor parcial do PSII,
na medida que deveria ter travado o transporte electrnico e apenas diminuiu a
velocidade de consumo de O2. Sabemos isto porque continuou a existir consumo de
oxignio mesmo aps a adio deste reagente, embora a velocidade tenha diminudo
acentuadamente.
A inibio do PS II pela aco do DCMU deve dar uma maior velocidade de
consumo de oxignio devida apenas aco do PS I sobre este, j que uma vez que a
cadeia respiratria comea a meio o nmero de reaces e o tempo despendido nas
mesmas menor, sendo assim a velocidade maior. Na primeira fase da experincia (PS I
+ PS II) o consumo de O2 deveria revelar uma velocidade muito menor. o ascorbato
funciona com dador de electres para o prprio DCPIP, e este que actua no PSI,
105
repondo o fluxo electrnico. No entanto como j referimos o nosso DCMU no inibiu

completamente o PSII, pelo que nunca se verificou a actuao isolada do PSI. Assim
isto justifica que a descida acentuada que seria significante do PSI isolado no seja
assim tao acentuada de modo a que a taxa de consumo no seja maior do que a
correspondente ao violognio de metilo em comparao.
106
PCR
1. Procedimento
1. Extraco do DNA a partir de carne de vaca
[O DNA total (genmico e mitocondrial) vai ser extrado de carne segundo uma variante
dos protocolos de Sambrook et al. (1989).]
Pulverizar, reduzindo em
p 500mg de carne
bovina picada num
almofariz com azoto
lquido (juntar mais
azoto se precisar).
Extrair mais uma vez

com clorofrmio
(adicionando o mesmo
volume tirado no passo
7, isso : <10ml).
Misturar, agitar,
centrifugar e tirar a fase
aquosa como nos pontos
6 e 7.
Dissolver o DNA em 500

l de TE (10 mM Tris-HCl,
(pH 7.4), 0.1 mM EDTA) e
transferir para um tubo
Eppendorf de 1,5ml
para utilizao como
molde nas reaes de
PCR.
Transferir para um tubo

plstico Falcon de
50ml.
Tirar quase toda a fase

aquosa (de cima) para um
novo tubo (<10ml), deixando
intacta a interface entre as
fases, desprezar a fase
orgnica.
Hidrolisar o RNA presente

em soluo soluo
juntando 100 ug/ml de
Ribonuclease A (= +/- 1 mg
num volume final de 10 ml:
ver concentrao do stock!).
Tirar o etanol todo sem

tocar no pellet e deixar
secar o pellet de DNA ao
ar durante 5 minutos.
Adicionar 20 vol
(aproximadamente 10 ml)
tampo de extraco (100
mM Tris-HCl pH 9.0, 100
mM NaCl, 5 mM EDTA e 1%
SDS) ao p dos 500 mg de
carne de vaca, para extrair
uma de DNA/RNA .
Misturar bem e deixar

incubar durante 30 min
temperatura ambiente.
Agitar bem, e centrifugar

para separar as fases
(1600 rpm, 10 min).
Separar os cidos
nuclecos da mistura
anterior, atravs da
adio de igual volume
(~10ml) da mistura
fnol/clorofrmio/alcool
-isoamil (25:24:1).
Incubar durante 30min1h a 37C.
Desta mistura extrair-se

o DNA uma vez com
volume igual (<10ml) de
fnol/clorofrmio/alcool
-isoamil (25:24:1) e uma
vez com volume igual de
clorofrmio (<10ml),
segundo a sequncia
anterior pontos 5 a 9.
Remover todo o
isopropanol e lavar o
pellet de DNA com 5 ml
etanol (70%), seguido por
centrifugao (1600 rpm,
10 min).
O DNA precipitado da
soluo final com um
volume igual de
isopropanol (<10ml)
seguido por
centrifugao (1600 rpm,
10 min).
2. Quantificao e determinao do grau de pureza do DNA extrado
107
Ligar o espectrofotmetro
cerca de 15 minutos antes de
iniciar as leituras e regular
para comprimento de onda
de 260nm.
Fazer as diluio de 1:250,

1:500 e 1:1000 do DNA
obtido aps extrao num
mililitro de H2O usando
eppendorfs de 1,5 ml.
Tenham ateno em agitar
bem as diluies de forma a
haver uma boa
homogeneizao do DNA em
soluo.
Fazer o zero de absorvncia

com 1ml de gua(a mesma
que foi usada para
ressuspender o DNA usado a
cuvette de quartzo.
Repetir as leituras a 280nm e

325nm.
Fazer a leitura de absorvncia

a 260nm.
Utilizar a mesma cuvette para

fazer a medio das duas
diluies da amostra de DNA
feitas no ponto 1.
Registar todos os valores.

Calcular a concentrao da
soluo de DNA obtido aps a
extrao, calcular a quantidade
total de DNA extrado e
tambm o seu grau de pureza.
Aps os clculos, faa uma

soluo com a
concentrao 100pg/ l do
DNA extrado num volume
final de 50 l em H2O.
Nota: Tenham muito cuidado com a manipulao das cuvetes pois so muito caras e
partem-se facilmente. Devem limpar bem as superfcies da cuvete por onde o feixe de luz
passa com papel higinico para evitar erros de leitura devido a dedadas ou outras impurezas
na superfcie da cuvete.
3. Amplificao de fragmentos de DNA por PCR
108
Num microtubo de 1,5 ml

em gelo, preparar a
seguinte mistura de
reaco
de PCR (1).
Adiciona 1 l dos DNAs aos

tubos A e B, deixando o tubo C
sem DNA (controlo de
amplificao negativo, neste
tubo em vez do DNA ser
adicionado 1 l H2O).
Misturar pipetando vrias

vezes com a micropipeta
suavemente. Deixar os
tubos em gelo.
Adaptar as quantidades para o

nmero de reaces a executar,
fazendo um master mix para n
reaces (n =3 nmero de amostras
de DNA (2) mais um tubo de controlo
negativo) para cada par de primers.
Um excesso de 10% pode ser
adicionado para precaver erros de
pipetagem.
Divide para cada tubo 24

l das respectivas master
mix.
Ligar o aparelho de PCR,

programar com o
programa de PCR abaixo
indicado (3) e iniciar o
programa de
amplificao.
Preparar as duas master

mixes em tubos separados.
Homogenizar as solues das
master mixes com a
micropipeta, pipetando vrias
vezes suavemente.
Preparar e marcar 3 tubos

de 200 l por reaco de
PCR no total so 6 tubos e
p-los em gelo. (2)
Transferir os microtubos preparados

com a mistura de PCR e DNA do gelo
para o bloco de aquecimento do
aparelho somente quando a
temperatura desde atingir os 94C.
Fechar a tampa e ajust-la para
contactar com a tampa dos
microtubos.
Depois da reaco PCR,

analisar os produto de PCR
atravs de electroforese em
gel de agarose 1,5%.
(1)
Componente Quantidade / 1 reaco
Tampo de PCR (c/ Mg2+) 10x --------------- 2,5l
dNTP Mix 100 (25mM cada dNTP)---------- 0,1l
109
Primer Foward 10M -------------------------- 0,5l

Primer Reverse 10M ------------------------- 0,5l
Taq DNA Polymerase Promega (5U/l)- --- 0,1 l
gua ultra-pura--------------------------------- 20,3l
Total (por reaco)------------------------------ 24 l
(2) A marcao deve ser feita da seguinte forma: V (para o PCR com os primers especficos
do DNA de vaca) seguido do numero do grupo e depois trao e A para o tubo de PCR
que leva o DNA do tubo A, B para o tubo de PCR que leva o DNA do Tubo B e C para
tubo de PCR que leva H2O. (Ento na tampa do primeiro tubo do grupo 1 estar V1-A;
o segundo tubo ter V1-B, e o terceiro V1-C, para o PCR com primers da batata ser
B1-A; B1-B e B1-C.
(3)
Programa de PCR:
1x: 94C - 5min
35x: (94C 30 seg; 55C 30seg; 72C 2min)
1x: 72C 5min
4. Electroforese em gel de agarose
110
Selar ambas as
extremidades do
suporte de preparao
do gel de agarose com
fita adesiva.Colocar o
suporte do gel dentro
da hotte e inserir o
pente na posio
conveniente para
definir os poos no gel.
Colocar o suporte com o

gel na tina de
electroforese, de modo a
que os poos estejam do
lado do elctrodo
negativo (ctodo), e
adicionar tampo TBE 1X
at cobrir o gel. Verificar
que todos os poos esto
preenchidos com tampo.
Para cada amostra,

misturar num
microtubo: (1).
Aplicar o contedo
total de cada tubo de
reaco para um poo
do gel, usando a
respectiva ponta. (2)
Examinar o gel com

iluminao ultravioleta
(UV) e registar o padro
de bandas em
fotografia.
Preparar uma soluo

de 100 ml agarose com
concentrao final de
1,5% (p/v) em tampo
TBE num frasco
erlenmeyer de 250 ml.
Quando o gel se tiver

polimerisado (~30 min),
retirar o pente com cuidado
para no danificar os poos
e retirar a fita adesiva de
ambas as extremidades.
Colocar a tampa da
tina. Verificar que os
poos com o DNA
esto do lado do polo
negativo (ctodo,
elctrodo de cor preta)
pois a migrao ser no
sentido do polo
positivo (nodo,
elctrodo de cor
vermelha).
Cuidadosamente para
no partir, e usando
luvas, retirar o gel com
o respectivo suporte da
cmara de
electroforese.
Dissolver a agarose em
forno micro-ondas ou em
banho de gua a ferver
com agitao frequente
(para que no haja
formao de agregados)
at dissoluo completa
da agarose.
Deixar arrefecer para

uma temperatura de
cerca de 50C
(temperatura que seja
suportada pelas mos
do manipulador).
Verter a agarose para o

suporte do gel at uma
altura de ~5mm.
Eliminar bolhas de ar
que se tenham
formado, com a ajuda
de uma ponta e deixar
solidificar
temperatura ambiente.
Na hotte adicionar 5 l
de uma soluo de
brometo de etdio a 10
mg/m (concentra o
final de 0,5 g/mL)
soluo de agarose.
Fechar a cmara de
electroforese e ligar os
cabos elctricos a uma
fonte de alimentao
elctrica de modo a
que o ctodo da
cmara fique ligado ao
ctodo da fonte (preto
preto), assim como o
nodo (vermelho
vermelho).
Aps migao julgada

conveniente (por avaliao
da posio do azul de
bromofenol a sensivelmente
3/4 do comprimento do gel),
desligar a corrente elctrica
na fonte, desligar os cabos e
retirar a tampa da tina de
electroforese.
Ligar os cabos fonte

de energia de modo a
que o ctodo da
cmara fique ligado ao
ctodo da fonte (preto
preto), assim como o
nodo (vermelho
vermelho).
Ligar a fonte de
alimentao e regular a
voltagem para 80
Volts. Verificar se h
desprendimento de
bolhas dos elctrodos
devido electrlise e
se, passados alguns
minutos, o azul de
bromofenol j
comeou a migrar no
sentido correcto, ou
seja, do polo positivo.
Nota: Durante o aquecimento para dissoluo da agarose ter cuidado na manipulao

do erlenmeyer pois a soluo no seu interior estar muito quente, se possvel usar luvas que
protejam do calor.
111
Ateno: O brometo de etdeo um agente mutagnico potente, usar sempre luvas e

colocar em recipiente prprio todo o material que tenha entrado em contacto com este
corante.
(1)
2 l de tampo de deposio de DNA (usar sempre a mesma ponta)
10 L do produto de PCR (deixar a ponta usada para pipetar o produto de PCR no tubo
da mistura
(2)
Cuidados a ter:
- Estabilizar a pipeta sobre o poo com ambas as mos
- Expelir o ar da ponta antes de carregar o gel
- Mergulhar a ponta da pipeta um pouco abaixo da superfcie do lquido (no necessrio
introduzir a ponta dentro do poo), posicion-la na direco do poo e expelir a amostra muito
lentamente. Cuidado para no furar o gel com a ponta da pipeta, e no deixar extravasar a
amostra do poo para no contaminar os poos vizinhos.
Ateno: As radiaes U.V. so extremamente perigosas, particularmente para os olhos,

provocando leses na retina. Evitar qualquer exposio dos olhos a estas radiaes. Usar
sempre culos protectores ou mscaras de material opaco aos U.V.
112
2. Resultados
Quantificao e determinao do grau de pureza do DNA extrado
Aps a extraco do DNA quantificou-se o mesmo e ainda se analisou a sua pureza
com o auxlio de tcnicas espectrofotomtricas.
A 260 nm, uma OD (optical density densidade ptica) equivale a cerca de 50g/mL
de DNA. Assim, obteve-se uma absorvncia de 1,417 OD, pelo que a concentrao de DNA
extrado
m .
Para determinar o grau de pureza do DNA mediu-se a igualmente a absorvncia da

amostra a 280 nm (registando-se 0,857) e determinou-se a relao A260/A280. De acordo com
os parmetros, se esta razo se encontrar entre 1,8 e 2,0, a amostra pode ser considerada
pura. Para valores abaixo de 1,8 considera-se a amostra contaminada com protena e fenol. A
nossa razo foi 1,65 pelo que se considera que a amostra est contaminada. No entanto,
utilizou-se esta amostra para as restantes partes da actividade experimental.
Tamanho de fragmentos ampliados

Pode fazer-se uma determinao in silico dos tamanhos dos fragmentos esperados
aps amplificao com os primers fornecidos, recorrendo a um alinhamento com as databases
de DNA usando os programas disponveis online (Primer-Blast), conhecendo as sequncias em
que os primers hibridam (os primers batata hibridam na sequncia existente na base de
dados Genebank com o nmero de acesso DQ185064, e os primers vaca hibridam na
sequncia existente na base de dados Genebank com o nmero de acesso V00654.).
Sabe-se que os primers so:
*Primer Forward mtDNA COX2 batata: 5- GCGCATAAACTATGTTCGTC -3
*Primer Reverse mtDNA COX2 batata: 5- AGATCCTAATTGCCATGGTT -3
*Primer Forward mtDNA Mt11 vaca: 5- TTCTGTAGCCATAGCCGTTGTA -3
*Primer Reverse mtDNA Mt11 vaca: 5- CCCTTGCGTAGGTAATTCATTC -3
113
Assim, in silico, para o DNA da batata o tamanho obtido foi 366bp e para o DNA da
vaca o tamanho obtido foi 1751bp.
Figura 1 - Primer-Blast para DNA da vaca.
Figura 2 - Primer-Blast para DNA da batata.
114
Pode
tambm
calcular-se
tamanho
dos
fragmentos
amplificados
experimentalmente (in vitro) por PCR para cada reaco com diferentes pares de primers,
usando o marcador de pesos moleculares.
Os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais
ao log10 das suas massas moleculares devido a um maior atrito com a matriz com o
aumento do tamanho. Para simplificar, substitui-se neste caso a massa molecular dos
fragmentos pelo seu tamanho em pares de bases (bp).
Tendo em conta esta informao deve medir-se a distncia, em mm, para o
marcador de pesos moleculares desde o bordo frontal do poo a cada uma das bandas. Ao
fazer corresponder a distncia a cada banda ao tamanho do respectivo fragmento pode
traar-se uma recta de regresso com a distncia migrada no eixo dos xx e o logaritmo de
bp no eixo dos yy para os valores do marcador de pesos moleculares usado, que servir
para conhecer os pares de bases que correspondem s nossas amostras.
115
V3A
V3B
V3C
B3A
B3B
B3C
Legenda:
V3A DNA de vaca e primers de batata
V3B DNA de vaca e primers de vaca
V3C Controlo
B3A DNA de batata e primers de batata
B3B DNA de batata e primers de vaca
B3C Controlo
M Marcador Generuler 1kb
Distncia (mm)
log10 bp
bp
18
3,3
2000
Figura 3 - Comparao entre o marcador comercial e os resultados obtidos com o nosso marcador.
22
3,2
1500
26
3
1000
30
2,9
750
35
2,7
500
42
2,4
250
116
Tabela 2 - Dados relativos ao marcador para traar a recta de regresso: distncia (mm), pares de bases (bp) e
log10bp.
Recta de regresso
3.5
3
log10bp
2.5
y = -0.0376x + 4.0018
R = 0.9941
1.5
1
0.5
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Distncia (mm)
Grfico 1 - Recta de regresso com dados do marcador.
Com a recta de regresso determinada, procede-se ento ao clculo do nmero de

pares de bases dos fragmentos de DNA que se pretendia determinar.
Equao da recta:
, onde y o log10bp e x a distncia percorrida em mm.
Ou seja, medindo a distncia percorrida pelo DNA das amostras que temos, podemos
determinar a sua quantidade de pares de bases.
Distncia percorrida pelo DNA de V3B = 21 mm
Distncia percorrida pelo DNA de B3A = 39 mm
117
Comparando com os valores acima obtidos atravs dos dados do NCBI, para o
tamanho do gene do DNA da batata temos 372 pares de bases obtidos experimentalmente em
contraste com 366 pares de bases e para o tamanho do gene DNA da vaca temos 1703 pares
de bases em contraste com 1751 pares de bases.
Os resultados so relativamente prximos sendo que para a diferena obtida
necessrio ter em conta que na construo da recta de regresso existe subjectividade por ser
um mtodo comparativo, e ainda que as amostras de DNA estavam contaminadas.
Anlise do gel
V3A
V3B
V3C
B3A
B3B
B3C
Legenda:
V3A DNA de vaca e primers de batata
V3B DNA de vaca e primers de vaca
V3C Controlo
B3A DNA de batata e primers de batata
B3B DNA de batata e primers de vaca
B3C Controlo
M Marcador Generuler 1kb
No tubo V3B verifica-se presena de DNA identificado como DNA da vaca e no tubo
B3A verifica-se presena de DNA identificado como DNA da batata. Os nossos tubos contendo
DNA no correspondem aos dos restantes grupos da turma devido a erros na ordem de
aplicao, sendo que para a maioria da turma o DNA da vaca se encontra no primeiro tubo e o
DNA da batata no quinto. Assim pode concluir-se que nestes dois tubos havia DNA e primers
118
correspondentes que tornaram possvel a hibridao e amplificao dos genes de acordo com
a tcnica de PCR.
Nos restantes tubos que continham DNA no se verifica um resultado positivo pois os
primers especficos e o DNA no eram correspondentes, no havendo por isso hibridao e
amplificao com a tcnica de PCR.
Os tubos de controlo, V3C e B3C possuem tambm um resultado negativo, esperado
porque estes tubos so controlos e no possuem DNA.
Em todos os tubos existe uma banda difusa que a mais afastada do poo. Esta banda
corresponde aos primer dimers em excesso que acabaram por hibridar entre eles formando
assim bandas visveis.
Uma vez que o nosso DNA no se encontrava puro possvel a existncia de produtos
inespecficos, nomeadamente no tubo V3B, pois apesar de no se verificar a existncia de mais
bandas alm das esperadas nota-se um arrastamento da banda muito pronunciado neste tubo.
Este arrastamento de bandas ocorreu principalmente em V3B e V3C. No primeiro caso
este arrastamento pode ser justificado devido elevada concentrao de DNA. No segundo
caso o problema foi provavelmente na micropipeta que estaria mal calibrada, uma vez que
aps esse ensaio foi utilizada uma diferente e no se registou arrastamento das bandas nos
poos seguintes.
119

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COMPLEXOS DE FERRO

Tambm designados por compostos de coordenao, so a espcie MLn que se forma

Geomtrico: Diferem no arranjo dos ligandos;

Ionizao: Os produtos slidos tm a mesma estequiometria, mas originam

Os metais de transio so moderadamente reactivos, combinando-se muitas vezes

b) Coordenao com molculas no metlicas

Um exemplo a biomolcula hemeritrina que ocorre no sangue de invertebrados

c) Coordenao com ies metlicos

comum a presena de ferro em enzimas como Oxidorredutases (catalisam reaces

Complexo Tris(oxalato) ferrato(III) de potssio

Para a realizao desta actividade experimental utilizou-se o sulfato ferroso amoniacal

O primeiro passo do procedimento consistiu na dissoluo de sulfato ferroso

Seguidamente adicionou-se uma soluo quente de cido oxlico em gua, para

Lavou-se o precipitado repetidamente com gua, com o objectivo de retirar o excesso

Adicionou-se oxalato de potssio monohidratado em gua, que levou desacidificao

Gota a gota, adicionou-se perxido de hidrognio agitando continuamente a soluo e

Aps ter sido adicionado todo o perxido de hidrognio, aqueceu-se a mistura at

Filtrou-se a soluo quente e adicionou-se etanol, que diminuiu a solubilidade do sal,

Deixou-se cristalizar o complexo no escuro, pois este complexo fotossensvel.

Filtraram-se os cristais verdes e lavaram-se os mesmos com acetona, que eliminou o

Deixaram-se secar os cristais ao ar e no escuro.

Seguidamente realizaram-se diversas reaces com os ies Fe(II) e Fe(III) e outros

Realizaram-se tambm reaces com hexacianoferrato (II) e (III) e observaram-se os

Adicionaram-se reagentes como tiocianato de amnio e hidrxido de sdio a

Por fim fizeram-se reaces com iodeto.

O precipitado amarelo o complexo oxalato de ferro (II) dihidratado.

3) Adio de oxalato de potssio

4) Adio gota-a-gota de perxido de hidrognio

Obteve-se o complexo tris(oxalato) ferrato (III) e, devido oxidao do perxido de

5) Adio de cido oxlico saturado

Adio de soluo saturada de cido oxlico de forma a redissolver o precipitado de

Clculo do reagente limitante

Uma concentrao de peroxide de hidrognio 20 volumes equivalente a

Reaces caractersticas dos ies ferro (II) e ferro (III)

* este composto branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxignio

log (K) (25C)

Sendo o oxalato bidentado, tambm est favorecida a ligao do segundo tomo de

(mas deveria ter

*este composto branco em anaerobiose, sendo oxidado pelo oxignio

Amarelo da Prssia um oxidante poderoso.

Aps oxidao do ferro, formou-se ferrocianeto frrico (azul da Prssia), a partir de

Forma-se o complexo ferrocianeto frrico.

K3[Fe(CN)6] ferricianeto de potssio, gera ies Fe3+

Primeiro formou-se um complexo azul, muito instvel, conhecido como azul de

Forma-se um complexo chamado amarelo da Prssia, ferricianeto frrico.

3) Complexo de fluoreto com ferro (III)

Obteve-se hexafluoro ferrato(III).

log (K) (25C)

4) Reaco com o iodeto

2 fases: aquosa superior amarela, orgnica inferior roxa

Sim (fase orgnica)

Incolor (evidncia de separao por fases)

Em fase aquosa, observa-se o aparecimento de uma cor amarelo torrado diferente da

Em primeiro lugar, o flor liga-se ao ferro formando um complexo incolor e muito

Uma concentrao de peroxide de hidrognio 20 volumes equivalente a

A estrutura do complexo sintetizado pode de certa forma ser um modelo para

MIOGLOBINA: EXTRACO, PURIFICAO E DOSEAMENTO DE PROTENA

Uso da fora centrfuga para sapara partculas por sedimentao;

Trata-se da espectroscopia de absoro em que so utilizados comprimentos de onda

Cromatografia de excluso molecular

Separao dos agentes redox da mioglobina;

Usado para a determinao da concentrao proteica, atravs da construo de rectas

1. Serve para provocar a ruptura celular e promover a libertao da mioglobina. Deve