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I
(Actos cuja publicação é uma condição da sua aplicabilidade)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, regulamento os seus anexos respeitantes aos métodos de
análise.
(7) O Regulamento (CE) n.o 2571/97 da Comissão, de 15 de pelo Regulamento (CE) n.o 2654/1999 (8) prevê que
Dezembro de 1997, relativo à venda a preço reduzido deve comprovar-se a ausência de coliformes. O método
de manteiga e à concessão de uma ajuda à nata, à de referência aceite internacionalmente para a pesquisa
manteiga e à manteiga concentrada destinadas ao fabrico de coliformes no leite e nos produtos lácteos é a norma
de produtos de pastelaria, de gelados alimentares e de internacional FIL73A: 1985. Todavia, esta norma apenas
outros produtos alimentares (1), com a última redacção é aplicável sob uma forma modificada à detecção de
que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 635/ coliformes numa determinada quantidade de produto.
/2000 (2), prevê, em determinadas circunstâncias, a Deste modo, estabelece-se um método comunitário de
marcação das natas, da manteiga e da manteiga concen- referência para a detecção dos coliformes baseada na
trada para garantir a utilização final adequada dos norma supracitada.
produtos em causa. Em virtude da importância da
marcação para o bom funcionamento do regime e de (11) O Regulamento (CEE) n.o 2658/87 do Conselho de 23
modo a garantir a igualdade de tratamento entre os de Julho de 1987, relativo à nomenclatura pautal e
operadores participantes, é conveniente estabelecer, na estatística e à pauta aduaneira comum (9), com a última
medida do possível, métodos comuns de determinação redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o
de alguns dos referidos marcadores. 254/2000 (10) diferencia os níveis dos direitos adua-
neiros aplicáveis aos alimentos compostos para animais
abrangidos pela posição pautal 2309, em função do seu
(8) A manteiga concentrada deve ser objecto de uma teor de produtos lácteos. De modo a garantir a aplicação
marcação sujeita a controlo, em conformidade com o uniforme das disposições em causa, há que definir um
Regulamento (CEE) n.o 3143/85 da Comissão, de 11 de método de determinação do teor de lactose obrigatório
Novembro de 1985, relativo ao escoamento a preço para todos os Estados-Membros e estabelecer, para esse
reduzido da manteiga de intervenção destinada ao fim, um método de aceitação geral.
consumo directo sob a forma de manteiga concen-
trada (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo (12) O Regulamento (CE) n.o 1255/1999 estipula que devem
Regulamento (CE) n.o 101/1999 (4) e o Regulamento respeitar-se determinadas condições qualitativas no que
(CEE) n.o 429/90 da Comissão, de 20 de Fevereiro de se refere à manteiga e ao leite em pó desnatado desti-
1990, relativo à concessão por concurso de uma ajuda à nados a intervenção e ao leite em pó desnatado desti-
manteiga concentrada destinada ao consumo directo na nado à alimentação animal. É, pois, oportuno fixar
Comunidade (5) com a última redacção que lhe foi dada métodos de referência para a verificação das referidas
pelo Regulamento (CE) n.o 124/1999 (6) e o Regula- condições.
mento (CE) n.o 2571/97. Para evitar riscos de práticas
não autorizadas, é indispensável o estrito respeito das
(13) A aplicação de alguns dos métodos introduzidos pela
condições relativas à marcação da manteiga concentrada.
primeira vez pelo presente regulamento necessita de um
Há, pois, que definir um método comum de detecção
período de adaptação, pelo que é oportuno diferir a sua
dos marcadores em causa.
aplicação.
(9) Nos termos do artigo 9.o do Regulamento (CE) n.o 1255/ (14) O Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos não
/1999, pode ser concedida uma ajuda à armazenagem emitiu qualquer parecer no prazo fixado pelo seu presi-
privada dos queijos à base de leite de ovelha. O artigo dente,
31.o do referido regulamento estipula que pode ser
concedida uma restituição especial aos produtos em
causa. Prevê-se a importação na Comunidade a partir de
determinados países terceiros, em condições preferen- ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
ciais, de queijos à base de leite de ovelha, de leite de
cabra e de leite de búfala ou de misturas de leite de
ovelha, cabra e búfala. Em virtude das disposições supra- CAPÍTULO I
citadas, é necessário verificar, mediante inspecções
adequadas, que não foi incorporado leite de vaca nos
DISPOSIÇÕES GERAIS
produtos em causa. Consequentemente, deve estabe-
lecer-se um método de referência comunitário para a
detecção do leite de vaca, sem prejuízo da aplicação de
métodos de rotina, caso sejam conformes a determi- Artigo 1.o
nados critérios.
Objecto e âmbito de aplicação
(10) O Regulamento (CEE) n.o 2921/90 da Comissão, de 10 O presente regulamento estabelece as normas de aplicação dos
de Outubro de 1990, relativo à concessão de ajudas ao métodos de análise química, física, microbiológica, bem como
leite desnatado com vista ao fabrico de caseína e de de exame organoléptico, do leite e dos produtos lácteos no
caseinatos (7), com a última redacção que lhe foi dada âmbito dos regimes previstos pela organização comum de
mercado no sector do leite e dos produtos lácteos, estabelecida
(1) JO L 350 de 20.12.1997, p. 3. pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999, bem como alguns dos
(2) JO L 76 de 25.3.2000, p. 9. referidos métodos.
(3) JO L 298 de 12.11.1985, p. 9.
(4) JO L 11 de 16.1.1999, p. 14.
(5) JO L 45 de 21.2.1990, p. 8. (8) JO L 325 de 17.12.1999, p. 10.
(6) JO L 16 de 21.1.1999, p. 19. (9) JO L 256 de 7.9.1987, p. 1.
(7) JO L 279 de 11.10.1990, p. 22. (10) JO L 28 de 3.2.2000, p. 16.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/3
O procedimento constante do anexo II pode ser aplicado à 3. O relatório laboratorial de análise deve incluir elementos
verificação de resultados obtidos por métodos de rotina que suficientes para permitir a avaliação dos resultados em confor-
sejam próximos dos limites especificados nos regulamentos em midade com os anexos IV e VIII.
causa.
4. Os resultados de uma análise são considerados admissí-
Em caso de litígio, os resultados obtidos pelo método de refe- veis se tiverem sido obtidos de acordo com os critérios de
rência são determinantes. aceitabilidade especificados no método interno de controlo da
qualidade referido no n.o 1 e as normas internas de precisão
referidas no n.o 2.
Artigo 4.o
1. As análises são efectuadas em laboratórios que aplicam 2. O procedimento definido no anexo VIII é aplicável caso
um método interno de controlo da qualidade conforme ao os resultados de uma análise não sejam aceites pelo operador.
L 37/4 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
Artigo 13.o
Artigo 10.o
Detecção de soro de coagulação desidratado
Detecção de caseína de leite de vaca
1. O método de detecção da presença de soro de coagulação
1. O método de análise descrito no anexo XV é aplicado desidratado no leite em pó desnatado destinado à armaze-
para garantir que o queijo que deve ser produzido exclusiva- nagem pública é definido no anexo XVIII.
mente com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala, ou
uma mistura de leite de ovelha, cabra e búfala, não contém 2. O método de detecção da presença de soro de coagulação
caseína de leite de vaca. desidratado no leite em pó desnatado e nas misturas destinados
à alimentação animal é definido no anexo XIX.
Considera-se que se encontra presente caseína de leite de vaca
se o teor aparente de caseína de leite de vaca da amostra a
analisar for igual ou superior ao teor da amostra de referência Artigo 14.o
que contém 1 % de leite de vaca, prevista no anexo XV.
Detecção de leitelho
2. Os métodos de rotina para a detecção de caseína de leite
de vaca nos queijos referidos no n.o 1 podem ser utilizados nas O método de detecção da presença de leitelho no leite em pó
seguintes condições: desnatado é definido no anexo XX.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/5
Revogações
CAPÍTULO III
São revogados os Regulamentos (CEE) n.o 1216/68, (CEE)
DISPOSIÇÕES FINAIS n.o 3942/92, (CEE) n.o 86/94, (CE) n.o 2721/95, (CE) n.o 1854/
/96, (CE) n.o 1080/96, (CE) n.o 1081/96, (CE) n.o 1082/96, (CE)
n.o 880/98 e (CEE) n.o 1459/98.
Artigo 20.o
As referências aos regulamentos revogados consideram-se feitas
Alterações do Regulamento (CE) n.o 2771/1999 ao presente regulamento.
2. A nota de rodapé n.o 2 do anexo I, passa a ter a seguinte Todavia, os métodos previstos no anexo III, no ponto 4 do
redacção : Ver o anexo I do Regulamento (CE) n.o 213/ anexo IV e nos anexos V, VI e VIII são aplicáveis dezoito meses
/2001. após a entrada em vigor do presente regulamento.
L 37/6 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
Pela Comissão
Franz FISCHLER
Membro da Comissão
ANEXO I
7.2.2001
(Artigo 2.o)
Índice:
Mín. = mínimo, Máx. = máximo, Anexo = anexo do regulamento citado, m.s.n.g. = matéria seca não gorda, AGL = ácidos gordos livres, IP = índice de
PT
peróxidos, A = aspecto, G = paladar, C = consistência, TTG = teor total de germes, Therm. = teor de germes termófilos, EM = Estado-Membro,
FIL = Federação Internacional do Leite, ISO = International Organization for Standardization (Organização internacional de normalização),
IUPAC = União Internacional de Química Pura e Aplicada, ADPI = American Dairy Products Institute, LCS = leite concentrado açucarado, LCC = leite
ou nata evaporados/a, MSNGL = matéria seca láctea não gorda
PARTE A:
Regulamento da
Produto Parâmetro Limite Método de referência Observações
Regulamento (CE) n.o 2771/1999: Manteiga sem sal Matéria gorda láctea Mín. 82 % Anexo XI
Armazenagem pública Humidade Máx.: 16 % Anexo IX
(JO L 333 de 24.12.1999, p. 11)
m.s.n.g. Máx.: 2 % Anexo X
AGL (máx.) 1,2 mmole/100 g de matéria gorda Norma FIL 6B:1989
IP (máx.) 0,3 meq. De oxigénio/1 000 g Norma FIL 74A:1991 (versão inglesa) Nota 1
matéria gorda
Coliformes indectáveis em 1 g Anexo XVII Nota 3
Matéria gorda não láctea indectáveis na análise dos triglicé- Anexo XXVI
ridos
Marcadores: esteróis Indetectáveis Anexo XIV
Outros marcadores:
— vanilina Indetectáveis Anexo XII
— éster etílico do ácido caroténico Indetectáveis Anexo XIII
— triglicéridos do ácido enântico Indetectáveis IUPAC 2.301 sub 5
Características organolépticas Mínimo: 4 pontos em 5 para A, G e Anexo VII
C
Dispersão da água Mínimo: 4 pontos Norma FIL 112A:1989
Regulamento (CE) n.o 2771/1999: Manteiga sem sal Matéria gorda láctea Mín.: 82 % Anexo XI Nota 6
Armazenagem privada Água Máx.: 16 % Anexo IX
Regulamento (CE) n.o 2771/1999: Manteiga com sal Matéria gorda láctea Mín.: 80 % Anexo XI Nota 6
Armazenagem privada Água Máx.: 16 % Anexo IX
L 37/7
Sal Máx.: 2 % Norma FIL 12B:1988
L 37/8
Regulamento da
Produto Parâmetro Limite Método de referência Observações
Comissão
Regulamento (CE) n.o 2571/97 Manteiga sem sal Matéria gorda láctea Mín.: 82 % Anexo XI
(JO L 350 de 20.12.1997, p. 3) Água Máx.: 16 % Anexo IX
Marcadores:
— esteróis Anexo XIV
PT
— vanilina Anexo XII
— éster etílico do ácido caroténico Anexo XIII
— triglicéridos do ácido enântico IUPAC 2.301 sub 5
Regulamento (CE) n.o 2571/97 Manteiga com sal Matéria gorda láctea Mín.: 80 % Anexo XI
Água: Máx.: 16 % Anexo IX
Regulamento (CE) n.o 2571/97 Manteiga concentrada Matéria gorda láctea Mín.: 99,8 % Norma FIL 24:1964
Humidade e msngl Máx.: 0,2 % Norma FIL 23A:1988 (humidade)
Norma FIL 24:1964 (MSNGL)
AGL Máx.: 0,35 % (ácido oleico) Norma FIL 6B:1989
IP (máx.) 0,5 meq. oxigénio/1 000 g de Norma FIL 74A:1991 (versão inglesa) Nota 1
gordura
Matérias gordas não lácteas Ausentes Anexo XXV
Paladar Característico
Odor Ausência de odores estranhos
Outros Ausência de agentes neutralizantes,
antioxidantes e conservantes
Marcadores:
— esteróis Anexo XIV
— vanilina Anexo XII
7.2.2001
— éster etílico do ácido caroténico Anexo XIII
— triglicéridos do ácido enântico IUPAC 2.301 sub 5
7.2.2001
Regulamento da
Produto Parâmetro Limite Método de referência Observações
Comissão
Regulamento (CE) n.o 2571/97 Nata Matéria gorda 35 % Norma FIL 16C:1987
Marcadores:
— esteróis Métodos aprovados pela autoridade Nota 2
competente
PT
— vanilina Anexo XII
— éster etílico do ácido caroténico Métodos aprovados pela autoridade Nota 2
competente
— triglicéridos do ácido enântico IUPAC 2.301 sub 5
Regulamento (CE) n.o 429/90 Manteiga concentrada Matérias gorda láctea Mín.: 96 % Métodos aprovados pela autoridade Nota 2
(JO L 45 de 21.2.1999, p. 8) competente
Regulamento (CEE) n.o 2191/81 Manteiga sem sal Matéria gorda láctea Mín.: 82 % Anexo XI
L 37/9
(JO L 213 de 1.8.1981. p. 20) Água Máx. 16 % Anexo IX
L 37/10
Regulamento da
Produto Parâmetro Limite Método de referência Observações
Comissão
Regulamento (CEE) n.o 2191/81 Manteiga com sal Matéria gorda láctea Mín.: 80 % Anexo XI
Água Máx. 16 % Anexo IX
Sal Máx. 2 % Norma FIL 12B:1988
PT
Artigo 9.o e título II do Regula- Queijo de leite de ovelha Leite de vaca <1% Anexo XV
mento (CE) n.o 1255/1999 e/ou de leite de cabra
Regulamento (CEE) n.o 2921/90 Anexo I — Caseína ácida Água Máx. 12,00 % Norma FIL 78C:1991
Matéria gorda Máx. 1,75 % FIL 127A: 1998
Acidez livre Máx. 0,30 % (ácido láctico) Norma FIL 91:1979
Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo I — Caseinatos Água Máx.: 6,00 % Norma FIL 78C:1991
Proteínas do leite Mín.: 88,00 % Norma FIL 92:1979
Matéria gorda e cinzas Máx.: 6,00 % FIL 127A:1988
Norma FIL 89:1979 ou
Norma FIL 90:1979
Regulamento (CEE) n.o 2921/90 Anexo II — Caseína ácida Água Máx.: 10,00 % Norma FIL 78C:1991
Matéria gorda Máx.: 1,50 % FIL 127A:1988
Acidez livre Máx.: 0,20 % (ácido láctico) Norma FIL 91:1979
TTG (Máx.) 30 000 l/g Norma FIL 100B:1991 Nota 3
Coliformes Ausente 0,1 g Anexo XVI Nota 3
Therm. (Máx.) 5 000 l/g Norma FIL 100B:1991 Notas 3 e 4
Regulamento (CEE) n.o 2921/90 Anexo II — Caseína de Água Máx.: 8,00 % Norma FIL 78C:1991
coagulação Matéria gorda Máx.: 1,00 % FIL 127A:1988
Cinzas Mín.: 7,50 % Norma FIL 90:1979
TTG (Max.) 30 000 l/g Norma FIL 100B:1991 Nota 3
7.2.2001
Coliformes Ausente/0,1 g Anexo XVI Nota 3
Therm. (Máx.) 5 000 l/g Norma FIL 100B:1991 Notas 3 e 4
7.2.2001
Regulamento da
Produto Parâmetro Limite Método de referência Observações
Comissão
Regulamento (CEE) n.o 2921/90 Anexo II — Caseinatos Água Máx. 6,00 % Norma FIL 78C:1991
Proteínas do leite Mín. 88,00 % Norma FIL 92:1979
Matéria gorda e cinzas Máx. 6,00 % FIL 127A:1988
FIL 89:1979 ou FIL 90:1979
PT
TTG (Máx.) 30 000 l/g Norma FIL 100B:1991 Nota 3
Coliformes Ausentes 0,1 g Anexo XVI Nota 3
Therm. (Máx.) 5 000 l/g Norma FIL 100B:1991 Notas 3 e 4
Regulamento (CEE) n.o 2921/90 Anexo III — Caseinatos Água Máx.: 6,00 % Norma FIL 78C:1991
Proteínas do leite Mín.: 85,00 % Norma FIL 92:1979
Matéria gorda Máx.: 1,50 % FIL 127A:1988
Regulamento (CEE) n.o 2799/1999 Alimento compostos para Água (leitelho ácido em pó) Máx.: 5 %
(JO L 340 31.12.1999, p. 3) animais e leite em pó Proteínas 31,4 % (min. em relação ao extracto Norma FIL 20B:1993
desnatado (LEP) (para a seco não gordo)
alimentação animal)
Água (LEP) Máx.: 5 % Norma FIL 26A:1993
Matéria gorda (LEP) Máx.: 11 % Norma FIL 9C:1987
Soro de coagulação desidratado (LEP) Ausente Anexo XIX Nota 7
Amido (LEP) Ausente Anexo XXIII
Água (mistura) 5 % máx. no extracto seco não Norma FIL 26A:1993
gordo
Matéria gorda (mistura) — Directiva 84/4/CEE da Comissão (JO Nota 7
L 15 de 18.1.1984, p. 28)
Soro de coagulação desidratado Ausente Anexo XXII Nota 8
(mistura)
Teor de LEP (do produto final) Mín.: 50 % Directiva 84/4/CEE da Comissão Nota 9
Matéria gorda (do produto final)
Amido (do produto final) Mín: 2,5 % ou 5 % Anexo XXII
L 37/11
Cobre (do produto final) Mín: 2 % Directiva 78/633/CEE da Comissão
25 ppm (JO L 206 de 26.7.1987, p. 43)
L 37/12
Regulamento da
Produto Parâmetro Limite Método de referência Observações
Comissão
Regulamento (CE) n.o 322/96 LEP (processo spray) Matéria gorda Máx.: 1,0 % Norma FIL 9C:1987
(JO L 45 de 23.2.1996, p. 5) Proteínas 31,4 % mín. no extracto seco não Norma FIL 20B:1993
gordo)
Água Máx.: 3,5 % Norma FIL 26A:1993
PT
Acidez (N/10 NaOH) Máx.: 19,5 ml Norma FIL 86:1981
Lactatos Máx.: 150 mg/100 g Norma FIL 69B:1987
Fosfatos Negativo Norma ISO 3356:1975
Solubilidade Máx.: 0,5 ml a 24 °C FIL 129A:1988
Partículas queimadas Filtro B mín. (15,0 mg) ADPI:1990
TTG 40 000/l g Norma FIL 100B:1991 Nota 3
PARTE B
Os métodos de referência incluídos na parte B são aplicáveis à análise de produtos abrangidos por qualquer dos regulamentos indicados na primeira coluna.
Regulamento da
Produto Código NC Parâmetro Limite Método de referência Notas
Comissão
Regulamento (CEE) n.o 2658/87 Leite e nata, não concen- 0401 Matéria gorda (≤ 6 %) Os limites são os referidos na Norma FIL 1D:1996
(JO L 256 de 7.9.1987, p. 1) trados nem adicionados de descrição do código NC relativo ao
Regulamento (CE) n.o 2414/98 (JO açúcar ou de outros edul- produto em causa e, se necessário,
L 299 de 10.11.1998, p. 7) corantes especificados pelo Regulamento
Regulamento (CE) n.o 1374/98 (CEE) n.o 3846/87 da Comissão
(JO L 185 de 30.6.1998, p. 21) (JO L 366 de 24.12.1987, p. 1)
Regulamento (CE) n.o 2508/97 (JO parte 9 da nomenclatura para
L 345 de 16.12.1997, p. 31) exportação ou pelo Regulamento
7.2.2001
Regulamento (CE) n.o 174/1999 (CE) n.o 1374/1998 (JO L 185 de
(JO L 20 de 27.1.1999, p. 8) 30.6.1998, p. 21)
Matéria gorda (> 6 %) Norma FIL 16C:1987
7.2.2001
Regulamento da
Produto Código NC Parâmetro Limite Método de referência Notas
Comissão
Leite e nata, concentrados 0402 Matéria gorda (forma Norma FIL 13C:1987
ou adicionados de açúcar líquida)
ou de outros edulcorantes Matéria gorda (forma Norma FIL 9C:1987
sólida)
PT
Proteínas Norma FIL 20B:1983
Soro do leite, concentrado 0404 Matéria gorda FIL 9C:1987, FIL 16C:1987
ou não ou adicionado de FIL 22B:1987
açúcar ou de outros edul- Proteínas Norma FIL 20B:1993
corantes; produtos consti-
Sacarose (teor normal) Norma FIL 35A:1992
tuídos por componentes
naturais do leite Sacarose (teor reduzido) Métodos aprovados pela autori- Nota 2
dade competente
0404 90 Proteínas Norma FIL 20B:1993
Água Norma FIL 26A:1993
Matéria seca Norma FIL 15B:1991
(produtos concentrados) Norma FIL 21B:1987
L 37/13
Água (se teor de matéria Norma FIL 23A:1988
gorda < 99 %)
L 37/14
Regulamento da
Produto Código NC Parâmetro Limite Método de referência Notas
Comissão
PT
Lactose Norma FIL 79B:1991
Regulamento (CEE) n.o 2658/87 Alimentos compostos para 2309 Lactose Anexo XVII
animais
7.2.2001
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/15
ANEXO II
(artigo 3.o)
VERIFICAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS POR MÉTODOS DE ROTINA QUE SE SITUAM PRÓXIMO DOS
LIMITES ESTABELECIDOS PARA AS CARACTERÍSTICAS DE COMPOSIÇÃO E DE QUALIDADE
ESPECIFICADAS NOS REGULAMENTOS
Seja mo um limite das características de composição e de qualidade especificadas num regulamento. O limite de decisão (L)
é
se RRout/RRef ≤ 1
RRout: Limite de reprodutibilidade do método de rotina
RRef: Limite de reprodutibilidade do método de reférência
Se mo for um limite superior e RRout/RRef > 1, o limite de decisão é dado pela fómula:
Se, nas mesmas condições, mo for um limite inferior, o limite de decisão é dado pela fórmula:
em que CrD95 representa a diferença crítica do método de referência (ver anexo IV).
Se mo for um limite superior, os resultados finais superiores ao limite de decisão obtidos por um método de rotina devem
ser substituídos por resultados finais obtidos pelo método de referência. Esses resultados finais devem basear-se, pelo
menos, no mesmo número de análises/amostra que os resultados finais obtidos pelo método de rotina.
Se mo for um limite inferior, deve aplicar-se ao mesmo procedimento aos resultados finais inferiores ao limite de decisão
obtidos por um método de rotina.
Nota
O procedimento descrito supra pode ser aplicado na ausência de efeitos detectáveis devidos à matriz.
Esses efeitos podem ser detectados da seguinte forma: calcula-se, para cada amostra utilizada na calibração, a diferença (wi)
entre os resultados obtidos pelo método de referência e pelo método de rotina.
O desvio-padrão, dado pela fórmula:
em que:
f= m (f: número de graus de liberdade)
α= probabilidade de erro; α = 0,05.
Neste caso, é necessária uma investigação complementar para estabelecer o limite de decisão.
L 37/16 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO III
(Artigos 4.o e 5.o)
A conformidade com o limite de reprodutibilidade é verificada por comparação dos resultados do laboratório em causa
com os resultados de um laboratório experimentado (1), obtidos com uma amostra idêntica. Efectua-se uma determinação
dupla em ambos os laboratórios, sendo os resultados avaliados de acordo com a fórmula:
em que:
CrD95: diferença crítica (P = 0,95)
–y : média aritmética de dois resultados obtidos no laboratório 1
1
–y : média aritmética de dois resultados obtidos no laboratório 2
2
R: limite de reprodutibilidade: a estabelecer por interpolação,
r: limite de repetibilidade: se a precisão variar em função da concentração.
Se for excedida a diferença crítica, deve realizar-se outro ensaio no prazo de dois meses. Se os resultados do segundo
ensaio não forem conformes ao limite de reprodutibilidade, as autoridades competentes adoptam as medidas necessárias.
em que:
–y : média de dois resultados obtidos no laboratório 1
1
–y : média de dois resultados obtidos no laboratório 2 (ver parte a) do anexo III)
2
r: limite de repetibilidade ou limite de repetibilidade provisório.
Notas:
1. Rprov pode ser utilizado para calcular as diferenças críticas (ver anexo VI).
3. Se o valor calculado for superior a 3r ou superior ao dobro do valor de R calculado através da equação de Horwitz (*),
o valor de Rprov é excessivamente elevado e não pode ser utilizado para calcular a diferença crítica.
4. Rprov deve ser calculado pelo menos uma vez por ano, com base nos resultados obtidos em dois laboratórios (cf. anexo
IV).
5. Se o valor médio de Rprov tiver de ser utilizado para calcular as diferenças críticas. As normas estabelecidas nos pontos
2 e 3 são aplicáveis ao valor médio de Rprov.
em que:
RSDR: desvio-padrão relativo da reprodutibilidade
c: concentração expressa em fracção decimal (exemplo: 10 g/100 g = 0,1).
Referência:
Peeler, J.T., Horwitz, W. and Albert, R.
J. Ass. Off. Anal. Chem.
72 (5), 784-806 (1989).
(1) Em geral, o laboratório experimentado deve ter participado com êxito tanto à validação do método de ensaio como a um ensaio de
adequação.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/17
O limite de reprodutibilidade (valor R) é obtido a partir do valor RSDR calculado do seguinte modo:
1 g/100 g 4
0,01 g/100 g 8
1 mg/1 000 g 16
ANEXO IV
(Artigo 4.o)
Se o resultado de uma análise exceder um determinado limite, calcula-se a média aritmética de dois ou mais resultados,
aplicando o procedimento seguinte:
1. Se a análise produzir um único resultado, efectua-se uma segunda análise em condições de repetibilidade. Se as duas
análises não puderem ser efectuadas nessas condições, efectua-se uma nova análise em duplo em condições de
repetibilidade, sendo os resultados obtidos utilizados para avaliar a conformidade com a diferença crítica.
2. Calcula-se o valor absoluto da diferença entre a média aritmética dos resultados obtidos em condições de repetibilidade
e o limite. Une um valor absoluto da diferença, superior à diferença crítica, significa que a amostra analisada não
satisfaz as condições requeridas.
em que:
–y: média aritmética dos resultados obtidos
mo: limite
n: número de análises/amostra.
Se a precisão variar em função da concentração, pode ser necessário calcular r e R por interpolação.
Em geral, os resultados finais obtidos numa amostra deve indicar o limite que foi considerado.
Os resultados finais compreendidos nos intervalos mencionados só são aceitáveis se ocorrerem, no máximo, uma vez
em cada cinco amostras analisadas por lote. Caso sejam analisadas menos de cinco amostras por remessa, um
resultado compreendido no intervalo mencionado é aceitável. No entanto, a norma segundo a qual apenas um
resultado compreendido nos intervalos mencionados deve ser obtido em cada cinco amostras analisadas deve ser
respeitada caso as remessas sejam sistematicamente oferecidas por um produtor.
3. Caso o resultado final x seja calculado utilizando a fórmula x = y1 ± y2 (exemplo: água + teor de matéria seca isenta de
gordura na manteiga, para calcular o teor de matéria gorda), sendo y1 e y2 os resultados finais de um único tipo de
análise, a repetibilidade global e os limites de reprodutibilidade rx e Rx dos resultados finais x são calculados da seguinte
forma:
O valor x é comparado com o limite mo de acordo com as normas especificadas nos pontos 1 e 2. A diferença crítica é
determinada através da fórmula:
sendo y1 e y2 os resultados finais de um único tipo de análise, a repetibilidade global e os limites de reprodutibilidade rx
e Rx podem ser calculados da seguinte forma:
em que:
r1: limite de repetibilidade, y1
r2: limite de repetibilidade y2
em que:
R1: limite de repetibilidade, y1
R2: limite de repetibilidade y2
Os processos utilizados para calcular rx e Rx só são aplicáveis caso os limites de repetibilidade e de reprodutibilidade
relativas (r*1 r*2; R*1; R*2) sejam inferiores ou iguais a 0,15.
O valor x deve ser comparado com o limite µx tal como indicado nos pontos 1 e 2. A diferença crítica é determinada
utilizando a fórmula:
sendo –x a média aritmética dos resultados x obtidos por ordem cronológica (*).
(*) N.B.: Se a ordem de obtenção dos resultados for, por exemplo, y11, y12, y21, y22, e y22, deve ser calculada a
média aritmética de y11/y21 e y12/y22.
L 37/20 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO V
CONTROLO INTERNO
(Artigo 5.o)
Material utilizado para o CQI e submetido, total ou parcialmente, ao mesmo processo que os materiais testados.
O laboratório deve estabelecer o CQI em conformidade com o processo descrito no documento da IUPAC intitulado
«Directrizes harmonizadas para o controlo interno da qualidade em laboratórios analíticos» (1).
O CQI é realizado inserindo materiais de controlo numa sequência analítica ou repetindo análise da amostra. Os materiais
de controlo devem ser semelhantes, na sua composição química, às amostras a ensaiar, e ser suficientemente estáveis
durante o período necessário. Deve ser demonstrado que podem ser convenientemente divididos em porções idênticas,
para análise, e que a espécie a analisar se encontra numa concentração adequada para o intervalo em estudo.
Deve inserir-se material de controlo pelo menos uma vez em cada série analítica, devendo o valor obtido ser inscrito num
gráfico de controlo, a fim de permitir a medição de erros a longo prazo. Além disso, o laboratório deve demonstrar,
periodicamente, que respeita as condições de repetibilidade na mesma determinação. Para tal, pode repetir-se as condições
de repetibilidade na mesma determinação. Para tal, pode repetir-se a análise de materiais de controlo e/ou de ensaio. Os
resultados destas análises devem ser comparados com limites de repetibilidade publicados e com os dados existentes
relativos à precisão no laboratório.
Quando se utilizam materiais de controlo, os valores obtidos para a análise entre determinações do material de controlo
devem ser inscritos num gráfico Shewhart [ISO 8258 (1991)] utilizando limites de controlo adequados. Os limites de
actuação devem ser fixados em
x ± 3st,
sendo st o desvio-padrão total,
e os limites de vigilância em
x ± 2st.
Desvio-padrão total:
em que:
sb: desvio-padrão entre determinações
sw : desvio-padrão na mesma determinação
n: número de determinações.
Caso não sejam utilizados materiais de controlo (p. ex., devido a uma estabilidade insuficiente), pelo menos um dos
materiais de ensaio deve ser analisado em duplicado em cada determinação.
Far-se-á então um gráfico das diferenças absolutas dos resultados das análises efectuadas em duplicado na mesma
determinação (ver anexo III). A curva central corresponde a 1,128 sw, o limite mínimo é 0 e o limite máximo (limite de
actuação) é 3,686 sw, sendo sw o desvio-padrão na mesma determinação.
Quando existir uma grande amplitude de concentrações, o procedimento de controlo deve incluir materiais de alta e baixa
concentração.
(1) M. Thompson and R. Wood: «Pure and Applied Chemistry» 67 (4), 649-666 (1995).
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/21
Caso exista uma grande diversidade de concentrações da espécie analisada nos materiais submetidos a ensaio, o
laboratório deve estabelecer a relação entre precisão e concentração. Caso a precisão seja proporcional à concentração, o
controlo deve ser realizado com base na precisão relativa (isto é, diferença absoluta expressa em percentagem do valor
médio).
O sistema analítico será considerado fora de controlo caso se verifique qualquer das seguintes condições:
A. Interrupção das análises até que sejam realizados testes de diagnóstico e que sejam tomadas medidas de correcção e
B. Rejeição da série de resultados e repetição da análise dos materiais de ensaio.
b) Método de selecção do material de controlo a utilizar no laboratório e método de determinação dos limites de
precisão do laboratório (análise química)
A precisão interna do laboratório pode ser determinada por repetição da análise de materiais de controlo e/ou por
repetição da análise de amostras.
O processo que a seguir se indica, a título de orientação, poderá ser utilizado pelos laboratórios para estabelecer
parâmetros de precisão para a variação dentro da mesma determinação e entre determinações, parâmetros que serão
depois utilizados no estabelecimento de gráficos de controlo. Os laboratórios podem optar por processos alternativos,
desde que possam demonstrar a fiabilidade dos dados obtidos quanto à precisão.
Caso seja indicada, num laboratório, a utilização de um material de controlo, é necessário primeiramente reunir dados que
permitam o estabelecimento de limites. Sempre que possível, devem ser utilizados materiais de referência certificados
(MRC). Os materiais de controlo a ensaiar devem ser analisados em condições de repetibilidade na mesma determinação,
devendo incluir-se MRC adequados, com repetições e casualização. Os MRC devem ser adequados tanto no que se refere à
composição da matriz como à concentração de espécie a analisar. Quando tal não for possível, os laboratórios devem
tentar participar em testes de aptidão e estabelecer médias consensuais (valores atribuídos) que possam ser considerados
como uma média verdadeira convencional à qual possa corresponder uma incerteza significativa. Outros processos
incluem a atribuição de um valor verdadeiro através de formulação ou a utilização de materiais de controlo marcados.
Além disso, quando se tratar de um laboratório experiente na análise em questão, dispondo já de um controlo estatístico,
os novos materiais de controlo (na sequência, por exemplo, do esgotamento das existências) devem ser obtidos utilizando
como referência análises nas quais seja utilizado como controlo o material existente.
2. Atribuição de limites
Uma vez seleccionado o material de controlo, o laboratório deve estabelecer valores de precisão na mesma determinação e
entre determinações, utilizando o material seleccionado.
A precisão na mesma determinação deve ser estabelecida analisando o material de controlo em duplicado, por doze vezes,
no mínimo. A análise em duplicado deve ser realizada em condições de repetibilidade, isto é, pelo mesmo operador, com
os mesmos reagentes, etc. A análise em duplicado dos materiais de controlo deve ser casualizada em cada série analítica.
Cada análise em duplicado deve ser realizada num dia diferente, durante um período suficiente para a obtenção de uma
variação razoável entre determinações, tendo em conta as fontes normais de variação, tais como reagentes, recalibração de
instrumentos e, se for o caso, diferentes analistas.
Nota: Chama-se a atenção para o facto de a utilização de dados que não representem adequadamente a variação entre
determinações poder resultar na duplicação desnecessária de análises, devido ao estabelecimento de limites
demasiado próximos. Inversamente, um laboratório que apresente dados de precisão demasiado imprecisos pode vir
a ser incapaz de satisfazer os limites exigidos por métodos de referência, revelar-se insatisfatório quando comparado
com laboratórios equivalentes e produzir dados inadequados para o fim pretendido.
Fazer primeiro um teste de variância máxima de Cochran com dados duplicados (12 duplicados, no mínimo). Neste teste é
feita a comparação entre o quadrado da diferença máxima entre duplicados e a soma dos quadrados das diferenças:
L 37/22 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
sendo
di = diferença entre duplicados.
O valor do critério de Cochran, C, é depois comparado com valores tabelados [ISO 5725 (1994)]. Caso um valor possa
ser classificado como isolado ou aberrante, deve investigar-se a razão de tal resultado: erro técnico, erro informático,
engano na realização do teste, engano na amostra analisada. Se a explicação do erro técnico for tal que se verifique ser
impossível substituir o resultado suspeito, esse resultado deve ser considerado como realmente aberrante, devendo ser
rejeitado. Caso subsistam resultados isolados ou aberrantes para os quais não se encontre explicação, os resultados
isolados devem ser considerados correctos e conservados e os resultados estatisticamente aberrantes devem ser rejeitados.
O laboratório deve procurar obter valores que os substituam.
Quando p laboratório estiver seguro de que os dados não incluem resultados aberrantes, o desvio-padrão na mesma
determinação, Sw, obtém-se do seguinte modo:
Para cada par p de dados duplicados Xi1, Xi2, calcular a soma dos duplicados,
e adicioná-los.
Caso se utilize um método de referência, o limite de precisão do laboratório deve ser comparado com o limite de
repetibilidade publicado. O laboratório deve satisfazer as exigências do método de referência; se assim não for, as causas
devem ser investigadas.
Os limites estabelecidos nesse caso devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.
O laboratório pode decidir estabelecer a precisão na mesma determinação através da análise em duplicado de amostras de
ensaio representativas (12 análises duplicadas no mínimo). Caso não seja possível utilizar materiais de controlo, por
razões de instabilidade, por exemplo, devem reunir-se dados duplicados obtidos por este método.
Nota: Parte-se do princípio de que as análises abrangem uma gama de valores relativamente reduzida e que, por
conseguinte, pode ser aplicado um valor único a todas as amostras. Caso a amplitude de resultados seja maior —
por exemplo, mais de uma ordem de grandeza — e a precisão seja dependente do nível, os laboratórios devem
analisar a utilização de desvios-padrão relativos.
Deve ser feito um teste de Cochran tal como indicado em 2.1.1. Caso o laboratório esteja seguro de que os dados não
contêm resultados aberrantes, o desvio-padrão na mesma determinação e o limite de precisão no laboratório podem ser
calculados como indicado no ponto 2.1.1.
O desvio-padrão na mesma determinação, Sw, pode ser utilizado para elaborar gráficos de controlo (ver anexo II). Os
limites estabelecidos devem ser considerados provisórios e passíveis de alteração.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/23
ANEXO VI
(Artigo 6.o)
Indicam-se a seguir os processos aplicáveis caso se utilizem métodos que incluam um sistema de pontuação
(IDF — norma 99C/1997).
em que:
wI : índice de repetibilidade
xi1: pontuação da primeira avaliação da amostra xi
xi2: pontuação da segunda avaliação da amostra xi
n: número de amostras.
Nas amostras a avaliar deve estar representada uma grande variedade em termos de qualidade. O valor wI não deve
exceder 1,5 (numa escala de 5 pontos).
em que:
xi1; xi2: ver alínea a)
–x ; –x : pontuação média atribuída pelo grupo de provadores na primeira e segunda avaliação da amostra xi,
i1 i2
respectivamente
n: número de amostras (pelo menos 10 amostras em 12 meses).
Nas amostras a avaliar deve estar representada uma grande variedade em termos de qualidade. O valor D1 não deve
exceder 1,5 (numa escala de 5 pontos).
Pede-se aos Estados-Membros que comuniquem as dificuldades que encontraram na aplicação deste método.
c) Comparação dos resultados obtidos em diferentes regiões do mesmo Estado-Membro e em diferentes Estados-Membros
Pelo menos uma vez por ano será organizado um ensaio que permita comparar os resultados obtidos pelos provadores
de diferentes regiões, se for o caso. Caso sejam detectadas diferenças significativas, devem ser tomadas as medidas
necessárias para identificar as razões dessas diferenças e para conseguir resultados comparáveis.
Os Estados-Membros são encorajados a organizar ensaios comparativos dos resultados obtidos pelos seus próprios
provadores e pelos provadores de Estados-Membros vizinhos. Caso sejam detectadas diferenças significativas deve ser
efectuado um estudo aprofundado, a fim de conseguir resultados comparáveis.
Pede-se aos Estados-Membros que notifiquem a Comissão dos resultados dos referidos ensaios comparativos.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/25
ANEXO VII
(Artigo 6.o)
1. Objectivo
O presente método tem por objectivo estabelecer um método uniforme de exame organoléptico da manteiga aplicável
em todos os Estados-Membros.
2. Definições
Entende-se por:
Exame organoléptico (avaliação), a apreciação das características de um produto pelos órgãos dos sentidos.
Júri, um grupo de provadores seleccionados que trabalha, durante a avaliação, sem comunicar e sem exercer quaisquer
influências entre si.
Pontuação, a avaliação organoléptica pelo júri, utilizando uma escala numérica. Deve ser utilizada a nomenclatura
relativa aos defeitos.
Controlo documental, os documentos utilizados para registar as pontuações individuais respeitantes a cada atributo e a
classificação final do produto. (Este documento pode ser também utilizado para registar a composição química).
3. Sala de prova
3.1. Devem ser enviados esforços para que os provadores na sala de prova não sejam influenciados por factores
externos.
3.2. A sala de prova deve estar isenta de cheiros estranhos e ser de fácil limpeza. As paredes devem ser de cor clara.
3.3. A sala de prova e a respectiva iluminação devem ser tais que as propriedades dos produtos a examinar não sejam
afectadas. A sala deve estar equipada com um dispositivo adequado de controlo da temperatura.
O provador deve estar familiarizado com produtos à base de manteiga e ter competência para realizar o exame
organoléptico. Essa competência deve ser avaliada regularmente (pelo menos uma vez por ano) pela autoridade
competente.
O número de provadores do júri deve ser ímpar, não podendo ser inferior a três. Os provadores, na sua maioria,
devem ser funcionários da autoridade competente. Após um período de transição de dois anos, o júri deve consistir
em, pelo menos, três provadores oficiais.
Antes da avaliação, deve atender-se a diversos factores, de modo a optimizar o desempenho dos provadores:
— Os provadores não devem padecer de nenhuma doença que possa afectar o seu desempenho. No caso contrário, é
conveniente incluir outro provador no painel.
— Os provadores devem apresentar-se com pontualidade para participar na avaliação e assegurar-se de que dispõem
de tempo suficiente para efectuar a mesma.
— Os provadores devem evitar a utilização de produtos fortemente odoríferos, tais como perfumes, loções aftershave,
desodorizantes, e comer alimentos fortemente aromatizados, tais como especiarias.
— Os provadores não podem fumar, comer, nem beber qualquer líquido, com excepção de água, na meia-hora que
precede a avaliação.
6.1. O exame organoléptico deve ser realizado relativamente aos três atributos seguintes: aspecto, consistência e
flavour.
O aspecto abrange as seguintes características: cor, pureza aparente, desenvolvimento de fungos e dispersão de
água.
Podem ser utilizados métodos físicos na avaliação da consistência da manteiga. A Comissão prevê a harmoni-
zação futura destes métodos.
O «flavour» envolve as seguintes características: sabor e cheiro.
Um desvio significativo da temperatura recomendada impossibilita uma avaliação fiável da consistência e do
flavour. Por conseguinte, a temperatura é de importância capital.
6.2. Cada atributo deve ser examinado organolepticamente de forma separada. A pontuação é atribuída de acordo
com o quadro 1.
6.3. Pode ser desejável que os provadores atribuam pontuação em conjunto, antes de iniciar o exame, relativamente a
uma ou mais amostras de referência quanto ao aspecto, consistência e flavour, de modo a obter uniformidade.
6.4. A pontuação para a aceitação é a seguinte:
Aspecto 5 4
Consistência 5 4
Flavour 5 4
Quando não seja obtida a pontuação necessária, deve ser apresentada uma descrição dos defeitos verificados. A
pontuação atribuída por cada provador relativamente a cada atributo deve ser registada num documento de
controlo. O produto é aceite ou rejeitado com base num decisão adoptada por maioria. Não podem ocorrer
frequentemente casos em que as diferenças entre a pontuação individual relativa a cada atributo seja superior a
um ponto (uma vez por vinte amostras, no máximo). Neste caso, a competência do júri deve ser verificada pelo
leader do júri.
7. Controlo
O leader do júri deve ser um funcionário oficial da autoridade competente; deve ser um membro do júri, responsabili-
zando-se de forma geral por todo o processo. Compete-lhe registar as pontuações individuais para cada atributo no
documento de controlo e verificar se o produto é aceite ou rejeitado.
9. Nomenclatura
Ver quadro 2 em anexo.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/27
Pontos Pontos
Número Número
Pontos Observações (classe de Consistência (classe de Número Flavour
(1) (1) (1)
qualidade) qualidade)
1 Muito fraca (defeitos acentua- 1 Muito fraca (defeitos acentua- 1 Muito fraca (defeitos acentua-
dos) dos) dos)
1 Aquosa, gotas de água visí- 14 Pasta, quebradiça grumosa 22 Sabor estranho,
veis 15 Pastosa, pomada Sabor a queijo
3 Raiada 16 Colante 24 Sabor a queijo ácido
4 Marmoreada 17 Dura 25 Ácido
5 Manchada 18 Mole 26 Fermentado
6 Separação do óleo 28 Sabor a bolor
7 Coloração demasiado intensa 29 Rançosa
9 Granulosa 30 Oleosa, sabor a peixe
10 Matérias estranhas 31 Sebosa
11 Bolorenta 32 Sabor a óxidado
12 Sal não dissolvido Sabor metálico
34 Acre, amarga
36 Sabor a bolor, pútrido
37 Sabor a malte
38 Sabor a produtos químicos
(1) Quadro 2.
(2) Os defeitos da categoria «boa» correspondem apenas a desvios muito ligeiros relativamente ao tipo ideal.
L 37/28 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
I. Aspecto
1. Aquosa, gotas de água visíveis
2. Não homogénea, bicolor
3. Raiada
4. Marmoreada
5. Manchada
6. Separação de óleo
7. Coloração demasiado intensa
8. Inclusão de ar aparente
9. Granulosa
10. Matérias estranhas
11. Bolorenta
12. Sal mal dissolvido
II. Consistência
14. Pasta, quebradiça, grumosa
15. Pastosa, pomada
16. Colante
17. Dura
18. Mole
III. Flavour
20. Falta de aroma
21. Impura (1)
22. Sabor estranho
23. Sabor a velho
24. Sabor a queijo
Sabor a queijo ácido
25. Ácida
26. Fermentada
27. a) Sabor a cozido
b) Sabor a queimado
28. Sabor a bolor
29. Rançosa
30. Sabor a óleo de peixe
31. Sebosa
32. a) Sabor a oxidado
b) Sabor metálico
33. Sabor a forragem
34. Acre, amarga
35. Demasiado salgada
36. Sabor a bolor, pútrido
37. Sabor a malte
38. Sabor a produtos químicos
(1) Esta designação deve ser utilizada o mais raramente possível e apenas quando não seja possível uma definição mais precisa.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/29
ANEXO VIII
(Artigo 7.o)
1. Pode ser efectuada uma nova análise a pedido do operador nos 7 dias úteis seguintes à comunicação dos resultados da
primeira análise, desde que existam duplicados das amostras, selados e armazenados de forma adequada por orga-
nismos competentes.
2. O operador pode enviar as referidas amostras a um segundo laboratório. Esse laboratório deve estar autorizado a
efectuar análises oficiais e ser reconhecido como competente para a realização das análises em questão. A competência
do laboratário deve ser reconhecida com base na participação bem sucedida em estudos interlaboratoriais, em testes de
aptidão ou em comparações interlaboratoriais. O segundo laboratório deve utilizar o método de referência. Os
resultados obtidos pelos dois laborátoios são avaliados do seguinte modo:
em que:
–y: média aritmética de todos os resultados obtidos por ambos os laboratórios
mo: limite
R: reprodutibilidade
r: repetibilidade
n1: número de resultados obtidos pelo laboratório 1
n2: número de resultados obtidos pelo laboratório 2.
Nota: Caso o resultado final seja calculado utilizando as fórmulas
ver, (respectivamente, pontos 3 e 4 do anexo IV), deve substituir-se, nas fórmulas, R2 e r2 por R2x e r2x.
b) Se ambos os laboratórios satisfazerem as exigências de repetibilidade mas não estiverem satisfeitas as exigências de reprodutibi-
lidade
A remessa é rejeitada, caso os resultados de ambos os laboratórios conduzam a tal decisão. Caso contrário, o lote é
aceite.
d) Se nenhum dos laboratórios satisfizer as exigências de repetibilidade mas estiverem preenchidas as exigências de reprodutibili-
dade
Aplica-se o disposto na alínea a).
e) Se nenhum dos laboratórios satisfizer as exigências de repetibilidade e não estiverem preenchidas as exigências de reprodutibili-
dade
A remessa é aceite, caso os resultados obtidos por um dos laboratórios conduzam a tal conclusão.
ANEXO IX
(Artigo 8.o)
2. Referência
3. Definições
Teor de água da manteiga: perda de massa depois de completado o processo de aquecimento descrito nesta norma. É
expresso em gramas por 100 g.
4. Resumo do processo
Evaporação da água de uma toma da amostra numa estufa, na presença de pedra-pomes, à temperatura de 102 °C.
5. Aparelhos e utensílios
6. Colheita de amostras
7. Técnica
Aquecer ligeiramente a amostra num recipiente adequado de plástico ou vidro, fechado, com metade a dois
terços da sua capacidade ocupados, até uma temperatura à qual a manteiga esteja suficientemente amolecida
para poder ser bem homogeneizada por agitação mecânica ou manual vigorosa. A temperatura a que decorre a
agitação não será normalmente superior a 35 °C. Arrefecer a amostra até à temperatura ambiente. Uma vez
concluído o arrefecimento, abrir o recipiente que contém a amostra e remexer brevemente (no máximo durante
10 s) a manteiga com um utensílio apropriado (por exemplo, colher ou espátula) antes de pesagem.
7.2.4. Depositar na cápsula uma toma da amostra de aproximadamente 5 g, pesada com a precisão de 1 mg.
7.2.5. Secar a cápsula na estufa a 102 °C ± 2 °C durante 3 h.
7.2.6. Deixar a cápsula arrefecer no exsicador até à temperatura do compartimento das balanças e pesar com a
precisão de 1 mg.
7.2.7. Repetir o processo de secagem durante períodos suplementares de 1 h, arrefecendo e pesando de cada vez
como descrito em 7.2.6 até massa constante (variação de massa não superior a 1 mg).
Se a massa aumentar, utilizar nos cálculos a menor das massas registadas.
8. Resultados
em que:
m0 é a massa, em grama, da cápsula com a pedra-pomes (7.2.3)
m1 é a massa, em grama, da toma da amostra, da cápsula e da pedra-pomes antes da secagem (7.2.4)
m2 é a massa, em grama, da toma da amostra, da cápsula e da pedra-pomes depois da secagem (7.2.7)
Os resultados são arredondados às décimas.
8.2. Repetibilidade
A diferença absoluta entre os resultados de duas determinações singelas, efectuadas em simultâneo ou uma
imediatamente a seguir à outra pelo mesmo analista, nas mesmas condições e com o mesmo material, não deve
exceder 0,2 %.
8.3. Reprodutibilidade
A diferença absoluta entre dois resultados singelos independentes, obtidos por dois analistas em laboratórios
diferentes com material idêntico, não deve exceder 0,3 %.
9. Relatório
O relatório deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos e fazer refêrencia a todos os aspectos
operacionais não mencionados nesta norma internacional ou entendidos como opcionais. Também devem ser referidos
todos os incidentes que possam ter influenciado os resultados. O relatório deve conter ainda todos os elementos
necessários à identificação completa da amostra.
L 37/32 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO X
(Artigo 8.o)
Esta norma descreve um processo de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda na manteiga.
2. Referências
3. Definições
Teor de resíduo seco isento de matéria gorda da manteiga: percentagem mássica das substâncias determinadas pelo
método descrito. É expresso em gramas por 100 g.
4. Resumo do processo
Evaporação da água de uma massa conhecida de manteiga, extracção da matéria gorda com éter de petróleo e
pesagem do resíduo.
5. Reagentes
Éter de petróleo com intervalo de destilação entre 30 °C e 60 °C. A evaporação de 10 ml deste reagente não deve
produzir mais de 1 mg de resíduos.
6. Aparelhos e utensílios
7. Colheita de amostras
8. Técnica
Aquecer ligeiramente a amostra num recipiente adequado de plástico ou vidro, fechado, com metade a dois
terços da sua capacidade ocupados, até uma temperatura à qual a manteiga esteja suficientemente amolecida
para poder ser bem homogeneizada por agitação mecânica ou manual vigorosa. A temperatura a que decorre
a agitação não será normalmente superior a 35 °C. Arrefecer a amostra até à temperatura ambiente. Uma vez
concluído o arrefecimento, abrir o recipiente que contém a amostra e remexer brevemente (no máximo
durante 10 s) a manteiga com um utensílio apropriado (por exemplo, colher ou espátula) antes da pesagem.
8.2. Determinação
8.2.1. Secar a cápsula com a vareta (6.4) e o cadinho (6.5) na estufa (6.3) durante 1 h. Deixar arrefecer no
exsicador e pesar todos estes objectos (cápsula, vareta e cadinho) em conjunto com a precisão de 1 mg (m0).
8.2.2. Retirar o cadinho e registar a massa da cápsula e da vareta em conjunto, com a precisão de 1 mg (m1).
8.2.3. Depositar na cápsula uma toma de amostra (8.1) de aproximadamente 5 g, pesada com a precisão de 1 mg
(m2).
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/33
8.2.4. Secar a cápsula (com a vareta e a toma de manteiga) na estufa a 102 °C ± 2 °C durante uma noite.
8.2.5. Deixar a cápsula (8.2.3) arrefecer até à temperatura ambiente.
8.2.6. Deitar 15 ml de éter de petróleo ligeiramente aquecido (aproximadamente 25 °C) na cápsula e, com a vareta
de vidro, destacar o máximo de sedimento possível que esteja aderente à cápsula. Transferir o solvente para o
cadinho e filtrar para o frasco de sucção.
8.2.7. Efectuar quatro vezes a operação descrita em 8.2.6 Se, durante a quarta lavagem, já não houver vestígios de
matéria gorda na superfície da cápsula, transferir quantitativamente o máximo possível de sedimento para o
cadinho. Caso contrário, repetir a operação descrita em 8.2.6 até eliminação completa de todos os vestígios
de matéria gorda.
8.2.8. Lavar o sedimento retido no cadinho com 25 ml de éter de petróleo ligeiramente aquecido.
8.2.9. Secar a cápsula, a vareta de vidro e o cadinho, em conjunto, na estufa a 102 °C ± 2 °C durante 30 minutos.
8.2.10. Deixar arrefecer no exsicador até à temperatura ambiente e pesar com a precisão de 1 mg.
8.2.11. Repetir as operações descritas em 8.2.9 e 8.2.10 até massa constante (m3) — variação da massa conjunta da
cápsula, da vareta e do cadinho não superior a 1 mg.
9. Resultados
9.1. Cálculo do teor de resíduo seco isento de matéria gorda
O teor de resíduo seco isento de matéria gorda, SNF, em percentagem mássica é calculado pela seguinte fórmula:
em que:
m é a massa, em grama, da cápsula vazia com a vareta de vidro e o cadinho (8.2.1)
m1 é a massa, em grama, da cápsula vazia com a vareta de vidro (8.2.2)
m2 é a massa, em grama, da toma de amostra, da cápsula e da vareta de vidro (8.2.3)
m3 é a massa final, em grama, da cápsula, da vareta de vidro e do cadinho com o sedimento retido (8.2.11 )
Os resultados são arredondados às décimas.
9.2. Repetibilidade
A diferença absoluta entre os resultados de duas determinações singelas, efectuadas em simultâneo ou uma
imediatamente a seguir à outra pelo mesmo analista, nas mesmas condições e com o mesmo material, não deve
exceder 0,1 %.
9.3. Reprodutibilidade
A diferença absoluta entre dois resultados singelos independentes, obtidos por dois analistas em laboratórios
diferentes com material idêntico, não deve exceder 0,2 %.
10. Relatório
O relatório deve especificar o método utilizado e os resultados obtidos e fazer referência a todos os aspectos
operacionais não mencionados nesta norma internacional ou entendidos como opcionais. Também devem ser
referidos todos os incidentes que possam ter influenciado os resultados. O relatório deve conter ainda todos os
elementos necessários à identificação completa da amostra.
Nota:
Se a amostra analisada for de manteiga com sal, o sal adicionado será contabilizado como resíduo seco isento de
matéria gorda, pelo que, para a determinação do resíduo seco isento de matéria gorda lácteo, haverá que subtrair ao
teor de resíduo seco isento de matéria gorda o teor de sal adicionado. Os valores calculados para os parâmetros de
precisão do método de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda lácteo são os seguintes:
Repetibilidade: r = 0,104 %
Reprodutibilidade: R = 0,206 %
Os valores dos parâmetros de precisão obtidos para o método de determinação do teor de resíduo seco isento de
matéria gorda são, portanto, válidos para o método de determinação do teor de resíduo seco isento de matéria gorda
lácteo.
L 37/34 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO XI
(Artigo 8.o)
O teor de matéria gorda é obtido indirectamente a partir dos valores determinados para os teores de água e de resíduo
seco isento de matéria gorda pelos métodos descritos nos anexos IX e X, respectivamente. A percentagem mássica de
matéria gorda é igual a:
em que:
W é a percentagem mássica de água
SNF é a percentagem mássica de resíduo seco isento de matéria gorda.
Os valores calculados para os parâmetros de precisão do método de determinação do teor de matéria gorda são os
seguintes:
Repetibilidade: r = 0,22 %
Reprodutibilidade: R = 0,36 %.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/35
ANEXO XII
(Artigo 9.o)
O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de vanilina na manteiga, na manteiga
concentrada e na nata.
2. Princípio
Extracção de uma determinada quantidade de amostra com uma mistura isopropanol/etanol/acetonitrilo (1:1:2).
Precipitação da maior parte da matéria gorda por refrigeração (temperatura compreendida entre – 15 e – 20 °C),
seguida de centrifugação.
Após diluição com água, determinação do teor de vanilina por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
3. Equipamento
4. Reagentes
Pesar, com aproximação a 0,1 mg, cerca de 50 mg (mg CM) de vanilina (4.5) num balão aferido de 100 ml,
adicionar 25 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água.
Através de uma pipeta, introduzir 5 ml de solução-mãe de vanilina (4.5.1) num balão aferido de 250 ml e
completar com água.
4.6. Metanol de qualidade para HPLC.
4.7. Ácido acético glacial.
4.8. Água de qualidade para HPLC.
L 37/36 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
5. Procedimento
5.1.1. M a n t e i g a
Aquecer a amostra até a mesma começar a fundir. Evitar o sobreaquecimento parcial da amostra a mais de
40 °C. Quando a amostra se tornar suficientemente plástica, homogenizá-la por agitação. Mexer a manteiga
durante 15 s antes de tomar uma porção. Introduzir num balão aferido de 100 ml uma porção de cerca de 5 g
(g SM) de manteiga e pesar com aproximação a 1 mg.
5.1.2. M a n t e i g a c o n c e n t r a d a
Imediatamente antes da amostragem, colocar numa estufa a 40-50 °C o recipiente que contém a manteiga
concentrada até à fusão completa da mesma. Misturar a amostra agitando-a ou mexendo-a; evitar a formação de
bolhas de ar. Introduzir num balão aferido de 100 ml cerca de 4 g (g SM) de manteiga concentrada e pesar
com aproximação a 1 mg.
5.1.3. N a t a
Aquecer a amostra em banho-maria ou numa estufa a uma temperatura de 35 à 40 °C. Repartir a gordura de
forma homogénea por agitação e, se necessário, mexendo-a. Arrefecer a amostra rapidamente (20 ± 2 °C). A
amostra deve apresentar um aspecto homogéneo; em caso contrário, recomeçar a operação. Introduzir num
balão aferido de 100 ml cerca de 10 g (g SM) de nata e pesar com aproximação a 1 mg.
Adicionar cerca de 75 ml de solução de extracção (4.4) à toma de ensaio (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), agitar ou
sacudir vigorosamente durante cerca de 15 min e completar o volume com a solução de extracção (4.4).
Transferir cerca de 10 ml do extracto obtido para um tubo de ensaio munido de rolha. Colocar o tubo de
ensaio no congelador (3.1) e deixar repousar durante cerca de 30 min. Centrifugar o extracto frio durante cerca
de 5 minutos a cerca de 2 000 rpm e decantar de imediato. Deixar arrefecer à temperatura ambiente a solução
decantada. Introduzir com uma pipeta 5 ml da solução decantada num balão aferido de 100 ml e completar o
volume com água. Filtrar uma alíquota com um microfiltro de membrana (3.3). O filtrado encontra-se pronto
para a determinação por HPLC.
5.3. Calibração
Introduzir com uma pipeta 5 ml de solução-padrão de vanilina (4.5.2) num balão aferido de 100 ml.
Adicionar 5 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água até à marca. A solução resultante contém
0,5 µg/ml de vanilina.
Estabilizar o sistema cromatográfico durante cerca de 30 minutos. Injectar a solução-padrão (5.3) e repetir o
processo até que a diferença entre as áreas ou as alturas dos picos correspondentes a duas injecções consecu-
tivas seja inferior a 2 %. Nas condições descritas, o tempo de retenção da vanilina é cerca de 9 minutos. Analisar
a solução-padrão (5.3) em duplicado, injectando um volume de 20 µl. Injectar 20 µl das soluções a analisar
(5.2). Determinar a área ou a altura de cada pico de vanilina obtido. Repetir o duplicado da solução-padrão (5.3)
após 10 injecções de soluções a analisar (5.2).
Calcular a área (ou a altura) média (AC) dos picos da vanilina correspondentes às injecções em duplicado que
delimitam cada lote de soluções a analisar (quatro áreas no total).
R = AC/CM
O teor (mg/kg) de vanilina (C) da amostra de ensaio é dado pela seguinte fórmula:
em que:
7. Precisão do método
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas num intervalo tão breve quanto possível por
um único operador, utilizando o mesmo equipamento, com material de ensaio idêntico, não deve exceder
16 mg/kg.
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes,
utilizando equipamento diferente, com material de ensaio idêntico, não deve exceder 27 mg/kg.
8. Limites e tolerância
8.1. Devem colher-se três amostras do produto marcado, de modo a verificar a respectiva homogeneidade.
8.2.2. Para verificar a taxa e a homogeneidade da incorporação do marcador, utilizam-se os resultados obtidos para as
três amostras na análise do produto, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes limites
[tendo em conta a diferença crítica, para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:
— 221,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),
— 159,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).
A concentração do marcador na amostra que origina o resultado mais reduzido é utilizada por interpolação
entre 221,0 mg/kg e 159,0 mg/kg.
8.3. Marcador obtido exclusivamente a partir de vagens de baunilha ou de extractos integrais das mesmas.
8.3.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a
homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados com os seguintes limites
[tendo em conta a diferença crítica, para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:
— 79,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),
— 54,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).
A concentração do marcador na amostra que origina o resultado mais reduzido é utilizada por interpolação
entre 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg.
9. Notas
9.1. A repetibilidade r é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos obtidos por
aplicação do mesmo método à mesma amostra nas mesmas condições (mesmos aparelhos, mesmo laboratório,
num curto intervalo de tempo) tem uma determinada probabilidade de se situar; salvo indicação em contrário,
essa probabilidade é de 95 %.
L 37/38 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
9.2. A reprodutibilidade R é o valor abaixo do qual a diferença absoluta entre dois resultados analíticos obtidos por
aplicação do mesmo método à mesma amostra em condições diferentes (analistas diferentes, aparelhos dife-
rentes, laboratórios diferentes e/ou momentos diferentes) tem uma determinada probabilidade de se situar; salvo
indicação em contrário, essa probabilidade é de 95 %.
9.3. Para uma taxa de incorporação de 250 mg/kg de buteroil a taxa de recuperação de vanilina adicionada varia
entre 97,0 e 103,8 %. O teor médio determinado foi de 99,9 %, com desvio-padrão de 2,7 %.
9.4. A solução-padrão contém 5 % de solução de extracção para compensar o alargamento dos picos provocado
pela presença de 5 % da solução de extracção das tomas para análise. Tal permite que se proceda à quantificação
com base na altura dos picos.
9.5. A análise baseia-se numa curva de calibração linear com ordenada na origem zero.
Utilizando para o efeito diluições apropriadas da solução-padrão (4.5.2), deve confirmar-se a linearidade na
primeira vez que se efectuem as análises e, posteriormente, a intervalos regulares e depois de qualquer
modificação ou reparação do equipamento de HPLC.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/39
ANEXO XIII
(Artigo 9.o)
O método descreve um processo para a determinação quantitativa do éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico (éster
apocaroténico) na manteiga e na manteiga concentrada. O éster apocaroténico é a soma de todas as substâncias que
absorvem a luz a 440 nm presentes num extracto de amostras obtidas nas condições descritas no método.
2. Princípio
A matéria gorda da manteiga é dissolvida em éter de petróleo e a absorvância medida a 440 nm. O teor de éster
apocaroténico é determinado por referência a um padrão externo.
3. Equipamento
3.2. Espectrofotómetro adequado para utilização a 440 nm (e 447-449 nm) e equipado com células de 1 cm de
percurso óptico.
4. Reagentes
Pesar com uma aproximação de 0,1 mg cerca de 0,100 g de suspensão de éster apo-caroténico (4.1.1 ) (Wg),
dissolver em éter de petróleo (4.2), transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 ml e
completar o volume até à marca com éter de petróleo.
5. Procedimento
5.1.1. M a n t e i g a c o n c e n t r a d a
5.1.2. M a n t e i g a
Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C e filtrar uma quantidade representativa com um filtro que
contenha cerca de 10 g de sulfato de sódio anidro (4.3), num meio ao abrigo de luz natural ou artificial forte
mantido à temperatura de 45 °C. Recolher uma quantidade adequada de matéria gorda da manteiga.
5.2. Determinação
Pesar com uma aproximação de 1 mg cerca de 1 g de manteiga concentrada ou de matéria gorda da manteiga
extraída (5.1.2). Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 20 ml (Vml) utilizando éter de
petróleo (4.2), completar até à marca e misturar cuidadosamente.
Transferir uma alíquota para uma célula de 1 cm e medir a absorvância a 440 nm, relativamente a um branco
de éter de petróleo. Obter a concentração de éster apocaroténico na solução a partir do gráfico de calibração (C
µg/ml).
Pipetar 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 ml de solução-padrão de éster apocaroténico (4.1.2) para cinco balões
volumétricos de 100 ml. Diluir com éter de petróleo (4.2) até perfazer o volume e misturar.
As concentrações aproximadas das soluções variam de 0 a 2 µg/ml e são calculadas rigorosamente a partir da
concentração da solução-padrão (4.1.2) (W.P)/100 mg/ml. Medir as absorvâncias a 440 nm relativamente a um
branco de éter de petróleo.
Traçar um gráfico com os valores da absorvância no eixo das ordenadas e as concentrações do éster
apocaroténico no eixo das abcissas.
7. Precisão do método
7.1. Repetitividade
7.1.1. A n á l i s e d a m a n t e i g a
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas imediatamente uma após outra pelo mesmo
operador, utilizando o mesmo equipamento e uma amostra idêntica, não deve exceder 1,4 mg/kg.
7.1.2. A n á l i s e d a m a n t e i g a c o n c e n t r a d a
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas imediatamente uma após outra pelo mesmo
operador, utilizando o mesmo equipamento e uma amostra idêntica, não deve exceder 1,6 mg/kg.
7.2. Reprodutibilidade
7.2.1. A n á l i s e d a m a n t e i g a
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores diferentes em laboratórios
diferentes, com equipamento diferente e uma amostra idêntica, não deve exceder 4,7 mg/kg.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/41
7.2.2. A n á l i s e d a m a n t e i g a c o n c e n t r a d a
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores diferentes em laboratórios
diferentes, com equipamento diferente e uma amostra idêntica, não deve exceder 5,3 mg/kg.
8. Limites de tolerância
8.1. Devem ser colhidas três amostras do produto marcado para verificar se a marcação foi efectuada correctamente.
8.2. Manteiga
8.2.1. A taxa de incorporação para a manteiga, tendo em conta a absorvância de fundo, é de 22 mg/kg.
8.2.2. Utilizam-se os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto para verificar a taxa e a
homogeneidade da incorporação do marcador, comparando o menor dos resultados em causa com os seguintes
limites [tendo em conta a diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]:
— 18,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima),
— 13,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima).
A concentração do marcador na amostra que dá o resultado mais baixo é utilizado por interpolação entre
18,0 mg/kg e 13,0 mg/kg.
ANEXO XIV
(Artigo 9.o)
2. Princípio
A manteiga é saponificada com uma solução etanólica de hidróxido de potássio; os insaponificáveis são extraídos com
éter etílico.
Os esteróis são convertidos em éteres trimetilsilílicos e analisados por cromatografia em fase gasosa com coluna
capilar, tomando como referência um padrão interno de betulina.
3. Equipamento
3.1. Balão de saponificação de 150 ml munido de um refrigerante de refluxo com juntas esmeriladas.
3.4. Balões de 250 mililitros ou uma capacidade similar, para equilíbrio da pressão, para a recolha do éter etílico
evaporado.
3.5. Coluna de vidro, com 350 mm x 20 mm, munida de tampa de vidro sinterizado.
3.8. Cromatógrafo de fase gasosa utilizável com coluna capilar, que disponha de um sistema de divisão da amostra
sendo constituído por:
3.8.1. Câmara termostática para colunas com a possibilidade de manter a temperatura desejada com uma precisão
de ± 1 °C.
3.8.2. Unidade de vaporização com regulação de temperatura.
3.8.3. Detector de ionização de chama com conversor-amplificador.
3.8.4. Integrador-registador adequado ao conversor-amplificador (3.8.3).
3.9. Coluna capilar de sílica fundida totalmente revestida com BP1 ou equivalente, com uma espessura uniforme
de 0,25 µm; a coluna deve permitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanosterol e do
sitosterol. É adequada uma coluna com 0,2 mm de diâmetro interno e 12 m de comprimento, revestida com
BP1.
3.10. Microsseringa de 1µl com agulha de aço temperado, para cromatografia em fase gasosa.
4. Reagentes
Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser água destilada ou água de grau
de pureza pelo menos equivalente.
4.2. Solução de hidróxido de potássio a 60 %. Dissolver 600 g de hidróxido de potássio (pureza mínima 85 %) em
água e completar com água até perfazer 1 l.
4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada para a determinação do sitosterol deve ser de 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. A concentração da solução de betulina utilizada para a determinação do estigmasterol deve ser de 0,4 mg/ml.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/43
4.5. Sulfate de sódio anidro granulado, previamente seco a 102 °C durante duas horas.
4.6. Reagente de sililação, por exemplo, TRI-SIL (comercializado, nomeadamente, por Pierce Chemical Co, Cat
n.o 49001 ), ou equivalente (Atenção: o TRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e, possivelmente, cancerígeno.
O pessoal do laboratório deve estar familiarizado com os cuidados a ter com o TRI-SIL e tomar as precauções
apropriadas).
4.7. Lanosterol.
4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar uma solução aproximadamente 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) em
éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.
4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar uma solução aproximadamente 0,2 mg/ml (W1) de estigmasterol
(4.9) em éter etílico (4.4), com a precisão de 0,001 mg/ml.
4.10. Solução para teste da resolução: preparar uma solução que contenha 0,05 mg de lanosterol (4.7) e 0,5 mg de
sitosterol (4.8) por mililitro, em éter etílico (4.4).
5. Técnica
5.1. Preparação das soluções-padrão para cromatografia: o padrão interno (4.3.1) deve ser adicionado à solução-
-padrão do esterol apropriado ao mesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).
5.2.1. Fundir a amostra de manteiga por aquecimento a uma temperatura não superior a 35 °C, misturando por
agitação.
Pesar para um balão de 150 ml (3.1), com a precisão de 1 mg, cerca de 1 g de manteiga (W2). Adicionar 50
mililitros de etanol (4.1) e 10 mililitros da solução de hidróxido de potássio (4.2). Adaptar o condensador de
refluxo e aquecer a cerca de 75 °C, durante 30 minutos. Retirar o condensador e arrefecer o balão até à
temperatura ambiente, aproximadamente.
5.2.2. Adicionar ao balão 1,0 ml do padrão interno (4.3.1.1) caso se pretenda determinar o sitosterol, ou 1,0 ml de
(4.3.1.2), caso se pretenda determinar o estigmasterol. Homogeneizar completamente. Transferir quantitativa-
mente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 mililitros (3.2), procedendo a lavagens
com 50 mililitros de água e 250 mililitros de éter etílico (4.4). Agitar a ampola de decantação vigorosamente,
durante dois minutos, e deixar as fases separarem-se. Escoar a fase aquosa inferior e proceder à lavagem da
fase etérea, agitando a ampola com quatro alíquotas sucessivas de 100 mililitros de água.
Nota 2: Para evitar a formação de uma emulsão e essencial que as duas primeiras lavagens com água sejam
efectuadas com precaução (procedendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode-se agitar vigorosa-
mente durante 30 segundos. No caso de se formar uma emulsão, esta pode ser eliminada através da
adição de 5 a 10 mililitros de etanol. Se se adicionar etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens
vigorosas com água.
5.2.3. Passar a fase etérea, límpida e isenta de sabões, por uma coluna de vidro (3.5), contendo 30 gramas de sulfato
de sódio anidro (4.5). Recolher a fase etérea num balão de 250 mililitros (3.3). Introduzir um regularizador de
ebulição e evaporar quase até à secura por recurso a um banho de água ou a uma manta de aquecimento;
recolher os solventes evaporados.
Nota 3: Se o extracto que contém a amostra for levado à secura total, a temperaturas muito elevadas, podem
ocorrer perdas de esteróis.
L 37/44 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
5.3.1. Como o auxílio de 2 ml de éter etílico, transferir do balão para um tubo de ensaio de 2 ml (3.7) a solução
etérea remanescente e remover o éter com uma corrente de azoto. Lavar o balão com mais duas alíquotas de
2 ml de éter etílico, transferindo-as para o tubo de ensaio e removendo o éter, cada uma das vezes, com uma
corrente de azoto.
5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando um mililitro de TRI-SIL (4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar
vigorosamente, para dissolver. No caso de a dissolução ser incompleta, aquecer a 65-70 °C. Deixar em
repouso durante, pelo menos, cinco minutos antes de proceder à injecção no cromatógrafo de fase gasosa.
Proceder à sililação dos padrões do mesmo modo que as amostras. Proceder à sililação da solução para testes
da resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras.
Nota 4: A sililação deve ser efectuada na ausência de água. A sililação incompleta da betulina é revelada pela
presença de um segundo pico, próximo do pico correspondente à betulina.
A presença de etanol durante a sililação interfere no processo podendo resultar de lavagem inadequada na
etapa de extracção. Se este problema persistir, poderá ser efectuada uma quinta lavagem, com agitação
vigorosa durane 30 segundos, na etapa de extracção.
Deixar que o sistema atinja o equilíbrio e obter uma resposta suficientemente estável antes de iniciar as
análises.
As condições indicadas podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase
gasosa, de modo a obter cromatogramas que obedeçam às seguintes condições:
— o pico do sitosterol deve distinguir-se claramente do pico do lanosterol. A figura 1 mostra o cromato-
grama típico que deve ser obtido com a solução para teste da resolução (4.10), depois de submetida a
sililação.
— os tempos de retenção relativos dos esteróis a seguir referidos devem ser, aproximadamente:
colesterol : 1,0
estigmasterol: 1,3
sitosterol: 1,5
betulina: 2,5
— o tempo de retenção da betulina deve ser, aproximadamente, de 24 minutos.
6.1. Determinar as áreas dos picos do esterol e da betulina nos padrões que delimitam cada série de amostras e
calcular R1:
Determinar a área do pico do esterol (estigmasterol e sitosterol) e do pico da betulina na amostra e calcular
R2:
7. Precisão do método
7.1. Manteiga
7.1.1. Repetibilidade
7.1.1.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível
pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder
19,3 mg/kg.
7.1.1.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível
pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder
23,0 mg/kg.
7.1.2. Reprodutibilidade
7.1.2.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes,
utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 31,9 mg/kg.
7.1.2.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes,
utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 8,7 % da média das
determinações.
Os dados relativos à precisão foram determinados com base num ensaio efectuado em 1992, que envolveu
oito laboratórios, seis amostras (três duplicados em teste cego) de estigmasterol e seis amostras (três
duplicados em teste cego) para o sitosterol.
L 37/46 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
7.2.1. Repetibilidade
7.2.1.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível
pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder
10,2 mg/kg.
7.2.1.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível
pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder
3,6 % relativamente à média das determinações.
7.2.2. Reprodutibilidade
7.2.2.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por operadores de laboratórios diferentes,
utilizando equipamento diferente e testando o mesmo material, não deve exceder 25,3 mg/kg.
7.2.2.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível
pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder
8,9 % relativamente à média das determinações.
Os dados relativos à precisão foram determinados com base num ensaio efectuado em 1992, que envolveu
oito laboratórios, seis amostras (três duplicados em teste cego) de estigmasterol e seis amostras (três
duplicados em teste cego) para o sitosterol.
8. Tolerâncias
8.1. Para verificar se o produto foi marcado de forma adequada, devem colher-se três amostras do produto
marcado.
8.2. Manteiga
8.2.1. Estigmasterol
8.2.1.1. A taxa de incorporação de estigmasterol é de 150 gramas de estigmasterol com grau de pureza de, pelo
menos, 95 % por tonelada de manteiga, isto é, 142,5 mg/kg; ou 170 gramas de estigmasterol com grau de
pureza de, pelo menos, 85 % por tonelada de manteiga, isto é, 144,5 mg/kg.
8.2.1.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da
distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a
diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]
— 116,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 95 %),
— 118,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 85 %),
— 81,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 95 %),
— 82,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o estigmasterol com grau de pureza 85 %).
A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre
116,0 mg/kg e 81,0 mg/kg ou entre 118,0 mg/kg et 82,0 mg/kg, respectivamente.
8.2.2. Si t o s t e r o l
8.2.2.1. A taxa de incorporação do sitosterol é de 600 g de sitosterol com grau de pureza de, pelo menos, 90 % por
tonelada de manteiga, isto é, 540 mg/kg.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/47
8.2.2.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da
distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a
diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]
— 486,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o sitosterol com grau de pureza 90 %),
— 358,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o sitosterol com grau de pureza 90 %).
A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre
486,0 mg/kg e 358,0 mg/kg.
8.3.1. Estigmasterol
8.3.1.1. A taxa de incorporação de estigmasterol é de 150 g de estigmasterol com grau de pureza de, pelo menos,
95 % por tonelada de manteiga concentrada, isto é, 142,5 mg/kg; ou 170 g de estigmasterol com grau de
pureza de, pelo menos, 85 % por tonelada de manteiga concentrada, isto é, 144,5 mg/kg.
8.3.1.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da
distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a
diferença crítica para uma probabilidade de 95 % DCr95)]
— 120,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 95 %),
— 122,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 85 %),
— 84,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 95 %),
— 86,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o stigmasterol com grau de pureza 85 %).
A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre
120,0 mg/kg e 84,0 mg/kg ou entre 122,0 mg/kg e 86,0 mg/kg, respectivamente.
8.3.2. Si t o s t e r o l
8.3.2.1. A taxa de incorporação do sitosterol é de 600 g de sitosterol com grau de pureza de, pelo menos, 90 % por
tonelada de manteiga concentrada, isto é, 540 mg/kg.
8.3.2.2. O menor dos resultados obtidos na análise do produto é utilizado para verificar a homogeneidade da
distribuição do marcador. Tal é efectuado por comparação com os seguintes limites [tendo em conta a
diferença crítica para uma probabilidade de 95 % (DCr95)]
— 486,0 mg/kg (95 % da taxa de incorporação mínima para o sistosterol com grau de pureza 90 %),
— 358,0 mg/kg (70 % da taxa de incorporação mínima para o sistosterol com grau de pureza 90 %).
A concentração de marcador na amostra com o menor dos resultados é obtida por interpolação entre
486,0 mg/kg e 358,0 mg/kg.
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7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/49
L 37/50 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/51
ANEXO XV
Artigo 10.o
1. Objectivo
Detecção de leite de vaca e caseinatos em queijos produzidos com leite de ovelha, de cabra, de búfala ou com misturas
de leite de ovelha, de cabra e de búfala por focalização isoeléctrica de γ(caseínas) após plasminólise.
2. Campo de aplicação
O método é adequado para uma detecção sensível e específica da caseína de leite de vaca nativa e tratada pelo calor em
queijos frescos e curados produzidos com leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala ou com misturas de leite de
ovelha, de cabra e de búfala. Não é adequado para a detecção de leite e queijo adulterados por concentrados proteicos
de soro bovino tratados pelo calor.
3. Fundamento do método
4. Reagentes
Salvo outra indicação, devem ser utilizados reagentes de qualidade analítica. A água deve ser bidestilada ou de pureza
equivalente.
Nota: As especificações seguintes aplicam-se a géis de poliacrilamida que contenham ureia, de dimensões
265 × 125 × 0,25 mm preparados em laboratório. Em caso de utilização de outras dimensões e tipos de gel, as
condições de separação devem ser ajustadas.
Focalização isoeléctrica
Dissolver:
4,85 g de acrilamida
0,15 g N,N'-metileno-bis-acrilamida (BIS)
48,05 g de ureia
15,00 g de glicerol (87 % p/p),
em água e perfazer até 100 ml. Armazenar em recipiente de vidro de cor âmbar no frigorífico.
Nota: Pode de ser usada, de preferência, uma solução disponível no comércio de acrilamida/BIS previamente
misturada em vez das acrilamidas neurotóxicas com as massas fixadas referidas. Caso essa solução
contenha 30 % (p/v) de acrilamida e 0,8 % (p/v) de BIS, deve ser utilizado na formulação um volume de
16,2 ml em vez das massas fixadas. A solução pode ser armazenada durante um período máximo de
10 dias. Se a sua condutividade for superior a 5 µS, proceder a uma desionização por agitação com 2 g
de Amberlite MB-3 durante 30 minutos, seguida de filtração através de membrana de 0,45 µm.
L 37/52 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
(1) Os produtos Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia) e Resolyte pH 5-7 e pH 6-8 (BDH, Merck) mostraram-se especialmente
adequados para a obtenção da necessária separação das γ-caseínas.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/53
4.8. Padrões
4.8.1. Padrões de referência certificados de uma mistura de leite desnatado e coagulado de ovelha e de cabra com
0 % e 1 % de leite de vaca estão disponíveis no Instituto de Materiais e Medidas de Referência da Comissão,
B-2440 Geel.
4.8.2. Preparação de padrões laboratoriais provisórios de leite de búfala coagulado com 0 % e 1 % de leite de vaca.
O leite desnatado é preparado por centrifugação de leite cru de búfala ou de vaca a 37 °C a 2 500 g durante
20 minutos. Após arrefecimento rápido do tubo e do seu conteúdo para 6-8 °C, a camada superior de
gordura é totalmente retirada. Para a preparação do padrão a 1 %, adicionar 5,00 ml de leite de vaca
desnatado a 495 ml de leite desnatado de búfala num copo de 1 litro, ajustar o pH a 6,4 através da adição de
ácido láctico diluído (10 % p/v). Ajustar a temperatura a 35 °C e adicionar 100 µl de coalho de vitelo
(actividade do coalho: 1: 10 000, c. 3 000 U/ml), agitar durante um minuto e deixar o copo coberto com
uma folha de alumínio a 35 °C durante uma hora a fim de permitir a formação de requeijão. Após a
coagulação, todo o leite coalhado é liofilizado sem homogeneização prévia ou escorrimento do soro de leite.
Após liofilizada, a amostra é moída finamente a fim de produzir um pó homogéneo. Para a preparação do
padrão a 0 %, proceder do mesmo modo, com leite desnatado puro de búfala. Os padrões devem ser
conservados a – 20 °C.
Nota: É aconselhável verificar a pureza do leite de búfala através da focalização isoeléctrica das caseínas
tratadas com plasmina antes da preparação dos padrões.
4.9. Fixador
Misturar 500 ml de metanol e 200 ml de ácido acético glacial e perfazer até 2 000 ml com água destilada.
Nota: Preparar a solução de descoloração todos os dias; esta pode ser facilmente preparada misturando
volumes iguais de soluções-mãe de metanol a 50 % (v/v) e de acético glacial a 20 % (v/v).
Dissolver 3,0 g de azul de Comassie G 250 (Color Index 42655) em 1 000 ml de metanol a 90 % (v/v),
utilizando um agitador magnético (aproximadamente 45 minutos) e filtrar através de dois filtros de pregas de
velocidade média.
Misturar 125 ml de cada uma das soluções-mãe (4.11.1, 4.11.2) imediatamente antes da coloração.
5. Aparelhos e utensílios
5.1. Placas de vidro (265 × 125 × 4 mm) rolos de borracha (espessura: 15 cm); mesa de nivelamento
5.3. Folha de cobertura (280 × 125 mm). Colar uma faixa de fita adesiva (280 × 6 × 0,25 mm) a cada uma das
margens mais longas (ver figura 1).
5.4. Câmara de electrofocalização com placa de arrefecimento (por exemplo 265 × 125 mm) com um gerador de
potência adequada (≥ 2,5 kV) ou aparelho automático de electroforese
6. Técnica
Ligar o termóstato de arrefecimento a 12 °C. Limpar o reverso da folha de suporte do gel com querosene e,
em seguida, deitar algumas gotas de querosene (4.2) para o centro do bloco de arrefecimento. Aplicar a
sanduíche de gel (desenrolada), com o lado de suporte para baixo e para dentro, tendo o cuidado de evitar
bolhas de ar. Limpar qualquer excesso de querosene e retirar a folha de cobertura. Impregnar os eléctrodos
com as soluções de electrólise (4.3, 4.4), cortar segundo o comprimento do gel e colocar nas posições
previstas (a distância dos eléctrodos deve ser de 9,5 cm).
(1) Aplicação da amostra: após pré-focalizar (fase 1), pipetar 18 µl da amostra e das soluções-padrão para os aplicadores de
amostras (10 × 5 mm), colocá-los no gel com intervalos de 1 mm e 5 mm longitudinalmente a partir do ânodo e
pressionar ligeiramente. Efectuar a focalização nas condições supra e remover cuidadosamente os aplicadores de amostras
após 60 minutos de focalização da amostra.
Nota: Se a espessura ou largura dos géis forem alteradas, os valores da corrente eléctrica e da potência têm de
ser devidamente adaptados (por exemplo, duplicar os valores da corrente eléctrica e da potência se for
utilizado um gel de 265 × 125 × 0,5 mm).
6.3.2. Exemplo de um programa de voltagem para um aparelho automático de electroforese (dois géis de
5,0 × 4,5 cm), eléctrodos sem placas aplicados directamente no gel
Retirar os eléctrodos de placas imediatamente após desligar a corrente e colocar logo o gel numa placa de
coloração/descoloração cheia com 200 ml de fixador (4.9); deixar durante 15 minutos, agitando continua-
mente.
Escorrer a totalidade do fixador e lavar a placa de gel duas vezes, durante 30 segundos de cada vez, com
100 ml da solução de descoloração (4.10). Decantar a solução de descoloração e encher a placa com 250 ml
de solução de coloração (4.11.3); deixar corar durante 45 minutos agitando suavemente.
L 37/56 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
7. Avaliação
A avaliação é efectuada por comparação da disposição das bandas da amostra com as das amostras de referência no
mesmo gel. A detecção de leite de vaca nos queijos produzidos com leite de ovelha, leite de cabra e leite de búfala ou
com misturas de leites de ovelha, de cabra e de búfala é efectuada através das γ2 e γ3-caseínas, cujos pontos
isoeléctricos variam entre pH 6,5 e pH 7,5 (figuras 4a, 4b e figura 5). O limite de detecção é inferior a 0,5 %.
8. Referências
1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of
plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing
of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).
2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to
detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese ussing immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).
3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: «Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier
ampholyte/immobilised pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier» in: Electro-
phoresis-Forum 89 (B. J. Radola Ed.) pp. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).
4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweiss von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch
isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199
(1982).
5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-1001 µm polyacrylamide gels on silanised glass plates or
polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/57
Figura 2: Camada de caseína a flutuar entre as fases aquosas e orgânica após centrifugação
Figura 4a: Focalização isoeléctrica (FIE) das caseínas tratadas com plasmina de queijo produzido com leite de ovelha e de
cabra com diferentes quantidades de leite de vaca
% CM = percentagem de leite de vaca; C = vaca; E = ovelha; G =cabra.
Apresenta-se a metade superior do gel de FIE.
Figura 4b: Focalização isoeléctrica (FIE) das caseínas tratadas com plasmina de queijo produzido com mistura de leite de
ovelha, de cabra e de búfala com diferentes quantidades de leite de vaca.
% CM = percentagem de leite de vaca; 1 + = amostra com 1 % de leite de vaca e com adição de caseína bovina
pura e meio de percurso; C = vaca; E = ovelha; G = cabra; B = búfala.
Apresenta-se a distância de separação total do gel de FIE.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/59
Figura 5: Sobreposição de densitogramas de amostras de padrões (STD) e de queijo produzido com uma mistura de leite
de ovelha e de cabra após focalização isoeléctrica.
a,b = padrões com 0 e 1 % de leite de vaca; c-g = amostras de queijo que contêm 0,1,2,3 e 7 % de leite vaca;
C = vaca; E = ovelha; G = cabra.
A metade superior do gel foi examinada a γ = 634 nm.
L 37/60 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO XVI
(Artigo 11.o)
No caso de a manteiga ser testada para a detecção da presença de coliformes, inocular-se-ão no meio de cultura amostras
correspondentes a 1 g de manteiga.
No caso de o leite em pó desnatado ou a caseína/caseinatos serem testados para a detecção da presença de coliformes,
inocular-se-ão no meio de cultura amostras correspondentes a 0,1 g.
É aplicável a norma FIL 73A/1985, método B, com as seguintes alterações:
1) A amostra é preparada segundo a norma FIL 122B:1992. Para a caseína ácida, pode, em alternativa, recorrer-se ao
processo de preparação da amostra descrito na norma FIL 73A/1985.
2) Apenas são submetidos a incubação e avaliados os tubos inoculados com amostras de 1 g (manteiga) ou de 0,1 g
(leite em pó desnatado, caseína/caseinatos). Não são feitas diluições decimais.
Observação
Teor de coliformes: 1/10 g de manteiga, 1/g de leite em pó desnatado ou de caseína/caseinatos em média:
Os resultados que indicam que a exigência é satisfeita são obtidos com uma probabilidade de 93 %.
Teor de coliformes: 1/g de manteiga, 1/0,1 g p de leite em pó desnatado ou de caseína/caseinatos em média:
Os resultados que indicam que a exigência não é satisfeita são obtidos com uma probabilidade de 91 %.
(Hipótese: Distribuição de Poisson)
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/61
ANEXO XVII
(Artigo 12.o)
PARTE I
1. Domínio de aplicação
2. Princípio
Dissolver os açúares em água. Fazer actuar a levedura (Saccharomyces cerevisiae) que não altera a lactose. Determinar o
teor de lactose da solução, segundo o método de Luff-Schoorl, após decantação e filtração.
3. Reagentes
Indicador: solução de amido. Adicionar a 1 litro de água ebuliente uma mistura de 5 g de amido solúvel (juntar,
eventualmente, 10 mg de iodeto de mercúrio como agente de conservação) e de 30 ml de água; manter esta mistura
em ebulição durante 3 minutos; deixar arrefecer.
Reagente de Luff-Schoorl:
Deitar b) em c) (após arrefecimento), agitando cuidadosamente, e juntar de seguida a). Completar até 1 litro, deixar
repousar durante uma noite e filtrar. Verificar a normalidade do reagente assim obtido (0,1 N em Cu, 2 N em
Na2CO3). O pH deve ser próximo de 9,4.
Solução de Carrez I: dissolver 23,8 g de Zn (C2H3O2)2.2H2O e 3 g de ácido acético glacial em água e completar até
100 ml.
Solução de Carrez II: dissolver 10,6 g de K4Fe(CN)6.3H2O em água e completar até 100 ml.
Grânulos de pedra-pomes, fervidos em ácido clorídrico, lavados em água e secos; suspensão de Saccharomyces cerevisiae:
25 g de levedura fresca em 100 ml de água (não conservar mais de uma semana no frigorífico).
4. Modo operatório
Pesar, com rigor ao mg, 1 g da amostra a analisar, introduzir esta quantidade num balão aferido de 100 ml. Juntar 25
a 30 ml de água. Colocar o balão, em banho-maria, em ebulição, durante 30 minutos; arrefecer, seguidamente, até
cerca de 35 °C.
Juntar 5 ml da suspensão da levedura e agitar. Manter o balão aferido e o seu conteúdo, em banho-maria, à
temperatura de 38 a 40 °C.
Após a fermentação, arrefecer até cerca de 20 °C. Juntar 2,5 ml de solução de Carrez I e agitar durante 30 segundos;
juntar seguidamente 2,5 ml da solução de Carrez II e agitar novamente durante 30 segundos. Completar, até 100 ml,
com água, misturar e filtrar. Pipetar uma quantidade de filtrado que não exceda 25 ml e que contenha, de preferência
40 a 80 mg de lactose; se necessário, completar, até 25 ml, com água e determinar o teor em lactose anidro segundo
Luff-Schoorl.
PARTE II
TABELA
Tabela para 25 ml de reagente de Luff-Schorrl
(ver condições no texto)
1 2 1 2
ml mg Diferença ml mg Diferença
1 3,6 12 44,6
3,7 3,8
2 7,3 13 48,4
3,7 3,8
3 11,0 14 52,2
3,7 3,8
4 14,7 15 56,0
3,9
3,7
16 59,9
5 18,4
3,9
3,7
17 63,8
6 22,1
3,9
3,7
18 67,7
7 25,8
4,0
3,7
19 71,7
8 29,5
4,0
3,7 20 75,7
9 33,2 4,1
3,8 21 79,8
10 37,0 4,1
3,8 22 83,9
11 40,8 4,1
3,8 23 88,0
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/63
ANEXO XVIII
(Artigo 13.o)
2. Referência
Norma internacional ISO 707 — Leite e produtos lácteos — Métodos de amostragem, conformes às indicações
contidas no n.o 2, alínea c), último parágrafo, do anexo I.
3. Definição
Teor em glicomacropéptidos no leite em pó desnatado: teor em substâncias determinado de acordo com o método a
seguir descrito e expresso em percentagem em massa.
4. Princípio
— Reconstituição do leite em pó desnatado, eliminação das gorduras e proteínas com ácido tricloroacético e
centrifugação,
— determinação da quantidade de glicomacropéptidos (GMP) presentes no sobrenadante por cromatografia líquida de
alta resolução (CLAR),
— avaliação dos resultados obtidos nas amostras por comparação com amostras-padrão constituídas por leite em pó
desnatado com ou sem adição de uma percentagem conhecida de lactossoro em pó.
5. Reagentes
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida. A água utilizada deve ser destilada ou água de pureza
pelo menos equivalente.
Filtrar a solução eluente antes de a utilizar, através de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 µm.
5.4. Amostras-padrão
5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaz as exigências do presente regulamento, seja [0].
5.4.2. Idêntico leite em pó desnatado adulterado com 5 % (m/m) de lactossoro e pó de tipo coalhado e composição
padrão, seja [5].
L 37/64 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
6. Aparelhos
6.2. Centrifugadora susceptível de atingir uma força centrífuga de 2 200 g dotada de tubos de centrifugação
rolhados, com uma capacidade aproximada de 25 ml.
6.7. Dispositivo de filtração em vidro, dotado de uma membrana filtrante de porosidade 0,45 µm.
6.8. Pipeta graduada que permite deitar 10 ml, em conformidade com a norma ISO 648, classe A ou ISO/R 835.
6.10.1. bomba;
6.10.2. injector manual ou automático, com uma capacidade de 15 a 30 µl;
6.10.3. duas colunas em série TSK 2 000 SW (comprimento 30 cm, diâmetro interior 0,75 cm) ou colunas de
eficácia equivalente e uma precoluna anterior (3 cm × 0,3 cm) provida de I 125 ou um material de eficácia
equivalente;
6.10.4. estufa com coluna, com um termóstato regulado a 35 ± 1 °C;
6.10.5. detector de UV de comprimento de onda variável, permitindo efectuar medições a 205 nm com uma
sensibilidade de 0,008 Å;
6.10.6. integrador susceptível de integrar de vale a vale.
Nota: É possível com colunas mantidas à temperatura ambiente, mas o seu poder de resolução é ligeira-
mente inferior. Neste caso, as variações de temperatura ao longo de uma mesma série de análises
devem ser inferiores a ± 5 °C.
7. Amostragem
7.1. Norma internacional ISO 707 — Leite e produtos lácteos — Métodos de amostragem, coforme às indicações
contidas no n.o 2, alínea c), último parágrafo, do anexo I.
7.2. Conservar a amostra de modo a que não possa ocorrer qualquer deterioração ou alteração da mesma.
8. Metodologia
8.3.2. Adicionar em dois minutos 10,0 ml da solução de ácido tricoloracético (5.1), ao mesmo tempo que a
solução é agitada pelo agitador magnético (6.4). Colocar o tubo no banho de água (6.9), onde deve
permanecer durante 60 minutos.
8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 2 200 g, ou filtrar através de papel (6.6), rejeitando os 5 primeiros
ml de filtrado.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/65
8.5. Calibração
8.5.1. Aplicar exactamente às amostras-padrão (5.4) a metodologia descrita da alínea 8.2 à alínea 8.4.2.
Utilizar soluções recentemente preparadas pois os GMP degradam-se em meio tricloroacético a 8 %. Com
efeito o seu teor baixa aproximadamente 0,2 % por hora a 30 °C.
8.5.2. Antes de proceder a qualquer determinação cromatográfica das amostras, condicionar as colunas mediante
injecções sucessivas de solução (8.5.1) da amostra-padrão (5.4.2) até que a superfície e o tempo de retenção
do pico correspondentes ao GMP sejam constantes.
8.5.3. Determinar os coeficientes de resposta R injectando um volume de filtrados (8.5.1) idêntico ao que foi
utilizado nas amostras.
pico II:
pico IV:
em que:
RII e RIV = coeficientes de resposta dos picos II e IV respectivamente,
AII [0] e AIV [0] = superfícies dos picos II e IV respectivamente da amostra-padrão [0], obtidas na alínea
8.5.3
pico III:
em que:
RIII = coeficientes de resposta do pico III,
AIII [0] e AIII [5] = superfícies do pico III nas amostras-padrão [0] e [5] respectivamente, obtidas na
alínea 8.5.3,
W= quantidade de lactossoro presente na amostra-padrão [5], ou seja, 5.
L 37/66 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
em que:
SII [E], SIII [E], SIV [E] = superfícies relativas dos picos II, III e IV respectivamente da amostra [E],
AII [E], AIII [E], AIV [E] = superfícies relativas dos picos II, III e IV da amostra [E], obtidas na alínea 8.4.2,
RII, RIII, RIV = coeficientes de resposta calculados na alínea 9.1.1.
em que:
TRRIII [E] = tempo de retenção relativo ao pico III da amostra [E],
TRIII [E] = tempo de retenção do pico III da amostra [E] obtido na alínea 8.4.2,
TRIII [5] = tempo de retenção do pico III da amostra-padrão [5] obtido na alínea 8.5.3.
9.1.4. Foi experimentalmente demonstrado que existe uma relação linear entre o tempo de retenção relativo ao
pico III, ou seja TRRIII [E], e a percentagem de soro em pó adicionada até 10 %:
— TRRIII [E] é < 1,000 quando o teor em soro é > 5 %,
— o TRRIII [E] é ≥ 1,000 quando o teor em soro é ≤ 5 %.
Normalmente, o valor de TRRIII [0] difere pouco de 1,034. Consoante o estado das colunas, este valor pode
aproximar-se de 1,000, mas deve ser sempre superior.
em que:
W= percentagen m/m de lactorosso presente na amostra [E],
SIII [E] = superfície relativa do pico III da amostra a testar [E] obtido na alínea 9.1.2,
1,3 = superfície relativa média do pico III, expressa em g por cada 100 g de lactossoro
determinada nos leites em pó desnatados não adulterados, de origens diversas. Este
valor foi obtido experimentalmente,
SIII [0] = superfície relativa do pico III, que é igual a RIII × AIII [0]. Estes valores são obtidos
respectivamente nas alíneas 9.1.1 e 8.5.3,
(SIII [0] – 0,9) = correcção a introduzir na superfície relativa média 1,3 quando o valor SIII [0] se afasta
de 0,9. Experimentalmente, a superfície relativa média do pico III da amostra-padrão
[0] é de 0,9.
9.3.1. Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou num certo espaço de
tempo, pelo mesmo analista utilizando o mesmo aparelho, na mesma amostra para análise não deve
ultrapassar 0,2 % m/m.
9.3.2. Reprodutibilidade
A diferença entre dois resultados individuais e independentes obtidos em dois laboratórios diferentes, na
mesma amostra para análise, não deve ultrapassar 0,4 % m/m.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/67
9.4. Interpretação
9.4.1. Concluir que não há presença de soro se a superfície relativa ao pico III, SIII [E], expressa em gramas de soro
coalhado por 100 g de produto, for ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9)
em que
2,0 é o valor máximo admitido para a superficie relativa do pico III, que tem em conta a
superfície relativa do pico III, i.e. 1,3 a incerteza devida às variações de composição dos
leites desnatados em pó e a reprodutibilidade do método (9.3.2),
(SIII [0] — 0,9) é a correcção a utilizar quando a superfície SIII [0] for diferente de 0,9 (ver ponto 9.2)
9.4.2. Se a superfície relativa do pico III,SIII [E] for >2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a superfície relativa do pico II, SII
[E] ≤ 160, calcular o teor em lactossoro presente do modo indicado no ponto 9.2.
9.4.3. Se a superfície relativa do pico III,SIII [E] for >2,0 + (SIII[0] – 0,9) e a superfície relativa do pico II, SII
[E] ≤ 160, determinar o teor em matérias proteicas totais (P %); examinar seguidamente os gráficos 1 e 2.
9.4.3.1. Os datos obtidos após análise de amostras de leites desnatados em pó não adulterados, com um teor em
matérias proteicas totais elevado, estão reunidos nos gráficos 1 e 2.
A recta representada a traço cheio representa a recta de regressão linear, cujos coeficientes são calculados
pelo método dos mínimos quadrados.
A recta representada a tracejado fixa o limite superior relativa do pico III, com uma probabilidade de 90 %
de não ser ultrapassado.
As equações das rectas a tracejado dos gráficos 1 e 2 são respectivamente iguais a:
SIII = 0,376 P % – 10,7 (gráfico 1)
SIII = 0,0123 SIII [E] + 0,93 (gráfico 2)
em que
SIII é a superfície relativa do pico III calculada ou a partir do teor em matérias proteicas
totais, ou a partir da superfície relativa do pico SIII [E],
P% é o teor em matérias proteicas totais expresso em percentagem do seu peso,
(SIII [E] é a superfície relativa da amostra, calculada no ponto 9.1.2
9.4.3.2. Se T1 e/ou T2 forem inferiores ou iguais a zero, não se pode concluir que há presença de lactossoro.
em que
0,91 representa a diferença, medida no eixo vertical, entre as rectas, a cheio e a tracejado.
L 37/68 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/69
ANEXO XIX
(Artigo 13.o)
3. Definição
O teor de soro de coagulação desidratado é definido em percentagem ponderal, determinada pelo procedimento
descrito.
4. Fundamento do método
Determinação da quantidade de glicomacropéptido A (GMPΑ) de acordo com o anexo XVIII. As amostras que
apresentem resultados positivos são analisadas em relação ao glicomacropéptido A por um método de cromatografia
líquida de alta resolução em fase inversa (processo CLAR). Avaliação do resultado obtido por comparação com
amostras-padrão de leite em pó desnatado com e sem uma percentagem conhecida de soro de leite em pó. A obtenção
de resultados superiores a 1 % (m/m) prova a presença de soro de coagulação desidratado.
5. Reagentes
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica. A água utilizada deve ser destilada ou, pelo menos, de pureza
equivalente. O acetonitrilo deve ser de qualidade para espectroscopia ou HPLC.
5.2. Eluentes A e B
Eluente A: misturar 150 ml de acetonitrilo (CH3CN), 20 ml de Isopropanol (CH3CHOHCH3) e 1,00 ml de
ácido trifluoroacético (TFA, CF3 COOH) com água até perfazer 1 000 ml. Eluente B: misturar 550 ml de
acetonitrilo, 20 ml de isopropanol e 1,00 ml de ácido trifluoroacético com água até perfazer 1 000 ml.
Antes da utilização, filtrar a solução eluente numa membrana de filtração com poros de 0,45 µm de diâmetro.
5.4. Soluções-padrão
5.4.1. Leite em pó desnatado que satisfaça as exigências aplicáveis à armazenagem pública, ou seja (0).
5.4.2. O mesmo leite em pó desnatado adulterado com 5 % (m/m) de soro de coagulação desidratado de compo-
sição-padrão (5).
5.4.3. O mesmo leite em pó desnatado adulterado com 50 % (m/m) de soro de coagulação desidratado de
composição-padrão (50) (1)
6. Equipamento
6.2. Centrifugadora que possa atingir uma força centrífuga de 2 200 g equipada com tubos de centrifugação
fechados de cerca de 50 ml.
(1) O soro de coagulação desidratado de composição-padrão, bem como o leite em pó desnatado adulterado são comercializados por
NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA. Todavia, podem também ser utilizados produtos que forneçam resultados
idênticos aos dos produtos da NIZO.
L 37/70 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
6.6. Papel de filtro para filtração média, com cerca de 12,5 cm de diâmetro.
6.7. Dispositivo de filtração de vidro munido de membrana de filtração com poros de 0,45 µm de diâmetro.
6.8. Pipetas graduadas de 10 ml (ISO 648, classe A ou ISO/R 835) ou sistema que possa debitar 10,0 ml em dois
minutos.
7. Amostragem
7.1. A colheita das amostras é efectuada de acordo com o procedimento previsto na norma internacional ISO 707.
Todavia, os Estados-Membros podem utilizar outro método, desde que o mesmo seja conforme aos princípios
estabelecidos pela norma supracitada.
7.2. Conservar a amostra em condições que evitem qualquer deterioração ou alteração da composição.
8. Procedimento
8.3.2. Juntar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético a 25 °C (5.1) de uma forma constante durante 2 minutos
enquanto se agita vigorosamente por meio de um agitador magnético (6.4). Colocar o tubo num banho-maria
(6.9) e deixar em repouso durante 60 minutos.
8.3.3. Centrifugar (6.2) durante 10 minutos a 22 000 g ou filtrar através de papel (6.6), rejeitando os primeiros
5 ml de filtrado.
8.4.2. Antes de se proceder à análise CLAR de fase inversa, devem ser optimizadas as condições de gradiente. Para os
sistemas de gradiente com um volume morto de cerca de 6 ml (volume a partir do ponto em que os solventes
se juntam até ao volume da ansa do injector, inclusive), é óptimo um tempo de retenção de 26 minutos ± 2
minutos para o GMPA. Os sistemas de gradiente com um volume morto inferior (por exemplo 2 ml) devem
utilizar 22 minutos como tempo óptimo de retenção.
Injectar 100 µl do sobrenadante ou filtrado (8.3.3) no aparelho de CLAR, que deve funcionar nas condições
de gradiente de aferição indicadas no quadro 1.
Quadro 1
Tempo Fluxo
%A %B Curva
(minutos) (ml/minuto)
Início 1,0 90 10 *
27 1,0 60 40 lin
32 1,0 10 90 lin
37 1,0 10 90 lin
42 1,0 90 10 lin
Utilizando as fórmulas a seguir indicadas, pode ser calculada a composição inicial de solvente a utilizar para o
gradiente normal (ver 8.4.3):
Em que:
TRgmpA: tempo de retenção do GMPA com o gradiente de aferição
10: % B inicial do gradiente de aferição
2,5: % B no ponto médio menos % B no início do gradiente normal
13,5: tempo médio do gradiente de aferição
26: tempo de retenção necessário do GMPA
6: razão entre os declives do gradiente de aferição e do gradiente normal
30: % B no início menos % B após 27 minutos no gradiente de aferição
27: tempo decorrido do gradiente de aferição
Injectar 100 µl de sobrenadante ou filtrado medidos rigorosamente (8.3.3) no aparelho de CLAR, que deve
funcionar com um caudal de 1,0 ml da solução eluente (5.2) por minuto.
A composição de eluente no início da análise é obtida a partir de 8.4.2, sendo normalmente próxima de
A:B = 76:24 (5.2). Imediatamente após a injecção, é iniciado um gradiente linear, que dá origem a uma
percentagem de B 5 % mais elevada após 27 minutos. Em seguida, é iniciado um gradiente linear, o que leva a
composição de eluente a 90 % de B em 5 minutos. Esta composição é mantida durante 5 minutos mudando
seguidamente, via um gradiente linear em 5 minutos para a composição inicial. Em função do volume interno
do sistema de bomba, a injecção seguinte pode ser feita 15 minutos após a obtenção das condições iniciais.
Observações
1. O tempo de retenção do glicomacropéptido deve ser de 26 minutos ± 2 minutos. Este pode ser conseguido
através da variação das condições iniciais e finais do primeiro gradiente. Todavia, a diferença entre a
percentagem de B das condições iniciais e finais do primeiro gradiente deve permanecer 5 % de B.
2. Os eluentes devem ser suficientemente desgaseificados e permanecer nesse estado. Tal é essencial para o
funcionamento adequado do sistema de bomba de gradiente. O desvio-padrão do tempo de retenção do
pico de GPM deve ser inferior a 0,1 minutos (n = 10).
3. Devem ser injectadas as cinco amostras de referência (5) e utilizadas para calcular um novo factor R de
resposta (9.1.1).
L 37/72 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
8.4.4. Os resultados de análise cromatográfica da amostra a testar (E) são obtidos na forma de um cromatograma em
que o pico de GMP é identificado pelo seu tempo de retenção de cerca de 26 minutos.
O integrador (6.10.6) calcula automaticamente a altura A do pico de GMP. Em todos os cromatogramas, deve
ser verificada a localização da linha de base. A análise ou a integração devem ser repetidas se a linha de base
estiver localizada dum modo incorrecto.
Para detectar quaisquer anomalias devidas quer a um funcionamento deficiente do aparelho ou da coluna quer
à origem e natureza da amostra analisada, é necessário observar o aspecto de cada cromatograma antes de
proceder a qualquer interpretação quantitativa.
8.5. Calibração
8.5.1. Aplicar exactamente às amostras-padrão (5.4.1-5.4.2) a técnica descrita desde o ponto 8.2 até ao ponto 8.4.4.
Utilizar soluções recentemente preparadas, pois o GMP é degradado à temperatura ambiente, em meio de
ácido tricloroacético a 8 %. A 4 °C, a solução permanece estável durante 24 horas. No caso de séries longas de
análises, é desejável a utilização de um recipiente arrefecido para amostras no injector automático.
Nota
O ponto 8.4.2. pode ser suprimido se a percentagem de B nas condições iniciais for conhecida das análises
anteriores.
O cromatograma da amostra de referência (5) deve ser idêntico à figura 1, onde o pico de GMPA é antecedido
de dois picos pequenos. É essencial obter uma separação semelhante.
8.5.2. Antes da determinação cromatográfica das amostras, injectar 100 µl da amostra-padrão sem soro de coalho
(0) (5.4.1).
O cromatograma não deve apresentar um pico com um tempo de retenção do pico de GMPA.
8.5.3. Determinar os factores R de resposta por injecção do mesmo volume de filtrado (8.5.1), como utilizado para
as amostras.
9. Resultados
Em que:
R = factor de resposta do pico de GMP
A = altura do pico de GMP
SL = quantidade de soro de leite na amostra-padrão (5).
SL(E) = R × A (E)
Em que:
SL(E) = percentagem (m/m) de soro de coalho na amostra (E)
R = factor de resposta do pico GMP (9.1.1)
A(E) = altura do pico de GMP da amostra (E).
Se SL(E) for superior a 1 % e a diferença entre o tempo de retenção e o da amostra-padrão (5) for inferior a 0,2
minutos, conclui-se que o soro sólido de coalho está presente.
9.3.1. Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas simultaneamente ou com um curto intervalo
de tempo pelo mesmo analista, utilizando os mesmos aparelhos e utensílios, no mesmo material de teste, não
deve exceder 0,2 % mim.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/73
9.3.2. Reprodutibilidade
Por determinar.
9.3.3. Linearidade
A partir de 0 até 16 % de soro de coalho, deve ser obtida uma relação linear com um coeficiente de correlação
superior a 0,99.
9.4. Interpretação
9.4.1. Considera-se que o soro de leite está presente se o resultado obtido no ponto 9.2 for superior a 1 % m/m e se
o tempo de retenção do pico de GMP diferir em menos de 0,2 minutos do obtido com a amostra-padrão (5). É
fixado o limite de 1 % de acordo com o disposto no Regulamento (CEE) n.o 625/78, anexo 5, pontos 9.2 e
9.4.1.
L 37/74 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO XX
(Artigo 14.o)
2. Definição
Teor de PS + PE: a fracção, em massa, da substância determinada pelo processo especificado abaixo. O resultado é
expresso em miligramas de dipalmitato de fosfatidiletanolamina (PEDP) por 100 g de pó.
3. Princípio
4. Reagentes
Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água deve ser destilada ou de pureza pelo menos
equivalente, salvo indicação em contrário.
4.3.2. Solução aquosa de ácido bórico 0,4 M com o pH ajustado para 10,0 com hidróxido de sódio (4.3.1)
4.3.3. 2-Mercaptoetanol
5. Equipamento
5.3. Pipetas de 1 e 10 ml
5.11. Proveta de 25 ml
5.12. Medidor de pH
5.13.1. Sistema de bombagem regulável, adequado a um caudal de 1,0 ml/min a 200 bar
5.13.2. Sistema de auto-amostragem com possibilidade de derivação
5.13.3. Sistema de aquecimento de colunas regulado para 30 °C
5.13.4. Detector de fluorescência regulado para um comprimento de onda de excitação de 330 nm e um compri-
mento de onda de emissão de 440 nm
5.13.5. Integrador ou software de tratamento de dados para a determinação da área dos picos
5.13.6. Coluna Ichrosphère — 100 (250 x 4,6 mm) ou coluna equivalente preenchida com octadecilsilano (C 18) de
5 µm de granulometria
6. Amostragem
7. Procedimento
Solvente A:
Solução 0,3 mM de fosfato de sódio di-hidrogenado e 3 mM de acetato de sódio (com pH ajustado a 6,5
por adição de ácido acético): de metanol: de tetra-hidrofurano = 558 : 440 : 2 (v/v/v)
Solvente B:
Metanol
Início 40 60 0
0,1 40 60 0,1
5,0 40 60 0,1
6,0 40 60 1,0
6,5 40 60 1,0
9,0 36 64 1,0
10,0 20 80 1,0
11,5 16 84 1,0
12,0 16 84 1,0
16,0 10 90 1,0
19,0 0 100 1,0
20,0 0 100 1,0
21,0 40 60 1,0
29,0 40 60 1,0
30,0 40 60 0
Nota: Pode ser necessário alterar ligeiramente o gradiente de eluição de modo a conseguir a resolução
indicada na figura 1.
Temperatura da coluna: 30 °C
7.5.6. Realizar a sequência de análises cromatográficas mantendo um intervalo constante entre passagens de forma
a obter tempos de retenção constantes. Injectar a solução do padrão externo (7.3) entre cada 5–10 amostras
da solução a ensaiar a fim de avaliar o factor de resposta.
Nota: A coluna deve ser limpa efectuando uma lavagem com 100 % de solvente B (7.5.1) durante pelo
menos 30 min., após cada 20–25 passagens.
sendo
C= teor de PS ou PE (mg/100 g de amostra pulverulenta a dosear)
A1 = área do pico de PEDP da solução-padrão da amostra (7.3)
A2 = área do pico de PS ou PE da solução de amostra a analisar (7.2)
T1 = área do pico da triptamina da solução-padrão da amostra (7.3)
T2 = área do pico da triptamina da solução de amostra a analisar (7.2).
9. Precisão
Nota: Os valores relativos à repetibilidade foram calculados em conformidade com a norma internacional IDF (1). O
limite de reprodutibilidade provisório foi calculado em conformidade com a alínea b) do anexo III.
9.1. Repetibilidade
O desvio-padrão relativo da repetibilidade, que exprime a variabilidade de resultados analíticos indepen-
dentes obtidos pelo mesmo operador utilizando o mesmo aparelho nas mesmas condições, com a mesma
amostra, num intervalo curto, não deve exceder 2 %. Se duas determinações forem obtidas nestas condições,
a diferença relativa entre os dois resultados não deve ser superior a 6 % da média aritmética dos resultados.
9.2. Reprodutibilidade
Se foram efectuadas duas determinações por operadores em laboratórios diferentes, utilizando aparelhos
diferentes, em condições diferentes, na análise da mesma amostra, a diferença relativa entre os dois
resultados não deve exceder 11 % da média aritmética dos resultados.
10. Bibliografia
10.1. Resmini (P.), Pellegrino (L.), Hogenboom (J.A.), Sadini (V.), Rampilli (M.), «Détection des solides du babeurre
dans le lait écrémé en poudre par dosage des aminophospholipides à la CLHP», Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39, 395
(1988).
(1) International IDF Standard 135B/1991. Milk and milk products. Precision charachteristics of analytical methods. Outline of collabo-
rative study procedure (esquema de um método de estudo em colaboração).
L 37/78
PT
Jornal Oficial das Comunidades Europeias
Figura 1: Curva resultante da HPLC de derivados OPA da fosfatidilserina (PS) e da fosfatidiletanolamina (PE) obtidas por extracção com metanol de leite em pó desnatado reconstituído. O modo de integração dos
picos de PS, PE e triptamina (padrão interno) encontra-se indicado.
7.2.2001
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/79
ANEXO XXI
(Artigo 15.o)
Utilizar um teste de selecção com inibidor microbiano, usando Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 como
microrganismo de ensaio, devendo o teste ter uma sensibilidade suficiente para detectar 4 µg de benzilpenicilina por litro
de leite e 100 µg de sulfadimidina por litro de leite. Podem ser utilizados kits de ensaio existentes no comércio, desde que
tenham a sensibilidade exigida no que repeita à benzilpenicilina e à sulfadimidina (1).
No ensaio é utilizado leite em pó desnatado reconstituído (1 g de pó + 9 ml aqua dest). O ensaio é efectuado conforme
descrito no Boletim IDF n.o 258/1991, secção 1, capítulo 2 ou de acordo com as instruções do fabricante do kit de ensaio.
A interpretação dos resultados positivos é feita do seguinte modo:
1. Repetir o ensaio adicionando penicilinase ao sistema de ensaio:
Resultado positivo: A substância inibidora não pode ser identificada por este método.
Resultado negativo: A substância inibidora é um antibiótico do grupo de β-lactame.
2. Repetir o teste adicionado ácido p-aminobenzóico ao sistema de ensaio:
Resultado positivo: A substância inibidora não pode ser identificada por este método.
Resultado negativo: A substância inibidora é uma sulfonamida/dapsona.
3. Repetir o teste adicionando penicilinase + ácido p-aminobenzóico ao sistema de ensaio:
Resultado positivo: A substância inibidora não pode ser identificada por este método.
Resultado negativo: As substâncias inibidoras são um antibiótico do grupo do β-lactame e uma sulfonamida/dapsona.
(1) Aviso importante: a análise de leite em pó desnatado pode produzir resultados positivos falsos. É importante, por conseguinte, veri-
ficar que o sistema de ensaio utilizado não produz resultados positivos falsos.
L 37/80 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO XXII
(Artigo 16.o)
1. Objectivo
Determinação da quantidade de leite em pó desnatado presente num alimento composto para animais por coagulação
enzimática da para-caseína.
2. Domínio de aplicação
O método é aplicável aos alimentos compostos para animais que contenham pelo menos 10 % de leite em pó
desnatado; a presença de quantidades importantes de leitelho e/ou de certas proteínas não lácteas pode provocar
interferências.
3. Princípio do método
3.1. Solubilização da caseína contida no alimento composto para animais por extracção com uma solução de
citrato de sódio.
3.3. Determinação do azoto da para-caseína, após mineralização, pelo método de Kjeldahl (norma FIL 20A 1986);
cálculo da quantidade de leite em pó desnatado presente, com base num teor mínimo de caseína de 27,5 %
(ver o ponto 9.1).
4. Reagentes
São utilizados reagentes para análise e água destilada ou de pureza equivalente. Com excepção do coalho (4.5), todos
os reagentes e soluções utilizados devem estar isentos de substâncias azotadas.
4.2. Cloreto de cálcio (solução 2M). Pesar 20,018 g de CaCO3 (pureza para análise) numa cápsula de porcelana de
capacidade adequada (150-200 ml) ou num copo. Cobrir com água destilada e transferir para um banho-
-maria. Adicionar lentamente 50-60 ml de uma solução de HCl (concentração de HCl: água = 1:1), para
dissolver completamente o carbonato. Manter o recipiente no banho-maria até à secagem do CaCl2, para
eliminar o HCl que não tenha reagido. Transferir com água destilada para um balão graduado de 100 ml e
diluir até à marca. Verificar o valor do pH, que não deve ser inferior a 4,0. Guardar a solução em frigorífico.
4.5. Solução de coalho estandardizada 1:10 000 (extracto de coalheira de vitelo); conservar em frigorífico a 4-6 °C
4.6. Reagentes para o doseamento do azoto segundo o método de Kjeldahl (norma FIL 20A 1986).
5. Aparelhagem
5.3. Centrífuga de bancada (2 000 rpm a 3 000 rpm), equipada com tubos de centrifugação de 50 ml.
5.8. Filtros circulares sem cinzas, de filtração rápida, com diâmetro de 150 mm (S.S. 5892 S.S. 595 1/2).
5.16. Termómetro.
6. Técnica
Moer 10-20 g de amostra num almofariz ou agitar a mesma quantidade num homogeneizador-misturador, de
modo a obter uma mistura homogénea.
6.2.1. Pesar 1,000 ± 0,002 g de alimento composto para animais bem homogeneizado (6.1) directamente para um
tubo de centrifugação de 50 ml. Juntar 30 ml de solução de citrato trissódico (4.1), previamente aquecida a
45 °C. Dispersar o pó por agitação magnética durante pelo menos cinco minutos.
6.2.2. Centrifugar a 500 g (2 000 rpm a 3 000 rpm) durante 10 minutos e recolher o sobrenadante aquosa para
um copo de 150-200 ml. Evitar a perda de partículas insolúveis durante a transferência do sobrenadante.
6.2.3. Submeter o resíduo a duas novas extracções, procedendo da mesma forma e misturando os três extractos
aquosos.
6.2.4. Se ocorrer uma subida de matéria gorda, arrefecer até à solidificação da fase gorda, que será, em seguida,
retirada com uma espátula.
6.3.1. Juntar, gota a gota, ao extracto aquoso total (cerca de 100 ml), sob agitação, 3,4 ml da solução saturada de
cloreto de cálcio (4.2). Ajustar o pH a 6,4-6,5 com solução diluída de NaOH (4.3) ou HCl (4.4). Colocar a
solução num banho termostatizado a 37 °C, durante 15 a 20 minutos, para permitir que se estabeleça o
equilíbrio salino. Este manifesta-se pela aparição de um aspecto leitoso.
6.3.2. Transferir o líquido para um (ou dois) tubo(s) de centrifugação e centrifugar a 2 000 g durante 10 minutos,
para remover o precipitado. Transferir o sobrenadante, sem lavar o sedimento, para um (ou dois) tubo(s) de
centrifugação.
6.3.3. Levar de novo a temperatura do sobrenadante a 37 °C. Adicionar gota a gota ao extracto, sob agitação, 0,5 ml
de coalho líquido (4.5). A coagulação ocorre em um ou dois minutos.
6.3.4. Recolocar a amostra no banho-maria e manter a 37 °C durante 15 minutos. Retirar a amostra do banho e
agitar, para romper o coagulado. Centrifugar a 2 000 g durante 10 minutos. Filtrar o sobrenadante com um
papel de filtro adequado (1). (Whatman n.o 541 ou equivalente) e guardar o papel de filtro. Lavar o sedimento
no tubo de centrifugação, utilizando 50 ml de água a cerca de 35 °C e mexendo o sedimento.
Centrifugar novamente a 2 000 g, durante 10 minutos. Filtrar o sobrenadante com o papel de filtro que fora
guardado.
6.4.1. Lavar e transferir quantitativamente o sedimento para o papel de filtro no balão de Kjeldahl. Determinar o teor
de azoto pelo método de Kjeldahl, conforme descrito na norma FIL 20A 1986.
7. Determinação em branco
7.1. Efectuar sistematicamente uma determinação em branco, utilizando um filtro sem cinzas (5.8) humedecido
com uma mistura composta por 90 ml da solução de citrato de sódio (4.1), 1 ml da solução saturada de
cloreto de cálcio (4.2) e 0,5 ml de coalho líquido (4.5) e lavado com 3 × 15 ml de água antes de ser
mineralizado pelo método de Kjeldahl (norma FIL 20A 1986).
7.2. Deduzir ao volume de ácido (4.4) utilizado na titulação da amostra analisada o volume necessário para a
determinação em branco.
8. Determinação de controlo
8.1. Para manter sob controlo o processo analítico e os reagentes mencionados, efectuar uma determinação com
um alimento composto para animais de composição padrão, cujo teor de leite em pó desnatado, conhecido,
tenha sido determinado por análise interlaboratorial. O resultado médio de uma determinação em duplicado
não deve afastar-se mais de 1 % do resultado obtido na analise interlaboratorial.
12. Observações
12.1. A adição de uma percentagem importante de certas proteínas não lácteas, nomeadamente de soja, que tenham
sido aquecidas juntamente com o leite em pó desnatado conduz a resultados demasiado elevados, devido à
co-precipitação dessas proteínas com a para-caseína do leite.
12.2. A adição de leitelho pode conduzir, por vezes, a valores demasiado baixos, dado que a determinação só se
referirá a extracto magro. A adição de certos leitelhos de nata ácida pode conduzir a valores bastantes
inferiores, por ser incompleta a sua dissolução na solução de citrato.
12.3. A adição de 0,5 % ou mais de lecitina pode igualmente conduzir a resultados demasiado baixos.
12.4. A incorporação de leite em pó aquecido a alta temperatura (high-heat) pode conduzir a valores demasiado
elevados, devido à co-precipitação de certas proteínas do soro lácteo com a para-caseína do leite.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/83
ANEXO XXIII
(Artigo 17.o)
1. Objectivo
O presente método destina-se à detecção do amido utilizado como marcador no pó de leite desnaturado.
O limite inferior de detecção do método é de, aproximadamente, 0,05 g de amido por 100 g de amostra.
2. Fundamento
A reacção é a mesma da utilizada iodometria:
— fixação por colóides do iodo livre numa solução aquosa,
— absorção pelas micelas de amido e formação de cor.
3. Reagentes
3.1. Solução de iodo
— iodo: 1 g,
— iodeto de potássio: 2 g,
— água destilada: 100 ml.
4. Aparelhos e utensílios
4.1. Balança analítica.
4.2. Banho-maria.
4.3. Tubos de ensaio de 25 mm × 200 mm.
5. Técnica
Pesar 1 g de amostra e transferi-la para o tubo de ensaio (ponto 4.3).
Adicionar a 20 ml de água destilada e agitar a fim de dispersar a amostra.
Colocar no banho-maria em ebolição (ponto 4.2) e deixar durante cinco minutos.
Retirar do banho-maria e arrefecer à temperatura ambiente.
Adicionar 0,5 ml de solução de iodo (ponto 3.1), agitar e observar a cor resultante.
7. Observações
A cor, a intensidade da cor e o aspecto microscópico do amido variam em função da origem do amido nativo (por
exemplo de milho ou batata) e do tipo de amido modificado presente na amostra.
Na presença de amido modificado, a cor produzida muda para violeta, vermelho ou castanho, de acordo com o grau
de modificação da estrutura cristalina do amido nativo.
L 37/84 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
ANEXO XXIV
(Artigo 18.o)
1. Domínio de aplicação
Determinar o teor de humidade de leitelho ácido em pó destinado à preparação de alimentos para animais.
2. Princípio
3. Instrumentos
3.2. Recipientes secos de metal inoxidável ou de vidro, munidos de uma tampa hermética; superfície útil que permita
obter uma repartição da amostra da ordem dos 0,3 g/cm2.
3.3. Estufa de vácuo, com aquecimento eléctrico regulável, equipada de uma bomba de óleo e, quer de um dispositivo
de introdução de ar quente desidratado, quer de um desidratante (por exemplo, óxido de cálcio).
4. Modo operatório
Aquecer um recipiente (3.2) e a respectiva tampa na estufa de dessecação (3.5) durante pelo menos 1 hora. Tapar o
recipiente, transferi-lo imediatamente para um exsicador (3.4), deixar arrefecer até à temperatura ambiente e pesar com
uma aproximação de 0,5 mg.
Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, o recipiente (3.2) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de
1 mg, cerca de 5 g da amostra, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vácuo (3.3)
previamente aquecida a 83 °C. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da
estufa desça demasiado.
Diminuir a pressão até atingir 100 Torr (13,3 kPa) e deixar secar a essa pressão durante quatro horas, quer numa
corrente de ar quente, quer utilizando um desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste último caso, desligar
a bomba de vácuo quando a pressão indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em
que a temperatura da estufa voltar a atingir 83 °C. Restabelecer cuidadosamente a pressão atmosférica na estufa. Abrir
a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador
(3.4) e pesar com uma aproximação de 1 mg. Secar por mais 30 minutos na estufa de vácuo (3.3) a 83 °C e repetir a
pesagem. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.
sendo:
E = massa inicial da amostra, em gramas,
m = massa da amostra seca, em gramas.
6. Precisão
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas no mínimo intervalo de tempo possível, pelo
mesmo operador, utilizando os mesmos instrumentos e material de ensaio idêntico, não deve exceder 0,4 g de
água por 100 g de leitelho ácido em pó.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/85
ANEXO XXV
(Artigo 19.o)
2. Definição
Na presente norma, entende-se por matéria gorda estranha na matéria gorda láctea toda a gordura vegetal e animal,
excluindo a gordura láctea.
3. Fundamento do método
Após extracção da matéria gorda láctea, é preparada uma solução-padrão. A partir desta solução, são determinados os
triglicéridos (números de carbono total) por cromatografia em fase gasosa em colunas de enchimento. Introduzindo o
peso percentual das moléculas de gordura de diferentes dimensões (C24—C54—unicamente números pares) na
fórmula do triglicérido, as matérias gordas estranhas são detectadas qualitativamente ou quantitativamente.
Nota: Mediante o respeito do processo descrito, é possível utilizar a cromatografia em fase gasosa em colunas
capilares, se se tiver garantias quanto à obtenção de resultados comparáveis (1).
4. Reagentes
Devem ser utilizados produtos químicos de qualidade analítica.
4.1. Gás de arrastamento: azoto, grau de pureza 99,996 %
4.2. Triglicéridos-padrão (2), saturados, bem como colesterol para normalizar a matéria gorda láctea padrão, de
acordo com o ponto 6.5.4.
4.3. Metanol, isento de água
4.4. n-Hexano
4.5. n-Heptano
4.6. Tolueno
4.7. Solução de dimetilclorossilano: são dissolvidos 50 ml de dimetilclorossilano em 283 ml de tolueno
4.8. Gás combustível: hidrogénio e ar artificial
4.9. Fase estacionária: 3 % de OV-1 em 125/150 µm (100/120 mesh) de GasChromQ (3).
4.10. Solução a 10 % de manteiga de cacau
5. Aparelhos e utensílios
Equipamento normal de laboratório e, em especial, o seguinte:
5.1. Cromatógrafo de fase gasosa de temperatura elevada, adequado para funcionar a, pelo menos, 400 a 450 °C,
equipado com um detector de ionização de chama (DIC) e um regulador do fluxo mássico do gás de
arrastamento. Gás de combustão: 30 ml de H2/min, 270 ml de ar artificial/min.
(1) Foram já descritos métodos adequados (ver D. Precht e J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns,
Chrompack News 4 16-17 (1993).
(2) Encontram-se no comércio produtos adequados.
( ) As designações comerciais como, por exemplo, Extrelut, GasChromQ, Chrompack, correspondem a produtos adequados disponíveis
3
no comércio especializado. Esta informação serve para facilitar ao utilizador a preparação do padrão, mas não representa a obrigato-
riedade de utilização deste produto. A indicação do grão foi transferida para unidades do sistema internacional µm, de acordo com
BS 410: 1988 «British Standard Specification for test sieves».
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/87
Atendendo ao elevado fluxo do gás de arrastamento, o jacto da chama deve ser especialmente amplo.
Nota: Devido às temperaturas elevadas que ocorrem durante a análise dos triglicéridos, as cabeças de vidro
do DIC ou do sistema de injecção devem ser limpas frequentemente.
O cromatógrafo de fase gasosa deve estar equipado com septos, resistentes a elevadas temperaturas, que
possam ser utilizados frequentemente e que apresentem, em geral, um grau muito reduzido de fugas.
Nota: São adequados os septos Chromblue (tm) [Chrompach]
Os septos devem ser mudados periodicamente, por exemplo após cerca de 100 injecções ou quando a
resolução se deteriorar (ver figura 4).
Figura 1
Enchimento da coluna
5.3.1. Coluna plástica com extremidades com tampas de atarrachar, que disponha de uma marca até à qual pode
ser vertida a quantidade necessária de fase estacionária.
5.3.2. Peneira fina (dimensão de malha de, aproximadamente, 100 µm) com uma tampa de atarrachar, adequada
para fechar a coluna de vidro, de acordo com a figura 1.
5.4. Coluna de Extrelut de 1 a 3 ml (1), com sílica gel. Esta coluna pode ser utilizada, alternativamente, para
extracção com vista à obtenção da matéria gorda láctea.
5.6. Dispositivos para silanizar a superfície de vidro da coluna, de acordo com o ponto 6.1
5.9. Micropipeta
5.13. Funtil
5.16. Ampolas, de volume nominal de 1 ml, que possam ser fechadas com uma tampa de alumínio, com um
septo no interior.
5.17. Seringa de injecção, cujo êmbolo não deve atingir a extremidade da agulha.
Nota: As seringas deste tipo permitem uma melhor reprodutibilidade dos resultados obtidos.
Para evitar a deterioração do septo, a extremidade da agulha deve ser controlada regularmente (por exemplo,
com um estereomicroscópio).
6. Técnica
Figura 2
Processo de silanização
A coluna é fixada num suporte e completamente enchida com a solução de dimetildiclorossilano, através de
uma pipeta.
Após 20 a 30 minutos, a garrafa de Woulff é substituída por um balão de filtração, e a coluna é enchida
ligando-a à bomba de sucção de água (ver figura 3).
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/89
Figura 3
Processo de lavagem
Para o enchimento da coluna, é utilizado o processo da figura 1. A fase estacionária, de acordo com o ponto
4.9, é vertida para a coluna de plástico até à marca.
A extremidade inferior da coluna de vidro a encher é fechada com uma rolha, de fibra de vidro, com cerca
de 1 cm de comprimento, previamente silanizada, e que é introduzida por meio de uma vareta metálica. Em
seguida, a extremidade da coluna é fechada com a peneira de acordo com o ponto 5.3.2.
O enchimento da coluna é feito sob pressão (com azoto a 3 bares) com a fase estacionária. Para obter um
empacotamento uniforme, contínuo e firme, o vibrador é deslocado para cima e para baixo ao longo da
coluna de vidro, durante o enchimento. Após o enchimento, introduz-se uma rolha sólida de fibra de vidro
silanizada na outra extremidade da coluna cheia, as extremidades protuberantes são cortadas e a rolha é
empurrada para o interior da coluna mais alguns milímetros, por meio de uma espátula.
Numa estufa a 50 °C, são aquecidos um balão de Erlenmeyer de 50 ml e um funil, equipado com um filtro,
de acordo com o ponto 5.14. A camada de matéria gorda da amostra de manteiga fundida é filtrada através
do equipamento pré-aquecido.
Com esta matéria gorda láctea, os fosfolípidos permitem a obtenção de um pico de colesterol aumentado em
aproximadamente 0,1 %.
O cromatograma dos triglicéridos normalizados a 100 com colesterol é, assim, influenciado apenas de uma
forma negligenciável.
Para desnaturar os complexos proteína-lípidos, são adicionados, com uma pipeta, 1,5 ml de metanol. Em
seguida, a amostra é extraída com 20 ml de n-hexano. O n-hexano é adicionado lentamente, em pequenas
quantidades, e o solvente resultante é recolhido num balão de gargalo redondo de 50 ml, que foi objecto de
secagem, até obtenção de um peso constante e conhecido.
Após extracção, deixa-se drenar a coluna até que esta fique vazia.
L 37/90 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
A partir do eluído, os solventes são destilados num evaporador rotativo num banho de água a uma
temperatura compreendida entre 40 e 50 °C.
Na preparação de amostras de acordo com o ponto 6.3.3, a quantidade de n-heptano a adicionar ao material
de amostra no balão é calculada com base na pesagem, e o restante é dissolvido na mesma.
De acordo com o ponto 5.16, é vertido aproximadamente 1 ml de solução de amostra numa ampola.
O aumento da linha de base a altas temperaturas pode ser totalmente evitado combinando duas colunas ou
mediante subtracção da linha de base. Com o método de compensação ou a utilização de colunas simples,
bem como para as cabeças de vidro do injector e do detector, devem ser utilizadas juntas de grafite de
acordo com o ponto 5.5.
Com a utilização do cromatógrafo de fase gasosa sem injecção da solução de matéria gorda e subsequente
subtracção da linha de base registada, pode ser evitado o aumento da linha de base.
Com a utilização de um sistema de integração sem injecção de solução de matéria gorda e subsequente
subtracção da linha de base registada, pode ser evitado o aumento da linha de base.
Com um condicionamento inicial adequado da coluna e aproximadamente 20 injecções com soluções com
matéria gorda láctea, o aumento da linha de base e altas temperaturas é, frequentemente, tão reduzido que
são desnecessárias as correcções da linha de base.
Para não danificar o septo, deve-se evitar curvar a extremidade da agulha devido ao contacto com o fundo
do recipiente que contém a amostra (mesmo que tal seja dificilmente visível a olho nu).
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/91
Figura 4
Cromatograma dos triglicéridos de uma amostra de matéria gorda láctea
6.5.5. Programa de temperatura, gás de arrastamento e outras condições para a análise dos triglicéridos
Programa de temperatura: temperatura inicial da coluna 210 °C, mantida durante 1 minuto; em seguida
programar para 6 °C/minuto até 350 °C e manter à temperatura final durante 5 minutos.
Nota: As temperaturas do detector, injector e estufa (temperaturas iniciais) devem ser mantidas a um nível
constante (igualmente durante a noite, fins-de-semana e férias).
Nota: Se forem utilizadas colunas com 80 cm, o fluxo deve ser de, pelo menos, 75 ml de N2/min. O fluxo
do gás de arrastamento deve ser mantido constante (igualmente durante a noite, fins-de-semana e
férias). O fluxo exacto do gás de arrastamento deve ser ajustado de modo a eluir a 341 °C,
independentemente do comprimento da coluna, um triglicérido C54.
Nota: A seringa deve ser lavada diversas vezes com heptano puro, após cada injecção.
Nota: O detector de ionização de chama deve ser posto em funcionamento no princípio de cada dia de
trabalho.
Os triglicéridos com um número ímpar de grupos c-acilo (2n + 1) são combinados com os triglicéridos anteriores de
número par (2n). Não são tidos em conta os teores de baixa reprodutibilidade de C56. Os restantes triglicéridos (área
dos picos) do cromatograma, incluindo o colesterol (pico próximo de C24), são multiplicados pelos respectivos
factores de resposta de uma matéria gorda padrão (última calibração), sendo todos normalizados a 100. Junto do
colesterol livre, os triglicéridos C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 e
C54 são, por conseguinte, avaliados. Os resultados são apresentados em percentagem em peso (g/100 g).
A avaliação dos picos do cromatograma deve ser feita com um integrador, que permite delinear a linha de base. Deve
ser possível a reintegração com parâmetros de integração optimizados.
As figuras 5 e 6 ilustram dois exemplos de cromatogramas de triglicéridos. A figura 5 mostra um cromatograma que
pode ser bem avaliado, enquanto a figura 6 apresenta um erro esporádico na gama de C50 a C54, com a linha de
base incorrectamente traçada em comparação com a figura 5. Estes erros típicos podem ser detectados com um
elevado grau de certeza e evitados unicamente através da utilização de um integrador que permita delinear a linha de
base.
Figura 5
Cromatograma dos triglicéridos de matéria gorda láctea de fácil avaliação, com a linha de base traçada
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/93
Figura 6
Cromatograma dos triglicéridos de matéria gorda láctea, incorrectamente integrado
Para o controlo das condições de medida, podem utilizar-se os desvios-padrão relativos (RSD: coeficiente de variação
× 100) que se apresentam no quadro 1 para os diversos triglicéridos. Os desvios-padrão em causa foram calculados
com base em 19 análises consecutivas da mesma matéria gorda láctica.
Quadro 1
C24 10,00
C26 2,69
C28 3,03
C30 1,76
C32 1,03
C34 0,79
C36 0,25
C38 0,42
C40 0,20
C42 0,26
C44 0,34
C46 0,37
C48 0,53
C50 0,38
C52 0,54
C54 0,60
Se os RSD forem consideravelmente superiores aos valores apresentados no quadro 1, as condições cromatográficas
não são adequadas, devendo verificar-se os septos e o caudal do gás vector. Além disso, podem depositar-se pequenas
partículas de septo na lã de vidro presente no topo da coluna. Por vezes, a coluna não é utilizável devido a factores
tais como o seu desgaste e a influência da temperatura (ver figura 3).
Nota: Os valores que se apresentam no quadro 1 não possuem carácter obrigatório, proporcionado apenas uma
orientação para o controlo de qualidade. Caso se aceitem RSD mais elevados, é necessário respeitar os limites
de repetibilidade e reprodutibilidade apresentados no ponto 11.
L 37/94 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
Para a detecção de matéria gorda estranha foram desenvolvidas fórmulas de triglicéridos (quadro 2) com limites S
(quadro 3), nas quais os valores S de matéria gorda láctea pura podem flutuar. Se estes limites forem ultrapassados,
conclui-se que existe matéria gorda estranha.
6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · (1) C52 +
0,9892 · C54 = S
Nota: Utilizando 755 amostras diferentes de matéria gorda láctea, o intervalo de confiança corresponde a 99 % entre
S = 97,96 e 102,04 para amostras puras de matéria gorda láctea; o desvio-padrão para todos os valores S é de
0,39897.
A partir de uma composição de triglicéridos de uma amostra de matéria gorda desconhecida, essa fórmula permite,
sem usar um computador, verificar de uma forma simples se a soma do teor de triglicéridos assim estabelecida, com
os factores correspondentes, sai do intervalo de 97,96-102,04 e se, provavelmente, se trata de uma adição de matéria
gorda estranha.
Para a detecção de diferentes matérias gordas estranhas, o quadro 2 apresenta diferentes fórmulas de triglicéridos. Para
a detecção de matérias gordas estranhas como o óleo de soja, óleo de girassol, azeite, óleo de colza, óleo de linhaça,
óleo de gérmen de trigo, óleo de gérmen de milho, óleo de semente de algodão e óleo de peixe hidrogenado, gorduras
vegetais de coco e óleo de palmiste, bem como para o óleo de palma a gordura de bovino, pode ser utilizada uma
fórmula comum.
Dado que a composição de triglicéridos das matérias gordas estranhas também está sujeita a flutuações, foram usadas
até 4 dados diferentes, avaliados experimentalmente, respeitantes a triglicéridos de matérias gordas estranhas. [Com
os mesmos tipos de matéria gorda estranha, foi considerado o limite menos favorável, respectivamente (ver quadro
4)].
Com a seguinte «fórmula total» podem ser obtidos bons resultados semelhantes para todas as gorduras vegetais:
– 2,7575 · C26 + 6,4077 · C28 + 5,5437 · C30 – 15,3247 · C32 + 6,2600 · C34 + 8,0108 · C40 – 5,0336 · C42 +
0,6356 · C44 + 6,0171 · C46 = S
Os cálculos para a detecção de qualquer combinação de matéria gorda estranha em matéria gorda de leite mostraram
que, por exemplo, apesar de com a fórmula para a banha indicada no quadro 2 o limite para a matéria gorda
estranha ser baixo, nomeadamente 2,7 %, outras matérias gordas como a gordura de coco, o óleo de palma ou o óleo
de palmiste, com limites de detecção de, respectivamente, 26,8, 12,5 e 19,3 %, só podem, com esta fórmula, ser
detectadas se tiverem sido adicionadas quantidades muito elevadas à matéria gorda láctea. O mesmo se aplica a outras
fórmulas do quadro 2.
Quadro 2
Fórmulas de triglicéridos para detecção de diversas matérias gordas estranhas em matéria gorda láctea e que
indicam os desvios-padrão para S
Fórmula para o óleo de soja, girassol, colza, linhaça, gérmen de trigo, gérmen de milho, sementes de algodão e peixe e para o azeite
2,0983 · C30 + 0,7288 · C34 + 0,6927 · C36 + 0,6353 · C38 + 3,7452 · C40 – 1,2929 · C42 + 1,3544 · C44 +
1,7013 · C46 + 2,5283 · C50 = S; SD = 0,38157
3,7453 · C32 + 1,1134 · C36 + 1,3648 · C38 + 2,1544 · C42 + 0,4273 · C44 + 0,5809 · C46 + 1,2926 · C48 +
1,0306 · C50 + 0,9953 · C52 + 1,2396 · C54 = S; SD = 0,11323
3,6644 · C28 + 5,2297 · C30 – 12,5073 · C32 + 4,4285 · C34 – 0,2010 · C36 + 1,2791 · C38 + 6,7433 · C40 –
4,2714 · C42 + 6,3739 · C46 = S; SD = 0,81094
6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 +
0,9892 · C54 = S; SD = 0,39897
Por conseguinte, para a verificação de uma amostra de matéria gorda desconhecida, devem ser utilizadas todas as
fórmulas indicadas no quadro 2 e a fórmula total (2), se for provável que a amostra consista numa mistura de matéria
gorda láctea e de uma das catorze diferentes matérias gordas estranhas ou numa combinação destas últimas. Se,
através da análise de triglicéridos de uma amostra de matéria gorda, for obtido um valor S não abrangido pelos
intervalos do quadro 3 para apenas uma das cinco fórmulas, poder-se-à concluir que é provável que a amostra
consista numa matéria gorda láctea modificada. A detecção de uma matéria gorda estranha na gordura do leite
através de uma das quatro fórmulas do quadro 2 não permite tirar conclusões quanto ao tipo de mistura de matéria
gorda estranha.
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/95
Quadro 3
Limites-S para matérias gordas lácteas
O quadro 4 indica os limites de detecção para as diferentes matérias gordas estranhas, com intervalo de confiança de
99 %. Da primeira coluna constam os limites de detecção mínimos para as melhores fórmulas respeitantes às matérias
gordas lácteas do quadro 2. A segunda coluna indica os limites de detecção para a fórmula total. Apesar de estes
limites serem ligeiramente superiores, só é necessária esta fórmula para detectar quantidades ligeiramente mais
elevadas de matérias gordas estranhas. Com todas as fórmulas, podem também ser detectadas combinações de
diferentes matérias gordas estranhas. Os intervalos de variação dos triglicéridos das diferentes matérias gordas
estranhas de um tipo não têm influência considerável nos limites de detecção.
Quadro 4
Limites de detecção, em %, para adição de gordura estranha à matéria gorda láctea, com um intervalo de
confiança de 99 %
Nota: Os intervalos-S são calculados de modo a que a preseença de uma matéria gorda estranha só pode ser
estabelecida se os limites das fórmulas individuais forem superadas (ver quadro 4).
em que X é a quantidade de matéria gorda estranha desconhecida ou de uma mistura de matéria gorda estranha numa
matéria gorda láctea desconhecida. S resulta da adição de uma gordura desconhecida, inserindo os triglicéridos da
matéria gorda estranha/mistura de matéria gorda láctea na fórmula total de triglicéridos anteriormente indicada. Se
for adicionada uma gordura estranha desconhecida à matéria gorda láctea, escolhe-se para SF o valor médio S das
diferentes matérias gordas estranhas para a fórmula total; este valor médio S é obtido adicionando os dados dos
triglicéridos de matérias gordas estranhas puras a esta fórmula e calculando o valor médio (SF = 7,46). São também
obtidos resultados quantitativos adequados respeitantes a qualquer adição de matéria gorda estranha utilizando a
fórmula relativa ao óleo de palma/gordura de bovino (quadro 2) e um valor médio SF de 10,57.
A partir de tipos de matéria gorda estranha conhecidos, devem ser adicionados os seguintes valores SF na fórmula
anterior, devendo ser escolhida a fórmula respectiva de matéria gorda estranha do quadro 2:
L 37/96 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 7.2.2001
Quadro 5
O método descrito aplica-se a leite a granel e baseia-se na representatividade das amostras da matéria gorda láctea.
Seria possível uma detecção altamente específica se, para um número representativo de matérias gordas lácteas, as
fórmulas anteriormente descritas fossem provenientes de diferentes países.
A probabilidade de detecção seria mais elevada se fosse estabelecido, para um número representativo de matérias
gordas lácteas, fórmulas para diferentes países, como as anteriormente descritas. Neste caso, não é necessário a
utilização de programas complexos de informática caso as combinações de triglicéridos usadas no quadro 2 sejam
aplicadas e os factores redeterminados utilizando o método dos mínimos quadrados.
Através da aplicação dos intervalos S como indicado no quadro 3, as fórmulas são geralmente aplicáveis, em
condições especiais de alimentação como, por exemplo, a subalimentação ou a alimentação de bovinos com
alimentos fermentados ou sais de cálcio. Só no caso de condições extremas de alimentação (por exemplo, adminis-
tração de grandes quantidades de óleos alimentares puros ou de sais de cálcio combinados com alimentos gordos,
etc.), as fórmulas indicam parcialmente uma matéria gorda láctea modificada.
Nota: As matérias gordas fraccionadas são geralmente consideradas matérias gordas não modificadas, e só se conclui
que existe uma modificação se forem superados os limites. As fórmulas só indicam uma modificação com
matérias gordas lácteas fraccionadas que apresentem uma composição de gordura inabitual como, por
exemplo, no caso de uma fracção dura obtida através do fraccionamento, por métodos físicos a altas
temperaturas de aproximadamente 30 °C, com baixos rendimentos de poucos pontos percentuais ou com o
fraccionamento em condições supercríticas de dióxido de carbono.
O fraccionamento da matéria gorda láctea pode, no entanto, ser detectado utilizando outros processos, como
por exemplo, a análise calorimétrica diferencial.
Determinada utilizando matéria gorda láctea com base nas fórmulas do quadro 2 e nos intervalos-S do quadro 3.
11.1. Repetibilidade
A diferença entre os valores-S de duas determinações realizadas com o menor intervalo de tempo possível,
por um operador, utilizando a mesma técnica e material de amostra idêntico, nas mesmas condições (mesmo
operador, mesmo equipamento/instrumentos, mesmo laboratório).
7.2.2001 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 37/97
Quadro 6
Fórmula de detecção de r
11.2. Reprodutibilidade
A diferença dos valores-S de duas determinações realizadas por operadores em laboratórios diferentes,
utilizando a mesma técnica e material de amostra idêntico, em condições diferentes (operador diferente,
diferente equipamento/instrumentos) em ocasiões diferentes.
Quadro 7
Fórmula de detecção R
A partir dos limites de repetibilidade (r) e de reprodutibilidade (R) podem ser calculadas as diferenças críticas
para todos os intervalos-S do quadro 3 (análises duplicadas). Os respectivos valores são indicados no quadro
8.
Quadro 8
ANEXO XXVI
— Regulamento (CEE) n.o 1216/68 da Comissão, de 9 de Agosto de 1968, que determina o método de verificação do
teor em lactose dos alimentos compostos para animais importados em proveniência de países terceiros (1) alterado
pelo Regulamento (CEE) n.o 222/88 da Comissão, de 22 de Dezembro de 1987, que altera certos actos relativos à
aplicação da organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos (2),
— Regulamento (CEE) n.o 3942/92 da Comissão, de 22 de Dezembro de 1992, que estabelece o método de referência
para a determinação do sitosterol e do estigmasterol no butteroil (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo
Regulamento (CE) n.o 175/1999 da Comissão alterado pelos Regulamentos (CEE) n.o 3942/92, (CE) n.o 86/94, (CE) n.o
1082/96 e (CE) n.o 1459/98, que estabelecem métodos de referência para a determinação de marcadores na manteiga,
no butteroil e na nata (4),
— Regulamento (CE) n.o 86/94 da Comissão, de 19 de Janeiro de 1994, que estabelece o método de referência para a
determinação do sitosterol e do estigmasterol na manteiga (5), alterado pelo Regulamento (CE) n.o 175/1999,
— Regulamento (CE) n.o 2721/95 da Comissão, de 24 de Novembro de 1995, que estabelece as normas de execução dos
métodos de referência e dos métodos de rotina a utilizar na análise e na avaliação qualitativa do leite e dos produtos
lácteos no âmbito da organização comum de mercado (6),
— Regulamento (CE) n.o 1080/96 da Comissão, de 14 de Junho de 1996,que estabelece um método de referência para a
detecção de coliformes na manteiga, leite em pó desnatado e caseina/caseinatos (7),
— Regulamento (CE) n.o 1081/96 da Comissão, de l4 de Junho de 1996, que estabelece um método de referência para a
detecção de caseína de leite de vaca em queijos de leite de ovelha, de cabra ou de búfala ou de misturas de leites de
ovelha, cabra e búfala e que revoga o Regulamento (CEE) n.o 690/92 (8),
— Regulamento (CE) n.o 1082/96 da Comissão de 14 de Junho de 1996 que estabelece um método de referência para a
determinação do éster etílico do ácido β-apo-8'- caroténico na manteiga e na manteiga concentrada (9), alterado pelo
Regulamento (CE) n.o 175/1999,
— Regulamento (CE) n.o 1854/96 da Comissão de 26 de Setembro de 1996, que estabelece uma lista dos métodos de
referência a utilizar na análise e avaliação qualitativa do leite e dos produtos lácteos no âmbito da organização comum
de mercado (10) alterado pelo Regulamento (CE) n.o 881/1999 (11),
— Regulamento (CE) n.o 880/98 da Comissão, de 24 de Abril de 1998, que estabelece métodos de referência para a
determinação dos teores de água, resíduo seco isento de matéria gorda e matéria gorda da manteiga (12),
— Regulamento (CE) n.o 1459/98 da Comissão, de 8 de Julho de 1998, que estabelece um método de referência para a
determinação do teor de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga ou na nata (13), alterado pelo Regulamento
(CE) n.o 175/1999.