Escola Superior de Tecnologia EST

Curso de Engenharia Qumica

Microbiologia Industrial

AULA PRTICA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

1- TEMA 1: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
2- OBJETIVOS DA AULA
Mostrar aos alunos a tcnica de isolamento de microrganismos
de diferentes substratos utilizando a tcnica de diluio sucessiva
e espalhamento em superfcie;

Apresentar aos alunos a diversidade microbiana presente em

diferentes substratos.

3- INTRODUO
3.1 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Isolamento consiste na obteno de culturas puras que envolvem
somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de
uma colnia atravs da observao da produo de determinado produto ou da
morfologia da colnia.
Apesar

de

existir

possibilidade

de

utilizar

microrganismos

geneticamente modificados, ainda possvel encontrar uma grande variedade

de novos microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser at
comercialmente interessantes. A primeira etapa para a utilizao de um
microrganismo de interesse industrial muitas vezes a etapa de isolamento de
uma colnia.
Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o
microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada
cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de

caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros

microrganismos e em uma densidade populacional muito maior do que a
encontrada em amostras de meio ambiente. No entanto, alguns fatores podem
ser alterados justamente por esse motivo, pois no meio ambiente ocorre uma
interao entre diversas espcies e nutrientes, podendo, por exemplo,
modificar o formato, a textura e a colorao de colnias.

3.2 ISOLAMENTO EM MEIO SLIDO

Antigamente, as tentativas de isolamento eram feitas somente atravs
de meios lquidos, sendo assim muito difcil isolar microrganismos como
bactrias. Em 1881, Koch fez uma tentativa de cultivo slido em superfcie de
batata. Por volta do mesmo tempo, um associado de Koch, Frederick Loeffler,
desenvolveu o extrato de carne peptonado para o cultivo de bactrias
patognicas e Koch tentou solidificar esse meio. Ele conseguiu atravs da
mistura do meio com gelatina em um suporte slido que permitia a sua
solidificao, mas tinha a desvantagem de se liquefazer temperaturas
superiores a 28C e ser degradado por vrias espcies microbianas que
possuem gelatinase.
Por volta do ano de 1882, passou-se a se utilizar gar como agente
solidificante, que foi descoberto por Minora Tarazaemon, um japons dono de
uma hospedaria, ao perceber que uma sopa de algas tinha gelificado aps uma
noite fria. Outro agente solidificante o cido silcico, o qual quimicamente
definido. Ele importante na preparao de meios que devem ser
rigorosamente definidos.

3.3 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS

Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de
uma ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se
uma pequena parcela do meio de inculo e o espalha sobre uma placa de Petri
com gar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um caminho na
forma de estrias. Existem vrias possibilidades de fazer essas estrias, sendo

ela descontnua ou contnua. A forma descontnua seria feita como mostrado na

figura absixo, onde so feitas estrias na poro 1 da placa e em seguida
flamba-se a ala; aps, faz-se uma retirada de bactrias da regio 1 e espalhase sobre a regio 2; flamba-se mais uma vez e espalha-se bactrias da regio
2 na 3. As colnias presentes na regio 3 estaro mais isoladas.
Fazendo de forma contnua, haveria primeiramente a coleta de uma
pequena quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma
das bordas da placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de
estrias at a outra borda da placa.

3.4 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO

Nessa tcnica, que mostrada na figura abaixo, um pequeno volume da
soluo de microrganismos contendo de 30-300 clulas transferido para o
cento de uma placa de gar j solidificado com o auxlio de uma pipeta estril.
Em seguida, mergulha-se uma ala de Drigalski em lcool e a flamba de modo
a manter todo o material estril. Com o auxlio dessa ala, espalha-se aquele
volume depositado por toda a superfcie do gar. As colnias crescero
espalhadas por toda a superfcie do gar.

3.5 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO

O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm denominado
de pour plate muito utilizado para bactrias e fungos. A amostra
original diluda de forma que quando feita a placa consegue-se
colnias bem separadas. Um pequeno volume da melhor diluio
ento derramado em uma placa de Petri sem gar. Em seguida,
derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e mistura-se os dois
com uma agitao leve da placa e deixa-se o meio solidificar.

3.6 CULTURAS PURAS DE BACTRIAS

Ao fazer o isolamento das culturas, no s de bactrias, mas tambm de

outros microrganismos, deve-se fazer uma coleta de material ambiental com
instrumentos estreis.
Bactrias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo
necessita de um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam gar
suplementado com extratos na concentrao de 10 a 50% do volume total,
outras necessitam de infuses feitas do material da onde foram coletadas (solo,
lama, folhas, pedras, troncos, detritos). Podem ser usados tambm alguns
meios seletivos como gar sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey.
3.7 CULTURAS PURAS DE FUNGOS

Fungos podem ser isolados de diversos materiais. Devido sua preferncia

por substratos que tambm forneam suporte para o seu crescimento, eles so
frequentemente encontrados em matria em decomposio, plantas, rochas e
solo. Em uma planta, por exemplo, dependendo do tecido que for coletado,
pode-se encontrar diferentes tipos de fungos.
Esses microrganismos tambm so bastante variados, e a mudana de
somente um dos constituintes de um meio de cultivo pode resultar no
isolamento de um fungo diferente. Para a seleo de um meio, deve-se
considerar as condies fsicas do meio de origem e o tipo de fungo que se
deseja. A luminosidade tambm um fator importante s vezes, pois alguns
fungos necessitam de luz para frutificarem.
Macrofungos tem o isolamento facilitado, pois possvel isol-los do
ambiente atravs da coleta de tecidos, esporos ou estruturas vegetativas.
3.8 PROCEDIMENTO
1- Pesar 1g do material e transferir para o primeiro tubo de ensaio
contendo gua destilada estril;
2- Agitar o primeiro tubo at homogeneizar o contedo e, em seguida,
retirar 1000L do primeiro tubo e passar para o segundo tubo com soluo
salina;
3- Repetir o procedimento 2 at o ltimo tubo com a ltima diluio;

4- Em seguida, transferir 200 L dos tubos da primeira, terceira e quinta

diluies para as placas de Petri contendo meio Agar sabouraud e
espalhar o contedo sobre a superfcie do meio com o auxlio de uma
ala de Drigalski.
5- Incubar as placas temperatura ambiente e observar o crescimento de
microrganismos.
6- Cada grupo dever trazer seu material para que seja feita a pesagem e
diluio nos tubos. Segue a lista do material de cada grupo:
a. GRUPO 1 - Terra (deve ser coletada de solo mido)
b. GRUPO 2 - Leite (de preferncia que j esteja h algum tempo
aberto na geladeira no pode ser leite em p)
c. GRUPO 3 - Fruta (a fruta deve estar bem madura, quase
estragada)
d. GRUPO 4 - Folhas (coletar algumas folhas que j estejam cadas
no cho, em lugar com alguma unidade)
e. GRUPO 5 - Po (de preferncia embolorado)
f. GRUPO 6 - gua da torneira (essa vai ser coletada no
laboratrio)
g. GRUPO 7 - Um vegetal (j deve estar quase estragado)
h. GRUPO 8 um pedao de carne (esse pode ser deixado fora da
geladeira de hoje pra amanh).
7- OBS.: S LEMBRANDO QUE VAMOS USAR APENAS 1g DE CADA
UM DESSES MATERIAIS. ENTO, NO PRECISAM LEVAR GRANDE
QUANTIDADE PARA O LABORATRIO.