06/11/2015

Apresenilina1dependente[gamma]secretaselikeproteasemedeialiberaodeNotchdomniointracelular:Artigo:Natureza

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CartasaNatureza
Nature398,518522(8Abrilde1999)|doi:10.1038/19083Recebido05
denovembrode1998Aceito05defevereirode1999

Apresenilina1dependente protease
secretaselikemedeialiberaodeNotch
domniointracelular
BartDeStrooper 1,WimAnnaert 1,PhilippeCupers 1,Paul
Saftig 2,KatleenCraessaerts 1,JeffreyS.Mumm 3,EricH.
Schroeter 3,VincentSchrijvers 1,MichaelS.Wolfe 4,
WilliamJ.Ray 5,AlisonGoate5&RaphaelKopan 3
1. BiologiacelularneuronaleLaboratriodeTransfernciadeGene,
InstitutodeBiotecnologiaFlanders(VIB4),CentrodeGentica
Humana,KULeuven,B3000Leuven,Blgica
2. ZentrumBiochemieundMolekulareZellbiologie,AbteilungBiochemie
II,UniversittGttingen,B37073,Alemanha
3. DivisodeDermatologiaedoDepartamentodeBiologiaMoleculare
FarmacologiadaUniversidadedeWashington,StLouis,Missouri63110,
EUA
4. DepartamentodeCinciasFarmacuticasdaUniversidadede
Tennessee,Memphis,Tennesse38138,EUA
5. DepartamentosdePsiquiatriaeGenticadaFaculdadedeMedicinada
UniversidadedeWashington,StLouis,Missouri63110,EUA
Endereoparacorrespondncia:BartDeStrooper 1RaphaelKopan 3
correspondnciaepedidosdemateriaisdevemserendereadasaoBDS(e
mail:Email:Bart.Destrooper@med.kuleuven.ac.be)ouRK(email:Email:
Kopan@Pharmsun.Wustl.Edu).

Sinalizaoatravsdoentalheprotenado
Topo
receptor,queestenvolvidanodestinocelular
cruciaisduranteodesenvolvimento,requeraclivagem
induzidapeloligandodeNotch.Estaclivagemocorre
dentrododomniotransmembranarprevisto,libertando
odomniointracelulardeNotch(NiCd),e
reminiscenteda clivagemmediadaporsecretasede
protenaprecursoradeamilide(APP),um
acontecimentocrticonapatognesedadoenade
Alzheimer.Umadeficincianapresenilina1(PS1)inibe
oprocessamentodaAPPpela secretaseemclulas
demamferos,einteracesgenticasentreNotche
homlogosPS1emCaenorhabditiselegansindicamque
aspresenilinaspodemodularaviadesinalizaoNotch
1,2,3,4.Aquimostramosque,emclulasde
mamferos,adeficinciadePS1tambmreduza
libertaoproteolticadeNICDdeumaconstruode
Notchtruncada,identificandoassimopassobioqumico
especficodaviadesinalizaodeNotchque
afectadaporPS1.Almdisso,vrios inibidoresde
secretasebloquearestamesmaetapano

http://www.nature.com/nature/journal/v398/n6727/full/398518a0.html

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Mtodos
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Apresenilina1dependente[gamma]secretaselikeproteasemedeialiberaodeNotchdomniointracelular:Artigo:Natureza

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Nature
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Scitable
Genetics

NPGrevistas
porrea
temtica

processamentodeNotch,indicandoqueasatividades
deproteaserelacionadossoresponsveis
pela

clivagemdentrodosdomniostransmembranares
previstosdeNotcheAPP.Assim,odireccionamentoda
secretaseparaotratamentodadoenadeAlzheimer
podeoriscodetoxicidadecausadaporreduodosinal
deNotch.
Notch1sintetizadocomoumaprotenadetipoI
integrantedamembranaderelaodemassamolecularde
300.000(H R 300K)(Fig.1)queclivadaporuma
proteasetipofurinanoGolgiduranteotrficodeNotch
paraasuperfciecelular.Osdoisfragmentosproteolticos
permanecemassociadasparaformaroreceptorfuncional5,
6.Nasequnciadeligaodoligando,Notch1sofremais
clivagempertooudentrodeseudomniotransmembranar,
liberandooNICD.ONiCdtranslocaparaoncleoemodifica
atranscriodegenesalvoatravsdasuaassociaocom
protenasCSL(ondeCSLmeiosCBF1,Su(H),LAG1) 7,8,9.

Qumica
Qumica
Descobertade
drogas

Osfragmentosproteolticos(NiCde e
stubs)econstrues(Mn E)usados
para

analisarNotch1edometabolismodeAPP
estoindiciados,comosoasproteases
envolvidasnoprocessamento(furina, ',
, e secretases,elocal1esite2
proteases).Paraumadiscussomaisampla
sobreasanalogiasentreaAPP,Notch1e
SREBPprocessamento,verref.30.

Materiais
Mtodose
protocolos
PrticaClnicae
Pesquisa

Medicina
cardiovascular

Mtodose
protocolos
Pathology&
Pathobiology
Urologia
TerraeMeio
Ambiente
CinciasdaTerra
EvoluoeEcologia
CinciasdaVida
Biotecnologia
Cncer
Desenvolvimento
Descobertade
drogas
EvoluoeEcologia
Gentica
Imunologia
Pesquisamdica
Mtodose
protocolos
Microbiologia
Biologiacelular
molecular
Neuroscience

PhilippeCupers
PaulSaftig
KatleenCraessaerts
JeffreyS.Mumm
maisautoresdeste
artigo

openinnovation
challenges

Restauraodehabitats,
melhoriaecriaoem
rios,crregoseesturios
soelementoschavef
...
MaisDesafios
Distribudopor:

Endocrinologia
Gastroenterology&
Hepatology

WimAnnaert

Prazo:16de
novembrode2015
Recompensa:$
30.000USD

Imagemdealtaresoluoelegenda
(12K)

Cncer

BartDeStrooper

Quantificando
Invertebradosderiva
norioenoEsturio
Sistemas

Figura1:AclivagemproteolticadeNotch,APPe
SREBP(semescala).

Biotecnologia

PESQUISAPARA
PUBMED

APPtambmumaprotenademembranadotipointegral
I.APPoprecursordaamilide peptdeo,que
depositadanocrebrodospacientescomdoenade
Alzheimer.Amiloe pptidoderivadodeAPP,como
umresultadodaclivagemdeAPPpor e.secretase,
Cujanaturezamolecularpermaneceobscura cliva
secretaseodomnioextracelulardeAPP,produzindoum
ectodomniosolveleumfragmentocarboxiterminal
associadamembrana(Fig.1). secretasecatalisauma
clivagemintramembranosadestefragmentoassociada
membrana,resultandonageraodeamilide pptidoea
produodeumfragmentoCterminaldeAPP.Clivagemde
APPpela secretaseseopeaproduodeamilide
peptdeo(Fig.1).Opapelfuncional(s)destesfragmentos
deAPPdesconhecido.Estudosgenticosebioqumicos
tmimplicadooseventosdeprocessamentoqueconduzam
aproteolticasamiloe geraopptidonapatognese
dadoenadeAlzheimer.MutaesemAPPeaspresenilinas
(PS1ePS2)causardoenafamiliardeincioprecocede
Alzheimer,easmutaespresenilinalevaraumaumento
processamentodeAPPpela secretaseinvitroeinvivo10.
PS1deficienteshowderatosdiminuiu processamento
secretasedeAPP 4eanormalidadesdodesenvolvimento
consistentescomasinalizaoNotchalterada2,3.
InteracesgenticasentreoentalhehomlogosGLP1e
lin12eapresenilinahomlogossel12elpulo1emC.
elegansfornecerevidnciasindiretasparaoenvolvimento
dospresenilinasnaviadesinalizaoNotch1,11.Aquins
identificaropassoespecficonasinalizaoNotch,que
controladoporPS1.

http://www.nature.com/nature/journal/v398/n6727/full/398518a0.html

naturezaempregos
Faculdadevagas
disponveisem
Universidadedo
Sudoeste,Chongqing,
China
SUDOESTEUNIVERSITY

PosiesFaculdade
conjuntasnoCentro
deBiologia
QuantitativaePeking
TsinghuaCentrode
CinciasdaVida
CentrodeBiologia
QuantitativaePeking
TsinghuaCentrodeCincias
daVidadaUniversidadede
Pequim

Maisempregoscincia
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Farmacologia
Biologiade
sistemas
Cinciasfsicas
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Apresenilina1dependente[gamma]secretaselikeproteasemedeialiberaodeNotchdomniointracelular:Artigo:Natureza

EmprimeirolugartemosinvestigadoseaausnciadePS1
interferecomaexpressonormaldoentalhe,talcomofoi
sugerido2.UtilizouseapartirdeextractosdecrebroPS1
deficiente(PS1 /)embriesderatinhonodia
embrionrio(E)14.Talcomoesperado,nenhuma
expressodosfragmentosaminoterminaisouCterminais
dePS1foiencontrada(Fig.2aeref.4).Almdisso,de
acordocomosnossosresultadosanterioresobtidosapartir
deestudodasculturasneuronais 4,observouseuma
acumulaoderatoendgenafragmentosAPPCterminais
nosmesmosextratosdecrebro,indicandodeficiente
processamentosecretasedeAPPquandoPS1estausente
(Fig.2a,setainferior).Estesfragmentosso
predominantemente'topos'produzidopelasecretase,
porqueratoAPPendgenonoumbomsubstratoparaa
secretase(devidopresenadesubstituiesde
aminocidosentreoratoeassequnciashumanasnolocal
secretase)4, 12.Nosmesmoshomogeneizados,
wedetectednveisdeestadoestacionrionormaisdeNotch
1fragmentosCterminaisdefurinaprocessados,indicando
quePS1nonecessriaparaabiossntesedoentalheou
porclivagemdefurinanoGolgi(Fig.2b).MaturaoNotch
PS1independentetambmfoiobservadoinvitro,em
fibroblastosdemurganhoderivadasdaPS1 /embries
(Fig.2c).ConclumosquePS1 /clulasdecamundongo
produzirquantidadesnormaisdeprotenamadura1(clivada
porfurina)Notch.

Figura2:ProcessamentodeAPPeNotch1emPS1
/crebrodoratoeMEFs.
Asprotenasforamdetectadasemmanchas
Western.Um, extractosdecrebro
membrana(420%deSDSPAGE,50gpor
pista)foramfeitosreagircomAPP675695,
umantisoroespecficoparaoterminalC
deAPPoucomumantisoroespecficopara
oPS1Nterminal(PS1NTF).Setas
identificarPS1NTFeummouseAPP
fragmentogeradopelo processamento
secretasemediada(mouseAPP stubs).
B, Notch1foiimunoprecipitadaapartir
de100gdeextractodecrebrousandoIC
antisoro,umantisoroantiNotch1 5e
coradoscomoanticorpomonoclonalTan20
(Ref.6)(6%deSDSPAGE).TMIC
identificaogeradofurinaNotch1madura
fragmento.C, extractosdeclulasMEF
foramfeitosreagircommN1A,um
anticorpomonoclonalcontraaNotch1(4
20%deSDSPAGE,50gporpista).
Imagemdealtaresoluoelegenda
(24K)

AssemelhanasentreatransformaoproteolticadeNotch
eAPPsoimpressionantes,especialmenteoseventosfinais
proteolticasqueliberamosdomnioscitoplasmticos,
levantandoapossibilidadedequePS1podemediara
clivagemproteolticaintramembranosodeNotch1para
liberarNICD 7,8,9.ComoosnveisendgenosNICDem
clulasetecidossobioquimicamenteabaixodonvelde
deteco 7, aproveitamosduasconstruesNotchbem
caracterizados,mNotchEeN ICV,queforamutilizadospara
demonstrararelaoentreoprocessamentodeesinalizaoatravs
Notch1(refs7,13).OmNotchEconstruircodificaa

transmembranaedomniosintracelularesdemurinoNotch
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1esofreumanicaclivagemproteolticaparalibertar
NiCd.EstaclivagemseassemelhaaclivagemdoNotch1
endgenoemtodososaspectos7,13.AN ICVconstruo
codificaodomniointracelulardeNotch1semancorade
membrana,produzindoumaprotenaidnticadeNiCd.N
ICVfoiusadocomoumcontroloparathefatedeNiCdPS1 /
clulas7.Ambasasconstruestmpartedoseudomnio
CterminalsubstitudocomseismarcasMycepitopo
consecutivos7.Nsclonadasdestasconstruesemvrus
recombinanteflorestadeSemliki(SFV)vector,para
permitirasuaexpressoemculturasprimriasde
neurnios4.Aexpressoelocalizaosubcelularda
mNotchEeramsimilaresnotiposelvagemePS1 /
clulas,comotambmfoiocasoparaN ICV(Fig.3).No
entanto,aprotenaNICDproduzidaapartirdeN ICV
translocadaparaoncleoemambosPS1 +/+ePS1 /
(neurniosFig.3,painisinferiores),aopassoquea
coloraonuclearnotiposelvagemePS1 /neurnios
expressandomNotchEestavaquaseindetectvel,oque
indicaqueasquantidadesrelativasdeNICDem
comparaocomnotransformadosmNotchEestavam
abaixodolimitededetecodonossoensaiode
imunofluorescncia(Fig.3,painissuperiores).Estas
observaessoconcordantescomaevidnciagenticade
C.elegansquesel12mutaesnointerfiramcomlin12
sinalizaoquandooLIN12domniointracelularexpressa
sozinho11.

Figura3:otransportenucleardodomnio
intracelular(NiCd)deNotch1.
OsneurniosforamtransfectadascomSFV
expressodeconduomNotch EouN ICV
(queidnticoaoNiCd),fixae
imunocoradas.Fluorescnciavermelha
indicaMycmarcadomNotch E(painis
superiores)ouNICDfragmento(painis
inferiores).ImportaonucleardeNICD
noperturbadonaPS1 /neurnios.A
fluorescnciaverdenospainisinferiores
indicaimmunoreactivitydireocalnexin,
revelandoaER.Apresenadeneurnios
noinfectadasnospainisinferiores
mostramaespecificidadedacoloraoanti
Myc.+/+,PS1 +/+neurnios:/,PS1
/neurnios.
Imagemdealtaresoluoelegenda
(33K)

ParaensaiardirectamenteopapeldePS1emmNotch E
clivagem,realizamosexperimentospulsechaseeanalisou
ageraodeNICD.Dentrode3060minutos,aps
marcaocom 35Smetionina,foidetectadapelaprimeira
vezNICDemPS1 +/+culturas.NICDcontinuaramase
acumularaolongodoperododeperseguiode120
minutos(Fig4a.,B proporodeNICDparatotalizar
mNotchEpresentenopontodeinciodaperseguio).Em
contraste,aproduodeNICDfoigrandementereduzida
emPS1 /(neurniosFig.4a,b).ComooPS1 /
embriestendemaproduzirmenosclulasdoqueosseus
irmosdeninhadadetiposelvagem 4,analisamosodobroda
quantidadedePS1/extractoscelulares.Apenasquantidades
residuaisdeNICDforamdetectadosemPS1 /(neurnios
Fig.4c),mesmoquandoomNotchsinalEeramaisfortedo
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quenasPS1 +/+extractoscelulares.Estadiferenano
pdeserexplicadoporumamaiortaxaderotaodeNiCd
PS1 /neurnios,asNICDproduzidosapartirdecontrolo
N ICVconstruesmostraramamesmaestabilidadeem
ambosPS1 /ePS1 +/+clulas(Fig4d.).

Figura4:GeraodeNICDnoPS1+/+ePS1/
neurnios.
um, neurniostransfectadascomSFV
codificandomNotchEforammarcadas
durante30minedepoisperseguidaem
meionormal,talcomoindicado.Omaterial
imunoprecipitadofoiresolvidoem420%
SDSPAGE.B,imagiologiacomfsforo
anlisedeexperinciasrealizadas
comoemum.OmNotchsinalEnotempo
zerofoitomadacomo100%(pistas
marcadas0'emum).NICDproduzidoa
partirdemNotchEemcadapontode
tempofoinormalizadoparaosinal(fraco
produzido).OsvaloressomdiasSEM(n
=3).C,experinciadecontrolo,realizado
comoemum,masutilizandoodobrodo
materialfromPS1/neurnios.NICD
dificilmentedetectvelem120minou240
mindeperseguionaPS1 /neurnios
(setaparaaesquerda),mesmoquando
maismNotch.Eprecursorcarregadod,
volumedenegciosdeNICDidntica
emPS1+/+ePS1 /neurnios
transfectadascomcodificaoSFVN ICV.
neurnios.Osforammarcadasdurante30
minseguidodeumaperseguioconforme
indicadoe,mNotchEfoiexpressaemPS1
+/+ePS1 /MEFs.Emseguida,
analisamosextratosMEF(esquerda)e
imunoprecipitadosproduzidosusando
anticorposantiFlagCSL(direita)por
transfernciadewestern.NICDest
presenteemPS1 +/+extractoscelularese
indetectvelemPS1 /extractos
celulares.EnriquecedorparaNICDusando
antiCSLcoimunoprecipitaorevela
quantidadesresiduaisdeNICDnaPS1 /
clulas(5mindeexposio,em
comparaocom20snasoutraspistas).
Asteriskindicaumadegradaopeptdica
pslise.
Imagemdealtaresoluoelegenda
(24K)

Paratestarageneralidadedestaobservaonaoutra,no
neuronal,PS1tipodeclula,quetransitoriamente
transfectadas /fibroblastoscommNotch plasmdeosE.
EmboraNICDfoiproduzidoemPS1 +/+clulas,era
dificilmentedetectvelnoPS1 /extractosdeclulas(Fig.
4e,extrato).CoimunoprecipitaodeNICDcomoseu
parceironuclear,cometiquetasFlagCSL RBP3(Ref.7),
confirmouaexistnciadequantidadesmuitobaixasdeNiCd
PS1 /clulas(Fig.4e).Comoquantidadesresiduaisde
ambosNiCdeamiloepptidopodeserdetectadaem
PS /clulas,possvelqueohomlogoPS2PS1
(expressaemPS1 /clulasKCeBDS,observaesno
publicadas),podecompensarparcialmenteoperdada
funoPS1.ConcluisequeaproduodeNICDdiminudo
acentuadamentenaPS1 /clulas.
OlocaldeclivagemdeNotch1,libertandobateriasde
NiCd,podeocorrernaposioananalogousaolocalde
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clivagemdeAPPpela secretase 14,Nterminalrelativamenteao

sinaldeparagemdetransfernciaRKRRRQ7.Estaclivagem
aparentementeintramembranosaincomumeocorreem
apenasumaprotenaotherknown,aprotenadeligaode
esterolreguladorelemento(SREBP) 15(Fig.1).Noentanto,
osmutantesdeficientesemSREBPclivagemnomostram
nenhumaanormalidadenageraodeamilidepptido,o
queindicaqueaenzimaquemedeiaaclivagemSREBPno
podemestarestreitamenterelacionadocomsecretase16.
NenhumefeitosobreoprocessamentodeSREBPforam
observadosemPS1 /clulas(dadosnomostrados).Em
contraste,osnossosresultadosdePS1 /clulasmostram
quePS1importanteparaaclivagemdeambosNotch1e
APP.Paradeterminarseaenzimaresponsvelpela
libertaodoNICDtempropriedadesfarmacolgicas
semelhantesasecretase,quecomparouosefeitosde
inibidoresdeproteasesobreoprocessamentodeNotch1e
APP,aseleodeinibidoresqueforammostrados
19,20.Estes

anteriormenteparabloquearsecretase 17,18,
inibidorestambminterferircommNotchEprocessamento
(Fig.5erefs7,13).MDL28170,queuminibidorda
calpainapptidoaldedo,foioprimeiroinibidormostrado
parainterferircomsecretase 18,eMG132,outropptido
aldedo,tambminibeasecretase.Noentanto,MG132(e,
possivelmente,MDL28170)sorelativamenteinibidoresde
proteasedelargoespectroqueinibemoproteassoma.Ns
excluirapossibilidadedequeainibiodoproteassoma
estenvolvidonosefeitosobservadosdeMDL28170e
MG132noprocessamentodeNotch1usandolactacistina,
uminibidordeproteassomaespecfica,quenotem
nenhumefeitosobreageraodeNICD(Fig.5eEHSeRK,
observaesnopublicadas).Damesmaforma,lactacistina
noafectaaclivagemmediadaporsecretasedeAPP21.

Figura5:Efeitode inibidoresdesecretaseem
mNotch processamentodeE.
OsneurniosforamtransfectadascomSFV
codificandomNotch Ecomonafig.4a,c.
Etiquetafoiperseguidadurante4hna
presenade1%deDMSO(controlo),MDL
28170(100M),lactacistina(100M)ou
MG132(20M).Ossinaismaisfortesna
pistalactacistinaprovavelmenterefletema
estabilizaodamNotchEquandoo
proteassomainibida.
Imagemdealtaresoluoelegenda
(33K)

Paraexploraraindamaisasemelhanaaparenteentre
secretaseeoNotch1protease,foiutilizadaa MW167
inibidorsecretase,umanlogodepptidocetonadifluoro
concebidoscombasenasequnciaprimriadolocalde
clivagempela secretasedeAPPem17.Estecomposto
inibiu,deumaformadependentedaconcentrao,a
clivagemmediadaporsecretasedeAPPhumanoexpresso
emneurniosqueutilizamrecombinantedeSFV(Fig.6),
queconduzacumulaodetoposdeAPPCterminaisea
inibiodeamilidesecreopptidoparaomeio.Como
ambosefragmentossecretaseprocessadoapareceunas
clulas(estubs,Fig.6)e,comoasecreodo
ectodomnioAPPnomeionofoiafectada(dadosno
mostrados),nemnemaactividadeenzimticainibida
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secretaseporMW167(vertambmref.17).Processamento
demNotchEfoiinibidaporMW167emconcentraes
semelhantestothosequeinibemoprocessamentodeAPP
(Fig.6).Ametadedovalormximoestimadoda
concentraoinibitria(IC 50)paraMW167(10M)em
mNotchprocessamentoEquaseidnticasuaIC 50para
APP17.MW167tambmumpotenteinibidordacatepsina
D22Noentanto,usandoumasriedeanlogosdifluoro
cetnicosrelacionados,descobrimosqueoefeitodaMW167
noprocessamentodeAPPnoumaconsequnciada
catepsinaDinibio22.Ostrsinibidores(MG132,
MDL28170eoquimicamentediferenteMW167)todasinibir
mNotchprocessamentoEeclivagemmediadasecretasede
APPigualforma.Emboranemsecretasenemaenzimaque
clivamNotchEfoiaindapurificado,osnossosresultados
soconsistentescomahiptesedequeestasduas
actividadesproteolticasestointimamenterelacionados.

Figura6:Efeitoda secretaseinibidorMW167em
processamentodemNotch E(painelsuperior)e
APP(painisinferiores).
NeurniosSFVinfectadasforammarcadas
compulsodurante30minefoiperseguida
etiquetadurante4h,napresenade
veculodeDMSOouasconcentraes
indicadasdeMW167.mNotch EeNICD
foramimunoprecipitadosutilizando
anticorposantiMyc.ToposdeAPP(que
reflectem secretasee processamento
secretasemediadadeAPPhumana)e
amiloe pptido(Um pptido4h
etiquetagem)foramimunoprecipitados
comodescrito4,12.
Imagemdealtaresoluoelegenda
(74K)

NsmostramosqueotratamentoeficientedeNotch1para
produzirNICDrequerPS1einibidapor inibidoresde
secretase.NsmostramosissousandoomNotch construto
E,ummodelodeprocessamentoforintracellularconfivel
deNotch1(ref.7).Almdisso,aexpressodeNotch1
endgena,asuamaturaoporumaenzimatipofurina,ea
translocaodeNICDparaoncleonosoafectadospela
deficinciadePS1.Notch1etantoaAPPexibemuma
interacogenticacompresenilinas 1,2,3, 11eso
clivadosporuma actividadedesecretasesemelhanteque
requerprotenaPS1paraefectuarumaclivagem
aparentementeintramembranosa.Estesresultados
fornecemumaexplicaoparaainteracomolecular
genticaamplamentedivulgadoentreNotch1ePS1(refs
13,11)emdiferentesespcies.
HtambmumainteracofsicadirectaentreNotchePS1
(Ref.23),comoexisteentreaAPPePS1/2(refs24,25).
AfunodePS1naNotch/processamentodeAPPpoderia
seradeum"facilitador",anlogafunodoretculo
endoplasmtico(ER)resident,multimembraneabrangendo
SCAPprotenaSREBPem 15deprocessamento.Tal
facilitadorpoderiaexpordiretamenteAPPeNotch1ao
secretase.Alternativamente,PS1possamindirectamente
regulamotrficocorretodeAPP,Notch1esecretasea
umsubcelular(micro)dedomniocomoaindaindefinido
ondeaclivagemocorre26.Noentanto,osnossos
resultadossotambmconsistentescomumpapelmais
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Apresenilina1dependente[gamma]secretaselikeproteasemedeialiberaodeNotchdomniointracelular:Artigo:Natureza

directoparaPS1comoumcomponentereguladorou
catalticodeprotease(s)queclivamo(s)Notch1eAPP.
Nestecaso,PS1teriaumpapelsimilaraodoERresidente
multimembraneSpanning2localdeprotease 27no
processamentodeSREBP(Fig.1).
Finalmente,nossosresultadostmimplicaes
significativasparaopotencialusode inibidoresde
secretasecomomedicamentosparaotratamentodadoena
deAlzheimer.Ainibioresultantedoprocessamentode
Notch1noadultoseriaprevistoparalevara
imunodeficinciaeanemiadevidofunoimportantede
Notch1emhematopoiesedurantetodaavida28,29.
Assim,podesernecessrioodesenvolvimentodeinibidores
especficosparaaclivagemmediadaporsecretasedeAPP
ouparaatingiroutrospassosnageraoedeposiode
amilidepptido.
Mtodos

Topo

AgeraoecaracterizaodePS1 /ratos,ageraode
culturasdeclulasneuronais,autilizaoderecombinante
deSFV,marcaometablica,aextracodeclulasea
imunoprecipitaoforamrealizadosduasvezescomo
descrito4,12.Paraasexperinciasdepulsechase,as
clulasdeumembrioforamsemeadasemumde12poos
ou4bemplacadeculturacelular(NUNC)prtratadascom
polilisinaesoro.Apsainfecocomorecombinante
apropriadoSFV4, 12,osneurniosforamdurante30
minutoscom200marcadocompulsoCi 35Smetioninapor
ml,eperseguidosduranteotempoindicado,emmeio
normal.Asclulasforamprocessadascomoantes12.Cada
pista(Figuras4a,c,d,5,6)mostraqueomaterialobtidoa
partirdeumpoo,eossinaisforamcomparadosentreos
embriesdamesmaninhada.MG132(Calbiochem),MDL
28170(fornecidaporB.Cordell)eMW167,cadaum
dissolvidoemdimetilsulfxido(DMSO),foramadicionados
nofinaldamarcaoporpulsoscomasconcentraes
finaisindicadas.DMSOnasculturasdeclulasfoide1%.
Crebrodoratofoihomogeneizadoem5mMdeTrisHCl,
pH7,4,250mMdesacarose,1mMdeEGTA,5mMde
EDTA,1 gml 1depepstatinaAe100mldeL 1
aprotinina,ecentrifugadoa500gdurante10min.O
sobrenadanteresultantefoicentrifugadoa100.000g
durante60min.OsedimentofoiressuspensoemPBSea
concentraodeprotenafoimedida(testedeprotenasde
Biorad).
Nsbanhado5 10 5fibroblastosderatoembrionrias
(MEFs)imortalizadascomSV40antgenoTgrandeem
placasde100mmetransfectadaselespeloCa 2PO 4

mtodo/BBS 13comambosBandeiraCSL RBP3emNotch

E.Apsaliseemtampodecoimunoprecipitao 7
contendoKCl200mM,10%daamostrafoiusadapara
anlisedeextractoembruto.Orestantefoico
imunoprecipitada 7utilizandoanticorpoantiFlag.Opelete
lavadofoiressuspensoem50 detampodelisede
LaemmliLeresolvidopor6%deSDSPAGE,transferidos
paramembranadenitroceluloseevisualizadosutilizando
9E10antiMycanticorpo7,13.Paraimunocitoqumica,
neurnioscultivadosemlamelasdevidroforamfixadosem
paraformaldedoa4%epermeabilizadasemmetanole
acetonagelada.Osanticorposforamdiludosemtampode
bloqueiodeslizaetampaforammontadasemMowiol
(Calbiochem).Asclulasforamanalisadasutilizandoum
http://www.nature.com/nature/journal/v398/n6727/full/398518a0.html

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microscpioconfocalMRC1024(Biorad).
OsDNAscomplementaresquecodificamparamNotch Ee
N ICV7, 13,(antisoroAPF67569512ref.)Utilizadopara
imunoprecipitaraApptocosCterminal,e(antisoro
APF59761212ref.) Utilizadoparaimunoprecipitar
amilidepeptdeotemForamdescritos.Nsusamos
mNotch EemqueMet1727foimutadoparaVal
alternativaparaprevenirainiciaodatraduo.Produo
NICDdemNotch Enoafetadoporestamutao,como
mostradoanteriormente7,13.B19/2foilevantadacontra
osaminocidos3044dePS1.CIantisorocontraodomnio
citoplasmticodemurinoNotch1(Ref.15)foifornecidapor
A.IsraeleutilizadoparaimunoprecipitarNotch1endgena
apartirdeextractosdecrebro.Anticorpomonoclonalde
ratoTan20(fornecidaporS.ArtavanisTsakonas)foi
utilizadoparaaimunodetecodeprecipitadoNotch1(Ref.
6).mN1A,umanticorpomonoclonalespecficoparao
domniocitoplasmticodeNotch1(fornecidoporL.Milner),
foiutilizadoparaadetecoderatoNotch1apartirde
extractosdeSDSMEF.Calnexinaantisoroeoanticorpo
monoclonalantiMyc9E10foramfornecidosporJ.A.
HeleniuseCremers.

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Agradecimentos

Topo

EstetrabalhofoiapoiadopeloFWOVlaanderen,aHuman
FrontierScienceProgramde,oInstitutoFlamengode
Biotecnologia(VIB)eKULeuven.BDS,WA,PCeKCso
pesquisadoresdaFWO.RK,MSWeAGsosuportadospelo
NIHWJRapoiadoporumabolsadaFundaoKECKJSM
suportadoempartepelaMarkeyPathwaynfaseespecial
emPathobiologyHumanoPSsuportadapelaDeutsche
Forschungsgemeinschaft.AgradecemosaA.RoebroekeJ.
Gordonpeloscomentriosteis.

Topo

Natureza
SobreNPG

00280836

14764687
PolticadePrivacidade

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Naturezaempregos

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