UNIVERSIDADEFEDERALDOABC

AulaPrtica4:Observaoafrescoecoloraes

AmandaCelliMendesVelozoRA:11154809
DaniloCamargoFinoRA:11075107
IgorAugustoCaparrsCoalhetaRA:11021011
MarcoAurlioCasanovaRA:11023814
RafaelJustodeAlmeidaRA:11045310

SantoAndr
1Quadrimestrede2016

1.Introduo

2.Objetivos
Compreendera habilidade de biodegradaodetoluenoapartirdamicrobiotadediferentes
solos;
qualificar a propensodebiodegradao de um composto recalcitrante (coranteRBBR)por
diferentesgruposdefungos.

3.Metodologia

3.1Materiais

3.1.1.Amostras

01amostradesolomido(areiadepraia);
02 placas de Petri contendo meiodecultura previamente preparado (gar nutritivo + 2,0g
glicose+coranteRBBR0,02%);
02 placasde Petricontendomeiodecultura previamente preparado (gar nutritivo+2,0g
amido+coranteRBBR0,02%);
02 placas de Petri contendo meio de cultura previamente preparado (gar nutritivo +
coranteRBBR0,02%);
02 placasde Petricontendomeiodecultura previamente preparado (gar nutritivo + 2,0 g
glicose);
02 placasde Petricontendomeiodecultura previamente preparado (gar nutritivo + 2,0 g
amido).
01PlacadePetricontendoFungo
Pleurotus
(basiodiomiceto);
01TubodeEnsaiocontendoFungo
Penicillium
;

3.1.2.Reagentes

guadestilada;
guaisentadeCO
2

Glicose;
MarcadorFenolftalena;
SoluodeTolueno(20ppm,40ppme100ppm);
1

SoluodeHCl(0,1mol/LFatordecorreo:1,061);
SoluoKOH(0,2N0,2mol/LFatordecorreo:0,9643);
Soluode
BaCl

2(1N).

3.1.3.EquipamentoseVidraria

LamparinaouBicodeBunsen;
AladePlatina;

Balanaanalticadigital;
Bureta;
Canetamarcadora;
Estufabacteriolgica;
Filmeplstico;
FunildeVidro;
LamparinaouBicodeBunsen;
Papelfiltro;
Pina;
Provetagraduada;

05potesdevidrocomtampametlicaderosca(previamenteesterilizados);
05frascosdevidrodesuporte;
05bquerspequenos(10mL);
02Erlenmeyers;

3.2Mtodos

3.2.1ObservaodabiodegradaodocoranteRBBR
Inicialmente, as cinco placas de Petri destinadas ao cultivo do fungo
Pleurotus e as
cinco placas destinadas ao cultivo do fungo
Penicillium foram devidamente identificadas
(nome do grupo, data, meio de cultivo, fonte de carbono e tipo de microrganismo). Em
seguida,alamparinafoiacesaedevidamenteposicionadasobreabancadadolaboratrio.
A partir deste ponto todos os passos descritos foram executados dentro da zona de
segurana da chama da lamparina (o mais perto possvel da chama sem que haja riscos de
superaquecimento ou queimaduras), visandoassim a criao deum ambiente sobcondies
deassepsia,paraevitaraocorrnciadecontaminaespormicrorganismosindesejados.
2

Primeiramente o fio da ala de platina foi submetido flambagem na chama da

lamparina formando em ngulo de 45

em relaobancadade trabalho,atque omesmo

apresentase uma cor vermelha, visando sua esterilizao. Aps,aparte inferior docabofoi
passada trs vezes pela chama na posio indicada na Figura 1. Emseguida ofioda ala de
platinafoiresfriadonaparteinternadeumadasplacasdePetri.

Figura1:Posiocorretaparaaflambagemdaaladeplatina

Aps, a tampada placa dePetri quecontinhao fungo

Pleurotusfoiabertaeapontado

fioesterilizadoeresfriado daaladeplatinafoipassadasobre ofungodemodoacoletaruma

pequena amostra que, em seguida, foi transferida delicadamente para o centro do meio de
cultura (previamente preparado) de uma placa de Petri. Este procedimento foi repetido de
modo a todas as quatro placasdePetripreviamenteidentificadas conteremumaamostra do
fungo em questo. Para finalizar, todas as placas de Petri foram devidamente fechadas e
lacradascomfilmeplstico.

Dandocontinuidadeaoexperimento,ofiodaaladeplatinafoinovamenteesterilizado

nachamada lamparina (conformeprotocolo j descrito)e, aps aaberturadatampadotubo

de ensaio que continha o fungo
Penicillium,
a pontado fio esterilizado e resfriado da ala de
platina foi passada sobre o fungo de modo a coletarumapequena amostraque, emseguida,
foi transferida delicadamente para o centro do meio de cultura (previamente preparado) de
umaplacadePetri. Este procedimentofoi repetidode modoatodasasquatroplacasdePetri
previamente identificadas conterem umaamostra dofungoemquesto. Para finalizar, todas
asplacasdePetriforamdevidamentefechadaselacradascomfilmeplstico.

Deste modo, a seguinte configurao de placas foi obtida ao final dos procedimentos
realizados:
Tabela1e2:MontagemdasPlacasdePetriparaObservaodaBiodegradaodo
CoranteRBBR
Fungo
Pleurotus
Placa

Meiodecultivo+Fontedecarbono

Placa1

garnutritivo+2,0gglicose+coranteRBBR0,02%

Placa2

garnutritivo+2,0gamido+coranteRBBR0,02%

Placa3

garnutritivo+coranteRBBR0,02%

Placa4

garnutritivo+2,0gglicose

Placa5

garnutritivo+2,0gamido

Fungo
Penicillium
Placa

Meiodecultivo+Fontedecarbono

Placa1

garnutritivo+2,0gglicose+coranteRBBR0,02%

Placa2

garnutritivo+2,0gamido+coranteRBBR0,02%

Placa3

garnutritivo+coranteRBBR0,02%

Placa4

garnutritivo+2,0gglicose

Placa5

garnutritivo+2,0gamido

Para finalizar,h todas as placas foram mantidas emumaestufa bacteriolgica 35

C

para estimular o crescimento dos microorganismos. A leitura das mesmas foi realizada 96
horas (segundafeira), 120 horas (terafeira), 144 horas (quartafeira) e 168 horas
(quintafeira) aps a realizao deste experimento. Os dados coletados (visualizao do
crescimento fngico) foram registrados atravs do preenchimento da umaplanilha abaixo e
porfotos.

3.2.2EnsaiodeRespirometriaBiodegradaodeMatriaOrgnica

Todasas etapasdesteexperimentoforamexecutadosdentroda zonadeseguranada

chama da lamparina (o mais perto possvel da chama sem que haja riscos de

superaquecimento ou queimaduras), visandoassim a criao deum ambiente sobcondies

deassepsia,paraevitaraocorrnciadecontaminaespormicrorganismosindesejados.

3.2.2.1DeterminaodaCRMA

Primeiramente, foi realizado o clculo da Capacidade Mxima de Retenode gua

(CRMA)dosoloaserutilizadonoexperimento(areiadepraia).

Para isto, um papel filtro foi devidamente posicionado em um funil de vidro e, em

seguida,o mesmo foiumedecido comguadestilada.Comoauxliodeumabalanaanaltica

digital, uma amostra de 10,0 g do solo mido foi mensurada e transferida para o funil
contendo o papel filtro mido e, em seguida, uma proveta de 100 mL foi devidamente
posicionadaembaixodofunil.

Aps, 100mL de gua destilada foram vertidos sobre a amostra de soloe ovolume

percolado foi coletado e medido como auxlioda proveta.Apartir dovalor obtido,aCRMA

dosolofoideterminadautilizandoafrmulaabaixo:

CRMA(%)=[(100mldeguadestiladavolumepercoladodeguaemmL)x10]+umidade
dosoloutilizado(%)

Volumedeguadestiladapercolado:97,0mL
Umidadedosolo(areiadepraia):1,032%
ValordeCRMAcalculado:40,32%

Aps, foi realizado o clculo daquantidade de mililitros(mL)degua destilada que

seriam necessrios adicionar amostra de solo (areia de praia) para que a umidade do
mesmoestivesseentre50%70%daCRMA:
CRMA=40,32%
Faixadeumidadedesejada=50%a70%
Umidadesolo=10,32%
Quantidadedeguaacompletar=4,91mLpara50gsolomido.

3.2.2.2MontagemdosRespirmetros
Inicialmente, os cinco potes de vidro com tampa metlica de rosca (previamente
esterilizados) que seriam utilizados para a confecodosrespirmetros foram devidamente
5

identificados (nome do grupo, data e cdigo de identificao R1, R2, R3, R4 e R5). Em
seguida,alamparinafoiacesaedevidamenteposicionadasobreabancadadolaboratrio.
Comoauxliodeumabalanaanalticadigital,umaamostrade50,0gdosolomidofoi
mensuradaedepositadaemumpotedevidro,aoredordofrascosuportepresentenointerior
do mesmo. Emseguida,esteprocedimentofoirepetidopara os outros quatro potesde vidro
comtampa.

Aps, a quantidadedeguacalculadanoitemanteriorfoigotejada,comcuidado,sobre

o solo presente em cada umdospotes de vidrode modo todos osvidros possurem uma
amostradesolocomumidadeentre50%70%daCRMA.

Em seguida, cadaamostra desolo presente nospotesdevidrorecebeuumtratamento

conformeatabelaabaixo:

Tabela3:MontagemdosRespirmetros
CdigodeIdentificao

TratamentodoSolo

R1

Nenhum(ControleNegativo)

R2

1,5gdeGlicose(ControlePositivo)

R3

0,692mLdeTolueno(Poluente20ppm)

R4

1,280mLdeTolueno(Poluente40ppm)

R5

3,460mLdeTolueno(Poluente100ppm)

Observao importante: Toda a manipulao dos potes que receberam tolueno

como tratamento de solo foi realizada na capela presente no laboratrio, com a devida
distncia para que o manipulador responsvel no respirasse prximo ao solo contendo
tolueno.

Com o auxlio de uma pina, o bquer presentedentrodo frascosuportede cada um

dos potes de vidro foi retirado e, com uma proveta graduada, uma amostra de 10 ml de
soluo KOH (0,2N) foi transferida para cada deles. Em seguida, cadabquer foi recolocado
dentro do seu respectivo frasco suporte eospotesdevidroforamdevidamentefechadoscom
atampametlicaderosca.
6

Figura2:EsquemademontagemdeumRespirmetro

Para finalizar estaetapa doexperimento, cadaum dos cinco respirmetrosmontados

foramincubadosnacapelatemperaturaambiente.

3.2.2.3Titulao

Os procedimentos abaixo descritos referentes titulao do branco (controle) e de

cadaumdoscincorespirmetros edo branco (controle) foram realizadosdurante cincodias

apsamontagemdosmesmos.

a)TitulaodoRespirmetro

Primeiramente,umaburetafoipreenchidacomsoluo de HCl (0,2N),comocuidado

deretirartodooarpresentenamesma,earmazenada.

Aps, um dos respirometros (exemplo: R1 Controle Negativo) foi aberto e, com o

auxlio de uma pina, o frasco suporte contendo obquer foi retirado e posicionadosobre a
bancadadetrabalho.

Delicadamente, todaaamostra dasoluoKOH (0,2N) presente nointeriordobquer

foitransferidaparaum Erlenmeyere,emseguida,o interiordo bquerfoilavado com10ml

degua isenta de CO
Aofinaldalavagem,estes10mLdeguaforamvertidosparaointerior
2.

domesmoErlenmeyer(quejcontinhaKOH).

Este procedimento de lavagem do bquer foi repetido mais duas vezes, de modo ao

Erlenmeyerconter,almdoKOH,exatamente30mldeguadestiladaisentadeCO
2.

Aps, uma amostra de

1,0 ml de BaCl
2 (1N) foi vertida dentro do Erlenmeyer e, em

seguida, 02 gotas de gotas de fenolftalena foram adicionadas esta mistura, que passou a
adquirirumacoloraorosa.

Assim, este Erlenmeyer foiposicionadosobaburetaeachave decontroledevolume

foidelicadamente aberta demodo apossibilitarqueasoluodeHClgotejasselentamentena

soluo rosa. A cada gota adicionada, a mistura presente no Erlenmeyer era delicadamente
misturada. Esteprocedimentofoi repetidoatomomentoemqueasoluomudassedecore
passassease tornar incolor(transparentee translcida).Nesteponto,achave decontrolede
volumedaburetafoifechadaeovolumegastofoianotado.

Figura3:ProcedimentodeTitulao

Aps, com uma proveta graduada, uma amostra de 10 ml de soluo KOH (0,2N)foi

transferida para o bquer que, com o auxlio de uma pina, foi posicionado novamente no
dentro do frasco suporte que foi novamente inserido norespirmetro. Parafinalizar,o pote
de vidro foi novamente fechado com a tampa metlica de rosca e incubado na capela
temperaturaambiente.

Esta etapa do experimento foi repetida novamente para cada um respirmetros

restantes(R2,R3,R4e R5) e ovolume de HClgastoparacadaumfoidevidamenteregistrado

emumatabela.

Observao importante:
Toda a manipulaodos potes quereceberamtoluenocomo
tratamento de solo foi realizada na capela presente no laboratrio, com a devidadistncia
paraqueomanipuladorresponsvelnorespirasseprximoaosolocontendotolueno.

c.TitulaodoBranco(controle)

Primeiramente,umaburetafoipreenchidacomsoluo de HCl (0,2N),comocuidado

deretirartodooarpresentenamesma,earmazenada.

Uma amostrade 10 mL dasoluode KOH(0,2N) foivertidaemumErlenmeyere,em

seguida,umaamostrade30mldeguaisentadeCO2foiadicionadaaomesmo.
Aps, uma amostra de
1,0 ml de BaCl
2 (1N) foi vertida dentro do Erlenmeyer e, em

seguida, 02 gotas de gotas de fenolftalena foram adicionadas esta mistura, que passou a
adquirirumacoloraorosa.

Este Erlenmeyer foi posicionado sob a bureta e a chave de controle de volume foi

delicadamente aberta de modo a possibilitar que a soluo de HCl gotejasse lentamente na

soluo rosa. A cada gota adicionada, a mistura presente no Erlenmeyer era delicadamente
misturada. Esteprocedimentofoi repetidoatomomentoemqueasoluomudassedecore
passassease tornar incolor(transparentee translcida).Nesteponto,achave decontrolede
volumedaburetafoifechadaeovolumegastofoianotado.

4.Resultadoseconcluses

O controle positivo foi utilizado pra indicar a capacidade de desenvolvimento das

populaes de microrganismos presentes nas amostras. Foi verificado que nas amostras de
areia de praiaagerao deCO
2para todas as amostras contendo tolueno ficaram abaixo dos
nveis encontrados para o controlenegativo,isto indicaqueparte das espciespresentesno
solomorreramdevidopresenadetolueno.
Nas amostras de solo de jardim, as amostras contendotolueno produziram maisCO
2
do que o controle negativo,porm,menos queo controle negativo.Isto indica que parte das
espcies morreram, mas que entre as espcies sobreviventes existem algumas que podem
degradarotolueno.
A diferena nos resultados encontrados para a areia de praia e o solo de jardim
explicada pela variedade de organismos presentes nas duas amostras.O solo de jardim,por

possuir maiorquantidade dematria orgnica,possuimaiorvariedadede espcies,jaareia

depraiaporserumambientemaispobreemnutrientessustentaapenasalgumasespcies.
O fato de existirem espcies capazes de degradar o tolueno pode ter potencial
econmico, j que comum encontrar reas contaminadas em regies urbanas e boa parte
destasreasapresentacomoumdeseuscontaminantesotolueno.

5.Bibliografia

MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; DUNLAP,P.V.; CLARK, D.P. Microbiologiade Brock. 12. ed.,
PortoAlegre:Artmed,2010.1160p.
TORTORA,G.J.;FUNKE,B.R.;CASE,CL.Microbiologia.10.ed.,PortoAlegre:Artmed,2010.
VERMELHO, A.B..PrticasdeMicrobiologia.RiodeJaneiro:EditoraGuanabaraKoogan,2006.
xiv,239p.ISBN8527711656.

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