CURSO TERICO PRTICO DE TCNICAS EM

MICROSCOPIA ELETRNICA

Apostila elaborada por:

Prof. Dr. Eduardo Gross
Tc. MSc. Marcel Pires
Tc. Valria Fernandes

Ilhus, Bahia
Maro de 2014

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

1. Introduo
O microscpio eletrnico fornece informaes analticas juntamente com a observao da
ultraestrutura ou morfologia do objeto em estudo. De maneira geral, o microscpio eletrnico de
transmisso (MET) funciona como um microscpio fotnico (de luz), enquanto que o microscpio
eletrnico de varredura (MEV) funciona como um estereomicroscpio (lupa), entretanto, com maior
poder de resoluo. Em condies apropriadas, os eltrons apresentam propriedades ondulatrias que,
assim como a luz visvel, encontram-se associados a um comprimento de onda cujo valor de,
aproximadamente, 0,005 nm. A comparao deste valor com o comprimento de onda da luz visvel (0,5
mm ou 500 nm) demonstra que um feixe eletrnico cerca de 100.000 vezes menor, e considerando
apenas este fator, teramos um aumento correspondente no poder resolvente.
2. Microscpio Eletrnico de Transmisso (MET)
O emprego do microscpio eletrnico de transmisso (MET) bastante difundido no estudo de
materiais biolgicos, pois ele permite definio de imagens intracelulares, permitindo estudos de
morfologia celular e de aspectos gerais das organelas.

Figura 1. Representao esquemtica de um MET (Duvert et al., 2003).

Um MET moderno possui cinco ou seis lentes magnticas, alm de vrias bobinas
eletromagnticas de deflexo e aberturas localizadas ao longo do caminho do feixe eletrnico. Entre
estes componentes, destacam-se os trs seguintes pela sua importncia com respeito aos fenmenos de
difrao eletrnica: lente objetiva, abertura objetiva e abertura seletiva de difrao. A funo das lentes
projetoras apenas a produo de um feixe paralelo e de suficiente intensidade incidente na superfcie
da amostra. Na prtica, o intervalo de aumentos do MET varia de 1.000 a cerca de 380.000 vezes.
No MET, a imagem do espcime formada simultaneamente passagem do feixe de luz atravs
dele. Os eltrons saem da amostra pela superfcie inferior com uma distribuio de intensidade e direo
Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

controladas pelas leis de difrao impostas pelo arranjo cristalino dos tomos na amostra. Em seguida, a
lente objetiva entra em ao, formando a primeira imagem desta distribuio angular dos feixes
eletrnicos difratados. Aps este processo, as lentes restantes servem para aumentar a imagem ou
diagrama de difrao para futura observao. Deve-se, finalmente, destacar que embora existam em
operao alguns aparelhos cuja tenso de acelerao de 1.000 kV, a maioria dos equipamentos
utilizados no estudo de materiais (metlicos, cermicos e polimricos) dispe de tenso de acelerao
de at 200 kV. Os MET utilizados em biologia, em geral, operam na faixa de 60 a 80 kV.
3. Microscpio Eletrnico de Varredura (MEV)
O microscpio eletrnico de varredura (MEV) surgiu comercialmente em 1965 e desde ento
tornou-se indispensvel em muitos tipos de pesquisa biolgica, contribuindo para a classificao e
taxonomia de insetos e fungos, estudo da morfologia de gros de plen e em pesquisas de superfcies
de diversas estruturas de plantas e animais. No MEV a imagem formada atravs de um feixe de
eltrons que usado para varrer o espcime, o qual emite os chamados eltrons secundrios (interao
de um feixe primrio com a superfcie de interesse). O canho e as lentes eletrnicas constituem os
componentes essenciais do microscpio eletrnico. A imagem final projetada em uma tela para
observao. O feixe de eltrons produzido em vcuo para evitar coliso com molculas do ar. Para
espcimes bem preparados (bons condutores) vantajoso trabalhar-se com feixe primrio de eltrons
acelerados com 20 e 25 kV, pois ganha-se na resoluo. Espcimes mais sensveis podem precisar de
eltrons menos energticos. Tambm importante corrigir o astigmatismo da imagem e escolher
adequadamente a distncia de trabalho. Distncias curtas favorecem melhor resoluo, com certo
sacrifcio da profundidade de foco. O inverso, maiores distncias de trabalho so necessrias para se
fotografar com pequeno aumento, reas e volumes grandes, garantindo boa profundidade de foco.

Figura 2. Representao esquemtica de um MEV (Duvert et al., 2003).

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

4. Preparo de amostras para MET e MEV

O texto que segue um breve resumo sobre os passos bsicos de processamento de amostras
para a microscopia eletrnica de transmisso e varredura. So aqui descritas as etapas de fixao, psfixao e desidratao, bem como a importncia das solues tampo no preparo de amostra para
microscopia eletrnica. As particularidades do processamento para cada tipo de microscpio eletrnico
sero descritas em seguida.
4.1 Fixao
Processo pelo qual se obtm estabilizao das estruturas celulares e intercelulares. Idealmente,
a morfologia dos diferentes tipos de biomacromolculas, suas relaes topolgicas, bem como da fase
aquosa com os respectivos solutos devem ser preservados como na situao in vivo. Entretanto,
qualquer processo de fixao inevitavelmente introduzir perturbaes no sistema provocando o
aparecimento de artefatos.
4.1.1 Fixao por Mtodos Fsicos:
a) Secagem ao ar: este procedimento induz grandes distores nos componentes
submicroscpicos dos tecidos, pois a evaporao da gua provoca o colapso e desarranjo das estruturas
subcelulares, devido tenso superficial. Alguns organismos (p. ex., insetos) podem ser visualizados
diretamente ao microscpio eletrnico e portanto submetidos ao vcuo (da ordem de 10 -4 a 10-5 torr)
da coluna do microscpio eletrnico, pois no exibem deformaes nas suas estruturas.
b) Criofixao: fundamenta-se no fato de que submetendo as clulas a congelamento rpido
e super-rpido (velocidade de 1000C/s) a gua intracelular e pericelular passa do estado lquido para o
slido formando cristais de gelo diminutos. Denomina-se vitrificao o procedimento em que h
passagem direta da gua do estado lquido para o slido sem passar pelo estado de rede de cristal de
gelo. Quando a velocidade de congelamento baixa (-1C/min) ocasiona na amostra a perda de gua
pelo efeito osmtico e a clula apresentar deformaes ficando enrugada e distorcida.
As substncias crioprotetoras tm a capacidade de se ligar gua intra e/ou extracelular,
tornando-a no disponvel para a formao de cristais de gelo se houver congelamento. O glicerol (ou
glicerina), o dimetilsulfxido e a sacarose na concentrao de 2,0-2,3 M tm ao crioprotetora.
c) Criofixao convencional: o procedimento convencional para criofratura consiste em
fixao qumica inicial com glutaraldedo e paraformaldedo. Em seguida, o fragmento de material
impregnado com concentraes crescentes de glicerol at a concentrao final de 30% (vol./vol.).

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

Fragmentos com dimenses de, por exemplo, 0,3 x 0,3 x 0,5 mm so colocados em suporte de ouroirdio e imersos na fase liquefeita de Freon 22 (-150C) em nitrognio lquido.
d) Criofixao por congelamento ultra-rpido (Quick-freezing): obtido com o
emprego de hlio lquido (-271C ou 2K). O fragmento de rgo ou tecido, com as clulas ainda vivas,
preso na parte central de um suporte especial de forma discide que est na extremidade de uma
haste que, por sua vez, deslizar em queda com velocidade controlada (2 m/s) sobre uma superfcie
resfriada com hlio lquido (-253C ou 20K), batendo contra uma superfcie resfriada de cobre. O
congelamento ultra-rpido pode-se obter bons resultados para clulas em tecidos frescos no fixados
quimicamente, entretanto somente a uma profundidade de 10 a 30 m da superfcie de impacto.
4.1.2 Fixao por Mtodos Qumicos
obtida pelo emprego de substncias que, reagindo com determinados stios das
biomacromolculas, estabilizam as mesmas. As molculas das substncias empregadas na fixao
podem ou no ser adicionadas s macromolculas dos tecidos. Os fixadores qumicos podem desnaturar
as protenas em graus variveis, conforme a estrutura molecular do agente fixador. Os fixadores que
tm ao coagulantes sobre as protenas (p. ex., etanol) alteram a configurao das mesmas (por isso
no so utilizadas em microscopia eletrnica) e, geralmente, no so incorporadas s protenas sendo
por isso tambm referidos como no aditivos.
Sob a ao dos fixadores no coagulantes, como os aldedos frmico e glutrico, a acrolena e o
tetrxido de smio, as protenas assumem o aspecto de um gel transparente, isso porque ocorre
estabilizao estrutural atravs de uma amarrao que as molculas fixadoras fazem sobre as
macromolculas tissulares sem distorcer muito estas ltimas (aqui ocorre ligaes cruzadas entre os
componentes estruturais; por isso os fixadores capazes de manter estas ligaes so denominados de
aditivos). Um efeito importante dessa fixao que a mesma pode tornar no coagulveis protenas
coagulveis pelos fixadores que tm ao coagulante. Assim, aps a fixao pelo aldedo glutrico as
protenas no so mais coagulveis pelo etanol ou a acetona utilizados na desidratao.
a) Dialdedo glutrico (aldedo glutrico AG ou Glutaraldedo): a substncia mais
utilizada como fixador em microscopia eletrnica. Tem frmula estrutural:
O

H C CH2 CH2 CH2 C H

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

 fornecido em solues aquosas de concentraes entre 25 e 70% com pH entre 4,0 e 5,0.
Solues estoques de AG com pH inferior a 3,5 devem ser descartadas, pois tero m ao fixadora. O
AG um fixador aditivo, medida que penetra vai sendo irreversivelmente incorporado s estruturas.
Alm disso, em cada stio reativo para fixao sero consumidas em mdia vrias molculas do fixador.
Portanto deve-se prover excesso de molculas fixadoras. Com as concentraes de aldedo glutrico
entre 1,5 e 2,0% temos como norma prtica que o volume total dos fragmentos a serem fixados no
devem exceder a 1/20 do volume da soluo fixadora.
Vale ressaltar que: a) a ao desnaturante do AG sobre as protenas pequena, portanto o AG
altera relativamente pouco a configurao terciria das cadeias polipeptdicas; b) a estrutura em hlice
dessas cadeias substancialmente reduzida, mas no abolida; e c) vrias molculas de AG participam
das ligaes cruzadas intra e intermoleculares.
b) Formaldedo (CH2): as solues comerciais designadas de formalina tm concentraes
de formaldedo de 37-40%. A formalina apresenta de 11-16% de metanol que extrai o citoplasma das
clulas. Preservao razovel de material obtida se a amostra for fixada em formalina 10% (ou de
formaldedo 3,7-4,0%) em tampo fosfato 0,1M (pH 7,2-7,4) e depois em tetrxido de smio. Para se
obter formaldedo livre de metanol parte-se da forma polimrica do formaldedo que o
paraformaldedo.
c) Paraformaldedo (CH2O)n ou trioximetileno: um p solvel em meio aquoso
ligeiramente alcalino. A soluo de formaldedo preparada a partir do paraformaldedo deve ser feita
extemporaneamente em capela. O formaldedo preserva menos a estrutura celular que o AG ou a
acrolena por ser menos eficiente que estes em estabelecer ligaes cruzadas, entretanto bastante
empregado para estudos de imunocitoqumica. O formaldedo um dos piores fixadores de lipdios,
entretanto a fixao de certas protenas tissulares muito semelhante obtida pelo AG.
d) FAA (formaldedo, cido actico e lcool etlico): este fixador mais comumente
utilizado em estudos anatmicos de microscopia ptica. Entretanto, pode ser utilizado para MEV. Alguns
autores afirmam que o FAA deve ser feito na hora de usar. A desidratao deve comear num grau
prximo ao do fixador. O FAA tem diversas frmulas (ver Kraus & Arduin, 1997). O FAA 70 tem a seguinte
frmula: 50 ml de cido actico glacial, 50 ml de formaldedo (a 37%) e 900 ml de lcool etlico. O grau
alcolico dessa frmula de 63%.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

CONDUTA PARA UMA BOA FIXAO

Os fatores que afetam a velocidade de penetrao dos fixadores nos diferentes tecidos de um
rgo so vrios e dependem das caractersticas fsico-qumicas da molcula do fixador, da concentrao
desta, da temperatura de fixao e da textura do rgo a ser fixado. A velocidade de penetrao do
glutaraldedo, por exemplo, da mesma ordem de grandeza daquela do tetrxido de smio (0,2-0,6
mm/hora), podendo conforme o rgo ser ou ligeiramente superior ou ligeiramente inferior. O
formaldedo penetra cerca de 5 a 10 vezes mais rapidamente que qualquer dos dois fixadores citados.
importante considerar ainda a velocidade de reao do fixador com as biomacromolculas.
a) Fixao por imerso: o meio mais utilizado para fixar rgos e tecidos, principalmente os
mais superficiais. pr-requisito do mtodo que o fragmento de rgo ou tecido a ser fixado seja
imerso no fixador imediatamente aps a sua retirada do organismo. O fragmento deve ter idealmente de
1,0-0,5 mm em sua maior dimenso.
b) Fixao por perfuso: o procedimento que propicia fixao de qualidade superior pois
imediatamente coloca o fixador ao nvel pericelular e celular. Os fatores a serem cuidadosamente
considerados neste tipo de fixao so: composio inica, osmolaridade efetiva, temperatura da
soluo fixadora e pH do rgo em estudo.
c) Osmolaridade: uma soluo isosmtica em relao a uma determinada categoria celular se
a presso osmtica da clula e da soluo forem iguais. A soluo ser isotnica se as clulas no
exibirem modificao de volume quando mantidas na soluo. Osmolaridade a molaridade (expressa
em moles/L) de uma soluo ideal de substncia absolutamente no ionizvel qual corresponde uma
dada presso osmtica. Os tampes fosfato e cacodilato nas concentraes 0,1 M so hipotnicos. O
glutaraldedo parece exercer algum efeito osmtico sobre as clulas, porm sua contribuio para a
presso osmtica efetiva da soluo bem menor que a presso osmtica do tampo.
4.2 Ps-Fixao
Tetrxido de smio (OsO4): o OsO4 protege as lipoprotenas naturais dos tecidos evitando
sua ruptura e coagulao. Em relao s protenas, a ao do tetrxido de smio ainda pouco
conhecida. O smio estabiliza e contrasta especialmente os fosfolipdios constituintes da membrana
citoplasmtica. Atua sobre os cidos graxos insaturados (com dupla ligao) desses fosfolipdios. Este
fixador tem um papel importante na contrastao inicial da amostra, no devendo a exposio dos
tecidos ser muito prolongada. O OsO4 altamente cancergeno, devendo ser manipulado com todos os
equipamentos de proteo necessrios, como capela de exausto, luvas e mscara.
Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

4.3 Solues Tampo

Um dos requerimentos bsicos para uma boa fixao de amostras de material biolgico para
microscopia eletrnica a manuteno do pH das solues fixadoras. Sabe-se que tecidos fixados em
solues fixadoras no tamponadas sofrem profundas alteraes, uma vez que a acidificao da amostra
precede sua fixao. Esta acidificao responsvel por modificaes na estrutura de protenas. Atravs
do tamponamento de solues fixadoras a acidificao pode ser neutralizada ou progredir mais
lentamente, diminuindo assim o dano sobre a amostra processada. Solues tampo contm cidos ou
bases fracas, com seus respectivos sais resistindo a variaes na concentrao de ons hidrognio,
garantindo desta maneira que durante o tempo de fixao o pH da soluo fixadora sofra apenas
pequenas alteraes.
A eficincia do sistema tampo varia de acordo com o pH. Para evitar que o tampo caia em uma
faixa no tamponante, deve-se medir a temperatura e o pH da soluo fixadora no momento da fixao.
A capacidade tamponante de uma soluo tampo tambm dependente da concentrao do soluto, da
natureza do material celular e do tipo de fixador usado, uma vez que alguns fixadores podem reagir com
os componentes da soluo tampo. Os tampes fosfato e cacodilato [Na(CH3)AsO2 .3H2O] so os mais
largamente empregados. O tampo fosfato tem propiciado timos resultados de fixao quando utilizado
tanto na fixao primria com aldedo como na fixao secundria com tetrxido de smio. Se a tima
qualidade de fixao que promove no superior obtida com cacodilato, certamente no inferior a
esta, tendo as vantagens de ser mais fisiolgico, no txico para clula em cultivo e apresentando ao
fixadora.
Os tampes com cacodilato por conterem arsnio devem ser manipulados em capelas. Porm,
quando for necessrio utilizar cloreto de clcio (CaCl2) na soluo fixadora, deve-se utilizar o tampo
cacodilato. O fosfato precipita na presena de clcio sobre a forma de fosfato de clcio.
Para que um tampo seja considerado um bom tampo, ele deve satisfazer as seguintes
exigncias: a) pKa entre 6,0 e 8,0, uma vez que a maioria das funes biolgicas ocorrem dentro desta
faixa de pH; b) solubilidade mxima em gua e mnima em outros solventes; c) penetrao reduzida em
membranas biolgicas; d) efeito reduzido com ons para que alguns possam ser introduzidos na soluo
fixadora final; e) ausncia de aminas primrias que possam reagir com o glutaraldedo interferindo assim
com a fixao; f) pouca dissociao do tampo em relao temperatura, concentrao e composio
inica; g) resistncia oxidao; h) que seja de fcil preparo.
a) Tampo Cacodilato: seu pH de tamponamento mximo se encontra na faixa de 6,4 a 7,4 e
oferece vantagens na fixao de materiais biolgicos: ausncia de ons fosfato que possam interferir em
estudos citoqumicos; preservao da atividade de determinadas enzimas; resistncia contaminao
por bactrias; e possibilidade de adio de clcio s solues fixadoras.
Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

b) Tampo Fosfato: de todos, considerado o tampo mais fisiolgico porque encontrado

em clulas na forma de fosfatos inorgnicos e ster de fosfato. O pH de tampes fosfato apresenta
pouca variao em diferentes temperaturas. Este tampo no recomendado para citoqumica de
enzimas e no pode ser suplementado com sais de clcio ou urnio, pois pode resultar em precipitao
de compostos.
4.4 Desidratao
Antes de realizar as etapas de ponto crtico durante o processamento para o MEV e de incluso
em resina para o MET necessrio retirar toda a gua do sistema biolgico, o que deve ser feito de
maneira gradual. Modificaes bruscas podem levar ao colabamento das finas projees citoplasmticas,
afetando a estrutura celular. Aps a fixao, o material deve ser bem lavado, com tampo caso o fixador
seja tamponado ou com gua caso no o seja, iniciando-se em seguida a desidratao com banhos
sucessivos de concentraes crescentes de um agente adequado que substitua a gua e a elimine do
espcime. Os agentes desidratantes mais usados so o etanol e a acetona.
5. Particularidades do processamento de amostras para MET
5.1. Embebio e Incluso
Aps a desidratao, o espcime a ser analisado em MET deve ser includo em um material que
permita a posterior obteno de cortes ultrafinos. Este material deve apresentar boa estabilidade
quando submetido ao feixe eletrnico e permitir uma contrastao adequada. Vrias substncias so
utilizadas como agentes de incluso, sendo as resinas as mais conhecidas.
Praticamente todas as resinas utilizadas na microscopia eletrnica so suspeitas de serem
cancergenas, devendo, portanto, ser manipuladas com todos os equipamentos de proteo necessrios,
como capela de exausto, luvas e mscara. As resinas so comercializadas em kits, contendo os
componentes e as propores de preparo dos reagentes. Antes de levar estufa para a polimerizao,
os espcimes infiltrados devem ser colocados em cpsulas de gelatina ou em moldes flexveis,
devidamente identificados. As principais resinas utilizadas so a Epon, a Spurr e a LR White.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

5.2. Ultramicrotomia
O conhecimento da ultraestrutura celular s avanou quando se tornou possvel efetuar cortes
ultrafinos de material biolgico, com espessura entre 10 e 100nm. Para consegu-los foi necessrio o
desenvolvimento do ultramicrtomo, providos de navalhas de fio mais uniforme e agudo do que as de
ao utilizadas at ento, e feitas de vidro, safira ou diamante. A espessura dos cortes ultrafinos
avaliada pela cor que apresentam quando flutuam na superfcie da gua na cuba coletora (barcas). As
cores cinza, prateada, dourada e avermelhada correspondem, respectivamente, s espessuras de 60,
60-90, 90-150 e 150-190 nm.

Figura 4. Representao esquemtica de um ultramicrtomo (Duvert et al., 2003).

As navalhas de vidro so de fcil confeco, a partir de uma barra de vidro de 25 mm de largura
por 6 mm de espessura. Porm, so frgeis, necessitando substituio freqente. A qualidade do vidro
importante para a obteno de boas navalhas. As barras so quebradas com auxlio de uma mquina
especialmente desenvolvida com este fim (Knifemaker, Reichert). As navalhas de vidro devem
apresentar o gume mais reto possvel, s vezes com um pequeno esporo de um lado, mas livre, na sua
maior parte, de imperfeies da fratura, como um fino serrilhado, usando-se somente o trecho melhor,
longe do esporo mas no muito prximo ao outro lado. As barcas coletoras de cortes ultrafinos so
afixadas s navalhas, atravs de esmalte ou fita adesiva.

Figura 5. Representao esquemtica da confeco de uma navalha de vidro (Duvert et al., 2003).
Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

As navalhas de diamantes so muito resistentes e durveis, mas deve-se tomar cuidado para
evitar qualquer movimento transversal ao gume. Desde que no cortem materiais que contenham
incluses muito duras, uma navalha de diamante bem tratada pode durar vrios anos em boas
condies. Para se evitar defeitos nos cortes, deve se manter a navalha perfeita, limpa e sem dente, e
obter blocos homogneos, de consistncia adequada e material bem infiltrado.
Os cortes so coletados na gua e posicionados sobre uma grade, em geral de cobre, podendo
ser de nquel ou ouro (utilizadas em citoqumica e histoqumica). H grades com aberturas de diferentes
formatos, mais comumente quadrados ou hexagonais.

5.3. Contrastao
Para intensificar o contraste dos cortes ultrafinos, as grades so colocadas sobre uma gota de
acetato de uranila 5% em gua destilada durante 5-30 minutos, com o corte voltado para a gota. Esta
previamente depositada sobre um pedao de parafilme no fundo de uma placa de Petri, devidamente
protegida da poeira ambiente. Em seguida, deve-se lavar a grade em gua destilada. O excesso de gua
absorvido com um pedao de papel filtro, podendo-se ento colocar a grade sobre uma gota de citrato
de chumbo durante 5-30 minutos, lavando-se e secando-se como descrito anteriormente. Aps a
contrastao, o corte est pronto para ser examinado com o MET.

6. Particularidades do processamento de amostras para MEV

6.1. Ponto Crtico
A secagem final da amostra para observao no MEV ser feita sobre condies tais que por
ela no passe um menisco de transio de fases evitando as foras resultantes da tenso superficial.
Isto obtido na cmara de ponto crtico (em ingls CPD-Critical Point Dryer, no caso um BalTec CPD
030), geralmente utilizando-se dixido de carbono como agente de troca. Sabe-se que para cada fluido,
existe uma condio de temperatura e presso caracterstica, em que as fases lquida e gasosa do fluido
no podem co-existir; esta combinao corresponde ao ponto crtico do fluido.
Para se fazer o ponto crtico, leva-se a amostra j fixada e completamente desidratada,
cmara de CPD, em um pequeno volume de acetona. Com a cmara isolada injeta-se o CO2 liquido, e
para isso a cmara deve estar 4-5C, fazendo-se vrias substituies at remoo total da acetona.
Com o posterior aquecimento controlado da cmara o CO2 torna-se gasoso a uma determinada presso
sem que se forme o menisco de transio e sem que exista a modificao na estrutura do material
biolgico.
Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

6.2. Montagem e Metalizao

O espcime seco precisa ser montado de modo adequado no suporte porta-amostras do MEV
(stub), ajustando-se a melhor orientao em relao ao feixe de eltrons e ao coletor. Vrios tipos de
adesivos podem ser usados: cola de prata coloidal, fitas adesivas dupla face, esmalte de unha contendo
carbono coloidal, dentre outros. A escolha depender das caractersticas da amostra.
Depois da montagem o prximo passo a ser dado a cobertura da amostra com metal. Este
passo visa prover ou aumentar a condutividade da superfcie da amostra atravs de uma fina camada
(com at 20-30 nm de espessura) de metal, de preferncia, ouro ou ouro-paldio. O processo mais
eficaz de deposio atravs de um sistema de evaporao conhecido como sputtering. Neste
sistema, o ouro removido de um eletrodo macio, por bombardeamento com ons pesados de argnio,
e se deposita sobre todas as reentrncias e proeminncias da superfcie da amostra. Embora seja
possvel usar evaporao trmica em alto vcuo, o sistema de sputtering mais eficiente. Alm de
ouro, alguns materiais podem necessitar de uma cobertura adicional com carbono, obtida no evaporador
convencional de alto vcuo. Aps a metalizao, a amostra est pronta para ser examinada com o MEV.

7. Referncias Bibliogrficas
DUVERT, M.; THIBAUD, P.; VERNA, A.; VERNAY, J-L. & THZ, N. 2003. Training of students in microscopy
studies of normal and pathological structures: a practical course. In: ROSEI, W. Science Technology and

Education of Microscopy: An Overview. Madrid: FORMATEX, 2003. v. 1, p. 802-816.

FARINA, M. Fundamentos de Microscopia Analtica para Bilogos. In: SOUZA, W. Tcnicas Bsicas de Microscopia

Eletrnica aplicada s Cincias Biolgicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrnica, 1998.
GALLETI, S.R. 2003. Introduo a Microscopia Eletrnica. Biolgico, v. 65, p. 33-35.
GRIMSTONE, A. V. 1980. O Microscpio Eletrnico em Biologia. [traduo Marina Silveira]. EPU: Editora da
Universidade de So Paulo. Coleo Temas de Biologia. Volume 11. So Paulo - SP.
GRIZZI, F.; FRANCESCHINI, B.; CHIRIVA-INTERNATI, M.; HERMONAT, P.; SHAH, G.; MUZZIO, P. & DIOGUARD, N.
2003. The Complexity and the Microscopy in the Anatomical Sciences. In: ROSEI, W. Science Technology and

Education of Microscopy: An Overview. Madrid: FORMATEX, 2003. v. 1, p. 396-404.

MACHADO, R. D. & SOUZA, W. Desidratao, Incluso, Ultramicrotomia e Contrastao. In: SOUZA, W. Tcnicas

Bsicas de Microscopia Eletrnica aplicada s Cincias Biolgicas. Rio de Janeiro : Sociedade Brasileira de
Microscopia Eletrnica, 1998.
PADRON, T. S. Solues Tampo. In: SOUZA, W. Tcnicas Bsicas de Microscopia Eletrnica aplicada s Cincias

Biolgicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrnica,1998.

SESSO, A. Fixao de Sistemas Biolgicos. In: SOUZA, W. Tcnicas Bsicas de Microscopia Eletrnica aplicada s

Cincias Biolgicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrnica,1998.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

SILVEIRA, M. Preparo de Amostras Biolgicas para Microscopia Eletrnica de Varredura. In: SOUZA, W. Tcnicas

Bsicas de Microscopia Eletrnica aplicada s Cincias Biolgicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de
Microscopia Eletrnica, 1998.
SOUZA, W. Manual sobre Tcnicas Bsicas em Microscopia Eletrnica . Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de
Microscopia Eletrnica, 1993, v.III.

Alguns websites de interesse:

http://potency.berkeley.edu/cpdb.html
http://stainsfile.info/StainsFile/index.html
http://hazard.com/
http://msds.ehs.cornell.edu/msdssrch.asp
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e03/03e.htm
http://www.materiais.ufsc.br/lcm/web-MEV/MEV_index.htm
http://fap01.if.usp.br/~lff/mev.html

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

ANEXOS
1. PROTOCOLO PARA PROCESSAMENTO DE TECIDO ANIMAL PARA MICROSCOPIA ELETRNICA
DE TRANSMISSO
# Fixao em glutaraldedo 2,5% em tampo cacodilato de sdio 0,1M (pH 7,1-7,2) 2 horas, temperatura
ambiente.
Obs: caso necessrio, conservar as amostras em tampo cacodilato de sdio 0,1M (pH 7,1-7,2).
# Lavar o material em tampo cacodilato de sdio (3x) 5 minutos cada.
# Ps-fixao em tetrxido de smio 1% 1 hora, temperatura ambiente.
# Lavar o material em tampo cacodilato de sdio (3x) 5 minutos cada.
# Desidratao srie crescente de acetona:

Acetona 70% 10 minutos, temperatura ambiente;

Acetona 80% 10 minutos, temperatura ambiente;

Acetona 90% 10 minutos, temperatura ambiente;

Acetona 95% 10 minutos, temperatura ambiente;

Acetona 100% (3x) 10 minutos cada, temperatura ambiente.

Obs: no caso de usar o Etanol no lugar da acetona, a ltima troca deve ser com xido de propileno. Etanol no
miscvel com EPON. Dar preferncia para desidratar com acetona.
# Infiltrao resina EPON-812:

EPON-812 + Acetona 100% (proporo 1:2) 1 hora;

EPON-812 + Acetona 100% (proporo 1:1) 1 hora;

EPON-812 + Acetona 100% (proporo 2:1) overnight;

EPON-812 pura 30 minutos.

# Emblocar em formas apropriadas, devidamente identificadas.

# Polimerizao em estufa a 60C 24 horas.
# Ultramicrotomia cortes em navalha de vidro ou diamante, com espessuras em torno de 60-70 nm.
# Contrastao:

Acetato de Uranila 2% 20-30 minutos;

Citrato de Chumbo 5 minutos;

Lavar em gua destilada e secar com papel filtro.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

2. PROTOCOLO PARA PROCESSAMENTO DE TECIDO VEGETAL PARA MICROSCOPIA ELETRNICA

DE TRANSMISSO
# Fixao em glutaraldedo 2,5% em tampo fosfato de sdio 0,1M (pH 7,2) 1-4 horas.
Obs: caso necessrio, conservar as amostras em tampo fosfato de sdio 0,1M (pH 7,2).
# Lavar o material em tampo fosfato de sdio (2x) 10 minutos cada.
# Ps-fixao em tetrxido de smio 1% 2 horas.
# Lavar o material em tampo fosfato de sdio (2x) 10 minutos cada.
# Desidratao srie etanlica crescente:

Etanol 60% 10 minutos;

Etanol 70% 10 minutos;

Etanol 80% 10 minutos;

Etanol 90% 10 minutos;

Etanol 95% 10 minutos;

Etanol 100% (2x) 10 minutos cada.

# Infiltrao resina LR White:

LR White + Etanol 100% (proporo 1:2) 2 horas;

LR White + Etanol 100% (proporo 1:1) 2 horas;

LR White pura overnight, trocar pela manh, incluir tarde.

# Emblocar em cpsulas de gelatina devidamente identificadas, para evitar o contato com o ar, o que impede
a polimerizao.
# Polimerizao em estufa a 60C 48 horas.
# Ultramicrotomia cortes em navalha de vidro ou diamante, com espessuras em torno de 60-70 nm.
# Contrastao:

Acetato de Uranila 2% 20-30 minutos;

Citrato de Chumbo 5 minutos;

Lavar em gua destilada e secar com papel filtro.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

3. PROTOCOLO PARA PROCESSAMENTO DE HIFAS DE FUNGOS PARA MICROSCOPIA

ELETRNICA DE TRANSMISSO
# Fixao em glutaraldedo 2,0% em tampo fosfato de sdio 0,1M (pH 7,2) overnight, 4C.
# Lavar o material em gua destilada (3x) 10 minutos cada, temperatura ambiente.
# Ps-fixao em tetrxido de smio 1% 45 minutos, temperatura ambiente.
Obs: Cada lavagem corresponde a ressuspenso do material em gua.
# Lavar o material em gua destilada at clarear o material.
# Desidratao srie etanlica crescente:

Etanol 30% 10 minutos;

Etanol 50% 10 minutos;

Etanol 70% 10 minutos;

Etanol 90% 10 minutos;

Etanol 95% 10 minutos;

Etanol 100% (3x) 10 minutos cada.

xido de propileno (2x) 30 minutos cada.

# Infiltrao resina EPON-812:

EPON-812 + xido de propileno (proporo 1:2) 1 hora;

EPON-812 + xido de propileno (proporo 1:1) 1 hora;

EPON-812 + xido de propileno (proporo 2:1) overnight;

EPON-812 pura 30 minutos.

# Emblocar em formas apropriadas, devidamente identificadas.

# Polimerizao em estufa a 60C 24 horas.
# Ultramicrotomia cortes em navalha de vidro ou diamante, com espessuras em torno de 60-70 nm.
# Contrastao:

Acetato de Uranila 2% 20-30 minutos;

Citrato de Chumbo 5 minutos;

Lavar em gua destilada e secar com papel filtro.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014

4. PROTOCOLO PARA MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA

# Fixao de pequenos fragmentos da amostra (aproximadamente 3x3mm) em glutaraldedo 2,5% em tampo
fosfato de sdio ou cacodilato de sdio 0,1M 4 horas.
# Lavar o material em tampo fosfato de sdio ou cacodilato de sdio 0,1M (3x) 10 minutos cada.
# Ps-fixao em tetrxido de smio 1% em tampo fosfato de sdio ou cacodilato de sdio 0,1M 1 hora
(opcional).
# Lavar o material em tampo fosfato de sdio ou cacodilato de sdio 0,1M (3x) 10 minutos cada.
# Desidratao srie crescente de etanol ou acetona:

Acetona ou Etanol 50% 10 minutos;

Acetona ou Etanol 60% 10 minutos;

Acetona ou Etanol 70% 10 minutos;

Acetona ou Etanol 80% 10 minutos;

Acetona ou Etanol 90% 10 minutos;

Acetona ou Etanol 100% (3x) 10 minutos cada.

# Ponto Crtico: o processo permite a retirada de toda gua do tecido e dura cerca de 40 minutos na cmara
de ponto crtico (em ingls CPD-Critical Point Dryer). Em seguida a amostra deve ser montada em Stub com
fita dupla face de carbono.
# Metalizao: depositada uma fina camada de ouro sobre a amostra com cerca de 20 a 30nm de espessura,
atravs de um sistema de evaporao conhecido como sputtering, utilizando o aparelho Sputter Coater SCD
050, BalTec.
# Observao do material no Microscpio Eletrnico de Varredura.

Curso Terico Prtico de Tcnicas em Microscopia Eletrnica

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
17 a 21 de maro de 2014