UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUB

CINCIAS BIOLGICAS LICENCIATURA

BIOQUMICA PRTICA

RELATRIO DE AULA PRTICA

ENZIMAS

BRUNA TERRIBILE

ISADORA SOUZA

VANESSA CARVALHO

PROF. MARCELO MATSUDO

ITAJUB

2016
1. INTRODUO

As enzimas so substncias proteicas constitudas de aminocidos, que atuam

na catlise de reaes qumicas especficas, convertendo substrato em produto,
atravs de um stio de ligao chamado centro ativo. Para que a catlise seja
eficiente, enzima e substrato devem se encontrar com conformao e carga
adequadas para permitir essa ligao.
O pH e a temperatura so fatores determinantes na atividade enzimtica pois
a variao desses agentes pode causar mudanas conformacionais na estrutura
da protena. A interferncia do pH se d quando diferentes valores fazem com
que os grupos titulveis das enzimas (cadeia lateral) apresentem-se protonados
ou desprotonados. Dessa forma, a maioria das enzimas apresenta um valor de
pH para o qual sua atividade mxima, ou seja, o arranjo desses grupos
protonados ou desprotonados leva a uma conformao ideal para sua ao
cataltica. Tal valor denominado pH timo. [1]
A sacarose um dissacardeo comum, solvel em gua e de sabor doce, que
sofre hidrlise pela ao cataltica da enzima invertase (sacarase). Essa reao
qumica chamada de inverso da sacarose e libera as molculas de glicose e
frutose, que so, respectivamente, uma aldose e uma cetose, como apresentado
no esquema 1. Ambas as molculas liberadas na quebra da sacarose possuem
capacidade de se oxidar para reduzir outra molcula, devido a presena da
carbonila livre (C=O), assim, so denominadas acares redutores. [1] [2]

Esquema 1 Inverso da sacarose

O cido dinitrosaliclico (DNS) um composto oxidante, comumente usado

para medir a quantidade de acares redutores em amostras, pois sua reao
com o acar forma um produto estvel, de cor alaranjada, que absorve luz a 540
nanmetros no espectrofotmetro. [2]
2. OBJETIVOS

Realizar a hidrlise da sacarose em diferentes valores de pH solues

tampo cidas e bsicas - e observar a atividade da enzima invertase, a partir
da ao do reagente DNS com o produto formado, determinando o valor de pH
timo.

3. MATERIAIS

Solues tampes com diferentes valores de pH

Enzima invertase (0,1 mg.mL-1)
Soluo de sacarose (0,2 M)
Banho-maria
gua fervente
Reagente DNS (cido dinitrosaliclico)
Espectrofotmetro
Pipetas
gua destilada
Tubos de ensaio

4. MTODOS

Em sete tubos de ensaio foram adicionados: soluo tampo, gua destilada

e soluo de sacarose (0,2 M), conforme a tabela 1.

TUBOS 1 - 6 TUBO 7 (BRANCO)

SOLUO TAMPO 1 ml 1 ml

H2O 0,8 ml 1 ml

SACAROSE 0,5 ml 0,5 ml

INVERTASE 0,2 ml ---

Tabela 1 Composio da soluo nos tubos de ensaio 1 a 7

Cada tubo de ensaio recebeu uma soluo tampo com pH diferente, que
ter influncia na ao da enzima invertase (Tabela 2).
 Tubo Tampo pH

1 Ftalato cido de potssio 3,06

2 KC 8H5O4 - HCl 3,97

3 KC 8H5O4 - NaOH 5,07

4 KH2PO4 - NaOH 6,56

5 KH2PO4 - NaOH 6,80

6 H3BO3 - KCl - NaOH 8,0

7 (Branco) KH2PO4 - NaOH 6,80

Tabela 2 Solues Tampo adicionadas a cada tubo

Logo aps foram adicionadas as quantidades de gua e sacarose

correspondentes a cada tubo (tabela 1).

A enzima invertase (0,1 mg.mL-1) foi adicionada, por ltimo e rapidamente,

nos tubos 1 a 6. No tubo 7, da soluo padro (branco), a enzima foi substituda
por gua destilada, deixando todos os tubos com volume de 2,5 ml.
Foram ento levados para o banho-maria a 25 C por 5 minutos para que
ocorresse a hidrlise da sacarose. Em seguida, retiraram-se os tubos e
adicionou-se 1 ml de reagente DNS em cada, e colocados em banho de gua
fervente por mais 5 minutos, para inativar a enzima invertase.
Por fim, adicionou-se 11,5 ml de gua destilada em cada tubo, completando
um volume final de 15 ml. Os tubos foram agitados e esperou-se at que a
soluo estivesse fria. Foi realizada a leitura de absorbncia em cada tubo, no
espectrofotmetro a um comprimento de onda de 540 nanmetros, calibrado com
a soluo padro branca (tubo 7).

5. RESULTADOS E DISCUSSO

A tabela seguinte estabelece a relao entre os tubos de ensaio, a soluo

tampo contida em cada um com seu respectivo pH e a absorbncia obtida.
 Tubos Soluo Tampo Absorbncia

Ftalato cido de potssio

1 0,781
pH = 3,06
KC 8H5O4 HCl
2 1,407
pH = 3,97
KC 8H5O4 NaOH
3 1,433
pH = 5,07
KH2PO4 NaOH
4 1,202
pH = 6,56
KH2PO4 NaOH
5 0,878
pH = 6,80
H3BO3 KCl - NaOH
6 0,047
pH = 8
KH2PO4 NaOH
7 (BRANCO) 0
pH = 6,80

Tabela 3 Relao entre a absorbncia e a soluo tampo nos tubos

1,6
1,407 1,433
1,4
1,202
1,2
ABSORBNCIA

1 0,878
0,781
0,8

0,6

0,4

0,2
0,047
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH

Grfico 1 Absorbncia x pH
 Com fundamentos na lei de Lambert Beer sabe-se que, por fim, a absorbncia
proporcional a concentrao da soluo de amostra. Desta maneira com os valores de
absorbncia e seu respectivo pH, possvel determinar qual o melhor pH para a
atividade da enzima invertase, ou seja, em qual pH a enzima transformou o maior
nmero de reagentes (sacarose) em produtos (glicose + frutose).
Essa determinao possvel por meio da reao de DNS com o produto, de
maneira que, quanto maior a concentrao de glicose + frutose, maior ser a formao
do DNS, que o responsvel pela cor alaranjada das solues e, consequentemente,
pelas medidas de absorbncia.

Esquema 2: Relao entre pH timo e absorbncia

O mtodo do DNS se fundamenta na reduo do cido 3,5-dinitrosaliclico em

cido 3-amino-5-nitrosaliclico por conta da ao dos acares redutores (glicose e
frutose).

Imagem 1: Mtodo de DNS [3]

 Observando o grfico pode-se concluir que nas faixas de pH entre 4 e 5 obteve-se
a maior absorbncia, ou seja, a maior concentrao de DNS reduzido e
consequentemente a maior concentrao de produto, glicose e frutose. Permitindo
assim julgar que a enzima invertase de levedura de panificao encontra-se na sua
melhor conformao e hidrolisando mais eficientemente a sacarose em pH 4 a 5.

6. CONCLUSO

Sendo uma enzima uma substncia proteica constituda por aminocidos ela
necessita de fatores ideais para sua atividade enzimtica, so exemplos o pH e a
temperatura. Conhecer o pH timo de uma enzima, assim como seus outros fatores
ideias, permite que se obtenha seu mximo aproveitamento, ou seja, que a enzima
transforme o mximo de reagentes em produtos e aumente a velocidade de reaes, a
partir da atividade cataltica.
A partir deste experimento foi possvel constatar o pH timo da enzima invertase
de levedura de panificao na hidrlise da sacarose, atravs do produto sendo formado
e da reao com DNS, e com base nos preceitos de Beer em que o maior nmero de
produtos eram indicados pela maior absorbncia.

7. REFERNCIAS

[1] MARZZOCO, A., TORRES, B. B. - Bioqumica Bsica, 3 edio; Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2013. Pg. 66 5.4. Fatores que interferem na atividade
enzimtica: pH e temperatura.

[2] MACHINI, M. T. e MARANA, S. R. Exerccios de Bioqumica Experimental.

Departamento de Bioqumica, Instituto de Qumica da USP, 2015. Disponvel em:
http://www2.iq.usp.br/docente/srmarana/bioquimica%20experimental/exerciciosquim.pd
f, acessado em 24 de maio de 2016.

[3] MALDONADE, CARVALHO E FERREIRA. Protocolo para determinao de

acares totais em hortalias pelo mtodo de DNS. Disponvel em:
http://www.cnph.embrapa.br/paginas/serie_documentos/publicacoes2013/cot_85.pdf.
Acesso: 25 de maio de 2016.