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GENTICA
MOLECULAR

MIRNA DUARTE BARROS

190 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 191

Captulo 4

GENTICA MOLECULAR
MIRNA DUARTE BARROS

INTRODUO

O dogma central da Gentica Molecular define um paradigma que envolve

polmeros de nucleotdeos, o cido desoxirribonuclico, o DNA e o cido
ribonuclico, o RNA e polmeros de aminocidos, as protenas.
O dogma central pode ser resumido com esquema a seguir:

DNA DNA RNAm PROTENA

DUPLICAO TRANSCRIO TRADUO

O DNA contm ao longo da seqncia das bases nitrogenadas de seus

nucleotdeos, as mensagens para a vida, para o funcionamento do maquinrio
necessrio para o funcionamento celular e do indivduo. Essas mensagens no
precisam e no so lidas simultaneamente. Assim como lemos um livro, palavra
por palavra, pargrafo por pargrafo, o DNA tambm lido por parte ao longo da
vida.
Cada segmento de DNA que codifica uma protena denominado de gene.
Neste momento, vrios genes esto sendo transcritos e traduzidos em nossas
clulas.
O processo de duplicao perpetua o material gentico ao longo das
geraes celulares do indivduo, fornecendo s novas geraes cpias idnticas
de origem.
A transcrio fornece um cido nuclico de cadeia simples, ao contrrio
do DNA, que formado por uma cadeia dupla. O DNA, nos eucariontes, est
restrito ao ncleo celular. O RNA, complementar ao DNA, leva ao citoplasma,
local da sntese protica, a mensagem gentica que traduzida da linguagem
das bases nitrogenadas dos cidos nuclicos, para a linguagem dos aminocidos
das protenas, que iro efetuar as atividades celulares.

ESTRUTURA DO DNA

O DNA a principal fora determinante de todo o ser vivo, pois a informao

que ele contm dirige toda a complexidade da vida.
Apesar de sua importncia, o DNA permaneceu desconhecido durante muito
tempo; somente em 1869, Miescher detectou pela primeira vez o DNA. Ele usou
como fonte de ncleos, os ncleos de glbulos brancos contidos no pus, por
serem grandes, facilitando seu isolamento. Sua anlise revelou um composto de
carcter cido, rico em fsforo, organizado em grandes molculas, que foi
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
192 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

denominado de nuclena. Em 1874, o prprio Miescher, utilizando tcnicas mais

avanadas, observou que estas grandes molculas de nuclena eram ricas em
nitrognio, alm do fsforo.
Em 1880, Kossel demonstrou que as nuclenas eram formadas por unidades
estruturais: as bases nitrogenadas. Em 1889, com tcnicas que permitiam isolar
as nuclenas de forma pura, Altmann separou-as das protenas e chamou-as de
cidos nuclicos. (Figura 4.1)

Figura 4.1: Bases

Nitrogenadas, com-
ponentes dos nucleo-
tdeos dos cidos
nuclicos. (Adaptado
de Lewin, B. Gene V.
Oxford Press, 1994).

Com os mtodos de preparaes puras de cidos nuclicos, foi demonstrado

que a degradao destes cidos liberava quatro tipos de bases nitrogenadas,
adenina e guanina, conhecidas como bases pricas e citosina e timina,
denominadas de bases pirimdicas.
Em 1912, Levene e Jacobs determinaram que o componente bsico dos
cidos nuclicos era uma estrutura composta de um acar com 5 carbonos,
uma pentose, ligada a uma base nitrogenada e a um fosfato, que denominaram
de nucleotdeo. (Figura 4.2).

Figura 4.2: O nucleotdeo formado

de uma pentose, uma base
nitrogenada ligada ao carbono 1 e
de um grupo fosfato, que pode ligar-
se ao carbono 3 ou 5 da pentose.
(Adaptado de Lewin, B. Gene V.
Oxford Press, 1994).

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 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 193
Nesta mesma poca, tornou-se evidente que existiam dois tipos de cidos
nuclicos: o cido extrado de timo de bezerro e o extrado de clulas de levedura.
Quando degradava-se por hidrlise (quebra molecular pela ao da gua), cidos
nuclicos provenientes de levedura, observou-se a liberao de uma base
nitrogenada diferente daquelas que apareciam at ento, denominada de uracila
e nunca havia a liberao de timina. O cido nuclico do timo no tinha uracila
e o de levedura no tinha timina; a pentose do cido nuclico do timo tinha um
oxignio a menos do que a pentose do cido da levedura, portanto o primeiro foi
chamado de ribose e o segundo de desoxirribose.
O cido nuclico que continha desoxirribose e timina foi denominado cido
desoxirribonuclico (DNA ou ADN), e o que apresentava uracila e ribose de
cido ribonuclico (RNA ou ARN). (Figura 4.3).

Figura 4.3: Es-

trutura mole-
cular das pento-
ses dos cidos
nuclicos. A-
desoxirribose
(DNA). B- ribose
(RNA). (Adaptado
de Lewin, b.
Gene V. Oxford
Press, 1994).

At a algumas dcadas atrs, no se podia afirmar o papel exato do DNA

das clulas. Sugeriu-se, atravs de evidncias experimentais que o DNA seria a
molcula responsvel pela manuteno e passagem atravs das geraes das
informaes das caractersticas hereditrias. Mas restavam dvidas, j que alguns
pesquisadores acreditavam serem as protenas as molculas responsveis pela
hereditariedade.
O experimento de Alfred Hershey e Martha Chase, em 1952, trouxe a
confirmao de que a molcula de DNA era o material hereditrio. Eles utilizaram
a propriedade j conhecida das protenas de no conterem fsforo (P) e do DNA
no conter enxofre (S). Cultivaram bactrias em meio de cultura contendo fsforo
radioativo (P3 2) e enxofre radioativo (S3 5). Em seguida, estas bactrias foram
infectadas com vrus bacterifagos. Os vrus que se desenvolveram nestas
bactrias apresentavam suas protenas marcadas com S3 5 e seus cidos nuclicos
marcados com P3 2 . Estes bacterifagos marcados foram utilizados para infectar
bactrias de culturas normais, no radioativas. Aps a infeco, as culturas
foram agitadas em um liqidificador, desfazendo as ligaes das capas proticas
virais adsorvidas s paredes das bactrias.
Praticamente todo o fsforo radioativo incorporado no vrus era transmitido
para o interior da bactria que ele infectara, aparecendo na prognie produzida.
O enxofre radioativo, por sua vez, no penetrava na bactria e no aparecia na
prognie viral. Concluiu-se portanto, que apenas o DNA do vrus penetra na
bactria quando da infeco e, a partir dele, a nova gerao viral produzida,
com as informaes que ele contm.

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194 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Com a confirmao do DNA como material hereditrio, muitos pesquisadores

interessaram-se no estudo desta molcula. Estudaram vrios DNA de diferentes
origens e observaram que a porcentagem de timina era semelhante a de adenina,
enquanto a porcentagem de citosina era semelhante a de guanina.

A G A+G
=1 =1 =1
T C T+C
Em 1953, Watson e Crick apresentaram um modelo espacial para a molcula
de DNA, que aceito praticamente na ntegra at hoje. (Figura 4.4).

Figura 4.4: Estrutura

tridimencional da dupla
hlice da molcula de
DNA. (Adaptado de Lewin,
B. Gene V. Oxford Press,
1994).

O modelo props que a molcula de DNA constituda de duas cadeias

helicoidais dispostas ao redor de um eixo central imaginrio. Cada cadeia
constituda por unidades de desoxirribose unidas por ligaes dister-fosfato
entre os seus carbonos 3 e 5. Uma base nitrogenada est ligada ao carbono 1
da pentose e as duas cadeias mantm-se unidas por pontes de hidrognio entre
as bases nitrogenadas: duas entre adenina e timina e trs entre citosina e guanina
(Figura 4.5).

Figura 4.5: Cadeia polinu-

cleotdica, com destaque para a
ligao dister-fosfato entre os
carbonos 5` e 3` das pentoses.
(Adaptado de Lewin, B. Gene V.
Oxford Press, 1994).

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 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 195
As duas cadeias helicoidais da molcula de DNA so complementares entre
si, ou seja, quando em uma cadeia a seqncia for adenina-citosina-timina-
adenina, na outra cadeia a seqncia ser obrigatoriamente timina-guanina-
adenina-timina. Alm de complementares entre si, as duas cadeias do DNA so
anti-paralelas, ou seja correm em sentidos opostos. Quando em uma cadeia o
carbono livre da pentose o 3, o carbono livre da outra cadeia o 5 e vice-versa.
Este modelo permitiu imaginar um mecanismo de autoduplicao para a
molcula de DNA, onde as pontes de Hidrognio rompidas, permitiriam o
desenrolamento e a separao das cadeias helicoidais. Cada cadeia serve de
molde para a sntese de uma nova cadeia helicoidal complementar ao molde,
resultando em duas molculas filhas, cada uma contendo uma cadeia proveniente
da molcula me e uma cadeia recm sintetizada, configurando o que se denomina
de duplicao semiconservativa do DNA (Figuras 4.6 e 4.7).

Figura 4.6: Duplicao semiconservativa do Figura 4.7: Esquema da estrutura das cadeias
DNA. (Adaptado de Griffith A. J. et al. An antiparalelas do DNA. Enquanto uma cadeia apresenta o
introduction to genetic analysis. W. H. sentido 5` - 3`, a outra est no sentido 3` - 5`. (Adaptado
Freeman & Cia. 1993). de Lewin, B. Gene V. Oxford Press, 1994).

CIDOS NUCLICOS: COMPONENTES

Os cidos nuclicos so grandes molculas, constitudas de subunidades

arranjadas seqencialmente. Cada subunidade um nucleotdeo constitudo
por uma pentose (um acar de 5 carbonos em forma de anel), uma base
nitrogenada (um anel de tomos carbono e nitrognio) e um grupo fosfato.
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196 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Os nucleotdeos so diferenciados pelo tipo de pentose ou pelo tipo de

base nitrogenada que os constituem. No DNA, o acar a desoxirribose e no
RNA a ribose, que diferem entre si somente pela presena de um grupo hidroxila
no carbono 2 da ribose.
Quanto s bases nitrogenadas, elas podem ser classificadas em dois grupos:
as pricas e as pirimdicas. As primeiras so formadas por anis fundidos de 6
e 5 tomos, enquanto as ltimas so constitudas por um anel de 6 tomos. H
duas purinas, adenina e guanina, encontradas tanto em ribonucleotdeos quanto
em desoxirribonucleotdeos e trs bases pirimdicas: citosina, que ocorre tanto
no DNA quanto no RNA, timina, exclusiva do DNA e uracil ou uracila, exclusiva
do RNA. Ao citar as bases nitrogenadas, usa-se apenas a inicial delas em
maiscula, ento temos A, G, C, T, e U. (Figura 4.8).

Figura 4.8: Pontes de Hidro-

gnio entre adenina e Timina
(duas) e Citosina e Guanina
(trs). (Adaptado de Lewin, B.
Gene V. Oxford Press, 1994).

Os carbonos das pentoses so numerados de 1 a 5, iniciando pelo carbono

que se liga covalentemente com o Nitrognio 1 das bases pirimdicas e com o
Nitrognio 9 das pricas. Como os tomos dos anis das bases nitrogenadas
tambm so numeradas, a numerao dos carbonos das pentoses seguida do
smbolo (), evitando ambigidades. Portanto, a base nitrogenada est na posio
1, e o grupo fosfato na 5. A ligao com o grupo fosfato com um nucleosdeo
(pentose mais base nitrogenada) compe um nucleotdeo.
Os nucleotdeos unidos entre si formam uma cadeia de polinucleotdeos.
A ligao entre um nucleotdeo e seu vizinho faz-se sempre atravs de ligao
covalente do tipo fosfo-dister, envolvendo o carbono 5 de um nucleotdeo o 3
do outro. Em uma cadeia polinucleotdica, um dos nucleotdeos terminais
apresenta o grupo 5 livre, enquanto na outra extremidade, o grupo 3 est livre.
Observando a dupla hlice do DNA, uma apresenta a direo 53 e a outra, a
direo 35. Ento, cadeias polinucleotdicas do DNA so antiparalelas, ou
seja, colocam-se em direes opostas uma outra. (Figura 4.7).
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 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 197
A estrutura molecular do DNA revelou o modelo de duplicao ou replicao
da molcula, j que h complementaridade entres as bases nitrogenadas das
cadeias da dupla hlice (para detalhes, veja o item seguinte deste captulo). Alm
disso, a estrutura seqencial das bases nitrogenadas condiciona a seqncia de
aminocidos das protenas. Ento, a seqncia de bases nitrogenadas revela um
cdigo de inscrio de informaes que sero traduzidas para a linguagem de
aminocidos na sntese protica.
A estrutura molecular proposta por Watson & Crick em 1953 para o DNA
aceita at hoje. O DNA formado por duas cadeias que se dispem em dupla
hlice ao redor de um eixo central imaginrio. Cada hlice ou cadeia formada
por subunidades: os nucleotdeos. Portanto, podemos afirmar que o DNA um
polmero de nucleotdeos. Esta estrutura espacial do DNA independente da
seqncia particular de nucleotdeos que a molcula contm, apesar da seqncia
de nucleotdeos ser crucial na determinao da informao gentica (Figura 4.6).
A molcula de DNA constituda de uma hlice regular, que faz uma volta
completa a cada 34 A (3,4 nm). Como a distncia mdia entre os nucleotdeos
de 3,4 A, cada volta da molcula contm 10 nucleotdeos. A hlice desenvolve-se
direita, ou seja, no sentido horrio.
As ligaes entre nucleotdeos da mesma cadeia so covalentes do tipo
fosfo-dister, onde o grupo fosfato forma uma ponte entre os grupos -OH de
duas desoxirriboses vizinhas.
A conformao espacial de dupla hlice mantida em funo das pontes
de Hidrognio entre bases nitrogenadas de ambas as cadeias. As pontes de
Hidrognio ocorrem entre os tomos de Hidrognio com pequena carga positiva
e um tomo receptor com uma pequena carga negativa. Cada tomo de Hidrognio
do grupo NH2 levemente positivo, pois o Nitrognio tem a tendncia de atrair os
eltrons da ligao N-H, enquanto o de Oxignio com dupla ligao tem eltrons
ao seu redor, conferindo uma leve negatividade.
A ponte de Hidrognio forma-se entre o H e o O dos pares de bases das
duas cadeias de DNA. Apesar da ponte de Hidrognio no ser uma ligao muito
forte, quando comparada a uma ligao covalente, sustenta a dupla hlice de
DNA e desempenha papel importante na hereditariedade. A ligao ocorre sempre
entre adenina e timina com duas pontes de Hidrognio, enquanto que entre
guanina e citosina formam-se trs pontes. O DNA que contm maior quantidade
de pares G - C mais estvel do que o que contm predominantemente o par A
- T. A ligao entre as bases nitrogenadas denominada de pareamento das
bases e complementar, j que guanina s pareia com citosina e adenina com
timina.
As ligaes das bases nitrogenadas ocorrem sempre entre uma base prica
e uma pirimdica, proporcionando um dimetro constante ao longo de toda a
molcula. Ligaes entre duas bases pricas resultariam em uma molcula
extremamente espessa, enquanto que a ligao entre duas bases pirimdicas em
uma molcula muito delgada.
Em uma viso tridimensional, as bases nitrogenadas dispem-se formando
degraus entre as cadeias do DNA, que aproximam-se umas das outras na formao
helicoidal da molcula. A aproximao entre as bases nitrogenadas, como uma
gaveta sobre outra, aumenta a estabilidade da molcula, pois exclui molculas
de H2O que ocupariam o espao entre uma base e outra.

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

198 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Podem ser identificadas duas formas de DNA por anlise de difrao, quanto
ao grau de hidratao da molcula. A forma A menos hidratada e mais compacta
que a forma B. Esta ltima a encontrada com maior freqncia nas clulas.

DUPLICAO DO DNA

A duplicao do DNA a sntese de uma nova molcula de DNA, atravs

de um processo de polimerizao de nucleotdeos, mediada por enzimas
especficas. O processo ocorre com a presena da molcula de DNA molde ou
molcula me, j pr-existente na clula e precede a diviso celular, tanto nos
procariontes como nos eucariontes, para a manuteno da quantidade de DNA.
Isto s no ocorre na meiose, cujo produto final so clulas com a metade do
DNA da clula inicial.
Nos eucariontes, a duplicao do DNA um processo que ocorre
principalmente no interior do ncleo, j que o DNA das mitocndrias apesar de
duplicar-se, acompanhando o DNA nuclear, representa pequena quantidade em
relao ao DNA nuclear. Uma clula humana pode levar de seis a dezenas de
horas para completar a duplicao de seu DNA.
primordial que o processo de duplicao da molcula de DNA seja preciso.
Para tanto, um dos mecanismos ter a molcula inicial como molde para a
sntese da nova molcula. Na realidade, cada cadeia da dupla hlice serve de
molde separadamente e denominada de template. A separao das cadeias
ocorre como uma abertura de um zper, com a quebra das pontes de hidrognio
entre as bases nitrogenadas. Se as ligaes entre as bases fossem covalentes, o
processo exigiria uma quantidade maior de energia para romp-las.
As molculas filhas so sintetizadas complementares s cadeias da
molcula me de DNA. Uma adenina na cadeia parental determina uma timina
na cadeia filha; uma guanina na cadeia parental determina uma citosina na
cadeia filha e assim por diante. Ao final da duplicao, existiro duas molculas
de DNA idnticas quanto seqncia das bases nitrogenadas, mas cada molcula
ser constituda de uma cadeia proveniente da molcula parental e uma cadeia
recm-sintetizada. Este modelo de duplicao do DNA denominado de
semiconservativo, pois a nova molcula de DNA mantm metade da estrutura
da molcula parental. A ligao entre geraes seqenciais do DNA a
permanncia de uma das cadeias parentais na molcula da gerao seguinte.
Este padro de duplicao foi confirmado experimentalmente por Meselson
& Stahl, em 1958. Eles cultivaram bactrias Escherichia coli em um meio com
N15, um istopo pesado. O DNA destas bactrias era mais denso e aps ser
isolado e centrifugado, observava-se uma banda denominada de pesada ou
parental. O DNA de bactrias cultivadas em meio com N14, apresentava densidade
menor e aps centrifugao formava uma banda leve.
As bactrias do meio com N15 foram transferidas para um meio de cultivo
com N14. Aps uma gerao de duplicao bacteriana, o DNA foi centrifugado,
resultando em uma banda intermediria entre a parental e a leve. O DNA da
segunda gerao apresentou uma banda hbrida e uma leve. Portanto, na primeira
gerao bacteriana, todo o DNA era constitudo de uma cadeia com bases
nitrogenadas contendo N15 e uma cadeia recm sintetizada, mais leve, com N14,
resultando na banda hbrida. Na segunda gerao, parte do DNA ainda continha
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 199
uma cadeia com N15 e outra com N14 e parte com cadeias s com N14 (Figura 4.9).
Esses resultados confirmaram que a sntese do DNA semiconservativa e
corroboraram o modelo estrutural e de duplicao do DNA proposto por Watson
& Crick em 1953.

Figura 4.9: Centrifugao do DNA

em um gradiente de cloreto de
csio. DNA com N15 aparece como
uma banda pesada; DNA com N14
encontra-se na banda leve; a ban-
da intermediria representa o DNA
hbrido. (Adaptado de Griffith A. J.
et al. An Introduction to Gentic
Analysis. W. H. Freeman & Cia.
1993).

A unidade ou poro do DNA que replica chamada de unidade de

replicao ou replicon. O replicon possui uma origem, onde a duplicao inicia
e pode ter um ponto de trmino, onde ela finaliza. Cada replicon controla os
elementos para a sntese da nova cadeia de DNA e funciona uma nica vez em
cada ciclo de diviso celular.
O genoma dos procariontes composto por uma nica molcula de DNA,
portanto s h um replicon. Entretanto, cada cromossomo dos eucariontes contm
um grande nmero de replicons.
Na regio onde a duplicao inicia, h a separao das cadeias do DNA,
formando uma figura em forma de Y. Esta regio chamada forquilha de
duplicao, que move-se seqencialmente ao longo do DNA, partindo do ponto
de origem do replicon. A duplicao pode ser uni ou bidirecional. No primeiro
caso, apenas uma forquilha de duplicao forma-se a partir da origem, enquanto
que no segundo caso, duas forquilhas so formadas, ambas partindo da origem,
mas em direes opostas (Figura 4.10).

Figura 4.10: Representao da

separao da cadeia dupla do
DNA durante a duplicao da
molcula, formando a forquilha
de duplicao, que pode ser uni
ou bidirecional. (Adaptado de
Lewin, B. Gene V. Oxford
Press, 1994).

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200 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

ENZIMAS DA DUPLICAO DO DNA

A duplicao do DNA um evento complexo, mediado por enzimas e envolve

trs estgios:
1. Iniciao: ocorrem o reconhecimento da origem do replicon, a abertura da
dupla hlice e a estabilizao da cadeia nica do DNA.
2. Elongao: sntese da nova cadeia do DNA ao longo da forquilha de duplicao.
3. Trmino ou Parada: encerramento da sntese e separao das novas molculas
j duplicadas.

Para que haja o incio da sntese das novas cadeias de DNA, necessrio
romper as ligaes que mantm a dupla hlice. A enzima helicase age na forquilha
de duplicao, rompendo as pontes de hidrognio. A hidrlise de ATP libera energia,
que modifica a conformao espacial da helicase, provocando o rompimento das
pontes de hidrognio e a separao da dupla hlice.
O DNA estvel quando a molcula forma a dupla hlice. Para que a
cadeia simples seja mantida aps a ao da helicase, as enzimas
desestabilizadoras da dupla hlice ligam-se s cadeias simples do DNA,
esticando-as e impedindo a reunio das cadeias, deixando espao e tempo para
a ao das enzimas polimerizadoras. (Figura 4.11)

Figura 4.11: Enzimas que participam da abertura

da cadeia dupla do DNA, no incio de sua sntese,
como a helicase e as enzimas desestabilizadoras
da dupla hlice. (Adaptado de Lewin, B. Gene V.
Oxford Press, 1994).

A contnua abertura da dupla hlice pela helicase, requer a rotao de

uma cadeia sobre a outra. Como as extremidades do DNA no so livres a medida
que h o desenrolamento a partir de um ponto, h um superenrolamento no
restante da molcula. O superenrolamento relaxado pela ao das enzimas
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 201
topoisomerases, que induzem a quebra de uma das cadeias do DNA, ligam-se
extremidade livre da cadeia rompida e giram ao redor da cadeia que ficou intacta,
diminuindo a tenso da molcula. A enzima desliga-se e a cadeia soldada
novamente, permitindo a continuao da abertura da forquilha de duplicao.
(Figura 4.12).

Figura 4.12: Ao das

topoisomerases para dimi-
nuir a tenso de
enrolamento da molcula
de DNA. (Adaptado de
Lewin, B. Gene V. Oxford
Press, 1994).

As enzimas que efetivamente sintetizam a nova molcula de DNA so

denominadas de DNA polimerases. A primeira DNA polimerase foi isolada e
identificada em uma bactria, E. coli, por Kornberg em 1956. Posteriormente,
foram identificadas trs DNA polimerase: DNA pol I, DNA pol II e DNA pol III.
Tanto procariontes, quanto eucariontes, possuem DNA polimerase com o
mesmo tipo fundamental de atividade sinttica, ou seja, todas as DNA pol
acrescentam novos nucleotdeos na extremidade 3-OH da desoxirribose.
Portanto, o crescimento da molcula de DNA sempre ocorre no sentido 5 3.
Apesar das trs DNA pol possurem atividade sinttica 5 3, a DNA pol
III a principal responsvel pela duplicao do DNA. uma enzima multimrica,
ou seja, composta por vrias subunidades e age na forquilha de duplicao
(Figura 4.13).

Figura 4.13: Esquema da

ao das enzimas atuan-
tes na forquilha de dupli-
cao. (Adaptado de
Lewin, B. Gene V. Oxford
Press, 1994).

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

202 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Tanto a DNA pol I, quanto a DNA pol II, apresentam a capacidade de

retirar nucleotdeos tanto da extremidade 5 quanto da 3, por isso so
denominadas exonucleases 5 3 e 3 5. A DNA pol I est envolvida no
reparo de quebras ou injrias do DNA e possui papel subsidirio na duplicao.
A DNA pol II uma enzima de reparo do DNA.
Uma caracterstica comum a todas as DNA pol o fato de todas serem
incapazes de iniciar a sntese da cadeia de DNA. Precisa haver um pequeno
segmento j pronto, com a extremidade 3-OH livre, denominado de primer. Na
realidade, estas enzimas so capazes de alongar a cadeia, acrescentando novos
nucleotdeos. Normalmente, o primer constitudo de um pequeno segmento de
RNA, sintetizado pela RNA polimerase, ou RNA primase, que tem a capacidade
de iniciar a sntese.
As DNA polimerases atuam sobre o trifosfato dos nucleotdeos. A base
complementar cadeia molde emparelha-se e a DNA pol age sobre o trifosfato,
liberando um difosfato e adicionando o novo nucleotdeo extremidade 3' OH
da cadeia, formando uma ligao diestrica (Figura 4.14).

Figura 4.14: ao da DNA

polimerase na unio de dois
nucleotdeos, formando uma
ligao diestrica. (Adaptado
de Lewin, B. Gene V. Oxford
Press, 1994).

A estrutura antiparalela da molcula de DNA constitui uma dificuldade

para a duplicao, j que as polimerases conhecidas s conseguem adicionar
nucleotdeos na extremidade 3 da cadeia, determinando um crescimento no
sentido 5 3. Na forquilha de duplicao, uma das cadeias moldes est no
sentido 3 5, onde a polimerase poder atuar sem dificuldades, mas a outra
cadeia molde est no sentido 5 3 e a polimerase no sintetizar uma cadeia
complementar no sentido oposto (Figura 4.15).

Figura 4.15: Enquanto a cadeia leading sintetizada continuamente, a cadeia lagging duplicada em segmentos,
caracterizando a duplicao semidescontnua do DNA. (Adaptado de Lewin, B. Gene V. Oxford Press, 1994).
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 203
Okasaki e colaboradores, em 1968, descobriram que a sntese de DNA
no contnua. No sentido 5 3, a DNA pol III catalisa normalmente a
polimerizao dos nucleotdeos, mas na outra cadeia molde, a fita complementar
sintetizada em pequenos segmentos, denominados fragmentos de Okasaki,
de 1000 a 2000 nucleotdeos, tambm no sentido 53. Esses fragmentos so
sintetizados na direo oposta ao da abertura da forquilha de duplicao. Sua
sntese termina, quando encontram a extremidade do fragmento que o precedeu
na sntese.
A sntese de cada fragmento de Okasaki representa uma nova iniciao
na duplicao do DNA. Como nenhuma DNA pol capaz de iniciar a sntese,
cada fragmento possui em sua extremidade inicial um primer de aproximadamente
10 ribonucleotdeos, sintetizado pela RNA primase. O primer funciona como
iniciador para a DNA pol III. O primer de RNA da extremidade 5 do segmento de
Okasaki posteriormente substitudo por desoxirribonucleotdeos pela ao da
DNA pol I, que atravs de sua atividade reparadora exonucleotdica 5 3,
remove os ribonucleotdeos.
Os fragmentos j reparados so unidos entre si pela DNA ligase, que
conecta a extremidade 3-OH de um fragmento com a extremidade 5-P do
fragmento adjacente. Como a cadeia leading (53) duplicada continuamente,
enquanto a cadeia leagging (3 5) sintetizada em fragmentos, uma das
caractersticas da duplicao do DNA ser semi-descontnua. (Figura 4.15).

SNTESE DE RNA TRANSCRIO

O RNA um polmero de ribonucleotdeos de cadeia simples e linear. O

tamanho das cadeias bastante varivel, de 75 at 10.000 nucleotdeos.
A sntese do RNA tem como molde uma das cadeias do DNA. A seqncia
de ribonucleotdeos determinada pela complementaridade seqncia de bases
da cadeia molde de DNA. Este processo denominado de Transcrio.
Embora, para cada gene, apenas uma das cadeias da dupla hlice do DNA
sirva de molde para a transcrio, ao longo de todo o cromossomo no ocorre
transcrio da mesma cadeia de DNA. Diferentes genes podem ser ativados em
diferentes segmentos do cromossomo em tempos distintos, variando a cadeia de
DNA a ser transcrita. Enquanto o RNA complementar cadeia molde do DNA,
sua seqncia de ribonucleotdeos a mesma da cadeia de DNA que no foi
transcrita, exceto pelas uracilas que substituem as timinas no RNA.
A transcrio s ocorre na presena da enzima RNA polimerase, que
formada por 4 subunidades diferentes: (alfa), (beta), (beta linha) e (sigma),
sendo que cada conjunto enzimtico possui um representante de cada subunidade
e duas subunidades . (Figura 4.16).

Figura 4.16: Sub-uni-

dades constituintes da
RNA polimerase.
(Adaptado de Griffiths,
A. J. An Introduction
of Genetic Analysis.
W. H. freeman & Cia.,
1993).

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

204 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Podem ser distinguidas trs fases da transcrio: Iniciao, Elongao e

Trmino ou Parada.

Iniciao:
A RNA pol reconhece e liga-se a uma regio especfica do DNA, denominada
de regio promotora ou promotor, atravs da subunidade . As regies
promotoras dos vrios genes possuem homologias, ou seja, apresentam
similaridade na seqncia de bases. Estes segmentos esto ao lado da primeira
base a ser transcrita e so denominados de stios de iniciao. (Figura 4.17).

Figura 4.17: Inicializa-

o da transcrio.
Aps a localizao da
Regio Promotora, h a
liberao do fator .
(Adaptado de griffiths,
A. J. An Introduction
of Genetic Analysis. W.
H. Freeman & Cia.,
1993).

Aps a ligao com a regio promotora, a RNA pol causa uma desnaturao
local no DNA, abrindo a dupla hlice. A presena do fator primordial para a
ocorrncia destes eventos.
Elongao:
Com a abertura da dupla hlice do DNA, o fator sigma () dissocia-se da
RNA pol. O RNA sintetizado no sentido 5 3, com a colocao de
ribonucleotdeos com bases complementares s da cadeia molde do DNA. A energia
da reao deriva da quebra do trifosfato dos ribonucleotdeos.

Trmino ou Parada:
A elongao termina, quando a RNA pol reconhece o sinal de parada.
H dois mecanismos envolvidos no trmino. No primeiro, uma seqncia no
DNA molde, de aproximadamente 40 pb (pares de bases), com alta freqncia de
G-C, seguidos de 6 ou mais adeninas o sinal de parada. As seqncias repetidas
de C-G no RNA formam uma cadeia dupla, resultando num looping, seguido de
uma seqncia de uracilas, complementares seqncia de A do DNA molde. O
looping impede a continuao da ao da RNA polimerase e a transcrio termina.
No segundo mecanismo, h a necessidade da presena de uma protena
especfica, o fator (rho), que se liga a uma regio especfica do RNA recm
sintetizado, deslocando-o do stio de sntese da RNA pol, impedindo a continuao
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 205
da transcrio. Uma vez terminada a sntese, a molcula de RNA separa-se
completamente do DNA, j que a cadeia hbrida DNA-RNA no estvel. (Figura
4.18).

Figura 4.18: Papel do Fa-

tor Rho no trmino da
transcrio. (Adaptado de
Griffiths, A. J. An
Introduction of Genetic
Analysis. W. H. freeman &
Cia., 1993).

TIPOS DE RNA

Existem trs tipos fundamentais de RNA: o transportados (RNAt), o

ribossmico (RNAr) e o mensageiro (RNAm), cada um com caractersticas e
funes especficas.

RNA transportador:
O RNAt atua na sntese protica, levando os aminocidos at o ribossomo,
local da sntese protica.
A estrutura terciria do RNAt confere a sua capacidade funcional. Seu
tamanho est em torno de 74 a 95 bases, que em algumas regies ligam-se por
pontes de Hidrognio, formando cadeia dupla.
Encontram-se ao longo da molcula, nucleotdeos com bases no usuais,
modificadas como a pseudouridina (), a dihidrouridina (DHU) e outras. Nestas
regies, no h pareamento das bases, a cadeia permanece simples, formando
alas que se continuam com as pores de cadeia dupla, permitindo que grupos
livres (amino ou cetona) possam formar ligaes secundrias. (Figura 4.19).
A seqncia de bases do RNAt dispe-se, formando uma imagem que lembra
uma folha de trevo, com 4 extremidades:
a. Extremidade receptora, formada por uma seqncia de bases pareadas,
terminando com uma seqncia ACC, onde h a ligao com o amino-cido.
b. Ala TC, que contm pseudouridina, formada por 7 bases no emparelhadas
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
206 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Figura 4.19: Estrutura do

RNA transportador. A. Extre-
midade ligada ao amino-ci-
do. B. Ala TC. C. Ala do
anti-cdon. D. Ala DHU. E.
Ala extra. (Adaptado de
Griffiths, A. J. An
Introduction of Genetic
Analysis. W. H. freeman &
Cia., 1993).

e que se liga ao ribossomo na sntese protica.

c. Ala anticdon, que se liga ao cdon do RNAm durante a sntese protica,
formada por 7 bases no emparelhadas, sendo trs destas bases as formadoras
da trinca do anti-cdon.
d. Ala extra, de ocorrncia e tamanho variveis, entre as alas TC e do anticdon,
com funo desconhecida.
Dentre a populao de RNAt, determinadas seqncias de bases so
constantes, comuns a todos, dando a mesma conformao espacial a todas as
molculas.
Estudos com difrao de raio X elucidaram a estrutura terciria do RNAt.
Estes estudos mostraram que pontes de hidrognio adicionais so responsveis
por dobras nas alas do trevo, conferindo molcula uma estrutura terciria
estvel com forma aproximada de um L.

RNA ribossmico:
O RNA ribossmico, juntamente com as protenas ribossomais,

Figura 4.20: Tipos de

RNA ribossmicos e seu
papel na formao dos
ribossomos de proca-
riontes e de eucariontes.
(Adaptado de Griffiths,
A. J. An Introduction of
Genetic Analysis. W. H.
freeman & Cia., 1993).

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 207
constituem uma organela no membranosa, o ribossomo, local onde ocorre a
sntese protica. (Figura 4.20).
A transcrio do DNA que codifica o RNAr, a regio organizadora de
nuclolo (RON) ou organizador nucleolar (ON), composta de grupos de vrios
genes iguais repetidos e origina, nos procariontes, uma molcula de taxa de
sedimentao de 30S (medida em Svedbgergs, em um gradiente de densidade de
sacarose, onde um alto valor de S indica uma molcula com alta densidade e
massa). Aps sua sntese, a molcula clivada em trs RNA ribossmicos menores,
de ndice de sedimentao 23S, 16S e 5S.
Nos eucariontes, a molcula de RNAr, maior que a dos procariontes,
45S e clivada em segmentos 28S e 18S. Neste caso, o RNAr 5S no faz parte da
molcula precursora 45S, derivando de outro gene a ser transcrito.

RNA mensageiro:
Suspeitava-se da existncia do RNAm, pois nos eucariontes h a
necessidade de um intermedirio que leve a informao gentica do DNA nuclear
para o citoplasma, onde as protenas so sintetizadas.
O RNAm representa uma seqncia de nucleotdeos feita a partir do DNA
e que corresponder seqncia de aminocidos de uma protena. Portanto, as
molculas de RNAm so bastante heterogneas quanto ao seu tamanho e
seqncia de bases nitrogenadas que os compem.
Existem diferenas marcantes entre os RNAm de procariontes e de
eucariontes.

Procariontes:
1. Como no h separao fsica entre o ncleo e o citoplasma, o RNAm
transcrito e traduzido no mesmo compartimento e de maneira simultnea.
2. O RNAm extremamente instvel, com vida mdia de 1 a 2 minutos. Enquanto
a extremidade 3ainda est sendo transcrita, a extremidade 5j degradada.
3. O RNAm , na maioria das vezes, policistrnico, ou seja, representa vrios
genes vizinhos e ao ser traduzido, gera vrias protenas diferentes, cada uma
correspondente a um dos genes que foi transcrito.
4. A extremidade 5do RNAm contm uma trinca de iniciao, AUG (ou GUG, ou
UUG), que acrescida de mais quatro bases, compem uma seqncia de 7
bases conhecida como seqncia de Shine-Dalgarno. Por esta extremidade
que o RNAm liga-se ao RNAr 16S da sub-unidade menor do ribossomo, para
dar incio traduo.

Eucariontes:
1. A transcrio e a maturao do RNAm ocorrem exclusivamente no ncleo,
enquanto que a traduo restrita ao citoplasma.
2. RNAm monocistrnico. Representa apenas um gene e, transcrito, origina
um nico tipo protico.
3. RNAm mais estvel, durando por vrias horas, pois h sntese de maior
quantidade de protena e as protenas so mais complexas, aumentando o
tempo da traduo.
4. extremidade 3 do RNAm j processado, acrescida uma seqncia de
aproximadamente 200 ribonucleotdeos de adenina, denominado de poli-A.

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

208 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

A presena da poli-A est relacionada com a estabilidade da molcula RNAm,

pois a degradao da molcula s ocorre aps a sua remoo.
5. A extremidade 5 do RNA est ocupada por uma purina, A ou G. Ao invs da
extremidade desta base apresentar como radical um trifosfato, h a ligao
com uma guanina trifosfatada, o que ocorre aps a transcrio. Enquanto
todos os nucleotdeos do RNAm esto unidos por ligaes 53 fosfo-dister,
a Gppp liga-se ao ltimo nucleotdeo do RNAm pela extremidade 5, com uma
orientao reversa do restante da molcula (55). Esta conformao
chamada de cap ou capuz e freqentemente metilada. O grupamento inicial
5cap imprescindvel no reconhecimento e ligao com a sub-unidade
menor do ribossomo. (Figura 4.21).

Figura 4.21: Nos eucariontes o

grupamento inicial 5 -cap facilita
o reconhecimento e ligao do
RNAm com a sub-unidade menor
do ribossomo. Outros locais de
metilao tambm podem existir.
(Adaptado de Lewis B. Genes V.
Oxford Press, 1994).

Processamento do RNA em Eucariontes:

Apesar do RNAm possuir uma seqncia de nucleotdeos que corresponde
exatamente seqncia de aminocidos da protena que traduz, o segmento de
DNA que originou o RNAm, possui seqncias de nucleotdeos que no esto
representadas na protena. Esta discrepncia devida a funo diferente de
duas pores do gene: o exon e o intron.
Exon: regies do DNA que so transcritas e traduzidas.
Intron: regies do DNA que so transcritas, mas so retiradas do RNAm
antes da traduo, por um processo denominado splicing, que ocorre ainda
no ncleo. (Figura 4.22).
Aps o splicing, os exons so unidos na mesma ordem ditada pela seqncia
no DNA. O RNAm que ainda contm os introns chamado de RNAm precursor
ou pr-RNA.
O splicing um processo mediado por enzimas, as endonucleases que
reconhecem os introns e os cortam, retirando-os da seqncia a ser traduzida.
um processo extremamente preciso, pois cortes no exatos geraro RNAm diversos
e protenas alteradas.
Enquanto h colinearidade entre as seqncias de bases do DNA e a
seqncia de aminocidos da protena nos procariontes, esta caracterstica
interrompida nos eucariontes pela presena dos introns, que no so traduzidos.
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 209

Figura 4.22: Representao da retirada

de segmentos do RNAm de eucariontes,
splicing, correspondentes aos introns do
DNA. (Adaptado de Lewis B. Genes V.
Oxford Press, 1994).

CDIGO GENTICO

O gene uma unidade funcional que codifica um polipeptdeo. A unidade

funcional corresponde a um segmento do DNA nuclear. A seqncia de
aminocidos da protena corresponde seqncia de bases nitrogenadas do DNA.
Alteraes das bases do DNA determinam alteraes na seqncia de aminocidos
da protena.
A informao contida na molcula de DNA, em forma de seqncia de
bases nitrogenadas, transcrita para a seqncia de bases nitrogenadas do
RNAm, que traduzida para uma linguagem de aminocidos durante a sntese
protica.
Em 1954, George Gamov, um fsico terico, props que cada amino-cido
seria codificado por um conjunto de trs nucleotdeos. Como so conhecidos 20
aminocidos diferentes e apenas 4 tipos de nucleotdeos, o nmero mnimo de
combinaes de nucleotdeos para dar um nmero igual ou maior que 20, seriam
combinaes de trs nucleotdeos. Esta hiptese foi confirmada por CricK e
colaboradores, em 1961, trabalhando com um vrus, o fago T4.
Durante a sntese protica, a leitura do RNAm tem incio de uma
extremidade da molcula, deslocando-se em blocos consecutivos de trs bases,
em direo ao extremo oposto.
Em 1961, Nurenberg & Mattei sintetizaram um RNA artificial poli-U e in
vitro sintetizaram uma protena constituda exclusivamente pelo amino-cido
fenilalanina. Concluram que cada amino-cido codificado por uma trinca de
nucleotdeos que foi chamada de cdon. Em 1964, decifraram todo o Cdigo
Gentico, com o quadro completo de correspondncia entre os 20 aminocidos
e os cdons. Portanto, durante a traduo, cada trinca de bases do RNAm, o
cdon, corresponde a um amino-cido especfico na protena que est sendo
sintetizada. A leitura dos cdons seqencial e sem sobreposio. Um RNA com
a seqncia AUCAUUCAG tem trs cdons a serem traduzidos que so AUC,
AUU e CAG.
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
210 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Qualquer uma das quatro bases nitrogenadas pode ocupar cada uma das
trs posies do cdon. Assim, so 43 = 64 combinaes possveis. Como so 20
aminocidos que constituem as protenas, h mais cdons do que aminocidos,
determinando que quase todos os aminocidos sejam representados por mais de
um cdon. Por esse motivo, diz-se que o Cdigo Gentico degenerado.
Cdons que representam o mesmo amino-cido so denominados
sinnimos. Somente triptofano e metionina so aminocidos relacionados com
apenas um cdon cada. H uma tendncia de que quanto mais comum o amino-
cido, maior a quantidade de cdons que o representam. Alm disso, cdons
sinnimos so similares em suas seqncias de bases, minimizando os efeitos
das mutaes.
Trs cdons, UAA, UAG e UGA no representam qualquer amino-cido.
Eles participam do trmino da sntese protica como cdons de parada.
(Figura 4.23).

Figura 4.23: Trincas de bases

nitrogenadas dos cdons e a cor-
respondncia com os respectivos
amino-cidos que determina. As
trincas seguidas de TERM, no
codificam amino-cido algum,
indicando a parada da sntese
protica. (adaptado de Lewis, B.
Genes V. Oxford Press, 1994).

Comparaes entre a seqncia de bases do DNA e a protena que gera

demonstraram que a correspondncia dos cdons com os aminocidos a mesma
tanto nas bactrias quanto nos eucariontes. Um RNAm de uma espcie pode ser
traduzido por um aparato enzimtico de outra espcie, gerando uma protena
idntica original. O Cdigo Gentico universal, sugerindo seu estabelecimento
precoce na histria evolutiva dos seres vivos.

TRADUO OU SNTESE PROTICA

A traduo ocorre com a leitura da srie de cdons do RNAm, no sentido

5 3, produzindo uma protena.
A polimerizao dos aminocidos em protenas ocorre no ribossomo. Todos
os ribossomos podem ser dissociados em duas subunidades, uma maior e uma
menor, cada uma constituda por um RNAr e vrias protenas diferentes, as
protenas r, que coordenam as atividades da traduo e estabelecem a estrutura
dos stios ativos do ribossomo.
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 211
O ribossomo dos procariontes menor do que o dos eucariontes. Nos
procariontes, a subunidade menor (30S) formada pelo RNAr 16S e 21 protenas.
A subunidade maior (50S) formada pelos RNAr 23S e 5S e 31 protenas.
Nos eucariontes, a subunidade menor (40S) formada pelo RNAr 18S e a
subunidade maior (60S) formada pelos RNAr 28S e 5S. Ambas unidades possuem
maior quantidade de protenas r do que nos procariontes.
A subunidade menor possui uma forma plana, enquanto a subunidade
maior mais esfrica. A subunidade maior apoia-se sobre a menor, limitando
um espao, como um tnel, onde o RNAm aloja-se durante a traduo.
Como os processos de transcrio e traduo so acoplados, enquanto o
RNAm dos procariontes est conectado pela extremidade 5 aos ribossomos, onde
est sendo traduzido, a extremidade 3 ainda est sendo transcrita. Nos
eucariontes, os ribossomos ou esto livres no citoplasma ou esto associados
face externa da membrana nuclear ou do retculo endoplasmtico rugoso.
O ribossomo prov um ambiente que controla o reconhecimento do cdon
do RNAm e o anticdon do RNAt. Para que a sntese protica prossiga, o ribossomo
move-se ao longo do RNAm no sentido 5 3 e traduz cada cdon para um
amino-cido.
O amino-cido trazido pelo RNAt correspondente. Para que seja possvel
a ligao de um amino-cido ao seu RNAt especfico, necessrio que este
amino-cido seja ativado, o que feito pela enzima aminoacil-RNAt sintetase.
Existem pelo menos 20 tipos diferentes desta enzima, especficas para cada amino-
cido. A reao de ativao quebra a ligao fosfato do ATP, liberando energia e
difosfato e ligando o amino-cido ao AMP. Em seguida, o amino-cido ativado
transferido ao RNAt, liberando o AMP, resultando um aminoacil-RNAt.
A traduo pode ser subdividida em trs etapas: Iniciao, Elongao e
Trmino ou Parada. (Figura 4.24).

Figura 4.24: Etapas da iniciao da

traduo. (Adaptado de Griffiths, A.
J. An Introduction of Genetic
Analysis. W. H. freeman & Cia.,
1993).

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

212 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Iniciao:
Envolve a reao do RNAm ao seu stio de ligao na subunidade menor
do ribossomo, formando o complexo de iniciao, ao qual a subunidade maior
vem acoplar-se.
A formao do complexo de iniciao acionada por protenas denominadas
Fatores de iniciao (IF), que permanecem ligadas ao ribossomo somente durante
a fase de iniciao.

Nos procariontes, a poro do RNAm que liga-se ao ribossomo a seqncia

de Shine-Dalgarno. Nos eucariontes, existem vrios tipos de fatores de iniciao
e, alguns deles reconhecem o capuz (cap) da extremidade 5 do RNAm, ligando-a
subunidade 40S do ribossomo.
O primeiro cdon a ser lido o referente metionina, AUG.

Elongao:
Nesta fase, ocorrem as reaes de sntese do polipeptdeo. Os aminocidos
so acoplados atravs de ligaes peptdicas.
A subunidade maior do ribossomo possui dois stios de ligao: A e P,
assim denominados, pois o A abriga o aminoacil-RNAt e o P o polipeptdeo-
RNAt. O stio A tem afinidade pelo aminoacil-RNAt, cujo anticdon complementar
ao cdon que est exposto no stio A.
O fator EF-tu, nos procariontes e o EF-1 nos eucariontes, so protenas
ligadas a um GTP com a funo de carregar o aminoacil-RNAt ao stio A do
ribossomo. Aps a colocao do aminoacil-RNAt, o GTP clivado, o fator EF-tu
desliga-se e a energia liberada faz com que o ribossomo exponha o stio P, para
onde o aminoacil-RNAt vai ser transferido. Com o stio A livre, outro aminoacil-
RNAt carreado pelo fator EF. H, ento, a ligao do amino-cido do stio P
com o do stio A mediada pela enzima peptidil transferase e seu desprendimento
do RNAt, que perde afinidade pelo stio P e sai do ribossomo. O RNAt, ligado ao
dipeptdeo, passa a ocupar o stio P e denominado polipeptidil-RNAt.
O processo de elongao continua com a entrada de um novo aminoacil-
RNAt no stio A, complementar ao cdon seguinte. Uma nova ligao peptdica
entre os aminocidos adjacentes processada, h liberao do stio P, migrao
do polipeptidil-RNAt do stio A para o P e entrada de novo aminoacil-RNAt.
(Figura 4.25).

Figura 4.25: Fatores

envolvidos na elonga-
o da cadeia polipep-
tdica e a transferncia
do RNAt do stio A
para o stio P do
ribossomo. (Adaptado
de Griffiths, A. J. An
Introduction of
Genetic Analysis. W.
H. freeman & Cia.,
1993).

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 213
Trmino ou Parada:
A traduo prossegue at que um cdon de trmino ou de parada seja
exposto no stio A do ribossomo. Os cdons UAG, UAA e UGA no so
complementares a nenhum anticdon, portanto no representam qualquer dos
aminocidos.
As reaes de trmino envolvem a liberao do polipeptdeo do ltimo
RNAt, retirada deste RNAt do stio P e a dissociao do ribossomo do RNAm.
Vrios ribossomos so percorridos por uma molcula de RNAm
simultaneamente. Isto determina que diversas cadeias polipeptdicas, em
diferentes fases de crescimento, possam ser encontradas ao longo de uma mesma
molcula mensageira. Ao conjunto constitudo pela molcula de RNAm, pelos
ribossomos a ela acoplados e pelas cadeias polipeptdicas em formao, que
esto sendo traduzidas pelo conjunto, denomina-se polissomo ou
polirribossomo. Em uma atividade de sntese intensa pode ser encontrado o
mximo de um ribossomo para cada 80 nucleotdeos do RNAm. Isto permite que
muitas protenas formem-se a partir de uma nica cadeia de RNAm e explica a
baixa porcentagem que a frao de RNAm representa no total de RNA de uma
clula.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

O uso da tecnologia do DNA recombinante em pesquisas na rea de sade

e, recentemente, na prtica mdica , constitui um revolucionrio recurso tanto
para o estudo de doenas, genticas ou no, quanto para a pesquisa do genoma
humano.
No incio da dcada de 70, os trabalhos de Davis & Mertz sobre enzimas
de restrio e a introduo da tcnica de transferncia de Southern (Southern
blot) foram os passos fundamentais para o rpido desenvolvimento da biologia
molecular e os seus aspectos aplicados, tanto para a medicina, quanto para a
gentica populacional, a agricultura e a veterinria.
Atualmente, pode-se isolar fragmentos distintos de DNA de qualquer
organismo e recombin-los em pequenos genomas, que so mais fceis para
serem analisados e manipulados. O DNA recombinante pode ser feito a partir de
segmentos de DNA no homlogo e de origem diversa ou de diferentes espcies.
Pode ser amplificado, ou seja, duplicado por vrios ciclos, produzindo um grande
nmero de cpias, facilitando a anlise de detalhes da molcula.

Enzimas de Restrio:

As enzimas de restrio so endonucleases bacterianas que cortam o

DNA em fragmentos e representam o principal instrumento da tecnologia do
DNA recombinante. Reconhecem uma seqncia especfica de nucleotdeos, como
CTGCA e cortam o DNA onde esta seqncia ocorre, produzindo uma populao
de fragmentos heterogneos com extremidades idnticas.
As enzimas de restrio so protenas de ocorrncia natural nas bactrias,
da onde foram isoladas e identificadas. Constituem um sistema imune
bacteriano primitivo, pois reconhecem um DNA exgeno, de bacterifagos ou
de outros vrus que invadem as bactrias. Cortam o DNA viral, tornando-os
inofensivos.
GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS
214 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

O DNA bacteriano est protegido contra a ao de suas prprias

endonucleases de restrio, atravs de modificaes qumicas, como a metilao,
que se faz nas bases nitrogenadas.
So conhecidas dezenas de enzimas de restrio diferentes, que constituem
uma potente ferramenta de anlise, pois localizam uma seqncia especfica no
DNA, cortando-o. (Figura 4.26).

Figura 4.26: Ao da enzima de restrio EcoRI sobre um DNA circular bacteriano, resultando em um DNA
linear. (Adaptado de Griffiths, A. J. An Introduction of Genetic Analysis. W. H. freeman & Cia., 1993).

Metodologia do DNA recombinante:

Um dos objetivos da obteno do DNA recombinante isolar e recombinar

um segmento especfico do DNA com um genoma pequeno, como o de um vrus
ou plasmdeo, que ao duplicar-se, gera numerosas cpias, amplificando o
segmento de DNA de interesse. Este processo denominado de clonagem.
(Figura 4.27).

Figura 4.27: Introduo de um

segmento de DNA exgeno
(laranja), no genoma de uma
bactria, dando origem a uma
linhagem mutante. (Adaptado
de Griffiths, A. J. An
Introduction of Genetic
Analysis. W. H. freeman &
Cia., 1993).

GENTICA BASEADA EM EVIDNCIAS SNDROMES E HERANAS

 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 215
Os veculos para a clonagem so fragmentos de DNA, denominados vetores,
que contm uma origem para replicao e tm a capacidade de duplicar-se
juntamente ao fragmento de DNA inserido. Podem ser utilizados como vetores os
plasmdeos, o fago e os cosmdeos.

Plasmdeos: Molculas pequenas e circulares de DNA, que podem ser

introduzidas em bactrias ou outras clulas. So considerados minicromossomos,
pois autoduplicam-se. Permitem a amplificao do DNA, pois podem existir at
1000 plasmdeos por ciclo celular.

Fago : Um vrus que reproduz-se introduzindo seu DNA em bactrias. utilizado

para clonar fragmentos grandes de DNA, de 15 a 20 kilobase (kb=1000 bases).

Cosmdeo: So hbridos de fagos e plasmdeos, que foram desenvolvidos para

a clonagem de fragmentos maiores de DNA, com cerca de 45kb.

Deteco de genes clonados:

Uma das tcnicas mais valiosas para a identificao de genes clonados foi
desenvolvida por E. M. Southern e, por isso, foi denominada de transferncia
de Southern ou Southern blot.
Nesta tcnica, fragmentos de DNA resultantes da ao de enzimas de
restrio so separados por diferena de tamanho em um gel de agarose,
submetido a eletroforese. Eles so transferidos do gel para um filtro de
nitrocelulose carregado eletrostaticamente.
A transferncia de Southern pode ser estendida para fragmentos de RNA
e ento denominada transferncia de Northern ou Northern blot. Utilizando-
se os mesmos passos descritos da transferncia de Southern, na transferncia
de Northern a anlise torna-se mais difcil, pois o RNAm uma molcula mais
instvel do que o DNA, mas apresenta a vantagem de revelar os genes que esto
sendo transcritos, ou seja que esto em funcionamento na clula no momento
da coleta dos RNA.
A enzima transcriptase reversa tem a capacidade de sintetizar um DNA
a partir de um RNAm. Este DNA denominado DNA complementar ou cDNA.
Este processo facilita a obteno dos segmentos de DNA que esto transcrevendo
naquele momento na clula, sem apresentar o problema da instabilidade do
RNAm. A populao de cDNA pode ser unida a plasmdeos, cada plasmdeo com
um tipo de cDNA e clones de cada populao podem ser obtidos.
Tanto os fragmentos de DNA quanto os de RNA so revelados por
hibridizao com sondas marcadas radioativamente. Estas sondas,
complementares ao DNA de interesse, juntam-se a ele, por ao da
complementaridade de suas bases. O filtro exposto a um filme de Raio X e no
autorradiograma as bandas hbridas, DNA mais sonda radioativa, so reveladas
(Figura 4.28).
Existem mtodos frios de marcao de DNA, que utilizam nucleotdeos
marcados quimicamente, com biotina, fosfatase alcalina ou substncias
quimioluminescentes, que apresentam a vantagem de serem mais estveis do
que as sondas radioativas.
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216 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

Na transferncia de Western ou Western blot h a transferncia de

protenas de um gel de agarose, aps eletroforese, para a membrana de
nitrocelulose, onde podem ser reveladas por ao de anticorpos especficos.
(Figura 4.29 e 4.30)

Figura 4.28: Autorradio-

grama revelando bandas
hbridas com a sonda de DNA.
(Adaptado de Griffiths, A. J.
An Introduction of Genetic
Analysis. W. H. freeman &
Cia., 1993).

Figura 4.29: Eletroforese de fragmentos de DNA ou de RNA para realizao da transferncia de Southern e de
Northern, respectivamente. (Adaptado de Griffiths, A. J. An Introduction of Genetic Analysis. W. H. freeman
& Cia., 1993).

A Reao em Cadeia da Polimerase PCR:

O mtodo da reao em cadeia da polimerase tem como principal objetivo

a amplificao de segmentos de DNA de interesse para pesquisa, ou para sade
ou outros. Foi estabelecido por Kary Mullis, em 1983, que ganharia o Prmio
Nobel em 1994.
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 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 217

Figura 4.30: Transferncia de

fragmentos de DNA ou RNA
para o filtro nitrocelulose.
(Adaptado de Griffiths, A. J. An
Introduction of Genetic
Analysis. W. H. freeman &
Cia., 1993).

O PCR apresenta trs etapas distintas:

A) Sntese dos primers: sntese de dois segmentos de 20 pb, complementares s
extremidades do fragmento de DNA de interesse.
B) Reunio dos primers com nucleotdeos livres, o fragmento de DNA a ser
amplificado e uma DNA polimerase especial, a Taq polimerase.
C) Trs ciclos de temperatura:
1. 95C: desnaturao da cadeia dupla do DNA a ser amplificado.
2. 55 C: com o resfriamento h a ligao dos primers com stios
complementares do DNA de cadeia simples.
3. 75C: a Taq polimerase promove a sntese de uma nova cadeia do DNA, a
partir dos primers, no sentido 53. Cpias novas ao DNA inicial foram
criadas a partir da regio de ligao com os primers.

A etapa C repetida vrias vezes e, com a utilizao de aparelhos

automatizados, como o termociclador , que aps 30 ciclos obtm 1 milho de
cpias do DNA inicial.
A Taq polimerase uma polimerase especial, pois atua sintetizando o
DNA a latas temperaturas (75C) e no desnatura em temperaturas mais altas,
como 95C da etapa de desnaturao. Esta enzima de ocorrncia natural e foi
isolada de um microrganismo aqutico, o Thermus aquaticus, que vive nas fontes
termais do Parque Nacional de Yellowstone.

Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante:

A) Clonagem gnica:
Um segmento de DNA pode ser isolado e clonado. Este segmento obtido
pela ao de enzimas de restrio e inserido em um vetor, como um plasmdeo.
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218 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR

O plasmdeo portador do segmento de DNA multiplica-se dentro de bactrias. O

DNA multiplicado removido dos plasmdeos e pode ser utilizado para pesquisa
ou na deteco do produto deste gene.

B) Animais transgnicos:
Resultado da insero de um gene exgeno na fase embrionria do animal.
O gene exgeno passa a fazer parte do material gentico do animal hospedeiro.
Se o animal for frtil o transgene pode ser herdado pela futura prognie.
A tcnica envolve a escolha do gene exgeno, a colocao do gene exgeno
na forma de um construto, que orientar a insero do gene exgeno no genoma
do animal e estimular sua expresso e a injeo do construto em um zigoto, ou
em um embrio nas primeiras fases de desenvolvimento do animal hospedeiro.
O animal transgnico pode expressar o gene exgeno em apenas alguns
dos seus tecidos, em determinadas ocasies de sua vida.
Os animais transgnicos podem servir de modelos animais para o estudo
de doenas humanas, como tumores malignos. Tambm servem como modelos
para terapia gnica. At agora os animais mais usados como transgnicos so os
camundongos, mas pode se utilizar em breve outros animais, como vacas
transgnicas que secretem substncias farmacuticas importantes em seu leite.

C) Deteco de doenas infecciosas:

A aplicao da tecnologia do DNA recombinante a doenas infecciosas
direto, pois detecta-se uma seqncia de DNA de origem no humana, no interior
de clulas. O potencial do diagnstico molecular para a identificao de
microrganismos ilimitado.
A deteco de DNA ou RNA microbianos podem ser identificados por uma
sonda que hibridiza com a seqncia alvo. A sonda marcada com radioatividade,
quimioluminescncia ou marcadores enzimticos, facilitando a visualizao do
hbrido.
O PCR uma alternativa ao mtodo da hibridizao direta, podendo
amplificar um pequeno segmento do DNA microbiano at que seja mais facilmente
detectvel.
Muitos kits de deteco de microrganismos usando hibridizao direta ou
PCR, j esto disponveis e so utilizados de rotina em laboratrios clnicos,
como a deteco do vrus da herpes simples (HSV), o citomegalovrus (CMV), o
vrus da hepatite B (HBV), a Chlamydia trachomatis, causador de doena
sexualmente transmissvel e a deteco do vrus da AIDS, o HIV, que realizado
pela tcnica de PCR.

D) Deteco de doenas genticas:

Uma das principais tcnicas moleculares para a deteco de doenas
genticas o mtodo do polimorfismo do tamanho do fragmento de restrio
(RFLP), que utiliza a hibridizao por transferncia de Southern.
Um polimorfismo uma variao acidental do genoma, que ocorre entre
os genes e no afeta a expresso dos mesmos. Um RFLP serve como marcador
gentico til, que permite estudar a hereditariedade de genes prximos. Um
polimorfismo pode auxiliar, indicando que cromossomo uma criana herdou de
que progenitor. Portanto, tenta-se descobrir marcadores genticos polimrficos
ligado a uma doena gentica.
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 CAPTULO 4 - GENTICA MOLECULAR 219
Diversos defeitos bioqumicos hereditrios podem ser detectados ainda
na fase pr-natal, por bipsias fetais. A condio de portador de alelos recessivos
para doenas graves como a Fibrose cstica pode ser determinada nos pais, assim
como o estudo das bases genticas de outras doenas como a hipercolesterolemia.

E) Fingerprint do DNA e teste de paternidade:

Um dos maiores desafios da medicina legal e da justia estabelecer com
segurana a identidade de um indivduo, vivo ou morto. Os testes do DNA
recombinante tm a capacidade de substituir as impresses digitais convencionais
usadas at ento.
Dos 6 bilhes de pb que constituem o DNA de uma clula humana, uma
pessoa difere da outra em 0,05% de seu genoma, Tais alteraes so os
polimorfismos mencionados no item anterior. Muitos dos polimorfismos ocorrem
no DNA espaador, que corresponde a segmentos curtos de DNA que se repetem
no genoma. O zigoto formado pela reunio ao acaso de metade dos elementos
espaadores de seu pai com metade dos elementos espaadores de sua me..
Isto forma a base do fingerprint do DNA (Figura 4.31).

Figura 4.31: Autorradiograma de fingerprint

de DNA de um casal e de seus dois filhos. A
coluna mais da direita corresponde a um
indivduo no aparentado. Cada banda que
ocorre nos filhos est presente em pelo menos
um dos pais. (Adaptado de Muller & Young.
Emergys Elements of Medical Genetics.
Churchill Livingstone, 1996).

O DNA, ao contrrio das impresses digitais muito estvel. Uma amostra

de sangue seco, um fio de cabelo, ou um pequeno fragmento de pele, pode ser
testado tanto pela transferncia de Southern quanto pelo PCR.
O fingerprint do DNA pode ser usado tanto em aplicaes policiais,
detectando o autor de crimes violentos como estupros, como identificando vtimas
de acidentes e guerras. amplamente empregado em testes de paternidade
duvidosa, em que o polimorfismo do filho comparado ao do suposto pai, com
alto grau de confiabilidade.
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O DNA de um indivduo que possui um polimorfismo pode ser reconhecido

pela transferncia de Southern.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

1. ALBERTS, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. & Watson, J.D. Molecular
Biology of the cell. Garland Publishing Inc., N. York, 1994, 1361 p.;
2. BROWN, T.A. DNA sequencing: the basics. Oxford University Press, Oxford, 1 edi-
o, 101 p.;
3. DULBECCO, R. Os genes e o nosso futuro. Editora Best Seller, So Paulo, 1 edi-
o, 101 p.;
4. GRIFFITHS, A.J.F.; Miller, J.H.; Suzuki, D.T.; Levontin, R.C. & Gelbart, W.M. An
Introduction to genetic analysis. W.H. Freeman & Company, N. York, 5 edio,
1993, 840 p.;
5. LEWIN, B. Genes V. Oxford University Press, Oxford, 1994, 1272 p.;
6. MUELLER, R.F. & Young, I.D. Emerys elements of medical genetics. Churchill
Livingstone, Edimburgo, 1995, 317 p.;
7. ROSS, D.W. Introduo medicina molecular. Interlivros, Rio de Janeiro, 2 edi-
o, 1997, 204 p.;
8. WATSON, J.D. & Crick, F.H.C. Molecular structure of nucleic acids: a structure for
deoxyribose nucleic acid. Nature, 171: 737-738, 1953;
9. WATSON, J.D. & Crick, F.H.C. Genetical implications of the structure of deoxy-
ribonucleic acid. Nature, 171: 964-967, 1953.

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