Dirio Oficial da Unio Seo 1 N 224, quarta-feira, 21 de novembro de 2012

RESOLUO DA DIRETORIA COLEGIADA - RDC N 55 DE 14 DE NOVEMBRO DE 2012

Dispe sobre os detergentes enzimticos de uso

restrito em estabelecimentos de assistncia
sade com indicao para limpeza de dispositivos
mdicos e d outras providncias.

A Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso das atribuies

que lhe conferem os incisos III e IV, do art. 15 da Lei n. 9.782, de 26 de janeiro de 1999, o
inciso II, e 1 e 3 do art. 54 do Regimento Interno aprovado nos termos do Anexo I da
Portaria n 354 da ANVISA, de 11 de agosto de 2006, republicada no DOU de 21 de agosto de
2006, e suas atualizaes, tendo em vista o disposto nos incisos III, do art. 2, III e IV, do art. 7
da Lei n. 9.782, de 1999, e o Programa de Melhoria do Processo de Regulamentao da
Agncia, institudo por meio da Portaria n 422, de 16 de abril de 2008, em reunio realizada
em 30 de outubro de 2012, adota a seguinte Resoluo da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-
Presidente, determino a sua publicao:

Art. 1 Fica aprovado o regulamento que estabelece os requisitos mnimos para detergentes
enzimticos de uso restrito em estabelecimentos de assistncia sade com indicao para
limpeza de dispositivos mdicos.

CAPTULO I
DAS DISPOSIES INICIAIS

Seo I
Objetivo

Art. 2 Este regulamento possui o objetivo de estabelecer definies, caractersticas gerais,

requisitos tcnicos e de rotulagem para o registro de produtos categorizados como detergentes
enzimticos de uso restrito em estabelecimentos de assistncia sade com indicao para
limpeza de dispositivos mdicos, de forma a minimizar o risco sade.

Seo II
Abrangncia

Art. 3 Este regulamento se aplica aos detergentes enzimticos de uso restrito em

estabelecimentos de assistncia sade e com indicao de uso para limpeza de dispositivos
mdicos.

Seo III
Definies

Art. 4 Para efeito deste regulamento, so adotadas as seguintes definies:

I detergente enzimtico para limpeza de dispositivos mdicos: produto cuja formulao

contm, alm de um tensoativo, pelo menos uma enzima hidroltica da subclasse das
proteases EC 3.4, podendo ser acrescida de outra enzima da subclasse das amilases EC 3.2 e
demais componentes complementares da formulao, inclusive de enzimas de outras
subclasses, tendo como finalidade remover a sujidade clnica e evitar a formao de
compostos insolveis na superfcie desses dispositivos;

II atividade enzimtica em detergentes: capacidade que a enzima possui em catalisar uma

reao, degradando substratos especficos, desde que o complexo enzimtico contido no
detergente esteja em condies ativas dentro da formulao;

III enzima hidroltica (EC 3): enzima capaz de catalisar uma reao de hidrlise;

1
IV enzima proteoltica (EC 3.4): enzima capaz de catalisar a hidrlise de ligaes peptdicas;

V - enzima lipoltica (EC 3.1): enzima capaz de catalisar a hidrlise de ligaes steres de
lipdeos;

VI - substrato: molculas ou substncias-alvo cuja enzima capaz de catalisar sua reao;

VII estabelecimentos de assistncia sade: nome genrico dado a qualquer local ou

ambiente fsico destinado prestao de assistncia sade da populao, tais como:
hospitais, clnicas, consultrios, entre outros;

VIII dispositivo mdico: produto para a sade, tal como instrumento, aparelho, equipamento,
material ou outro artigo, utilizado isoladamente ou em combinao, destinado pelo fabricante a
ser utilizado em seres humanos para fins de diagnstico, preveno, controle, tratamento,
atenuao de uma doena, compensao de uma leso ou deficincia, ou controle de
concepo e que no tem o objetivo de agir no corpo humano por meios farmacolgicos,
imunolgicos ou metablicos, mas que pode ser assistido nas suas funes por tais meios;

IX - sujidade clnica: substncia composta de matria inorgnica, orgnica ou biolgica,

tipicamente encontrada em dispositivos mdicos aps uso clnico;

X limpeza de dispositivos mdicos: a remoo de sujidade clnica de objetos e superfcies

por meio de atividade manual ou mecnica;

XI produtos de aplicao/manipulao profissional: so os produtos que, por sua forma de

apresentao, toxicidade ou uso especfico, devem ser aplicados ou manipulados
exclusivamente por profissional devidamente treinado, capacitado ou por empresa
especializada.

CAPTULO II
DAS CARACTERSTICAS GERAIS

Art. 5 Os produtos abrangidos por este regulamento so considerados de Risco 2 e esto

sujeitos ao registro na Anvisa.

Art. 6 Todos os laudos exigidos por este regulamento devem ser emitidos por laboratrios
acreditados pelo Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia - Inmetro ou
Habilitados na Rede Brasileira de Laboratrios Analticos em Sade Reblas.

Art. 7 O registro de detergentes enzimticos para uso em estabelecimentos de assistncia

sade e com indicao para limpeza de dispositivos mdicos fica restrito
aplicao/manipulao profissional.

Art. 8 Os detergentes enzimticos para limpeza de dispositivos mdicos devem apresentar

composio condizente com sua finalidade, no podendo conter substncias que
comprometam a atividade das enzimas ou que danifiquem os materiais e equipamentos que
entrem em contato com estes produtos.

Art. 9 Para os detergentes enzimticos com indicao de uso para limpeza de dispositivos
mdicos que contenham apenas um tipo de enzima, essa deve ser da subclasse das proteases
EC 3.4.

Art. 10 Os detergentes enzimticos para limpeza de dispositivos mdicos no podem conter

enzimas que comprometam a sade da populao, conforme as normas vigentes.

Art. 11 Os detergentes enzimticos para limpeza de dispositivos mdicos quando estiverem

associados a substncias com atividade antimicrobiana, devem obedecer legislao
especfica, bem como cumprir o disposto neste regulamento.

2
Art. 12 Na formulao dos produtos de que trata este regulamento no so permitidas
substncias que sejam comprovadamente carcinognicas, mutagnicas e teratognicas para o
homem segundo a Agncia Internacional de Investigao sobre o Cncer da Organizao
Mundial de Sade (IARC/OMS).

Art. 13 As embalagens para os produtos de que trata este regulamento no devem permitir a
migrao de substncias txicas das mesmas para o produto, bem como migrao do produto
para o meio externo e devem ter caractersticas que garantam a estabilidade durante o seu
prazo de validade.

CAPTULO III
DOS REQUISITOS PARA O REGISTRO

Art. 14 Para obteno do registro sanitrio dos produtos abrangidos no presente regulamento,
o interessado dever apresentar os seguintes documentos:

I formulrios emitidos pelo peticionamento eletrnico;

II - literatura e/ou ficha tcnica dos componentes da frmula que no possuam nmero de
inscrio no Chemical Abstracts Service (CAS);

III - documentao do fornecedor de todas as enzimas constantes da formulao informando a

nomenclatura adotada pela International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB),
incluindo o nmero completo do cdigo e a descrio da origem biolgica contendo o gnero e
a espcie;

IV - laudo da atividade proteoltica.

A atividade amioltica deve ser comprovada de acordo com a presena de enzima da subclasse
das amilases EC 3.2 na formulao;

V - laudo de pH do produto puro e na diluio de uso;

VI - estudo de estabilidade acelerado ou de longa durao para comprovao da atividade

enzimtica durante o prazo de validade proposto;

VII peso molecular dos tensoativos utilizados na formulao;

VIII - modelo de rtulo em duas vias, em papel A4, conforme o original, impresso colorido e em
resoluo que permita a leitura dos dizeres e com as cores e matizes do rtulo final. Sendo
necessrio, efetuar a reduo para adequar ao tamanho A4, informando a relao de escala;

IX - desenho, croqui ou foto da embalagem;

X - dados gerais da empresa, tais como: Razo social, nome do responsvel legal, nome e
nmero de registro do responsvel tcnico no conselho da categoria, endereo completo,
nmero de telefone e fax.

1 No caso dos produtos tratados no inciso V cujo pH no possa ser medido na forma pura,
esses devem ser avaliados na diluio de uso.

2 Os resultados encontrados ao final do estudo de estabilidade tratados no inciso VI devero

ser declarados na rotulagem do produto.

Art. 15 Os ensaios de atividade enzimtica devem ser realizados com o produto puro, quando
este for para pronto uso, ou na diluio de uso recomendada pelo fabricante e devem obedecer
ao disposto no ANEXO a esse regulamento.

CAPTULO IV
DA ROTULAGEM

3
Art. 16 As palavras em destaque no rtulo devem ser impressas em negrito com, no mnimo, o
dobro de altura do tamanho do restante do texto.

Art. 17 Os dizeres de rotulagem devem ser indelveis, legveis, com limite mnimo de 1 mm de
altura, sendo que a cor e o tipo das letras usadas no podem se confundir com o fundo.

Art. 18 O rtulo do produto no pode conter etiquetas e dados escritos a mo e os dizeres no

podem ser apagados ou rasurados durante a vigncia do prazo de validade.

Art. 19 proibida a inscrio de lote, data de fabricao e validade na tampa do produto.

Art. 20 No pode haver indicao de: NO TXICO, SEGURO, INCUO, NO PREJUDICIAL

ou outras indicaes similares. No devem constar tambm termos superlativos tais como: O
MELHOR, INCOMPARVEL, O MENOS AGRESSIVO ou similar.

Art. 21 Quando a superfcie da embalagem no permitir a indicao da forma de uso,

precaues e cuidados especiais, estas devem ser indicadas em prospectos ou equivalente,
que acompanhem obrigatoriamente o produto, devendo na rotulagem figurar a advertncia:
"ANTES DE USAR, LEIA AS INSTRUES DO PROSPECTO EXPLICATIVO" ou frase
equivalente.

Art. 22 O painel principal (face imediatamente voltada para o consumidor; mesmo painel onde
est localizado o nome comercial do produto), dever conter as seguintes informaes:

I - marca e/ou nome do produto;

II - categoria do produto: DETERGENTE ENZIMTICO;

III - destinao de uso: ASSISTNCIA SADE;

IV - indicao quantitativa relativa ao contedo lquido da embalagem;

V - a frase ANTES DE USAR, LEIA AS INSTRUES DO RTULO, em destaque e em

letras maisculas;

VI - a frase CONSERVE FORA DO ALCANCE DAS CRIANAS E DOS ANIMAIS

DOMSTICOS, em destaque e em letras maisculas;

VII - a frase PRODUTO EXCLUSIVAMENTE DE USO PROFISSIONAL PROIBIDA A

VENDA DIRETA AO PUBLICO, que deve estar em destaque e em letras maisculas,
ocupando uma rea igual ocupada pelo nome comercial ou tendo cada uma das letras altura
de no mnimo 1/25 (um vinte e cinco avos) da maior altura do painel principal com no menos
que 0,3 cm.

Art. 23 O painel principal ou secundrio dever trazer as seguintes informaes:

I Instrues sobre o uso do produto, com as seguintes informaes:

a) recomendaes quanto qualidade da gua utilizada no preparo da soluo de

limpeza (pH, condutividade e dureza);

b) informaes a respeito da diluio de uso do produto que deve ser expressa em

porcentagem, relao produto/diluente ou seus equivalentes no Sistema Mtrico
Decimal;

c) temperatura e tempo de imerso;

d) para produtos de pronto uso, exceto para produtos na forma de aerossis e/ou
pulverizados, a frase: A REUTILIZAO DO PRODUTO PODE PROVOCAR

4
 PERDA DA EFICINCIA. Essa frase deve estar em destaque e em letras
maisculas;

e) para produtos com diluio de uso, as frases: UTILIZAR IMEDIATAMENTE APS

O PREPARO. A REUTILIZAO DA SOLUO DE LIMPEZA PODE PROVOCAR
PERDA DA EFICINCIA. Estas frases devem estar em destaque e em letras
maisculas.

II- Informaes sobre composio qualitativa e princpio ativo, obedecendo aos seguintes
critrios:

a) na composio do produto os princpios ativos (tensoativos e enzimas) e outros

componentes de importncia toxicolgica devem ser indicados pelo nome qumico
aceito internacionalmente e os demais componentes da formulao por sua funo;

b) devem ser informados os teores dos tensoativos em porcentagem peso por peso
(% p/p);

c) a atividade enzimtica mnima encontrada ao final do estudo de estabilidade deve

ser expressa em Unidades de Atividade Enzimtica, conforme definido no anexo a
esse regulamento. Os valores devem ser representados por nmeros inteiros,
decimais ou exponenciais, sempre com arredondamento na segunda casa decimal
aps a vrgula, e por meio da expresso designativa abaixo:
-1 -1
1. Atividade Proteoltca mnina: _ _,_ _ UP.mL .min ;
-1 -1
2. Atividade Amiloltica mnima: _ _,_ _ UA.mL .min .

III faixa de pH do produto puro e na diluio de uso quando este no for lquido;

IV - lote ou partida e data de fabricao;

V - o prazo de validade deve ser descrito na rotulagem dos produtos por meio das expresses
designativas abaixo, suas abreviaes ou outras expresses equivalentes:

a) VLIDO AT: (MS/ANO) ou

b) VLIDO POR: ____ MESES, a partir da data de fabricao., incluindo DATA DE

FABRICAO (MS/ANO) ou

c) USAR EM ____ MESES, a partir da data de fabricao., incluindo DATA DE

FABRICAO (MS/ANO).

VI - dados do Fabricante e/ou Distribuidor e/ou Importador:

a) razo social, endereo e Cadastro Nacional da Pessoa Jurdica (CNPJ) do

fabricante e/ou distribuidor e/ou importador;

b) Indstria Brasileira ou o nome do pas de origem do produto, no caso de produto

importado;

c) nmero do registro do produto junto a Anvisa/MS;

d) nmero de telefone do Servio de Atendimento ao Consumidor SAC;

e) telefone para emergncias toxicolgicas, Centro de Intoxicaes (CEATOX), ou

servio equivalente. O nmero do disque-Intoxicao 0800-722-6001
disponibilizado pela Anvisa, que coordena a Rede Nacional de Centros de
Informao e Assistncia Toxicolgica (Renaciat), poder ser informado.

5
VII - frases de advertncia:

a) inserir a frase: ATENO! Provoca irritao ocular e cutnea. Usar luvas, avental,
culos e mscara de proteo durante a manipulao do produto.. Essa frase
pode ser omitida se for comprovado que o produto puro, ou na diluio de uso,
quando este no for lquido, enquadra-se na classificao drmica e ocular
primria como no irritante ou levemente irritante, de acordo com o teste de
Draize em coelhos albinos ou atravs de ensaios in vitro devidamente validados e
aceitos pela Autoridade Sanitria competente;

b) inserir o smbolo de substncia irritante (figura 1) que deve ter altura equivalente a
15% da maior altura do painel principal e no inferior a 1,0 cm de altura. O smbolo
deve ser na cor preta em fundo branco e com moldura vermelha (no padro CMYK:
C0M100Y100K0, referncia: Pantone 485). Esse smbolo pode ser omitido se for
comprovado que o produto puro ou na diluio de uso, quando este no for lquido,
enquadra-se na classificao drmica e ocular primria como no irritante ou
levemente irritante, conforme descrito no subitem anterior;

Figura 1.

c) No misturar com outros produtos, exceto se tal procedimento estiver indicado

pelo fabricante do produto no rtulo;

d) Mantenha o produto em sua embalagem original;

e) No reutilize as embalagens vazias.

VIII - frases de precauo:

a) No ingerir. Evite inalao ou aspirao, contato com os olhos ou com a pele;

IX - primeiros socorros:

a) Em caso de contato com os olhos ou a pele, lave imediatamente com gua em

abundncia;

b) Em caso de ingesto, no provoque vmito e consulte imediatamente o Centro de

Intoxicaes ou o mdico levando o rtulo do produto.

CAPTULO V
DOS ENSAIOS ANALTICOS PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA

Art. 24 Os ensaios de atividade enzimtica devem obedecer ao disposto no anexo a esse

regulamento.

Art. 25 A solicitao de incluso e/ou excluso, modificao ou adaptao aos mtodos de

ensaio de atividade enzimtica estabelecidos no anexo a esse regulamento, devem ser
encaminhada Anvisa, na forma de relatrio, para avaliao. O relatrio deve conter as
seguintes informaes:

6
I justificativa tcnica;

II fundamento terico da proposta;

III bibliografia sobre o assunto;

IV protocolo e estudo final de validao, contemplado no mnimo os parmetros de

especificidade, seletividade, linearidade, intervalo, preciso, recuperao, robustez, limite de
quantificao e exatido.

CAPTULO VI
DAS DISPOSIES FINAIS E TRANSITRIAS

Art. 26 A partir da publicao desta resoluo, o registro de novos produtos deve atender na
ntegra este regulamento.

Art. 27 Concede-se o prazo de 360 dias para que os produtos anteriormente notificados sejam
ajustados aos dispositivos desta resoluo.

Art. 28 O descumprimento das disposies contidas nesta resoluo e no regulamento por ela
aprovado constitui infrao sanitria, nos termos da Lei n 6.437, de 20 de agosto de 1977,
sem prejuzo das responsabilidades civil, administrativa e penal cabveis.

Art. 29 Esta resoluo entra em vigor na data de sua publicao.

DIRCEU BRS APARECIDO BARBANO

ANEXO

METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE PROTEOLTICA

UTILIZANDO AZOCASENA COMO SUBSTRATO EM DETERGENTES ENZIMTICOS.

I - CONSIDERAES GERAIS:

a) Todos os reagentes utilizados nos ensaios devem ser de grau analtico;

b) Todos os ensaios devem ser realizados no mnimo em triplicata, utilizando um

branco para cada amostra;

c) So adotadas as seguintes condies padres de ensaio:

1. Temperatura de incubao: (40 1)C;

2. Sistema tamponante: tris-HCl 0,05M pH 8,0;

3. Tempo de reao: 15 minutos.

II - PRINCPIO:

a) Este mtodo se baseia na determinao da atividade proteoltica pela

quantificao do grupamento azo liberado pela hidrlise do substrato
cromognico azocasena.

7
III - EQUIPAMENTOS:

a) Espectrofotmetro UV/VIS;

b) Centrfuga para microtubos;

c) Banho-termosttico.

IV - MATERIAL UTILIZADO:

a) Bqueres;

b) Bales volumtricos;

c) Provetas;

d) Micropipetas para volumes de 100 a 1000L;

e) Microtubos de 2mL;

f) Cubetas para espectrofotmetro com 1cm de caminho ptico.

V - REAGENTES:

a) Tris (tris-hidroximetil-aminometano);

b) cido clordrico 37%;

c) cido tricloroactico (TCA);

d) Azocasena.

VI - PREPARO DE SOLUES:

a) Soluo de cido clordrico 1 M

1. Diluir 8,5mL de cido clordrico (d = 1,18 g/mL e concentrao de 37%) em

gua destilada e completar o volume para 100mL.

b) Sistema tamponante: Tampo tris-HCl 0,05M pH 8,0:

1. Dissolver 0,605g de tris em 90mL de gua destilada. Adicionar HCl 1M at

atingir o pH 8,0. Completar o volume para 100mL. Estocar a (5 3)C por
no mximo uma semana.

c) Substrato: Soluo de azocasena a 2% (m/v):

1. Dissolver 2g de azocasena em 100mL de gua destilada. Esta soluo

deve ser preparada no dia da anlise.

d) Soluo de parada da reao: Soluo de cido tricloroactico (TCA) 20%

(m/v):

1. Dissolver 20g de cido tricloroactico em 100mL de gua destilada.

Estocar a (5 3)C por no mximo uma semana.

VII - MTODO DE ENSAIO.

8
 a) Preparo da amostra

1. A amostra dever ser preparada na diluio de uso declarada pelo

fabricante.

b) Ensaio da amostra:

1. Em um microtubo de 2mL, adicionar 200L de tampo tris-HCl 0,05M e

100L do substrato (azocasena 2%);

2. Incubar em banho-termosttico a (40 1)C e deixar atingir o equilbrio

trmico (aproximadamente de 1 a 2 minutos);

3. Adicionar 100L da amostra a temperatura ambiente, preparada conforme

item VII a nos microtubos, em intervalos de tempo previamente estipulados
(15 a 30 segundos) entre as adies, e incubar no banho por 15 minutos
na mesma temperatura;

4. Parar a reao adicionando 800L de TCA 20% observando os intervalos

estipulados (15 a 30 segundos) para que o tempo de reao (15 minutos)
seja o mesmo em todos os microtubos;

5. Em seguida, centrifugar os microtubos a 6000g (no mnimo) por 5 minutos,

recolher o sobrenadante e ler em espectrofotmetro a 400nm;

c) Ensaio do branco da amostra:

1. Preparar um branco adicionando em um microtubo de 2mL, 200L de

tampo tris-HCl 0,05M, 100L de azocasena 2% e 800L de TCA 20%;

2. Acondicionar em banho-termosttico a (40 1)C, deixar atingir o equilbrio

trmico (aproximadamente de 1 a 2 minutos);

3. Adicionar 100L de amostra e deixar no banho por 15 minutos a mesma

temperatura;

4. Em seguida centrifugar os microtubos a 6000g (no mnimo) por 5 minutos,

recolher o sobrenadante e ler em espectrofotmetro a 400nm.

VIII - RESULTADO.
-1 -1
a) Definio da Unidade de Atividade Proteoltica (UP.mL .min. ):

1. Definida como a quantidade de enzima necessria para produzir uma

variao de uma unidade de Densidade ptica (DO) em uma cubeta de
1cm de caminho ptico por mL de amostra por minuto, sob condies
padres.

b) Clculo do resultado:

( ABS AM ABS BR ) * 10
Atividade Pr oteoltica [UP.mL1 . min . 1 ] =
15

ONDE: ABSAM absorbncia da amostra.

ABSBR absorbncia do branco da amostra.

OBS.: caso a amostra no possa ser analisada na diluio de uso (em virtude da atividade
proteoltica gerar uma densidade ptica maior do que o limite mximo de confiana do

9
espectrofotmetro = 0,9), realizar diluio 5 vezes da amostra descrita no item VII a; se
necessrio, realizar diluies subseqentes (ex.: 10 vezes, 15 vezes, e assim sucessivamente).
.

( ABS AM ABS BR ) * 10 * fd
Atividade Pr oteoltica [UP.mL1 . min .1 ] =
15

ONDE: ABSAM absorbncia da amostra

ABSBR absorbncia do branco da amostra
fd fator de diluio

Para o clculo da atividade, deve ser considerada somente a primeira diluio que
apresentar resultado dentro da faixa de deteco do aparelho (a leitura da absorbncia deve
ficar entre 0,1 e 0,9).

METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DA ATIVIDADE AMILOLTICA

UTILIZANDO AMIDO SOLVEL COMO SUBSTRATO EM DETERGENTES ENZIMTICOS.

I - CONSIDERAES GERAIS:

a) Todos os reagentes utilizados nos ensaios devem ser de grau analtico;

b) Todos os ensaios devem ser realizados no mnimo em triplicata, utilizando um

branco para cada amostra;

c) So adotadas as seguintes Condies Padres de Ensaio:

1. Temperatura de incubao: (40 1)C.

2. Sistema tamponante: citrato-fosfato 0,05M pH 6,0.

3. Tempo de reao: 30 minutos.

II - PRINCPIO:

a) Este mtodo baseia-se na determinao da atividade amiloltica pela

quantificao dos acares redutores liberados pela reao de hidrlise do
amido catalisada por amilases.

III - EQUIPAMENTOS:

a) Espectrofotmetro UV/VIS;

b) Banho-termosttico;

c) Placa de aquecimento.

IV - MATERIAL UTILIZADO:

a) Bqueres;

b) Bales volumtricos;

10
 c) Pipetas volumtricas de 15mL;

d) Provetas;

e) Micropipetas para volumes de 10 a 5000L;

f) Tubos de ensaio com capacidade mnima de 25mL com tampa;

g) Cubetas para espectrofotmetro com 1cm de caminho ptico.

V - REAGENTES:

a) Amido solvel;

b) cido ctrico;

c) Fosfato de sdio dibsico;

d) Glicose;

e) Hidrxido de sdio;

f) Tartarato de sdio e potssio;

g) Metabissulfito de sdio;

h) Fenol;

i) cido 3,5-dinitrosaliclico;

VI - PREPARO DE SOLUES:

a) Soluo de cido ctrico 0,05M: dissolver 1,05g de cido ctrico em 100mL de

gua destilada.

b) Soluo de fosfato de sdio dibsico 0,05M: dissolver 1,38g de fosfato de

sdio dibsico em 100mL de gua destilada.

c) Sistema tamponante (tampo citrato-fosfato 0,05M pH 6,0): em um balo de

100mL, adicionar 36 mL de cido ctrico 0,05M e juntar com 64 mL de fosfato
de sdio dibsico 0,05M. Se necessrio, corrigir o pH com uma destas
solues. Estocar a (5 3)C por no mximo uma semana.

d) Substrato: Soluo de amido solvel 1% (m/v): dissolver 1g de amido em

100mL de gua destilada, aquecer at a fervura, esfriar e completar o volume
novamente para 100mL. Esta soluo deve ser preparada no dia da anlise.

e) Soluo padro de glicose 55,6 mol.mL (1% m/v): dissolver 1g de glicose

-1

em 100mL de gua destilada, considerando a pureza do reagente.

f) Reagente de cido 3,5-dinitrosaliclico (reagente DNS): em 236mL de gua

destilada adicionar 3,0g de hidrxido de sdio e dissolver at solubilizao
total. A partir desta soluo, adicionar sequencialmente 51g de tartarato de
sdio e potssio, 1,38g de metabissulfito de sdio, 0,63g de fenol e 1,77g de
cido 3,5-dinitrosaliclico.

11
OBS.: a adio de cada reagente dever ser feita aps a dissoluo do reagente anterior.

VII - MTODO DE ENSAIO.

a) Curva analtica de glicose:

1. Transferir 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 e 140L da soluo glicose a
-1
55,6mol.mL para tubos de ensaio com tampa;

2. Adicionar respectivamente 600, 580, 560, 540, 520, 500, 480 e 460L de
tampo citrato-fosfato 0,05M, pH 6,0, conforme tabela 1.

Tabela 1. Valores para construo da curva de calibrao de glicose.

Volume da soluo Conc. final de glicose
Tubo N Volume de tampo (L) -1
de glicose 1% (L) (mol. mL )
0 0 600 0,000
1 20 580 0,06515
2 40 560 0,1303
3 60 540 0,1954
4 80 520 0,2609
5 100 500 0,3257
6 120 480 0,3909
7 140 460 0,4560

3. Adicionar 1,5 mL de reagente DNS;

4. Em seguida ferver por 5 minutos em banho-maria;

5. Aps os 5 minutos de fervura, resfriar os tubos transferindo-os para outro

becker contendo gua a temperatura ambiente;

6. Aps resfriamento dos tubos de ensaio, adicionar 15 mL de gua destilada

em cada tubo de ensaio;

7. Agitar os tubos de ensaio fechados;

8. Ler em espectrofotmetro a 550nm;

9. Construir uma curva analtica para glicose (concentrao de glicose [mol]

vs. absorbncia), utilizando o primeiro ponto como zero do equipamento,
conforme tabela 1;

10. Construir a equao da reta, para clculo posterior.

NOTA: a concentrao de acares redutores ser expressa em mol. mL de glicose.

-1

b) Preparo da amostra

1. A amostra dever ser preparada na diluio de uso declarada pelo

fabricante.

12
 c) Ensaio da amostra:

1. Em um tubo de ensaio com tampa, adicionar 300L de tampo citrato-

fosfato 0,05M e 200L de soluo de amido solvel 1%.

2. Incubar em banho-termosttico a (40 1)C, deixar atingir o equilbrio

trmico (aproximadamente de 1 a 2 minutos).

3. Realizar um branco para cada replicata, com adio de amostra,

substituindo o volume do substrato por tampo. Este deve ser lido
juntamente com a amostra;

4. Realizar um branco sem adio de amostra, substituindo o volume da

amostra por tampo. Ser utilizado para zerar o equipamento, no
comprimento de onda do ensaio;

5. Adicionar em cada tubo de ensaio 100L de amostra a temperatura

ambiente, preparada conforme item VII b, em intervalos de tempo
previamente estipulados (15 a 30 segundos) entre as adies, e deixar no
banho-termosttico por 30 minutos;

6. Parar a reao adicionando 1,5 mL de reagente DNS, observando os

intervalos estipulados (15 a 30 segundos) para que o tempo de reao (30
minutos) seja o mesmo em todos os tubos de ensaio.

7. Em seguida ferver por 5 minutos em banho-maria;

8. Aps os 5 minutos de fervura, resfriar os tubos transferindo-os para outro

becker contendo gua a temperatura ambiente;

9. Aps resfriamento dos tubos de ensaio, adicionar 15 mL de gua destilada

em cada tubo de ensaio;

10. Agitar os tubos de ensaio fechados;

11. Ler em espectrofotmetro a 550nm;

12. Determinar a concentrao de acares redutores utilizando a curva

analtica de glicose.

VIII - RESULTADO.

-1 -1
a) Definio da Unidade de Atividade Amiloltica (UA.mL .min ):

1. Definida como a quantidade de enzima necessria para liberar 1 mol de

acares redutores por mL por minuto, conforme condies descritas
acima.

b) Clculos:

Clculo da Concentrao na curva analtica (mol/mL):

y b ( ABS AM ABS * BR ) b
x= C=
a a

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 concentrao, em mol.ml
-1
ONDE: C
(ABSAM) valor da leitura na amostra, em nm
(ABS*BR) valor da leitura no branco, em nm
b coeficiente linear
a coeficiente angular

* Se a leitura do branco da amostra (sem substrato) for negativa, deve-se desconsiderar no

clculo.

Clculo da atividade amiloltica:

C 10
Atividade Amiloltica [UA.mL1 . min . 1 ] =
30

ONDE: C concentrao de acares redutores na amostra (mol), determinada atravs da curva

analtica de glicose.

OBS.: caso a amostra no possa ser analisada na diluio de uso, por apresentar atividade
maior do que a faixa analtica da curva presente no item VII a, realizar diluio 5 vezes da
amostra descrita no item VII b; se necessrio, realizar diluies subsequentes (ex.: 10 vezes,
15 vezes, e assim sucessivamente).

C 10 fd
Atividade Amiloltica [UA.mL1 . min . 1 ] =
30

ONDE: C concentrao de acares redutores na amostra (mol), determinada atravs da curva

analtica de glicose.
fd fator de diluio da amostra, quando houver.

Para o clculo da atividade, deve ser considerada somente a primeira diluio que
apresentar resultado dentro da faixa de deteco da curva analtica.

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