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Microscopia Confocal Aplicada s Cincias

Biolgicas Bsicas

Chapter April 2015

CITATIONS READS

0 455

9 authors, including:

Renato A Mortara Alexis Bonfim-Melo

Universidade Federal de So Paulo Federal University of So Paulo, Brazil
274 PUBLICATIONS 4,001 CITATIONS 16 PUBLICATIONS 57 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

Fernando Real Diana Bahia

Institut Cochin, Universit Paris Descartes, C Universidade Federal
29 PUBLICATIONS 152 CITATIONS 45 PUBLICATIONS 366 CITATIONS

SEE PROFILE SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Study of Trypanosoma cruzi trypomastigotes egress from infected cells. View project

Trypanosoma cruzi: genomic variations and mechanisms of cell invasion and egress View project

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 8
CAPTULO
MICROSCOPIA
CONFOCAL POR
VARREDURA
A LASER:
FUNDAMENTOS
E MTODOS
Renato A. Mortara
Alexis Bonfim-Melo
Bianca Rodrigues Lima
Carina Carraro Pessoa
Cristina Mary OrikazaToqueiro
Diana Bahia
den Ramalho de Arajo Ferreira
Fernando Real
Pilar V. Florentino

8.1 INTRODUO

A microscopia confocal baseia-se na iluminao por varredura a laser,

ponto-a-ponto, de um espcime biolgico normalmente tratado ou marcado
com compostos fluorescentes. A luz refletida pela amostra (usualmente sob
a forma de fluorescncia) atravessa uma abertura mecnica ou ris (pinhole)
que bloqueia feixes provenientes de pontos acima e abaixo do plano focal.
222 Biotecnologia Aplicada Sade

Portanto, ao chegar a um detector (de regra um fotomultiplicador), apenas

a luz originada em um nico plano focal observada. Assim, os chamados
microscpios confocais permitem a aquisio de imagens digitalizadas de
diferentes planos focais de uma amostra biolgica, em analogia a uma tomo-
grafia. Com estas galerias ou sries (no plano z), pode-se reconstruir tridi-
mensionalmente a estrutura observada. Por meio de pseudocores aditivas
(Red, Green, Blue), diferentes fluorforos podem ser identificados em detec-
tores especficos, para os quais cores primrias foram definidas. Mediante
o uso de diferentes fluorforos numa mesma amostra, podem-se inferir fun-
es de componentes biolgicos visualizados pelos instrumentos bem como
se identificar regies de colocalizao (pela sobreposio de cores), normal-
mente sugestivas de interaes fisiolgicas. A obteno simultnea de ima-
gens com exata sobreposio do sinal de fluorescncia e da luz transmitida
(contraste de fase, ou contraste interferencial de Nomarski - DIC) permite
ainda a localizao estrutural da marcao por fluorescncia, sobre a estru-
tura biolgica analisada. Outra caracterstica, nica destes instrumentos,
sua capacidade de se obter uma seco atravs do eixo z, chamado de corte
ptico vertical ou y section, que possibilita a visualizao lateral de uma
amostra. Amostras vivas podem ser observadas e seccionadas opticamente
ao longo do tempo, gerando imagens chamadas multidimensionais.

8.2 HISTRICO

Marvin Minsky, em 1955, concebeu um arranjo que consiste de ilumi-

nao pontual (por meio de pinholes os componentes n 14, Figura 8.1)
acoplada a uma barreira, tambm pontual, na deteco de luz (pinholes os
componentes n 24, Figura 8.1). Este desenho inovador permitiria a elimina-
o do brilho intenso e difuso proveniente de luz no focalizada, originada
de uma amostra biolgica1. Seu invento previa a deteco da luz oriunda da
amostra tanto por transiluminao (Figura 8.1A), como tambm por refle-
xo (Figura 8.1B), arranjo este que persiste at hoje na maioria dos instru-
mentos. Como os pinholes esto situados em planos pticos conjugados, o
invento ficou conhecido pelo nome de microscpio confocal.
A ideia de Minsky comeou a atrair a ateno de cientistas e bilo-
gos quando surgiram na literatura os primeiros trabalhos demonstrando
o enorme potencial de molculas fluorescentes como marcadores de estru-
turas biolgicas, particularmente por meio de anticorpos especficos 2 e
indicadores de clcio 3. Entretanto, as imagens obtidas por microscpios
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 223

Figura 8.1 Desenhos esquemticos do princpio da microscopia confocal, extrados do trabalho original de seu inventor, Marvin Minsky
[1]. Na parte A, o esquema mostra o percurso da luz com a fonte de iluminao ( esquerda), que atravessa a amostra (22) para
ser detectada ( direita, No. 22). Neste caminho por transiluminao do plano focal D da amostra, a luz atravessa dois pinholes:
nmeros 14 na parte da iluminao/excitao e 24, na deteco; na parte B, o esquema ilustra o caminho da luz por epi-iluminao
(a luz incidente e a refletida passam pela objetiva): a iluminao pontual (pinhole assinalado com o nmero 14) atravessa um espelho
dicrico (17) e a objetiva (11), incidindo na amostra (22) no plano focal D; a luz refletida retorna ao detector (28) atravs do
segundo pinhole conjugado (24).

de fluorescncia convencionais eram de baixa qualidade, especialmente

pela contribuio da luz oriunda dos diferentes planos focais das amostras.
Desta forma, era impossvel se distinguir finos padres de distribuio em
fundo brilhante e difuso. Vrios grupos, independentemente, comearam
a enfrentar este problema de diferentes formas, por meio de engenhosas
abordagens como o disco giratrio de Petrn4,5 e o pinhole fixo do grupo de
Brakenhoff que publicou as primeiras imagens convincentes utilizando um
microscpio confocal 6 (Figuras 8.2A, B).
Mas foi a perfeita e profcua integrao de conhecimento e tcnica que
permitiu que os bilogos John White e Brad Amos, juntamente com o
engenheiro eletrnico Mick (Michael) Fordham da excelente oficina (wor-
kshop) do Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology
224 Biotecnologia Aplicada Sade

(MRC-LMB), em Cambridge, Inglaterra, desenhassem e construssem o

primeiro instrumento com revolucionrias concepes pticas de White e
Amos. Este prottipo era controlado por um programa desenvolvido por
Richard Durbin, ento estudante de White7. Um dos diferenciais deste sis-
tema era a movimentao do feixe de iluminao (a laser) ao invs da inst-
vel translao da amostra, que deu origem denominao de varredura a
laser (Figura 8.2C). O sistema demonstrou ser extremamente interessante
e com ele, White, Amos e Fordham publicaram no Journal of Cell Biology
suas primeiras imagens 8. Como descrevem posteriormente White e Amos 7,
um dos editores da revista lhes pediu para adquirir um instrumento como
aquele! Vale destacar que uma das amostras cujas imagens no microscpio
confocal se mostraram espetacularmente mais ntidas do que na micros-
copia convencional (Figura 8.2, na referncia 5) foi, precisamente, uma
preparao de plasmcitos marcados com um anticorpo contra uma pro-
tena majoritria do retculo endoplasmtico, endoplasmina 9,10, fornecido
por Gordon L.E. Koch. Gordon foi orientador de PhD do autor (RAM),
alm de amigo e colega no MRC-LMB de White e Amos. A tecnologia
desenvolvida por White, Amos e Fordham foi comercializada pela BioRad
e teve tremendo impacto na rea de biologia nos anos seguintes. Hoje, so
poucas as instituies de pesquisa na rea biomdica que no possuem um
microscpio confocal.
Uma das primeiras aplicaes na biologia celular de infeces por parasi-
tas intracelulares foi a observao, por microscopia confocal e outras tcni-
cas, que a interao entre formas infectivas tripomastigotas de Trypanosoma
cruzi (o agente causador da doena de Chagas) com clulas de cultura, era
acompanhada de extensa redistribuio de actina das clulas11 e tambm, de
glicoprotenas do parasita12 (Figura 8.3). Vale lembrar que uma das primei-
ras imagens em que se utilizou contraste interferencial de Nomarski (DIC,
do ingls, differential interference contrast), uma tcnica de microscopia
ptica de iluminao usada para aumentar o contraste nas amostras no
coradas ou transparentes, ilustrou a capa do volume das Memrias do Ins-
tituto Oswaldo Cruz com material da XXVIII Reunio Anual de Pesquisa
Bsica em Doena de Chagas, em 1991 (Figura 8.4A, notas de rodap). DIC
trabalha com o princpio da interferometria para obter informaes sobre o
comprimento do caminho ptico da amostra, para ver detalhes de amostras
biolgicas de outra forma invisveis. Trata-se de um sistema de iluminao
relativamente complexo que produz uma imagem com o objeto que aparece
de tons do preto ao branco, sobre um fundo cinza. Esta imagem seme-
lhante obtida por microscopia de contraste de fase, mas sem o halo de
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 225

Figura 8.2 Esquema dos microscpios confocais de Brakenhoff (A), Petrn (B) e Amos & White (C). Nos trs esquemas, as letras
I indicam a deteco/ocular, S indicam a posio da amostra e as setas indicam em A: a posio do estgio/platina mvel, em B:
o disco de Nipkow com os orifcios que permitem iluminao pontual e em C: o conjunto de espelhos acoplados a galvanmetros que
movimentam o feixe de laser para a varredura. D: Acessrio para aquisio de imagem de monitor, chamado de pallete, com cmera
para filme de 35 mm acoplada.
226 Biotecnologia Aplicada Sade

difrao brilhante associado imunofluorescncia neste tipo de material.

Naquela poca, as imagens eram documentadas por meio de filmes foto-
grficos que registravam a imagem do monitor do computador, projetada
num acessrio chamado de palette que, por sua vez, estava acoplado a uma
cmera fotogrfica com filme de 35 mm. Para imagens coloridas, utiliza-
va-se filme para cpias coloridas ou para diapositivos (Figura 8.2D). Em
1997, quando o sistema MRC-1024UV foi adquirido pela Escola Paulista
de Medicina, este acessrio (pallete) foi includo por US$ 12.600. Atual-
mente (17 anos depois), pode ser encontrado, quase como raridade, por
menos de US$ 30 (eBay).

Figura 8.3 Imagens obtidas por microscopia confocal, com contraste de fase e fluorescncia, de formas metacclicas de Trypanosoma
cruzi invadindo clulas HeLa revelando concentrao de F-actina (marcada com faloidina fluorescente) e redistribuio de glicoprotenas
de superfcie marcadas com anticorpo anti-mucina 3F5. A e B: contraste de fase e marcao para F-actina na regio do parasita externa
clula (setas); C e D: contraste de fase e marcao para mucina com anticorpo 3F5 mostrando redistribuio das glicoprotenas
(setas) [11, 12, 22]. Imagens originalmente registradas em negativo de 35mm, escaneados.

8.3 O RPIDO DESENVOLVIMENTO DE UMA TECNOLOGIA

A metodologia se popularizou rapidamente e vrios laboratrios passaram

a utilizar a microscopia confocal em sua rotina. Para se ter uma ideia deste
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 227

Figura 8.4 A: Imagem por contraste interferencial de Nomarski (DIC) de clulas HeLa sendo invadidas por formas tripomastigotas
metacclicas de Trypanosoma cruzi (painel esquerda), marcados com anticorpo anti-mucina 3F5 [12], painel direita; notar as
marcaes registradas no monitor, ao alto e esquerda. Possivelmente a primeira imagem em DIC adquirida em microscpio confocal
(conforme confirmam mensagens trocadas entre o autor e Brad AmosI, II), originalmente registrada em negativo de 35mm, copiada em
papel fotogrfico e escaneada.

I "On 24 July 2013 21:46, Renato A. Mortara <ramortara@unifesp.br> wrote:

Hello Brad,I hope everything is fine with you. I hope you remember the very early 1990's when I
returned to the MRC (after my PhD) to work with Gordon Koch (who supervised my thesis) on the
then excitingly new confocal microscope.You helped me to set up the instrument several times and
in one particular occasion, set the DIC prisms/polarizers to detect beautiful images of Trypanosoma
cruzi parasites invading HeLa cells that were crucial for a paper that I published with a friend
(Schenkman, S. & Mortara, R.A. 1992. HeLa cells extend and internalize pseudopodia during active
invasion by Trypanosoma cruzi trypomastigotes. Journal of Cell Science, 101: 895-905).One of such
images was selected to illustrate an issue of a Brazilian journal that covered the most important
meeting on Chagas' disease (caused by T. cruzi) - attached.I am writing a small review on confocal
microscopy and wondered whether this image could be one of the very first DIC images obtained by
this technique: any input will be most welcome! My kindest regards, Renato."
II "Dear Renato,
It is very nice to hear from you.
I can confirm that the trypanosome image was one of the first examples of a combination of scanned DIC
and confocal fluorescence imaging.
Currently, I am retired but working like crazy on a novel type of microscope enabling scientists to get
confocal images of large objects such as whole mouse embryos 5 mm long. This involves a total redesign of
the microscope. I am making two such systems for an MRC funded project in Strathclyde, Scotland.
If you have an hour to spare, you can listen to a long lecture about modern microscopy and my work: just
search for ' Brad Amos Royal Society Leeuwenhoek Lecture' and you will be able to click on a box to show
the video.
One of the scientists working in the University of Strathclyde, Owain Millington, is already using the system
to image Leishmania invading mouse ear tissues.
Brad."
228 Biotecnologia Aplicada Sade

Figura 8.4 B: Imagem por contraste interferencial de Nomarski (DIC) de clulas Vero coinfectadas com amastigotas de Leishmania
amazonensis (cabeas de setas) e tripomastigotas metacclicos de Trypanosoma cruzi (setas). Neste caso, como no havia marcao
fluorescente e o objetivo foi o registro da coinfeco, o material foi fixado com glutaraldedo. Note que neste plano focal, parasitas das
duas espcies coabitam os mesmos vacolos, neste caso, de L. amazonensis [15]. Barra = 10 micrmetros.

crescimento, a palavra-chave, confocal, na base de dados Pubmed, em 1987,

fornece apenas seis entradas: em 2012, foram 4.837! Paralelamente ao desenvol-
vimento dos microscpios, ocorreu uma significativa evoluo nos computado-
res nos quesitos de armazenamento e aquisio de imagens com maior resolu-
o e velocidade, capacidade de processamento, bem como no arquivamento de
dados e imagens. Imagens coloridas deixaram de ser um problema para registro e
arquivamento. O repertrio de sondas fluorescentes cresce dia a dia, assim como
a variedade de protenas fluorescentes s quais se podem fusionar componentes
de interesse sendo observados tanto em clulas quanto em tecidos. Alm disto,
a variedade de anticorpos (comercialmente disponveis) ligados covalentemente
a conjugados fluorescentes das mais variadas caractersticas espectrais ampla
e crescente no mercado. Com estas construes pode-se avaliar, com preciso,
o envolvimento, recrutamento e redistribuio de componentes celulares. Igual-
mente, a disponibilidade crescente de laseres (de diodo ou de gases) ampliou de
forma significativa as possibilidades de estudos nesta rea, de modo que se pode
visualizar, atualmente, de seis a oito fluorforos numa mesma amostra.
H diversos textos sobre o tema e um dos mais citados o livro de James
B. Pawley 13. H tambm uma excelente e completa fonte de informao
sobre microscopia de luz em um Portal criado e mantido por quatro dos
principais fabricantes de instrumentos pticos (Leica, Zeiss, Nikon e Olym-
pus - http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html).
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 229

O uso crescente de protenas fusionadas Green Fluorescent Protein

(GFP) e seus inmeros variantes espectrais tambm impulsionou a uti-
lizao de diferentes tcnicas de microscopia de luz in vivo, inclusive a
microscopiaconfocal.
A introduo de elementos Accousto Optical Tunable Filters (AOTF)
(http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/filters/aotf/index.html) que permitem
a seleo precisa de comprimentos de onda de excitao (laseres) e emisso
tambm contribuiu enormemente para um avano significativo na preciso
e velocidade de aquisio de imagens pelos novos instrumentos. Com estes
dispositivos, que substituem os filtros dicricos, pode-se selecionar tambm a
geometria de uma rea da amostra (Region Of Interest ROI) tanto para ilu-
minao como para deteco, a qualquer momento de um experimento. Detec-
tores espectrais incorporados aos novos instrumentos possibilitam a separa-
o das emisses de fluorforos com espectros com alto grau de sobreposio
(spectral unmixing - http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/spectralima-
ging/introduction.html) como, por exemplo, fluorescena e GFP (Figura 8.5).

Figura 8.5 Separao espectral da fluorforos com espectros (excitao e emisso) prximos. A: Imagem original, sem separao, de
formas intracelulares de Trypanosoma cruzi: tripomastigotas (GFP) e amastigotas (revelados por anticorpo monoclonal 4B5 [22]; aps
separao: B: tripomastigotas, GFP; C: amastigotas (4B5); D: sobreposio dos canais separados. Barra de aumento = 10 micrmetros.

Outra razo para a ampla utilizao da microscopia confocal deve-se ao

fato de que os protocolos para a preparao de amostras fixadas so rela-
tivamente simples e reprodutveis (ver abaixo); alm disso, a incluso do
corante de DNA nuclear, DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol), possibilita a
imediata delimitao dos ncleos celulares nas amostras a serem observadas,
230 Biotecnologia Aplicada Sade

facilitando enormemente a caracterizao dos diferentes compartimentos

intra e extra-nucleares (Figura 8.6)14.

Figura 8.6 Marcao de clulas em cultura com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). A: fluorescncia de DAPI; B: mesmo campo reve-
lando as duas clulas por contraste interferencial de Nomarski (DIC); C: sobreposio de DAPI sobre DIC as setas indicam a marcao
nuclear, facilmente observada. Barras = 10 micrmetros.

Uma particularidade adicional que agrega qualidade s imagens e infor-

mao sobre as amostras , como citado acima, a utilizao do DIC para
observao da luz transmitida, pois esta tcnica permite tambm o fatia-
mento ptico da amostra, de modo que apenas o plano de foco aparece con-
trastado [http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/dic/dichome.html].
Um exemplo desta ferramenta a observao da colocalizao de formas
tripomastigotas de Trypanosoma cruzi em vacolos espaosos formados por
amastigotas de Leishmania amazonensis em clulas Vero (Figura 8.4B)15.
A visualizao de amostras vivas avanou extraordinariamente com o
desenvolvimento de acessrios que permitem a manuteno, on stage, de
clulas por at vrios dias com temperatura, umidade e CO2 controlados
(http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/livecellimaging/index.html)16.

8.4 PROTOCOLO BSICO PARA PREPARAO DE AMOSTRAS

PARA VISUALIZAO POR MICROSCOPIA CONFOCAL,
AQUISIO DE IMAGENS E PROCESSAMENTO

A preparao de amostras para microscopia confocal normalmente utiliza

espcimes fixados. Para cortes de tecidos ou culturas celulares, aderidos ao
vidro (lmina ou lamnula), os agentes mais utilizados para fixao so alde-
dos ou, alternativamente, solventes desnaturantes como metanol ou acetona.
A vantagem dos aldedos permitir melhor preservao geral da morfologia
sem extrao de componentes que ocorre com os agentes desnaturantes: a
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 231

reatividade dos eptopos em estudo que ir determinar o mtodo de esco-

lha. Cortes de material includo em parafina devem ser previamente despara-
finizados com solues sequenciais de xileno:etanol (1:0; 1:1; 3:7; 0:1; 0:1)
e imerso em soluo salina tamponada com 0,01M fosfato (PBS, do ingls,
phosphate buffered saline). Aps lavagem das amostras em PBS, recomenda-se
fixar com para-formaldedo soluo 4% em soluo salina tamponada com
0,1M fosfato, por 10 a 30 minutos temperatura ambiente (TA). Lava-se com
PBS 3 vezes para remoo do aldedo e incuba-se a amostra com compostos
com amino grupos livres (50 mM NH4Cl ou glicina, em PBS) para exausto
dos grupamentos aldedos remanescentes por 15 minutos TA. Aps fixao,
lavam-se as amostras pelo menos trs vezes com PBS e imerge-se o material em
soluo bloqueadora, com excesso de protena inerte para minimizar ligaes
no especficas dos anticorpos primrios e secundrios. Recomenda-se soluo
de PBS com 2% de gelatina (PG) ou albumina srica bovina (BSA, do ingls,
bovine serum albumin). Caso haja necessidade de permeabilizao das amostras
para garantir o acesso dos anticorpos ao interior de clulas e tecidos, pode-se
acrescentar detergente no inico soluo de bloqueio (que aqui chamaremos
de PBS/gelatina/saponina ou PGS). Na rotina, emprega-se 0,1% saponina (ou,
alternativamente, Triton X-100 ou Nonidet P-40). O bloqueio/permeabilizao
pode ser feito por uma hora TA. A seguir, as amostras so incubadas com os
anticorpos primrios previamente titulados, como ilustrado no Esquema 8.1 e
diludos em PG ou PGS (no caso de antgenos intracelulares) por 1 hora TA
ou, alternativamente, por 16 horas em cmara mida (caixa plstica fechada
com um pedao de algodo umedecido) a 4 oC. Para clulas aderidas s lamnu-
las, pode-se adicionar 20-30 l (microlitros) da soluo de anticorpo primrio a
uma superfcie hidrofbica (Parafilm, por exemplo) no fundo de uma cmara
mida e inverte-se a lamnula sobre a gota para as incubaes. Aps a exposio
aos anticorpos primrios, as amostras devem ser lavadas com PBS TA (com
um volume adequado de PBS/amostra tipicamente utiliza-se 3-4 ml por lam-
nula de 13 mm de dimetro e 5-10 ml por lmina). Lava-se por cinco minutos e
repete-se trs vezes. A seguir, evitando que a amostra seque ao ar, incuba-se com
os anticorpos secundrios fluorescentes previamente titulados, tambm chama-
dos de conjugados, adequados s espcies das imunoglobulinas dos anticor-
pos primrios (por exemplo, um anticorpo primrio monoclonal produzido em
camundongo deve ser revelado com conjugado fluorescente anti-Ig de camun-
dongo, porm os anticorpos secundrios devem ser feitos em espcies diferentes
dos preparados em primrios). Os conjugados so tambm diludos em PG ou
PGS, de acordo com o objetivo do experimento. Quando so realizadas duplas
ou mltiplas marcaes, devem-se observar os seguintes critrios: a) cada par
232 Biotecnologia Aplicada Sade

anticorpo primrio-conjugado deve ser previamente testado e titulado; b) deve-

-se verificar a ausncia total de reatividade cruzada dos anticorpos secundrios
com os anticorpos primrios no relacionados bem como de seus respectivos
fluorforos (por exemplo, fluorescena, GFP, rodamina, DAPI etc.) de modo
que, para observao ao microscpio, no haja cross-talk ou vazamento da
fluorescncia no canal de um fluorforo em outro, gerando ao final uma falsa
colocalizao, semelhantemente ao ilustrado na Figura 8.5. Nestes casos, opta-
-se pelas incubaes sequenciais: 1 anticorpo primrio 1 anticorpo secun-
drio 2 anticorpo primrio 2 anticorpo secundrio etc. Normalmente
DAPI e outros corantes fluorescentes como faloidina acoplada a fluorforos, so
adicionados na ltima incubao, sempre aps titulao prvia. Aps lavagem
final, conforme descrito acima, as lminas ou lamnulas so montadas em meio
prprio (90% glicerol, 0,86M Tris/HCl pH 8,6 e 0,1% de p-fenilenodiamina
como anti-fading, que reduz a fotodestruio ou photobleaching). Como nor-
malmente os microscpios acoplados aos sistemas de aquisio so invertidos
(por permitirem a visualizao de material vivo), as lminas e lamnulas devem
ser seladas porque ao serem invertidas, em direo s objetivas, no podem
vazar e ter o contedo do meio de montagem misturado com o leo de imerso;
para tanto, esmalte para unhas incolor adequado (Esquema 8.2).

Esquema 8.1 Titulao de anticorpos por diluio seriada. O soro ou anticorpo na concentrao inicial X, diludo sequencialmente para
1/2 da diluio anterior. O ttulo do anticorpo ser a maior diluio que apresentar reao positiva.
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 233

Esquema 8.2 Imunofluorescncia de amostras aderidas a lamnulas. Sequncia das etapas, cuja fundamentao e objetivos esto
assinalados, para preparao de rotina de amostras para microscopia confocal por imunofluorescncia.
234 Biotecnologia Aplicada Sade

Uma vez prontas as amostras, o material levado ao microscpio con-

focal. No instrumento, inicialmente se focaliza a amostra ao microscpio
com a objetiva adequada, escolhe-se o campo a ser observado e inicia-se
a aquisio de imagens. Normalmente, os instrumentos so operados por
softwares especficos que permitem selecionar os laseres a serem utilizados,
os detectores (ou fotomultiplicadores ou PMTs - http://micro.magnet.fsu.
edu/primer/digitalimaging/digitalimagingdetectors.html) correspondentes,
bem como outros parmetros como tamanho da imagem, velocidade de
aquisio, dimetro do pinhole ou ris, ganho/potncia a ser aplicada nos
PMTs para ajuste da saturao da imagem, alm do tamanho do pixel ou
pixel size (as dimenses lineares em nm x nm, de cada ponto do monitor
ou picture element ou pixel). Este ltimo parmetro que varia conforme o
zoom eletrnico aplicado amostra (quanto maior o zoom, menor o pixel
size), deve ser ajustado de modo a satisfazer o critrio de amostragem de
Nyquist, um engenheiro sueco que trabalhou nos famosos Bell Telephone
Laboratories nos anos 1950 e 1960. Segundo Nyquist, quando um sinal
analgico digitalizado, o contedo de informao no sinal digitalizado
somente ser preservado se o dimetro da rea representada da amostra por
cada Pixel (ou pixel size), for, pelo menos, 2,3 vezes menor em dimenses
lineares (x, y, z) que o limite de resoluo do sistema ptico definido pela
equao de Raleigh: R= 0,61 x /NA. Para uma boa objetiva de N.A. 1.44 -
(assumindo-se comprimento de onda () = 488 nm), a resoluo (Rayleigh)
ser: R= 206,7 nm / 2,3 = 90 nm. Portanto, o tamanho do pixel de 90 nm
ser necessrio para se obter uma amostragem ideal (de um pixel) do mate-
rial a ser observado (x/y). Assim, em termos estatsticos, se ajustarmos o
zoom eletrnico para um pixel size menor, estaremos superamostrando e
para um pixel size maior, subamostrando13. Atualmente, os instrumentos
trazem estas informaes nos painis de controle dos aplicativos que os
controlam. Para se fazer uma srie z, selecionam-se os planos limitantes,
inferior e superior, que incluam, obviamente, a amostra a ser observada;
normalmente, os parmetros cruciais como o z-step ou a distncia entre
os diferentes planos, que no deve ser maior que 3 vezes o pixel size 13, so
definidos pelo instrumento e cabe ao operador aceit-los ou ajust-los, bem
como definir as dimenses das imagens em cada plano e o mtodo de aqui-
sio (ver a seguir). Usualmente, as imagens obtidas em velocidade padro
(400 Hz) e quadros de 512 x 512 pixels so ruidosas (pixeladas) e com
baixa resoluo. Para uma imagem sequencial (cada fluorforo excitado
detectado separadamente, para evitar crosstalk) de uma srie z, deve-se
optar por imagens de no mnimo 1024 x 1024 pixels e uma velocidade
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 235

menor ou, alternativamente, um protocolo de line averaging ou frame ave-

raging ou Kalman, normalmente disponveis no software de aquisio como
ilustrado no Esquema 8.3. Por estes procedimentos, as imagens so corrigi-
das por meio de mltiplas tomadas (tipicamente entre 5 e 10) de uma linha
ou de um quadro (frame) e os pixels no coincidentes vo sendo gradati-
vamente eliminados (filtrados), reduzindo o rudo e aumentando a nitidez
e, consequentemente, a qualidade final.

Esquema 8.3 Fluxograma para aquisio de Imagem em Microscpio Confocal.

H vrios aplicativos, comerciais e abertos, que podem ser utilizados para

o processamento de imagens obtidas em microscpios confocais. Um dos
softwares mais utilizados, por ser de acesso gratuito e ter constante atuali-
zao, o ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Este aplicativo compatvel
com diferentes plataformas (Windows, Macintosh, Linux) e tem inmeros
acessrios ou plugins que permitem que o programa processe imagens dos
mais diversos formatos digitais.
236 Biotecnologia Aplicada Sade

Um exemplo da capacidade de seccionamento ptico de uma amostra

biolgica ao microscpio confocal pode ser apreciado na Figura 8.7. Neste
caso, miracdios (larvas encontradas em locais com gua doce) do parasita
Schistosoma mansoni, fixados e processados como descrito acima, aps marca-
o com faloidina fluorescente, foram observados em diferentes planosfocais.
As imagens apresentadas na Figura 8.7 foram selecionadas, com o ImageJ,
entre 51 planos diferentes para se evidenciar as clulas flama (rgos excretores
primitivos) destas larvas que aparecem claramente marcados (Figura 8.7, cabe-
as de setas nas partes 1 e 3)17. A partir dos 51 diferentes planos focais, pode-se
obter, tambm com o ImageJ, uma projeo (denominada de projeo mxima
ou maximum projection) na qual ficam evidenciados os feixes musculares longi-
tudinais e transversais da larva (Figura 8.7, parte 2). Ainda, a partir das sries z
em que se selecionaram os planos de imagem de interesse, neste caso aqueles que
evidenciam as clulas flama, pode-se delimitar as imagens, que significa atribuir
um aspecto de slido aos pixels em trs dimenses, tambm chamados de voxels
(volume elements). O aspecto das clulas flama no formato de tbulo fica clara-
mente evidenciado por meio deste recurso (Figura 8.7 parte 3, B e C).
Conforme citado acima, nos instrumentos atuais, pode-se selecionar por
meio do AOTF uma rea da amostra para estudo. Se o posicionamento da
amostra nos eixos x,y puder ser controlado pelo software, em alguns instru-
mentos possvel se obter sries z em diferentes posies da amostra, com
sequncias temporais nas mesmas posies, permitindo a obteno de ima-
gens multidimensionais (x, y, z, tempo, intensidade de fluorescncia etc.) 16,
conforme ilustrado adiante.
No portal mencionado abaixo, o usurio pode tambm ter acesso, com
grande riqueza de detalhes e muita interatividade, aos princpios das vrias
tcnicas de microscopia de luz e at simular a utilizao de um microscpio
confocal com os principais ajustes e controles citados anteriormente como
seleo e intensidade dos laseres, dimetro dos pinholes, ganho dos PMTs,
velocidade da varredura, deteco da luz transmitida por DIC, plano de foco
e ainda pode escolher entre mais de dez amostras diferentes: http://www.
olympusconfocal.com/java/confocalsimulator/index.html.
Para material vivo (clulas em cultura, cortes de tecido etc.) devem-se uti-
lizar placas/cmaras especiais que possuem uma lamnula em seu fundo (com
espessura da ordem de 0,15 a 0,17 mm) de modo que as amostras possam ser
focalizadas, se necessrio, com objetivas de imerso em leo (Figura 8.8A). H
vrios fornecedores deste tipo de material (como por exemplo: http://glass-
bottom-dishes.com/pages/, http://ibidi.com/home/, http://www.matrical.com/
index.php/consumables/glass-bottom-optical-imaging-microplates). Para tanto,
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 237

Figura 8.7 1: A-H: Seccionamento ptico de miracdios de Schistosoma mansoni marcados para F-actina com faloidina-rodamina. No
painel so mostrados 8 dos 51 diferentes planos de imagens obtidos atravs do miracdio, selecionados para evidenciar suas 4 clulas
flama (cabeas de seta) [17]. 2: A: imagem de DIC da larva; B: projeo dos 51 diferentes planos da srie z mostrada no painel
superior onde podem ser claramente vistos os feixes musculares transversais (*) e longitudinais (setas). Barras = 20 micrmetros.
3: Visualizao das clulas flama em miracdio de S. mansoni por renderizao da srie z; larvas marcadas para F-actina acima foram
submetidas a seccionamento ptico (71 planos) e a galeria submetida projeo mxima (A); para se obter os detalhes demarcados
em B e C, estas regies foram selecionadas e depois se eliminaram os planos mais externos, para permitir a visualizao do interior com
as clulas flama; estas sub-galerias foram ento renderizadas com o plugin VolumeJ, do ImageJ e so mostrados, em B e C diferentes
ngulos de rotao que evidenciam as duas clulas flama (cabeas de setas) superiores em B e as duas inferiores, em C.
238 Biotecnologia Aplicada Sade

o equipamento deve possuir adaptadores na platina que permitam a manuten-

o adequada de temperatura, CO2 e umidade, alm de aquecedor de objetiva
para evitar transferncia de calor com a amostra. H no mercado placas de
cultura para clulas com marcaes de posio gravadas nas lamnulas que
permitem a realizao, por exemplo, de microscopia correlativa: aps a reao
de imunofluorescncia e aquisio de imagens, pode-se processar a amostra
para localizar a mesma regio da amostra para obteno da imagem corres-
pondente, por exemplo, por microscopia eletrnica18 (Figura 8.8 B).

confocal

FEG-SEM

Figura 8.8 Cmaras com registro posicional permitem incubao de clulas e tecidos vivos e microscopia correlativa. No exemplo, as c-
maras (seta vertical, acima; placa da marca ibidi) permitem a incubao de clulas vivas no microscpio, com sistemas que mantm CO 2,
temperatura e umidade controlados. As clulas podem ser observadas vivas por vrios dias (como na figura 13) ou, alternativamente,
processadas para imunofluorescncia (painis coloridos esquerda mostram diferentes posies no eixo z desta amostra com indicao
de 3 estruturas a, b e c); aps processamento para microscopia eletrnica de varredura (fixao, secagem em ponto crtico e meta-
lizao), a mesma posio encontrada e imagens so obtidas (imagem direita, onde se visualizam novamente as trs estruturas)

8.4 A MICROSCOPIA CONFOCAL NO ESTUDO DA INTERAO

TRYPANOSOMA CRUZI - CLULAS HOSPEDEIRAS

Conforme mencionado acima, as primeiras imagens em microscopia con-

focal da interao entre Trypanosoma cruzi e clulas hospedeiras11,12 foram
adquiridas no modelo mais antigo do microscpio confocal da BioRad,
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 239

ento chamado de MRC-500. Como j citado, naquele equipamento o regis-

tro das imagens era feito por meio de filme fotogrfico ou em diapositivos
por meio de palletes que adquiriam as imagens diretamente do monitor, pois
a digitalizao ainda no havia se popularizado. Quando o microscpio
confocal comeou a se difundir rapidamente pelo mundo e aqui no Brasil,
o grupo do prof. Wanderley de Souza na UFRJ, provavelmente o primeiro
a utilizar a microscopia confocal no Brasil, tambm focalizou no estudo da
interao entre vrios parasitas e clulas hospedeiras, empregando anticor-
pos e sondas fluorescentes especficas para organelas citoplasmticas como
complexo de Golgi, microfilamentos, microtbulos, mitocndrias, lipdeos
e vesculas acdicas19. Em 1997, a Escola Paulista de Medicina adquiriu, por
meio de apoio da Fundao de Amparo Pesquisa de So Paulo (FAPESP),
um instrumento MRC -1024 da BioRad (Hercules, Califrnia, EUA) equi-
pado com laseres UV e visvel. Este instrumento foi operado com sucesso
por treze anos e permitiu um grande avano em diferentes reas da bio-
logia celular na Instituio. Em 2011, foi substitudo por um microscpio
SP5 Tandem Scanner (que permite aquisies em alta velocidade) da Leica
Microsystems (Wetzlar, Alemanha), tambm com laseres near-UV e de vrios
comprimentos de onda no visvel. Este novo instrumento, tambm adquirido
com auxlio da FAPESP, permite aquisio de imagens multidimensionais
atravs de detector espectral e AOTF (para excitao e emisso).
A microscopia confocal no estudo da interao entre T. cruzi e clulas
e tecidos de mamferos foi, gradativamente, gerando resultados por nosso
grupo de pesquisa. Outros parasitas e tambm patgenos intracelulares
foram sendo estudados em vrios trabalhos sobre coinfeco. Vamos salien-
tar aqui alguns destes trabalhos, cuja relevncia pode ser aferida pelas cita-
es ou prmios recebidos, ou at pelo fato de que imagens de alguns destes
artigos tenham sido selecionadas para ilustrar as capas dos peridicos das
edies correspondentes (http://www.ecb.epm.br/~ramortara/Covers1.htm).
Entre 1997 e 1999, iniciaram-se estudos sobre os componentes parasitrios e
celulares envolvidos na invaso e crescimento intracelular de T. cruzi20,21 que
prosseguiram em vrias publicaes, alm de teses e dissertaes. Naquela
poca tambm foram produzidos anticorpos monoclonais anti-T. cruzi que
se mostraram teis nos anos seguintes22 e que, posteriormente, permitiram
estudos sobre a infeco in vivo 23-26.
Em 1999, em um estudo sobre protenas celulares recrutadas ao local
de invaso celular por formas amastigotas extracelulares de Trypanosoma
cruzi, verificou-se que alm de F-actina (facilmente visualizada pela mar-
cao com faloidina fluorescente 27), componentes do citoesqueleto e da
240 Biotecnologia Aplicada Sade

matriz extracelular colocalizavam-se nas expanses de membrana formadas

ao redor dos parasitas 20,28,29 (Figura 8.9). Para confirmar que as protenas
colocalizadas com F-actina ao redor do parasita so de fato originadas das
clulas, pode-se realizar o corte vertical ou y-section (Figura 8.10).

Figura 8.9 Colocalizao de trs componentes colocalizando em expanses de membrana formadas ao redor de amastigotas de Trypano-
soma cruzi durante a invaso de clulas HeLa (setas). a: DIC; b: cortactina (em vermelho, anticorpo + conjugado Alexa568); c: PKD-GFP,
em verde; d: em azul, F-actina (faloidina-Alexa647); e: em ciano, DAPI; f: sobreposio dos 4 canais de fluorescncia. Para preparao
desta montagem, foram selecionados os mesmos planos de uma srie z e somente estes so mostrados. Barra de aumento= 5 micrmetros.

Uma das aplicaes em que a microscopia confocal se mostrou bastante van-

tajosa foi a anlise da distribuio de eptopos definidos por anticorpos mono-
clonais anti-T. cruzi 22. Como vrios destes anticorpos reconhecem eptopos de
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 241

Figura 8.10 Cortes verticais (y sections) confirmam a colocalizao de F-actina (marcada com faloidina-rodamina, em vermelho) com gel-
solina (protena ligadora de actina, em verde) nas expanses de membrana ao redor de formas amastigotas extracelulares de Trypanosoma
cruzi invadindo clulas HeLa [20], em tons amarelo-alaranjados e DNA (em azul, marcao com DAPI de ncleos e cinetoplastos das
clulas e parasitas). a: imagem x, y; b, c: cortes pticos verticais (y sections) atravs de expanses de membrana formadas ao redor de
formas amastigotas, na orientao da seta em a; b e c: dois exemplos de y sections, com clara colocalizao de F-actina (marcada com
faloidina-rodamina, em vermelho) e gelsolina (protena ligadora de actina, em verde) assinalada com cabeas de setas, e DNA (em azul,
marcao com DAPI de ncleos e cinetoplastos dos parasitas, envoltos pela expanso). Barras de aumento em micrmetros.

carboidrato, que so particularmente resistentes incluso em parafina, pode-

-se examinar material de bancos de patologia at a dcada de 1970. Utilizando
cortes de parafina originados de tecidos de pacientes chagsicos com as mais
diferentes formas da doena, foi possvel se detectar e observar o parasita em
material de bipsias daquela poca, em doentes chagsicos transplantados e at
em portadores de coinfeco com HIV30. Num destes materiais, uma bipsia de
crebro de um paciente aidtico e chagsico, foi possvel se observar at formas
tripomastigotas do parasita, detectadas com anticorpo monoclonal especfico22,
sugestivas de intensa reativao da infeco (Figura 8.11)30.
242 Biotecnologia Aplicada Sade

Figura 8.11 Observao de formas tripomastigotas em crebro de paciente Chagsico com reativao por HIV. Cortes de bipsia foram
desparafinados e incubados com DAPI (a) e 3B2 (b) (anticorpo monoclonal especfico contra formas tripomastigotas intracelulares 22)
e (c) a sobreposio de a e b. As setas indicam os parasitas visualizados pelas marcaes com DAPI e pelo anticorpo. A cabea de seta
indica um ninho de parasitas com formas amastigotas que no so reconhecidas pelo anticorpo22. Barras em micrmetros.

Estudos in vivo de coinfeco de T. cruzi e a bactria intracelular Coxiella

burnetii 31,32 tambm avanaram significativamente em nosso laboratrio,
por meio da microscopia confocal33-35. Dentre os vrios trabalhos destaca-
-se aquele em que se demonstrou que formas tripomastigotas metacclicas
de T. cruzi so eficientemente transferidas para o espaoso vacolo de C.
burnetii 35 e, neste ambiente com caractersticas lisossomais (marcadores
membranares como Lamp-1, pH cido, hidrolases ativas 33,35-37), o parasita
diferencia-se em formas amastigotas e capaz de se dividir (Figura 8.12)34.
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 243

Figura 8.12 Diviso de formas amastigotas de Trypanosoma cruzi dentro de vacolo da bactria Coxiella burnetii (*). Sequncia tem-
poral (adquirida em microscpio confocal), de imagens de parasitas (transfectados com histona H2-GFP, em verde): imagem sobreposta
sobre registro de luz transmitida (em cinza). Notar que a partir de 40 minutos j possvel se observar a completa diviso dos ncleos
dos parasitas, que aparecem totalmente separados aos 70 minutos [31]. Barra de aumento em micrmetros.

A possibilidade de se observar amostras vivas por longos perodos de

tempo permite a identificao inequvoca de componentes e suas possveis
interaes. Em um estudo recente em que confirmamos os dados da Figura
8.4B, observamos vacolos espaosos de Leishmania amazonensis alber-
gando concomitantemente formas tripomastigotas de T. cruzi. Pelo fato dos
vacolos de Leishmania serem fusognicos38, a transferncia de formas tri-
pomastigotas de T. cruzi para seu interior pode ser observada15, bem como
sua posterior diferenciao em amastigotas (Figura 8.13).
244 Biotecnologia Aplicada Sade

Figura 8.13 Formas tripomastigotas metacclicas de Trypanosoma cruzi so transferidas para o vacolo de Leishmania amazonensis
onde se diferenciam em amastigotas. No topo, esquerda, a sequncia de imagens em DIC, com o tempo em horas assinalado abaixo;
nestas imagens, possvel observar os amastigotas de Leishmania na caracterstica distribuio perivacuolar; as trs imagens inferiores
mostram os registros de fluorescncia das clulas (transfectadas com GFP) e de T. cruzi (transfectado com Ds-RED) nestes mesmos
tempos. Nota-se que at as 3 primeiras horas, o tripomastigota ainda se encontra sob forma flagelada, e nos dois tempos seguintes,
transforma-se em amastigota (cabeas de seta). A renderizao direita, feita com o programa Imaris (Bitplane www.bitplane.com)
corresponde ao tempo de 7:50h quando perfeitamente visvel o tripomastigota j transformado em amastigota (em vermelho), dentro
do vacolo espaoso de Leishmania.

8.5 CONCLUSES E PERSPECTIVAS

A partir do exposto acima, fica claro que a microscopia confocal uma

ferramenta poderosa em biologia. O princpio de gerao de imagens con-
focais tem sido amplamente aplicado na concepo e construo de instru-
mentos destinados a diferentes procedimentos diagnsticos e teraputicos
em medicina, biologia e cincia dos alimentos39.
Acreditamos que metodologias que aumentem a resoluo espacial (os
chamados instrumentos de super-resoluo, baseados em diferentes princ-
pios) evoluem para se tornarem viveis no estudo de material vivo40 e, certa-
mente, iro contribuir de modo significativo para desvendar novos processos
e fenmenos em biologia, ou at para se revisitar amostras do passado30.
Microscopia Confocal por Varredura a Laser: Fundamentos e Mtodos 245

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AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao constante apoio financeiro da Fundao de Amparo Pes-

quisa do Estado de So Paulo (Fapesp), do Conselho Nacional de Desenvolvi-
mento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) e da Coordenao de Aperfeioamento de
Pessoal de Nvel Superior (Capes). Agradecemos especialmente ao orientador de
doutorado de Renato A. Mortara, Gordon L.E. Koch e a Brad Amos pela enorme
ajuda nos primrdios do confocal no MRC-LMB, em Cambridge. E a todos os
alunos e colaboradores que permitiram que esta histria pudesse ser construda.
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