Aulas passadas

Clulas 1: Procariotos e eucariotos

Clulas, tecidos e orgos
Reinos filogenticos

Compartimentalizao em sistemas biolgicos

- rompimento e fracionamento celular
 QBQ2451- 2013

Clula 2: Marcadores qumicos de organelas

- microscopia
Organelas: estrutura e funo
 Clula animal
Cada organela tem uma funo e produz protenas especficas: marcadores
Histonas/DNA

Monmero de tubulina
MAP4
(citoesqueleto) Enzima Golgi-residente humana
N-acetilgalactosaminiltransferase-2

Calreticulina
KDEL

Hexoquinases
Succinato desidrogenase

(citoesqueleto)

Myristoylation/palmitoylation
Lck tyrosine kinase
Receptores proteicos

Diversas possibilidades de marcao de estruturas celulares para:

1. investigar as suas funes
2. localiz-las (identificao e isolamento)
3. acompanhar eventos celulares (influxo de Ca+2, reconhecimento, determinadas
aes biolgicas, p.ex.)
Tcnicas de visualizao/localizao de estruturas celulares:
microscopia

Tipo de Resoluo Tipo de O que mede Estado da

Microscopia Feixe amostra
tica 0,2 Luz branca Luz absorvida Amostras
(visvel) ou refletida molhadas ou
fixadas

microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescncia, contraste de fase

Geralmente para clulas intactas
Eletrnica 0,05 Feixe de Eltrons Amostras
(transmisso eltrons transmitidos, secas e
ou de secundrios, fixadas
varredura) raios X
visualizar organelas com grande definio e at mesmo estruturas
intraorganelas. Tambm permite obter informaes multidimensionais
Aumento de contraste: melhoria da imagem obtida!
(a) Microscpio ptico composto.(b) microscpios eletrnicos

Tipos: microscopias de campo claro, campo escuro, fluorescncia, invertida, de

transmisso confocal (microscopia de varredura confocal) e de polarizao.
 Microscopia
de campo claro

Microscopia
de contraste de fase

Microscopia
de campo escuro

Largura mdia = 8-10 m

Dihidrocloreto de (4',6-diamidino-2-fenilindole:
se liga a DNA
Corando/visualizando clulas
Marcadores qumicos coloridos ou fluorescentes
substituiram os radioistopos

Marcadores coloridos:
aumento de contraste na microscopia de campo claro

Marcadores fluorescentes fluorescncia permite:

maior sensibilidade
variabilidade de cor
possibilidade de supresso
 Reveladores de organelas: corantes ou fluorescentes
Compostos orgnicos que coram ou fluorescem estruturas nas clulas com
base em suas naturezas qumicas.
Muitos: bsicos: carregados + interao com estruturas carregadas (c.
nucleicos, carboidratos cidos, superfcies celulares)

Exemplos incluem:

1. Rastreador para mitocndria

2. Corantes de cidos nucleicos para ncleo
3. Lisorastreador e lisosensor para compartimentos cidos
4. Corantes lipoflicos para membranas
5. Rastreador para retculo endoplasmtico
6. Conjugados de ceramida para complexo de Golgi

Clulas vivas LBPAE incubadas

simultaneamente com:

MitoTracker Deep Red FM -mitocndrias

LysoTracker Green DND-26 -lisossomas
Hoechst 33342 - ncleolo
Exemplos de corantes:
azul de metileno, cristal violeta, safranina

Bactrias:
Gram + ou -?
Para Complexo de Golgi

N1154 NBD-ceramide
D3521 BODIPY FL ceramide
D7540 BODIPY TR ceramide
Clulas vivas ou fixadas com aldedo
Para Mitocndria

Mais populares:
M7510 MitoTracker Orange CMTMRos
M7512 Mitotracker RED CMXROS 578/599 Add live and fix
M22425 MitoTracker Red 580 580/644
M22426 MitoTracker Deep Red 633 640/662

Clulas vivas e fixveis:

M7514 MitoTracker Green FM

Formas fluorognicas reduzidas; menos retido; melhor para clulas vivas:

M7511 MitoTracker Orange CM-H2TMRos
M7513 MitoTracker Red CM-H2XRos

Mais eficientes:
Rhodamine 123 (R-302), TMRM (T668), TMRE (T-669). Though these
remain popular.
Formatted for High Content Screening/ HCS
H10295 HCS Mitochondrial Health Kit
Para Retculo endoplasmtico

E34251 ER-Tracker Green

E34250 ER-Tracker Red
Boa fixao, mas sem permeabilizao intensa

D273 DiOC6(3)
Usado para clulas vivas e fixadas com glutaraldedo
Limitado para certos tipos de clula
(corante dependente de concentrao)
Muito fototxico

ER-Tracker\u2122 Green
Para Ncleos celulares DAPI =

No so especficos para s um tipo de ncleo. Dependendo das

condies de marcao, o corante tambm pode aparecer no
citoplasma.

Somente alguns entram em clulas vivas devido polarizao da

membrana plasmtica.

H1399 Hoechst 33342

S7578 SYTO 16
S7575 SYTO 13
D1306 DAPI

A1301 Acridine orange

 Para Membrana Plasmtica

CellMask Orange CellMask Deep Red

clulas 293 MSR marcadas por 1 min em

meio completo, lavadas e submetidas
coleta de imagem

~100% de marcao do total de clulas

aps 1-10 min de incubao
Aglutinina de germen de trigo
AlexaFluor 594
 Produo de organelas fluorescentes
pq produzem proteinas recombinantes fluorescentes

1) Experimentos de co-localizao:
localizao de alvo intracelular de
um bioativo
2) Trfico celular
3) Induo ou represso da expresso
gnica

clulas vivas ou mortas

 Anticorpos marcados com fluorescentes (radioativos)
X

Etapas

- Determinar sequncia do antgeno/parte dela

(peptdeo) produzida na clula de interesse
(humana, p.ex.)
- Produzir anticorpo 1. contra o antgeno em
coelho ou cavalo (o anticorpo 1o. no
marcado)
-Produzir anticorpo 2. (contra o 1.) e marc-lo
-Ligar o 1. com antgeno e anticorpo 2.
marcado com AF488 ao complexo (reconhece
o anticorpo 1. de coelho ou cavalo; no liga o
antgeno humano)
-Ligao dele ao anticorpo 1. possibilita
a visualizao da organela associada ao
antgeno Anti-Calreticulina detectada com AF488
secundrio, Mitotracker Red e DAPI
(os ltimos so referncias na microscopia)
Clulas mortas
 Possibilidades para estudar funo ou localizar alvo
de interesse em organelas celulares
1) Introduo de reveladores marcadores = corantes ou fluorescentes que
reagem com protenas especficas ou outros alvos moleculares, p. ex.
cidos nucleicos (mais indicados para localizar tais protenas e alvos)
2) Deteco de protenas especficas (antgenos) marcadores = anticorpos
(mais indicados para entender funo)
3) Uso de microscopias adequadas

Clulas vivas ou fixadas!

Cuidados para uso de clulas vivas (manter a sua integridade):

1) Garantir que o tecido (clulas) foi incubado em condies apropriadas
2) Usar o mnimo de reagente revelador
3) Se possvel, no expor as clulas excitao de luz, principalmente na
presena de reagente revelador
4) Se no, usar a menor excitao de luz possvel
5) Maximizar a sensibilidade de deteco antes de aumentar a excitao de luz.
Referncias bibliogrficas:
1) Invitrogen Corporation, Eugene OR.
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-
Analysis/Cellular-Imaging/Fluorescence-Microscopy-and-Immunofluorescence-
IF/Organelle-Stains-for-Fluorescence-Imaging-Selection-Guide.html

2) http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/segun2.htm

3) Nelson D.L & Cox M.M. Lenhinger Principles of Biochemistry, Fourth Edition ,
2005

4) B. Alberts e col., Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 5th. Edition,
Cap. 9, 2008

5) Microbiologia de Brock, M.T. Madigan, J.M. Martinko, P.V. Dunlap, D.P.Clark, 12.
edio, 2010.