Virologia

Princípios da Virologia  Entrada, desnudamento e liberação

► Estrutura viral: Terminologia ● Helicoidal

● Partícula viral = Estrutura molecular que ● Helicoidal envelopada: Pode ser envolvido
compõe o vírus. por uma membrana viral.
● Partícula viral infecciosa = Virion ● Complexa

● Capa proteica que cobre o genoma =

Capsídeo.

● Capsídeo usualmente simétrico.

● Capsídeo + genoma ou proteínas virais +

genoma = Nucleocapsideo

● Os vírus podem ter um envelope que

sempre terá uma ou mais glicoproteínas de
origem viral.

● Partículas virais que são envelopadas

possuem matriz proteica que é responsável
por dar estrutura a partícula.

► Tipos de genoma – Classificação de

► Envelope:
● O envelope é obtido após o brotamento da
partícula viral através de uma membrana
celular (exceto Poxviruses).
● O fato de adquirir o envelope é uma
característica que dá a possibilidade da
partícula viral de sair da célula sem matá-la
de uma única vez.
Baltimore:
É importante frisar que os vírus possuem
diversos tipos de genoma. E existe
classificação para denominar quais são esses
tipos de genoma. Essa classificação foi feita
por Baltimore.

● O envelope contém pelo menos uma

proteína viral.

► Tipos básicos de estruturais virais:

● Icosahédrica: O núcleo capsídeo possui um

formato geométrico de hexaedro e não
possui membrana plasmática.
Os vírus foram separados em diferentes
● Icosahédrica envelopada: O núcleo grupos de acordo com o seu genoma. E
capsídeo possui um formato geométrico de cada tipo de genoma vai ter um tipo
hexaedro e possui membrana plasmática.
especifico de replicação viral, de acordo
com esse tipo de genoma.
O genoma vai determinar aonde esse vírus vai
se replicar e em que parte da célula esse vírus
vai se replicar, qual a estratégia de
replicação do genoma viral, qual a estratégia
para produção do RNA mensageiro para a
produção das proteínas virais. Uma vez que o
vírus entra na célula, é importante que ele
produza RNA mensageiros virais para a
produção das proteínas virais e assim, o vírus
consiga se replicar.
Os vírus são separados em 7 diferentes grupos,
são eles:
● Grupo I: É o grupo DNA dupla fita, possui
uma fita positiva e uma fita complementar.
● Grupo II: É o grupo formado por um genoma
DNA fita simples, seria somente a fita positiva
do DNA.
Para replicar o seu genoma, é necessário que
faça uma dupla fita ou um intermediário de
dupla fita. É preciso fazer isso para produzir os
RNA mensageiros.
Obs.: Os vírus de genoma DNA
necessariamente replicam dentro do núcleo
da célula. Porque é o núcleo da célula que
possui a maquinaria necessária para
replicação de DNA.
E os outros grupos são formados por vírus RNA
ou DNA com intermediário de RNA.
● Grupo III: É composto por RNA dupla fita.
Não tem a necessidade de formar nenhum
intermediário para formação de RNA
mensageiro.
● Grupo IV: É formado por genomas RNA
positivo, o RNA positivo já é o RNA
mensageiro. Então, o genoma desse vírus já é
capaz de ser reconhecido pelos ribossomos
para a produção de proteínas virais. Assim
que esse vírus entra na célula, é desnonado
(?) no interior da célula.
Para a replicação do genoma viral
(produzirem mais cópias desse RNA
mensageiro) é necessário produzir uma fita
complementar de RNA negativo. E essa fita
de RNA negativo servirá como molde para
produção de mais fitas positivas de RNA que
poderão ser incorporadas na partícula viral.
● Grupo V: É composto pelos RNA fitas
negativas, estes já servem como molde
diretamente para a produção dos RNA
mensageiros.
● Grupo VI: É composto por vírus de genomas
RNA positivo, só que esses vírus são os
retrovírus, fazem uma retrotranscrição desse
DNA. Ou seja, fazem o caminho inverso do
que seria o comum na biologia molecular.
Eles possuem uma DNA-polimerase RNA
dependente que é capaz de produzir uma
fita de DNA a partir do molde de RNA,
carreado pelo vírus.
E essa enzima é chamada de transcriptase
reversa. E essa enzima reconhece o genoma
viral que é um RNA positivo e usa esse RNA
positivo como molde para a produção de
uma fita de DNA. E essa mesma transcriptase
reversa assim que vai fazendo a fita de DNA
já vai clivando a fita de RNA positivo.
Uma vez que tem-se uma fita única de DNA,
esse DNA é reconhecido como molde para
fazer a fita negativa de DNA, para a
formação da dupla fita. Essa dupla fita vai ser
integrada no genoma da célula hospedeira e
assim, serão produzidos os RNA mensageiros
virais.
● Grupo VII: É um DNA mas com um
intermediário de RNA.
Também usa uma transcriptase reversa para
produção dos RNA mensageiros virais.
É importante frisar que cada tipo de genoma
viral vai ter uma estratégia diferente de
replicação.
► Vírus estão vivos?
Os vírus possuem uma fase inerte que é uma
fase extracelular, onde eles não são capazes
de fazer nada porque os vírus não possuem a
maquinaria necessária para se auto-replicar
fora da célula.
Hoje, o que se considera é que esse vírus que 3) Desempacotamento
está na fase extracelular não é uma partícula
4) Síntese de proteínas e ácido nucleico viral
viva.
5) Montagem (maturação)
Mas uma vez que ele entra na célula, aí sim
ele possui toda necessária para corromper 6) Liberação
essa célula e produzir novas partículas virais.

Nessa aula de hoje, iremos abordar os passos

de: adsorção, penetração,
desempacotamento, montagem e liberação.

A imagem abaixo representa os passos do

ciclo replicativo viral:

Não são todas as células que são capazes de

servir como “fábrica” para a produção de
vírus. Existe alguns tipos diferentes e aí,
algumas nomenclaturas que são necessárias
de frisar:

● Célula suscetível a infecção viral, ou seja,

possui um receptor funcional para o vírus -
podendo ou não suportar a replicação viral.
● Célula resistente a infecção viral, ou seja,
não possui um receptor funcional para o vírus
- podendo ou não suportar a replicação viral.
● Célula permissiva, possuem a capacidade
de replicar o vírus - podendo ou não ser
suscetível.
Não necessariamente essa célula permissiva
vai ter o receptor para a adsorção do vírus.
Como o vírus reconhece a célula-alvo? Quais
são as diferentes formas do vírus entrar na
célula para poder entregar e desempacotar
o genoma no interior dessa célula, para que
essa célula replique esse genoma e faça
proteínas virais e seja capaz de produzir um
vírus maduro?
Então, existem diferentes formas para isso
acontecer, podemos observar formas na
imagem:

● Célula suscetível e permissível, ou seja,

possui o receptor funcional para o vírus e é
capaz de replicá-lo. É a situação perfeita
para vírus.

► Ciclo replicativo viral:

O ciclo replicativo viral possui diferentes

passos:

1) Adsorção

2) Penetração
Fusão direta da membrana viral com a
membrana plasmática celular. Isso acontece
através do reconhecimento das espículas
virais a um receptor que fica na membrana
celular. E isso permite o desempacotamento
direto do genoma desse vírus no citoplasma
da célula.
Uma outra forma disso acontecer é liberar o
capsídeo viral no interior da célula e esse
capsídeo vai ser carreado através de
microtúbulos para o seu sítio de replicação,
que no caso da figura, esse vírus replica
dentro do núcleo. Então, ele será carreado
até os poros nucleares e libera o seu material
genético dentro do núcleo.
As outras formas de entrada acontecem
através de endocitose e elas podem ser
clatrina mediadas, caveolina medias ou
clatrina e caveolina independente. Como
isso acontece?
Clatrina ou caveolina dependente: A espicula
viral reconhece a molécula receptora, será
cotado para a região da membrana as
proteínas clatrina ou caveolina e esse vírus
será endocitado e a vesícula endocítica será
completamente coberta pela clatrina ou
pela caveolina. E o que difere os dois casos é
que a vesícula coberta por clatrina será
entregue aos microtúbulos e direcionada
para os endossomos tardios e o sistema de
transporte de endossomos tardios vai levar
essa vesícula endocítica para os lisossomos.
No lisossomo, ocorrerá uma queda de pH
(acidificação) e através dessa acidificação,
ocorrerá o desnudamento da partícula viral.
Já para a caveolina, essas vesículas não
serão direcionadas para os lisossomos e sim
para retículo endoplasmático. Então, essa é a
grande diferença dessas duas estratégias de
entrada.
Clatrina e claveolina independente: Esse vírus
será endocitado e independe dessa vesícula
ser coberta clatrina ou claveolina. Ele pode
encontrar uma maneira de se livrar dessa
membrana para desnudar ou pode ser
direcionado para os endossomos tardios.
► Absorção:
A adsorção é a interação entre a proteína
viral com uma molécula receptora da
membrana plasmática.
Quem são essas moléculas receptoras?
Cada vírus possui um tipo de molécula
receptora, existem vírus de diferentes
espécies que compartilham as mesmas
moléculas receptores.
Existem vírus que interagem com açúcares
que fazem parte de proteínas
transmembranares da membrana
plasmática. Existem vírus que interagem com
proteínas transmembranares multiméricas ou
monoméricas. Então, existem diversos tipos de
proteínas que podem interagir com as
proteínas virais para mediar a adsorção viral.
Só que são proteínas celulares, então,
possuem funções celulares que o vírus se
utiliza e que selecionou evolutivamente para
mediar a adsorção e posterior entrada desse
vírus na célula.
► Penetração – Vírus envelopados:
Vamos comentar dois tipos diferentes de
entrada dos vírus envelopados. E iremos
separar entre vírus envelopados e não
envelopados. Porque isso pode diferir um
pouco dos tipos de entrada.
Para os vírus envelopados, falaremos sobre:
● Fusão da membrana plasmática celular
com a membrana viral.
● Entrada via endossomas.
● Fusão da membrana plasmática celular
com a membrana viral:
Para acontecer essa fusão entre as duas
membranas é necessário sempre um gatilho.
Seja para a fusão direta, seja através do
endossoma. Nessas duas formas é necessário
que haja um gatilho para que aconteça essa
fusão.
Nesse caso da fusão da membrana viral com
a membrana celular o gatilho vai ser a
adsorção (interação entre a espicula viral
com a molécula receptora).
● Para os Paramyxovirus:
Ocorre a interação entre a espícula viral e a
molécula receptora e essa interação leva a
uma mudança conformacional que expõe o
peptídeo de fusão.
Esse peptídeo de fusão é um peptídeo que
fica embebido na membrana plasmática
mas não fica exposto. Fica voltado em
direção a membrana do vírus.
Só que uma vez que acontece a interação
entre a proteína viral e a proteína receptora,
isso leva a uma mudança conformacional na
espícula viral que induz uma alteração
também no peptídeo de fusão. E esse
peptídeo de fusão passa a ficar exposto para
a membrana plasmática e a ancora na
membrana plasmática. Uma vez ancorado
ele vai puxar essa membrana plasmática em
direção a membrana viral e mediar a fusão
entre as duas membranas. Uma vez
fusionado, o vírus pode liberar seu conteúdo
dentro do citoplasma.
● Para o HIV:
O HIV tem a proteína de superfície e a
proteína transmembranar que também possui
peptídeo de fusão (fica virada para a
membrana viral). Só que pro HIV acontecem
duas interações distintas que serão gatilhos
para exposição do peptídeo de fusão:
Interação com a molécula receptora CD4.
Essa primeira interação leva a uma mudança
conformacional na proteína de superfície que
expõem um domínio de interação com uma
molécula co-receptora.
Então, o HIV possui uma molécula receptora
e uma molécula co-receptora.
Uma vez exposto esse domínio de interação
com a molécula co-receptora, a proteína de
superfície interage com ela e isso leva a outra
mudança conformacional. E essa segunda
mudança expõe o peptídeo de fusão e esse
peptídeo de fusão aí sim interage com a
membrana plasmática da célula e faz o
mesmo processo de puxar a membrana da
célula em direção a membrana viral,
ocasionado na fusão das duas membranas.
● Entrada via endossomas, fusão de
membrana após acidificação de endossoma:
Existe a entrada pela via endocítica. A
vesícula endocítica é acidificada e isso leva a
mudanças conformacionais. Vamos ver isso
mais a fundo:
Os endossomas iniciais possuem um pH 6,5 e
possuem proteínas ATPases que são bombas
de hidrogênio na sua membrana. E essas
bombas jogam prótons de hidrogênio para
dentro do endossoma inicial. E isso vai
fazendo ele passe para um pH 5,5 e no
endossoma tardio um pH de 4,5 e no
lisossoma um pH ainda mais baixo.
E o vírus se utiliza dessa via de endocitose que
é uma via comum da célula. As células
endocitam coisas para adquirir nutrientes e
fatores de crescimento. E os vírus sequestram
essa maquinaria para mediar a sua entrada e
o desnudamento da partícula viral e a
entrega do genoma para a citoplasma da
célula.
Temos um exemplo de um vírus que faz isso
que é o influenza:
e do conteúdo viral para dentro do
citoplasma da célula.
Só para deixar claro, o gatilho desse processo
é a acidificação do endossoma.
De forma bem interessante acontece
também, uma vez que esses hidrogênios
entram no endossoma, eles também entram
na partícula viral. A partícula viral possui uma
proteína que é chamada de N2 e esta
permite o íon de hidrogênio entre na partícula
viral. Gerando uma mudança
conformacional dentro da partícula viral. E
isso resulta em um processo onde quando há
a fusão entre as duas membranas, há
também a liberação do genoma do influenza
todo dentro do citoplasma. E outra coisa
interessante, apesar do influenza possuir um
genoma RNA positivo e segmentado (possui 8
segmentos de RNA positivo) ele vai replicar
dentro do núcleo. Então, precisa passar por
um processo de importação para dentro do
núcleo.

► Penetração – Vírus não-envelopados:

Como foi dito, nos vírus envelopados é

O gatilho será a alteração de pH, será a necessária a interação da espicula viral com
diminuição de pH. Então, uma vez que o a molécula receptora. Mas os vírus não
influenza é endocitado e isso acontece de envelopados não possuem espícula viral
uma forma clatrina independente. (existe apenas uma exceção que são os
Quando o influenza está dentro do adenovírus). Então, o próprio capsídeo
endossoma, vai ocorrer essa etapa de medeia a interação com a membrana
acidificação do endossoma. plasmática e isso medeia a entrada do vírus
na célula e o posterior desnudamento.
E como podemos observar na imagem
acima, tem-se a proteína H (espícula viral do
influenza). E tem uma parte da proteína que
é o peptídeo de fusão, ele fica no interior da
proteína. O peptídeo de fusão do influenza
fica protegido pela própria conformação da
H.

E uma vez que o pH vai diminuindo, vai

ocorrendo uma mudança conformacional na
proteína H que expõem o peptídeo de fusão
e uma vez exposto, esse peptídeo vai fazer o
contato com a membrana do endossoma e
fará aquele processo de puxar a membrana
do endossoma em direção a membrana viral,
e aí sim, mediar a fusão das duas membranas
Na imagem anterior temos o exemplo do e transmitir a partícula viral. Então, existem
adenovírus. alguns mecanismos diferentes de liberação.

O adenovírus interage com a molécula

receptor e acontece uma entrada mediada
► Brotamento:
por clatrina (?). Então, o vírus é direcionado
para dentro do endossoma e acontece
também a acidificação do endossoma. E
nesse caso, a acidificação do endossoma vai
mudar toda conformação do capsídeo viral,
vai desestruturar o capsídeo viral. E o
capsídeo viral possui algumas proteínas, em
especial, proteína VI. Uma vez que ocorre a
desestruturação do capsídeo viral, essa
proteína VI é liberada e essa proteína vai fazer
furos na membrana do endossoma
acidificação e esses furos vão liberar o
capsídeo desestruturado no citoplasma da
célula. E essa capsídeo é carreado através de
microtúbulos para a região perinuclear e
nessa região esse capsídeo desestruturado
vai carrear o genoma do adenovírus para
dentro do núcleo. Lembrando que os
O brotamento das partículas virais acontece
adenovírus são vírus que possuem genoma
através da cooptação de uma maquinaria
DNA.
celular. O vírus para mediar o brotamento ele
coopta essa maquinaria que é uma
maquinaria ESCRT (está envolvida com a rede
Então, já abordamos as três primeiras etapas:
de endereçamento endolisossomal). É uma
adsorção, entrada e desnudamento da
maquinaria que medeia o direcionamento
partícula viral. A etapa quatro veremos em
de proteínas que são monoubiquitinadas
outra aula. Vamos ver a etapa 5 e 6 agora.
para degradação através da interiorização
dessas proteínas dentro de endossomas ou
corpos multivesiculares. E uma vez que há
esse direcionamento, esse endossoma ou
esses corpos multivesiculares se fundem com
os lisossomas e essas proteínas que foram
monoubiquitinadas vão poder ser recicladas
através da degradação dessas proteínas.
Então, os vírus cooptam essa maquinaria para
mediar o seu brotamento.

● Ocorre através da cooptação da

Obs.: Existem alguns tipos diferentes de
liberação viral, daremos uma ênfase maior na
estratégia de brotamento. Mas o vírus pode
ser liberado da célula através da lise celular
(estouraria a célula e essa célula estourada
liberaria toda partícula viral que estaria ali
anteriormente presa no citoplasma da
célula). E existem outras formas de
transmissão célula-célula também, a célula
pode fazer uma sinapse com a célula vizinha
maquinaria ESCRT (Endosomal Sorting
Complex Required for Transport);
● Pode ocorrer ano lúmen de MVB’s
(Multivesicular bodies), endossomas ou
para o meio extracelular;
● Nesse processo a membrana do sítio de
brotamento é incorporada a partícula
viral.
 E como eles fazem isso?
Os vírus envelopados possuem late domains
(domínios tardios virais), são domínios
conservados entre esses vírus envelopados. E
que são capazes de interagir com proteínas
dessa maquinaria ESCRT.
E como essa maquinaria ESCRT funciona?
● É uma maquinaria conservada de fungos.
● É composta por 4 complexos, esses
complexos são formados por agregados de
proteínas de alto peso molecular.
● O complexo ESCRT-0 é formado pela
proteína STAM e pela proteína HRS. Esse
complexo é responsável por fazer a primeira
interação com a proteína que foi
monoubiquitinada. Esse complexo sempre
funciona com um complexo passando essa
proteína para o outro. Então, o ESCRT-0 passa
para o ESCRT-I que vai passar para o ESCRT-II
e que vai passar para o ESCRT-III. E o ESCRT-III
é a etapa final que leva essa proteína para
dentro dos MVB’s.
A imagem abaixo seria o que acontece no
contexto celular:
A proteína que foi monoubiquitinada é
reconhecida pelo complexo ESCRT-0
(formado pela STAM e HRS). Esse complexo
entrega essa proteína monoubiquitinada
para o complexo ESCRT-I e é importante frisar
que esse complexo possui a proteína
Tsg101(proteínas que é cooptada pelos late
domains, é cooptada pelo HIV por exemplo).
O ESCRT-I entrega essa proteína para o ESCRT-
II e este entrega para o ESCRT-III. O ESCRT-III é
formado por essas proteínas CHMP. E no final
desse processo, esses complexos são
desagregados por proteínas vacuolares
como as VPS. Uma vez que esse processo está
completo, a VPS4A ou VPS4B desagrega esses
complexos para eles poderem ficar livres e
poderem atuar novamente em outros sítios.
● Modelos de recrutamento:
Existem alguns modelos diferentes de
recrutamento dessa maquinaria ESCRT:
● “Handing-off”: É o modelo onde acontece
uma via direta de entrega de uma
maquinaria para outra da proteína que foi
monoubiquitinada.
● “Cluster”: Não seria mais passando de um
para o outro sucessivamente entre os
complexos. Esse modelo de cluster acontece
através da interação entre adaptadores.
Então, o ESCRT-0 mediaria a interação com o
ESCRT-I ou diretamente com o ESCRT-II através
de adaptadores. E esses adaptadores que
fazem a interação diretamente com o ESCRT-
III.
Abaixo temos um modelo de como acontece
para o HIV:
Na etapa de número 1, tem-se a biossíntese
(veremos em outra aula).
As proteínas virais que foram produzidas
durante a biossíntese viral vão carrear o RNA
viral para a região de brotamento. Então, elas
já possuem um TAG, no caso HIV, possui duas
poliproteínas que vão mediar esse
brotamento que é a Gag e o Gag-pol. Essas
proteínas vão interagir com RNA mensageiro,
vão para a região de brotamento para a
face interna da membrana plasmática.
Possuem um TAG para direcionamento para
a membrana plasmática.
E uma vez que essas proteínas começam a se
aglomerar na face interna da membrana
plasmática, essas proteínas vão começar a
interagir e formas multímeros.
Qual a diferença de gag para gag-pol?
Gag é a poliproteína que possui todas as
proteínas estruturais do vírus. Só que gag-pol
é a proteína que possui também as enzimas
virais.
É importante ressaltar que a gag-pol possui a
protease viral porque uma vez que elas
chegam nessa face interna da membrana,
gag-pol passa a ter a oportunidade de
interagir com outra proteína de gag-pol. E
essa interação vai mediar a auto-clivagem
de gag-pol. E essa auto-clivagem vai liberar a
protease viral para fazer a clivagem de todas
as proteínas dessa poliproteína viral. E essa
auto-clivagem vai gerar uma partícula viral
madura.
Uma vez que essas poliproteínas chegam na
face interna da membrana plasmática, elas
vão se multimerizar e vão interagir com a
maquinaria ESCRT.
Uma vez que gag chega na membrana
plasmática, a região p6 de gag possui o
domínio tardio que é responsável por interagir
com tsg101. Essa região p6 também é capaz
de interagir com Alx que é uma molécula
adaptadora.
E o brotamento do HIV acontece através do
modelo cluster. Através de moléculas
adaptadoras. Então, não é necessário a
interação com o ESCRT-II para mediar o
brotamento viral.
Gag possui interação com tsg101 e Alx e essa
interação com essas duas proteínas vai
mediar a interação com ESCRT-III. ESCRT-III é a
proteína que vai mediar o remodelamento de
membrana.
A interação dessas duas proteínas com
ESCRT-III vai mediar o remodelamento da
partícula viral e uma vez que forma esse
“pescoço” de brotamento, isso é um sinal
para a chegada de VPS4 que vai clivar o
ESCRT-III e isso vai mediar o brotamento da
partícula viral.
Uma vez que a partícula viral brota, ela ainda
não está necessariamente madura porque
ainda não ocorreram todos os processos de
atuação da protease viral. Então, somente
quando as proteínas virais forem clivadas e aí
sim chegue na conformação viral da
partícula viral, é que essa partícula viral estará
madura e capaz de infectar uma próxima
célula.
Abaixo temos uma imagem que representa
esse processo de brotamento e maturação
da partícula viral:
A imagem abaixo explica mais
profundamente como acontece esse
processo de maturação viral:
Tem-se o vírus “imaturo”. A proteína gag que
é formada por matriz, capsídeo, SP1, núcleo
capsídeo, SP2 e p6 (região responsável por
interagir com a maquinaria ESCRT). A proteína
gag vai passar por clivagens sucessivas para
formação do capsídeo viral. Então, a primeira
autoclivagem acontece através da clivagem
de gag-pol. E uma vez que gag-pol está
clivado, a protease está livre. Acontece a
clivagem na região SP1, isso vai gerar duas
poliproteínas que serão novamente clivadas,
essa clivagem será entre a matriz e o
capsídeo e entre a região p6 e a SP2,
liberando o núcleo capsídeo viral.
Haverá mais uma etapa de clivagem, onde
serão liberadas as regiões SP1 e SP2.
E por fim, terá disponíveis todas as proteínas
virais estruturais clivadas e será formado o
vírus maduro.
● Outras vias de liberação/transmissão:
É importante frisar que existem outras formas
de liberação viral. Tem como o vírus brotar
para dentro de vesículas e essas vesículas
serem liberadas na membrana plasmática e
assim, esse vírus ser capaz de infectar novas
células.
Existe a possibilidade de formarem sinapses
célula-célula que são capazes de transmitir o
vírus.
O Sars-CoV-2 é capaz de fazer essas sinapses
em células (?) e transmitir de uma célula para
outra.
E através canais de junção entre duas células,
esses vírus podem ser transmitidos.
Ou através de lise.