05/10/2017

Cinética enzimática

O que é?
Estudo da velocidade da reação
enzimática e como ela se altera
Cinética em função de diferentes parâmetros
enzimática
Engenharia Bioquímica - UFSC

Cinética enzimática Cinética enzimática

• Função
– catalisar a produção de compostos de interesse

• O que é “catalisar”?
– baixar Eat
– aumentar a taxa de reação
– catalisador não é consumido

• Catalisadores
– homogêneos x heterogêneos

Cinética enzimática Cinética enzimática

Por que? Atividade enzimática

• Definição de atividade
Cinética é o estudo da velocidade da reação. – Reatividade

Estudo da cinética enzimática é útil para:
- definir concentração da enzima a ser utilizada;
- afinidade pelo substrato;
– Medida pela velocidade da reação (taxa de reação ou da conversão
substrato em produto)
– U = unidade ou UI = unidade internacional
– 1 U = quantidade de enzima que converte 1 mol de substrato/min

- comparação entre enzimas de diferentes fontes;

• Atividade específica
- efeito de inibidores.
– Unidades por mg de proteína total

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Cinética enzimática Cinética enzimática

Como determinar a quantidade de enzima a ser usada na reação
Diferenças entre enzimas e catalisadores
químicos
a) Especificidade: catálise de uma ou um pequeno número de reações

b) Maiores taxas de reação quando comparada com a mesma reação

catalisada por catalisadores não biológicos

c) Condições amenas de reação (T, pH, etc)

d) Moléculas sensíveis e instáveis (condições adequadas de uso)

- a quantidade de enzima deve ser tão baixa quanto possível... [Enzima] <<< [Substrato];
e) Biodegradáveis e atóxicas
- suficiente para que a velocidade da reação possa ser detectada.

H. Bisswanger. Pratical enzymology. Wiley-Blackwell. 2011

Cinética enzimática Cinética enzimática

Cinética enzimática
Representação gráfica:
Velocidade da reação enzimática é obtida pela medida da quantidade de
produto formado por unidade de tempo.

Determinação experimental da velocidade da reação é feita pela análise do

meio reacional em intervalos regulares de tempo.
formação de
produto

consumo de
substrato Até certo ponto da reação, a variação é linear.
Mede-se a velocidade no início da reação , quando a [S] é alta.

Cinética enzimática Cinética enzimática

Concentração de substrato
Como a taxa de reação é afetada pela [E], [S]??
A concentração de substrato afeta a velocidade das reações catalisadas por enzimas.
Medida de taxa inicial em diferentes [S] e [P]
Apenas quando a concentração de substrato é alta (mas não inibitória), esta taxa máxima
pode ser alcançada
A velocidade da reação é proporcional à concentração da enzima

[E] constante

A velocidade de formação de produto (dp/dt) varia com a [E]. Em qualquer

[S], V é função da [E]. Curva que relaciona [S] e V é uma hipérbole

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Modelo catalítico

EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

V0 = Velocidade no tempo inicial quando [S] >> [E]

Vmax = Velocidade máxima da reação
[S] = concentração de substrato
Km = constante de Michaelis

Cinética enzimática Cinética enzimática

Dedução da Equação - Formação do complexo enzima-substrato

1. Com relação a velocidade de formação e quebra do complexo ES - Poder catalítico da

• E+S ES : etapa de formação do complexo é reversível e relativamente rápida enzima
• ES E E + P : etapa de quebra do complexo ES é lenta ; etapa que determina a velocidade Cinética enzimática - Afinidade da enzima
da reação
2. Com relação a concentração de E, ES e P com o substrato
• A enzima pode existir em duas formas, livre ou complexada ao substrato. Portanto:
[Etotal] = [Elivre] + [ES]
• Normalmente [S]>>> [Etotal], portanto a quantidade de S ligada à enzima é insignificante:
[Slivre] = [Stotal]
• Considerando a dissociação de [ES] preferencial em P, k2 pode ser ignorado.
• Durante a reação, considera-se estado estacionário, onde a velocidade de formação de ES
deve ser igual a velocidade de quebra de ES.

Cinética enzimática Cinética enzimática

Kcat (s-1) mede o poder catalítico da enzima. Exercício 1.

Um grupo de pesquisadores descobriu uma nova enzima , que catalisa a
Turnover number ou número de renovação reação de hidrólise de celulose cristalina.
Capacidade da enzima de transformar o substrato ligado ao complexo ES em
produto por unidade de tempo No primeiro experimento, com [Et] de 4 nM, eles observaram que a Vmax foi
de 1,6 uM/s. Com base nesse experimento, qual é o Kcat da enzima.
ES → E + P t= 1/Kcat Tempo em que o substrato permanece complexado a enzima

Para calcular Kcat considera-se que toda a E está complexada ao substrato e que V0=Vmax

𝑉𝑚𝑎𝑥
[Et] =[ES] 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝐾3 [𝐸𝑡 ] 𝐾3 = = 𝐾𝑐𝑎𝑡
[𝐸𝑡 ]

Eficiência catalítica = Kcat / Km

Medida do quão rápido 2 moléculas (E+S) podem reagir.

Quanto maior o valor melhor é a eficiência catalítica da enzima.

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CURVA DE MICHAELIS-MENTEN

Analisando a curva:

Quando V0=1/2 Vmax

1 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉 =
2 𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑚 + [𝑆]
𝐾𝑚 + 𝑆 = 2 𝑆 → 𝐾𝑚 = [𝑆]

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]

Quando [S]<< Km 𝑉0 = 𝑉0 =
𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑚
desprezado
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
Quando [S]>> Km 𝑉0 = 𝑉0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝐾𝑚 + [𝑆]
desprezado

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a = coeficiente angular

b = coeficiente linear

Cinética enzimática

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Inibição Enzimática
Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser considerada
 MAS... como inibidor.

 Velocidade da reação enzimática pode ser modificada Implica na destruição ou modificação de um ou mais grupos
Irreversível funcionais da enzima
pela presença de outros compostos  COFATORES.
Inibição
 Reversível 1. Competitiva
2. Não Competitiva
Det. v em função da [S] Ativadores 3. Acompetitiva
na presença de diversas Inativadores
concentrações de inibidores Inibidores
Importância do estudo da inibição enzimática – área farmacêutica
 Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou
 acelerando a velocidade da reação. Esse é o mecanismo da grande maioria de agentes
AQUI: farmacêuticos.
Estudo detalhado da Inibição competitiva
cinética de inibição  Inibição incompetitiva
Inibição não competitiva https://www.youtube.com/watch?v=PILzvT3spCQ
Inibição mista

1. Inibição Competitiva
1. Inibição Competitiva
O inibidor competitivo se combina com a enzima livre de tal forma que impede a ligação do Substituindo em [E]t, multiplicando por k 3, pondo [ES] em evidência e invertendo:
substrato, ou seja, o inibidor compete com o substrato pelo mesmo sítio ativo.
O complexo EI é inativo. Dividir em cima e
em baixo por KI

Neste caso: v

V max
[I]=0
Inibição Competitiva com inibidor

½ Vmax
Variação das
concentrações ou Vmax  [S]
dos complexos v
[S]  Km aparente
com o tempo:
Km Kmaparente [S]

1. Inibição Competitiva 2. Inibição Incompetitiva

O inibidor só se liga no complexo ES, reversivelmente, formando o complexo ESI inativo.

Há um aumento de Km por um
fator α, que permite o cálculo da
constante de inibição KI
Neste caso:

Variação das concentrações

dos complexos com o tempo:

Inibidor combina-se reversivelmente com E

Km altera, vmáx não! [S] alta contorna o problema!!

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2. Inibição Incompetitiva
Substituindo em [E]t, multiplicando por k 3, invertendo e pondo [ES] em evidência:
3. Inibição Não competitiva
O inibidor se liga em sítio diferente do sítio ativo, tanto na enzima livre quanto no complexo ES
(aleatoriamente).
O substrato se liga tanto na enzima livre quanto no complexo EI.
Os complexos ESI e EI são inativos.

Neste caso:
• Inibidor se combina com o
complexo ES
• Km e vmáx diminuem!
• [S] alta não contorna o problema!

3. Inibição Não competitiva 3. Inibição Não competitiva V = Vmax S

αKm +αS
Variação das
concentrações dos
complexos com o
tempo: 1 = αKm 1 + α
v Vmax S Vmax

Substituindo em [E]t, multiplicando por k 3, invertendo e pondo [ES] em evidência:

Inibidores se combinam com o complexo ES ou com enzima livre

[S] alto não resolve!
vmáx cai e Km não altera!

Inibidor apresenta características tanto de inibidor

4. Inibição Mista competitivo quanto incompetitivo
Linearização das curvas com inibição

Equação de Lineweaver-Burk

1. Inibição Competitiva

2. Inibição Incompetitiva

3. Inibição Não competitiva

4. Inibição Mista
Vmax diminui
Km aumenta

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Representação gráfica Michaelis-Menten Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk
v 1/v [I]
v 1/v 3. Reação com Inibidor [I]=0
1. Reação sem inibidor Não Competitivo V max [I]=0
V max
1/Vmax tg = Km/Vmax
½ Vmax com inibidor
tg = Km/Vmax aparente
½ Vmax ½ Vmax
aparente
1/V max 1/V max

-1/Km 1/[S]
-1/Km Km [S]
Km [S] 1/[S]

v 1/v [I]
v 1/v [I]
[I]=0
2. Reação com Inibidor 4. Reação com Inibidor V max [I]=0
Competitivo V max [I]=0 Incompetitivo
[I]=0
com inibidor 1/Vmax
½ V max tg = Km/V max
tg = Km/Vmax com inibidor aparente
½ Vmax ½ Vmax
aparente
1/V max 1/Vmax

Km Km [S] - 1/Km - 1/Km 1/[S]

Km Kmaparente [S] -1/Km -1/Kmaparente 1/[S] aparente aparente

Questão de inibição enzimática -1 Questão de inibição enzimática -2

Uma reação enzimática apresenta valores de Km = 5 x 10-3M e Vmax = 60 mols.litro-1.min-1. Quando A velocidade de uma reação catalisada enzimaticamente foi medida na ausência e na presença de
a reação se processa com [S] = 10-4M, na presença de 5 x 10-4M de um inibidor competitivo, resulta inibidores (A e B) em procedimentos separados. Em cada caso, a concentração de inibidor foi de
numa velocidade de 0,5 mol.litro-1.min-1. Determine o valor de Ki. 8 x 10-3 M. Os seguintes dados foram obtidos:

Vmax  S v  S  [S] v (M/s) vA (M/s) VB (M/s) a) Determine os valores de Km e Vmax da

v
Km aparente  S
 Vmax Km aparente  S 
M S/ inibidor inibidor A Inibidor B enzima. b) determine o tipo de inibição
Substituindo: imposta pelos inibidores A e B, e calcule o
10 4 5,00E-04 1.25E-6 5.8E-7 3.8E-7
0,5  valor de KI em cada caso.
60 Km aparente  10  4 O que significa KI?? 1,00E-03 2,00E-06 1.04E-6 6.3E-7
0,5 Km aparente  0,5  10  4
 60  10  4 0.0025 3.13E-6 2,00E-06 1,00E-06
Concentração mínima de Inibidor que afeta Km
0,5 Km aparente  59 ,5  10 4 0.005 3.85E-6 2.78E-6 1.25E-6
59 ,5  10 4
Quanto menor KI maior sua capacidade de 0.01 4.55E-6 3.57E-6 1.43E-6
Km aparente   11,9  10  3 M
0,5
inibição
Como:
1/[S] 1/v 1/vA 1/vB
 I   Km   I Inversão de [S] e v
Km aparente  Km 1   Ki  S/ inibidor inibidor A Inibidor B
 Ki  Km aparente  Km
2000 8,00E+05 1,72E+06 2,63E+06
Ki 
5  10   5  10  
3 4
25  10 7  Ki  3,6  10 4 M
1000 5,00E+05 9,62E+05 1,59E+06
11,9  10   5  10 
3 3 6,9 10 3 400 3,19E+10 5,00E+05 1,00E+06
200 2,60E+10 3,60E+05 8,00E+05
100 2,20E+10 2,80E+05 6,99E+05

a) Determine os valores de Km e Vmax da

enzima. b) determine o tipo de inibição
imposta pelos inibidores A e B, e calcule o
valor de KI em cada caso.

Inibidor A – competitivo
Inibidor B – não competitivo

Da inclinação, sabe-se que:

a) Determine os valores de Km e Vmax da

enzima. b) determine o tipo de inibição
imposta pelos inibidores A e B, e calcule o
valor de KI em cada caso.

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Cinética enzimática
Eq. para reação de inibição competitiva
Km e Vmax são os mesmos obtidos para a reação sem inibição

Km = 1,5 x 10-3 M
Vmax = 5,1 x 10-6 M s-1
Importante abordagem para o
[I] = 8 x 10-3 M entendimento do mecanismo de ação
de uma enzima
Eq. para reação de inibição não competitiva

pH
Temperatura
Substrato

Cinética enzimática Cinética enzimática

pH
pH ótimo atividade é máxima.
Temperatura
Acima ou abaixo pH ótimo velocidade de reação, diminui.
+
Quando a concentração de H (pH) no meio é drasticamente alterada, a estrutura A medida que a temperatura aumenta, a atividade catalítica também aumenta, até
tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração atingir um determinado valor – Temperatura ótima. A partir desta temperatura que
de ácidos ou bases modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H + ou corresponde ao valor máximo de atividade enzimática, a atividade catalítica começa a
OH- competem com o H nas pontes de H e ligações iônicas presentes na estrutura da diminuir, pois a temperaturas elevadas inicia-se a desnaturação térmica das proteínas.
enzima, resultando na sua desnaturação.

Enzimas T ótima =
35 e 45oC

Variação na atividade relativa de uma enzima com o Variação na atividade relativa de uma enzima com o
tempo e temperatura tempo e temperatura
Cinética de reação de 1º ordem

- dE/dt = k [E]

Tempo de meia vida – decaimento de 50% da

atividade inicial → [E]/[E0] = 0,5

ln([E]/[E0]= - kt1/2
ln 0,5 = - kt1/2

t1/2 = ln 0,5/k

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Imobilização de enzimas Métodos de

Imobilização

Por que
Imobilizar?

Interações física ou química com

a matriz sólida

Imobilização de enzimas
SiO2
Ex.: sílica e vidro poroso

Materiais minerais
Matriz Ideal Ex.: celite, centonite

- Inerte Derivados de celulose

- Estável e robusto Ex.: DEAE-celulose, CM-celulose
Orgânico/ Natural
- Custo baixo
- Regenerável Dextran
- Baixa inibição do produto Polissacarídeos

Polímeros