CLASE 15

TRANSGENESIS

TRANSGÉNESIS es la manipulación de organismos para cambiar sus características genéticas. Estas

manipulaciones se mueven en hartos medios distintos pero principalmente importa en el área de
la salud.

La INGENIERIA GENETICA es un conjunto de tecnicas que permiten alterar el genotipo y el

fenotipo de un organismo.

Estamos hablando
de un gen que se
introduce en un
organismo de
distinta especie, eso es un TRANSGEN.

¿Por qué podemos decir que el organismo no necesariamente poseía este gen con anterioridad?
Puede ser que tal vez lo tenía pero expresándose de manera distinta. Este proceso de introducir
un transgén en un organismo da origen a un ORGANISMO TRANSGENICO

. El transgén se
debe mantener
en forma
ESTABLE, esto
puede ser por inserción en cromosomas o por medio de mantención de plásmidos (los plásmidos
se pueden mantener en algunos eucariontes por ejemplo: levadura).

FORMAS DE INCORPORAR UN GEN

Tenemos un gen "X" (normal) , tenemos dos

maneras de incorporarlo:

Gen pintado de rojo: TRANSGEN

FORMA 1: Reemplazar un gen normal por optro distinto (transgen). Transgen reemplaza a otro
gen (no necesariamente genes que codifican caracteristicas similares)

FORMA 2: Adicionar el transgen al genoma del organismo hospedero.

Los genes que se incorporan pueden o no estar modificados.

 MODIFICANDO GENES

Basta con saber que cuando clonamos un segmento de DNA efectivamente se puede introducir
modificaciones. Las modificaciones mas pequeñas que se pueden hacer, es un cambio de
nucleotido o agregar un nucleotido o eliminar un nucleotido. Las modificaciones mas grandes es
sacar segmentos completos.

Aqui tenemos una copia silvestre de un gen y tenemos una manipulada, que tiene un cambio. Ese
cambio es un nucleotido por otro en una secuencia de un gen, que se refleja en el cambio de un
aminoacido por otro en la secuencia de la proteina.

En ambos casos, si cualquiera de estos dos genes (GEN SILVESTRE O GEN MANIPULADO) se
introduce en una especie distinta a la especie original de este gen, cualquiera de los dos equivale a
un transgen.

TRANSGEN es un gen modificado o silvestre que se incorpora en una especia distinta. El punto
inportante para que sea un transgen es que vengan de ESPECIES DISTINTAS (ejemplo: un gen de
elefante con otro gen de otra especie, independientemente que sea el gen silvestre del elefante o
un gen modificado del elefante).

En ese sentidos vamos a tener una

herramienta que se usa que es la creacion de
plantas transgenicas.

Aqui se esta aprovechando la existencia de

una bacteria que causa infecciones en plantas.
Parte del mecanismo de infeccion de la
bacteria es transpasar una pequeña parte de
material genetico a las celulas de las plantas
que infecta.

La bacteria tiene un plasmido Ti, en ese

plasmido hay algunos genes que
se llaman el T-DNA que se
transpasan desde el plasmido y se
integra en material genetico de las
celulas infectadas.

La expresion de estos genes

inducen la aparicion de tumores
en la celulas infectadas. Se
produce una enfermedad que se
llama AGALLA DE LA CORONA.
 1. Tenemos a la planta infectada
2. La bacteria transpasa su material genetico a las celulas de la planta
3. Se expresa el material genetico SE EXPRESA TUMOR

Eso sucede en forma normal, ¿como se aprovecha eso? se reemplaza ese T-DNA por DNA que
codifique algo que interese.

Cuando se infecta una planta (son

diploides) el DNA del plasmido se
va a transferir a un cromosoma de
la planta.

Eventualemente se puede empezar

a cruzar las plantas modificadas
consigo mismas.

Se va obtener una descendencia:

a) Homocigota para nada de DNA transferido

b) Heterocigoto
c) Homocigoto para DNA transferido. Si llegamos a cruzar este consigo mismo, vamos a
tener una planta que para siempre incorpora el DNA transferido.

**SUTILEZAS Se pueden obtener plantas haploides. La bacteria puede infectar celulas en cultivo. Si
llegamos a tener una planta haploide en cultivo y la infectamos, vamos a obtener una celula que
en su unico cromosoma tiene inserto del DNA transferido y a partir de esa se puede obtener una
planta diploide.

PLANTAS TRANSGENICAS

Aqui se utilizan plantas para producir

proteinas (anticuerpos) que son relevantes
desde el punto de vista clinico.
 CREACION DE ANIMALES TRANSGENICOS

Estamos viendo aca una situación donde

tenemos el embrion de una sola celula
(cigoto). En ese citogo fecundado,
podemos realizar micro inyección con
una solución de DNA, potencialmente
ese DNA que se esta incorporando en el
nucleo, se puede incorporar en alguno de
los cromosomas de este núcleo.

A partir de esto se supone que se podria

desarrollar un animal completo
transgenico RIESGOSO Y DIFICIL DE LOGRAR

Lo que realmente se hace, en vez de tratar de modificar el cigoto, se modifica unas pocas celulas
embrionarias por microinyeccion e incorporamos esas celulas a un embrion temprano de raton (en
estado de blastocisto).

Lo que se esta fabricando es un animal

que el tejido en ultimo termino van a
provenir de dos animales distintos
porque tenemos dos embriones
distintos. Tenemos un embrion
normal y un embrion del cual se
tomaron las celulas para modificarlas.

Una vez que se modfican las celulas,

se juntan para generar un embrion
quimerico.

¿Cual es la idea de este embrion quimerico? Va a tener celulas modificadas y va a tener celulas sin
modificar.

a) Celulas modificadas son de un raton café

b) Celulas sin modificar son de un raton negro

Cuando tenemos el embrion que incorpora celulas de las dos cruzas, vamos a tener lo que se
llama un ORGANISMO QUIMERICO.

El embrion quimerico se implanta en una madre adoptiva y lo que nace de este embrion es un
RATON QUIMERICO. Parte del organismo es cafe (PARTE MANIPULADA) y otra parte es negro
(PARTE SIN MANIPULAR).
¿Que hacemos con este raton quimerico? Se cruza con un raton negro.

La idea es que cuando

tengamos animales cafe, van a
ser heterocigotos para la
manipulacion que se hizo.

Entonces en la segunda
generacion (GENERACION DE
IMPORTANCIA), se van a
obtener ratones y ratonas
heterocigotos para la
caracteristica que se importoro
de forma artificial.

Cuando ya tenemos la descendencia heterocigota de ambos sexos, los cruzamos (se cruzan entre
hermanos) y la descendencia van a ser homocigotos (no presenta gen manipulado), heterocigotos
y homocigotos en el gen manipulado (se ven en la imagen con la cola enroscada).

Se elige una proteina fluorescente verde para ver

a simple vista si el experimento funciono o no.
No es necesario uin analisis genetico especifico al
animal para saber si esta expresando el
transgen.
 TERAPIA GENICA

Situaciones en las cuales vamos a realizar una modificacion genetica con un objetivo terapeutico.

Estos dos ratones son ejemplo de terapia

genica. Es una caso de terapia genica que no
se puede raalizar en personas.

Tenemos un animal enfermo que tiene

problemas en la hormona de crecimiento y el otro raton es el descendiente donde se incorporo el
gen que codifica para la hormona de crecimiento.

¿QUE ES LA TERAPIA GENICA?

La diferencia entre curar y aliviar es que aliviar es aminorar los sintomas y curar es hacer
desaparecer la enfermedad.

La terapia genica puede abarcar varias estrategias y el material genetico transferido al paciente
puede ser de distinta naturaleza.

TIPOS DE TERAPIA GENICA

a) INYECCIÓN SOBRE UN HUEVO FERTILIZADO En ese caso se deberia curar por completo la
condicion que estaria afectando al raton que se genera a partir del huevo fertilizado. NO
SE HACE EN SERES HUMANOS
b) TERAPIA GENICA GERMINAL Se manipulan unas pocas celulas embrionarias y se
incorporan en un embrion para dar origen a un raton quimerico. . NO SE HACE EN SERES
HUMANOS

c) TERAPIA GENICA SOMATICA Se toman unas pocas celulas de un individuo que ya nacio, se
manipulan esas celulas y se reincorporan en el individuo. SE HACE EN SERES HUMANOS

Cuando se manipula las celulas de un paciente,

puede ser:

a) IN VIVO La manipulacion se hace en el

paciente mismo
b) EX VIVO Se toman celulas del paciente, se
trabajan fuera del paciente y despues se le
reincorporan.

PRIMER CASO DE TERAPIA GENICA

Basicamente la niña no tenia sistema inmune, y es considerada como la niña burbuja. Como
no tiene sistema inmune, se puede enfermar de cualquier cosa.

La enzima que falta es la

Adenosina deaminasa.
No fue una solucion
definitiva porque las celulas
las celulas que se
modificaron fueron
globulos blancos maduros.
Los globulos blancos vienen
de la medula osea, tendrian que haber modificado las celulas totipotenciales de la medula
osea de la niña.

¿Como se incorpora el gen terapeutico a las celulas del individuo? ya sea si vamos a realizar
terapia genica ex vivo o terapica in vivo, hay que incorporar el material genetico a las celulas
del individuo. Se puede hacer microinyeccion, se inyecta el material genetico directo a la
celula que se quiere manipular, es bastante eficiente esto pero es celula a celula (entonces
toma mucho tiempo si quiero hacer una gran cantidad de celulas).

METODOS DE INCORPORAR DNA TERAPEUTICO A LAS CELULAS

Métodos para incorporar:

a) Uso de virus
b) Liposomas
c) Endocitosis mediada por receptor

USO DE VECTORES VIRALES (USO DE VIRUS) Los virus sirven para transportar material
genetico a un tipo celular en
particular. Ejemplo: cuando
nos resfriamos, el virus
infecta nuestras celulas y
lleva material genetico viral
adentro de nuestras celulas.
Si uno conoce lo
suficientemente bien a un
virus como para manipularlo
y manejar el material
genetico que esta dentro, se
puede usar el virus como
 vehiculo para llevar el material genetico terapeutico a un tipo celular en particular.

CONSIDERACIONES DEL USO DE VECTORES VIRALES

(son desventajas del uso de vectores)

1. No todos los virus funcionan igual, por eso es necesario un gran conocimiento al virus
utilizado
2. El virus puede ser reconocido por el sistema inmune y puede causar algunos
problemas (mayores o menores)

¿HAY ALGUNA VENTAJA DE USAR UN VIRUS? Se puede usar como ventaja que los virus
normalmente tienen un tipo celular como blanco (reconocen tipos restringidos de celulas como
blanco).

Otra alternativa para incorporar DNA es LIPOSOMAS

Los liposomas son vesiculas de

bicapa lipidica.

¿Como se consigue la vesicula de

bicapa lipidica? Se hace una
emulsion, es decir, se hace una
mezcla de lipidos con agua y
eventualmente los lipidos se van a
juntar formando vesiculas
(encierran dos ambientes acuosos).
Al hacer esta emulsion, en vez de
juntar los lipidos solamente con agua, juntamos los lipidos con una suspension de DNA y vamos a
tener liposomas que en su interior van a tener DNA. Si ese DNA es el DNA terapeutico, ahi
encontramos un vehiculo para el DNA terapeutico.

¿Como va a funcionar esto?

a) Estas vesiculas de bicapa lipidica, se puede fucionar con la membrana de la celula y permitir
que el DNA terapeutico entre a la celula.
b) Se pueden utilizar lipidos que tengan carga (cabeza hidrofilica) y eso puede maximizar la
cantidad de DNA que pueden llevar. Lipidos que estan cargados positivamente en forma
externa pueden acomodar moleculas de DNA por fuera incluso y luego transportar esas
moleculas de DNA.
c) Cuando liposoma interactua con la celula, se fusiona el liposoma con la membrana plasmatica
de la celula y ese DNA potencialmente puede llegar al nucleo. ¿Si no llega al nucleo, se va
mantener de forma estable el DNA? No

CARACTERISTICAS DE LIPOSOMAS

Otro mecanismo de incorporar DNA, es aprovechar un fenomeno biologico, como por ejemplo:
ENDOCITOSIS MEDIADA POR RECEPTORES.

Se aprovecha de la endocitosis mediada por receptores, por ejemplo, la transferrina.

Vamos a tener proteinas que pueden circular en un organismo para las cuales existen receptores
en algunas celulas (ejemplo: celulas epiteliales). Esas proteinas se van a unir a los receptores y a
partir de esas receptores, se va a producir la endositosis , se va a incorporar esa proteinas adentro
de las celulas que tenian los receptores.
 Si nosotros logramos asociar el DNA
terapeutico a alguna proteina que sea
reconocida por receptores para luego ser
indocitadas, eso nos asegura que el DNA
terapeutico termine dentro de una celula
en especifico. ¿Cual es el problema? En
material genetico termina en el
endosoma y es el endosoma se decide si
se degrada, si se recicla o si se envia por
transcitosis hacia alguna otra parte de la
celula. El DNA asociado a la proteina
endocitada tiene que arreglarselas para
llegar al nucleo.

Algunas veces es posible que la terapia genica intente adicionar un gen que este faltando, busque
apagar o disminuir la expresion de un gen que se esta sobre expresando en el individuo.
Esta diapositiva resume las distintas alternativas que existen para eliminar o apagar la expresion
de un gen.

1) La manera mas sencilla de apagar la expresion de un gen es ELIMINAR el gen o MUTAR el

gen. No es factible de hacer in vivo
2) Agregar TFO = OLIGO FORMADOR DE TRIPLE HEBRA (oligonucleotido de secuencia corta
que forma hebra triple), la idea es agregar una secuencia corta que es capaz de meterse
en la zona de doble hebra para formar una triple hebra. La hebra triple no es un buen
sustrato para la DNA polimerasa y se puede bloquear replicacion.
3) Se incorpora interferente para el proceso de transcripcion, se puede agregar un
OLIGONUCLEOTIDO complementario al mRNA. Este oligonucleotido se une por
complementariedad de bases y aquellas regiones que sean de doble hebra, se inhibe la
traduccion y por otra parte, se favorece la degradacion del mRNA (se esta eliminando o se
disminuye la expresion del gen)
4) Se incorpora secuencias que codifican ANTICUERPOS dentro de la celula, entonces
podemos expresar dentro de la celula un anticuerpo que reconozca al producto de este
gen (proteina codificada por ese gen). SE BLOQUEA LA ACCION DE LA PROTEINA
 CASO DE ASHANTI DESILVA

En ella se hizo terapia genica

EXVIVO.

Se le saco sangre, se
recolectaron linfocitos T . Esas
celulas se hicieron proliferar
en cultivo y se infectaron con
un vector viral, ese vector
llevaba el gen para la proteina
faltante. Se seleccionaron las
celulas infectadas (no es 100%
efectivo). Las celulas
correctamente afectadas se
incorporaron en el paciente. Se mejoro su condicion por un tiempo.

Este tipo de terapia genica exvivo se conoce TERAPIA DE AUMENTO GENICO (GAT).

GAT : Se refiere a aumentar la cantidad de un gen que no esta presente.

Aqui se muestran ejemplos en casos donde esto se usa o se ha intentado con exito mayor o
menor.
 CONSIDERACIONES ETICAS

En Humanos solo se hace TERAPIA GENICA SOMATICA.

HITO NEGATIVO DE LA TERAPIA GENICA Caso ocurrido en Estados Unidos. Joven

presentaba una enfermedad hereditaria que afectaba su hígado, tenía una forma muy leve de esta
enfermedad. Se presento como voluntario a un estudio para evaluar terapia génica para la
enfermedad que el presentaba.

Era por medio de TERAPIA GENICA INVIVO. Pusieron el virus modificado al joven y este al
día siguiente o el mismo día, desarrollo una reacción sumamente severa que lo hizo fallecer en un
par de días.