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Fundamento da emissão molecular

 Átomos no estado fun damental absorvem radiação ultravioleta ou

visível;
Emissão Molecular
 Passam ao estado excitado;
Fluorescência
 Quando reto rnam ao estado fundam ental – po dem e mitir radiação q ue é
medida pelo equipamento.

Radiação
UV/visível

+
Prof. Clésio Paim conversão interna,
externa e energia
vibracional
1

Fundamento da emissão molecular Fundamento da emissão molecular

Luminescência molecular
Transições Eletrônicas

Antiligante  * Fotoluminescência Quimiluminescência

Antiligante *
Emissão de radiação
E Não ligante n por espécie formada
em reação química
Ligante  Fluorescência Fosforescência
Ligante 

Fluorescência: as transições eletrônicas NÃO envolvem mudança do spin

eletrônico, tempo de vida curta (10-10 a 10-5 segundos).

Fosforescência: as transições eletrônicas envolvem mudança do spin

eletrônico, tempo de vida – mais longo (10-5 até segundos ).

3 4

Fundamento da emissão molecular Fundamento da emissão molecular

Conversão interna e intersistemas:
Spin Eletrônico processos não radiativos
Estado excitado Estado excitado
singleto tripleto

Estado fundamental
singleto

São paralelos

Direção do spin
Dois elétrons por
orbital molecular

Estado emparelhado
singleto S0 = fundamental; Relaxação vibracional: energia vibracional
Fluorescência Fosforescência S1 = estados singlete; transferida para outras moléculas (colisões)
5 T = estado triplete. - liberação de energia como calor 6

1
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Fundamento da emissão molecular Fundamento da emissão molecular

Relação energia x comprimento de onda

Métodos de fotoluminescência: menor aplicação em análise
quantita tiva que os méto dos de a bsorção (m uitas moléculas abs orvem
radiação UV e visível, mas não apresentam fotoluminescência);
Fenantreno

 Número de métodos que envolve a fluorescência é muito maior

que as aplicações propostas para a fosforescência e
quimiluminescência.

 Métodos que podem ser utilizados como detectores em

cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar;

7 8

Método por fluorescência Método por fluorescência

Características:

 Alta sensibilidade;
Espectros de
 Limite de detecção: 0,001 – 0,01 ng (UV: 0,1 a 1 ng);
excitação e
emissão do Amplo intervalo de resposta linear (soluções diluídas -
quinino A < 0,05);

 Interferências de matriz são relevantes (alta sensib.);

 Poucas substâncias exibem fluorescência (derivação);

Na maioria dos casos a fotoluminescência ocorre em  maiores que os  Detectores para cromatografia a líquido e eletroforese
da excitação. capilar.
9 10

Variáveis que afetam a fluorescência e a fosforescência Variáveis que afetam a fluorescência e a fosforescência

Rendimento Quântico (  f) Efeitos de temperatura e solvente

 É a fraç ão da r adi ação inci dente q ue é reemeti da c omo
fluorescência (fosforescência) em um determinado λ;
  f = n ° de fótons em itido / n ° de fótons abso rvido;
 Quanto mais próximo da unidade, maior é a fluorescência;
 Valores próximos de zero: não fluorescem.
Temper aturas alta e baixa visc osidade do s olvente: aumento das
colisões entre os elétrons e el evaç ão do númer o de transiç ões
externas;
 Presença de átomos pesados na molécula (iodo, bromo);

Tipos de transição eletrônica

 Comprimentos de onda () menores que 250 nm dificilmente resultam em
Mudança de spin
fluorescência   * (baixo , alta energia)
Tempo de v ida do s estad os
excitados são peq ueno s (sem
Fluorescência   * (estado singleto excitado) inversão) e os pr ocess os de Diminuição da fluorescência
desativação são menos prováveis.
Fosforescência n  * (estado tripleto excitado - menos susceptível a Condições que tendem a reduzir o numero de colisões entre as partículas (baixa
desativação) 11 temperatura e alta viscosidade) geralmente levam a um aumentam da fluorescência. 12

2
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Fluorescência e estrutura química Fluorescência e estrutura química

 Geralmente a fluorescência mais intensa é obser vada em  Estruturas aromáticas bifundidas apresentam fluorescência
compostos contendo grupos aromáticos:   *
N

 Estruturas alifáticas e carbonilas alicíclicas podem apresentar N

fluorescência em menor grau que as aromáticas. N H

Quinolina Isoquinolina Indol

 A maioria dos hidrocarbonetos heteroaromáticos não substituídos :

N S O
H N
A substituição do anel causa deslocamento de 
Pirrol Tiofeno Furano Piridina
máximos de absorção e mudanças nos picos de
Compostos heterocíclicos
nitrogenados: transição de energia emissão de fluorescência.
mais baixa envolve transições n-π
Não apresentam fluorescência (fosforescência). 14

Fluorescência e estrutura química Efeito da substituição na fluorescência do benzeno

Inserção de grupos substituintes no

 Substituição de um grupo carboxílico ou carbonílico em anel aromático
anel benzeno

Alteração da eficiência quântica

Composto Comprimento de onda da Intensidade relativa

fluorescência (nm) da fluorescência
benzeno Ácido benzoico Benzeno 270 – 310 10

Intensidade relativa da Intensidade relativa da Tolueno 270 – 320 17

fluorescência = 10 fluorescência = 3 Propilbenzeno 270 – 320 17
Bromobenzeno 290 – 380 5
 Inibição da fluorescência: energia de transição n– π* é menor do Iodobenzeno - 0
que a energia π – π* (rendimento da fluorescência em sistemas n – π* Fenol 285 – 365 18
é geralmente baixo). Nitrobenzeno - 0

15 Moléculas grandes – cruzamento intersistema para o estado tripleto 16

Fluorescência e estrutura química Fluorescência e estrutura química

Efeito de rigidez estrutural

Agentes quelantes
 A fluorescência é favorecida em moléculas estruturalmente rígidas. orgânicos
O
complexados com um
*
Zn íon metálico

N+
fluoreno bifenil

Eficiência quântica 1,0 Eficiência quântica 0,2

Aumentam a fluorescência
 Moléculas com estruturas mais flexíveis podem sofrervibrações de
A 8-hidroxiquinolina apresenta menor fluorescência do que o complexo
baixa frequência com perda de energia. de Zn.
Complexo com Zn: molécula mais rígida – impede a desativação não
radioativa (choques entre as moléculas).
17 18

3
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Fluorescência e estrutura química Efeito da concentração na fluorescência

 Utilização de métodos  A potência de emissão de fluorescência (F) é proporcional a

fluorimétricos para Necessidade de agentes potência radiante do feixe de excitação absorvido pelo sistema.
determinação de reagentes de
espécies inorgânicas complexação Onde:
 f é a eficiência quântica;
F = 2,303  f K’’ A P
K’’ é a constante dependente de
geometria (ângulo)
Íon Reagente Absorção Fluorescência Sensibilidade A é a absorbância
(nm) (nm) ( g/mL) P é a radiação de emissão.
Al3+ Alizarina garnet R 470 500 0,007
F- Alizarina garnet R 470 500 0,001
 A potência da fluorescência de uma solução deve ser linear com
(+Al)
Li+ 8-hidroxiquinolina 370 580 0,2 a concentração de uma amostra;
Sn4+ Flavonol 400 470 0,1  Concentração elevada de analito provoca colisões entre
espécies e formação de complexos, os quais são interferentes em
análises quantitativas.
19 20

Equipamentos Equipamentos

 Similares aos equipamentos de absorção molecular;

 Tipos: fluorímetros ou espectrofluorímetros.  Fluorímetros: quando são empregados apenas filtros;

Seletor de excitação

Amostra  Espectrofluorímetros: empregam dois monocromadores (um para

em 90 o excitação e outro emissão) ou podem ser híbridos (filtro e monocromador);
xx
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx - Permitem a produção de espectro de excitação ou de emissão de
Seletor de emissão
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
de  fluorescência.
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx São utilizados como
Xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx detectores em equipamentos
Xxxxxxxxxxxxxxxxxx xx de CLAE e ELETROFORESE
xxxxxx
CAPILAR

21 22

Equipamentos Equipamentos

ocular

3 – Segundo filtro de corte: elimina

sinais de fluorescência não desejada e
deixa passar emissão de de λ entre
520 e 560 nm
FONTE DE
RADIAÇÃO
2 – Espelho: reflete a luz com λ inferior
a 510 nm e transmite luz de λ superior
a 510 nm
1 – Primeiro filtro de corte:
deixa passar luz azul de λ
entre 450 e 490 nm

Intensidade de emissão é muito menor do que a

- Microscópio de fluorescência
intensidade da radiação de excitação 23 24

4
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Equipamentos Equipamentos

Fontes de radiação
• Lâmpadas de vapor de m ercúrio de baixa pressão com determinados Células de medida (cubetas ou célula de fluxo)
λ (254, 302, 313, 546, 578, 691, 773 nm), equipada c om janela de sílica
fundida. • Cilíndricas ou retangulares;
• Lâmpadas de xenônio de alta pressão (75 - 450W)
(emissão contínua 300 - 13000 nm) • Material utilizado: vidro, sílica e quartzo;

• Diodos emissores de Luz • Pequenos volumes de amostra;

- Emitem radiação em 450 – 475 nm.
- Adequados a alguns fluoróforos (mais específicos) • Alguns equipamentos podem apresentar controle de temperatura.
• Laseres
- Mais caros e menos usados que as lâmpadas
- Importantes em baixas concentrações do analito
Detectores
Sistema óptico
• Filtros (absorção e interferência) • Fotomultiplicadoras;
• Monocromadores
25 • Arranjos de sensores (diodos). 26

Equipamentos Aplicações

Sensibilidade do detector de fluorescência acoplado a CLAE Métodos Quantitativos baseados em fluorescência

-Elevada sensibilidade
 Métodos Diretos: detecção direta do analito ou detecção da reação
-Exemplo: análise de antraceno; de complexação da amostra com agente complexante;

-
 Método indireto: análise da redução da fl uorescência do agente
fluorescente (supressão);
Uma relação sinal/ruído
- Agente fluorescente + amostra =  fluorescência (medida que é
(S/N) igual a 21,5 foi quantificada).
alcançada para uma
injeção de 10,48 fg de
antraceno, com limite de Aplicações de modo geral: fármacos, ânions, proteínas,
detecção de apenas 1,5 fg
(S/N= 3). vitaminas, alcaloides, esteroides, flavonoides, identificação da
origem de petróleo, entre outros.
Exemplo: detector de fluorescência Shimadzu®
27 28

Aplicações na indústria farmacêutica Aplicações na indústria de alimentos

Método quantitativos para determinação de etinilestradiol Determinação de histamina em peixes

Formação da histamina
(Descarboxilases exógenas
produzidas por micro-
organismos

Extração da matriz Processo de extração e purificação (troca-iônica)

da histamina

Reação com agentes de

fluorescência
Dose = 35 μg
Dissolução = 1 dose / 500 ml
[ ] = 0,07 μg/ml ou 70 ng/ml 29
Excitação: 350 nm
Emissão: 444 nm

5
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Equipamentos Quimiluminescência

Fosforímetros Reação química que produz

Alguns espectrofluorímetros realizam medidas
fosforescência:
Procedimento de análise:
Irradia a amos tra (lâmpada de
xenônio) e a pós período de tempo
realiza-se a medida da amostra –
tempo de atraso para diferenciar
a fluorescência da fosforescência.
uma espécie eletronicamente
de excitada que emite luz quando
retorna ao seu estado
fundamental
Bioluminescência (energia Produção de luz está principalmente na
química transformada em reação em que uma enzima denominada
energia luminosa) - bactérias, luciferase oxida o substrato da proteína
luciferina, a qual fica excitada e libera a
fungos, plantas e animais
(vagalumes) energia química na forma de energia
luminosa.
31 32

Quimiluminescência Quimiluminescência

Aplicação – toxicologia forense

Equipamentos Geralmente a quimiluminescência usa
equipamentos simples com um Ativação do
luminol com um
fotomultiplicador (não necessita de fonte oxidante
para excitação da amostra)

Fe+2
máx = 425 nm
3-aminoftalato
O sinal típico é dependente do Luminol
tempo e aumenta rapidamente
para um máximo à medida que a
mistura do reagente para o
analito se completa.
xxxx
Leitura de vestígios de sangue em local de crime.
Análise quantitativa: sinal geralmente integrado por um tempo fixo e
comparado com padrões tratados de forma idêntica 33

Quimiluminescência
Referências
Aplicação na análise ambiental HOLLER, J. F., SKOOG, D. A., CROUCH, S. R. Princípios em Análise
Instrumental. 6. ed., Editora Bookman, Porto Alegre, 2009.

HARRIS, D. Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC

Análise de gases Determinação de Editora, 2001.
poluentes
atmosféricos

Determinação de monóxido de nitrogênio (NO) que reage com ozônio (O3 ).

NO + O3 NO2 * + O2
NO2* NO + hv (λ = 600 a 2800 nm - emissão de luz).

36