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Apresentação:
Reagente A: Imunogene:
1 alíquota 0.5 ml de anticorpo monoclonal purificado (15x). Estirpe Ratcliffe.
Tampão Fosfato pH: 7.2
Inibidor de fluorescência não específico. Isotipo:
15 mMol/l azida de sódio como conservante (< 0;1%). IgG2b
Reagente C: Hospedeiro:
1 ampola de 7,0 ml de tampão de diluição. Rato.
Folheto informativo : Purificação:
1 Folheto informativo fornecido na embalagem ou a partir Purificado em coluna de proteína A recombinante.
de www.biomerieux.com/techlib
Reconstituição:
Diluir o reagente A extemporaneamente a 1/15 no tampão
Especificidade: de diluição (reagente C), a fim de obter uma solução pronta
Determinada por imunofluorescência indirecta em células a usar.
infectadas por estirpes de HSV-1 e HSV-2, este anticorpo
reconhece, com uma reacção cruzada de 100%, as estirpes Armazenagem antes e depois da abertura:
HSV-1 et HSV-2. Por outro lado, não dá qualquer reacção Reagente A:
cruzada com os outros herpesviridae (CMV, VZV, EBV) A uma temperatura de +2/+8ºC (não diluído) até ao prazo de validade
humanos e com os adenovírus testados. O anticorpo é indicado na embalagem ;
específico de uma glicoproteína comum ao HSV-1 / HSV-2. Reagente C:
A fluorescência obtida em células infectadas é nuclear ou A uma temperatura de +2/+8ºC até ao prazo de validade
nuclear-citoplásmica, conforme o tipo de herpes e o estado indicado na embalagem.
da infecção.
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1. Interesse do teste
O diagnóstico das infecções a herpes simplex desempenha diversos papéis no follow-up dos doentes. Um diagnóstico específico das
infecções por HSV pode implicar uma terapêutica rápida dos doentes infectados, com os antivirais adequados. Nas grávidas com
infecção genital activa por HSV, pode ser encarada a hipótese de uma histerectomia abdominal no momento do parto, a fim de limitar os
riscos de transmissão para o recém-nascido.
O método de referência para a identificação do HSV é o isolamento em cultura celular. A cultura celular permite ampliar quantidades de
vírus, mas necessita de 1 a 7 dias de incubação. A confirmação da cultura e os métodos de tipagem são efectuados com o auxílio de
diversas técnicas biológicas, como a formação de halos de lise em cultura de células embrionárias de frango, métodos imunológicos de
tipagem com o auxílio de anticorpos policlonais anti-HSV-1 ou HSV-2, e análise por enzimas de restrição. O principal problema com que
se deparou nos testes imunológicos, designadamente neutralização, imunofluorescência ou imunoperoxidase, é o da reactividade
cruzada dos anticorpos policlonais convencionais. Embora a análise por enzimas de restrição seja um método de tipagem fiável, é
demorado e requer bons conhecimentos técnicos.
Este teste combina a especificidade e a reprodutibilidade dos anticorpos monoclonais com a velocidade e a simplicidade das técnicas de
imunofluorescência directa ou indirecta. A identificação é possível na hora que procede a recepção das amostras. Exige-se uma colheita
simultânea das amostras destinadas ao exame directo e à cultura. Confirmar todos os exames directos negativos ou as amostras com
poucas células por cultura celular. Para a tipagem dos isolados em cultura celular, pode ser utilizado o anticorpo juntamente com os
anticorpo XX-088 (HSV-1 específico) ou anticorpo XX-089 (HSV-2 específico). Estes anticorpos oferecem uma alternativa simples e fiável
à tipagem por enzimas de restrição.
2. Âmbito de utilização
Este reagente constitui uma ajuda para o diagnóstico das infecções por HSV e permite a detecção, por imunofluorescência indirecta, de
uma glicoproteína comum ao HSV-1 e ao HSV-2 em amostras de pele, de líquido broncoalveolar ou de líquido cefaloraquidiano.
É necessária uma colheita simultânea das amostras destinadas ao exame directo e à cultura. Confirmar todos os exames directos
negativos ou amostras contendo um baixo número de células por cultura celular.
3. Princípio do teste
Este reagente destina-se à detecção dos vírus Herpes simplex 1 e 2 (HSV-1 e -2) nas células infectadas, através da técnica da
imunofluorescência indirecta.
O anticorpo primário (anticorpo monoclonal murino) fixa-se no antígeno expresso no núcleo das células infectadas obtidas a partir de
colheitas de pele, de líquido broncoalveolar, de líquido cefaloraquidiano, ou após isolamento em cultura celular.
Este anticorpo é, em si mesmo, evidenciado pela junção de um segundo anticorpo ligado à fluoresceína e dirigido contra as
imunoglobulinas de ratinho.
As células que se ligam a este anticorpo monoclonal, exibem uma fluorescência, quando examinadas por microscopia de fluorescência.
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5. Colheita de amostras
A colheita de amostras é a etapa mais crítica dos exames directos e da cultura de células. O pessoal que efectua este tipo de amostras
deve ser treinado correctamente, por forma a minimizar o risco de amostra inadaptada. Seguidamente é descrito um processo de
colheita; para mais informações, consulte as referências em anexo(4).
Colher em paralelo uma amostra para exame directo e uma amostra para a cultura celular, utilizando um meio de transporte adequado.
Meio de transporte
A. Solução de base :
D Sacarose ................................................. 68,44 g
K2HPO4 ....................................................... 2,084 g
KH2PO4 ....................................................... 1,084 g
Água destilada ............................................ QSP 1 litro
Esterilizar.
Pode ser armazenada durante 3 meses a +2/+8°C.
B. Para 100 ml do meio de transporte:
Solução de base ......................................... 92 ml
Soro fetal de vitela descomplementado ....... 5 ml
Vermelho de fenol ....................................... 2 ml
Vancomicina ............................................... 100 µg/ml final
Estreptomicina ............................................ 50 µg/ml final
Homogeneizar.
Filtrar sobre membrana de 0,22 µm.
Dividir em tubos estéreis:
0,2 ml/tubo para as amostras destinadas ao diagnóstico directo.
2 ml/tubo para as amostras destinadas à cultura.
10 ml/tubo em tubos de centrifugação, de fundo cónico, para os LBA (líquidos
de lavagem broncoalveolar).
Pode ser armazenado durante 6 meses a -18/-22°C.
As lesões externas por HSV começam geralmente por uma ou várias vesículas, cheias de líquido, sobre uma base de erupção cutânea.
Alguns dias mais tarde, estas vesículas abrem-se, formando úlceras artificiais. A partir do momento em que a erupção se atenua, as
partes ulceradas revestem-se de uma crosta que permite a cicatrização. Para obter os melhores resultados possíveis, proceder à colheita
das amostras preferencialmente nas fases mais precoces das lesões vesiculares, em detrimento das fases mais avançadas.
A utilização de cremes, loções, álcool, sprays vaginais, etc..., pode reduzir significativamente o rendimento viral em cultura. Se possível,
os doentes deverão evitar este tipo de tratamentos antes da colheita de amostras.
A. Pele:
A.1. Para expôr a base da lesão:
Vesículas (pele):
Utilizar uma agulha estéril para levantar a parte superior da vesícula. Embora o líquido vesicular não constitua uma
amostra adequada para exame directo, é o ideal para um isolado viral. Se estiver presente líquido vesicular, este deve ser
aspirado com uma seringa munida de uma agulha estéril e injectado no meio de transporte (ver composição mais acima).
Úlceras (pele, membranas mucosas):
Utilizar um escolvilhão estéril para eliminar o pus eventualmente presente, sem danificar a base da lesão.
Crostas:
Utilizar uma agulha estéril para soltar a base da lesão.
A.2. Colheita:
Humedecer um pequeno escovilhão com água estéril e raspar vigorosamente toda a base da lesão.
A raspagem vigorosa da base da lesão é essencial e deve normalmente causar dor momentânea.
Se possível, evitar colher sangue, porque os anticorpos séricos podem bloquear os pontos de fixação do monoclonal para o exame
directo e a replicação viral para a cultura celular.
A maior parte das células infectadas encontram-se na base da lesão. Estas células epiteliais não superficiais são imperativamente
necessárias para o diagnóstico pelo laboratório.
Colheita de amostras para cultura celular:
Raspar a base da lesão com um escovilhão estéril e mergulhar imediatamente em 2 ml de meio de transporte,
rodar o escovilhão no meio e extrair o líquido nele contido, mediante pressão-rotação contra a parede do tubo.
A fim de evitar uma eventual toxicidade do escovilhão, não o deixar no meio de transporte.
Escrever o nome do doente no tubo.
Colheita de amostras para exame directo:
Raspar vigorosamente a base da lesão com um escovilhão estéril. A amostra destinada ao exame directo deve
imperativamente conter células retiradas da base da lesão.
É possível espalhar de imediato as células na lâmina para imunofluorescência a partir do escovilhão de colheita
ou, de preferência, proceder como segue:
Para melhorar a recuperação das células, o escovilhão deve ser agitado em 2 ml de PBS*. A suspensão celular
obtida é centrifugada durante 10 minutos a 220 g.
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6. Conservação / Transporte
A. Lâminas de exame directo:
Conservar e transportar à temperatura ambiente ou a +2/+8°C. Para melhores resultados, revelar as lâminas à sua recepção no
laboratório, por forma a identificar as eventuais amostras inadaptadas e a poder obter uma segunda colheita.
Se a amostra fixada não for revelada nos 3 dias após a respectiva colheita, deverá ser conservada desidratada, a 78/-82°C, ou o seu
tempo de vida dependerá da qualidade da amostra e do seu título viral. Nunca conservar as amostras a temperaturas de -18/-22°C.
B. Meio de transporte para cultura:
A amostra a colocar em cultura deve ser inoculada o mais rapidamente possível. Pode ser conservado a +2/+8°C ou congelado a 78/-
82°C até ser fornecido o resultado da imunofluorescência. Não congelar a 18/-22°C. Evitar as congelações / descongelações repetidas.
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10. Desempenhos
POULETTY P., CHOMEL JJ., THOUVENOT D., CATALAN F., RABILLON V., KADOUCHE J. Detection of Herpes simplex virus in direct
specimens by immunofluorescence assay using a monoclonal antibody. In « Journal of clinical microbiology », May 1987, pp958-959.
Este estudo foi realizado em 682 amostras (escovilhões e líquido broncoalveolar). Permite comparar o método de imunofluorescência
com o método de referência: a cultura celular com o aparecimento do efeito citopático.
Cultura celular + IF
Total
- +
+ 104 24 128
Imunofluorescência directa
- 19 535 554
Total 123 559 682
Sensibilidade (%) = 86,6%
Especificidade (%) = 95,9%
Concordância (%) = 94,1%
Os 19 falsos negativos resultam de uma falta de células no spot para imunofluorescência directa.
Os 24 falsos positivos devem-se ao facto de o vírus não estar viável no momento da respectiva colocação em cultura.
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AZUL de EVANS 1%
2 ml ARGENE® Ref: 33-030
Aplicação:
Contrastante das células em imunofluorescência. Diluir entre 1/100 e 1/500 em PBS.
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13. Referências
1) WHITLEY RJ, et al.
Infections caused by herpes simplex virus in the immunocompromised host: Natural history and atopical acyclovir therapy.
Journal of Infectious Diseases, V150, n°3, pp323-329 (1984).
2) NAHMIAS AJ, KEYSERLING HL, KERRICK GM.
Herpes simplex, in Remington JS, Klein JO (eds). Infectious diseases of the fetus and newborn infant. Second Edition, 636-678, WB
Saunders Co, Philadelphia, (1983).
3) DECLERQ E, et al.
Comparative efficacy of antiherpes drugs against different strains of herpes simplex virus.
Journal of infectious Diseases, V141, N°.5, 563-574, (1980).
4) RAWLS WE.
Herpes Simplex types 1 and 2 and Herpesvirus Simiae, in Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic procedures for Viral Rickettsial
and chlamydial infections, Fifth Edition, 309-373, American Public Health Association, Washington, DC, (1979).
5) PEREIRA L., DONDERO D.V., GALLO D, DEVLIN V., WOODIE J.D.,
Serological analysis of Herpes Simplex Virus Types 1 and 2 with monoclonal antibodies.
Infection and Immunity, 1982, pp 363-367.
6) GOLDSTEIN L.C., COREY L., Mc DOUGALL J.K., TOLENTNO E., NOWINSKI RC
Monoclonal antibodies to Herpes Simplex Viruses : Use in Antigenic Typing and Rapid diagnosis.
Journal of Infectious Diseases, Vol 147, n°5, 1983.
7) LECOMTE J., LAGACÉ-SIMAR J., SLICEWICZ B., FAUVEL M.
Typing of Herpes Simplex Virus isolates with selected monoclonal antibodies.
Develop. Biol. Standard., 1984, Vol. 57, pp275-281.
8) BALACHANDRAN N., FRAME B., CHERNESKY M., KRAISELBURD E., KOURI Y., GARCIA D., LAVERY C., RAWLS W.E.
Identification and typing of Herpes Simplex Viruses with Monoclonal antibodies.
Journal of Clinical Microbiology, 1982, Vol. 16, pp 205-208.
9) CHOMEL JJ., THOUVENOT D., and AYMARD M.
Feuillets de Biologie, 1984, 136, 62.
10) FUNG JC., SHANDLEY J., and TILTON R.C.
Comparison of the detection of Herpes Simplex Virus in direct clinical specimens with Herpes Simplex DNA probe and monoclonal
antibodies.
Journal of Clinical Microbiology, 1985, Vol 22, pp 748-753.
11) MOSELEY RC., COREY L., BENJAMIN D., WINTER C., and REMINGTON M. L.
Comparison of viral isolation, direct immunofluorescence and indirect immunoperoxidase technqiues for detection of genital Herpes
Simplex Virus infection.
Journal of Clininical Microbiology, 1981, Vol.13, pp 913-918.
12) POULETTY Ph., CHOMEL JJ., THOUVENOT D., CATALAN F., RABILLON V., KADOUCHE J.
Detection of Herpes simplex Virus in Direct Specimens by immunofluorescence assay using a monoclonal antibody.
Journal of Clinical Microbiology. 1987, Vol. 25, pp 958-959.
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