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Nitric oxide (NO) is an inorganic and incolor free radical gas containing seven electrons from nitrogen and Nitric oxide
eigth from oxigen and one unpaired electron. Until midlle of 1980 decade, NO was considered as a member
Nitric oxide synthase
of an undesiderable and envirommental poluents family and as a potential carcinogen agents. At the
moment, NO constitutes one of the most important mediators of intra and extra cellular processes. This Free radical
radical is produced from the L-arginine envolving a reaction mediated by constitutive and inducible NO Stress oxidative
synthase. NO presents a dubious role, sometimes it brings benefits, sometimes it is harmful. It is envolved in
the vascular relaxing and it protects the blood vessels. It constitutes an important cytotoxic mediator on
immune activated cells capable of killing pathogenic agents and tumor cells. It also has a role as messager/
modulator in a variety of essential biological processes. However, NO is a potentially toxic agent, whose
toxicity could be particulary denoted in stress oxidative conditions, by the generation of O2 intermediates and
antioxidant system deficiency. Laboratory measurement of NO is complex and the characterization of specific
activators and inhibitors of the NO synthesis constitutes the new challenge for a better comprehension and
treatment of a number of pathologies. NO studies have been one of the main target for pharmaceutical
industries.
Professores da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
de Minas Gerais.
Revisão sobre óxido nítrico Dusse et al.
A primeira linha de pesquisa constava da investiga- trogênio, quando se demonstrou que a quantidade elimi-
ção do papel do endotélio vascular no processo de rela- nada destes compostos excedia a quantidade ingerida. Esta
xamento do vaso sangüíneo. O interesse por esta ques- observação, entretanto, foi ignorada até o final da década
tão teve origem nas conclusões de Furchgott e Zawadzki de 1970. Durante todo este período, acreditou-se que óxi-
(15) de que a ação de alguns vasodilatadores, como a dos de nitrogênio inorgânicos eram produzidos somente
acetilcolina, era inteiramente dependente da presença por bactérias, via reações de nitrificação e denitrificação,
do endotélio intacto e envolvia a liberação de um fator e que, em mamíferos, estes compostos derivavam da die-
essencial para o relaxamento vascular, o qual chamaram ta (61). Bredt e Snyder (59) citaram que a constatação de
de endothelial-derivated relaxing factor (EDRF). Rapoport que o organismo humano era capaz de converter nitrato
344
e Murad (53) propuseram que o mecanismo pelo qual o (NO 3 - ) e nitrito (NO 2 - ) da dieta em nitrosaminas
EDRF causava o relaxamento vascular era mediado pela carcinogênicas, após a reação do NO2- com aminas, foi
guanosina monofosfato cíclica (GMPc). Cerca de sete recebida com grande temor, levando a alterações nos há-
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anos após a descoberta do EDRF, estudos detalhados da bitos alimentares, de onde bacon e outros alimentos cura-
sua ação biológica nos vasos (24, 44, 50) e nas plaquetas dos foram excluídos. Um maior impacto ocorreu quando
(52) demonstraram que este composto era idêntico ao foi demonstrado que camundongos e seres humanos ali-
NO. Curiosamente, dez anos antes, dois grupos de pes- mentados com uma dieta pobre em NO3- excretavam
quisadores, Katsuki et al. (28) e Schultz et al. (57), bus- quantidades substanciais deste composto, comprovando,
cavam um respaldo científico para uma conduta tera- de modo inquestionável, a produção endógena de NO3-
pêutica introduzida, empiricamente, pela medicina nos mamíferos (19). Posteriormente foi demonstrada a pro-
chinesa há mais de cem anos. Tratava-se do uso de nitra- dução de NO3- em camundongos isentos de germes (19),
tos orgânicos e de nitroglicerina como tratamento da e um estudo do balanço metabólico comprovou a
angina pectoris, da insuficiência cardíaca congestiva, da biossíntese de NO3- em homens saudáveis (18).
hipertensão pulmonar e de outras complicações vascula- As observações de que altas concentrações de NO - 3
res. Ambos os grupos concluíram que nitratos orgânicos eram um achado constante em crianças com diarréia agu-
induzem a um aumento dos níveis de GMPc dependente da de etiologias diversas sugeriram, pela primeira vez, uma
da dose e que estes compostos eram, a princípio, inati- associação entre a produção de NO3- e o sistema imuno-
vos, mas sua metabolização resultava na produção de lógico (21). As observações de que animais portadores de
NO. Posteriormente, esses investigadores concluíram que uma deficiência de macrófagos apresentavam baixa ex-
o NO era a molécula efetora comum a todos os nitrovaso- creção de NO3- reforçaram a relação entre o sistema imu-
dilatadores, que resultava na dilatação das artérias ne e NO3- (59). Estes dados, aliados à demonstração da
coronárias, melhorava o suprimento sangüíneo ao cora- produção de NO3- e NO2- por macrófagos de rato in vitro,
ção e, conseqüentemente, aliviava os sintomas. Katsuki em resposta ao lipolissacarídeo de Escherichia coli, estabe-
et al. (28) demonstraram que o mecanismo pelo qual leceram, de forma definitiva, uma associação entre a pre-
estes compostos causavam vasodilatação envolvia a ati- sença de macrófagos, a resposta imune e a síntese de NO3-
Dusse et al. Revisão sobre óxido nítrico
(60). Estudos subseqüentes, desenvolvidos por Hibbs et mais importantes mediadores de processos intra e extrace-
al. (22), esclareceram a origem do NO3-, estabelecendo a lulares. Nas duas últimas décadas, o NO tem sido alvo de
L-arginina como o aminoácido essencial para a sua pro- uma infinidade de estudos e está constantemente surpre-
dução. Esses pesquisadores estudaram os mecanismos endendo a comunidade científica, dada a quantidade de
envolvidos nas reações citotóxicas mediadas por macró- processos biológicos em que está envolvido.
fagos e verificaram que as atividades tumoricida e
bactericida dos macrófagos eram dependentes de
Síntese e inibição
L-arginina e inibidas por um análogo desta, a N G -
monometil-L-arginina (L-NMMA). Desta forma, demons- A síntese do NO resulta da oxidação de um dos dois
traram que o NO3- e o NO2- não eram os responsáveis nitrogênios guanidino da L-arginina, que é convertida em
pela citotoxidade dos macrófagos e sugeriram a existên- L-citrulina. Esta reação é catalisada pela enzima NO-sintase
cia de um precursor destes compostos na cultura. Palmer (NOS) (37, 43). Uma variedade de isoformas de NOS tem
et al. (49) demonstraram que a L-arginina era o precursor sido purificada em diferentes tecidos de mamíferos e mui-
fisiológico do NO nas células endoteliais. Com base nesta tas já tiveram seus genes clonados. Estudos bioquímicos e
informação, vários grupos de investigadores suspeitaram análise seqüencial de aminoácidos revelaram que estas
lada pelos níveis de Ca++ (38, 43). A i-NOS não é expres- neo. Em condições fisiológicas, o relaxamento vascular
sa sob condições normais, é induzida por citocinas e/ou ocorre quando receptores da membrana das células endo-
endotoxinas em uma variedade de células, incluindo-se teliais são ativados por estímulos solúveis (incluindo-se
macrófagos, linfócitos T, células endoteliais, miócitos, acetilcolina, bradicinina, adenosina difosfato, substância
hepatócitos, condriócitos, neutrófilos e plaquetas (43). Esta P, serotonina e outros) ou quando há um aumento do
isoforma requer algumas horas para ser expressa, mas, uma atrito exercido pelas células circulantes sobre a camada
vez sintetizada, libera quantidades maiores de NO que a endotelial (shear-stress), levando à ativação da e-NOS pre-
c-NOS e a produção deste continua indefinidamente até sente nestas células e à conseqüente produção de NO (7).
que a L-arginina ou os co-fatores necessários para sua sín- A e-NOS está estrategicamente ancorada à membrana da
tese sejam depletados ou ocorra a morte celular (13). célula endotelial, o que favorece a presença de grandes
A síntese de NO, esquematizada na Figura 2, envol- quantidades de NO próximo à camada muscular do vaso
ve duas etapas. Na primeira, ocorre a hidroxilação de e às células sangüíneas circulantes. Em resposta a agonistas
um dos nitrogênios guanidinos da L-arginina para gerar como a bradicina, ocorre a fosforilação da e-NOS, deter-
NG-hidroxi-L-arginina (NHA). Esta reação utiliza NADPH minando sua translocação para o citosol. Este mecanismo
e oxigênio (O2) e, provavelmente, envolve o complexo provavelmente tem um papel na regulação da produção
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heme da NOS. Na segunda etapa, ocorre a conversão da de NO in situ e na sua atividade biológica (41). O NO
NHA em NO e citrulina. Flavina adenina dinucleotídeo produzido na célula endotelial difunde-se rapidamente
(FAD), flavina mononucleotídeo (FMN) e a tetraidro- para a célula muscular e para o lúmen vascular. A difusão
biopterina (BH4) são utilizados como co-fatores na rea- rápida e a facilidade com que esta molécula penetra em
ção (38, 39). outras células, graças ao seu pequeno tamanho e à sua
característica lipofílica, são cruciais para o entendimento
Todas as isoformas de NOS podem ser inibidas
das suas atividades biológicas (43). No interior da célula
por análogos da arginina N-substituídos, como a
muscular, o NO interage com o ferro do grupo heme da
N G-monometil-L-arginina (L-NMMA), N-imino-etil-L-
enzima guanilato ciclase, acarretando uma alteração da
346 ornitina (L-NIO), NG-amino-L-arginina (L-NAA), NG-nitro-
conformação desta enzima, tornando-a ativa (GCa). A GCa
L-arginina (L-NA) e o metil éster correspondente, o
catalisa a saída de dois grupamentos fosfato da molécula
NG-nitro-L-arginina-metil-éster (L-Name). Estes análogos
de guanosina trifosfato (GTP), resultando na formação de
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H2 N
+
N H2 H2 N N OH H2 N O NO
GC GCa
NH NH NH
NADPH NADPH + NO
O2 O2
+ + + GTP GMPc
H3 N COO- H3 N COO- H3 N COO-
L-arginina N-hidroxi-L-arginina L-citrulina Óxido nítrico
Figura 3 – Formação de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a partir da
Figura 2 – Reação catalisada pela NO-sintase guanosina trifosfato (GTP), mediada por NO
Dusse et al. Revisão sobre óxido nítrico
cessária é desconhecido. Sabe-se que a produção de GMPc e células endoteliais secretam simultaneamente NO e in-
é interrompida segundos após a remoção do NO da enzima termediários reativos do oxigênio, e a ação citotóxica in-
guanilato ciclase (4). direta do NO consiste, principalmente, na sua reação com
O NO que deixa a célula endotelial em direção à cor- esses intermediários do oxigênio. Uma ação tóxica coo-
rente sangüínea pode penetrar nas plaquetas, especial- perativa de NO e ânion superóxido (O2-) resulta na for-
mente nas que se encontram justapostas à parede do vaso mação de peroxinitrito (ONOO-), um poderoso oxidante
ou nas hemácias. No interior das plaquetas, de modo aná- de proteínas. O ONOO- pode, posteriormente, protonar-
logo ao discutido para a célula muscular, o NO promove se na presença de íon hidrogênio (H+), originando um
um aumento de GMPc e a conseqüente diminuição do radical altamente reativo e tóxico, o hidroxil (HO.), au-
Ca++ livre. Como o Ca++ é essencial para o processo de mentando efetivamente a ação tóxica do NO e do O2-
ativação plaquetária, esse processo estará inibido (65). As (4). A célula produtora de NO e sua vizinhança não estão
plaquetas humanas possuem e-NOS e são também pro- a salvo da toxicidade dessa molécula, podendo ser
dutoras de NO. Tanto o NO oriundo das células endoteliais destruídas. Evidências estão se acumulando no sentido
quanto o produzido endogenamente são importantes no de admitir que o NO contribui para algumas condições
controle da função plaquetária (51, 62). Das et al. (9) su- patológicas como asma (20), artrite reumatóide (55),
la de adesão da célula vascular (VCAM-1), a molécula de luminescência) e por detecção eletroquímica, utilizando
adesão intercelular (ICAM), a proteína quimiotática de sensores intravasculares (2, 29). A determinação indireta pode
monócitos (MCP-1), a selectina e as citocinas. Estas molé- ser feita por dosagem plasmática ou urinária de nitrato e
culas são expressas quando há um aumento do estresse nitrito (produtos da reação do NO com o oxigênio), da GMPc,
oxidativo na célula endotelial. Doadores de NO têm mos- do co-produto (L-citrulina), da detecção de nitrosil
trado potentes inibidores da adesão de monócitos e neu- hemoglobina (NO-hb) nas hemácias circulantes, da quanti-
trófilos à camada endotelial (32). ficação histoquímica da NOS, da determinação da atividade
da NOS, da avaliação de suas ações fisiológicas, como o rela-
Efeito antiproliferativo xamento vascular e a inibição da agregação plaquetária, do
A proliferação das células da camada muscular do vaso uso de inibidores da NOS e da detecção de resíduos de 3-
tem um papel-chave no estreitamento da luz vascular. Um nitrotirosina, formados pela ação do ONOO- sobre os resí-
estímulo proliferativo é o fator de crescimento derivado duos tirosina das proteínas. O turn-over de proteínas conten-
das plaquetas (PDGF). Nesse processo, as células da ca- do resíduos 3-nitrotirosina gera resíduos livres de
mada muscular apresentam alterações importantes da sua 3-nitrotirosina (2, 12, 29).
função, com perda da atividade contrátil. As células mus-
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O campo está aberto para investigação do papel bidores específicos da síntese de NO constitui o novo
do NO em circunstâncias diversas, e o número de pu- desafio para o entendimento e o tratamento de várias
blicações relacionadas a esta molécula tem aumentado doenças, e tem sido um dos principais alvos da indús-
exponencialmente. A determinação de ativadores e ini- tria farmacêutica.
Referências
1. Albrecht, E.W.J.A. et al. Nitric oxide production and nitric oxide 18. Green, L.C. et al. Nitrate biosynthesis in man. Proc. Natl. Acad.
synthase expression in acute human renal allograft rejection. Sci. U.S.A., 78: 7764-8, 1981a.
Transplantation, 70(11): 1610-6, 2000. 19. Green, L.C. et al. Nitrate synthesis in the germfree and
2. Archers, S. Measurement of nitric oxide in biological models. conventional rat. Science, 212: 56-8, 1981.
FASEB J., 7: 349-60, 1993. 20. Hamid, Q. et al. Induction of nitric oxide synthase is asthma.
3. Bagasra, O. et al. Activation of inducible form of Inducible nitric Lancet, 342: 1510-3, 1993.
oxide synthase in the brains of patients with multiple 21. Hegesh, E. & Shiloah, J. Blood nitrates and infantile
sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 12041-5, 1995. methemoglobinemia. Clin. Chim. Acta, 125: 107-42, 1982.
36. Mannick, E.E. et al. Inducible nitric oxide synthase, nitrotyrosine 52. Radomski, M.W. et al. Comparative pharmacology of
and apoptosis in Helicobacter pylori gastritis: effects of endothelium-derivated relaxing factor, nitric oxide and
antibiotics and antioxidants. Cancer Res., 43: 3238-43, 1996. prostacyclin in platelets. Br. J. Pharmacol., 92:181-7, 1987.
37. Marletta, M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. 53. Rapoport, R.M. & Murad, F. Agonist induced endothelium-
J.Biol.Chem., 268(17): 12231-4, 1993. dependent relaxation in rat thoracic aor ta may be
38. Marletta, M.A. Nitric oxide synthase: aspects concerning mediated through cyclic GMP. Circ. Res., 52: 352-7, 1983.
structure and catalysis. Cell, 78: 927-30, 1994. 54. Rees, D.D. et al. Chacterization of three inhibitors of endothelial
39.Marletta, M.A et al. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite nitric oxide synthase in vitro and in vivo. Br. J. Pharmacol.,
and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 101: 746-52, 1990.
27: 8706-11, 1988. 55. Sakurai, H. et al. Nitric oxide production and inducible nitric
40. Miki, N. et al. Activation of cerebral guanylate cyclase by nitric oxide synthase expression in inflammatory arthrides. J. Clin.
oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun., 75: 851-6, 1977. Invest., 96: 2357-63, 1995.
41. Michel,T. et al. Phosphorilation and subcellular translocation of 56. Schmidt, H.H.H.W. & Walter, U. NO at work. Cell, 78: 919-
endothelial nitric oxide synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 25,1994.
90: 6252-6, 1993. 57. Schultz, K.D. et al. Sodium nitroprussiate and other smooth
42. Moilanen, E. & Vappatalo, H. Nitric oxide in inflamation and muscle relaxants increase cyclic GMP levels in rat ductus
immune response. Ann. Med., 27: 359-67, 1995. deferent. Nature, 265: 750-1, 1977.
Rio de Janeiro, v. 39, n. 4, 2003
43. Moncada, S. et al. Nitric oxide: physiology, pathophysiology 58. Scott-Burden, T. & Vanhoutte, P.M. The endothelium as a
and pharmacology. Pharmacol. Reviews, 43(2): 109-42, 1991. regulator of vascular smooth muscle proliferation.
44. Moncada, S. et al. Endothelium-derivated relaxing factor : Circulation, 87(suppl. 5): 51-5, 1993.
identification as nitric oxide and role in the control of vas- 59. Snyder, S.H. & Bredt, D.S. Biological roles of nitric oxide. Scientific
cular tone and platelet function. Biochem. Pharmacol., 37: American, may: 28-35, 1992.
2495-501, 1988. 60. Stuehr, D.J. & Marletta, M.A. Mamallian nitrate biosynthesis:
45. Morris, S.M. & Billiar,T.R. New insights into regulation of inducible mouse macrophages produce nitrite and nitrate in
nitric oxide synthesis. Am. J. Physiol., 266: E829-39, 1994. response to Escherichia coli lipopolysaccharide. Proc. Natl.
46. Nava, E. & Lüscher,T.F. Endothelium-derivated vasoactive factors Acad. Sci. USA, 82: 7738-42, 1985.
in hypertension: nitric oxide and endothelin. J. Hypert., 61. Szabó, C. Alterations in nitric oxide in various forms of
13(suppl. 2): S39-48, 1995. circulatory shock. New Horizons, 3(1): 2-32, 1995.
350 62.Vasta,V. et al. Identification of a specific transport system for L-
47. Nicholson, S. et al. Inducible nitric oxide synthase pulmonary
alveolar macrophages from patients with tuberculosis. J. arginine in human platelets. Bioch. Biophys. Res.Commun.,
Exp. Med., 183: 2293-302, 1996. 206(3): 878-84, 1995.
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial
48. Nishida, K. et al. Molecular cloning and characterization of the 63. Vodovotz, Y. et al. Inducible nitric oxide synthase in tangle-
constitutive bovine aortic endothelial nitric oxide synthase. bearing neurons of patients with Alzheimer’s disease. J. Exp.
J. Clin. Invest., 90: 2092-6, 1992. Med., 33: 1425-33, 1996.
49. Palmer, R.M.J.; Ashton, D.S. & Moncada, S. Vascular endothelial 64. Wennmalm, A. Endothelial nitric oxide and cardiovascular
cells synthetize nitric oxide from L-arginine. Nature, 333: disease. J. Int. Med., 235: 317-27, 1994.
664-6, 1988. 65.Wolin, M.S. Interations of oxidants with vascular signaling
50. Palmer, R.M.J. et al. Nitric oxide release accounts for the systems. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 20:1430-42, 2000.
biological activity of endothelium-derivated relaxing factor. 66. Yoshikawa, K. & Kuriyama, K. Characterization of cerebellar
Nature, 327: 524-6, 1987. guanylate cyclase using N-methyl-N’-nitro-N-
51. Radomski, M.W. et al. An L-arginine: nitric oxide pathway present nitroguanidine. Presence of two types of guanylate cyclase
in human platelets regulates aggregation. Proc. Natl. Acad. in soluble and particulate fractions. Biochim. Biophys. Acta,
Sci. USA, 87: 5193-7, 1990. 157: 87-94, 1988.