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Métodos utilizadas para detecção, isolamento e identificação de

micro-organismos

Técnicas microbiológicas
dependente de
crescimento

MÉTODOS MOLECULARES Enriquecimento; Cultura

Alimento Meios seletivos pura
APLICADOS À MICROBIOLOGIA
DE ALIMENTOS
identificação

Testes Bioquímicos
Métodos imunológicos Métodos moleculares Testes imunológicos
Testes moleculares
TP 328 Princípios de Ciência de Alimentos
Profa. Dirce Yorika Kabuki

MÉTODOS MOLECULARES
MÉTODOS DE GENOTIPAGEM
Métodos de Fenotipagem
Tipagem plasmidial
Sorologia
Análise de restrição do DNA cromossômico (¨restriction endonuclease
Fagotipagem analysis¨ - REA)
MEE (Multilocus enzyme electrophoresis)
Eletroforese em gel de campo pulsante (¨pulsed-field gel eletrophoresis¨
Análise do perfil de ácidos graxos - PFGE)
Cromatografia gasosa
DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (¨randomly amplified
Eletroforese bidimensional polymorphic DNA¨ - RAPD)
Diferenciação de proteínas celulares PCR - polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (PCR-
Espectrometria de massa MALDI-TOF (matrix-assisted laser ¨restriction fragment length polymorphism¨ - PCR-RFLP)
desorption/ionozation –time of fligth)
Ribotipagem
Detecção e identificação de proteínas
Sequenciamento de DNA
Métodos de Genotipagem

MÉTODOS GENÉTICOS DNA- RNA

Estrutura do DNA (Watson; Crick, 1953)
Hélice dupla
2 cadeias polinucleotídica
Nucleotídeos:
Base nitrogenada
bases púricas: A, G
Bases pirimídicas: T, C
Desoxirribose
Grupo fosfato

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GENÉTICA MICROBIANA
Replicação ou Duplicação do DNA

Transcrição: síntese de uma fita complementar de RNA a partir do

DNA; fita de mRNA é sintetizada a partir de um gene específico do
DNA.
DNA TCGA
mRNA AGCU

Tradução: síntese de proteínas; mRNA serve como fonte de

informação para síntese de proteínas.
Códon: grupo de 3 nucleotídeos; a sequencia de códons determina a
sequencia de aminoácidos da proteína

Tradução: síntese de
proteínas; mRNA serve
como fonte de
informação para síntese
de proteínas

Códon: grupo de 3
nucleotídeos; a
sequencia de códons
determina a sequencia
de aminoácidos da
proteína

TÉCNICA DA PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION) GENES DE VIRULÊNCIA DE LISTERIA MONOCYTOGENES
Gene Produto
Método de replicação in vitro de uma prfA fator regulador (PrfA)
sequência de DNA. hlyA listeriolisina O (LLO)
mlp metaloprotease (Mpl)
É uma amplificação enzimática actA proteína ActA (ActA)
Taq DNA polimerase copia a sequência alvo; plcB fosfatidilcolina fosfolipase C (PC-PLC)

Primers (iniciadores, oligonucleotídeos) são necessários inlA internalina A

para promover o ponto de início da adição de bases de inlB InlB
nucleotídeos na ordem correta da sequência alvo. iap proteína p60
Primer: 15-30 bp

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PCR PCR
Detecção de bactéria diretamente do alimento Reagentes (Master Mix) (µl)
Água ultra pura
Extração de DNA do alimento
Tampão PCR
Extração de DNA após enriquecimento da amostra de alimento
MgCl2 (mM)
Kits de extração
dNTPs (A, T, C e G) (mM)
Primers (µM)
Identificação de culturas isoladas
Taq DNA polimerase (U/µL)
Extração do DNA de cultura
Alta temperatura (100°C por 10 min.)
Uso de enzimas (Lisozima e proteinase K) DNA (amostra)
Kits de extração
Purificação
Controle positivo (cultura positiva)

Centrifugação Controle negativo (cultura negativa ou água)

PCR
Etapas da reação
• Desnaturação (94-95°C)
Inicial – 1 a 3 min.
Ciclos - 0,5 a 2 min.

• Pareamento (anelamento) do primer (50-65 °C)

Ciclos - 0,5 a 2 min.

• Extensão (72 °C)

Ciclo – 1kb / min
Final – 5 a 15 min.

https://www.youtube.com/watch?v=DkT6XHWne6E
https://www.youtube.com/watch?v=NYlT3f-MZ5o

ELETROFORESE
PCR
Eletroforese em gel de agarose
Ciclo da amplificação:
• Concentração da agarose depende do tamanho do produto da PCR:
(Termociclador) • 0,5% - 30 a 1 kb
94°C – ciclo inicial • 1,0% - 10 a 0,5 kb
• 1,5% - 3 a 0,2 kb
94°C
• Potência: 90 – 120 V
50 - 65°C 30-40 x
• Corrente: 30mA
72°C
72°C – ciclo final DNA (negativo) – corre para o ânodo (positivo)

Tampão de corrida: TAE (Tris Acetado EDTA)

TBE (Tris Borato EDTA)

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Eletroforese
horizontal
Corante de corrida
(loading dye):
•Azul bromofenol –
migra com fragmento TBE ou TAE
de 300bp
•xileno cianol – 4.000
bp

DNA carga negativa

COLORAÇÃO DO PRODUTO DA PCR

Visualização e fotodocumentação

Corantes
Brometo de etídio (0,5 a 1 µg/ml)
mutagênico

Syber SAFE ™
Menos tóxico que o brometo de
etidio

Transiluminador Câmera fotográfica

(UV – 260 nm)

PCR MULTIPLEX
IDENTIFICAÇÃO DE L. MONOCYTOGENES
PCR que detecta simultaneamente mais de um gene

PCR para fragmento 858 bp do hlyA Vários pares de primer são usados concomitantemente numa
mesma reação
1 2 3 4 5 6 7 + - M bp
Amplificação simultânea de várias regiões do DNA
2.645
Cuidados com a técnica:
1.198
Verificar as interações entre os primers
676
Ajustar as concentrações dos reagentes da reação
Pouca reprodutibilidade, portanto necessário padronização do
método

Foto do gel de eletroforese de hlyA

PCR Multiplex de genes de
hemolisinas de V. parahaemolyticus

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PCR Multiplex para E. coli O157:H7

PCR MULTIPLEX
5P Multiplex PCR para confirmação de E. coli
O157:H7 (FDA-BAM)
PCR simultâneo para os genes:
stx1 (toxina STx1)
stx2 (toxina STx2)
uidA (beta-glicuronidase)
ehxA (enterohemolisina)
eae (intimina)

FDA-BAM

PCR REAL TIME REVERSE TRANSCRIPTION- PCR (RT-PCR)

(PCR EM TEMPO REAL)
RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a
Sistema Bax- automatizado, reduz o problema de contaminação. expressão gênica, uma vez que analisa o RNA
Rápido, fácil. responsável pela síntese de proteínas.
Resultados confiáveis.
Técnica:
Pré-enriquecimento da amostra Reação da transcriptase reversa seguido da PCR
Extração do DNA
Adição do DNA na reação RNA como molde
Amplificação no equipamento
Enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA
complementar (cDNA)
Princípio: corante Syber green se liga entre a dupla fita de DNA;
uma luz emitida gera um sinal fluorescente que é captada e
monitorada (quantidade crescente do DNA amplificado) pelo
sistema.

MÉTODOS DE GENOTIPAGEM
RT-PCR
Tipagem plasmidial
Análise de restrição do DNA cromossômico (¨restriction endonuclease
analysis¨ - REA)
Eletroforese em gel de campo pulsante (¨pulsed-field gel eletrophoresis¨
- PFGE)
DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (¨randomly amplified
polymorphic DNA¨ - RAPD)
PCR - polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (PCR-
¨restriction fragment length polymorphism¨ - PCR-RFLP)
Ribotipagem
Sequenciamento de DNA

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REA ENZIMA DE RESTRIÇÃO: ENZIMA DE RESTRIÇÃO “ABRE” A MOLÉCULA

DE DNA NUM PONTO ESPECIFICO.
Foi um dos primeiros métodos baseado no DNA.
DNA cromossomal é digerido com enzimas de restrição, HindIII e PstI
EcoRI
Eletroforese em gel de agarose separa os fragmentos de DNA pelo
tamanho.
Os fragmentos variam de 1.000 a 20.000 bp
O padrão de bandas dos vários fragmentos de DNA é referido como
perfil do DNA ou ¨fingerprint¨ do DNA.
Universalmente aplicável e sensível porque o genoma inteiro é
avaliado,
Os fragmentos de restrição genômica são normalmente numerosos e Outras endonucleases de restrição:
muito próximos, o que dificulta a comparação
HhaI HhaII PvuI AscI SmaI
Enzima de restrição (endonuclease de restrição) HpaI HpaII PvuII ApaI EcoR

RAPD
O RAPD é um método baseado na PCR.
Difere da PCR convencional em dois aspectos:
i) os primers usados são curtos (9 a 10 nucleotídeos) e as
sequências a serem amplificadas são escolhidas aleatoriamente;
ii) a temperatura de pareamento do primer é menor do que na
PCR convencional.
Método rápido, simples, de fácil execução e não
conhecimento anterior da sequência de DNA.
A reprodutibilidade depende da padronização do método.
Um protocolo bem padronizado deve ser seguido e usado para
obter resultados confiáveis
RAPD
A comparação e a interpretação de perfis com intensidades
diferentes é difícil porque algumas bandas podem representar
reações ineficientes e os fragmentos obtidos a partir de um isolado
podem variar nas diferentes reações de amplificação.
fatores que podem causar uma variação no padrão de perfil:
pureza e composição do primer usado,
equipamento (termociclador)
requer
origem da Taq DNA polimerase
Para L. monocytogenes, o RAPD pode ser reprodutível sob
condições cuidadosamente controladas

PFGE PFGE
PFGE caracteriza a bactéria em subtipos pela geração de perfil de Alguns fatores que afetam a resolução dos fragmentos de DNA
bandas de DNA após digestão do DNA bacteriano por enzimas de durante a separação no campo pulsante são:
restrição. • força do campo elétrico,
• ângulo e forma do campo,
DNA bacteriano é purificado e posteriormente é cortado em fragmentos
usando-se enzimas de restrição. Após a digestão, os fragmentos de • concentração e tipo de agarose,

DNA são separados pelo tamanho, utilizando-se a eletroforese de • tempo de pulso,

campo pulsante para gerar perfis de bandas de DNA. • força iônica
(concentração do tampão)
As enzimas são escolhidas para cortar o DNA e produzir entre 8 a 25
• temperatura
bandas grandes de DNA, variando de 40 a 600 kilobases (kb).

Alto nível de sensibilidade para discriminação de cepas de L.

monocytogenes

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DISCRIMINAÇÃO DE DE SALMONELLA ENTERICA SEROVAR

PFGE CHOLERAESUIS ISOLADOS DE SUÍNOS
As vantagens do método são:
• alta reprodutibilidade e poder discriminatório

• fácil interpretação dos resultados devido à produção de 10 a 15 bandas

facilmente visíveis

As principais desvantagens são:

• tempo necessário para completar o procedimento (2-3 dias),
• custo das enzimas de restrição (caros)

• equipamento de eletroforese
(relativamente caro)

PFGE (XbaI, AvrII e SpeI): D=0,9870 RAPD: D=0,9935

Chiu et al. Improvement of strain discrimination by combination of RAPD qith PFGE for the
analysis of the swine isolates of Salmonella enterica serovar Choleraesuis. World J
Microbiol Biotechnol. V. 27, p. 465-469, 2010

PCR- RFLP SEQUENCIAMENTO DE DNA

Método rápido para tipagem de micro-organismos e os alvos são os genes de
virulência
1995 – sequenciamento do DNA de Haemophilus influenza.
PCR inicial é realizada usando-se primers conhecidos de região particular de
virulência Método enzimático desenvolvido por Sanger e colaboradores é o
As amplificações resultantes são digeridas por enzimas de restrição adequada, a mais simples e amplamente usado na determinação de sequência
qual é escolhida baseada na composição do DNA da região alvo de interesse,
de nucleotídeos em um fragmento de DNA.
usualmente 1 a 2 kb
Um perfil de DNA resulta após separação do produto da PCR digerido por Baseia-se na geração de sequências de oligonucleotídeos de
eletroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio. tamanhos variados pelo uso de um primer, a fita simples de DNA
vantagens do método são: rapidez, simplicidade e reprodutibilidade como molde, uma DNA polimerase, dNTPs e ddNTPs (3’
Desvantagens são: didesoxinucleotídeos trifosfatos).
a necessidade do conhecimento anterior da sequência do DNA na região de interesse
variação substancial do poder discriminatório dependendo da espécie, lócus e enzima de
restrição,
poder discriminatório moderado

SEQUENCIAMENTO DE DNA
ddNTPs são dNTPs que perderam o resíduo hidroxila
• Quando o ddNTP é incorporado na cadeia de uma nova fita de DNA
na posição 3’ da desoxirribose sintetizada, ele não pode formar a ligação fosfodiester com outro dNTP e,
consequentemente, a cadeia de DNA termina.

• Usando-se um ddNTP específico na mistura da reação, a cadeia de DNA é

concluída na posição da base específica, gerando sequência de tamanhos
aleatoriamente variados com um terminal 5’ fixo.

• PCR do gene ou local do DNA a ser sequenciando

• Purificação do produto da PCR
• Adição de primer marcado, taq DNA polimerase, dNTPs e ddNTPs
• Reação
• Eletroforese em gel de poliacrilamida
• Leitura

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SEQUENCIAMENTO DE DNA SEQUENCIAMENTO DE DNA

Leitura da sequência
TATCCACTG

Sequenciamento de DNA MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST)

Método que usa o sequenciamento de múltiplos genes ou
fragmentos de genes, para diferenciar subtipos bacterianos.

Programas Clustal X ou O MLST refere-se ao sequenciamento de múltiplos genes de

Clustal W – manutenção (¨house keeping genes¨), mas também pode ser
alinhamento usado o sequenciamento de múltiplos genes de virulência.

Programa Blast – Amplificação de fragmentos internos de 450-500bp de 7 genes de

Comparar sequências manutenção são amplificados e sequenciados.
do banco de dados Determina o perfil alélico de cada isolado.
Altamente discriminatório.
Troca de sequencias facilmente entre laboratório (internet).

RIBOTIPAGEM RIBOTIPAGEM

A ribotipagem refere-se ao uso de sondas de DNA marcado para
reconhecer os genes ribossomal presente em todas as bactérias
Este método consiste da digestão do DNA bacteriano por uma
endonuclease de restrição (EcoRI)
As enzimas usadas na ribotipagem cortam o DNA em muitos
fragmentos pequenos (300 a 500) de aproximadamente 2 a 20 kb.
Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose,
Transferência dos fragmentos para uma membrana de nylon ou
celulose (blotting)
Detecção dos fragmentos contendo a informação específica do
gene codificador do ácido ribonucléico ribossômico (rRNA) pelo uso
de sondas de DNA marcado (hibridização)
Os perfis de banda de DNA resultantes são baseados somente
naqueles fragmentos de DNA que contêm os genes rRNA.
A enzima de restrição EcoRI normalmente é usada para
ribotipagem. O uso de diferentes enzimas em reações separadas,
proporciona um aumento na discriminação de cepas.
PstI e SphI para S. Enteritidis
PvuII para L. monocytogenes

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RIBOTIPAGEM AUTOMATIZADA RIBOTIPAGEM AUTOMATIZADA

Esta comparação pode resultar na identificação do organismo de
Um sistema totalmente automatizado para ribotipagem, o “RiboPrinter
interesse ao nível de gênero, espécie e cepa
Microbial Characterization System”, desenvolvido pela Qualicon, Inc.,
Requer 8 h para produzir resultados confiáveis e acurados
realiza todas as etapas do processo requerido para caracterizar a
bactéria ao nível de cepa, a partir das células lisadas até a análise da O sistema automatizado possui elevado nível de
imagem. reprodutibilidade e padronização
é rápido, prático e bom para estudos em larga escala, assim
Quando os DNA de cepas bacterianas diferentes são clivados com a
como para indústrias.
EcoRI, separados pelo tamanho e hibridizados com uma sonda de rRNA
marcada, cada cepa produz um padrão único. Poder discriminatório da ribotipagem automatizada, é menor que
da PFGE.
A partir desses dados de padrões de fragmento, o sistema usa uma
série de propriedades para gerar o padrão de RiboPrint, que é A ribotipagem, quando está associada a outra técnica molecular
caracterizado, arquivado e comparado com padrões fornecidos pelo
como a PCR-RFLP (ex. genes hly e actA de L. monocytogenes)
apresenta um aumento no índice de discriminação
banco de dados.

RIBOPRINTER MICROBIAL CHARACTERIZATION SYSTEM

COMENTÁRIOS SOBRE ALGUNS MÉTODOS DE GENOTIPAGEM

Método Tipabilidade Reprodutibilidade Discriminação Interpretação uso

MLST Todos Excelente Muito boa Fácil Fácil
TP-187 Limpeza e sanitização

TP-187 Limpeza e sanitização

PFGE Variável Excelente Excelente Fácil Médio
PCR-RFLP Variável Excelente Boa Fácil Médio

Aplicações RAPD Todos Regular Regular Difícil Fácil

monitoramento da microbiota de REP-PCR Todos Muito boa Muito boa Fácil Fácil
indústrias de alimentos Ribotipagem Todos Excelente Boa Fácil Fácil
• traçar a origem de contaminação *
• desenvolver estratégias e ações
* automatizado
corretivas
monitoramento de doenças

PERFIL DE PFGE DE ISOLADOS DE SURTO DE L.

MONOCYTOGENES

APLICAÇÕES DOS MÉTODOS

Avaliação de surtos.
País: Alemanha
TP-187 Limpeza e sanitização

Diagnóstico da contaminação de indústrias de alimentos.

189 casos (81%
Fonte de contaminação
hospitalizados)
Disseminação Taxa de fatalidade: 14%
Controle da contaminação e aplicação de medidas de Alimento: queijo
erradicação do micro-organismo
Subtipagem molecular: PFGE
Caracterização do potencial patogênico.

Koch et al. Large listeriosis outbreak linked to cheese made from pasteirized milk, Germany,
2006-2007. Foodborne Pathogens and Disease. v.7,n.12, p.1581-1584, 2010.

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RASTREAMENTO DE MICRO-ORGANISMOS NAS MÉTODOS DE AVALIAÇÃO AMBIENTAL

INDÚSTRIAS DE ALIMENTOS
Contaminação de Superfícies:
1. Visita à indústria (conhecimento layout e das características das instalações
e processamento) Técnicas Microbiológicas:
Zaragatoas (suabe)
2. Planejamento dos pontos amostrais e número de amostras, ocasiões de
coleta de amostras Esponja
3. Escolha dos métodos e amostragem de acordo com os locais
Placas de contato (Rodac e Petrifilm)
Técnica de enxágue
4. Coleta das amostras (métodos de avaliação de superfícies)
Métodos químicos
5. Análises das amostras (isolamento e identificação do micro-organismo)
Detecção e dosagem de ATP residual
6. Subtipagem molecular dos isolados Detecção de resíduos proteicos, glicose, NAD
7. Análise dos resultados e determinação dos locais de contaminação (focos de
contaminação)

8. Medidas corretivas e preventivas

RASTREAMENTO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM INDÚSTRIAS

DE QUEIJO FRESCAL
Subtipagem de L. monocytogenes - PCR-RFLP dos genes actA e hlyA)
Nova Iorque - EUA
3 indústrias de queijo frescal tipo Latino: 4 visitas
Amostras:
Análise do polimorfismo alélico dos genes de virulência

246 ambientes (superfícies que contatam alimentos, pisos, drenos, M 1 2 3 4 5 6 7 8 M bp

paredes, outros)
Técnica diferencia 2 tipos 2.645
1.605
111 queijos frescos 1.198
alélicos para actA 676
517
Coleta de amostras ambientais: Técnica da esponja 460
Técnica diferencia 8 396
350

Método isolamento: FDA tipos alélicos para hlyA 222

179
Subtipagem dos isolados de L. monocytogenes: 126

PCR-RFLP para gene hlyA e actA

ribotipagem automatizada Gel de eletroforese do polimorfismo alélico do
hlyA. Colunas de número par: digestão com HhaI;
colunas de número impar: digestão com HpaII. M=
Kabuki, D. Y.; Kuaye, A. Y.; Wiedmann, M.; Boor, K. J. Molecular subtyping and tracking of Listeria marcador pGEM
monocytogenes in latin-style fresh-cheese processing plants. Journal of Dairy Science, v. 87, n. 9, p. 2803-
2812, 2004.

Table 3. L. monocytogenes contamination patterns and subtyping results for three Latin-style soft Table 5a. Positive sites for L. monocytogenes in
cheese processing plants Factory A
TM
Plant Visit Sites (sample code) actA hlyA Lineage Ribotype RiboPrinter pattern Sites 1st visit 2nd visit 3rd visit 4th visit
type type (DUP)
Drain 10 L. monocytogenes - - -
A 1 Drain 10, processing area 2 4 1 I 1044A DUP-1044A
Drain 13 - L. monocytogenes - -
Floor, processing area 2 4 1 I 1044A DUP-1062C
2 Drain, cooler room 4 2 II 1062C Floor 2 L. monocytogenes - - -
DUP-1044A
3 Crate 4 2 II 1062C
Crate NA* - L. monocytogenes -
B 1 Drain, processing area 4 1 I 1042C DUP-1062C
Floor, processing area 4 1 I 1042C * NA = not analysed

Crate 3 1 I 1042A
2 Drain, processing area 4 1 I 1042C Table 5b. Positive sites for L. monocytogenes in
1
Crate 3 1 I 1042A Factory B
4 2 II 1049A Sites 1st visit 2nd visit 3rd visit 4th visit
3 Drain, processing area 4 1 I 1042C Drain 1 L. monocytogenes L. monocytogenes L. monocytogenes -
1 DUP-1042C DUP-1042C DUP-1042C
4 Crate 3 1 I 1042A
Floor 2 L. monocytogenes - - -
4 2 II 1062C DUP-1042C
Milk package 3 1 I 1052 Crate L. monocytogenes L. monocytogenes - L. monocytogenes
1
Two subtypes as determined by allelic analysis of hly and actA were isolated from these samples; subtype characteristics DUP-1042A DUP-1042A DUP-1042A
for both strains are shown. DUP-1049A DUP-1062C
Milk package NA - - L. monocytogenes
DUP-1052

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LOCAIS POSITIVOS PARA L. MONOCYTOGENES

(INDÚSTRIA B)

Caixa vazada dreno

Table 5c. Positive sites for L. monocytogenes in Factory C

Sites 1st visit 2nd visit 3rd visit 4th visit LOCAIS POSITIVOS PARA L. MONOCYTOGENES (INDÚSTRIA C)
Plastic connecting - L. monocytogenes - -
tube DUP-1044A Superfícies que contatam alimentos
Table 2 (polytetrafl.) - - - L. monocytogenes
DUP-1044A
Drain 1 L. monocytogenes L. monocytogenes - -
DUP-1044A DUP-1044A
Drain 2 L. monocytogenes L. monocytogenes - L. monocytogenes
DUP-1044A DUP-1045B DUP-1045B
Drain 3 L. monocytogenes L. monocytogenes - -
DUP-1044A DUP-1044A
Floor 2 L. monocytogenes - - -
DUP-1045B
Floor 3 - L. monocytogenes - -
DUP-1044A
Floor 4 L. monocytogenes L. monocytogenes L. monocytogenes -
DUP-1044A DUP-1044A DUP-1044A
Crate NA* NA L. monocytogenes - Tubo de conexão de plástico Mesa de polietileno
DUP-1039C
* NA = not analysed
All cheese samples – DUP-1044A

RASTREAMENTO DE L. MONOCYTOGENES EM INDÚSTRIAS DE

LOCAIS POSITIVOS PARA L. MONOCYTOGENES (INDÚSTRIA C)
QUEIJO

Ambiente Medidas corretivas sugeridas:

uso de sanitizante a base de amônio quaternário nos drenos

Implantação de BPF, melhorar higineização das instalações e

equipamentos
Trocar a tubulação de plástico por aço inoxidável

Dreno área de processamento Pisos

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Berzins et al. Contamination patterns of Listeria monocytogenes in cold-smoked pork • Pagotto, F.; Corneau, N.; Scherf, C.; Leopold, P.; Clark, C.; Farber, J.M. Molecular
processing. J. Food Prot. v.73, n.11, p.2103-2109, 2010. typing and differentiation of foodborne bacterial pathogens. In: Fratamico, P.M.;
Bhunia, A.K.; Smith, J.L. Foodborne pathogens. Caister Academic Press, 2005, cap.4,
• Doyle , M.P.; Beuchat, L.R. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers. ASM Press. p 51-75.
3th ed. 2007. 1038p.
• Evancho, G. M.; Sveun, W. H.; Moberg, L. J.; Frank, J. F. Microbiological monitoring of
the food processing environment. In: Downes, F. P.; Ito, K. Compendium of Methods for
the Microbiological Examination of Foods. 4rd Ed. APHA, Washington, D.C., Cap 3, p.25-
35, 2001.

• Farber, J. M.; Gendel, S.M.; Tyler, K. D. Boerlin, P.; Landry, W. L.; Fritschel, S.; Barret, T.
J. Molecular typing and differentiation. In: Downes, F. P.; Ito, K. Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods. 4rd Ed. APHA, Washington, D.C., Cap. 11,
p.127-156, 2001.
• Fung, D.Y.C.; Rapid Methods for Detecting Microbial contaminats in Foods: Past present
and future. In Wilson, C. Microbial Food Contamination. CRC Press. 2nd ed. 2008. Cap.7.
• Kabuki, D. Y.; Kuaye, A. Y.; Wiedmann, M.; Boor, K. J. Molecular subtyping and tracking
of Listeria monocytogenes in latin-style fresh-cheese processing plants. Journal of Dairy
Science, v. 87, n. 9, p. 2803-2812, 2004.

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