Biologia Molecular

Biologia Molecular
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Resumos ___________________
Autor: Hugo Rocha

Licenciatura em Biotecnologia
Ano Letivo 2022/2023
Universidade de Aveiro
Biologia Molecular – Resumos
Índice
Estrutura e Função do DNA ....................................................................................................... 5
Introdução................................................................................................................................ 5
Formação de nucleótidos e cadeias ........................................................................................ 5
Nomenclatura de nucleótidos ................................................................................................. 6
Estrutura Secundária do DNA e Regras de Chargaff.......................................................... 6
Conformação em Dupla Hélice .............................................................................................. 7
Estruturas em Dupla-Hélice Alternativas ............................................................................. 8
Estruturas de DNA incomuns ................................................................................................ 9
Desnaturação do DNA .......................................................................................................... 10
Efeitos da salinidade e do conteúdo GC na desnaturação ................................................. 11
Replicação e Ciclo Celular ........................................................................................................ 12
Eucariotas .............................................................................................................................. 12
Passos da Replicação do DNA .............................................................................................. 12
Enzimas e reações na forquilha de replicação .................................................................... 13
Origens de Replicação nos Eucariotas ................................................................................ 14
Formação do Complexo de Pré-Replicação: ................................................................... 15
Ciclo Celular .......................................................................................................................... 16
Regulação nos checkpoints internos ................................................................................ 16
Licenciamento de Replicação ........................................................................................... 16
O Processo de Replicação está dividido em 2 passos .......................................................... 17
Eventos de Licenciamento de Replicação levam à ativação da origem apenas uma vez
por ciclo celular ................................................................................................................. 18
Regulação do sistema de licenciamento de replicação pelas CDKs .............................. 18
Fator de Crescimento Eucariótico – Teórica 4 ....................................................................... 19
A via de transdução de sinal do fator de crescimento eucariótico .................................... 19
Revisão: Resposta Celular ................................................................................................ 19
Checkpoint controlo para entrada na Fase S ..................................................................... 23
O exemplo do checkpoint controlado por p53 ................................................................ 24
Células não danificadas progridem através de G1 ............................................................. 25
Origens de Replicação de DNA – Teórica 5 ............................................................................ 26
Archaea .................................................................................................................................. 26
Modelo de Replicação dos Archaea ................................................................................. 26
Revisão do modelo de replicação para todos os domínios de vida .................................... 27
Replicação do organelo DNA: mitocôndria de mamíferos ................................................ 28
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Rocha. H
Mitocôndria de Mamíferos (mtDNA): ............................................................................. 28

Replicação do genoma mitocondrial humano ................................................................. 29
Separação e Segregação do genoma mitocondrial humano........................................... 29
Replicação em procariotas: metilação das origens de replicação ................................. 29
Replicação de Elementos Extracromossomais .................................................................... 30
Círculos rolantes produzem multímeros de um replicão ............................................... 31
Círculos rolantes são usados para replicar o genoma de fagos ..................................... 32
O plasmídeo F é transferido por Conjugação entre Bactérias ...................................... 32
Plasmídeo F e Conjugação ................................................................................................ 34
O Plasmídeo F é transferido por conjugação entre bactérias ....................................... 35
A Conjugação transfere DNA de cadeia simples ............................................................ 37
Plasmídeos têm um sistema de partição .......................................................................... 38
A incompatibilidade dos plasmídeos (grupo inc) é determinada pelo replicão ........... 40
Transcrição em Procariotas – Teórica 6 ................................................................................. 41
Visão Geral da Transcrição .................................................................................................. 41
Transcrição em procariotas.................................................................................................. 42
Passos da Transcrição:...................................................................................................... 43
Mecanismos de ação da polimerase: ................................................................................ 44
Fases de Reação na Transcrição: ..................................................................................... 44
A RNA polimerase bacteriana consiste em múltiplas subunidades .............................. 45
Mecanismos da Transcrição em Procariotas – Teórica 7 ...................................................... 46
Revisão Teórica 6 – Bases da Transcrição .......................................................................... 46
RNA Polimerase e Sequências Promotoras......................................................................... 47
Transições da Holoenzima no Processo ............................................................................... 49
Promotores e o Fator Sigma – Controlo nas ligações ao DNA .......................................... 52
Eficiência dos Promotores pode ser alterada por Mutações ............................................. 54
RNA Polimerase contacta diretamente com o Promotor de DNA .................................... 55
Terminação da Transcrição de RNA ................................................................................... 56
Anti-Terminação pode ser um Evento de Regulação ......................................................... 59
Competição por Fatores Sigma ............................................................................................ 60
Fatores Sigma podem ser organizados em Cascadas ......................................................... 61
Transcrição em Eucariotas – Teórica 9................................................................................... 62
Introdução.............................................................................................................................. 62
RNA Polimerases dos Eucariotas consistem em várias Subunidades............................... 66
RNA Polimerase I tem um Promotor Bipartido ................................................................. 68
RNA Polimerase III usa Promotores a Jusante e a Montante .......................................... 70
O Start Point para a RNA Polimerase II ............................................................................ 73
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Rocha. H
TBP é um Fator Universal .................................................................................................... 74

O Aparelho Basal forma-se no Promotor ........................................................................... 76
A Iniciação é seguida pela Libertação e Elongação do Promotor. .................................... 77
RNA Splicing e Processamento – Teórica 10 .......................................................................... 78
Introdução.............................................................................................................................. 78
Capping – Adição da 5’-7-metilguanosina .......................................................................... 79
Splicing – as zonas de junção nuclear são sequências pequenas ....................................... 80
Aspetos Gerais da Regulação ............................................................................................... 83
Terminação e Poliadenilação................................................................................................ 84
Processamento e Modificação de RNA (Parte 2) – Teórica 11 .............................................. 86
Trans-Splicing ....................................................................................................................... 86
Edição/Modificação do RNA – RNA editing....................................................................... 86
Maturação do pré-mRNA..................................................................................................... 87
Maturação do pré-tRNA em tRNA...................................................................................... 89
Estabilidade e Fiscalização do mRNA ................................................................................. 91
Tradução – Teóricas 12 e 13 ..................................................................................................... 98
Introdução à Tradução ......................................................................................................... 98
A Tradução ocorre por Iniciação, Elongação e Terminação ........................................... 101
Mecanismos especiais controlam a precisão da Tradução .............................................. 107
Iniciação em Bactérias necessita de subunidades 30S e de Fatores Acessórios ............. 109
A Iniciação envolve Emparelhamento de Bases entre o mRNA e o rRNA .................... 111
Um tRNA iniciador especial dá início à Cadeia Polipeptídica ........................................ 114
O uso de fMet-tRNAf é controlado por IF-2 e pelo Ribossoma....................................... 116
Subunidades Menores varrem as Zonas de Iniciação no mRNA Eucariótico ............... 116
Os Eucariotas usam um complexo de Vários Fatores de Iniciação ................................ 118
Fator de Elongação Tu carrega Aminoacil-tRNA para a Zona A .................................. 119
A Cadeia Polipeptídica é transferida para o Aminoacil-tRNA ....................................... 120
A Translocação move o Ribossoma ................................................................................... 121
Os Fatores de Elongação ligam-se Alternativamente ao Ribossoma .............................. 122
Três codões terminam a Tradução .................................................................................... 123
A Tradução pode ser regulada ........................................................................................... 123
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Rocha. H
Estrutura e Função do DNA
Introdução
A função do DNA não pode ser compreendida sem o conhecimento da sua estrutura. O
Objetivo é, então, descrever a estrutura do DNA, tendo em conta a sua função celular.
Uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA) consiste em duas cadeias ligadas em
dupla hélice por pontes de hidrogénio entre as bases dos nucleótidos, tal como mostrado na
figura.
Nucleótidos: são compostos por uma pentose, um grupo fosfato e bases azotadas que
podem ser citosina (C), Timina (T), Adenina (A), Guanina (G) e Uracilo (U).
• C e T têm apenas um anel e, por isso, chamam-se pirimidinas;

• A e G têm dois anéis, denominando-se purinas.
• T é apenas encontrada no DNA, enquanto U é específica do RNA.
Existem dois tipos de pentoses (ribose e desoxirribose) que diferem uma da outra pela
presença ou ausência de um grupo hidroxilo no carbono C2’ da pentose.
Formação de nucleótidos e cadeias
A formação de ácidos nucleicos pode ser dividida em 3 passos:

1. Formação de nucleosídeos: ligação entre a base azotada e a pentose em C1’
2. Formação do nucleótido: ligação entre o grupo fosfato e a pentose
3. Formação do DNA ou do RNA
Ligações Fosfodiéster:
O grupo fosfato dá a propriedade de ácido ao DNA e ao RNA ao libertar iões H+ na
solução. Isto acontece quando há a ligação de um grupo OH no carbono 3’ de um nucleótido
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Rocha. H
com o grupo OH presente no fosfato do carbono 5’ de outro nucleótido, trata-se de uma reação
de condensação, tal como mostra a imagem.
As Ligações fosfodiéster (entre
o fosfato e a pentose) são estáveis,
mas facilmente quebráveis por hi-
drólise enzimática.
É esta ligação fosfodiéster no
sentido 5’ → 3’ que permite determi-
nar a polaridade da cadeia e que é a
chave para entender processos como
a replicação, a transcrição ou a lei-
tura de sequências de DNA.
Nomenclatura de nucleótidos
Quando estão livres na célula, os nucleótidos tendem a ocorrer como trifosfatos. A forma
trifosfatada serve como um bloco de construção precursor do DNA e do RNA durante a sua sín-
tese e, habitualmente, são usadas abreviaturas para os seus nomes.
As letras A, G, C, T e U indicam as bases azotadas, mas, na prática, são comummente

usadas para representar o nucleótido inteiro que contém estas bases.
Note-se que ATP e GTP, as fontes de energia da célula, são ambos nucleosídeos trifos-
fatados.
Estrutura Secundária do DNA e Regras de Chargaff
As ligações de hidrogénio entre as bases nitrogenadas nas cadeias opostas de DNA são
termodinamicamente estáveis.
Complementaridade de bases ou bases de Watson-Crick:
• Adenina e Timina são ligadas por duas pontes de hidrogénio;
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Rocha. H
• Guanina e Citosina são ligadas por três pontes de hidrogénio.

Isto resulta na estrutura regular e simétrica em dupla hélice do DNA.
Em 1951, Chargaff descobriu que numa molécula de DNA, a relação entre purinas e pi-
rimidinas é constante na maioria das espécies animais, estabelecendo então algumas regras.
1ª Regra: Numa molécula de DNA em dupla hélice, a %A = %T e a %G = %C
2ª Regra: Existe uma razão estequiométrica de 1:1 entre purinas e pirimidinas, ou seja,
A+G = T+C.
Regra de Agrupamento: As purinas (A e G) tendem a agruparem-se em cadeias não-
modelo e as pirimidinas (T e C) agrupam-se em cadeias modelo, quer isto dizer que as se-
quências codificantes, o número de purinas irá exceder o número de pirimidinas.
Regra GC: A proporção de G+C tende a ser maior em exões do que em intrões.
Conformação em Dupla Hélice
As bases azotadas são apolares e, por isso, hidrofóbicas. Para se tornarem solúveis em
água, elas são ligadas a um açúcar e a uma pentose formando um nucleótido. A insolubilidade
destas bases tem um papel muito importante de restrição na conformação do DNA em solução.
Uma molécula de DNA em dupla hélice é feita com bases nitrogenadas empilhadas, for-
mando um núcleo hidrofóbico.
Este empilhamento, elimina qualquer
espaçamento entre as bases e qualquer mon-
tante máximo de água que exista dentro da du-
pla hélice.
Devido a serem solúveis em água, os
açúcares e os fosfatos estão orientados para o
exterior da hélice, onde os grupos fosfato po-
lares possam interagir com o ambiente polar
que o rodeia.
Watson & Crick descobriram que para
que haja ligações de hidrogénio, a polaridade
das duas cadeias de DNA tem de estar em dire-
ções opostas, ou seja, as duas cadeias de DNA
em dupla hélice são antiparalelas (5’→3’ e 3’→5’).
A superfície da molécula é irregular, formando dois sulcos ou depressões de diferentes
tamanhos, que aparecem ao longo do seu comprimento:
• Sulco Menor (Minor Groove): corresponde à depressão entre duas cadeias com-
plementares.
• Sulco Maior (Major Groove): equivalente à depressão existente entre curvas
adjacentes.
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Rocha. H
Dada a hidrofobicidade das bases azotadas, o sulco maior tem um papel mais proemi-
nente no que toca a interações DNA-proteínas. Maior parte dos fatores de transcrição (proteínas
envolvidas na regulação da expressão de genes), ligam-se ao DNA no sulco maior.
Estruturas em Dupla-Hélice Alternativas
Por cristalografia de raio-X, conseguiu-se identificar, várias estruturas da dupla cadeia

para diferentes oligonucleótidos sintéticos.
A-DNA B-DNA Z-DNA

Orientação Contrário aos ponteiros Contrário aos ponteiros Ponteiros do relógio
do relógio do relógio
Sulco Maior Profundo e Estreito Profundidade moderada, Muito superficial, quase
largo não existente, muitas ve-
zes chamado “sulco sim-
ples”
Sulco Menor Raso e Amplo (superfi- Profundidade moderada, Muito Profundo e Estreito
cial) estreito
Bases/Curva 11 10.5 12
Condições* Baixa humidade (75%), Alta humidade (95%), Alta [MgCl2], NaCl ou
alta salinidade baixa salinidade) etanol, alta humidade ou
baixa salinidade
*Condições que facilitam a conversão entre formas helicoidais.
A-DNA: Comum em híbridos de DNA-RNA e RNA de dupla hélice; ocorre durante a
transcrição, onde o híbrido de RNA-DNA é mais estável na conformação A; Ocorre em bactérias
esporuladoras, quando uma proteína se liga a uma molécula de B-DNA e a induz a mudar para a
hélice de A-DNA.
B-DNA: Fortemente dependente na sua sequência. Exemplo da sequência TATA que o
seu desnaturamento é uma estratégia para abrir a dupla hélice do DNA para iniciar a transcrição.
Z-DNA: Tem função na regulação da expressão dos genes (proteínas que se ligam espe-
cificamente ao Z-DNA). Em alguns genomas de eucariotas, 10% ou mais do genoma contém
sequências capazes de formar Z-DNA.
Em adição a estas três diferentes conformações, ainda há outras estruturas de DNA que
podem ser formadas sob várias condições.
Existem muitas mais estruturas de DNA para além da mera conformação B-DNA imple-
mentada por Watson & Crick.
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Rocha. H
Estruturas de DNA incomuns
A expressão da informação contida numa sequência de DNA linear pode ser regulada
através de mudanças dinâmicas na estrutura secundária e terciária, especificamente determina-
das pela sequência.
Estruturas Escorregadias:
Ocorrem em associação com repetições em comboio e são encontradas a montante das

sequências regulatórias. Parecem ter um papel importante nas interações entre o DNA e a proteína.
Para além disso, bloqueiam os “garfos” de replicação, promovendo a reparação do DNA.
Cruciforme:
O desemparelhamento de
pequenas sequências de DNA
pode ser estabilizado por estrutu-
ras cruciformes.
Estas estruturas resultam
de formações de loops emparelha-
dos e podem atuar como elemen-
tos reguladores na replicação do
DNA e na expressão de genes.
Por outro lado, estão tam-
bém associadas a sequências palindrómicas:
- São uma curta secção de bases (normalmente entre 3 a 5 de comprimento), seguidas
pelas suas bases complementares no sentido contrário, tal como demonstra a figura.
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Rocha. H
Tripla Hélice:
É favorecida pela presença de sequências
que contêm repetições e simetria espelhada. A dupla
cadeia de purinas associa-se a uma terceira cadeia
através do sulco maior.
A estrutura inicial de B-DNA é mantida
nesta nova conformação. Esta estrutura tem alguma
relevância, devido à ocasional relação com terapias de cancro e doenças genéticas.
Desnaturação do DNA
Muitas questões se colocam acerca de como se desnatura o DNA reversivelmente? Que

ligações são quebradas? Pode este processo ser invertido?
Separação reversível das Cadeias de DNA:
A temperaturas elevadas, as ligações de hidrogénio podem ser quebradas com a conse-
quente separação do DNA, enquanto as ligações fosfodiéster se mantêm intactas - Desnaturação.
Com o arrefecimento da solução, a complementaridade de cadeias tende a formar a nova
dupla hélice – Renaturação.
Em processos como a replicação, transcrição ou translação, isto ocorre frequentemente:
as cadeias em dupla hélice devem-se separar transitória e reversivelmente. Para que a hibridação
possa ocorrer, as cadeias devem ser desnaturadas.
Métodos para desnaturar o DNA:

- Reduzir a concentração de
sais de uma solução de DNA pode pro-
mover a desnaturação devido à remoção
de catiões (mostrado a laranja na imagem)
que protegem as cargas negativas na su-
perfície da molécula em hélice.
- Solventes orgânicos e valores
elevados de pH promovem a quebra das
pontes de hidrogénio.
A desnaturação reversível do DNA permite a manipulação deste in vitro. Já a renaturação
possibilita que aconteça hibridação, isto é, o emparelhamento de bases de cadeias
complementares de duas fontes diferentes.
A desnaturação do DNA em dupla hélice leva ao aumento da Absorvância a 260nm (a

absorvância a este comprimento de onda é devida à ressonância da estrutura das bases de purina
e pirimidinas.
O dsDNA absorve 40% menos luz (260 nm) do que a quantidade equivalente de ssDNA.
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Rocha. H
A temperatura de fusão (melting temperature) – Tm – é definida pela temperatura à

qual se dá 50% da desnaturação.
Efeitos da salinidade e do conteúdo GC na desnaturação
O conteúdo GC de uma molécula de DNA tem efeitos significativos na sua temperatura

de fusão: quanto maior for o conteúdo de GC de uma dada molécula de DNA, maior será a
temperatura necessária para o desnaturar.
Isto deve-se ao facto de o emparelhamento entre Guaninas e Citosinas requerer três pon-
tes de hidrogénio, logo será necessária mais energia para as quebrar.
Por outro lado, também já se viu que concentrações baixas de sais promovem a desnatu-
ração devido à remoção de catiões que protegem as cargas negativas da molécula.
Assim, podemos concluir que, quanto maior for a quantidade de sais e maior for o
conteúdo de GC, maior será Tm, tal como a figura demonstra.
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Rocha. H
Replicação e Ciclo Celular
Eucariotas
Nos eucariotas, podemos dizer que é verdade que:

- Os cromossomas residem no núcleo;
- Cada cromossoma consiste em várias unidades de replicação chamadas replicões;
- A replicação requer coordenação deste replicões para duplicar o DNA durante o período
um período discreto do ciclo celular;
- A decisão sobre se replicar é determinada por uma via complexa que regula o ciclo celular;
- Os cromossomas duplicados são segregados para as células-filhas durante a mitose.
Uma das características mais importantes da replicação do DNA nos eucariotas mais de-
senvolvidos é a sua elevada plasticidade. Um exemplo disso é a rápida replicação do genoma
inteiro dos ovos fertilizados de anfíbios (20-30 min) comparado com a replicação do genoma de
células somáticas que leva entre 8 e 10 horas.
Passos da Replicação do DNA
Iniciação: envolve a montagem de uma forquilha de replicação (bolha) na origem da

replicação da sequência do DNA. A forquilha é gerada por um complexo de proteínas chamado
primossoma.
Elongação: adição de bases por outro complexo de proteínas chamado replissoma. As
cadeias originais desenrolam e, assim, as cadeias-filhas são sintetizadas.
Terminação: nos eucariotas, a replicação provavelmente continua até uma forquilha de
replicação encontrar outra forquilha que procede em direção a ela, vindo do replicão adjacente.
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Rocha. H
Enzimas e reações na forquilha de replicação
Antigénio Nuclear Celular em Proliferação Proteínas de Manutenção de Cromossomas-Mini (MCM)

Engate de DNA para a processabilidade da Helicases para abrir a cadeia dupla de DNA para iniciar a for-
DNA polimerase e coordenação dos proces- quilha de replicação de DNA
sos de maturação do fragmento de Okazaki
Complexo de RNA polimerase e Pol

α
Sintetiza inicadores de RNA e peque-
Fator-C de Replicação
nos fragmentos de DNA para iniciar
É o carregador do engate do PCNA fragmentos de Okazaki
até ao duplex de DNA
Nucleases
Removem os iniciadores
de RNA
Proteína de Replicação A
Vertente principal da Proteína que se liga ao

síntese do DNA DNA de cadeia simples
para proteger o molde de Síntese de
DNA da clivagem da nu- Fragmentos
Liga fragmentos de Oka-
clease Okazaki
zaki processados à DNA
lagging strand (cadeia que
está a ser replicada no
sentido 5’ para 3’)
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Rocha. H
Origens de Replicação nos Eucariotas
Nos eucariotas, a replicação bidirecional não começa no fim dos cromossomas lineares,
mas sim em muitas zonas internas.
Origin of Replication: é uma sequência particular num genoma onde a replicação é ini-
ciada.
O enrolamento negativo, isto é, que é fácil de desenrolar é bastante importante para as

origens de replicação. Numerosas aberturas na estrutura do DNA, conhecidas como bolhas de
replicação, ocorrem nas zonas de replicação nos cromossomas eucarióticos. Quanto mais tempo
durar a replicação, mais largas serão as bolhas.
As bolhas irão, eventualmente, fundir-se, separando, assim, as novas moléculas de DNA
replicadas.
As sequências de Origem de DNA têm imensos pares AT – são ricas em AT (mas apenas
em eucariotas unicelulares).
Em Saccharomyces cerevisiae existe uma sequência chamada autonomous replicating
sequence (ARS) – Sequência de replicação autónoma, onde Y é uma pirimidina (T ou C) e R é
uma purina (A ou G).
Sequências de origem mamífera carecem de uma sequência de consenso facilmente iden-

tificável (foi objeto de debate há muitos anos).
14
Rocha. H
ORC – “Origin-Recognition Complex”

Uma vez que a cromatina dos eucariotas tenha sido aberta, proteínas iniciadoras especí-
ficas reconhecem e ligam sequências de DNA origem, formando um Complexo de Reconheci-
mento de Origem – Origin Recognition Complex (ORC).
ORC é um complexo de ligação ao DNA, regulado pelo ATP e composto por seis subuni-
dades polipeptídicas (Orc1-6).
As células eucarióticas separam a seleção da replicação de origem da iniciação, através
da formação de um complexo de pré-replicação (Pre-RC), que impede uma replicação imensa do
genoma.
Formação do Complexo de Pré-Replicação:

• Recrutamento do Cdc6 (ciclo 6 da divi-
são celular), Cdt1 (licenciamento de cro-
matina e Fator de replicação de DNA 1) e
de proteínas Mcm (Minichromosome
maintenance).
• São todas proteínas essenciais para a ini-
ciação da replicação do DNA.
• Proteínas acessórias, tal como a proteína de replicação A (RPA), também têm
um papel importante na iniciação nos mamíferos.
Depois disso, há remoção das histonas nas origens de replicação, o que permite, ao com-
plexo Pré-RC, acesso à cadeia de DNA.
Uma vez ligado, ORC recruta pelo me-
nos duas proteínas adicionais, Cdc6 e Cdt1.
A hidrólise do ATP em Cdc6 leva ao es-
tabelecimento do complexo MCM e à libertação
de Cdt1.
A dissociação de Cdc6 da origem de re-
plicação completa, assim, a formação do com-
plexo de pré-replicação (Pré-RC).
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Rocha. H
Ciclo Celular
Interfase
Fase G1 – as células controlam o seu ambiente e, quando os sinais necessários são rece-
bidos, as células sintetizam RNA e proteínas para induzir o seu crescimento.
Fase S – quando as condições são ideais, as células sintetizam DNA e replicam o seu
DNA cromossomal.
Fase G2 – as células continuam o seu crescimento e preparam-se para a mitose.
Regulação nos checkpoints internos

A integridade do DNA é avaliada no checkpoint G1.
A duplicação apropriada dos cromossomas é avaliada no checkpoint G2.
A ligação de cada cinetocoro a microtúbulos do fuso é avaliada no checkpoint M (no fim
da metáfase no estágio da cariocinese).
Licenciamento de Replicação
O DNA apenas se replica uma vez por ciclo celular e a sua síntese é restrita a uma fase
específica deste ciclo, a fase S.
O sistema de licenciamento de replicação garante uma regulação rigorosa da formação
e ativação dos complexos Pré-RC aos níveis das cyclin-dependent kinases (CDKs).
As quinases fosforilam serinas e treoninas selecionadas em proteínas específicas – estão
a modelar as suas funções específicas.
As CDKs são proteínas quinases que, quando completamente ativas, podem fosforilar e,
assim, ativar outras proteínas que avançam no ciclo celular ao passar por um checkpoint.
Para tornar-se completamente ativa, uma CDK deve ligar-se a uma proteína ciclina e de-
pois ser fosforilada por outra quinase.
16
Rocha. H
Existe uma correlação direta entre a acumulação de ciclinas e os três checkpoints do ciclo
celular, representados por setas na imagem seguinte. As ciclinas vão-se acumulando durante a
interfase e são brutamente destruídas durante a mitose. As CDKs são ativadas durante a fase G1
tardia.
O Processo de Replicação está dividido em 2 passos
1) Formação do Complexo Pré-RC

Montagem sequencial do ORC, Cdc6, Cdt1 e MCM2-7 → acontece no final da
fase mitótica e no início da fase G1.
• Quando o Complexo de Reconhecimento de Origem (ORC) é incapaz de hidro-
lisar ATP, a montagem dos complexos MCM 2-7, no DNA origem, é inibida.
• Alternativamente, quando o complexo MCM 2-7 é carregado, torna-se forte-
mente associado ao DNA origem e o complexo ORC-CDC6-CDT1 já não é
necessário para manter a sua ligação ao DNA.
2) Ativação das forquilhas/bolhas de replicação

A atividade das CDKs facilita o carregamento de outras proteínas essenciais à
replicação no pré-RC para seguir com a cadeia. → isto acontece na transição entre a fase
G1 e a fase S.
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Rocha. H
• Apenas origens licenciadas que contêm MCM 2-7 podem iniciar um par de for-
quilhas de replicação.
• A atividade da helicase do complexo desenrola o DNA antes de cada bolha de
replicação.
• Uma vez que as forquilhas são iniciadas, MCM 2-7 é deslocada da origem e
move-se juntamente com a bolha de replicação. (imagem página 13)
Eventos de Licenciamento de Replicação levam à ativação da origem apenas uma

vez por ciclo celular
Formação do complexo Pré-RC
ocorre durante a fase G1 quando a
atividade das CDKs é baixa.
Quando a atividade das CDKs au-
menta, na transição de G1 para S,
o pré-RC é desmontado.
O pós-RC mantém estável até ao
fim da mitose e, devido à elevada
atividade de CDK, o complexo
pré-RC não se consegue reassociar
durante este tempo, tendo, então,
de aguardar pela próxima fase G1.
Regulação do sistema de licenciamento de replicação pelas CDKs

ORC, Cdc6, Cdt1 e MCM2-7 podem ser, cada uma, desreguladas como consequência da
atividade das CDKs.
Quando a atividade de CDK é elevada, as proteínas MCM2-7 não podem ser carregadas
nas origens durante a fase S, G2 e início da mitose.
A remoção de proteínas de licenciamento das origens durante a fase S bloqueia a forma-
ção dos complexos de pré-replicação e assegura que, apenas uma vez por ciclo celular, as
origens de replicação iniciam um par bidirecional de forquilhas.
Sequestro de Mcm2-7 no núcleo: a atividade de CDK fosforila Mcm2-7. Esta modifi-
cação faz com que se associe ao RanGTP (um mediador de exportação nuclear). Este complexo
sequestra Mcm 2-7 no núcleo e impede que ele se ligue a origens de replicação.
18
Rocha. H
Fator de Crescimento Eucariótico – Teórica 4
A via de transdução de sinal do fator de crescimento eucariótico
A via de transdução de sinal do fator de crescimento eucariótico promove a entrada na

Fase S.
Uma vasta maioria de células eucarióticas não cresce – elas estão no ciclo celular na Fase
G0 (células-tronco e células embrionárias estão a crescer ativamente.
Uma célula que sai da mitose tem 2 opções:
• Entrar na Fase G1;
• Parar de se dividir e entrar em G0.
Esta decisão é controlada:

• Pelo desenvolvimento histórico da célula;
• Pela presença ou ausência de fatores de crescimento e os seus recetores.
Noutra parte do organismo, o gene para o devido fator de crescimento deve ser ex-
presso, ativando a via de transdução de sinal, há comunicação de qual sinal de fator de cresci-
mento deve crescer (desde a sua fonte fora da célula até ao núcleo).
Revisão: Resposta Celular

As vias de sinalização celular variam imenso.
• Os sinais (ligandos) e os recetores existem em muitas variedades;
• A ligação pode acionar uma ampla gama de retransmissão de sinais dentro da
célula, desde simples e curtos a longos e complexos.
19
Rocha. H
Em alguns casos, pode ser percebida uma resposta celular tanto a nível molecular como
ao nível macroscópico:
- Ao nível molecular: Por exemplo, o aumento da transcrição de certos genes ou a ativi-
dade de enzimas particulares.
- Ao nível macroscópico: Por exemplo, mudanças no comportamento externo ou na apa-
rência da célula, tal como o crescimento celular ou a morte celular, que são causados por altera-
ções moleculares. (A resposta pode alterar o metabolismo da célula, forma e a expressão de genes)
Via de Transdução de Sinal do Fator de Crescimento

✓ É universal em todos os eucariotas.
Proto-oncogenes: genes que codificam elementos da via de transdução de sinal (que

quando alterados podem provocar cancro).
As células contêm recetores muito diferentes que estão ativos ao mesmo tempo e, cada
recetor, tem múltiplas zonas de encaixa/ancoragem para múltiplas proteínas. Não é uma via, mas
uma rede de informações.
Participantes
1 - EGF: Epidermal Growth Factor – fator de crescimento epidermal – estabiliza a dime-

rização do recetor (EGFR).
2 - EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor (Família de Recetores ErbB).
- A ligação ao recetor também causa a endocitose do complexo que está a ser alvo de
destruição (lisossomas). Os fatores de crescimento devem estar continuamente presentes para
propagar um sinal sustentado.
20
Rocha. H
3 - RAS: É uma G-Protein (isto é, tem a habilidade de se ligar a Guanosina Trifosfato

(GTP) ou a Guanosina Difosfato (GDP)), que quando ativa é RAS-GTP e inativa é RAS-GDP.
- Os Fatores de Crescimento estão conectados ao lado citoplasmático da membrana e
encontram-se em nanoclusters para melhorar a sinalização a jusante.
4 – SOS Protein: Fator de Troca de Nucleótido de Guanosina – GEF – converte RAS-
GDP em RAS-GTP.
Fatores de Crescimento e Recetores dos Fatores de Crescimento:

• Ligam-se à semelhança de uma chave e fechadura;
• Os fatores de crescimento contêm um domínio de proteínas quinase – RTK;
• A ligação estabiliza a dimerização do recetor, levando à fosforilação na tirosina
(b);
• A Fosfotirosina pode servir como uma zona de ligação para diversas proteínas,
tal como a Grb2 (b);
• Grb2 (uma proteína adaptadora) traz SOS à membrana e pode ativar RAS-GDP
(c);
• SOS remove o GDP, trocando-o com GTP, ativando assim a RAS (d).
A única função do fator de crescimento é estabilizar a dimerização do recetor, o que leva
à fosforilação, que por sua vez, leva ao recrutamento de SOS para a membrana para ativar RAS.
21
Rocha. H
RAS-GDP inativa e RAS-GTP ativa estão num equilíbrio dinâmico controlado pelo
GEF (fator de troca de nucleótidos de guanosina (como SOS) e outro conjunto de proteínas.
➢ Função do RAS-GTP: recrutar RAF (a.k.a MAPKKK/MAP3K – uma proteína

quinase de serinas/treoninas) para a membrana para ativação.
➢ RAS-GDP forma dímeros (em nanoclusters) para ativar cooperativamente RAF.
Então, como isto tudo se conecta à regulação do ciclo celular?

O dímero RAF é fosforilado e é libertado da plataforma. O RAF ativado fosforila uma
segunda quinase (Fatores MEK), que por sua vez fosforila uma terceira quinase (Fatores ERK),
que podem depois ser fosforilados e ativar um conjunto de fatores de transcrição.
Os fatores de transcrição entram no núcleo para começarem a transcrever os genes, de
modo a preparar a transição entre as fases G1 e S.
22
Rocha. H
ras mutações oncogénicas RASONC

Mais comuns é a mutação num simples nucleótido (causando a mudança do aminoácido).
Função Alterada: liga GTP com maior afinidade e já não requer um fator de crescimento
para causar a ativação. Está constitutivamente ativo.
Checkpoint controlo para entrada na Fase S
Depois da ativação inicial pelos Fatores de Crescimento, é necessária a presença contí-

nua destes. Isto é fortemente controlado por CDKs.
As CDKs (Cyclin-dependent kinases) estão sob um controlo complexo (ligadas a cicli-
nas) e sob múltiplos eventos de fosforilação. Estas podem ser sintetizadas com antecedência e
deixadas no citoplasma.
23
Rocha. H
A transição de G1 para S
• A célula deve crescer até um tamanho específico;
• Não deve haver nenhum DNA danificado (As células não devem replicar DNA
danificado!).
Para assegurar tal as CDKs/Complexos de Ciclinas são controlados por proteínas de
checkpoint.
Proteínas de Checkpoint: Fatores de Transcrição p53 e Rb (tumor supressor proteins).
O exemplo do checkpoint controlado por p53
A transcrição de p53 é regulada pela estimulação de fatores de crescimento quando a

célula atravessa a fase G1. A p53 é regulada por múltiplas vias.
Função de p53: transmitir informação às CDKs/Ciclinas que ocorreram danificações,

levando à paragem do ciclo celular (G0).
• A p53 interrompe o ciclo celular através de Rb e estimula a reparação do DNA;
• A p53 é regulada por um conjunto complexo de ativadores e inibidores.
Quando o dano é imenso (inreparável), p53 começa uma via alternativa, a apoptose
(morte programada da célula).
Rb: é uma proteína retinoblastoma e é uma proteína supressora de tumores e disfuncional

em vários cancros importantes.
Se ambos os alelos deste gene forem mutados, a proteína é inativada e resulta no desen-
volvimento do cancro do retinoblastoma, daí o nome “pRb”.
24
Rocha. H
• Tem função no núcleo, regulador da estrutura de cromatina e da transcrição;

• Função no citoplasma, guardião de entrada na Fase S.
Como funciona o supressor de tumor Rb?

A proteína Rb limita a proliferação celular ao prevenir a entrada na Fase S do ciclo celular.
Alcança o seu efeito inibidor ao bloquear a atividade de E2F.
Células não danificadas progridem através de G1

• O sinal de fator de crescimento é execu-
tado – via de transdução de sinal;
• Resulta na ativação do gene da ciclina
D (1ª Ciclina expressa);
• Ciclina D junta-se a CDK4 – necessá-
rio para entrar na Fase S;
• O controlo final da progressão do ciclo

celular é a regulação da atividade de CDK
por proteínas inibidoras – CDKI (p21 e
p27);
• Rb liga-se a E2F (Fator de Transcri-

ção) e inibe a habilidade de entrar no
núcleo. EF2 ativa os genes para progres-
são de G1;
• Para a progressão do ciclo celular, Rb
deve ser fosforilada por CDK/Ciclinas,
isto faz com que Rb liberte EF2.
• A ciclina E é ativada no meio de G1
(necessária para avançar para a Fase S).
25
Rocha. H
Origens de Replicação de DNA – Teórica 5
O número de origens de replicação num genoma é, na maioria, dependente do tamanho

do cromossoma.
Genomas bacterianos e arqueais, que normalmente consistem num cromossomas pe-
queno e circular, frequentemente têm uma única origem de replicação. Em contraste, os genomas
eucarióticos contêm significativamente mais origens, desde 400 em leveduras até 10/100 mil em
humanos devido à duplicação oportuna dos seus cromossomas lineares e maiores que requer o
estabelecimento de múltiplas forquilhas de replicação em múltiplas localizações.
A interação de origens de DNA e proteínas iniciadoras ultimamente resulta na forma-
ção de complexos pré-replicativos (pré-RC), cuja função é carregar e ativar as DNA helicases
necessárias ao desenrolamento do DNA antes da replicação.
Archaea
Archaea foram inicialmente classificadas como bactérias e denominadas archaebacteria.

Têm uma história evolucionária e uma bioquímica distinta.
Similaridades: Archaea e Eubacteria são procariotas – organismos unicelulares que não
têm núcleo nem organelos.
Modelo de Replicação dos Archaea

• Iniciadores trans-acting (trans-regulador, trans-regulação, em geral, significa
“atuar de uma molécula diferente”, isto é, intermolecular) reconhecem a orgiem
de replicação para formar complexos pré-replicativos (pré-RC) necessários
para desenrolar o DNA e carregar a DNA helicase.
• Iniciadores simples Orc1/Cdc6 ligam-se a zonas de reconhecimento e formam-
se em complexos no DNA.
• As DNA helicases (MCMs) são recrutadas para a origem e carregadas em ca-
deias de DNA simples.
26
Rocha. H
Revisão do modelo de replicação para todos os domínios de vida
• Para células de cada tipo de domínio, iniciadores trans-acting reconhecem origens de

replicação para formar complexos pré-replicativos necessários para desenrolar DNA e
carregar DNA helicases.
• Iniciadores eucarióticos são pré-montados em complexos de reconhecimento de ori-
gem hexaméricos (ORCs) antes da interação com o DNA.
• Nos procariotas, iniciadores simples (archael Orc1/Cdc6 ou Bacterial DnaA) li-
gam-.se a zonas de reconhecimento e montam-se em complexos no DNA.
• Em todos os casos: Dna Helicases são recrutadas para a origem (MCMs ou DnaB).
• Nas bactérias: proteínas de dobragem do DNA (proteínas associadas ao nucleoide), tal
como Fis ou IHF, podem modular a formação de pré-RC, ao dobrarem a origem de DNA.
• Duas atividades de DnaA: Versão alargada liga-se às zonas de reconhecimento e a ver-
são mais pequena representa o DnaA necessário para assistir o DnaC ao carregar DnaB
helicase na cadeia simples de DNA.
27
Rocha. H
Replicação do organelo DNA: mitocôndria de mamíferos
Mitocôndria de Mamíferos (mtDNA):

• Múltiplas cópias de um genoma de DNA de cadeia dupla circular.
• Maquinaria dedicada à replicação de DNA é necessária para a sua manutenção.
• Tem 13 mRNA (verde), 22 tRNA (violeta) e 2 rRNA (azul-pálido); Regiões não-codifi-

cantes maior e menor – noncoding regions (NCR);
• Major NCR: contém o promotor da cadeia pesada (heavy strand promoter – HSP), o
promotor da cadeia leve (light strand promoter – LSP), três caixas de sequências con-
servadas (CSB1-3, laranja), a origem de replicação da cadeia H (OH) e a sequência de
terminação associada (termination-associated sequence – TAS, amarelo).
• É formada uma estrutura de deslocamento de loop de cadeia tripla pela terminação pre-
matura da nascente da síntese da cadeia H de DNA em TAS. O produto de replicação
pequeno da cadeia H formado é, desta forma, denominado 7S DNA.
• Minor NCR: localizado aproximadamente 11000 bases a jusante de OH e contém a ca-
deia L da origem de replicação (OL).
28
Rocha. H
Replicação do genoma mitocondrial humano
• Iniciado em OH (Cadeia H na Origem de replicação) e procede unidireccionalmente

para produzir a cadeia H nascente de comprimento total (mtSSB);
• mtSSB liga-se e protege a cadeia que ficou exposta – cadeia H parental;
• Quando o replissoma passa OL (Cadeia L da Origem de replicação), uma estrutura de
haste-loop é formada e bloqueia a ligação de mtSSB, apresentando uma região de loop
de cadeia simples onde POLRMT pode iniciar a síntese de primers.
• A transição para a síntese da cadeia L de DNA toma lugar depois de cerca de 25 nt,
quando POLy substitui POLRMT no último carbono 3’ do primer.
• Síntese de duas cadeias procede de maneira contínua até duas moléculas inteiras de
cadeia dupla de DNA tenham sido formadas.
Separação e Segregação do genoma mitocondrial humano

• Durante a replicação de DNA, a molécula paren-
tal permanece intacta.
• Depois da replicação de mtDNA, as novas molé-
culas filhas são mecanicamente ligadas através de
uma estrutura hemicatenana que requer Top3α (Tipo
1ª) para ser resolvida.
Replicação em procariotas: metilação das origens de replicação

Sumário
• mtDNA mamífero é replicado por proteínas distintas daquelas usadas para a

replicação do DNA nuclear;
• De acordo com o modelo de deslocamento de cadeias, a replicação é iniciada
em duas origens distintas, OH e OL;
• Transcrições iniciadas no LSP (promotor da cadeia leve) fornecem o primer a
partir do qual POLy pode iniciar a síntese de DNA em OH;
29
Rocha. H
• OL forma uma estrutura de haste-loop e POLRMT inicia a síntese de primers

a partir da região de loop de cadeia simples.
• A função do D-loop mitocondrial não é compreendida;
• RNASEH1 e MGME1 têm funções importantes na remoção de primers, mas os
detalhes deste processo também não são compreendidos;
• Top3α é necessária para resolver estruturas de hemicatenano formadas entre
as novas moléculas de mtDNA no fim da replicação;
• mtDNA não é uma molécula “nua”, mas sim empacotada em complexos de nu-
cleoproteínas, nucleoides;
• A divisão mitocondrial está ligada à síntese ativa de mtDNA.
Replicação de Elementos Extracromossomais
Uma bactéria pode ser um hóspede para unidades genéticas de replicação independente:
- Plasmídeos:
• Genomas de DNA livre
• Mantidos na célula num número de cópias estável e característico.
- Fagos:
• Ácidos nucleicos são empacotados numa capa de proteína e são libertados da bactéria no
final de um ciclo infecioso.
30
Rocha. H
Círculos rolantes produzem multímeros de um replicão
• A repli-
cação de uma cadeia é usada para gerar cópias de algumas moléculas circulares: Círculos
Rolantes;
• Um corte abre uma cadeia e, depois, a extremidade 3’-OH livre criada pelo corte é ex-
tendida pela DNA polimerase;
• A nova cadeia sintetizada desloca a cadeia original parental;
• À medida que se move, a bolha de replicação extende a cadeia externa e desloca a anterior.
O destino da cauda deslocada determina o tipo de produtos criados pelos círculos rolantes:
• Clivagem em unidades de comprimento gera monó-
meros, que podem ser convertidos em formas duplas e circu-
lares;
• Clivagem de multímeros gera séries de cópias repetidas
em tandem/comboio da unidade original.
31
Rocha. H
Círculos rolantes são usados para replicar o genoma de fagos

Φ X174 RF (forma replicativa) DNA é um modelo para sin-
tetizar círculos virais de cadeia simples.
A proteína viral A permanece ligada ao mesmo genoma atra-
vés de revoluções indefinidas, cada vez cortando a origem na
cadeia viral (+) e transferindo para a nova extremidade 5’.
Ao mesmo tempo, a cadeia viral libertada é circularizada.
O plasmídeo F é transferido por Conjugação entre Bactérias
Conceitos-Chave:
• O plasmídeo F livre é um replicão que é mantido ao nível de um plasmídeo por
cromossoma bacterial;
• Um plasmídeo F pode integrar no cromossoma bacterial, caso este onde o seu
próprio sistema de replicação é suprimido;
• O plasmídeo F codifica um complexo de translocação de DNA e pili específicos
que se formam na superfície da bactéria;
• Um pilus-F permite que uma bactéria F-positiva entre em contacto com uma bac-
téria F-negativa e permite que inicie a conjugação.
32
Rocha. H
Mecanismos de troca de genes em procariotas
Epissoma:
• Um plasmídeo que pode integrar o ge-
noma;
• Plasmídeo e epissoma são dois tipos de
elementos de DNA que existem independen-
temente do genoma. Em geral, ambos podem
sofrer uma replicação autónoma.
• Semelhantes aos bacteriófagos lisogéni-
cos
Ciclos de Vida de Bacteriófagos

Lítico
33
Rocha. H
Lisogénico
Plasmídeo F e Conjugação
Conjugação: Um genoma de plasmídeo ou parte de um cromossoma hospedeiro com um

epissoma integrado é transferido de uma bactéria para outra. A conjugação é mediada pelo plas-
mídeo F (exemplo clássico de um epissoma).
Plasmídeo F: O fator de fertilidade. Primeiramente denominado F, também chamado por
fator de sexo F em E. coli.
A conjugação é um exemplo de conexão entre a replicação e a propagação de uma uni-
dade genética.
OriT (Origem de Transferência): A sequência
que marca o ponto de partida da transferência
conjugativa.
OriV (Origem da Replicação Vegetativa): A se-
quência começa com o DNA-plasmídeo que será
replicado na célula recetora.
Tra-region (Genes de transferência): Genes que
codificam F-Pilus e o processo de transferência
de DNA.
IS (Elementos de Inserção): composto por uma
cópia do IS2, duas cópias do IS3 e uma cópia do
IS1000 – sequência de fragmentos que podem integrar cópias de si mesmos em diferentes locais.
34
Rocha. H
O plasmídeo F pode integrar-se em numerosas zonas nos cromossomas de E. coli mui-

tas vezes por um evento de recombinação que envolve sequências IS que estão presentes tanto no
cromossoma hóspede como no plasmídeo F.
Na sua forma livre, o plasmídeo F utiliza a sua própria origem de replicação (OriV) e
sistema de controlo.
Quando é integrado no cromossoma bacteriano, este sistema é suprimido e o F DNA é
replicado como uma parte do cromossoma.
O Plasmídeo F é transferido por conjugação entre bactérias
A presença de plasmídeos F (livres ou integrados) tem consequências para a bactéria

hóspede:
• Bactérias F-positivas são capazes de conjugar apenas com bactérias que são F-
negativas;
• A conjugação envolve contacto físico e direto entre as bactérias dadora (F-po-
sitivo) e recipiente (F-negativo);
• O contacto é seguido por uma transferência de sentido único do plasmídeo F;
• Se o plasmídeo F existir como um plasmídeo livre: depois do processo de infeção
o recipiente negativo torna-se num estado F-positivo.
35
Rocha. H
Região de Transferência:
• Uma região larga (cerca de 33 kb) de plasmídeo F necessária para a conjugação;

• Cerca de 40 genes necessário para a transmissão de DNA;
• Os genes são organizados em loci denonimandos tra e trb;
• Maior parte deles são expressos coordenadamente como parte da unidade de transcrição
de polycistronic 32kb (a unidade traY-I).
Região Reguladora:
• traM e traJ são expressos separadamente;
• traJ é um regulador que ativa traM e traY-I.
No lado oposto da cadeia, finP é um regulador que codifica para um pequeno RNA anti-
sentido que desliga traJ.
Apenas quatro dos genes tra e trb estão diretamente ligadas com a transferência de DNA
(traD, trai, traM e traY). Maior parte deles codificam proteínas que formam uma larga membrana
que abrange um complexo proteico chamado sistema de secreção de tipo 4 (T4SS).
Tal como a imagem em cima demonstra, as bactérias conjugadas estão inicialmente co-
nectadas quando o F-pili do dador contacta a bactéria recipiente.
36
Rocha. H
A Conjugação transfere DNA de cadeia simples

A transferência de um plasmídeo F é iniciada quando a
replicação de um círculo rolante começa em oriT.
A formação de um relaxossoma inicia a transferência
para uma bactéria recipiente.
O DNA transferido é convertido para a forma de cadeia
dupla na bactéria recipiente.
Quando um plasmídeo F é integrado, a conjugação
causa a transferência da unidade cromossómica bacteriana.
O processo é interrompido por uma quebra aleatória do con-
tacto entre o dador e a bactéria recipiente.
1. A transferência de DNA ocorre quando o plasmídeo F é

cortado em oriT e uma cadeia simples é liderada pela extremi-
dade 5’ vinculada ao TraI para o destinatário.
2. Apenas uma unidade de comprimento é transferida.
3. Cadeias complementares são sintetizadas para a cadeia simples que permanece no da-
dor e para a cadeia transferida para o recipiente.
A transferência do DNA cromossomal ocorre quando o plasmídeo F integrado é cortado

em oriT.
A transferência do DNA começa com uma pequena sequência de DNA F e continua até
ser prevenida pela perda de contacto entre bactérias.
37
Rocha. H
Plasmídeos têm um sistema de partição
Conceitos-Chave:
➢ Plasmídeos de cópia única existem em uma cópia de plasmídeo por origem de cromos-
soma bacteriano;
➢ Plasmídeos de cópia múltipla (multicópia) existem em mais do que uma cópia de plas-
mídeo por origem de cromossoma bacteriano;
➢ Os sistemas de partição asseguram que plasmídeos duplicados são segregados para di-
ferentes células filhas produzidas pela divisão.
➢ Sistemas de controlo de cópia simples: assemelha-se ao do cromossoma bacteriano e
resulta numa replicação por ciclo celular. Um plasmídeo de cópia única mantém efetiva-
mente paridade com o cromossoma bacteriano.
➢ Sistemas de controlo de cópia múltipla: Permitem múltiplos eventos de iniciação por
ciclo celular, com o resultado de existirem várias cópias do plasmídeo por bactéria.
Tipicamente, existem dois loci trans-acting (normalmente chamados parA e parB) e um

elemento de cis-acting (chamado parS) localizado a seguir aos dois genes anteriores.
ParA é uma ATPase de partição que se liga ao parB, que por sua vez se liga à zona
parS no DNA.
Estes parA’s usam o nucleoide bacteriano para posicionamento de plasmídeos, embora
os mecanismos pelo qual isto é conseguido ainda não sejam muito claros.
O parS desempenha um papel para o plasmídeo equivalente ao centrómero de um cro-
mossoma eucariótico.
A ligação da proteína parB a parS cria uma estrutura que segrega as cópias de plasmídeo
para as células filhas opostas.
38
Rocha. H
Complexo de Partição:
➢ O complexo de parB com parS.
➢ A formação deste complexo inicial permite que moléculas de parB se liguem cooperati-
vamente, formando um grande complexo proteína-DNA.
➢ Estes complexos mantêm os plasmídeos filhos juntos em pares até que estejam prontos
para interagir com o para.
➢ A atividade de para é necessária para o posicionamento dos plasmídeos na célula para
que pelo menos uma cópia esteja em cada lado do septo divisor da célula.
Os plasmídeos devem assegurar que as bactérias não consigam vi-

ver sem eles ao sintetizar uma toxina de longa vida e um antídoto
de curta duração – sistema de toxina-antitoxina.
39
Rocha. H
A incompatibilidade dos plasmídeos (grupo inc) é determinada pelo replicão
Os plasmídeos num grupo de compatibilidade simples têm origens que são reguladas por
um sistema de controlo comum.
Incompatibilidade de Plasmídeos: está relacionada com a regulação do número de có-
pias de plasmídeo e com a segregação.
Um grupo incompatível é definido por:

• Um conjunto de plasmídeos cujos membros são incapazes de coexistir na mesma célula
bacteriana;
• Porquê? Eles não conseguem ser distinguidos um do outro em alguma fase* que é es-
sencial para a manutenção de plasmídeos;
• Dois plasmídeos são incompatíveis (pertencem ao mesmo grupo inc) se as suas origens
não conseguirem ser distinguidas na fase de iniciação.
*A replicação de DNA ou a segregação são fases a que isto se pode aplicar.
Um efeito semelhante seria produzido se o sistema de segregação de produto das

células filhas não conseguisse distinguir entre dois plasmídeos.
Por exemplo: se dois plasmídeos têm a mesma zona de partição de cis-acting, a competição
entre eles iria garantir que eles iriam ser segregados para células diferentes, e, por tal motivo, não
conseguiriam sobreviver na mesma linha.
A presença de um membro de um grupo compatível não afeta diretamente a sobrevi-

vência do plasmídeo pertencente a um grupo diferente.
Apenas um replicão de um certo grupo Inc pode ser mantido na bactéria, mas não interage
com replicões de outros grupos compatíveis.
40
Rocha. H
Transcrição em Procariotas – Teórica 6
Visão Geral da Transcrição
É o primeiro passo da expressão génica (e o mais regulado).

Um polímero de RNA é criado a partir de um modelo de DNA. O DNA consiste em duas
cadeias longas que correm em direções opostas na formação de dupla hélice.
Os produtos de transcrição podem ser diferentes tipos de RNA. Tanto em procariotas
como em eucariotas, podemos encontrar: RNA mensageiro (mRNA), RNA ribossomal (rRNA) e
RNA de transferência (tRNA). Estes três tipos de RNA estão envolvidos na síntese de proteí-
nas.
Existem, porém, outros tipos de RNA, tal como micro RNA (miRNA) – envolvidos na
silenciação de genes -, RNA de interferência pequena (siRNA) e RNA de longa cadeia dupla
(dsRNA).
É dito que a vida começou a partir de RNA auto-replicante, moléculas capazes tanto de
catálise como de transporte de informação genética.
As proteínas assumiram a catálise – maior variedade de sequências e estruturas.
As ligações na cadeia principal de fosfato e açúcar do RNA são vulneráveis a mudanças
leves no pH e podem sofrer hidrólise alcalina.
O DNA emergiu como a molécula preferida para carregar informação genética, pois é
mais estável e resistente à degradação.
A transcrição mantém a ligação entre estas duas moléculas e permite à célula usar um
ácido nucleico estável como material genético, enquanto retém maior parte da maquinaria de sín-
tese de proteínas.
41
Rocha. H
Devido à desoxirribose, que contém um oxigénio a menos, o DNA é mais estável que o
RNA, sendo uma molécula útil para manter a informação genética segura.
O RNA, como contém ribose, é mais reativo e não é estável em condições alcalinas. Os
sulcos helicoidas maiores do RNA fazem com que este seja mais sujeito a ação enzimática.
Transcrição em procariotas
A transcrição é feita no sentido 5’ para 3’ a partir de uma cadeia molde de DNA que é 3’
para 5’.
A síntese do RNA é catalisada pela RNA polimerase.

Uma célula bacteriana típica contém cerca de 0.5-20 fg de DNA e 100 fg de RNA.
DNA bacteriano é de cadeia duplas, organizado num único cromossoma circular, no nu-
cleoide, localizado no citoplasma. Para além disso, está também presente na forma de plasmídeos
– pequenas moléculas de DNA extracromossomais.
Em células de E. coli existe cerca de 13 mil RNA polimerases num único momento.
42
Rocha. H
Passos da Transcrição:
1. Polimerase liga-se ao modelo de DNA na região promotora (região no ínicio do
gene que vai ser transcrito);
2. O primeiro par de bases que é transcrito é incluído no promotor – ponto de par-
tida (+1);
3. A polimerase sintetiza RNA até chegar à região terminal;
4. A região desde o promotor até ao terminador é chamada unidade de transcrição.
Uma única molécula de RNA é produzida a partir de uma unidade de transcrição. Uma
unidade de transcrição pode conter um ou mais genes.
O produto de transcrição é chamado transcrito primário, que contém a extremidade 5’.
Estabilidade do RNA transcrito

Em bactérias, os rRNA e tRNA primariamente transcritos são processados por endonu-
cleases (as pontas são cortadas), tornando os operões estáveis (eles podem suportar quase todo o
tempo de geração de uma célula bacteriana).
O mRNA apenas dura entre 1 a 3 minutos em procariotas (é mais estável em eucariotas).
43
Rocha. H
Mecanismos de ação da polimerase:
1. A transcrição ocorre na bolha de transcrição – separação transiente das cadeias de DNA

pela polimerase depois da ligação à região promotora;
2. A bolha de transcrição tem 12 a 14 bp;
3. O híbrido de RNA e DNA dentro da bolha tem 8 a 9 bases;
4. Através de complementaridade de bases, a cadeia de RNA é sintetizada desde a extremi-
dade 5’ até a extremidade 3’;
5. O duplex de DNA volta-se a formar quando a RNA polimerase atinge a região termina-
dora.
Fases de Reação na Transcrição:
1 – Iniciação
A RNA polimerase liga-se ao promotor, separa a cadeia
dupla dentro da bolha fechada e comete alguns “erros”. Esta
fase termina quando a enzima atinge a extensão do RNA e
deixa o promotor.
2 – Elongação
A RNA polimerase catalisa a síntese de RNA através da
adição de nucleótidos na extremidade 3’.
3 – Terminação
A RNA polimerase atinge a zona de terminação e está
livre (dissociada) para catalisar a síntese de RNA em promo-
tores próximos.
44
Rocha. H
A RNA polimerase bacteriana consiste em múltiplas subunidades
Estrutura e função das RNA polimerases

Estrutura bem caracterizada (estruturas cristalinas de elevada resolução).
Múltiplas subunidades enzimáticas (α2 ββ′ ω) com um peso médio de 400 kD
A catálise é feita pelas subunidades β e β’ – conservadas em bactérias, archaea e eucari-
otas.
O dímero formado pelas duas subunidades α serves como um andaime para a formação
do núcleo enzimático.
Nas bactérias, um único tipo de RNA polimerase sintetiza rRNA, mRNA e tRNA (o que
não é o caso para os eucariotas).
A RNA polimerase de E. coli pesa 406 kD quando completa (holoenzima) e é composta
pelo núcleo enzimático e pelo fator sigma.
β e β’ formam o centro ativo. Elas são conservadas com subunidades maiores de RNA
polimerase de bactérias, archaea e eucariotas.
45
Rocha. H
Mecanismos da Transcrição em Procariotas – Teórica 7
Revisão Teórica 6 – Bases da Transcrição
A transcrição produz uma cadeia de RNA idêntica (em termos de sequências) com uma
cadeia de DNA, a cadeia codificante. Esta cadeia é feita de 5’ para 3’ e é complementar à cadeia
molde que é 3’ para 5’. Ou seja, a cadeia codificante é a cadeia não-molde e a cadeia comple-
mentar é a cadeia molde para a transcrição.
A síntese de RNA é catalisada pela RNA Polimerase e a transcrição começa quando esta
enzima se liga a uma região denominada, o promotor (que se encontra no ínicio do gene). O
promotor inclui: o primeiro par de bases que é transcrito para o RNA (start point - +1), assim
como as bases que o rodeiam.
Uma unidade de transcrição é uma sequência de DNA transcrito num único RNA, co-
meçando num promotor e acabando num terminador.
A Holoenzima da RNA Polimerase consiste no núcleo da enzima (α2ββ′ω) e no fator
sigma.
É o núcleo que catalisa a transcrição e o fator sigma só é requerido para a iniciação. Este
fator também altera as propriedades das ligações ao DNA da RNA Polimerase para que a afini-
dade geral ao DNA seja reduzida e a sua afinidade aos promotores seja aumentada.
O núcleo da enzima tem uma afinidade para com o DNA, principalmente devido às inte-
rações eletrostáticas entre a proteína (básica) com o DNA (ácido). Quando a enzima se liga ao
DNA desta forma, o DNA permanece na forma de dupla cadeia e o núcleo da enzima tem a capa-
cidade de sintetizar RNA na cadeia de DNA, mas não consegue reconhecer promotores.
Desta forma, o fator sigma é o responsável para que haja reconhecimento dos promotores
e haja, então, um início da transcrição.
Uma vez terminada a iniciação, o fator sigma liberta o núcleo da enzima, que vai proceder
para a elongação, antes que o RNA contenha cerca de 10 nucleótidos.
46
Rocha. H
RNA Polimerase e Sequências Promotoras
Como é que a RNA Polimerase encontra os Promotores?

A velocidade com que a RNA Polimerase se liga aos promotores pode ser muito rápida
para ser contabilizada como difusão simples. Esta enzima, liga-se a zonas aleatórias no DNA e
troca-as com outras sequências até um promotor ser encontrado.
A RNA Polimerase deve encontrar promotores no contexto do genoma, mas como são
estes distinguidos dos outros milhares de bases que se encontram no genoma?
A figura seguinte demonstra modelos simples de como a RNA Polimerase pode encontrar
um promotor entre todas as sequências a que pode ter acesso.
Deste modo, a enzima localiza o cromossoma por difusão aleatória e liga a sequência não
específica ao DNA carregado negativamente.
A figura mostra que o processo é suscetível de ser acelerado porque o alvo inicial da RNA
Polimerase é o genoma inteiro e não uma sequência promotora específica. Ao aumentar o tama-
nho do alvo, a taxa constante de difusão do DNA é correspondentemente aumentada e não é mais
limitante.
Porém, como é que a enzima se move de uma zona a que se ligou aleatória no DNA para
um Promotor?
Ocorrem, pelo menos, três processos diferentes que contribuem para a procura do promo-
tor pela RNA Polimerase.
Em primeiro lugar, a enzima deve-se mover numa caminha aleatória unidimensional ao
longo do DNA, processo este denominado sliding.
47
Rocha. H
Em segundo lugar, dada a natureza dobrada do cromossoma no nucleóide bacteriano,

tendo-se ligado a uma sequência no cromossoma, a enzima está agora mais próxima de outros
locais, reduzindo o tempo necessário para a dissociação e religação para outro sítio (intersegment
transfer ou hopping).
Por último, enquanto a enzima está ligada não especificamente a uma zona, ela pode mu-
dar as zonas de DNA até encontrar um promotor, sendo este último passo chamado de direct
transfer.
48
Rocha. H
Transições da Holoenzima no Processo
A Holoenzima passa por transições no processo de reconhecer e “fugir” de Promotores.

Quando a RNA Polimerase se liga a um promotor, ela separa as cadeias de DNA para
formar uma bolha de transcrição e incorporar os nucleótidos no RNA.
Um ciclo de iniciações abortivas, pode também ocorrer antes da enzima passar à próxima
fase.
O fator sigma é normalmente libertado da RNA Polimerase quando a nascente do RNA
contém cerca de 10 bases de comprimento.
A reação de iniciação pode ser descrita pelos parâmetros que estão sumarizados na figura
seguinte:
• A reação Holoenzima-promotor começa quando se forma um complexo binário

fechado, tal como mostrado em (a), e por fechado quer se dizer que a dupla cadeia
de DNA se mantém. A formação deste complexo é reversível.
• Este complexo fechado é convertido num complexo aberto, ao desnaturar uma
pequena região do DNA (perto da região -10), dando um complexo intermédio
instável e aberto dentro da sequência vinculada pela enzima, tal como mostrado
em (b).
• Para a maior parte dos promotores, a conversão de um complexo fechado em
aberto é irreversível, mas alguns promotores não formam complexos abertos es-
táveis e esta é a chave para a sua regulação.
• O Fator Sigma tem um papel essencial na reação de desnaturação.
• As transições que possam ocorrer da iniciação até à elongação são também acom-
panhadas de mudanças na estrutura e composição do complexo.
Trocas na forma da RNA Polimerase acompanham as transições cinéticas descri-

tas anteriormente, assim como a transição do complexo de elongação.
49
Rocha. H
No complexo fechado, a Holoenzima da RNA Polimerase cobre cerca de 55 pares de

bases do DNA, estendendo-se de -55 até +1. A dupla cadeia de DNA liga-se, principalmente, a
uma face da holoenzima, contactando os domínios do terminal-C das subunidades α, assim como
as regiões 2 a 4 do fator sigma.
Durante a transição para o complexo aberto, a conformação tanto da RNA Poli-

merase como do DNA mudam, sendo as transições mais dramáticas vistas na figura 17.12:
1. Uma curva de aproximadamente 90º no DNA, que permite à cadeia aproximar-
se da zona ativa da enzima.
2. Abertura das cadeias do DNA Promotor entre -11 e +3, no que diz respeito à zona
de início da transcrição.
3. Raspagem do DNA do Promotor para o canal ativo, formando a bolha de trans-
crição
4. E o encerramento das mandíbulas da enzima para envolver a secção do promotor
a jusante do local de início da transcrição.
5. Assim, o contacto dos promotores no complexo aberto estende.se de -55 até +20.
O próximo passo é incorporar os dois primeiros nucleótidos e formar uma ligação fosfo-
diéster entre eles. Isto gera um complexo ternário que contém RNA, assim como DNA, e a en-
zima. Na maioria dos promotores, após cada nucleótido ter sido adicionado, existe uma probabi-
lidade da enzima se libertar da cadeia de RNA, resultando em produtos de iniciação abortiva.
50
Rocha. H
Depois da libertação de um produto abortivo, a enzima volta a sintetizar RNA na posição

+1.
Embora a libertação do fator sigma ocorra durante o processo de “fuga” do promotor, isto
não é obrigatório da transição para a elongação. Em alguns casos, o fator sigma tem sido identi-
ficado em complexos de elongação, mas a sua associação com a enzima pode refletir uma nova
ligação com o núcleo da enzima durante a fase de elongação.
51
Rocha. H
Promotores e o Fator Sigma – Controlo nas ligações ao DNA
O Fator Sigma controla a ligação ao DNA ao reconhecer Sequências Específicas no Promo-

tor
Um promotor é definido pela presença de pequenas sequências de consenso em locais
específicos.
As sequências de consenso do Promotor normalmente consistem numa purina (A ou G)
no start point, um hexâmero com uma sequência próxima de TATAAT centrada perto de -10 e
outro hexâmero com uma sequência semelhante a TTGACA centrada perto de -35.
Promotores individuais normalmente diferem do consenso em uma ou mais posições e a
eficiência do promotor pode ser afetada por elementos adicionais.
Como uma sequência de DNA cuja função é ser reconhecida por proteínas, um promotor
difere das sequências cuja função é ser transcritas. A informação para o Promotor é fornecida
diretamente pela sequência de DNA, diga-se que a sua estrutura é o seu sinal.
Uma forma de designar um promotor seria uma sequência particular do DNA ser reco-
nhecida pela RNA Polimerase. Qualquer promotor consiste, ou pelo menos contém, esta sequên-
cia. No genoma bacteriano, o tamanho mínimo que pode fornecer um sinal adequado são 12 pares
de bases, um número suficiente para evitar falsos sinais.
Esta sequência de 12-bp não necessita de ser contígua, pois a separação também pode ser
parte do sinal, independentemente da sequência de separação.
De facto, a RNA Polimerase reconhece as sequências de DNA Promotor em grande parte
a partir de uma “leitura direta” de bases específicas do DNA por aminoácidos específicos na ho-
loenzima.
As diferenças dramáticas nas forças de diferentes promotores de bactérias derivam da
variação do quão bem as diferentes sequências de promotores são capazes de ser lidas por certas
sequências de aminoácidos presentes nas subunidades α e σ.
Algumas tentativas para identificar as características do DNA que são necessárias para a
ligação da RNA Polimerase começaram por comparar sequências de promotores diferentes. Qual-
quer nucleótido essencial deve estar presente em todos os promotores e, tal sequência, é denomi-
nada de conservada.
Uma sequência conservada não precisa de ser conservada em todas as posições, porém
alguma variação é permitida.
Uma sequência de consenso é definida ao alinhar todos os exemplos conhecidos ao ma-
ximizar a sua homologia. Para uma sequência ser aceite como uma sequência de consenso, cada
base particular deve ser razoavelmente predominante na sua posição.
52
Rocha. H
Diversos elementos, nos promotores bacterianos, contribuem para o seu reconhecimento

pela holoenzima RNA Polimerase. Dois elementos de 6-bp, referidos como o elemento -10 e o
elemento -35, são normalmente os mais importantes para o reconhecimento destas sequências.
A sequência do Promotor no ponto de início da transcrição, e diretamente adjacente a este,
as sequências em cada lado do elemento -10 e os 10 a 20 pares de bases a jusante do elemento-35
interagem especificamente com a RNA Polimerase e contribuem para a eficiência do promotor:
• Uma região de 6-bp centrada é reconhecida, aproximadamente, a 10 bp a jusante do start
point na maioria dos promotores. Esta sequência hexamérica é o que se chama de ele-
mento -10 ou por vezes a caixa TATA. O seu consenso pode ser sumarizado na forma
de onde os números denotam a percentagem de ocorrência da

base mais frequentemente encontrada. O primeiro TA e o último T são cruciais para o
reconhecimento do promotor.
• O hexâmero conservado, TTGACA, centrado aproximadamente a 35 bp a jusante do start
point é chamado de elemento -35. Com mais detalhe, pode ser escrito da seguinte forma
. As bases deste elemento interagem diretamente com a região 4.2

do fator sigma, semelhante ao que acontece nos complexos abertos e fechados.
• A distância que separa as zonas -35 e -10 é cerca de 16/18 bp em cerca de 90% dos
promotores. Embora a sequência seja maior parte da região esta não é muito importante,
mas a distância é sim crítica, dada a natureza helicoidal do DNA, que determina não só a
separação apropriada das duas regiões que interagem na RNA Polimerase, mas também
da orientação geométrica das duas zonas com respeito uma à outra.
• O start point é normalmente uma purina (90% das vezes uma Adenina). É comum que o
start point seja a base central na sequência CAT, mas a conservação deste tripleto não é
grande o suficiente para o considerar um sinal obrigatório.
• Alguns pares de bases entre o start point e o elemento -10 são contactados pela região 1.2
do fator sigma. Por exemplo, uma interação específica de sequências entre um resíduo de
guanina na cadeia não modelo duas posições a jusante do elemento -10 é especialmente
importante para determinar a estabilidade do complexo aberto. Isto trata-se de um exem-
plo de como regiões não conservada conferem diferentes forças nos promotores.
• As bases no elemento -10 estendido são contactadas pela região 3.0 do fator sigma. A
sequência a montante do elemento -10 resulta em interações que são especialmente es-
senciais para a iniciação da transcrição quando falta, ao promotor, uma sequência do ele-
mento -35 que corresponde ao consenso.
• A região a 20-bp a montante do elemento -35 pode interagir com os domínios do terminal
carboxílico (CDTs) das duas subunidades α. Os efeitos destas interações na atividade do
promotor podem ser o aumento da transcrição numa ordem de grandeza para promotores
53
Rocha. H
altamente expressos, como aqueles nos genes do rRNA. Esta região é referida como o
elemento UP.
A estrutura de um promotor está demonstrada na figura a seguir.
Eficiência dos Promotores pode ser alterada por Mutações
Mutações baixas (mutações onde há redução dos genes transcritos) diminuem a eficiência
do promotor geralmente diminuindo a conformidade com as sequências de consenso, enquanto as
mutações altas (mutações onde há um aumento da transcrição a partir do promotor) têm o efeito
oposto.
Mutações na sequência -35 podem afetar a ligação inicial da RNA Polimerase. Já as mu-
tações na sequência -10 podem afetar ou a ligação ou a reação de desnaturação que converte um
complexo fechado para um complexo aberto.
Muito basicamente, os efeitos das mutações podem fornecer informação sobre a função
do promotor.
(O Capítulo até é grande mas acho que o sor não quer saber muito mais disto)
54
Rocha. H
RNA Polimerase contacta diretamente com o Promotor de DNA
Múlitplas regiões na RNA Polimerase contactam diretamente com o Promotor de DNA
A estrutura do fator sigma σ70 muda quando associada com o núcleo da enzima, permi-
tindo às regiões que se ligam ao DNA que interajam com o promotor. Múltiplas regiões no fator
sigma σ70 interagem com o promotor.
A subunidade α também contribui para o reconhecimento do promotor.
A identificação de séries de diferentes séries de sequências de consenso reconhecidas por
holoenzimas que contêm diferentes fatores sigma implica que a subunidade do fator sigma con-
tacte com o DNA. Isto sugere que os diferentes fatores sigma se liguem, à semelhança do núcleo
enzimático, para que as superfícies de reconhecimento de DNA, nos diferentes fatores sigma,
sejam posicionadas de forma semelhante para fazer contactos críticos com as sequências do pro-
motor nas proximidades das sequências -35 e -10.
Durante a Fuga aos Promotores:
• A interação entre o fator sigma e o núcleo enzimático altera para a fuga a promotores;
• A fuga a promotores necessita de rearranjos no fator sigma – uma parte do fator sigma
vai ocupar o canal de saída do RNA.
• Este domínio necessita que ocorra a síntese de RNA deslocada.
55
Rocha. H
Terminação da Transcrição de RNA
A RNA Polimerase Bacteriana termina em zonas discretas

Duas classes de terminadores foram identificadas:
• Aqueles reconhecidos apenas pela RNA Polimerase sem ser necessário nenhuns fatores
celulares são denominados de terminadores intrínsecos.
• Outros necessitam de uma proteína chamada rho e são, então, referidos como termina-
dores dependentes de rho (rho-dependent terminators).
Um terminador intrínseco necessita do reconhecimento de uma sequência terminadora no

DNA que codifica um produto de RNA em forma de gancho de cabelo.
Os sinais para a terminação residem principalmente em sequências já transcritas pela
RNA polimerase e, assim, a terminação depende da análise do modelo e/ou do produto de RNA
que a polimerase está a transcrever.
Uma vez que a RNA Polimerase tenha começado a transcrição, a enzima move-se ao
longo da cadeia modelo, sintetizando RNA. Como visto antes, a RNA Polimerase pode parar,
prender ou mesmo recuar, o que pode levar à terminação. A enzima para de adicionar nucleótidos
à cadeia de RNA que está a ser formada, libertando um produto completo e dissociando-se da
cadeia de DNA (quando se localiza numa sequência terminadora ou quando está numa pausa
prolongada).
A terminação requer que todas as ligações de hidrogénio que ligam o híbrido de RNA-
DNA sejam quebradas e que, de seguida, a dupla estrutura de DNA se volte a formar.
As figuras seguintes resumem as duas características principais encontradas nos termi-
nadores intrínsecos.
Em primeiro lugar, os terminadores intrínsecos – isto é, aqueles que não precisam de um
56
Rocha. H
fator rho auxiliar – necessitam de um gancho rico em G+C para formar uma estrutura secundária
no RNA que está a ser transcrito. Assim, a terminação depende do produto de RNA e não é
determinada simplesmente pela sequência de DNA durante a transcrição.
A segunda característica é uma série de até 7 resíduos de uracilo (resíduos de timina no
DNA a seguir ao caule do gancho, mas que precedem a atual posição de terminação.
Aproximadamente metade dos transcritos de E. coli são terminados através do uso de
terminadores intrínsecos.
Porém, os terminadores variam demasiado na sua eficiência:
• Readthrough transcripts (transcritos de leitura) – refere-se à fração de transcritos que
não são parados por um terminador.
• Antiterminação – refere-se a uma situação onde a terminação pode ser evitada por fato-
res auxiliares específicos que interagem com o RNA ou com a RNA Polimerase.
Passemos agora aos terminadores dependentes de Rho.

O fator Rho é uma proteína de terminação que se liga ao RNA nascente e segue junto
com o RNA para interagir com a RNA Polimerase e libertá-la do complexo de elongação. A figura
seguinte mostra um modelo da função de Rho.
57
Rocha. H
Primeiro, o Rho liga-se a uma sequência na transcrição a montante da zona de terminação,

sendo esta sequência denominada de zona rut (rho utilization). De seguida, o fator rho segue
com o RNA até encontrar uma RNA Polimerase e, quando a enzima chega à zona de terminação,
o fator rho, primeiramente, para a estrutura da polimerase e, depois, invade o canal de saída para
desestabilizar a enzima, provocando a saída do RNA.
Ao parar a polimerase na zona de terminação, é dado tempo ao fator rho para se translocar
para a parte híbrida, sendo esta uma importante característica da terminação.
O Rho é um membro da família das helicases hexaméricas dependentes de ATP. Cada

subunidade tem um domínio que se liga a RNA e um domínio que hidrolisa ATP. O hexâmero
funciona ao passar ácidos nucleicos por um buraco no meio da estrutura formada a partir dos
domínios de ligação ao RNA pertencentes às subunidades, tal como se pode ver na figura seguinte.
A estrutura do Rho dá algumas ideias de como ele funciona. Ele enrola RNA desde a
extremidade 3’ à volta do exterior dos domínios N-terminais e empurra a extremidade 5’ para a
região de fronteira interior, onde está ligado por um domínio secundário de RNA-Ligado em do-
mínios de terminais-C.
Podem ser formados complexos de Anti-terminação que inibem a ação do Rho.
58
Rocha. H
Anti-Terminação pode ser um Evento de Regulação
Um complexo de anti-terminação permite que a RNA Polimerase leia através de termi-

nadores.
A anti-terminação é usada como um mecanismo de controlo da transcrição tanto nos ope-
rões dos fagos como nos bacterianos.
Como mostrado na figura, a anti-terminação refere-se a uma modificação na enzima, o

que permite a leitura através de um terminador e dos genes que se encontram a jusante.
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Rocha. H
Competição por Fatores Sigma
A Competição por Fatores Sigma pode regular a Iniciação

E. coli tem 7 fatores sigma e cada um faz com que a RNA Polimerase inicie num conjunto
de promotores definidos por sequências -35 e -10 específicas.
As atividades dos diferentes fatores sigma são reguladas por diferentes mecanismos.
A divisão do trabalho entre o núcleo enzimático para a elongação da cadeia e o fator
sigma responsável pela seleção do promotor, levantou a questão se haveria mais do que um tipo
de fator sigma, cada um específico para um conjunto diferente de promotores.
A figura mostra o princípio de um sistema no qual a substituição de um fator sigma muda

a escolha do promotor. E. coli frequentemente usa fatores sigma alternativos para responder a
alterações nas condições ambientais e nutricionais.
O fator sigma mais abundante, responsável pela transcrição de maior parte dos genes sob
condições normais, é o σ70. Outros fatores sigma adicionais, são induzidos por certas condições
específicas, tal como a tabela indica.
60
Rocha. H
Fatores Sigma podem ser organizados em Cascadas
Uma cascada de fatores sigma é criada quando um fator é necessário para transcrever o
gene que codifica o próximo fator sigma. Os primeiros genes do fago SPO1 são transcritos pela
RNA Polimerase.
Um dos primeiros genes codifica o fator sigma que faz com que a RNA Polimerase trans-
creva os genes do meio. Dois dos genes do meio codificam subunidades de um fator sigma que
fazem com que a RNA Polimerase transcreva os últimos genes.
61
Rocha. H
Transcrição em Eucariotas – Teórica 9
Introdução
A cromatina necessita de ser aberta antes que a RNA Polimerase se ligue ao promotor.
A iniciação da transcrição num modelo de cromatina que já foi aberto, necessita que a
enzima RNA Polimerase se ligue ao promotor e que os fatores de transcrição se liguem a intensi-
ficadores/melhoradores (enhancers).
Diversos fatores de transcrição atuam ao reconhecerem zonas de ação-cis no DNA. Po-
dem também reconhecer outro fator, reconhecer a RNA Polimerase ou serem incorporados no
complexo de iniciação na presença de outras proteínas.
Uma diferença significativa entre a transcrição nos eucariotas e nos procariotas é que, nas
bactérias, a transcrição dá-se num modelo de DNA, enquanto que nos eucariotas toma lugar na
cromatina.
A cromatina muda tudo e deve ser tomada em conta em todos os passos. Esta deve estar
numa estrutura aberta e, mesmo estando aberta, os octâmeros nucleossómicos devem ser movidos
ou removidos das sequências dos promotores antes que os fatores de transcrição ou a RNA Poli-
merase se liguem.
Uma segunda grande diferença é que a RNA Polimerase bacteriana, junto com o fator
sigma, conseguem ler uma sequência de DNA para encontrar e se ligar ao promotor. Já a RNA
Polimerase eucariota não consegue ler DNA. A iniciação em promotores eucarióticos envolve
um vasto número de fatores que se devem ligar previamente a uma variedade de elementos de
ação-cis e a outros fatores já ligados ao DNA, antes que a RNA Polimerase se ligue – estes fatores
chamam-se de fatores de transcrição basal.
A RNA Polimerase liga-se, então, a este complexo de fator de transcrição basal – DNA.
Esta região de ligação é definida como núcleo do promotor, região esta que contém todas
as zonas necessárias à ligação da RNA Polimerase para esta se ligar e funcionar.
A própria RNA Polimerase liga-se à volta do start point da transcrição, mas não contacta
diretamente com a região a montante do promotor.
Ao contrário das bactérias que têm uma única RNA Polimerase que transcreve as três
classes principais de genes, a transcrição em células eucarióticas é dividida em três classes, sendo
cada classe transcrita por uma RNA Polimerase diferente.
62
Rocha. H
Os fatores de transcrição basais são precisos para a iniciação, mas muitos não são neces-
sários posteriormente. Para as três RNA Polimerases eucarióticas, os fatores de transcrição são
responsáveis pelo reconhecimento da sequência promotora, em vez da própria RNA Polimerase.
Para todas as RNA Polimerases eucarióticas, os fatores de transcrição basal criam uma
estrutura no promotor para fornecer o alvo que é reconhecido pela RNA Polimerase.
Para as RNA Polimerases I e III, estes fatores são relativamente simples, mas para a
RNA Polimerase II eles formam um grupo considerável.
Os fator basais juntam-se à RNA Polimerase II para formar um complexo que envolve o
start point e eles determinam a zona de iniciação. Os fatores basais, junto com a RNA Polimerase,
constituem o Aparelho de Transcrição Basal.
Os promotores da RNA Polimerase I e II encontram-se (maior parte) a montante do start
point, mas um vasto número de promotores para a RNA Polimerase III, encontram-se a jusante
(junto da unidade de transcrição) do start point. Cada promotor contém conjuntos característicos
de pequenas consequências conservadas que são reconhecidas pela classe apropriada de fatores
de transcrição basais.
As RNA Polimerases I e III cada uma reconhece um conjunto restrito de promotores e
assim baseiam-se num menor número de fatores acessórios.
Os promotores utilizados pela RNA Polimerase II mostram uma maior variação na se-
quência e têm uma organização modular. Todos os promotores da RNA Polimerase II têm ele-
mentos de sequência perto do start point da transcrição que estão ligados pelo aparelho basal e
pela polimerase para estabelecer a zona de iniciação.
Outras sequências mais a montante ou mais a jusante, chamadas de sequências de me-
lhoramento, determinam se um promotor é expresso e, se for expresso, determinam se tal ocorre
em todos os tipos de células ou num tipo de célula específico.
As sequências de melhoramento são um segundo tipo de zona envolvida na transcrição e
é identificada por sequências que estimulam a iniciação. Os elementos de melhoramento são mui-
tas vezes alvos para regulação temporal.
Algumas sequências de melhoramento ligam fatores de transcrição que funcionam por
interações de curto alcance e que estão localizados perto do promotor, enquanto outros podem ser
63
Rocha. H
localizados a milhares de pares de bases de distância. A figura seguinte demonstra as propriedades

gerais de promotores e de enhancers.
Uma zona reguladora que liga mais reguladores negativos do que positivos para controlar
a transcrição chama-se silencer (silenciador). Tal como pode ser visto na figura, promotores e
enhancers são sequências que ligam uma variedade de proteínas que controlam a transcrição.
Os Enhancers, tal como os promotores, podem também ligar a RNA Polimerase e iniciar
a transcrição de um RNA, denominado enhancer RNA (eRNA). Estes eRNAs podem promover
interações entre o enhancer e o promotor por looping de DNA, muitas vezes por intermediários
chamados coativadores.
Os componentes de um enhancer ou de um silencer assemelham-se aos de um promotor
na medida em que consistem de uma variedade de elementos modulares que podem ligar regula-
dores positivos ou reguladores negativos num conjunto bem organizado.
Por outro lado, os enhancers (melhoradores) não necessitam de estar perto do promotor.
Eles podem estar a montante, dentro do gene ou para além do fim do gene e a sua orientação,
relativamente ao gene, não interessa.
Os promotores que são constitutivamente expressos e necessários em todas as células (por
vezes os seus genes são chamados de genes domésticos) têm sequências de elementos a montante
que são reconhecidas por ativadores omnipresentes.
Nenhuma combinação fator/elemento é um componente essencial do promotor, o que su-
gere que a iniciação pela RNA Polimerase II possa ser regulada de várias formas.
Os promotores que são expressos apenas em certos períodos ou locais têm elementos
sequenciais que necessitam de ativadores que apenas estão disponíveis nesses locais ou períodos.
Devido à cromatina ser, em geral, um regulador negativo, a transcrição eucariótica está
muitas vezes sobre regulação positiva. Um fator de transcrição é fornecido sob controlo específico
64
Rocha. H
dos tecidos para ativar um promotor ou um conjunto de promotores que contêm uma sequência
alvo comum. Este é um processo em várias etapas:
1. Abrir a cromatina e ligação dos fatores de transcrição basal;
2. Ligação da RNA Polimerase.
Uma unidade de transcrição eucariótica, geralmente, contém um único gene e a termina-
ção ocorre para além do fim da região codificante. A terminação carece da importância regulatória
que se aplica em sistemas procarióticos.
A RNA Polimerase I e III terminam em sequências discretas em reações definidas,
mas o modo de terminação da RNA Polimerase II ainda não é clarificado.
Contudo, o acontecimento importante em criar a extremidade 3’ de um mRNA não é o
evento de terminação em si, mas sim a reação de clivagem no transcrito primário.
65
Rocha. H
RNA Polimerases dos Eucariotas consistem em várias Subunidades
• A RNA Polimerase I sintetiza rRNA no nucléolo.

• A RNA Polimerase II sintetiza mRNA no nucleoplasma.
• A RNA Polimerase III sintetiza pequenos RNAs no nucleoplasma.
Todas as RNA Polimerases eucarióticas têm cerca de 12 subunidades e cerca de 500 kDa.
Algumas subunidades são comuns às três RNA Polimerases.
A maior subunidade na RNA Polimerase II tem um domínio carboxi-terminal (CTD)
que consiste em múltiplas repetições de uma sequência heptamérica.
As três RNA Polimerases eucarióticas têm diferentes localizações no núcleo, o que cor-
responde aos diferentes genes que elas transcrevem.
Na figura seguinte, pode-se observar a constituição geral de uma RNA Polimerase II eu-
cariótica.
As duas subunidades maiores são homólogas às subunidades β e β’ da RNA Polimerase

Bacteriana. Três das restantes subunidades são comuns aos três tipos de RNA Polimerase. Note-
se que não existe nenhuma subunidade relacionada com o fator sigma bacteriano, pois a sua
função está contida nos fatores de transcrição basal.
A maior subunidade na RNA Polimerase II tem um domínio carboxi-terminal (CTD),
que consiste em múltiplas repetições de sequências de consenso de 7 aminoácidos. Esta sequência
é única da RNA Polimerase II.
O número destas repetições é importante, porque deleções que removem mais do que
metade destas repetições são letais.
O CTD pode ser altamente fosforilado em resíduos de serina ou treonina e também está
envolvido na regulação das reações de iniciação (através destes padrões de fosforilação), da
66
Rocha. H
elongação da transcrição e em todos os aspetos do processamento do mRNA, mesmo a exportação

deste para o citoplasma.
67
Rocha. H
RNA Polimerase I tem um Promotor Bipartido
• O Promotor da RNA Polimerase I consiste num núcleo do promotor e um elemento de

promotor a montante (UPE).
• O Fator UBF1 envolve o DNA por volta da estrutura da proteína para aproximar o núcleo
e o UPE.
• SL1 inclui o fator TBP (TATA-binding protein) que está envolvido na iniciação por todas
as três RNA Polimerases.
• A RNA Polimerase I liga-se ao complexo UBF1-SL1 no núcleo do promotor.
A RNA Polimerase I transcreve apenas os genes para RNA ribossomal a partir de um

único tipo de promotor numa região especial do núcleo chamada nucléolo.
O precursor transcrito inclui as sequências tanto de 28S como de pequenos rRNAs 18S,
que são mais tarde processado por clivagens e modificações.
A organização de um promotor e os eventos envolvidos na iniciação estão ilustrados na
figura seguinte.
A RNA Polimerase I existe como uma holoenzima que contém fatores adicionais neces-
sários para a iniciação e é recrutada pelos fatores de transcrição diretamente, como um complexo
gigante, para o promotor.
A eficiência do núcleo do promotor é bastante aumentada pelo upstream promoter ele-
mento, UPE. Esta RNA Polimerase necessita de dois fatores de transcrição auxiliares para reco-
nhecer a sequência do promotor.
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Rocha. H
O fator que se liga ao núcleo do promotor é o SL1, que consiste em 4 subunidades pro-
teicas. Dois dos componentes do SL1 são a TATA-binding protein (TBP), um fator que também
é necessário para a iniciação pelas outras duas RNA Polimerases, e um segundo componente que
é homólogo ao fator TFIIB da RNA Polimerase II.
Basicamente, SL1 permite que a RNA Polimerase I seja iniciada a partir do promotor a
uma frequência basal baixa.
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Rocha. H
RNA Polimerase III usa Promotores a Jusante e a Montante
• A RNA Polimerase III utiliza dois tipos de promotores.

• Promotores internos têm pequenas sequências de consenso localizadas dentro da unidade
de transcrição e fazem com que ocorra a iniciação a uma distância fixa a montante.
• Os Promotores a montante contêm três sequências de consenso pequenas a montante do
start point que são ligadas por fatores de transcrição.
• TFIIIA e TFIIIC ligam-se às sequências de consenso e permitem que TFIIIB se ligue ao
start point.
• TFIIIB tem TBP como uma subunidade o que permite que a RNA Polimerase se ligue.
Os promotores desta RNA Polimerase podem-se dividir em três classes gerais que são
reconhecidos de maneiras diferentes por diferentes grupos ou fatores.
Os promotores das classes I e II, 5S e genes tRNA são internos e encontram-se a jusante
do start point. Os promotores para genes de snRNA de classe III encontram-se a montante do start
point.
Tanto nos promotores internos como nos externos, os elementos individuais necessários
para a função do promotor consistem, exclusivamente, de sequências reconhecidas por fatores de
transcrição, que, por sua vez, direcionam a ligação da RNA Polimerase.
A estrutura dos três tipos de promotores da RNA Polimerase III encontra-se sumarizada
na figura seguinte.
Dois dos tipos de promotores são promotores internos e, cada um, contém uma estrutura
bipartida, onde duas sequências de consenso estão separadas por uma sequência variável.
As interações detalhadas são diferentes nos dois tipos de promotores internos, mas o prin-
cípio é o mesmo.
O TFIIIC liga-se a jusante do start point, quer seja independentemente (apenas nos pro-
motores de tipo 2 de tRNA) ou em conjunção com TFIIIA (nos promotores de tipo 1 de 5S). A
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Rocha. H
presença de TFIIIC permite que o fator de posicionamente TFIIIB se ligue ao start point e, deste
modo, a RNA Polimerase III é recrutada.
A figura seguinte sumariza as várias fases da reação num promotor interno de tipo 2 usado
para genes de tRNA. A distância entre a boxA e a boxB pode variar porque vários genes de tRNA
contêm um pequeno intrão. TFIIIC liga-se a ambos boxA e boxB, o que vai permitir que TFIIIB se
ligue ao start point. A partir deste ponto, a RNA Polimerase III pode-se ligar.
A diferença em promotores internos do tipo 1 é que TFIIIA se deve ligar à boxA para
permitir que TFIIIC se ligue à boxC. O TFIIIA é um fator de ligação específico da sequência 5S
que se liga ao promotor e ao RNA 5S como um chaperone e regulador génico.
A figura seguinte, mostra, então, que , uma vez que TFIIIC se tenha ligado, os eventos
decorrem o mesmo percurso que os promotores de tipo 2, com TFIIIB (que contém a TBP omni-
presente) a ligar-se ao start point e, posteriormente, a RNA Polimerase III a juntar-se ao com-
plexo.
Os promotores do tipo 1 são encontrados apenas em genes de 5S rRNA.
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Rocha. H
Diz-se, assim, que TFIIIA e TFIIIC são fatores de montagem (assembly factors) cuja
função é assistir a ligação do fator de posicionamento TFIIIB na localização correta.
Uma vez que TFIIIB se tenha ligado, estes dois fatores podem ser removidos do promotor
sem afetar a reação de iniciação.
No entanto, TFIIIB mantém-se ligado nos arredores do start point e a sua presença é o
suficiente para permitir que a RNA Polimerase III identifique e se ligue ao start point.
Assim, TFIIIB é o único fator de iniciação verdadeiramente necessário pela RNA Polime-
rase III.
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Rocha. H
O Start Point para a RNA Polimerase II
• A RNA Polimerase II necessita de fatores de transcrição gerais para iniciar a transcrição

(TFIIX).
• Os promotores da RNA Polimerase II frequentemente têm uma pequena sequência de
consenso no start point, Py2CAPy5 – o iniciador, Inr.
• A TATA box é um componente comum dos promotores da RNA Polimerase II, consiste
num octâmero rico em A-T localizado a aproximadamente 25 bp a montante do start point.
• O elemento promotor a jusante (DPE) é um componente comum dos promotores da
RNA Polimerase II que não contém a TATA box.
• Os núcleos dos promotores da RNA Polimerase II incluem o iniciador e, comummente,
ou uma TATA box ou um DPE. Também podem conter outros elementos menores.
A figura seguinte mostra a construção do núcleo de um promotor típico da Polimerase II

com três dos elementos mais comuns desta polimerase. Contudo, o promotor da RNA Polimerase
II eucariótica é muita mais diverso estruturalmente do que o promotor bacteriano e os promotores
das RNA Polimerases I e III. Para além dos três elementos principais, um númeor de elementos
menor pode também servir para definir o promotor.
O start point não tem uma extensa homologia de sequência, mas existe uma tendência
para a primeira base do mRNA ser uma adenina, flanqueado de ambos os lados por pirimidinas.
Esta região é chamada de iniciador (Inr) e pode ser descrita na forma geral de Py2CAPy5 onde
Py significa qualquer pirimidina. O iniciador está contido entre as posições -3 e +5.
Muitos promotores têm uma sequência denominada TATA box, normalmente localizada
aproximadamente a 25 bp a montante do start point em eucariotas avançados. Os promotores que
não contêm o elemento TATA são chamados de TATA-less promoters. Cerca de mais de 50%
dos promotores não são TATA-Less. Quando um promotor não contém a TATA box, normal-
mente contém outro elemento, o elemento promotor a jusante (DPE) que está localizado de +28
a +32, dentro da unidade de transcrição.
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Rocha. H
TBP é um Fator Universal
• A TATA-binding protein (TBP) é um componente do fator de posicionamento que é ne-

cessário para que cada tipo de RNA Polimerase se ligue ao promotor.
• O fator para a RNA Polimerase II é o TFIID, que consiste em TBP e cerca de 14 fatores
associados a TBP (TAFs), com uma massa total de 800 kDa.
• TBP liga-se à TATA box no sulco menor do DNA.
• TBP forma uma sela à volta do DNA e liga-o por aproximadente 80º.
Cada classe de RNA Polimerase é assistida por um fator de posicionamento que contém
TBP associado com outros componentes.
É de recordar que TBP significa TATA-binding protein, que foi assim denominada por
ser uma proteína que se ligava à TATA box nos genes da RNA Polimerase II.
Mais tarde foi descoberto que também fazia parte do fator de posicionamento SL1 para a
RNA Polimerase I e do TFIIIB para a RNA Polimerase III. Para estas duas últimas polimerases,
TBP não reconhece a sequência da TATA box (à exceção dos promotores do tipo 3 da polimerase
III), sendo o nome enganador.
Para além disso, muitos promotores de RNA Polimerase II carecem de TATA boxes, mas
ainda necessitam da presença de TBP.
Para a RNA Polimerase II, o fator de posicionamento é TFIID, que consiste em TBP
associada com 14 subunidades denominadas TAFs (fatores associados a TBP).
A figura seguinte mostra que o fator de posicionamento reconhece o promotor de uma
maneira diferente em cada caso. Nos promotor para a RNA Polimerase III, TFIIIB liga-se adja-
cente a TFIIIC.
Nos promotores para a RNA Polimerase I, SL1 liga-se em conjunção com UBF.
Já TFIID é unicamente responsável pelo reconhecimento dos promotores da RNA Poli-
merase II. Para um promotor que contém um elemento TATA, TBP liga-se especificamente à
TATA box, mas nos promotores que não contém este elemento, os TAFs têm a função de reco-
nhecer outros elementos do promotor como o iniciador e o DPE.
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Rocha. H
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Rocha. H
O Aparelho Basal forma-se no Promotor
• Os elementos a montante e os fatores que se ligam a eles aumentam a frequência da ini-

ciação.
• Ligação do TFIID à TATA box ou ao Inr é o primeiro passo da iniciação.
• Outros fatores de transcrição ligam-se ao complexo numa ordem definida, estendendo o
comprimento da região protegida do DNA.
• Quando a RNA Polimerase II se liga ao complexo, ela pode iniciar a transcrição.
O processo de iniciação necessita que os fatores de transcrição basal atuem numa ordem
definida para construir um complexo ao qual se juntará a RNA Polimerase. A série de eventos
que ocorre está sumarizada na figura seguinte.
É importante relembrar que os promotores da RNA Polimerase II são estruturalmente
bastante diversos. Uma vez que a polimerase se liga, a sua atividade é, então, controlada pelos
fatores de transcrição que reforçam a ligação.
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Rocha. H
A Iniciação é seguida pela Libertação e Elongação do Promotor.
• TFIIB, TFIIE e TFIIH são necessários para desnaturar DNA, permitindo o movimento da
polimerase.
• A fosforilação do Domínio carboxi-terminal (CTD) é necessária para que a libertação do
promotor e elongação comecem.
• Uma posterior fosforilação do CTD é necessária em alguns promotores para evitar pausas
e iniciações abortivas.
• Os octâmeros de histonas devem ser temporariamente modificados durante o movimento
da RNA Polimerase.
• O CTD coordena o processamento do RNA com a transcrição.
• Os genes transcritos são preferencialmente reparados quando ocorrem danos no DNA.
• TFIIH fornece a ligação para um complexo de reparação de enzimas.
A desnaturação do promotor é necessária para começar o processo de transcrição. TFIIH

é necessária para a formação do complexo aberto em conjunção com a hidrólise de ATP, forne-
cendo stress para a desnaturação. Alguns passos finais são necessários para libertar a RNA Poli-
merase do promotor uma vez formada a primeira ligação entre nucleótidos.
A libertação de promotores é o passo chave regulado em eucariotas para determinar se
um gene equilibrado ou um gene ativo serão transcritos. Este passo é controlado pelos enhancers.
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Rocha. H
RNA Splicing e Processamento – Teórica 10
Introdução
Todos os RNAs estudados são transcritos dos seus genes respetivos e necessitam de pos-
terior processamento para se tornarem maduros e funcionais.
A discrepância entre a organização interrompida do gene e a organização ininterrupta do
mRNA necessita do processamento do produto de transcrição primário.
O Transcrito primário tem a mesma organização que o gene e, por isso, chama-se pré-
mRNA.
A remoção dos intrões é o papel principal do processamento dos RNAs em todos os eu-
cariotas. O processo pelo qual os intrões são removidos é denominado de RNA splicing.
O processo de splicing ocorre no núcleo, junto das outras modificações que são feitas aos
novos RNAs sintetizados.
O pré-mRNA eucariótico é covalentemente processado por três formas, a seguir à sua

exportação do núcleo:
1. Transcritos são limitados na extremidade 5’ com um nucleótido de guanosina
metilado;
2. Os intrões são removidos por splicing;
3. As extremidades 3’ são clivadas e extendidas com uma cauda de poliadeninas.
Os três eventos do processamento estão intimamente ligados com a transcrição e neces-
sitam de um CTD da RNA Polimerase II.
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Rocha. H
Capping – Adição da 5’-7-metilguanosina
O processo de capping é a adição do 5’-cap ao pré-mRNA. Mas o que é o 5’-cap?

O 5’-cap é uma 7-metilguanosina adicionada à extremidade 5’ do pré-mRNA durante a
iniciação da transcrição (o transcrito emerge da Polimerase II e a cap é adicionada por um com-
plexo de proteínas – Capping enzyme complex, CEC).
Quando a transcrição começa e o RNA emergente tem cerca de 22-40 bases de compri-
mento, o cap é adicionado por uma sequência de passos mediados por enzimas.
Após a modificação, um complexo de proteínas – o CBC (Cap binding complex) liga-

se ao cap do pré-mRNA. A natureza química do cap torna a extremidade 5’ inacessível às exori-
bonucleases-5’ e a atividades decapping específicas, prevenindo a sua degradação. Para além
disso, CBC é uma das chaves para a exportação nuclear e, no citoplasma, promove a iniciação
da translação.
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Rocha. H
Splicing – as zonas de junção nuclear são sequências pequenas
Nos eucariotas, principalmente nos mais desenvolvidos, os genes codificantes de proteí-

nas têm intrões. Contudo, as proteínas são, na sua maioria, codificadas por exões.
As células têm um mecanismo que permite a excisão dos intrões e ligação dos exões de
um pré-mRNA, processo este denominado por splicing.
Resumidamente, splicing é o processo pelo qual intrões, as regiões de genes não codifi-
cantes, são excisadas do transcrito primário de RNA mensageiro e os exões, isto é, as regiões
codificantes, são unidas para criar um RNA mensageiro maduro. Embora os intrões sejam, nor-
malmente, excluídos do pré-mRNA, eles não são lixo!
Os intrões contêm sequências reguladoras que podem codificar outros ncRNAs ou podem,
eles próprios, constituir um ncRNA com funções celulares, especialmente regulação da expressão
génica.
Nos eucariotas mais desenvolvidos e nas plantas, o splicing é, recorrentemente, alterna-

tivo: O splicing alternativo é o processo celular pelo qual exões do mesmo gene são unidos em
diferentes combinações, o que leva a diferentes (mas relacionados) transcritos de mRNA. Estes
mRNAs podem ser traduzidos para produzir diferentes proteínas com diferentes estruturas e fun-
ções – todas a partir do mesmo gene.
O splicing alternativo é um dos principais motores da expansão da diversidade do prote-
oma e é extremamente essencial para alguns processos biológicos como diferenciação de tecido
e ao longo do desenvolvimento.
• Os Splice Sites são sequências que rodeiam imediatamente as fronteiras exão-intrão. Eles
são nomeados de acordo com as posições relativas ao intrão.
• O 5’Splice Site na extremidade 5’ (esquerda) do intrão, inclui a sequência de consenso
GU.
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Rocha. H
• O 3’Splice Site na extremidade 3’ (Direita) do intrão, inclui a sequência de consenso AG.

• A regra GU-AG descreve a necessidade constante destes dinucleótidos nas primeiras e
últimas duas posições dos intrões nos pré-mRNAs.
O splicing alternativo pode ocorrer de diversas formas:
Desta forma, os exões podem-se classificar como constitutivos, se forem sempre incluí-
dos no mRNA, ou como alternativos, caso não sejam sempre incluídos no mRNA.
Mas, como é que os intrões ou os conjuntos intrão/exão/intrão (Splicing Alternativo) são
excisados do pré-mRNA?
Primeiramente, os elementos acabados de referir devem ser reconhecidos como elemen-
tos a serem excisados, enquanto que os exões devem ser mantidos no mRNA. Para além disso,
a remoção de um segmento do pré-mRNA e a junção dos exões tem de ocorrer.
1. As sequências de nucleótidos dos Splicing Sites e o Branchpoint/ Ponto de ancoragem
(dentro do intrão) são importante para as reações químicas que devem ocorrer – transes-
terificação.
2. A catálise das reações requer o spliceossoma (um enorme complexo de RNA-proteínas
que promove a dobragem no splicing e a reação de remoção)
O aparelho de splicing contém 5 diferentes RNAs e mais de 200 proteínas adicionais. Os

principais componentes do spliceossoma são cinco complexos de RNA-proteína denominados
snRNPs, isto é, small nuclear ribonucleoprotein particles. Estes snRNPs designam-se por U1,
U2, U4, U5 e U6.
A composição do spliceossoma é altamente dinâmica, pois este altera-se ao longo de
todo o processo de splicing – Ciclo do Spliceossoma:
1. U1 liga-se à extremidade 5’ do Splice Site – complexo E;
2. U2 liga-se ao Branchpoint, formando, assim, o préspliceossoma – complexo A;
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Rocha. H
3. Ligação do tri-snRNP previamente formado ao complexo A – complexo B;

i. As interações entre os pares de base de U6 e U4 são quebradas e U6 vai-
se ligar a U2 e também à extremidade 5’ do intrão, substituindo U1.
4. Assim, o spliceossoma está completamente montado, mas ainda é pré-catalítico;
5. O complexo C, ou o spliceossoma catalítico, forma-se por remodelações dos snRNPs e
há a libertação de U1 e U4.
6. De seguida, ocorre o primeiro passo de transesterificação, onde a extremidade 5’ do
Splice Site é clivada, forma-se o Lariat e os intrões são libertados;
7. E por último, ocorre o segundo passo de transesterificação, onde a extremidade 3’ do SS
é clivada e os exões são unidos.
Após estes processos, os elementos do spliceossoma são “reciclados” e alguns intrões

são degradados, enquanto outros são processados para se tornarem ncRNAs com funções celula-
res.
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Rocha. H
Aspetos Gerais da Regulação
Para ser incluído no mRNA, o pré-spliceossoma precisa de se formar à volta de exões

constitutivos e alternativos.
A formação do pré-spliceossoma à volta de exões alternativos é um processo altamente
regulado e afetado por:
• Força dos Splice Sites;
• O tipo de sequências dos enhancers e dos silencers;
• Disponibilidade de ativadores e repressores;
A figura seguinte demonstra que elementos de RNA são reconhecidos em exões e intrões
perto do Splice Site alternativo e exercem uma influência positiva ou negativa na seleção do splice
site alternativo.
Estas proteínas ativadoras ou repressoras recrutam, especificamente, intervientes de spli-

cing para promover ou inibir o reconhecimento de splice sites próximos, respetivamente.
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Rocha. H
Terminação e Poliadenilação
A terminação da transcrição, na maioria dos genes, ocorre em várias posições e não numa
única zona e nenhuma sequência consenso de terminação foi identificada.
A maioria das extremidades 3’ dos mRNAs são produzidas pela clivagem do pré-mRNA
entre AAUAAA conservado e elementos de sequência ricos em G/U.
As regiões são reconhecidas pelos fatores específicos de clivagem e poliadenilação
(CPSF) e pelo fator estimulante da clivagem (CstF), respetivamente.
1. Os Fatores de Clivagem reconhecem e ligam-se ao PAS (Poli(A) Site) e às sequências
ricas em GU;
2. A interação dos dois fatores de clivagem desencadeia a clivagem do pré-mRNA pela
subunidade com atividade de endonuclease do CPSF.
3. O CPSF aumenta a afinidade de uma poliadenilato polimerase (PAP) ao RNA, que
adiciona várias adenosinas à extremidade 3’ do pré-mRNA.
4. As Poli(A)-binding proteins (PABP) ligam-se às oligoadenosinas e aumentam a proces-
sividade da PAP, que irá adicionar uma cauda de 100-250 adenosinas.
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Rocha. H
A terminação pode ocorrer por:

5. Uma exonuclease liga-se à extremidade 5’do transcrito emergente, cliva o RNA e final-
mente interagem com a Polimerase II, levando à terminação.
6. Ou, a transcrição de Poli(A)-Sites desencadeia alterações conformacionais na elongação
do complexo que desalojam a Polimerase II.
A cauda de poliadenosinas protege o mRNA da degradação e o CBC (cap binding com-

plex) e as PABPs (poli(A)-binding proteins) permanecem associadas aos mRNAs até que eles
sejam exportados para o citoplasma. Quando chegam ao citoplasma, estes são substituídos.
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Rocha. H
Processamento e Modificação de RNA (Parte 2) – Teórica 11
Trans-Splicing
Como sugerido pelo nome, envolve o splicing de duas moléculas de pré-mRNA diferentes
e é frequentemente encontrado em tripanossomas.
Na maioria dos pré-mRNAs, os exões são unidos apenas dentro de um pré-mRNA indi-
vidual. No entanto, em casos raros, um exão de um pré-mRNA pode unir-se a um exão de outro
pré-mRNA num processo denominado trans-splicing.
Edição/Modificação do RNA – RNA editing
É o processo molecular através do qual algumas células conseguem fazer alterações dis-
cretas a sequências específicas de nucleótidos contidas no RNA após a transcrição.
Para além disso, é um processo mediado por proteínas, principalmente deaminases, que
atuam nos tRNAs, mRNAs e em pequenos RNAs.
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Rocha. H
Maturação do pré-mRNA
Primeiramente, é necessário relembrar que os ribossomas são constituídos por diferentes

rRNAs e proteínas. Os rRNAs maduros necessitam de processamento do pré-mRNA e de modi-
ficações químicas.
O processamento e a modificação são, também, cotranscricionais.
Focando-nos, primeiro, no processamento e na modificação do rRNA, em bactérias, os

três genes de rRNAs estão organizados em operões e, normalmente, esse operão também codifica,
pelo menos, um tRNA.
Todos estes genes são transcritos juntos na mesma molécula de pré-rRNA (transcrito pri-
mário).
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Rocha. H
As zonas ETS/ITS correspondem às zonas UTR (zonas não codificantes do mRNA) e,

por isso, são removidas com uma exonuclease e com uma endonuclease, respetivamente, pois
estas enzimas cortam no meio e nas pontas.
De seguida, juntam-se as proteínas S ou L e ocorrem modificações químicas mediadas
por proteínas. Existem então três tipos de modificações que podem ocorrer:
1. Metilação da base;
2. Metilação da Ribose (2’-OH);
3. Pseudouridilação – isomerase que transforma uridina em pseudouridina.
Agora, nos eucariotas, os pré-rRNAs são transcritos por diferentes RNA polimerases.
Relativamente ao pré-rRNA produzido pela RNA Polimerase III, o 5S rRNA é codificado

e transcrito por esta enzima e pouco ou nenhum processamento e modificação são necessários.
Já os três rRNAs (18S, 5.8S e 28S) que são codificados pelo mesmo gene e são transcritos
pela RNA Polimerase I no mesmo pré-rRNA, necessitam de processamento e modificação para
se tornarem rRNAs maduros.
1. Clivagem guiada por um complexo de snoRNP (snoRNA + proteínas);
2. Corte das extremidades 5’ e 3’ por diferentes endonucleases e exonucleases, ob-
tendo-se, assim, os rRNA maduros;
3. Ocorrem as diferentes modificações químicas tal como nas bactérias.
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Rocha. H
Nos processos de modificação química, os snoRNAs dos complexos snoRNP têm regiões
que são complementares às regiões de pré-rRNA. Eles fazem par com essas regiões e controlam
a atividade da modificação das enzimas incluídas no complexo snoRNP.
Com isto, sabe-se que os rRNAs maduros (transcritos pela Polimerase I), mais o rRNA
5S (transcrito pela Polimerase III), junto das proteínas S e L (produto da RNA Polimerase II)
formam o ribossoma.
Maturação do pré-tRNA em tRNA
É necessário relembrar a estrutura de um tRNA, principalmente, que estes apresentam

uma estrutura secundária em forma de “trevo”, isto é, têm regiões de cadeia dupla alternadas com
cadeias simples.
Como é possível visualizar na imagem, a forma de trevo é devido à existência de três
loops, sendo que um deles contém um anticodão. Para além disso, o tRNA tem um braço acei-
tador, isto é, a extremidade 3’ acaba sempre em CCA, pois este braço vai transportar o aminoá-
cido. Mas nem todos os genes codificam para este terminal CCA, ou seja, nem todos os tRNAs
vão ser capazes de transportar aminoácidos.
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Rocha. H
Os genes de tRNA codificam um transcrito grande, logo, no processamento, as extre-

midades 5’ e 3’ terão que ser clivadas.
Para além disso, maior parte dos genes não codifica o terminal CCA do braço aceitador,
pelo que, posteriormente, tem que ocorrer a adição deste terminal na extremidade 3.
Por outro lado, estes genes também têm intrões pelo que, tal como no processamento de
mRNA, terá que ocorrer splicing, mas desta vez de forma um pouco diferente. Nas bactérias, os
intrões são autocatalíticos, isto é, conseguem catalisar a sua própria remoção, enquanto que, nos
eucariotas, os intrões são removidos enzimaticamente e não pelo spliceossoma!
Relativamente aos intrões autocatalíticos, mesmo não sendo necessárias, a presença de

algumas proteínas pode acelerar a reação e estes intrões podem-se classificar em dois grupos que
diferem na sua função, mas têm em comum o ataque ao grupo hidroxilo:
❖ Grupo 1 – Raramente se encontram nos genes bacterianos, enquanto que, nos eucariotas,
podem ser encontrados nos genes nucleares de rRNAs e em genomas relativos a organelos.
Para além disso, necessitam de uma guanina externa.
▪ Em primeiro lugar, o OH da guanina ataca a outra extremidade de ponta 5’, deixando
um OH livre.
▪ Posteriormente, o OH livre ataca a extremidade 3’ e o intrão é removido.
▪ Por fim, os exões são unidos.
❖ Grupo 2 – Abundantes em genes bacterianos e, nos eucariotas, só se encontram em genes
que codificam para organelos.
▪ Ocorre o ataque da adenosina do próprio intrão à extremidade 5’ deste, deixando um
OH livre e formando um lariat.
▪ Posteriormente o OH livre ataca a extremidade 3’, excisando o intrão.
▪ Por último, os exões são unidos.
➢ Tecnicamente, esta reação é praticamente igual à do spliceossoma, mas este não está pre-
sente.
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Rocha. H
Resumindo, o splicing depende do reconhecimento de uma estrutura secundária comum

em vez da sequência comum de um intrão. O complexo de splicing pode diferir entre organismo,
mas necessita sempre de atividade de endonucleases e de ligases.
Nos tRNAs, A-to-I é uma modificação comum encontrada no loop do anticodão, isto é,
se um nucleótido do anticodão for adenosina, este é editado para inosina que consegue estabilizar
a ligação com mais nucleótidos de uracilo.
Estabilidade e Fiscalização do mRNA
As células devem ser capazes de degradar o mRNA, o que é um mecanismo de regula-

ção pós-transcricional da expressão génica. Um certo mRNA é usado diversas vezes pela “ma-
quinaria” da tradução para produzir proteínas, mas é necessário um equilíbrio entre a síntese de
um mRNA competente e a sua degradação. Existem então diversas vias para degradar mRNA.
O mecanismo mais bem estudado até ao momento é a degradação de mRNA em bacté-
rias e envolve a ação de uma endonuclease e de uma 3’→5’ exonuclease.
91
Rocha. H
A degradação de mRNA ocorre durante o processo acoplado de transcrição/tradução,

visto que os ribossomas começam a tradução antes da transcrição estar completa.
1. Remoção do pirofosfato da extremidade 5’ pela pirofosfohidrolase;
2. Estimulação da atividade de endonucleases (RNAse E);
3. Degradação do fragmento a montante por uma exonuclease 3’-5’.
4. Estes últimos dois passos do ciclo de ribonucleases é repetido ao longo de todo o com-
primento do mRNA à medida que mais RNA é exposto após a passagem de ribossomas
previamente iniciados. Este complexo de proteínas denomina-se de degradossoma.
Relativamente à degradação de mRNA nos Eucariotas:

A decomposição do mRNA foi caracterizada de forma mais extensiva em leveduras em
crescimento, embora maior parte das descoberta se apliquem a células animais.
A degradação do mRNA ocorre no citoplasma e pode ser alterada em resposta a uma
variedade de estímulos ambientais e internos, incluindo a progressão do ciclo celular, a diferen-
ciação celular, hormonas, fornecimento de nutrientes e infeção viral.
Existem, então, 4 vias de degradação diferentes do mRNA:
• Dependente de desadenilação – maioria dos mRNAs (via mais comum);
• Independente da desadenilação;
• Mediada por endonucleases;
• Mediada por miRNA/siRNA.
92
Rocha. H
Não é surpresa que a via depende de desadenilação seja a mais comum visto que a cauda
Poli(A) e as suas proteínas (PABPs) previnem a degradação do mRNA em certa medida, mas as
caudas de Poli(A) são encurtadas gradualmente pela ação de pol(A)nucleases, também conhecidas
como desadenilases (deA). Deste modo, a remoção da cauda poli(A) pode desencadear duas vias
de degradação do mRNA.
1. Remoção da cauda poli(A) por desadenilação – Após a primeira ronda de tra-
dução, o CBC nuclear é substituído por eIF4F. Também, durante a tradução,
existe uma interação física entre as PABPs e o complexo eIF4F. A libertação de
PABP desestabiliza a interação entre o cap e eIF4F.
2. Ligação das proteínas ativadoras que removem o cap da extremidade 3’.
3. Ativação do complexo decapping.
4. Degradação por uma exonuclease 5’-3’.
Na outra via, o primeiro passo é exatamente igual ao da via anterior:

1. Desadenilação – Libertação de PABPs que desestabilizam a interação entre o
cap e eIF4F, expondo o cap.
2. O Exossoma liga-se à extremidade 3’.
3. O Exossoma degrada o mRNA por atividade de exonuclease 3’-5’.
93
Rocha. H
Algumas sequências específicas contidas num mRNA (elementos cis) são conhecidas por
afetarem a sua estabilidade. Os mRNAs maduros retêm múltiplas zonas de ligação (elementos cis)
para diferentes proteínas reguladoras ou para miRNA/siRNAs, principalmente, nas regiões não
codificantes das extremidades 5’ ou 3’, mas principalmente nas UTRs 3’.
Os elementos estabilizadores (SE) e os elementos desestabilizadores (DE) são os mais
estudados dentro dos elementos cis aos quais as proteínas reguladoras se ligam.
A ligação dessas proteínas aos DEs recrutam a maquinaria para degradação, aumentando
a extensão do processo. Já a ligação aos SEs protege o mRNA da desadenilação e inibe a função
dos DEs, prevenindo a degradação do mRNA.
Os mRNAs anormais são rapidamente degradados.

Os erros no DNA são reparados por uma variedade de sistemas, enquanto que os erros
detetáveis no RNA são tratados ao destruir o RNA defeituoso.
Ao nível do núcleo, se no processamento houver a falta de uma cauda poli(A) (termina-
ção imprópria) ou um pré-mRNA que não tenha sofrido splicing, ocorre degradação nuclear.
94
Rocha. H
O mRNA defeituoso é reconhecido por diferentes cofatores proteicos que recrutam um

exossoma nuclear. Esse exossoma, junto da TRAMP, degradam o mRNA no sentido 3’ para 5’.
Alguns tipos de mRNAs defeituosos só podem ser acessados durante a tradução. Os sis-
temas de fiscalização evoluíram para detetar três tipos de defeitos de mRNA que ameaçam a
fidelidade traducional e para direcionar os mRNAs defeituosos para uma rápida degradação.
• Nonsense-mediated decay (NMD) – mRNAs com um codão de terminação prematuro.
• Nonstop decay (NSD) – mRNAs sem codão de terminação.
• No-go decay (NGD) – Ribossomas parados.
Non-mediated decay (NMD)

No caso dos mamíferos, quando ocorre splicing, as proteínas permanecem ligadas às fron-
teiras dos exões que foram unidos (complexo EJC). Contudo, normalmente não ocorre splicing
entre o último exão e a extremidade 3’ não codificante, logo o complexo EJC estará presente a
jusante do codão de terminação.
Já em relação aos eucariotas, em geral, é necessário recordar que nem todos os genes
codificantes de proteínas têm intrões. Por isso, as células eucarióticas devem ter outro mecanismo.
A proteína Upf1 liga-se ao ribossoma e recruta fatores libertadores e outras proteínas

Upf. O ribossoma desassocia-se, mas a subunidade menor e a proteína Upf1 permanecem ligadas
ao mRNA. De seguida, ocorre a ativação do decapping complex e o mRNA é degradado pela
exonuclease 5’-3’ (nas leveduras). Nos mamíferos, ocorre a degradação do mRNA dependente
de desadenilação e mediada por endonucleases.
95
Rocha. H
Nonstop Decay (NSD)

Neste caso, os transcritos sem codão de terminação são gerados porque há terminação
precoce/prematura da transcrição seguida da poliadenilação. Assim, como não contém codão
de terminação, o ribossoma vai transcrever toda a cauda de Poli(A) e para na extremidade 3’.
A cauda poli(K) traduzida e o ribossoma parado desencadeiam a atividade de Ski7. Esta

Ski7 induz a libertação do ribossoma que irá atuar como fator de libertação da tradução.
Junto com outras proteínas Ski (complexo Ski), desencadeia a atividade do exossoma,
ocorrendo a degradação do mRNA de 3’ para 5’.
No-go Decay (NGD)

Os ribossomas parados na região codificante do codão provêm de estruturas secundárias
fortes ou da presença de codões raros.
96
Rocha. H
Os ribossomas parados desencadeiam o recrutamento de proteínas semelhantes aos fa-

tores de libertação com um domínio de endonuclease. Assim, o mRNA é clivado pela atividade
da endonuclease.
Desta forma, o exossoma 3’ para 5’ e a exonuclease 5’-3’ degradam o mRNA, ou seja,
ocorre degradação em ambos os sentidos.
97
Rocha. H
Tradução – Teóricas 12 e 13
Introdução à Tradução
Um RNA mensageiro transcrito (mRNA) carrega uma série de codões que interagem com
os anticodões dos tRNAs-aminoacil, para que a série de aminoácidos correspondente seja incor-
porada numa cadeia polipeptídica.
O ribossoma fornece o ambiente para controlar a interação entre o mRNA e o aminoacil-
tRNA. O ribossoma comporta-se como uma pequena fábrica migratória que se move ao longo da
cadeia de mRNA, envolvendo-se em ciclos rápidos de síntese de ligações peptídicas para construir
um polipeptídico.
Os aminoacil-tRNAs penetram no ribossoma a um ritmo incrivelmente rápido para depo-
sitar aminoácidos e as proteínas do fator de elongação associam-se e desassociam-se ciclica-
mente do ribossoma.
Junto com os seus fatores acessórios, a estrutura ribossomal fornece toda a gama de ati-
vidades necessárias para todos os passos da tradução.
Os aminoacil-tRNAs são substratos para a tradução. A função da síntese de aminoacil-

tRNA é, precisamente, combinar aminoácidos com tRNAs que contêm o anticodão correspon-
dente, ou seja, determinar como o código genético é interpretado como aminoácidos.
98
Rocha. H
O aminoacil-tRNA (aa-tRNA) é RNA de transferência ao qual se liga quimicamente

com o seu aminoácido. O aa-tRNA, junto com os fatores de elongação particulares, entregam os
aminoácidos ao ribossoma para incorporação na cadeia polipeptídica que está a ser produzida.
Cada aminoácido tem a sua própria aminoacil-tRNA sintetase, que, quimicamente, o
liga ao tRNA ao qual ele é específico.
A estrutura básica do ribossoma tem sido conservada ao longo da evolução, mas

existem variações apreciáveis no tamanho geral e nas proporções dos RNAs e proteínas nos ri-
bossomas dos procariotas e do citoplasma eucariota, mitocôndrias e cloroplastos.
99
Rocha. H
Tanto os ribossomas bacterianos como os de mamíferos são partículas de ribonucleopro-

teínas que contêm mais RNA do que proteínas. As proteínas ribossomais são conhecidas como
proteínas-r.
As ribonucleoproteínas (RNP) incluem uma família de proteínas presentes no núcleo e
no citoplasma que estão complexadas com/influenciam o processamento de diferentes ácidos ri-
bonucleicos de baixo peso molecular. Basicamente, RNP é um complexo de ácido ribonucleico
com RNA-binding proteins.
A figura seguinte demonstra as dimensões relativas dos componentes do aparelho de tra-
dução.
O ribossoma consiste em duas subunidades (maior e menor) que têm papeis específi-
cos na tradução.
Cada subunidade ribossomal contém um rRNA principal e um número de pequenas
proteínas.
Em Escherichia coli, a subunidade menor (30S) consiste em 16S rRNA e em 21 proteí-

nas-r. Já a subunidade maior (50S) contém 23S rRNA, o pequeno 5S rRNA e 31 proteínas-r.
Os RNAs principais constituem a parte maior da massa do ribossoma bacteriano. A sua
presença é omnipresente para que maior parte, ou todas, as proteínas-r contactem, de facto, o
rRNA. Assim, estes rRNAs principais formam aquilo que, muitas vezes, é considerado o
100
Rocha. H
“esqueleto” de cada subunidade – uma sequência contínua cuja presença domina a estrutura e
determina a posição das proteínas ribossomais.
Os ribossomas no citoplasma dos eucariotas são maiores do que os dos procariotas. O
conteúdo total tanto de RNA como de proteínas é maior, as moléculas de RNA principais são
maiores (chamadas 18S e 28S rRNAs) e existem mais proteínas.
Porém, o RNA continua a ser o componente predominante em massa.
Os ribossomas das mitocôndrias e cloroplastos eucarióticos são distintos do ribossomas
do citoplasma e podem ter várias formas. Em alguns casos, eles são praticamente do tamanho dos
ribossomas dos procariotas e têm cerca de 70% de RNA. Noutro casos, só são compostos por
60S rRNA e têm menos de 30% de RNA na sua composição.
O ribossoma possui diversos centros ativos, cada um construído a partir de um grupo de
proteínas associadas com uma região do rRNA. Os centros ativos necessitam da participação di-
reta do rRNA num papel estrutural ou mesmo catalítico (onde o RNA funciona como uma ribo-
zima) com proteínas suportando estas funções em papeis secundários.
Algumas funções catalíticas necessitam de proteínas individuais, mas nenhuma das ativi-
dades pode ser reproduzida por proteínas isoladas ou grupos de proteínas. Estas apenas funcio-
nam no contexto do ribossoma.
Então, duas abordagens experimentais podem ser tomadas na análise das funções dos
componentes estruturais do ribossoma:
• Os Efeitos das Mutações nos genes para proteínas ribossomais particulares ou em posições
específicas do genes de rRNA iluminam na participação destas moléculas em reações parti-
culares.
• A análise estrutural, incluindo modificação direta dos componentes do ribossoma e compa-
rações para identificar características conservadas no rRNA, identificam os locais físicos dos
componentes envolvidos em funções particulares.
A Tradução ocorre por Iniciação, Elongação e Terminação
• A tradução é feita de 5’ para 3’;

• O Ribossoma tem três zonas de ligação ao tRNA (tRNA-binding sites);
• Um aminoacil-tRNA entra na zona A;
• O peptidil-tRNA é ligado à zona P;
• O tRNA desacilado sai através da zona E;
• Um aminoácido é adicionado à cadeia polipeptídica ao transferir o polipéptido do pepti-
dil-tRNA na zona P para o aminoacil-tRNA na zona A.
101
Rocha. H
Um peptidil-tRNA é uma molécula de tRNA que se encontra ligada à zona P (P site) do

ribossoma.
Após o complexo de iniciação se ter formado devidamente, o processo de tradução pro-

cede pela elongação do polipéptido.
O metionil-tRNA iniciador liga-se sempre à zona P. O próximo aminoacil-tRNA liga-se
à zona com a ajuda do fator de elongação (EF-Tu nos procariotas e eEf-1α nos eucariotas) e de
GTP.
Posteriormente, uma ligação peptídica é formada entre o metionil-tRNA na zona P e o
segundo aminoacil-tRNA na zona A. Esta reação é catalisada pela enzima peptidil transferase e
transfere a metionina para o aminoacil-tRNA na zona A, formando, assim, um peptidil-tRNA.
Durante a fase de translocação, o peptidil-tRNA move-se para a zona P do ribossoma com
a ajuda de fatores de elongação (EFG nos procariotas e eEf-2 nos eucariotas). Para além disso,
o tRNA não carregado/desacetilado move-se, primeiro, para a zona E do ribossoma e, depois,
é que sai desta zona no final do processo.
Como já foi visto, o aminoacil-tRNA e o peptidil-tRNA são dois tipos de moléculas de
tRNA que participam na tradução, participando ambos na fase de elongação.
A principal diferença entre estas duas moléculas é que o aminoacil-tRNA é uma molé-
cula de tRNA que se encontra ligada à zona A do ribossoma, enquanto o peptidil-tRNA é uma
molécula de tRNA que se encontra ligada à zona P do ribossoma.
Para além disso, o aminoacil-tRNA tem um único aminoácido no terminal, enquanto que
o peptidil-tRNA tem uma cadeia de péptidos.
A tabela seguinte apresenta, então, as principais diferenças entre estes dois RNAs de
transferência que participam no processo de tradução.
102
Rocha. H
Retornando ao processo da Tradução, como já foi visto anteriormente, um aminoácido é

levado ao ribossoma através de um aminoacil-tRNA. A sua adição à cadeia polipeptídica cres-
cente ocorre por interação com o tRNA que trouxe o aminoácido anterior. Cada um destes tRNAs
encontra-se no seu próprio local distinto no ribossoma.
A figura seguinte demonstra que as duas
zonas têm características completamente di-
ferentes.
• Com a exceção do tRNA iniciador, o
aminoacil-tRNA recebido liga-se à zona A
(Site A). Antes da entrada do aminoacil-
tRNA, a zona expõe o codão de mRNA que
representa o próximo aminoácido a ser adici-
onado à cadeia.
• O codão que representa o aminoácido
mais recente a ser adicionado à cadeia poli-
peptídica crescente encontra-se na zona P (P
Site). Esta zona é ocupada pelo peptidil-
tRNA, um tRNA que carrega a cadeia poli-
peptídica que se está a formar.
103
Rocha. H
A figura seguinte mostra que o terminal aminoacil do tRNA se encontra na subunidade

maior, enquanto que o anticodão, na outra extremidade do tRNA, interage com o mRNA ligado
pela subunidade menor. Assim, as zonas P e A estendem-se, cada uma, por ambas as subunidades
ribossomais.
Para um ribossoma formar uma ligação peptídica, deve ser quando o peptidil-tRNA se
encontra na zona P e o aminoacil-tRNA se encontra na zona A. A formação da ligação peptídica
ocorre quando o polipéptido carregado pelo peptidil-tRNA é transferido para o aminoácido
carregado pelo aminoacil-tRNA.
Este passo necessita o correto posicionamento dos terminais aminoacil dos dois tRNAs
na subunidade maior. Esta reação é catalisada pela subunidade maior do ribossoma.
A transferência do polipeptídeo cria o ribossoma representado na figura a seguir pelo
passo 2, no qual o tRNA desacetilado, com falta de aminoácidos, se encontra na Zona P e um
novo peptidil-tRNA se encontra na Zona A.
104
Rocha. H
A proteína neste peptidil-tRNA é um resíduo de aminoácidos maior do que aquele que

era carregado no peptidil-tRNA que se encontrava na Zona P no passo 1.
O ribossoma agora move-se um tripleto ao longo do RNA mensageiro. Esta fase é cha-
mada de translocação. O movimento transfere o tRNA desacetilado para fora da Zona P e move
o peptidil-tRNA para esta zona (passo 3 anterior).
O próximo codão a ser traduzido encontra-se, agora, na Zona A, pronto para entrar um
novo aminoacil-tRNA, quando o ciclo for repetido. A figura seguinte sumariza as interações entre
os tRNAs e o ribossoma.
O tRNA desacetilado sai do ribossoma através de outra zona ligante de tRNA, a Zona E
(E Site). Esta zona é ocupada, de forma transitória, pelo tRNA que se encontra no caminho entre
sair da Zona P e ser libertado do ribossoma para o citoplasma.
Assim, o caminho do tRNA através do ribossoma é para a Zona A, seguido para a
Zona P e, finalmente, através da Zona E.
A figura seguinte compara o movimento do tRNA e do mRNA, que pode ser considerado
uma espécie de chave catraca onde a reação é impulsionada pela interação codão-anticodão.
105
Rocha. H
Como é possível visualizar na figura seguinte, a tradução divide-se em três fases:
1. Iniciação:
a. Envolve reações que precedem a formação da ligação peptídica entre os dois pri-
meiros aminoácidos do polipéptido.
b. Necessita que o ribossoma se ligue ao mRNA, formando um complexo de inici-
ação que contém o primeiro aminoacil-tRNA.
c. É um passo relativamente lento na tradução e, normalmente, determina a taxa
com que um mRNA é traduzido.
d. A subunidade menor liga-se ao mRNA e só depois se une à subunidade maior.
2. Elongação:
a. Inclui todas as reações desde a formação da primeira ligação peptídica até à adi-
ção do último aminoácido.
b. Os aminoácidos são adicionados à cadeia um de cada vez.
c. A adição de um aminoácido é o passo mais rápido da tradução.
d. O mRNA move-se através do ribossoma e é traduzido em tripletos de nucleótidos
(embora seja geralmente referido que o ribossoma se move ao longo do mRNA,
é mais exato dizer que o mRNA é puxado através do ribossoma).
106
Rocha. H
3. Terminação:
a. Engloba todos os passos que são necessários para libertar a cadeia polipeptídica
completa.
b. Ao mesmo tempo, o ribossoma desassocia-se do mRNA.
c. O polipéptido é libertado, o mRNA é libertado e as subunidades individuais do
ribossoma separam-se e podem ser usadas de novo.
Os RNAs mensageiros podem ser traduzidos simultaneamente por diversos ribossomas
tanto em procariotas como em eucariotas.
Quando um ribossoma se tiver movido da zona de iniciação, outro ribossoma pode-se
ligar ao mRNA e começar a síntese de uma nova cadeia polipeptídica.
Mecanismos especiais controlam a precisão da Tradução
A precisão da tradução é controlada por mecanismos específicos em cada fase. A precisão

geral da tradução é confirmada pela consistência que é encontrada quando se determina uma
sequência de aminoácidos de uma proteína.
Poucas medições detalhadas da taxa de erro in vivo estão disponíveis, mas pensa-se que
está na gama de um erro para cada 104 a 105 aminoácidos incorporados. Considerando que maior
parte dos polipeptídeos são produzidos em grandes quantidades, isto significa que a taxa de erro
é muito baixa para ter efeito num fenótipo de uma célula.
Então, como é alcançada uma taxa de erro tão baixa?
Não é imediatamente óbvio, mas, de facto, um erro pode ser cometido em vários passos
da expressão génica:
• As enzimas que sintetizam RNA podem inserir uma base que não é complemen-
tar com a base da cadeia molde;
• As sintetases podem juntar o tRNA errado a um aminoácido ou um aminoácido
errado ao tRNA.
• Um ribossoma pode permitir a ligação de um tRNA que não corresponda ao co-
dão na zona A.
Cada caso representa uma problema semelhante: Como distinguir um determinado mem-
bro de um conjunto inteiro, pois todos eles partilham as mesmas características gerais.
Provavelmente, qualquer substrato pode contactar inicialmente o centro ativo por tenta-
tiva de ligação aleatória, mas os substratos errados são rejeitados e apenas os corretos são aceites.
Com isto, o substrato correto é sempre raro (1 em 4 bases, 1 em 20 aminoácidos, 1 entre
30 a 50 tRNAs), por isso, o critério de discriminação tem de ser bastante rigoroso.
107
Rocha. H
A questão é que a enzima ou a ribozima devem ter algum mecanismo para discriminar os
substratos que são, estruturalmente, muito semelhantes.
A figura seguinte sumariza as taxas de erro nos passos que afetam a precisão da tradução.
É possível visualizar que erros na transcrição do mRNA são raros. A transcrição é uma fase muito
importante pois uma única molécula de mRNA pode ser traduzida em imensas cópias de polipép-
tidos.
Um ribossoma pode cometer dois tipos de erros na tradução:

• Pode causar frameshift ao saltar uma base quando lê o mRNA (ou no sentido inverso, ao ler
uma base duas vezes). Estes erros são raros.
• Pode também permitir que um aminoacil-tRNA incorreto emparelhe com o codão, fazendo
com que o aminoácido incorporado seja o errado. Isto é provavelmente o erro mais comum
na tradução.
Uma aminoacil-tRNA sintetase também pode cometer dois tipos de erros:
• Pode encaixar o aminoácido errado no seu tRNA. Este tipo de erro é mais comum, provavel-
mente porque o tRNA disponibiliza uma maior superfície com a qual a enzima pode estabe-
lecer muitos mais contactos para assegurar a especificidade.
• Pode carregar os seus aminoácidos com o tRNA errado.
• Estas enzimas têm mecanismos específicos para corrigir erros antes que o tRNA carregado
incorretamente seja libertado.
108
Rocha. H
Iniciação em Bactérias necessita de subunidades 30S e de Fatores Acessórios
• A iniciação da tradução, nos procariotas, necessita das subunidades ribossomais 30S e

50S.
• A iniciação também necessita de fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3) que se ligam às
subunidades 30S.
• Uma subunidade 30S que carrega fatores de iniciação liga-se a uma zona de iniciação no
mRNA para formar um complexo de iniciação.
• IF-3 deve ser libertada para permitir que a subunidade 50S se junte ao complexo 30S-
mRNA.
Os ribossomas procarióticos encarregados de alongar a cadeia polipeptídica existem

como partículas 70S. Na terminação, eles são libertados do mRNA como ribossomas livres ou
subunidades ribossomais.
Estas subunidades reassociam-se durante a reação de iniciação. A figura seguinte suma-
riza o ciclo das subunidades ribossomais durante a tradução em bactérias.
A iniciação ocorre numa sequência especial do mRNA denominada de Ribosome-bin-

ding Site (Zona de ligação do Ribossoma). Esta é uma pequena sequência de bases que é posi-
cionada a montante da região codificante e é complementar à porção do 16S rRNA.
As subunidades maior e menor associam-se no ribosome-binding site para formar um
ribossoma intacto. A reação ocorre em dois passos:
1. Reconhecimento do mRNA ocorre quando a subunidade menor se liga para formar o
complexo de iniciação no RBS (ribosome-binding site).
2. A subunidade maior une-se, então, ao complexo para formar um ribossoma completo.
109
Rocha. H
Embora a subunidade 30S esteja envolvida na iniciação, ela própria não é suficiente para
ligar o mRNA ao tRNA. Isto requer proteínas adicionais chamadas fatores de iniciação (IFs).
Estes fatores encontram-se apenas nas subunidades 30S e são libertados quando a subuni-
dade 30S se associa com a subunidade 50S para criar ribossomas 70S. Esta ação distingue fatores
de iniciação das proteínas estruturais do ribossoma.
Os fatores de iniciação estão apenas preocupados com a formação do complexo de inici-
ação, estão ausentes nos ribossomas 70S e não desempenham qualquer papel nas fases de alon-
gamento.
A figura seguinte sumariza as fases da iniciação.
Os procariotas utilizam três fatores de iniciação, numerados IF-1, IF-2 e IF-3. Eles são
necessários tanto para o mRNA como para o tRNA entrarem no complexo de iniciação.
• IF-3 tem múltiplas funções:
 É necessário para estabilizar (libertar) subunidades 30S e para inibir a ligação
prematura da subunidade 50S;
 Permite que as subunidades 30S se liguem às zonas de iniciação no mRNA;
 Como parte do complexo 30S-mRNA, verifica a precisão de reconhecimento
do primeiro aminoacil-tRNA.
• IF-2 liga um tRNA iniciador especial e controla a sua entrada no ribossoma.
• IF-3 liga-se às subunidades 30S como parte do complexo de iniciação completo.
110
Rocha. H
 Liga-se nas proximidades da Zona A e impede a entrada do aminoacil-tRNA.

 A sua localização pode, também, impedir a subunidade 30S de se ligar à
subunidade 50S.
A Iniciação envolve Emparelhamento de Bases entre o mRNA e o rRNA
• Uma Zona de Iniciação no mRNA bacteriano consiste no codão de iniciação AUG pre-
cedido pelo hexâmero de polipurina de Shine-Dalgarno a aproximadamente 10 bases
a montante.
• O rRNA da subunidade 30S bacteriana ribossomal tem uma sequência complementar que
emparelha com a sequência de Shine-Dalgarno durante a iniciação.
O sinal para iniciar uma cadeia polipeptídica é um codão de iniciação especial que marca
o início do reading frame (janela de leitura). Normalmente o codão de iniciação é o tripleto AUG
(metionina), mas em bactérias GUG (valina) ou UUG (leucina) também podem ser utilizados.
Um mRNA pode conter vários tripletos AUG, então como é reconhecido o codão de
iniciação correto como o starting point da tradução?
As zonas no mRNA onde a tradução é iniciada podem ser identificadas pela ligação do
ribossoma ao mRNA sob condições que bloqueiam a elongação, para que o ribossoma permanece
na zona de iniciação.
Quando a ribonuclease é adicionada ao complexo de iniciação bloqueado, todas as regiões
do mRNA fora do ribossoma são degradas, mas aquelas realmente ligadas a ele são protegidas,
tal como ilustrado na figura seguinte. Os fragmentos protegidos podem, então, ser recuperados e
caracterizados.
111
Rocha. H
As sequências de iniciação protegidas pelos ribossomas procarióticos têm aproximada-

mente 30 bases de comprimento. Os Ribosome-binding Sites dos diferentes mRNAs bacterianos
exibem duas características comuns:
• O codão de iniciação AUG é sempre incluído dentro da sequência protegida;
• Aproximadamente 10 bases a montante do codão de iniciação está uma sequência que
corresponde a parte ou a todo o hexâmero.
Este segmento de polipurinas é conhecido como a sequência de Shine-Dalgarno. É com-
plementar a uma sequência altamente conservada perto da extremidade 3’ do 16S rRNA. Escrito
na direção oposta, está a sequência de rRNA hexamérica.
A sequência de Shine-Dalgarno emparelha com o seu complemento de rRNA du-
rante a ligação mRNA-ribossoma?
Mutações de ambas as sequências demonstram importância na iniciação. Mutações pon-
tuais na sequência de Shine-Dalgarno podem prevenir um mRNA de ser traduzido. Para além
disso, a introdução de mutações na sequência complementar no rRNA é prejudicial para a célula
e altera o padrão da tradução.
A confirmação decisiva da reação de emparelhamento de bases é que uma mutação na
sequência de Shine-Dalgarno de um mRNA pode ser suprimida pela mutação no rRNA que
restaura o emparelhamento de base.
A sequência na extremidade 3’ do rRNA é conservada entre procariotas e eucariotas, ex-
ceto que em todos os eucariotas existe uma deleção da sequência das cinco bases CCUCC que é
o principal componente da sequência Shine-Dalgarno.
112
Rocha. H
O emparelhamento de bases não parece ocorrer entre mRNAs eucarióticos e o 18S rRNA.
Isto é uma diferença significativa entre procariotas e eucariotas no mecanismo de iniciação.
Nas bactérias, a subunidade 30S liga-se diretamente ao ribosome-binding site. Como re-
sultado, o complexo de iniciação forma-se numa sequência que rodeia o codão de iniciação AUG.
Quando o mRNA é policistrónico (codifica duas ou mais proteínas), cada região codificante co-
meça com um ribosome-binding site.
A natureza da expressão génica bacteriana significa que a tradução de um mRNA poli-
cistrónico bacteriano prossiga sequencialmente atraHHvés de cada um dos seus cistrões (regiões
codificantes). No momento em que os ribossomas se ligam à primeira região codificante, as re-
giões codificantes seguintes ainda não foram transcritas. Por essa altura, o segundo ribosome-
binding site está disponível, a tradução através do primeiro cistrão está bem encaminhada.
O que acontece entre as regiões codificantes varia entre mRNAs policistrónicos indivi-
duais. Na maioria dos casos, os ribossomas provavelmente ligam-se independentemente no início
de cada cistrão. A série de eventos mais comuns encontra-se ilustrada na figura seguinte.
Quando a síntese do primeiro polipeptídeo termina, o ribossoma deixa o mRNA e desas-
sociam-se em subunidades. Depois, um novo ribossoma deve formar-se na próxima região co-
dificante e começar a tradução do próximo cistrão.
Em alguns mRNAs policistrónicos bacterianos, a tradução entre cistrões adjacentes está

diretamente ligada, porque os ribossomas ganham acesso ao codão de iniciação do segundo cis-
trão, assim que completam a tradução do primeiro cistrão.
Isto necessita que a distância entre as duas regiões codificantes seja pequena. Pode de-
pender da elevada densidade local dos ribossomas, ou a justaposição da terminação e os locais de
iniciação podem permitir que alguns dos habituas eventos intercistrónicos sejam contornados.
Um ribossoma abrange fisicamente cerca de 30 bases de mRNA, por isso pode contactar
simultaneamente um codão de terminação e a próxima zona de iniciação se estes forem apenas
separados por poucas bases.
113
Rocha. H
Um tRNA iniciador especial dá início à Cadeia Polipeptídica
• A tradução começa com o aminoácido da metionina, normalmente codificado por

AUG.
• Diferentes tRNAs de metionina estão envolvidos na iniciação e na elongação.
• O tRNA iniciador tem características estruturais únicas que o distinguem dos ou-
tros tRNAs.
• O grupo amino da metionina ligado ao tRNA iniciador bacteriano é formilado.
A síntese de todos os polipeptídeos começa com o mesmo aminoácido – a metionina. Os

tRNAs que reconhecem o codão AUG carregam metionina e dois tipos de tRNA podem carregar
este aminoácido: um é usado na iniciação, enquanto o outro é utilizado para reconhecer codões
AUG durante a elongação.
Nas bactérias, mitocôndrias e cloroplastos, o tRNA iniciador carrega um resíduo de me-
tionina que foi formilado no seu grupo amina, formando uma molécula de N-formil-metionil-
tRNA. Este tRNA é conhecido como tRNAf-Met. O nome do aminoacil-tRNA é normalmente
abreviado para fMet-tRNAf.
O tRNA iniciador ganha o seu aminoácido modificado numa reação de dois passos:
1. Primeiro, o tRNA é carregado com o aminoácido para criar Met-tRNAf.
2. De seguida, ocorre a reação de formilação, demonstrada na figura seguinte, que bloqueia
o grupo amina livre (-NH2).
Embora , o grupo aminoácido bloqueado possa prevenir o iniciador de participar na cadeia
de elongação, não interfere com a habilidade de iniciar um polipéptido.
114
Rocha. H
Assim, este tRNA é usado apenas para a iniciação. O tipo de tRNA responsável por reco-
nhecer apena codões AUG, a seguir ao codão de iniciação, ou seja, durante a elongação, é o
tRNAmMet. A sua metionina não pode ser formilada.
Então, que características distinguem o fMet-tRNA iniciador do Met-tRNAm?

Algumas carcaterísticas da sequência do tRNA são importantes, tal como sumarizado na
figura seguinte. Algumas destas características são necessárias para prevenir que o iniciador seja
usado na elongação, enquanto que outras são necessárias para este funcionar na iniciação:
• A Formilação não é estritamente necessária porque um Met-tRNAf pode funcionar como um
iniciador. No entanto, a formilação aumenta a eficiência com a qual o Met-tRNAf é usado
porque é uma das características reconhecidas pelo IF-2, que se liga ao tRNA iniciador.
• As bases que se encontram frente a frente na última posição do braço ao qual o aminoácido
está conectado estão emparelhadas em todos os tRNAs exceto no tRNAfMet. Mutações que
criam um par de bases nesta posição do tRNAfMet permitem que este funcione na elongação.
Por isso, a ausência deste par é importante para prevenir que o tRNAfMet seja usado na elon-
gação. Também é necessário para a reação de formilação.
• Uma série de três pares G-C no braço que precede o loop que contém o anticodão é uma
característica única do tRNAfMet. Estes pares de bases são necessários para permitir que o
fMet-tRNAf seja inserido diretamente na Zona P.
115
Rocha. H
O uso de fMet-tRNAf é controlado por IF-2 e pelo Ribossoma
O fator de iniciação IF-2 liga o fMet-tRNAf iniciador e permite-o entrar na zona P parcial
na subunidade 30S.
Na tradução bacteriana, o significado dos codões AUG e GUG dependem do seu contexto.
Quando o codão AUG é utilizado para a iniciação, uma formil-metionina começa o polipeptídeo,
mas quando é usado na região codificante, apenas uma metionina normal é adicionada ao po-
lipeptídeo.
A figura seguinte demonstra o papel decisivo do ribossoma quando atua em conjunto com
os fatores acessórios.
Subunidades Menores varrem as Zonas de Iniciação no mRNA Eucariótico
▪ As subunidades ribossomais 40S eucarióticas ligam-se à extremidade 5’ do mRNA e

analisam o mRNA até chegarem a uma zona de iniciação.
▪ Uma zona de iniciação eucariótica consiste numa sequência de 10 nucleótidos que
incluem o codão AUG.
▪ As subunidades ribossomais 60S juntam-se ao complexo na zona de iniciação.
A iniciação da tradução no citoplasma eucariótico assemelha-se ao processo que ocorre

nas bactérias, mas a ordem de eventos é diferente e o número de fatores acessórios é maior.
Algumas das diferenças na iniciação estão relacionadas com uma diferença na maneira com que
116
Rocha. H
as subunidades 30S bacteriana e 40S eucariótica encontram as suas zonas de ligação (binding
sites) para iniciar a tradução do mRNA.
Nos eucariotas, as subunidades menores primeiro reconhecem o 5’cap no final do mRNA
e depois, movem-se para a zona de iniciação, onde são unidos pelas subunidades maiores. (Nos
procariotas, as subunidades menores ligam-se diretamente à zona de iniciação).
A figura seguinte ilustra o modelo de “scanning” que contém a subunidade 40S a reco-
nhecer inicialmente o 5’cap e, de seguida, a migrar ao longo do mRNA. A análise a partir da
extremidade 5’ é um processo linear. Quando as subunidades 40S analisam a região principal,
elas podem desnaturam estruturas secundárias de ganchos (hairpins) com estabilidade menor que
-30 kcal, mas ganchos com maior estabilidade impede ou previnem a migração.
A migração/movimento para quando a subunidade 40S encontra o codão de iniciação

AUG. Normalmente, nem sempre, o primeiro tripleto AUG a ser encontrado será o codão de
iniciação.
Contudo, o tripleto de AUG não é suficiente para parar a migração, este apenas é reco-
nhecido eficientemente como um codão de iniciação apenas quando se encontra no contexto certo.
Os determinantes mais importantes do contexto são as bases nas posições -4 e +1. Um codão de
iniciação pode ser reconhecido na sequência NNNPuNNAUGG pela subunidade ribossomal me-
nor utilizando o anticodão Met-tRNA. As três bases de purina (A ou G) antes do codão AUG e a
G imediatamente a seguir podem influenciar a eficiência da tradução por 10 vezes.
117
Rocha. H
Quando a sequência principal é comprida, mais subunidades 40S podem reconhecer a

extremidade 5’ antes que a primeira deixe a zona de iniciação, criando uma fila de subunidades
que procedem ao longo da sequência principal até à zona de iniciação.
O que acontece, quando existe um tripleto AUG na região 5’ não traduzida (UTR)?
Dois mecanismos de fuga são possíveis para um ribossoma que começa a analisar na
extremidade 5’.
O mais comum é que a análise tem fugas, isto é, o ribossoma pode continuar após um
AUG não iniciador porque não está no contexto correto.
No caso mais raro em que reconhece AUG, pode iniciar a tradução, mas terminá-la antes
do codão de iniciação adequado, retomando o scanning.
Os Eucariotas usam um complexo de Vários Fatores de Iniciação
Os Fatores de Iniciação são necessários para todas as fases da iniciação:

• Ligação do tRNA iniciador;
• Anexação da subunidade 40S ao mRNA;
• Junção da subunidade 60S;
• Movimento do ribossoma ao longo do mRNA.
O tRNA iniciador eucariótico é o Met-tRNA que é diferente do Met-tRNA utilizado na
elongação, mas a metionina não é formilada como é no tRNA iniciador dos procariotas.
O fator eIF2 liga o Met-tRNA iniciador e GTP, formando um complexo ternário que se
liga à subunidade 40S antes de esta se associar ao mRNA.
O CBC (cap-binding complex) liga-se à extremidade 5’ do mRNA a seguir à associação
do mRNA com a subunidade 40S.
A figura seguinte sumariza as fases da iniciação em eucariotas e mostra quais fatores de
iniciação estão envolvidos em cada passo.
118
Rocha. H
▪ eIF2, junto com o Met-tRNA, eIF3, eIF1 e eIF1A ligam-se à subunidade 40S ribos-
somal para formar o complexo de pré-iniciação 43S.
▪ eIF4A, eIF4B, eIF4E e eIF4G ligam-se à extremidade 5’ do mRNA para formar o
Cap-binding Complex (CBC).
▪ Este complexo associa-se com a extremidade 3’ do mRNA através de eIF4G, que
interage com a PABP (Poli(A) binding protein).
▪ O complexo 43S liga os fatores de iniciação na extremidade 5’ do mRNA e analisa à
procura do codão de iniciação. Pode ser isolado como complexo de iniciação 48S.
Fator de Elongação Tu carrega Aminoacil-tRNA para a Zona A
EF-Tu é uma proteína G monomérica cuja forma ativa (isto é, ligada a GTP) se liga a
aminoacil-tRNA.
O complexo EF-Tu-GTP-aminoacil-tRNA liga-se à Zona A do ribossoma.
A figura seguinte retrata o papel do EF-Tu em levar o aminoacil-tRNA para a Zona A.
EF-Tu é uma proteína monomérica ligante a GTP que fica ativa quando se liga a GTP e inativa
quando se liga a GDP.
119
Rocha. H
O complexo binário EF-Tu-GTP liga-se ao aminoacil-tRNA formando um complexo ter-

nário de aminoacil-tRNA-EF-tu-GTP. Este complexo ternário liga-se à Zona A dos ribossomas,
cuja Zona P já se encontra ocupada pelo peptidil-tRNA.
Esta é a reação crítica em assegurar que o aminoacil-tRNA e o peptidil-tRNA se encon-
tram corretamente posicionados para a formação da ligação peptídica.
A Cadeia Polipeptídica é transferida para o Aminoacil-tRNA
▪ A subunidade 50S tem atividade de peptidil transferase, proveniente de uma ribo-

zima de rRNA.
▪ A cadeia polipeptídica emergente é transferida do peptidil-tRNA (Zona P) para o
aminoacil-tRNA (Zona A).
▪ A síntese da ligação peptídica cria tRNA desacetilado na Zona P e peptidil-tRNA
na zona A.
O componente responsável pela síntese da ligação peptídica é a peptidil transferase. Esta

é uma função da subunidade maior do ribossoma (50S ou 60S). A figura seguinte demonstra a
reação que ocorre.
120
Rocha. H
A Translocação move o Ribossoma
▪ A translocação ribossomal
move o tRNA através do ribos-
soma por três nucleótidos.
▪ A translocação move o tRNA
desacetilado para a Zona E e o pep-
tidil-tRNA para a Zona P, dei-
xando livre a Zona A.
▪ O modelo de estado híbrido diz
que a translocação ocorre em dois
passos, no qual a subunidade 50S
se move relativamente à 30S e, de-
pois, a 30S, junto do mRNA,
move-se para restaurar a confor-
mação original.
121
Rocha. H
Os Fatores de Elongação ligam-se Alternativamente ao Ribossoma
▪ A translocação necessita de EF-G, cuja estrutura assemelha-se à do complexo ami-

noacil-tRNA-EF-Tu-GTP.
▪ A ligação do EF-Tu e de EF-G ao ribossoma é mutuamente exclusiva, ou seja, ape-
nas um deles se pode ligar de cada vez.
▪ A translocação necessita que ocorra a hidrólise de GTP, que desencadeia uma mu-
dança em EF-G, que, por sua vez, desencadeia uma mudança na estrutura do ribos-
soma.
A translocação necessita de GTP e do fator de elongação EF-G (o homólogo eucariótico

é o eEF2). Este fator é o principal constituinte da célula, está presente num nível de 1 cópia por
ribossoma.
Os ribossomas não conseguem ligar EF-Tu e EF-G simultaneamente, por isso a tradução
segue o ciclo ilustrado na figura seguinte, no qual os fatores estão ligados alternadamente e liber-
tados do ribossoma.
122
Rocha. H
Três codões terminam a Tradução
Os codões UAA, UAG e UGA terminam a tradução. Nas bactérias, eles são utilizados
mais comummente com frequências relativas de UAA > UGA > UAG.
O 16S rRNA tem um papel ativo nas funções da subunidade 30S. Ele interage direta-
mente com mRNA, com a subunidade 50S e com os anticodões dos tRNAs nas Zonas P e A.
Já a atividade de peptidil transferase reside exclusivamente no 23S rRNA.
A Tradução pode ser regulada
▪ A tradução pode ser regulada pela UTR (5’ untraslated region) do mRNA.
▪ A tradução pode ser regulada pela abundância de vários tRNAs.
▪ Uma proteína repressora pode regular a tradução ao prevenir o ribossoma de se
ligar a um codão de iniciação.
▪ A acessibilidade de codões de iniciação num mRNA policistrónico pode ser contro-
lada por mudanças na estrutura do mRNA que ocorrem como resultado da tradução.
A 5’ untraslated region (também conhecida como 5’UTR, sequência principal, trans-

crito principal ou RNA principal) é a região do RNA mensageiro que está diretamente a montanto
do codão de iniciação.
A 5’UTR eucariótica é critica para o recrutamento de ribossomas para o mRNA e escolha
do codão de iniciação, tendo um papel principal no controlo da tradução e em moldar o proteoma
celular.
As UTRs no mRNA têm um papel crítico de regular a estabilidade, função e localização
do mRNA. As 3’UTRs do mRNA também servem como moldes para a ligação do miRNA que
controla a função do mRNA.
123
Rocha. H

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Autor: Hugo Rocha

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