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435 | 9 de junho de 2005 | doi: 10.1038 / nature03608

CARTAS
Os sesquiterpenos vegetais induzem ramificações hifais
fungos micorrízicos arbusculares
Kohki Akiyama 1,2 , Ken-ichi Matsuzaki 1 e Hideo Hayashi 1

Os fungos micorrízicos arbusculares (AM) formam mutualistas, simbióticos A purificação dos metabolitos das raízes foi dificultada pela
associações com as raízes de mais de 80% das plantas terrestres 1 . o concentrações extremamente baixas produzidas e exsudadas pelas raízes hospedeiras 11
fungos são incapazes de completar seu ciclo de vida na ausência de e sua instabilidade relativa (KA, dados não publicados). Aqui relatamos
raiz do host. Seus esporos podem germinar e crescer na ausência de um isolamento e identificação estrutural do AM a partir de exsudatos radiculares de
hospedeiro, mas seu crescimento hifal é muito limitado. Pouco se sabe sobre o modelo leguminosa L. japonicus.
os mecanismos moleculares que governam a sinalização e reconhecimento As plantas foram cultivadas hidroponicamente sob condições de baixo Pi
entre os fungos AM e suas plantas hospedeiras. Em um dos primeiros estágios de (35 m M). Compostos lipofílicos liberados na solução hidropônica
reconhecimento do hospedeiro, as hifas dos fungos AM mostram foram extraídos com acetato de etila e depois testados quanto à
nas proximidades das raízes hospedeiras antes da formação do apressor atividade de ramificação nos esporos em germinação de G. margarita. Usando o
ium 2–4 , a estrutura usada para penetrar na raiz da planta. Hospedeiro método de difusão em disco de papel, o extrato de acetato de etila provocou forte
Sabe-se que as raízes liberam moléculas de sinalização que desencadeiam hifas ramificação em 15 m g por disco (Fig. 1a, b). O extrato mostrou
hifal ramificação 5–7 , mas esses fatores de ramificação não foram atividade em concentrações tão baixas quanto 1,9 m g por disco. O acetato de etila
isolado. Aqui, isolamos um fator de ramificação de O extrato foi dividido em ácido acético, solúvel em acetato
os exsudatos radiculares de Lotus japonicus e usaram espectroscopia e frações básicas. A atividade foi encontrada apenas no ponto morto
análise e síntese química para identificá-lo como uma estrigolactona, fração, indicando que o AM de L. japonicus é um composto neutro
5-desoxi-estrigol. As estrigolactonas são um grupo de sesquiterpenos lac- (Fig. 1c, d).
tons, previamente isolados como estimulantes da germinação de sementes Para isolar o composto ativo neutro, usamos carvão ativado
ervas daninhas parasitas Striga e Orobanche 8 . As estrigolactonas naturais
5-desoxi-estrigol, sorgolactona e estrigol e um agente sintético
logue, GR24, induziu extensa ramificação hifal na germinação
esporos do fungo AM Gigaspora margarita em níveis muito baixos
concentrações.
Os fungos AM são antigos, simbiontes obrigatórios no filo Glomero-
mycota 9 . O passo crítico do desenvolvimento em seu ciclo de vida é a hifa
ramificação, o que os ajuda a garantir contato com a raiz do host e
o estabelecimento de simbiose. O fator de ramificação (AM) é uma hipótese
considerado uma molécula de sinal de planta necessária para acionar o hifa
morfogênese que precede a colonização radicular bem-sucedida 5,6 . Diálise
membranas foram usadas para determinar que o AM exsudava
raízes crescentes de Ocimum basilicum, o que provoca ramificação de hifas
do fungo AM Glomus mosseae, é uma espécie de baixo peso molecular
composto (inferior a 500Da) 5 . O desenvolvimento de um in vitro
bioensaio para ramificação de hifas em esporos em germinação do gênero
Gigaspora 10 facilitou a análise das características químicas
e distribuição de AM no reino vegetal 6,7 . AM estava presente em
exsudatos radiculares de todas as plantas micotróficas testadas, mas ausentes naquelas
de plantas não hospedeiras. A descoberta de que o composto ativo é
particionada em acetato de etila a partir de um exsudato aquoso de raiz 6 , e
retida na resina de fase reversa C 18 7 , indica que BF é um
composto lipofílico. A presença de vários BFs nas plantas hospedeiras
foi sugerido pela coluna de fase reversa C 18 e diluente preparativo
cromatografia em camada 7 . Os flavonóides foram descartados como AM Figura 1 Ramificação hifal de G. margarita induzida por frações lipofílicas
de exsudatos radiculares de L. japonicus usando a difusão em disco de papel
candidatos porque os exsudatos radiculares de mutantes de milho são deficientes em
método. a, Hifa de controle (etanol a 70% em água). b, ramificação hifal
A chalcona sintase mostra atividade comparável à dos animais selvagens
de uma hifa secundária após tratamento com extratos de acetato de etila
tipo 6 . Exsudatos de raízes de plantas cultivadas com fosfato (Pi) -
(15 mg por disco). Barras de escala, 300 mm. c, d, Traçados de ramos hifais
condições limitadas são mais ativas do que as de plantas com traçados diretamente em uma placa de Petri às 0 h (c) e 24 h (d) após o tratamento com o
nutrição suficiente de Pi, sugerindo que a produção de AM em fracção neutra solúvel em acetato de etilo (15 mg por disco). Formação extensa
raízes e sua exsudação são reguladas pela disponibilidade do Pi 7 . A identidade ramos hifos das hifas secundárias e primárias foram induzidos. Escala
de AM tem sido objeto de uma quantidade considerável de pesquisa, mas barras, 6 mm.
 1 Divisão de Química Biológica Aplicada, Escola de Pós-Graduação em Agricultura e Ciências Biológicas, Universidade da Prefeitura de Osaka, Sakai, Osaka 599-8531, Japão. 2 Pesquisa Principal para
Evolutional Science and Technology (CREST), Agência de Ciência e Tecnologia do Japão, 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama 332-0112, Japão.

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extrair BF da solução hidropônica. A solução foi exsudado das raízes. Isolado como um produto natural pela primeira vez,
circulava continuamente através de um cartucho de carvão ativado. O 5-desoxi-estrigol pode ser convertido em estrigol e orobancol 17 por
Os compostos ativos adsorvidos no carvão foram eluídos com hidroxilação em C-5 e C-4, respectivamente, sugerindo que este
acetona. A fração neutra, solúvel em acetato de etila, preparada a partir de O composto é um ponto de ramificação na biossíntese da estrigolactona.
o eluato de acetona foi primeiro cromatografado em uma coluna de sílica gel Para descobrir se o 5-desoxi-estrigol natural provocou hifas
eluindo gradualmente de n-hexano a acetato de etilo. A atividade foi ramificação, testamos em G. margarita em concentrações variando
encontrado em 40% de eluato de acetato de etilo. A fração ativa foi ainda de 1ng a 1pg por disco. O AM natural provocou o mesmo hifa
purificado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em um ramificação como a observada para o neutro solúvel em acetato de etila
coluna semi-preparativa de fase reversa C 18 , resultando no isolamento frações preparadas a partir de exsudatos radiculares de L. japonicus a 1 ng-30 pg
de um BF eluído como um pico único aos 22,3 min (Fig. 2). Nenhum dos outros
os picos estavam ativos no ensaio.
Submetemos o BF, obtido como um sólido amorfo incolor, a
análise espectroscópica. O espectro ultravioleta mostrou uma absorção
ção máxima a 234 nm, o que sugere um um , b carbonil insaturada
cromóforo. O espectro infravermelho exibiu forte absorção
bandas indicativas de g- lactonas (1.784, 1.744cm 21 ) e éter enol
(1.683 cm 21 ). O espectro de massa de impacto de elétrons (EI) mostrou uma
pico de íon molecular fraco em m / z 330, com o pico base em m / z 97. O
O espectro indicou clivagens de m / z 330 a picos em m / z 315 [M þ -
CH 3 ], 233 [M þ -97], 215 [M þ -97-H 2 O], e 187 [M þ -97-H 2 O-CO]
(Fig. 3a). A ressonância magnética de protão nuclear ( 1 H-RMN) espec-
trum exibiu sinais para dois metil singletos ( d H 1.08,1.10), um
metil alílico ( d H 2.01, tripleto, J ± 1,5 Hz), uma oximetina ( d H 5,49,
gibão largo, J ¼ 8.0 Hz) e um próton olefínico alilicamente acoplado
( d H 7,39, dupleto, J = 2,7 Hz). Dois prótons metino foram observados
em d H 6,12 e 6,90 como um multipleto, respectivamente. Tomados em conjunto, estes
Os dados sugerem fortemente que o AM está estruturalmente relacionado
estrigolactonas, um grupo de lactonas sesquiterpenas previamente identificado
como estimulantes da germinação de sementes para as ervas daninhas parasitas Striga e
Orobanche. Até o momento, cinco estrigolactonas naturais foram isoladas
(Fig. 3e, f) 12–17 , e vários análogos estruturais foram
sintetizado (Fig. 3g) 18 . Os dados espectrais do AM estavam em boa
acordo com os relatados para um derivado sintético do estrigol,
(^) - 5-desoxi-estrigol 19 , que não foi isolado de qualquer substância natural
fonte 20 . O próprio Strigol é a primeira estrigolactona natural a ser isolada
do algodão falso hospedeiro 12,13 . Para confirmar a estrutura química de
o BF, (^) - 5-desoxi-strigol foi sintetizado de acordo com o
procedimentos relatados 19,21,22 . Tempos de retenção na HPLC e em todos
os dados espectrais para o composto sintético eram idênticos aos
do composto natural (Fig. 3b e Tabela Suplementar 1). Portanto,
o BF isolado de L. japonicus foi identificado como 5-desoxi-estrigol.
O espectro de dicroísmo circular (CD) do composto natural
foi sobreposta ao relatado para as estrigolactonas naturais
(þ) -strigol e (þ) -sorgolactona (Fig. 3c), confirmando que o
configuração absoluta do 5-desoxi-estrigol natural é a mesma que
o das estrigolactonas que ocorrem naturalmente (isto é, 3a (R), 8b (S)
e 2 (R)) (Fig. 3d) 19,21,23 . Pouco se sabe sobre o biossintético
0

caminho para estrigolactonas em plantas devido ao nível extremamente baixo

concentrações de compostos altamente ativos produzidos por e

Figura 3 | Análise espectroscópica de GC isolado de L. japonicus. a, b, EI

espectros de massa de BF de L. japonicus, identificados como 5-desoxi-strigol (a), e
sintético (^) - 5-desoxi-estrigol (b). c, espectro CD de BF em acetonitrilo.
Figura 2 Purificação de BF por HPLC em um C- 18 reverso semi-preparativo d – f, Estruturas químicas de BF isoladas de L. japonicus, naturais
coluna de fase. Um eluato de acetato de etila a 40% foi obtido a partir da primeira sílica estrigolactonas e um análogo sintético da estrigolactona. d, BF, identificado como
cromatografia em gel da fração neutra solúvel em acetato de etila da raiz 5-desoxi-estrigol; e, quatro estrigolactonas naturais; f, alectrol (a estrutura tem
exsudatos de L. japonicus. Um pico eluiu aos 22,3 min (seta). não foi confirmado); g, GR24.
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por disco (Fig. 4a). Esse composto ainda estava ativo a 10–3 pg por disco,
induzindo hifas secundárias extensas a partir da hifa primária.
Estudar as relações estrutura-atividade do AM, (^) - 5-desoxi-
estrigol, (^) - sorgolactona, (þ) -strigol e a estrigolactona sintética
O analógico GR24 foi testado quanto à atividade em concentrações variando
de 100ng a 30pg por disco. Em todas as concentrações testadas
(100ng-30pg por disco), (^) - 5-desoxi-strigol exibiu atividade
(Fig. 4b). Sorgolactona, um derivado mono-8-desmetílico do 5-desoxi-
estrigol, é a terceira estrigolactona natural a ser isolada do sorgo
exsudatos radiculares 14 . Sorgolactona racêmica preparada por sinergias orgânicas
A tese 21 também foi altamente ativa no fungo AM (Fig. 4c). o
A atividade deste composto foi comparável à de (^) - 5-desoxi-
strigol (100 ng-30 pg por disco). Isolado de uma cultura de raiz asséptica
de uma planta medicinal chinesa Menispermum dauricum 24 , (þ) -strigol
também induziu ramificação hifal a 1–100 ng por disco (Fig. 4d), embora
sua atividade em menos de 1 ng por disco ainda não foi avaliada.
O GR24 foi menos ativo que as estrigolactonas naturais (100-1 ng por
mesmo), considerando que o GR24 utilizado neste estudo foi um
mistura equimolar de dois diastereômeros racêmicos. As estrigolactonas são
altamente ativo em ervas daninhas parasitárias, induzindo 50% de germinação
concentrações picomolares 14,15 . A parte do CD (veja a Fig. 3e) do
moléculas de lactona demonstraram ser responsáveis por estimular
germinação 25 . Um mecanismo molecular proposto para germinação
estimulação envolve a adição de uma espécie nucleofílica, presente em
um local receptor putativo, à ligação dupla de carbono éter enol em um
Michael moda, seguido pela eliminação do anel D. O inerente
instabilidade de estrigolactonas na presença de agentes nucleofílicos pode
também ser entendido por esse mecanismo. Tomado com nossas observações
que todas as estrigolactonas testadas tiveram um efeito potente no fungo,
e que sua atividade diminuiu drasticamente após a concentração de um
solução de BF dissolvida em solventes nucleofílicos como metanol
e sua mistura aquosa, parece que a parte do CD também é essencial
para o efeito das estrigolactonas no fungo AM.
As estrigolactonas foram isoladas dos exsudatos radiculares de um
variedade de plantas 8 , incluindo monocotiledôneas sorgo, milho e proso
milho e dicotiledôneas algodão, feijão-caupi, trevo vermelho e M. dauricum.
O isolamento de (þ) -strigol de uma cultura de raiz asséptica de
M. dauricum demonstrou inequivocamente que esse estrigo-
a lactona é de origem vegetal 24 . Embora tenha sido sugerido que
Figura 4 | Atividade ramificada hifal de BF e estrigolactonas naturais em
G. margarita. a, BF natural, 5-desoxi-estrigol isolado de L. japonicus
(30 pg por disco). b, BF sintético, (^) - 5-desoxi-estrigol (3 ng por disco).
c, (^) - Sorgolactona preparada por síntese orgânica (10 ng por disco).
d, (þ) -Strigol isolado da cultura de raiz de M. dauricum (3 ng por disco).
Emergência extensa de hifas terciárias, quarta e quinta hifas secundárias
as hifas foram induzidas por tratamento com BF ou estrigolactonas. As setas indicam
direção do crescimento das hifas primárias. Hifas de controle, que foram tratadas
com etanol a 70% - água, não formou ramificações hifais, como mostra a Fig. 1a.
Barras de escala, 600 mm.
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O ensaio foi repetido pelo menos duas vezes, usando entre três e cinco placas para cada
concentração.
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As estrigolactonas são mais amplamente distribuídas no reino vegetal,
isolamento e caracterização de estrigolactonas em exsudatos radiculares, como
No caso deste AM, foram dificultados pela extrema baixa
concentrações produzidas e exsudadas pelas raízes hospedeiras e seus
instabilidade. Vale ressaltar que Arabidopsis thaliana, que pertence
à família não micotrófica Brassicaceae, foi encontrado para
produzem estimulantes da germinação de sementes, mas com uma concentração muito menor
do que nas plantas de cultivo cenoura e tabaco 26 , que têm
fungos simbióticos. A ampla distribuição de estrigolactonas na planta
reino e seus níveis nos exsudatos das raízes das plantas são consistentes com
a especificidade do hospedeiro dos fungos AM. Análise usando HPLC conectado a
espectrometria de massa em tandem 27 indica a presença de vários novos
estrigolactonas, além das conhecidas, nos exsudatos radiculares de
soja, cenoura, tomate e ervilha (K. Yoneyama, comunicação pessoal
catiões). Também isolamos dois novos compostos ativos de BF do
exsudatos radiculares de sorgo. Fragmentos intensos e característicos atingem picos de
m / z 97 nos espectros de massa EI mostraram que estes eram estrigolactona
derivados (KA, KM e HH, dados não publicados).
Em grandes áreas do mundo, as ervas daninhas parasitas Striga e
Orobanche estão entre as pragas agrícolas mais prejudiciais 8 . A maioria
espécies são parasitas obrigados incapazes de completar seu ciclo de vida
na ausência de um host. Foi sugerido que as estrigolactonas
desempenham um papel na relação ecológico natural hospedeiro-parasita, porque
O (þ) -strigol foi primeiro isolado do algodão hospedeiro falso. Dado que
A produção de estrigolactonas pelas raízes do trevo vermelho é estimulada
condições de baixo Pi e que as ervas daninhas parasitárias predominam em áreas com
disponibilidade limitada de Pi no solo 28 , é tentador especular que
ervas daninhas parasitárias podem encontrar potenciais hospedeiros através da detecção de estrigo
(que são liberadas das raízes das plantas nas condições de Pi
deficiência na comunicação com os fungos AM). A purificação
e caracterização de sinais simbióticos vegetais abrem novos caminhos
estudar a base molecular das interações fungo planta-AM.
A disponibilidade de BF e seus análogos facilitará a análise detalhada
das respostas moleculares, fisiológicas e morfológicas de
Sou fungos para esta molécula de sinal. O uso do modelo leguminosa
L. japonicus 29 aprofundará nossa compreensão do bio-sintético BF
via e sua regulamentação. Análise molecular e química de
Eventos mediados por AM durante o desenvolvimento da simbiose com AM
entre L. japonicus e G. margarita fornecerá insights sobre a
comunicação química entre plantas e fungos AM. Isso poderia
também fornece uma nova estratégia para a gestão e controle de
simbiontes fúngicos benéficos e ervas daninhas parasitárias devastadoras em ambos
agricultura e ecossistemas naturais.
MÉTODOS
Métodos espectroscópicos. Os espectros de infravermelho foram registrados com um JASCO FT / IR-
Espectrômetro 460plus e espectros ultravioleta foram medidos com um aparelho Hitachi
Instrumento U-3210. Os espectros de massa foram registrados em um instrumento JEOL JMS-700.
1 H-RMN Os espectros foram obtidos com um espectrómetro JEOL JNM-AL400 RMN.
Os desvios químicos foram referenciados ao pico do solvente (CDCl 3 d H 7,24) como um
padrão interno. Os espectros de CD foram medidos com um espectro JASCO J-820.
polarímetro.
Ensaio de ramificação hifal. Os efeitos sobre a ramificação hifal dos fungos AM foram
avaliados in vitro pelo método de difusão em disco de papel. Esporos de G. margarita
Becker & Hall (CGC1411, Central Glass Co.), esterilizados à superfície com
0,2% de NaClO e 0,05% de Triton X-100 (e lavado com água destilada esterilizada
água) foram inseridos em gel Phytagel a 0,2% (Sigma-Aldrich) contendo
3 mM de MgSO 4 , em 60 mm pratos Petri de plástico. Os pratos foram incubados verticalmente
durante 5-7 dias num CO 2% 2 incubadora a 32 8C. Hifas secundárias emergindo de um
hifas primárias, que cresceram para cima de maneira geotrópica negativa no gel,
foram utilizados para o ensaio. As amostras de teste foram primeiro dissolvidas em acetona e depois diluídas
com etanol a 70% em água. A concentração de soluções de amostras de teste de
o 5-desoxi-estrigol natural foi ajustado com referência à calibração de
(^) - 5-desoxi-estrigol sintético na análise por HPLC. Discos de papel (6 mm de diâmetro;
ADVANTEC) carregado com 15 m l de solução de amostra de teste foram colocados em frente de
as pontas das hifas secundárias. O controle foi de etanol a 70% em água. o
padrões de ramo da hifa foram observados 24 horas após o tratamento A amostra foi
pontuou como positivo para ramificação do hifa se novos ramos do hifa se formarem a partir do
hifas secundárias tratadas ou hifas primárias localizadas próximas aos discos de papel.
CARTAS
10. Nagahashi, G. & Douds, DD Um bioensaio rápido e sensível com práticas
pedido de estudos sobre interações entre exsudatos radiculares e arbusculares
Cultura hidropônica. Sementes (, 2.000) de L. japonicus B-129 Gifu foram semeadas em
vermiculita em uma bandeja plástica com fundo de malha e cultivada por 11 dias em uma
armário de crescimento com um ciclo dia / noite de 16/8 h a 25/22 8C. A bandeja foi colocada em
recipiente de plástico cheio com meio 20lM (pH 6,8) sem sacarose e
vitaminas 30 . A solução foi aerada continuamente com água do aquário
bomba. Cinco semanas após a semeadura, um cartucho de carvão ativado foi colocado no
porta de entrada de água da bomba para extrair BF da solução. O hidropônico
solução foi usada para as experiências de fracionamento de solvente.
Fracionamento de solvente de BF. A solução hidropônica foi ajustada para pH2
usando HCl e extraído com acetato de etila. A fase de acetato de etila foi
Repartiu com 0,2 MK 2 HPO 4 (pH 9). A fase restante de acetato de etila foi
secou-se sobre Na 2 SO 4 e concentrou-se para dar uma fracção neutra. O primeiro aquoso
a fase foi ajustada para pH 12 usando NaOH e extraída com acetato de etila para dar
uma fracção básica solúvel em acetato de etilo. A segunda fase de 0.2MK 2 HPO 4 foi
acidificada a pH 2,0 e extraída com acetato de etila para dar origem a um acetato de etila
fração ácida solúvel.
Purificação de BF (5-desoxi-strigol). Após três dias no porto de entrada de água de
Na bomba, o cartucho de carvão ativado foi eluído com acetona. O etil
A fração neutra solúvel em acetato (4 mg) preparada a partir do eluato de acetona foi
cromatografada em coluna de sílica gel (Wakogel C-200, Wako Pure Chemical
Indústrias) e eluído gradualmente com solventes de polaridade crescente de
n-hexano em acetato de etilo, com incrementos de 10%. A fração eluída com 40%
o acetato de etila foi cromatografado em uma coluna Inertsil ODS-3 HPLC
( f 10 £ 250 mm, 5 m m; GL Sciences) empregando uma eluição de gradiente linear dentro
30min de 40% de acetonitrila em água a 100% de acetonitrila a uma taxa de fluxo de
3,8 ml min 21 . Os compostos eluídos da coluna foram monitorizados a 236 nm.
Aos 22,3 min, o 5-desoxi-estrigol eluiu como um único pico. Essa fração foi evaporada
para regar in vácuo e extraído três vezes com acetato de etilo. Após a remoção do
o solvente orgânico in vácuo, 5-desoxi-strigol (18 m g) foi obtido como um incolor,
sólido amorfo.
5-desoxi-estrigol: ultravioleta (acetonitrilo) l max 234 nm; infravermelho (KBr) n máx
1.784, 1.744, 1.683, 1.340, 1.024 cm 21 ; 1 H-RMN (400 MHz, CDCl 3 ) d 1,08 (3H, s,
H-9 ou H-10), 1,10 (3H, s, H-9 ou H-10), 2,01 (3H, t, J ± 1,5 Hz, H-7 0 ), 5,49
(1H, br.d.J ¼ 8,0 Hz, H-8b), 6,12 (1H, m, H- 0 ), 6,90 (1H, m, H-3 0 ), 7,39 (1H,
d, J ¼ 2,7 Hz, H-6 0 ); EIMS 70 eV, m / z (int. Rel.) 330 [M] þ (4), 315 (2), 233 (16),
216 (9), 215 (18), 205 (7), 201 (9), 187 (18), 97 (100); CD (acetonitrila) l max
(D 1 ) 262 (22,86), 230 (21,2) nm.
Síntese de ( 6 ) -5-desoxi-strigol. O anel racêmico do ABC foi sintetizado 21 ,
a partir de 2,2-dimetil-ciclo-hexanona 22 . Éster condensação do racêmico
Anel ABC com formato de etila seguido de alquilação com 4-bromo-2- racêmico
metil-2-buten-4-olide fornecida (^) - 5-desoxi-estrigol e sua 2 0 epímero 19 .
(^) - 5-Deoxy-strigol foi purificado por uma coluna de sílica gel (Wakogel C-200,
n-hexano-acetato de etila por etapas) e HPLC semi-preparativa (Inertsil ODS-3,
70% de acetonitrilo em água).
Recebido em 1 de março; aceito em 4 de abril de 2005.
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Informações Complementares estão vinculadas à versão on-line do artigo em
www.nature.com/nature.
Agradecimentos Agradecemos a M. Kawaguchi pelas discussões e críticas
leitura do manuscrito, Y. Sugimoto, por fornecer (^) - sorgolactona, GR24
e (þ) -strigol e K. Yoneyama para discussões e leitura crítica do
manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo Core Research for Evolutional Science
e Tecnologia (CREST), Agência de Ciência e Tecnologia do Japão e um
Auxílio à Pesquisa Científica do Ministério da Educação, Ciência,
Esportes e Cultura do Japão.
Informações do autor Informações sobre reimpressões e permissões estão disponíveis em
npg.nature.com/reprintsandpermissions. Os autores declaram não haver concorrência
interesses financeiros. Correspondências e solicitações de materiais devem ser
endereçado a KA (akiyama@biochem.osakafu-u.ac.jp).
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