UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO

COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

Relatório Parcial

PIBIC, PIBIC-AF, PIBIC-MS, PIBITI E VOLUNTÁRIOS

<Observação: Favor não alterar o layout desta página de rosto. Apenas preencha os dados
nos campos solicitados. A partir da segunda página estão os demais itens do modelo a serem
preenchidos.>

EDITAL / PROGRAMA
PIBIC ( x ) PIBIC-AF ( ) PIBIC-MS ( ) PIBITI ( ) VOLUNTÁRIO ( )

ESTUDANTE IC
(Digitar nome completo, sem abreviações).

Gloriene Carvalho de Jesus

Título do Plano de Trabalho do Estudante

(Digitar o título completo, sem abreviações, exatamente igual ao título do plano de trabalho aprovado).

Papel de receptores de glicocorticóides na sinalização de flavonoides em modelos in vitro

de doenças neurodegenerativas

ORIENTADOR
(Digitar nome completo, sem abreviações).

Suzana Braga de Souza

Título do Projeto do Orientador

(Digitar o título completo, sem abreviações, exatamente igual ao título do projeto do orientador).

Investigação da via de sinalização do receptor de glicocorticóide na atividade

neuroprotetora e anti-inflamatória de flavonoides em modelos de doenças
neurodegenerativas.

Salvador
Fevereiro /2020

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 1/7

 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO
COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

1. OBJETIVOS E METAS DO PROJETO DO ALUNO

● Esclarecer sobre o envolvimento da sinalização via receptores de glicocorticóides (GR) no
efeito imunomodulador de flavonoides em culturas de células gliais submetidas a
estímulos inflamatórios.
● Analisar a morfologia das células gliais (astrócitos e microglia) em resposta ao tratamento
neuroinflamação induzida por LPS, na presença ou não de antagonistas de receptor de
glicocorticóide.
● Analisar a expressão de citocinas em culturas de células gliais induzidas a neuroinflamação
com LPS tratadas com flavonoides, na presença ou não de antagonista do receptor de
glicocorticóide.
● Promover a capacitação técnico-científica através de técnicas de cultivo e avaliação de
células gliais.

2. PRINCIPAIS ETAPAS EXECUTADAS PELO ALUNO NO PERÍODO

● Treinamento para realização de atividades científicas

Foi realizado, pela técnica responsável pelo laboratório, treinamento em normas de biossegurança
e boas práticas em um laboratório de neurociências. O treinamento capacitou os estudantes de
iniciação científica à utilização de equipamentos de rotina do laboratório (e.g. pHmetro, balança,
centrífuga) e ao uso adequado da sala de cultura de células. fluxo estéril, a fim de que todos os
experimentos aconteçam com o melhor desempenho possível.

Foi realizado treinamento de biossegurança e boas práticas em laboratório para capacitar os

estudantes de iniciação científica a utilizarem os equipamentos de rotina do laboratório. Também
foi realizado acompanhamento das seguintes atividades:

● Lançamento e manutenção de culturas primárias de astrócitos e microglia

Foram realizados acompanhamentos para obtenção de cultura primária mediante revisão de

protocolo e discussão dos procedimentos já descritos na literatura do grupo (Souza et al., 2018). A
cultura primária de células gliais foi obtida de hemisférios cerebrais de ratos neonatos Wistar. Os
hemisférios cerebrais dos filhotes foram isolados assepticamente e as meninges foram removidas
mecanicamente. O córtex foi dissecado dentro de um fluxo estéril e submetido a uma dissociação
mecânica com o auxílio de uma pipeta pasteur. Posteriormente, a mistura composta pelas células
de interesse e restos de tecido do rato Wistar é forçado suavemente através de um filtro estéril de
células Falcon ™ de 70 µm. As células foram suspensas no meio DMEM, suplementado com L-
glutamina 2 mM, 0,011 g / l piruvato, 10% de soro fetal bovino (SFB), 3,6 g / L de Hepes, glicose 33
mM, 100 UI / mL penicilina G e estreptomicina 100 µg / ml, e cultivadas em placas de 100 mm em
uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 ° C.

Para garantir melhor desenvolvimento e crescimento destas células, o meio de cultura foi trocado
a cada dois dias durante quinze dias. Ao fim desse período, as células foram lavadas três vezes com
PBS e incubadas com tripsina ( EDTA) por aproximadamente cinco minutos. A incubação garante a
melhor atividade enzimática da tripsina. Em seguida, foi adicionado soro suplementado com 10 %

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 2/7

 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO
COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

de SFB, que inativa a ação da enzima. As células foram centrifugadas e ressuspendidas em meio
para então serem plaqueadas e incubadas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 ° C por 8
dias, quando os tratamentos foram realizados.

● Treinamento em Imunocitoquímica para marcadores de proliferação e morfologia glial

A imunocitoquímica consiste na localização de uma proteína característica na célula, através da

ligação específica do anticorpo com seu antígeno. Esta ligação leva a formação de um
imunocomplexo, o qual emitirá uma fluorescência quando o anticorpo secundário, portador do
fluoróforo, se ligar. Para realização desta técnica, ocorreram discussões e revisões dos protocolos,
bem como dos artigos publicados pelo próprio grupo. Primeiramente, as células pós- tratadas
foram fixadas em paraformaldeído 4%, por 20 min, a temperatura ambiente, para fixação das
proteínas e fatores de interesse para marcação. Em seguida, as células passaram por uma
sequência de lavagem com PBS por três vezes, permeabilização com Triton X-100 e outra lavagem
com PBS. O bloqueio foi feito com uma solução de albumina de soro bovino a 5% diluído com PBS
durante 1 hora. Após o bloqueio, as amostras foram incubadas com anticorpos primários contra
proteína ácida fibrilar glial (GFAP; DAKO Z0334) ou de anticorpo primário contra molécula
adaptadora da proteína de ligação ao cálcio 1 (Iba-1; Wako019-19741), diluídos em PBS contendo
1% de BSA durante três horas. As células foram lavadas com PBS três vezes; em seguida, o
anticorpo secundário contra imunoglobulina G (IgG) foi adicionado às células e incubados por 2 h.
Em seguida, as células foram lavadas com PBS apenas por 1 vez, e incubadas em câmara escura
umidificada com um agente intercalante de DNA (DAPI) por 5 min. Após incubação, as células
foram lavadas 1 vez com PBS e encaminhadas para montagem de lâminas de vidro com N-
propilgalato.

3. PRINCIPAIS RESULTADOS OBTIDOS

● Análise de proliferação e morfologia astrocitária e microglial em modelo de doenças
neurodegenerativas

A proliferação e morfologia glial serve como indicativo para determinar o comportamento destas
células frente à indução de uma neuroinflamação por lipopolissacarídeo (LPS), que condiz com os
quadros de doenças neurodegenerativas. Além de expressar a reação destas células aos
tratamentos com mifepristona (RU) e agathisflavona (FAB) durante o processo inflamatório.

Portanto, o objetivo deste experimento foi avaliar a proliferação e expressão de GFAP em

astrócitos, através do número de núcleos astrocitários positivos para BrdU e intensidade relativa
de fluorescência, respectivamente.

Para o experimento, os grupos foram divididos em: 1) Controle (DMSO); 2) RU a 1µM; 3) FAB a
1µM; 4) LPS a 1µM ; 5) FAB + RU; ; 6) LPS+FAB; 7) LPS + RU; 8) LPS+ FAB + RU.

As células foram incubadas por 72h com meio DMEM sem suplementação de soro fetal bovino
(SFB), contendo os respectivos tratamentos para cada grupo (retratados anteriormente). Após
incubação, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% (PFA 4%) em temperatura ambiente
por 20 min e preparadas para imunocitoquímica (descrito em materiais e métodos).

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 3/7

 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO
COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

Figura 1. Cultura de astrócitos

e microglia submetida a
diferentes tratamentos e
marcados contra a proteína
ácida fibrilar glial (GFAP,
verde), identificando
prolongamentos e corpo
celular de astrócitos. Núcleos
foram marcados por 4′,6-
diamidino-2-phenylindole
(DAPI, azul) e incorporação de
bromodeoxiuridina (BrdU, vermelho), mostrando a proliferação ao incorporar-se no DNA durante a fase de síntese (fase
S) .Escala 100 µm.

As marcações da imunocitoquímica indicam que houve um aumento significativo dos núcleos

astrocitários positivos para BrdU (BrdU+), após tratamento com a agathisflavona, quando
comparado ao controle. Este efeito foi consideravelmente ressaltado na presença de mifepristona
a 1 µM (FAB + RU), o que sugere uma atuação contrária do receptor de glicocorticoide a
agathisflavona sobre a proliferação astrocitária.

O tratamento com LPS, lipopolissacarídeo que promove resposta inflamatória neste modelo,
aumentou o número de núcleos BrdU+, em relação ao controle. Em contrapartida, esta condição
foi atenuada na presença da agathisflavona e/ou mifepristona. (LPS+FAB+RU ou LPS+RU).

Já quanto a expressão de GFAP, medida por meio da intensidade relativa de fluorescência, não
houve aumento após tratamento com agathisflavona, em relação ao controle. Todavia, há um
aumento significativo quando o FAB foi administrado juntamente a mifepristona (FAB+RU). A
administração de LPS levou a um aumento na expressão de GFAP, que não se mostrou afetada
diante da agathisflavona (LPS+FAB) e/ou mifepristona (LPS+FAB+RU ou LPS+RU).

4. DISCUSSÃO SUCINTA
Neste estudo, foi visto um considerável aumento na expressão da proteína ácida fibrilar glial
(GFAP, do inglês, glial fibrillary acidic protein) quando administrado LPS , bem como na associação
de mifepristona e agathisflavona. Resultado este que não se repete na aplicação de
agathisflavona em conjunto com LPS e/ou mifepristona. Por outro lado, a positividade dos núcleos

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 4/7

 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO
COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

astrocitários para BrdU (BrdU+) mostrou-se aumentada frente a aplicação de agathisflavona em

comparação com o controle. Além disso, este efeito foi intensificado na presença de mifepristona.

Os receptores de glicocorticóide (GR) são proteínas citoplasmáticas que contêm em sua estrutura
domínios comuns a outros membros da superfamília de receptores nucleares (Wright et al, 1993).
Eles possuem o cortisol como ligante natural e podem atuar como fatores de transcrição,
alterando a expressão dos genes alvo em resposta a um sinal específico de um ligante(Anti et al,
2008). Sua ativação pode induzir a síntese de proteínas anti-inflamatórias, como lipocortina-1 e
IkB, que concede a este receptor uma importante propriedade anti- inflamatória. O RU 486,
também conhecido como mifepristona, é um antagonista da progesterona e possui alta afinidade
pelo receptor de glicocorticóide. Sua administração permite visualizar a influência do GR inativado
em tratamentos com outras substâncias, como o flavonoide agathisflavona. Neste estudo, a
presença de Ru juntamente com a agathisflavona não levou a um aumento significativo da
intensidade relativa de GFAP, o que sugere uma atuação da agathisflavona não mediada pelo GR.

O flavonoide agathisflavona (FAB) é um biflavonóide constituído por um dímero de apigenina e

pode ser encontrado em diversos tipos e partes de plantas, como a Caesalpinia pyramidalis Tul.,
também conhecida como catingueira, presente no Nordeste brasileiro. Segundo Andrade et al,
este composto apresenta um considerável efeito antioxidante, podendo retardar ou evitar
significativamente a peroxidação lipídica e as demais moléculas responsáveis pela indução dos
radicais livres. Devido a esta capacidade, estudos vêm mostrando um potencial efeito
neuroprotetor da agathisflavona frente à doenças neurodegenerativas. Neste experimento, foi
visto um aumento na proliferação astrocitária através dos núcleos BrdU positivos, após
administração da agathisflavona, que se sustentou na presença de mifepristona. Por outro lado,
estudos indicam que o aumento da proliferação astrocitária pode ser fruto do modelo de cultura
empregado neste trabalho, já que a agathisflavona não modificou o número de astrócitos em
modelo de co-cultura com neurônios. (DOS SANTOS 33 SOUZA et al., 2018).

Além disso, foi possível observar um aumento tanto da expressão de GFAP, quanto nos núcleos
BRUD+ quando administrado LPS, sugerindo uma relação direta entre o lipopolissacarídeo e a
neuroinflamação. Por outro lado, a expressão de GFAP e proliferação não retratam com mais
clareza o perfil inflamatório deste experimento. Para melhor identificar se o perfil tende mais para
pró- inflamatório ou antiinflamatório, é necessário realizar testes com citocinas e fatores destas
culturas, para então analisar quais tipos são liberadas durante os tratamentos.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (máximo 15)

SANTOS, Cleonice C. et al. Aminochrome induces microglia and astrocyte activation. Toxicology in
Vitro, v. 42, p. 54-60, 2017.

DOS SANTOS SOUZA, Cleide et al. Agathisflavone, a flavonoid derived from Poincianella
pyramidalis (Tul.), enhances neuronal population and protects against glutamate excitotoxicity.
NeuroToxicology, v. 65, p. 85-97, 2018.

SILVA, A. R. et al. The flavonoid rutin induces astrocyte and microglia activation and regulates TNF-
alpha and NO release in primary glial cell cultures. Cell Biol Toxicol, v. 24, p.75–86, 2008.

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 5/7

 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO
COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

SANTOS, B. L. et al. Antiproliferative, proapoptotic and morphogenic effects of the flavonoid rutin
on human glioblastoma cells. Food Chemistry, v. 127, p. 404–411,2011.

WRIGHT, AP et al. Structure and function of the glucocorticoid receptor. J Steroid Biochem Mol
Biol. v. 47, p.11-9, 1993.

ANTI, Sônia Maria Alvarenga et al. Antiinflamatórios hormonais: Glicocorticóides. Einstein. v. 6. p.

S159-S65, 2008.

ANDRADE, A.W.L; MACHADO, K.L; MACHADO, K.L et al. In vitro antioxidant properties of the
biflavonoid agathisflavone. Chemistry Central Journal. v. 12, 2018.

6. OUTRAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS PELO ALUNO NO PERÍODO

● Sessões científicas semanais junto ao Laboratório de Neuroquímica e Biologia Molecular da UFBA-
(Labnq)- Ouvinte
● V Simpósio Internacional de Neuroquímica e Fisiopatologia da Célula Glial & X Simpósio de
Atualização em Farmacologia da UFBA - Comissão organizadora e Ouvinte.
● Defesa de doutorado de Monique Marylin Alves de Almeida. - Ouvinte
● Defesa de doutorado de Ravena Nascimento .- Ouvinte
● Qualificação de mestrado de Áurea Maria Almeida- Ouvinte.
● Defesa de mestrado de Deivison Silva Argolo- Ouvinte.
● Qualificação de doutorado de Rafael Short- Ouvinte.

● Preparo de aminocrono

A sintetização do aminocromo é feita a partir de de 7,5 mM de dopamina em 10ng de tirosina

incubados em tampão ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico monohidratado (MES) a 25 mM e pH
6 por cerca de 15 a 20 minutos em temperatura ambiente. A solução de incubação é submetida à
purificação por meio de uma coluna CM-Sephadex C50-1000 (18 × 0,7 cm) (Sigma-Aldrich, C25120)
com o uso do MES como eluente . Após coleta, o aminocromo apresenta uma coloração alaranjada
e sua detecção é dada por espectrofotometria, medindo a absorbância a 480 nm. A concentração
de aminocromo foi determinada através do coeficiente de extinção molar de 3058 M - 1 cm - 1.

● Treinamento em Western Blot

Para a técnica do western Blot, foi preciso dosar as proteínas presentes na amostra através do
método de Lowry utilizando um kit de reagentes para análise de proteínas. Para análise por imuno
transferência, foram carregadas 20 µg de proteínas em um empilhamento descontínuo de gel de
SDS-poliacrilamida 4% e 8%. A eletroforese foi realizada a 200 V por 45 min.Em seguida, as
proteínas foram então transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF), a
100V por 1h. As proteínas de cargas iguais foram confirmadas por coloração de membranas com
Ponceau Red. As membranas de PVDF foram encaminhadas para o bloqueio por 1 h à temperatura
ambiente em 20 mM de TBS (pH 7,5) contendo 0,05% de Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite em pó
desnatado. Após bloqueio, as membranas foram incubadas com o o anticorpo GFAP diluído em
TBS-T contendo 1% de leite desnatado em pó por 1 h. Posteriormente, houve a incubação com o
anticorpo secundário, também diluído em TBS-T. As bandas imunorreativas foram visualizadas
usando o kit de substrato conjugado com AP (Bio-Rad, Hercules, CA) de acordo com as instruções

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 6/7

 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, CRIAÇÃO E INOVAÇÃO
COORDENAÇÃO DE INICIAÇÃO A PESQUISA, CRIAÇÃO E
INOVAÇÃO

do fabricante. A quantificação foi obtida por densitometria de varredura e a análise foi feita com o
ImageJ 1.33u.

● Preparo de soluções
- Meio DMEM
- Meio DMEM F12
- Tampão salino fosfato (PBS)

7. DIFICULDADES ENCONTRADAS / CAUSAS E PROCEDIMENTOS PARA SUPERÁ-LAS

Os protocolos do Labnq referentes ao PCR e imunocitoquímica foram submetidos a uma
repadronização, a qual atrasou o andamento dos demais passos do projeto. Visto isso, só foi
possível obter as amostras para posterior extração de RNA, que dará início à etapa de PCR.
Para superá- las, é necessário uma reavaliação e repadronização dos protocolos para uma
realização eficiente do PCR e consequente retomada desta etapa do projeto.

Salvador, _______ de_____________ de XXXX.

Estudante Orientador (a)

Plano de Trabalho do Estudante Pág. 7/7