Crescimento Microbiano

1
Cultivo e Crescimento de Micro-organimos

Everlon Cid Rigobelo

2
 Objetivos

• Cultivo laboratorial de Micro-organismos

– Técnica asséptica

• Meios de cultura

• Meios sólidos

• Meios Líquidos

3
 Objetivos

• Crescimento de micro-organismos
– Crescimento de bactérias

– Crescimento de Fungos

– Multiplicação dos vírus

4
 Objetivos

• Métodos utilizados para a contagem do

crescimento de micro-organismos

– Contagem em placas
– Contagem em lâmina
– Turbidimetria

5
 Micro-organismos

Escherichia coli Aspergillus niger

Fonte: www.hyperscience.com 6
Bacteriófago
 Finalidade de cultivo

• Isolar e identificar

• Testes utilizados:

– Tintoriais, morfológicos, bioquímicos

sorológicos e moleculares

7
 Morfologia dos Micro-organismos

Vírus animal

Bactérias do solo

Micorrizas
Fonte: www.hyperscience.com 8
 Testes de Identificação

Teste Bioquímico
Teste Tintorial

Teste Sorológico 9
Teste Molecular
Fonte: www.rehagro.com.br
Importância dos micro-organismos

Doenças de Planta
Álcool e Bebidas Bactericidas

Antibióticos
Produtos Láctios Probióticos 10
Fonte: www.brasilescola.com.br
 Cultivo laboratorial de micro-
organismos

• Cultura com um único micro-organismo

– Ausência de contaminantes

– Meios sólidos crescimento das colônias

– Uniformidade das colônias

Fonte: www.worldespress.com 11
Cultura Pura
 Cultivo laboratorial de micro-
organismos

• Técnica asséptica

– Meios esterilizados

Esterilização calor úmido

– Câmara de fluxo laminar

– Uso da chama do bico de Bunsen 12

Fonte: www.worldespress.com
 Técnicas Assépticas
Fluxo Laminar Bico de Bunsen

13
Fonte: www.worldespress.com
 Cultivo de micro-organismos

• Meios de Cultura
– Soluções nutrientes que promovem o
crescimento microbiano

• Classes de meios de cultura

– Meios definidos e meios complexos

Fonte: www.biomedicinamicro.com 14
Agar Sangue
 Meios Definidos

• Quantidades precisas de compostos:

– Orgânicos e inorgânicos

– Fonte de Carbono

– Origem e a concentração da fonte de Carbono

• Depende
– Do micro-organismos cultivado
15
 Meios Complexos

• Digestos de produtos animais ou vegetais

– Caseína (proteína do leite)

– Carne (extrato de carne)

– Soja (caldo tríptico de soja) Agar Trípico Soja

– Células de leveduras (extrato de leveduras)

Fonte: www.biomedicinamicro.com 16
 Meios Complexos

• Possuem substâncias altamente nutritivas

• Porém impuras
• Comercializados na forma de pó
– Pesados e dissolvidos em água destilada

Agar Seletivo 17
Fonte: www.biomedicinamicro.com
 Meios Complexos

caseína Extrato de carne

Trípico de soja Extrato de Levedura

18
Fonte: www.biomedicinamicro.com
 Meios Seletivos

• Inibem seletivamente o crescimento de

micro-organismos
– Presença de compostos

Agar Baird Parker

19
Fonte: www.pvl.pt
 Meio Diferencial
• Possui um indicador
Agar TSI

– Permite a diferenciação de reações químicas

– Específicas que ocorrem durante o crescimento

• Alguns microrganismos realizam:

– Reações particulares outros não

– São úteis na distinção e espécies bacterianas

20
Fonte: www.pvl.pt
 Meio Sólido

• Adição de um agente gelificante aos meios

líquidos

Agar NI
• Vantagens
– Imobilizam as células
– Crescem em massas isoladas e visíveis

Fonte: www.mkldiagnostic.com 21
 Agar

Alga da classe Rodophyta Agar

Agar Mitis Salivarius

Fonte: www.mkldiagnostic.com 22
 Crescimento de Bactérias

• Fase elongação
– Podem atingir o dobro do comprimento

• Formação do septo
– Crescimento da membrana plasmática
– Parede celular no interior da célula

• Divisão
– Formam partição que divide a célula em duas

23
Fonte: www.mkldiagnostic.com
 Fissão Binária

• Geração

• Tempo de geração

24
 Crescimento de bactérias

• Culturas de batelada
– Sistema fechado

– Sofre alterações contínuas

– Atividades metabólicas dos micro-organismos

– Alterações drásticas na composição química e

física dos meios de culturas

25
 Culturas de Batelada

Fermentação Alcoólica Usina Sucro alcooleira

26
Fermentação Acoólica
Fonte: www.shared.com
27
 Ciclo de Crescimento Microbiano
• Fase Lag
– Pouca ou ausência de divisão celular

– Síntese enzimática e de moléculas variadas

– Pode ser curta ou longa dependendo das condições

fisiológicas do inóculo

– Aumento da quantidade de proteínas no peso seco,

e no tamanho celular
28
 Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Exponencial
– Crescimento Exponencial das células
– Tempo de geração constante

• Taxa de Crescimento Exponencial

– Número de gerações por Unidade de Tempo
– Será curto ou longo dependendo da
disponibilidades de nutrientes
– Estudos enzimáticos são realizados nesta fase
29
30
 Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Estacionária
– Não se observa crescimento microbiano

– Podem prosseguir o metabolismo energético e

processos biossintéticos

– Consumo de um nutriente essencial

– Acúmulo de um produto de excreção do organismo

31
 Ciclo de Crescimento Microbiano

• Fase Morte
– Número de células mortas excede o de células
vivas

– A taxa de morte pode ser inferior a taxa de

crescimento exponencial

– A contagem total permanece constante, enquanto

que a taxa de células viáveis cai lentamente

– Pode ocorrer lise celular

32
 Cultura contínua: quimiostato

• Culturas são mantidas constantes

– Longo período de tempo

– Sistema aberto

– Mantém um volume constante

– Adicionado um meio de cultura fresco a uma taxa

constante

– Remove-se o mesmo volume de meio usado

33
 Cultura contínua: quimiostato

• Cultura contínua
– Sistema em equilíbrio

• O volume do quimiostato
– Número de células e a quantidade de nutrientes
– Permanecem constantes
34
Fonte: www.podcastmicro.com
 Quimiostato

• Permite o controle
– Taxa de crescimento populacional da cultura
– Densidade populacional da cultura

• Fatores importantes para esse controle

– Taxa de diluição
– Concentração de um nutriente limitante C - N
35
 Crescimento em Fungos

– Crescimento e disseminação de filamentos de

hifas

– Produção assexuada de esporos

– Produção esporos sexuais

– Simples divisão celular - brotamento

36
 Micorrizas

37
Fonte: www.infoescola.com
 Crescimento de vírus

• Vírus
– Parasitas obrigatórios
– Crescimento utilizando a maquinaria celular da
célula hospedeira

38
Fonte: www.infoescola.com
 Multiplicação dos Vírus

• Multiplicação do vírus
– Culturas de células – Hela, Vero, BHK, IBRS2

Células de Fibroblastos

39
Fonte: www.infoescola.com
 Multiplicação dos Vírus

• Inoculação em ovos embrionados

Vias de Inoculação Lesões Virais

40
Fonte: www.infoescola.com
 Multiplicação Viral

• Animais de Laboratório

41
Fonte: www.infoescola.com
Medidas do Crescimento Microbiano
Medidas do Crescimento Microbiano
Diretas Indiretas

Contagem de Viáveis Verificação da Turbidez

Contagem de Células Totais

42
 Medidas de Crescimento

• Contagem Direta
– No número de células viáveis

– Alterações na concentração de algum

componente celular

– Proteínas, ácidos nucleicos e peso seco das

próprias células

43
 Medidas de Crescimento

• Contagem de Células Totais

– Contagem microscópica células
– Amostras secas ou líquidas

• Amostras secas
– Podem ser coradas para aumentar o contraste em
as células e o fundo

44
 Medidas Diretas do Crescimento
Microbiano
• Contagem em placas
– Contagem das células viáveis

– Cada colônia é originada de uma única bactéria (UFC)

– Inóculo original é sempre homogêneo

– Não existe agregação de células

• Desvantagem: precisa de 24 horas de incubação

45
 Contagem de Células Viáveis

• Viável – capaz de se dividir

• Contagem do número de células em uma

placa
– Capazes de formar colônias

– Contagem de placa

• Método da semeadura por espalhamento

• Método da semeadura em profundidade

46
47
 Método da Semeadura por
Profundidade
– Volume de 0,1 – 1mL

– Pipetado em uma placa de meio estéril

– Adiciona-se meio de cultura fundido

– Mistura-se com movimentos delicados

• Formação de colônias por toda a placa

– Não somente na superfície do ágar

48
Método de Semeadura

49
 Medidas Diretas do Crescimento
Microbiano
• Contagem em Lâmina
– Utilização de câmaras de contagem (Neubauer)

– Lâmina quadriculada de área conhecida (grid)

– Lamínula sobre a superfície da lâmina de vidro

50
Fonte: www.infoescola.com
 Limitações da Contagem
Microscópica
• Apesar de serem rápidas e simples

• Limitações são:
– Não se distingue células vivas e mortas sem
coloração especial

– Células pequenas são de difícil visualização

– Técnica pouco precisa

– Células móveis precisam ser fixadas

51
52
 Método da Semeadura por
Espalhamento
– Volume de 0,1mL

– Espalhado sobre a superfície do meio sólido com

o auxílio de alça

– Incubação da placa e crescimento

– Contagem do número de colônias

53
 Contagem por Turbidimetria

• Medição do aumento de componentes

celulares
– Proteínas, DNA e peso seco de uma cultura

• Medidas de turbidez
– Suspensão celular – aspecto turvo
– Quanto maior o número de células – maior a luz
dispersa
– Avaliação da massa total de células proporcional
ao número de células
54
 Turbidimetria

55
Fonte: www.infoescola.com
Número Mais Provável

56
 Contagem de Vírus

• Placas de Lise
– Inoculação do vírus em culturas celulares

– Contagem de células lisadas

– Cada célula equivale a um vírion

• Teste de Elisa
– Número de ligações entre os vírus e o anticorpo

57
Contagem de Vírus em Placas de
Lise

58
Teste de Elisa

59
 Temperatura e Crescimento
Microbiano
• Temperatura
– Fator mais importante que afeta o crescimento
microbiano

– Temperaturas muito frias ou muitos quentes os

micro-organismos não são capazes de crescer

– As temperaturas máximas e mínimas refletem a

variação da temperatura média de seus hábitats.

60
 Classes Térmicas de Micro-
organismos
• Psicrófilos
– Temperaturas baixas
• Mesófilos
– Temperaturas medianas
• Termófilos
– Temperaturas altas
• Hipertermófilos
– Temperaturas muito elevadas

61
62
Fatores que influenciam a atividade
enzimática
• Temperatura
– Em altas temperaturas, as enzimas sofrem
desnaturação e perdem suas propriedades
catalíticas
– Em baixas temperaturas, a taxa de reação diminui
• pH
– pH no qual a atividade enzimática é máxima é
conhecido como pH ótimo
• Concentração do substrato
– Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta
com o aumento da concentração do substrato
63
64
65
 Literatura Consultada

Microbiologia de Brook, Michael T. Madigan,

2010.
Pelczar, Jr., Joseph Michael. Microbiologia,

66
Muito Obrigado!

67