MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
DISCIPLINA DE ANÁLISE DE ALIMENTOS

Determinação de proteína e
aminoácidos em alimentos

Profa. Rosana Aparecida da Silva Buzanello

 Introdução

 Funções das proteínas

 Nos organismos vivos:

 Regeneração de tecidos;
 Catalisadores de reações nos organismos vivos;
 Reações imunológicas;
 Crescimento e reprodução;
 Elemento estrutural do organismo animal;
 Energética.
 Introdução

 Funções das proteínas (continuação)

 Nos alimentos:

 Nutricional
 Fonte de aminoácidos essenciais;
 Alergia alimentar;

 Sensorial
 Participa de reações que envolvem produção de compostos aromáticos
e de cor;
 Atuam como agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e
espessantes.
 Introdução

 Definição de proteínas:

 Polímeros de alto peso molecular constituídos por unidades

monoméricas de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas.

 Substâncias orgânicas complexas que apresentam, em média:

 50-55% de C,
 20-23 % de O,
 14-18 % de N,
 6-8% de H,
 0-4 % de S.
 Importância da análise

 Determinação de proteínas:

 Para informar sobre o valor nutricional e compor a Informação

Nutricional nos rótulos dos produtos alimentícios.
 Importância da análise

 Determinação de proteínas:

 Estimar rendimento industrial;

 Avaliar a qualidade (por exemplo, determinação de glúten em farinha);

 Avaliar a influência nas propriedades sensoriais.

 Importância da análise

 Determinação de aminoácidos:

 Validar estudos de sequência de aminoácidos;

 Confirmar a identidade de proteínas biossintéticas;

 Avaliar a pureza de proteínas;

 Investigação de distúrbios fisiológicos causados por aminoácidos;

 Avaliação nutricional.
 Métodos de análises de proteínas em alimentos

 Podem ser quantificadas e/ou estimadas através da determinação de:

 Análises elementares:

 Os elementos analisados geralmente são C ou N;

 Grupos:

 Aminoácidos e ligações peptídicas.

 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de carbono
 Vantagens:
 Digestão mais fácil do que para nitrogênio;
 Menores erros no resultado devido a maior quantidade em relação
ao nitrogênio;
 Fator de correção mais constante que para o N.
 Desvantagens
 Maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína
dos carbonos de outros componentes.
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio

 É a determinação mais empregada - método oficial e padrão.

 Considera que as proteínas apresentam, em média, 16% de

nitrogênio.

 Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é

de 6,25%.

% Proteínas = F x %N
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio

 Quando o conteúdo de nitrogênio for muito diferente de 16%,

considera-se outro fator:
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Etapas e reações envolvidas:

 Digestão;

 Neutralização e destilação;

 Titulação;

 Conversão do nitrogênio total para teor de proteína.

 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Etapas e reações envolvidas - Digestão:

Cobre
Selênio
Mercúrio
Oxidação úmida

Bloco digestor
Fonte: PURGATO (2005)
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Etapas e reações envolvidas - Neutralização e Destilação:

Fonte: PURGATO (2005)

 DESTILADOR
NaOH

DIGESTOR

Água de
arraste
Erlenmeyer com
solução de H3BO3
Amostra
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Etapas e reações envolvidas - Titulação:

Observação:
A metodologia inicial
previa a utilização de
uma solução padrão de
ácido sulfúrico como
coletora de nitrogênio,
que posteriormente era
titulada com uma
solução padrão de
NaOH.

Fonte: PURGATO (2005)

 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Vantagens:

 Alta precisão;

 Boa reprodutibilidade;

 Variações permitem utilizar menor quantidade de amostra e de

reagentes (Micro-Kjeldahl).
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Desvantagens:

 Utiliza substâncias corrosivas/ oxidantes;

 Demorado;

 Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção,

pois tem diferentes sequências de aminoácidos e,
consequentemente, de composição em nitrogênio.
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Kjeldahl

 Desvantagens:

 Não detecta só proteína:

N proteico e não proteico.

Fonte: PURGATO (2005)

 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Dumas

 Determina N total após combustão da amostra (100-500 mg) a 700-

800 °C em CO2, H2O e N2, sendo este último medido
volumetricamente.

 Equipamento: CG com uma coluna que detecta a condutividade

térmica.

 O N determinado também precisa ser convertido em proteína.

 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Dumas

Combustão da amostra Medição do

(700º-800ºC) N gasoso
Oxidação à seco
 Análises de proteínas – análises elementares

 Análise de nitrogênio - Método de Dumas

 Desvantagens:
 Amostra muito pequena;
 Custo elevado;
 Mede N proteico e não proteico.
 Vantagens:
 Mais rápido que o Kjeldahl (cerca de 4 min);
 Não requer compostos tóxicos nem catalisadores;
 Permite automatização (até 150 análises);
 Aplicável para todos os alimentos.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por biureto

 Princípio:

 Compostos com duas ou mais ligações peptídicas formam um

complexo de coloração roxa com sais de cobre em solução
alcalina.

 A proteína é misturada com o reagente de Biureto, que contém:

sulfato de cobre, NaOH e tartarato de sódio e potássio.

 Após 15-30 min mede-se a absorbância em 540 nm, cuja

intensidade da cor será proporcional a quantidade de proteína.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por biureto

 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por biureto

 Vantagens
 Específico;
 Simples, rápido e barato;
 Determina proteína.
 Desvantagens:
 Necessita de uma curva de calibração tomada com um padrão
conhecido de proteína;
 A tonalidade de cor formada não é idêntica para todas as proteínas.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por biureto

 Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à
quantidade.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por fenol – Follin-Ciocalteau-Lowry

 Princípio:
 Baseia-se na interação das proteínas com os reagentes fenol e
cobre em condições alcalinas.
 Envolve a oxidação, catalisada pelo cobre, de aminoácidos
aromáticos por um reagente heteropolifosfato (fosfotungstico-
fosfomolíbdico), desenvolvendo cor azul, cuja intensidade é medida
em comprimento de onda de 500-750 nm.
 500 nm: determinação de concentrações proteicas elevadas.
 750 nm: determinação de menores concentrações.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por fenol – Follin-Ciocalteau-Lowry

 Vantagens:
 Alta sensibilidade e especificidade.
 Desvantagens:
 A intensidade da cor varia com a composição de proteína e condições
analíticas;
 Lento;
 Operações múltiplas;
 Necessita de curva padrão com proteína conhecida;
 Necessita de um tempo de incubação.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método por fenol – espectrofotometria UV

 Princípio:
 A maioria das proteínas possui absorção UV em 280 nm devido a presença
de aas aromáticos (tir, trp e fen).
 Vantagens:
 Rápido e simples
 Desvantagens:
 Resultados não muito precisos, pois dependem da composição em aas
aromáticos da proteína;
 Os ácidos nucléicos interferem na amostra;
 Tempo de preparo da amostra muito longo.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método Turbidimétrico
 Princípio:
 Baseia-se na turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente
precipitante (ácido tricloroacético, ferrocianeto de potássio e ácido
sulfossalicílico).
 Vantagens:
 Rápido e simples para amostras em que a proteína encontra-se em solução.
 Desvantagens:
 Não é vantajoso para amostras sólidas (necessita extração da proteína);
 Pode ocorrer precipitação de outras substâncias;
 Necessita calibração com padrões conhecidos.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método Dye-binding
 Princípio:
 Baseia-se na reação entre proteína e excesso de um corante (Laranja G,
laranja 12, vermelho A, preto búfalo, preto amino 10B), no qual o complexo
formado é removido e mede-se a quantidade de corante que não reagiu.
 O resultado é obtido por diferença.
DYE-BINDING

Fundamento:

Amostra Formação de Separação

+ um complexo (centrifugação
corante insolúvel ou filtração)
(exc.)

 Boa correlação com o Kjeldahl. Mede o excesso

de corante que
não reagiu

Por diferença obtém-

se a quantidade de
proteína
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Método Dye-binding

 Vantagens:

 Simples, rápido, exato e econômico.

 Desvantagens:

 Necessita de equipamento específico.

 Cor varia de acordo com a proteína.

 Reage com cubeta de quartzo.

 Análises de proteínas – análises por grupo

 Métodos Físicos

 Densidade

 A densidade da proteína é superior a da maioria dos componentes

dos alimentos;

 Quanto maior o teor de proteína, maior será a densidade.

 Índice de refração:

 Quanto maior o teor de proteína, maior o índice de refração.

 Análises de proteínas – análises por grupo

 Quantificação por medida de adsorção por IV

 Princípio:

 Grupos químicos no esqueleto

polipeptídico possuem vibrações
características (3300-3500nm, 2080-
2220nm, 1560-1670nm), que permite
absorção de radiação IV a
determinados comprimentos de onda,
propriedade esta usada para
quantificar concentração proteica
numa amostra.
 Análises de proteínas – análises por grupo

 Quantificação por medida de adsorção por IV

 Vantagens:
 Permite análise rápida e on-line.

 Não destrutivo.

 Não necessita muita preparação de amostra.

 Desvantagens:
 Elevado custo inicial.

 Requer calibração demorada.

 Análise de aminoácidos

 Quantificação pelo método de ninhidrina:

 Princípio:
 Baseia-se na reação de desaminação oxidativa dos aminoácidos,
produzindo amônia (NH3) e a redução da ninhidrina a hidrindantina.

 Esta reage com a amônia liberada, formando um complexo azul,

com absorção máxima em luz de comprimento de onda de 570 nm.

 A intensidade da cor azul produzida em condições padronizadas

serve de base para um teste quantitativo para aminoácidos, podendo
detectar até 1µg de aminoácido.
Análise de aminoácidos

 A ninhidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) é
um produto químico utilizado para a detecção de
aminas primárias, particularmente de aminoácidos.

 Ao reagir com essas aminas livres, uma cor azul

escura ou roxa, conhecida como púrpura de
Ruhemann é produzida.

 Comumente usada para detectar impressões

digitais - reação com os aminogrupos terminais das
moléculas de lisina incorporadas nas proteínas ou
peptídeos: sensível para revelar resíduos de pele.
 Análise de aminoácidos

 Quantificação pelo método de ninhidrina:

 Princípio:
 Outras aminas além dos aminoácidos, também reagem com a
ninhidrina, formando uma cor azul, mas sem ocorrer liberação de
CO2, a qual é indicativa de um aminoácido.

 A amônia (NH3) e peptídeos também reagem, porém, mais

lentamente que os α-aminoácidos.

 A prolina e a 4-hidroxiprolina produzem um complexo de cor amarela

quando reagem com a ninhidrina.
 Análise de aminoácidos

 Analisador de aminoácidos:

 Cromatografia líquida de alta eficiência.

 Cromatografia gasosa.
 REFERÊNCIAS

 CARVALHO, H. H. et al. Alimentos: métodos físicos e químicos de análise.

Porto Alegre: UFRGS, 2002.
 CECCHI, H. M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2 ed.
Campinas: UNICAMP, 2003.
 INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas. Métodos químicos e físicos para
análise de alimentos. v. 1, 3 ed. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 1985.
 GOMES, J. C.; OLIVEIRA, G. F. Análises físico-químicas de alimentos. Viçosa:
UFV, 2011.
 SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. Análise de alimentos: métodos químicos e
biológicos. Viçosa: UFV, 2009.
 Sites:
 http://www.pfigueiredo.org/BromII_3.pdf
 xa.yimg.com/kq/groups/21698665/3175234/.../aula7-proteinas2.ppt