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IMUNOENSAIOS:

IMUNOENSAIOS • IMUNOPRECIPITAÇÃO

• IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO

• RADIOIMUNOENSAIO (RIA)

• ENZIMOIMUNOENSAIO
MODELOS DE TESTES • IMUNOENSAIOS FLUORESCENTES

• IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE

Natalia Witzke Testoni – estagiária Laboratório Verner Willrich

IMUNOPRECIPITAÇÃO

IMUNOPRECIPITAÇÃO NEFELOMETRIA:
n As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e até quantificar
precipitados resultantes da interação antígeno- anticorpo. Segundo o princípio da nefelometria, as reações de
precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas
n Entre os principais interferentes, entre físicos-químicos e imunológicos, produzem um aumento da reflexão da luz, que pode ser
o que mais interfere na quantidade de precipitado formado são as diretamente medida pela dispersão da luz incidente.
concentrações relativas de antígeno e e de anticorpos.

Princípio de Tyndall:
Sensor

Feixe de Luz Sensor

Sensor
Estrutura da malha quando há Equivalência Estrutura da malha quando há
excesso de Ac excesso de Ag
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO

IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO n Fatores que diferem a formação dos

agregados:

• Classe do anticorpo envolvido

• Concentração iônica e pH do meio
A característica principal da imunoaglutinação é • Presença de macromoléculas, íons, enzimas e
que um dos componentes é apresentado na conservantes.
forma insolúvel em suspensão, de forma natural • Tempo e temperatura
em células ou adsorvido artificialmente em • Padronização adequada da suspensão de
micropartículas ou células. micropartículas ou células.
• Concentração ótima de antígeno ou Ac a ser fixado
nas micropartículas ou células.
• Estabilidade da ligação do Ag/Ac e acessibilidade
dessa molécula nas micropartículas ou células.

VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

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IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO

n AGLUTINAÇÃO DIRETA:
Neste teste, o antígeno faz parte naturalmente da célula, e
haverá aglutinação dessas células promovida por anticorpo
AGLUTINAÇÃO INDIRETA:
contra esses antígenos (antígeno é naturalmente insolúvel). Esse método emprega a absorção de anticorpos ou
antígenos protéicos solúveis na superfície de
micropartículas inertes (suporte).

Antígeno Complexo precipitado As principais partículas usadas como suporte são o

Anticorpo conjugado
látex, hemácias e gelatina.
Ex: Identificação de antígenos eritrocitários na tipagem sanguínea, reação de Widal

VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

IMUNOAGLUTINAÇÃO IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO

Vantagens da técnica de imunoaglutinação:
• Baixo custo
• Elevada sensibilidade
INDIRETA

• Leitura visual
Antígeno • Facilidade de execução
Anticorpo conjugado
A aglutinação ocorre quando há formação de Complexo precipitado
agregados suficientemente grandes de Desvantagens da técnica de imunoaglutinação:
micropartículas ou células interligados por
pontes moleculares de anticorpos
• Reprodutibilidade dos lotes de reagentes.
• Acessibilidade molecular para interação Ag-Ac
• Estabilidade da ligação do Ag/Ac no suporte

Antígeno conjugado Anticorpo

HENRY VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

RADIOIMUNOENSAIO (RIA) RADIOIMUNOENSAIO (RIA)

• Os Radioimunoensaios utilizam anticorpos 1° MÉTODO:
conjugados com radioisótopos para quantificar os Uma quantidade conhecida de antígenos marcados e Antígenos da
ensaios. amostras são misturadas e reagem competitivamente com uma
quantidade fixa de Anticorpos fixos na fase sólida.
• Os radioisótopos podem ser: Iodo 125 ou 131,
Depois que a reação imune atinge o equilíbrio, a mistura é lavada
Cobalto, Trício. para remover os conjugados não reativos, que são separados do
complexo imune preso na fase sólida. A concentração do analito é
inversamente proporcional ao sinal emitido.
• Devido a meia-vida dos reagentes utilizados, o risco
operacional e a necessidade de medidas especiais e
de elevado custo de biossegurança e descarte de
material levam a laboratórios optarem por técnicas Lavagem

que empregam reagentes de maior estabilidade.

http://www.dpcmedlab.com.br/areacientifica/metodologias.asp Antígeno da amostra Antígeno conjugado
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods

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RADIOIMUNOENSAIO (RIA) RADIOIMUNOENSAIO (RIA)

2° MANEIRA:
• Vantagens:
Método do sanduíche, onde um anticorpo ligado a fase sólida
– Alta sensibilidade
forma um imunocomplexo. Um segundo Anticorpo conjugado se liga ao
imunocomplexo. – Permite medidas rápidas e precisas
É feito uma lavagem para retirar os anticorpos conjugados não – Limiar de detecção em nanogramas e picogramas.
reativos. E em seguida é feita a lavagem

• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
A concentração do
analito é diretamente Quantificação
proporcional ao sinal
emitido.
Ténicas imunológicas -
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ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA) ENZIMOIMUNOENSAIO

• É similar a RIA, exceto que é a atividade Enzima

enzimática que é quantificada e não a

radioatividade. Enzima

Ensaio competitivo Ensaio Não-competitivo (sanduíche)

• O EIA requer um processo secundário para

obter o sinal através das reações catalíticas
Enzima
das enzimas.
Ensaio Antígeno
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
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ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA) ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA)

Vantagens: Desvantagens:

Reagentes são relativamente • A quantificação da enzima

ENZIMA baratos e tem uma longa pode ser mais complexa que
ENZIMA estabilidade a de alguns radioisótopos.

ENZIMA • Podem ser desenvolvidos • Atividade enzimática pode

múltiplos ensaios simultâneos ser afetada por constituintes
do plasma
ENZIMA • O equipamento é barato e
facilmente disponível • Ensaios homogêneos não
ENZIMA são tão sensíveis quanto os
RIA.
• Não há riscos de radiação
durante a marcação ou
Forma ativa descarte do teste • EIA para moléculas protéicas
da enzima grandes necessitam de
reagentes imunoquímicos
complexos
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods
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ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA) Variação nos tons

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

Baseia-se na imobilização de um dos

componentes, em fase sólida, e na utilização de
um conjugado ligado a uma enzima.

Como o substrato forma um produto colorido,

a alteração de cor é monitorada visualmente ou
por meio de espectrofotômetro que relaciona a
quantidade de substância dosada à intensidade de
cor.

MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods n httpwww.microvet.arizona.educoursesmic419ToolBoxelisa3.jpg

ENZIMOIMUNOENSAIO (EIA) MEIA – Microparticle Enzyme Immuno Assay

Ele apresenta: n Depois do ELISA, nasceu o MEIA. A tecnologia MEIA

tem como princípio o uso de micropartículas
• Elevada sensibilidade sensibilizadas com anticorpos ou antígenos
• Rapidez e baixo custo (dependendo da finalidade do produto), sendo sua
técnica utilizada para testes qualitativos e quantitativos.
• Objetividade na leitura
• Possibilidade de adaptação a diferentes
graus de automação. n O fato de utilizar micropartículas como fase sólida
aumenta a superfície de contato entre as partes da
• utiliza reagentes estáveis
solução, aumentando a sensibilidade e a especificidade
• não trabalha com radioisótopos do método e diminuindo o seu tempo de incubação.
• Não depende de formação de precipitado,
aglutinado, etc.
PAULA, T. B. C.; MORONI, A. F.; GUAZZELLI, C.; NONOYAMA, K.; SALZONE, C. M. Efeitos dos contraceptivos hormonais orais de baixa dosagem
estrogênica nas taxas de folato intra-eritrocitário
VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods

ENSAIOS IMUNOFLUORESCENTES IMUNOFLUORESCENTES

n Nos testes de imunofluorescência são Os testes de imunofluorescência podem ser classificados

de acordo com o componente marcado (antígeno ou
empregados anticorpos ou antígenos anticorpo), pelo método (competitivo ou não competitivo), por
conjugados a moléculas reveladoras serem homogêneos ou heterogêneos, ou ainda pela
realização em fase sólida ou líquida.
chamadas fluorocromos
fluorocromos..
• A principal aplicação da imunofluorescência direta é na
imunocitoquímica (doenças imunológicas renais e de pele).

• A imunofluorescência indireta amplifica o sinal e aumenta a

sensibilidade do teste. Além disso, pode ser empregado na
pesquisa de antígenos (plasmódio em hemácia) e de anticorpos
(sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus do herpes
simples, doença de Chagas, malária, etc).

Técnica imunológicas -
MAPHERSON, R.A., PINCUS, M. R. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods VAZ, A. J.; TAKEI, K.; BUENO, E. C.; Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
IMUNOFLUORESCENTES
• As VANTAGENS da imunofluorescência indireta:
– Sensibilidade
– Especificidade
– Reprodutibilidade
– De simples padronização e execução

• As DESVANTAGENS da imunofluorescência indireta:

– Necessidade de microscópio de fluorescência
– Subjetividade na leitura
– Não-automação

http://www.labsaluti.com.br/img/fotoifichagas.png

IMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE Vantagens sobre o ELISA e MEIA

Esses teste utilizam como conjugados moléculas
geradoras de quimioluminescência como os derivados
do luminol, ésteres acridinium, derivados de nitrofenil n O sinal da quimioluminescência é um sinal que
oxalato ou rutenium tri-bipridyl com tripropilamina(TPA). permite verificar muito mais variações que o sinal
colorimétrico emitido pelo ELISA ou MEIA.
Esta reação hidrolisa o substrato quimiluminescente
gerando um produto instável o qual após estabilização
gera emissão de fótons de luz (amplificados) que é n Devido à elevada sensibilidade, os ensaios de
medida através de um fotomultiplicador, que tem a
quimiluminescentes são muito usados para a
função de transformar a luz emitida pelos fótons em
determinação quantitativa de hormônios, marcadores
impulsos elétricos.
tumorais, peptídeos e drogas.
Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por
segundo (cps).
http://www.dpcmedlab.com.br/areacientifica/metodologias.asp Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics
ELETROQUIMIOLUMINESCENCIA

ELETROQUIMIOLUMINESCENCIA

ECLIA Leitura:
A eletroquimioluminescência ocorre quando é
aplicada uma corrente elétrica em um eletrodo de 1. Utilizando um ímã as micropartículas que se encontram
revestidas com complexos de antígeno - anticorpo são
platina, cria um campo elétrico que fazendo com que uniformemente depositadas no eletrodo de trabalho.
todos os materiais nesse campo reajam.
2. O ímã é removido e depois é aplicada a voltagem ao
Complexo que gera a luminescência: eletrodo onde estão depositadas as micropartículas.

Rutênio(II)tri(bipiridil) + Tripropilamina 3. A emissão de luz é medida com um fotomultiplicador.

[Ru(bpi)3]2 (TPA)
4. Depois da medição as micropartículas são limpas da
O rutênio e o TPA são estáveis quando não é superfície do eletrodo usando o Clean Cell
aplicada a voltagem.

Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics

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-Método sanduíche
Primeira etapa Segunda etapa

Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics Terceira etapa

ELETROQUIMIOLUMINESCENCIA

VANTAGENS
• Marcação estável permite utilizar reagentes líquidos.

- • Tem alta sensibilidade com um período curto de

incubação (Elecsys: 18 minutos)

• Não existem grandes necessidades de diluição.

• É aplicável na detecção de todos os analitos

(métodos)

• A vantagem de iniciar a reação quimioluminescente

eletricamente reside no fato de se possível controlar,
com rigor, toda a reação.

Manual Elecsys 2010 – Roche Diagnostics

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