Artigo 3

17/04/2021 Development of a Simple RP-HPLC-UV Method for Determination of Azithromycin in Bulk and Pharmaceutical Dosage forms as an…
Iran J Pharm Res. Inverno de 2013; 12 (Suplemento): 57–63. PMCID: PMC3813375

PMID: 24250672
Desenvolvimento de um método simples de RP-HPLC-UV para

determinação de azitromicina em formas de dosagem farmacêutica
e a granel como alternativa ao método USP
Tayebeh Ghari , um, c Farzad Kobarfard , b e Seyed Alireza Mortazavi um, *
aDepartment of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran,
Iran.
bDepartment of Pharmaceutical Chemistry, School of Pharmacy, Shahid Beheshti University of Medical
Sciences, Tehran, Iran.

cStudents Research Committee, School of Pharmacy, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran,
Iran.
* Autor para correspondência: E-mail: mortazavisar@yahoo.com
Recebido em dezembro de 2012; Aceito em janeiro de 2013
Copyright © 2013 da School of Pharmacy, Shaheed Beheshti University of Medical Sciences and Health
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Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License, (
http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/ ) que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em
qualquer meio, desde o trabalho original é devidamente citado.
Abstrato
O presente estudo foi planejado para desenvolver um método simples e validado de cromatografia
líquida para a análise de azitromicina a granel e formas farmacêuticas usando detector de ultravioleta.
A melhor fase estacionária foi determinada como coluna C18, 5 μm, 250 mm × 4,6 mm. A fase móvel
foi otimizada para obter uma separação rápida e seletiva do fármaco. A taxa de fluxo foi de 1,5 mL /
min, o comprimento de onda foi definido em 210 nm e o volume de cada injeção foi de 500 μL. Uma
fase móvel isocrática de metanol / tampão na proporção de 90:10 v / v deu a melhor separação e
resolução. O método proposto foi acurado, preciso, sensível e linear em uma ampla faixa de
concentração de azitromicina. O método desenvolvido tem a vantagem de utilizar detector de UV em
comparação ao método USP no qual o detector eletroquímico tem sido utilizado.
Palavras-chave: Azitromicina, HPLC, Detecção UV, Determinação, Produtos farmacêuticos
Introdução
A azitromicina (AZI) é um antibiótico macrolídeo semissintético com um anel de azalactona de 15
membros. É derivado da eritromicina; no entanto, difere quimicamente da eritromicina em que um
átomo de nitrogênio substituído com metil é incorporado ao anel de lactona (como mostrado em
figura 1)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3813375/ 1/12
figura 1
Estrutura da azitromicina
Como a eritromicina, parece ligar-se ao mesmo receptor, subunidades ribossômicas 50 S de bactérias

suscetíveis e suprime a síntese de proteínas. É usado principalmente para tratar várias infecções
bacterianas, como microrganismos aeróbios Gram-positivos e microrganismos aeróbios Gram-
negativos. A incorporação do nitrogênio no anel altera significativamente as propriedades químicas,
microbiológicas e farmacocinéticas do AZI. Apresenta um espectro de atividade mais extenso, maior
estabilidade ácida e parâmetros farmacocinéticos mais favoráveis do que a eritromicina ( 1 ).
Vários métodos foram desenvolvidos para a determinação de AZI em formas de dosagem farmacêutica.
Esses métodos incluem cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e métodos microbiológicos.
A separação cromatográfica é um dos componentes essenciais e poderosos das análises mais
quantitativas e o HPLC é atualmente a ferramenta mais versátil que satisfaz as necessidades de uma
separação ideal ( 2 ). AZI foi analisado por cromatografia líquida de alta performance usando
fluorescência ( 3 - 5 ), eletroquímica (usando detectores amperométricos e coulométricos) ( 6 - 7 ) e
detector de espectrometria de massa ( 8 - 11) para quantificação em material a granel e formas de
dosagem farmacêutica. A detecção de fluorescência requer um pré-tratamento complicado da amostra,
envolvendo a derivatização pré-coluna do analito. Os procedimentos de ensaio que utilizam a detecção
eletroquímica costumam ser demorados, tanto nas etapas de preparação da amostra quanto na
cromatografia. O método USP ( 12 ) descreve uma fase móvel de alto pH (pH 11), bem como uma
coluna específica (gama alumina) que é bastante cara e difícil de obter comercialmente, pois muitos
dos fabricantes de coluna não fornecem esta coluna. Além disso, o método USP emprega detecção
eletroquímica amperométrica, que não está disponível em muitos laboratórios. Os métodos de
espectrometria de massa podem ter a maior sensibilidade, mas o processo de determinação é complexo
( 13 ).
Um método espectrofotométrico foi relatado por Suhagia et al para determinação de AZI em formas
farmacêuticas em que o AZI é oxidado com permanganato de potássio para liberar formaldeído, que é
então determinado in situ usando acetilacetona, na presença de acetato de amônio. Embora o método
seja simples e de fácil execução, ele sofre com a falta de separação no processo de determinação, o que
o torna inadequado para formulação farmacêutica com excipientes desconhecidos que podem interferir
na leitura da absorção de UV do AZI ( 14 ).
Mallah et al usaram a espectroscopia de transmissão FT-IR para determinação de AZI em suas formas
farmacêuticas, que é fácil de executar, mas apresenta o mesmo problema de não ser adequado para
formulações com composição desconhecida de excipientes ( 15 ).
Portanto, existe a necessidade de um método conveniente e eficaz para a determinação de AZI em

formas de dosagem farmacêutica. A cromatografia líquida com detecção no UV já foi empregada para
a análise do AZI em comprimidos ( 16 ) e em matéria-prima ( 17 ). No presente trabalho, foi
desenvolvido um método de HPLC com detector de UV para a determinação de menor concentração de
AZI em formas farmacêuticas. Diferentes fases estacionárias reversas foram comparadas entre si e seu
desempenho foi determinado. O método final foi seletivo e sensível o que permite a determinação de
AZI na concentração de 1 μg / mL com boa precisão usando detector de UV.
Experimental
Materiais
O padrão AZI (99,49%) foi fornecido pelo Shifa PharMed Industrial Group (Irã) como amostra de
presente. O metanol de grau HPLC, acetonitrilo de grau HPLC, di-hidrogenofosfato de potássio, ácido
clorídrico e hidróxido de sódio eram da Merck (Darmstadt, Alemanha). A água grau de pureza para
HPLC usada na análise foi preparada por osmose reversa e passada por um filtro millipore de 0,45 μm
(Millipore Company, EUA) antes do uso. Um tampão de fosfato de pH 6,0 (0,2 M) foi preparado
dissolvendo 6,8 g de dihidrogenofosfato de potássio em 500 mL de água, adicionando 28 mL de
solução de hidróxido de sódio 0,2 M em água e diluindo com água para 1000 mL (USP). O tampão de
fosfato pH 8,0 foi preparado dissolvendo 6,8 g de di-hidrogenofosfato de potássio em 500 mL de água,
adicionando 230,5 mL de solução de hidróxido de sódio 0,2 M em água e diluindo com água para 1000
mL (USP).
Equipamento
Instrumentos
Foi utilizado o sistema HPLC (D-7000, Merck Hitachi, Tóquio, Japão) com bomba binária L-7100,
detector UV-Vis L-7420 com forno de coluna (águas, EUA). O software HSM-7000 foi usado para
aquisição e processamento de dados.
Colunas analíticas
AZI foi analisado por análise de HPLC de fase reversa usando diferentes colunas de HPLC. MZ-
Analysentechnik GmbH, Perfectsil target, ODS-3 (250 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro
interno e 5 μm de tamanho de partícula) coluna com coluna de guarda analítica MZ C18 (20 mm × 4,6
mm) empacotada com o mesmo sorvente, Lichrospher RP-8 , Merck, (250 mm de comprimento, 4 mm
de diâmetro interno e 5 μm de tamanho de partícula), Lichrospher RP-8, Merck, (100 mm de
comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 5 μm de tamanho de partícula), Lichrospher RP-18, Merck
(250 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 10 μm de tamanho de partícula), ODS-H
ideal, Capital, (150 mm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 3 μm de tamanho de partícula)
e C 18 -SB-ZX 3 , Zorbax (50 mm de comprimento , 2,1 mm de diâmetro interno e 3,5 μm de tamanho
de partícula). Todos os experimentos foram empregados no modo isocrático.
Determinação do comprimento de onda UV apropriado
Um comprimento de onda adequado foi necessário para a determinação de AZI. O comprimento de

onda apropriado para a detecção da droga na fase móvel foi determinado por varredura de comprimento
de onda na faixa de 200–400 nm com um espectrofotômetro Shimadzu® UV-1201 (Shimadzu, Japão).
Condições cromatográficas
Dois solventes orgânicos (acetonitrila e metanol), diferentes frações de volume de um metanol filtrado
e desgaseificado e acetonitrila (50, 60, 70, 80 e 90 v / v) e tampão de fosfato com pH diferente (6,0,
8,0) em concentrações de 0,2 M, 0,02 M foram examinados como possíveis fases móveis. O
comprimento de onda foi estabelecido em 210 nm. Este comprimento de onda foi selecionado porque é
um UV máximo e fornece a sensibilidade necessária para a quantificação da baixa concentração do
fármaco em formas farmacêuticas. A temperatura da coluna foi mantida a diferentes temperaturas (25 °
C, 50 ° C). A fase móvel foi bombeada em diferentes taxas de fluxo (1,0, 1,5 mL / min) com volume de
injeção de 500 μL.
Preparação de soluções padrão
Uma quantidade precisamente pesada de AZI (10 mg) foi transferida para um balão volumétrico de 10
mL, aproximadamente 5 mL da fase móvel foram adicionados e dissolvidos. A solução foi trazida ao
volume pela fase móvel e devidamente misturada para obter uma concentração final de 1,0 mg / mL. A
solução estoque preparada foi armazenada a 4 ° C em um frasco de vidro. A partir desta solução
estoque, as soluções padrão foram preparadas de fresco antes da análise.
Validação de método HPLC
A validação do método foi realizada na fase estacionária melhor determinada, ie . Coluna C18, 5 μm,
250 mm × 4,6 mm.
Linearidade
As curvas de calibração foram construídas com nove concentrações (preparadas simultaneamente)

variando de 1 a 80 μg / mL para AZI. Cada nível de concentração foi preparado em triplicado e
analisado três vezes. As curvas de calibração foram construídas traçando a concentração de compostos
versus a resposta da área do pico. A linearidade foi avaliada pelo método de regressão de mínimos
quadrados.
Precisão
A precisão do método foi determinada pela repetibilidade (intra-dia) e precisão intermediária (inter-dia)
e foi expressa como RSD (%). Nove injeções replicadas das soluções padrão de AZI em concentrações
que variam de 1 a 80 μg / mL preparadas conforme descrito acima. A variação intra-dia foi avaliada
pelo mesmo analista ao longo de um dia, enquanto a precisão inter-dia foi realizada por outro analista
independente ao longo de 3 dias ( 18 ).
Precisão
A precisão do método foi testada pela análise de réplicas de diferentes amostras de AZI em
concentrações conhecidas e, em seguida, comparada com a concentração real do mesmo. A precisão foi
avaliada pelo percentual de recuperação ( 18 ).
Limites de detecção e quantificação (sensibilidade)
O limite de quantificação (LOQ) foi determinado durante a avaliação da faixa linear da curva de
calibração. LOQ foi definido como a concentração mais baixa produzindo uma precisão (% CV) e
exatidão (% recuperação) dentro de sua faixa aceitável com uma área de pico de três vezes os limites
de detecção (LOD) ( 18 ).
Resultados e discussão
Desenvolvimento de método
Seleção de comprimento de onda
O espectro ultravioleta de AZI mostrou o comprimento de onda de absorção máximo em 210 nm

(como mostrado em Figura 2) Portanto, o comprimento de onda de 210 nm foi selecionado para atingir
a maior sensibilidade para o estudo.
Figura 2
Espectro UV de AZI
Seleção de fase móvel
Diferentes combinações de acetonitrila ou metanol e tampão fosfato, bem como diferentes

concentrações de tampão (0,2 M, 0,02 M) foram testadas e a condição ótima em metanol-tampão
fosfato 0,02 M (90:10, v / v) foi alcançada. O cromatograma obtido mostrou uma rápida separação com
tempo de retenção de AZI em 7,23 min (Figura 3)
Figura 3
Cromatogramas de AZI usando MZ-Analysentechnik GmbH, alvo Perfectsil, coluna ODS-3 (250 mm de
comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e 5 μm de tamanho de partícula)
Seleção de fase estacionária de HPLC
Diferentes fases estacionárias reversas foram utilizadas e os resultados foram comparados. Os melhores
resultados foram obtidos usando octadecilsilano (ODS, 18). Várias colunas C18 com diferentes
comprimentos e tamanhos de partículas foram testadas e os resultados foram comparados com base na
largura do pico e na simetria do pico. A melhor largura de pico foi obtida em uma coluna C18 com 250
mm de comprimento e 5 μm de tamanho de partícula (como mostrado emFigura 3)
Diminuir o comprimento da coluna para 150 mm, embora resultou em menor tempo de retenção, mas a
simetria do pico foi deteriorada. Alterar o tamanho de partícula da fase estacionária C18 de 5 μm para 3
μm resultou em cauda e perda de simetria de pico (Figura 4)
Figura 4
Cromatogramas de AZI usando coluna ODS-H ideal, Capital (150 mm de comprimento, 4,6 mm de
diâmetro interno e tamanho de partícula de 3 μm).
O aumento do tamanho de partícula para 10 μm, embora tenha dado picos perfeitamente simétricos,
mas aumentou a largura do pico em até 5 min com reprodutibilidade mais baixa e limite de detecção
mais alto (como mostrado em Figura 5)
Figura 5
Cromatogramas de AZI usando coluna Lichrospher RP-18, Merck (250 mm de comprimento, 4,6 mm de
diâmetro interno e 10 μm de tamanho de partícula)
Seleção da taxa de fluxo e temperatura da coluna
O aumento da temperatura da coluna de 25 μ para 50 μ levou a uma diminuição no tempo total

necessário para o processo de separação com diminuição do alargamento do pico e aumento da
sensibilidade. Além disso, o aumento da taxa de fluxo de 1 mL / min para 1,5 mL / min mostrou uma
diminuição semelhante no tempo de retenção.
Efeito do pH da fase móvel
Estudamos o efeito da variação do pH ( 6 , 8 ), utilizando solução de hidróxido de sódio a 10%.

Tampão de fosfato com pH alto ( 8 ) foi usado para evitar problemas com a dissolução da sílica. Além
disso, a estabilidade do AZI é baixa em meios ácidos. Observamos que os melhores resultados de
separação foram obtidos em pH 8.
Validação do método
Linearidade
O gráfico das respostas da área do pico contra a concentração de AZI é mostrado em Figura 6. O
gráfico é linear ao longo da faixa de concentração de 1-80 μg / mL produzindo uma equação de
regressão Y = 2,05 × 10 4 X + 2,94 × 10 4 com um coeficiente de correlação de 0,9976 e com intervalos
de confiança em p = 0,05. Um gráfico semelhante em baixas concentrações (1-10 μg / mL) deu um
valor de inclinação de 2,14 × 10 4 (consulte a caixa inserida emFigura 6)
Abra em uma janela separada

Figura 6
Gráfico de linearidade para substância medicamentosa AZI
Precisão
Os resultados obtidos para estudos de repetibilidade e para precisão intermediária são apresentados em
tabela 1. A precisão do método possui desvio padrão relativo (RSD) abaixo de 1,59% para
repetibilidade e 1,61% para precisão intermediária, que atendem aos critérios de aceitação propostos
(RSD: não mais 2,0%) ( 19 ).
tabela 1
Variações intra e inter-dia do método de HPLC para determinação de AZI
Concentração (μg / mL) Precisão intra-dia (% RSD) Precisão entre dias (% RSD)
1 1,29 1,49
3 1,2 1,18
5 0,75 1,27
7 0,98 1.08
10 1,59 0,75
20 1.09 0,88
40 1,79 1.08
60 0,79 1,16
80 1,49 1,61
Precisão
Os resultados foram expressos como recuperações percentuais obtidas para diferentes concentrações de
AZI. mesa 2mostra que o percentual de recuperação varia de 85 a 115,4% com RSDs. variando de 0,59
a 1,59% que atendem aos critérios de aceitação propostos (% Faixa de recuperação: 80-120%) ( 19 ).
mesa 2
Precisão / recuperação do método proposto
Concentração (μg / mL) % Recuperação % RSD

1,5 110,2 1,19
4 115,4 1,59
6 97,9 1.09
8 90,09 0,79
15 85,39 0,89
30 105,4 1,29
50 101,2 0,69
70 85 0,59
Limites de detecção e quantificação (sensibilidade)
Os resultados mostraram que os limites de detecção e quantificação para AZI usando este método são
0,3 μg / mL e 1 μg / mL, respectivamente.
Conclusão
Foi desenvolvido um método novo, específico e validado para a análise de AZI usando HPLC equipado
com detecção de UV em 210 nm. Este método é exato, preciso, sensível e linear. Este método pode ser
empregado para a análise de AZI em várias concentrações e em diferentes formulações de fármacos,
bem como na matéria-prima.
Reconhecimento
Este estudo faz parte do Ph.D. tese de Tayebeh Ghari, proposta e aprovada pela Escola de Farmácia da
Universidade Shahid Beheshti de Ciências Médicas, Teerã, Irã. Os autores também gostariam de
agradecer ao vice-pesquisador da Shahid Beheshti University of Medical Sciences por fornecer o apoio
financeiro para a realização desta pesquisa.
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Artigos do Iranian Journal of Pharmaceutical Research: IJPR são fornecidos aqui como cortesia de Shahid
Beheshti University of Medical Sciences

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Desenvolvimento de um método simples de RP-HPLC-UV para

Sciences, Tehran, Iran.

Recebido em dezembro de 2012; Aceito em janeiro de 2013

Palavras-chave: Azitromicina, HPLC, Detecção UV, Determinação, Produtos farmacêuticos

Como a eritromicina, parece ligar-se ao mesmo receptor, subunidades ribossômicas 50 S de bactérias

Portanto, existe a necessidade de um método conveniente e eficaz para a determinação de AZI em

Determinação do comprimento de onda UV apropriado

Um comprimento de onda adequado foi necessário para a determinação de AZI. O comprimento de

Preparação de soluções padrão

Validação de método HPLC

As curvas de calibração foram construídas com nove concentrações (preparadas simultaneamente)

Limites de detecção e quantificação (sensibilidade)

Seleção de comprimento de onda

O espectro ultravioleta de AZI mostrou o comprimento de onda de absorção máximo em 210 nm

Seleção de fase móvel

Diferentes combinações de acetonitrila ou metanol e tampão fosfato, bem como diferentes

Seleção de fase estacionária de HPLC

Seleção da taxa de fluxo e temperatura da coluna

O aumento da temperatura da coluna de 25 μ para 50 μ levou a uma diminuição no tempo total

Efeito do pH da fase móvel

Estudamos o efeito da variação do pH ( 6 , 8 ), utilizando solução de hidróxido de sódio a 10%.

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Gráfico de linearidade para substância medicamentosa AZI

Precisão / recuperação do método proposto

Concentração (μg / mL) % Recuperação % RSD

Limites de detecção e quantificação (sensibilidade)

4. Bahrami G, Mirzae S, Kiani A. Determinação por cromatografia líquida de alto desempenho de

6. Taninaka C, Ohtani H, Hanada E, Kotaki H, Sato H, Iga T. Determinação de eritromicina,

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