453

Comparação de três técnicas de produção do

Raymundo Rizaldo
PINHEIRO1
Aurora Maria Guimarães
GOUVEIA2
Eliane Harumi YORINORI3
Alice ANDRIOLI1
Correspondência para:
RAYMUNDO RIZALDO PINHEIRO
EMBRAPA Caprinos
Estrada Sobral-Groaíras, Km 04
62011-970 – Sobral – CE
rizaldo@cnpc.embrapa.br
Recebido para publicação: 09/12/2003
Aprovado para publicação: 29/09/2005
antígeno do lentivírus caprino utilizado no teste de
imunodifusão em gel de ágar
1 - Embrapa Caprinos, Sobral – CE
2 - Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte – MG
3 - Médica Veterinária – Autônoma
Resumo Palavras-chave
Caprino.
A Artrite Encefalite Caprina (AEC) é uma enfermidade que causa Lentivírus.
IDGA.
perdas econômicas consideráveis, incluindo perda na produção de Antígeno.
leite e diminuição da vida útil do animal. No diagnóstico desta
enfermidade o teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) é
utilizado mundialmente como o teste de triagem. Este trabalho teve
como objetivo testar três diferentes concentrações de soro fetal bovino
(SFB) na produção do antígeno (Ag) para o diagnóstico da AEC,
verificar dentre três métodos o mais eficiente para efetuar a
concentração e qual a concentração do antígeno produzido mais
apropriada para o teste. Tanto o método do AMICON, como o da
concentração do Ag por diálise são indicados, entretanto o sistema
AMICON, apesar dos custos de implantação, promoveu menor perda
de antígeno, maior rapidez e praticidade. Com relação à quantidade de
soro fetal bovino (SFB) colocada após a inoculação viral observou-se
que 5% de SFB foi a quantidade que apresentou melhores resultados.
A concentração do antígeno mais indicada é de 100 vezes, pois permite
a detecção de anticorpos contra o vírus da AEC (LVC) por duas
proteínas (gp 135 e p28). A purificação do Ag por precipitação/
ultracentrifugação, utilizada para provas imunoenzimáticas (ELISA e
Dot-BLOT), não apresentou resultados satisfatórios para o IDGA.

Introdução relativamente baixo, a razoável sensibilidade

O Lentivírus caprino é um retrovírus
da subfamília Lentiviridae que causa a Artrite-
Encefalite Caprina (AEC), uma enfermidade
crônica e multissistêmica. Esta doença causa
perdas econômicas consideráveis, incluindo
queda na produção de leite, diminuição da
vida útil e aumento da mortalidade de
cabrito nascido de cabras infectadas. Além
do aspecto econômico, o estudo da infecção
tem despertado interesse devido a
semelhanças biológicas e patogenéticas com
o vírus da Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida (AIDS)1. No diagnóstico desta
enfermidade o teste de imunodifusão em
gel de ágar (IDGA) é utilizado mundialmente
como o teste de triagem devido ao custo
e especificidade, além da praticidade de
execução e leitura2.
No Brasil, o diagnóstico do lentivírus
caprino (LVC) é realizado quase que
exclusivamente pelo teste de IDGA e com
antígeno (Ag) heterólogo (Maedi- Visna) o
que reduz a sensibilidade do teste. Segundo
Knowles et al.3, se o antígeno for produzido
com LVC a sensibilidade do teste seria
provavelmente maior em até 35% devido
ao uso de antígeno homólogo4.
Este trabalho teve como objetivo
produzir um antígeno nacional utilizando
diferentes quantidades de soro fetal bovino
na produção do antígeno, verificar dentre
os três métodos o mais eficiente em termos
de concentração e qual a concentração do

Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 453-458, 2005
454
antígeno produzido é mais apropriada para
o teste.
Materiais e Métodos
Cultivo primário de células de membrana sinovial
caprina
Foram utilizados cultivos secundários
de células de membrana sinovial caprina
(MSC) obtidas a partir de cabrito
comprovadamente negativo para LVC e
submetidos a subcultivos por tripsinização
das células5.
Produção do Antígeno
Vírus
Utilizou-se amostra do vírus CAEV-
Cork (Amostra viral gentilmente cedida pela
UFRPE, oriunda do Laboratoire Associé de
Recherches sur les Petits Ruminants – INRA –
ENVL – France) com título de 10 4,5
TCID50(Tissue Culture Infectious Dose50%)/
mL multiplicada em MSC.
Titulação do vírus
Titularam-se as amostras virais em
microplacas por diluições decimais em meio
essencial mínimo (MEM) sem soro fetal
bovino (SFB), utilizando-se oito repetições
por diluição. Em cada diluição foram
colocados 50mL da diluição viral, a qual
permaneceu por uma hora a 37ºC em 5%
de atmosfera de CO 2. Adicionaram-se
50mL da suspensão de células de MSC
obtidas por tripsinização, contendo 3,0 x 104
células/cm3 em MEM com 10% de SFB.
Os poços controle de vírus e do cultivo
continham respectivamente, a diluição do
vírus e meio de cultivo, a suspensão celular,
e o meio de cultivo. O título calculado
segundo Reed e Muench7, definiu-se como
a recíproca da diluição que apresentou, 14
dias após inoculação, sincícios em 50% dos
poços inoculados, e definido como uma
dose formadora de sincício (DFS).
Cultivo da MSC e inoculação viral
Na produção viral as monocamadas
Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 453-458, 2005
semiconfluentes de MCS cultivadas em
garrafas roller de 830 cm2 de superfície de
cultivo, foram inoculadas 72 a 96 horas após
passagem, com a monocamada contendo
de 70 a 90% de confluência, com 15 mL de
solução viral e com 200 DFS diluídas em
MEM sem SFB8.
Quantidade de Soro Fetal Bovino
Após 60 minutos da inoculação viral
adicionaram-se 135 mL de MEM com três
diferentes concentrações de soro fetal
bovino 0%, 2% e 5%. Coletou-se o
sobrenadante (SN) por 3 vezes ou até a
destruição de 75% da monocamada. Os
sobrenadantes coletados, bem como as
garrafas na última coleta, foram congeladas
a –80ºC.
Concentração do Antígeno
Antes de ser concentrado o SN foi
submetido a dois ciclos de congelamento e
a clarificação por centrifugação a 3300g a
40C. O SN foi concentrado a partir de três
técnicas:
Diálise contra polietilenoglicol (PEG) – A
concentração por diálise foi realizada
conforme metodologia descrita por Cutlip
et al.9 e constituiu-se na colocação do SN
em membrana de diálise com cut-off de
12000 Daltons e dialisado contra PEG 6000
a 10% em Tampão fosfato (PBS - 0,05M;
0,15M NaCl; pH 7,4) à 40C por 24 a 48
horas.
Ultrafiltração - No sistema AMICON
aplicou-se pressão do gás nitrogênio
diretamente à célula de ultrafiltração modelo
8400 da Millipore® conforme determinação
do Fabricante10. Solutos acima do peso
molecular de retenção “cut-off” da membrana
(10000 Daltons) foram retidos na câmara,
enquanto solutos abaixo do “cut-off” saíram
para o filtrado. Nas duas técnicas
concentrou-se 50X, 100X e 150X do volume
inicial.
Precipitação e Ultracentrifugação – Esta
técnica foi descrita por Houwers, Gilkens e
Jan Schaake11 e constituiu-se em precipitação

da suspensão clarificada, com PEG-8000 a
40% até a concentração final de 8%, por 18
horas a 4C e centrifugação a 12000g por 60
min a 4oC17. O sedimento foi suspenso em
TNE (10,0 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10,0 mM
NaCl; 1,0 mM EDTA) na proporção de
1/10 do volume original da suspensão viral.
A suspensão foi passada em colchão de
sacarose (25% em TNE) através de
centrifugação 42000g (Beckman rotor SW
50.1) por 120 min a 4oC (Houwers et al.
1982). Utilizou-se em cada tubo de
centrífuga: 1mL de sacarose para 4 mL de
suspensão viral. O novo sedimento foi
suspenso em PBS (volume igual a 0,5%,1%
e 1,5% do volume inicial de suspensão = 10
mL), contendo 2x10 -4 Molar de PMSF
(Phenylmethylsulphonyl fluoride).
Teste de Imunodifusão em Gel de Ágar - IDGA
Foi utilizada a microtécnica de IDGA
descrita por Gouveia et al.13 em agarose a
0,9% em tampão borato, utilizando 30 ml
de soro/antígeno, com a leitura realizada
após 72 horas, com luz indireta sobre fundo
escuro. Como controle utilizou-se soro
positivo do kit americano para diagnóstico
da AEC por IDGA [Caprine Arthritis-
Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody
Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology, Inc®,
USA. Este kit é composto por 1 mL de
antígeno (p28 e gp135) produzido com o
Tabela 1 - Formação de linhas de precipitação antígeno-anticorpo (Ag-Ac)sob a influência da quantidade de soro fetal bovino e do método de
concentração do Antígeno. Sobral-Ceará, 2003* Verifica-se uma segunda linha entre o poço do Ag e do Ac considerada fraca
** Verifica-se uma segunda linha entre o poço do Ag e do Ac considerada boa
a- Sem reação – sem visualização da linha de precipitação de Ag-Ac
b- Muito fraca - linha de precipitação de Ag-Ac de difícil visualização
c- Fraca – linha de precipitação de Ag-Ac de regular visualização
d- Boa – linha de precipitação de Ag-Ac de boa visualização
e- Excelente - linha de precipitação de Ag-Ac de ótima visualização
455
MVV, 3 mL de soro reagente (soro rico em
anticorpos contra a glicoproteína gp135, 0,5
mL de soro positivo (soro rico em
anticorpos contra as proteínas p28 e gp135),
0,5 mL de soro fraco-positivo (soro pobre
em anticorpos contra a g p135 e sem
anticorpos contra a p28) e soro negativo
(soro sem anticorpos contra as proteínas p28
e gp135)].
Resultados e Discussão
As células sub-cultivadas com
intervalos de 5 a 9 dias apresentaram níveis
satisfatórios de vitalidade e produtividade
por mais de 15 passagens. Os vírus, com
título de 104,5 TCID50/mL, multiplicaram-se
bem, tanto em células de um número baixo
de passagens (7a a 8a) como em células de
num número elevado de passagens (15a a
16 a). Verificou que as células até a 20 a
passagem permanecem com boa vitalidade
e que o vírus se multiplica promovendo
efeitos citopáticos (sincícios) até a 18 a
passagem. Este dado é semelhante aos
observados por Castro6.
Na tabela 1 encontram-se os resultados
obtidos no IDGA quando cruzados as
concentrações do Ag, quantidade de SFB e o
método de concentração. Com relação à
quantidade de SFB aplicada após a
inoculação viral verificou-se que 5% de SFB
Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 453-458, 2005
456
Figura 1 - IDGA do antígeno Ag concentrado 50 X (poço central)
método AMICON frente ao soro positivo do kit comercial
(poços 1, 2, 3 e 5), negativo (poço 4) e fraco positivo (poço 6).
Nos poços 1, 2, 3 e 5 verifica-se a presença de uma linha de
precipitação referente a proteína p28
foi a concentração que apresentou melhor
resultado corroborando com os achados de
Castro6, provavelmente em virtude da maior
multiplicação celular, o que estimula a
replicação viral14, mesmo sabendo que o SFB
em grandes quantidades inibe o crescimento
viral. Abreu5 utilizando Ag preparado com
2% de SFB e concentração de 50X, por
diálise, verificou boas linhas de precipitação.
Nos métodos de concentração diálise
e AMICON somente na concentração do
Ag de 150 X, produzido com SFB 5%,
verificou-se a presença de duas linhas de
precipitação referentes às proteínas p28
(Figura 1) e a gp 135 (Figura 2). Em todas
as outras situações verificou-se somente uma
linha de precipitação referente a proteína
nuclear p28. Desta forma, pode-se verificar
que ao se concentrar mais o Ag pode-se
obter as duas linhas de precipitação.
Entretanto, quando se utilizou a concentração
de 150X verificou-se que existia um
extravasamento de material do poço
provavelmente em decorrência de uma alta
concentração do Ag que retirava água do
próprio gel.
Com relação as concentrações
verificou-se que tanto a técnica de membrana
Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 453-458, 2005
Figura 2 - IDGA do antígeno ag concentrado 150x (poço central)
método AMICON frente ao soro positivo do kit comercial
(poços 1, 3, 4 e 5), e reagente nos (poços 2 e 6). Nos poços
com soro positivos observa-se claramente a formação de
duas linhas de precipitação das proteínas gp135 (interna) e p28
de diálise quanto o sistema AMICON
apresentaram bons resultados com relação à
formação de linhas de precipitação e IDGA,
entretanto o sistema AMICON é mais rápido
e reduz as perdas de Ag. Na concentração
por precipitação/ultracentrifugação apesar de
concentrar até 150 vezes verificou-se apenas
linha de difícil visualização.
Utilizando os métodos do AMICON
ou concentração por diálise, concentração
de 100X e SFB a 5% verificou-se que é
possível realizar o IDGA detectando as duas
principais proteínas do LVC, o que aumenta
a sensibilidade do Ag. Adams et al. 3
identificaram as proteínas p28 e gp 135
como as responsáveis pelas linhas de
precipitação obser vadas na IDGA.
Avaliando dois antígenos do LVC (gp 135
e p28) para a detecção de anticorpos através
do IDGA, Adams e Gorham16 concluíram
que o antígeno gp 135 detecta maior número
de caprinos infectados do que o antígeno
p28, ainda que alguns animais desenvolvam
resposta anti-p28 na ausência de resposta
anti-gp 135. A importância da escolha de
um antígeno influencia marcadamente os
resultados da IDGA no diagnóstico das
enfermidades causadas pelo LVC. A
 457

utilização do antígeno com as duas proteínas Conclusões

(gp 135 e p28) aumenta a sensibilidade
diagnóstica do teste. Os autores salientaram,
ainda, a importância da escolha dos soros
de referência utilizados em testes IDGA para
diagnóstico de infecção por LVC.
Com o objetivo de observar como
a expressão de anticorpos varia durante o
tempo em caprinos soropositivos, Hanson,
Hydbring e Olsson17 utilizando a IDGA para
detectar anticorpos para os antígenos gp135
e p28 do lentivírus MVV, verificaram que a
expressão de anticorpos para LVC variou
ao longo do tempo, mostrando que reações
soropositivas e soronegativas podem ocorrer
intermitentemente. Baseado nestes fatos
ressalta-se a necessidade da utilização conjunta
das proteínas nos antígenos para aumentar
a sensibilidade da prova.
A produção de antígeno nacional para
o teste de imunodifusão de gel de agarose é
tecnicamente viável. Quanto à quantidade de
SFB a mais indicada durante o processo é de
5%.
Tanto o método do sistema AMICON
quanto o da concentração por diálise são
indicados, entretanto o sistema AMICON,
apesar dos custos de implantação, promoveu
maior rapidez e praticidade.
A concentração de 100 vezes permite
o diagnóstico da AEC por duas proteínas
(gp 135 e p28).
A produção do Ag por precipitação
e ultracentrifugação, utilizada para provas
imunoenzimáticas, não apresentou resultados
satisfatórios para o IDGA.

Comparison of three techniques for production goat lentivirus antigen

used in the agar gel immunodifusion test
Abstract Key-words
Goats.
The Caprine Arthritis Encephalitis (CAE) is a disease who cause Lentivirus.
AGID.
considerable economic losses, including loss in the milk production Antigen.
and reduction of the useful life of the animal. In the diagnosis of
this disease the agar gel immunodifusion test (AGID) is used
worldwide as the selection test. The objective of thid work was to test
three different concentrations of bovine fetal serum (BFS) in the
production of the antigen (Ag) for the diagnosis of the CAE virus
(CAEV), to verify amongst the three methods the most efficient
concentration and which the antigen concentration of the antigen
produced is appropriate for the test. The method of the AMICON
and the concentration of the Ag for dialysis was indicated, however
the system AMICON, despite the implantation costs, promoted
minor loss of antigen, little time expense in the processing and greater
simplicity. With relation to the amount of BFS placed after the viral
inoculation it was verified that 5% of BFS the amount that presented
better resulted. The antigen concentration 100 times was more
indicated, therefore it allowed the diagnosis of the CAEV for two
proteins (gp 135 and p28). The concentration of the Ag for
precipitation/ultracentrifugation, used for imunoenzimatic tests, did
not present resulted satisfactory used in the AGID.

Referências
1 HAASE, A. T. Pathogenesis of lentivirus infections.
Nature, v. 322, n. 6075, p. 130-136, 1986.
2 HARKISS, G. D.; WATT, N. J. Lentivirus infections
and their detection. Goat Veterinary Society Journal,
v. 11, n. 1, p. 19-25, 1990.
3 KNOWLES, D. P. et al. Evaluation of agar gel
immunodiffusion serology using caprine and ovine
lentiviral antigens for detection of antibody to caprine

Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 453-458, 2005
458

arthritis-encephalitis virus. Journal of Clinical encephalitis retrovirus proteins in immunodiffusion

Microbiology, v. 32, n. 1, p. 243-245, 1994. precipitin lines. Journal of General Virology, v. 66, n.
5, p. 1139-1143, 1985.
4 ALVES, F. S. F. Teste de imunodifusão em gel de
agarose no diagnóstico da Artrite Encefalite Caprina 16 ADAMS, D. S.; GORHAM, J. R. The gp135 of
utilizando antígenos do lentivírus caprino e ovino. caprine arthritis encephalitis virus affords greater
Sobral: EMBRAPA-CNPC, 1999, 3 p. (EMBRAPA- sensitivity than the p28 in immunodiffusion serology.
CNPC. Comunicado Técnico, 51). Research Veterinary Science, v. 40, n. 2, p. 157-160,
1986.
5 ABREU, S. R. O. Isolamento de um vírus sincicial
caprino (amostra RPE-03) e comparação da sensibilidade 17 HANSON, J.; HYDBRING, E.; OLSSON, K. A long
e especificidade relativas do antígeno Maedi-Visna term study of goats naturally infected with caprine
frente ao antígeno AEC (amostra Cork) em teste de arthritis-encephalitis virus. Acta Veterinary
IDGA. 1996. 45 f. Dissertação (Mestrado) - Scandinavica, v. 37, n. l, p. 31-39, 1996.
Departamento de Medicina Veterinária, Universidade
Federal Rural de Pernambuco. Recife, 1996.
6 CASTRO, R. S. Lentivírus de pequenos ruminantes:
ensaios imunoenzimáticos, perfil sorológico e
inferências filogenéticas. 1998. 132 f. Tese (Doutorado)
- Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, 1998.
7 REED, L. J., MUENCH, H. A simple method of
estimating fifty percent end points. American Journal
of Hygiene, v. 27, p. 493-497, 1938.
8 PINHEIRO, R. R. Vírus da artrite encefalite caprina:
desenvolvimento e padronização de ensaios
imunoenzimáticos (ELISA e Dot-Blot) e estudo
epidemiológico no Estado do Ceará. 2001. 115 f. Tese
(Doutorado) - Escola de Veterinária, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2001.
9 CUTLIP, R. C. et al. Immunodiffusion test for ovine
progressive pneumonia. American Journal Veterinary
Research, v. 38, n. 7, p. 1081-1084, 1977.
10 MILLIPORE, S. Ultrafiltration cells. 2003. 31 p.
Disponível em: <http://www.millipore.com/
userguides.nsf/docs/99228>. Acesso em: 2 dez. 2003.
11 HOUWERS, D. J.; GIELKENS, A. L. J.; JAN
SCHAAKE, J. An indirect enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) for the detection of antibodies to MAEDI-
VISNA virus. Veterinary Microbiology, v. 7, n. 3, p.209-
219, 1982.
12 REIS, J. K. P.; LEITE, R. C. An enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) test for the diagnosis of
equine infectious anemia in Brazil. Preventive Veterinary
Medicine, v. 20, n. 4, p. 261-267, 1994.
13 GOUVEIA, A. M. G. et al. Microimunodifusão em
gel de ágar para o diagnóstico sorológico de infecção
por lentivírus de pequenos ruminantes. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINÁRIA, 27, 2000, Águas de Lindóia. Anais...
Águas de Lindóia: 2000. p. 33. Resumo.
14 NARAYAN, O. et al. Slow virus replication: the role
of macrophages in the persistence and expression of
Visna viruses of sheep and goats. Journal of General
Virology, v. 59, pt. 2, p.345-356, 1982.
15 ADAMS, D. S. et al. Identification of caprine arthritis-

Braz J vet Res anim Sci, São Paulo, v. 42, n. 6, p. 453-458, 2005