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Comparação de três técnicas de produção do


antígeno do lentivírus caprino utilizado no teste de
imunodifusão em gel de ágar
Raymundo Rizaldo 1 - Embrapa Caprinos, Sobral – CE
PINHEIRO1 2 - Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Aurora Maria Guimarães Horizonte – MG
GOUVEIA2 3 - Médica Veterinária – Autônoma
Eliane Harumi YORINORI3
Alice ANDRIOLI1 Resumo Palavras-chave
Caprino.
Correspondência para: A Artrite Encefalite Caprina (AEC) é uma enfermidade que causa Lentivírus.
RAYMUNDO RIZALDO PINHEIRO IDGA.
EMBRAPA Caprinos perdas econômicas consideráveis, incluindo perda na produção de Antígeno.
Estrada Sobral-Groaíras, Km 04 leite e diminuição da vida útil do animal. No diagnóstico desta
62011-970 – Sobral – CE enfermidade o teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) é
rizaldo@cnpc.embrapa.br
utilizado mundialmente como o teste de triagem. Este trabalho teve
Recebido para publicação: 09/12/2003 como objetivo testar três diferentes concentrações de soro fetal bovino
Aprovado para publicação: 29/09/2005 (SFB) na produção do antígeno (Ag) para o diagnóstico da AEC,
verificar dentre três métodos o mais eficiente para efetuar a
concentração e qual a concentração do antígeno produzido mais
apropriada para o teste. Tanto o método do AMICON, como o da
concentração do Ag por diálise são indicados, entretanto o sistema
AMICON, apesar dos custos de implantação, promoveu menor perda
de antígeno, maior rapidez e praticidade. Com relação à quantidade de
soro fetal bovino (SFB) colocada após a inoculação viral observou-se
que 5% de SFB foi a quantidade que apresentou melhores resultados.
A concentração do antígeno mais indicada é de 100 vezes, pois permite
a detecção de anticorpos contra o vírus da AEC (LVC) por duas
proteínas (gp 135 e p28). A purificação do Ag por precipitação/
ultracentrifugação, utilizada para provas imunoenzimáticas (ELISA e
Dot-BLOT), não apresentou resultados satisfatórios para o IDGA.

Introdução relativamente baixo, a razoável sensibilidade


e especificidade, além da praticidade de
O Lentivírus caprino é um retrovírus execução e leitura2.
da subfamília Lentiviridae que causa a Artrite- No Brasil, o diagnóstico do lentivírus
Encefalite Caprina (AEC), uma enfermidade caprino (LVC) é realizado quase que
crônica e multissistêmica. Esta doença causa exclusivamente pelo teste de IDGA e com
perdas econômicas consideráveis, incluindo antígeno (Ag) heterólogo (Maedi- Visna) o
queda na produção de leite, diminuição da que reduz a sensibilidade do teste. Segundo
vida útil e aumento da mortalidade de Knowles et al.3, se o antígeno for produzido
cabrito nascido de cabras infectadas. Além com LVC a sensibilidade do teste seria
do aspecto econômico, o estudo da infecção provavelmente maior em até 35% devido
tem despertado interesse devido a ao uso de antígeno homólogo4.
semelhanças biológicas e patogenéticas com Este trabalho teve como objetivo
o vírus da Síndrome da Imunodeficiência produzir um antígeno nacional utilizando
Adquirida (AIDS)1. No diagnóstico desta diferentes quantidades de soro fetal bovino
enfermidade o teste de imunodifusão em na produção do antígeno, verificar dentre
gel de ágar (IDGA) é utilizado mundialmente os três métodos o mais eficiente em termos
como o teste de triagem devido ao custo de concentração e qual a concentração do

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antígeno produzido é mais apropriada para semiconfluentes de MCS cultivadas em


o teste. garrafas roller de 830 cm2 de superfície de
cultivo, foram inoculadas 72 a 96 horas após
Materiais e Métodos passagem, com a monocamada contendo
de 70 a 90% de confluência, com 15 mL de
Cultivo primário de células de membrana sinovial solução viral e com 200 DFS diluídas em
caprina MEM sem SFB8.
Foram utilizados cultivos secundários
de células de membrana sinovial caprina Quantidade de Soro Fetal Bovino
(MSC) obtidas a partir de cabrito Após 60 minutos da inoculação viral
comprovadamente negativo para LVC e adicionaram-se 135 mL de MEM com três
submetidos a subcultivos por tripsinização diferentes concentrações de soro fetal
das células5. bovino 0%, 2% e 5%. Coletou-se o
sobrenadante (SN) por 3 vezes ou até a
Produção do Antígeno destruição de 75% da monocamada. Os
sobrenadantes coletados, bem como as
Vírus garrafas na última coleta, foram congeladas
Utilizou-se amostra do vírus CAEV- a –80ºC.
Cork (Amostra viral gentilmente cedida pela
UFRPE, oriunda do Laboratoire Associé de Concentração do Antígeno
Recherches sur les Petits Ruminants – INRA – Antes de ser concentrado o SN foi
ENVL – France) com título de 10 4,5 submetido a dois ciclos de congelamento e
TCID50(Tissue Culture Infectious Dose50%)/ a clarificação por centrifugação a 3300g a
mL multiplicada em MSC. 40C. O SN foi concentrado a partir de três
técnicas:
Titulação do vírus
Titularam-se as amostras virais em Diálise contra polietilenoglicol (PEG) – A
microplacas por diluições decimais em meio concentração por diálise foi realizada
essencial mínimo (MEM) sem soro fetal conforme metodologia descrita por Cutlip
bovino (SFB), utilizando-se oito repetições et al.9 e constituiu-se na colocação do SN
por diluição. Em cada diluição foram em membrana de diálise com cut-off de
colocados 50mL da diluição viral, a qual 12000 Daltons e dialisado contra PEG 6000
permaneceu por uma hora a 37ºC em 5% a 10% em Tampão fosfato (PBS - 0,05M;
de atmosfera de CO 2. Adicionaram-se 0,15M NaCl; pH 7,4) à 40C por 24 a 48
50mL da suspensão de células de MSC horas.
obtidas por tripsinização, contendo 3,0 x 104 Ultrafiltração - No sistema AMICON
células/cm3 em MEM com 10% de SFB. aplicou-se pressão do gás nitrogênio
Os poços controle de vírus e do cultivo diretamente à célula de ultrafiltração modelo
continham respectivamente, a diluição do 8400 da Millipore® conforme determinação
vírus e meio de cultivo, a suspensão celular, do Fabricante10. Solutos acima do peso
e o meio de cultivo. O título calculado molecular de retenção “cut-off” da membrana
segundo Reed e Muench7, definiu-se como (10000 Daltons) foram retidos na câmara,
a recíproca da diluição que apresentou, 14 enquanto solutos abaixo do “cut-off” saíram
dias após inoculação, sincícios em 50% dos para o filtrado. Nas duas técnicas
poços inoculados, e definido como uma concentrou-se 50X, 100X e 150X do volume
dose formadora de sincício (DFS). inicial.
Precipitação e Ultracentrifugação – Esta
Cultivo da MSC e inoculação viral técnica foi descrita por Houwers, Gilkens e
Na produção viral as monocamadas Jan Schaake11 e constituiu-se em precipitação

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da suspensão clarificada, com PEG-8000 a MVV, 3 mL de soro reagente (soro rico em


40% até a concentração final de 8%, por 18 anticorpos contra a glicoproteína gp135, 0,5
horas a 4C e centrifugação a 12000g por 60 mL de soro positivo (soro rico em
min a 4oC17. O sedimento foi suspenso em anticorpos contra as proteínas p28 e gp135),
TNE (10,0 mM Tris-HCl, pH 7,4; 10,0 mM 0,5 mL de soro fraco-positivo (soro pobre
NaCl; 1,0 mM EDTA) na proporção de em anticorpos contra a g p135 e sem
1/10 do volume original da suspensão viral. anticorpos contra a p28) e soro negativo
A suspensão foi passada em colchão de (soro sem anticorpos contra as proteínas p28
sacarose (25% em TNE) através de e gp135)].
centrifugação 42000g (Beckman rotor SW
50.1) por 120 min a 4oC (Houwers et al. Resultados e Discussão
1982). Utilizou-se em cada tubo de
centrífuga: 1mL de sacarose para 4 mL de As células sub-cultivadas com
suspensão viral. O novo sedimento foi intervalos de 5 a 9 dias apresentaram níveis
suspenso em PBS (volume igual a 0,5%,1% satisfatórios de vitalidade e produtividade
e 1,5% do volume inicial de suspensão = 10 por mais de 15 passagens. Os vírus, com
mL), contendo 2x10 -4 Molar de PMSF título de 104,5 TCID50/mL, multiplicaram-se
(Phenylmethylsulphonyl fluoride). bem, tanto em células de um número baixo
de passagens (7a a 8a) como em células de
Teste de Imunodifusão em Gel de Ágar - IDGA num número elevado de passagens (15a a
Foi utilizada a microtécnica de IDGA 16 a). Verificou que as células até a 20 a
descrita por Gouveia et al.13 em agarose a passagem permanecem com boa vitalidade
0,9% em tampão borato, utilizando 30 ml e que o vírus se multiplica promovendo
de soro/antígeno, com a leitura realizada efeitos citopáticos (sincícios) até a 18 a
após 72 horas, com luz indireta sobre fundo passagem. Este dado é semelhante aos
escuro. Como controle utilizou-se soro observados por Castro6.
positivo do kit americano para diagnóstico Na tabela 1 encontram-se os resultados
da AEC por IDGA [Caprine Arthritis- obtidos no IDGA quando cruzados as
Encephalitis/Ovine Progressive Pneumonia Antibody concentrações do Ag, quantidade de SFB e o
Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology, Inc®, método de concentração. Com relação à
USA. Este kit é composto por 1 mL de quantidade de SFB aplicada após a
antígeno (p28 e gp135) produzido com o inoculação viral verificou-se que 5% de SFB

Tabela 1 - Formação de linhas de precipitação antígeno-anticorpo (Ag-Ac)sob a influência da quantidade de soro fetal bovino e do método de
concentração do Antígeno. Sobral-Ceará, 2003* Verifica-se uma segunda linha entre o poço do Ag e do Ac considerada fraca

** Verifica-se uma segunda linha entre o poço do Ag e do Ac considerada boa


a- Sem reação – sem visualização da linha de precipitação de Ag-Ac
b- Muito fraca - linha de precipitação de Ag-Ac de difícil visualização
c- Fraca – linha de precipitação de Ag-Ac de regular visualização
d- Boa – linha de precipitação de Ag-Ac de boa visualização
e- Excelente - linha de precipitação de Ag-Ac de ótima visualização

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Figura 1 - IDGA do antígeno Ag concentrado 50 X (poço central) Figura 2 - IDGA do antígeno ag concentrado 150x (poço central)
método AMICON frente ao soro positivo do kit comercial método AMICON frente ao soro positivo do kit comercial
(poços 1, 2, 3 e 5), negativo (poço 4) e fraco positivo (poço 6). (poços 1, 3, 4 e 5), e reagente nos (poços 2 e 6). Nos poços
Nos poços 1, 2, 3 e 5 verifica-se a presença de uma linha de com soro positivos observa-se claramente a formação de
precipitação referente a proteína p28 duas linhas de precipitação das proteínas gp135 (interna) e p28

foi a concentração que apresentou melhor de diálise quanto o sistema AMICON


resultado corroborando com os achados de apresentaram bons resultados com relação à
Castro6, provavelmente em virtude da maior formação de linhas de precipitação e IDGA,
multiplicação celular, o que estimula a entretanto o sistema AMICON é mais rápido
replicação viral14, mesmo sabendo que o SFB e reduz as perdas de Ag. Na concentração
em grandes quantidades inibe o crescimento por precipitação/ultracentrifugação apesar de
viral. Abreu5 utilizando Ag preparado com concentrar até 150 vezes verificou-se apenas
2% de SFB e concentração de 50X, por linha de difícil visualização.
diálise, verificou boas linhas de precipitação. Utilizando os métodos do AMICON
Nos métodos de concentração diálise ou concentração por diálise, concentração
e AMICON somente na concentração do de 100X e SFB a 5% verificou-se que é
Ag de 150 X, produzido com SFB 5%, possível realizar o IDGA detectando as duas
verificou-se a presença de duas linhas de principais proteínas do LVC, o que aumenta
precipitação referentes às proteínas p28 a sensibilidade do Ag. Adams et al. 3
(Figura 1) e a gp 135 (Figura 2). Em todas identificaram as proteínas p28 e gp 135
as outras situações verificou-se somente uma como as responsáveis pelas linhas de
linha de precipitação referente a proteína precipitação obser vadas na IDGA.
nuclear p28. Desta forma, pode-se verificar Avaliando dois antígenos do LVC (gp 135
que ao se concentrar mais o Ag pode-se e p28) para a detecção de anticorpos através
obter as duas linhas de precipitação. do IDGA, Adams e Gorham16 concluíram
Entretanto, quando se utilizou a concentração que o antígeno gp 135 detecta maior número
de 150X verificou-se que existia um de caprinos infectados do que o antígeno
extravasamento de material do poço p28, ainda que alguns animais desenvolvam
provavelmente em decorrência de uma alta resposta anti-p28 na ausência de resposta
concentração do Ag que retirava água do anti-gp 135. A importância da escolha de
próprio gel. um antígeno influencia marcadamente os
Com relação as concentrações resultados da IDGA no diagnóstico das
verificou-se que tanto a técnica de membrana enfermidades causadas pelo LVC. A

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utilização do antígeno com as duas proteínas Conclusões


(gp 135 e p28) aumenta a sensibilidade
diagnóstica do teste. Os autores salientaram, A produção de antígeno nacional para
ainda, a importância da escolha dos soros o teste de imunodifusão de gel de agarose é
de referência utilizados em testes IDGA para tecnicamente viável. Quanto à quantidade de
diagnóstico de infecção por LVC. SFB a mais indicada durante o processo é de
Com o objetivo de observar como 5%.
a expressão de anticorpos varia durante o Tanto o método do sistema AMICON
tempo em caprinos soropositivos, Hanson, quanto o da concentração por diálise são
Hydbring e Olsson17 utilizando a IDGA para indicados, entretanto o sistema AMICON,
detectar anticorpos para os antígenos gp135 apesar dos custos de implantação, promoveu
e p28 do lentivírus MVV, verificaram que a maior rapidez e praticidade.
expressão de anticorpos para LVC variou A concentração de 100 vezes permite
ao longo do tempo, mostrando que reações o diagnóstico da AEC por duas proteínas
soropositivas e soronegativas podem ocorrer (gp 135 e p28).
intermitentemente. Baseado nestes fatos A produção do Ag por precipitação
ressalta-se a necessidade da utilização conjunta e ultracentrifugação, utilizada para provas
das proteínas nos antígenos para aumentar imunoenzimáticas, não apresentou resultados
a sensibilidade da prova. satisfatórios para o IDGA.

Comparison of three techniques for production goat lentivirus antigen


used in the agar gel immunodifusion test
Abstract Key-words
Goats.
The Caprine Arthritis Encephalitis (CAE) is a disease who cause Lentivirus.
AGID.
considerable economic losses, including loss in the milk production Antigen.
and reduction of the useful life of the animal. In the diagnosis of
this disease the agar gel immunodifusion test (AGID) is used
worldwide as the selection test. The objective of thid work was to test
three different concentrations of bovine fetal serum (BFS) in the
production of the antigen (Ag) for the diagnosis of the CAE virus
(CAEV), to verify amongst the three methods the most efficient
concentration and which the antigen concentration of the antigen
produced is appropriate for the test. The method of the AMICON
and the concentration of the Ag for dialysis was indicated, however
the system AMICON, despite the implantation costs, promoted
minor loss of antigen, little time expense in the processing and greater
simplicity. With relation to the amount of BFS placed after the viral
inoculation it was verified that 5% of BFS the amount that presented
better resulted. The antigen concentration 100 times was more
indicated, therefore it allowed the diagnosis of the CAEV for two
proteins (gp 135 and p28). The concentration of the Ag for
precipitation/ultracentrifugation, used for imunoenzimatic tests, did
not present resulted satisfactory used in the AGID.

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