UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA RELAÇÃO

PARASITO-HOSPEDEIRO

JÉSSICA DE OLIVEIRA VELOSO

Prevalência e tipagem molecular de Staphylococcus aureus

isolados de uma Unidade de Terapia Intensiva de um
hospital escola do município de Goiânia, Goiás.

Goiânia
2016
i
 JÉSSICA DE OLIVEIRA VELOSO

Prevalência e tipagem molecular de Staphylococcus aureus

isolados de uma Unidade de Terapia Intensiva de um
hospital escola do município de Goiânia, Goiás.

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Biologia da
Relação Parasito-Hospedeiro da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título de
Mestre

Orientadora:Profa Dra Maria Cláudia Dantas

Porfirio Borges André
Co-orientadora: Profa Dra Juliana Lamaro
Cardoso

Goiânia
2016

ii
iii
iv
 Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da
Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno (a): Jéssica de Oliveira Veloso

Orientador (a): Profa Dra Maria Cláudia Dantas Porfirio Borges André

Co-orientador (a): Profa Dra Juliana Lamaro Cardoso

Membros:
1. Profa Dra Maria Cláudia Dantas Porfirio Borges André

2.Profa DraLúcia Kioko Hasimoto e Souza

3.Profa Dra Lizandra Ferreira de Almeida e Borges

Data:30/09/2016

v
Dedico esse trabalho ao meu papai, Aroaldo de Oliveira Veloso, minha maior
riqueza nessa vida, pelo apoio e compreensão nos momentos em que estive
ausente, pelo amor e confiança de sempre. E à Professora Dra. Maria Cláudia
D. P. B. André, minha orientadora, grande referencial de profissionalismo,
caráter, humildade e sabedoria.

vi
 AGRADECIMENTOS

A Deus, ao Salvador Jesus e ao espírito santo, a quem devo tudo que sou.
Que toda honra e toda glória seja dada a Deus sobre cada vitória conquistada em
minha vida.

Ao meu papai Aroaldo, o grande amor da minha vida! Obrigada por ter
trabalhado tanto para conseguir investir nos meus estudos, por tantas vezes que em
silêncio abriu mão de si próprio para que eu e minha Joyce pudéssemos alcançar
vôos mais altos, por ser sempre o meu porto seguro, o meu melhor amigo, o melhor
pai que alguém pode ter, meu maior referencial de ser humano. Te amo!

À minha família em geral, mãe, irmã, e em especial toda a família Veloso por
serem a minha eterna e sincera torcida, refúgio e fortaleza nos momentos difíceis.
Amo vocês!

À Professora Dra. Maria Cláudia D. P. B. André, minha orientadora, um dos

maiores presentes de Deus nesse tempo de mestrado, exemplo de educadora, de
ser humano, de mulher, de esforço, ética e competência. Agradeço por toda a sua
atenção, dedicação, paciência, ensinamentos diários, ver que existem pessoas
como você me inspiram em tentar ser alguém melhor e continuar lutando pelos
meus sonhos, saiba que você é admirável e inspira a todos em sua volta. Sem você
esse trabalho não teria sido feito, obrigada, o aprendizado ao seu lado foi
gratificante.

À Professora Dra. Juliana Lamaro Cardoso, minha co-orientadora, por todo

apoio durante os experimentos, por transmitir parte do seu conhecimento prático, por
todas as críticas construtivas que possibilitaram meu crescimento como profissional
e fazer os devidos ajustes necessários em todo o projeto.

A toda equipe do laboratório: Cyndi, Lorraine, Fernando, Tainá, Barbara,

Robmary e Luana. A amizade e coleguismo que construí com cada um de vocês
enche meu coração de alegria. Obrigada pelos momentos de descontração, pelo
trabalho em equipe, pelos ensinamentos de vida. A finalização desse projeto não
seria possível sem a presença e cooperação em particular de cada um de vocês.

vii
 A todos os meus amigos, que são no dia a dia minha segunda família, em
especial, à minha melhor amiga Amanda, por ter sempre me incentivado a fazer o
mestrado, por sempre ter acreditado no meu potencial e estar sempre ao meu lado
compartilhando momentos bons e ruins.

Aos membros das bancas de qualificação e defesa, pela disponibilidade em

avaliar o trabalho e por acrescentarem ao mesmo, com seus pontos de vista.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação

Parasito-Hospedeiro pela oportunidade de realizar o projeto pela contribuição em
meu crescimento profissional e pelo aprimoramento científico.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação

Parasito-Hospedeiro, pela eficiência em sanar dúvidas e contribuir para que o
projeto fosse finalizado com sucesso.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pelo apoio financeiro.

viii
 SUMÁRIO

FIGURAS, QUADROS E ANEXOS ix

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIAÇÕES x
RESUMO xi
ABSTRACT xiii
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Staphylococcus aureus 2
1.2 INFECÇÕES RELACIONAS À ASSISTÊNCIA À SAÚDE – IRAS 5
1.3 EPIDEMIOLOGIA DE S. aureus 6
1.4 FATORES DE PATOGENICIDADE EM S. aureus 7
1.4.1 Superantígenos (SAgs) 8
1.4.2 Leucocidina de Panton-Valentine 11
1.4.3 Hemolisinas 13
1.5 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS 13
1.5.1 Evolução temporal da resistência aos antimicrobianos 14
1.5.2 Staphylococcus aureus resistente à meticilina - MRSA 15
1.5.3 Staphylococcus aureus e resistência a glicopeptídeos 19
1.5.4 Fenótipo de resistência MLSb em Staphylococcus aureus 20
1.6 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE Staphylococcus aureus 21
2 JUSTIFICATIVA 23
3 OBJETIVOS 25
3.1 OBJETIVO GERAL 25
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 25
4 MÉTODOS 26
4.1 AMOSTRAGEM 26
4.2 COLETA DAS AMOSTRAS 26
4.3 PROCEDIMENTOS MICROBIOLÓGICOS 27
4.3.1 Isolamento e Identificação fenotípica de S. aureus 27
4.3.2 Identificação molecular de S. aureus 28
4.3.2.1 Extração de DNA 28
4.3.2.2 PCR para detecção do gente femA 29
4.3.3 Teste de suscetibilidade a antimicrobianos 29
4.3.4 Determinação da concentração inibitória mínima 30
4.3.5 PCR para detecção do gene mecA 31

ix
4.3.6 PCR para detecção do gene luks-F 31

4.3.7 Multiplex PCR para detecção de genes codificadores de fatores de 32

virulência
4.3.8 Multiplex PCR para tipagem SCCmec 33

4.3.9 Eletroforese em gel em campo pulsado (Pulsed Field Gel 35

Electrophoresis – PFGE)
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA 36
5 RESULTADOS 37
5.1 PREVALÊNCIA DE COLONIZAÇÃO/CONTAMINAÇÃO POR S. aureus 37
5.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS 38

5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MINÍMA (CIM) E 39

DETECÇÃO DO GENE mecA
5.4 TIPAGEM DO SCCmec 42
5.5 DETECÇÃO DO GENE lukS-F 42
DETECÇÃO DOS GENES PARA ENTEROTOXINAS, TOXINAS
5.6 ESFOLIATIVAS, HEMOLISINAS E TOXINA DA SÍNDROME DO CHOQUE 44
TÓXICO POR MULTIPLEX PCR
5.7 ELETROFORESE EM GEL EM CAMPO PULSADO (PULSED FIELD 45
GEL ELECTROPHORESIS – PFGE
6 DISCUSSÃO 49
7 CONCLUSÕES 63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 65

x
 FIGURAS, QUADROS E ANEXOS

Microscopia ótica de Staphylococcus aureus pela técnica da coloração

Figura 1. 3
de Gram
Classificação das enterotoxinas estafilocócicas que são codificadas em
Quadro 1. 11
MGEs
Tipos de SCCmec identificados com maior frequência em cepas de S.
Quadro 2. 17
aureus
Figura 2. Prova da coagulase utilizando plasma de coelho 28
Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a detecção de genes de
Quadro 3. 32
virulência em S. aureus
Quadro 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para tipagem do SCCmec 34
S. aureus identificados em amostras de pacientes e de ambiente de
Tabela 1. 37
uma UTI de um hospital escola de Goiânia, GO.
Figura 3. Detecção do gene femA 38
Suscetibilidade antimicrobiana dos 68 isolados de S. aureus isolados
Tabela 2. 38
da UTI de um hospital escola de Goiânia, GO.
Determinação da concentração inibitória minima para os S. aureus
Figura 4. 40
resistentes à cefoxitina por meio do E- test®
Figura 5. Detecção do gene mecA em S. aureus isolados em UTI 40
Figura 6. Teste de disco-difusão e teste D para detecção do fenótipo iMLSB 41
Características dos isolados identificados como MRSA na UTI de um
Tabela 3. 42
hospital universitário
Figura 7. Multiplex PCR para tipagem de SCCmec.em isolados MRSA 43
Figura 8. Detecção do gene lukS-F em S. aureus isolados de UTI 43
PCR multiplex para detecção de genes de virulência em S. aureus
Figura 9. 44
isolados de UTI – Reação I
PCR multiplex para detecção de genes de virulência em S. aureus
Figura 10. 44
isolados de UTI - Reação II
Perfis de fatores de virulência encontrados nos S. aureus identificados
Quadro 5. 45
em pacientes e ambiente de UTI
Dendrograma resultante da análise de similaridade genética entre
Figura 11. isolados de S. aureus obtidos de ambiente e pacientes de UTI de 46
hospital-escola de Goiânia, Goiás
Dendrograma resultante da comparação entre isolados MRSA do
Figura 12. 48
estudo e clones MRSA mundiais
Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética 84

xi
 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIAÇÕES

ATCC – American Type Culture Collection

BEC – Brazilian Endemic Clone
CA-MRSA – Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
CCIH - Comissão de Controle de Infecção Hospitalar
CIM – Concentração inibitória mínima
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
ECN – Estafilococos coagulase negativos
ET – Exfoliative Toxin
HA-MRSA – Hospital-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
HLA – Hemolisina α
HLB – hemolisina β
IC 95% - Intervalo de Confiança 95%
MDRO–Multidrug Resistant Organisms
MGE – Mobile genetic element
MLSB – Macrolide, Lincosamide and Streptogramin B
MRSA – Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
MSSA – Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus
OSPC – Ocean Southwest Pacific Clone
PBP – Penicillin binding protein
PCR – Polymerase chain reaction
PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis
PVL – Panton-Valentine Leucocidin
SAg – Superantigen
SCCmec – Staphylococcal Cassette Chromosome mec
SE – Staphylococcal enterotoxin
SSSS – Staphylococcal scalded skin syndrome
SSTI - Skin and soft tissue infection
TSS – Toxic schock syndrome
TSST-1 – Toxic shock syndrome toxin 1
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
VISA - Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus

xii
 RESUMO

Staphylococcus aureus é um importante patógeno relacionado a infecções

nosocomiais, com elevadas taxas de prevalência, morbidade e mortalidade. Nesse
contexto, as Unidades de Terapia Intensiva (UTI) tem sido áreas de alto risco para a
seleção de cepas multirresistentes. O ambiente (objetos, equipamentos e
superfícies) de uma UTI também pode se contaminar, e os microrganismos podem
permanecer viáveis por um longo período de tempo, podendo colonizar pacientes,
trabalhadores, visitantes e contaminar ainda outros ambientes. Os objetivos do
estudo foram determinar a prevalência de colonização por S. aureus em pacientes e
ambiente da UTI de um hospital universitário na cidade de Goiânia-GO, bem como o
perfil de susceptibilidade antimicrobiana e perfil de virulência dos isolados e realizar
a tipagem molecular dos S. aureus resistentes à meticilina (MRSA). Foi realizado o
isolamento e identificação presuntiva de S. aureus por técnicas fenotípicas e a
confirmação da espécie pela detecção do gene femA por PCR. Os isolados foram
submetidos ao teste de disco-difusão para determinação do perfil de suscetibilidade
antimicrobiana e aqueles que apresentaram resistência à cefoxitina foram
submetidos ao E-test® para determinação da concentração inibitória mínima à
oxacilina e vancomicina, assim como, à detecção do gene mecA para identificação
das cepas MRSA. Nestes isolados foi realizada a tipagem do SCCmec. Em todos os
S. aureus isolados foi realizada a detecção dos genes codificadores de fatores de
virulência e a comparação genética para determinação do perfil de similaridade por
eletroforese em gel em campo pulsado. Foram coletados 536 swabs sendo 134 de
pacientes e 402 de ambiente de UTI. A prevalência de colonização por S. aureus foi
de 12,7% (68/536), sendo 13,4% (18/134) para pacientes e 12,4% (50/402) para o
ambiente. A maior taxa de resistência apresentada foi à penicilina (85,3%) seguida
da eritromicina (69,1%), clindamicina (66,2%) e sulfametoxazol-trimetoprim (54,4%).
Cinquenta e seis isolados (82,4%) foram considerados multirresistentes. A
prevalência de MRSA foi de 20,6% (14/68), houve ainda a existência de sete
(10,3%) isolados com suscetibilidade intermediária à vancomicina (VISA). O fenótipo
de resistência induzível (iMLSb) foi encontrado em 11 isolados (16,2%) e o de
resistência constitutiva (cMLSb) em 25 (36,8%). Onze isolados apresentaram genes
codificadores para pelo menos um fator de virulência pesquisado, sendo detectados
seis perfis de virulência. Das 14 cepas MRSA, seis (42,9%) foram SCCmec tipo IV,
cinco (35,7%) SCCmec tipo I, duas (14,3%) SCCmec tipo II e uma (7,1%) SCCmec
tipo III.A análise de PFGE revelou diversidade genética entre os isolados, apesar de
que um cluster agrupou 16 isolados mostrando a disseminação da bactéria entre
pacientes e fômites. Um isolado MRSA mostrou relacionamento genético à cepa
USA300 e dois isolados MRSA/VISA foram semelhantese outro idêntico ao clone
USA400. Os resultados sugerem que a prevalência de S. aureus e MRSA
permanece elevada em instituições de saúde, especialmente em UTI, com elevadas
taxas de resistência antimicrobiana e potencial patogênico. A detecção desses
microrganismos no ambiente evidencia risco de transmissão cruzada desses
patógenos, principalmente via profissionais da saúde. A identificação de isolados
com background genético de cepas adquiridas na comunidade alerta para um fluxo
de disseminação intra e inter-ambiente hospitalar e comunitário. Além disso,
acredita-se que as superfícies ambientais podem estar atuando como reservatórios
de genes de resistência e virulência, bem como fontes potenciais de contaminação
de pacientes, profissionais e ambientes.

xiii
Palavras-chave: MRSA, iMLSb, PVL, VISA, Fatores de Virulência, SCCmec, PFGE.

xiv
 ABSTRACT

Staphylococcus aureus is an important pathogen related to nosocomial infections,

with high prevalence, morbidity and mortality rates. In this context, the Intensive Care
Units (ICU) has been high-risk areas for the selection of multiresistant strains. The
environment (objects, equipment and surfaces) of an ICU can also get contaminated,
and micro-organisms may remain viable for a long period of time, and can colonize
patients, employees, visitors and other environments.The objectives of the study
were to determine the prevalence of S. aureus contamination in patients and ICU
environment of a university hospital in the city of Goiânia-GO, as well as to determine
the antimicrobial susceptibility and virulence profile of the isolates and perform
molecular typing of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolates. The isolation and
presumptive identification of S. aureus by phenotypic techniques and the
confirmation of the species by detection of femA gene by PCR were performed.The
isolates were subjected to disk-diffusion test for determining antimicrobial
susceptibility profile, and those showing resistance to cefoxitin were subjected to E-
Test® to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) to oxacillin and
vancomycin, as well as the mecA gene detection for identification of MRSA strains. In
these isolates the SCCmec typing was performed. In all S. aureus isolates were
detected virulence factors-coding genes and held the genetic comparison for
determining the similarity profile by pulsed field gel electrophoresis. Fifty hundred and
thirty six swabs were collected being 134 of patients and 402 of ICU environment.
The prevalence of colonization by S. aureus was 12.7% (68/536), being 13.4%
(18/134) for patients and 12.4% (50/402) for the environment. The highest resistance
rate presented was to penicillin (85.3%) followed by erythromycin (69.1%)
clindamycin (66.2%) and sulfamethoxazole-trimethoprim (54.4%). Fifty-six isolates
(82.4%) were classified as multiresistant. The prevalence of MRSA was 20.6%
(14/68), and seven isolates (10.3%) presented intermediate susceptibility to
vancomycin (VISA). The inducible resistance phenotype (iMLSb) was found in 11
strains (16.2%) and the constitutive resistance (cMLSb) in 25 (36.8%). Eleven
isolates showed genes encoding for at least one virulence factor and were detected
six virulence profiles. Of the 14 MRSA strains, six (42.9%) were SCCmec type IV,
five (35.7%) SCCmec type I, two (14.3%) SCCmec type II and one (7.1%) SCCmec
type III. PFGE analysis showed genetic diversity among the isolates, although a
cluster grouped 16 isolates showing the spread of the bacteria among patients and
environment. One MRSA isolate showed genetic relationship to the USA300 strain
and two isolates MRSA/VISA were similar and another identical to the clone
USA400. The results suggest that the prevalence of S. aureus and MRSA remains
high in health institutions, especially in the ICU, with high rates of antimicrobial
resistance and pathogenic potential. The detection of these microorganisms in the
environment shows risk of cross-transmission primarily via health professionals.
Identification of isolates with genetic background of strains acquired in the community
alert to a flow of intra and inter- hospital and community environment. In addition, it is
believed that environmental surfaces can be acting as reservoirs of genes of
resistance and virulence as well as potential sources of contamination to patients,
professionals and environments.

Keywords: MRSA, iMLSb, PVL, VISA, Virulence Factors, SCCmec, PFGE.

xv
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

A microbiota endógena consiste em um complexo conjunto de micro-

organismos que habitam o corpo de animais e seres humanos estabelecendo uma
relação simbiótica, mutualística, de equilíbrio com o hospedeiro. Geralmente não
provoca doenças, garante a sobrevivência, crescimento, propagação dos micro-
organismos e do homem, além de desempenhar papel importante no estímulo da
resposta imunológica (Blaser & Falkow 2009; Cho & Blaser 2012).
Os indivíduos após exposição a determinado micro-organismo podem ser
colonizados de forma permanente, transitória ou chegar a desenvolver uma infecção
e consequente doença. Porém, se sabe que poucas infecções são causadas por
patógenos primários, sendo a maioria por patógenos oportunistas (por exemplo,
Staphylococcus aureus, Salmonella, Streptococcus pneumoniae), estes que são
tipicamente membros da microbiota humana normal, mas em ocasiões oportunas
estabelecem infecções. Quando o hospedeiro está colonizado assintomaticamente
se encontra em um estado de “portador” (Von Graevenitz 1977; Cho & Blaser 2012).
As bactérias patogênicas de pessoas infectadas ou portadores podem ser
transmitidas a outros indivíduos por diversificadas vias: primariamente via contato
(indireto ou direto), fonte comum, ar e vetores. Ao longo dos anos, vários estudos
alteraram esta perspectiva incluindo um modelo de transmissão multifatorial mais
complexo, demonstrando que as superfícies e objetos inanimados contaminados
(fômites) desempenham um papel fundamental como agentes de transmissão direta,
cruzada, disseminação e reservatórios de germes (Mayer et al. 2009).
Destaca-se entre os fômites aqueles que com maior frequência estão em
contato com as mãos. As mãos possuem uma microbiota diversificada que pode
atuar como veiculadora de bactérias e fungos patogênicos, o que aumenta os riscos
da ocorrência de doenças infecciosas, muitas vezes causadas por micro-organismos
resistentes a múltiplas drogas (multidrug resistant organisms – MDRO) e de difícil
tratamento clínico (Gerba & Pepper 2009).
O meio ambiente hospitalar assim como as superfícies inanimadas que
cercam o paciente, guardam uma íntima relação com as infecções relacionadas à
assistência à saúde (IRAS), podendo proporcionar focos de contato e de

1
transmissão. O papel das mãos dos profissionais da saúde na transmissão indireta e
disseminação de micro-organismos nesses ambientes é um dos mais valorizados
aspectos da epidemiologia das infecções nosocomiais, direcionando parte
considerável de atividades educacionais pelas Comissões de Controle de Infecção
Hospitalar (CCIH), para sua orientação e supervisão. Várias pesquisas enfatizam
esse potencial de disseminação, além da frequente correlação com altas taxas de
morbidade, mortalidade e resistência bacteriana a fármacos (Borges et al. 2006;
Judah et al. 2010;Sowndarya et al. 2016).
Com relação à saúde pública, as IRAS, atualmente, estão no centro das
atenções, devido aos graves desfechos que provocam nos pacientes, assim como
pelo enorme ônus gerado para assisti-los. É importante ressaltar que dentro das
Unidades de Terapia Intensiva (UTI) os pacientes têm de cinco a 10 vezes mais
probabilidades de contrair uma infecção hospitalar e que estas podem representar
cerca de 20% do total de infecções de um hospital. O risco de infecção é
diretamente proporcional à gravidade da doença, às condições nutricionais, à
natureza dos procedimentos diagnósticos e/ou terapêuticos, bem como, ao tempo de
internação, dentre outros aspectos (Huang et al. 2016; Sievert et al. 2013).
Diversos micro-organismos tem a capacidade de colonizar as superfícies
existentes dentro dos hospitais, como por exemplo, Staphylococcus aureus,
Clostridium difficile, Pseudomonas sp., Proteus sp., Serratia marcescens, Candida
sp. e outros. Dentre estes, o S. aureus é um dos mais frequentemente identificados
(Sievert et al. 2013,Rosenthal et al. 2014).

1.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica do grupo dos cocos Gram-

positivos, com tamanho aproximado de 0,5 a 1,5 µm de diâmetro, podendo
apresentar-se isolada, aos pares, em cadeias curtas ou grupos em arranjos que se
assemelham a cachos de uva (Figura 1). Foi descrita primeiramente em 1880, pelo
cirurgião escocês Alexandre Ogston, em pus de abscessos cirúrgicos. Pertence à
família Staphylococcaceae e ao gênero Staphylococcus, atualmente classificado em
52 espécies e 29 subespécies (DSMZ 2016). São anaeróbios facultativos, imóveis e

2
capazes de crescer em meio com elevada pressão osmótica, na presença de 7,5 %
de cloreto de sódio (Santos et al. 2007; Murray & Rosenthal 2009).

Figura 1: Microscopia ótica de Staphylococcus aureus

pela técnica da coloração de Gram.
Fonte: Acervo próprio.

Staphylococcus aureus quando cultivado em meio sólido, forma colônias

usualmente lisas e podem apresentar pigmentação amarela ou amarelo-alaranjado,
características que se tornam mais evidentes após incubação a 37oC, enquanto
outras colônias podem ser esbranquiçadas ou acinzentadas (Kloos 1997).
Os estafilococos são produtores de catalase, sendo esse um teste fenotípico
importante para diferenciá-los dos estreptococos (catalase negativos). Um dos
fatores de patogenicidade que diferencia S. aureus das demais espécies do gênero
é a capacidade de coagular o plasma, humano ou de coelho, por reação direta com
o fibrinogênio. Esta reação produz fibrina, que recobre as células bacterianas,
permitindo sua rápida aglutinação e resistência aos processos de opsonização e
fagocitose. Esta propriedade é conferida tanto pela presença da enzima coagulase
livre como pela coagulase aderida ou “fator de agregação” na superfície da parede
celular (Kloos 1997; ANVISA 2013).
S. aureus é considerado o principal agente etiológico de infecções
nosocomiais e comunitárias. Tem o ser humano como seu principal reservatório,
sendo frequentemente encontrado na pele e nas fossas nasais de indivíduos

3
saudáveis. A bactéria pode colonizar também a garganta, intestinos, região perineal,
trato urinário, regiões umbilical e axilar, além de feridas (Wang et al. 2012).
Devido à capacidade de resistir à dessecação, ao frio, habilidade de se
adaptar às diversidades ambientais e alta plasticidade metabólica, S. aureus é uma
das mais resistentes bactérias não formadoras de esporos, permanecendo viável por
longos períodos de tempo em objetos inanimados, o que torna sua distribuição ainda
mais ampla (Cursino et al. 2012; Dastgheyb & Otto 2015).
A transmissão da bactéria pode ocorrer por contato direto. Neste caso o
indivíduo que carreia a bactéria na cavidade nasal, tem maior propensão à
colonização das mãos e, por conseguinte, a se tornar uma fonte de infecção. Dessa
maneira, com enfoque no ambiente hospitalar, os pacientes, os visitantes e até os
profissionais envolvidos podem ser portadores de S. aureus e, consequentemente,
representam riscos para disseminação dessa bactéria (Wang et al. 2012; Zarpellon
et al. 2015).
A colonização nasal também favorece a transmissão aérea desse micro-
organismo, entretanto, as transmissões ambientais e por vias aéreas ocorrem em
situações específicas como, por exemplo, unidades de queimados e unidades de
terapia intensiva (UTI). O portador de S. aureus é o maior fator de risco para
desenvolvimento de IRAS e de infecções adquiridas na comunidade (Miller & Diep
2008; Angelakis et al. 2014).
Pode haver a transmissão cruzada, quando os trabalhadores da área de
saúde ao atenderem pacientes portadores persistentes ou ao manusear objetos
contaminados, se contaminam e carream a bactéria para outros pacientes
(Cavalcanti et al. 2006; Angelakis et al. 2014).
Por estar habitualmente na pele, o micro-organismo pode infectar pacientes
que fazem uso de cateteres endovenosos, podendo a bactéria invadir a corrente
sanguínea através do local onde o cateter foi implantado. Essa invasão pode
desencadear uma séria bacteremia, sobretudo se cepas resistentes a
antimicrobianos estiverem envolvidas na colonização. As feridas cirúrgicas
contaminadas aumentam potencialmente a ocorrência de infecções sistêmicas, nas
quais é realizado de forma frequente, o isolamento de S. aureus (Brooks et al. 2010;
Otto 2015).
As doenças provocadas por S. aureus podem ser infecções superficiais e
localizadas, assim como infecções profundas, sistêmicas e potencialmente fatais

4
(pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque tóxico, sepse e outras),
sendo que a maioria delas é proveniente de fonte endógena. Estas doenças estão
geralmente associadas a fatores de riscos como hospitalização ou tempo de
internação prolongado, dispositivos e aparelhos implantados, principalmente em
pacientes cuja imunidade esteja comprometida, seja por outras doenças ou por
condições fisiológicas, como idade (Santos et al. 2007; Wang et al. 2012).
A gravidade dos processos patológicos que a bactéria pode ocasionar é
avaliada de acordo com a extensão, comprometimento clínico e hemodinâmico do
paciente, necessidade de intervenção cirúrgica e padrão de antibioticoterapia exigido
(Santos et al. 2007).

1.2 INFECÇÕES RELACIONADAS À ASSISTÊNCIA À SAÚDE - IRAS

O problema das IRAS é bastante antigo e apesar dos avanços na área da

Saúde Pública e no cuidado do ambiente hospitalar, essas infecções continuam a
ocorrer em pacientes e na equipe de profissionais envolvidos no cuidado
assistencial. São definidas como infecções adquiridas após a admissão do paciente,
as quais podem se manifestar tanto durante a internação ou após a alta, desde que
seja possível estabelecer uma relação com algum dos diversos tipos de
procedimentos hospitalares (Garner et al. 1998; Huang et al. 2016).
As IRAS têm sido observadas em todo o mundo tanto nos países
desenvolvidos quanto nos países em desenvolvimento, levando a taxas elevadas de
morbidade, mortalidade e aumento nos custos hospitalares, com grande impacto
para pacientes e sistema de saúde público (Pittet et al. 2005).Por ano, no mundo,
aproximadamente 10 milhões de pessoas adquirem IRAS e dessas, quase 300 mil
vão a óbito. Em algum momento, 1,4 milhões de indivíduos desenvolverão
complicações infecciosas decorrentes da assistência em saúde (InFocus, 2008).
Estudos da Associação Nacional de Biossegurança (ANBIO) mostram que
no Brasil cerca de 80% dos hospitais não fazem o controle microbiológico adequado
de suas instalações, o índice de infecção hospitalar varia entre 14% e 19%, podendo
chegar a 88,3% em algumas unidades, com uma mortalidade de cem mil pessoas
por ano. A OMS acredita que as infecções hospitalares atinjam 14% dos pacientes
internados no país (ANBIO, 2012).

5
 As UTIs são unidades destinadas a atender pacientes clinicamente graves,
que necessitam de monitorização e suporte contínuos de suas funções vitais. É
considerada uma área crítica, tanto pelo risco elevado de desenvolver IRAS, quanto
pela instabilidade hemodinâmica dos pacientes internados nessa unidade. É
destacado que em UTIs os pacientes têm de 5 a 10 vezes mais probabilidades de
contrair IRAS e que estas podem representar cerca de 20% do total de infecções de
um hospital (Couto et al. 2003; Gacouin et al.2009).
Nas UTIs, as IRAS estão relacionadas principalmente, ao uso de
procedimentos invasivos (catéteres venosos centrais, sondas vesicais de demora,
ventilação mecânica, dentre outros), uso de imunossupressores, uso de grande
quantidade de antimicrobianos, períodos longos de internação e o próprio ambiente
da unidade, que constitui a principal fonte de surtos de micro-organismos
multirresistentes, além de favorecer a seleção dos mesmos (Klevens et al. 2007;
Ritchie et al. 2009).
As infecções nosocomiais em UTIs são aquelas, que de acordo com o
National Nosocomial Infections Surveillance System (NNISS), são notificadas na UTI
após 48 horas de admissão do paciente na unidade, ou até 48 horas após a alta do
mesmo. O sítio mais frequente de infecção é o respiratório (71,2%), seguido pelo
trato urinário (16,6%), abdomen (13,4%,) e corrente sanguínea (10,1%) (Grau
Cerrato & Alvarez Lerma, 2008).

1.3 EPIDEMIOLOGIA DE Staphylococcus aureus

Em humanos a colonização pela S. aures é mais frequente que a infecção,

cujo nicho ecológico preferencial são as narinas anteriores, porém a colonização da
nasofaringe, pele, períneo e membranas mucosas é um processo dinâmico que
pode ocorrer logo após o nascimento e recorrer durante a vida, favorecendo a
ocorrência de uma possível infecção. Estudos demonstram que cerca de 60% de
toda a população mundial é portadora de forma persistente de alguma cepa de S.
aureus; podendo existir variantes quanto ao tipo de cepa colonizadora. Ao contrário
há 20% de indivíduos que praticamente não são colonizados pela bactéria,
evidenciando o fato de que algumas populações estão mais propensas a serem
colonizadas pela bactéria do que outras (Wertheim et al. 2005).

6
 A prevalência do estado portador do paciente pela bactéria tem taxas
variáveis eas maiores frequências são encontradas entre algumas populações
específicas como profissionais da área da saúde, pacientes hospitalizados,
pacientes diabéticos ou não, usuários de drogas endovenosas, indivíduos
apresentando lesões dermatológicas, indivíduos em uso de catéteres venosos de
longa permanência e indivíduos HIV positivos (Braga et al. 2014; Tong et al. 2015).
A colonização nasal é mais comumente encontrada em crianças,
contribuindo para a disseminação do micro-organismo no ambiente domiciliar. No
Brasil, pesquisas têm evidenciado que a taxa de colonização por S. aureus em
crianças menores de cinco anos aproxima-se de 30%. Essa taxa de colonização em
crianças vem sendo relacionada com fatores diversos como tamanho da família,
mães com baixo grau de instrução e tabagistas (Lamaro-Cardoso et al. 2009).
Prates et al. (2009) em seus estudos analisando uma populaçãode jovens de
17 a 28 anos (estudantes universitários), observaram prevalência de 40% de
portadores de S. aureus, valendo ressaltar que o fator que pode ter influenciado
essa alta prevalência seria o fato desses estudantes serem graduandos de cursos
da área da saúde. Posteriormente, Pires et al. (2014), constataram que cerca de
32% dos indivíduos da população de Botucatu, SP, eram portadores da bactéria, no
estudo foi relatado que os portadores da população tinham 28 anos em média e que
os mesmos se encontravam suscetíveis a infecções de pele.
A prevalência de colonização por S. aureus em pacientes internados e
profissionais da área da saúde envolvidos com as UTIs observada em estudos em
vários países nos últimos anos é bastante variável, oscilando entre 10 e 60%. Uma
das hipóteses que justifica essa variação seria a forma como é feita, por parte do
hospital, o controle microbiológico de micro-organismos nessas unidades (Cavalcanti
et al. 2006, Sader et al. 2016).

1.4 FATORES DE PATOGENICIDADE EM S. aureus

Os variados fatores, dependentes da expressão das classes de genes

acessórios, como proteínas participantes da adesão celular e proteínas
extracelulares, que levam à capacidade específica de colonização e patogenicidade
do S. aureus são os chamados fatores de virulência. Estes fatores são produzidos

7
por diferentes cepas do micro-organismo e podem atuar de forma isolada ou
coordenada e sinérgica, estando relacionados às infecções severas (Santos et al.
2007; Rasigade & Vandenesch 2013).
No que se refere à patogênese do S. aureus, tem-se observado que
diferentes cepas podem ser diferentes quanto à capacidade de provocar infecção em
um determinado organismo. A explicação para esse fato seria a variação genética,
onde cerca de 75% do genoma bacteriano é constituído por um núcleo conservado e
constante, 10% de regiões variáveis e ainda 15% por elementos genéticos móveis
(plasmídeos, ilhas genômicas e de patogenicidade), carreando uma variedade de
genes de virulência e resistência (Lindsay & Holden 2005; Alibayov et al. 2014b).
A patogenicidade de S. aureus é multifatorial, geralmente envolvendo um
grande número de proteínas extracelulares e outros fatores de virulência que são
responsáveis pela colonização e subsequente evasão da resposta imune,
disseminação e invasão de tecidos, sendo codificados na grande maioria pelos
elementos genéticos móveis de seu genoma. Algumas destas proteínas, incluindo
citotoxinas e exoenzimas, são secretadas; outras, incluindo a proteína A e várias
adesinas, fixadas na parede celular. Juntas, estas proteínas capacitam o micro-
organismo a escapar das defesas do hospedeiro, aderir às células e moléculas da
matriz intercelular, invadir ou destruir as células do hospedeiro e a se propagar
dentro dos tecidos (Jiménez et al. 2011; Rasigade & Vandenesch 2013).
Existe um gene regulador global, nomeado agr (acessory gene regulator)
que é responsável por fazer o controle da maioria dos fatores de virulência do S.
aureus, sendo a regulação feita a partir de ativação dependente da molécula AIP
(auto-inducing peptide) em um sistema denominado de quorum-sensing. Neste
micro-organismo existem quatro tipos diferentes de agr (agr I, II, III e IV)
classificados inicialmente de acordocom a sequência do AIP produzido (Singh & Ray
2014).

1.4.1 Superantígenos (SAg)

Dentre os importantes fatores de virulência associados a S. aureus, destaca-

se a sua capacidade de produzir os chamados superantígenos (SAgs), que são
proteínas que induzem forte ativação de subpopulações de linfócitos T, que como

8
moléculas bifuncionais, permitem uma interação entre as moléculas MHC de classe
II das células apresentadoras de antígeno e a região VB do receptor de linfócitos T
(TCR), levando a uma intensa ativação destas células. Expressiva parte dos SAgs
são codificados em ilhas de patogenicidade e fagos, podendo também ser
encontrados em plasmídeos ou no cassete de resistência antimicrobiana (SCCmec).
Os SAgs deste micro-organismo compreendem as toxinas esfoliativas (Exfoliative
toxin – ET), toxina 1 da síndrome do choque tóxico (Toxic Shock Syndrome Toxin 1 –
TSST 1) e as enterotoxinas estafilocócicas (Staphylococcal enterotoxins - SE)
(Holtfreter et al. 2007; Malachowa & DeLeo 2010; Alibayov et al. 2014b).
As toxinas esfoliativas são responsáveis pela chamada doença de Ritter ou
síndrome da pele escaldada estafilocócica (SSSS- staphylococcal scalded skin
syndrome), doença que leva à desidratação, perda das camadas superficiais da
pele, infecções secundárias, afetando principalmente bebês lactentes, embora
adultos também sejam susceptíveis (Bukowski et al. 2010).
A SSSS pode apresentar ainda outra forma clínica, o chamado impetigo
bolhoso, que é uma forma localizada da doença, sendo mais comum e podendo
ocorrer em qualquer faixa etária. Ocorrem lesões bolhosas com exsudato purulento,
sinais locais de inflamação e necrose e ainda S. aureus pode ser isolado das lesões
(Lisa & Plano 2004; Malachowa & DeLeo 2010).
As duas principais isoformas de toxinas esfoliativas A e B produzidas pela
bactéria, ETA e ETB, são biológica e sorologicamente diferentes. O gene que
codifica ETA se encontra no cromossomo, já o de ETB se localiza em um plasmídeo
chamado pETB. Ambas são proteases de serina altamente específicas ao substrato,
tendo como alvo a desmogleína 1, levando à perda da adesão celular apenas na
camada superficial da epiderme (Bukowski et al. 2010; Singh & Ray 2014).
A TSST-1 é o principal fator de virulência em doenças como: choque tóxico
neonatal, escarlatina estafilocócica e doença exantematosa, sendo secretada
exclusivamente por cepas de S. aureus. A toxina é codificada pelo gene tst, situado
no cromossomo bacteriano dentro de elementos genéticos móveis de 15 a 19 kb,
chamadas ilhas de patogenicidade estafilocócicas (Brosnahan & Schlievert 2011;
Low 2013).
A síndrome do choque tóxico (toxic shock syndrome – TSS) é uma doença
aguda, multissistêmica, que leva o organismo a entrar no estado de choque e ter
falha múltipla dos órgãos. A sintomatologia envolve mialgia severa, desconforto

9
abdominal, letargia e agitação, hipovolemia e descamação, sendo esta uma
característica tardia da síndrome estafilocócica (Lappin & Ferguson 2009; Brosnahan
& Schlievert 2011; Low 2013).
A TSST-1 é um polipeptídeo de 29,1 KDa, com propriedades biológicas
semelhantes a outras exotoxinas pirogênicas e superantigênicas, porém apenas as
SE têm atividade emética. A proteína madura é uma cadeia polipeptídica com um
peso molecular de 22 KDa (Dinges et al. 2000). A TSST-1 pode ser capaz de
estimular a secreção de citocinas por monócitos na ausência de proliferação de
linfócitos T (Almeida et al. 2013; Bonesso et al. 2014).
O gene tst tem sido detectado em cepas que possuem relações com surtos
de intoxicação alimentar e a presença de enterotoxinas. Em decorrência da relação
com ilhas de patogenicidade, por exemplo, o tst pode transportar os genes sell, sec,
selk, selq e ser carreado pelas ilhas de patogenicidade SaPIm1/n1, SaPIbov1, SaPI-
SaPI1 e SaPI68111(Alibayov et al. 2014a).
As SE são as mais prevalentes dentre os SAgs. São proteínas extracelulares
de baixo peso molecular (26,9 a 29,6 KDa), tendo como características, pertencerem
à família de toxinas termoestáveis. As enterotoxinas pertencem a uma ampla família
de toxinas que compartilham relações filogenéticas de estrutura, função e
sequências de nucleotídeos entre si (Krakauer 2013).
Estas toxinas são agentes da intoxicação alimentar estafilocócica, a segunda
maior causa de doenças transmitidas por alimentos no Brasil (ANVISA 2014b), tendo
um amplo impacto em saúde pública. São produzidas no alimento após
contaminação pela bactéria, multiplicação e liberação das toxinas. O processo de
intoxicação alimentar estafilocócica ocorre por um rápido início de sintomatologia
pela ingestão das toxinas pré-formadas, com dor abdominal, diarreia, náuseas e
vômito. Normalmente a intoxicação não é letal, sendo os idosos os mais afetados
com relação à morbidade e mortalidade dessa intoxicação alimentar (Balaban &
Rasooly 2000; Tang et al. 2011).
As SE estão divididas em dois grupos, as enterotoxinas clássicas
(Staphylococcal enterotoxins - SE), que têm atividade emética e as toxinas
semelhantes às enterotoxinas (Staphylococcal enterotoxins-like proteins- SEl), que
não possuem atividade emética comprovada em seres humanos (Quadro 1).
Estudos de amostras causadoras de diversos surtos de intoxicação alimentar no

10
Brasil mostraram que as enterotoxinas SEA e SEB são as mais frequentemente
encontradas (Pinchuk et al. 2010; Principato & Qian 2014).

Quadro 1. Classificação das enterotoxinas estafilocócicas que são codificadas em

Elementos Genéticos Móveis (MGE)
Peso Molecular
Enterotoxinas Gene Elementos Genéticos Acessórios
(kDa)
Prophage-phiNM3, phiSa3mu, phiSa3mw,
SEA 27,1 Sea
phiSa3ms, phiMu50A, phiMu3, phi252B
Plasmid-pZA10, SaPI-SaPI3, SaPIivm10,
SEB 28,336 Seb SaPIishikawa11, SaPIivm60, SaPIno10,
SaPIhirosaki4, SaPINN54, SaPIPM1
SaPI-SaPIbov1, SaPImw2, SaPIn1/m1,
SEC1 27,5 Sec
SaPI68111, SaPIj50
SED 26,360 Sed Plasmid-pIB485-like
Enterotoxinas SEE 26,425 See Defective prophage
(SE) Clássicas egc, chromosome—egc1, egc2, egc3,
SEG 27,042 Seg
egc4
Transposon-MGEmw2/seh/Δseo, mssa476
SEH 25,210 Seh
seh/Δseo
SEI 24,298 Sei egc, chromosome—egc1, egc2, egc3
SER 27,049 Ser Plasmid-pIB485-like, pF5, plUH02
SES 26,217 Ses Plasmid-pF5, p047A
SET 22,614 set Plasmid-pF5, p047A
Plasmid-pIB485-like, pF5, plUH02,
SElJ 28,565 selj
pWBG744
Prophage-phiSa3mw, phiSa3ms, SaPI-
SElK 25,539 selk
SaPI1, SaPI3, SaPI5, SaPIj11
SaPI-SaPIm1/n1, SaPImw2, SaPIbov1,
SElL 24,593 sell
SaPI68111, SaPIj50
SElM 24,842 selm egc, chromosome—egc1, egc2, egc3
egc, chromosome—egc1, egc2, egc3,
Toxinas SelN 26,067 seln
egc4
semelhantes Transposon-MGEmw2/seh/Δseo, mssa476
às SE SelO 26,777 selo seh/Δseo; egc, chromosome—egc1, egc2,
egc3, egc4
SelP 27 selp Prophage-phiN315, phiMu3A
SaPI-SaPI1, SaPI3, SaPI5, SaPIj11;
SelQ 25,207 selq
prophage-phiSa3mw, phiSa3ms
SelU 27,1 selu egc, chromosome—egc2, egc3
SelW 27,1 sew egc, chromosome—egc4
SelV 27,1 selv egc, chromosome—egc4
SelX 19,343 slex egc, chromosome
Fonte: Adaptado de Alibayov et al. (2014a).

1.4.2 Leucocidina de Panton-Valentine

A Leucocidina de Panton Valentine (Panton-Valentine Leukocidin - PVL) é

um tipo de toxina capaz de formar poros nas membranas das células eucarióticas

11
que levam à destruição de leucócitos e morte tecidual, o que torna essa toxina um
fator de virulência de valiosa importância. A PVL tem como alvo leucócitos
polimorfonucleares (PMNs) e demais leucócitos fagócitos, que constituem a linha
primária de defesa contra infecções por bactérias (Brizuela et al. 2016; Löffler et al.
2010).
A presença da toxina PVL em S. aureus está relacionada com infecções
primárias de pele e pneumonia do tipo necrotizante em jovens, frequentemente em
pacientes imunocompetentes. Estudos recentes mostraram PVL associada às cepas
de S. aureus resistentes à meticilina (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus –
MRSA), uma variante de resistência da bactéria, muito importante em ambiente
hospitalar. Porém, tanto cepas sensíveis a antibióticos quanto cepas MRSA podem
ser produtoras de PVL, sendo que esta possui relação com a ocorrência de
infecções invasivas. Os dados existentes demonstram que cepas sensíveis a
antimicrobianos têm carreado o gene para PVL numa prevalência de 0 a 15%, sendo
que esse gene se encontram mais presentes nas cepas patogênicasdo que entre
cepas colonizadoras (Mimica et al. 2011; Pires et al. 2014; Hanratty et al. 2015).
Recentemente a toxina teve associações com isolados de CA-MRSA
(Community-Associated Methicillin-Resistant S. aureus), cepas de origem
comunitária. É provável que essas cepas possuam esse fator de virulência por
carrear o loci para PVL mais frequentemente. Isso pode explicar porque em geral, as
cepas CA-MRSA são mais virulentas que as HA-MRSA (Hospital-Associated
Methicillin-Resistant S. aureus), associadas àIRAS (Maeda et al. 2012; Kono et al.
2013; Brizuela et al. 2016).
O efeito tóxico da PVL se relaciona com a ação sinérgica das seguintes
proteínas, a lukF-PV e lukS-PV. Essas proteínas são codificadas por dois genes
contíguos e co-transcritos (lukF-PV e lukS-PV), os quais podem ser transmitidos
entre cepas por meio de fagos lisogênicos. O bacteriófago ՓSLT pode converter
cepas PVL- em PVL+ (Vandenesch et al. 2012).
Nos EUA e Japão S. aureus é endêmico, tendo sido estudado nos últimos
anos a relação entre a toxina PVL e as cepas MRSA. No Brasil a PVL tem sido
encontrada de forma inconsistente entre cepas MRSA e MSSA (Methicillin-
Susceptible S. aureus), associadas a IRAS ou a infecções de origem comunitária
(Lamaro-Cardoso et al. 2009; Brust et al 2013; Bonesso et al. 2014; Yamaguchi et al.
2015).

12
1.4.3 Hemolisinas

S. aureus é produtor de duas importantes hemolisinas que possuem papéis

fundamentais na patogênese do micro-organismo, a α e β toxinas. A α-hemolisina
(HLA) é formadora de poros e possui ampla especificidade celular, capaz de
promover lise em células nucleadas e eritrócitos. Já a β-hemolisina (HLB) é uma
esfingomielinase dependente de Mg² que degrada a esfingomielina encontrada na
membrana celular de leucócitos, neurônios, eritrócitos, levando à lise (Berube &
Wardenburg 2013; Otto 2015).
A HLA é secretada como um monômero solúvel capaz de se ligar à
membrana da célula do hospedeiro se transformando em um heptâmero. Essa
estrutura cria um poro na membrana permitindo o efluxo de K +e outras pequenas
moléculas e o influxo de Na+, Ca2+e moléculas com pequeno peso molecular. A
citólise não é a única consequência da ação da HLA. Existe um grande número de
respostas celulares à intoxicação sublítica, como alteração na sinalização celular,
resposta inflamatória, secreção de citocinas e interação entre células (Berube &
Wardenburg 2013; Otto 2015).
A HLB de S. aureus édependente de Mg2+ que degrada a esfingomielina
presente na membrana celular de eritrócitos, leucócitos, neurônios e outras células
teciduais, causando ruptura. Estudos têm observado que o HLB está presente em 13
a 11% das cepas isoladas de septicemia e de portadores nasais, respectivamente
(Vandenesch et al. 2012).
A expressão dessas toxinas é regulada pelo sistema agr sendo dependente
de vários fatores ambientais, como concentração de gás carbônico, temperatura e
osmolaridade. Os genes que codificam as hemolisinas podem ser encontrados na
maior parte dos isolados de S. aureus, podendo ser expressos ou não (Berube &
Wardenburg 2013).

1.5 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS

A resistência microbiana refere-se a cepas de micro-organismos que tem a

capacidade de se multiplicar mesmo na presença de concentrações mais altas de
antimicrobiano. Esta resistência tem aumentado de forma rápida nos últimos anos no

13
Brasil e no mundo, gerando uma necessidade cada vez mais crescente do
conhecimento do perfil de sensibilidade e caracterização molecular das bactérias
que com maior frequência causam infecção (Kobayashi et al. 2009; Nikolaidis et al.
2014).
Varias espécies possuem resistência antimicrobiana amplamente difundida
em todo o mundo, como é o caso de S. aureus, enquanto outras até o presente
momento mantêm ainda sua sensibilidade aos fármacos ativas. Já os micro-
organismos epidêmicos multirresistentes são de grave notabilidade por carrearem
diferentes genes de resistência (S. pneumoniae, S. aureus, K. pneumoniae), todavia,
permanece ainda incerto porque algumas linhagens bacterianas alcançam a
disseminação epidêmica enquanto outras igualmente resistentes não (Chambers &
DeLeo 2009).
O advento de cepas resistentes é um fator preocupante, pelo fato de diminuir
as opções de tratamento clínico em casos de infecção bacteriana. Neste caso
existem poucas opções terapêuticas disponíveis na farmacopéia, e a expectativa em
relação à descoberta de novos antimicrobianos, com princípio ativo eficiente, não
são satisfatórias (Lindsay & Holden 2005; Sader et al. 2016).
A utilização excessiva e indevida de antimicrobianos é mundialmente
frequente, entretanto, é particularmente maior em países em desenvolvimento, que
possuem em comum, tornando essa prática uma das responsáveis pela emergência
de resistência bacteriana. Recursos limitados para a aquisição de antimicrobianos,
higiene precária e procedimentos de prevenção e controle de infecções pouco
eficientes nas instituições de saúde, também contribuem efetivamente para a
emergência e manutenção de cepas resistentes (Chua et al. 2011; Rossi 2011;
Sader et al. 2016).

1.5.1 Evolução temporal da resistência aos antimicrobianos

Pacientes infectados por S. aureus apresentavam uma mortalidade com

taxas de 80%, na era pré-antibiótica, com 70% destes pacientes desenvolvendo
infecções disseminadas. A resistência à penicilina na terapêutica clínica por cepas
de S. aureus foi encontrada logo após o início de seu uso na década de 40.Essa
resistência era mediada pela aquisição de genes codificadores de enzimas, como

14
penicilinases, e agora denominadas β-lactamases,enzimas que possuem a
capacidade de hidrolisar o anel β-lactâmico, inativando o antimicrobiano usado no
tratamento de infecções.Estas β-lactamases são codificadas por genes presentes
em plasmídeos, podendo ser transferidos para bactérias sensíveis disseminando a
resistência dentro da comunidade bacteriana (Holden et al. 2004; de Lencastre et al.
2007; Nikolaidis et al. 2014; Sader et al. 2016).
A incidência de resistência à penicilina aumentou de forma considerável
após a segunda guerra mundial devido ao uso intenso deste medicamento entre os
soldados feridos. Em função desta resistência, a mortalidade causada pelo micro-
organismo aumentou para 50% em 1954 e na mesma época a produção de
penicilinases pela bactéria passou a predominar nas cepas isoladas de pacientes
hospitalizados (Brumfitt & Hamilton-Miller 1989; Nikolaidis et al. 2014).
Em 1960, a meticilina foi lançada no mercado como alternativa terapêutica
para cepas produtoras de penicilinase, uma vez que essa droga não sofre ação
dessa enzima. Porém, já em 1961, relatos de cepas também resistentes à meticilina
passaram a ser descritos e foram identificados os denominados Staphylococcus
aureus resistentes à meticilina (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus –
MRSA) (Deurenberg et al. 2007; Rossi 2011).

1.5.2 Staphylococcus aureus resistente à meticilina - MRSA

O MRSA representa grave ameaça à saúde pública em todo o mundo,

graças à rápida propagação e diversificação de clones pandêmicos com virulência e
resistência antimicrobianas cada vez maiores. Nestes casos, o tratamento de
infecções causadas por MRSA fica limitado à administração de outras substâncias
como vancomicina, daptomicina, linezolida e tigeciclina, as quais geralmente
apresentam custo mais elevado e/ou maior toxicidade (Guzmán-Blanco et al. 2009;
Gould et al. 2011; Rahimi et al. 2016).
Recentes estudos demonstram índices de mortalidade significativamente
mais altos em pacientes que desenvolvem bacteremia por MRSA, do que por MSSA.
Os índices de mortalidade chegam a ser 2,5 vezes maiores nos casos de infecções
por MRSA (21,0%) do que por MSSA (8,0%) (Liu et al. 2008; D’Agata et al. 2009).
Dados do National Nosocomical Infections Surveillance (NNIS), do Centers
for Disease Control and Prevention (CDC), nos Estados Unidos da América (EUA),

15
mostraram que, desde 1999, a proporção de MRSA ultrapassa 50% entre os
pacientes em UTI. No Brasil, estes índices são também bastante elevados (40% a
80%). Nos hospitais brasileiros o chamado clone endêmico brasileiro (BEC- Brazilian
Endemic Clone) tem sido bastante disseminado, sendo relatado também em outros
países da Europa e América do Sul (Senna et al. 2003; Chambers & DeLeo 2009).
O mecanismo de resistência à meticilina (oxacilina) possui três vias distintas,
sendo que esses mecanismos podem estar presentes numa mesma amostra e
interagirem entre si, sendo eles: a hiperprodução de beta-lactamases; modificação
na capacidade de ligação das PBPs (Penicillin Binding Proteins), proteínas de
membrana envolvidas na biossíntese da parede celular bacteriana, que podem
apresentar as alterações chamadas PBP 2a ou PBP2’ (Souza et al. 2005;
Deurenberg et al. 2007; Boundy et al. 2013).
A resistência envolve a aquisição do gene denominado mecA, que codifica
uma proteína ligadora de penicilina adicional, anômala, de 78 KDa chamada PBP 2a,
sendo este o principal mecanismo de resistência à meticilina em estafilococos. O
gene mecA é responsável pela resistência cruzada dos estafilococos a todos os
antibióticos beta-lactâmicos incluindo a meticilina (Gelatti et al. 2009; Deurenberg et
al. 2007; Rahimi et al. 2016).
O complexo SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec) que está
integrado ao cromossomo de S. aureus, é um tipo de cassete cromossômico, sendo
o único vetor encontrado para o gene mecA. A classificação de SCCmec existe de
acordo com a classe do complexo mec e a combinação do tipo de cassete
chromosome recombinase (ccr), responsável pela mobilidade do elemento. Estudos
têm sugerido que Staphylococcus aureus suscetíveis à meticilina se transformaram
em cepas MRSA por adquirirem o SCCmec, elemento genético responsável pela
integração do fenótipo de resistência aos beta-lactâmicos. Até o presente momento
já foram descritos 11 tipos de SCCmec, entre os quais 8 tipos são os mais
prevalentes e citados como mostra o quadro 2 (Lamaro-Cardoso 2009; Boundy et al.
2013).
De acordo com a disposição genética dos elementos situados próximos ao
gene mecA (sequências de inserção, mecRI, mecI) são feitas definições a respeito
do complexo do gene mec. Nesse micro-organismo são classificadas as classes: A,
B e a classe C possuindo dois complexos mec diferentes, o C1 e C2 (Katayama et
al. 2001; Ito et al. 2001).

16
Quadro 2. Tipos de SCCmec identificados com maior frequência em cepas de S.
aureus
Tipo do SCCmec Complexo do gene ccr Complexo do gene mec
I 1(ccrA1B1) B
II 2(ccrA2B2) A
III 3(ccrA3B3) A
IV 2(ccrA2B2) B
V 5(ccrC1) C2
VI 4 (ccrA4B4) B
VII 5(ccrC1) C1
VIII 4 (ccrA4B4) A
Fonte: International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements
(IWG-SCC 2009).

Os isolados de MRSA associados a hospitais recebem o nome de HA-MRSA

(Hospital or Healthcare Associated MRSA), sendo responsáveis pelo aumento da
morbimortalidade dos pacientes e aumentando os custos com a assistência à saúde
devido à hospitalização; ou associados a ambientes comunitários, os CA-MRSA
(Community-Associated MRSA) causando no ambiente global um grave problema de
saúde pública (David & Daum 2010; Mediavilla et al. 2012).
Cepas HA-MRSA e CA-MRSA possuem diferenças genotípicas. HA-MRSA
em geral carreiam SCCmec maiores e dos tipos I, II ou III, são geralmente
multirresistentes e raramente carreiam o gene para PVL. Já as cepas CA-MRSA
carreiam SCCmec menores, geralmente dos tipos IV e V (David & Daum 2010; Otter
& French 2011).
Estudos com cepas HA-MRSA com SCCmec tipo II têm demostrado que são
prevalentes em manifestações de infecções do trato respiratório, já o SCCmec tipo
III esta associado a pacientes com fibrose cística, onde até 49% dos pacientes
acometidos com esse processo patológico, tem a infecção estafilocócica carreando
esse SCCmec (Gelatti et al. 2009; Reiter et al. 2010).
As IRAS por HA-MRSA influenciam significativamente o período de
hospitalização, os índices de morbimortalidade que repercute nos custos da
internação, o consumo de antibióticos, os gastos com isolamento e os exames
laboratoriais. Estudos relatam também que a colonização por MRSA é mais

17
frequente em pessoas em constante contato com ambientes hospitalares do que
dentro da comunidade (Ribeiro et al. 2005; Carvalho et al. 2010; Sakai et al. 2016).
Os isolados de CA-MRSA têm sido responsáveis pelo aumento de casos
observados nos últimos anos, tendo a capacidade de rápida disseminação entre a
população em geral, acometendo pacientes com ou sem exposição prévia a
ambientes hospitalares. A rapidez com que essas cepas se disseminam tem sido um
importante agravante. Esse patógeno tem sido relatado em várias regiões, como
Estados Unidos, Canadá, Ásia, América do Sul, Europa e também em países que
costumavam ter baixa prevalência de cepas MRSA como Países Baixos, Finlândia e
Dinamarca (Chambers & DeLeo 2009; David & Daum 2010).
As infecções por CA-MRSA podem acometer pacientes saudáveis e mais
jovens, se associando com infecções de tecidos moles e síndromes clínicas severas.
Em geral, os processos patológicos causados por CA-MRSA são mais graves do que
aqueles provocados por cepas HA-MRSA, indicando uma maior virulência dessas
cepas comunitárias (Chambers & DeLeo 2009; Otter & French 2011).
O clone USA300 é um clone de CA-MRSA mais comumente isolado nos
Estados Unidos, tendo se espalhado pelo mundo sendo identificado no Japão,
países da Europa, Austrália e América do Sul, e um importante causador de
infecções de pele e tecidos moles (Skin and Soft Tissue Infections – SSTI) (Johnson
et al. 2007; Liu et al. 2008; David & Daum 2010).
No Brasil relatos de casos de infecções por CA-MRSA já foram descritos.Os
primeiros relatos foram no ano de 2004, em infecções relacionadas a tecidos moles
em pacientes que não tiveram exposição prévia a fatores de riscos associados ao
HA-MRSA. As cepas isoladas possuíam genes para PVL, SCCmec tipo IV,
enterotoxinas e hemolisina (Gelatti et al. 2009).
Em estudos realizados no município de Goiânia sobre a colonização de S.
aureus, foram descritos apenas 1,2 % de portadores MRSA entre as crianças
atendidas em creches, quando foi descrito pela primeira vez no Brasil uma cepa
MRSA portadora do SCCmec tipo V (Lamaro-Cardoso et al. 2009).
Atualmente, novas opções terapêuticas que apresentam alta afinidade pelas
proteínas anômalas (PBP2a) foram desenvolvidas a fim de superar este tipo de
resistência. Classificados como cefalosporinas de 5ª geração, os antimicrobianos
ceftarolina e ceftobiprole, apresentam atividade anti-MRSA e esta é a principal

18
característica que os diferencia da geração anterior (File et al. 2012; Sader et al.
2016).

1.5.3 Staphylococcus aureus e resistência a glicopeptídeos

A vancomicina é o antimicrobiano de primeira escolha para o tratamento de

infecções por MRSA, bem como para infecções graves por cocos Gram-positivos,
em pacientes hospitalizados, agindo por inibição da síntese da parede celular
bacteriana. Entretanto, o primeiro isolado clínico de S. aureus com sensibilidade
diminuída aos glicopeptídeos foi descrito no Japão, em 1996 (Hiramatsu et al.1997).
Assim como, Basseti et al. (2013) descreveram também no Japão, outras cepas de
S. aureus com susceptibilidade reduzida à vancomicina (Vancomycin-Intermediate
Staphylococcus aureus - VISA). Após esta notificação, este fenótipo foi relatado
também em outros locais, como Estados Unidos, Austrália, França, Coréia do Sul,
Israel, África do Sul, entre outros países, inclusive o Brasil (Askari et al. 2013;
Bassetti et al. 2013; Sakai et al. 2016).
De acordo com o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) cepas de
S. aureus submetidas ao teste fenotípico para determinar a concentração inibitória
mínima (CIM), que forem resistentes a concentrações de 4-8 µg/mL de vancomicina
são consideradas cepas VISA e aquelas resistentes a concentrações iguais ou
superiores a 8µg/mL, são cepas resistentes (Vancomycin Resistant Staphylococcus
aureus – VRSA) (Sakai et al. 2016).
A resistência plena do S. aureus ao glicopeptídeo foi descrita pela primeira
vez nos Estados Unidos (2002) pelo Centers for Disease Control and Prevention
(CDC), sendo que até o momento foram notificados 33 isolados, sendo 16 isolados
provenientes da Índia, 13 dos Estados Unidos e os demais isolados relatados no Irã
e Paquistão (CDC 2003; Askari 2013; Bassetti et al. 2013). No Brasil Rossi (2011),
encontraram um isolado contendo o gene vanA, em linhagem comunitária.
A resistência completa à vancomicina está relacionada à aquisição de um
plasmídeo contendo o gene vanA, proveniente do Enterococcus faecalis. Para atuar
na célula bacteriana, os glicopeptídeos precisam se ligar ao terminal D-alanil-D-
alanina da molécula de peptideoglicano. O mecanismo de resistência resulta na
substituição do peptídeo final do terminal D-alanil-D-alanina para D-alanil-D-lactato,

19
cuja afinidade reduzida à vancomicina não resulta em prejuízos para a síntese da
parede celular bacteriana (Chang et al.2015).
Os estafilococos resistentes aos glicopeptídeos têm como alternativas
terapêuticas as estreptograminas (quinuspristina/dalfopristina) e as oxazolidinonas
(linezolida). Novos fármacos encontram-se em teste, incluindo substâncias das
classes das quinolonas e everninomicinas, possíveis novas opções para o
tratamento clínico nessas circunstâncias (Fitzgerald et al. 2011).

1.5.4 Fenótipo de resistência MLSb em Staphylococcus aureus

No tratamento clínico de infecções estafilocócicas, os antibióticos beta-

lactâmicos são os principais tipos de medicamentos utilizados. As alternativas
terapêuticas usadas em caso de infecção por cepas resistentes aos antibióticos de
primeira escolha são, por exemplo, os macrolídeos, lincosamidas e estreptograminas
do tipo B, que juntos são denominados de MLSb, apresentando mecanismo de ação
similar, que consiste na inibição da síntese proteica do micro-organismo (Adaleti et
al. 2010; Coutinho et al. 2010; Seifi et al. 2012).
Dentre as opções de lincosaminas (lincomicina e clindamicina) a
clindamicina é a droga de escolha para o tratamento de infecções estafilocócicas
resistentes à eritromicina, devido às suas propriedades farmacocinéticas, além de
representar uma alternativa para pacientes alérgicos à penicilina (Ylmaz et al. 2007;
Amorim et al. 2009; Majhi et al. 2016).
A eritromicina foi o primeiro medicamento da classe dos macrolídeos
introduzido na clínica, sendo observadas cepas resistentes, por volta de 1953, após
o primeiro ano do início de seu uso, na Europa, Japão e EUA (Coutinho et al. 2010).
As estreptograminas são formadas pela estreptogramina tipo A
(pristinamicina) e tipo B (dalfopristina e quinuspristina combinadas), que atuam
sinergicamente na inibição da síntese proteica bacteriana, representando uma opção
terapêutica para cepas de MRSA (Souza et al. 2009).
O mecanismo de ação dos antimicrobianos das classes dos macrolídeos,
lincosaminas e estreptograminas do tipo b é similar, atuando em geral, na inibição da
síntese proteica do micro-organismo por ligação ao receptor 23S do rRNA integrante
da subunidade 50S do ribossomo bacteriano. A expressão do fenótipo de resistência
ao grupo MLSb pode ser induzível (iMLSb) ou constitutiva (cMLSb). No tipo induzível

20
ocorre a transcrição do mRNA inativo na presença de um indutor e após ativado há
produção de metilases. Os genes erm (ermA, ermB, ermC – erythromycin ribosome
methylase) codificam metilases que irão conferir resistência aos MLSb pela
metilação do resíduo A2058, localizado no domínio V conservado do RNA
ribossomal 23S o que leva à redução da ligação do agente antimicrobiano ao
ribossomo. Já na resistência constitutiva não há necessidade da presença de um
indutor para que o mRNA relativo à metilase seja ativado, sendo nesse caso os
isolados resistentes à todas as lincosaminas, macrolídeos e estreptograminas tipo B.
Somente os macrolídeos que possuem 14 e 15 átomos atuam como indutores
efetivos na síntese das metilases, como é o caso da eritromicina (Majihi et al. 2016).
O fenótipo de resistência MLSb pode ser identificado pelo teste D realizado
concomitantemente ao antibiograma pelo método de disco-difusão, onde um disco
de eritromicinaé posicionado a uma distância de 15 mm centro a centro de um disco
de clindamicina na placa de antibiograma. A resistência induzível é determinada pela
deformação do halo de inibição da clindamicina que fica com o formato da letra D
(Seifi et al. 2012; Hatkar et al. 2014, CLSI 2016; Majhi et al. 2016).

1.6 EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DE Staphylococcus aureus

Clones de S. aureus multirresistentes se encontram em ampla disseminação

e nesse contexto, técnicas de biologia molecular (genotipagem) têm sido utilizadas
como ferramentas importantes relacionadas à epidemiologia molecular permitindo a
diferenciação de isolados com fenótipos idênticos. Os resultados fornecem
informações úteis para a compreensão da distribuição mundial dos clones, através
dos perfis genômicos gerados, permitindo relacionar ou não isolados de diferentes
fontes (infecções cruzadas), além do estudo a respeito dos mecanismos de
resistência existentes nos diversos clones (Rahimi et al. 2016, Sakai et al. 2016).
Dentre os métodos de escolha para se realizar a tipagem da maioria dos
isolados microbianos, a eletroforese em campo elétrico pulsado (Pulsed Field Gel
Electrophoresis - PFGE) é considerada a técnica padrão ouro por proporcionar boa
reprodutibilidade, alto poder discriminatório e um perfil de DNA cromossômico bem
definido. A técnica consiste de uma alteração da eletroforese convencional, com
campo elétrico variável, favorecendo a resolução de moléculas de DNA com elevado

21
peso molecular, sendo descrita pela primeira vez em 1984 por Schwartz & Cantor
(Rahimi et al. 2016).
A utilização do PFGE possibilita uma análise de macrorrestrição, resultante
do emprego de enzimas que reconhecem sequências de 6 a 8 bases
(raras/infrequentes), resultando em 5 a 20 fragmentos, com peso molecular que
varia de aproximadamente 10 a 800 kb. O perfil de restrição é relativamente simples,
por ser constituído por poucas bandas, facilitando a análise e comparação das cepas
(Sakai et al. 2016).
No Brasil, a técnica de PFGE foi usada pela primeira vez para tipagem de
estafilococos por Teixeira et al. (1995). Caracterizaram-se 85 MRSA isolados em
cinco hospitais de quatro regiões geográficas distintas (São Paulo, Rio de Janeiro,
Rio Grande do Sul e Amazonas). Todos os 85 isolados mostraram um fenótipo
comum de resistência à meticilina com mais de 70,0% das cepas multiresistentes e
66 (77,0%) cepas foram caracterizadas pelo perfil A e seus subtipos. Foi observada
a existência de um clone multirresistente amplamente distribuído no norte, sudeste e
sul brasileiro. Posteriormente, um total de cinco linhagens principais de cepas MRSA
foram descritas (Oliveira et al.2002). Pela habilidade em causar infecções, persistir e
disseminar por regiões geográficas distintas, inclusive entre continentes; estas
linhagens foram denominadas de clones epidêmicos. Através de técnicas
moleculares, estes clones foram classificados como Brasileiro, Ibérico, Húngaro,
Nova Iorque/Japão e Pediátrico epidêmico (Oliveira et al. 2002; Rahimi et al. 2016).
Nas pesquisas de S. aureus e demais micro-organismos patogênicos
oriundos de centros hospitalares e principalmente aqueles isolados de UTIs, a
análise molecular através do PFGE é um excelente aporte técnico para avaliar a
transmissão horizontal em infecções nosocomiais, estabelecer rotas de
disseminação nacional einternacional de cepas resistentes, no controle e vigilância
destas infecções, assim como, na avaliação de efetivas intervenções durante surtos
de infecções por cepas MRSA (Sakai et al. 2016).

22
2 JUSTIFICATIVA

Staphylococcus aureus é um patógeno frequentemente resistente a

antimicrobianos, mais isolado em hospitais no mundo todo, tornando-se um
problema de saúde pública. Sua importância está relacionada à virulência,
resistência aos antimicrobianos e associação a várias doenças, incluindo
enfermidades sistêmicas potencialmente fatais, infecções cutâneas, infecções
oportunistas e intoxicação alimentar (Rosenthal et al. 2014, Sievert et al. 2013).
O sucesso terapêutico contra infecções por S. aureus está sendo
prejudicado cada dia mais pela multirresistência que esta bactéria apresenta, pela
sua capacidade de disseminação nos serviços de saúde e na comunidade. A alta
prevalência e ampla disseminação de cepas MRSA multirresistentes em hospitais
brasileiros é uma grande preocupação no que se refere à segurança dos pacientes.
Variações importantes na prevalência de MRSA, de 1 a 61%, têm sido evidenciadas
por vários pesquisadores, em vários países do mundo (Rosenthal et al. 2014; Sader
et al. 2013; Sievert et al. 2013).
Entre os antimicrobianos para os quais S. aureus apresentam resistência
destacam-se os betalactâmicos (MRSA) e glicopeptídeos (VISA e hVISA-S. aureus
com resistência intermediária heterogênea à vancomicina). A epidemiologia do
MRSA está em constante transformação e tanto os clones circulantes como seus
perfis de resistência a antibióticos variam consideravelmente de acordo com o país e
a região onde são identificados (Guzmán-Blanco et al. 2009; Rodríguez-Noriega &
Seas 2010; Howden et al. 2010; Sader et al. 2013).
O estudo do perfil de suscetibilidade antimicrobiana, epidemiologia e
disseminação clonal de S. aureus realizado em diversas partes do mundo tem
demonstrado resultados diversos entre as diferentes regiões geográficas e entre as
cepas isoladas de comunidades ou hospitalares o que pode levar a medidas de
precaução específicas para cada realidade.
A elevada prevalência de S. aureus em ambientes hospitalares, o aumento
da frequência de cepas isoladas de pacientes hospitalizados (estas resistentes a
diferentes antimicrobianos), o aumento da incidência de infecção por MRSA e que o
conhecimento da susceptibilidade aos antimicrobianos podem fornecer informações

23
importantes para a implementação de terapia adequada e adoção de medidas de
controle. Diante disso, torna-se necessário conhecer a realidade do perfil de
sensibilidade antimicrobiana das cepas de S. aureus que colonizam tanto os
pacientes hospitalizados em UTIs, quanto o próprio ambiente de UTI. Estes dados
poderão ainda caracterizar a epidemiologia relacionada à colonização e
disseminação de S. aureus, proporcionando uma comparação com dados nacionais
e internacionais, visto que, medidas de prevenção e controle destas infecções são
baseadas nestes indicadores.

24
3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Estimar a prevalência de colonização e o perfil de virulência de

Staphylococcus aureus isolados de amostras obtidas de ambiente e de pacientes
hospitalizados em uma UTI de um hospital-escola de Goiânia, Goiás.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Isolar e identificar S. aureus em amostras coletadas dos pacientes internados

e do ambiente de UTI;

 Determinar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos dos S. aureus

identificados;

 Caracterizar geneticamente as cepas encontradas quanto aos fatores de

virulência e resistência;

 Avaliar o relacionamento genético das cepas circulantes no ambiente de UTI

de um hospital-escola de Goiânia, Goiás.

25
4 MÉTODOS

4.1 AMOSTRAGEM

Este estudo foi realizado a partir da coleta de amostras em um hospital-

escola do município de Goiânia, Goiás, que oferece assistência terciária à população
de Goiânia e região, com 12.000 internações/ano e cerca de 300 leitos.
As coletas ocorreram em dois momentos, a primeira no período
compreendido entre dezembro de 2012 a junho de 2013 e a segunda coleta de abril
a junho de 2014. As amostras foram obtidas de diferentes pacientes internados na
UTI Médica do hospital (swabs nasais e retais) e de fômites desse ambiente
hospitalar específico, totalizando 526 amostras.
A UTI Médica é constituída por seis leitos. A equipe assistencial é composta
por médicos plantonistas, médicos residentes, fisioterapeutas, enfermeiros e
técnicos de enfermagem. Os atendimentos mensais são pagos pelo Sistema Único
de Saúde. O protocolo do referido estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética
Regional do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás (processo
nº006/2010). O termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), por escrito, foi
obtido de cada participante.

4.2 COLETAS DAS AMOSTRAS

Após a obtenção do consentimento do paciente ou responsável, swabs

nasais foram obtidos semanalmente de cada paciente seguindo orientações da
Organização Mundial de Saúde. A primeira coleta foi realizada até 48 horas após a
admissão na UTI Médica. As coletas subsequentes foram realizadas de sete em sete
dias até a alta ou óbito do paciente. Os swabs de ambiente, incluindo, bandeja,
suporte de soluções, grade da cama de cada leito, maçanetas, cubas das pias,
torneiras e ralos foram coletados a cada semana. Os swabs foram coletados por
enfermeiras treinadas, em seguida acondicionados em tubos contendo 2 mL de
caldo BHI (Brain Heart Infusion – caldo infusão de cérebro e coração) e

26
encaminhados ao Laboratório de Bacteriologia Aplicada (LABAP) do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da UFG (IPTSP/UFG), para processamento
imediato.

4.3 PROCEDIMENTOS MICROBIOLÓGICOS

Foram realizados no laboratório do LABAP/IPTSP/UFG procedimentos

laboratoriais para isolamento e identificação da espécie de interesse, seguindo as
técnicas recomendadas pela (ANVISA, 2014a).

4.3.1 Isolamento e identificação fenotípica de Staphylococcus aureus (Winn Jr.

et al. 2006)

As técnicas de isolamento e identificação fenotípica de S. aureus foram

realizadas segundo Winn Jr. et al. (2006). Após incubação dos swabs obtidos em
caldo BHI por 24 horas a 37ºC, o isolamento foi feito pela semeadura de uma
alíquota do caldo em ágar manitol salgado com posterior incubação a 37ºC por 24-
48 horas. Do ágar manitol salgado foram selecionadas colônias de halo amarelado,
em decorrência da fermentação do manitol e com morfologia sugestiva de
estafilococos (colônias lisas, cremosas, arredondadas, com coloração de branco a
amarelo-alaranjado). Todas essas colônias foram subcultivadas em ágar nutriente e
após crescimento de 24 h foram inoculadas em caldo TSB (Tripticase Soy Broth)
suplementado com 30% de glicerol e estocados a -80ºC para provas adicionais.
Para identificação presuntiva da espécie S. aureus foram realizadas as
provas de catalase e coagulase em tubo (Winn Jr. et al. 2006). Após reconstituição
do plasma de coelho liofilizado e distribuição em tubos de ensaio, colônias
previamente cultivadas em ágar nutriente, foram inoculadas em 0,5 mL de plasma de
coelho e incubadas a 37 °C por 6 a 24 horas. Após esse período foi observada a
formação de coágulo, indicando prova positiva (Figura 2).
Em adição, a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para a
identificação da bactéria.

27
 A

Figura 2. Prova da coagulase utilizando plasma de coelho.

A: prova positivo - ocorre a formação de um coágulo;
B: prova negativo, não há formação de coágulo.

4.3.2 Identificação molecular de S. aureus

4.3.2.1 Extração de DNA

O DNA genômico foi extraído seguindo protocolo estabelecido por Aires-de-
Sousa et al. (2007) com modificações. Quatro a cinco colônias de bactérias foram
suspensas em 50 μL de solução tampão TE 1X (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) e
2 μL de lisostafina (5 mg/mL) foram adicionados à suspensão, que foi incubada em
bloco térmico a 37 °C por 30 minutos. Logo após, para desnaturação, as amostras

28
foram aquecidas em banho-maria a 95 °C por 15 minutos e 150 μL de H2O milliQ
esterilizada foram adicionados à suspensão. Após homogeneização, foi realizada
uma centrifugação de 5 minutos a 13.000 rpm e o sobrenadante foi utilizado como
DNA template para as reações de amplificação.

4.3.2.2 PCR para detecção do gene femA

Todos os isolados que apresentaram morfologia sugestiva (cocos Gram-
positivos, catalase e coagulase positivos) foram submetidos à reação de
amplificação do gene femA para a confirmação da espécie (S. aureus) seguindo
protocolo estabelecido por Mehrotra et al. (2000). A reação foi preparada com
volume final de 50 µL contendo tampão de reação (20 mM Tris-HCl, pH 8,4; 50 mM
KCl; 1,5 mM MgCl2); 100 µM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP); 0,2 µM de
cada oligonicleotídeo iniciador; 2,5 U de Taq DNA polimerase; 20 ƞg do DNA
template. A reação de amplificação foi realizada em termociclador convencional com
a programação: 5 minutos a 94 oC, seguidos de 35 ciclos de 2 minutos a 94 oC, 50
segundos a 57 oC, 1 minuto a 72 oC e uma extensão adicional de 7 minutos a 72 oC.
Foram utilizadas as seguintes sequências de nucleotídeos iniciadores: femA-
R: 5’- AAAAAAGCACATAACAAGC-3’; femA-F: 5’- GATAAAGAAGAAACCAGCAG-
3’para obtenção de um produto de 132 pb.
A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1,5 % em tampão Tris-
Borato-EDTA (TBE) 1 X por 50 minutos a 110 V. O marcador molecular de 50 pb foi
utilizado como padrão de peso molecular, a cepa S. aureus ATCC 25923 como
controle positivo e a mistura da reação sem o DNA bacteriano como controle
negativo. Os géis foram corados com brometo de etídeo (0,5 µg/mL) e visualizados
por transiluminação com luz ultravioleta capturada com o sistema Bio-Rad® (GelDoc
XR).

4.3.3 Teste de suscetibilidade a antimicrobianos

As amostras identificadas como S. aureus pelas provas convencionais foram

subcultivadas em ágar nutriente por 24 horas a 35 – 37ºC e submetidas ao teste de
disco difusão conforme preconizado pelo CLSI (2016). Um inóculo padrão contendo
1,5 x 108 UFC/mL (escala de 0,5 de MacFarland) foi utilizado para a semeadura das
placas de ágar Müeller-Hinton com o auxílio de um swab estéril. Sobre as placas

29
inoculadas foram depositados os seguintes discos de antimicrobianos: eritromicina
(15 µg), clindamicina (2 µg), quinupristina-dalfopristina (15 µg), cefoxitina (30 µg),
penicilina (10 UI), tetraciclina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), sulfametoxazol-
trimetoprim (1,25/23,75 µg) e rifampicina (5 µg).
O teste D foi realizado junto ao teste de disco-difusão para identificação do
fenótipo de resistência conhecido com MLSb, onde o disco de eritromicina foi
posicionado a uma distância de 15 mm da borda do disco de clindamicina e de
quinupristina-dalfopristina, na placa de antibiograma. O tempo de incubação até a
leitura foi de até 24 horas e após esse período observou-se o achatamento ou
deformação do halo de inibição da clindamicina e/ou quinupristina-dalfopristina,
sendo relatado como resistência induzível aos antimicrobianos correlatos (iMLSb).
Quando resistente à eritromicina, clindamicina e quinupristina-dalfopristina sem a
deformação do halo de inibição do crescimento, o isolado apresentou a chamada
resistência constitutiva (cMLSb). Toda a leitura dos halos de inibição foi realizada
segundo os critérios do CLSI (2016).

4.3.4 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

Todas as amostras que apresentaram resistência à cefoxitina pelo teste de

disco-difusão, ou seja, aquelas que apresentarem um halo ≤ 21 mm foram
submetidas ao E-test® (Biomérieux, Solna, Suécia) para a determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) aos antimicrobianos: vancomicina e oxacilina. A
preparação do inóculo foi realizada de acordo com o descrito no item 4.3.3. Sobre as
placas inoculadas foram depositadas fitas plásticas com concentrações crescentes
dos antimicrobianos, as placas incubadas a 37oC e a leitura dos resultados foi feita
após 24 horas de incubação.Todas as amostras que apresentaram CIM ≥ 4 µg/mLà
oxacilina foram consideradas resistentes a este antimicrobiano, e aquelas com
valores de CIM entre 4-8 µg/mL para vancomicina foram consideradas cepas de
susceptibilidade intermediária à vancomicina (VISA), segundo critérios estabelecidos
pelo CLSI (2016).A cepa ATCC de S. aureus 29213 foi utilizada como controle de
qualidade do teste e das fitas de E-test®.

30
4.3.5 PCR para detecção do gene mecA

A detecção do gene mecA por PCR foi realizada como marcador para a
identificação das cepas MRSA em todos os S. aureus resistentes à cefoxitina. O
protocolo estabelecido por Murakami et al. (1991) foi seguido para realização da
tipagem.
Foram utilizados os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: mecA F 5’ -
TCCAGATTACAACTTCACCAGG- 3’; mecA R 5’ - CCACTTCATATCTTGTAACG- 3’,
para obtenção de um produto de 533 pb.
A mistura da reação foi preparada com volume final de 50µL contendo
tampão de reação (20 mM Tris-HCl, pH 8,4; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2); 80 µM de
cada dNTP; 0,25 µM de cada oligonucleotídeo, 1 U de Taq DNA polimerase e 20 ƞg
do DNA template. A reação de amplificação foi realizada em termociclador (Axygen ®)
seguindo o programa: 4 minutos a 94 oC, 30 ciclos de 30 segundos a 94 oC, 30
segundos a 53 oC, 1 minuto a 72 oC e uma extensão adicional de 4 minutos a 72 oC.
A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1,5 % em tampão Tris-
Borato - EDTA (TBE) 1 X por 40 minutos a 120 V. O marcador molecular de 50 pb foi
utilizado como padrão de peso molecular, a cepa USA300 como controle positivo e a
mistura da reação sem o DNA bacteriano como controle negativo. Os géis foram
corados com brometo de etídeo (0,5 µg/mL) e visualizados por transiluminação com
luz ultravioleta capturada com o sistema Bio-Rad® (GelDoc XR).

4.3.6 PCR para detecção do gene lukS-F

O gene lukS-F é codificador do fator de virulência chamado Leucocidina de

Panton-Valentine (PVL). A reação foi realizada em todos os S. aureus identificados.
Os oligonucleotídeos utilizados para a amplificação do gene foram aqueles
sintetizados a partir de sequências de DNA genômico do banco de dados GenBank
(número de acesso GenBank AB006796) (Lina et al. 1999).
As sequências dos oligonucleotídeos iniciadores utilizadas foram: PVL1: 5’ -
ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA - 3’; PVL2: 5’ -
GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC - 3’.
A mistura da reação foi preparada com volume final de 50 µL contendo
tampão de reação (20 mM Tris-HCl, pH 8,4; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2); 80 µM de

31
cada dNTP, 0,25 µM de cada oligonucleotídeo; 1 U de taq DNA polimerase; 20 ƞg do
DNA template. Para amplificar a reação foi usado o termociclador convencional com
o programa: 5 minutos a 94 oC, 25 ciclos de 30 segundos a 94 oC, 30 segundos a 55
oC, 1 minuto a 72 oC e uma extensão adicional de 7 minutos a 72 oC.
A eletroforese foi realizada em gel de agarose a 1,5 % em tampão Tris-
Borato - EDTA (TBE) 1 X por50 minutos a 110 V. O marcador molecular de 50 pb foi
utilizado como padrão de peso molecular, a cepa S. aureus OSPC (Oceania
Southwest Pacific Clone) como controle positivo e a mistura da reação sem o DNA
bacteriano como controle negativo. Os géis foram corados com brometo de etídeo
(0,5 µg/mL) e visualizados por transiluminação com luz ultravioleta capturada com o
sistema Bio-Rad® (GelDoc XR).

4.3.7 Multiplex PCR para detecção de genes codificadores de fatores de

virulência
Os S. aureusisolados foram submetidos à detecção de genes que codificam
fatores de virulência pela técnica de multiplex PCR de acordo com Peacock et al.
(2002), Jarraud et al. (2002) e Holtfreter et al. (2007) com modificações. Foram
realizadas 2 reações sequenciais com as sequências-alvo descritas no quadro 3.

Quadro 3. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a detecção de genes de

virulência em S. aureus
Oligonucleotídeo Tamanho do
Sequência dos oligonucleotídeos 5’3’
iniciador Amplicon (pb)
TSST-F TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT
180
TSST-R TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT
SEA-F GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA
560
Reação I SEA-R CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGGTTC
SEC-F GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG
297
SEC-R CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT
SEE-F CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC
482
SEE-R CACCTTACCGCCAAAGCTG
SEH-F CAATCACATCATATGCGAAAGCAG
376
SEH-R CATCTACCCAAACATTAGCACC
SEB-F ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA
404
SEB-R ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT
SED-F GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG
492
SED-R GCTGTATTTTTCCTCCGCTAAATAATATG
ETA-F ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT
Reação II 190
ETA-R TGGTACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC
ETB-F CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC
612
ETB-R AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC
HLB-F GTGCACTTACTGACAATACTGC
309
HLB-R GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT

32
 A reação de PCR foi realizada em volume final de 25µL com 5µL de tampão
de reação 5 X (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8,0) 100 µM de cada dNTP,
5,0 mM de MgCl2, 150 a 400 mM de cada oligonucleotídeo. 1U de Taq DNA
polimerase, e 10 a 20 ƞg de DNA template. A reação de amplificação foi realizada
em termociclador convencional seguindo o programa: 15 minutos a 95 oC, seguidos
de 35 ciclos de 30 segundos a 95 oC, 30 segundos a 56 oC, 50 segundos a 72 oC e
uma extensão adicional de 10 minutos a 72 oC. Em seguida os produtos de
amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5 % em tampão
Tris-Borato-EDTA 1 X por 90 minutos a 100 V. O marcador de 50 pb foi usado como
padrão de peso molecular.Foram usados os seguintes controles positivos: cepa
USA400 (controle positivo – seh); cepa HW2 (controle positivo – sea, seh e sec);
cepa N315 (controle positivo – tst); cepa 1036BV2 (controle positivo – eta); cepa
QF34 (controle postivo – hlb); coluna QF35 (controle positivo– hlb e seb) e a mistura
da reação sem o DNA bacteriano como controle negativo.O gel foi corado com
brometo de etídeo a 0,5 µg/mL visualizado sob transiluminação com luz ultravioleta e
capturados com o sistema Molecular Imager GelDoc XR (Bio-Rad®).

4.3.8 Multiplex PCR para tipagem do SCCmec

A metodologia de PCR multiplex foi usada para determinação do tipo de

SCCmec existente nas cepas MRSA identificadas. A técnica foi realizada seguindo
protocolo desenvolvido por Oliveira et al. (2002) e Milheiriço et al. (2007), com
modificações. Oito loci (A-H) foram selecionados baseados nas sequências do
elemento mec previamente descritas (Ito et al. 1999, Ito et al. 2001, Oliveira et al.
2002). O locus A está localizado downstream ao gene pls, específico para o
SCCmec tipo I; o locus B é um fragmento interno do gene kdp, o qual é especifico
para o SCCmec tipo II; o locus C é um framento interno do gene mecl presente nos
SCCmec tipo II e tipo III; o locus D é um fragmento interno da região dcs, presente
nos SSCmec tipo I, II e IV; o locus E está localizado na região entre o plasmídeo
pl258 e o transposon Tn554, específico para o SCCmec tipo III; o locus F, que
também é específico para o locus III, está localizado na região entre Tn554 e a
junção cromossômica direita (orfX); os loci G e H foram incluídos para distinguir as
variantes estruturais IA e IIIA, respectivamente; o locus G corresponde a junção
esquerda entre a sequência de inserção IS431 e o plasmídeo Pub110, específico

33
para a variante estrutural IA devido à presença de um fragmento de 381pb (inserção
do pUB110). O locus H corresponde a junção esquerda entre a sequência de
inserção IS431 e o plasmídeo pT181, permite identificar a variante estrutural IIIA
devido a ausência do fragmento de 303 pb neste tipo de elemento.
Para a reação de amplificação foi utilizada uma mistura de reação de 50 µL
contendo tampão de reação II 1X, 200 µM de cada dNTP; 400 nM dos
oligonucleotídeosCIF2, CIF2 R2, MECI P3, RIF5 F10, RIF5 F10, RIF5 F13, pUB110
R1 e pT181 R1; 800 nM dos oligonucleotídeosKDP F1, KDP R1, RIF4 F3, RIF4 R9;
1,25 U de Amplitaq DNA polimerase e 5 ng do DNA template. O desenho de cada
oligonucleotídeo e especificidade estão demonstrados no quadro 4. A reação de
amplificação foi realizada em termociclador com os seguintes parâmetros: 4 minutos
a 94 oC, 30 segundos a 53 oC, 1 minuto a 72 oC e uma extensão adicional de 4
minutos a 72 oC. Até o momento da eletroforese os tubos foram mantidos a 4 oC.

Quadro 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para tipagem do SCCmec

Especificidade Tamanho
Oligonucleotídeo
Sequência do oligonucleotídeo 5’3’ (Tipo de SCCmec, do
iniciador
região) amplicon
CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG
SCCmec tipo I 495
CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC
KDP F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC
SCCmec tipo II 284
KDP R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG
MECI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC SCCmec tipos II e
209
MECI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC III
DCS F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC SCCmec tipos I, II e
342
DCS R1 CTAAATCATAGCCATGACCG IV
RIF5 F10 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG
SCCmec tipo III 414
RIF5 R13 GTCACAGTAATTCCATCAATGC
ccrC F2 GTACTCGTTACAATGTTTGG SCCmec tipo V,
449
ccrC R2 ATAATGGCTTCATGCTTACC complexo ccr
ccrB2 F2 AGTTTCTCAGAATTCGAACG SCCmec tipo II e
311
ccrB2 R2 CCGATATAGAAWGGGTTAGC IV, complexo ccr
SCCmec III J1 F CATTTGTGAAACACAGTACG SCCmec tipo III,
243
SCCmec III J1 R GTTATTGAGACTCCTAAAGC região J1
SCCmec V J1 F TTCTCCATTCTTGTTCATCC SCCmec tipo V,
377
SCCmec V J1 R AGAGACTACTGACTTAAGTGG região J1
MECA P4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG mecA(controle
162
MECA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG interno)

Como controle positivo dos diferentes tipos de SCCmec foram usados as

cepas COL (SCCmec tipo I), PER34 (SCCmec tipo IA), N315 (SCCmec tipo II),
ANS46 (SCCmec tipo III) HU25 (SCCmec tipo IIIA) e MW2 (SCCmec tipo IV). Os
produtos da reação de amplificação foram submetidos a PCR em gel de agarose a
2% em tampão Tris-Borato-EDTA 0,5 X durante duas horas a 100 V. Após o término

34
da eletroforese o DNA foi corado em solução aquosa de brometo de etídio (0,5
µg/mL), visualizado sobre transiluminação ultravioleta e capturados com o sistema
Molecular Imager GelDoc XR (Bio-Rad®). Como padrão de peso molecular, foi
utilizado o marcador de 1 kb.

4.3.9 Eletroforese em gel em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis

- PFGE)

A técnica de PFGE foi utilizada para determinaçãodo perfil de

macrorrestrição do DNA cromossômico dos isolados, segundo Chung et al. (2000),
com modificações. Os isolados de S. aureus foram cultivados em ágar nutriente a 37
oC por 24 horas, e em seguida as células tiveram concentração ajustada pelo cálculo
da OD 620 nm (V add (µL) = OD x 40 x 210 – 210) em tampão Tris-NaCl (Tris 10 mM
pH 8,0, NaCl 1M) utilizando espectrofotômetro.
A suspensão celular ajustada foi homogeneizada com 100 µL de agarose
LMP (Low Melting Point agarose) 1,5 % para formação de pequenos blocos (plugs).
As células bacterianas contidas nos plugs foram lisadas por 5 horas em solução EC
(Tris-HCl, 6 mM pH 8,0; NaCl 1 M; EDTA 100 mM pH 8,0; desoxicolato de sódio 0,2
% e sódio laurilsarcosina 0,5%) acrescida de lisozima (100 µg/mL), lisostafina (50
µg/mL) e RNAse (50 µg/mL). Após esse período, a desproteinização foi realizada em
solução ES (EDTA 0,5 M, pH 9,0 e sódio laurilsarcosina 1 %), com proteinase K (1
mg/mL) por um período mínimo de 17 horas a 50 oC. Após a incubação, os blocos de
agarose foram lavados (cinco lavagens com incubação de 30 minutos cada) com
solução tampão TE 1 X (Tris 10 mM pH 7,5 e EDTA 1 mM pH 8,0) e armazenados
nessa solução a 4 oC até serem submetidos a digestão enzimática e eletroforese.
Para cada cepa isolada, o DNA contido no bloco de agarose foi digerido com
20 U da enzima de restrição Smal e incubados overnight a 25 oC. A eletroforese foi
realizada em gel de agarose 1 % em solução tampão Tris-borato-EDTA 0,5 X (Tris 90
mM, ácido bórico 90 mM e EDTA 2 mM) no sistema CHEF DRII (Bio-Rad®
Laboratories). A técnica de eletroforese foi realizada para resolução dos fragmentos
com corrente alternando em intervalos de pulso de 5 a 35 segundos a 6 V/cm e
temperatura de 14 oC por 21 horas.

35
 Após a eletroforese, os géis foram corados com brometo de etídeo (1 µg/mL)
por uma hora, descorados em H2O/15’ e visualizados sob luz UV em transiluminador
e capturados com o sistema Molecular ImagerGelDoc XR (Bio-Rad®).

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O banco de dados foi construído no programa Microsoft Office Excel®. A

avaliação dos parâmetros microbiológicos foi realizada utilizando o software SPSS
PC versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). A prevalência de colonização e
respectivos intervalos de 95% de confiança (IC 95%) foram calculados. As
diferenças de proporções foram comparadas usando o teste de qui quadrado (X 2) ou
teste exato de Fischer, quando apropriado. Valores de p menores que 0,05 foram
considerados resultados estatisticamente significantes
Cepas multirresistentes foram definidas com aquelas que apresentaram
resistência a pelo menos três classes de antimicrobianos (Magiorakos et al. 2012).
Os géis de PFGE foram utilizados como imagens branco e preto, invertidas
de oito bits e processados pelo programa BioNumerics® versão 5.1. O dendrograma
construído para avaliar a relação genética entre as cepas foi feito utilizando o
coeficiente de similaridade de Dice, baseado na posição e presença das bandas e
no algoritmo de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method)
através de agrupamentos por médias não ponderadas. Os parâmetros de otimização
e tolerância foram utilizados com os respectivos valores, 0,8 e 1,0%. Cada cluster foi
definido como um agrupamento de perfis (n > 2) com 80 % ou mais de coeficiente de
similaridade (Carriço et al. 2005).
.

36
5 RESULTADOS

5.1 PREVALÊNCIA DE COLONIZAÇÃO/CONTAMINAÇÃO POR S. aureus

Foram obtidos 536 swabs provenientes de 134 pacientes e 402 de ambiente

de UTI (tabela 1). A prevalência total de S. aureus foi de 12,7% (68/536) (Figura 3),
sendo 13,4% (18/134) em pacientes e 12,4% (50/402) no ambiente da UTI.

Tabela 1: S. aureus identificados em amostras de pacientes e de ambiente de uma

UTI de um hospital escola de Goiânia-GO.
Amostras Positivas
Amostras coletadas (n*)
n (%)
Paciente (134) 18 (13,4)
Nasal (XX) 18 (100,0)
Retal (XX) 0 (0,0)
Ambiente (n=402) 50 (12,4)
Grade (120) 17 (34,0)
Bandeja (80) 10 (20,0)
Suporte (102) 8 (16,0)
Pia (40) 8 (16,0)
Maçaneta (40) 6 (12,0)
Ralo (20) 1 (2,0)
Total (536) 68 (12,7)
*n= n° de swabs coletados

37
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

132 pb

Figura 3. Detecção do gene femA em amostras de S. aureus de

colonização e ambiente.
Colunas 1, 2, 4, 7, 8, 9- S. aureus, colunas 3, 5 e 6 - amostras femA negativas, coluna
10 - controle positivo ATCC 25923, coluna 11 - controle negativo e coluna 12 -
marcador de peso molecular de 50 pb.

5.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS

O perfil de suscetibilidade antimicrobiana dos 68 isolados de S. aureus

analisados encontra-se na Tabela 1. Os isolados que apresentaram suscetibilidade
intermediária a qualquer antimicrobiano foram classificados como resistentes.
Verifica-se que a maior resistência apresentada foi à penicilina (85,3 %)
seguida da resistência à eritromicina (69,1 %), clindamicina (66,2 %) e à
sulfametoxazol-trimetoprim (54,4 %). Quatro (5,9 %) isolados foram resistentes às
oito classes de antimicrobianos avaliados.

38
 Tabela 2. Suscetibilidade antimicrobiana dos 68 isolados de
S. aureus isolados da UTI de um hospital escola de Goiânia,
GO
Resistência
Antimicrobianos testados
N° %
Penicilina (PEN) 58 85,3
Eritromicina (ERI) 47 69,1
Clindamicina (CLI) 45 66,2
Sulfametoxazol-trimetoprim (SUT) 37 54,4
Quinupristina-dalfopristina (QD) 33 48,5
Tetraciclina (TET) 29 42,7
Ciprofloxacina (CIP) 24 35,3
Rifampicina (RIF) 23 33,8
Cefoxitina (CFO) 17 25,0

5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MINIMA (CIM) E

DETECÇÃO DO GENE mecA

Para as amostras resistentes à cefoxitina (17) foi determinada a

concentração inibitória mínima para a oxacilina e vancomicina pelo Etest ®. Onze
isolados tiveram CIM para a oxacilina ≥ 4 µg/mL (Figura 4), indicando resistência e
sete isolados (10,3 %) testados apresentaram resistência intermediária à
vancomicina, apresentando CIM entre 4 - 8 µg/mL. Um destes isolados, obtido de
paciente, foi resistente a todos os antibióticos testados, com exceção da
cefoxitina/oxacilina.

39
 Figura 4. Determinação da concentração
inibitória mínima para os S. aureus
resistentes à cefoxitina pelo E-test®.
CIM ≥ 256 µg/mL - resistente à oxacilina

Dos 17 isolados resistentes à cefoxitina, 14 (20,6 %) apresentaram o gene

mecA, sendo considerados MRSA (Figura 5). A prevalência de colonização por
MRSA na UTI do hospital escola foi de 2,6% (14/536), em pacientes foi de 5,2 %
(7/134) e de contaminação ambiental, 1,7 % (7/402).

1 2 3 4 5 6 7

533 pb

Figura 5. Detecção do gene mecA em S. aureus

isolados em UTI
Colunas 1, 3 e 4 – amostras positivas; coluna 5- controle
positivo (USA 300); coluna 6- controle negativo e coluna 7-
ladder 50 bp.

Quarenta e sete (69,1%, 47/68) de todos os isolados identificados foram

resistentes à eritromicina sendo 27,7 % (13/47) MRSA. Perfil de suscetibilidade

40
similar (66,1%) foi observado para o antimicrobiano clindamicina (Tabelas 1 e 2). Foi
observado 12 (17,6 %) isolados que apresentaram o fenótipo MLSb constitutivo, ou
seja, foram resistentes à eritromicina, clindamicina e quinupristina-dalfopristina
sendo dois (2,9 %) MRSA e 11 (16,2 %) apresentaram o fenótipo MLSb induzível
(Figura 6) sendo um (1,5 %) MRSA. Acredita-se que haja uma tendência dos MRSA
apresentarem resistência também à eritromicina e mostrar algum fenótipo de
resistência MLSb, apesar de não ter sido encontrado diferença estatisticamente
significante (p= 0,06) entre as cepas MRSA e MSSA, que foram resistentes a esse
antibiótico.

Figura 6: Teste de disco-difusão e teste D para detecção

de fenótipo iMLSb
O isolado resistente à eritromicina (seta verde) possui o fenótipo
iMLSB, assim esse antimicrobiano induz resistência à clindamicina
onde se observa o achatamento do halo de clindamicina (seta
vermelha).

A multirresistência (resistência a três ou mais classes de antibióticos) foi

observada em 56 (82,4%) isolados. Todos os isolados identificados como MRSA
apresentaram multirresistência. Destes, sete (50,0%) foram provenientes de
amostras do ambiente da UTI e sete (50,0%) de pacientes (Tabela 2).

41
5.4 TIPAGEM DO SCCmec

A tipagem do SCCmec foi realizada através de reação única de multiplex

PCR. Todas as cepas MRSA submetidas à detecção tiveram o tipo de SCCmec
definido (Figura 7). Das 14 cepas MRSA, seis (42,9%) foram classificadas como
SCCmec tipo IV, cinco (35,7%) como SCCmec tipo I, duas (14,3%) como SCCmec
tipo II e uma (7,1%) como SCCmec tipo III (Tabela 3).

Tabela 3 - Características dos isolados identificados como MRSA na UTI de

um hospital universitário do município de Goiânia-GO.

Local de
Resistência aos antibióticos** CIM VAN mecA SCCmec
coleta*
S ERI, CLI, QD, TET, PEN, CFO 4 µg/mL + Tipo IV
S ERI, CLI, CIP, TET, SUT, PEN, CFO 0,12 µg/mL + Tipo I
B ERI, CLI, CIP, SUT, PEN, CFO 4 µg/mL + Tipo IV
B ERI, CLI, QD, SUT, PEN, CFO 0,47 µg/mL + Tipo IV
G ERI, CLI, CIP, TET, PEN, CFO 0, 48 µg/mL + Tipo II
G CLI, RIF, PEN, CFO 1 µg/mL + Tipo III
G ERI, CLI, CIP, PEN, CFO 6 µg/mL + Tipo II
P ERI, CLI, CIP, SUT, PEN, CFO 0,38 µg/mL + Tipo IV
P ERI, CLI, CIP, TET, SUT, PEN, CFO 0,12 µg/mL + Tipo I
P ERI, SUT, PEN, CFO 0,75 µg/mL + Tipo IV
P ERI, CLI, RIF, CIP, SUT, PEN, CFO 6 µg/mL + Tipo I
P ERI, CLI, QD, TET, PEN, CFO 6 µg/mL + Tipo I
P ERI, CIP, TET, PEN, CFO 0,38 µg/mL + Tipo IV
P ERI, CLI, RIF, CIP, SUT, PEN, CFO 4 µg/mL + Tipo I
* S- suporte de soluções, B- Bandeja, G- Grade da cama, P- Paciente.
** ERI - Eritromicina), CLI - Clindamicina, QD – Quinupristina/Dalfopristina, RIF - Rifampicina, CIP -
Ciprofloxacina, TET – Tetraciclina, SUT - Sulfametoxazol-trimetoprim, PEN - Penicilina, CFO –
Cefoxitina, VAN - Vancomicina

5.5 DETECÇÃO DO GENE lukS-F (Leucocidina de Panton-Valentine)

Detectou-se a presença do gene lukS-F em 4,4 % (3/68) dos isolados

(Figura 8). Estes isolados foram provenientes de grades da cama do leito de
pacientes. Um dos isolados positivos para o gene da PVL também era MRSA e outro
apresentou o fenótipo iMLSB. Todas as cepas PVL+ foram multirresistentes.

42
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

495 pb
342 pb

162 pb

Figura 7. Multiplex PCR para tipagem de SCCmec em isolados

MRSA.
Colunas 1 a 15 – S. aureus. Colunas 1, 5 ,8, 10 e 11 - SCCmec tipo IV, coluna 4,
9, 13 e 15 - SCCmec tipo I. Coluna 16 e 20 - controles SCCmec tipo I (cepas
COL e PER34), coluna 19 – controle SCCmec tipo II (cepa N315), coluna 17 –
controles SCCmec tipo III (cepa HU25), colunas 18 – controles SCCmec tipo IV
(cepa USA300), coluna 21 – controle negativo e coluna 22 – marcador de peso
molecular 100 pb.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

433 pb

Figura 8. Detecção do gene lukS-F em S. aureus isolados

de UTI.
Coluna 7 - cepa positiva para o gene lukS-F, coluna 14 - controle
positivo (cepa OSPC), coluna 15 - controle negativo e coluna 16 -
marcador de peso molecular de 50 pb.

43
5.6 DETECÇÃO DOS GENES PARA ENTEROTOXINAS, TOXINAS ESFOLIATIVAS,
HEMOLISINAS E TOXINA DA SÍNDROME DO CHOQUE TÓXICO

Através da reação de multiplex PCR para os fatores de virulência, detectou-

se que 12 (17,6 %) isolados de S. aureus apresentaram genes codificadores para
pelo menos um fator de virulência pesquisado (Figuras 9 e 10). Dois isolados (2,9%)
apresentaram genes para mais de um fator de virulência.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

297
pb
180
pb

Figura 9. PCR multiplex para detecção de genes de virulência em S.

aureus isolados de UTI – Reação I
Colunas 1 a 19 – S. aureus; coluna 20 – cepa USA400 (controle positivo – seh); coluna
21 – cepa HW2 (controle positivo – sea, seh e sec); coluna 22 – cepa N315 (controle
positivo – tst); coluna 23 – controle negativo; coluna 24 – marcador de peso molecular. O
amplicon do tst possui 180 pb, do sec 297 pb, seh possui 376 pb e sea possui 560 pb.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

612 pb
309 pb
190pb

Figura 10. PCR multiplex para detecção de genes de virulência em S.

aureus isolados de UTI - Reação II
Colunas 1 a 19 – S. aureus isolados; coluna 20 – 1078BH4 (controle positivo – etb);
coluna 21 – cepa 1063BH3 (controle postivo – hlb); coluna 22- cepa 1079BH4 (controle
positivo– eta); coluna 23 – controle negativo; coluna 24 – marcador de peso molecular 50
pb. O amplicon do eta possui 190 pb, do hlb possui 309 pb, do seb possui 404 pb, e do etb
possui 612 pb.

44
 Os genes relacionados à virulência detectados em maior prevalência foram
os genes tst, hlb e lukS-F, presentes cada um em três (4,4 %) isolados diferentes
Três isolados (4,4 %) foram considerados enterotoxigênicos, sendo o gene seh o
segundo gene mais prevalente, detectado em dois (2,9 %) isolados. Os genes sec,
eta e etb, foram encontrados em apenas um (1,4 %) isolado cada um. Considerando
todos os resultados das reações de PCR para os genes de virulência detectados,
foram encontrados seis perfis de virulência (Quadro 5) em 12 isolados (17,6%). Foi
observado que os isolados VISA apresentaram mais fatores de virulência do que as
cepas sensíveis à vancomicina (p < 0,0001, teste exato de Fisher). Já entre os
isolados MRSA e MSSA não houve diferença significativa quanto à presença de
genes de virulência (p = 0,41).

Quadro 5. Perfis de fatores de virulência encontrados nos S. aureus identificados

em pacientes e ambiente de UTI

Genes de Resistência
Isolados mecA SCCmec CIM VAN
virulência antimicrobiana
Paciente eta, etb - - MDR – 4 classes
Grade da cama sec, hlb - - MDR – 5 classes
Bandeja Tst + IV MDR - 5 classes 4
Paciente Tst + I MDR – 6 classes 6
Maçaneta Tst - - MDR – 3 classes
Suporte de soluções Hlb - - MDR – 4 classes
Grade da cama Hlb - - MDR – 8 classes
Paciente Seh + IV MDR – 4 classes
Paciente Seh - - MDR – 8 classes
Grade da cama luks-f + II MDR – 4 classes 6
Grade da cama luks-f - - MDR – 4 classes
Grade da cama6 luks-f - - PEN

5.7 ELETROFORESE EM GEL EM CAMPO PULSADO (PULSED FIELD GEL

ELECTROPHORESIS – PFGE)

A similaridade genética entre as 68 cepas de S. aureus isoladas foi

determinada pela técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis – PFGE e pode ser
observada no dendrograma (Figura 11).

45
Figura 11. Dendrograma resultante da análise de similaridade genética entre
isolados de S. aureus obtidos de ambiente e pacientes de UTI de hospital-escola de
Goiânia, Goiás. Cl: cluster; ID: identificação da amostra

46
 A análise dos isolados revelou a presença de 15 diferentes clusters
(similaridade ≥ 80 %). Os clusters que agruparam mais isolados foram o cluster C (7
isolados), o cluster L(16 isolados) e o cluster M (5 isolados). Foi observada a
existência de 18 clones (100 % de similaridade) entre os isolados obtidos da UTI do
hospital, sendo que dois deles, presentes nos clusters M e L, agruparam cinco
isolados.
Dentro dos clusters observamos isolados com o mesmo perfil genético
recuperados de diferentes fômites, cepas idênticas isoladas tanto de paciente
quanto de fômites e cepas idênticas isoladas de diferentes pacientes.
Foi observdo que sete clusters agruparam dois isolados (E, F, H, I, J, N, O);
quatro clusters agruparam três isolados (A, D, G, K); o cluster B agrupou quatro
isolados, o cluster M cinco isolados, o cluster C sete isolados e o cluster L, 16
isolados. Este cluster demonstrou a presença de isolados idênticos e altamente
relacionados, obtidos de pacientes e fômites, evidenciando a disseminação e
persistência da bactéria tanto no ambiente de UTI (bandeja, maçaneta, grade da
cama e cuba da pia) quanto a transmissão entre pacientes diferentes.
Não foi observada relação entre similaridade genética e produção de fatores
de virulência, nem com resistência intermediária à vancomicina, estando os isolados
agrupados em clusters diferentes.
Com o objetivo de avaliar a similaridade genética das cepas MRSA com
clones disseminados mundialmente foi feita uma análise com cepas de clones
MRSA conhecidas. Interessantemente, um isolado MRSA apresentou semelhança
genética (80 %) com um importante clone, o USA300 e dois isolados foram
altamente relacionados (92,2 %) com o clone USA400 e houve ainda um isolado
obtido de paciente (P2-L2) com perfil de restrição idêntico a esse clone (Figura 12).
Os isolados MRSA obtidos neste estudo, mostraram-se policlonais, pouco
relacionados entre si, evidenciando a presença endêmica deste fenótipo e a
circulação de várias cepas entre pacientes e fômites no ambiente da UTI avaliada
(Figura 12).

47
Figura 12. Dendrograma resultante da comparação entre isolados MRSA do estudo
e clones MRSA mundiais.
ID – identificação; SCCmec – tipo do SCCmec; VAN – cepas VISA.

48
6 DISCUSSÃO

A capacidade do S. aureus sobreviver em superfícies ambientais por longos

períodos de tempo, associada aos seus diversos fatores de virulência faz dele um
dos patógenos oportunistas mais importantes no ambiente hospitalar, como as UTIs
e outros ambientes comunitários. Devido aos surtos de infecções relatados em todo
mundo e à facilidade dessa bactéria adquirir resistência aos antimicrobianos de
primeira escolha, existe uma grande preocupação em se realizar periodicamente um
monitoramento e vigilância em relação à aquisição de resistência por cepas deS.
aureus (Stepanovic et al. 2008; Sakai et al. 2016).
A prevalência total de colonização/contaminação por S. aureus no presente
estudo foi de 12,7%, englobando amostras coletadas de pacientes e do ambiente de
UTI do hospital. A taxa de contaminação do ambiente da UTI foi de 12,4 %,
evidenciando positivamente o controle de infecção pela limpeza do local, porém
ainda se encontra em um nível distante do que seria satisfatório. A observação de
contaminação nas superfícies de contato com as mãos, analisadas no presente
estudo, atesta o potencial das mãos dos profissionais de saúde como fontes de
disseminação de importantes patógenos como o S. aureus.
Um estudo feito por Ferreira et al. (2011), avaliou superfícies de colchões
tipo caixa de ovo em hospital escola no interior de São Paulo, encontrando taxas de
prevalência de S. aureus e MRSA de 72,2 % e 53,3 %, respectivamente. Outro
estudo de Renner & Carvalho (2013) no Rio Grande do Sul analisou 38 superfícies
de UTI e encontrando prevalência de 37,0 % de S. aureus.Rocha et al. (2013)
obteve prevalência de 7,1 % de contaminação do ambiente da UTI por S. aureus em
Minas Gerais. Essa diferença existente nas taxas de contaminação, encontradas nos
estudos referentes ao ambiente da UTI, tem como uma possível justificativa a falta
de uma metodologia padronizada para a coleta de amostra nesses tipos de
superfícies, o que pode subestimar ou superestimar o resultado da prevalência de S.
aureus e limitar uma comparabilidade mais precisa dos dados da literatura. O fato é
que a contaminação ambiental representa um importante reservatório da bactéria
em UTI e evidencia a necessidade de limpeza constante e eficiente do ambiente
hospitalar (Rocha et al. 2013).

49
 A prevalência de colonização nasal de 13,4 % em pacientes encontrada no
presente estudo foi inferior a outras encontradas no país. Moreira & Gontijo Filho
(2012) encontraram prevalência de 36,4 % de S. aureus em orofaringe de pacientes
adultos internados em UTI de hospital escola em Uberlândia, MG, Brasil. Em outro
estudo no mesmo hospital a prevalência de colonização nasal em pacientes de UTI
por S. aureus encontrada foi de 22,5 % (Rocha et al. 2013). Na Turquia, a taxa de
colonização pela bactéria chegou a 31,7 % (Durmaz et al. 2016).
S. aureus é um patógeno que coloniza com grande facilidade a pele e as
narinas, sendo, portanto, inoculado com grande frequência nessas regiões durante
os procedimentos hospitalares invasivos e veiculados pela equipe de profissionais
da saúde (Moura et al. 2011).A colonização de pacientes por S. aureus pode
aumentar o risco de ocorrência de infecções do trato respiratório superior (Moreira &
Gontijo Filho 2012).
Os níveis de resistência ilustram a extensão dos microrganismos resistentes
que estão circulando dentro dos hospitais, inclusive dentro das UTIs. A consequente
queda na suscetibilidade dos mesmos aos antimicrobianos tem sido bastante
enfatizada na literatura em todo o mundo como um grave problema de saúde
pública, principalmente quando é observado nas unidades de terapia intensiva
(Rosenthal et al. 2014; Sader et al. 2016).
O S. aureus possui grande notabilidade quanto à resistência, atribuída pela
sua rápida capacidade de adaptação à pressão seletiva dos antimicrobianos. Os
isolados encontrados no presente estudo demonstraram alto nível de resistência
antimicrobiana, já que, das 68 cepas identificadas como S. aureus 56 (82,4 %)
apresentaram multirresistência, entre elas, 14 isolados (20,6 %) com padrão MRSA
e quatro isolados (5,9 %) apresentaram resistência a todas as classes de
antimicrobianos avaliados. A alta prevalência de cepas multirresistentes pode ser
causada pelo uso indiscriminado de antibióticos, selecionando cepas de micro-
organismos cada vez mais resistentes e diminuindo as possibilidades de uma
escolha terapêutica capaz de combater infecções graves em hospitais (Alvarez et al,
2010; Sader et al. 2016).
Existe uma correlação entre altos níveis de colonização por organismos
multidroga resistentes e infecção subsequente em pacientes de UTI. A redução
destas populações após a colonização dos pacientes pode ser uma medida

50
preventiva para reduzir a evolução para um quadro de infecção, bem como a
transmissão destas bactérias entre pacientes das UTIs (Damaceno et al. 2015).
No Brasil, os estafilococos apresentam resistência elevada à penicilina, com
prevalência em torno de 80,0 % das cepas isoladas, seja em ambiente hospitalar ou
na comunidade, não sendo mais indicado o uso deste antimicrobiano para o
tratamento de infecções estafilocócicas (Tavares 2000; Santos et al. 2007). Nosso
estudo corrobora esses dados, com uma taxa de resistência à penicilina de 85,3 %.
Essa alta taxa pode ocorrer devido a vários fatores, entre eles destaca-se a
produção pela bactéria de penicilinases inativadoras, cujos genes podem ser
transmitidos a outras bactérias por conjugação plasmidial.
A resistência à clindamicina varia de acordo com a área geográfica,
diferença essa associada com a origem do isolado, que pode ser nosocomial, de
infecções relacionadas à comunidade ou assistência à saúde e à evidente
inconsistência na administração do uso da eritromicina nas diferentes instituições de
saúde. Lavallé et al. (2010) realizaram um estudo com amostras provenientes de um
hospital escola situado no Canadá, onde encontraram uma prevalência de 82,0 % do
fenótipo iMLSb entre os isolados de Staphylococcus spp analisados. Outro estudo
realizado por Coutinho et al. (2010) no Rio Grande do Sul, encontraram prevalência
de 3,2 % entre isolados clínicos de S. aureus.
A resistência à eritromicina foi observada em 69,1 % dos isolados, onde 23,4
% destes apresentaram o fenótipo induzível iMLSb, perfazendo um total de 16,2 %
(11/68) em relação à todas as cepas de S. aureus identificadas. É valido ressaltar
que 50,0 % (34/68) dos MSSA foram sensíveis à eritromicina, enquanto 13 dos 14
MRSA identificados foram resistentes. Alguns estudos têm relatado que até 45,0 %
de todos os S. aureus resistentes à eritromicina apresentam fenótipo iMLSb
(Fiebelkorn et al 2003; Majhi et al. 2016). A resistência à eritromicina é em muitos
casos usada como marcador de resistência à clindamicina, onde a prevalência da
resistência induzível entre cepas eritromicina-resistentes é alta, podendo chegar a
80,0 % (Hatkar et al. 2014). O grupo de antimicrobianos MLSb, no qual o antibiótico
clindamicina se encontra, é uma segunda opção terapêutica para infecções
causadas por MRSA (quando essas cepas não apresentam o fenótipo de resistência
cMLSb ou iMLSb) devido às suas excelentes propriedades farmacocinéticas, além
de ser uma alternativa para pacientes alérgicos à penicilina, tornando as altas
prevalências de resistência preocupantes (Fiebelkorn et al 2003).

51
 Têm-se relatado falência clínica da clindamicina durante antibioticoterapia
em infecções estafilocócicas com resistência MLSb induzível, mostrando que este
fenótipo pode limitar a efetividade da droga.Outra limitação para detecção deste
fenótipo é a realização do antibiograma padrão, adotado nas rotinas laboratoriais de
todo o mundo, incapaz por si só de detectar essa falsa suscetibilidade à clindamicina
(Majhi et al. 2016). Assim, o test D, que tem a finalidade de detectar a resistência
induzível, deve ser implantado na rotina laboratorial clínica, devido à sua importância
diagnóstica, além de ter um custo-benefício vantajoso, guiando a antibioticoterapia
contra cepas com fenótipo induzível de resistência ao grupo MLSb (Prabhu et al.
2011).
Nos nossos estudos além de 16,2 % dos isolados apresentarem o fenótipo
iMLSb outros 17,6 % (12/68) apresentaram a resistência constitutiva cMLSb. Dentre
as 14 cepas MRSA detectadas, uma (7,1 %) também era iMLSb e outras duas (14,3
%) apresentaram o fenótipo cMLSb. No Brasil é possível encontrar variabilidade da
prevalência dos fenótipos induzível e constitutivo. Bottega et al. (2014) em estudo na
cidade de Santa Maria (RS), encontrou semelhante prevalência de iMLSb e cMLSb
entre cepas S. aureus de amostras de pacientes em um hospital terciário, 7,9 % e
17,9 % respectivamente, já a prevalência encontrada de cepas MRSA, foi de 3,1 %
dos MRSA sendo iMLSb e 14,3 % cMLSb.
Majhi et al. (2016) em um estudo prospectivo analisando a detecção do
fenótipo de resistência iMLSb e cMLSb em amostras de S. aureus isolados de um
hospital terciário na Índia, em concordância ao presente estudo, encontraram 17,7 %
(37/209) de prevalência de cMLSb (7 MSSA, 30 MRSA), 22,0 % (46/209) cepas
iMLSb (14 MSSA, 32 MRSA). Este estudo foi de grande impacto na região, pois
após publicação do mesmo, o laboratório de microbiologia do hospital no qual foram
realizadas as coletas, tomou como medida incorporar o test D junto ao antibiograma
de todos os isolados de S. aureus na rotina laboratorial para assim fornecer um guia
clínico apropriado para o uso da clindamicina. Medida essa que deve ser aplicada
por outros centros hospitalares, principalmente naqueles que se encontram em
regiões onde a frequência do fenótipo de resistência MLSb entre os S. aureus é
elevada, para evitar casos de falência clínica desse importante antimicrobiano, além
da disseminação de cepas multirresistentes.
A resistência a beta lactâmicos como a cefoxitina (penicilinase-resistentes)
tem aumentado muito em ambientes hospitalares (Sader et al. 2016). Além disso,

52
estas cepas resistentes geralmente apresentam resistência a todas as penicilinas,
cefalosforinas, carbapenêmicos e monobactâmicos. Foi observado que17 (25,0 %)
dos nossos isolados apresentaram tal perfil. Porém, após PCR para detecção do
gene mecA, a prevalência encontrada de MRSA foi de 20,6 % (14/68) entre os S.
aureus isolados e de 5,2 % (7/134) em relação aos pacientes avaliados. Cavalcanti
(2013), ao avaliar a prevalência de cepas MRSA provenientes de pacientes com
tonsilites, encontrou nove isolados de S. aureus resistentes à cefoxitina, porém,
apenas dois apresentaram o gene mecA.
Apesar da cefoxitina ser o antimicrobiano usado para triagem de cepas
MRSA podem existir esses casos, onde as cepas se mostram resistentes à
meticilina no antibiograma, mas dão resultado negativo para a PCR de detecção do
gene mecA. Esse fato se deve aos isolados de S. aureus possuírem outros
mecanismos de resistência que não o gene mecA, como hiperprodução de
betalactamases ou o gene mecC, homólogo do gene mecA, que determina o
fenótipo de resistência aos β-lactâmicos em muitas cepas, mas não são detectados
na PCR para o gene mecA. O mecC inicialmente denominado como mecALGA251,
teve sua primeira identificação pelo sequenciamento completo do genoma de uma
cepa de S. aureus isolada no Reino Unido (Bassettiet al. 2013). Entretanto,
investigações mais aprofundadas devem ser feitas para justificar essa resistência.
Prevalências de colonização de cepas resistentes à meticilina semelhantes à
encontrada no presente estudo pôde ser vista por Rahimi et al. (2016) em um estudo
de cepas MRSA isoladas de pacientes em UTI de um hospital em Tehran/Irã, no
qual 25,8 % dos isolados foram caracterizados como MRSA pela detecção do gene
mecA.
A elevada incidência de cepas MRSA é motivo de preocupação e índices
semelhantes ao presente estudo (5,2 %) têm sido descritos pela literatura. No Brasil,
Damaceno et al. (2015) encontraram taxa de colonização por MRSA em pacientes
de UTI de 7,5% em Minas Gerais. Renner & Carvalho (2013) obtiveram taxa de
contaminação ambiental de UTI de 7,1 %, superiores à contaminação ambiental em
nosso estudo que foi de 1,7 %. Em outros países, taxas de colonização bem mais
elevadas são descritas, como 11,8 % na Tanzânia (Geofrey et al. 2015); 15,7 % na
Turquia (Durmaz et al. 2016); 16,4 % em Taiwan (Kao et al. 2015) e até 63,0 % no
Egito (Fouda et al. 2016).

53
 Moreira et al. (2013) encontraram 56,0 % de isolados de S. aureus
resistentes à cefoxitina em pacientes e membros da equipe de enfermagem, de uma
UTI de um hospital Geral do Norte do Paraná. Sousa et al. (2011) conduziram um
estudo onde foram selecionadas cepas de S. aureus provenientes de diferentes
locais de um hospital terciário, incluindo a UTI, na cidade de Santa Maria (RS), onde
uma taxa alarmante de 89,0 % das cepas apresentaram essa resistência. Em
contrapartida Lamaro-Cardoso et al. (2009) em um estudo sobre a prevalência de
MRSA em creches situadas na cidade de Goiânia, com crianças de 2 a 5 anos,
detectaram 1,5 % de prevalência, evidenciando a diferença de prevalência de MRSA
em ambiente hospitalar e na comunidade.
O tipo de SCCmec de maior prevalência encontrado entre os 14 isolados
MRSA no presente estudo foi o SCCmec tipo IV (42,9 %), seguido do SCCmec tipo I
(35,7 %), SCCmec tipo II (14,3 %) e o de menor prevalência foi o SCCmec tipo III
(7,1%). Darban-Sarokhalil et al. (2016) ao realizar em seus estudos a caracterização
molecular de S. aureus de isolados clínicos de hospitais no Iran, encontraram
prevalência de 88,5 % de SCCmec tipo III, 7 % tipo IV e 4,5 % foram não tipáveis.
Em outro estudo realizado por Rahimi et al. (2016) também no Iran de isolados
clínicos, 97,0 % das cepas eram do tipo III. A maioria dos estudos relata o SCCmec
tipo III como o mais prevalente entre as cepas HA-MRSA, contrastando com os
resultados encontrados pelo presente estudo. As cepas tipo SCCmec I do presente
estudo são cepas multirresistentes com SCCmec característico de cepas
hospitalares.
Dos 11 tipos de SCCmec reportados em pesquisas por todo o mundo, os
tipos I, II e III, têm sido considerados tipos de SCCmec de origem nosocomial e os
demais, de cepas de origem comunitária. Porém essa classificação sofre grande
influência geográfica e a diversidade clonal das cepas de S. aureus vem crescendo
ao longo dos anos. Os resultados encontrados mostram a emergência de novos
clones de MRSA e que a população de cepas MRSA inseridas nos hospitais está se
diversificando. É possível que novas cepas estejam sendo inseridas via ambientes
comunitários em ambientes hospitalares (Ribeiro et al. 2007).
Há mais de trinta anos cepas MRSA têm sido a maior causa de infecções
nosocomiais. A vancomicina é o principal antimicrobiano usado no tratamento clínico
de S. aureus com fenótipo MRSA devido às suas características farmacocinéticas. A
detecção do perfil de suscetibilidade à vancomicina é feita através da determinação

54
da concentração inibitória mínima (CIM) (Basseti et al. 2013).De acordo com o CLSI
(2016) as cepas que apresentarem CIM de 4-8 µg/mL são consideradas como VISA.
Após ter sido reportado o primeiro caso de paciente com infecção causada por VISA,
vários outros relatos do patógeno puderam ser observados em diversos países do
mundo (Sakai et al. 2016; Mahida & Boswell 2016).
Em nosso estudo foi encontrada a prevalência de 10,3 % (7/68) de cepas
VISA, com resultado de MIC entre 4 e 6 µg/mL para vancomicina, sendoseisdesses
isolados também confirmados como MRSA. Sakai et al. (2016) observaram maior
prevalência ao analisar um surto hospitalar envolvendo cepas VISA em UTI de
hospital no Japão, onde foram identificados 14 isolados VISA de 65 isolados
investigados. Essa maior prevalência pode estar superestimada já que a coleta de
todos os isolados foi realizada no período referente ao surto do micro-organismo no
ambiente hospitalar. E Mahida & Boswell (2016) ao estudarem a prevalência de
contaminação por MDRs relacionada a fômites no ambiente hospitalar em UK,
encontraram prevalência similar de 9,0 % de cepas VISA. A prevalência de cepas
com resistência ao antibiótico de primeira opção para a terapêutica de cepas
resistentes à meticilina é de grande preocupação para os centros hospitalares em
vista da debilidade dos pacientes que ali se encontram e pela diminuição das opções
terapêuticas para as infecções causadas por estas bactérias.
Além da resistência antimicrobiana, MRSA e MSSA, são produtores de
fatores de virulência associados à patogenicidade e virulência dos S. aureus,
podendo auxiliar na evasão da resposta imune, contribuindo na gravidade das
infecções causadas pela bactéria. A detecção da PVL, hemolisinas, SAgs e toxinas
determina o potencial patogênico das cepas identificadas (David & Daum 2010;
Rahimi et al. 2016).
Em nosso estudo apenas em quatro isolados MRSA foi possível a detecção
de algum de tipo de fator de virulência, havendo um número maior de fatores de
virulência detectados nas cepas MSSA estudadas. Fator esse que demonstra que
cepas MSSA possuem potencial patogênico e sua inserção no ambiente hospitalar
não pode ser negligenciada.
A PVL é um importante fator de virulência em S. aureus, bastante estudada
devido à sua toxicidade, já que a patogenicidade de certas cepas tem associação
com a produção dessa toxina e a mesma possui relação com a ocorrência de
infecções invasivas. Acredita-se que genes codificadores da PVL estejam presentes

55
em menos de 5,0% dos S. aureus, sendo conservados em diversas linhagens de
MSSA e MRSA. Porém estudos ao longo dos anos têm mostrado que as cepas
MRSA costumam produzir com maior frequência esse fator de virulência (Kobayashi
et al. 2011; Brizuela et al. 2016).
A prevalência do gene lukS-F dosS. aureus identificados foi de 4,4 %, entre
os MRSA foi de 7,1 % (1/14) e entre as cepas VISA foi de 14,3 % (1/7). Todos os
isolados PVL+ foram isolados do ambiente da UTI, de grades da cama dos leitos de
pacientes. A cepa MRSA e PVL positiva encontrada carreava o SCCmec tipo I,
característico do ambiente hospitalar. A capacidade de produção de PVL têm sido
fortemente associada às cepas CA-MRSA, sendo encontrado nestes ambientes com
menor frequência. A presença do gene que codifica a PVL entre cepas MRSA pode
facilitar a disseminação pela sua habilidade de provocar infecções primárias de pele
(Linpinska et al. 2011; Paramythiotou et al. 2014).
Bettin et al (2012) em estudo sobre a prevalência S. aureus em estudantes
do curso de medicina observou a presença dos genes lukS-F entre os isolados de
MSSA, em 4,2 % dos isolados, enquanto 83,3 % das amostras de MRSA
identificadas carreavam esse gene. Observou-se também que todas as cepas MRSA
e PVL+ carreavam o SCCmec IV, confirmando mais uma vez que as cepas MRSA
carreiam esses genes com mais regularidade que as cepas MSSA em isolados
associados à comunidade.
Pardo et al. (2013) na América do Sul, encontraram uma prevalência de
isolados PVL+superior à do nosso estudo, ao avaliarem isolados de pacientes
colonizados pela bactéria, encontrando relação significativa entre PVL, MSSA e
MRSA. A prevalência de PVL+ entre MSSA foi de cerca de 28,0%, enquanto que
entre cepas MRSA foi de 86,0 %. Brizuela et al. (2016) ao estudar infecções graves
por MSSA produtoras da PVL em hospital pediátrico de Buenos Aires, encontraram
uma maior relação de infecções invasivas por cepas MSSA produtoras de PVL, do
que aquelas cepas MRSA também produtoras do fator de virulência.
Outros fatores de virulência que S. aureus produz são as enterotoxinas
estafilocócicas (SEs), sendo essa bactéria uma das principais causas de doenças
transmitidas por alimentos (DTA), onde o manipulador é a maior fonte de
transmissão (Ho et al. 2015). Nos EUA esta bactéria é responsável por mais de 240
mil casos de intoxicação alimentar anualmente. No Brasil, nos anos de 2007 até
março de 2016 foram observados 6.632 surtos de DTA. S. aureus foi o terceiro

56
patógeno relacionado, sendo causa de aproximadamente 6.850 casos de
intoxicação alimentar estafilocócica notificados (Scallan et al. 2011; Brasil 2016).
O presente estudo encontrou três isolados (4,4 %) potencialmente
enterotoxigênicos. Dois foram provenientes de pacientes e um da grade da cama do
leito. O tipo de enterotoxina mais prevalente foi a SEH. Pesquisas sugerem que a
antissepsia regular das mãos deve ser feita na rotina hospitalar para complementar
a desinfecção ambiental efetiva (Ho et al. 2015). As cepas produtoras de tais toxinas
quando entram em contato com a pele de manipuladores de alimentos, podem ser
transmitidas aos alimentos, pois ao serem ingeridos irão provocar episódios de
intoxicação alimentar. A maioria dos relatos sobre o perfil enterotoxigênico de S.
aureus é feito em amostras de origem alimentar, e com isso a prevalência é
geralmente bem maior do que a apresentada no nosso estudo. Porém o isolamento
de cepas produtoras de SE que são superantígenos, em ambiente hospitalar, pode
em algum grau, interferir na evolução das infecções com agravamento do seu
desfecho.
A prevalência do gene tst no presente estudo foi de 4,4 % (3/68) sendo que
66,6 % (2/3) também eram cepas MRSA. As cepas produtoras deste gene foram
isoladas de paciente, bandeja e maçaneta da porta. A cepa isolada da bandeja além
ser MRSA, possuir o gene tst, ainda foi classificada como VISA. Nunes et al. (2016)
detectaram uma prevalência maior que a nossa de 10,4 %, isolados de portadores
assintomáticos. Rodrigues et al. (2012) detectaram prevalência de 22,6 % de
isolados clínicos, 12,4 % de isolados de vigilância, o que evidencia a associação
deste gene a isolados invasivos. Válido ressaltar que ambos os estudos foram feitos
em Botucatu-SP, e as diferenças de prevalências encontradas devem estar
relacionadas aos grupos estudados, por serem diferentes.
No nosso estudo as toxinas esfoliativas foram detectadas em baixa
prevalência (1,4 %) onde uma mesma cepa MSSA era carreadora tanto do gene eta
quanto do gene etb, sendo esta isolada de um paciente. Na maioria dos estudos as
cepas nas quais as toxinas são encontradasem geral de origem hospitalar, ou seja,
isolados de pacientes. Em geral elas são menos disseminadas entre os S. aureus do
que as SEs, como confirmado pelo presente estudo. Em estudos de um hospital
universitário de Botucatu-SP, Rodrigues et al. (2012) analisando isolados clínicos e
de vigilância, encontraramo gene etb em uma frequência de 9,5 % em isolados
clínicos e 1,8 % em culturas de vigilância. Em outro estudo realizado por Nunes et

57
al. (2016) em SP, foi encontrado o perfil toxigênico de S. aureus com a presença do
gene eta em frequência de 3,0 %, não sendo encontrando o gene etb. No presente
estudo 82,3 % dos S. aureus não apresentaram nenhum fator de virulência.
A PVL e as ETs são codificadas em fagos (Malachowa & DeLeo 2010), isso
pode justificar a distribuição dos genes lukS-F e eta entre os clusters. O tst e o hlb
são genes cromossomais, transferidos de forma vertical, em vista disso, podem estar
mais associados à algumas linhagens do que a outras. Alguns elementos genéticos
móveis (Mobile genetic elements – MGE) são ausentes em algumas linhagens,
provavelmente devido a algum mecanismo que restringe a transferência horizontal
(Kuroda et al. 2001).
As SEs possuem fontes genéticas variadas (Alibayov et al. 2014). O gene
sea pode ser transferido por meio de fagos e pode ser mais distribuído entre as
diferentes linhagens. O gene sec não foi associado a nenhum cluster no presente
estudo, entretanto encontra-se em ilhas de patogenicidade, podendo ser transferido
de forma vertical e horizontal, com o auxílio de fagos. O gene seb está presente em
ilhas de patogenicidade e plasmídeos, transferido de forma vertical e horizontal. O
gene seh é encontrado em transposons e pode ser transferido de forma vertical ou
horizontal e estar associadoa linhagens genéticas.
A transferência de genes que codificam toxinas contidos em MGEs entre
cepas de S. aureus ocorre, resultando em diferentes combinações de toxinas (Xie et
al. 2011). Esse fenômeno de transferência cria a possibilidade de gerar cepas cada
vez mais patogênicas inseridas nos mais diversos locais, o que gera problemas de
saúde pública além de diminuir a segurança alimentar devido à disseminação e
inserção de cepas em ambientes de manipulação de alimentos (Hait et al. 2014).
A heterogeneidade encontrada nas cepas de Staphylococcus aureus é
referente ao arsenal de fatores de virulência, assim como a variedade de perfis de
resistência apresentados pelos isolados. Esses isolados muitas vezes são
negligenciados pela comunidade científica, que por vez deixa de reportar e publicar
dados sobre essas cepas.
Os 68 isolados de S. aureus aos serem submetidos ao PFGE foram
agrupados em 15 diferentes clusters, havendo um número alto de cepas idênticas,
estritamente relacionadas e a existente predominância de clones específicos, que
demonstram uma mesma origem genética dessas bactérias, pela similaridade nos
padrões de restrição obtidos.

58
 A observação de isolados idênticos ou relacionados obtidos de diferentes
fontes aponta para a evidente disseminação dessas cepas entre pacientes e fômites,
sendo possível assim, relacionar uma cadeia de transmissão que envolve não
somente os pacientes internados na UTI, mas também os profissionais da área da
saúde, especialmente a mão desses profissionais, e os objetos inanimados
presentes no ambiente hospitalar (David & Daum 2010). Pode observar também a
persistência desses isolados no ambiente, já que isolados idênticos foram obtidos de
amostras coletadas em momentos diferentes.
Apesar da observação de vários clusters diferentes indicando grande
variabilidade genética entre os isolados, o cluster L agrupou 16 isolados oriundos de
diferentes amostras, indicando uma fonte comum de contaminação. Não foi
observada associação dos fatores de virulência com clusters específicos.
Foram isoladas cepas MRSA com SCCmec dos tipos IV, I, II e III na UTI do
hospital escola. Os perfis de restrição dessas cepas se encontraram bem
distribuídos pelos clusters e cepas não agrupadas em clusters. É possível que novas
cepas estejam sendo inseridas na interface entre hospitais e comunidade. Os
estudos anteriores de Lamaro-Cardoso et al. (2009) e Vieira et al. (2014) juntamente
com o presente estudo demonstram que a população de cepas MRSA inseridas no
ambiente hospitalar e na comunidade de Goiânia está se diversificando.
Todas as cepas VISA identificadas no presente estudo eram cepas MDRs e
MRSA, sendo isoladas de pacientes, suporte de soluções, grade da cama e bandeja.
Dentre esses isolados, os isolados S16-L4 (isolado de suporte de soluções) e P13-
L2 (isolado de paciente) tiveram um perfil de restrição idêntico e apresentaram
SCCmec tipo IV e I respectivamente. Foi possível observar também que em alguns
tipos clonais havia cepas que eram VISA e outras que não apresentam esse perfil de
resistência, mesmo tendo um perfil de restrição semelhante e pertencerem ao
mesmo cluster, que foi o caso das cepas: P5-2/13 (Cl C)e P10L4 (Cl M). Houve
ainda a cepa B2L2 oriunda de uma bandeja, positiva para o gene de virulência tst,
que não foi agrupada dentro de nenhum cluster.
A existência de clones de cepas VISA, MRSA e MDRs simultaneamente,
isoladas de pacientes e de objetos dentro do ambiente da UTI do hospital, é um fato
grave, de grande preocupação para a saúde pública, tendo em vista a iminente falha
terapêutica que essa realidade gera em infecções causadas por essas cepas. A
preocupação principal é a inexistência de alternativas terapêuticas eficazes e

59
seguras para o tratamento de infecções por S. aureus com esse perfil de resistência
antimicrobiana.
Nas cepas MRSA o clone de HA - MRSA multirresistente, conhecido como
clone epidêmico brasileiro (BEC), SCCmec tipo III, é responsável pela maioria das
infecções nosocomiais no Brasil. No entanto , estudos mais recentes relatam uma
ocorrência frequente de outros clones como o USA800 (SCCmec tipo IV), USA100
(SCCmec tipo II), USA400 (SCCmec tipo IV ) e USA300 (SCCmec tipo IV) em
hospitais brasileiros (Carrel et al. 2015).
O USA300 é uma cepa de grande importância que foi primeiramente
reconhecida nos EUA, onde se tornou a principal causa de infecções por CA-MRSA
nos anos 2000. Porém ao longo dos anos começou a ser detectada em ambientes
hospitalares não sendo mais restrita ao ambiente comunitário, se tornando causa
comum de infecções por HA-MRSA nos Estados Unidos (David & Daum 2010; Carrel
et al. 2015).
O USA300 se disseminou por diversas partes do mundo e tem sido descrito
em países de varios continentes (Glaser et al. 2016). No Brasil, Austrália e Ásia
Oriental, ao contrário do que ocorre nos EUA, ele é raramente encontrado. Podem
existir nesses locais outros clones predominantemente disseminados, como no
Brasil onde o BEC, citado anteriormente, é comumente isolado em hospitais de
diversas regiões (Rossi 2011; Ferreira et al. 2014).
A cepa USA300 tem sido bastante estudada quanto ao seu perfil de
resistência e virulência. Entre as características relevantes associadas a essas
cepas estão a suscetibilidade diminuída a diversos antimicrobianos, possuir
SCCmec tipo IV, apresentar gene para PVL e, na maioria das vezes, o ACME
(arginine catabolic element), elemento associado à patogênese, pois confere às
cepas MRSA melhor habilidade de colonizar a pele de pessoas saudáveis, sendo
por isso mais facilmente disseminado (Thurlow et al. 2012). Porém esses elementos
característicos do USA300 não foram encontrados da cepa S62-L2, que teve 80 %
de similaridade do seu perfil de restrição com o perfil do USA300, foi PVL negativa,
apresentando SCCmec tipo I.
Entre os raros relatos de USA300 no Brasil está o estudo de Ribeiro et al.
(2007), que descreve a presença de uma cepa associada ao USA300 em um
hospital de Porto Alegre. Schuenk et al. (2009) relataram o primeiro caso de infecção
por uma cepa relacionada ao USA300 na cidade de Rio de Janeiro, a cepa foi

60
isolada de um turista americano com infecção cutânea, o que mostra uma possível
rota da inserção dessas cepas no país.
No ano de 2014, Vieira et al. realizaram um levantamento da colonização
nasal em população pediátrica de neonatos e crianças em ambiente hospitalar. A
maioria dos isolados foi relacionada a dois clones pandêmicos de MRSA, o Clone
Pediátrico (USA800) e o Clone Endêmico Brasileiro (BEC). Nenhuma cepa teve

relação ao USA300 e todos os MRSA foram PVL- (Vieira et al. 2014).

No presente estudo houve a detecção de três cepas relacionadas ao

USA400, sendo que uma delas (P2-L2) teve seu perfil de restrição idêntico ao do
USA400. As linhagens mais comuns nos Estados Unidos são do tipo USA400 e
USA300, que são normalmente SCCmec tipo IV e PVL negativas (Glaser et al.
2016). Dos três isolados relacionados ao clone, dois eram SCCmec tipo IV e todos
PVL negativos, o que fortalece o resultado da associação encontrada no
dendrograma (Figura 12).
Na Europa, os dados são mais limitados, as cepas USA400 ainda são raras
no continente. Figueiredo-Andrade & Balbino (2016) publicaram sobre a importação
do USA400 na Itália e seu isolamento no país. O organismo foi isolado a partir de
uma italiana com uma infecção da pele contraída nos Estados Unidos. O USA400 foi
descrito pela primeira vez no Brasil em 2005 e continua a ser descrito em hospitais
no Brasil, sendo responsável por vários tipos de problemas de saúde pública
(Thurlow et al. 2012).
No campo de pesquisa sobre Staphylococcus aureus existe, na atualidade,
grande atenção voltada para cepas MRSA, havendo grande volume de estudos
destacando tais isolados. Entretanto, existem cepas MSSA que são multirresistentes
e com potencial altamente patogênico circulando em diversos ambientes. Esses
isolados muitas vezes são negligenciados pela comunidade científica, que por vez
deixa de reportar e publicar dados sobre essas cepas.
Em nosso estudo apenas quatro isolados MRSA apresentaram algum de tipo
de fator de virulência, enquanto os outros fatores estavam distribuídos entre cepas
MSSA. Isso demonstra como cepas MSSA com potencial patogênico estão inseridas
no ambiente hospitalar, o que pode facilitar a disseminação e
contaminação/colonização.

61
 A população de bactérias é vasta, diversificada e polimórfica. Diante desse
fato se faz necessário constantes pesquisas sobre cepas circulantes, principalmente
em ambientes hospitalares, mas também em portadores assintomáticos, pacientes,
assim como nas possíveis transferências de clones de origem comunitária para
dentro das UTIs e vice-versa. Dessa forma torna-se possível estabelecer as
particularidades regionais da relação entre contaminação/colonização e infecção,
como também determinar o nível de disseminação dessas cepas entre pacientes,
profissionais da saúde e ambiente. E enfim, estabelecer o grau de importância das
cepas MRSA e MSSA na colonização e, consequentemente, na infecção em geral,
além do surgimento de cepas VISA e VRSA na região de estudo.

62
7 CONCLUSÕES

 Foi possível observar, assim como em diversos estudos, que pacientes

internados e o ambiente da UTI avaliados estão expostos à
colonização/contaminação por S. aureus, muitos deles multirresistentes;
 A multirresistência verificada entre os isolados aumenta o risco de
disseminação de genes de resistência no ambiente da UTI;
 Cepas apresentando o fenótipo MRSA e VISA encontradas entre os isolados
apontam para a necessidade de medidas de controle urgentes;
 Cepas com fenótipo MRSA dentro da UTI apresentaram predomínio do
SCCmec tipo IV, característico de cepas associadas à comunidade,
evidenciando cada vez mais o fluxo de disseminação intra e inter-ambiente
hospitalar e comunitário;
 Alguns isolados apresentaram genes de virulência, principalmente para PVL e
TST;
 A similaridade genética dos isolados demonstra tanto a ocorrência de
diferentes cepas circulando na UTI, como a ocorrência de persistência de
isolados que constituem uma fonte de micro-organismos nesse ambiente,
podendo disseminar entre pacientes, fômites e pessoal envolvido na
manipulação dos mesmos. Além disso, acredita-se que as superfícies
ambientais podem estar atuando como reservatórios de genes de resistência e
virulência.
A disseminação desses patógenos no meio hospitalar aumenta o custeio da
internação dos pacientes, além de aumentar seu risco de infecções e seu tempo de
internação, o que mostra que programas de controle devem ser criados, visando a
diminuição de colonização/contaminação de cepas multirresistentes nesses locais.
Por fim, espera-se com o presente estudo melhorar o entendimento da
epidemiologia, disseminação, virulência, patogenicidade e distribuição clonal das
cepas locais. E que os resultados encontrados possam contribuir para atestar
programas de vigilância, medidas de intervenção para a detecção e monitoramento
de patógenos tanto em pacientes quanto nas superfícies inanimadas,

63
potencializando assim a quebra de transmissão do patógeno e principalmente de
cepas MRSA e VISA.

64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Adaleti R, Nakipoglu Y, Ceran N, Tasdemir C, Kaya F, Tasdemir S. Prevalence

of phenotypic resistance of Staphylococcus aureus isolates to macrolide,
lincosamide, streptogramim B, ketolid and linezolid antibiotics in Turkey. Braz J
Infect Dis 14: 11-14, 2010.
2. Aires-de-Sousa M, Parente CE, Vieira-da-Mota O, Bonna IC, Silva DA, de
Lencastre H. Characterization of Staphylococcus aureus isolates from buffalo,
bovine, ovine, and caprine milk samples collected in Rio de Janeiro State,
Brazil. Appl Environ Microbiol 73: 3845-3849, 2007.
3. Alibayov B, Baba-Moussa L, Sina H, Zdenková K, Demnerová K.
Staphylococcus aureus mobile genetic elements. Mol Biol Rep 41(8): 5005-
5018, 2014a. doi:10.1007/s11033-014-3367-3.
4. Alibayov B, Zdenkova K, Sakorova H, Demnerova K. Molecular analysis of
Staphylococcus aureus pathogenicity islands (SaPI) and their superantigens
combination of food samples. J Microbiol Methods 107: 197–204, 2014b. doi:
org/10.1016/j.mimet.2014.10.014
5. Almeida LM, Almeida MZPRB, Mendonça CL De, Mamizuka EM, Paulo UDS,
Paulo S. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among
subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus isolates from sheep
flocks of the Northeast of Brazil. Braz J Microbiol 498: 493-498, 2013.
6. Alvarez C, Labarca J, Salles M. Estratégias de prevenção de
Staphylococcusaureus resistente à meticilina (MRSA) na América Latina. Braz J
Infect Dis 14: S108-S120, 2010.
7. Amorim DMR, Person OC, Amaral PJ, Tanaka II. Resistência induzível à
clindamicina entre isolados clínicos de Staphylococcus aureus. O mundo da
Saúde 33(4): 401-405, 2009.
8. ANBIO. Agência Nacional de Biossegurança. Biossegurança hospitalar. 2012.
Disponível em: http://www.anbio.org.br/.
9. Angelakis E, Azhar EI, Bibi F, Al-ghamdi AK, Ashshi AM, Elshemi AG. Paper
money and coins as potential vectors of transmissible disease. Future Microbiol
9: 249–61, 2014.
10. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e Identificação de

65
 bactérias de Importância Médica. 2014a. disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_5_2014.pdf
11. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Vigilância Epidemiológica
das Doenças Transmitidas por Alimentos – VE-DTA. 2014b. Disponível em:
http://www.portal.saúde.gov.br.
12. ANVISA. Detecção e Identificação de bactérias de Importância Médica. 2013.
Disponível em:
http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/1d5166804e2574a3b08db3c09d49
251b/6+%E2%80%93+Detec%C3%A7%C3%A3o+e+identifica%C3%A7%C3%
A3o+de+bact%C3%A9rias+de+import%C3%A2ncia+m%C3%A9dica..pdf?MOD
=AJPERES .
13. Askari E, Tabatabai SM, Arianpoor A, Nasab MN. VanA-positive vancomycin-
resistant Staphylococcus aureus: Systematic search and review of reported
cases. Infect Dis Clin Pract 21(2): 91-93, 2013. doi:
10.1097/IPC.0b013e31826e8199.
14. Balaban N, Rasooly A. Staphylococcal Enterotoxins. Int J Food Microbiol 61: 1-
10, 2000.
15. Basseti D, Bergh K, Mishali H, Arbeit RD, Spratt BG. Regional infection control
assessment of an antibiotic resistance knowledge and practice in
Staphylococcus aureus. Infect Control Hosp Epidemiol 35:805-810, 2013a.
16. Bassetti M, Merelli M, Temperoni C, Astilean A. New antibiotics for bad bugs:
where are we? Ann Clin Microbiol Antimicrob 12: 22, 2013b. doi: 10.1186/1476-
0711-12-22.
17. Berube BJ, Wardenburg JB. Staphylococcus aureusα-toxin: Nearly a century of
intrigue. Toxins (Basel) 5(6): 1140-1166, 2013. doi:10.3390/toxins5061140.
18. Bettin A, Causil C, Reyes N. Molecular identification and antimicrobial
susceptibility of Staphylococcus aureus nasal isolates from medical students in
Cartagena, Colombia. Brazilian J Infect Dis 16: 329-334, 2012.
doi:10.1016/j.bjid.2012.06.017.
19. Blaser MJ, Falkow S. What are the consequences of the disappearing human
microbiota? Nat Rev Microbiol 7(12):887-894, 2009. doi:10.1038/nrmicro2245.
20. Bonesso MF, Marques SA, Camargo CH, Fortaleza CMCB, Cunha MLRS.
Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in non-
outbreak skin infections. Braz J Microbiol 45: 1401-1407, 2014.

66
21. Borges LFA, Kataguiri LG, Nunes MJ, Gontijo Filho PP. Contaminação das
mãos de profissionais de saúde em diferentes unidades de um Hospital
Universitário Brasileiro. Rev Nursing 100(8): 1000-1003, 2006.
22. Bottega A, Rodrigues MA, Carvalho FA, Wagner TF, Leal IAS, Santos SO.
Evaluation of constitutive and inducible resistance to clindamicin in clinical
samples of Staphylococcus aureus from a tertiary hospital. Rev Soc Bras Med
Trop 47(5): 589-592, 2014.
23. Boundy S, Safo MK, Wang L, Musayev FN, O’Farrel HC, Rife JP, Archer GL.
Characterization of the Staphylococcus aureus rRNA methyltransferase
encoded by orfx, the gene containing the staphylococcal chromosome cassette
mec (SCCmec) insertion site. J Biol Chem 288: 132-140, 2013. doi:
10.1074/jbc.M112.385138.
24. Braga EDV, Aguiar-Alves F, Freitas MFN, Silva MO, Correa TV, Snyder RE, et
al. High prevalence of Staphylococcus aureus and methicillin-resistant S.
aureus colonization among healthy children attending public daycare centers in
informal settlements in a large urban center in Brazil. BMC Infect Dis 14: 1-10,
2014. doi:10.1186/1471-2334-14-538.
25. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Unidade de
Vigilância das Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar.Surtos de Doenças
Transmitidas por Alimentos no Brasil. Junho, 2016. Disponível em:
http://u.saude.gov.br/images/pdf/2016/junho/08/Apresenta----o-Surtos-DTA-
2016.pdf. Acesso em: 07/09/2016.
26. Brizuela M, Guadalupe P, Ruvinsky S, Sarkis C, Romero R, Mastroianni A,
Casimir L, Venuta ME, Bonduele VGB, Bolonga R. Infección grave por
Staphylococcus aureus meticilino sensible productor de leucocidina de Panton-
Valentine: reportes de dos casos. Arch Argent Pediatr 114(4): e237-e240, 2016.
27. Brooks GF, Jawetz E, Melnick TA, Adelberg EA. Jawetz, Melnick & Adelberg’s
Medical Microbiology. McGram Hill Medical. New York, 2010.
28. Brosnahan AJ, Schlievert PM. Gram-positive bacterial superantigen outside-in
signaling causes toxic shock syndrome. FEBS J 278: 4649–67, 2011.
29. Brumfitt W, Hamilton-Miller J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. New
Engl J Med 320: 1188-1196, 1989. doi: 10.1056/NEJM198905043201806.
30. Brust T, da Costa TM, Amorim JC, Asensi MD, Fernandes O, Aguiar-Alves F.
Hospital-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus carrying the

67
 PVL gene outbreak in a public hospital in Rio de Janeiro, Brazil. Braz J
Microbiol 44: 865-868, 2013. doi:10.1590/S1517-83822013000300031.
31. Bukowski M, Wladyka B, Dubin G. Exfoliative Toxins of Staphylococcus aureus.
Toxins 2: 1148-1165; 2010. doi: 10.3390/toxins2051148.
32. Carrel M, Perencevich EN, David MZ. USA300 methicillin-resistant
Staphylococcus aureus, United States, 2000-2013. Emerg Infect Dis 21: 1973–
80, 2015.
33. Carriço JA, Pinto FR, Simas C, Nunes S, Sousa NG, Frazão N, de Lencastre H,
Almeida JS. Assessment of band-based similarity coefficients for automatic type
and subtype classification of microbial isolates analyzed by pulsed-field gel
electrophoresis. J Clin Microbiol 43:5483-5490, 2005.
34. Carvalho K, Mamizuka EM, Filho PPG. Methicillin/Oxacillin-resistant
Staphylococcus aureus as a hospital and public health threat in Brazil. Braz J
Infect Dis 14: 71-76, 2010.
35. Cavalcanti SMM, França ER, Vilela MA, Montenegro F, Cabral C, Medeiros
ACR. Estudo comparativo da prevalência de Staphylococcus aureus importado
para as unidades de terapia intensiva de hospital universitário, Pernambuco,
Brasil. Rev Bras Epidemiol 9(4): 436-446, 2006.
36. Cavalcanti, VP. Staphylococcus aureus em tonsilas de pacientes com
faringotonsilite aguda recorrente: prevalência, perfil de suscetibilidade e
caracterização genotípica. Goiânia [Dissertação de Mestrado em Biologia da
Relação Parasito Hospedeiro – IPTSP/UFG], 2013.
37. CDC. Centers for Disease Control and Prevention. Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus infections among competitive sports participants.
Colorado, Indiana, Pennsylvania, and Los Angeles County, 2000-2003. MMWR
Morb Mortal Wkly Rep 52: 793-795, 2003.
38. Chambers HF, Deleo Fr. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the
antibiotic era. Nat Rev Microbiol 7(9): 629-641, 2009. doi:10.1038/nrmicro2200.
39. Chang CJ, Chen NC, Lao CK, Huang YC. Nasal Staphylococcus aureus and
methicillin-resistant S. aureus carriage among janitors working in hospitals in
northern Taiwan. PLoSOne 10: 1–11, 2015. doi: 10.1371/journal.pone.0138971.
40. Cho I, Blaser MJ. The human microbiome: at the interface of health and
disease. Nat Rev Genet 13:260–70, 2012. doi: 10.1038/nrg3182.
41. Chua K, Laurent F, Coombs G, Grayson ML, Howden BP. Antimicrobial

68
 resistance: Not community-associated methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (CA-MRSA)! A clinician’s guide to community MRSA - its evolving
antimicrobial resistance and implications for therapy. Clin Infect Dis 52: 99-111,
2011.
42. Chung M, de Lencastre H, Matthews P, Tomasz A, Adamsson I, Aires de Sousa
M, et al. Molecular typing of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus by
pulsed-field gel electrophoresis: comparison of results obtained in a
multilaboratory effort using identical protocols and MRSA strains. Microb Drug
Resist 6: 189-198, 2000.
43. CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing. 26th ed. CLSI supplement M100S, 2016.
44. Coutinho VLS, Paiva RM, Reiter KC, de-Paris F, Barth AL, Mombach AB,
Machado P. Distribution of erm genes and low prevalence of inducible
resistance to clindamycin among staphylococci isolates. Braz J Infect Dis 14:
564-568, 2010.
45. Couto RC, Pedrosa TM, Nogueira JM. Infecção hospitalar e outras
complicações não infecciosas da doença: Epidemiologia, Controle e
Tratamento. 3 ed. Medsi. Rio de Janeiro, 2003.
46. Cursino MA, Garcia CP, Lobo RD, Salomão MC, Gobara SG, Raymundo GF, et
al. Performance of surveillance cultures at different body sites to identify
asymptomatic Staphylococcus aureus carriers. Diagn Microbiol Infect Dis
74:343-348, 2012. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2012.08.006.
47. D'Agata EMC, Webb GF, Horn MA, Moellering RC Jr, Ruan S. Modeling the
Invasion of Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
into Hospitals. Clin Infect Dis 48(3): 274-84, 2009.
48. Damaceno Q, Nicoli JR, Oliveira A. Variability of cutaneous and nasal
population levels between patients colonized and infected by multidrug-resistant
bactéria in two Brazilian intensive care units. SAGE Open Medicine, 2015. doi:
10.1177/2050312114566668
49. Darban-Sarokhalil D, Khoramrooz SS, Marashifard M, Hosseini SAAM,
Parhizgari N, Yazdanpanah M, Gharibpour F, Mirzaii M, Sharifi B, Haeili Mehri.
Molecular characterization of Staphylococcus aureus isolates from southwest of
Iran using spa and SCCmec typing methods. Microb Pathog 98: 88-92,
2016.doi: 10.1016/j.micpath.2016.07.003.

69
50. Dastgheyb SS, Otto M. Staphylococcal adaptation to diverse physiologic
niches : an overview of transcriptomic and phenotypic changes in different
biological environments. Fut Microbiol 10:1981–95, 2015.
51. David MZ, Daum RS. Community-Associated Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an
Emerging Epidemic. Clin Microbiol Rev 23(3): 616–687, 2010. doi:
10.1128/CMR.00081-09.
52. De Lencastre H, Oliveira D, Tomasz A. Antibiotic resistant Staphylococcus
aureus: a paradigma of adaptive power. Curr Opin Microbiol 10: 428-435, 2007.
53. Deurenberg RH, Vink C, Kalenic S, Friedrich AW, Bruggeman CA, Stobberingh
EE. The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin
Microbiol Infect 13(3): 222-235, 2007. doi:10.1111/j.1469-0691.2006.0173.x.
54. Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins of Staphylococcus aureus.
Clin Microbiol Rev 13(1): 16-34, 2000.
55. DSMZ. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. 2015.
Prokariotyc Nomenclature up-to-date. Genus: Staphylococcus. Available at:
https://www.dsmz.de/bacterial-diversity Acessed at: 27/07/2016.
56. Durmaz G, Sanci O, Oz Y, Guven K, Kiremitci A, Aksit F.Methicillin-resistant S.
aureus colonization in intensive care unit patients: Early identification and
molecular typing.J Infect Dev Ctries 10(5):465-471, 2016. doi:10.3855/jidc.6575
57. Ferreira AM, Andrade D, Almeida MTG, Cunha KC, Rigotti MA. Colchões do tipo
caixa de ovo: um reservatório de Staphylococcus aureus resistente à
meticilina? Rev Esc Enferm USP 45(1): 161-6, 2011.
58. Ferreira D, da Silva G, Cavalcante F, do Carmo F, Fernandes L, Moreira S, et
al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in HIV patients: Risk factors
associated with colonization and/or infection and methods for characterization
of isolates – a systematic review. Clinics 9: 770–776, 2014.
59. Fiebelkorn KR, Crawford SA, McElmeel ML, Jorgensen JH. Practical Disk
Diffusion Method for Detection of Inducible Clindamycin Resistance in
Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. J Clin Microbiol
41(10): 4740-4744, 2003. doi: 10.1128/JCM.41.10.4740.
60. Figueiredo-Andrade M; Balbino TC. Clonal diversity and epidemiological
characteristics of Staphylococcus aureus: high prevalence of oxacillin-
susceptible mecA-positive Staphylococcus aureus (OS-MRSA) associated with

70
 clinical isolates in Brazil. BMC Microbiol 72:341-352, 2016. doi:
10.1186/s12866-016-0733-4.
61. File TM, Wilcox MH, Stein GE. Summary of Ceftaroline Fosamil Clinical Trial
Studies and Clinical Safety. Clin Infect Dis 3(55): 173-180, 2012. doi:
10.1093/cid/cis559.
62. Fitzgerald SF, O’Gorman J, Morris-Downes MM, Mishali H, Bukholm G. A 12-
year review of Staphylococcus aureus bloodstream infections in haemodialysis
patients: more work to be done. J Hosp Infect 79: 218-211, 2011.
63. Fouda R, Soliman MS, ElAnany MG, Abadeer M, Soliman G. Prevalence and
risk factors of MRSA, ESBL and MDR bacterial colonization upon admission to
an Egyptian medical ICU. J Infect Dev Ctries 10(4):329-336, 2016.
doi:10.3855/jidc.6798
64. Gacouin A, Barbarot N, Camus C, Salomon S, Isslame S, Marque S, et al. Late-
Onset Ventilator-Associated Pneumonia in Nontrauma Intensive Care Unit
Patients. Anest Analg 109(5): 1584 - 90, 2009.
65. Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC, Hughes JM. CDC definitions for
nosocomial infections. Am J Infect Control 16(3): 128-40, 1998.
66. Gelatti LC, Sukiennik T, Becker AP, Inoue FM, do Carmo MS, Castrucci FMS,
Pignatari AC, Ribeiro LC, Bonamigo RR, d'Azevedo PA. Sepse por
Staphylococcus aureus resistente à meticilina adquirida na comunidade no sul
do Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 42(4): 458-460, 2009.
67. Geofrey A, Abade A, Aboud S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) colonization among Intensive Care Unit (ICU) patients and health care
workers at Muhimbili national hospital, Dar Es Salaam, Tanzania, 2012.Pan Afr
Med J 21:211, 2015. doi:10.11604/pamj.2015.21.211.4207
68. Gerba CP, Pepper IL. Domestic and Indoor Microbiology. In: Maier R, Pepper I,
Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. San Diego. 2009.
69. Glaser P, Martins-Simões P, Villain A, Barbier M, Tristan A, Bouchier C, et al.
Demography and intercontinental spread of the USA300 community-acquired
methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineage. MBio 7: 1–11, 2016.
70. Gould IM. Clinical activity of anti-Gram-positive agents against methicillin-
resistant Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 66(4): 17–21, 2011.
doi:10.1093/jac/dkr073.
71. Grau Cerrato S, Álvarez Lerma F. Farmacoeconomía de la infección en la

71
 Unidad de Cuidados Intensivos. Rev Esp Quimioter 21(NE 1): 26-34, 2008.
72. Guzmán-Blanco M, Mejia C, Isturiz R, Alvarez C, Bavestrello L, Gotuzzo E. et
al. Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Latin
America. Int J Antimicrob Agents 34: 304–308, 2009. doi:
10.1016/j.ijantimicag.2009.06.005
73. Hanratty J, Changez H, Smith A, Wales C. Panton-Valentine Leukocidin Positive
Staphyloccal aureus Infections of the Head and Neck: Case Series and Brief
Review of Literature. J Oral Maxillofac Surg 73(4): 666-670, 2015. doi:
10.1016/j.joms.2014.10.004.
74. Hatkar S, Bansal V, Mariya S, Ghogare H. Antimicrobial Profile of Inducible
Clindamycin Resistant Strains of Staphylococcus aureus Isolated from Clinical
Samples. Int J Health Sci Res 4(6): 99-103, 2014.
75. Hiramatsu K, Katayama Y, Yuzawa H, Ito T. Molecular genetics of methicillin-
resistant Staphylococcus aureus. Int J Med Microbiol 292: 67-74, 1997.
doi:10.1078/1438-4221-00192.
76. Ho J, Boost MV, O’Donoghue MM. Tracking sources of Staphylococcus aureus
hand contamination in food handlers by spa typing. Am J Infect Control 43:
759–761, 2015.
77. Holden MTG, Feil EJ, Lindsay JA, Peacock SJ, Day NPJ, Enright MC, et al.
Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for
the rapid evolution of virulence and drug resistance. Proc Natl Acad Sci USA
101(26): 9786-9791, 2004. doi: 10.1073/pnas.0402521101.
78. Holtfreter S, Grumann D, Schmudde M, Nguyen T, Eichler P, Strommenger B,
Kopron K, Kolata J, Giedrys-Kalemba S, Steinmetz I, Witte W, Bröker BM.
Clonal Distribution of Superantigen Genes in Clinical Staphylococcus aureus
Isolates. Clin Infect Dis 45(8): 2669-2680, 2007.
79. Howden B P, Davies J K, Johnson PDR, Stinear T P, Grayson ML. Reduced
vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus, including vancomycin
intermediate and heterogeneous vancomycin intermediate strains: resistance
mechanisms, laboratory detection, and clinical implications. Clin Microbiol Rev
23(1):99-139, 2010.
80. Huang P, Pichon B, Gao S, Ribner BA, Cosgrove AS, Black SR. The impact of
hospital-acquired infections with multidrug-resistant bacteria in an oncology
intensive care unit. Int J Infect Dis 31:32-36,2016.

72
81. Infocus. Getting Inside Healthcare-Associated Infections (HAIs). Infocus 7,
2008.
82. Ito T, Katayama Y, Asada K, Mori N, Tsutsumimoto K, Tiensasitorn C, Hiramatsu
K. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome
mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Antimicrob Agents Chemother 45(12): 3677, 2001.
83. Ito T, Katayama Y, Hiramatsu K. Cloning and Nucleotide Sequence
Determination of the Entire mec DNA of Pre-Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus N315. Antimicrob Agents Chemother 43: 1449-1458,
1999.
84. IWG-SCC. Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec
(SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrob
Agents Chemother 53: 4961–4967, 2009.
85. Jarraud S, Mougel C, Thioulouse J, Lina G, Meugnier H, Forey F, Nesme X,
Etienne J, Vandenesh. Relatioships between Staphylococcus aureus genetic
backgroung, virulence factors, agr groups (alleles), and human disease. Infect
Immun 70(2): 631-641, 2002.
86. Jiménez JN, Ocampo AM, Vanegas JM, Rodríguez EA, Garcés CG, Patiño LA,
Ospina S, Correa Mm. Characterisation of virulence genes is methicillin
susceptible and resistant Staphylococcus aureus isolates from a paediatric
population in a university hospital of Medellín, Colombia. Mem Inst Oswaldo
Cruz 106: 980-985, 2011.
87. Johnson JK, Khoie T, Shurland S, Kreisel K, Stine OC, Roghmann MC. Skin
and soft tissue infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus
USA300 clone. Emerg Infect Dis 13: 1195–1200, 2007. doi:
10.3201/eid1308.061575.
88. Judah G, Donachie P, Cobb E, Schmidt W, Holland M, Curtis V. Dirty hands:
bacteria of faecal origin on commuters’ hands. Epidemiol Infect 138:409–14,
2010.
89. Kao KC, Chen CB, Hu HC, Chang HC,Huang CC, MD, Huang YC. Risk Factors
of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection and Correlation With
Nasal Colonization Based on Molecular Genotyping in Medical Intensive Care
Units. Medicine 94(28): e1100, 2015.
90. Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. Genetic organization of the chromosome region

73
 surrounding mecA in clinical staphylococcal strains: role of IS431-mediated
mecl deletion in expression of resistance in mecA-carrying, low-level methicillin-
resistant Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother 45:
1955-1963, 2001. doi: 10.1128/ACC.45.7.1955-1963.2001
91. Klevens RM, Morrison MA, Nadle J. Invasive methicillin-resistant
Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA 298: 1763–1771,
2007.
92. Kloos WE. Taxonomy and systematics of staphylococci indigenous to humans.
In: The staphylococci in human disease. Churchill Livingstone. New York, 1997.
93. Kobayashi CCB, Sadoyama G, Vieira JDG. Determinação da resistência
antimicrobiana associada em isolados clínicos de Staphylococcus aureus e
Pseudomonas aeruginosa em um hospital público de Goiânia, Estado de
Goiás. RevSoc Bras Med Trop 42(4): 404-410, 2009.
94. Kobayashi SD, Malachowa N, Whitney AR, Braughton KR. Comparative
analysis of USA300 virulence determinants in a rabbit model of skin and soft
tissue infection. J Infect Dis 204(6): 937-41, 2011.
95. Kono M, Oda Y, Kitoh Y, Watanabe Y, Ando T, Kamide R, Ohnishi A. Molecular
epidemiology of Panton-Valentine leukocidin (PVL) – positive Staphylococcus
aureus associated with skin and soft tissue infection. Rinsho Byori 61: 659-664,
2013.
96. Krakauer T. Update on staphylococcal superantigen-induced signaling
pathways and therapeutic interventions. Toxins 5: 1629–54, 2013.
97. Kuroda M, Ohta T, Uchiyama I, Baba T, Yuzawa H, Kobayashi I, et al. Whole
genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet 357:
1225–1240, 2001.
98. Lamaro-Cardoso J, De Lencastre H, Kipnis A, Pimenta FC, Oliveira LSC,
Oliveira RM, Nouer SS, Aires de Souza M, Milheiriço C, Andrade ALS.
Molecular epidemiology and risk factors for nasal carriage of Staphylococcus
aureus and methicillin-resistant S. aureus in infants attending day care centers
in Brazil. J Clin Microbiol 47(12): 3991-3997, 2009. doi: 10.1128/JCM.01322-09.
99. Lappin F, Ferguson AJ. Gram-positive toxic shock syndromes. Lancet Infect Dis
9: 281-290, 2009.
100. Lavallé C, Rouleau D, Gaudreau C, Roger M, Tsimiklis V, Locas MC,Gagnon S,
Delorme J, Labbé AC. Performance of an agar dilution method and a Vitek 2

74
 card for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp. J
Clin Microbiol 48(4): 1354-7, 2010. doi: 10.1128/JCM.01751-09
101. Lina G, Piemont Y, Godail-Gamot F, Bes M, Peter MO, Gauduchon V,
Vandenesch F, Etienne J. Involvement of Panton-Valentine leukocidin-producing
Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis
29: 1128-1132, 1999.
102. Lindsay JA, Holden MTG. Understanding the rise of the superbug: investigation
of the evolution and genomic variation of Staphylococcus aureus. Funct Integr
Genomics 6(3): 186-201, 2005. doi: 10.1007/s10142-005-0019-7.
103. Linpinska U, Hermans K, Meulemans I, Dumitrescu O,Badiou C, Duchateau L,
Haesebrouck F,Etienne J,Lina G. Panton-Valentine leukocidin does play a role
in the early stage of Staphylococcus aureus skin infections: a rabbit model.
PloS One 6(8): e22864, 2011.doi: 10.1371/journal.pone.0022864.
104. Lisa RW, Plano MD. Staphylococcus aureus exfoliative toxins: How they cause
disease. J Invest Dermatol 122: 1070-1077, 2004.
105. Liu C, Graber CJ, Karr M, Diep BA, Basuino L, Schwartz BS, et al. A population-
based study of the incidence and molecular epidemiology of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus disease in San Francisco, 2004-2005. Clin Infect Dis
46(11): 1637-1646, 2008. doi: 10.1086/587893.
106. Löffler B, Hussain M, Grundmeier M, Bruck M, Holzinger D, Varga G, Roth J,
Kahl BC, Proctor RA, Peters G. Staphylococcus aureus Panton-Valentine
leukocidin is a very potent cytotoxic fator for human neutrophils. PLoS Pathog
6(1): e1000715, 2010.doi: 10.1371/jornal.ppat.1000715.
107. Low DE. Toxic Shock Syndrome Major Advances in Pathogenesis, But Not
Treatment. Crit Care Clin 29: 651–75, 2013.
108. Maeda T, Saga T, Miyazaki T, Kouyama Y, Harada S, Iwata M, Yoshizawa S,
Kimura S, Ishii Y, Urita Y, Sugimoto M, Yamaguchi K, Tateda K. Genotyping of
skin and soft tissue infection (SSTI)-associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) strains among outpatients in a teaching
hospital in Japan: Application of a phage-open reading frame typing (POT) kit. J
Infect Chemother 18(6): 906-914, 2012. doi:10.1007/s10156-012-0506-4.
109. Magiorakos AP, Srinivasan A, Carey RB, Carmeli Y, Falagas ME, Giske CG,
HarbarthS, Hindler JF, Kahlmeter G, Olsson-Liljequist B, Paterson DL, Rice LB,
Stelling J, Struelens MJ, Vatopoulos A, Weber JT, Monnet DL. Multidrug-

75
 resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an
international expert proposal for interim standard definitions for acquired
resistance. Clin Microbiol Infect 18: 268–281, 2012.
110. Mahida N, Boswell T. Non-slip socks: a potential reservoir for transmitting
multidrug-resistant organisms in hospital? J Hosp Infect, In Press, 2016. doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jhin.2016.06.018.
111. Majhi S, Dash M, Mohapatra D, Mohapatra A, Chayani N. Detection of inducible
and constitutive clindamycin resistance among Staphylococcus aureus isolates
in a tertiary care hospital, Eastern India. Avicenna J Med 6: 75-80, 2016. doi:
10.4103/2231-0770.184066.
112. Malachowa N, Deleo FR. Mobile genetic elements of Staphylococcus aureus.
Cell Mol Life Sci 67: 3057–3071, 2010.
113. Mayer R, Pepper I, Gerba C. Environmental Microbiology. Academic Press. San
Diego, 2009.
114. Mediavilla JR, Chen L, Mathema B, Kreiswirth BN. Global epidemiology of
community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA).
Curr Opin Microbiol 15(5): 595-588, 2012. doi: 10.1016/j.mib.2012.08.003
115. Mehrotra M, Wang G, Johnson WM. Multiplex PCR for detection of genes for
Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome
toxin 1, and methicillin resistance. J Clin Microbiol 38(3): 1032-1035, 2000.
116. Milheiriço C, Oliveira DC, de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy
for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob
Agents Chemother 51: 3374-3377, 2007.
117. Miller LG, Diep BA. Colonization, Fomites, and Virulence: Rethinking the
Pathogenesis of Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus
aureus Infection.Clin Infect Dis 46(5): 752-760, 2008. doi: 10.1086/526773.
118. Mimica MJ, Berezin EN, Damaceno N, Carvalho RB. SCCmec type IV, PVL-
negative, methicillin-resistant Staphylococcus aureus in cystic fribosis patients
from Brazil. Curr Microbiol 62(2): 388-390, 2011. doi: 10.1007/s00284-010-
9718-y.
119. Moreira ACM, Santos RR, Bedendo J. Prevalência e perfil de sensibilidade de
Staphylococcus aureus isolados em pacientes e equipe de enfermagem. Cienc
Cuid Saude 12(3): 572-579, 2013.
120. Moreira MR, Gontijo Filho PP. Relationship between antibiotic consumption,

76
 oropharyngeal colonization, and ventilator-associated pneumonia by
Staphylococcus aureus in an intensive care unit of a Brazilian teaching hospital.
Rev Soc Bras Med Trop 45(1): 106-111, 2012.
121. Moura JP, Pimenta FC, Hayashida M, Almeida ED, Canini SRMS, Gir E. A
colonização dos profissionais de enfermagem por Staphylococcus aureus. Rev
Latino- Am Enferm 19(2): 325-331, 2011.
122. Murakami K, Minamide W, Wada K, Nakamura E, Teraoka H, Watanabe S.
Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase
chain reaction. J Clin Microbiol 29: 2240-2244, 1991.
123. Murray PR, Rosenthal KS. Microbiologia Médica. 6 ed. Elsevier. Rio de Janeiro-
RJ, 2009.
124. Nikolaidis I, Favini-Stabile S, Dessen A. Resistance to antibiotics targeted to the
bacterial cell wall. Protein Sci 23: 243-259, 2014. doi: 10.1002/pro.2414.
125. Nunes RSC, Pires de Souza C, Pereira KS, Del Aguila EM, Paschoalin VMF.
Identification and molecular phylogeny of coagulase-negative staphylococci
isolates from Minas Frescal cheese in southeastern Brazil: Superantigenic toxin
production and antibiotic resistance. J Dairy Sci 99: 2641-2653, 2016. doi:
dx.doi.org/10.3168/jds.2015-9693
126. Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H. Secrets of success of a human
pathogen: molecular evolution of pandemic clones methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Lancet Infect Dis 2: 180-189, 2002.
127. Otter JA, French GL. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus
aureus strains as a cause of healthcare-associated infection. J Hosp Infect
79(3): 189-193, 2011. doi:10.1016/j.jhin.2011.04.028.
128. Otto M. Staphylococcus aureus toxins. Curr Opin Microbiol 17: 32–37, 2015.
129. Paramythiotou E, Souli M, Galani I, Giamarellou H. Sucess stories about severe
pneumonia caused by Panton-Valentine leucocidin-producing Staphylococcus
aureus. Braz J Infect Dis 18(3): 341-5, 2014.
130. Pardo L, Vola M, Macedo-Viñas M. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
in children treated in Uruguay. J Infect Dev Ctries 7: 010-016, 2013.
131. Peacock SJ, Moore CE, Justice A, Kantzanou MN, Story L, Mackie K, et al.
Virulent Combinations of Adhesin and Toxin Genes in Natural Populations of
Staphylococcus aureus. Infect Immun 70(9): 4887-4996, 2002. doi:
10.1128/IAI.70.9.4987.

77
132. Pinchuk IV, Beswick EJ, Reyes VE. Staphylococcal Enterotoxins. Toxins 2:
2177-2197, 2010. doi: 10.3390/toxins2082177.
133. Pires FV, Da Cunha MLRS, Abraão LM, Martins PYF, Camargo CH, Fortaleza
CMCB. Nasal carriage of Staphylococcus aureus in Botucatu, Brazil: A
population-based survey. PLoS One 9(3): 1-7, 2014. doi:
10.1371/jornal.pone.0092537.
134. Pittet, D. Infection control and quality heath care in the new millennium. Am J
Infect Control 33: 258-267, 2005.
135. Prabhu K, Rao S, Rao V. Inducible Clindamycin Resistance in
Staphylococcusaureus Isolated from Clinical Samples. J Lab Physicians 3(1):
25-27, 2011. doi: 10.4103/0974-2727.78558.
136. Prates KA, Torres AM, Garcia LB, Ogatta SFY, Cardoso CLC, Tognim MCB.
Nasal carriage of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in university
students. Bras J Infect Dis 14(2): 316-318, 2009.
137. Principato M, Qian BF. Staphylococcal enterotoxins in the Etiopathogenesis of
Mucosal Autoimmunity within the Gastrointestinal Tract. Toxins 6: 1471-1489,
2014. doi: 10.3390/toxins6051471.
138. Rahimi F, Katouli M, Karimi S. Biofilm production among methicillin resistant
Staphylococcus aureus strain isolated from catheterized patients with urinary
tract infection. Microbiol Pathog 98: 69-76, 2016. doi:
10.1016/j.micpath.2016.06.031
139. Rasigade JP, Vandenesch F. Staphylococcus aureus: A pathogen with still
unresolved issues. Infect Genet Evol 21: 510–514, 2014.
140. Reiter KC, Machado AB, Freitas AL, Barth AL. High prevalence of methicillin-
resistant Staphylococcus aureus with SCCmec type III in cystic fibrosis patients
in southern, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop 43(4): 377-381, 2010.
141. Renner JDP, Carvalho ED. Microrganismos isolados de superfícies da UTI
adulta em um hospital do Vale do Rio Pardo – RS. Rev Epidemiol Control Infect
3(2): 40-44, 2013.
142. Ribeiro J, Boyce JM, Zancanaro PQ. Prevalence of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) among patients visiting the emergency room at
a tertiary hospital in Brazil. Braz J Infect Dis 9(1): 52-55, 2005. doi:/S1413-
8670200500100009.
143. Ritchie DJ, Alexander BT, Finnegan PM. New antimicrobial agents for use in

78
 the Intensive Care Unit. Infect Dis Clin North Am 23(3): 665–81, 2009.
144. Rocha LA, Ribas RM, Darini ALC, Gontijo Filho PP.Relationship between nasal
colonization and ventilator-associated pneumoniaand the role of the
environment in transmission of Staphylococcus aureus in intensive care units.
Am J Infect Control 41: 1236-40, 2013.
145. Rodrigues MVP, Fortaleza CMCB, Souza CSM, Teixeira NB, Cunha MLRS.
Genetic Determinants of Methicillin Resistance and Virulence among
Staphylococcus aureus Isolates Recovered from Clinical and Surveillance
Cultures in a Brazilian Teaching Hospital. ISRN Microbiol 2012: 975143, 2012.
doi: 10.5402/2012/975143.
146. Rodríguez-Noriega E, Seas C. The changing pattern of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus clones in Latin America: implications for clinical practice
in the region. Braz J Infect Dis 14 Suppl 2: S87-S96, 2010.
147. Rosenthal CB, Mootz JM, Horswill AR. Staphylococcus aureus biofilm formation
and inhibition. In: Rumbaugh KP, Ahmad I. Antibiofilm Agents. Springer. New
York, NY, 2014.
148. Rossi F. The challenges of antimicrobial resistance in Brazil. Clin Infect Dis 52:
1138–1143, 2011.
149. Sader HS, Flamm R, Jones RN. Antimicrobial activity of daptomycin tested
against Gram-positive pathogens collected in Europe, Latin America, and
selected countries in the Asia-Pacific Region. Diagn Microbiol Infect Dis 75(4):
417-22, 2013.
150. Sader HS, Mendes RE, Jones RN, Flamm RK. Antimicrobial susceptibily
patterns of community- and hospital-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus from United States Hospitals: results from AWARE
Ceftaroline Surveillance Program (2012-2014). Diagn Microbiol Infect Dis 86(1):
76-79, 2016. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2016.06.017.
151. Sakai Y, Qin L, Miura M, Masunaga K, Tanamachi C, Iwahashi J, Kida Y,
Takasu O, Sakamoto T, Watanabe H. Successful infection control for a
vancomycin intermediate Staphylococcus aureus outbreak in an advanced
emergency medical service centre. J Hosp Infect 92(4): 385-391, 2016. doi:
10.1016/j.jhin.2015.12.016.
152. Santos AL, Santos DO, Freitas CC, Ferreira BLA, Afonso IF, Rodrigues CR,
Castro HC. Staphylococcus aureus: visitando uma cepa de importância

79
 hospitalar. J Bras Patol Med Lab 43: 413-423, 2007.
153. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe R V, Widdowson MA, Roy SL,
Jones JL. Griffin PM. Foodborne illness acquired in the United States-Major
pathogens. Emerg Infect Dis 17(1): 7–15, 2011. doi: 10.3201/eid1701.P11101.
154. Schuenck RP, Nouér SA, Winter CO, Cavalcante FS, Scotti TD, Ferreira ALP,
et al. Polyclonal presence of non-multiresistant methicillin-resistant
Staphylococcus aureus isolates carrying SCCmec IV in health care-associated
infections in a hospital in Rio de Janeiro, Brazil. Diagn Microbiol Infect Dis 64:
434-441, 2009. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2009.04.007.
155. Seifi N, Kahani N, Askari E, Mahdipour S, Nasab Naderi M. Inducible
clindamycin resistance in Staphylococcus aureus isolates recovered from
Mashhad, Iran. Iran J Microbiol 4(2): 82-86, 2012.
156. Senna JP, Pinto CA, Mateos S, Quintana A, Santos DS. Spread of a dominant
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clone between Uruguayan
and South of Brazil Hospitals. J Hosp Infect 53: 156-7, 2003.
157. Sievert DM, Ricks P, Edwards JR, Schneider A, Patel J, Srinivasan A, Kallen A,
Limbago B, Fridkin S, National Healthcare Safety Network (NHSN) Team.
Antimicrobial-resistant pathogens associated with healthcare-associated
infections: summary of data reported to the National Healthcare Safety Network
at the Centers for Disease Control and Prevention, 2009-2010. Infect Control
Hosp Epidemiol 34:1–14, 2013.
158. Singh R, Ray P. Quorum sensing-mediated regulation of staphylococcal
virulence and antibiotic resistance. Future Microbiol 9: 669-81, 2014.
159. Sousa LU, Mielke TP, Horner R, Rodrigues MA, Santos SO, Martini R, Salla A.
Avaliação de metodologias para a detecção de cepas de Staphylococcus
aureus resistentes à meticilina (MRSA) e análise do perfil de sensibilidade
frente aos antimicrobianos em um hospital terciário. Saúde 37(1): 23-30, 2011.
160. Souza MV, Reis C, Pimenta FC. Revisão Sobre Aquisição Gradual de
Resistência de Staphylococcus aureus aos Antimicrobianos. Rev Pat Trop 34:
27-36, 2005.
161. Souza RR, Coelho LR, Botelho AMN, Ribeiro A, Rito PN, Vieira VV, et al.
Biofilm formation and prevalence of lukF-pv, seb, sec and tst genes among
hospital and community-acquired isolates of some international methicillin-
resistant Staphylococcusaureus lineages. Clin Microbiol Infect 15(2): 203-207,

80
 2009. doi: 10.1111/j.1469-0691.2008.02118.x.
162. Sowndarya V,Palraj KK, Kopula SS, Sekar UMA.Carriage of Multidrug Resistant
Bacteria on Frequently Contacted Surfaces and Hands of Health Care
Workers.J Clin Diag Res 10(5): DC18-DC20, 2016.
doi:10.7860/JCDR/2016/19692.7772.
163. Stepanovic S, Cirkovic I, Djukic S, Vukovic D, Svabic-Vlahovic M. Public
transport as a reservoir of methicillin-resistant staphylococci. Lett Appl Microbiol
47(4): 339-341, 2008. doi: 10.1111/j,1472-765X.2008.02436.x.
164. Tang J, Tang C, Chen J, Du Y, Yang X, Wang C, et al. Phenotypic
characterization and prevalence of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus
isolates from outbreaks of illness in Chengdu City. Foodborne Pathog Dis
8:1317–20, 2011.
165. Tavares, W. Bactérias Gram-Positivas: Resistência do estafilococo, do
enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Rev Soc Bras Med Trop
33(3): 281-301, 2000.
166. Teixeira LA, Resende CA, Ormonde LR, Rosenbaum R, Figueiredo MAS,
Lencastre H, Tomasz A. Geographic spread of epidemic multiresistant
Staphylococcus aureus clone in Brazil. J Clin Microbiol 33: 2400 - 2404 1995.
167. Thurlow LR, Joshi GS, Richardson A. Virulence Strategies of the Dominant
USA300 Lineage of Community Associated Methicillin Resistant
Staphylococcus aureus (CA-MRSA). FEMS Immunol Med Microbiol 65: 5–22,
2012.
168. Tong SYC, Davis JS, Eichenberger E, Holland TL, Fowler VG. Staphylococcus
aureus infections: Epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and
management. Clin Microbiol Rev 28: 603–61, 2015.
169. Vandenesch F, Lina G, Henry T. Staphylococcus aureus hemolysins, bi-
component leukocidins, and cytolytic peptides: a redundant arsenal of
membrane-damaging virulence factors? Front Cell Infect Microbiol 2: 1-15,
2012.
170. Vieira MA, Minamisava R, Pessoa-Júnior V, Lamaro-Cardoso J, Ternes YM,
Andre MCP, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus nasal carriage in
neonates and children attending a pediatric outpatient clinics in Brazil. Braz J
Infect Dis 18: 42–7, 2014.
171. Von Graevenitz A. The role of opportunistic bacteria in human disease. Ann Rev

81
 Microbiol 31: 447-471, 1977. doi: 10.1146/annurev.mi.31.100177.002311.
172. Wang W, Chiueh T, Sun J, Tsao S, Lu J. Molecular Typing and Phenotype
Chatacterization of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates from
Blood in Taiwan. Plos One 7: 1 e 30394, 2012. doi:
10.1371/jornal.pone.0030394.
173. Wertheim HFL, Melles DC, Vos MC, et al. The role of nasal carriage in
Staphylococcus aureus infections. Lancet Infect Dis 5(12): 751-762, 2005. doi:
10.1016/S1473-3099(05)70295-4.
174. WHO. World Health Organization. Prevention of hospital-acquired infections.A
practical guide. 2nd ed. WHO/CDS/CSR/EPH/2002.12, 2002.
175. Winn Jr. W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P,
Woods G. Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology.
6thed. Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, 2006.
176. Xie Y, He Y, Gehring A, Hu Y, Li Q, Tu SI, et al. Genotypes and toxin gene
profiles of Staphylococcus aureus clinical isolates from China. PLoS One 6:
e2876, 2011.
177. Hait J, Tallent S, Melka D, Keys C, Bennett R. Prevalence of enterotoxins and
toxin gene profiles of Staphylococcus aureus isolates recovered from a bakery
involved in a second staphylococcal food poisoning occurrence. J Appl
Microbiol 117: 866–75, 2014.
178. Yamaguchi T, Okamura S, Miura Y, Koyama S, Yanagisawa H, Matsumoto T.
Molecular Characterization of Community-Associated Methicillin-Resistant
Staphylococcus aureus Isolated from Skin and Pus Samples of Outpatients in
Japan. Microb Drug Resist 21(4): 441-447, 2015. doi:10.1089/mdr.2014.0153.
179. Ylmaz G, Aydin K, Iskender S, Caylan R, Koksal I. Detection and prevalence of
inducible clindamycin resistance in staphylococci. J Med Microbiol 56(3): 342-
345, 2007. doi: 10.1099/jmm.0.46761-0.
180. Zarpellon MN, Gales AC, Sasaki AL, Selhorst GJ, Menegucci TC, Cardoso CL,
et al. Survival of vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus on hospital
surfaces. J Hosp Infect 90:347–350, 2015.

82
ANEXOS

83
Anexo 1– Parecer do Comitê de Ética

84
85
86
87