Dissertação Maio 2008

URI - CAMPUS ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE IN VITRO E EM

SALAME TIPO ITALIANO DO ÓLEO ESSENCIAL DE
MANJERICÃO (Ocimum basilicum L.)
ILOIR GAIO
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de

Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-Campus
de Erechim, como requisito parcial à obtenção do Grau
de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de
Concentração: Engenharia de Alimentos, da
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das
Missões – URI, Campus de Erechim.
ERECHIM, RS - BRASIL
MAIO DE 2008
i
ILOIR GAIO
Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de

Mestrado em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários à
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de Concentração:
Engenharia de Alimentos.
Comissão Julgadora:
____________________________________
Prof. Dr. Alexandre José Cichoski
Orientador
____________________________________
Prof. Dr. Rogério Luis Cansian
Orientador
____________________________________
Prof. Dr. Nelcindo Nascimento Terra
____________________________________
Profa. Dra. Geciane Toniazzo
Erechim, 09 de Maio de 2008
ii
NESTA PÁGINA DEVERÁ SER INCLUÍDA A FICHA CATALOGRÁFICA DA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. ESTA FICHA SERÁ ELABORADA DE ACORDO
COM OS PADRÕES DEFINIDOS PELO SETOR DE PROCESSOS TÉCNICOS DA
BIBLIOTECA DA URI – CAMPUS DE ERECHIM.
iii
Dedico este trabalho:
À minha amada esposa Elisandra (Ise) que
sempre esteve presente nesta jornada com
muito amor, carinho e paciência, dando-me
muito incentivo e apoio necessários para a
realização deste trabalho.
Aos meus pais Júlio (in memorian) e Maria
por todo amor, carinho e dedicação e por
vocês terem sido pessoas exemplares para
mim.
A todos aqueles que contribuíram para a
que esta etapa fosse cumprida.
iv
AGRADECIMENTOS
Aos professores Alexandre José Cichoski e Rogério Luis Cansian pelo estímulo
e orientação;
Aos professores do programa de mestrado José Vladimir de Oliveira, Marco Di

Luccio, Débora de Oliveira, Helen Treichel, Marcos e Fernanda Corazza, Cláudio
Dariva, Francine Padilha, pelos bons momentos compartilhados e pelos
ensinamentos;
Aos professores Altemir Mossi, Eunice Valduga, Geciane Toniazzo, Rogério

Dallago, Cláudio Augusto Zakrzevski, pelo auxílio, sugestões e colaborações
durante o desenvolvimento deste trabalho;
À Minha amada esposa Elisandra, pelo amor, incentivo e apoio;
Aos colegas de mestrado Gabriela, Jarbas, Renata, Joncimar, Luis Franken,

Bernardo, Nara, Adriana Sagioratto, Adriana Biasi, Marilucia, Cilda e Marcelo, pela
amizade, colaboração e principalmente pelos bons momentos vividos;
Aos colegas Lindomar Lerin, Viviane Astolfi, Jarbas Ferrari, Roberta Kruger,
Clarissa Dalla Rosa, Morgana Maloz, Gabriele Gaiki, Leandro Borges, André Colla e
Marcieli Peruzzolo, pelo auxílio e colaboração;
Ao pessoal de Central de Materiais Rositânia Frozza, Juliane Bernardi,

Leonardo Galião, Vera Lúcia Berto, Rogério Dellanora, Fernanda Morgan e
Madalena Bandiera, pelo apoio técnico para realização dos experimentos;
À Aline Petkowicz em agradecimento ao profissionalismo e atenção;
Aos bolsistas Annelise Candeia, Renata Ril, Mariane Zanella, Franciele de

Oliveira, Naira Carniel, pelo auxílio na realização da etapa experimental;
À Sacco Com. Imp. E Exp. De Alimentos Ltda. Campinas SP. - pelo

fornecimento das Culturas microbianas (starters);
À Kraki - Kienast & Kratschmer Ltda. São Paulo SP. – Pelo fornecimento dos
ingredientes e envoltórios;
À URI – Campus de Erechim pelo apoio na realização deste projeto.
v
À medida que nos aproximamos da verdade,
vamos encontrar muitas coisas que antes nos
iludiam e agora são simples ninharias,
obrigando-nos a modificar nossa escala
de valores.
Alberto A. Lohmann
vi
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Engenharia de
Alimentos como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de
Mestre em Engenharia de Alimentos.
ILOIR GAIO
Maio/2008
Orientadores: Alexandre José Cichoski
Rogério Luis Cansian
Este trabalho teve como objetivo a avaliação da atividade antimicrobiana e

antioxidante in vitro e em Salame Tipo Italiano do óleo essencial de manjericão
(Ocimum basilicum L.). A extração por hidrodestilação foi realizada através de um
extrator tipo Clevenger. A identificação dos compostos do óleo essencial foi feita por
CG/EM e os picos obtidos foram integrados de modo manual comparando-os com
os espectros existentes no banco de dados da biblioteca Willey do equipamento. A
atividade antimicrobiana in vitro foi avaliada preliminarmente através do método de
difusão em placas, posteriormente determinaram-se as concentrações inibitórias
mínimas (CIM) fundamentadas na densidade ótica. A atividade antioxidante in vitro
foi realizada através da captura de radicais livres com o teste de DPPH. Realizou-se
previamente uma análise sensorial empregando diferentes concentrações de óleo
essencial de manjericão em salame tipo italiano, com a finalidade de avaliar sua
vii
aceitação. Com as concentrações de óleo essencial de manjericão aceitas
sensorialmente (0,75, 0,38 e 0,19 mg g -1), elaborou-se o Salame Tipo Italiano
empregando-as, juntamente com outros dois tipos de salame onde um foi adicionado
de antioxidante comercial (Padrão) e o outro sem nenhum tipo de antioxidante
adicionado (Branco). Nestes cinco tipos de salames elaborados durante a etapa de
processamento (0, 2°, 7°, 14°, 21° e 28° dias) e após armazenamento de 30 dias a
22°C, realizou-se as análises de pH, atividade de água, umidade, acidez, TBARS,
bactérias lácticas e mesófilas, Micrococcaceae, Staphylococcus aureus e
Escherichia coli. Pelo método de extração utilizado obteve-se um rendimento de
1,2% (v/m) de óleo essencial de manjericão. Foram identificados como compostos
majoritários o linalol (71,01%), 1,8 cineol (8,27%), aromadendreno (6,73%) e trans
cariofileno (4,84%). Das 18 bactérias avaliadas preliminarmente em relação a
atividade antimicrobiana, o óleo essencial de manjericão não apresentou atividade
somente em relação a bactéria Pseudomonas aeruginosa. Para todas as bactérias
avaliadas a CIM variou entre 0,25 e 1,00 mg g -1, sendo que nas Gram positivas a
média foi de 0,75 mg g-1 e nas Gram negativas de 0,73 mg g -1. Na atividade
antioxidante in vitro encontrou-se um valor de IC50 de 12.003,93 µg mL-1, valor esse
semelhante ao encontrado em óleos essenciais de outras espécies, porém baixa em
relação a extratos vegetais. Concentrações acima de 0,75 mg g-1 de óleo essencial
de manjericão foram classificadas como muito e extremamente diferentes do padrão
em relação ao aroma e sabor. As concentrações de 0,75, 0,38 e 0,19 mg g-1do óleo
testadas na formulação de Salame Tipo Italiano não tiveram influência significativa
sobre os valores de pH, aw, umidade e acidez, assim como para as bactérias da
família Micrococaceae, bactérias lácticas e aeróbicas heterotróficas. O óleo
essencial de manjericão mostrou influência significativa na redução da população de
Staphylococcus aureus na concentração de 0,75 mg g-1, até o 14º dia de
processamento, enquanto que para à Escherichia coli houve diminuição no número
de células inoculadas após o sétimo dia em todos os tratamentos não sendo
possível avaliar a influência do óleo essencial.
viii
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial
fulfillment of the requirements for the Degree of Master in Food Engineering
ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES IN VITRO AND

DRY SAUSAGE OF Ocimum basilicum L. ESSENTIAL OIL
ILOIR GAIO
May/2008
Advisors: Alexandre José Cichoski
Rogério Luis Cansian
This work evaluates antimicrobial and antioxidant activity of the essential oil of
basil (Ocimum basilicum L.) in vitro and in Italian type sausage. The hydrodistillation
was carried out in a Clevenger apparatus. The volatile compounds were analyzed by
GC/MS, comparing the mass spectra with those from the database of Wiley library.
The in vitro antimicrobial activity was preliminarily evaluated by the method of
diffusion in plates, and were later determined by the minimum inhibitory
concentrations (MIC) based on the optical density. The in vitro antioxidant activity
was carried out by the capture of free radicals with the DPPH test. A sensorial
analysis was previously carried out using different basil essential oil concentrations in
Italian sausage formulation, with the purpose to evaluate its acceptance. The
concentrations of basil essential oil that passed the acceptance test in the sensorial
evaluation (0.75, 0.38 and 0.19 mg g -1) were used for assessment of antioxidant
activity in the Italian type sausage. Standard and control (blank) formulations were
also tested. In the standard product a commercial antioxidant was added, while in the
control no antioxidant was used in the formulation. The five types of sausages
elaborated were analyzed during the stage of processing or maturation (0, 2°, 7°,
ix
14°, 21° and 28° day), and after 30 days of storage at 22°C. The samples were
analyzed for pH, water activity, humidity, acidity, TBARS, lactic and heterotrophic
bacteria, Micrococcaceae, Staphylococcus aureus and Escherichia coli. An yield of
1.2% (v/w) of basil essential oil was obtained using the hydrodistillation. The major
compounds identified were linalool (71.01%), 1,8 cineole (8.27%), aromadendrene
(6.73%) and trans-caryophyllene (4.84%). Only Pseudomonas aeruginosa was not
influenced by the essential oil of basil from the 18 bacteria tested for antimicrobial
activity. The MIC varied between 0.25 and 1.00 mg g -1, for all the evaluated bacteria.
The Gram positive presented an average MIC of 0.75 mg.g -1, while for the Gram
negative the average MIC was 0.73 mg.g -1. In the in vitro antioxidant activity
experiments an IC50 of 12,003.93 µg.mL-1 was obtained. This result is similar to those
found for other essential oils. Concentrations of essential oil above 0.75 mg.g -1 were
classified as very and extremely different from the standard in relation to aroma and
flavor. The concentrations of 0.75, 0.38 and 0.19 mg.g -1 did not significantly (p<0.05)
influence the final values of pH, aw, humidity and acidity, as well as for the
Micrococaceae, lactic and heterotrophic bacteria. The essential oil of basil could
significantly reduce the population of Staphylococcus aureus until the 14th day of
processing, when the concentration of 0.75 mg g -1 was used in the formulation. For
Escherichia coli a reduction in the viable cell counting was detected in all
formulations, and therefore it was not possible to evaluate the influence of the
essential oil.
x
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................19
1.1.Referências Bibliográficas 22
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................24
2.1 Plantas Aromáticas, Medicinais e Condimentares 24
2.2 Metabólitos Secundários 25
2.2.1 Óleos Essenciais 26
2.3 Manjericão 29
2.4 Extração e Caracterização de Compostos de Matrizes Vegetais 30
2.5 Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais 34
2.5.1 Métodos de Avaliação da Atividade Antimicrobiana 35
2.5.1.1 Antibiograma em Meio Sólido 36
2.5.1.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) 37
2.6 Utilização de antimicrobianos Naturais em Alimentos 38

2.7 Atividade Antioxidante de Óleos Essenciais 39
2.8 Avaliação da Atividade Antioxidante em Alimentos 42
2.9 Utilização de Antioxidantes Naturais em Alimentos 45
2.10 Referências Bibliográficas 47
3 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................69
3.1 Material 69
3.1.1 Análises in vitro: 69
3.1.2 Análises no Produto: 69
3.2 Extração por Hidrodestilação 70
3.2.1 Aparato Experimental 70
3.2.2 Procedimento Experimental 70
3.3 Composição Química 71
3.4 Avaliação de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L. sobre a
Atividade Antimicrobiana e antioxidante in vitro 71
xi
3.4.1 Atividade Antimicrobiana 71
3.4.1.1 Difusão em Placas 71
3.4.1.2.Concentração Inibitória Mínima (CIM) 72

3.4.2 Atividade Antioxidante in vitro pela Captura de Radicais Livres com o Teste do Radical
Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) 73
3.5 Avaliação Sensorial 74
3.5.1 Preparo das Amostras 74
3.5.2 Análise Sensorial 76
3.5.3 Análise Estatística 77
3.6 Análises Físico-Químicas da Parte Interna do Salame Tipo Italiano 77
3.6.1 Determinação de pH 78
3.6.2 Determinação de Atividade de Água (aw) 78
3.6.3 Determinação do Teor de Umidade 78
3.6.4 Determinação da Acidez 78
3.7 Avaliação da Atividade Antioxidante e Antimicrobiana de Diferentes Concentrações do Óleo
Essencial de Ocimum basilicum L. Sobre a Parte Interna do Salame Tipo Italiano 79
3.7.1 Análise da Atividade Antioxidante 79
3.7.2 Análise de Bactérias Lácticas, Bactérias da Família Micrococaceae e Bactérias Aeróbicas
Heterotróficas 80
3.7.3 Análise de Staphylococcus aureus e Escherichia coli Previamente Inoculados no Salame
Tipo Italiano 80
3.8 Análises Estatísticas 81
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................84
4.1 Extração e Análise da Composição Química do Óleo Essencial de Manjericão (Ocimum
basilicum L.) Obtido por Hidrodestilação 84
4.2 Atividade Antimicrobiana e Antioxidante in vitro 86
4.2.1 Atividade Antimicrobiana in vitro pelo Método de Difusão em Placas 86
4.2.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) 89
4.2.3 Atividade Antioxidante in vitro pela captura de radicais livres com o teste do Radical
Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) 93
4.3 Avaliação Sensorial 96
4.4 Análises Físico-químicas 99
4.4.1 pH 99
4.4.2 Atividade de Água (aw) 102
4.4.3 Umidade 104
4.4.4 Acidez 106
4.5 Efeito de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L. frente à
Atividade Antioxidante e Antimicrobiana Sobre a Parte Interna do Salame Tipo Italiano 109
4.5.1 Efeito de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L. sobre a
Atividade Antioxidante Analisada pelo Índice de TBARS em Salame Tipo Italiano. 109
xii
4.5.2 Efeito de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L. sobre a
flora natural de Bactérias da Família Micrococaceae em Salame Tipo Italiano. 112
4.5.3 Efeito de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L. sobre
Bactérias Láticas em Salame Tipo Italiano. 115
Bactérias Aeróbias Heterotróficas em Salame Tipo Italiano. 118
Staphylococcus aureus Previamente Inoculado em Salame Tipo Italiano. 120
Escherichia coli Previamente Inoculada em Salame Tipo Italiano. 123
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES...........................................................................134
5.1 CONCLUSÕES 134
5.2 SUGESTÕES 137
APÊNDICE A.............................................................................................................138
APÊNDICE B.............................................................................................................139
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Curva de Extração do óleo essencial de Ocimum basilicum L. obtido pelo

método de Hidrodestilação.........................................................................................84
Figura 02 – Cromatograma obtido para o óleo essencial de Ocimum basilicum L.
pela análise de CG-EM...............................................................................................86
Figura 03 – Gráfico representativo da determinação da concentração inibitória
mínima do óleo essencial de manjericão sobre Staphylococcus epidermidis (A) e
sobre Escherichia coli (B)............................................................................................90
Figura 04: Curva de calibração da atividade antioxidante do óleo essencial de
manjericão (Ocimum basilcum L.)...............................................................................95
Figura 05 – Valores de pH na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo
diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão durante o período de 28
dias dentro da câmara de processamento e após 30 dias de estocagem a
temperatura de 22°C.................................................................................................101
Figura 06 - Valores de aw na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo
diferentes concentrações de óleo essencial de manjericaão durante o período de 28
temperatura de 22°C.................................................................................................104
Figura 07 - Valores de Umidade (%) na parte interna do Salame Tipo Italiano
contendo diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão durante o
período de 28 dias dentro da câmara de processamento e após 30 dias de
estocagem a temperatura de 22°C...........................................................................106
Figura 08 - Valores de acidez (mg kg -1) na parte interna do Salame Tipo Italiano
Figura 09 - Valores de TBARS (mg de Malonaldeido/kg de amostra) na parte interna
do Salame Tipo Italiano contendo diferentes concentrações de óleo essencial de
xiv
manjericão durante o período de 28 dias dentro da câmara de processamento e
após 30 dias de estocagem a temperatura de 22°C................................................112
Figura 10 - Contagem de bactérias da Família das Micrococaceae em Salame Tipo
Italiano com diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em sua
formulação durante o período de 28 dias dentro da câmara de processamento e
após 30 dias de estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em
Log10 UFC g-1.............................................................................................................114
Figura 11 - Contagem de bactérias Lácticas em Salame Tipo Italiano com diferentes
concentrações de óleo essencial de manjericão em sua formulação durante o
estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em Log 10 UFC g-1..118
Figura 12 - Contagem de bactérias Aeróbicas Heterotróficas em Salame Tipo Italiano
diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em sua formulação
durante o período de 28 dias dentro da câmara de processamento e após 30 dias de
estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em Log 10 UFC g-1...120
Figura 13 – Análise do comportamento de Staphylococcus aureus em Salame Tipo
Italiano com diferentes concentrações óleo essencial de manjericão em sua
após 30 dias em estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em
Log10 UFC g-1.............................................................................................................122
Figura 14 – Análise do comportamento de Escherichia coli em Salame Tipo Italiano
com diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em sua formulação
durante o período de 28 dias dentro da câmara de processamento e após 30 dias
em estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em Log 10 UFC g-1.
124
Figura A01 – Modelo de ficha de avaliação sensorial para teste de diferença do
controle......................................................................................................................138
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Compostos químicos selecionados, após análise do cromatograma do

óleo essencial de Ocimum basilicum L. analisado por Cromatografia Gasosa e
Espectrometria de Massas..........................................................................................85
Tabela 02a - Atividade Antimicrobiana do óleo essencial de Ocimum basilicum L. e
do cloranfenicol sobre as bactérias Gram-positivas obtidas pelo método de difusão
em placas....................................................................................................................87
Tabela 02b - Atividade Antimicrobiana o óleo essencial de Ocimum basilicum L. e do
cloranfenicol sobre as bactérias Gram-negativas obtidas pelo método de difusão em
placas..........................................................................................................................88
Tabela 03a - Atividade Antimicrobiana avaliada pelo método da concentração
inibitória mínima do óleo essencial de Ocimum basilicum L. sobre bactérias Gram-
positivas.......................................................................................................................91
Tabela 03b - Atividade Antimicrobiana avaliada pelo método da concentração
negativas.....................................................................................................................92
Tabela 04 - Porcentagem da neutralização do DPPH sobre óleo essencial de
manjericão (Ocimum basilicum L.)..............................................................................94
Tabela 05 - Média de pontuação dos provadores para os atributos sabor, cor e
aroma das amostras de Salame Tipo Italiano com diferentes concentrações de óleo
essencial de manjericão e para o salame não contendo nenhum agente antioxidante
(branco).......................................................................................................................97
essencial de manjericão e para o salame sucedâneo ao comercial (padrão)...........98
Tabela 08 - Valores de aw na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo
temperatura de 22°C.................................................................................................102
xvi
Tabela 09 - Valores de Umidade (%) na parte interna do Salame Tipo Italiano
Tabela 10 - Valores de acidez (mg kg -1) na parte interna do Salame Tipo Italiano
Tabela 11 - Valores de TBARS (mg de Malonaldeido/kg de amostra) na parte interna
após 30 dias de estocagem a temperatura de 22°C...............................................110
Tabela 12 - Desenvolvimento de bactérias da família das Micrococaceae em Salame
Tipo Italiano com diferentes concentrações óleo essencial de manjericão em sua
Log10 UFC g-1.............................................................................................................113
Tabela 13 - Desenvolvimento de bactérias Láticas em Salame Tipo Italiano com
estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em Log 10 UFC g-1...116
Tabela 14 - Desenvolvimento de bactérias Aeróbicas Heterotróficas em Salame Tipo
Log10 UFC g-1.............................................................................................................119
Tabela 15 – Análise do comportamento de Staphylococcus aureus em Salame Tipo
Log10 UFC g-1.............................................................................................................121
xvii
Tabela 16 – Análise do comportamento de Escherichia coli em Salame Tipo Italiano
durante o período de 28 dias dentro da câmara em processamento e após 30 dias
123
Tabela B01 – Análise de variância para diferentes concentrações de óleo essencial
de manjericão em salame tipo Italiano frente ao branco..........................................139
Tabela B02 – Análise de variância para diferentes concentrações de óleo essencial
de manjericão em salame tipo Italiano frente ao Padrão.........................................140
xviii
Capítulo 1 - Introdução
1. INTRODUÇÃO
Com o desenvolvimento da sociedade nas últimas décadas, e a mudança de

hábitos alimentares e ambientais, estabeleceu-se uma nova relação da população
com os alimentos. Neste contexto os consumidores procuram nos alimentos, uma
vida mais saudável e um meio de evitar doenças.
A carne é um dos alimentos mais importantes na dieta humana, não apenas

como fonte de proteína de alta qualidade, mas também de minerais e todas as
vitaminas do complexo B. Neste sentido tem merecido especial atenção pelo seu
valor nutritivo, e principalmente em relação à conservação de suas propriedades
funcionais, a fim de garantir um produto final de boa qualidade para os
consumidores e rentabilidade para a indústria cárnea (PADILHA et al., 2007).
Um dos maiores desafios para a indústria de carnes é oferecer produtos

macios, suculentos e com cor e sabor agradáveis e que estas características de
frescor mantenham-se estáveis durante toda a sua vida-de-prateleira, com maior
segurança e menor custo possível.
Os alimentos cárneos, devido a sua riqueza de umidade, proteínas, gorduras

e outros nutrientes, são produtos bastante susceptíveis a alterações de ordem físico-
química e microbiológica. Entre estas alterações, a oxidação lipídica e a oxidação de
cor são difíceis de ser controladas devido a sua complexidade e variabilidade
podendo ser potencializada pela ação de microrganismos. Os lipídios são
importantes componentes dos produtos cárneos, conferindo características
desejáveis de suculência, sabor, aroma, valor nutricional e propriedades
tecnológicas. Contudo, os mesmos são facilmente oxidáveis, levando a rancificação,
com a produção de substâncias indesejáveis comprometendo a qualidade e a vida
útil dos produtos (OLIVO, 2005). A complexidade do processamento dos produtos
cárneos, e a necessidade de aumentar o período de armazenamento, tornam o
produto muito vulnerável à deterioração (ARAUJO, 1999). Logo, a utilização de
agentes capazes de oferecerem proteção contra tais alterações torna-se obrigatória.
Os antioxidantes naturais apresentam-se como alternativa para prevenir a
deterioração oxidativa dos alimentos, minimizando assim os danos que esses
19
compostos oxidados causariam nos seres humanos. Desde os anos 80 o emprego

de antioxidantes sintéticos na indústria de alimentos tem sido alvo de
questionamentos quanto a sua inocuidade. Devido a este questionamento,
pesquisas encontram-se voltadas para a busca de compostos naturais que exibam
esta propriedade funcional (MELO & GUERRA, 2002). Desta forma os antioxidantes
naturais passaram a ser considerados como objeto de estudos na busca por
padrões, para combater ou retardar as alterações oxidativas em produtos cárneos.
De forma semelhante, pesquisas da atividade antimicrobiana, modo de ação e

uso potencial de plantas tem ganho importância. Atualmente, a avaliação de
propriedades antimicrobianas de óleos essenciais abrange uma grande variedade de
microrganismos contra os quais têm sido testados, incluindo microrganismos
deteriorantes de alimentos (ZAIKA et al., 1983; CONNOR & BEUCHAT, 1984;
JANSSEN et al., 1988; OUATTARA et al. 1997) e microrganismos produtores de
toxinas alimentares (BEUCHAT, 1976; THARIB et al., 1983; DEANS & RITCHIE ,
1987; LIS-BALCHIN & DEANS, 1997). Os condimentos usados, principalmente para
tornar os alimentos mais agradáveis ao paladar, apresentam ação conservadora por
inibirem ou retardarem a atividade microbiana, bem como por retardarem a
autoxidação dos gorduras. Estima-se que pelo menos a metade do total de
condimentos utilizados pelas indústrias nos Estados Unidos se dá pela indústria de
produtos cárneos (SHARMA et al., 1981; OLIVEIRA, 1991).
Os condimentos apresentam-se como uma fonte promissora de agentes

antimicrobianos, para serem utilizados em produtos cárneos visando assegurar um
produto final de melhor qualidade microbiológica, e conseqüente aumento da vida-
de-prateleira.
Embora os óleos essenciais sejam bastante estudados, o seu uso em

alimentos como substâncias antimicrobianas é bastante limitado devido as possíveis
alterações que promovem nos sabores, pois doses eficazes contra microrganismos
podem mudar a aceitabilidade do produto. Como conseqüência, há uma demanda
crescente para conhecer as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) dos óleos
essenciais, e com isso obter um balanço entre a eficácia como agente
antimicrobiano e a aceitabilidade sensorial (KOUTSOUMANIS et al.,1998).
20
Vários estudos abordam a capacidade que os óleos essenciais apresentam

em agir como agentes antioxidantes e antimicrobianos, porém, há poucos estudos
realizados relatando a aplicação de óleos em alimentos, visando a obtenção da
atividade antioxidante e antimicrobiana.
Estudos relacionados á atividade antioxidante e antimicrobiana do óleo

essencial de manjericão em alimentos são escassos na literatura, no entanto, este
assunto tem despertado enorme interesse a nível industrial e comercial.
Face à relevância de estudos relacionados à obtenção de produtos

alimentícios seguros e saudáveis, dando ênfase a utilização de conservantes e
aditivos naturais, o presente trabalho teve como objetivo a avaliação da atividade
antimicrobiana e antioxidante primeiramente in vitro e, posteriormente em Salame
Tipo Italiano do óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum L).
Para alcançar este objetivo foi realizada a extração e caracterização do óleo

essencial; determinação das atividades antimicrobianas e antioxidante in vitro;
análise sensorial para definição das concentrações a serem utilizadas; análises
físico-químicas, microbiológicas e antioxiadantes no produto, com as diferentes
concentrações determinadas do óleo essencial.
21
1.1.Referências Bibliográficas
ARAUJO, M.A.J. Química dos Alimentos-Teoria e prática. 2.ed. – Viçosa: UFV.

1999, 416p.
BEUCHAT, L.R. Sensitivity of Vibrio parahaemolyticus to spices and organic acids.

Journal of Food Science, v. 41, p.899-902, 1976.
CONNOR, D.E.; BEUCHAT, L.R. Effects of essential oils from plants on growth of
food spoilage yeasts. Journal of Food Science, v.49, p.429-434,1984.
DEANS, S.G.; RITCHIE, G. Antibacterial properties of plant essential oils.

International Journal of Food Microbiology, v.5, p.165-180, 1987.
JANSSEN, M.A.; SCHEFFER, J.J.C.; PARHAN-VAN ATTEN, A.W.; SVENDEN, A.B.

Screening of some essential oils for their activities on dermatophytes.
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23
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plantas Aromáticas, Medicinais e Condimentares
Plantas aromáticas são aquelas que possuem aroma capaz de sensibilizar

nosso olfato de modo agradável. Plantas medicinais possuem princípio ativo que,
dependendo da concentração, podem possuir propriedades tóxicas ou curativas,
enquanto que as plantas condimentares são usadas como tempero para realçar o
sabor e o aspecto dos alimentos, podendo apresentar propriedade de conservação
(UPNMOOR, 2003).
Existem plantas que podem ser, ao mesmo tempo, aromáticas condimentares e

medicinais, e sua utilização é importante desde as primeiras civilizações (FURLAN,
1998). Povos da Grécia, Egito e Israel, costumavam utilizar estes vegetais em vários
procedimentos, tanto culinários como medicinais. No Brasil, o emprego destas
plantas está presente desde antes da colonização, quando os índios já utilizavam
ervas, passando pelos colonizadores e tornando-se amplamente utilizadas na
medicina caseira em forma de chás, xaropes e outros (MENDONÇA, 2004).
Atualmente, as propriedades antimicrobianas dos óleos essenciais das plantas

tem despertado interesse pela possibilidade de constituírem uma fonte alternativa
para as exigências dos consumidores quanto a utilização de aditivos naturais em
alimentos (TASSOU et al., 2000; MENDONÇA, 2004). No entanto, quando a
finalidade destes óleos é inibir o crescimento microbiano, as concentrações devem
ser maiores do que aquelas utilizadas para realçar o sabor e o aroma dos alimentos.
Shelef (1983) relata que a concentração para inibir o crescimento microbiano é de
1% a 5%, ao passo que para fins culinários é de 0,5% a 1%. Portanto, a
determinação da concentração ideal que promova simultaneamente efeito
antimicrobiano e realçador de sabor e aroma dos alimentos é primordial para
utilização de óleos essenciais de plantas, em substituição aos aditivos sintéticos.
2
24
4
2.2 Metabólitos Secundários
Os processos metabólicos relacionados às macromoléculas (carboidratos,

lipídios, proteínas e ácidos nucléicos) apresentam um elevado grau de similaridade
entre os organismos e são denominados metabólitos primários. Vegetais,
microrganismos e em menor escala os animais, entretanto, apresentam todo um
arsenal metabólico (enzimas, coenzimas e organelas) capazes de produzir,
transformar e acumular inúmeras outras substâncias não necessariamente
relacionadas de forma direta à manutenção da vida do organismo produtor. Nesse
grupo, encontram-se substâncias cuja produção e acumulação estão restritas a um
número limitado de organismos, com bioquímica e metabolismos específicos e
únicos, caracterizando-se como elementos de diferenciação e especialização
(SANTOS, 2004). Todo esse conjunto metabólico é definido como metabolismo
secundário, cujos produtos, embora não necessariamente essenciais para o
organismo produtor, garantem vantagem para sua sobrevivência e para a
perpetuação da sua espécie em seu ecossistema (CASTRO et al., 2004).
Uma característica importante dos metabólitos secundários é a inserção

desses em caminhos oxidativos, os quais protegem o metabolismo vegetal contra a
ação do oxigênio, que causa toxidez nas plantas. O oxigênio molecular liberado
passa por transformações, produzindo radicais livres que causam rompimento de
cromossomos, ruptura de proteínas, polissacarídeos e ácidos graxos. A captação
eficiente de radicais é condição fundamental para sobrevivência e manutenção da
estabilidade da célula. Estudos mostram que substâncias produzidas pelas
angiospermas, após um trauma provocado em suas folhas, produzem dois tipos de
antioxidantes: as fitoalexinas e os álcoois cinamílicos, formados pelo acoplamento
oxidativo das ligninas (CASTRO et al., 2004).
Durante muito tempo, os metabólitos secundários foram considerados como

produto de excreção vegetal. Atualmente, sabe-se que muitas dessas substâncias
estão diretamente envolvidas nos mecanismos que permitem a adequação do
produtor ao seu meio, sendo reconhecidas várias funções de substâncias
pertencentes a essa classe de metabólitos, como por exemplo, a defesa contra
2
25
5
herbívoros e microrganismos, proteção contra raios UV, atração de polinizadores ou

animais dispersores de sementes (SANTOS, 2004).
Os metabólitos secundários apresentam várias atividades biológicas. Muitos

são de importância comercial tanto na área farmacêutica, quanto nas áreas
alimentar, agronômica e de perfumaria, entre outras. Entre os metabólitos
secundários, os principais grupos de compostos encontrados com atividade
biológica são os alcalóides, flavonóides, cumarinas, taninos, quinonas e óleos
essenciais. A origem de todos esses metabólitos pode ser resumida a partir do
metabolismo da glicose, via dois intermediários principais:o ácido chiquímico e o
acetato. O ácido chiquímico origina os aminoácidos aromáticos, precursores da
maioria dos metabólitos secundários aromáticos, considerados responsáveis pelo
desenvolvimento do sabor. O álcool cinamílico, formado por esse caminho, é o
constituinte aromático da canela e da pimenta-da-jamaica, sendo transformado
enzimaticamente em eugenol, principal aroma e elemento pungente do cravo-da-
índia (FRANCO, 2003).
A biologia, farmacologia, tecnologia de alimentos e outras áreas têm se

interessado em buscar informações úteis para a correta utilização desses
compostos, que possuem distribuição e características químicas peculiares. Estudos
mostram que determinadas plantas podem variar a concentração de óleo dentro da
mesma espécie, influenciadas por fatores hereditários, que dizem respeito às
interferências quantitativas e qualitativas, e por fatores ontogênicos, como solo,
clima e microrganismos, entre outros (CARDOSO, 2001).
2.2.1 Óleos Essenciais
Os óleos essenciais são produtos voláteis do metabolismo secundário das plantas

aromáticas, formados em células especiais e encontrados em folhas, flores,
sementes, caules e raiz.
A ISO (International Standard Organization) define óleos essenciais como os

produtos obtidos de partes de plantas mediante destilação por arraste com vapor
2
26
6
d’água, bem como os produtos obtidos por expressão dos pericarpos de frutos
cítricos. De forma geral, são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas,
geralmente odoríferas e líquidas (SANTOS, 2004). Também podem ser chamados
de óleos voláteis, óleos etéreos ou essências, por serem de aparência oleosa à
temperatura ambiente. Entretanto, sua principal característica é a volatilidade,
diferindo, assim, dos óleos fixos, mistura de substâncias lipídicas, obtidos
geralmente de sementes. Outra característica importante é o aroma agradável e
intenso da maioria dos óleos essenciais, os quais, são solúveis em solventes
orgânicos apolares, apresentam solubilidade limitada em água, mas suficiente para
aromatizar as soluções aquosas, denominadas hidrolatos (SIMÕES et al., 2004).
São geralmente incolores ou ligeiramente amarelados; poucos são os óleos

que apresentam cor, como o óleo volátil de camomila, de coloração azulada, pelo
seu alto teor em azulenos; em geral, são muito instáveis, principalmente na
presença de ar, luz, calor, umidade e metais; a maioria dos óleos voláteis possui
índice de refração e são opticamente ativos, propriedades essas usadas na sua
identificação e controle da qualidade (SIMÕES et al., 2004; OUSSALAH, 2006).
Seus constituintes variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e
terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, éteres, óxidos, peróxidos, furanos,
ácidos orgânicos, lactonas e cumarinas, até compostos com enxofre. Na mistura,
tais compostos apresentam-se em diferentes concentrações; normalmente, um deles
é o composto majoritário, existindo outros em menores teores e alguns em
baixíssimas quantidades (traços) (SIMÕES et al., 2004).
Biologicamente, os óleos essenciais, por serem voláteis, atuam como sinais

de comunicação química com o reino vegetal e armas de defesa contra o reino
animal. Essa característica torna as plantas que os produzem poderosas fontes de
agentes biocidas sendo largamente estudadas na agricultura por apresentarem
atividades bactericidas, inseticidas e fungicidas (SAITO & SCRAMIN, 2000).
Muitas plantas são usadas com fins medicinais por conterem esses
compostos voláteis, mas, em muitos casos, o próprio óleo separado da planta é
usado como medicamento (ROBBERS, 1997). O uso de óleos essenciais em
alimentos vem ganhando importância por apresentarem componentes naturais,
2
27
7
evitando-se o uso de aditivos sintéticos, deteriorações, oxidações e o ataque de

microrganismos, apresentando eficiência nas funções antioxidantes, antiradicais e
antimicrobianas em alimentos (SACCHETTI et al., 2005; OUSSALAH, 2006).
Quimicamente, a maioria dos óleos essenciais é constituída de derivados

fenilpropanóides ou de terpenóides, preponderando esses últimos. Normalmente
apresentam um composto majoritário (CARDOSO, 2001). Os terpenóides constituem
uma grande variedade de substâncias vegetais, sendo esse termo empregado para
designar todas as substâncias cuja origem biossintética deriva de unidades do
isopreno (2-metil-1,3-butadieno). A unidade isoprênica, por sua vez, origina-se a
partir do ácido mevalônico. Os esqueletos carbonados dos terpenóides são
formados pela condensação de um número variável de unidades pentacarbonadas
(SIMÕES et al., 2004).
Os compostos terpênicos mais freqüentes nos óleos essenciais são os

monoterpenos (cerca de 90% dos óleos voláteis) e os sesquiterpenos (IKAN, 1991).
Os óleos essenciais são raramente encontrados em gimnospermas (exceto

coníferas). Em angiospermas monocotiledôneas, a ocorrência é relativamente rara,
com exceção de gramíneas e zingiberáceas. No entanto, plantas ricas em óleos
essenciais são abundantes em angiospermas dicotiledôneas, tais como nas famílias
Asteraceae, Apiaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Myristicaceae,
Piperaceae e Rutaceae, entre outras (SIMÕES et al., 2004).
Dependendo da família, os óleos essenciais podem ocorrer em estruturas

secretoras especializadas, tais como pêlos glandulares (Lamiaceae), células
parenquimáticas diferenciadas (Lauraceae, Piperaceae, Poaceae), canais oleíferos
(Apiaceae) ou em bolsas lisígenas ou esquizolisígenas (Pinaceae, Rutaceae). Os
óleos essenciais podem estar estocados em certos órgãos, tais como flores
(laranjeira, bergamoteira), folhas (capim-limão, eucalipto, louro) ou ainda nas cascas
dos caules (canelas), madeira (sândalo, pau-rosa), raízes, rizomas (cúrcuma,
gengibre), frutos (anis-estrelado, funcho, erva-doce) ou sementes (noz-moscada).
Embora todos os órgãos de uma planta possam acumular óleos essenciais, sua
composição pode variar segundo a localização (ROBBERS, 1997; OUSSALAH,
2006).
2
28
8
A temperatura, a umidade relativa, a duração total de exposição ao sol e o

regime de ventos exercem uma influência direta, sobretudo nas espécies que
possuem estruturas histológicas de estocagem de óleo essencial na superfície
(SALGADO, 2005).
2.3 Manjericão
O Manjericão (Ocimum basilicum L., Lamiaceae) é planta anual ou perene,

dependendo do local em que é cultivado. Nos Estados Unidos da América o cultivo é
de média escala e para fins culinários, ornamentais e extração de óleo essencial.
Essa espécie é comercialmente cultivada para utilização de suas folhas verdes e
aromáticas, usadas frescas ou secas como aromatizante ou tempero (BLANK et al.,
2004). Tradicionalmente, o manjericão tem sido usado como planta medicinal no
tratamento de dor de cabeça, tosse, diarréia, constipação, disfunções renais e
vermífugo (SIMON et al., 1999). Atualmente o óleo essencial extraído de folhas
verdes e flores são largamente empregados como aromatizante em alimentos, na
indústria farmacêutica e cosmética (SENATORE 1996, SIMON, et al.,1999;
JAVANMARDI et al. 2002;).
A importância do estudo dessas plantas não só está relacionada ao seu uso

como aromatizante e realçador das características organolépticas dos alimentos,
mas também na medicina e na preservação de alimentos devido as suas
propriedades antimicrobianas e antixiodantes (BOZIN et al., 2006).
Segundo Lawrence (1993), a produção mundial de óleo essencial de

manjericão em 1992 foi de 43 toneladas, equivalente a 2,8 milhões de dólares. Só os
EUA importaram em 1988, 1.806 toneladas de manjericão (folhas secas e óleo
essencial), equivalente a 2,5 milhões de dólares (SIMON, 1990). Esse valor
aumentou para 4.195 toneladas de matéria seca em 1996, equivalente a 5,5 milhões
de dólares (USDA, 1998).
A nomenclatura botânica correta para as espécies e variedades do gênero

Ocimum da família Lamiaceae, da qual o manjericão comercial está incluído, é de
2
29
9
grande interesse, uma vez que mais de sessenta espécies e formas tem sido
relatadas, sendo questionável a verdadeira identidade botânica do manjericão citado
em algumas literaturas. A dificuldade em classificar todas estas variedades de
Ocimum basilicum L. provavelmente se deve à ocorrência de polinização cruzada,
facilitando hibridações, resultando em grande número de subespécies, variedades e
formas (BLANK et al., 2004).
De acordo com o aroma, os manjericões podem ser classificados em doce,

limão, cinamato ou canela, cânfora, anis e cravo. Porém, para as características
morfológicas da planta o manjericão pode receber uma nomenclatura dependendo
do porte, formato da copa, tamanho e coloração da folhagem (SIMON, 1995;
PERRY, 1997). O conteúdo dos óleos essenciais pode caracterizar os manjericões
em tipo Europeu, Francês ou Doce; Egípcio, Reunião ou Comoro; Bulgário, Java ou
Cinamato de Metila e Eugenol, sendo o primeiro tipo que contém principalmente
linalol e metilchavicol. O óleo essencial pode ser extraído das folhas e ápices com
inflorescências através de hidrodestilações (SIMON, 1985; CHARLES & SIMON,
1990), sendo o óleo mais valorizado no mercado o de manjericão tipo Europeu
(SIMON et al.,1990), cujos principais constituintes são linalol (40,5 a 48,2%) e
metilchavicol (estragol) (28,9 a 31,6%) (FLEISHER, 1981; CHARLES & SIMON,
1990).
2.4 Extração e Caracterização de Compostos de Matrizes Vegetais
Os óleos voláteis podem ser obtidos através de diferentes processos. As

técnicas usuais são: a prensagem ou expressão para matérias primas ricas em
óleos voláteis e quando estão em tecidos periféricos como em casca de citros;
extração com solvente orgânico ou com gorduras (“enfleurage” ou enfloração) para
matérias-primas delicadas como pétalas de flores; extração com fluido supercrítico
(EFS) no caso de interesse em determinada fração de óleo e a destilação por
arraste de vapor para substâncias termorresistentes (GUENTHER, 1948;
DOMINGUEZ, 1973).
3
30
0
Usando diferentes técnicas extrativas é possível obter uma grande variedade

de produtos a partir de plantas medicinais e aromáticas. De acordo com Serafini et
al. (2001), três processos merecem atenção especial no que se refere à obtenção de
óleos em níveis laboratoriais: arraste a vapor, hidrodestilação e extração com fluidos
supercríticos. Geralmente em indústrias, as essências são extraídas por arraste a
vapor, e em escala laboratorial, por hidrodestilação das plantas ou parte das plantas
(folhas, flores, sementes e raízes).
O método de extração por arraste a vapor é um dos processos mais usados

no Brasil em nível industrial. A destilação por arraste de vapor de água se
caracteriza pela sua extrema simplicidade, onde o material a ser extraído, é
geralmente moído ou triturado, e colocado em um recipiente através do qual se faz
passar uma corrente de vapor de água, com ou sem pressão. Como os óleos
essenciais têm pressão de vapor mais elevada que a água, acabam sendo
arrastados pelo vapor de água e a mistura de vapores é conduzida a um
condensador, onde os compostos são recolhidos em um separador.
O princípio da hidrodestilação consiste em submergir o material vegetal

diretamente na água, onde após a ebulição os compostos voláteis existentes são
carregados até o condensador, onde são resfriados e separados na água. Em
escala laboratorial este processo ocorre em aparelho denominado Clevenger
(MECHKOVSKI & AKERELE, 1992).
Neste método pode-se medir o volume do óleo destilado e facilmente calcular

o conteúdo, expresso em teor de óleo essencial (%v/m). Sua maior importância
reside no fato de que as informações obtidas no processo servem de base para o
desenvolvimento do processo industrial de destilação por arraste a vapor. Por outro
lado, essa metodologia pode proporcionar degradação de alguns compostos
presentes no óleo essencial, visto que a matéria prima permanece em contato com a
água à elevada temperatura por longo período de tempo (SERAFINI et al., 2002).
A EFS (Extração por Fluído Supercrítico) é uma técnica de interesse analítico,

sendo utilizada pela indústria de alimentos, na manufatura de produtos
descafeinados (chá, café), desengordurados e desodorizados (óleos vegetais,
3
31
1
batatas fritas, salgadinhos, e outros), na refinação de óleos vegetais, e outros

(JALSENJAK et al., 1987).
Esta técnica, também tem sido aplicada na análise de alimentos, conforme

citam Blanch et al. (1994), principalmente para determinar a composição química de
diferentes produtos, como a análise de aditivos e contaminantes dos alimentos. A
EFS tem sido usada mais recentemente como técnica de extração em escala
analítica, trazendo um incremento para a química analítica, como um método de
preparação de amostra para cromatografia, tanto para preparação da amostra (off-
line), como para substituir o processo normal de injeção de amostra no cromatógrafo
(on-line ou acoplado).
Outros métodos podem ser utilizados para a obtenção de extratos, como por
exemplo, extração com Soxhlet, extração com maceração e extração com ultra-som.
Para a avaliação da composição química dos óleos essenciais observa-se que

os avanços das técnicas analíticas instrumentais, aliados à simplicidade, rapidez e
precisão, tornaram a cromatografia gasosa (CG) uma das técnicas mais difundidas
para análises químicas, por apresentar um processo de separação eficiente na
elucidação de uma determinada estrutura, quer seja na indústria ou nos laboratórios
de pesquisa científica. Vários autores destacam a cromatografia gasosa entre as
melhores ferramentas analíticas e de extrema utilidade na análise de misturas
complexas (JALSENJAK et al., 1987; KUSTRAK & PEPELJNJAK, 1989;
VELICKOVIC et al., 2002; RADULESCU et al., 2004; TEPE et al., 2004; SAHIN et
al., 2004; BAGAMBOULA et al., 2004; VAGI et al., 2005; NICKAVAR et al., 2005;
AVATO et al., 2005).
Esta metodologia (CG) tem sido aplicada na determinação do teor de gases,

moléculas orgânicas complexas, pesticidas, alguns metais e ânions, sendo
extremamente sensível, e possibilita determinar o número de componentes de uma
mistura, a presença de impurezas em uma substância e, muitas vezes, numa
primeira aproximação, informa sobre a identidade de um composto, sendo a técnica
preferida para o estudo das composições dos óleos essenciais (MOYNA et al.,
2002).
3
32
2
O parâmetro utilizado para a determinação de compostos é o tempo de

retenção transcorrido desde a injeção da amostra até o máximo do pico gerado. Na
análise quantitativa, a área de cada pico do cromatograma é proporcional à
concentração do componente na amostra e usada na determinação da concentração
de um ou mais componentes de uma mistura (SIMÕES & SPITZER, 2000).
O sistema de injeção da amostra permite a introdução de amostras líquidas,

gasosas ou sólidas no sistema cromatográfico (CG/DIC), com volumes de 0,1 a
10µL de amostra. No injetor a amostra líquida evapora-se instantaneamente e é
arrastada em forma de vapor até a coluna. Para conduzir a amostra através da
coluna até o detector, é necessário que o gás de arraste possua pureza e inércia
química. A coluna é o coração do sistema cromatográfico, pois é nela que ocorre a
separação dos componentes presentes na amostra. O detector indica e mede a
quantidade dos componentes individuais separados na coluna cromatográfca
(CIENFUEGOS & VAITSMAN, 2000).
A utilização da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas

(CG/EM), transforma o conjunto das duas técnicas na melhor ferramenta de
separação e identificação dos constituintes de uma mistura complexa. Nesta técnica,
a amostra é injetada no cromatógrafo a gás e o material eluído é continuamente
bombardeado por um feixe de elétrons, obtendo-se assim, o espectro de massas de
cada pico cromatográfico, o qual comparado com uma biblioteca de espectros,
permite a identificação do composto (NASCIMENTO FILHO, 2002).
A utilização do CG/EM é amplamente difundida para a caracterização da

composição química de óleos essenciais de diversas plantas (BAGAMBOULA et al.,
2004; BOZIN et al., 2006; MIMICA-DUKIC et al., 2004; SAHIN et al., 2004; TEPE et
al., 2004).
3
33
3
2.5 Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
Inúmeros microrganismos tornam-se resistentes aos múltiplos antimicrobianos

disponíveis, representando um desafio para o tratamento de doenças e infecções,
tornando premente a necessidade de encontrar novas substâncias com
propriedades antimicrobianas a serem utilizadas no combate a esses
microrganismos (DEVIENNE & RADDI 2002; PEREIRA et al., 2004).
Pesquisas da atividade antimicrobiana, modo de ação e uso potencial de

óleos essenciais de plantas têm ganhando importância. Atualmente, a avaliação de
propriedades antimicrobianas de óleos essenciais abrange uma grande variedade de
microrganismos contra os quais têm sido testados, incluindo microrganismos
deteriorantes de alimentos (ZAIKA et al., 1983; CONNOR & BEUCHAT, 1984;
JANSSEN et al., 1988; OUTTARA et al., 1987), microrganismos produtores de
toxinas alimentares (BEUCHAT, 1976; THARIB et al., 1983; DEANS & RITCHIE,
1987; LIS-BALCHIN & DEANS, 1997), fungos filamentosos micotoxigênicos
(KNOBLOCH et al., 1989), fungos patogênicos e leveduras dimórficas (BOONCHILD
& FLEGEL, 1982; GHANNOUM, 1988) e vírus de plantas e animais (IEVEN et al.,
1982; ROMERIO et al., 1989).
Dentre as plantas aromáticas com atividade antimicrobiana destacam-se

aquelas da família Lamiaceae, como Origanum vulgare (orégano), Thymus vulgaris
(tomilho), Rosmarimus officinalis (alecrim), Mentha piperita (menta), Salvia
officinalis (sálvia) e Ocimum basilicum (manjericão) entre outras. Espécies do gênero
Salvia são extensivamente usadas pela medicina popular, e muitas pesquisas
farmacológicas têm pretendido identificar compostos biologicamente ativos
responsáveis pelos seus efeitos terapêuticos (MARINO et al., 2001; RADULESCU et
al., 2004; BOZIN et al., 2006).
Segundo Altman (1989) e Lambert et al. (2001), na composição dos óleos

essenciais há compostos que apresentam maior atividade antimicrobiana, sendo que
a mistura de dois ou mais compostos em quantidades adequadas, podem
apresentar atividade antimicrobiana sobre as bactérias mais resistentes. Além disso,
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34
4
o sinergismo entre os compostos do óleo deve ser levado em conta (KUSTRAK &
PEPELJNJAK, 1989; SAVELEV et al., 2003; DELAMARE et al., 2005).
Burt (2004) trabalhou com óleo essencial de orégano e observou que os

princípios ativos (timol e o carvacrol) provocam distorção na estrutura física da
célula, causando expansão e conseqüente desestabilidade na membrana,
modificando sua permeabilidade, desnaturando enzimas essenciais por meio de
variações no pH e no potencial elétrico.
Embora o mecanismo de ação dos óleos essenciais não seja totalmente

conhecido, sua atividade biológica é avaliada de diferentes formas, na ativação e/ou
inativação de compostos, que ao romper ou desestruturar as membranas celulares,
por ação sobre os compostos lipofílicos, causam perdas de várias enzimas,
nutrientes e no controle quimiostático. Em alimentos os componentes hidrofóbicos
do óleo essencial podem impedir o contato de regiões do alimento com as células
bacteriológicas hidrofílicas em crescimento e ainda interferir no sistema respiratório
bacteriano (KIM et al., 1995; SVOBODA & DEANS, 1995; SIVROPOULOU, 1996;
BARATTA et al., 1998a; BARATTA et al., 1998b; COWAN, 1999; COX et al., 2000;
KALEMBA & KUNICKA, 2003; BAGAMBOULA et al., 2004).
2.5.1 Métodos de Avaliação da Atividade Antimicrobiana
A suscetibilidade dos microrganismos a determinado óleo essencial depende

das propriedades deste óleo, como sua composição química e suas concentrações,
bem como dos microrganismos utilizados (KALEMBA & KUNICKA, 2003).
Para a avaliação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais, geralmente

são utilizadas duas metodologias: método de difusão em placas (utilizando discos de
papel) e de microdiluição em caldo (utilizando microplacas) (NCCLS, 1997;
DEVIENNE & RADDI, 2002; KALEMBA & KUNICKA, 2003).
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35
5
2.5.1.1 Antibiograma em Meio Sólido
O método de difusão em placas fornece informações sobre a sensibilidade ou

resistência de um microrganismo a um determinado agente antimicrobiano. Para o
teste, um disco de papel filtro é impregnado com o agente antimicrobiano (óleo
essencial) em concentrações apropriadas e aplicados sobre o meio de cultura recém
semeado com a bactéria a ser testada. O agente difunde-se pelo meio, formando um
gradiente decrescente de concentração a partir do disco. Se a bactéria for sensível
ao agente, seu crescimento será inibido, formando um halo de inibição em torno do
disco, caso contrário, a bactéria crescerá normalmente (BARBOSA & TORRES,
1998; BLACK, 2002).
O diâmetro da zona de inibição de crescimento bacteriano dependerá da

habilidade da substância em teste de se difundir uniformemente pelo meio de
cultura. A maioria dos óleos essenciais e suas combinações ativas são altamente
voláteis e de baixa solubilidade em fase aquosa, fato que limita a utilização desta
técnica (BAGAMBOULA et al., 2004).
Este método é reconhecido e satisfatório para determinar a sensibilidade de

muitos microrganismos a determinados fármacos e suficientes quando o mecanismo
de resistência decorre da degradação enzimática do agente antimicrobiano pelo
organismo, embora forneça resultados semi-quantitativos, e de acordo com alguns
autores, qualitativos e nem sempre reprodutíveis (KATZUNG, 2003; KALEMBA &
KUNICKA, 2003).
Assim sendo, este método deve ser utilizado com cautela, previamente a
outros mais precisos. Apesar das suas limitações, é a técnica mais empregada para
a avaliação de atividade antibacteriana e antifúngica de óleos essenciais, dado que
é de fácil execução e requer pequenas quantias da amostra (JANSSEN et al., 1987;
KALEMBA & KUNICKA, 2003).
3
36
6
2.5.1.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Segundo Barbosa e Torres (1998), a determinação da concentração inibitória

mínima é um teste adequado para conhecer a concentração de um antimicrobiano
capaz de inibir o crescimento de um dado microrganismo. Esta concentração é um
parâmetro orientador da conduta terapêutica, especialmente nos casos de pacientes
imunodeprimidos. Também é útil em levantamentos epidemiológicos de resistência e
para a avaliação de novos antimicrobianos.
A concentração inibitória mínima (CIM) é definida como a menor

concentração de óleo essencial em caldo que resulta na falta de crescimento de
microrganismos visíveis (TORTORA et al., 2000). Pode ser determinada através de
métodos de contagem direta, tais como, microscopia e câmaras eletrônicas ou por
métodos de contagem indireta como plaqueamento e contagem de unidades
formadoras de colônias (UFC) e também em princípios baseados na turbidez óptica,
através das medidas de absorbância em meio líquido adequado ao crescimento do
microrganismo selecionado, juntamente com o agente antimicrobiano em
concentrações diferentes. Pesquisadores que utilizam o método de diluição estão
normalmente interessados na determinação da CIM e somente em alguns casos
utilizam concentração letal mínima (CLM) (PELCZAR et al., 1996; KALEMBA &
KUNICKA, 2003).
Métodos de diluição oferecem resultados quantitativos, podendo-se determinar

as concentrações inibitórias mínimas (CIM), ainda que dependentes de muitos
fatores como temperatura, dispersão em meios aquosos, tempo de incubação e a
quantidade do inóculo utilizado no teste (BAGAMBOULA et al., 2004).
Após a inoculação das bactérias estudadas e das diferentes concentrações de

óleo essencial, as placas são incubadas em tempo e temperatura adequados.
Transcorrido o tempo determinado, interpreta-se os resultados obtidos e, a menor
concentração, que inibir o crescimento bacteriano corresponde à CIM. As medidas
de densidade óptica ou absorbância são feitas em espectrofotômetros. Este método
é considerado eficiente sendo bastante utilizado devido a sua rapidez e facilidade de
execução, porém, mede células vivas e mortas, sofrendo interferências de
3
37
7
substâncias presentes que absorvem a luz (BARBOSA & TORRES, 1998; BLACK,
2002; KALEMBA & KUNICKA, 2003).
Hammer et al. (1999), avaliaram óleos essenciais de salvia (Salvia officinalis)

e obtiveram valores de CIM de 20 mg mL -1 para Enterococcus faecalis, 5 mg mL-1
para Escherichia coli e 20 mg mL-1 para Klebsiella pneumoniae.
Velickovic et al. (2002), obtiveram valores de CIM de 0,5 mg mL -1 para
Escherichia coli, 0,4 mg mL-1 para Salmonella typhimurium e 0,2 mg mL-1 para
Staphylococcus aureus, quando avaliaram óleos essenciais de tomilho (Thymus
vulgaris) e menta (Mentha piperita).
Sahin et al. (2004), avaliaram a atividade biológica do óleo essencial de
orégano (Origanum vulgare) e obtiveram substancial atividade antimicrobiana contra
10 espécies bacterianas testadas. Os valores da CIM variaram de 0,015 mg mL -1 a
0,13 mg mL-1, dentre as quais destacamos: Escherichia coli 0,031 mg mL-1; Bacillus
subtilis, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris e Staphylococcus aureus 0,062 mg
mL-1.
2.6 Utilização de antimicrobianos Naturais em Alimentos
Nos últimos anos, o surgimento de novas indústrias de alimentos foi

impulsionado pelo crescente consumo e procura por alimentos frescos e naturais.
Com isso ocorreu modificação na forma de processamento e conservação dos
alimentos com objetivo de oferecer produtos saudáveis e seguros (KNOBLOCH et
al., 1989).
Os óleos essenciais extraídos de vegetais conhecidos pelas suas

propriedades antibacteriana, antifúgica, antioxidante e anticarcinogênica, podem ser
utilizados como aditivos e antimicrobianos em muitos produtos alimentícios
(TEISSEDRE & WATERHOUSE, 2000).
A eficácia dos óleos essenciais e seus componentes foram testadas em patês,

carne bovina fresca embalada, carne bovina moída, carne de carneiro moída,
presunto embalado a vácuo, queijo tipo muzzarela, queijo light e salada de berinjela
(KIM et al., 1995; KOUTSOUMANIS et al., 1999; SKANDAMIS & NYCHAS, 2000,
3
38
8
2001; TSIGARIDA et al., 2000; SKANDAMIS & NYCHAS, 2001; MENON & GARG,
2001; SMITH-PALMER et al., 2001; GILL et al., 2002).
Hao et al. (1998a, b) demonstraram que o eugenol obtido de extrato de plantas

apresentou redução significativa no crescimento de Aeromonas hydrophila em carne
bovina cozida e refrigerada e em carne de frango cozida.
Vários óleos essencias de plantas aromáticas incluindo o tomilho (Thymus

vulgaris L.) e o manjericão (Ocimum basilicum L.) inibiram o crescimento de fungos
em amido de milho em estudos realizados por Montes-Belmont & Carvajal (1998).
Nielsen & Rios (2000) também demonstraram a inibição do crescimento de fungos
em pães utilizando óleo essencial de mostarda (Brassica sp).
Compostos purificados derivados dos óleos essenciais tais como carvacrol,

eugenol, linalol e timol inibiram o crescimento de vários microrganismos (HULIN et
al., 1998).
Entre sete componentes de óleos essenciais testados individualmente frente a

25 cepas bacterianas, o timol apresentou melhor resultado seguido do carvacrol
(DORMAN & DEANS, 2000). O carvacrol tem demonstrado ser um bom inibidor do
crescimento de diferentes patógenos (ULTEE et al., 2000). Hulin et al., (1998)
demonstraram o efeito antimicrobiano do carvacrol contra Salmonella sp em
pedaços de peixe armazenados a 4°C.
2.7 Atividade Antioxidante de Óleos Essenciais
Os radicais de oxigênio (radicais hidroxila e peroxila) e o ânion superóxido têm

um papel importante nas reações bioquímicas e fisiológicas do corpo humano. No
entanto, se houver produção excessiva de radicais de oxigênio durante os processos
patofisiológicos ou devido a fatores ambientais adversos e não existirem
antioxidantes disponíveis in vivo, poderá ocorrer doenças e danos profundos nos
tecidos (MOLYNEUX, 2004; HUANG et al., 2005).
3
39
9
A oxidação é uma reação que pode ocorrer também nos alimentos provocando
a perda do valor nutritivo pela decomposição dos ácidos graxos e a formação de
compostos que podem reagir com outros componentes dos alimentos e também se
tornarem prejudiciais para o organismo humano e animal (MARINOVA &
YANSHILIEVA, 2003; MATHEW & ABRAHAM, 2005).
Antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação, através

de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e complexação de
metais (PIETTA, 2000). Eles podem ser sintéticos ou naturais e, para serem
utilizados em alimentos, devem ser seguros para a saúde.
Alguns dos antioxidantes sintéticos mais importantes são o butil hidroxianisol

(BHA) e o butil hidroxitouleno (BHT), entre os naturais destacamos o ácido
ascórbico, a vitamina E e o β-caroteno (RICE-EVANS et al., 1996). Os compostos
fenólicos também são potentes antioxidantes, podendo agir como redutores do
oxigênio singleto, atuando nas reações de oxidação lipídica assim como na quelação
de metais (SATUÉ-GARCIA et al.; 1997; HOPIA & HEINONEM, 1999).
Vários tipos de plantas e especiarias com potencial antioxidante reconhecido

estão sendo usadas em diversos tipos de alimentos (SHETTI, 1997). Em especial, o
alecrim (Rosmarinus officinalis) e a salvia (Salvia officinalis), conhecidos na família
Lamiaceae por possuírem grande atividade antioxidante (MADSEN & BERTELSEN,
1995; CUPPET & HALL, 1998). O Ocimum basilicum, que também pertencente a
esta família, é rico em compostos fenólicos e flavonóides (XAASAN et al., 1980;
GERHARDT & SCHROTER, 1983; GRAYER et al.; 1996; LOUGHRIN &
KASPERBAUER 2001) tais como, ácido o cinâmico, caféico, sinápico e o ácido
ferúlico (LOUGHRIN & KASPERBAUER 2001). Estes compostos fenólicos e
flavonóides são potentes antioxidantes, seqüestram radicais livres e quelam metais
(COOK & SAMMAN, 1996). Entretanto, existem poucos estudos sobre a capacidade
antioxidante do óleo extraído das folhas de Ocimum basilicum L. (PIZZOCARO et
al., 1985).
Lee et al. (2005), em estudos de identificação de componentes voláteis e suas

propriedades antioxidantes em manjericão (Ocimum basilicum L.) e folhas de tomilho
(Thymus vulgaris), evidenciaram que o linalol é o componente majoritário encontrado
4
40
0
no manjericão e o terceiro principal composto do tomilho. Doze compostos de

manjericão e do tomilho (dentre estes o linalol) foram avaliados em relação a
atividade antioxidante. O eugenol, timol, carvacrol e o alilfenol foram os compostos
que apresentaram maior atividade antioxidante.
Diversas técnicas têm sido utilizadas para determinar a atividade antioxidante
in vitro de óleos extraídos de ervas de forma a permitir uma rápida seleção das
substâncias, e também das misturas potencialmente interessantes, na prevenção de
doenças crônico-degenerativas. Dentre estes métodos destacam-se o sistema β-
caroteno/ácido linoléico e o método de radicais livres, tais como DPPH• - 2,2 difenil-1
picrilhidrazila. O método de oxidação do β-caroteno/ácido linoléico avalia a atividade
de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico. O
método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração
(oxidação) do β-caroteno induzida por produtos da degradação oxidativa do ácido
linoléico (MARCO, 1968; MILLER, 1971). Igualmente ao sistema β-caroteno/ácido
linoléico, o método de radicais livres está baseado no descoramento de uma solução
composta por radicais estáveis DPPH• de cor violeta quando da adição de
substâncias que podem ceder um átomo de hidrogênio (BRAND-WILLIAMS et al.,
1995; HUANG et al., 2005).
Mensor et al., (2001), relatam que a planta Ginkgo biloba é uma das plantas
consideradas com alta atividade antioxidante, pois possui um IC50 (concentração de
óleo essencial necessária para causar 50% de atividade antioxidante) de 38,91 µg
mL-1, sendo utilizada como referência para comparar a atividade antixodante de
outras espécies.
Óleos essenciais de várias plantas tem sido utilizados para avaliar a atividade
antioxidante empregando o teste de DPPH, entre os quais temos: Hippomarathrum
microcarpum com IC50 de 10.690 µg mL-1 (OZER et al., 2007); Chaerophyllum
libanoticum com IC50 superior a 30.000 µg mL -1 (DEMIRCI et al., 2007); Rosmarinus
officinalis com IC50 de 20.000 µg mL-1 ( WANG et al., 2007); Artemisia fragrans com
IC50 de 7.860 µg mL -1 e Artemisia austriaca com IC50 de 8.060 µg mL -1 (DELAZAR
et al., 2007); Petroselinum crispum L. com IC50 de 80.210 µg mL-1 (ZHANG et al.,
2006).
4
41
1
2.8 Avaliação da Atividade Antioxidante em Alimentos
O sabor é um dos atributos mais importantes na aceitação das carnes e seus

derivados. Compostos hidrossolúveis presentes na porção muscular determinam o
aroma das carnes percebido após a cocção. Os lipídios, por sua vez contribuem
para o sabor específico das espécies. A oxidação dos lipídios durante o
processamento e armazenamento das carnes está associada a sabores estranhos,
indesejáveis, identificados como ranço e sabor de requentado (Warmed over flavor),
mudança de coloração, propriedades reológicas e solubilidade podendo também
ocorrer a formação de compostos tóxicos como o 4-hidroxi-nonenal (ADDIS &
PARK, 1989).
Uma das principais causas da alteração no sabor das carnes é a oxidação

lipídica que ocorre com os ácidos graxos, principalmente com os poliinsaturados.
Alguns fatores post-mortem podem influenciar nessa oxidação, e com isso diminuir a
vida útil dos produtos cárneos, pois aceleram o ínicio da peroxidação. A oxidação
dos ácidos graxos presentes na porção muscular é um processo que se inicia após o
abate (ALLEN & ALLEN, 1981).
A oxidação de uma pequena quantidade de gordura é suficiente para que o

consumidor detecte aroma e sabor associados à alteração e rejeite o alimento. A
exclusão do oxigênio, baixas temperaturas e/ou uso de antioxidantes são
necessários para controlar a oxidação. O fenômeno da oxidação também é
extremamente dependente do teor de umidade (LABUZA, 1982; SINGHI, 1996).
As taxas de oxidação são influenciadas por uma série de fatores como: a

presença de oxigênio e as altas temperaturas que exercem uma atividade
preponderante na taxa de oxidação. Reações de oxidação mais drásticas podem ser
associadas ao grau de cominuição (moagem), e estocagem congelada, associada a
altos teores de gordura, presença de gordura insaturada e baixa atividade de água
(EBURNE & PRENTICE, 1996; SHINGH, 1996).
De acordo com Degenhart (1998), alteração nas gorduras ocorrem desde o

primeiro dia da fabricação do salame, com hidrólise enzimática das gorduras e, no
processo final de cura, o índice de ácidos graxos livres é praticamente dez vezes
4
42
2
superior ao inicial. Depois de certo período de secagem, essas reações são inibidas
pelo processo de autoxidação. Assim, as gorduras continuam a ser desdobradas em
outros ácidos de cadeia menor, produzindo um grande número de aldeídos que dão
o sabor e aroma característico deste produto. Por isso, produtos de cura rápida
nunca podem ser comparados aos produtos de cura lenta e com elevado grau de
secagem.
Para acompanhar a evolução da rancidez das carnes e derivados, durante a

estocagem, o número de TBA (ácido 2-tiobarbitúrico) tem sido utilizado como valor
empírico (KOWALE et al., 1996). O número de TBA tem sido correlacionado com
outros métodos, objetivos e subjetivos, para determinação da oxidação de lipídios
(RAHARJO & SOFOS, 1993). Este é um dos mais antigos métodos e
frequentemente utilizado para acompanhar a oxidação de lipídios em tecidos
animais, sendo expresso em miligramas de malonaldeído equivalente por
quilograma da amostra.
O malonaldeído é um produto secundário da oxidação de lipídios, sendo

formado durante a oxidação dos ácidos graxos polinsaturados e reage com o ácido
Tiobarbitúrico (TBA) formando um complexo colorido com absorção máxima a 530-
532 nm. A intensidade do complexo colorido proveniente da reação do TBA com o
malonaldeído presente nos alimentos, extratos de alimentos ou destilados,
originalmente foi considerado como uma medida da concentração do malonaldeído,
sendo que alguns autores relatam altas correlações com o sabor e aroma de
oxidado em produtos cárneos. Porém, alguns fatores podem afetar a intensidade da
cor do complexo. Por exemplo, outros produtos de oxidação de lipídios, tais como
alca-2,4 dienos, que também reagem com o TBA formando um complexo de cor
vermelha com mesmo número de absorção do complexo malonaldéido-TBA. Por
esta razão, o número de TBA deve ser utilizado para acompanhar a oxidação de
lipídios em geral, ao invés de apenas quantificar o malonaldeído. O termo
“Substâncias reativas ao Ácido Tiobarbitúrico” (TBARS) deve ser utilizado ao invés
de número de TBA (MELTON, 1983; RHEE, 1989; GRAY & MONAHAN, 1992).
O nitrito residual em carnes curadas pode aparentar reagir com o

malonaldeído durante a etapa de destilação para formar compostos que levam a
4
43
3
leituras equivocadas. A sulfanilamida quando adicionada a carnes curadas antes da

destilação reage com o nitrito residual produzindo um sal de diazônio e elimina a
interferência (GRAY & PEARSON, 1987).
Apesar do método de extração por destilação ser o mais popular, isto não
significa que ele seja o método mais preciso ou reprodutível. Os valores de TBARS
em produtos cárneos são geralmente mais altos do que aqueles obtidos em
amostras cuja extração é feita diretamente, porém altas correlações entre os dois
métodos de extração são verificados por alguns autores (WITTE et al., 1970.
MELTON, 1983).
Os valores de TBARS encontrados em embutidos fermentados relatados na

literatura variam muito, mesmo quando comparados entre estudos que utilizam o
mesmo método de extração, no caso, de destilação (WANG et al., 1995; BLOUKAS
et al., 1997; GHIRETTI et al., 1997; NOVELLI et al., 1998).
O TBARS é considerado como adequado para determinação da oxidação

lipídica em produtos cárneos, desde que sejam reconhecidas as limitações do
método e que todas as análises sejam realizadas através de um único meio de
extração. Assim, a mudança nos valores de TBARS para aquela situação particular
e tipo de produto cárneo pode mostrar o comportamento da oxidação de lipídios que
ocorre durante a estocagem e/ou processamento – por exemplo, para avaliar a
eficácia de antioxidantes de diferentes fontes ou de diferentes embalagens, na
estabilidade de um dado produto. Além disso, o TBARS é relativamente simples e
barato se comparado com outros métodos instrumentais (RHEE, 1989; RAHARJO &
SOFOS, 1993). Porém, é recomendável quantificar a oxidação de lipídios através de
análises complementares como determinação de hexanal e relacioná-los com dados
obtidos através de análise sensorial com painel treinado (GRAY & PEARSON, 1987;
GRAY & MONAHAN, 1992).
4
44
4
2.9 Utilização de Antioxidantes Naturais em Alimentos
A utilização de antioxidantes naturais tem como vantagens a aceitação

imediata do consumidor e sua utilização não é limitada pela legislação brasileira. No
Brasil, o alecrim é utilizado devido ao seu poder antioxidante, mas faz parte da
formulação como condimento (MERLO, 1998). A desvantagem destes produtos é o
seu alto custo quando o extrato é purificado; as propriedades podem variar, no caso
de compostos não purificados e devido ao seu aroma forte e característico, que
pode afetar a cor, inferir sabor residual e causar off-flavors no produto ao qual foi
adicionado (BROOKMAN, 1991; POKORNÝ, 1991).
Existem várias alternativas de adição de antioxidantes naturais. Alguns

estudos relatam a utilização de condimentos e ervas, tais como orégano, noz
moscada, páprica, alecrim, salvia e outros (BROOKMAN, 1991). A atividade
antioxidante destes produtos tem sido reconhecida ao longo dos anos a partir de
experiências práticas (POKORNÝ, 1991). Dentre estes produtos, alecrim e salvia
têm demonstrado maior potencial para utilização como antioxidantes em alimentos,
junto dos tocoferóis, também considerados como antioxidantes naturais. Em
particular o alecrim, tem sido extensamente estudado em relação à sua atividade
antioxidante, como também o seu uso comercial (LÖLIGER, 1983; WONG et al,
1995).
Estudos realizados recentemente com a utilização de extratos de algumas

plantas mostraram significativa atividade antioxidante em produtos cárneos como
por exemplo: chá verde (Camellia sinsensis L.) em hamburgers, salsichas,
mortadelas. O chá verde possui vários componentes polifenólicos com atividade
antixodante porém, os mais efetivos são as catequinas (epigalocatequina-3-galato
(EGCG) e epicatequina-3-galato (ECG)(VAN DER SLUIS, 2007); extrato hidro-
alcoólico de marcela (Achyrocline satureoides DC.) em salames. O alto conteúdo de
compostos polifenolícos, na maioria flavonóides e diferentes ácidos fenólicos como o
cafeico, clorogênico e isoclorogênico sugere que esta planta possa ter potente
atividade antioxidante (CAMPAGNOL, 2007). Erva mate (Ilex paraguariensis St. Hil.)
em carne de frango in vivo. As folhas de erva mate apresentam elevado conteúdo de
4
45
5
flavonóides e cafeoil derivados, responsáveis pelas suas propriedades

antioxidantes. A presença de rutina, quercitina e camferol, ambos livres ou como
glicosídeos, em várias espécies de Ilex, incluindo a I.paraguariensis, podem também
serem responsáveis em parte pela atividade antioxidante observada na erva mate
(PADILHA, 2007). Casca da batata Inglesa (Solanum tuberosum) em cortes de
carne de frango. A casca da batata inglesa é rica em constituintes fenólicos, em sua
maioria representados pelos ácidos fenólicos, cafeico e clorogênico entre outros, os
quais atuam na minimização dos efeitos indesejáveis dos produtos da oxidação
lipídica em alimentos (SOUZA, 2006).
Os condimentos usados (compostos por óleos essenciais), principalmente

para tornar os alimentos mais agradáveis ao paladar, apresentam ação
conservadora por inibirem ou retardarem a atividade antimicrobiana, bem como por
retardarem a autoxidação de gorduras. Estima-se que pelo menos a metade do total
de condimentos utilizados pela indústria nos Estados Unidos se dá pela indústria de
produtos cárneos (SHARMA et al., 1981; OLIVEIRA, 1991).
4
46
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2.10 Referências Bibliográficas
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Capítulo 3 – Materiais e Métodos
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Foram utilizadas amostras foliares secas em temperatura ambiente até peso

constante de Ocimum basilicum L. com a finalidade de extrair o óleo. A análise da
composição química do óleo essencial de manjericão foi feita através de
Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas GC-MS. A condição analítica
está descrita na página 71 dentro do ítem 3.3 – Composição química.
3.1.1 Análises in vitro:
Nas análises microbiológicas com o óleo foram utilizados: Agar Müller-Hinton,

para o método de difusão em placas, e Triptona, Extrato de Levedura, Cloreto de
Sódio, para avaliar a concentração inibitória mínima (CIM).
3.1.2 Análises no Produto:
Para a formulação do Salame Tipo Italiano foram utilizados carne suína

(paleta e pernil) 60%, toucinho 10%, carne bovina 30% e os demais ingredientes
calculados sobre o peso das carnes e do toucinho nas seguintes quantidades:
cloreto de sódio (NaCl) 3%, sacarose 1%, condimento para Salame Tipo Italiano 1%,
sal de cura 0,3%, pimenta branca moída 0,06%, pimenta preta moída 0,05% e
0,25% de eritorbato de sódio para o lote denominado padrão. O Salame Tipo Italiano
foi elaborado de acordo com normas legais vigentes (BRASIL 2000).
Nas análises microbiológicas do Salame Tipo Italiano, foram utilizados Agar

Baird Parker, Brain Heart Broth (BHI) para determinação de Staphylococcus aureus,
Agar MacConkey, para determinação de Eschecrichia coli, Plate Count Agar (PCA),
para determinação das bactérias Aeróbicas Heterotróficas, Mannitol Salt Phenol-red
Agar (MSA), para determinação das bactérias da família Micrococaceae e Agar de
69
Man, Rogosa and Sharpe (MRS), para determinação das bactérias Lácticas todos da
marca Merck.
3.2 Extração por Hidrodestilação
3.2.1 Aparato Experimental
O óleo essencial de manjericão foi extraído por hidrodestilação, onde utilizou-

se os aparelhos tipo Clevenger conforme modelo citado na Farmacopéia Brasileira
(1999), os quais foram interligados em série. O aparato era composto por 3 mantas
aquecedoras com controlador de temperatura, três balões de fundo redondo com
capacidade de 5000 mL, três extratores de Clevenger e um banho termostático
Marca Nova Ética Modelo 321/3D para refrigeração nos condensadores.
3.2.2 Procedimento Experimental
Para obtenção do óleo essencial da planta estudada, foram utilizadas 100 g de

amostra para cada extração juntamente com 3000 mL de água destilada, os quais
foram submetidos a uma temperatura de extração de 100°C durante um período de
90 minutos após o início da ebulição, sendo a temperatura de refrigeração dos
condensadores programada a 4°C. O rendimento de óleo foi obtido pela medição no
próprio aparelho em intervalos de 5 min. O óleo essencial foi separado da água por
diferença de densidade e, a seguir filtrado e um funil com filtro de papel adicionado
de sulfato de sódio anidro previamente seco a 105°C durante 30 minutos, para
retirada das partículas de água ainda existentes. Este procedimento foi realizado a
temperatura ambiente e o óleo foi estocado em vidro âmbar a -18°C até sua
utilização.
70
3.3 Composição Química
A análise da composição química do óleo essencial de manjericão foi feita

através de Cromatografia Gasosa e Espectrometria de Massas CG-EM (Shimadzu,
Modelo QP 5050A). A amostra utilizada na cromatografia foi preparada a 5000 ppm,
sendo o óleo essencial de manjericão dissolvido em Diclorometano (Merck). Foi
empregada uma coluna capilar DB-5 (30 m x 0,25 mm de diâmetro x 0,25 µm de
espessura do filme); vazão do gás de arraste (hélio) de 1,0 mL/min; detector em 1,0
Kv; Modo Split (1:20): injetor a 280°C a interface em 280°C. Programação da
temperatura inicial 50°C (4 min); 2,5°C/min até 180° e 5°C/min até 280°C. O tempo
de corte do solvente foi de 4 min. O tempo total de análise foi de 76 minutos. Os
picos dos compostos foram integrados de modo manual e comparados com a
literatura e o banco de dados (Wiley) existente no equipamento, com
aproximadamente 170000 espectros. Os compostos foram listados pelo tempo de
retenção e área do pico.
3.4 Avaliação de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum

basilicum L. sobre a Atividade Antimicrobiana e antioxidante in vitro
3.4.1 Atividade Antimicrobiana
Para a realização dos testes antimicrobianos, foram realizadas as metodologias

de difusão em placas e concentração inibitória mínima (CIM).
3.4.1.1 Difusão em Placas
Com o objetivo de realizar um teste prévio da ação antimicrobiana do óleo

essencial de manjericão, foram testados pelo método de difusão em placas 18
71
microrganismos passíveis de serem encontrados em produtos cárneos, da coleção

do Laboratório de Microbiologia da Universidade Regional Integrada – URI –
Campus de Erechim, através do antibiograma em meio sólido. Os microrganismos
testados foram: Acinetobacter sp., Aeromonas sp., Citrobacter freundii,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococus luteus,
Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
choleraesuis, Sarcina sp., Serratia sp., Shigella flexneri, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans, Yersinia enterocolitica. Na
realização dos testes foram utilizados discos de papel Watmann número 3, com 7
mm de diâmetro, que foram colocados sobre o meio de cultura Agar Muller-Hinton
(Merck). Para cada microrganismo foi testado um volume correspondente a 5 L do
óleo em cada disco, sendo que em cada placa de Petri foram utilizados três discos,
um controle negativo, um controle positivo com cloranfenicol (30 g) e o disco teste.
As análises foram feitas em triplicata.
3.4.1.2.Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi utilizado o

método indireto de crescimento bacteriano através da densidade ótica em meio de
cultura líquido, avaliando-se as bactérias que apresentaram halo de inibição no teste
de difusão em placas.
Foram determinadas em triplicata as CIMs para 17 microrganismos

selecionados, *Acinetobacter sp., *Aeromonas sp., Citrobacter freundii (ATTC 8090),
Enterococcus faecalis (ATTC 19433), Escherichia coli (ATTC 25922), Klebsiella
pneumoniae (ATTC 13833), Micrococus luteus (ATTC 10240), Proteus mirabilis
(ATTC 25933), Proteus vulgaris (ATTC 13315), Salmonella choleraesuis (ATTC
10708), *Sarcina sp., Serratia sp. (ATTC 13880), Shigella flexneri (ATTC 12022),
Staphylococcus aureus (ATTC 6538), Staphylococcus epidermidis (ATTC 12228),
Streptococus mutans (ATTC 25175) e Yersinia enterocolitica (ATTC 10460).
ATTC – American Type Culture Collection – (USA)
72
* Obtidos a partir do Instituto Biológico – Campinas, SP.
Após o crescimento prévio das culturas, inoculou-se em microtubos 10 L de

pré-inóculo (108 UFC mL-1) em caldo LB (Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L e
cloreto de sódio 5 g/L) acrescido de 1% do emulsificante dimetilsulfóxido (DMSO) e
contendo diferentes concentrações do óleo essencial. Posteriormente ao processo
de inoculação os microtubos foram incubados sob agitação eletromagnética, por um
período de 24 horas à temperatura de 35°C.
Antes e após o período de incubação, 0 e 24 horas respectivamente, avaliou-se

a densidade ótica através do leitor automático de microplacas (Marca Bio-Tec
Instruments Inc., modelo EL800), em comprimento de onda de 490 nm. As
concentrações de óleo essencial testadas no experimento para os 17
microrganismos foram de 0; 0,01; 0,05; 0,075; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,5; e 5,0 mg
mL-1. O crescimento bacteriano foi determinado pela diferença entre a leitura
realizada após 24 horas de incubação e a leitura realizada logo após a inoculação (0
horas).
3.4.2 Atividade Antioxidante in vitro pela Captura de Radicais Livres com o Teste do
Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH)
A metodologia foi fundamentada na medida da extinção da absorção do radical

Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) em 515 nm (MIRANDA & FRAGA, 2006). A
determinação da atividade antioxidante foi realizada em triplicata, por método
espectrofotométrico. A técnica consistiu na incubação por 10 minutos, de 500 µL de
uma solução etanólica de DPPH 0,1 mM com 500 µL de soluções contendo
concentrações crescentes de óleo essencial de Manjericão (2500, 3750, 5000, 7500,
10000, 12500, 15000, 17500 e 20000 µg mL -1) em etanol. Procedeu-se da mesma
forma para a preparação da solução denominada “controle”, porém substituindo 500
µL da amostra por 500 µL de solvente etanol. Para a solução denominada “branco”
foi utilizado solvente etanol. O percentual de captação do radical DPPH foi calculado
73
em termos da porcentagem de atividade antioxidante (AA%), conforme a seguinte

fórmula:
AA% = 100 - {[(Abs. amostra – Abs.branco) x 100] ÷ Abs. controle}.
A determinação foi feita em espectrofotômetro UV-Visível marca Agilent

Technologies, modelo 8453E. Para verificação de interferentes da metodologia
empregada, diluiu-se o óleo essencial de Manjericão em etanol, na mesma faixa de
concentração em estudo (2500, 3750, 5000, 7500, 10000, 12500, 15000, 17500 e
20000 µg mL-1). Analisaram-se as amostras em espectrofotômetro em comprimento
de onda de 515 nm, com o objetivo de avaliar a absorbância das diferentes
concentrações das amostras. Após, determinou-se a faixa de concentração na qual
não ocorreria inferência da coloração do óleo essencial. Após a avaliação da faixa
de concentração ideal, calculou-se a concentração de óleo essencial necessária
para capturar 50% do radical livre DPPH (IC 50) por análise de regressão
(CARBONARI, 2005).
3.5 Avaliação Sensorial
3.5.1 Preparo das Amostras
Conhecidas as concentrações do óleo de manjericão que apresentaram boa

atividade antimicrobiana e antioxidante in vitro, procedeu a avaliação sensorial das
mesmas, com a finalidade avaliar se as amostras de salame contendo óleo
essencial de manjericão apresentariam diferenças quando comparadas com uma
considerada Padrão (similar ao produto comercial) e uma outra amostra considerada
Branco ( produto sem adição de antioxidante comercial e óleo).
Foram produzidos 7 lotes de Salame Tipo Italiano de acordo com a legislação

vigente (BRASIL, 2000). As matérias primas utilizadas em comum nas formulações
74
dos 7 lotes foram: carne suína (60%), carne bovina (30%), toucinho (10%) e cultura
microbiana (starters) de Staphylococcus xylosus e Pediococcus pentosaceus
(Lyocarni RHM 33 da SaccoBrasil, relação 25 g para 100 kg de massa). Os demais
ingredientes foram calculados levando-se em consideração somente a quantidade
de carne suína e bovina e nas seguintes quantidades: cloreto de sódio (NaCl) 3%,
sacarose 1%, condimento para Salame Italiano 1% (Kraki), sal de cura 0,3% (Kraki),
pimenta branca moída 0,06%, pimenta preta moída 0,05%. Apenas o lote padrão
recebeu 0,25% do antioxidante comercial eritorbato de sódio (Fixador A80-S, Kraki).
As carnes suínas e bovinas foram trituradas em disco de 5 mm e o toucinho

foi cortado em cubos de 0,6 cm x 0,6 cm.
A elaboração do salame ocorreu de forma convencional, após a preparação

da massa de carnes fez-se a mistura dos ingredientes comuns a todos os lotes em
um misturador (Frigomaq) durante 3 minutos. A seguir, a massa foi dividida em lotes
para possibilitar a adição dos ingredientes específicos. Os lotes foram assim
denominados:
1. Padrão formulado similar ao produzido industrialmente contendo 0,6 mg g -1 de

antioxidante comercial;
2. Branco formulado sem adição de antioxidante comercial e do óleo essencial
de manjericão;
3. Formulado com 3,75 mg g-1 de óleo essencial de manjericão
correspondendo a cinco vezes a Concentração Inibitória Mínima (CIM);
correspondendo a duas vezes e meia a CIM;
correspondendo a CIM;
correspondendo a metade da CIM;
correspondendo a um quarto da CIM.
Para inserir o óleo essencial na formulação do salame tipo italiano, foi
utilizado como veículo a sacarose desidratada.
75
A massa foi embutida em tripas de colágeno (Kraki) que apresentavam

diâmetro de 50 mm, previamente imersas em água contendo 8% de cloreto de sódio
(NaCl) e a temperatura de 30°C.
Os salames obtidos pesaram em média 650 gramas e apresentaram 30 cm

de comprimento. Foram identificados e colocados na câmara de fermentação com
temperatura e umidade relativa controladas que obedeceram a seguinte
programação: No 1° dia a temperatura utilizada foi 25°C e umidade relativa 95%, no
2° dia a temperatura utilizada foi de 24°C e umidade relativa 92%, no 3° dia a
temperatura utilizada foi de 23°C e umidade relativa 89%, no 4° dia a temperatura
utilizada foi 22°C e umidade relativa 86%, no 5° dia a temperatura utilizada foi 21°C
e umidade relativa 83%, no 6° dia a temperatura foi 20°C e umidade relativa 80%, no
7° dia a temperatura utilizada foi 19°C e umidade relativa manteve-se em 80%, do 8°
até o 28° dia de permanência na câmara de maturação a temperatura manteve-se
estável a 18°C e a umidade relativa em 75%. Após foram acondicionados em
embalagens Barrier Bag (Sealed Air Corporation), fechados a vácuo e armazenados
durante 30 dias à temperatura de 22°C na ausência de luz.
3.5.2 Análise Sensorial
A equipe que participou da avaliação sensorial foi constituída de 30 a 40

julgadores (conforme o atributo a ser julgado, análise de variância Apêndice B,
Tabelas 01 e 02B), pré-selecionados em função do hábito de consumo de produtos
fermentados derivados de carne suína e bovina, de ambos os sexos, com idade
variando entre 20 e 48 anos. As características sensoriais avaliadas foram cor,
aroma e sabor do Salame Tipo Italiano com adição de diferentes concentrações de
óleo essencial de manjericão, empregando-se o teste de diferença do controle, que
se constitui de escala estruturada de 10 pontos (0 – nenhuma diferença do padrão
e/ou do branco e 9 – extremamente diferente do padrão e/ou do branco), conforme
metodologia descrita por Faria (2002).
76
As amostras contendo as diferentes concentrações de óleo essencial de

manjericão e as amostras padrão e branco, foram colocadas em recipientes de vidro
codificados com números aleatórios de 3 dígitos, distribuídas e balanceadas na
quantidade de 3 gramas, juntamente com a ficha de avaliação (Apêndice A, Figura
A01) e um copo com água. Os julgadores avaliaram as amostras em cabines
individuais com auxílio de luzes coloridas.
3.5.3 Análise Estatística
Os resultados da análise sensorial foram avaliados estatisticamente, mediante

análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey, ao nível de significância de 5%,
utilizando software STATISTICA versão 5.0 (Statsoft Inc, USA).
3.6 Análises Físico-Químicas da Parte Interna do Salame Tipo Italiano
Para a realização das análises físico-químicas no Salame Tipo Italiano foram

produzidos 5 lotes conforme descrito no item 3.5.1, com exceção das amostras com
cinco vezes e duas vezes e meia a CIM.
As amostras foram obtidas logo após a elaboração (zero dia) e no 2°, 7°, 14°,
21°, 28° dia de processamento e após 30 dias de armazenamento, embalados a
vácuo em sacos Barrier Bag com estrutura EVA multicamadas, termo encolhível,
apresentando boa resistência mecânica, barreira ao vapor d’água – TPH 2O máximo
10 g/cm2.dia (1 atm/38°C/90% UR) e alta barreira ao oxigênio – TPO 2 máxima de 30
cm3/m2.dia (1 atm/23°C/O% UR) (Sealed Air Corporation) a uma temperatura de
22°C na ausência de luz.
77
3.6.1 Determinação de pH
Para determinar o pH foi utilizado dez gramas de cada amostra,

homogeinizadas em 100 mL de água destilada e este homogeinizado foi submetido
aos eletrodos do pHmetro Digimed® durante 5 minutos, a seguir foi procedida a
letitura do pH (TERRA & BRUM, 1988).
3.6.2 Determinação de Atividade de Água (aw)
A atividade de água do salame foi realizada pelo aparelho Aqualab CX-2 Water
Activity-Sistem e as determinações foram realizadas a 20°C.
3.6.3 Determinação do Teor de Umidade
A determinação do teor de umidade fundamentou-se na perda de umidade e

substâncias voláteis a 105°C (TERRA & BRUM, 1998).
3.6.4 Determinação da Acidez
O índice de ácido láctico das amostras foi acompanhado através do método de

titulação com solução Dornic. Dez gramas da amostra foram diluídas em 200 mL de
água destilada, triturados durante 1 minuto, transferidos para um balão volumétrico
de 250 mL, onde o volume foi completado e a solução filtrada. Foi transferido 25 mL
do filtrado para um erlenmeyer e adicionado de 75 mL de água destilada juntamente
com 3 gotas do indicador fenolftaleina e a seguir realizada a titulação até o ponto de
viragem (surgimento da coloração rósea). Cada 1 mL gasto de solução Dornic,
correspondeu a 10 mg de ácido lático (TERRA & BRUM, 1988).
78
3.7 Avaliação da Atividade Antioxidante e Antimicrobiana de Diferentes

Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L. Sobre a Parte
Interna do Salame Tipo Italiano
Para a avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana de diferentes

concentrações de óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum L.) sobre a parte
interna do Salame Tipo Italiano foram produzidos 5 lotes conforme descrito no item
3.5.1, com exceção das amostras com cinco vezes e duas vezes e meia a CIM.
Lotes especais de Salame Tipo Italiano foram produzidos para avaliar a ação
antimicrobiana do óleo essencial de manjericão em relação as bactérias
Staphylococus aureus e Escherichia coli sem a presença das concentrações
denominadas branco, cinco vezes a CIM e duas vezes e meia a CIM. Lotes estes
previamente inoculados com 1x103 UFC g-1 de Staphylococcus aureus e de
Escherichia coli.
As amostras para a realização das análises foram obtidas logo após a

elaboração (zero dia) e no 2°, 7°, 14°, 21°, 28° dia de processamento e após 30 dias
de armazenamento, embalados a vácuo em sacos Barrier Bag com estrutura EVA
multicamadas, termo encolhível, apresentando boa resistência mecânica, barreira ao
vapor d’água – TPH2O máximo 10 g/cm2.dia (1 atm/38°C/90% UR) e alta barreira ao
oxigênio – TPO2 máxima de 30 cm3/m2.dia (1 atm/23°C/O% UR) (Sealed Air
Corporation) a uma temperatura de 22°C na ausência de luz.
3.7.1 Análise da Atividade Antioxidante
Para avaliar a extensão da oxidação lipídica ocorrida nos tratamentos do

Salame Tipo Italiano utilizou-se o teste das substâncias reativas ao ácido 2
tiobarbitúrico (TBA) de acordo com Raharjo et al. (1992), modificado por Wang et al.
(2002) em relação à interferência do açúcar na reação e seguindo remomendações
de Shaidi et al., (1985) no que se refere à adição de sulfanilamida para as amostras
que contém nitrito. Os valores de TBARS foram determinados em triplicata para
79
cada amostra e os resultados foram expressos em miligramas de malonaldeído por

quilograma de amostra.
3.7.2 Análise de Bactérias Lácticas, Bactérias da Família Micrococaceae e Bactérias

Aeróbicas Heterotróficas
Para analisar a atividade antimicrobiana do óleo essencial do Ocimum

basilicum L. frente às bactérias lácticas, bactérias da família Micrococcaceae e
bactérias aeróbicas heterotróficas e com o objetivo de acompanhar o
desenvolvimento destas bactérias, porções de 25 g de salame foram
homogeneizadas com 225 mL de água peptonada 0,1% e diluições decimais foram
utilizadas para realização das análises microbiológicas. .
Para realização das contagens bacterianas, utilizou-se o método de

plaqueamento em profundidade. As bactérias Lácticas foram semeadas em Agar
MRS com sobrecamada, enquanto as bactérias da família Micrococaceae foram
semeadas em Agar MSA, mas ambas foram incubadas a 29°C durante 72 horas. As
bactérias aeróbicas heterotróficas foram semeadas em meio PCA e incubadas a
37°C durante 48 horas, conforme metodologia do Laboratório Nacional de
Referência Animal - LANARA (BRASIL,1992).
3.7.3 Análise de Staphylococcus aureus e Escherichia coli Previamente Inoculados no

Salame Tipo Italiano
Para avaliar a ação antimicrobiana do óleo essencial de manjericão no Salame

Tipo Italiano em relação a Staphylococus aureus e Escherichia coli, previamente
inoculados com 1x103 UFC g-1 e com o objetivo de acompanhar o desenvolvimento
destas bactérias, porções de 25 g de salame foram homogeneizadas com 225 mL
de água peptonada 0,1% e diluições decimais foram utilizadas para realização das
análises microbiológicas.
80
Foram realizadas determinações de Staphylococcus coagulase negativa em

meio Agar Baird-Parker pelo método de plaqueamento em superfície,
Staphylococcus coagulase positiva utilizando a prova bioquímica da coagulase com
plasma de coelho e Escherichia coli em meio Agar MacConkey pelo método de
plaqueamento em profundidade. Ambas foram incubadas a 37°C durante 48 horas.
A prova da coagulase foi realizada em banho maria a 37°C durante 4 horas. Estas
análises foram realizadas segundo a metodologia do Laboratório Nacional de
Referência Animal – LANARA (BRASIL,1992).
3.8 Análises Estatísticas
Todas as análises foram realizadas em triplicata. Os resultados foram

analisados estatisticamente através de cálculos de média, desvio padrão, análise de
variância e teste de Tukey com significância ao nível de 5% (p<0,05), utilizando o
software STATISTICA versão 6.1 (Statsoft Inc, USA).
81
BRASIL – Ministério da Agricultura, Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária.

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83
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capítulo são apresentados os resultados e discussões referentes aos

efeitos do óleo essencial de Ocimum basilicum L. sobre a atividade antimicrobiana e
antioxidante. Estes estão divididos em caracterização química do óleo, determinação
das atividades in vitro, análise sensorial para determinação das concentrações a
serem utilizadas no Salame Tipo Italiano, bem como as análises físico-químicas e
microbiológicas realizadas no mesmo.
4.1 Extração e Análise da Composição Química do Óleo Essencial de

Manjericão (Ocimum basilicum L.) Obtido por Hidrodestilação
O valor médio do rendimento em base seca obtido na extração por

Hidrodestilação (Clevenger) do óleo essencial de manjericão foi de 1,2% ± 0,14
como pode ser observado na Figura 01.
1,2
1
Volume (mL)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80 100
Tempo (min)
Figura 01 - Curva de Extração do óleo essencial de Ocimum basilicum L. obtido pelo

método de Hidrodestilação.
84
O volume extraído do óleo essencial estabilizou a partir do tempo de 60

minutos.
A análise do óleo essencial foi feita por CG/EM e os picos foram integrados de
modo manual sendo a identificação dos compostos feita por comparações do
espectro de massas com os espectros existentes no banco de dados do
equipamento (Wiley).
Na Tabela 01 e Figura 02 observamos os compostos químicos presentes no

óleo essencial de Ocimum basilicum L. obtido na extração, sendo o linalol
componente majoritário (71,01%). Resultados similares foram encontrados por Lee
et al. (2005) e Bozin et al. (2006).
Tabela 01 – Compostos químicos selecionados, após análise do cromatograma do

óleo essencial de Ocimum basilicum L. analisado por Cromatografia Gasosa e
Espectrometria de Massas.
Picos Nome do Composto Tempo de Retenção (min) Área (%)
1 Beta pineno 6.842 0,58

2 1,8 cineol. 9.325 8,27
3 Linalol 14.175 71.01
4 Canfora 15.217 1.09
5 Bornil acetato 22.742 1.56
6 Beta elemeno 28.133 1.79
7 Trans cariofileno 30.333 4.84
8 Germacreno D 32.417 0.87
9 Alfa guaieno 33.692 1.27
10 Delta Cadieno 34.125 1.99
11 Aromadendreno 40.325 6.73
85
T IC
3
60e6
50e6
40e6
2
30e6
20e6
11
10e6 4
1
10
9
6
5
8
5 10 15 20 25 30 35 40
Figura 02 – Cromatograma obtido para o óleo essencial de Ocimum basilicum L.

pela análise de CG-EM
4.2 Atividade Antimicrobiana e Antioxidante in vitro
Buscando-se determinar o potencial de uso do óleo essencial de Ocimum

basilicum L. como agente antimicrobiano e antioxidante para posterior uso do
mesmo em produtos cárneos (Salame Tipo Italiano), avaliou-se a atividade
antimicrobiana pelo método de difusão em placas como teste qualitativo e
determinou-se a concentração inibitória mínima do mesmo, como teste quantitativo.
Também foi avaliada a atividade antioxidante in vitro pela captura de radicais livres
com o teste de DPPH.
4.2.1 Atividade Antimicrobiana in vitro pelo Método de Difusão em Placas
A análise da atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjericão foi

testada em relação à 18 microrganismos, 6 Gram-positivos e 12 Gram-negativos,
passíveis de serem encontrados em embutidos cárneos, através do método de
difusão em placas. Nas Tabelas 02a e 02b são apresentados os halos de inibição
(mm) obtidos para o óleo essencial de manjericão (Ocimum basilicum L.) e para o
86
clorafenicol, estando incluídos nesses valores o diâmetro do disco de papel

empregado que foi de 7 mm.
Tabela 02a - Atividade Antimicrobiana do óleo essencial de Ocimum basilicum L. e

do cloranfenicol sobre as bactérias Gram-positivas obtidas pelo método de difusão
em placas.
Bactérias Gram-positivas ATCC Ocimum basilicum L. (5 µL) Cloranfenicol (30 µg)

Halo médio (mm) Halo médio (mm)
Enterococcus faecalis 19433 10,3 25,33

Micrococcus luteus 10240 13,5 39,3
Sarcina sp * 14,6 29,6
Saphylococcus aureus 6538 13,0 27,6
Staphylococcus 12228 12,5 30,6
epidermidis
Streptococcus mutans 25175 11,0 27,0
Média 12,48 29,90
ATCC: American Type Culture Colletction – (USA)
* Obtidos a partir do Instituto Biológico - Campinas, SP
Tabela 02b - Atividade Antimicrobiana o óleo essencial de Ocimum basilicum L. e do

cloranfenicol sobre as bactérias Gram-negativas obtidas pelo método de difusão em
placas.
87
Bactérias Gram-negativas ATCC Ocimum basilicum L. (5 µL) Cloranfenicol (30 µg)
Halo médio (mm) Halo médio (mm)
Acinetobacter sp * 15,0 16,6

Aeromonas sp * 10,6 28,0
Citrobacter freundii 8090 11,6 21,0
Escherichia coli 25922 10,3 25,3
Klebsiella pneumoniae 13833 12,2 30,3
Proteus mirabilis 25933 11,3 21,6
Proteus vulgaris 13315 18,0 23,6
Pseudomonas aeruginosa 27853 ** 12,5
Salmonella choleraesuis 10708 10,0 27,0
Serratia marcescens 13880 16,6 34,0
Shigella flexneri 12022 17,1 27,3
Yersinia enterocolitica 10460 12,6 24,6
Média 13,2 26,52
ATCC: American Type Culture Colletction – (USA)
* Obtidos a partir do Instituto Biológico - Campinas, SP
**Não houve inibição microbiana
Todas as bactérias avaliadas sofreram efeito inibitório do óleo essencial com

exceção à bactéria Pseudomonas aeruginosa. Este resultado está de acordo com o
estudo de Bozin et al. (2006) onde foram testados óleos essenciais de Ocimum
basilcum L., Origanum vulgare L. e Thymus vulgaris L., e foi observado que o óleo
essencial de Ocimum basilicum L. não apresentou atividade antimicrobiana sobre
esta bactéria em diferentes concentrações.
A maior atividade antimicrobiana do óleo essencial de manjericão foi

observada sobre a bactéria Proteus vulgaris com a formação de 18,0 mm de halo. Já
a menor atividade foi sobre a bactéria Salmonella choleraesuis com 10,0 mm de
halo.
Estes resultados demonstram que este método de avaliação pode ser

utilizado como método de avaliação prévio, por ser reconhecido e determinar a
88
sensibilidade de muitos microrganismos a determinados fármacos, produzindo

resultados semi-quantitativos, ainda que de acordo com alguns autores só
qualitativos e nem sempre reprodutíveis (JANSSEN et al., 1987). No entanto, ainda
é a técnica mais comum para a avaliação de antibacterianos e antifúngicos de óleos
essenciais, por ser de fácil execução e requerer pequenas quantidades de amostra
(JANSSEN et al., 1987; KALEMBA & KUNICA, 2003; KATZUNG, 2003).
4.2.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
As concentrações inibitórias mínimas foram avaliadas a partir da densidade

ótica em comprimento de onda de 490 nm em microplacas. As concentrações de
óleo essencial testado no experimento para os 17 microrganismos selecionados que
apresentaram atividade antimicrobiana foram de 0; 0,01; 0,05; 0,075; 0,1; 0,25; 0,5;
0,75; 1,0; 2,5; e 5,0 mg mL -1, conforme demonstrado nas Figura 03 para as bactérias
Staphylococcus epidermidis (Gram-positivo) e Eschericha coli (Gram-negativo).
89
Figura 03 – Gráfico representativo da determinação da concentração inibitória

mínima do óleo essencial de manjericão sobre Staphylococcus epidermidis (A) e
sobre Escherichia coli (B).
A ação antimicrobiana dos componentes dos óleos essenciais pode ocorrer de

três formas: pela interferência na dupla camada fosfolipídica da parede celular; pelo
aumento da permeabilidade e perda dos constituintes celulares e por alteração de
uma variedade de sistemas enzimáticos, incluindo aqueles envolvidos na produção
de energia celular e síntese de componentes estruturais ou por inativação e
destruição do material genético (KIM et al.,1995; SVOBODA E DEANS, 1995;
BARATTA et al., 1998a,b; COWAN, 1999; COX et al., 2000; KALEMBA & KUNICKA,
2003; BAGAMBOULA et al., 2004; DELAMARE et al., 2005).
A avaliação dos resultados da CIM demonstrou que todos os microrganismos

apresentaram-se suscetíveis ao óleo essencial de manjericão (Tabelas 03a e 03b).
90
Tabela 03a - Atividade Antimicrobiana avaliada pelo método da concentração

positivas.
Bactérias Gram-positivas CIM (mg mL-1)
Enterococcus faecalis 0,75

Micrococcus luteus 0,50
Sarcina sp 0,75
Saphylococcus aureus 1,00
Staphylococcus epidermidis 0,75
Streptococcus mutans 0,75
Média 0,75
Tem sido relatada por alguns autores a menor susceptibilidade das bactérias
Gram-negativas aos óleos essenciais, podendo estar relacionada com a dificuldade
destes em difundir a membrana externa, ocasionada pela presença de uma barreira
hidrofílica, que embora não seja totalmente impermeável, dificulta a passagem de
macromoléculas e componentes hidrofóbicos (JANSSEN et al.1987; SHAPIRO et al.
1994; HELANDER et al., 1998; HAMMER et al., 1999; VELICKOVIC et al., 2002;
KALEMBA E KUNICKA, 2003; BAGAMBOULA et al., 2004; TEPE et al., 2004).
Tabela 03b - Atividade Antimicrobiana avaliada pelo método da concentração

negativas.
Bactérias Gram-negativas CIM (mg mL-1)
91
Acinetobacter sp. 0,75

Aeromonas sp. 1,0
Citrobacter freundii 1,0
Escherichia coli 1,0
Klebsiella pneumoniae 0,75
Proteus mirabilis 1,0
Proteus vulgaris 0,75
Salmonella choleraesuis 0,50
Serratia marcescens 0,25
Shigella flexneri 0,75
Yersinia enterocolitica 0,25
Média 0,73
Os resultados obtidos neste trabalho não demonstram tendência das bactérias

Gram-negativas serem menos sensíveis ao óleo essencial de manjericão pelo fato
de que se compararmos as médias das concentrações inibitórias mínimas das
bactérias Gram-negativas com as bactérias Gram-positivas, nota-se que são
semelhantes (Tabelas 03a e 03b).
Comparando-se as concentrações inibitórias mínimas com os diâmetros dos

halos obtidos, observa-se que não houve uma relação direta entre estes resultados
para os diversos tipos de bactérias analisadas. Estes dados confirmam que o
método de difusão em placas não pode ser empregado como única forma de
determinação quantitativa da atividade antimicrobiana, confirmando os resultados
obtidos por Janssen et al. (1987).
Observa-se também que este óleo essencial de manjericão apresentou um

amplo espectro de ação, semelhante aos óleos essenciais de outras espécies como
o do orégano (BUSATTA et al., 2007) e da manjerona (BUSATTA et al., 2008).
Como o composto majoritário do óleo essencial de manjericão (linalol) é

conhecido por não possuir uma alta atividade antimicrobiana (BAGAMBOULA et al.
2004), atribui-se o amplo espectro de ação ao sinergismo entre compostos
92
majoritários e minoritários o qual deve ser levado em conta por potencializar o efeito
da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais (KUSTRAK & PEPELJNJAK, 1989;
SAVELEV et al., 2003; DELAMARE et al., 2005).
4.2.3 Atividade Antioxidante in vitro pela captura de radicais livres com o teste do
Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH)
No teste de DPPH, a habilidade do óleo essencial de manjericão agir como

doador de átomos de hidrogênio ou elétrons na transformação de DPPH na forma
reduzida de DPPH – H (difenilpicrilhidrazina) é medido espectrofotometricamente. O
DPPH é um radical livre, estável em temperatura ambiente que produz uma solução
violeta em etanol. Na presença de componentes antioxidantes o DPPH é reduzido
produzindo uma solução etanólica transparente.
Os resultados obtidos após a determinação da atividade antioxidante do óleo

essencial de manjericão em diferentes concentrações encontram-se na Tabela 04.
Podemos observar que o percentual antioxidante aumenta proporcionalmente a
concentração de óleo adicionado atingindo 70,49% de atividade antioxidante para a
concentração 20000 µg mL-1.
Tabela 04 - Porcentagem da neutralização do DPPH sobre óleo essencial de

manjericão (Ocimum basilicum L.)
Concentrações (µg.mL-1) (AA%)
2500 13,59
3750 22,20
5000 29,60
7500 33,00
10000 44,81
93
12500 55,73
15000 63,65
17500 65,63
20000 70,49
A faixa de concentração de 2500 – 20000 µg mL-1 foi utilizada para construção

da curva de calibração. Após a identificação da faixa de concentração com aumento
linear em relação à atividade antioxidante, traçou-se a equação da reta (Figura 04) e
então foi determinado a concentração de óleo essencial necessária para capturar
50% do radical livre DPPH (IC50) do óleo essencial de manjericão.
80
Atividade Antioxidante (%)
70
60
50
y = 0,0033x + 10,387
40 2
R = 0,9681
30
20
10
0
0 5000 10000 15000 20000 25000
-1
Concentrações de óleo (µg mL )
Figura 04: Curva de calibração da atividade antioxidante do óleo essencial de

manjericão (Ocimum basilcum L.).
A correlação entre a atividade antioxidante (%) e a concentração de óleo

utilizado (Y = 0,0033x + 10,387) com R 2 = 0,9681 forneceu um IC 50 de 12.003,93 µg
mL-1, que é a concentração de óleo essencial necessária para apresentar 50 % de
atividade antioxidante. Esta atividade antioxidante pode ser considerada baixa em
94
relação à atividade antioxidante média de outros tipos de extratos vegetais, mas na

mesma ordem de grandeza de atividade, de óleos essenciais de diversas outras
espécies.
Segundo Mensor et al. (2001), a planta Ginkgo biloba é uma das plantas
consideradas com alta atividade antioxidante, pois possui um IC50 de 38,91 µg mL-1.
Isso demonstra que o óleo essencial de Ocimum basilicum L. apresenta uma baixa
atividade antioxidante quando comparado com o extrato de G. Biloba, cerca de 348
vezes menos.
Diversos autores avaliaram a atividade antioxidante de óleos essenciais de

algumas plantas e encontraram os seguintes resultados: Hippomarathrum
microcarpum com IC50 de 10.690 µg mL-1, Chaerophyllum libanoticum com IC50
superior a 30.000 µg mL -1, Rosmarinus officinalis com IC50 de 20.000 µg mL-1,
Artemisia fragrans com IC50 de 7.860 µg mL-1 e Artemisia austriaca com IC50 de
8.060 µg mL-1, Petroselinum crispum L. com IC50 de 80.210 µg mL-1 (OZER et al.,
2007; DEMIRCI et al., 2007; WANG et al. 2007; DELAZAR et al., 2007; ZHANG et
al., 2006). Bozin et al. (2006) avaliaram óleo essencial de Manjericão (Ocimum
basilicum L.) encontrando valores de IC 50 de 0,39 µg mL-1, estando em desacordo
com os resultados obtidos neste trabalho por apresentar atividade antioxidante
inúmeras vezes maior como também, em relação aos resultados obtidos pelos
demais autores citados.
Lee et al. (2005), em estudos de identificação de componentes voláteis e

suas propriedades antioxidantes em manjericão (Ocimum basilicum L.) e folhas de
tomilho (Thymus vulgaris), evidenciam que o linalol é o componente majoritário
encontrado no manjericão e o terceiro principal composto do tomilho. Doze
compostos de manjericão e tomilho (dentre estes o linalol) foram examinados para
atividade antioxidante. O eugenol, timol, carvacrol e o alilfenol foram os compostos
que apresentaram maior atividade antioxidante, comparados a antioxidantes
conhecidos como o BHT e α-tocoferol.
95
Tepe et al. (2007), avaliaram a atividade antioxidante do óleo essencial e de

vários outros extratos de Nepeta flavida (Nepeta flavida Uber-Mor., 1978), a qual
possui como componetes majoritários o 1,8-cineol e o linalol. Observaram uma alta
atividade antioxidante do óleo, mas atribuída somente ao 1,8-cineol, e consideram
não haver atividade antioxidante significativa do linalol.
4.3 Avaliação Sensorial
Embora os óleos essenciais sejam bastante estudados, o seu uso em

alimentos como substâncias antimicrobianas e antioxidantes é bastante limitado
devido à alteração dos sabores, pois doses eficazes contra microrganismos podem
mudar a aceitabilidade do produto. Como conseqüência, há uma demanda crescente
para conhecer as concentrações dos óleos essenciais que permitam atingir um
balanço entre a eficácia como agente antimicrobiano e/ou antioxidante e a
aceitabilidade sensorial (KOUTSOUMANIS et al.,1998).
Neste sentido, foram feitas análises sensoriais (cor, aroma e sabor) da adição
de diferentes concentrações do óleo essencial de Ocimum basilicum L. sobre
Salame Tipo Italiano, a fim de determinarem-se as concentrações passíveis de
serem utilizadas no produto sem alterações sensoriais significativas. Cabe ressaltar
que quanto maior a pontuação atribuída pelos avaliadores, maior a diferença em
relação ao padrão.

essencial de manjericão e para o salame não contendo nenhum agente antioxidante
(branco).
Amostras Média das Pontuações*
Cor Aroma Sabor
Branco 0,76 b 0,94 c 0,78 d
96
0,19 mg g-1 (um quarto da CIM) 1,73 ab 1,63 bc 2,78 c

0,38 mg g-1 (metade da CIM) 1,97 ab 2,31 b 4,31 b
-1
0,75 mg g (CIM) 1,27 ab 2,77 b 4,03 bc
1,87 mg g-1 (duas vezes e meia a CIM) 1,82 ab 6,37 a 7,81 a
3,75 mg g-1 (cinco vezes a CIM) 2,24 a 7,09 a 8,28 a
* Médias seguidas de letras iguais em cada coluna não diferem em nível de 95% de
confiança (Teste de Tukey). Onde: 0 = nenhuma diferença; 2 = ligeiramente diferente; 4 =
moderadamente diferente; 6 = muito diferente; 9 = extremamente diferente.
De acordo com a escala de pontuação do teste de diferença do controle

(Apêndice A, Figura A01), a maioria das amostras diferiram estatisticamente
(p<0,05) em relação a amostra do branco (sem antioxidante), ressaltando que não
houve diferença significativa (p<0,05) da concentração 0,75 mg g -1 para o atributo
cor e, da concentração de 0,19 mg g-1 para o atributo aroma.
As diferenças podem ser interpretadas como ligeiramente diferente nos demais

tratamentos para o atributo cor; ligeiramente diferente nas concentrações 0,38 mg
g-1 e 0,75 mg g-1, muito diferente na concentração 1,87 mg g -1 e extremamente
diferente na concentração de 3,75 mg g -1 para o atributo aroma; ligeiramente
diferente na concentração 0,19 mg g -1, moderadamente nas concentrações 0,38 mg
g-1 e 0,75 mg g-1 e extramente diferente nas concentrações 1,87 mg g -1 e 3,75 mg g-1
para o atributo sabor, conforme demonstrado na Tabela 5 (Apêndice A, Figura A01
e Apêndice B, Tabela B01).

essencial de manjericão e para o salame sucedâneo ao comercial (padrão).
Amostras Média das Pontuações*
Cor Aroma Sabor
97
Padrão 1,73 a 1,40 c 0,83 c

0,19 mg g-1(um quarto da CIM) 2,18 a 2,43 c 3,87 b
0,38 mg g-1 (metade da CIM) 2,08 a 4,15 b 4,87 b
-1
0,75 mg g (CIM) 2,53 a 4,03 b 4,90 b
1,87 mg g-1 (duas vezes e meia a CIM) 2,48 a 6,45 a 7,77 a
3,75 mg g-1 (cinco vezes a CIM) 2,33 a 7,45 a 8,57 a
* Médias seguidas de letras iguais em cada coluna não diferem em nível de 95% de
confiança (Teste de Tukey). Onde: 0 = nenhuma diferença; 2 = ligeiramente diferente; 4 =
moderadamente diferente; 6 = muito diferente; 9 = extremamente diferente.
Para as amostras avaliadas contendo diferentes concentrações de óleo

essencial de manjericão frente ao padrão (formulado similar ao produto produzido
industrialmente), não houve diferença significativa (p<0,05) em nenhum dos
tratamentos com relação ao atributo cor. Porém, houve diferença significativa
(p<0,05) da amostra padrão para todos os tratamentos em relação aos atributos
aroma e sabor, respectivamente.
Cabe ressaltar que a concentração 0,19 mg g -1 diferiu ligeiramente, as

concentrações 0,38 mg g-1 e 0,75 mg g-1, diferiram moderadamente, a concentração
1,87 mg g-1, diferiu muito e a concentração 3,75 mg g -1 diferiu extramente do padrão
em relação ao atributo aroma. Com relação ao atributo sabor, as concentrações 0,19
mg g-1, 0,38 mg g -1
e 0,75 mg g-1 diferiram moderadamente e as concentrações 1,87
mg g-1 e 3,75 mg g-1 diferiram extramente do padrão conforme demonstrado na
Tabela 06 (Apêndice A, Figura A01 e Apêndice B, Tabela B02).
Embora tenha ocorrido diferenças significativas (p<0,05) na maioria dos

tratamentos relacionados às amostras do branco e do padrão, o critério utilizado
para a escolha das concentrações usadas (0,19 mg g -1, 0,38 mg g-1 e 0,75 mg g-1)
nos testes de avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana do óleo essencial
de manjericão levaram em consideração o teste da diferença do controle haja vista
que os provadores não detectaram grandes diferenças (ligeiramente a
moderadamente diferente) entre as amostras do branco e do padrão e as
concentrações escolhidas para realização deste trabalho.
98
4.4 Análises Físico-químicas
4.4.1 pH
As mudanças nos valores de pH durante o processamento do Salame Tipo

Italiano e após a estocagem durante 30 dias a 22°C são apresentados na Tabela 07
e Figura 05.
A redução do pH é responsável pela liberação de água do produto fermentado,

pela troca do estado sol para gel pela proteínas miofibrilares, conferindo textura
característica deste produto, além de interferir no potencial de membrana dos
microrganismos deteriorantes e patogênicos e reduzir a quantidade de água livre
para suas reações bioquímicas (BRANEN & DAVIDSON, 1983).
Tabela 07 – Valores de pH na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo

temperatura de 22°C.
99
Tempo (dias)
0 dia 2o dia 7o dia 14o dia 21º dia 28º dia 60º dia
Padrão 5,80bA 4,51bD 4,25bE 4,50bD 4,70abC 4,71bC 4,79bcB

± 0,015 ± 0,01 ± 0,025 ± 0,031 ± 0,050 ± 0,025 ± 0,015
Branco 6,01aA 4,68aBC 4,45aD 4,59abC 4,63bC 4,70bBC 4,81abB

± 0,095 ± 0,056 ± 0,006 ± 0,025 ± 0,029 ± 0,051 ± 0,006
0,75 mg g-1 5,81bA 4,53bE 4,26bF 4,68aD 4,78aCD 4,83aC 5,11aB

± 0,015 ± 0,030 ± 0,053 ± 0,078 ± 0,075 ± 0,014 ± 0,038
0,38 mg g-1 6,00aA 4,69aD 4,40aE 4,62aB 4,76aBC 4,72bB 4,79bcB

± 0,044 ± 0,023 ± 0,032 ± 0,015 ± 0,006 ± 0,023 ± 0,015
0,19 mg g-1 5,92abA 4,70aBC 4,45aD 4,65aC 4,76aB 4,76abB 4,76cB

± 0,061 ± 0,06 ± 0,021 ± 0,025 ± 0,021 ± 0,017 ± 0,015
NOTA: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05),
sendo comparadas letras minúsculas em colunas e maiúsculas em linhas. Padrão:
Eritorbato de Sódio 0,6 mg g-1 (antioxidante industrial); Branco: sem antioxidante; 0,75 mg g -
1
; 0,38 mg g-1; 0,19 mg g-1: concentrações de óleo essencial de manjericão.
No segundo dia os valores de pH baixaram variando entre 4,51 (padrão) e 4,70

(0,19 mg g-1 de óleo), atingindo seus valores mínimos no sétimo dia onde variou de
4,25 (padrão) a 4,45 (0,19 mg g-1 de óleo). Essa diminuição de pH estaria
relacionada com o acúmulo de ácido láctico produzido pelas bactérias lácticas
presentes no starter adicionado (TERRA, 1998). Esta redução de pH é importante
pois caracteriza a etapa de fermentação, a qual propicia a produção de salames de
alta qualidade e com segurança alimentar, pois ocorre inibição no desenvolvimento
da flora microbiana indesejável, assim como auxilia na formação dos pigmentos
responsáveis pela cor, influenciando também na formação de compostos
relacionados ao sabor e aroma (LÜCKE, 1994, CAPLICE et al., 1999).
A partir do décimo quarto dia, observou-se pequeno acréscimo nos valores de

pH variando entre 4,50 (padrão) e 4,68 (0,75 mg g -1 de óleo) que se estendeu até o
final do processamento com valores de 47,0 (branco) e 4,83 (0,75 mg g -1 de óleo)
não havendo praticamente alteração durante a estocagem. Este comportamento
100
estaria relacionado com a produção de amônia e de aminas biogênicas como

resultado da atividade enzimática (LÜCKE, 1998).
As diferentes concentrações do óleo essencial de manjericão não afetaram

significativamente os valores de pH durante o processamento e estocagem do
Salame Tipo Italiano, sugerindo desta forma que o óleo não interferiu no processo
fermentativo.
6 ,2
6 ,0
P a d rã o
B ra n c o
5 ,8 0 ,7 5 m g g -1
0 ,3 8 m g g -1
0 ,1 9 m g g -1
5 ,6
5 ,4
5 ,2
pH
5 ,0
4 ,8
4 ,6
4 ,4
4 ,2
4 ,0
0 7 14 21 28 60
T e m p o (d ia s )
Figura 05 – Valores de pH na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo

temperatura de 22°C.
4.4.2 Atividade de Água (aw)
As mudanças nos valores de atividade de água (a w) do Salame Tipo Italiano são

mostradas na Tabela 08 e Figura 06.
Tabela 08 - Valores de aw na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo

101

temperatura de 22°C
Tempo (dias)
0 dia 2o dia 7o dia 14o dia 21o dia 28o dia 60o dia
Padrão 0,963bA 0,952aAB 0,942aB 0,886aC 0,850bD 0,824aE 0,802aF

± 0,0001 ± 0,002 ± 0,0038 ± 0,0072 ± 0,005 ± 0,0065 ± 0,0015
Branco 0,971aA 0,938bB 0,938aB 0,890aC 0,813dD 0,775cE 0,773cE

± 0,001 ± 0,0051 ± 0,051 ± 0,0035 ± 0,0038 ± 0,009 ± 0,0006
0,75 mg g-1 0,964bA 0,957aA 0,939aA 0,884aB 0,872aB 0,825ªC 0,795aC

± 0,000 ± 0,001 ± 0,0012 ± 0,0135 ± 0,0015 ± 0,0015 ± 0,0064
0,38 mg g-1 0,971aA 0,940bB 0,940aB 0,894aC 0,844bcD 0,798bE 0,781bcF

± 0,003 ± 0,0044 ± 0,0044 ± 0,0053 ± 0,0036 ± 0,0026 ± 0,0036
0,19 mg g-1 0,965bA 0,935bB 0,935aB 0,897aC 0,837cD 0,785bcE 0,783cE

± 0,023 ± 0,002 ± 0,002 ± 0,0006 ± 0,0025 ± 0,002 ± 0,0025
sendo comparadas letras minúsculas em colunas e maiúsculas em linhas. Padrão: Eritorbato
de Sódio 0,6 mg g-1 (antioxidante industrial); Branco: sem antioxidante; 0,75 mg g -1; 0,38 mg g-
1
; 0,19 mg g-1: concentrações de óleo essencial de manjericão.
A atividade de água diminuiu nos cinco tipos de salames elaborados durante o

processamento, variando de 0,963 (padrão) a 0,971 (branco) no zero dia a 0,775
(branco) e 0,824 (padrão) no final do processamento (vigéssimo oitavo dia)
mantendo-se praticamente estável durante a estocagem a 22°C. Esta redução pode
ser atribuída ao decréscimo dos valores de pH, pois a capacidade de retenção de
água das proteínas é diminuída quando o pH se aproxima do seu ponto isoelétrico,
acelerando a desidratação e consequentemente reduzindo o pH (CHASCO et
al.,1996).
A atividade de água indica a quantidade de água livre contida em um alimento,

a qual constitui um meio que possibilita a reprodução, transferência e contaminação
microbiológica. A atividade de água mede o potencial de biodegradação dos
102
materiais, que é o responsável pelas alterações de cor, odor, sabor , textura e shelf-
life de um produto alimentício (RODRIGUES, 1998).
O principal fator na estabilidade de um alimento não é, portanto, o seu teor de

umidade, mas sim a disponibilidade de água para o crescimento microbiano e o
desenvolvimento de reações químicas. Conceitualmente, o termo atividade de água
tem sido utilizado por pesquisadores e cientistas da área de alimentos para
quantificar esta disponibilidade de água (COULTATE, 2002).
No décimo quarto dia em diante os valores de atividade de água encontrados

nos cinco tipos de salames elaborados foram inferiores ao valor máximo,
determinado pela legislação, que é de 0,90 (BRASIL, 2000). Os valores encontrados
neste experimento demonstram que a atividade de água está bem abaixo de 0,88,
resultando em prejuízo para a textura do produto (TERRA, 1998).
A adição do óleo essencial de manjericão não teve influência na diminuição

da atividade de água durante o processamento e estocagem nos diferentes tipos
Salame Tipo Italiano estudados.
0 ,9 8
0 ,9 6 P a d rã o
B ra n c o
0 ,9 4 -1
0 ,7 5 m g g
-1
0 ,9 2 0 ,3 8 m g g
-1
0 ,1 9 m g g
0 ,9 0
0 ,8 8
Aw
0 ,8 6
0 ,8 4
0 ,8 2
0 ,8 0
0 ,7 8
0 ,7 6
0 ,7 4
0 7 14 21 28 60
T e m p o ( d ia s )
103
Figura 06 - Valores de aw na parte interna do Salame Tipo Italiano contendo

diferentes concentrações de óleo essencial de manjericaão durante o período de 28
temperatura de 22°C
4.4.3 Umidade
Os valores relativos à variação da umidade do salame tipo Italiano são

mostrados na Tabela 09 e Figura 07.
Ocorreu a diminuição dos valores de umidade continuamente em todos os

dias de processamento. Os percentuais iniciais de umidade (zero dia) para todos os
tratamentos variaram de 61,33% a 66,43% e ao final do processamento (vinte e oito
dias), a umidade apresentou valores entre 29,97% e 39,56%, mostrando diferença
significativa entre os tratamentos padrão, branco com 0,75 mg g -1 de óleo essencial
de manjericão.
As variações ocorridas entre os tratamentos se devem possivelmente às

diferenças na composição da amostragem para análise, decorrente da maior ou
menor presença de gordura em cada amostra, ou da localização dos salames dentro
da sala de maturação.
Tabela 09 - Valores de Umidade (%) na parte interna do Salame Tipo Italiano

estocagem a temperatura de 22°C.
104
Tempo (dias)
0 dia 2° dia 7° dia 14° dia 21° dia 28° dia 60° dia
Padrão 63,44bA 63,3bA 59,70aB 49,16aC 41,17bD 36,44bE 30,47aF

±0,224 ± 0,270 ±0,225 ±0,421 ±0,591 ±0,454 ±0,089
Branco 66,43aA 63,60bB 51,09cC 43,85cD 35,07dE 29,97dF 29,26abF

±0,654 ±0,521 ±0,490 ±0,497 ±0,923 ±0,799 ±0,970
0,75 mg g-1 63,40bA 65,31aB 60,80ªC 49,95aD 43,71aE 39,56aF 30,12abG

±0,370 ±0,643 ±0,550 ±0,636 ± 0,145 ±0,329 ±0,248
0,38 mg g-1 65,15aA 62,51bB 57,13bC 41,00dD 39,09cD 34,56bcE 29,65abF

±0,863 ±0,369 ±0,980 ±0,566 ±0,514 ±0,969 ±0,885
0,19 mg g-1 61,33cA 58,24cB 52,59cC 47,26bD 39,13cE 34,18cF 28,15bG

±0,685 ±0,586 ±0,758 ±0,283 ±0,629 ±0,771 ± 0,938
1
Na câmara de maturação, a utilização de altas temperaturas, durante a etapa

inicial de elaboração de embutidos fermentados é uma prática de rotina, sendo que
as temperaturas decrescem progressivamente a medida que a secagem avança,
juntamente com a diminuição da umidade relativa (VARNAN & SUTHERLAND,
1998).
105
70
P a d rã o
65 B ra n c o
-1
0 ,7 5 m g g
60 0 ,3 8 m g g -1
-1
0 ,1 9 m g g
55
Umidade (%)
50
45
40
35
30
25
0 7 14 21 28 60
Figura 07 - Valores de Umidade (%) na parte interna do Salame Tipo Italiano

4.4.4 Acidez
Os valores de ácido láctico obtidos nos diferentes tratamentos de salame tipo

Italiano durante o processamento e estocagem estão demonstrados na Tabela 10 e
Figura 08.
Tabela 10 - Valores de acidez (mg kg -1) na parte interna do Salame Tipo Italiano
106

Tempo (dias)
Padrão 0,059aD 0,093abC 0,093abC 0,096bC 0,127aB 0,135aB 0,151aA

±0,003 ±0,0001 ±0,005 ±0,001 ±0,003 ±0,005 ±0,005
Branco 0,052abD 0,084bcC 0,099abBC 0,102bB 0,133aA 0,138aA 0,141aA

±0,005 ±0,0001 ±0,005 ±0,0001 ±0,010 ±0,008 ±0,005
0,75 mg g-1 0,056abC 0,093abB 0,090bB 0,096bB 0,129aA 0,134aA 0,139aA

±0,003 ±0,0001 ±0,005 ±0,010 ±0,0001 ±0,014 ±0,005
0,38 mg g-1 0,058aF 0,078cE 0,102aD 0,120aC 0,127aBC 0,133aB 0,147aA

±0,0001 ±0,005 ±0,0001 ±0,0001 ±0,005 ±0,005 ±0,005
0,19 mg g-1 0,049aF 0,087bE 0,099abD 0,120aC 0,121aC 0,133aB 0,149aA

±0,0001 ±0,005 ±0,005 ±0,0001 ±0,0001 ±0,005 ±0,005
1
Os valores iniciais de acidez (zero dia) variaram para todos os tratamentos de

0,049 mg kg-1 a 0,059 mg kg-1 e, ao final do processamento (vinte e oito dias)
apresentava-se entre 0,133 mg kg -1 e 0,138 mg kg-1. Ocorreram diferenças
significativas entre os diferentes tipos de salames no 2°, 7° e 14° dias de
processamento. Os valores de acidez aumentaram durante o período de estocagem
nos cinco tipos de salames elaborados.
Os valores de pH (Tabela 07 e Figura 05) diminuíram a partir do segundo dia

de processamento, indicando que ocorreu aumento na quantidade de ácido láctico
(Tabela 10 e Figura 08), caracterizando assim o início da fermentação. O aumento
na quantidade de ácido láctico ficou bem caracterizado pelos resultados das
análises obtidas durante todo o tempo de processamento dentro da câmara. A
produção de grande quantidade de ácido láctico, acompanhada da queda do pH, é
107
resultante da fermentação dos açúcares presentes na massa cárnea sendo

fundamental no processo de fabricação de embutidos fermentados (LANDVOGT &
FISCHER, 1991, COVENTRY & HICKEY, 1991).
A produção de ácido láctico ocorreu devido à ação das bactérias ácido-

lácticas sobre os carboidratos diminuindo o pH e contribuindo para a formação do
produto cárneo fermentado. O ácido láctico caracteristicamente confere um flavor
ácido, contribuindo para desnaturação protéica, resultando na textura peculiar dos
salames fermentados (SMITH & PALUMBO, 1981).
0 ,1 6
0 ,1 4
Ácido Láctico (mg kg-1)
0 ,1 2
0 ,1 0
0 ,0 8
P a d rã o
B ra n c o
-1
0 ,7 5 m g g
0 ,0 6 -1
0 ,3 8 m g g
-1
0 ,1 9 m g g
0 ,0 4
0 7 14 21 28 60
Figura 08 - Valores de acidez (mg kg -1) na parte interna do Salame Tipo Italiano
108
4.5 Efeito de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum

basilicum L. frente à Atividade Antioxidante e Antimicrobiana Sobre a
Parte Interna do Salame Tipo Italiano
Tendo como base a concentração inibitória mínima obtida nas análises in vitro,
e a análise sensorial, com várias concentrações do óleo essencial adicionado na
formulação do Salame Tipo Italiano, foram definidas as concentrações de 0,75 mg
g-1, 0,38 mg g-1 e 0,19 mg g-1 (CIM, metade da CIM e um quarto da CIM,
respectivamente) para avaliar-se o efeito do óleo essencial de Ocimum basilicum L.
em relação a atividade antioxidante e antimicrobiana sobre o produto.
4.5.1 Efeito de Diferentes Concentrações do Óleo Essencial de Ocimum basilicum L.

sobre a Atividade Antioxidante Analisada pelo Índice de TBARS em Salame
Tipo Italiano.
Os valores da atividade antioxidante do óleo essencial de manjericão analisada

pelo índice de TBARS em Salame Tipo Italiano estão demonstrados na Tabela 11 e
Figura 09.
Em todos os dias analisados os valores deTBARS, foram inferiores a 0,4 mg

MDA/kg de amostra, sugerindo que ocorreu pouca oxidação lipídica. Os valores de
TBARS até 1,59 mg MDA/kg de amostra são considerados baixos para serem
percebidos em análise sensorial e não causam alarme para a saúde do consumidor
(TERRA, CICHOSKI & FREITAS 2006). Torres et al. (1994) relatam que a
percepção de ranço em carnes cozidas ocorre quando os valores de TABRS
encontram-se na faixa entre 0,6 a 2,0 mg MDA/kg de amostra.
109
Tabela 11 - Valores de TBARS (mg de Malonaldeido/kg de amostra) na parte interna

após 30 dias de estocagem a temperatura de 22°C.
Tempo (dias)
Padrão 0,163aC 0,157bCD 0,129bD 0,255abB 0,267bAB 0,287bA 0,171cC

± 0,004 ± 0,015 ± 0,006 ± 0,019 ± 0,004 ± 0,009 ± 0,025
Branco 0,089cC 0,252aB 0,281aB 0,282aB 0,351aA 0,375aA 0,298bB

± 0,001 ± 0,018 ± 0,02 ± 0,004 ± 0,001 ± 0,003 ± 0,004
0,75 mg g-1 0,137bCD 0,093cD 0,110bCD 0,149cCB 0,253bA 0,268bA 0,194cB

± 0,002 ± 0,027 ± 0,001 ± 0,034 ± 0,034 ± 0,008 ± 0,002
0,38 mg g-1 0,077dF 0,135bcE 0,299aC 0,231bD 0,339aB 0,358aAB 0,378aA

± 0,001 ± 0,0001 ± 0,02 ± 0,004 ± 0,004 ± 0,006 ± 0,002
0,19 mg g-1 0,102cG 0,185bF 0,305aC 0,224bE 0,337aB 0,362aA 0,277bD

± 0,001 ± 0,004 ± 0,006 ± 0,001 ± 0,010 ± 0,001 ± 0,002
1
Os valores de TBARS para amostra padrão decresceram no intervalo do

tempo zero até o sétimo dia, devido provavelmente pela ação do antioxidante
sintético, porém a partir do décimo quarto dia estes valores apresentaram
comportamento crescente até o vigésimo oitavo dia quando findou a etapa de
processamento do produto. Os valores voltaram a cair durante o tempo em que ficou
armazenado. Comportamento similar ocorreu com a amostra contendo a
concentração de 0,75 mg g-1 de óleo porém, o decréscimo de valores de TBARS se
estendeu do zero até o segundo dia apenas. Para as amostras com 0,38 mg g -1 e
0,19 mg g-1 de óleo, os valores de TBARS apresentaram comportamento crescente
do zero até o sétimo dia, havendo redução nestes valores apenas no décimo quarto
dia e logo a seguir os valores voltaram a aumentar até o vigésimo oitavo dia. Já na
110
amostra denominada branco os valores de TBARS apresentaram comportamento

crescente durante todo tempo de processamento. No período de armazenamento
os valores de TBARS do padrão, branco, com 0,75 mg g -1 e com 0,19 mg g-1 de óleo
diminuiram, enquanto que para a concentração de 0,38 mg g -1 de óleo aumentaram.
Estatisticamente podemos observar que há em termos gerais menor diferença

significativa entre os valores das amostras com 0,75 mg g -1 e o padrão, como
também maior similaridade de valores entre o branco e as demais concentrações.
A redução nos valores de TBARS durante o armazenamento pode ser atribuída

às reações do malonaldeído com as proteínas (NASSU et al., 2003; SAMMET et al.,
2006). Nassu et al. (2003), em estudo avaliando o efeito de diferentes níveis de
alecrim (Rosmarinus officinalis) na estabilidade oxidativa de embutidos fermentados
de carne caprina, relataram valores de TBARS com comportamento similar ao deste
estudo, em um período de armazenamento de 90 dias.
111
0 ,4 0
TBARS (mg malonaldeído/kg de amostra)

0 ,3 5
0 ,3 0
0 ,2 5
0 ,2 0
0 ,1 5 P a d rã o
B ra n c o
-1
0 ,7 5 m g g
0 ,1 0 -1
0 ,3 8 m g g
-1
0 ,1 9 m g g
0 ,0 5
0 7 14 21 28 60
Figura 09 - Valores de TBARS (mg de Malonaldeido/kg de amostra) na parte interna

após 30 dias de estocagem a temperatura de 22°C.

sobre a flora natural de Bactérias da Família Micrococaceae em Salame Tipo
Italiano.
Os valores da contagem de bactérias da família das Micrococaceae em Salame

Tipo Italiano com diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em sua
formulação estão demonstrados na Tabela 12 e Figura 10.
112
Tabela 12 - Desenvolvimento de bactérias da família das Micrococaceae em Salame

Tipo Italiano com diferentes concentrações óleo essencial de manjericão em sua
Log10 UFC g-1.
Tempo (dias)
0 2o 7o 14o 21o 28o 60o
Padrão 3,03aC 4,26aA 4,27cbA 3,59bB 3,04dB 2,98aC 2,88aC

± 0,17 ± 0,07 ± 0,05 ± 0,12 ± 0,04 ± 0,06 ± 0,014
Branco 2,28bcB 3,62b,C 4,25cbA 3,94aA 3,45bB 2,44bC 2,31cC

± 0,23 ± 0,14 ± 0,04 ± 0,06 ± 0,04 ± 0,13 ± 0,01
0,75 mg g-1 2,69abCD 4,20ªA 4,12cA 3,63bB 3,86aB 2,82aC 2,54bD

± 0,11 ± 0,09 ± 0,10 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,14 ± 0,06
0,38 mg g-1 2,32bcB 3,62bC 4,37abA 3,37bB 3,33cB 2,32bC 2,28cC

± 0,27 ± 0,14 ± 0,09 ± 0,11 ± 0,03 ± 0,02 ± 0,03
0,19 mg g-1 1,99cE 3,77b,B 4,52ªA 3,53bC 3,36bcC 2,23bD 2,04dDE

± 0,03 ± 0,01 ± 0,05 ± 0,15 ± 0,5 ± 0,07 ± 0,04
NOTA: médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05), sendo comparadas letras minúsculas em colunas e maiúsculas em linhas.
Padrão: Eritorbato de sódio 0,6 mg g-1 (antioxidante industrial); Branco: sem antioxidante;
0,75 mg g-1; 0,38 mg g-1; 0,19 mg g-1: concentrações de óleo essencial de manjericão.
Os microrganismos da família Micrococaceae auxiliam na coloração sabor e

aroma dos embutidos fermentados. Contribuem na coloração devido a atividade das
enzimas nitrato redutase e catalase, importantes para a formação e estabilidade da
cor, além de prevenir contra a oxidação lipídica (TERRA et al., 2004).
A contagem das bactérias pertencentes à família Micrococaceae em amostras

de salame tipo Italiano, nas diferentes concentrações de óleo essencial de
manjericão, apresentaram valores considerados baixos no zero dia principalmente
para a concentração 0,19 mg g-1 (1,99 ciclos log).
113
Observa-se um aumento na população destas bactérias até o 7º dia de

armazenamento e posterior redução até o 28º dia de maturação. Durante o período
de armazenamento não ocorreram grandes alterações na população destas
bactérias. Também se observa não ter havido influência das diferentes
concentrações do óleo essencial de manjericão sobre as bactérias da família
Micrococaceae, pois embora tenham ocorrido variações entre os diferentes
tratamentos, não existe uma relação direta entre as maiores concentrações e a
maior inibição.
4 ,8
4 ,6
4 ,4
Pa d rã o
4 ,2 B ra n c o
Micrococaceae (Log10 UFC g-1)
4 ,0 0 ,7 5 m g g -1
3 ,8 0 ,3 8 m g g -1
0 ,1 9 m g g -1
3 ,6
3 ,4
3 ,2
3 ,0
2 ,8
2 ,6
2 ,4
2 ,2
2 ,0
1 ,8
0 7 14 21 28 60
Figura 10 - Contagem de bactérias da Família das Micrococaceae em Salame Tipo

Log10 UFC g-1.
Embora, Johansson et al. (1994) relatem que em condições de pH baixo a

quantidade de bactérias da família Micrococaceae sofre redução drástica, morrendo
após o início da fermentação, não foi o que ocorreu neste estudo.
114
Bover-Cid, et al. (1999), demonstraram comportamento similar aos deste

trabalho, das bactérias da família Micrococaceae, em estudo sobre o efeito
proteolítico de cultura starters de Staphylococcus spp. na formação de aminas
biogênicas em salames.
A redução numérica nos valores da atividade de água (aw) a partir do décimo

quarto dia de processamento para valores inferiores a 0,90 seguindo está tendência
até o final do processamento e também durante a estocagem (Tabela 08 e Figura
06), sugere que esta condição tenha tido influência direta no desenvolvimento das
células bacterianas da família Micrococaceae.
A ICMSF (1980), relata que o crescimento de Micrococcus luteus ocorre em

valores de aw de 0,93 porém, ressalva que é possível haver desenvolvimento de
bactérias da família Micrococaceae em aw inferior a 0,9.
Hugas e Monfort 1997, Aksu e Kaya 2004, Kaya e Gökalp 2004, relatam que
em condição de anaerobiose durante a maturação de salames ocorre redução no
desenvolvimento de bactérias da família Micrococaceae.

sobre Bactérias Láticas em Salame Tipo Italiano.
Os valores da contagem de bactérias Lácticas em Salame Tipo Italiano com

diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em sua formulação estão
demonstrados na Tabela 13 e Figura 11.
115
Tabela 13 - Desenvolvimento de bactérias Láticas em Salame Tipo Italiano com

estocagem a temperatura de 22°C. Os valores são expressos em Log 10 UFC g-1.
Leituras (dias)
0 2o 7o 14o 21o 28o 60o
Padrão 5,69bD 7,59abA 7,74aA 6,98bBC 7,59abA 7,44aAB 6,91cC

± 0,03 ± 0,16 ± 0,38 ± 0,05 ± 0,13 ± 0,06 ± 0,04
Branco 5,11cD 7,91aA 7,86aA 7,40aB 7,07cdC 7,07bC 7,08bBC

± 0,08 ± 0,26 ± 0,08 ± 0,08 ± 0,03 ± 0,04 ± 0,01
0,75 mg g-1 6,00aD 7,50bB 8,06aA 7,34aBC 7,94aA 7,41aBC 7,07bC

± 0,09 ± 0,05 ± 0,22 ± 0,16 ± 0,24 ± 0,13 ± 0,06
0,38 mg g-1 5,34cE 7,83abA 7,86aA 7,48ªB 7,27bcC 6,88bD 7,31aBC

± 0,12 ± 0,05 ±0,05 ± 0,04 ± 0,05 ± 0,12 ± 0,01
0,19 mg g-1 5,38cF 7,69abAB 7,90aA 7,49aBC 6,83dE 7,09bD 7,35aC

± 0,18 ± 0,07 ± 0,05 ± 0,02 ± 0,09 ± 0,10 ± 0,05
Padrão: Eritorbato de Sódio 0,6 mg g-1 (antioxidante industrial); Branco: sem antioxidante;
0,75 mg g-1; 0,38 mg g-1; 0,19 mg g-1: concentrações de óleo essencial de manjericão.
A contagem das bactérias láticas em amostras de salame tipo Italiano, nas

diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão, apresentaram aumento
significativo no número de células bacterianas a partir do segundo dia de maturação,
se mantiveram com pequenas flutuações, mas com tendência de permanecerem
estáveis até o final do processamento e também após 30 dias de estocagem do
produto embalado a vácuo. Este incremento na contagem das bactérias lácticas está
relacionado com a adição da cultura starters (Pediocuccus pentosaceus) no início do
processo. As culturas starters desempenharam importante função ao fermentar
116
carboidratos do meio, liberando ácido láctico e reduzindo o pH do meio no segundo

dia (ORDÓÑEZ et al., 1999).
Estudos realizados por Ibañez et al. (1996) revelam que há uma forte
correlação entre o desenvolvimento de bactérias lácticas e a redução do pH.
As bactérias lácticas fazem parte do grupo que compõem os gêneros

Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Vagococcus e Carnobacterium, geralmente produzem ácido lático
como seu maior produto final. São estritamente fermentativas, não sintetizam o
heme, sendo catalase negativas (CONDON, 1987; JAY, 1994).
Segundo Caplice & Fitzgerald (1999), as bactérias ácido lácticas, pelo fato de
possuírem um comportamento geralmente mesofílico, podem desenvolver-se na
faixa de temperatura de 5°C a 45°C e pH entre 4,0 a 4,5, são fracamente
proteolíticas e lipolíticas, exigindo fontes de aminoácidos, purinas e pirimidina, além
de vitaminas do complexo B para o seu crescimento.
As concentrações testadas do óleo essencial de manjericão não inibiram os

microrganismos pertencentes a este grupo, não afetando assim o processo
fermentativo do produto.
117
8 .5
P a d rã o
B ra n c o
8 .0 0 ,7 5 m g g -1
-1
0 ,3 8 m g g
Bactérias Lácticas (Log10 UFC g-1)
7 .5 0 ,1 9 m g g -1
7 .0
6 .5
6 .0
5 .5
5 .0
4 .5
0 7 14 21 28 60
T e m p o (d ia s )
Figura 11 - Contagem de bactérias Lácticas em Salame Tipo Italiano com diferentes

concentrações de óleo essencial de manjericão em sua formulação durante o

sobre Bactérias Aeróbias Heterotróficas em Salame Tipo Italiano.
Os valores da contagem de bactérias Aeróbicas Heterotróficas em Salame Tipo

formulação estão demonstrados na Tabela 14 e Figura 12.
118
Tabela 14 - Desenvolvimento de bactérias Aeróbicas Heterotróficas em Salame Tipo

Log10 UFC g-1.
o o o o o o
0 2 7 14 21 28 60
P a d rã o 5 ,3 7 bD 7 ,6 7 abB 8 ,0 7 aC 7 ,0 5 cC 7 ,5 7 aB 7 ,1 8 aC 6 ,9 6 bC
± 0 ,1 6 ± 0 ,0 4 ± 0 ,1 3 ± 0 ,0 3 ± 0 ,0 1 ± 0 ,0 6 ± 0 ,1 3
B ra n c o 5 ,2 6 bC 7 ,8 6 abA 8 ,0 3 abA 7 ,3 3 bB 6 ,9 9 bB 7 ,0 8 abC 7 ,0 2 bD

± 0 ,0 9 ± 0 ,3 3 ± 0 ,0 5 ± 0 ,0 3 ± 0 ,0 8 ± 0 ,0 9 ± 0 ,0 2
0 ,7 5 m g g -1 5 ,8 3 aE 7 ,5 0 bB C 8 ,1 6 aA 7 ,1 8 bcC D 7 ,8 2 aA B 7 ,1 6 aC D 7 ,0 5 bD
± 0 ,0 8 ± 0 ,0 5 ± 0 ,0 9 ± 0 ,1 6 ± 0 ,2 3 ± 0 ,1 1 ± 0 ,0 5
0 ,3 8 m g g -1 5 ,2 3 bD 7 ,9 4 aA 7 ,9 3 bA 7 ,3 6 bB 7 ,0 2 bC 6 ,8 9 bC 7 ,3 2 aB
± 0 ,2 5 ± 0 ,0 3 ± 0 ,0 3 ± 0 ,0 5 ± 0 ,0 2 ± 0 ,0 3 ± 0 ,0 2
0 ,1 9 m g g -1 5 ,3 5 bE 7 ,7 6 abA B 7 ,8 8 bA 7 ,5 9 aB 6 ,8 0 bD 6 ,8 7 bD 7 ,3 3 aC
± 0 ,1 1 ± 0 ,0 8 ± 0 ,0 3 ± 0 ,0 3 ± 0 ,1 2 ± 0 ,0 9 ± 0 ,0 2
1
A contagem de bactérias aeróbicas heterotróficas em amostras de Salame

Tipo Italiano nas diferentes concentrações do óleo essencial de manjericão,
apresentaram comportamento similar ao das bactérias lácticas. Existe uma
tendência de que os microrganismos adicionados como starters pelo fato de se
comportarem como facultativos (BERGEY’S 1994) não tiveram nenhuma dificuldade
para se multiplicarem neste meio de cultivo.
119
8 .5
P a d rã o
B ra n c o
Bactérias Heterotróficas (Log10 UFC g-1) 8 .0 -1
0 ,7 5 m g g
-1
0 ,3 8 m g g
-1
7 .5 0 ,1 9 m g g
7 .0
6 .5
6 .0
5 .5
5 .0
0 7 14 21 28 60
T e m p o (d ia s )
Figura 12 - Contagem de bactérias Aeróbicas Heterotróficas em Salame Tipo Italiano


sobre Staphylococcus aureus Previamente Inoculado em Salame Tipo Italiano.
Os valores da contagem de Staphylococcus aureus previamente inoculados

(1x103 UFC.g-1) em Salame Tipo Italiano com diferentes concentrações de óleo
essencial de manjericão em sua formulação estão demonstrados na Tabela 15 e
Figura 13.
120
Tabela 15 – Análise do comportamento de Staphylococcus aureus em Salame Tipo

Log10 UFC g-1.
Tempo (dias)
0 2o 7o 14o 21o 28o 60o
Branco 4,18aA 3,79aC 3,67aCD 3,62aD 4,07aAB 4,01a B 3,32aE
± 0,03 ± 0,12 ± 0,05 ± 0,03 ± 0,04 ± 0,02 ± 0,06

0,75 mg g-1 4,05aA 3,74aB 3,55aBC 3,32bC 4,01aA 4,01aA 3,35aC
± 0,06 ± 0,04 ± 0,16 ± 0,03 ± 0,02 ± 0,02 ± 0,10

0,38 mg g-1 4,08aA 3,74aB 3,65aBC 3,56aC 4,01aA 4,01aA 3,38aD
± 0,04 ± 0,02 ± 0,05 ± 0,13 ± 0,01 ± 0,02 ± 0,07

0,19 mg g-1 4,09aA 3,76ªB 3,66ªB 3,64aB 4,11aA 4,02aA 3,60aB
± 0,07 ± 0,01 ± 0,11 ± 0,04 ± 0,07 ± 0,02 ± 0,03

sendo comparadas letras minúsculas em colunas e maiúsculas em linhas. Branco: sem
antioxidante; 0,75 mg g-1; 0,38 mg g-1; 0,19 mg g-1: concentrações de óleo essencial de
manjericão.
Observou-se uma tendência de redução na contagem de S. aureus até o 14º

dia em todos os tratamentos, mas com diferença significativa com a utilização da
concentração inibitória mínima (0,75 mg g -1) quando comparada aos demais
tratamentos. Após este tempo, aos 21º e 28º dias a população de S. aureus torna a
crescer, reduzindo-se novamente aos 60 dias, porém sem diferenças significativas
entre os tratamentos. Assim, pode-se pressupor que a utilização do óleo essencial
de manjericão na concentração inibitória mínima pode auxiliar na redução da
contagem desta bactéria no período inicial de maturação, sendo importante para
produtos comercializados com tempo de maturação curto, porém não é suficiente
para controlar a população desta bactéria em produtos normalmente maturados (28
dias).
121
4 ,3
B ra n co
-1
4 ,2 0 ,7 5 m g g
-1
0 ,3 8 m g g
Staphylococcus aureus (Log10 UFC g-1)

-1
4 ,1 0 ,1 9 m g g
4 ,0
3 ,9
3 ,8
3 ,7
3 ,6
3 ,5
3 ,4
3 ,3
3 ,2
0 7 14 21 28 60
Figura 13 – Análise do comportamento de Staphylococcus aureus em Salame Tipo

Italiano com diferentes concentrações óleo essencial de manjericão em sua
Log10 UFC g-1.
A tendência de flutuação da contagem de S. aureus independentemente dos

tratamentos pode estar associada a alterações de concentração de nitritos e nitratos
que se reduzem durante a maturação do produto e a temperatura de estocagem
após o 28º dia de maturação (22ºC).
Estes resultados indicam que as CIM determinadas in vitro não demonstram a

mesma eficiência quando utilizadas em alimentos. Isso se deve, provavelmente, à
complexidade nutricional e a dificuldade de dispersão do óleo essencial no alimento.
Em particular, as gorduras têm efeito protetor sobre microrganismos e o óleo
essencial, devido a sua polaridade, pode ter tendência de migração para estas
gorduras, reduzindo o seu efeito.
122
Diversos trabalhos mostram a necessidade de aumentar em duas a 100 vezes

a concentração do óleo essencial em relação à CIM (BURT, 2004), porém
geralmente afetando as características sensoriais do produto.

sobre Escherichia coli Previamente Inoculada em Salame Tipo Italiano.
Os valores da contagem de Escherichia coli previamente inoculada (1x10 3

UFC.g-1) em amostras de em Salame Tipo Italiano com diferentes concentrações de
óleo essencial de manjericão em sua formulação estão demonstrados na Tabela 16
e Figura 13.
Tabela 16 – Análise do comportamento de Escherichia coli em Salame Tipo Italiano

durante o período de 28 dias dentro da câmara em processamento e após 30 dias
Tempo (dias)
0 2o 7o 14o 21o 28o 60o
Branco 3,03aA 2,74aA *1,00aB *1,00aB *1,00aB *1,00aB *1,00aB

± 0,06 ± 0,57
0,75 mg g-1 3,03aA 3,02aA *1,00aB *1,00aB *1,00aB *1,00aB *1,00aB

± 0,06 ± 0,06

± 0,12 ± 0,14

± 0,12 ± 0,02
* log10 1,00 UFC g-1 corresponde a < 10 estimado. Branco: sem antioxidante; 0,75 mg g -1;
0,38 mg g-1; 0,19 mg g-1: concentrações de óleo essencial de manjericão.
123
Observou-se que o número de colônias de E. coli a partir do 7° dia em diante

permaneceu connstante em log10 1,00 UFC/g em todos os salames elaborados, e
não diferindo estatisticamente, demonstrando que os fatores do próprio produto
influenciaram no desenvolvimento da E. coli. Estes resultados estão associados às
alterações de pH que ocorreu nos produtos analisados, uma vez que o mesmo
atingiu valores de 4,6 a 4,7 (Tabela 07 e Figura 05) a partir do segundo dia de
processamento. Essa variação de pH foi resultante da fermentação que ocorreu,
promovida pelos microrganismos starters adicionados, e com isso influenciou no
desenvolvimento de microrganismos indesejáveis (LIZASO et al., 1999). Terra et al.
(2004) obtiveram resultados semelhantes em salames fermentados produzidos com
tripa artificial de calibre fino.
3 ,4
B ra n co
3 ,2 -1
0 ,7 5 m g g
-1
3 ,0 0 ,3 8 m g g
-1
0 ,1 9 m g g
Escherichia coli (Log10 UFC g-1 )
2 ,8
2 ,6
2 ,4
2 ,2
2 ,0
1 ,8
1 ,6
1 ,4
1 ,2
1 ,0
0 ,8
0 7 14 21 28 60
Figura 14 – Análise do comportamento de Escherichia coli em Salame Tipo Italiano

durante o período de 28 dias dentro da câmara de processamento e após 30 dias
124
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133
Capítulo 5 – Conclusões e Sugestões
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES
5.1 CONCLUSÕES
A realização do presente trabalho permite, de maneira geral, as seguintes

conclusões em relação aos diferentes tópicos analisados:
Atividade antimicrobiana e antioxidante in vitro:
O óleo essencial de manjericão apresentou bons resultados na ação

antimicrobiana, uma vez que das dezoito bactérias testadas, apenas sobre a
bactéria Pseudomonas aeruginosa, não ocorreu efeito inibitório. Os valores médios
dos halos de inibição foram de 12,48 mm para bactérias Gram-positivas e de 13,2
mm para Gram-negativas.
A variação das Concentrações Inibitórias Mínimas do óleo essencial de

manjericão para as bactérias Gram-positivas variou de 0,50 a 1,00 mg mL-1 com
média de 0,75 mg mL-1, enquanto que para as bactérias Gram-negativas variou entre
0,25 a 1,00 mg mL-1 com média de 0,73 mg mL -1. O óleo essencial de manjericão
apresentou bons resultados como agente antimicrobiano in vitro, não demonstrando
tendência de diferença de sensibilidade entre Gram-positivas e Gram-negativas.
Não houve uma relação direta entre os diâmetros dos halos de inibição e as
concentrações inibitórias mínimas para a maioria das bactérias avaliadas in vitro.
Análise Sensorial:
Concentrações de óleo essencial acima de 0,75 mg g -1 foram classificadas

como muito e extremamente diferentes do padrão em relação ao aroma e sabor, não
sendo aceitas pelo painel teste ou equipe de julgadores.
Análises Físico-químicas:
134
As concentrações de 0,75, 0,38 e 0,19 mg g-1, do óleo essencial de

manjericão testadas na formulação do Salame Tipo Italiano não tiveram influência
significativa sobre os valores de pH, aw, umidade e acidez.
Atividade antimicrobiana e antioxidante em Salame Tipo Italiano:
Os resultados de TBARS para a amostra padrão (com antioxidante comercial)

e para amostra contendo 0,75 mg g-1 de óleo essencial de manjericão apresentaram
os menores valores, sugerindo que nesta concentração o óleo essencial de
manjericão se apresenta como promissor agente antioxidante.
Não houve influência das diferentes concentrações do óleo essencial de

manjericão sobre as bactérias da família Micrococaceae, pois embora tenham
ocorrido variações entre os diferentes tratamentos, não há relação direta entre as
maiores concentrações e a maior inibição.
As bactérias lácticas e aeróbicas heterotróficas apresentaram comportamento

similar durante o seu desenvolvimento não sendo influenciadas pelas diferentes
concentrações do óleo essencial de manjericão.
O óleo essencial de manjericão mostrou influência significativa na redução da

população de Staphylococcus aureus na concentração de 0,75 mg g -1, até o 14º dia
de maturação do Salame Tipo Italiano. As demais concentrações testada
demonstraram ter baixa influência no desenvolvimento de Staphylococcus aureus.
135
Com relação à Escherichia coli houve dimunição no número de células

inoculadas após o sétimo dia de processamento em todos os tratamentos tendo
como motivo provável a redução do pH, não sendo possível avaliar a influência do
óleo essencial.
136
5.2 SUGESTÕES
Face aos conhecimentos obtidos sobre a ação do óleo essencial como agente
antimicrobiano e antioxidante, novos estudos seriam de extrema importância para
avaliar o modo de ação desse óleo e de seus compostos isolados, contribuindo para
definir quais são os compostos com maior ação antimicrobiana e antioxidante e
como agem sobre a célula bacteriana, evitando assim a adição de compostos que
prejudicam a aceitação sensorial quando aplicado num produto alimentício.
Estudos entre a interação dos componentes do óleo essencial de manjericão

e os componentes dos produtos cárneos, principalmente com os lipídios uma vez
que dificultam a ação antimicrobiana dos óleos.
O óleo essencial de manjericão tem como componente majoritário o linalol

conhecido por sua baixa ação antimicrobiana e antioxidante, porém a planta possui
também compostos polifenólicos relatados na literatura como potentes agentes
antioxidantes. Estudos devem ser realizados com objetivo de isolar estes compostos
fenólicos a partir de outros tipos de extrato e aplicá-los em produtos cárneos com
objetivo de confirmar sua eficiência como agentes antioxidantes.
137
Apêndice A – Teste da diferença do controle
APÊNDICE A
TESTE DE DIFERENÇA DO CONTROLE
Nome:____________________________________ Data:____/____/____
Você está recebendo uma amostra padrão (P) e seis amostras codificadas de
salame tipo Italiano. Prove a amostra padrão e em seguida prove cada uma das amostras
codificadas e avalie na escala abaixo, o quanto cada amostra codificada difere, em termos
globais da amostra padrão.
0 Nenhuma diferença
1
2 Ligeiramente diferente
3
4 Moderadamente diferente
5
6 Muito diferente
7
8
9 Extremamente diferente
Amostra Grau de Diferença Grau de Diferença Grau de Diferença

Cor Aroma Sabor
_______ _______ ______ _______

_______ _______ ______ _______
_______ _______ ______ _______
_______ _______ ______ _______
_______ _______ ______ _______
Comentários:_______________________________________________________________
___________
Figura A01 – Modelo de ficha de avaliação sensorial para teste de diferença do
controle.
138
Apêndice B – Análise de Variância
APÊNDICE B
Tabela B01 – Análise de variância para diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em salame tipo Italiano
frente ao branco.
Fontes de Variação Soma dos Quadrados Grau de Liberdade Quadrados Médios Fcalculado
Cor Aroma sabor Cor Aroma Sabor Cor Aroma Sabor Cor Aroma Sabor
Amostra (A) 46,99 1157,74 1348,54 5 5 5 9,40 231,55 269,71 3,91 99,46 93,57
Provador (P) 346,25 308,92 31,3,33 32 34 31 10,82 9,09 10,11
Resíduo (R) 384,84 395,76 446,79 160 170 155 2,41 2,33 2,88
Total (T) 778,09 1862,42 2108,67 197 209 191
Ftabelado = 2,26
139
Apêndice B – Análise de Variância
Tabela B02 – Análise de variância para diferentes concentrações de óleo essencial de manjericão em salame tipo Italiano
frente ao Padrão.
Fontes de Variação Soma dos Quadrados Grau de Liberdade Quadrados Médios Fcalculado
Cor Aroma sabor Cor Aroma Sabor Cor Aroma Sabor Cor Aroma Sabor
Amosta (A) 17,48 1062,68 1168,27 5 5 5 3,50 212,54 233,65 1,02 73,97 77,46
Provador (P) 623,07 442,93 369,13 39 39 29 15,98 11,36 12,73
Resíduo (R) 666,18 560,32 437,40 195 195 145 3,42 2,87 3,02
Total (T) 1306,73 2065,93 1974,80 239 239 179
Ftabelado = 2,26
140

Dissertação Maio 2008

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URI - CAMPUS ERECHIM

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE IN VITRO E EM

MANJERICÃO (Ocimum basilicum L.)

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de

SALAME TIPO ITALIANO DO ÓLEO ESSENCIAL DE

MANJERICÃO (Ocimum basilicum L.)

Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de

Erechim, 09 de Maio de 2008

À minha amada esposa Elisandra (Ise) que

sempre esteve presente nesta jornada com

muito amor, carinho e paciência, dando-me

muito incentivo e apoio necessários para a

realização deste trabalho.

Aos meus pais Júlio (in memorian) e Maria

por todo amor, carinho e dedicação e por

vocês terem sido pessoas exemplares para

A todos aqueles que contribuíram para a

que esta etapa fosse cumprida.

Aos professores do programa de mestrado José Vladimir de Oliveira, Marco Di

Aos professores Altemir Mossi, Eunice Valduga, Geciane Toniazzo, Rogério

À Minha amada esposa Elisandra, pelo amor, incentivo e apoio;

Aos colegas de mestrado Gabriela, Jarbas, Renata, Joncimar, Luis Franken,

Ao pessoal de Central de Materiais Rositânia Frozza, Juliane Bernardi,

À Aline Petkowicz em agradecimento ao profissionalismo e atenção;

Aos bolsistas Annelise Candeia, Renata Ril, Mariane Zanella, Franciele de

À Sacco Com. Imp. E Exp. De Alimentos Ltda. Campinas SP. - pelo

À URI – Campus de Erechim pelo apoio na realização deste projeto.

vamos encontrar muitas coisas que antes nos

iludiam e agora são simples ninharias,

obrigando-nos a modificar nossa escala

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIOXIDANTE IN VITRO E EM

SALAME TIPO ITALIANO DO ÓLEO ESSENCIAL DE

MANJERICÃO (Ocimum basilicum L.)

Orientadores: Alexandre José Cichoski

Rogério Luis Cansian

Este trabalho teve como objetivo a avaliação da atividade antimicrobiana e

fulfillment of the requirements for the Degree of Master in Food Engineering

ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES IN VITRO AND

Advisors: Alexandre José Cichoski

Rogério Luis Cansian

2.5.1.2 Concentração Inibitória Mínima (CIM) 37

2.6 Utilização de antimicrobianos Naturais em Alimentos 38

3.4.1.2.Concentração Inibitória Mínima (CIM) 72

Figura 01 - Curva de Extração do óleo essencial de Ocimum basilicum L. obtido pelo

Tabela 01 – Compostos químicos selecionados, após análise do cromatograma do

Com o desenvolvimento da sociedade nas últimas décadas, e a mudança de

A carne é um dos alimentos mais importantes na dieta humana, não apenas

Um dos maiores desafios para a indústria de carnes é oferecer produtos

Os alimentos cárneos, devido a sua riqueza de umidade, proteínas, gorduras

compostos oxidados causariam nos seres humanos. Desde os anos 80 o emprego

De forma semelhante, pesquisas da atividade antimicrobiana, modo de ação e

Os condimentos apresentam-se como uma fonte promissora de agentes

Embora os óleos essenciais sejam bastante estudados, o seu uso em

Vários estudos abordam a capacidade que os óleos essenciais apresentam

Estudos relacionados á atividade antioxidante e antimicrobiana do óleo

Face à relevância de estudos relacionados à obtenção de produtos

Para alcançar este objetivo foi realizada a extração e caracterização do óleo

ARAUJO, M.A.J. Química dos Alimentos-Teoria e prática. 2.ed. – Viçosa: UFV.

BEUCHAT, L.R. Sensitivity of Vibrio parahaemolyticus to spices and organic acids.

DEANS, S.G.; RITCHIE, G. Antibacterial properties of plant essential oils.

JANSSEN, M.A.; SCHEFFER, J.J.C.; PARHAN-VAN ATTEN, A.W.; SVENDEN, A.B.