M A R K F. S A N D E R S JOHN L.

BOWMAN
J

ANALISE
GEN É TICA
UMA ABORDAGEM INTEGRADA

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ANÁ LISE
GEN É TICA
UMA ABORDAGEM INTEGRADA

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I.MPRHS Ci
*
M A R K F. S A N D E R S JOHN L. BOWMAN
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ANALISE
GEN ÉTICA
UMA ABORDAGEM INTEGRADA

REVISÃO TÉCNICA
BIANCA BIANCO
.
Mestrado, doutorado e pó s - doutorado em genética pela Unifesp Graduação em biomedicina com habilitação
em genética humana e biologia molecular. Vlce-coordenadora do programa de pós- graduaçâ o, pesquisa e Inovação
da Faculdade de Medicina do ABC .
DENISE CHRISTOFOLINI
.
Mestrado e doutorado em genética pela Unifesp Graduação em déncias biológicas modalidade médica pela
Unifesp. Professora assistente e orientadora permanente do programa de pó s - graduaçã o da Faculdade de
Medicina do ABC.

TRADU ç AO
DANIEL VIEIRA
LUIZ CL Á UDIO QUEIROZ

PEARSON
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Rua Nefcou Kuncko. 26
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CL P 0271MO» Sio Paulo SP Bi ául - -
veadas
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Fone: II 21"S N6S6 Fax II :i vS6SS "

^ pcanorLcom
 Dedicató ria
.
Para minha esposa e parceira extraordin á ria Jta. cujo
apoio, paciência e incentivo durante todo este projeto
me faz muito feliz. Ela è um tesouro. Para meus filhos
maravilhosos, Jana e NTick , que conviveram por tanto
tempo com o pai trabalhando neste projeto que pode -
riam ser perdoados por pensarem ter outro irrnà o, mais
problemá tico, chamado “o livro*." Para John e Lincoln,
que, ate o momento, completam nosso cí rculo familiar.
L para todos os meus alunos, com os quais aprendi
tanto quanto ensinei.

Mark F. Sanders

Para meus pais , Lois e NoeE que me ensinaram a amar

e reverenciar a natureza. E para todos os meus alunos
gen ética , que me inspiraram ao longo dos anos, es -
Carregando u pero que a inspiraçã o tenha sido m ú tua.

John L Bowman
 Sumário
Sobre os autores XVII Teste de hipótese pela anáHse do cruzamento-teste 33
Teste de hipótese pela autofertilizaçào de F, 34

Prefácio XIX
2.3 Cruzamentos diíbridos e triibridos revelam a
segregaçã o independente dos alelos 35
Análise de cruzamento diibrido de dois genes 35
Parte 1 — Transmissão e função gênica
-
Análise Genétka 2 1 36
Testando a segregação independente pela análise de
cruzamento teste 38
Base molecular da hereditariedade, Análise Genética 2.2 39
variabilidade e evolução 1 Testando a segregação independente pela análise de
cruzamento trilbrido 40
1.1 A genética moderna entrou em seu Cálculos probablMstkos na resolução de problemas
segundo século 2 de genética 41
O primeiro sécu lo da genética moderna 2 Observação Experimental 2.1 42
A redescoberta do trabalho de Mendel 42
Genética: fu ndomental para a biologia moderna 4
Análise Genétka 2.3 43
1.2 A estrutura do DNA sugere um mecanismo Observação Experimental 2.2 44
para a replicaçã o 5
A dupla-hélke do DNA 5 2.4 A teoria da probabilidade prevê as razões
Nudeotideos do DNA 6 mendelianas 44
Regra do produto 44
Observação Experimental 1.1 8
Replicação do DNA 8
Regra da soma 45
Probabilidade condidonal 45
Análise Genética 1.1 9
Probabilidade binomial 45
13 A transcrição e a tradução expressam
os genes 10 2.5 A análise do qui- quadrado testa a adequação
Transcrição 11
entre os valores observados e os resultados
previstos 47
Tradução 12
Distribuição normal 48
1.4 A evolução tem uma base molecular 13 Análise do quhquadrado 48
Teoria da evolução de Darwin 14 Análise do qut-quadrado dos dados de Mendel 50

Análise Genética 1 15
Quatro processos evolutivos 16
Rastreando as relações evolutivas 17
Análise Genética 1.3 20
Estudo de Caso De volta no tempo — Análise genética e
genômlca dos dinossauros 21
Resumo 22 • Termos -chave 23 • Problemas 23
2 Transmissão genética
2.6 A herança autossômica e a genética
molecular se comparam á s previsões dos
princí pios da hereditariedade de Mendel 50
Herança autossômica dominante 51
Herança autossômica recessiva 52
Genétka molecular dos traç os de Mendel 53
Estudo de Caso Herança da anemia fakiforme nos seres
humanos 55
Resumo 56 • Termos -chove 57 • Probfemos 57
25

2.1 Gregor Mendel descobriu os princípios

bá sicos da transmissão genética 26
3 Divisão celular e hereditariedade
Abordagem experimental moderna de Mendel 26
cromossômica 63
Cinco inovações experimentais críticas 27
3.1 A mitose divide as células somáticas 64
23 Os cruzamentos monoibridos revelam a Est ágios do ciclo celular 64
segregação dos alelos 30 Subestágios da fase M 65
identificando traç os dominantes e recessivos 30 Distribuição dos cromossomos 68
Evidência da herança particulada e rejeição da teoria da Conclusão da divisão celular 70
hereditariedade por combinação 31 Pontos de controle do ciclo celular 71
Segregação dos alelos 32 Mutações do ciclo celular e câncer 72
VIII An á lise gen é tica: uma abordagem Integrada

3.2 A meiose produz gametas para a Expressividade variável 119

reprodução sexual 73 Interações gene-amb enle
* 120
Meios versus mitose 73 Genes pleiotrópicos 121
*
MeioseI 75
Meiose II 79 4.3 A interação génka modifica as razões
Base mecanldsta das razões mersde) lanas 79 mendelianas 122
Segregação em diploides unicelulares 81 Interação génka nas vias 122
A hipótese um gene-uma enzima 124
3.3 A teoria cromossómka da hereditariedade Dissecação genética para investigar a ação génka 124
propõe que os genes são transportados nos Observação Experimental 4.1 124
cromossomos 81 Eplstasia e seus resultados 127
Análise Genética 3.1 83 Análise Genética 4J2 128
Herança ligada ao X 84
Análise da náo disjunção 85 4.4 A análise de complementaçáo distingue as
mutações no mesmo gene das mutações em
3.4 A determinação do sexo é cromossômica genes diferentes 133
e genética 87 Análise Genética 1.3 134
Determinação do sexo na DrosophHo 87 Estudo de Coso Identificação de grupos de complementaçáo
Determinação do sexo dos mamíferos 87 do xeroderma pigmentoso 136
Análise Genética 3.2 88 Resumo 136 • Termos<have 137 • Problemas 137
Diversidade da determinação sexual 89

3.5 A transmissão humana ligada ao sexo segue

padr ões distintos 90
5 Liga ção e mapeamento genético
nos eucariotos 143
Observação Experimental 3.1 91
Expressão dos traços recessivos ligados ao X 92
5.1 Os genes ligados não segregam de maneira
Transmissão de traço dominante ligado ao X 93
independente 144
Herança ligada ao Y 94
Indicações da ligação génka 145
Análise Genética 3 3 95
A descoberta da ligação génka 147

3.6 A compensação da dosagem equaliza a Detecção da ligação génka autossómlca por melo da
análise de cruzamento-teste 149
dosagem dos genes ligados ao sexo 96
Inativaçáo aleatória do cromossomo X nos mamíferos
pfacentános 96
5.2 O mapeamento da ligação gênica se
baseia na frequência de recombínaçào
Estudo de Caso Os olhos de John Dalton ajudam a solucionar o
entre os genes 150
mistério do daltonismo 98
Resumo 99 • Termos-chave 99 • Problemas 100 Análise Genética 5.1 151
O primeiro mapa de ligação génica 152
Unidades de mapeamento 153

4 Interaçã o gênica 105 Análise do qui-quadrado dos dados de ligação génica 153

5.3 A análise do cruzamento- teste de trê s pontos

4.1 As interações entre alelos produzem relações
mapeia os genes 153
de dominância 106
Descobrindo a ordem relativa dos genes pelo
Base molecular da dominância 106
mapeamento de très pontos (trffbrido) 153
Efeitos da mutação 107
Construção de um rrapa de recombtnaçãode
Dominância incompleta ' 09 trés pontos 155
Codomlnàncla 110 Determinando as frequências dos gametas a partir de
Séries alé icas 112 mapas gcnétkos 158
Análise Genética 4.1 113
Mutações letais 114 5.4 A recombinação resulta do cross/ng-over 158
Traços limitados ao sexo 117 Evidência citológica da recombinaçáo 159
Traços influenciados pelo sexo 118 Limites da recombinaçáo ao longo dos cromossomos 159
Idade de inkio tardia 118 Recombinaçáo intragénlca 160
Fatores blolõgkos que afetam a precisão dos mapas
4.2 Alguns genes produzem fenótipos genéticos 161
variáveis 119 Análise Genética 5 2 162
Penetrânda incompleta 119 Correção das distâncias do mapa genético 163
 Sum á rio IX

5.5 Os genes humanos ligados são mapeados 6.6 Os cromossomos de bacteriófagos são
usando a análise do lod score 165 mapeados pela análise da estrutura fina 209
Fase olélicd 165 Análise Genética 6 3 211
Análise do lod score 166 Análise de complementar ão genética 212
Análise de recombinaçáo intragênica 212
5.6 A análise da ligação génica investiga a Análise de mapeamento de deleção 213
evolução do genoma 167
Estudo de Caso A evolução da resistência aos antibióticos 216
Observação Experimental 5.1 168 Resumo 216 • Termos -chave 217 Problemas 218
Análise Genética 5.3 169

5.7 A ligação génica nos eucariotos haploides é

identificada pela an álise das tétrades170
Parte 2 — Dogma central
Análise de tétrades náo ordenadas 170
Análise de ascos ordenados 173
7 Estrutura e replicaçâ o do DNA 222
5.8 O crossing-cver mltótico produz fenótipos
caracter í sticos 174 7.1 O DNA é a molécula hereditária da vida 223
Os cromossomos contém DNA 223
Estudo de Caso Mapeando o gene da doença de
Huntington 176 Fator de transformação 223
Resumo 177 • Termos -chave 178 • Problemas 178 O DNA é o fator de transformação 225
O DNA é a molécula hereditária 226

6 Análise e mapeamento genético nas 7.2 A dupla-hélice do DNA consiste em

duas cadeias complementares e
bactérias e bacteriófagos 184 antiparalelas 228
Nudeotídeos do DNA 228
6.1 As bactérias transferem genes por
Pareamento de nudeotí deos complementares no DNA 230
conjugação 185
Dupla-hélice torcida 230
Caracterlsttcas dos genornas bacterlanos 186
Conjuga ção identificada 186
7.3 A replica çâ o do DNA é semiconservativa e
Transferência do fator F 187
bidirecional 231
Formação de um cromossomo da Hfr 189
Três modelos de replicaçâo concorrentes 231
Transferência do gene da Hfr 191
Análise Genética 7.1 232
Experimento de Meselson- Stahl 232
6.2 A análise de conjugação interrompida
Origem da replicaçâo r>o DNA bacteriano 233
produz mapas de momento de entrada 193
Análise Genética 7.2 235
Experimentos de mapeamento do momento
de entrada 193 Evidência da replicaçâo bidirecional do DNA 235
Consolidação dos mapas de Hfr 195 Origem da replicaçâo múltipla nos eucariotos 236
Análise Genética 6.1 196
7.4 A replicaçâo do DNA duplica precisamente o
63 A conjugação com cepas F produz diploides material genético 237
parciais 198 Sequências do DNA nas origens de replicaçâo 238
Análise Genética 6.2 200 Iniciaçào da replicaçâo nas bact érias 239
ínua e descont
Replicaçâo cont ínua das fitas 240
6.4 A transformação bacteriana produz Remoção do RNA iniciador (prrmer) e ligação dos
recombinaçáo genética 201 fragmentos de Ofcazaki 241
Ftapas na transformação 701 Síntese simultâ nea das cadeias líder e atrasada 242
Mapeamento por transformação 201 Revisão do DNA 243
DNA polimerases eucarióticas 245
6.5 A transdução bacteriana é mediada por Telômeros 246
bacteriófagos 203 .
Telômeros envelhecimento e câncer 247
Ciclos de vida dos bacteriófagos 203
Descoberta da transdução 205 7.5 Os métodos analíticos genéticos moleculares
Transdução generalizada 206 utilizam o DNA nos processos de
Cotransdução 207 replicaçâo 248
Mapeamento da cotransdução 207 Reação em cadeia da polimerase 248
Transdução especializada 209 Separação dos produtos da PCR 249
 Sum á rio IX

5.5 Os genes humanos ligados são mapeados 6.6 Os cromossomos de bacteriófagos são
usando a análise do lod score 165 mapeados pela análise da estrutura fina 209
Fase olélicd 165 Análise Genética 6 3 211
Análise do lod score 166 Análise de complementar ão genética 212
Análise de recombinaçáo intragênica 212
5.6 A análise da ligação génica investiga a Análise de mapeamento de deleção 213
evolução do genoma 167
Estudo de Caso A evolução da resistência aos antibióticos 216
Observação Experimental 5.1 168 Resumo 216 • Termos -chave 217 Problemas 218
Análise Genética 5.3 169

5.7 A ligação génica nos eucariotos haploides é

identificada pela an álise das tétrades170
Parte 2 — Dogma central
Análise de tétrades náo ordenadas 170
Análise de ascos ordenados 173
7 Estrutura e replicaçâ o do DNA 222
5.8 O crossing-cver mltótico produz fenótipos
caracter í sticos 174 7.1 O DNA é a molécula hereditária da vida 223
Os cromossomos contém DNA 223
Estudo de Caso Mapeando o gene da doença de
Huntington 176 Fator de transformação 223
Resumo 177 • Termos -chave 178 • Problemas 178 O DNA é o fator de transformação 225
O DNA é a molécula hereditária 226

6 Análise e mapeamento genético nas 7.2 A dupla-hélice do DNA consiste em

duas cadeias complementares e
bactérias e bacteriófagos 184 antiparalelas 228
Nudeotídeos do DNA 228
6.1 As bactérias transferem genes por
Pareamento de nudeotí deos complementares no DNA 230
conjugação 185
Dupla-hélice torcida 230
Caracterlsttcas dos genornas bacterlanos 186
Conjuga ção identificada 186
7.3 A replica çâ o do DNA é semiconservativa e
Transferência do fator F 187
bidirecional 231
Formação de um cromossomo da Hfr 189
Três modelos de replicaçâo concorrentes 231
Transferência do gene da Hfr 191
Análise Genética 7.1 232
Experimento de Meselson- Stahl 232
6.2 A análise de conjugação interrompida
Origem da replicaçâo r>o DNA bacteriano 233
produz mapas de momento de entrada 193
Análise Genética 7.2 235
Experimentos de mapeamento do momento
de entrada 193 Evidência da replicaçâo bidirecional do DNA 235
Consolidação dos mapas de Hfr 195 Origem da replicaçâo múltipla nos eucariotos 236
Análise Genética 6.1 196
7.4 A replicaçâo do DNA duplica precisamente o
63 A conjugação com cepas F produz diploides material genético 237
parciais 198 Sequências do DNA nas origens de replicaçâo 238
Análise Genética 6.2 200 Iniciaçào da replicaçâo nas bact érias 239
ínua e descont
Replicaçâo cont ínua das fitas 240
6.4 A transformação bacteriana produz Remoção do RNA iniciador (prrmer) e ligação dos
recombinaçáo genética 201 fragmentos de Ofcazaki 241
Ftapas na transformação 701 Síntese simultâ nea das cadeias líder e atrasada 242
Mapeamento por transformação 201 Revisão do DNA 243
DNA polimerases eucarióticas 245
6.5 A transdução bacteriana é mediada por Telômeros 246
bacteriófagos 203 .
Telômeros envelhecimento e câncer 247
Ciclos de vida dos bacteriófagos 203
Descoberta da transdução 205 7.5 Os métodos analíticos genéticos moleculares
Transdução generalizada 206 utilizam o DNA nos processos de
Cotransdução 207 replicaçâo 248
Mapeamento da cotransdução 207 Reação em cadeia da polimerase 248
Transdução especializada 209 Separação dos produtos da PCR 249
X Aná lise gené tica: uma abordagem integrada

Sequenciamento de DNA pelo método de

didesoxirribonucleotídeos 250 9 Biologia molecular da traduçã o 298
Análise Genética 7.3 254
Estudo de Caso Uso da PCR e do sequenciamento do DNA para 9.1 Os ribossomos são máquinas
analisar as mutações da doença de Huntington 255 de tradução 299
Resumo 256 • Termos<have 257 • Problemas 257
Estruturas dos ribossomos bacteriano
e eucariótico 300
Estrutura tridimensional do ribossomo 301
8 Biologia molecular da transcriçã o e
processamento do RNA 260 9.2 A tradução ocorre em três fases 301
Iniciação da tradução 301

8.1 Os transcritos do RNA transportam as Inicio da tradução bactertana 302

mensagens dos genes 261 Técnica de Pesquisa 9.1 304
Nucleotideos e estrutura do RNA 261 Análise Genética 9 1 306
Identificação do RNA mensageiro 262 Prolongamento poiipeptidico 307
Classificação do RNA 262 Terminação da tradução 308

8.2 A transcrição bacter íana é um processo de 9.3 A tradução é rápida e eficiente 309
quatro está gios 264 Complexo de tradução 309
RNA polimerase bacteríana 264 Tradução do RNAm policistrõnico bacteriano 310
Promotores bactertanos 265 Análise Genética 9 J 311
Análise Genética 8 1 266
Iniciação da transcrição 267 9.4 O código genético traduz o RNA mensageiro
Prolongamento e terminação da transcrição 268 em polipeptideo 312
Mecanismos de terminação da transcrição 269 O código genético exibe osdlação da terceira base 312
Carregamento das moléculas de RNAt 314
8.3 A transcrição eucariótica usa várias RNA
polimerases 270 9.5 Experimentos decifraram o código
Polimeraseseucarlôtlcas 270 genético 315
Sequências de consenso para a transcrição da RNA Nenhuma sobreposição no código genético 315
polimerase II 270 C ódigo genético triplo 316
Técnica de Pesquisa 8.1 271 Nenhuma lacuna rvo código genético 317
Reconhecimento do promotor 273 Decifrando o código genético 317
Detecçáo dos elementos de consenso promotores 273 C ódigo genético (quase! universal 319
Ativadores e silenciadores 274 Análise Genética 9.3 321
Fatores de transcrição e trarvsdução de sinal 275 RNAs de transferência e especificidade do código
Promotores da RNA polimerase I 276 genético 322
Promotores da RNA polimerase III 276
Terminação na transcriçã o da RNA polimerase I ou III 277
9.6 A tradução é seguida pelo processamento
poiipeptidico e pela classificação proteica 322
8.4 O processamento pós- transcrição modifica Processamento pós-traduçáo 322
as moléculas de RNA 278 Classificação proteica 323
Capeamento da extremidade 5'do RNAm 278 Destruição das proteínas dobradas incorrctamontc 325
Poliadenilação da extremidade 3’ do pré -RNAm 278 Estudo de Caso Antibióticos e interferência na traduçã o 326
Spliclng intrônico do pré-RNAm 280 Resumo 327 • Termos -chave 328 • Problemas 328
Splktng das sequências de sinal 281
Etapas de processamento do acoplamento do pré-
-RNAm 283 10 Integra çã o das abordagens
Transcritos alternativos de genes isolados 283
genéticas: compreendendo a
Auto- spNdng intrônico 287
Processamento do RNA ribossômko 287
anemia falciforme 332
Análise Genética 8.2 288
Processamento do RNA de transferência 290
10.1 Uma variante da hemoglobina herdada
Edição pós-transcrição do RNA 291
provoca a anemia falciforme 333
O primeiro paciente com anemia fakiforme 333
Estudo de Coso Spfíonq sexual: sphcing alternativo do RNAm e
determinação do sexo na Drosaphtto 292 Estrutura da hemoglobina 334
Resumo 293 Termos -chove 294 • Problemas 295 Mutações dos genes das globmas 334
 Sum á rio XI

10.2 A variação genética pode ser detectada Mutações da PEV 375

examinando o DNA, o RNAe as proteínas 335 Proteínas de remodelação da cromatina 376
Eletroforese em gel 335 Inativaçáo dos cromossomos X femininos
em mamíferos 377
Análise da impressão digital de peptideos da
hemoglobina 338 Análise Genética 1U 378
Identificação de variação na sequência do ONA 338 Estudo de Caso Busca de anomalias cromossómicas nas células
Análise Genética 10.1 339 cancerosas 379
Resumo 380 • Termos -chave 380 • Problemas 381
Sondas moleculares 341
Técnica de Pesquisa 10.1 342
Técnica de Pesquisa 10.2 344
Análise eletroforética da anemia falciforme 346 12 Mutação gêníca, reparo do DNA e
Análise Genética 10.2 349 recombinação homóloga 383
10J A anemia falciforme evoluiu por causa 12.1 As mutações são raras e ocorrem de
da seleção natural nas populações maneira aleatória 384
humanas 350 Frequência das mutações 384
Infecçáo por malária 350 Teste de flutuação 386
Vantagem heterozigôtica 350
Evolução do Fe do & 352 12.2 As mutações génicas modificam a
Estudo de Caso Análise da transmissão e da genética molecular sequência do DNA 386
da talassemia 352 Mutações por substituição de pares de bases 387
Resumo 353 • Termos chove 3S4 • Problemas 354 Mutações por mudança da matriz de leitura 388
Mutações regulatónas 389
Mutação anterógrada e 'eversa (ou reversão) 390
Parte 3 — Estrutura e função do genoma Análise Genétka 12.1 391

12.3 As mutações génicas podem surgir de

Estrutura do cromossomo 359 eventos espontâ neos 392
Eros de repfkação do DNA 392

11.1 Os cromossomos bactéria nos têm uma Mudanças espontâneas das bases nudeotid icas 392

organização simples 360 Lesões nudeotidkas no DNA 395

Cromossomos bacterianos e arqueais 360

12.4 As mutações podem ser induzidas
Condensação do cromossomo bacterlano 361
por subst â ncias quí micas ou radiação
ionizante 395
112 Os cromossomos eucarióticos são
organizados como cromatina 362 Mutagénicos químicos 396
Danos ao DNA induzidos por radiação 399
Composição da cromatina 362
Análise Genétka 111 365
Teste de Ames 400
Estrutura de ordem supenor da cromatina 366
12.5 Os sistemas de reparo corrigem alguns danos
Distribuição e sí ntese dos nucleossomos durante a
replka çáo 367 ao DNA 402
Remodelaçã o da cromatina 367 Reparo direto de danos ao DNA 402
Análise Genétka 122 403
113 As regiões do cromossomo são Excisáo e substituição de nocleotídeos 404
diferenciadas pelo padrão de bandamento Reparo por recombinação do DNA 405
cromossômico 368 Sistemas de sinalização de danos ao DNA 406
Estruturas cromossómicas e padrões Transtornos de reparo de danos ao DNA 407
de bandamento 369
Heterocromatina e eucromatina 370 12.6 As proteínas controlam a síntese do
Estrutura do centrõmero 371 DNA translesão e o reparo das quebras na
Heterocromatina centromérica 371 fita dupla 407
Hlbridaçào in «tu 372 Síntese do DNA translesão 408
Reparo de quebras na fita dupla 408
11.4 A estrutura da cromatina influencia a
transcrição gênica 373 12.7 A recombinação meiótica é controlada por
Território cromossômko durante a Interfase 373 quebras da fita dupla programadas 410
Estrutura dinâmica da cromatina 374 Modelo de Holliday 410
XII An á lise gen ética: uma abordagem integrada

Modelo de recombtnaçào meiótica da quebra da fita Análise Genética 13.3 447

dupla 410 Transposon 443
Resolução das junçòes de HoBlday 411 Mecanismos da transposição 443

12.8 A conversão gènica é o reparo dirigido 13.7 A transposição modifica os genomas

dos erros de pareamento no DNA eucarióticos 449
heterodúplex 411 Elemento P da Drosophila 449
Estudo de Coto A síndrome de li-Ftaumenl é causada pela Retrotransposons 450
heranç a das mutações do p53 415
Estudo de Coso Evolução do cromossomo humano 451
Resumo 416 Termos -chave 417 • Problemas 418
Resumo 452 • Termos chave 453 • Problemas 454

13 Aberrações e transposição 14 Regulação da expressão genica nas

cromossômicas 422 bactérias e bacteriófagos 459
13.1 A não disjunção leva a mudanças no número 14.1 O controle transcricional da expressão gènica
de cromossomos 423 exige a interação DN A-proteína 460
Euploédia e aneupioidia 423 Controle negatuo e positivo da transcrição 460
Não disjunção cromossômica 423 Proteínas regulatórias de ligação ao DNA 461
Alteração da dosagem gènica 424
Aneupioidia nos seres humanos 425 14.2 O óperon lac é um sistema óperon induz í vel
Diminuição da fertilidade na aneupioidia 427 sob controle negativo e positivo 462
Mosaicismo 428 Metabolismo da lactose 463
Dissomia un parental 428 Estrutura do óperon lac 463
Função do óperon lac 464
13.2 Mudanças na euploidia resultam em v ários
tipos de polipioidia 429 14.3 A análise das mutações decifra a regulação
Autopoliploidia e alopoliploidia 429 genética do óperon loc 466
Consequências da polipioidia 430 Análise das mutações gênicas estruturais 466
Homozkjosidade recessiva reduzida 431 Mutações regulatórias do óperon lac 467
Pol tplotdka e evolução 431 Análise molecular do óperon loc 470
Análise Genética 13.1 432 Análise Genética 14 | 471
Observação Experimental 14.1 472
13.3 A quebra cromossômica provoca mutação Regulação positiva e negativa do óperon da arabinose 473
por perda, ganho e reorganização dos
cromossomos 433 14.4 A transcrição a partir do óperon do
Defeção cromossômica parcial 433 triptofano é repressí vel e atenuada 475
Cruzamento desigual 434 Inibição por feedback da síntese do triptofano 475
Detecção da duplicação e deleçao 434 Atenuaçào do óperon trp 476
Mapeamento das deteções 436 Mutações de atenua ção 479
Atenuaçãoem outros sistemas óperon de ammoácidos 480
13.4 A quebra cromossômica leva à inversão e
transloca ção dos cromossomos 436 14.5 As bactérias regulam a transcrição dos genes
Análise Genética 13.2 437 de resposta ao estresse e também regulam a
Inversão cromossômica 438 tradução 480
Translocação cromossômica 439 Fatores sigma alternativos e resposta ao estresse 480
Observação Experimental 13.1 441 Regulação da tradução nas bactérias 481
Análise Genética 14.2 482
13.5 Elementos genéticos transponí veis se
movem por todo o genoma 444 14.6 Os antrterminadores e repressores controlam
A descoberta da transposição 444 a infecçáo por fago lambda da E. coí i 483
CaracterKticas dos elementos genéticos transponíveis 445 Genoma do fago lambda 483
Transcrição gènica precoce 484
13.6 A transposição modifica os genomas Proteína cro e cick> litico 486
bacterianos 445 Proteína repressora\ e Iisogenia 486
Sequências de inserção 445 Indução lisogénica 487
 Sumá rio XIII

mfecçáo grave 488

—
Estudo de Caso Vibrião colérico A resposta ao estresse leva à Identificação da interação e da redundância gémea 528
Análise Genética 16.1 529
Resumo 488 • Termos chave 489 • Problemas 489

16.2 As sequências de DNA especificas são

reconhecidas usando tecnologia de DNA
15 Regulaçã o da expressã o gênica recombinante 531
nos eucariotos 494 Enzimas de restrição 531
Observação Experimental 16.1 532
15.1 As sequências cis-regulatórias ligam as Análise Genética 16.2 534
proteí nas trans-regulatórias para controlar a Clonagem molecular 535
transcrição eucariótica 495 A 'ea ção em cadeia da polimerase 540
Motivos estruturais das proteínas de ligação ao DNA 495
Interações regulatór as transcricionais 495 16.3 As tecnologias de sequenciamento do DNA
Conservação da sequência enbancer 498 revolucionaram a biologia 540
Sequências ativadoras a montante em leveduras 498 Sequenciamentos de moléculas de DNA longas 542
Regiões controladoras de lócus 499 Novas tecnologias de sequenciamento:próxima geração e
Proteínas represvoras e sequências silenciadoras 500 terceira geração 542
Regulação da transcrição pelas sequências enhancers e
silenciadoras 501 16.4 As coleções de fragmentos de DNA donados
Sequências tsolantes SOI chamam- se bibliotecas 543
Mutações das enhancers 502 Construção de bibliotecas genômicas 544
Construção de bibliotecas de DNAc 545
15.2 A remodelação da cromatina regula a Seleção nas bibliotecas 545
transcrição eucariótica 502
Promotores abertos e cobertos 503 16.5 Genes específicos sã o donados usando a
Remodelaçã o da cromatina pela modificação de tecnologia de DNA recombinante 546
nudeossomos 504 Clonagem de genes altamente expressos 547
Análise Genética 15.1 505 Clonagem de genes homólogos 548
Modrficaçóes químicas ca cromatina 507 Clonagem de genes por complcmentaçào 549
Um exemplo de regulação da transcrição na Utili/ação de transposons para donar genes 550
S. cerevisae 508
Clonagem posicionai 550
Herdabilidade epigenética 509
Estudo de Caso Clonagem posicionai em humanos, o gene da
Impressão genômlca 510
doenç a de Huntington 555
Si lenciamento por mediação de nudeotkieos 511 -
Resumo 557 • Termos chave 558 • Problemas 558

15.3 Mecanismos mediados pelo RNA controlam a

expressão génica 512
Análise Genética 15.2 513
Silenciamento gémeo pelo RNA de fita dupla 514
Modificação da cromatina pelo RNAi 515
A evolução do RNAl 516
Inadvação do X e RNA regulatório 517
Estudo de Caso EpigenétJca ambiental 517
Resumo 518 • Termos -chave 519 • Problemas
Parte 4 — Expressão e análise genômica
16 Genética prospectiva e tecnologia de
DNA recombinante 522
16.1 As triagens genéticas prospectivas identificam
os genes por seus fenótipos mutados 523
Projetando uma triagem genética 524
Análise da mutagênese 528
17 Aplicações da tecnologia de DNA
recombinante e genética reversa 562
17.1 A introduçã o de genes estranhos nos
genomas cria organismos transgénicos 563
Transgenes na Escherichiacoti 563
519 Produção de insulina humana na £ coR 565
Modificação da sequência das moléculas de DNA 567
Observação Experimental 17.1 568
Geração de fungos transgénicos 569
Transformação do genoma das plantas pela
Agrobacterium 571
Animais transgénicos 575
Recombinação sitio - específica 579
17.2 Os transgenes proporcionam um meio de
dissecar a função do gene 581
Montoração da expressão génica com genes repórteres S81
Análise Genética 17.1 583
Investigação da função génica com genes quiméricos 584
XIV Aná lise gen ética: uma abordagem Integrada

17.3 A genética reversa investiga a ação do gene
progredindo da identificação do gene até
o fenótipo 586
Uso de mutados por inserção na genética reversa
Interferência do RNA na atividade do gene 587
Genética reversa por TILLING 583
Aprisionamento da sequência potenciadora 590
Estudo de Caso A análise genômica dos intestinos de insetos
pode alimentar o mundo 636
Resumo 636 • Termosxhave 637 • Problemas 637
587
19 Herança citoplasmática e a evolução
dos genomas organelares 641

17.4 A terapia gênica usa tecnologia de DN A 19.1 A herança citoplasmática transmite os

recombinante 590 genes transportados pelos cromossomos
Análise Genética 17.2 591 das organelas 642
Terapia gênica humana 592 A descoberta da herança dtoplasmátka 642
Curando a anemia faldforme em camundongos 593 Homoplasmia e heteroplasmia 643
Replicaçào do genoma nas organelas 644
17.5 A donagem de plantas e animais produz Segregação variável aos genomas das organelas 645
indivíduos geneticamente idênticos 594
Estudo de Caso Genética reversa e redundância genética no 19.2 Os modos de herança citoplasmática
desenvolvimento das flores 596 dependem do organismo 646
Resumo 598 -
Termos chave 599 • Problemas 599
Heranç a mitocondrial em mamíferos 646
Análise Genética 19 1 650
Observação Experimental 19.1 652
18 Genômica: a genética do ponto de Tipo de acasalamento e segregação dos cloroplastos em
Chlamydomonas 653
vista do genoma inteiro 602
Herança biparental na Saccharomyces cereviuae 653
Análise Genética 19.2 654
18.1 A genômica estrutural fornece um catálogo
dos genes contidos em um genoma 603 19.3 Mitocôndrias são as f á bricas de energia das
A abordagem de sequenoamento de dones ordenados 603
células eucariótlcas 656
Sequenciamento shotçun do genoma inteiro 604 Estrutura do genoma mitocondrial e conteúdo génico 656
Genoma humano 607 Transcrição e tradução mitocondrial 658
Metagenômica 608
Anotação para dcscrcvcr genes 608 19.4 Cloroplastos sào os s/tios de fotossíntese 660
Anotação para descrever funçOes biológicas 609 Estrutura genômica do doroplasto e conteúdo génico 660
Técnica de Pesquisa 18.1 610 Transcrição e tradução dos cloroplastos 661
Variação na organização do genoma entre as espécies 612 Edição do RNAm cloroplá stico 661
Três Informações extraídas das sequências genâmtcas 613
19.5 A teoria da endossimbiose explica a evolução
18.2 A genômica evolutiva reconstitui a história mitocondrial e cloroplá stica 662
dos genomas 614 Evolução distinta das mitocôndrias e dos cloroplastos 662
Arvore da vida 614 Transferência contínua do DNA das organelas 664
Comparações genômlcas interespecificas:conteúdo Codificação das proteínas organetares 666
génico 615 A origem da linhagem eucariótka 666
Técnica de Pesquisa 18.2 616 Endossimbiose secundária e terciária 667
Comparações genômicas interespecificas: anotação Estudo de Caso Surdez ototóxka: uma interação do gene
genômica 620 mitocondrial com o ambiente 668
Comparações genômicas interespecificas:ordem dos Resumo 670 • Termos -chave 670 • Problemas 671
genes 622
Comparações genômicas Interespecificas 623
Diversidade genética humana 624 20 Genética evolutiva 674
18.3 A genômica funcional ajuda a elucidar a 20.1 O desenvolvimento é a construção de um
funçáo gênica 627 organismo pluricelular 675
Transcrtptômica 627
Diferenciação celular 675
Outros'omas'e 'ômicas' 630
Formação de padrão 676
Abordagens genômicas para a genética reversa 631
Uso de mutados de levedura para categorizar os genes 632 20.2 O desenvolvimento da Drosophila é um
Redes genéticas 633 paradigma do desenvolvimento animal 677
Observação Experimental 18.1 634 Okrt óe ferramentas de desenvolvimento da DrosopMa 679
 Sumá rio XV

Efeitos maternos na formaçao de padrões 680 21.3 A herdabilidade mede o componente

Padronizado genétka coordenada do eixo anterior- gené tico da variação fenotipka 721
posterior 681
Análise Genétka 21 2 722
Domínios de expressão do gene gap 682
Herdabilidade em sentido amplo 723
Regulação dos genes de regra dos pa ^es 683
Estudos em gémeos 723
Especif cação de parassegmentos pelos genes Hox 684
Herdabilidade em sentido estrito e seleçá o artificial 724
Alvos a jusante dos genes Hox 688
Genes Hox nos metazoários 688
21.4 Os lócus dos traços quantitativos são os
Análise Genética 20.1 689
genes que contribuem para esses traços 726
Estabilização da memória celular pela arquitetura da
cromatina 690 Estratégias de mapeamento de QTLs 726
Análise Genética 20.2 691 Identificação dos genes do QTL 729
Estudos de associação genômka ampla 730
203 As interações celulares determinam o Estudo dê Caso Seleçáo artificial para os teores de óleo e
destino da célula 692 proteína no milho732
Sinalização indutiva entre as células 692 Resumo 733 • Termos -chove 733 Problemas 734
Inibição lateral 69 S
Morte celular durante o desenvolvimento 695

20.4 "A evolução se comporta como um

22 Genética populacional e evolução 737
experimentador" 696
22.1 O equilíbrio de Hardy- Welnberg descreve a
Evolução peia cooptaçáo 696
relação das frequências alélicas e genot í picas
Restrições á coopta çáo 698
nas populações 738
Populações e reservas géricas 738
203 As plantas representam um experimento
Independente na evolução pluricelular 698 -
Equilíbrio de Hardy Weinberg 739

Desenvolvimento em meristemas 699 Determinação das frequências alélicas autossómícas nas

populações 741
Atividade homeótlca combinat ória na identidade dos
órgãos florais 700 Equilíbrio de Hardy -Weinberg para maès de
dois ale os 742
do Shb com fenótipos distintos 702
—
Estudo de Caso Cklopia e Polidactilia Diferentes mutações
Análise Genétka 22.1 743
Resumo 704 • Termos -chove 704 • Problemas 705 Teste do qui quadrado das previsões de Hardy
-Weinberg 744

22.2 As frequências genotí picas dos genes ligados

Parte 5 — Análise genética das populações
ao X são estimadas usando o equilíbrio de
Hardy-Weinberg 744
21 Análise genética dos traços Determinação das frequências dos alelos ligados
ao X 744
quantitativos 708 Equilíbrio de Hardy -Weinberg para os genes ligados
ao X 745
21.1 Os tra ços quantitativos exibem variação
fenotipka contínua 709 22.3 A seleçáo natural opera por meio da aptidão
Potencial genético 709 reprodutiva diferencial dentro de uma
Genes principais e efeitos genéticos aditivos 710 população 746
Variação fenotipka continua a partir de múltiplos genes Aptidão reprodutiva diferencial e aptidão relativa 746
aditivos 711
Seleçáo natural direcional 747
Segregação dos alelos na produção de traços
quantitativos 713 Seleçáo natural favorecendo os heterozigotos 749
Efeitos dos fatores ambientais na variação fenotípica 714
Análise Genética 21.1 715 22.4 A muta çã o diversifica a
Traç os de limiar 716 reserva genética 750
Observação Experimental 21.1 717 Efeitos das taxas de mutaçáo direta e reversa 750
Equilíbrio mutação-seleção 750
213 A análise dos traços quantitativos é
estatí stka 718 22.5 A migração identifica o movimento dos
Descrição estatístka da variação fenotípica 718 organismos e genes entre a população 751
Partição da variância fenotipka 720 Efeitos do fluxo gêmeo 751
Partlçao da vanánda genética 721 Equilíbrio e equalizaçáo da frequência alélica 752
XVI Aná lise gen ética: uma abordagem Integrada

22.6 A deriva genética provoca mudanças Isolamento reprodutivo e especiaçao 759

na frequência alélica pelo erro de —
Estudo de Caso COOIS Usando a genética populacional para
amostragem 752 solucionar crimes e identificar paternidade 762
Efeito fundador 752 Resumo 763 • Termos<have 764 • Problemas 764
Gargalos genéticos 754

22.7 O acasalamento não aleatório altera as

frequências genotípicas 754 Referências e leitura suplementar 769
Coeficiente de endogamia 754
Depressão endogámica 756 Respostas 777
Análise Genética 22.2 757
Efeitos do acasalamento seletivo 757 Glossário 797
22.8 As espécies e os grupos taxonômicos
superiores evoluem pela ação recí proca de Créditos 823
quatro processos evolutivos 758
Processos de especiaçào 758 índice 827

Marfc F. Sanders atua há 27 anos no
corpo docente do departamento de
biologia molecular e celular da Uni -
versity of Califórnia . Nesse per íodo,
lecionou mais de 150 cursos de ge-
nética para quase 35 mil alunos dc
graduação. Especializado no ensino
do curso de genética, para o qual
este livro é destinado, ele também
leciona um curso laboratorial de ge -
nética humana avançada para profissionais em biologia
e outro de hereditariedade humana para profissionais
que nã o atuam na á rea de ciências. Sua experiê ncia aca-
démica també m inclui biologia introdutória e cursos
sobre genética populacional e evolução.
O dr. Sanders obteve seu bacharelado em antropo
logia pela San Francisco State University e seus graus de
- do desenvolvimento floral. De 1996 a 2006, seu labora
mestre e doutor em antropologia biológica pela Univer-
sity of Califórnia , Los Angeles, Após a graduação, passou
quatro anos na University of Califó rnia, Berkeley, como
pesquisador pós-doutorado estudando a suscetibilidade
aos câ nceres mamário e ovariano humanos. Na UC
Berkeley, também administrou seus primeiros cursos de
genética. Desde que chegou à University of Califórnia,
Davis, mantém uma programação de ensino em tempo
integral e promove o rendimento acadêmico dos alunos
de graduação dc vá rias maneiras, incluindo a orientação
aos estudantes, através de sua coordenação de vá rios
programas estudantis para alunos dc graduação e do tra -
balho como reitor associado nos programas acadêmicos
de graduação da Faculdade de Ciências Biológicas.
Sobre os autores
John L. Bowman é professor na Es-
cola de Ciências Biológicas da Mo -
nash University em Melbourne,
Austrália , e professor adjunto no
departamento de biologia vegetal
na University of Califórnia , Davis,
nos Estados Unidos. Bacharelou -se
em bioquímica pela University of
-
Illinois em Urbana Champaign, em
-
1996, e formou se doutor pelo Ca -
.
lifórnia Institute of Technology em Pasadena Sua tese
de doutorado foi focada em como as identidades dos
ó rgã os florais sã o especificadas na Arabidopsis (des-
crita no Capitulo 20). Conduziu ainda uma pesquisa de
pós- doutorado na Monash University sobre regulação
tório na UC Davis se concentrou na gené tica evolutiva
-
das plantas, focando em como as folhas são modeladas.
De 2006 a 2011, foi um Federation Fellow na Monash
University, onde seu laboratório estuda a evolução das
plantas terrestres usando uma abordagem de genética
evolutiva. Na UC Davis , lecionou genética , “de Mendel
ao câ ncer" para alunos de graduação e continua a lecio -
nar cursos de genética na Monash University.

Marfc F. Sanders atua há 27 anos no
corpo docente do departamento de
biologia molecular e celular da Uni -
versity of Califórnia . Nesse per íodo,
lecionou mais de 150 cursos de ge-
nética para quase 35 mil alunos dc
graduação. Especializado no ensino
do curso de genética, para o qual
este livro é destinado, ele também
leciona um curso laboratorial de ge -
nética humana avançada para profissionais em biologia
e outro de hereditariedade humana para profissionais
que nã o atuam na á rea de ciências. Sua experiê ncia aca-
démica també m inclui biologia introdutória e cursos
sobre genética populacional e evolução.
O dr. Sanders obteve seu bacharelado em antropo
logia pela San Francisco State University e seus graus de
- do desenvolvimento floral. De 1996 a 2006, seu labora
mestre e doutor em antropologia biológica pela Univer-
sity of Califórnia , Los Angeles, Após a graduação, passou
quatro anos na University of Califó rnia, Berkeley, como
pesquisador pós-doutorado estudando a suscetibilidade
aos câ nceres mamário e ovariano humanos. Na UC
Berkeley, também administrou seus primeiros cursos de
genética. Desde que chegou à University of Califórnia,
Davis, mantém uma programação de ensino em tempo
integral e promove o rendimento acadêmico dos alunos
de graduação dc vá rias maneiras, incluindo a orientação
aos estudantes, através de sua coordenação de vá rios
programas estudantis para alunos dc graduação e do tra -
balho como reitor associado nos programas acadêmicos
de graduação da Faculdade de Ciências Biológicas.
Sobre os autores
John L. Bowman é professor na Es-
cola de Ciências Biológicas da Mo -
nash University em Melbourne,
Austrália , e professor adjunto no
departamento de biologia vegetal
na University of Califórnia , Davis,
nos Estados Unidos. Bacharelou -se
em bioquímica pela University of
-
Illinois em Urbana Champaign, em
-
1996, e formou se doutor pelo Ca -
.
lifórnia Institute of Technology em Pasadena Sua tese
de doutorado foi focada em como as identidades dos
ó rgã os florais sã o especificadas na Arabidopsis (des-
crita no Capitulo 20). Conduziu ainda uma pesquisa de
pós- doutorado na Monash University sobre regulação
tório na UC Davis se concentrou na gené tica evolutiva
-
das plantas, focando em como as folhas são modeladas.
De 2006 a 2011, foi um Federation Fellow na Monash
University, onde seu laboratório estuda a evolução das
plantas terrestres usando uma abordagem de genética
evolutiva. Na UC Davis , lecionou genética , “de Mendel
ao câ ncer" para alunos de graduação e continua a lecio -
nar cursos de genética na Monash University.

A genética moderna tem quase 150 anos de idade.
Suas origens sào atribu ídas a meados dos anos 1860,
quando Gregor Mcndcl descreveu os resultados e análi-
ses de seus experimentos em plantas de ervilha que, pela
primeira vez, descreveram corretamente as regras básicas
pelas quais os genes sào transmitidos de uma geração para
a seguinte. O trabalho de Mendel padeceu praticamente
desconhecido e mal -avaliado até 1900, quando foi redes-
coberto. Inumeráveis análises experimentais durante a
primeira metade do século XX esclareceram e expandi-
ram os princípios de Mendel e suas análises. A segunda
metade do século trouxe o reconhecimento e o desenvol
vimento rá pido dos princí pios e métodos da análise ge
nética molecular. Hoje, novas informações se acumulam
em um ritmo sem precedentes, ainda que as novas desco-
bertas na genética continuem arraigadas aos princípios da
transmissão genética e da genética molecular e evolutiva.
Em sua essência , a genética contí nua a ser uma ma -
neira de pensar sobre a análise dos organismos. É uma
disciplina experimental na qual a análise e solu ção de
problemas, através da aplicação de princí pios, sào fun
damentais para sua compreensào. Em Análise genética:
uma abordagem integrada , nossos objetivos principais
são fornecer aos alunos de gené tica uma base sólida nos
princípios de transmissão genética e genética molecu
lar, ajudá - los a desenvolver sólidas habilidades de reso -
lução de problemas, proporcionar exposição à natureza
experimental e ao contexto evolutivo da genética , além
de prepará -los para processar e organizar as novas in
formações à medida que forem adquiridas.
Nas muitas turmas que lecionamos ao longo dos
anos, continuamos a ver um desafio de aprendizagem
emergir repetidas vezes como um obstáculo para a com-
preensão da genética: a resoluçào de problemas. Em
bora os alunos leiam as soluções fornecidas pelos livros
e sejam suficientemente bem informados para com
preender o problema e a lógica das respostas apresen -
tadas, eles costumam não ter uma ideia clara de como
poderiam conceber pessoal mente as soluções por sua
própria conta. De modo similar, na sala de aula quando
um professor soluciona um problema , os alunos assen
tem enquanto acompanham as etapas da análise até a
sua conclusão. Mas, quando diante de um dever de casa
ou questão similar em prova, os alunos descobrem que
não sabem como resolver ou até mesmo abordar os pro-
blemas. Desse modo, com uma frequência exagerada,
os alunos sáo deixados à própria mercê quando se trata
de resolver problemas de genética. Os mais adiantados
procuram desenvolver sua própria abordagem para a re
solução de problemas a fim de adquirir o nível de com
preensão necessário, enquanto que muitos outros são
incapazes de fazê-lo e nã o conseguem desenvolver uma
compreensà o profunda da genética. Para abordar essa
questão de frente, concebemos uma estratégia inovadora
Prefácio
de resolução de problemas que pode ajudar os alunos a
atingirem o nível de proficiência necessá rio para com -
preender verdadeiramente a genética e suas aplicações.
Uma abordagem para a resoluçã o
de problemas
Embora seja essencial o fornecimento de expli -
cações claras sobre os princípios da genética para um
aluno compreender a disciplina , a aprendizagem exige
-
mais do que compreender os fatos da genética. Os alu -
-
nos precisam se envolver produtivamente com o ma
terial através da prá tica de resolução de problemas. A
-
ideia de que os alunos de gené tica precisam solucionar
problemas para aprenderem de modo eficaz a disciplina
não é nova. No entanto, oferecemos uma abordagem
exclusiva para aprender a resolver problemas, a qual foi
desenvolvida em sala de aula e fornece um arcabouço
l ógico e reproduzí vel para os alunos utilizarem quando
encontrarem problemas de genética de qualquer tipo.
- Ter uma estratégia habilita os alunos a aplicarem de
modo mais eficaz o que aprenderam às situa ções, tal
como os problemas de fim de capítulo e nas provas.
A pesquisa e nossa própria experiência em sala
- de aula mostram que os solucionadores de problemas
eficazes seguem uma estrat égia geral para enfrentar
problemas complexos. Então, para ajudar a treinar os
alunos para que se transformem em solucionadores de
- problemas eficazes, empregamos um recurso de reso-
lução de problemas exclusivo chamado Análise Gené-
tica , que proporciona aos alunos um método coerente
e reproduzível para ajudá- los a saber como começar a
pensar em um problema, qual é o objetivo final e qual
- é o tipo de análise necessária para chegar lá. Os três es-
tágios desse arcabouço para a resolução de problemas
- são: avaliar, deduzir e solucionar.
Avaliar: os alunos aprendem a identificar o tema
do problema, especificar a natureza ou formato da
resposta e identificar as informações críticas forne-
- cidas no problema.
Deduzir: os alunos aprendem como usar o conheci --
mento conceituai para analisar os dados, criar cone
xões e inferir outras informações ou próximas etapas.
Solucionar: os alunos aprendem como aplicar pre-
cisamente as ferramentas anal íticas e executar seu
plano para solucionar um determinado problema.
Independente do tipo de problema com o qual o
- aluno se depara, esse arcabouço o guia pelos estágios da
- resolução de problemas e lhe dá confiança para enfren
tar novos problemas.
-
Cada Análise Genética é organizada em um formato
com duas colunas para ajudar os alunos a acompanha -
rem facilmente cada etapa das estratégias de solução na
XX Aná lise gené tica: uma abordagem integrada
coluna da esquerda, junto com sua execução correspon
dente nas etapas da solução, que fica na coluna da direita.
Também incluímos dicas de resolução de problemas
para destacar as etapas críticas e as armadilhas a serem
evitadas, extraídas dc nossa experiência como professo-
res. A Análise Genética está totalmente integrada a cada
capítulo, logo após as discussões de conteúdos importan -
tes, para ajudar os alunos a aplicarem imediatamente os
conceitos. Cada capitulo inclui dois ou très recursos de
Análise Genética e o livro contém 50 no total.
Emparelhamos a Análise Genética com problemas
difíceis de fim de capítulo, divididos em dois grupos:
primeiro vêm os problemas de conceitos do capítulo,
revendo as informações mais importantes, princípios e
ferramentas analíticas discutidas no capítulo em questão;
depois vém os problemas de aplicação e integração, que
são mais complexos e proporcionam aos alunos uma prá
tica na resolução de problemas de escopo mais amplo.
No final do livro, fornecemos as respostas para
problemas de í f m de capítulo selecionados, com nu -
meração par.
Uma perspectiva evolutiva
Em seu ensaio de 1973, “ Nada na biologia faz sen -
tido, exceto à luz da evolução”, o biólogo evolutivo Theo-
dosius Dobzhansky declarou claramente seu conceito
do papel central da evolução. Hoje sua opinião é mais
atual do que nunca, particularmente no campo da ge
nética. O DNA conecta toda a vida e é a razão para a
aplicação dos princí pios da genética a todas as formas
de vida, passadas e presentes. Os geneticistas estão bem
a par das relações evolutivas entre genes, genomas e or-
ganismos. Os processos evolutivos no n ível dos organis-
mos descobertos através da biologia comparativa tam -
bém podem lan çar uma luz sobre a função dos genes e a
organização dos genomas no nível molecular. De modo
similar , a função dos genes e a organização dos geno-
mas informam o modelo evolutivo.
Para dar o tom , o Capítulo 1 introduz os princí pios
evolutivos e depois os conecta às semelhan ças e varia -
ções dos organismos. A evolução é um tema forte do
Capítulo 10 e o foco principal do Capítulo 22. As ideias
evolutivas são incluídas frequentemente para lembrar
os alunos de sua liga ção com a genética. Por exemplo,
no Capítulo 4, são discutidas as implicações evoluti
vas dos grupos sanguíneos ABO compartilhados pelo
homem, grandes símios e muitas espécies de macacos.
No Capítulo 9 ( Seção 9.4), descrevemos o código gené-
tico no contexto da origem ú nica da vida.
Conectando a transmissã o genética
com a genética molecular
Os experimentos que lançaram uma luz nos prin
cí pios da transmissão genética precederam a descoberta
da estrutura e função do DNA e de seu papel na varia-
ção molecular herdada por vá rias décadas. Contudo, os
- biólogos reconhecem que a variação do DNA é a base da
variação morfológica herdada observada na transmissão
genética. A compreensão da conexão entre essas duas
abordagens da genética é vital para pensar como um ge -
neticista. Destacamos essa conexão em vários capítulos.
No Capítulo 2, por exemplo, identificamos e descreve -
mos as atividades do tipo selvagem e as atividades mu-
tantes de quatro genes reconhecida mente estudados por
MendeL No Capítulo 4, os alelos dominantes e recessi-
vos são abordados em um contexto molecular. E, no ca -
pítulo 10, exploramos tanto a hereditariedade quanto a
base molecular da anemia íalciforme nos seres humanos.
Organização do livro
Este livro contém 22 capí tulos organizados em
- cinco partes que abrangem toda a genética. Seguimos
a organização frequentemente utilizada que aborda pri
meiro as teorias de Mendel, começando com a trans
--
missão e função gênicas e terminando com a análise
genética das populações .
Parte 1 — Transmissão e funçã o gênica
Começamos com uma revisão dos conceitos básicos
da replicação, transcrição e tradução do DNA, conceitos
ev olutivos e a conexão entre a variação herdada e os pro-
cessos evolutivos no nível coberto pelos cursos de biologia
- introdutórios ( Capítulo 1). Depois, a genética mendeliana
é introduzida, apresentando uma discussão da identifica -
ção dos quatro genes de Mendel ( Capítulo 2). Seguida por
divisão celular e a herança ligada ao sexo (Capítulo 3) e
as interações genicas (Capítulo 4). Finalmente, a identi-
ficação e análise da ligação genética nos genomas euca-
rióticos e a an álise da transferência génica nos genomas
bacterianos encenam a parte (Capítulos 5 e 6) .
Parte 2 — Dogma central
Calcada na introdução dos processos moleculares
da Parte 1, essa parte descreve os detalhes da replicação
do DNA (Capítulo 7), a transcriçã o e o processamento
do RNA (Capítulo 8) e a tradu ção (Capítulo 9). À me-
dida que exploramos em mais detalhes esses conceitos
fundamentais, também introduzimos técnicas laborato-
riais importantes, como a reaçã o em cadeia da polime-
- rase e o sequenciamento do DNA. A parte se encerra
com uma exploração do traço humano autossòmico
recessivo da anemia íalciforme, que apresenta a integra -
ção da transmissão genética, análise molecular, técnicas
moleculares e evolução (Capítulo 10).
Parte 3 — Estrutura e função do genoma
Começamos a Parte 3 descrevendo a estrutura cro-
- mossômica bacteriana e eucariótica (Capítulo 11). De-
pois, passamos para a mutação gê nica, reparaçã o do
DNA e recombinaçáo homóloga (Capítulo 12), seguida
pelas mutações cromossô micas e pela transposição (Ca -

pí tulo 13). A discussão da regulaçã o da expressão gênica
nas bactérias e bacteriófagos vem a seguir (Capitulo 14),
com o último capítulo enfatizando o papel dos fen ô me-
nos epigen éticos na regulação da expressão génica nos
eucariotos (Capítulo 15).
Parte 4 — Expressão e análise genômica
Discutimos a tecnologia do DNA rccombinantc
e seu uso nas abordagens gen éticas anter ógradas e
reversas ( Capí tulos 16 e 17), seguida pelas an á lises e
aplica ções genô micas (Capitulo 18), além da herança
dos genomas citoplasm á ticos e a evolução das orga
nelas citoplasm á ticas (Capítulo 19 ). O capítulo final
da parte descreve o uso das abordagens gen éticas
para compreender o desenvolvimento dos organis -
mos ( Capí tulo 20).
Parte 5 — Análise genética das populações
Amarramos os conceitos do curso explorando a ge-
nética quantitativa (Capítulo 21) que inclui a discus -
são dos experimentos historicamente importantes que
contribuíram para o desenvolvimento dessa área e tam -
bém as modernas aplicações da análise de associação
—
gen ômica e voltando a focar na evolução da gen ética
populacional (Capítulo 22).
Formas para melhor aproveitamento
do livro
Este livro foi escrito com uma abordagem que
trata primeiro das teorias mendelianas, a qual muitos
professores acham que oferece a abordagem pedagó-
gica mais eficaz para ensinar genética. No entanto, sa -
bemos que o escopo da informaçã o coberta nos cursos
de genética varia e que as preferê ncias de cada profes -
sor são diferentes. Mantivemos em mente as diferen
ças e as abordagens alternativas enquanto escrevemos
o livro. Desse modo, fornecemos cinco formas que os
professores podem usar na leitura deste livro para sa -
tisfazer seus variados objetivos de curso. Cada forma
apresenta a integração da resolu ção de problemas
através da inclusão de recursos de análise gené tica em
cada capí tulo.
1. Abordagem começando por Mendel
-
Caps. 1 22
Esse caminho proporciona uma abordagem tra
dicional que começa com a gen ética mendeliana,
-
integrando a com os conceitos evolutivos e a conec
tando com a genética molecular. Como exemplo , dis
cutimos os genes responsá veis por quatro dos traços
de Mendel ( Capítulo 2) e també m a estrutura gé nica
em relaçã o ã dominâ ncia e ao n ível funcional (Capí
tulo 15). Reunimos a variaçã o hereditá ria , a varia ção
molecular e a evolução na discussão da anemia falci
forme (Capí tulo 10).
Pref á cio XXI
2. Abordagem começando pela base
molecular
. - . - —
Cap 1 » Caps 7 10 > Caps. 2 6 -- 4 Caps. 11-22
Esse caminho proporciona uma abordagem que
começa desenvolvendo uma compreensã o clara da base
molecular da hereditariedade e da variação antes de nos
aprofundarmos na an álise da transmissão hereditá ria.
3. Integração da análise molecular
- - -
Cap.1 -> Cap. 10 * Caps. 2 15 -4 Caps. 16 22 -
Esse caminho se concentra nas semelhanças entre
as an álises da transmissão genética e da genética mole -
cular logo de início e reflete melhor a maneira como os
geneticistas abordariam o estudo da á rea. Recomenda -
mos esse caminho para os alunos que já possuem uma
forte base em genética e que estão familiarizados com
algumas técnicas moleculares comuns.
4. Foco na genética quantitativa
.-
Caps l 2 -> Cap 21. — .-
Caps 3 20
— .
Cap 22
Esse caminho incorpora a genética quantitativa,
assim que o curso se inicia , ao introduzir a herança po-
-
ligènica (Capitulo 2) e seguindo se com uma discussão
abrangente da genética quantitativa (Capítulo 21).
5. Foco na genética populacional
. - . -
Caps 1 2 -4 Cap 22 > Caps 3 21. -
Esse caminho incorpora a genética populacional
logo no início do curso. Os professores podem usar a
introdução aos princí pios e processos evolutivos (Capí -
tulo 1), o papel dos genes e alelos na transmissão (Capí-
tulo 2) e depois abordar a evolu ção no n ível populacio-
nal e em n íveis mais elevados (Capítulo 22).
-
Recursos dos capítulos
Um dos principais objetivos do nosso estilo de es -
crita e organiza ção dos capítulos é envolver o leitor in -
telectualmente e visualmente para convidá -lo à leitura
cont ínua, a todo momento explicando claramente as
ideias complexas e dif íceis. Nosso tom de conversa -
ção estimula a leitura e compreensão do aluno e nosso
design atraente e programa de arte realista envolvem
visualmente os alunos e os deixa confortáveis. Os pro -
- fessores de genética experientes sabem que os alunos
se envolvem mais quando relacionam os conceitos ao
mundo real. Para esse fim, usamos dados experimen -
-
- tais reais para ilustrar os princí pios e a análise genética,
bem como para familiarizar os alunos com pesquisas es-
-
timulantes e pesquisadores criativos na área. Também
discutimos um amplo conjunto de organismos seres
humanos, bact é rias, leveduras, plantas, moscas da fruta, —
- —
nematódeos, vertebrados e vírus para exemplificar os
princí pios da genética. Constatamos que essa aborda -
XXII An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
gem ajuda os alunos a enxergar a diversidade da gené
tica e a relacionar melhor os conceitos.
Nossos recursos dos capítulos foram pensados cui
dadosamente. Cada um deles serve para incrementar
a aprendizagem do aluno e fazer com que pensem de
forma mais parecida com a de um geneticista. Muitos
recursos estão incluídos em cada capítulo ou aparecem
de modo mais ocasional, mas os recursos a seguir ilus-
tram como destacamos as ideias principais, problemas e
métodos importantes para compreender a genética.
Aná lise genética: esse é o nosso principal recurso
para a resolução de problemas. A Análise Genética
orienta os alunos por todo o processo de solução
do problema usando o arcabouço avaliar deduzir
-solucionar.
figuras básicas: ilustrações altamente detalhadas de
conceitos de genética essenciais.
I Observações experimentais: discutem experimen -
tos importantes ou ilustrativos, os dados derivados
dos experimentos e as conclusões extraídas da aná
lise dos resultados experimentais.
I Técnicas de pesquisa: exploram métodos de pes-
quisa importantes e ilustra visualmente os resultados
e intepretações.
I Observa ções gen éticas: resumos curtos inseridos
nos capítulos, a respeito de princí pios fundamentais ,
ideias e conclusões.
Estudos de caso: exemplos curtos e realistas, ao final
de cada capítulo, destacam as ideias centrais ou os
conceitos do capí tulo com exemplos interessantes,
que fazem os estudantes se lembrarem de algumas
aplicações práticas da genética.
Revisando e testando a compreensão
No final dc cada capí tulo, temos um resumo dos
conceitos fundamentais organizados por seçã o do ca
pitulo, termos chave para ajudar os alunos a se autoa
valiarem durante a revisão do capítulo e conjuntos de
problemas diversos para ajudar os alunos a se prepa
.
rarem para as provas Os conjuntos de problemas são
separados em problemas conceituais e problemas de
aplicação/integraçâo. Os problemas de conceitos do ca
pitulo ajudam os alunos a avaliar sua compreensão dos
conceitos fundamentais apresentados no capitulo, en
quanto os problemas de aplicação e integração propor
cionam aos alunos um trabalho pr á tico com conjuntos
de dados reais ou conceitos sintetizados nos capítulos.
Os dois conjuntos de problemas podem ser abordados
usando a estratégia avaliar- deduzir -solucionar.
Seus comentários e sugestões são
bem-vindos
A gen ética muda permanentemente e os livros
também precisam mudar para acompanhar a á rea e sa
tisfazer as necessidades dos professores e alunos. A co-
- municação com nossos usuários talentosos e dedicados
é um fator importante de mudança. Acolhemos todas as
- sugestões e comentá rios e convidamos você a se comu
nicar conosco diretamente através de um endereço de
-
-
e mail dedicado ao livro. Por favor, envie comentá rios
sobre o livro para sbgenetics@ uc- davis.edu.
Agradecimentos
O adágio que começa com as palavras “ É preciso
uma aldeia inteira... [ para educar uma criança]” aplica
-se com mais exatidão ao desenvolvimento e montagem
-
da primeira edição de um livro do que a qualquer outro
- empreendimento que conhecemos. Podemos atestar que
este IíVTO não existiria sem as contribuições inestimá veis
de in úmeros profissionais, cujo talento e dedicação firme,
para produzir o melhor livro possível sobre genética, são
evidentes em cada página. Foi um verdadeiro esforço em
equipe e somos gratos a todos os nossas colegas.
Gary Carlson tem sido um amigo há muitos anos c
- também mentor, advogado e fadlitador deste livro desde
o início, quando nào passava de rascunhos. Não temos
como agradecé-lo o suficiente por seu apoio resoluto e
amizade. Este livro nào existiria sem ele. Michael Gillcs-
pie assumiu as rédeas como editor de aquisições no fim
deste projeto e trouxe consigo uma habilidade considerá-
vel e um entusiasmo implacá vel pelo I í VTO. Valorizamos
muito seu trabalho para levar este projeto à conclusão e
pretendemos trabalhar com ele no futuro.
Adam Stcinberg atuou como nosso editor de arte
e é um profissional incompará vel. Suas habilidades ex -
traordin á rias como artista só rivalizam com seu conhe-
cimento íntimo do assunto. Ele produziu muitas das
peças de arte dinâmicas e intelectualmente envolventes
no livro, e n ão há como mensurar o que sua concep-
ção artística acrescentou à obra. Os artistas sofistica-
dos da Precision converteram as orientações de Adam
- em muitas das peças de arte soberbas apresentadas no
- livro. Nossa editora de desenvolvimento, Moira Lerner
Nelson, trouxe suas excepcionais habilidades editoriais
- para cada capítulo. Sua orientação e dedicação foram
inestimáveis. També m queremos agradecer a Carol
Pritchard - Martinez, que nos prestou uma importante
- orienta ção editorial logo no início do projeto.
O desenvolvimento do nosso projeto esteve nas
- mãos talentosas de Deborah Gale. Apreciamos pro -
- fundamente seu envolvimento, tanto por sua expertise
quanto por sua orientação durante a elaboração e a re
dação dos manuscritos. Anna Amato realizou o dif ícil
-
e quase sempre ingrato trabalho de gerenciar as ativi -
dades dia a dia, semana a semana, da elaboraçã o e re
dação do livro, com boa vontade, competência e bom
-
humor. Ela foi a cola que algumas vezes manteve as coi-
sas juntas. Camile Herrera e sua equipe compuseram
e produziram um livro excepcionalmente atraente, fa -
zendo com que o nosso texto pareça melhor e faça mais
- sentido. Também agradecemos a Crystal Clifton e sua
equipe de editores de texto por sua assistência.

Lauren Harp, Michelle Cadden e Brooke Sucho
mel nos deram apoio e informações críticas importan -
tes através dc pesquisas dc marketing, testes cm sala
de aula e grupos de discussão com alunos. Seu trabalho
ajudou a formatar e melhorar o livro que vocé está se
gurando. També m agradecemos a Dave Theisen, nosso
-
diretor nacional de vendas para mercados chave, que
desenvolveu uma compreensão ampla do nosso con
teúdo e abordagem, além de nos prestar apoio excep -
cional , e a todos aqueles que trabalham com ele. Beth
Wilbur, M íchael Young e Paul Corey desempenharam
papéis importantes para tornar este livro realidade, e
agradecemos a eles por tudo o que fizeram em nosso
nome e em nome deste projeto.
Peter Mirabito, que desempenhou a tarefa hercú
lea de escrever as soluções para os problemas de fim
de capítulo, foi inestimável. Desde a primeira vez que
nos encontramos, Peter nos apoiou muito na confecçio
deste livro. Não poderíamos estar mais contentes por
ter Peter em nossa equipe.
Finalmente, agradecemos aos revisores técnicos
e aos demais colaboradores que investiram seu tempo
para ler e comentar o nosso manuscrito em vários está
gios. Valendo- nos de sua expertise e perspectivas, eles
são responsá veis pelas melhorias neste livro. F.ssa con -
tribuição nos é impossível contabilizar.
Revisores técnicos
Bert Abbott, Clemson University
Mary Alleman, Duquesne University
Ancha Baranova , George Mason University
Timothy Bloom, Campbell University
James Bradley, Aubum University
Caro! Burdsal, Tulane University
Patrick Burton , Wabash College
Pat Calle, Eastern Kentucky University
Vkckl Cameron, ithaca College
Kimberly Carlson, University of Nebraska at Kearney
Steven M. Carr, Memorial University of Newfoundland
—
Aaron Cassill, University of Texas San Antonio
Clarissa Cbeney, Pomona College
Francis Choy, University of Victoria
Beth Conway, Lipscomb University
Kirsten Crossgrove, University of Wisconsln Whitewater
Kenneth Curr, Calif órnia State University, East Bay
Kim Dej, McMaster University
Chunguang Du, Montclair State University
John Elder, Valdosta State University
Victoria Finnerty, Emory University
Robert Fowler, San Jose State University
RIckGaber, Northwestern University
—
Anne Galbraith, University of Wisconsln La Crosse
Susan Godfrey, University of Pittsburgh
Michael Goodisman, Georgia Tech University
Nels Granholm, South Dakota State University
.
Jody Hall Brown University
Pam Hanratty, Indiana University
Pref á cio XXIII
- Mike Harnngton, Umversity of AJberta
Patrick Hayes, Oregon State University
Jutta Heller, Loyola University
Jerald Hendrix, Kennesaw State University
- Kathleen Hlll, University of Western Ontario
Nancy Huang, Colorado College
Erik Johnson, Wake Forest University
- Cheryl Jorcyk, Boise State University
Davld Kass, Eastern Michigan University
Cliff Keil, University of Delaware
Steven Kempf, Auburn University
Ollver Kerscher, College of William & Mary
ElHot Krause, Seton Hall University
Jocelyn Krebs, University of Alaska
- Alan Leonard , Florida International University
-
Mln Ken Liao, Furman University
Kí rill Lobachev, Georgia Tech University
Heather Lorimer, Youngstown State University
Fordyce Lux, Metropolitan State College of Denver
Clint Magill, Texas A&M University
Jeffrey Marcus, Western Kentucky University
Phillip McCIean, North Dakota State University
- Philip Meneely, Haverford College
John Merriam, UCLA
Scott Michaels, Indiana University
Peter Mirabito, University of Kentucky
Margaret A. Olney, St. Martin's University
Greg Orloff, Emory University
. —
John C Osterman, University of Nebraska Lincoln
John N. Owens, retired
J. S. Parkinson, University of Utah
Bernie Possidente, Skldmore College
Chara J. Ragland, Texas A&M University
.
Dennis Ray University of Arizona
Rosie Redfield, University of Brltish Columbia
John Rinehart, Eastern Oregon University
Malcolm Schug, University of North Carolina at Greensboro
Rodney Scott, Wheaton College
—
Linda Sigismondi, University of Rio Grande
Tin Tin Su, University of Colorado Boulder
Martin Tracey, Florida International University
-
Tara Turley Stoulig , Louisiana State University
Fyodor Umov, University of Califórnia , Berkeley
Sarah VanVickle-Chavez, Washington University in St. Louis
Dennis Venema, Trinity Western University
David Waddell, University of North Florida
Dunkan Walker, private buslness
Clifford Weil, Purdue University
Karen Weiler, West Virgí nia University
Dan Wells, University of Houston
Brnce Wightman, Muhlenberg College
Diana Wolf , University of Alaska Fairbanks
Andrew J. Wood, Southern Illinois University
Joanna Wysocka Diller , Auburn University
Lev Yampolsky, East Tennessee State University
Ann Yezerski, Kings College
—
Janey Youngbiom, Calif órnia State University, Stanislaus
Chaoyang Zeng, University of Wisconsln Milwaukee
XXIV Aná lise gen é tica: uma abordagem integrada
Aplicadores práticos
Daron Barnard . Worcester University
Mary Bedell, University of Georgia
Indrani Bose, Western Carolina University
Mirjana Brockett, Georgia Institute of lechnoiogy
Gerald Buldak, Loyola University Chicago
Hui Mln Chung, University of West Florida
Craig Coleman, Brigham Young University
Cynthia Cooper, Washington State University Vancouver
Kenyon Daniel, University of South Florida
John Hamlin, Louisiana State University, Eunice
Kelly Hogan, University of North Carolina at Chapei Hill
Barbara Hollar, University of Detrolt Mercy
Rick Jellen, Brigham Young University
David Johnson, Samford University
Diana Johnson, Geocge Washington University
Hope Johnson, Calif órnia State University, Fulierton
.
Christopher Jones Moravian College
.
Todd Keison, Brigham Young University Idaho
Joomyeong Klm, Louisiana State University
-
Melanie Lee Brown, Guilford College
Alan Lloyd, University of Texas at Austin
Heather Lorimer, Youngstown State University
Peter Mirabito, University of Kentucky
Paul Morris, Bowling Green State University
Marlene Murray Nsuela, Andrews University
Nikolas Nlkolaldis, Calif órnia State University, Fulierton
.
Kavita Oomen Georgia State University
Rebekah Rampey, Hard í ng University
Mike Robinson, Miami University, Ohio
Melissa Rowland -Goklsmith, Chapman University
John Scales, Midwestem State University
Lillie Searles, University of North Carolina
Marty Shankland, University of Texas, Austin
Patrida Shields, University of Maryland
Bin Shuai, Wichita State University
Leslie Slusher, West Chester University of Pennsyivania
Tom Snyder, Michigan Technical College
.
Jeff Stuart Purdue University
Susan Sullivan, Louisiana State University, Aiexandria
Christine Terry, Augusta State University
Jimmy Triplett, Jacksonville State University
Virginia Vandergon, Calif órnia State University, Northridge
David Westenberg, Missouri University of Science & Technology
Bruce Wightman, Muhlenberg College
Craig Woodard, Mt Holyoke College
.
Roger Young Drury University
Demais colaboradores
Califórnia State Polytechnic University, Pomona
Professor Glenn Kageyama
Jacqueline Aguayo, Angela Beal, Rosslyn K. Beard, Tiffany
Chau, Jacklyn Chen, Joyce Chen , Nancy Chen, Stephen Chun,
Jacquelyn Coello, Sarah Cunningham, Elizabeth Demarest,
.
Damela Dorantes, Andrew Esterson, Erick Estrada Ch í rag Fain,
Janae Ferguson, Kamaljit GUI, Josiah Gin, Scion Gomez,
Israel Gonzales, Molly Gou í n, Leslie Hernandez, Phu Hoang,
Leticia Jaramillo, Amera Kchech, Daniel Lee, Jonathan Lee,
Fabiola Lugo, Marlsa Martlnez, Neha Mohindroo, Klng Moon,
.
Jared Nojima, Justin Padiernos Gricel Plascenc ía,
Bemice Ramirez, Sara Villa, Lu Wang, Brittany Ward ,
Ebony White
University of Texas, Austin
Professor Inder Saxena
Matthew Boumeuf , Kayla Bradfield, Shelley C Bradley,
Kiersten DeHart, Nathan Fu, Jered Heinrich, Grant Hogan,
Giertda Hope , Garcia, Ramu Kharel, Nafeeshathul S. Rlyaj,
Jarrett Scott, Elaina Spriggs, Diana Weng
University of Califórnia, Los Angeles
Professor John Merriam
Cameron Arakaki, Jasmine Chen, Michaela Ching,
Darwin Dirks, April Gamboa, Zhyliana Garcia Valdez,
Flizabeth Geledzhyan, Vktoria Hsu, Sophianne Kajouke,
Michael Kashiktchianjonathan Liem, Danielle Lingnau,
Tram Loi, Michael Opene, Michaeia Scott, Mital Shah,
Eve Tang
Colaboradores complementares
.
Pat Calie Eastern Kentucky University
Kathleen Fltzpatrlck, Simon Fraser University
Jutta Heller, Loyola University
David Kass, Eastern Michigan University
Fordyce Lux III, Metropolitan State College
Peter Mirabito, University of Kentucky
Louise Paquin , McDaniel College
-
Sarah Van Vickle Chavez, Washington University in St. Louis
Dennis Venema, Trlnlty Western University
Andrew J. Wood, Southern Illinois University
Agradecimentos da edição brasileira
Sem o trabalho de avaliação dos ilustres professores
Vieira Bianco
— —
Andrea Kely Ribeiro dos Santos UFPA, Rianca Alves
FMABC ( Departamento de Genética ),
Denise Maria Christof òlini
——
FMABC ( Departamento
de Genética ) e Waldir Stefano Mackenzie, a publica -
ção deste livTO não seria possível.
Sala Virtual
Como complemento do livro, a Sala
Virtual fica à disposição de alunos e
professores para que acessem materiais
adicionais, que facilitam tanto a exposição das aulas
como o processo de aprendizagem .
• Para professores: apresentações em PowerPoint, ga -
leria de imagens e exercícios adicionais (em inglês).
• Para estudantes: exercícios adicionais e discussões,
além de comentários de alguns estudos de caso ori -
ginais, sob a perspcctiva brasileira ( os estudos de
caso comentados estào sinalizados com ).
 Uma abordagem consistente e efetiva para solução
de problemas

Análise Genética proporciona aos estudantes uma estratégia única e integrada para a
solução de problemas.
O maior desafio em um curso de genética é ensinar aos alunos como se tornarem efetivos solucionadores de
problemas. Neste livro, aplicamos uma incompar ável ferramenta para solucionar problemas, a Aná lise Genética,
que oferece aos estudantes uma consistente abordagem para solucionar problemas em très etapas. A Análise
Genética está inserida em todos os capítulos, acompanhando discussões de conteúdos importantes, para ajudar
os estudantes a imedí atamente aplicar conceitos em um contexto de soiuçáo de problemas.

Todo exemplo de Análise Genética apresenta Cada Análise Genética é apresentada em um formato claro, em
uma consistente abordagem em três etapas, duas colunas que ajudam os estudantes a verem a Estratégia
que treina os estudantes para avaliar, deduzir de Solução em uma coluna e sua execução correspondente na
e, ent ão, solucionar problemas. coluna separada para as Etapas da Solução.

 _

A N Á L I S E G E NÉT I C A
Voeé está enemwrin no desenvcrfvtme
' * .
d kr<p iMnê «tg marrom comam en
* -
—
contradi ao tango de muitos Itorjts Asy
rep'»t nMd irespoclfeamento
* *
riliRinM«lfqu«dMp>)M
da
os ganes
i gémea
•
pato uso da mutagénasa
para o desenvofemento tateia! da —-
tas reversos ou pnxpecttvas conforme
se

Estrat égias de soluçéo Etapas d» soluçio

• Avaliar
1, Identifique o túptco aberdado por 1. Esta probtama db respeito a mvesbgeçio dos ganas qua determinam o desen-
est pmbéeme e eipéque a natumra
* voívimento 6« Mfc X elabcraçio da uma resposta requer a avefteçèo do po -
da resposta solatada. tencial refcrtvo da análae genética reversa /mus a arélise genética prospectfv»
(ver Capítulos 16 a 17X

2 Identifique is informaç A# criticas 2 A fa/Ç» é idenr ^cada como aig» marrom, um» forma de vid diferente das plan-
forreddes no problema * tas e anmaie tenestrev
*
• Oeduxlr
y -
Dctt mlnc se o narre da homologa . O exame da figura 18.12 indica que a kr
J í o tem uma ictaçio dlsurte com as
oWa (uma ábordegem genética .
plantas « anértais t«e*estres aooantp a busca por ganas das aigas marrons com
revena! tem uma alta pmbablidade base ras sequénoes génio evoiudm das pantas ou animais é como uma e -
* *
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4, Oe«rmin se o uso da mutagénese 4 Uma boa abordagem para encontrar gere» «rvokitlvo t «eaixar um experi-
*
(uma abodagem genétea prospec - *
mento de mutagénese que v» identificar mutados em que a formação de pa-
chral tende a ajudar a Identificar os dréo foi perturbada. A mutagénese tem potencial para afetar qualquer gene;
desse modo,a abordagem genélka prospective rd© poUiúeda ou resulta ao»
*
genes que compatttsam homologm com os genes em outras espéaes. Os mu-
Cana«amM9J»i tados que et!bem aromadas de formaçlo de pa&So do tipo selvagem tendem
•mOr a ser portadores da mutações dos ganas formadoras da pad*éo
+
Para praticar mal ver Problemas 17, 19.21, 25 e 28
* .
I Para praticar ma is, os estudantes sáo
direcionados para problemas similares
Os exemplos da Aná lise Genética incluem
dicas úteis para passar por etapas difíceis
no final do capitulo. e armadilhas a serem evitadas.
 Uma abordagem integrada da evolução e das
genéticas molecular e Mendeliana

O texto apresenta uma abordagem integrada da evolução e das genéticas molecular

e Mendeliana.
-
1.4 A evolução tem uma base
molecular
.
Uma persp«ctrva integrada e evolucionária é demonstrada em todo o li
vro auxiliando os estudantes a manter o foco em importantes princípios
evolucionários de modo que eles aprendam o cerne do conceito genético.
A medida que os biólogos fazem um levantamento
dis variedades de vida, avalia»
diferias genéticas entre as « 5 6 A aná lise da liga ção oênira

. .
reiaçio dos organismos moderno
com seus ancestral extintos, Ika
* investiga a evolut
A srleç An natural atuou para reter uma grande - Capítulo 8 **
«ida está «mectada peto DNA. R metoança das sequências nas regiões de conaenso e para
Amduçio ltaruosgmo » (der a posição das regsoes de coeucnao relatrvas ao ini*
togo e autor «Je vário livros subs laçóa evoluem t as espécies im
• *
tu CIMISKJO molecular quando • * 00 da transcriçio A eôcacia da evoluçlo para manter
muna Lsus alterações incluem
as sequências de consenso promotoras é álistrada pcU
Capítulo 1
rus iWicat (Capitulo 22) mui .
çompartçéo com as sequências entre e em tonto de
estrutura dos cromossomos
de mwr gem s 011 funções gên -
« .
10 e -35 que rsio são «mamadas e exibem variação
* - consideriveL Além disso, o espaçamento entre as se- Capitulo 8
quências e sua coloc&çOo relativa
Capítulo 5 retAvci A RNA pollmcrasc t uma| Lmt semelhanças de estrutura e função da RNA
polimrrase sao um resultado direto da hislóna evolu -
tiva comum de bactérias, archaea e eucartotos

Capitulo 10 incomparável: Integração

das abordagens genéticas explora a
Integração das abordagens hereditariedade e a base molecular da anemia
genéticas:compreendendo a falciforme em humanos, incluindo discussões
anemia falciforme sobre diversas técnicas de pesquisa .

TI»çD C#n» » pnAits .

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Com uma tradicional organização dos capítulos,
Sanders e Bowman integram transferência genética
e genética molecular em tabelas, figuras e texto.
«
Essa abordagem ajuda os estudantes a entender
i lir
* * vrriJm
1

como os geneticistas da atualidade pensam. wr »ja«»

Base molecular da dominância

;nrrnr rrU»
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* » «] #

—
Uma caractenstica t dita denunante se fcr obter -
vada no pendtipo homoaipctfos e bfterozipoto e e a Hí» « VM wytymixivww
* * * *
chama recessiva se for observada apenas em um genò- ** .*
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t po Komorígoto Nesse sentido, s domlnânce e s reces-
*
«Ivtdadr têm uma base íeivolípicx No entanto os fend- .
tlpo rfo uma romtequéncls das atividade das proteína
*
produzidas * sentido, s*
pelo airlos de uan gene. Neste
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*
domlninda e recesatvidide tém uma bx e molecular .
*
A damínónan de um alelo em relação s outro t deter
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*•
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minada pela atividade dos produtos proteico do alelo

*
pela maneira «imo os produto proteico dos oieios fun -
* *
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* »»vewosés 0 »
*
aat> flSau«KCMM 0 fcT«ci»«tisnapnk **
cionam para prockuar o lenolipo . aiksmpuwn linrisi

Comporemos dois «xavnpto para iludxur a base mo-

*
•
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*. Em ambos os
ewmpios, um >lo do tipo selvagens produz uma enzlana IflCuSoa SantOo: n.t»
* ^o
stiva e um alelo muUdo produz muito poucas enzimas
ou nenhuma. No pmnoro exemplo, o alelo rmitado é
recessivo, mas no segundo, o alelo t óormnantr No pn
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 Figuras elaboradas cuidadosamente que ensinam
processos genéticos complexos

As figuras em Análise Genética ajudam os estudantes a entender as mais importantes

e muitas vezes desafiadoras — lições em cada capítulo.

FIGURA BASIC 4.21

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Figuras Bá sicas assimilam texto e arte para

ilustrar conceitos genéticos essenciais em um
formato conciso e fácil de acompanhar.
Muitas figuras-chave incluem comentá rios, que
direcionam o foco dos estudantes para aspectos-chave
do conceito que está sendo ilustrado .

No processo das figuras, os números circulados na As figuras selecionadas incorporam um

ilustração são apresentados do mesmo modo que os adequado estilo de arte realístico,
números circulados na legenda da figura ou no texto. incluindo modelos moleculares em 30.
 Uma organização clara proporciona um caminho
de aprendizado e direciona o foco dos estudantes
para lições importantes

Análise Genética proporciona uma trajetória clara.

Capítulo Análise e mapeamento genético

6
AWSINTA ÇÀO
nas bactérias e bacteriófagos

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U A tato ta a

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Para uma breve visão geral ou

revisão, cada capítulo é aberto
com uma apresentação de
seu conteúdo e uma lista de
Pontos Essenciais.

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Observação genétka A conjugação hactMana é contro-

lada pek» ganas do fator F que dirigem a formação de um tubo
.
de conjugação entre as célu as doado* as e as receptoras A con-
jugação dnadora mrptorj leva á transfrrfnria dr DNA prla rr-
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apenas o DMA do fator F para as célu as F receptoras. **
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A Observação genética aparece em cada capitulo •» ( i tai

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e auxilia os estudantes a reconhecer e entender » a» . itatl

conceitos-chave de forma resumida . I AI

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taaaai v ta I Cl tvço»
A apresentação do capítulo e os pontos
essenciais sâo sintetizados e expandidos
I ta
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ao final do capítulo» no Resumo.
 Envolver os estudantes a aprender sobre as
pesquisas atuais

Análise Genética envolve os estudantes no processo da ciência com um pensamento

que promove a discussão de experimentos, técnicas de pesquisa e aplicações práticas
das pesquisas.

Obs#rva{&o Emperlmcntal S 1 .
.
Mapeindoumgtnfpana
* Mjtort cm
MtdncmtdenumieoviiUno

eaJtatil
Obiirvi(lo Eiptrli mtal 17.1
Os ensaios Observação Experimental
examinam prestigiados experimentos,
« » p> to Madacamantoi anlimaiártcoí òailveòo» da planta a pradudto na £ cotl
* *I * resumem dados reais derivados de
im
A a* MOMWC utoM
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sn » wlrrr .tu ri~ t* n « C ,'oJ
arim t ni «u IM U t rbU> 4: to
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experimentos e explicam conclusões tiradas
*»no « •a»anne ...
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TlCNICA 01 MSOUtSA 19.1
a Importantes métodos de pesquisa e Ilustram
•to* â os resultados e interpretações das técnicas.

SB

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ESTUDO DE CASO aparecem no final de cada capitulo e destacam
-
A ea oluçAo da resmènda
Unika. cn WW AkunJcr Kami M ntucii < nauaia,ulmlo nikim de poaiti
ideias e conceitos centrais do capítulo, para
relembrar os estudantes de algumas aplicações
iNkuNo coai *ua lAnki catEnl « «otitw
H wta IW . . . ind» o mud» rnimimttm A» «f»a» do O» «um» qt
* práticas da genética.
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Base molecular da Capítulo
hereditariedade,
variabilidade e evolução
APRESENTAÇÃO
1.1 A genética moderna entrou em seu segundo
século
1.2 A estrutura do DMA sugere um mecanismo para
a replicação
13 A transcrição e a tradução expressam os genes
1.4 A evolução tem uma base molecular

Escultura do DNA medindo três andares, pendurada no átrio do pré-

dio de Ciências da Vida na Universidade da Califórnia, Davis.

A vida é impressionante, tanto na riqueza de sua história

quanto em sua diversidade. A partir dos primeiros orga
nismos unicelulares simples que surgiram bilhões de anos atr á s
-
descenderam milhões de espécies de microrganismos, plantas
e animais. Todas essas espécies estão ligadas por um passado
evolutivo comum, que é revelado pelo estudo da genética, a
ciência que explora a organiza çã o, transmissão, expressã o,
PONTOS ESSENCIAIS
I A genética moderna se desenvolveu du-
rante o século XX e hoje é uma disciplina
proeminente da área de ciências biológicas.
I A replicação do DNA produz cópias exatas
da molécula original.
I O "dogma central da biologia ,* que descreve
1

a relação entre DNA, RNA e proteína, é a

variabilidade e evolução das características heredit árias dos
base da biologia molecular.
organismos . I A expressão genica é um processo de duas
A genética é uma disciplina dinâmica, que encontra apli- etapas que primeiro produz um RNA trans-
ca çã o sempre que os seres humanos interagem uns com os crito de um gene e depois sintetiza uma
sequência de aminoácidos pela tradução
.
outros e com outros organismos Em laboratórios de pesqui- desse RNA.
sa, fazendas, supermercados, consultórios médicos, tribunais I A evolução é a base da genética moderna,
e em muitos outros contextos, a genética exerce um grande e que ocorre através de quatro processos.
crescente papel nas nossas vidas. A genética moderna é uma
disciplina cada vez mais baseada em genes e genoma —ou
seja, está cada vez mais focada nos eventos no ní vel molecu-
lar — contudo, continua fortemente concentrada nas áreas tra-
2 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
dicionais de hereditariedade e variabilidade no n í vel
da aparência fí sica . Bem- vindo à disciplina fascinante
da genética; vocè está em uma jornada empolgante e
gratificante.
Neste capitulo fazemos um levantamento do es-
copo da gené tica moderna e apresentamos algumas
informações bá sicas sobreo ácido desoxirribonucleico
— DNA, o portador da informação genética. Começa-
mos com um breve panorama global das origens da
ciência genética. Em seguida, repassamos alguns fun-
damentos da replicação do DNA e da transcrição e tra -
du ção (os dois componentes principais da expressã o
gènica), revendo o que vocè aprendeu sobre esses
processos em cursos de biologia anteriores. Na seção
final, descrevemos a posição central da evolução na
gené tica e discutimos os papéis da hereditariedade e
da variabilidade na evolução.
1.1 A genética moderna entrou em
seu segundo século
O homem está implicitamente a par da genética há
mais de 10 mil anos ( Figura 1.1), Desde a época da im
plementação do cultivo do arroz na Ásia, do milho na
América Central e do trigo no Oriente Médio, os seres
humanos reconheceram que os traços desejados encon
trados em plantas e animais podem ser reproduzidos e
aperfeiçoados nas gerações seguintes através do acasala
mento seletivo. Por outro lado, a exploração explícita e a
compreensão dos princípios hereditários da genética o
que poderíamos considerar como a ciência da genética
— As bactérias são organismos unicelulares que n ão
—
moderna são um desenvolvimento muito mais recente.
O primeiro século da genética moderna
Em 1900, três botâ nicos que trabalhavam de ma-
neira independente entre si — Cari Correns na Alema
na Á ustria
—
nha, Hugo de Vries na Holanda e Erich von Tschermak
chegaram a conclusões surpreendente
mente similares a respeito do padrão de transmissão
.
dos traços hereditá rios em plantas ( Figura 1.2) Cada
um deles relatou que seus resultados se espelhavam nos
publicados cm 1866 por um botâ nico amador e monge
agostiniano desconhecido, chamado Gregor Mendel.
(O trabalho de Mendel é discutido no Capí tulo 2.) Em
bora Correns, de Vries e Tschermak tenham realmente
redescoberto uma explicação para a transmissão here-
ditá ria que Mendel havia publicado 34 anos antes, seu
an ú ncio da identifica ção dos princípios da transmissã o
hereditá ria deu início à genética moderna.
Biólogos começaram imediatamente a testar, veri
ficar e expandir a explicação recé m-avaliada da heredi
tariedade. Em 1901, Willian Bateson, um dos primeiros
e vigorosos proponentes do “ mendelismo", leu uma pu
-
blicaçào de um f ísico cientista britânico chamado Ar -
chibald Garrod , descrevendo o surgimento da doen ça
hereditá ria alcapton ú ria em vários membros de famílias
diferentes. Bateson percebeu imediatamente que a des-
crição de Garrod retratava "cxatamvntc as condições
mais propensas a permitir que uma característica rara
e geralmente recessiva se manifestasse”. Garrod, com
a assistê ncia interpretativa de Bateson, produziu o pri
meiro exemplo documentado de um transtorno heredi
--
tário humano.
Logo depois, Walter Sutton e Theodore Boveri, de
modo independente, usaram o microscópio para obser-
var o movimento cromossómico durante a divisão ce-
lular nas células reprodutivas. Ambos observaram que
os padrões de movimento cromossómico espelhavam a
transmissão das recém -descobertas unidades hereditá -
rias mendelianas. Esse trabalho sugeriu que as unidades
hereditá rias, ou genes, formuladas por Mendel, est ão
localizadas nos cromossomos. Os genes são as unidades
f ísicas da hereditariedade. Hoje sabemos que são com -
postos por sequências de DNA definidas que controlam
coletivamente a transcrição génica e contêm as infor
mações para produzir moléculas de RNA ou prote ínas.
-
Os cromossomos consistem em moléculas compridas
e ú nicas de DNA de fita dupla e podem se associar a
muitos tipos de proteínas diferentes. Os cromossomos
- das bactérias geralmente ocorrem de maneira isolada,
enquanto os cromossomos dos organismos de repro-
dução sexuada costumam ocorrer em pares, conheci -
- dos como cromossomos homólogos ou simplesmente
hom ólogos . Cada cromossomo carrega muitos genes e
- os homólogos carregam genes para os mesmos traços,
na mesma ordem, em cada membro do par.
possuem um n úcleo verdadeiro. Em quase todos os
casos, tê m um ú nico cromossomo que ocupa um es-
paço celular conhecido como nucleoide. O cromos -
somo se replica junto com a divisã o celular bacteriana.
—
Nos eucariotos uma classifica ção que inclui todas as
-
plantas e animais unicelulares e pluricelulares
n úcleo verdadeiro contém vá rios pares de cromosso-
— um
-
mos hom ólogos. Os cromossomos ficam permanente-
mente no n úcleo. Um conjunto completo de cromos-
somos é transmitido durante um processo de divisão
celular , chamado mitose , para produzir células filhas-
idênticas. A reprodução sexual destinada a produzir
uma prole ocorre por meio do processo de divisão ce-
lular chamado meiose, que produz células reprodutivas
- —
ou gametas espermatozóides e óvulos nos animais e
pólen e óvulos nas plantas.
Os padrões previsíveis da transmissão gé nica du -
rante a reprodução sexuada são o foco dos capítulos
posteriores, incluindo transmissão hereditá ria e análise
dos padrões de transmissão (Capítulo 2), divisão celu -
- lar e hereditariedade cromossômica (Capítulo 3), ação
- e interação gènica na produ ção da variabilidade da apa -
rência f ísica (Capítulo 4) e a aná lise da liga ção gen ética
- entre os genes (Capítulo 5).
 Capitulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução 3

( b)

Figura 1.1 Aplicações ancestrais da genética, (a) Um registro antigo da manipulação genética pelos humanos é o alto-
relevo assírio de 882-859 a .C que mostra sacerdotes usando máscaras de pássaros e polinizando tamareiras artifidalmente.
(b) Acredita-se que o milho moderno (à esquerda ) se desenvolveu a partir da domestica ção humana de seu ancestral selvagem,
o teosí nto (à direita ).

Os experimentos genéticos que ocorreram aproxi-
madamente na primeira metade do século XX desen -
volveram o conceito do gene como a unidade física da
hereditariedade e revelaram a relação entre fenó tipo,
significando os traços observá veis de um organismo, e
gen ó tipo , significando a constituição genética de um
organismo. Biólogos também descreveram como a va
riabilidade hereditá ria pode ser atribuída às formas al-
ternativas de um gene, chamadas alelos. Durante esse
período, o estudo da transmissão genica se estabeleceu
como base da gen ética. Os conceitos de ação e interação
gênica na produção da variabilidade fenotípica foram
descritos, assim como o conceito de mapeamento dos
genes. Também foi durante esse per íodo que os biólo-
gos evolutivos desenvolveram os modelos de evolu çã o
baseados em genes. Essas ideias formam a base dos
princ í pios da genética e da an á lise genética e seu uso
continua at é os dias de hoje.
Um experimento realizado em 1944 por Oswald
- Avery, Colin MacLeod e Madyn McCarty identificou
o ácido desoxirribonudeico { DMA ) como o material he-
reditá rio, e esse experimento frequentemente recebe o
crédito por ter inaugurado a "era molecular" na genética
(Capítulo 7). Essa nova era , que compreendeu a segunda
metade do século XX e continua até os dias de hoje,
começou como um esforço para descobrir a estrutura

(a ) Cari Correns
(b) HugodeVries (c) Erich von Tschermak Figura 1.2 Genética
do início do século XX.
( a ) Cari Correns, (b ) Huqo
de Vrles e (c) Erlch von
Tschermak redescobriram
simultaneamente os
experimentos e princ ípios de
Gregor Mendel em 1900.
4 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

molecular do DNA. Essa pesquisa chegou a uma etapa
importante em 1953, quando os esforços de muitos bió
logos, incluindo os mais famosos, como James Watson,
Francis Crick, Maurice Wilk í ns e Rosalind Franklin, con
tribuíram para a identificação da estrutura em dupla - hé
lice do DNA. Alguns anos mais tarde, em 1958, o meca
nismo da replicaçáo do DNA foi elucidado Em meados .
dos anos 1960, os mecanismos básicos da transcrição e
tradução foram estabelecidos e o código genético, por
meio do qual o RNAm é traduzido em prote ínas, foi deci
frado. Com base nessas realizações, a an álise genética em
nível molecular surgiu como o principal campo de inves
tigaçã o genética durante a segunda metade do século XX.
A clonagem e o desenvolvimento da tecnologia de
DNA recombinante evoluíram rapidamente durante os
anos 1970. No inicio dos anos 1980, os biólogos perce
beram que, para compreender adequadamente a uni
dade e a complexidade da vida, eles teriam de estudar
e comparar genomas inteiros. Essa percepçáo lançou
a "era gen òmica " na gen ética. O genoma é o conjunto
completo de informa ções genéticas portadas por uma
espécie. Os biólogos iniciaram centenas de projetos de
sequenciamento do genoma para decifrar as sequê ncias
de DNA completas dos organismos, de bactérias a seres
humanos. Convenientemente, em 2001, um século após
a identificação hist órica da alcapton ú ria como doença
hereditá ria humana realizada por Garrod e Bateson ,
grupos cient íficos do mundo inteiro publicaram o "pri
meiro rascunho" completo do genoma humano, o Pro
jeto Genoma. As notáveis informações proporcionadas
pelo Projeto Genoma Humano e por centenas de ou
tros projetos de sequenciamento do genoma que foram
realizados e concluídos nos últimos 25 anos prome -
- tem que o segundo século da genética será tão notável
quanto o primeiro.
-
- Gen ética: fundamental para a biologia
- moderna
Uma das bases da biologia moderna é a demons -
tração de que toda a vida na Terra compartilha uma
- origem comum, ou progerwta, um termo que significa
"forma progenitora" ( Figura 1.3 ). Toda a vida descende
- desse ancestral comum , sendo frequentemente dividida
cm três grandes domínios dc vida. Esses três domínios
são Eukarya , Bactéria e Archaea. O domínio Eucarya
também é conhecido como domínio dos eucariotos;
- eles consistem em organismos unicelulares e pluricelu -
- lares com um n úcleo verdadeiro, vá rios cromossomos
e outras características diferenciadas, identificadas na
figura. Os dom ínios Bact éria e Archaea consistem em
organismos unicelulares que não possuem um n úcleo
verdadeiro e geral mente têm um ú nico cromossomo,
entre outras caracter ísticas diferenciadas. As células
vegetais e animais conté m organelas especializadas,
chamadas mitocôndrias , e as células vegetais també m
contêm organelas, chamadas doroplastos , que desem -
penham fun ções essenciais. As mitocôndrias e os clo-
roplastos transportam seu pró prio DNA e descendem
- de invasores bacter íanos parasitá rios ancestrais que
- desenvolveram uma relação endossimbiótica com seus
hospedeiros eucarióticos ( ver Capítulo 19) .
- Uma segunda base da biologia é o reconhecimento
—
de que o material hereditá rio a substâ ncia molecular

1. Vários cromossomos Figura 1.3 Os tr ês domínios da vida.

organizados oor proteínas Um ancestral comum (o progenota )
1 N úcleo ligado à membrana e originou os três dom í nios da vida . A
Plantas Eukarya membranas Intracelulares endosslmblose entre os eucariotos e as
Metazoá rios . Organelas ligadas à membrana
terrestres Coano - (animais pluricelulares) 3
4 UniccUlaTs e plurioeiula ^s
bactérias { dom í nios Eukarya e Bact éria )
Algas flagelados .
levou às mitocôndrias ( azul ) e aos
FungosX , 5. Genomas maiores
doroplastos ( verde ) ocupando as cé lulas
Ameboldes
CromoafveoJjdos eucarióticas.
/

^ Rizaria Thermoproteales
Exeavados
/

—
> Desulfurococcales
/ Sulíolobales
Archaea
-Hdlobacteriales
Methanosarclnales
Thermoplasmatales
\ Archaeoglobales
Progenota , Metanococcales 1. Um único cromossomo grande
(algumas também conté m plasmkJeos)
Thermococcales
1 Nenhum n úcleo ligado â membrana
Mitoc ô ndrias ou nenhuma membrana celular
Gram- positivas de conte údo GC baixo
\ Plancomycetales 3. Unicelulares
doroplastos
Chlamydiales 4 Genomas menores
Ns. Espiroquetas
Aquifkales Bactéria
X
x. Thermotogales
L ^Gram-positivas de conteúdo GC alto
' Deí nococcales
Cyanobacteria
Proteobacteria
 Capitulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução
que transporta e armazena informação gen ética é o
ácido desoxirr —
íbonucleico ( DNA ) em todos os orga -
nismos. Alguns ví rus usam o ácido ribonucleico ( RNA )
como seu material hereditá rio, mas os vírus sào entida -
des biológicas nào celulares que precisam invadir cé-
lulas hospedeiras para se reproduzir. O DNA tem uma
-
estrutura em fita dupla, descrita como dupla hélice do
DNA ou DNA duplex, consistindo em duas fitas unidas
de acordo com regras bioquímicas espec íficas.
Os domínios Eukarya, Bactéria e Archaea compar
tilham mecanismos gerais de replica çâo do DNA, o
processo que duplica com precisã o o DNA duplex antes
da divisão celular, e também compartilham mecanismos
gerais de expressão genica , os processos que expressam
a informação gen ética no genoma. Todos os organis
mos expressam sua informação genética por meio da
transcrição, um processo em que uma fita de DNA é
usada para dirigir a síntese de uma ú nica fita de RNA.
A transcrição produz vá rias formas de RNA, incluindo
o RNA mensageiro ( RNAm ) , que em todos os organis-
mos se submete à tradução para produzir proteínas em
estruturas de nucleoprote í na chamadas ribossomos.
Como a disciplina Biologia se dedicou ao exame de
todos os aspectos da hereditariedade e da variabilidade
entre as gerações e ao longo do tempo da evolução, a
genética é fundamental para a biologia moderna. A ge-
nética moderna possui três ramos principais. A trans-
missão genética, também conhecida como genética
mendeliana , é o estudo da transmissão dos traços e ca - britâ nico de 30 e poucos anos, começaram a trabalhar
racterísticas em gerações sucessivas. A genética evolu -
tiva estuda as origens da genética e as relações genéticas
entre os organismos e examina a evolução de genes e ge-
nomas. A genética molecular estuda a heran ça e varia - de 1953 que chocou o mundo científico.
bilidade dos ácidos nucleicos e proteínas e tenta conectá -
los à variabilidade herdada e à evolução nos organismos.
Esses ramos da genética nào são r ígidos. H á uma cons-
tante intercomunicação entre esses ramos, sendo raro
encontrar um geneticista hoje que nào use abordagens
analíticas de todos os trés. De modo similar, não só pela
maioria dos cientistas biológicos, em maior ou menor
grau, assim como pelos geneticistas, mas muitos dos m é-
todos e técnicas de experimentação e análise genética sào
compartilhados por todos os dentistas biológicos. Afinal,
a análise genética interpreta a linguagem comum da vida
integrando a informação de todos os trés ramos.
1.2 A estrutura do DNA sugere um
mecanismo para a replica çâo
Em seu cerne, a transmissão hereditária é o processo
de dispersão genética dos pais para a prole. Nos orga - buições importantes para a descoberta da estrutura do
nismos que se reproduzem sexualmente, esse processo é
obtido pela criação de gametas masculinos (espermato -
zóides ou pólen ) e gametas femininos (óvulos), seguido
pela união dos gametas para formar um óvulo fertilizado
( embri ão) que se desenvolve em um organismo. O DNA
é a molécula hereditária nos gametas. De modo similar ,
nas células somáticas (corporais) de plantas e animais e
5
nos organismos que se reproduzem por processos asse
xuados, o DNA é a molécula hereditária que assegura
que as gerações sucessivas das células sejam idênticas.
-
Experimentos e pesquisas sobre células, ocorridos ao
longo de 75 anos, do final das anos 1800 até meados dos
anos 1900, culminaram na identificação do DNA como
material hereditário ( ver Seção 7.1). A identificação do
DNA foi de importância monumental para biólogos e
bioqu í micos e também foi a base das novas abordagens
- moleculares na pesquisa de ciências biológicas. Com a
identificação do DNA, eles perceberam que a compre-
ensão da estrutura molecular do DNA era essencial para
duas questões fundamentais: ( 1) como o DNA podia por-
tar o conjunto diverso de informação genética presente
- nas vá rios genomas de animais e plantas e (2) como a
molécula se replicava. Nesta seçã o, introduzimos con-
ceitos básicas da estrutura e da replicaçâo do DNA , com
detalhes moleculares da replicaçâo do DNA fornecidos
mais adiante neste livro ( Capítulo 7).
A dupla-hélice do DNA
O impacto imediato da identificação do DNA como
material hereditário foi estimular muitos biólogos a vol
tarem sua atenção para descobrir a estrutura do DNA.
-
No início dos anos 1950, James Watson, norte ameri - -
cano de 20 e poucos anos que havia concluído recen
temente seu doutorado, e Francis Crick, bioqu ímico
-
juntos na Universidade de Cambridge, na Inglaterra,
para solucionar o enigma da estrutura do DNA. Sua co-
laboraçã o, hoje lendá ria , culminou em uma publicação
O ensaio de Watson e Crick descrevia precisamente
a estrutura molecular do DNA como uma dupla - hélice
composta de duas fitas de DNA , com uma espinha dor-
sal invariante de a çúcar- fosfato no lado de fora e bases
—
de nudeotídeo adenina, timina, guanina e dtosina
dispostas em pares complementares e orientadas para o
—
centro da molécula . Essa foi uma descoberta de enorme
importâ ncia que formou uma pedra angular da biologia
moderna. Com a estrutura do DNA em mã os, o “ gene"
não era mais apenas uma entidade conceituai. Em vez
disso, tinha uma forma í f sica que podia ser quantificada
e sequenciada; um gene podia ser comparado com ou -
tros genes em seu genoma e com genes nos genomas de
outras espécies.
A descrição da estrutura do DNA feita por Watson
e Crick não foi produto exdusivamente de seu trabalho.
Na verdade, ao contrário de outros que deram contri -
DNA, Watson e Crick não estavam envolvidos produti -
vamente na pesquisa de laborató rio. Fora seus sal á rios,
eles tinham muito pouco apoio financeiro disponível
para fazer pesquisas. Em vez de pesquisa laboratorial,
Watson e Crick colocaram seus esforços na construção
de um modelo do DNA, baseando suas interpretações
nos dados experimentais reunidos por outros.
6 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) ( b) fitas trançadas uma em volta da outra, formando uma

3?
Figura 1.4 Evidência da estrutura do DNA na difra ção
.
dos raios X ( a ) Esse padrão em forma de X é coerente com
a difração dos feixes de ralos X por uma molécula helicoidal
composta de duas fitas, ( b ) Rosalind Franklin obteve esse
resultado da difração dos raios X.
Rosalind Franklin, biofísica que trabalhava com
Maurice Wilkins no King's College de Londres, foi uma
das principais fontes de informaçã o utilizadas por Wat -
son e Crick. Franklin usava uma forma inicial de gera -
ção de imagens por difração de raios X para examinar
a estrutura cristalina do DNA. No método de Franklin,
os raios X que passam por preparações cristalinas de
DNA são difratados quando encontram os á tomos nos
cristais. Os raios X difratados são registrados na pelí
cula de raios X e a estrutura cristalina é interpretada a
partir do padrão visual produzido pelos raios X ( Figura
1.4 ). A maLs famosa fotografia por difração de raios X
de Franklin mostra claramente ( para um olho bem
treinado) que o DNA é duplo, consistindo em duas
dupla - hélice.
Watson e Crick combinaram os dados da difração
dos raios X de Franklin com informações publicadas
.
alguns anos antes por Erwin Chargaff que descobriu
que no DNA da maioria dos organismos as porcenta -
gens de adenina e timina são aproximadamente iguais
e que as porcentagens de citosina e guanina também
são iguais (Tabela 1.1 ). Conhecida como regra de
Chargaff , essa informação ajudou Watson e Crick
a formularem a hipótese de que os nucleotídeos do
DNA sâ o dispostos em pares de bases complemen -
tares. A adenina, em uma fita da dupla - hélice, faz par
apenas com a timina 11a outra fita do DNA, e a citosina
forma par apenas com a guanina , compondo o outro
par de bases. Com esses dados, seu próprio conheci -
mento de bioquímica e sua an álise dos modelos incor -
retos da estrutura do DNA , Watson e Crick criaram
um modelo de mesa do DNA usando materiais espa -
lhados por seu laboratório de pesquisa praticamente
—
inativo arame, estanho, fita e papel, sustentados por
suportes e grampos ( Figura 1 . S ).
Nucleotídeos do DNA
-
Cada fita da dupla hélice é composta de nucleo-
-
tideos de DNA que possuem très componentes prin
cipais: um açúcar desoxirribose com cinco carbonos,
-
um grupo fosfato e uma de quatro bases de nucleot í-
deos contendo nitrogé nio, designadas adenina ( Á ),
guanina ( G ), timina ( T ) e citosina ( C) ( Figura 1.6 ).
Os nucleotídeos que formam uma fita são interligados
por uma ligação fosfodiéster covalente entre o grupo

Tabela 1.1 Composição das bases dos nucleot ídeos de vá rios genomas

Gervoma de
origem Porcentagens das bases de nucleotídeos Proporções
Adenina Guanina Citosina Timina
(A) (G) (c ) (T) G+ C G/c
Bactérias
E. coii (B) 233 26,8 26, 3 23,1 53.1 L02
Leveduras
S. cerevisae 31,3 18,7 17.1 32.9 35.8 1,09
Fungos
.
N crassa 23,0 27,1 26,6 23,3 53.7 1,02
Invertebrados
C.elegans 31,2 19,3 20.5 29,1 39,8 0,94
D. melanogaster 27,3 22,5 22.5 27,6 45.0 1,00
Plantas
A.thaliana 29.1 20,5 20.7 29.7 41.2 0,99
Vertebrados
M. muscu /us 29,2 21,7 19.7 29,4 41,4 1,10
.
H sapíens 30,6 19.7 19.8 30.3 39.5 0,99
 Capitulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução 7

mento de bases complementares entre as fitas une

Figura 1.5 James Watson (ã esquerda ) e Francis Crick
( à direita ) em 1953 com seu modelo de DMA feito de
papelão e arame.
5'- fo$fato de um nucleot ídeo e o grupo 3'- h í droxila
( OH ) do nucleotídeo adjacente. Essa ligação propor
ciona à fita uma espinha dorsal de açúcar - fosfato; as
bases dos nucleotídeos se projetam para fora da espi
nha dorsal.
Os nucleot ídeos podem ocorrer em qualquer
ordem ao longo de uma fita da molécula, mas o parea -
um A em uma fita com um T na fita complementar
e um G em uma fita com um C na outra. O pareamento
de bases complementares é o fundamento da regra de
Chargaff c produz porcentagens iguais de A c T c de
C e G nas moléculas de dupla fita do DNA. As pontes
de hidrogénio , ligações n ào covalentes que consistem
em atrações eletrost á ticas fracas, formam se entre os-
pares de base complementares para unir as duas fitas
do DNA em uma dupla - hélice. Cada fita do DNA pos-
sui uma extremidade 5' e uma 3’. Essas designações se
referem ao grupo fosfato (5') e ao grupo hidroxila (3')
nas extremidades de cada fita do DNA , estabelecendo
a polaridade da fita , isto é, a orientação 5’ para 3’ de
cada fita. As fitas complementares do DNA são anti
paralelas, o que significa que as polaridades das fitas
-
complementares seguem em sentidos opostos uma
fita é orientada de 5' para 3' e a fita complementar é
—
orientada de 3' para 5'.
Se você é como muitos alunos de biologia , prova -
velmente se perguntou, de tempos em tempos, com o
que o DNA realmente se parece, tanto no nível ma
croscó pico quanto no nível microscó pico. Até mesmo
-
os melhores microscópios atuais têm dificuldade para
capturar imagens em alta resolução do DNA, embora
- as técnicas assistidas por computador para analisar a
estrutura molecular possam produzir uma interpreta -
- ção de sua aparê ncia microscópica. No entanto, você
n à o precisa de instrumentos sofisticados para produ
zir uma amostra de DNA que você pode segurar em
-
sua mão. A Observa ção Experimental 1.1 apresenta

3
Pares de base
,complementares _.
5 /
Pares de base Espinha dorsal de
Fitai
complementares a çúcar-fosfato
Espinha dorsal de A
^
açú car -fosfato

Açú car
G
Fita 2 Ligação
fosfodiéster
Fosfato
Grupo 5' fosfato a -
Bases de nucleotídeo
Guanina
ctetn . I
T
5'
3’

Grupo
3’ hidroxila
Sítio da Açú cares Pontes de
Hga çâo

-
fosfodiéster
desoxirribose hidrogénio ‘v J

Xí~ k 4A ^ )
T A Figura 1.6 Composição e estrutura do
DNA. Os nudeotideos do DNA contém o açúcar
desoxirribose, um grupo fosfato e uma base de
nucleot ídeo ( A, T, G ou C). As ligações fosfodiéster
5' fosfato •
Tlmina
.. ,
Adenina
"
T
| // MÁ unem os nucleot ídeos adjacentes em cada fita
* T e as pontes de hidrogénio unem nucleot ídeos
complementares das fitas que tém orientação
5* 3*
antiparalela.
8 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Observa çã o Experimental 1.1
Isolamento do DNA de bancada: tente isso em casa!
Com toda a abundâ ncia do DNA nas células, sua estrutura mo-
lecular é pequena demais para ser vista sem o auxílio dos mi-
croscópios eletró nicos mais poderosos. No entanto, isso não
significa que o DNA continua invis ível a olho nu. A chave para
enxergá-lo é simplesmente uma questão de volume. Se for
—
reunida uma quantidade suficiente de DNA, ele pode ser visto
é claro que náo em seus detalhes moleculares. Usando
uma fonte rica em DNA (como cebolas, que estão dispon íveis
o ano inteiro, ou morangos, cujos n úcleos cont êm oito cópias
de cada cromossomo) e alguns itens domésticos familiares,
você pode coletar uma amostra visível de DNA em sua própria
casa, em aproximadamente 30 minutos.
INGREDIENTES
1 cebola pequena sem casca (aproximadamente 1 x ícara) ou 1
xícara de morangos sem as folhas
1 a 2 xícaras de á gua com 1 colher ( chá ) de sal por xícara
2 colheres (sopa ) de detergente l íquido
1 colher (sopa ) de amaciante de carne (contendo "papa ína'
do mamão)
120 ml a 1 flO ml de á lcool isopropílico ( 95% é melhor, mas
70% é suficiente)
EQUIPAMENTO
Processador de alimentos ( para a cebola ) ou amassador ou es-
premedor de batatas ( para os morangos )
Tigela pequena
Jarro ou recipiente de vidro transparente com lados verticais
Gaze de algodão para criar uma camada em cima do recipiente
de vidro com alguns cent ímetros de sobra em toda a volta
1 elá stico para envolver o recipiente de vidro
1 pauzinho de comida japonesa ou qualquer objeto similar
(de madeira )
uma receita simples para o isolamento do DNA, que
você pode fazer em casa com compostos domésticos
comuns e seguros.
Observa çã o gen é tica Cada fita do DNA em uma du
pla -hé llce tem uma extremidade 5' e uma extremidade 3'.
As fltas consistem em nucleot ídeos presos por ligações fos-
fodiéster covalentes. As pontes de hidrog é nio entre as fitas
exigem o pareamento de bases de nucleotideo complemen-
tares, no qual A forma par com T e C forma par com G. As
fltas complementares de uma dupla - hélice são antiparalelas,
de modo que a extremidade 5' de uma encara a extremidade
3' da outra.
A An á lise Genética 1.1 guia vocé através de um
problema que testa sua compreensão da complemen
taçào dos pares de base e da polaridade das fitas com
plementares. Você vai encontrar muitos problemas de
ORIENTA ÇÕ ES
1. Descasque a cebola e pique no processador de alimentos.
Altemativamente, amasse os morangos na tigela.
-
2, Acrescente 1 a 2 xícaras de água à cebola e processe a até
virar uma pasta fina. Derrame a pasta em uma tigela pequena.
Se estiver usando morangos em vez de cebolas, acrescente
uma xícara de água e amasse até virar uma pasta fina.
3. Acrescente 2 colheres (sopa ) de detergente l íquido à pasta
e mexa delicadamente. Tome cuidado para o detergente
não fazer espuma. Deixe a mistura descansar por alguns
minutos para que o detergente quebre as membranas ce -
lulares e nucleares.
4. Acrescente uma colher (sopa) de amaciante de carne á mis
tura e mexa delicadamente. Mais uma vez, evite a espuma do
-
detergente. A papaina no amaciante vai digerir grande parte
da proteína liberada pelas células rompidas e também as pro
teínas presas ao DNA. Deixe a mistura descansar por alguns
minutos para dar tempo á papa ína para trabalhar.
5. Coloque 2 a 3 camadas de gaze de algodáo soltas sobre
a abertura do recipiente de vidro, permitindo que a gaze
forme uma pequena 'tigela" dentro da abertura. Use o
elástico para prender a gaze no lugar. Derrame a mistura
- -
pastosa na gaze, escavando para fora os resíduos da cebola
ou dos morangos quando encher a 'tigela de gaze. Apro-
xlmadamente 240 ml a 350 ml de suco° serão coletados no
fundo do recipiente. Descarte a gaze e seu conteúdo.
6 . Derrame á lcool no suco e mexa muito pouco. Deixe a mis-
tura de suco descansar por 5 a 10 minutos. O suco se depo-
sita no fundo da mistura, o á lcool vai para a parte de cima e
a grande massa de material macio flutuante é o DNA.
7. Quando o á lcool estiver completamente separado do suco,
você pode "enrolar' o DNA em um pauzinho, torcendo o -
lentamente no material macio flutuante.
aná lise gen ética em cada capitulo do livro. Cada um
deles apresenta a você um problema e o conduz até
a solução seguindo a estratégia de resolução de pro-
- -
blemas “ Avaliar Deduzir Solucionar". A an álise gen é
tica é uma ferramenta de aprendizagem ú nica, con -
-
- cebida para ajudá - lo a dominar a tarefa mais dif ícil
para os alunos de genética
problemas.
—
aprender a solucionar
Replicaçã o do DNA
A identificação da estrutura de dupla - hélice do
DNA foi um marco da biologia do século XX, que es-
tabeleceu um ponto de partida para um novo conjunto
de questões a respeito da hereditariedade. A primeira
dessas questões diz respeito a como o DNA se replica
- e como dirige a síntese proteica. Watson e Crick con -
- clu íram seu ensaio de 1953 com uma diretriz para fu
turas pesquisas sobre a questão da replicação do DNA.
-

AN ÁLISE GENÉTICA
Escreva a sequência e a polaridade da fita de DNA complementar à fita exibida abaixo
5 ' - ~ ACGGATCCTCCCTAGTGCGTAATTCG ... - 3'
Estrat é gias de solu çã o
Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por esse
problema e explique a natureza da res-
posta solicitada.
2. Identifique as informações críticas fome-
cidas no problema.
Deduzir
3. Analise a relação dos nucleotideos na se-
gunda fita com os da fita fornecida.
DK À: As fiUs u*n DNA óuptex s*o
DNA com -
.
unMtas por por tvs d* h <Jrog rio
paro d* b«t compJ*n> tn«ar v
DICA: As fltis dp
plementara sio antiparaleUv
4. Descreva a relação de polaridade das fitas
de DNA complementares.
Solucionar
5. Forneça a sequência e a polaridade da fita
de DNA complementar.
Para praticar mais, ver Problemas 11, 12 e 14
Eles escreveram: “ Não deixamos de observar que o pa -
reamento de bases específico que propusemos sugere
imediatamente um possível mecanismo de cópia para o
material gen ético.”
Na realidade, ficou evidente que cada fita do DNA
cont ém as informações necessá rias para gerar a fita
complementar do DNA através do pareamento de
bases complementares e que a replicaçáo do DNA pre -
cisa gerar dois DNAs duplex idênticos a partir do DNA
duplex original durante cada ciclo de replicaçáo. No
entanto, no momento em que Watson e Crick desco-
briram a estrutura do DNA, o mecanismo da replica -
çào n ão era conhecido. Foram necessários outros cinco
anos para que Matthew Meselson e Franklin Stahl, em
um experimento engenhoso e de concepção simples,
provassem que o DNA se replica por meio de um meca -
nismo semiconservador (Capítulo 7) . merases ordena que as fitas do DNA se alonguem apenas
Como você pode se lembrar de cursos anteriores,
a replicaçáo scmiconscrvativa exige a separação das
duas fitas complementares do DNA original e o uso
de cada uma delas como um modelo para a síntese de
uma nova fita complementar de DNA. O mecanismo é
chamado ‘ semiconservador " porque cada novo duplex
é composto de uma fita parental (que é conservada a
Capitulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução 9
.
Etapas da solu çã o
1. Esse problema diz respeito ã complementaridade e à polaridade das fitas
do DNA em uma dupla-hélice. O problema pede para você fornecer a
sequência de nucleotideos e a polaridade de uma fita complementar.
2. O problema fornece a sequência de nucleotideos e a polaridade de uma
fita de um DNA duplex.
3. O pareamento de bases complementares do DNA une a adenina com a ti-
mina e a guanina com a crtosina para formar um DNA duplex.
*
*
4. A segunda fita desse DNA duplex será orientada com sua extremidade 3'
para a esquerda e sua extremidade 5' para a direita.
5. Pelas regras do pareamento de bases complementares e de acordo com a
orientação antiparalela, a segunda fita do DNA é
-
3 ' TG Ç CTAGGAGGGATCACGCATTAAGC - 5'
.
partir do DNA original ) e uma fita - ftlha recém -sinteti-
zada ( Figura 1.7).
A replicaçáo do DNA começa com as fitas paren-
tais separando-se uma da outra ao romperem as pontes
de hidrogé nio que as unem. (Esse processo é muito pa-
recido com o que acontece quando um zí per se solta.)
As DNA polimerases são as enzimas ativas na replica
çáo do DNA. Essas enzimas usam os nucleotideos nas
-
fitas de DNA parentais como um modelo para dirigir a
montagem de novos nucleotideos para a formaçã o das
fitas-filhas. A DNA pol í merase identifica primeiro o nu -
cleot ídeo complementar ao nudeotideo da fita parental;
então a enzima catalisa a formação de uma liga ção fos -
fodiéster para unir o novo nudeotideo ao nudeotideo
-
anterior na fita filha nascente.
A bioquímica dos ácidos nucleioos e das DNA poli-
na direção 5' para 3’. Em outras palavras, os nucleotideos
são adicionados exclusivamente à extremidade 3' da fita
nascente, levando ao crescimento 5’ para 3’. Assim como
o DNA duplex parental, cada novo DNA duplex contém
fitas antiparalelas. Cada combinação de fita parental com
fita -filha forma uma nova dupla - hélice de DNA, que é
uma réplica exata do duplex parental original.
10 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Fita Frta 1.3 A transcrição e a tradução

parental 1 parental 2
5'
expressam os genes
3'
O dogma central da biologia é um conceito que
descreve o fluxo da informação hereditá ria e resume
as relações críticas entre DNA, RNA e proteí na; o
papel funcional que o DNA desempenha em manter,
dirigir e regular a expressã o da informação genética;
e os papéis desempenhados pelo RNA e pelas proteí-
nas na função gê nica . Em 1956, Francis Crick propôs
a versão original do dogma central, exibida na Figura
1.8a, para encapsular o papel que o DNA desempenha
em dirigir a transcrição do RNA e, por sua vez, o papel
T que o RNA mensageiro desempenha na traduçã o das
Nucleotídeos proteínas. Conforme Crick contou anos mais tarde, ele
adicionados escreveu esse conceito como “ DNA RNA pro-
Fita teína " ( l ê-se " DNA para RNA para proteí na '') em um
parental 1
pedaço de papel e colou com fita na parede acima de
sua mesa para se lembrar da direção da transferê ncia
da informação durante a expressão das informações
Fita gen éticas. A ideia mais importante que ela transmite
-« ha 2
é que o DNA n ão codifica diretamente para proteína.
Flta - Em vez disso, o DNA compõe o genoma de um orga -
- fí ttldl nismo e é um repositó rio permanente de informações
gen éticas em cada célula que dirige a expressão gênica
DNA pela transcrição do DNA para RNA e pela tradução do
poiimerase RNAm para proteí nas.
Ao longo de décadas desde que Crick introduziu o
dogma central, biólogos desenvolveram uma compreen -
são clara do papel do DNA em manter e expressar infor-
mações gen éticas. A maioria dos detalhes do processo
de dois estágios, pelo qual as informações genéticas nas

—
Niiriõõtidõõs
-filha 2 parental 2 adicionados sequências de DNA dos genes são transcritas para RNA
5' 3' e depois traduzidas para proteína, é conhecida. Capítu
los posteriores discutem a transcrição (Capítulo 8) e a
-
tradução (Capítulo 9). Porém, hoje os biólogos também
sabem que várias formas de RNA são encontradas nas
Figura 1.7 Replica ção semkonservativa do DNA Cada . células e que essas moléculas de RNA são transcritas e
fita de DNA parental serve como modelo para a síntese de desempenham vá rios papéis nas células, mas somente
sua flta -filha. A DNA pollmerase sintetiza fitas-filhas um o RNAm é traduzido. Duas categorias importantes de
nucleotideo de cada vez. RNA que não são traduzidas, mas desempenham papéis
críticos na tradução, são o RNA ribossómico e o RNA

Figura 1.8 Dogma central (a )

da biologia , ( a ) Dogma central íf epltcaçáo
da biologia de Francis Crick. Transcrição Trodução
( b) Dogma central da biologia RNA Proteí na
atualizado.

( b)
RepJteoçôo
Transcrição Tradução
mensageiro IRNAm ) Proteí na
•y - Rr A ribossómico < RNAr)) t
Para o ribossomo
S
\
\^ » R transportador
micro
IRNAt
( RNAmi )
outros RNA
retroviral
Transcrição revtrsa
 Cap í tulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabi lidade e evolu ção 11

Fita A parceira complementar da fita molde do DNA é

-
DNA
S' l

- -
£ 3' codificadora
nir.wfMiiiM iiTmt iítíMi£ 5' mo
Fita
de
conhecida como fita codificadora . Como a fita codifi
cadora é complementar e antiparalela à fita molde do
—
DNA , ela tem a mesma polaridade 5' > 3' do transcrito
RNAm 5|
' c* de RNA sintetizado a partir da fita molde; alem disso,
o transcrito de RNA e a fita codificadora de DNA sâo
A nta codticadcfa do DMA e o transato de idênticos quanto à sequência de nucleotídeos, exceto
RNAm tém a mesma ootandade e sequência, pelo surgimento de U no lugar de T.
subiWuindo U no RNAm porT no DNA.
O RNA é composto de quatro nucleotídeos quimi-
Figura 1.9 Correspondência entre a fita molde e a fita camente muito similares ao DNA. Os nucleotídeos do
codificadora do RNA e do DNA . RNA consistem em um açúcar ( ribose, nesse caso), um
grupo fosfato e uma de quatro bases nitrogenadas. Três
transportador. O RNA ribossómico ( RNAr ) forma das bases de nucleotídeos do RNA sâo adenina, citosina e
parte dos ribossomos, as estruturas celulares abundantes
onde ocorTe a montagem das proteínas. O RNA trans -
portador ( RNAt ) transporta aminoácidos, os compo-
nentes fundamentais das proteínas, para o>s ribossomos.
guanina, as mesmas encontradas no DNA. A quarta base

Um dogma central da biologia atualizado é exibido na
Figura l.Ab. Além do RNAm, RNAr e RNAt, a figura
identifica a transcri ção reversa , uma forma de fluxo de
informações que sintetiza o DNA a partir de um modelo
de RNA nos vírus que contêm RNA ( retrovírus) usando
uma enzima chamada transcriptase reversa. Ela també m
identifica o RNAmicro ( RNAmi ), o foco de uma á rea
rapidamente emergente de investigação do RNA que
estuda o papel dessas pequenas moléculas de RNA na
regulação da expressão génica em plantas e animais ( ver
Capítulo 15).
Transcriçã o
A transcrição usa uma fita do DNA que compõe
um gene para dirigir a sí ntese de um transcrito de RNA
de fita única. A fita do DNA a partir da qual o trans-
crito é sintetizado é chamada fita molde. A RNA po-
limerase, enzima sintetizadora de RNA, pareia os nu
cleot ídeos da fita molde com os nucleotídeos do RNA
complementar para sintetizar o novo transcrito na di
reção 5’ para 3'; o transcrito é antiparalelo à fita molde
do DNA ( Figura 1.9).
— .
do RNA é a uracila (U) No pareamento de bases DNA
RNA e RNA RNA, C pareia com G e A pareia com U.
A transcrição que produz o RNA é um processo con-
—
trolado nas células. A RNA polimerase é a enzima res-
ponsá vel por sintetizar os transcritos de RNA- Para co-
meçar a transcrição, a RNA polimerase e outras proteínas
transcricionalmente atiras precisam localizar um gene e
obter acesso à fita molde do DNA. Depois de transcrita a
sequência de codificação do gene, a RNA polimerase pre
-
cisa parar a transcrição e desconectar se do DNA.
Os promotores são o tipo mais comum de sequê n -
cias de DNA reconhecidas pela RNA polimerase como
indicadoras da presença de um gene nas proximidades.
Os promotores (ou sequê ncias promotoras) ajudam a
regular a inicia ção da transcrição controlando o acesso
da RNA polimerase ao DNA. Os promotores n ão são
transcritos. Em vez disso, a transcrição de um gene co -
meça perto do promotor no início da transcri ção. A
transcrição termina na sequência de terminação, uma
sequência do DNA que facilita a cessa ção da transcri-
ção ( Figura 1 . i Oa ). Nas bacté rias, os genes produtores de
- proteí na sâ o transcritos para RNAm, que é rapidamente
traduzido para produzir proteína. Os genes eucarióticos
- têm uma estrutura diferente da encontrada nos genes
bacterianos. Eles são subdivididos em éxons , que con -
tém a informação de codificação que será usada durante

(a)
Sequência de Figura 1.10 Estrutura dos genes nas
Promotor Sequência de codificação terminação bactérií í cariotos. As sequ ências

DNA
s' 7/n 1f 3' Fita codificadora de codifica ção contêm informações a
3' 7/ 1 jf 5' Fita molde ser transcritas para o RNA. As sequências
Inicio da promotoras regulam a Iniciação da
Transcrição Os promotores regulam
transcrição transcri ção e as sequências de terminação
Região de a transa ção de um ou
termina ção mais genes bacterianos
controlam a cessaçã o da transcrição.
(a) Os genes bacterianos contém uma
ú nica sequência de codificação que
(b ) transporta as informações do gene.
Éxon 1 Éxon 2 Exon 3 ( b) A sequência de codifica ção dos genes
Promotor .
eucarióticos é dividida em éxons que são
DNA
5' 7n ~
3' Fita codificadora separados por introns.
3' 7/ 1 Jf 5' Fita molde
In ício da í ntron A Intron B Os genes eucar óticos
transcrição
- Transcnção cortêm introns e éxons
que são transcritos.
Região de
termina ção
12 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

a tradução, e introns, que separam os éxons e são re

movidos do transcrito antes da tradução ( Figura 1.10b).
- (a )
DNA
A remoção dos introns do RNAm eucariótico e outras 7/
Fita codificadora 5' ATG AC à CTG GGT ACG CTT TÃT? / 3'
"

modificações antes da tradução ocorrem no n úcleo (ver 7/

Fita molde 3' TAC TGT GAC CCA TGC 6 AA ATT >
/fs
Capítulo 8). Tripleto de DNA: 1 2 3 4 5 6 7

Observa ção gené tica As moléculas de RNA são trans-

RNAm 5' f, £ 3'
Códon: 1 2 3 4 5 6 7
critas da fita ú nica dos genes e são sintetizadas pela enzima
Polipeplidio HV ItttltNHlVfWJNNTW
RNA polimerase, usando uma fita de DNA como molde.
Sequência de aminoácidos: 1 2 3 4 5 6 PARADA
Cada RNA mensageiro dos genes bacterianos transporta uma
ú nica sequência de codificação, mas os RNAm eucarióticos
contém sequências de Introns e éxons e exigem processa -
mento antes da tradu ção.

Aminoá cido

Tradução Polipeplidio
Ponte pept ídka
As sequências dos genes do DNA sã o transcri
tas em RNAm e este é traduzido em prote í nas. A
-
tradu ção converte a mensagem genética transportada 3'
5'
pelos nucleotídeos do RNAm em sequê ncias de ami - Anticódon
.
noácidos usando o código genético Os aminoácidos
sã o unidos uns aos outros por uma ponte covalente
chamada ponte peptídica. A fita de aminoácidos
resultante é um polipeptídio, que após ser dobrado
compõe toda ou parte de uma proteína. Direção da
A tradução do RNAm ocorre no ribossomo, tradução
onde conjuntos de três nucleot ídeos consecutivos, com
cada conjunto chamado códon, especificam a sequê ncia
de aminoácidos que compõem o polipept ídio. Cada Códon /
de parada
^
códon do RNAm é um tripleto de nucleotídeos de
RNA codificados por três nucleotídeos de DNA comple - Figura 1.11 Visã o geral da traduçã o, (a ) Os códons do
mentares na fita molde e que são identificados como tri - RNA mensageiro são complementares e antiparalelos aos
tripletos do DNA da fita molde , ( b) Os ribossomos iniciam a
pleto de DNA (Figura 1.11a ). A tradução começa com o
tradução do RNAm no códon de in ício e se movem ao longo
RNAm se conectando a um ribossomo de uma maneira
do RNAm na direção 3', acrescentando um novo aminoácido
que coloca o códon de início, o códon que especifica o ao polipeptí dio nascente pela leitura de cada códon. As
primeiro aminoá cido de um polipept ídio, no local ne- moléculas do RNA transportador transportam aminoácidos
cessário (Figura 1.11b). O códon de início na maioria das para os ribossomos, onde as sequ ências de anticódon do
vezes é o AUG, sendo o códon onde a tradução começa. RNAt interagem com as sequências de códon do RNAm.
A partir do códon de início, os ribossomos se movem na A tradu ção termina quando o ribossomo encontra um
—
direção 5' 3’ ao longo do RNAm para montar a cadeia
de aminoácidos, com cada conjunto sucessivo de três
códon de parada.

nucleotídeos do RNAm formando um códon.
Os aminoácidos são transportados para ribossomos
pelos RNAt Em cada códon, ocorre um pareamento de
bases complementares entre os nucleotídeos do códon
e uma sequência de três nucleotídeos do RNAt , cha
mada ant ícódon. Essa interação monta aminoácidos
na ordem ditada pela sequência do RNAm. As proteí
nas ribossó micas alimentam a progressão contí nua do
ribossomo ao longo do RNAm e catalisam a formação
das pontes pept ídicas na cadeia polipept ídica crescente
A tradu ção continua até o ribossomo encontrar um dos
três códons de parada , levando à cessação da traduçao.
O código gen é tico, através do qual os códons do
RNAm especificam os aminoácidos, foi decifrado por
uma série de experimentos que ocorreram durante o
início dos anos 1960. Os experimentos revelaram que o
código genético contém 64 códons; cada códon consiste
em três posições, cada uma delas preenchida por um
dos quatro nucleotídeos do RNA. Uma sé rie de códons
no RNAm especifica a sequência de aminoácidos em
- um polipeptídio. Um códon de RNAm é lido na direção
5' para 3': a primeira base do códon está em sua extre -
- midade 5', a terceira base está em sua extremidade 3’ e a
segunda base está no meio.
Como existem 64 códons ( 4 %) e apenas 20 tipos
. comuns de aminoácidos nas proteínas, o código gené-
tico é redundante: a maioria dos aminoácidos pode ser
especificada por dois ou mais códons diferentes. Para
—
—
dois aminoácidos metionina ( Met ou M ) e triptofano
(Trp ou W) há apenas um códon , mas para outros há
até seis. Um total de 61 dos 64 códons especificam ami
noácidos e os outros três são códons de parada. Os 64
-
 Cap í tulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabi lidade e evolução 13

Tabela 1.2 Código genético

Segunda posiçã o

uuu
UUC
} PHe ( F)
UCU 1
UCC
UAU
UAC
} Tyr ( Y)
UGU
UGC
} Cys (C)

UCA
- Ser (S)
- parada UGA - parada
UUA
UUG
} Leu ( L ) UCGJ
UAA
UAG - parada UGG - Trp (W )
o. CUUl CCUl CAU CGU 1
1 CUC CCC CAC
His ( H )
CGC
Leu ( L) Pro ( P) Arg ( R )
CUA CCA CGA Í
3L
CUG J CCG J
CAA
CAG
} Gin (QJ CGG J
2
2
1
Jf
ACUl
I AUUl
AUC “ II* ( I ) ACC
AAU
AAC
} Asn ( N )
AGU
AGC
} Ser (S)
è
c
£
AUA J ACA
- Thr (T)
AAA
AUG - Met ( M )
ACGJ AAG
} Ly* ( K )
AGA
AGG } Arg ( R )
K
I
UI

GUUl GCU 1 GAU GGU 1

GUC GCC GAC
] Aip ( D)
GGC
Gly (G )
Vai ( V ) Ala CA )
GUA GCA GGA
GAA
GUGJ GCGJ
GAG
} Glu ( E) GGGJ

códons sã o exibidos na Tabela 1.2 usando as abreviações
de trés letras e de uma letra para os aminoácidos apre
sentados na Tabela 1.3.
A Aná lise Genética 1.2 permite que você trabalhe
com a transcrição e a tradu ção da sequê ncia de DNA
avaliada na Análise Genética 1.1.
Observa çã o genética A tradução converte a informa-
ção genética contida nas sequências de RNAm em polipeptí-
dios usando um código genético triplice. A tradução começa
no códon de início; os aminoácidos sucessivos são ligados por
pontes peptidicas; e a tradução cessa no códon de parada.
1.4 A evolução tem uma base
molecular
à medida que os biólogos fazem um levantamento
.
das variedades de vida avaliam as semelhanças c
diferen ças genéticas entre as espécies e exploram a
relaçã o dos organismos modernos uns com os outros e
com seus ancestrais extintos, fica evidente que toda a
vida está conectada pelo DNA. R íchard Dawkins, bió-
logo e autor de vá rios livros sobre evolu çã o, observou
essa conexão molecular quando observava que a rida
"é um rio de DNA, fluindo e se ramificando através do
- tempo geológico". O " rio através do tempo" de Dawkins,
que conecta todos os organismos passados e presentes,
é o DNA . Esse DNA compartilhado é a base para identi-
ficar c estudar as relações entre os organismos c traçar a
histó ria de sua evolu ção.
A vida não é está tica e uniforme, é claro; ela evo-
lui à medida que o DNA diverge, através de alterações
adquiridas por mutação, em " ramos” distintos cuja bi
furcação metaf ó rica leva a novas espécies. A cita ção de
-
Dawkins sugere que, para a hereditariedade manter a
continuidade genética através das gerações e para a va -
riabilidade se desenvolver entre os organismos e origi -
nar novas espécies, os processos bioquímicos que repli-
cam o DNA e expressam a informação genética também
precisam ser universais. Partindo dessa perspectiva, a
universalidade do DNA como molécula hereditária da
rida e os processos compartilhados de replicação do
DNA e da expressão génica são coerentes com a ideia
de uma origem ú nica da rida que evoluiu para os mi-
lhões de espécies que hoje povoam a Terra e também as
incontáveis espécies que as precederam , mas hoje estão
extintas.
A vida na Terra surgiu provavelmente de uma ú nica
fonte, entre 3,5 e 4 bilhões de anos atrás. As formas de
rida fossilizadas mais antigas são organismos esféricos
14 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Tabela 1.3 Abrevia ções dos amlnoá cidos

Abreviação de Abrevia ção de

Aminoã cido três letras uma letra
Acido aspá rtico Asp D
Filamento
Ácido glutàmico Glu E composta
Alanina Ala A de células
Individuais
Arginina Arg R

Asparagina Asn N

Cisteí na Cys C
Fenilalanina Pbe F

Gliclna Gly G r ?tym

Glutamina Gin Q

Histidina His H
- 10
Isoleucina lie I
Leucina Leu L
Usina Lys K

Metionina Met M
Lo rv
,J/
Prolina Pro P
Serina Ser S
Tirosina Tyr Y F igu ra 1.12 Formas de vida ancestrais. Bacté rias
vivas do gê nero Lyngbya (à esquerda ) lembram os restos
Treonina Thr T fossilizados da Paleolyngbya (à direita ) da Formação Lakhanda
Triptofano Trp W
.
de 950 milhões de anos que fica na Sibéria.

Valina Vai V
e filamentares provenientes de formações rochosas no
Oeste da Austrália com 2,5 bilhões de anos. Alguns dos
primeiros fósseis têm uma aparência similar à das bac
té rias que existem hoje ( Figura 1.12). Essas primeiras
formas de vida originaram uma deslumbrante variedade
de espécies, a maioria extinta. No entanto, elas são an -
cestrais das espécies modernas que habitam cada nicho
ecológico concebível na Terra, do mais temperado ao
mais extremo.
Teoria da evolução de Darwin
Ao longo de milénios desde a origem da vida , in
contáveis milhões de espécies surgiram e desaparece-
ram. Essas mudanças ocorreram através da evolu ção,
a teoria de que todos os organismos estão relaciona
dos por uma ancestralidade comum e que se diversi -
ficaram ao longo do tempo, principalmente por meio
do processo de seleção natural. A noçã o contemporâ
nea de evolução foi proposta de maneira independente
por Charles Darwin e Alfred Wallace no final dos anos
1850. Esses dois autores basearam suas propostas em
observações em primeira mão da distribuição e diver
sidade da vida no globo. Cada autor descreveu taxas
-
de sobrevivência e reprodução mais elevadas de certas
formas de uma espécie em relação a formas alternativas
por meio do processo de seleção natural. Esta funciona
- no nível fenotí pico, mas se baseia na variabilidade gen é-
tica subjacente: como a seleçã o natural aumenta a fre-
quência de uma forma morfológica em relação a outra
na população, as frequê ncias dos alelos que controlam
cada forma também mudam. Ao longo de muitas gera
ções, as formas morfológicas que produzem mais prole
-
també m deixam mais cópias dos alelos que controlam o
fenótipo, criando uma mudança genética na população.
A teoria da evolu ção pela seleção natural de Char-
- les Darwin hoje é um fato científico plenamente esta-
belecido, incorporando três princí pios da genética po-
pulacional que eram óbvios para muitos naturalistas
- contemporâ neos de Darwin, mas que não foram reuni
dos em um modelo coerente até que ele articulasse sua
-
conexão na publicação A origem das espécies, de 1859.
- A união desses princí pios em uma teoria evolutiva feita
por Darwin surtiu um efeito revolucioná rio na biologia,
lan çando as bases da ciência biológica moderna. Eis os
princí pios da genética das populações de Darwin:
 Capí tulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução 15

AN ÁLISE GENÉTICA
Voltando à fita de DNA apresentada na Análise Genética 1.1 (reproduzida abaixo) e usando também
a sequência complementar determinada naquele problema, responda às questões a seguir.

-
3' - .ACGGATCCTCCCTAGTGCGTAATTCG _ - 5'
.
a Uma fita da sequência de DNA de dupla fita que você produziu na Análise Genética 1.1 é usada como molde para produzir
RNAm contendo cinco códons de aminoáciòo e um códon de parada. O RNAm é traduzido em um polipeptídio contendo cinco
.
aminoácidos, o primeiro dos quais é a metionina (Met), codificada pelo códon de início Identifique o segmento da fita molde
do DNA que contém as sequências que codificam o códon de inicio, o códon de parada e os aminoácidos.
.
b Escreva a sequência e a polaridade do transcrito de RNAm, especificando os códons dos cinco aminoácidos e o códon de
parada.
c Escreva a sequência de aminoácidos da proteína produzida pela tradução. Use os códigos de três letras e de uma letra na
sequência.

Estrat é gias de solu ção Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por esse problema .
1 Este problema diz respeito à identificação de um segmento de DNA
e explique a natureza da resposta solicitada . que codifica uma sequência de cinco aminoácidos em uma proteí na.
Além do segmento de codificação do DNA, a resposta exige a iden -
tificação do transcrito de RNAm correspondente e a sequência de
aminoácidos resultante.
.
2 Identifique as informações críticas fornecidas no .
2 A informação necessária é a sequência de dupla fita produzida
problema. como resposta para a Análise Genética 1.1,
Deduzir
.
3 Escreva a sequência de DNA de dupla fita e iden - 3. A sequência de DNA de dupla fita (a partir da Análise Genética 1.1) é
tifique os tripletos de DNA que poderiam ser um 5' - TGCCTAGGAGGGATCACGCATTAAGC - 3 '
códon de início. 3'- ACGGATCCTCCCTAGTGCGTAATTCG - 5'
DICA: 0 códon de Inklo ma>s comum no RNAm
O único tripleto de DNA que codifica um possível códon de parada
-
é 5' AOG - 3’ (metíonlnaX codHkado pelo trt- está destacado em negrito.
-
pleto 3'- TAC 5 ’ datitamokíe òoDNA .

.
4 Identifique os tripletos de DNA correspondentes .
4 Cinco tripletos de DNA possivelmente codificando códons de pa-
aos possíveis códons de parada. rada são exibidos abaixo em negrito.
-
5' TGCCTAGGACGGATCACGCATTAAGC 3' -
. - . UAA UA6 e l»GA
DICA: HA tif códons de paraca
*
codiflcados pHo tnplrta ATT ATT e ATT, rrvprcttvamrritc 3' * ACGGATCCTCCCTAGTGCGTAATTCG 5' -
Solucionar Resposta A
.
S Faça uma varredura nas duas fitas de DNA pro- .
5 O único códon de início possível está na fita superior à direita (3'- TAC
curando por uma sequência 3'-TAC - 5' (códon -
50* fazendo que essa fita superior seja a fita molde. O tripleto que co-
de início) que seja seguida por 12 nudeotídeos .
difica o códon de parada está à esquerda (3'— ATC - 50 Quatro códons
(quatro códons) codificando aminoácidos e de - separam o inicio e a parada e estão destacados a seguir.
pois um códon de parada. 5' - TGCCTAGGAGGGATCACGCATTAAGC - 3'
£>I( A ; O RNA mensageiro é
3' - ACGGATCCTCCCTAGTGCGTAATTCG - 5'
complementar e anfroaralelo d
fra molde do DNA K Resposta B
.
6 Determine a sequência e a polaridade do RNAm. .
6 A sequência do RNAm é

.
-
5 ' AUG CGU GAU CCC UCC UAG 3' -
7 Determine a sequência de aminoácidos do poli - Resposta C
peptídio codificada por esse RNAm . .
7 O polipeptídio codificado pelo RNAm é Met -Tyr- Asp-Asn- Ala ou
M-Y-D-N A.
DICA: U t o cóc 90 genético para traduar
o RNAm. *

Para praticar mais, ver Problemas 15, 16 e 19 .

16 Análise gen é tica: uma abordagem integrada
1. Existe variabilidade entre cada membro das popu
lações com relação à expressão dos traços.
2. A transmissão hereditária permite que a variabilidade
nos traços seja passada de uma geração para outra.
3. Certas formas variantes de traços conferem aos
indivíduos portadores uma taxa de sobrevivência
e reprodução mais elevada em determinadas con
dições ambientais . Esses organismos deixam mais
prole e aumentam a frequê ncia da forma variante
na população.
Darwin apresentou o processo geral por meio do
qual as espécies evoluíram, mas nunca compreendeu os
mecanismos subjacentes da hereditariedade que permiti
ram a ocorrência desse processo. Hoje, mais de 150 anos
após Darwin introduzir sua proposta revolucionária, os
biólogos compreendem plenamente o papel da genética
na evolução. Com relação aos princí pios da evolu ção de
Darwin, a biologia estabeleceu estes achados:
1. A variabilidade fenotipica dos traços expressos re
flete a variabilidade genética herdada . As diferen -
ças na sequê ncia do DNA ( variabilidade alélica)
devem ser a causa da variabilidade fenotipica para
que a evolução ocorra.
2. A transmissão hereditária da variabilidade fenotí
pica requer que a prole herde e expresse os alelos
que foram responsáveis pela variabilidade nos or-
ganismos parentais.
3. Os organismos que portam os alelos favorecidos
pela seleção natural tê m uma vantagem reprodu
tiva em relação aos organismos que n ão portam
alelos favorecidos. O primeiro grupo, portanto,
deixa mais cópias dos seus alelos na geração se
guinte, fazendo que a população evolua por meio
de uma mudan ça na frequência alélica.
Em outras palavras, a mudança fenotipica progres-
siva em uma população é acompanhada por alterações
genéticas.
A evolução pela seleção natural implica que uma
forma se reproduz em maior quantidade do que outras
em uma população pelo fato de ser mais bem adaptada
às condições que conduzem à seleção natural. Esse pro-
cesso, conhecido como evolução adaptativa, é comum ;
mas muitos exemplos da conhecida evolu ção não adap-
tativa , a evolu ção das caracter ísticas que são equivalen
tes a outras formas na população, em termos reproduti
vos, també m sã o observados. Os traços não adaptativos
são neutros quanto à seleção natural, não conferindo
uma vantagem seletiva ou uma desvantagem seletiva a
seu portador. Os processos da evolução que não sejam
os da seleção natural ajudam a explicar a evolução da
variabilidade não adaptativa.
Quatro processos evolutivos
A genética evolutiva estuda e compara as mudanças
genéticas nas populações e espécies ao longo do tempo.
Suas bases foram estabelecidas nas quatro primeiras dé
- cadas do século XX por vá rios biólogos evolutivos no
táveis e inúmeros indivíduos menos conhecidos. Curio-
-
samente, esse trabalho aconteceu antes de o DNA ter
sido identificado como material hereditá rio e antes de a
estrutura química dos genes ter sido definida e compre-
endida. Ronald FLsher, Sewall Wright, J. B. S. Haldane e
- muitos outros criaram modelos matemá ticos e estatísti
cos da distribuição e evolução dos genes nas populações
-
e espécies. Esse trabalho produziu hipóteses evolutivas
que foram testadas e verificadas incontáveis vezes em
populações laboratoriais e naturais.
Através desse corpo de trabalho maciço, a biologia
evolutiva confirmou o modelo da evolução das espécies
- pela seleção natural de Darwin e expandiu a descrição
dos processas evolutivos para levar em conta a evolu
ção dos genes individuais e dos traços não adaptativos.
-
Os biólogos identificam quatro processos da evolução.
Cada um leva a mudanças na frequência de alelos em
uma população ao longo do lempo, uma característica
- que é a marca registrada da mudan ça evolutiva. Os qua -
tro processos evolutivos são:
1. Seleção natural
— as taxas reprodutivas diferen
ciais dos membros de uma espécie em razão da
posse de diferentes formas de uma caracter ística
-
- adaptável. Os membros da população com a forma
mais bem adaptada são mais bem -sucedidos na
reprodução e deixam mais prole do que os que
possuem formas menos adaptáveis. Ao longo do
tempo, a frequência da forma mais bem adaptada e
- dos alelos que a produzem aumenta na população.
-
—
2. Migração o movimento dos membros de uma es-
pécie de uma população para outra. Esse movimento
migratório transfere alelos de uma população para
outra e, se as frequências de alelos forem suficien -
temente diferentes ou se o tamanho da população
migratória for suficientemente grande, a migração
pode alterar rapidamente as frequências de alelos.
3. Muta ção
— o acréscimo lento de variabilidade
alélica que aumenta a diversidade hereditá ria das
populações e serve como "matéria - prima" da mu -
dança evolutiva. A evolução é impossível sem a
variabilidade herdada para os traços adaptáveis A.
mutação proporciona a diversidade hereditária ne -
cessá ria para a mudança evolutiva.
-
—
4. Desvio gen ético aleató rio a mudan ça aleatória
- das frequências de alelos decorrente do acaso nas
populações que acasalam aleatoriamente. O des -
vio gen ético ocorre em todas as populações, mas é
mais pronunciado em populações muito pequenas,
nas quais as flutuações estatísticas nas frequências
de alelos podem ser significativas de uma geração
para outra.
Em meados do século XX, a síntese moderna da
—
evolução o nome dado para a fusão da teoria evolu -
tiva com os resultados da biologia populacional experi-
- —
mental e molecular surgiu como uma visã o unifica-
dora da evolução. A sí ntese moderna conta a histó ria da
 Ca p ítu Io 1 Base molecular da hereditariedade, varlabi Iklade e evolu ção 17

evoluçã o morfológica e molecular de espécies de plan -

tas e animais usando processos e mecanismos experi - Tentilhões de solo
Comedores de sementes
mentalmente verificados.
Entre os principais e mais conhecidos arquitetos da Grande
síntese moderna estio Thcodosius Dobzhansky c Emst
Mayr, que reuniram ideias de Darwin, Fisher, Wright,
Haldane e outros para demonstrar como a evolução
opera nas populações reais. Dobzhansky e Mayr in
fluenciaram profundamente o pensamento e a pesquisa
- fi Médio

Pequeno

Grande
de gerações de biólogos, demonstrando que os meca -
nismos hereditários revelados por investigações labora -
toriais e a estrutura e evolução das popula ções naturais
t Cactos
Comedores
de flores
de cactos

são coerentes com as previsões feitas por Fisher, Wri

ght e Haldane. Em termos simples, Dobzhansky e Mayr
- Tentilhões de á rvore
Comedores de insetos
mostraram que a evolu ção nas populações e a evolução
Pequeno
nas espécies ocorrem conforme o previsto pela teoria
evolutiva. Hoje, aprofundada pelo trabalho de incon - Grande
tá veis pesquisadores, a síntese moderna fornece um Médio
quadro claro e praticamente completo dos fatores que
produzem as mudanças evolutivas nas populações e dos Pica-pau
mecanismos que produzem a evolução das espécies. In
corporamos exemplos evolutivos em muitos capítulos
- 4 Mangue

e discutimos especificamente a evolução nas espécies e

Tentilhã o Comedor
populações (ver Capítulo 22). vegetariano de brotos

Observa çã o gen é tica Quatro processos evolutivos

—
seleção natural, migração, mutação e desvio genético aleató-
rio
— moldam as populações e espécies. A síntese moderna
Tentilhão
de bico fino

Tentilhã o gorjeador
Comedor
de sementes

da evolu ção une as ideias evolutivas de Darwin com as dos
biólogos evolutivos contemporâ neos para proporcionar uma
vlsáo abrangente dos mecanismos e processos da mudança
evolutiva.
Rastreando as relações evolutivas
Os biólogos evolutivos investigam a evolu ção es-
tudando o desenvolvimento morfológico (f ísico) e mo-
lecular ( DNA, RNA e proteína ) dos organismos. As
comparações morfológicas e moleculares podem identi
ficar relações entre as espécies vivas, bem como revelar
as relações ancestral -descendentes. As semelhanças e
diferenças morfológicas ou moleculares que identificam
as relações evolutivas dos ancestrais e descendentes
podem ser retratadas em um diagrama chamado á rvore
fllogen ética. Essas á rvores resumem as histórias evolu
tivas das populações ou espécies usando pontos de ra
mifica ção na árvore para indicar os ancestrais comuns
dos organismos descendentes.
A abordagem mais utilizada na construção da ár-
vore fllogen ética é a abordagem dad ística, que re-
constrói as relações evolutivas e as classifica em grupos
chamados clades, baseados na identificação das carac
ter ísticas derivadas comuns que podem ser morfoló
gicas ou moleculares. As características derivadas co
muns se desenvolvem através da evolução a partir das
características mais primitivas e exibem uma gama de
Comedores de insetos
Ancestral Cinza
comum
Verde
Figura 1.13 Evolução morfológica. Uma á rvore fllogenética
baseada em caractensticas morfológicas mostra as relações
aparentes entre 14 espécies de tentilhão que habitam as Ilhas
.
Galápagos. (Adaptado com a permissão de CAMPBELL N. A;
. . .
REECE J. B. Biobgy.8. ed Fig. 1.22 p. 17, 0 2008.)
- diferenças entre os grupos que estã o sendo estudados.
A abordagem cladística para a construção da á rvore fl
logenética costuma utilizar o conceito de parcimó nia,
-
significando o uso de opções mais simples ou econ ómi-
cas, para construir uma á rvore fllogenética postulando
o menor n ú mero de mudanças necessá rias para levar
- em conta as diferenças entre grupos. A ideia por trás do
- conceito de parcimónia é que a explicação mais simples
para as diferenças conhecidas entre os grupos tem a
maior probabilidade de estar certa.
A Figura 1.13 mostra uma á rvore fllogen ética pro-
posta para 14 espécies de tentilhã o que habitam as
Ilhas Galá pagos. Essas espécies de tentilhão foram um
- dos grupos estudados por Darwin quando ele formulou
sua teoria evolutiva. A á rvore exibida aqui se baseia em
- uma série de características morfológicas e comporta
mentais, incluindo formato e tamanho do bico, hábitos
-
alimentares e o habitat de cada espécie, bem como seu
18 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
grau de isolamento ou separação das demais espécies
nas ilhas.
O conhecimento das relações evolutivas de um
grupo de organismos permite compreender melhor sua
biologia. Por exemplo, entre os tentilh ões de Darwin , os
—
tentilhões de á rvore formam um grupo monofilé tico
um conjunto de organismos que inclui um ances-
tral comum e todos os seus descendentes. Os tentilhões
de solo também formam um grupo monofilético. Por
outro lado, os tentilhões comedores de insetos formam
um grupo paraf í lético
—
um conjunto de organismos
que inclui um ancestral comum, mas nào inclui todos
as seus descendentes. O conhecimento sobre se um
grupo é monofilético ou parafílético permite inferências
sobre a evolução dos traços. Por exemplo, uma vez que
os tentilhões de árvore são monofiléticos, esse traço, a
vida arbórea, provavelmente evoluiu uma vez no an
cestral comum dos tentilhões de á rvore. Inversamente,
como os tentilhões comedores de insetos formam um
grupo parafílético, o traço da preferência por insetos
como fonte de alimento evoluiu vá rias vezes ou, de
modo alternativo, foi perdido várias vezes na evolução
dos tentilhões de Darwin.
Construção de árvores filogenéticas usando morfologia e
anatomia Considere as características compartilhadas
pelos vários agrupamentos de animais apresentados na
Figura 1.14: salmão, crocodilo, omitorrinco, canguru,
lobo, gorila e homem. Uma caracteristica morfológica
comum a todos esses animais é a presença de uma es-
pinha dorsal, que une esse grupo em um clade que co-
—
nhecemos como vertebrados, em que todos comparti
lham um ancestral comum neste caso, um ancestral
vertebrado. Uma segunda caracteristica morfológica ,
a presença de quatro pernas, une todos os animais
Caractorfsticas morfológicas
Espinha Pelo,
dorsal leite
3i
&
Táxon
Homem
S,
I SI
52 ]
O * O O Gorila
wo
1
ii! lf
I!
Lobo
Canguru
u cr Omitorrinco
Crocodilo
Salmão
Figura 1.14 Gera çã o de uma á rvore filogenética
baseada em características morfológicas. Os organismos
são avaliados quanto è presen ça ou ausência de uma série
de características morfol ógicas, e os que compartilham as
mesmas caracter ísticas formam clades. As origens de tra ços
espec íficos podem ser rastreadas na á rvore filogenética.
quadr ú pedes e exclui o salmão. Desse modo, todos os
animais, exceto o salmão, podem ser unidos em um
clade que chamamos quadr ú pedes. Como os peixes
n ào estão dentro do clade dos quadr ú pedes, eles for -
mam um exogrupo dos quadr ú pedes. Um exogrupo é
um tá xon ou grupo de tá xons relacionado ao clade em
-
.
questã o, mas que n ào faz parte dele As espécies dentro
do clade de interesse chamam se endogrupo. No nosso
exemplo, cada clade sucessivo é identificado pelo agru -
pamento das espécies com base em outras caracter ísti -
cas compartilhadas.
Após a constru ção de uma á rvore filogenética, é
possível sua utilização para inferir caracter ísticas das
espécies ancestrais. Por exemplo , podemos inferir que
o ancestral comum de todos os tá xons na Figura 1.14
tinha uma espinha dorsal, o que seria então uma ca -
- racteristica ancestral; mas ele n ão tinha quatro patas,
o que, nesse caso, seria uma caracteristica derivada
que evoluiu ma ís tarde, na ancestralidade comum dos
quadr ú pedes.
Construção de á rvores filogenéticas usando moléculas
As á rvores filogenéticas baseadas em caracter ísticas
moleculares são construídas da mesma maneira que as
baseadas em caracter ísticas morfológicas, exceto que as
caracter ísticas compartilhadas são sequê ncias de DNA
ou proteínas. Os grupos descendentes possuem áci-
dos nucleicos ou sequê ncias de aminoácidos derivadas
das sequências possu ídas por seus ancestrais comuns.
O conceito de parcimó nia diz que as sequências mais
estreitamente relacionadas sáo as que têm o menor n ú -
- mero de diferenças entre elas.
A Figura 1.15 considera as sequê ncias de DNA de
rivadas dos primeiros 15 nucleotídeos do gene (J - glo-
bina de sete espécies (a a g). Na figura, as sequências
-
foram alinhadas verticalmente e o n ú mero de diferen -
ças entre a sequência superior e cada uma das outras
sequ ê ncias é observado na primeira etapa da figura.
Um método comum para construir uma árvore fi -
logenética começa com comparações em pares, agru -
pando as sequ ências mais similares (sob o pressuposto
de que são as mais estreitamente relacionadas ) e sub-
sequentemente trazendo as sequ ências mais remo-
tamente relacionadas para obter a á rvore mais parci -
moniosa. A an á lise começa com as sequências a e b,
já que são idê nticas, e acrescenta sucessivamente as
sequ ê ncias mais remotamente relacionadas para cons -
truir uma árvore. A informação de sequência de c, que
é mais similar a a e b, é acrescentada em seguida, se -
guida pelas outras sequências. Uma á rvore filogen ética
completa , construída seguindo as etapas enumeradas,
resulta em uma á rvore que recapitula a filogenia co-
nhecida dos vertebrados.
-
Deve se ter cuidado na construção das á rvores fi -
logenéticas para assegurar que as características mor
fológicas ou moleculares nas quais se baseiam n ão
-
evoluíram de maneira independente, já que isso viola-
 Capí tulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução 19

Número de Número de nudeotideo

diferenças Sequência J 5 10 15
a GTGTGCTGGCCCACA
O As sequências de DNA
0 b GT6TGCT6GCCCACA
dos primeiros 15
nudeotídeos do gene 1 c GT 6 T G C T G G C Q C A C A
( -globina de sete
i 3 d QTGTGOTGGHCCACA
espécies são apresenta - 6 e QGTBDTGGCCCQDA
das (de dma para baixo)
na ordem do número de
7 f f l! G l f f l T B G C U
diferenças entre cada 7 9 D T G T B D T B G C C IG C A A
sequência.
Sequência 1 5 10 15
a GTGTGCT6GCCCACA
O Sequências idênticas e
muito parecidas formam ciade b GTGTGCTGGCCCACA
um dade. C GTGTGCTGGCQCACA
luência 1 5 10 15
O A sequência d, a próxima Sequência ancestral para a - c GTGTGCT6GCCCACA
mais parecida, difere nas
posições de aminoáódos
.
1, 6 e 10 Na posição 11 d
é o mesmo que a e b; isso
. -i
GTGTGCTGGCCCACA
O d
A sequência ancestral das espéces
G T G T G C T G G C C C A C A a-c pode ser nferida comparando
G T G T G C T G G C Q C A C A as sequências a-c com a de um
Q T G T G H T 6 G C C A C A exogrupo,a espécie d.
0
significa que C é o
nudeotideo ancestral na 1 5 10 15
posição 11 . a 6T 6 TSCT 6 6CCCACA
b GTGTGITGGZCCACA
c GTGTGCTGGCBCACA
Adicionar sucessivamente na pr
óocma d D I GiGQTGGBCCACA
sequência mais parecida etc e [EGTBHTGGCCCEDA
1 5 10 15
O Repare que T na GTGTGCTGGCCCACA
.
posição 11 nas
.
sequências c e f deriva
de mutações Sequência ancestral para a-e
i GTGTGCTGGCCCACA
GTGTGCTGGCBCACA
QTGTGQTCGBCCACA
independentes
evolutivamente do
TTGTC ?T ? GCCC ?CA
*
j
BGTBDTGGCCCEDA
ancestral C: isso é A sequêfKia arxesUal é ambígua
f ÍT G T| C
. nosnósemreeeí g.
homopiasia
CULI QT G TEETBG C CPHIA
1 5 10 15
a GTGTGCT6GCCCACA Homo sapiens (homem)
b GTGTGCTGG CCC ACA Pan trogloàytei (chimpanzé)
c G 1 G I G C T 6 GCpCACA Canis fomilforls (cã o doméstico)
d T G T G Q T G G0C C A C A Rattus norvegicus (rato da Noruega)
O Essa filogenia recapitula
e EZ36 TBDT 6 GCCCEDA Hynobius retardatus (salamandra)
afilogenia conhecida
dos vertebrados . f dTSTffiTflGCllfclA* Donio reoo (petxe- zebra)
9 ÍT G T TflGCC GCA A Salmo falar (salmão do Atlântico)

Figura 1.15 Construção de uma árvore filogenétka baseada em características moleculares usando o princípio da
parcimónia.

ria o pressuposto de que elas são uma evidê ncia de um
ancestral comum. Por exemplo, sabemos que as asas
em pássaros e morcegos t ê m origens independentes,
pois muitas outras caracter ísticas derivadas comuns
unem os morcegos aos mam íferos e os pássaros, aos
répteis. As caracter ísticas compartilhadas com ori
gens evolutivas independentes surgem por evolução
- grupos que eram reunidos tradicionalmente juntos,
convergente ou homopiasia. Embora a frequê ncia
da evolução convergente para o mesmo estado de
atributo gcralmentc seja lenta , os altos n íveis às vezes
podem confundir a construção das á rvores. A An álise
Genética 13 o orienta através da constru ção da árvore
íf logen ética .
A disponibilidade dos dados da sequ ência de DNA
para a maior parte das linhagens de vertebrados revolu -
cionou o modo como vemos a filogenia animal. Alguns
como mamíferos, pássaros e anf íbios, provam , a partir
dos dados de sequência, que formam grupos monofi-
l étkros. No entanto, análises indicaram que os répteis e
peixes não formam grupos monoílléticos e são parafi-
léticos. Por exemplo, os crocodilos são mais próximos
20 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
Os bi ólogos evolutivos pesquisaram o genoma de porcos, baleias e
Organismo Gene
vacas para identificar a presen ça ou náo de seis genes (chamados A
.
a F na tabela à direita ) Um gene é marcado com um sinal de posi - A B C D E F
.
tivo (+), se for encontrado em um genoma ou com um sinal de ne - Porco +
-
gativo ( ), se n á o for encontrado. Use as informa ções para construir
a á rvore filogenética mais prová vel relacionando a vaca, a baleia e
Baleia + + + +
o porco. Vaca + + + +

Estrat égias de soluçã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tó pico abordado por esse
problema e explique a natureza da res-
.
1 Esse problema requer a avalia ção da presença ou ausência do gene em três
mam íferos para construir uma á rvore filogenética retratando as relações
posta solicitada. entre os grupos.
2. Identifique as informações criticas forne- 2. A presença ou ausência de cada um dos seis genes é dada para cada tipo
c í das no problema. de mam ífero.

Deduzir
3. Identifique os genes compartilhados por 3. Dos seis genes testados, o gene A é encontrado nos três organismos. Os
todos os trés grupos, os genes compar
tilhados por dois dos grupos e os genes
- genes BeC são compartilhados pelos genomas da baleia e da vaca, mas
não são detectados no genoma do porco. O gene D é exclusivo dos porcos .
exclusivos de um grupo. E é exclusivo das baleias e F é exclusivo das vacas.
MCA: Ch germ comparTílhjòm pek»
-
o»g*nbmoi (Hovjwdmente esUvjm pre
sentes em seu «mctrsldl tomi#n.

.
4 Atribua os genes compartilhados a ramos
filogenéticos que na á rvore completa
serão compartilhados pelos organismos
correspondentes.
Solucionar
5. Comece a construir a á rvore com base
nos genes compartilhados pelo maior n ú -
mero e, depois, pelos menores n ú meros
de organismos.
.
4 O gene A é atribu ído à base da á rvore filogen ética, que ascende do ances-
tral comum dos três organismos. Os genes B e C sâo atribu ídos a um ramo
compartilhado pela baleia e a vaca. Os genes D, E e F são exclusivos de gru -
pos separados e, portanto, são colocados em ramos separados.
5. A á rvore filogenética baseada nos genes compartilhados é exibida a seguir,
BC. Baleia
4 Vaca

Porco

6. Atribua genes exclusivos de cada genoma 6. A á rvore filogenética completa contendo os três genes é exibida a seguir ,

aos ramos que n áo são compartilhados

. Baleia
pelos outros organismos.
A
BC
CZ D
Vaca

Porco

Para praticar mais, ver Problema 18.

dos pássaros do que de outros répteis. Análises morfo-
lógicas e moleculares de dinossauros sugerem que sã o
um grupo-irmâo dos pássaros, o que implica que os
pássaros ainda existentes sâo os dinossauros da era mo-
derna, como é discutido no Estudo de Caso no final do
capítulo.
Observa çã o gen é tica As diferenças morfológicas e
moleculares entre os grupos taxonómicos contemporâ neos
são usadas para construir á rvores fitogenéticas que retratam as
relaçóes evolutivas pntre os grupov Na construção da á rvore,
as caracteristícas primitivas ou sequências ancestrais são en-
contradas nos ancestrais comuns e as caracterist ícas derivadas
compartilhadas estão presentes nos grupos descendentes.
 Cap í tulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução
ESTUDO DE CASO
De volta no tempo — An álise genética e genômica dos dinossauros
Os ér pteis conhecidos como dinossauros surgiram há
estã o vivos
—
uproximudamenle 250 milh ões de anos. Hoje eles ainda
pelo menos na forma de seus descendentes
diretos, os pássaros modernos. A hipótese dc os pássaros
terem evoluído a partir dos dinossauros tem prevalecido
por muitas d écadas c bascia -sc cm muitas fontes dc in
formação, incluindo a observação de que as penas surgi-
.
ram primeiro nos dinossauros ( Figura 1.16) Dois estudos
publicados em 2007, al é m de dados de apoio subsequen -
tes, deram mais credibilidade à conexã o e trouxeram os
dinossauros cara a cara com a gen ética moderna e a an á
lise gen ômica.
O Tyrannosaurus m, com sua grande estatura, man -
d íbulas e dentes imensos, alé m da reputa ção temerária
como um carn ívoro voraz, talvez seja o mais familiar dos
dinossauros. A espécie era amplamente distribu ída e seus
f ósseis t ê m sido encontrados cm relativa abundâ ncia na
Am érica do Norte. O osso da perna de um T. rcx encon-
trado na Formação Hell Creek em Montana em 2003, . Embora a quantidade total de colágcno detectada nos
forneceu uma amostra a partir da qual Mary Schweitzer
e colegas extraíram uma diminuta quantidade da proteína
óssea colá gcno.
A prote ína colágcno forma uma tripla hélice altamente
ordenada nos ossos, que é conservada através dos grupos
taxon ómicos. A glicina , o menor dos aminoá cidos, é conser-
vada em cada volta da hé lice proteica e constitui aproxima-
damente 33% da sequência de aminoácidos do col ágeno. A
. . .
Pl icrnt irio*
Marsupiais
Monotremados
Répteis
Crocodilos
Dinossauros
Pássaros
Lagartos e serpentes
Tuataras
Tartarugas
Anfíbios
Peixes
Peixes dipiiokoi
Peixes
actlnopterlgeos
Peixes cartilaginosos
(tubarões e arraias)
Lampreias
Figura 1.16 Filogenia animal, baseada em dados
morfológicos e moleculares, mostrando que os pá ssaros
sáo os parentes vivos mais próximos dos dinossauros
21
alanina també m é rclativamcntc comum no colágcno assim .
como os aminoácidos prolina e lisina.
A partir dc sua estrutura em tripla hélice c do per
fil de aminoácidos, as moléculas de col ágeno são dife-
renciadas e facilmente identificáveis. Schweitzer e co
-
-
- laboradores dctcctaram essas estruturas diferenciadas
quando examinaram pequenos fragmentos de ossos dc T.
rcx da Forma ção Hell Creek usando microscó pio eletrô
nico. Uma série de testes de anticorpos confirmou a pre-
sença do colágeno nas amostras; em seguida, SchweitZjer
- e John Asara usaram um tipo altamente sensível de es
pectrometria dc massa para fazer uma análise dos ami-
-
noácidos do col ágeno presumido do T rcx. A aná lise
por espectrometria de massa indicou uma abundâ ncia
de glicina e n íveis relativamente altos de alanina e pro-
lina. coerentes com o que se poderia esperar do col ágeno.
Muitos controles c lestes repelidos confirmaram a dclcc-
çâo do col ágeno nas amostras de T. rcx .
ossos do T. rcx tenha sido m ínima , isso proporcionou dados
de espectrometria de massa suficientes para determinar
a proporção entre as quantidades dc glicina c alanina. A
proporção Gly : Ala para o colágcno do T. rcx c 2,6:1. Em
compara ção, o col ágeno das galinhas tem uma proporção
Gly : Ala dc 2,5:1. Essas proporções sã o coerentes com uma
relação próxima entre o col ágeno do dinossauro e o colá-
geno da galinha. Esse projeto de pesquisa em andamento
— usando a prote í na mais antiga conhecida c jamais ex-
traída de uma amostra fóssil
— ajuda a sustentar a opiniã o
prevalecente dc que dinossauros c pássaros compartilham
uma relação evolutiva próxima.
Mais apoio veio dc um estudo cm 2007 dc ossos dc di
nossauro, realizado por Chris Organ c colaboradores, que
-
tomaram uma direção bem diferente. Organ está interes-
sado na evolução do tamanho do genoma e especificamente
no motivo pelo qual os pássaros tê m os menores genomas
.
de todos os vertebrados Muitas teorias tê m sido propostas
para explicar esse genoma pequeno, mas cias assumem duas
formas: (1) de que os pássaros desenvolveram um genoma
pequeno como uma resposta adaptativa à sua alta taxa me
tabólica (sugerindo que o genoma grande é mais custoso
-
para ser mantido nos organismos metabolicamente ativos)
ou (2) dc que o genoma pequeno nos pássaros é uma carac
le r ústica ancestral antiga da linhagem dos pássaros.
-
Organ desenvolveu um método analítico baseado em
uma correlação geral bem estabelecida entre o tamanho do
genoma e o tamanho da célula. Em geral, organismos com ge-
nomas maiores também possuem células maiores. Ao exami -
nar os restos fossilizados dc 31 espécies dc dinossauro extintas,
sua equipe estimou o tamanho das células ósseas, chamadas
osteócitos, medindo o volume das cavidades no osso fossili-
zado onde as células estavam localizadas antes. Antes disso,
eles haviam calculado a correlação entre o tamanho do oste
ócito c o tamanho do genoma nas espécies modernas; depois,
-
eles aplicaram o mesmo método para estimar o tamanho dos
.
genomas dos dinossauros Seus resultados indicam que os di -
nossauros tinham genomas pequenos com aproximadamente
. o mesmo tamanho do genoma das espécies modernas de pás-
22 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
saros. Esses genomas pequenos remontam aproximadamente
a 250 milhões dc anos» pré-datando, assim, o surgimento dos
primeiros pássaros aproximadamente 100 milhões dc anos
atrás. A explicação evolutiva para os pequenos genomas dos
dinossauros continua uma questão em aberto, mas os resulta -
dos de Organ dão credibilidade à opinião de que o genoma
pequeno é uma caracter ística ancestral dos pássaros e nào
uma adaptação mais recente.
A importância desses estudos com dinossauros é
dupla . Primeiro, eles sugerem a possibilidade de realizar
RESUMO
1.1 A genética moderna entrou em seu segun-
do século
I Os princí pios da gen ética descritos pela primeira vez por
Gregor Mendel em 1865 foram 'redescobertos* em 1900
e, assim, fizeram da genética moderna uma disciplina
científica do século XX.
O estudo da transmissão da variabilidade morfológica
durante a primeira metade do século XX estabeleceu
a transmissão genética como o foco central da análise
genética.
.
A an á lise de DNA RNA e proteína começando na segunda
metade do século XX estabeleceu a genética como uma
disciplina molecular.
A vida na Terra possui trés dom í nios
e Eukarya — —Bactéria, Archaea
que compartilham uma história evolutiva
comum.
1.2 A estrutura do DNA sugere um mecanismo
para a replicaçã o
O ácido desoxirribonudeico ( DNA) é o material genético. O
DNA é uma dupla-hélice composta de quatro nudeot ídeos
que, por sua vez, são compostos de um açúcar desoxirribose
com anco carbonos, um grupo fosfato e uma de quatro
bases de nudeot ídeo: adenlna (A), timina (T), cltoslna (C)
ou guanina (G ).
I Os nudeot ídeos em uma fita de DNA são unidos por
ligações fosfodiéster cova lentes entre o 5' fosfato de um
nudeotídeo e o 3’ OH do nudeot ídeo adjacente.
I As fitas do DNA sáo unidas por pontes de hidrogénio que
se formam entre pares de base complementares. A forma
par com T e C forma par com G.
I As fitas do DNA duplex sáo ant í paraleias; uma fita é
- -
orientada 5' » 3' e a fita complementar é orientada 3' * 5*
O DNA se replica por meio de um processo semleonservaòor
que produz cópias exatas da dupla -hélice do DNA original.
A DNA polimerase usa uma fita do DNA como molde para
sintetizar uma fita -filha complementar, um nudeotídeo de
cada vez, na direçã o 5' para 3'.
1.3 A transcrição e a tradução expressam os genes
I O dogma central - -
da biologia (DNA » RNA > prote í na )
identifica o DNA como um repositório de informações e
an álises gené ticas e genômicas nos restos dos organismos
que viveram centenas de milh ões de anos atrás. M é todos
laboratoriais sofisticados para isolamento, extração c me-
di ção de quantidades- traço de ácidos nucleicos e proteínas
das espécies extintas podem ser combinados com procedi -
mentos de dctecçâo sensíveis e métodos computacionais
para realizar esses estudos. Segundo, eles fornecem novas
fundamentações para as teorias existentes a respeito da
estreita relação evolutiva entre os dinossauros e os pássa -
ros modernos.
descreve como o DNA dita a estrutura da proteí na através
de um RN A mensageiro intermediá rio que, por sua vez,
dirige a síntese pollpeptídica.
Transcrição é o processo que sintetiza o RN A de fita ú nica a
partir da fita molde do DNA.
Os transcritos do RNA tém a mesma polaridade 5'
e sequência da fita codificadora do DNA; eles diferem
- 3’
apenas quanto è presença do nucleot íòeo U no lugar deT.
Certas sequências de DNA , na maioria das vezes os
promotores, ligam a RNA pollmerase e outras proteí nas de
transcrição.
Tradução é o processo que usa sequ ê ncias do RNA
mensageiro ( RNAm ) para sintetizar proteí nas.
Os códons do RNA mensageiro formam pares de bases
com os anticódons do RNAt no rlbossomo.
Cada RNAt carrega um aminoácido específico que é
adicionado à cadeia polipeptidica em crescimento.
O código genético mantém 61 códons que especificam
aminoãcidos e 3 que são códons de parada.
1.4 A evolução tem uma base molecular
——
Quatro processos seleção natural, mutação, migração e
desvio genético conduzem a evolução de populações e
espécies.
A evolução das caracteristicas morfol ógicas adapt á veis
ocorre por meio das pressões seletivas naturais exercidas
sobre as espécies por seus ambientes. As caracter ísticas
não adaptáveis que são neutras em relação à seleção
natural evoluem por meio de outros processos evolutivos.
A síntese moderna da evolução é o nome aplicado à união
da transmissão genética, gen ética molecular, evolução
darwiniana e gen ética evolutiva moderna.
As á rvores fik>ger»éticas descrevem as relações evolutivas
entre as espécies modernas e traçam sua descendênda a
partir dos ancestrais comuns para identificar o padrão de
evolução mais prová vel.
As caracteristicas derivadas comuns sã o atributos
morfol ógicos que evoluem nas espécies descendentes
a partir de caracteristicas encontradas em um ancestral
comum.
As filogenias moleculares traçam a evolução do áddo
nudeico ou das sequ ências de proteí na dos ancestrais
comuns até a espécie moderna.
 Capí tulo 1 Base molecular da hereditariedade, variabilidade e evolução 23

T E R M O S- C H A V E

Acido desoxirribonudeico (DNA) (p. 5) Evolução convergente (homoplasia) (p. 79) Pares de bases complementares (p. 6)
Acido ribonucleico (RNA) (p. 5) Éxon (p. 7 7) Polaridade da fita (5' e 30 (p. 7)
Alelo ip. 3 ) Fenótipo (pi) . Ponte peptidíca (p. 72)
Aminoácido (p. 11 ) Fita codificadora (p 7 7) . Pontes de hidrogénio (p. 7 )
.
Anticódon (p 12) Fita molde (p 7 7 ) . Promotores [p. 11 )
Antiparalelas (p, 7) Fita parental (p 9) . Proteína (polipeptídio) (p. 12 )
Archaea (p. 4 ) Fita- filha (p. 9) Regra de Chargaff (p. 6)
Arvore filogenética (p. 17 ) Gametas (p. 2) Replicaçáo do DNA (replkaçào semicon
Bactéria {p. 4) Gene (p. 2) servativa) (p. 5)
Características derivadas comuns (p. 17) Gené tica evolutiva (p. 5) Ribossomo (p. 5)
.
Cladfstica (clade) (p 17) Genética molecular (p 5) . RNA mensageiro (RNAm) (p. 5)
.
Código genético (p 12 ) Genoma (p. 4 ) RNA ribossómico (RNAr) (p. 11 )
.
Códon (p 12 ) Genótipo (p. 3) RNA transportador (RNAt ) [p. 11 )
Códon de início (p. 72) Grupo monofiiético (p. 75) Seleção natural (p. 76)
Códon de parada (p. 72) Grupo parafilético (p. 78) Sequência de terminação (terminação
Cromossomo (p. 2) Início da transcrição ip. 11 ) .
da transcrição) (p 76)
Cromossomos homólogos ( homólogos) Introns (p. 72) Síntese moderna da evolução ip. 11 )
(p. 2) Ligação fosfodiéster (p. 6) Tradução (p. 5)
Desvio genético aleatório (p. 76) Meiose (p. 2) Transcrição reversa ip. 11 )
Dogma central da biologia (p. 70) Migração (p. 76) Transcnçào ip. 5)
Dupla hélice do DNA (DNA duplex ) (p. 5) Mitose (p. 2) Transmissão genética (genética
Endogrupo (p. 18 ) Mutação (p. 76) .
mendeliana) ip 5)
Eukarya (eucarioto) (p. 4) Nudeotídeos do DNA:adenina (A), Uracila (U) { p. 11 )
Evolução (p. 14) guanina (G), timina (T)r dtosina (C) (p. 6)

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. A genética afeta muitos aspectos das nossas vidas. Iden- 7. Defina seleção natural e descreva como ela funciona
tifique três maneiras como a gené tica afeta a sua vida ou como mecanismo de mudança evolutiva .
a vida de um membro de sua família ou de um amigo. Os
8. Descreva a sí ntese moderna da evolução e explique
efeitos podem ser encontrados regularmente ou podem
como ela conecta a evolução darwiniana com a evolução
ser únicos ou ocasionais.
molecular.
2. Em que você acha que a determinação do DNA como ma -
9. Quais são os quatro processos da evolução? Descreva re-
terial hereditário afetou a direção da pesquisa biológica?
sumidamente cada processo.
3. Um comentarista descreveu uma vez a gené tica como "a
.
10 Defina cada um dos seguintes termos:
rainha das ciências biológicas' A declaração quis insinuar
que a genética é de importância universal nas ciências a. Transcrição
biológicas. Você concorda com essa dedaração? De que .
b Alelo
maneiras você acha que a dedaração é precisa? .
c Dogma central da biologia
d. Tradução
4. Toda forma de vida compartilha DNA como material he- .
e Replicaçáo do DNA
reditário. De uma perspectiva evolutiva, por que vocé .
f Gene
acha que isso é verdade? .
g Cromossomo
5. Defina os termos alelo, cromossomo e gene e explique h. Antiparalelo
como eles se relacionam uns com os outros. Elabore uma L Fenótipo
analogia entre esses termos e o processo de utilização de j. Par de bases complementares
um mapa de ruas para localizar um novo apartamento k. Polaridade da fita de ácido nudeico
para morar no próximo ano, Isto é, considere qual termo L. Genótipo
é análogo a uma rua, qual é análogo a um tipo de prédio m. Seleção natural
n. Mutação
e qual é análogo à planta de um apartamento.
o. Síntese moderna da evolução
6. -
Defina os termos genótipo e fenótipo e relacione os um
ao outro.
24 Análise gené tica: uma abordagem integrada

Aplicação e integração

11. Se a timina corresponde a 21% dos nudeotideos do DNA DNA

no genoma de uma espécie vegetal, quais sáo as porcen - Codificadora 5' / T m
ancs*-
j Í
tagens dos outros nudeotideos no genoma? Molde 3' :[
12. Quais grupos químicos reativos sáo encontrados nos car -
Códon de RNAm
bonos 5' e 3' dos nudeotideos? Qual é o nome da ligação ~
5' j ! UAÇ j
formada quando os nudeotideos sáo unidos em uma
única fita? Essa ligação é covalente ou não covalente? Antk ó don de RNAt
.
13 Identifique duas diferenças na composição química que 3 f U U Aj |v
distinguem o DNA do RNA.
Amlnoácido
14. O que é o dogma central da biologia? Identifique e des- 3 letras Í METl íl
creva os processos moleculares que efetuam o fluxo de 1 letra [ rm V
informação genética descrito no dogma central .
15. Uma parte de um polipeptídio contém os aminoácidos
20. Quatro amostras de áddo nudeico sáo analisadas para
Trp-Lys-Met-Ala-VaL Escreva as possíveis sequências do
determinar as porcentagens de nudeotideos que con-
RNAm e da fita molde do DNA. (Dica: use A / G e T / C para
indicar que a dupla adenina/guanina ou timina/citosina
.
têm Analise os dados na tabela a seguir e determine
quais amostras são de DNA c quais sáo de RNA, especifi
pode ocorrer em uma determinada posição e use N para
indicar que qualquer nucleotídeo do DNA pode aparecer.)
cando se cada amostra é de dupla fita ou fita única Justi- .
fique sua resposta .
16. O segmento de DNA a seguir é a fita molde transcrita em
c
RNAm:
V -
_
.GACATGGAA-.- 3 '
Amostra 1
Amostra 2
A
22%
30%
G
28%
30%
T
22%
0
U
0
20%
28%
20%
a. Qual é a sequência de RNAm criada a partir dessa
Amostra 3 18% 32% 0 18% 32%
sequência?
b. Qual é a sequência de aminoácido produzida por Amostra 4 29% 29% 21% 0 21%
tradução?
.
21 Os tentilhões comedores de sementes estáo entre os
.
17 Considere o seguinte segmento de DNA: tentilhões de Darwln monofiléticos ou parafiléticos? E os

——
tentilhões comedores de flor de cactos?
5* - ATGCCAGTCACTGACTTG -- 3 *

3' TACGGTCAGTGACTGAAC
— 5*

a. Quantas ligações fosfodiéster sáo necessárias para

22. Se uma pessoa estiver construindo uma filogenia dos
répteis usando dados de sequência do DNA, qual tá xon
(pássaros, mamíferos, anfíbios ou peixes) poderia ser con-
formar esse segmento de DNA de dupla fita?
veniente para usar como um exogrupo ?
b. Quantas pontes de hidrogénio estão presentes nesse
segmento de DNA ? 23. Considere as seguintes sequências de aminoácidos obti-
c Se a fita inferior do DNA servir como molde transcrito das a partir de diferentes espécies de macacos. AplIçando
.
em RNAm quantas pontes peptídicas estão presentes
no fragmento de polipeptídio para o qual o RNAm é
o princípio da parcimónia, construa uma árvore filogené-
tica dos macacos.
traduzido? Pongo pygmoeos G G P H Y R L I A V E D
18. Analise a Figura 1.14 e responda ás seguintes perguntas: Pongo abtíH G G P H Y R L I A V E D
a. Quantos dades sáo exibidos na figura? Pan paniscuí C A P H F R L L A V E E
b. Qual é a característica compartilhada por todos os da* Pan troçfodyteí G A P H F R L L A V E E
des na figura?
GorINó gorMa G A P H F R L I A V E E
c Quais características sâo compartilhadas pelo dade
GoriNa berlngei G A P I I F R L I A V E E
mamífero e pelo clade humano? Quais características
distinguem esses dois clades? Homo sapiens G A F H F N L L A V E E
Hylobates lar G G P H Y R L I S V E D
.
19 Preencha os nudeotideos que estão faltando de modo
que haja tr ês por bloco e as abreviações de aminoácido Hootock hoofock G G P H Y R L I S V D D
que estão faltando no gráfico a seguir . Common Artcestor G G P H Y R L I S V D D
Transmissão genética Capítulo

APRESENTAÇÃO
2.1 Gregor Mendel descobriu os princípios bá sicos
da transmissão genética
2.2 Os cruzamentos monoibridos revelam a segre-
gação dos alelos
2.3 Cruzamentos dííbridos e trilbridos revelam a
segregação Independente dos alelos
2.4 A teoria da probabilidade prevê as razòes
mendelianas
2.5 A aná lise do qui-quadrado testa a adequação
entre os valores observados e os resultados
previstos
2.6 A herança autossòmica e a genética molecular
se comparam às previsões dos princípios da
hereditariedade de Mendel

Os frades de São Tomás eram professores dedicados à s artes e ciên-

cias. Gregor Mendel ( em pé na extrema direita ) analisa uma flor en-
quanto posa com seus colegas professores.

uando Gregor Mendel identificou e descreveu duas leis fun-

Q damentais da transmissão hereditária, ele inaugurou uma
nova era de compreensão na biologia. Os termos genética mende-
liana e mendelismo foram cunhados para reconhecer essa contri-
buição e são utilizados como sinónimos da transmissão genética,
campo que descreve a transferência de genes dos progenitores
para a prole. Assim como seu contemporâneo Charles Darwin, que
descreveu de maneira elegante o processo da evolução pela sele-
ção natural, Mendel ajudou a articular uma nova maneira de ver o
mundo através de suas descobertas.
Mendel não foi, de modo algum, a primeira pessoa a examinar
a transmissão de traços hereditários em plantas. Muitos botânicos
amadores do século XVIII e inicio do século XIX conduziram o que
depois foram chamados estudos de 'hibridização das plantas" em
muitas espécies, incluindo a planta de ervilha comestível (Pisam
sativum ) , que foi objeto dos experimentos de Mendel. Antes dele,
outros chegaram a realizar cruzamentos similares, alguns fizeram
observações como as que Mendel usou para basear seus dois princí-
pios da hereditariedade e alguns até mesmo chegaram perto de ar-
ticular uma descrição dos princípios da hereditariedade que Mendel
descreveu. Mas ninguém descreveu a transmissão hereditária com
tanta precisão quanto Mendel. Seu sucesso se deveu à elaboração
PONTOS ESSENCIAIS
I Os experimentos hereditários de Mendel
com ervilhas identificaram duas leis da he-
reditariedade conheddas como segregação
e segregação independente .
I As razões fenotípicas consistentes e previsí-
veis nas gerações que se descendem de dois
progenitores que se diferem quanto a um
únko traço apoiam a lei da segregação.
I A herança òe dois ou mais traços é prevista
pela lei da segregação Independente.
I As regras òe probabilidade preveem a he-
rança genética.
I O método estatístico conhecido como aná-
lise do quí-quadrado é empregado para
avaliar o grau de exatidão com que os resul-
tados previstos pelos experimentos genéti-
cos correspondem às observações experi-
mentais .
I A herança de traços nas famílias humanas
segue as leis hereditárias da segregação e
da segregação independente.
I A variação da herança de DNA, RNA e pro-
teína acompanha a herança da variação fe-
notfpka.
26 Análise gen é tica: uma abordagem integrada
superior de seus experimentos e à sua quantificação dos
resultados. Sua abordagem permitiu que ele formulasse
e testasse hipóteses genéticas com um nível de rigor que
ninguém havia conseguido antes dele nem conseguiria
até 35 anos após ele ter articulado sua hipótese.
Neste capítulo, examinamos como Mendel usou os
resultados experimentais para identificar dois princípios
fundamentais da transmissão hereditária. Examinamos
( 1 ) como a concepção sem precedentes dos experimen-
tos de Mendel lhe permitiu detectar fenômenos genéti-
cos que não foram identificados por seus predecessores
e ( 2) como a transmissão dos traços pode ser prevista
usando a teoria da probabilidade aleatória. O capítulo é
concluído com uma discussão que estende os princípios
da transmissão genética para o exame dos traços herda-
dos e as variantes da sequência do DNA nos seres huma-
nos e em outros organismos. Porém, começamos com
uma curta biografia de Gregor Mendel, que revela como
as suas experiências educacionais influenciaram profun-
damente sua abordagem para a exploração científica.
2.1 Gregor Mendel descobriu os
princípios bá sicos da transmissão
genética
Nascido em 1822, em uma fam ília de agricultores
sem muitas posses, em um lugar que hoje faz parte da Re -
pública Tcheca, johann ( posteriormente conhecido pelo
seu nome clerical, Gregor ) Mendel concluiu o equivalente
ao ensino médio aos 18 anos de idade com um certificado
atestando aptidões académicas excepcionais. Ele come-
çou a cursar o ensino superior no Olmutz Philosophical
Institute em 1840, mas esses estudos cobraram muito de
f sica e logo ele desistiu. Em 1843, após
sua sa úde mental e í
fracassar na tentativa de reiniciar os estudos em Olmutz,
ele decidiu buscar sua educação superior entrando para o
sacerdócio. Com base em sua grande reputação no trei
namento de professores e na recomendação de um ex -
- professor em Olmutz, ele escolheu o monastério de São
Tomás na cidade tcheca de Brno. As obrigações de Men
del no monastério incluíam o ensino temporá rio de ci
ências naturais em uma escola do ensino médio de Brno.
Seu grande interesse no ensino de ciências e seu desejo de
se tornar um professor permanente levaram os adminis
tradores do monastério a enviar Mendel para a Univer -
sidade de Viena, em 1851, para estudar dências naturais
como preparação para um exame de ensino.
Em Viena, Mendel estudou fisiologia e biologia das
plantas com o professor Franz Unger e f ísica com o pro
fessor Christian Doppler, assim como com o sucessor de
Doppler, o professor Andreas von Ettinghausen. Com o
professor Unger, Mendel aprendeu a raciocinar critica
mente sobre as teorias prevalecentes da reprodução e hi
bridização das plantas. Doppler, um f ísico experimental
famoso pelo efeito Doppler , defendia uma visão “ particu -
lada" da f ísica e ensinou Mendel a separar as característi-
cas individuais umas das outras em experimentos. O pro -
fessor Ettinghausen ensinou a Mendel a matemá tica da
análise combinatória. Mendel aplicaria cada uma dessas
liçòes à sua pesquisa posterior. Em 1853, Mendel voltou
a Brno para ensinar ciências naturais. Ele foi aprovado na
parte dissertativa do exame para professor permanente,
mas aparentemente nunca concluiu a parte oral, perma
necendo como professor “temporá rio” na escola em Brno
-
até se tornar abade do monastério em 1868.
No verto de 1856, após um período de três anos
durante o qual ele ponderou como poderia prosseguir
em seu interesse pelas ciências naturais, Mendel começou
seu trabalho de hereditariedade dos traços na planta de
ervilha Pisum sat .
ívum Mendel começou seus estudos
reunindo 34 variedades diferentes de ervilhas coletadas
nos fornecedores locais. Ao longo dos dois anos seguintes,
ele testou cada variedade quanto à sua capacidade de re -
produzir uniformemente caracteristicas idênticas de uma
geração para outra. No final das contas, ele estabeleceu
14 cepas de Pisum, representando sete traços individuais,
cada um deles com duas formas de expressão facilmente
distinguíveis em uma semente ou planta ( Figura 2.1 ).
Mendel trabalhou com essas 14 cepas pelos cinco anos se-
guintes, concluindo seus experimentos em 1863.
Em 8 de fevereiro e 8 de março de 1865, Mendel
discutiu seu trabalho sobre ervilhas em duas conferên-
cias da Brno Society for the Study of Natural Science.
A sociedade publicou seu relatório em seus Proceedings
no ano seguinte, 1866. Após a publicação de seu traba-
lho, Mendel se correspondeu com vá rios botâ nicos im -
portantes na Europa , mais notavelmente com Karl Nac-
gell As cartas de Mendel para Naegeli têm importâ ncia
científica , pois descrevem claramente seus experimentos,
resultados e conclusões. Infelizmente, nem Naegeli nem
qualquer um dos seus contemporâ neos pareceram captar
a importâ ncia do trabalho de Mendel.
Após se tomar abade do monastério, Mendel abando-
nou o trabalho científico e serviu fielmente o monastério
- até sua morte, cm 1884. Mendel morreu na obscuridade,
sem Jamais ter tido a importâ ncia dos seus experimentos
compreendida ou apreciada. Dezesscis anos mais tarde,
- no ano de 1900, biólogos repetiriam e redescobririam seus
- experimentos, lançando uma revolução na biologia. Hoje,
quase 150 anos após a realização do trabalho, o extinto
Monastério dc São Tomás, em Brno, é o local do Museu
- Mendel, que abriga exposições honrando Gregor Mendel
Você pode visitar o museu pela internet para ver algumas
das exposições e usufruir de uma série de recursos intera-
tivos em < www.mendel- museum.com >.
- Abordagem experimental moderna de
Mendel
- Mendel identificou com sucesso os princípios da
- transmissã o hereditá ria que iludiram os pesquisadores

Tra ç os
Semente Vagem
l. cor 2. forma 3. cor 4. forma 5. cor
( interior ) (imatura ) ( madura )
a»
I
I W
amarela lisa verde lisa roxa
& -
o
&
7.
t
I w
verde rugosa amarela
V . f- «
rugosa branca
que o precederam e continuaram iludindo os pesquisa
dores durante muitos anos após sua morte. Mendel era
mais perspicaz? Ele teve mais sorte ao escolher a Pisum
sativum como organismo experimental e ao selecionar
suas sete caracter ísticas? Ele teve uma abordagem su
perior para a experimentaçã o e análise genéticas? A res-
posta para cada uma dessas perguntas é sim.
A maior perspicá cia de Mendel veio principal
mente de sua familiaridade com o raciocínio quantita -
tivo e de sua compreensão da natureza particulada da
matéria , aprendida por meio do estudo da í f sica com
Doppler. A contagem do n úmero de descendentes com
fen ótipos específicos foi fundamental para o sucesso ex
perimental de Mendel. Esse componente lógico e hoje
rotineiro de coleta de dados foi a chave para a capaci -
dade de Mendel formular as hipó teses que explicaram
seus resultados. Com Doppler e Ettinghausen , Mendel
aprendeu a estudar as propriedades individuais da ma
téria separadamente e a raciocinar em termos quantita
tivos sobre as combinações de resultados.
Mendel fez uma escolha feliz ao selecionar a planta
de ervilha como seu organismo experimental. As ervi -
lhas eram usadas normalmente nos estudos de hibridi-
zaçâo na época de Mendel , entã o havia disponibilidade
de um grande n úmero de cepas exibindo características
fenotí picas diferentes. A ervilha é saudável e era fácil
para um botâ nico qualificado como Mendel manipular
e fazer cruzamentos com a planta.
Ao optar pelo estudo dos traços individuais da planta
de ervilha, Mendel concebeu seus experimentos para tes-
tar a teoria da hereditariedade por combinação, que era
a teoria da hereditariedade predominante naquela época.
A teoria da hereditariedade por combinação encarava
os traços da prole como uma mistura das caracter ísticas
possuídas pelas duas formas parentais. De acordo com
essa teoria , acreditava-se que a prole exibia característi-
cas aproximadamente intermediá rias entre as dos pais.
Por exemplo, a teoria da hereditariedade por combinação
prevê que o cruzamento de um gato preto com um gato
branco produziria filhotes cinzentos e que as cores preta
e branca originais jamais reapareceriam se os filhotes cin
Capítulo 2 Transmissão genética 27
Figura 2.1 Os sete traços dkotômicos
Flor Planta da Pisum sativum estudados por
6. posição 7. altura Mendel. Cada tra ço tem um fenótipo
( madura ) dominante e um fenótipo recessivo que são
facilmente distingu íveis.
axial alta
I 1.82 m 2.13 m
terminal baixa
-
( 46 cm 61 cm)
- zentos cruzassem uns com os outros. Mendel argumen -
tou que, se a teoria da hereditariedade por combinação
fosse verdadeira , ele veria evidências dela em cada traço.
Se a mistura não fosse observada nos traços individuais, a
- teoria da hereditariedade por combinação seria refutada.
Tão crucial para seu sucesso final quanto foram sua
-
abordagem quantitativa e a escolha da Pisum , a radical
mente nova concepção experimental de Mendel foi sua
-
inovação mais importante. Mendel estava à frente de seu
tempo pelo fato de seus experimentos serem movidos
por hipóteses. Em outras palavras, após uma observação
inicial, ele concebia uma hipótese para explicar a obser -
- vação e depois realizava um experimento independente
para testar a hipótese. Um experimento empregando
essa abordagem, que é a base do método científico mo-
derno, seguiria estas etapas:
1. Fazer observações iniciais sobre um fen ômeno ou
- processo.
- 2. Formular uma hipótese testável para explicar as ob-
servações.
3. Conceber um experimento controlado para testar a
hipótese.
4. Coletar dados a partir do experimento controlado.
5. Interpretar os resultados experimentais, compa
rando os resultados observados com os esperados
-
sob os pressupostos da hipótese.
6. Extrair conclusões razoáveis, reformular ou retes-
tar a hipótese, se necessá rio.
Nas próximas seções, discutimos como o planeja -
mento cuidadoso de sua concepção experimental per-
mitiu a Mendel coletar dados sobre os traços individuais
da planta de ervilha , formular hipóteses para explicar
suas observações fenot í picas e conduzir experimentos
independentes para testar suas previsões.
Cinco inovações experimentais críticas
Cinco caracter ísticas dos experimentos de cruza
mentos de Mendel os distinguem dos experimentos de
-
- seus contemporâneos e foram fundamentais para seu

Tra ç os
Semente Vagem
l. cor 2. forma 3. cor 4. forma 5. cor
( interior ) (imatura ) ( madura )
a»
I
I W
amarela lisa verde lisa roxa
& -
o
&
7.
t
I w
verde rugosa amarela
V . f- «
rugosa branca
que o precederam e continuaram iludindo os pesquisa
dores durante muitos anos após sua morte. Mendel era
mais perspicaz? Ele teve mais sorte ao escolher a Pisum
sativum como organismo experimental e ao selecionar
suas sete caracter ísticas? Ele teve uma abordagem su
perior para a experimentaçã o e análise genéticas? A res-
posta para cada uma dessas perguntas é sim.
A maior perspicá cia de Mendel veio principal
mente de sua familiaridade com o raciocínio quantita -
tivo e de sua compreensão da natureza particulada da
matéria , aprendida por meio do estudo da í f sica com
Doppler. A contagem do n úmero de descendentes com
fen ótipos específicos foi fundamental para o sucesso ex
perimental de Mendel. Esse componente lógico e hoje
rotineiro de coleta de dados foi a chave para a capaci -
dade de Mendel formular as hipó teses que explicaram
seus resultados. Com Doppler e Ettinghausen , Mendel
aprendeu a estudar as propriedades individuais da ma
téria separadamente e a raciocinar em termos quantita
tivos sobre as combinações de resultados.
Mendel fez uma escolha feliz ao selecionar a planta
de ervilha como seu organismo experimental. As ervi -
lhas eram usadas normalmente nos estudos de hibridi-
zaçâo na época de Mendel , entã o havia disponibilidade
de um grande n úmero de cepas exibindo características
fenotí picas diferentes. A ervilha é saudável e era fácil
para um botâ nico qualificado como Mendel manipular
e fazer cruzamentos com a planta.
Ao optar pelo estudo dos traços individuais da planta
de ervilha, Mendel concebeu seus experimentos para tes-
tar a teoria da hereditariedade por combinação, que era
a teoria da hereditariedade predominante naquela época.
A teoria da hereditariedade por combinação encarava
os traços da prole como uma mistura das caracter ísticas
possuídas pelas duas formas parentais. De acordo com
essa teoria , acreditava-se que a prole exibia característi-
cas aproximadamente intermediá rias entre as dos pais.
Por exemplo, a teoria da hereditariedade por combinação
prevê que o cruzamento de um gato preto com um gato
branco produziria filhotes cinzentos e que as cores preta
e branca originais jamais reapareceriam se os filhotes cin
Capítulo 2 Transmissão genética 27
Figura 2.1 Os sete traços dkotômicos
Flor Planta da Pisum sativum estudados por
6. posição 7. altura Mendel. Cada tra ço tem um fenótipo
( madura ) dominante e um fenótipo recessivo que são
facilmente distingu íveis.
axial alta
I 1.82 m 2.13 m
terminal baixa
-
( 46 cm 61 cm)
- zentos cruzassem uns com os outros. Mendel argumen -
tou que, se a teoria da hereditariedade por combinação
fosse verdadeira , ele veria evidências dela em cada traço.
Se a mistura não fosse observada nos traços individuais, a
- teoria da hereditariedade por combinação seria refutada.
Tão crucial para seu sucesso final quanto foram sua
-
abordagem quantitativa e a escolha da Pisum , a radical
mente nova concepção experimental de Mendel foi sua
-
inovação mais importante. Mendel estava à frente de seu
tempo pelo fato de seus experimentos serem movidos
por hipóteses. Em outras palavras, após uma observação
inicial, ele concebia uma hipótese para explicar a obser -
- vação e depois realizava um experimento independente
para testar a hipótese. Um experimento empregando
essa abordagem, que é a base do método científico mo-
derno, seguiria estas etapas:
1. Fazer observações iniciais sobre um fen ômeno ou
- processo.
- 2. Formular uma hipótese testável para explicar as ob-
servações.
3. Conceber um experimento controlado para testar a
hipótese.
4. Coletar dados a partir do experimento controlado.
5. Interpretar os resultados experimentais, compa
rando os resultados observados com os esperados
-
sob os pressupostos da hipótese.
6. Extrair conclusões razoáveis, reformular ou retes-
tar a hipótese, se necessá rio.
Nas próximas seções, discutimos como o planeja -
mento cuidadoso de sua concepção experimental per-
mitiu a Mendel coletar dados sobre os traços individuais
da planta de ervilha , formular hipóteses para explicar
suas observações fenot í picas e conduzir experimentos
independentes para testar suas previsões.
Cinco inovações experimentais críticas
Cinco caracter ísticas dos experimentos de cruza
mentos de Mendel os distinguem dos experimentos de
-
- seus contemporâneos e foram fundamentais para seu
28 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

sucesso: (1) cruzamentos controlados entre plantas;

( 2) o uso de cepas de linhagem pura para começar os Fertilizaçã o
cruzamentos experimentais controlados; (3) escolha de Antera ct
traços dicotô micos; (4) quantificação dos resultados; (5) (pólen)
uso dc cruzamentos replicados, recí procos c de teste. Óvulo 9
(ovo)
Cruzamentos controlados entre plantas Na natureza ,
as flores da planta de ervilha conté m antera produ -
tora de pólen e um óvulo contendo ovos e geralmente
se autofertilizam (Figura 2.2). A autofertilizaçào ocorre Maturação da planta,
desenvolvimento da flor
quando um espermatozóide do pólen proveniente da Desenvolvimento da semente
antera fertiliza um ovo dentro do óvulo. Os óvulos fer-
tilizados se desenvolvem no ovário, amadurecendo em
fruto (vagem ) à medida que as sementes (ervilhas) se
desenvolvem dentro da vagem. Uma vagem madura
normalmentc contém cinco a sete ervilhas, cada unia
delas resultando de um evento de fertilizaçã o diferente.
Em experimentos gen éticos, as ervilhas podem ser cole
tadas e classificadas quanto a seus fenótipos ou podem
- Sementes maduras
Crescimento
da planta
ser plantadas para produzir plantas de ervilha , classifi -
cadas quanto às suas características. Germina ção
As plantas de ervilha também sâo capazes de poli-
nização cruzada se o pólen de uma planta for utilizado
para fertilizar os óvulos de outra. Na natureza, as plan -
tas sofrem polinização cruzada por insetos, pássaros,
mamíferos e vento. Mendel usou sua familiaridade com
.
Figura 2.. Cklo de vkla da Pisum satfvum As sementes
(ervilhas) são plantadas e germinam, amadurecendo em
as plantas para realizar fertilização cruzada artificial plantas com flores. Os ovos no óvulo da flor são fertilizados pelo
( Figura 2.3 ). Primeiro, ele castrou as flores da ervilha pólen produzido pelas anteras. As sementes imaturas surgem
cortando as anteras nascentes. Essa modificação tor- de cada ovo fertilizado na vagem que se forma à medida que
nou a$ plantas incapazes dc se autopolinizarem, mas as sementes se desenvolvem. Após o amadurecimento, as
os óvulos ainda podiam ser fertilizados pela fertilização sementes são espalhadas para renovar o cklo.

Castrar as flores roxas Transfprir o pólen das anteras Figura 2.3 Fertilização cruzada
removendo as anteras (tf ). da flor branca (cf) para o artificial das plantas de ervilha.
óvulo da flor roxa ( 9 )

Anteras Anteras

As sementes são plantadas,

as plantas crescem e os
^-
traços são registrados. "

cruzada com o pólen de outra planta. Mendel realizou a
fertilização cruzada artificial usando um pequeno pin
cel para levantar o pólen maduro de uma flor nã o cas-
trada e varrê-lo para uma flor castrada. Com essa mani -
pulação, Mendel restringiu a reprodução às plantas que
ele identificou de antemão como propensas a produzir
resultados informativos, realizando assim o que hoje
é conhecido como cruzamento genético controlado
entre organismos selecionados.
Cepas de linhagem pura para começar os cruzamentos
experimentais Durante dois anos antes de começar
seus experimentos de hereditariedade , Mendel realizou
vá rios cruzamentos gen éticos controlados para obter
cepas que produziram consístentemente um ú nico
fenólipo sem varia ção. As cepas desse tipo que pro-
duzem consistentemente o mesmo fen ótipo são cha
madas cepas de linhagem pura , também conhecidas
como cepas verdadeiras. A autofertilizaçã o de uma
planta com flor roxa de linhagem pura vai produzir
apenas flores roxas entre as plantas da prole. Duas
plantas de uma linhagem pura podem ser cruzadas
com outra e vão produzir prole com o mesmo fenótipo.
Mendel passou quase dois anos gerando 14 cepas
de linhagem pura para suas sete caracter ísticas. Ele es -
tudou a heran ça de cada traço da mesma maneira, co
meçando cada experimento cruzando plantas parentais
de linhagem pura que expressavam fenótipos diferen -
tes do tra ço selecionado. Por exemplo, Mendel cruzou
plantas com flores roxas de linhagem pura com plan -
tas com flor branca de linhagem pura. Pela fertilização
cruzada artificial dessas plantas da geração parental
( geração P ), Mendel produziu sementes que foram cul
tivadas para formar a primeira geração filial ( geração
Fj ) de plantas [Figura 2.4 ). As plantas F, foram usadas,
entã o, como fonte de pólen e ovos para produzir as se-
mentes que foram cultivadas para formar a segunda
geração filial ( geração F ). A terceira geração filial
(geração F3) foi produzida ^pelo cruzamento das plantas
da geração F e assim por diante, por quantas gerações
^
fosse necessá rio.
Seleção dos traços individuais com fenótipos dlcotômi-
cos Cada um dos sete traços que Mendel escolheu é
encontrado em apenas duas formas dicotò micas Os . expressar seus resultados numericamente, Mendel con-
dois fen ótipos são facilmente distinguidos um do outro,
entã o n ão pode haver ambiguidade de atribuição e n ão
há fen ótipos intermediá rios. Por exemplo, um traço foi
a cor da semente; cada semente era amarela ou verde.
As formas alternativas dos sete traços que Mendel
estudou são ilustradas pela Figura 2.1. As 14 cepas de
linhagem pura foram reproduzidas para (1) cor da se -
mente ( amarela ou verde), ( 2) forma da semente (lisa
ou rugosa ), (3) cor da vagem (verde ou amarela ), (4)
forma da vagem ( lisa ou rugosa ), (5) cor da flor ( roxa
ou branca ), (6) posiçã o da flor ( axial ou terminal ) e (7)
altura da planta (alta ou baixa ).
E interessante observar que Mendel selecionou
inicialmente um oitavo traço produzindo tegumentos
Capítulo 2 Transmissão genética 29
Flor roxa de Flor branca de
- Inhagem pura linhagem pura
Prole com plantas
de flor roxa
Gera çã o F, autofertilizada ou artrficialmente fertilizada
Roxa Roxa Roxa Branca
-
i . » I •
Geração F, autofertilizada ou artlficlalmente fertilizada
1
Geração F,
Figura 2.4 Produção de tr ês gerações de plantas de
ervilha. As plantas da gera ção P sofrem fertilização cruzada
,.
artificial para produzir a geração F A autofertilização, ou
cruzamento das plantas da geração F,, produz a geração Fr
As plantas F se autofertilizam ou são cruzadas umas com as
^
- outras para produzir a gera ção Fr
cinzentos ou brancos nas sementes. No entanto, logo
no início de sua análise, ele constatou que as plantas
com flores roxas sempre tinham tegumentos cinzen
tos e que as plantas com flores brancas sempre tinham
-
tegumentos brancos. Ele especulou que a cor da flor e
- a cor do tegumento eram determinadas pelo mesmo
mecanismo gen ético, e ele estava certo. O pigmento
antocianina é produzido pelas plantas com flores roxas
e tegumentos cinzentos, mas a mutação elimina a pro-
dução de antocianina nas plantas com flores brancas e
tegumentos brancos.
Quantificação dos resultados Cada vez que Mendel fez
um cruzamento controlado, ele contou atentamente o
n ú mero de plantas de cada fen ótipo na prole Esse ato .
—
aparentemente simples hoje padrão na coleta de dados
—
científicos foi revolucioná rio na época de Mendel. Ao
seguiu analisá - los facilmente para revelar padrões como
a ocorrência de razões consistentes entre os fenótipos.
Essas razões foram criticamente importantes para sua
descoberta das regras pelas quais ele poderia prever a
transmissão dos alelos durante a reprodução e elas foram
a base de suas duas leis da hereditariedade .
Análise de cruzamentos repetidos, recíprocos e de teste
A caracter
ística Final que distinguiu os experimentos de
Mendel dos experimentos de seus predecessores foi a
sua repetição de cruzamentos. Em vez de simplesmente
contar os resultados de um ú nico cruzamento, Mendel
fez muitos cruzamentos repetidos, produzindo cente-
nas de plantas F , e vários milhares de plantas F, ao re -
petir o mesmo cruzamento vá rias vezes.
30 Análise gen é tica: uma abordagem integrada
Mendel também realizou cruzamentos recípro-
cos, nos quais os mesmos genótipos são cruzados, mas
os sexos dos pais doadores são trocados. A planta que
fornece o óvulo no primeiro cruzamento é usada como
fonte de pólen no cruzamento recíproco. Um exemplo de
cruzamento recíproco é exibido na Figura 2.5a, onde o
pólen da cepa que produz ervilhas amarelas (G- ) é usado
para fertilizar os ovos das plantas de uma cepa que pro-
duz ervilhas verdes (#-). O cruzamento reciproco é feito
usando pólen de uma planta que produz ervilhas verdes
para fertilizar os óvulos da planta que produz ervilhas
amarelas. Repare que esses cruzamentos recíprocos pro-
duzem F( com ervilhas amarelas. Discutimos a importân-
cia desse resultado na pr óxima seção.
Finalmente, Mendel realizou cruzamentos- teste
. Aqui, R e r representam alelos do gene ru-
(Figura 2.5 b )
goso. Examinamos os resultados e a importância desse
tipo de cruzamento genético controlado a seguir.
Observação genética Os experimentos de Mendel sobre
hereditariedade introduziram o uso dos cruzamentos contro-
lados;o uso de cepas parentais de linhagem pura; a seleção de
traços dicotómicos; a quantificação cuidadosa dos resultados
dos cruzamentos e a realização de cruzamentos repetidos, re-
cíprocos e de teste como elementos centrais de uma concep -
ção experimental cuidadosa.
( a ) Cruzamentos recíprocos
Pólen de Ovo de Pólen de Ovo de
linhagem pura linhagem pura linhagem pura linhagem pura
p
u 1
x ç p y* x de ervilha amarela com plantas de linhagem pura pro-
GGJ I99
* “
99“|
V / s x
FertiKzaiçáo ruzada artificial Fertiliizaçã ruza a artificial
F, ^W F, ^w ^
Gg
Cruzamentos recíprocos entre pais de
linhagem pura produzem resultados •dénttcos
(b) Cruzamento teste
Genótipo
desconhecido Linhagem pura
R - \ /
rr
FertikzaçdcKruzacJa artificial
A razão de 1:1 entre dominantes e recessivos é esperada
se a semente lisa for heterozgota (rtr); toda a prole é
dominante se a semente lisa for homozigota {RR ).
F guri 2 3 Cruzamentos recíprocos e cruzamentos-
-teste. (a ) Dois cruzamentos recíprocos entre diferentes pais
de linhagem pura amarela (GG) e verde (gg) produzem plantas
F, com sementes amarelas (Gg). (b) Um cruzamento-teste é
feito entre uma F , com o fenótipo dominante sob suspeita de
ser heterozigota (conforme indicado pelo R-) e uma planta de
linhagem pura (rr) com o fenótipo recessiva Ver na Seção 2.2 a
definição desses termos.
2.2 Os cruzamentos monoíbridos
revelam a segregação dos alelos
Na época de Mendel os experimentos genéticos em
geral não seguiam o método científico moderno e os es-
tudos de hereditariedade não costumavam quantificar os
resultados dos cruzamentos. Mendel deve seu sucesso na
proposição das leis da hereditariedade a seu uso do mé-
todo cientí fico e à abordagem quantitativa que ele trouxe
para a análise dos seus cruzamentos. Mendel executou
cuidadosamente os experimentos e sua análise igualmente
precisa refutou a teoria da hereditariedade por combina-
ção e produziu uma nova teoria da hereditariedade.
Identificando traços dominantes e recessivos
Nesta seção, ilustramos os resultados e a interpreta-
ção dos cruzamentos de Mendel estudando a transmissão
de dois dos traços de Mendel, a cor da ervilha (amarela
ou verde) e, cm cruzamentos separados, a transmissão do
formato da ervilha (Usa ou rugosa). ( )s resultados e inter-
pretações que descrevemos aplicam- se igualmente bem
aos cinco outros traços que Mendel examinou. A unifor -
midade dos resultados experimentais e as interpretações
devem- se à decisão de Mendel de realizar os experimen-
tos em cada traço da mesma maneira. Ele começou os
experimentos hereditários em cada traço fazendo uma
fertilização cruzada artificial de plantas parentais de li-
nhagem pura para produzir uma geração F , e depois rea-
lizou uma autofertilizaçào ou promoveu intereruzamen-
tos entre as plantas para produzir a geração F2.
Cruzando plantas de linhagem pura produtoras
dutoras de ervilha verde em cruzamentos repetidos ou
|CG
recíprocos, por exemplo, Mendel constatou de maneira
consistente que todas as plantas da geração F , produ-
ziram ervilhas amarelas e nenhuma produziu ervilhas
verdes (Figura 2.6 ). Mendel identificou a cor amarela
como o fenótipo dominante baseado em sua presença
na geração Tl e identificou a cor verde como o fenó-
tipo recessivo, j á que não é vista entre a prole de F..
F.m seguida, Mendel cruzou plantas amarelas de F , para
produzir a geração F2 e observou o ressurgimento do fe-
nótipo recessivo verde. Dentre as F2, Mendel constatou
que aproximadamente trés quartos (75%) das ervilhas
eram amarelas e o um quarto restante (25%) era verde.
A razão amarelo : verde na geração F, é * : ~ ou aproxi-
madamente 3:1. Mendel fez observações similares em
seus experimentos que testaram a herança do formato
da ervilha. Cruzamentos repetidos e recíprocos de plan-
tas de linhagem pura produtoras de ervilhas lisas com
plantas dc linhagem pura produtoras dc ervilhas ru-
gotas produziram plantas F , portando exclusiva mente
ervilhas lisas. Esse resultado identifica o formato liso
como o fenótipo dominante e o formato rugoso como
o fenótipo recessivo. Seu cruzamento Ft produziu ervi-
lhas F. na razão de 75% lisas para 25% rugosas —
mais
uma vez, uma razão aproximada de 3:1.
 Capítulo 2 Transmissão genética 31

Pura Pura Evidência da herança particulada e rejeição

GG 99
da teoria da hereditariedade por combinação
P . x V
\ / Pas hoTozigotDs Os resultados experimentais de obtidos por
Fo rma ão
dojjameta contribuem com apenas Mendel rejeitam a teoria da hereditariedade por com -
^ G 9
Y
um alelo do gene.
binação. Espcciflcamcntc, a observação de que toda a
prole de tem o mesmo fenótipo {isto é, o fen ótipo
Fertilização dominante) que é indistingu ível do fenótipo de um dos
1 pais de linhagem pura contradiz a previsã o da teoria da
Gg Os heierozigotos F , exibem hereditariedade por combinação de que Ft exibiria uma
o fenótipo dominante visto mistura de fen ótipos parentais. A persist ê ncia do fen ó-
I em dos país. tipo dominante e o ressurgimento do fenótipo recessivo
Formação do gameta
e autofeftilização na geraçã o F . também vão contra as previsões da teoria
da hereditariedade por combinação.
I l
Fi \g No entanto, tendo rejeitado a teoria da heredita -
GG Gg riedade por combinação, Mendel propôs uma nova
-* JG c A segrega ção dos alelos do
Gg heterozigoto produz hipótese de hereditariedade. Tirando proveito da supe-
Gf
gametas contendo G e rioridade anal ítica de sua abordagem quantitativa para
99 gametas contendo g em a análise de dados, Mendel propôs que cada traço é
c qual frequência.
determinado por duas “ part ículas de hereditariedade”.
Quadrado de Punnett Mendel usou a palavra alemã eiemeníen, um termo
Razão genoc pica Razã o fenotlpica União aleatória dos gametas que significa " unidade ou elemento", para descrever as
para formar a geração F, duas unidades discretas da informação hereditá ria de
Homozigoto
Heterozigoto
Heterozigoto
JGG
\Gg.
—
\ Gg J amarelo produz uma razão
genotipica 12:1 e uma
razão fenotfc*ca 3:1.
cada traço. Essa ideia é a base da teoria mendeliana da
herança particulada , que propõe que cada planta car -
Homozigoto 199)“1verde rega duas partículas de hereditariedade para cada traço.
Figura 2.6 Sagrega ção dos aklos para cor da Uma planta recebe uma unidade de hereditariedade no
semente. No cruzamento entre plantas parentais de ovo e a segunda unidade no pólen. Cada planta parental
linhagem pura com sementes amarelas e sementes verdes, a passa adiante uma de suas duas part ículas para a prole
prole F 5 exibe o fenótipo dominante da cor amarela . Repare durante a reprodução.
que a razão fenotípica 3:1 e a razão genotipica 1:2:1, exibidas As partículas hereditá rias que são passadas de uma
na geração Fj, resultam do cruzamento de F ,. geração para a próxima chamam-se alelos na terminologia
moderna. Esse termo não foi inventado na época de Men-
Com a tabulação dos resultados ao longo de vá rias del ( nem o termo gene, falando no assunto), mas ele supôs
safras para todos os sete traços, Mendel contou mais corretamente que dois demente (alelos) estavam presentes
de 20 mil ervilhas F 2 ou plantas. A Tabela 2.1 mostra para cada traço em uma planta e que, juntos, determina -
os resultados de Mendel, revelando três características vam o fenótipo do traço. Mendel usou letras como símbo-
consistentes: ( 1 ) domin â ncia de um fen ótipo sobre o los para representar os alelos de cada traço e propôs um
outro na geração F| ( 2 ) ressurgimento do fenótipo re-
f padrão de transmissão de alelos dos pais para a prole o qual
cessivo na gera çã o F 2 e (3) uma razão de aproximada
mente 3:1 (dominante : recessivo ) entre os fenótipos
- explicava essas observações fenotlpicas nas gerações F, e
Fr Mendel propôs que as linhagens derivadas de linhagem
l 2. Mendel determinou que a cor amarela é dominante
*
pura contém duas cópias idênticas do mesmo alelo.
em relação à cor verde e que o formato liso é domi - Os organismos de linhagem pura têm um genó -
nante em relação ao rugoso com base nos resultados tipo homozigoto , um termo que significa que os dois
.
da gera ção F, A cor verde e o formato rugoso da er
vilha reaparecem na geração F;, que exibe uma razão
- alelos ( isto é, as duas có pias do gene) portados por um
organismo sã o idênticos. Se uma planta homozigota
coerente de 3:1 entre os fenótipos dominantes e reces - for autofertilizada ou se dois organismos de linhagem
sivos. Por exemplo, Mendel classificou 8.023 ervilhas
F , pela sua cor e 6.324 ervilhas F , pelo seu formato.
pura para o mesmo traço forem cruzados, a prole re
cebe alelos idênticos de cada pai e tem o mesmo ge
--
Dentre as ervilhas F, classificadas pela cor, ele encon - nótipo homozigoto dos pais, além do mesmo genótipo
homozigoto entre si. Por outro lado, se for feito um
trou 6.022 sementes amarelas e 2.001 sementes verdes,
uma razão quase exatamente de 3:1. Das sementes de cruzamento genético entre pais de linhagem pura com
F; classificadas quanto ao formato da ervilha, 5.474 traços diferentes, cada pai é homozigoto para um alelo
eram lisas e 1.850 eram rugosas, mais urna vez em uma diferente. A prole recebe um alelo diferente de cada pai
razão de praticamente 3:1. Os dados de cada uma das
outras cinco caracter ísticas revelaram a mesma razão
e tem um genótipo heterozigoto, um termo que signi
fica que dois alelos diferentes compõem o genótipo. Os
-
de 3:1 dos fenótipos dominantes em relação aos reces - organismos heterozigotos podem ter um fenótipo do -
sivos na geração F2. minante se carregarem uma cópia do alelo dominante.
32 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Tabela 2.1 Observaçóes de Mendel para os sete traços monofbridos nas gerações F , e FJ
Cruzamentos entre fenótipos
Fenótipo F,
parentais de linhagem pura
Sementes lisas x rugosas® Todas as sementes lisas
Sementes amarelas x verdes (cor Todas as sementes amarelas
interna da semente)
Rores roxas x brancas*{tegumento Todas as flores roxas
cinzento x branco ou cor externa da (tegumento cinzento)
semente)
Rores axiais x terminais Todas as flores axiais
Vagens verdes x amarelas Todas as vagens verdes
Vagens lisas x rugosas Todas as vagens lisas
Plantas altas x baixas Todas as plantas altas
TOTAL
•O fenótipo dominante é escrito primeiro e sempre aparece como fenótipo F,.
.
*Um ú nico gene controla a cor da flor e a cor do tegumento Mendel discutiu os dois traços, mas reconheceu que eram controlados pe4o mesmo gene.
Hoje os geneticistas sabem que a herança dos sete tra -
ços que Mendel descreveu é controlada por pares de alelos
dos sete genes diferentes. Desse modo, embora Mendel
nào utilizasse as palavras gene ou alelo, ele compreendeu o
conceito incorporado por cada termo. Os geneticistas con -
tempor âneos descrevem a heran ça dos traços de Mendel
em termos de genes e alelos e continuam a usar letras para
representar os alelos. Diferentes esquemas notacionais e
convenções para a atribuição de nomes têm sido adotados
para diferentes espécies. ( Uma tabela descrevendo a no-
menclatura dos genes e outras informações sobre genes e
genomas de organismos que servem como modelo gené
tico está localizada nas páginas finais.)
Fundamental para compreender a herança dos sete
traços que Mendel estudou é o conceito de que os orga -
nismos de linhagem pura têm genótipos homozigotos.
Na Figura 2.6, por exemplo, o parental de linhagem pura
amarela tem o gen ó tipo homozigoto GG e o parental de
linhagem pura verde tem o gen ótipo homozigoto gg . Os
cruzamentos de parentais de linhagem pura com genóti -
pos homozigotos diferentes produzem prole F heterozi , -
gota ( Gg) em que todos têm o fenótipo dominante da cor
amarela. De acordo com a hipótese de Mendel, cada pa
rental de linhagem pura passa um alelo para a F;, tornan-
do-a heterozigota. Um alelo, G nesse caso, é dominante e
produz o fenótipo dominante em toda a F,.
A F, heterozigota é cruzada entre si ou autofertilizada
em um cruzamento monoí brido, um termo que se refere
a um cruzamento entre dois organismos que têm o mesmo
gen ótipo heterozigoto para um gene. Com um alelo domi -
nante e um recessivo no genótipo heterozigoto das plantas
submetidas a um cruzamento monoíbrido, prevê se uma
razão fenotipica 3:1 para a Fr Ao mesmo tempo, prevé-se
que os organismos F2 tenham três genótipos: os dois ge-
nótipos homozigotos (os mesmos presentes nos pais ori-
ginais de linhagem pura) devem ocorrer em um quarto da
prole F2 e o genótipo heterozigoto deve ocorrer na metade
Fen ótipos F , Razã o dos
Dominante Recessivo fen ótipos F 2
5.474 lisas 1.850 rugosas 2,96:1
6.022 amarelas 2.001 verdes 3,01:1
705 roxas 224 brancas 3,15:1
651 axiais 207 terminais 3,14:1
428 verdes 152 amarelas 2,82:1
882 lisas 299 rugosas 2,95:1
787 altas 277 baixas 2,84:1
14.949 5.010 2,98:1
restante da prole Fr Portanto, entre a prevé-se uma
razã o genotípka 1:2:1. Um quarto dos integrantes da F;
que são homozigotos GG mais a metade da prole F2 que
consiste em heterozigotos Gg sâo os trés quartos da Fv com
o fenótipo dominante (amardo). O um quarto restante da
F , contém o genótipo homozigoto gg e tem o fenótipo re-
cessivo ( verde). O mesmo padrào de herança ocorre para
todos os outros traços estudados por Mendel.
Segregação dos alelos
A Figura 2.6 usa letras como símbolos para repre-
- sentar os alelos e os genó tipos nos organismos parentais,
,
F » e F , e introduz uma ferramenta simples e funcional
—
de análise genética o quadrado de PunnctL O método
do quadrado de Punnett para diagramar o conteúdo
genético dos gametas e sua união para formar prole foi
batizado em homenagem a Sir Reginald Punnett, um
famoso geneticista do início do século XX. O quadrado
de Punnett separa os dois alelos portados por cada or
ganismo reprodutor, colocando os de um pai ao longo
-
da margem vertical do quadrado e os do outro pai ao
longo da margem horizontal. Esses alelos separados re-
- presentam os gametas dos organismos reprodutores, o
espermatozóide e o ovo, cada um deles portando ape-
nas uma cópia de cada gene. Os quadrados no corpo do
diagrama de Punnett mostram os resultados esperados
da união aleat ória dos gametas, identificando o genótipo
da prole produzida por cada combinação possível de ga -
metas parentais. Na Figura 2.6, os gametas dos pais F,
são colocados nas margens do quadrado de Punnett e a
união dos gametas produz a geração F2 nas proporções
genot í picas exibidas no corpo do quadrado de Punnett.
Mendel usou o conceito de herança particulada
para analisar seus experimentos e formular uma hipó-
tese para explicar seus resultados. A primeira hipó tese de
Mendel é conhecida como a lei da segregação, també m
chamada às vezes de primeira lei de Mendel. Essa hipó-
 Capítulo 2 Transmissão genética 33

tese descreve a natureza particulada da herança, identi

fica a segregação (separação) dos alelos durante a forma
-
-
Pura
RR
Pura
rr
çã o dos gametas e propõe a união aleatória dos gametas « ©
para produzir prole em proporções previsíveis:
Fertilização cruzada
Lei da segrega ção Os dois o/e/os para cada traço vão se separar Cruzamento-teste da
( segregar) um do outro durante a formação do gameta e codaalelo Heterozigota Pura pLinta h dominante para
Rr rr
terá uma probabilidade iquai de inclusão ( 1/2) em um gameta. A uma planta recessiva
união aleatória dos gametas na fertilização vai unir um gameta para determinar se a F, é
i i hetef 07iqota
,

de cada parental para produzir prole em proporções determinadas

Fertilização do cruzamento teste
pelo ocaso. I
A lei da segregação se aplica a cada um dos sete traços f 1
examinados por Mendel e cada experimento produz re- Fa h
sultados similares. Podemos pegar a cor da flor como um
exemplo e usar a lei da segregação para explicar os even - -\ + R
Rr Rr
Se a planta da geração F
.
for heterozigota a razão
,
tos exibidos na Figura 2.4, do cruzamento parental até a rr rr dos gametas será 1:1
produção de prole Fr l odos os gametas formados pelos U }r
parentais de linhagem pura roxa ( PP) contém P. De modo
Quadrado de Punnett
similar, todos os gametas de parentais de linhagem pura
branca ( pp) contêm p. Todos os integrantes da Ft têm o No experimento de euzamen:o-teste
fenótipo dominante roxo e um genótipo heterozigoto ( Pp ) . .
de Mendel ée constatou 193 sementes
lisas e 192 sementes rugosas na prole do
A segregação dos alelos é mais ladlmente visualizada entre cruzamento-teste uma razão 1.01:1 .
os gametas produzidos pelas plantas Fl heterozigotas: me-
Figura 2.7 Análise do cruzamento-teste das plantas
tade dos gametas dessas plantas deve conter P e metade .
da geração F , Um cruzamento- teste entre uma planta da
deve conter p. A união aleatória dos gametas das plantas geração F, e uma planta homozigota recessiva produz prole
F, heterozigotas leva às combinações e frequências exibi - com uma razão 1:1 do fenótipo dominante para o recessivo
das no quadrado de Punnett da Figura 2.6, levando a uma se a planta da F , for heterozigota.
razão genotípica 1:2:1 e a uma razão fenotí pica 3:1.

Observa ção gen é tica A lei da segregação de Mendel

prevê uma razão fcnotipica 3:1 entre a prole F } das plantas he
terozigotas F,. Mendel reconheceu que uma razão genot í pica
1:2:1 sustenta a razão fenotípica F supondo corretamente
^
que os alelos segregam durante a formação dos gametas e
unem- se aleatoriamente para produzir zigotos.
Teste de hipótese pela análise do
cruzamento- teste
Mendel propôs a lei da segregação para explicar as
proporções fenotípicas que observou nas gerações Ft e F2
dos seus experimentos de cruzamento. Coerente com seu
método científico, ele considerou a lei da segregação uma
hipótese que fazia previsões testáveis sobre prole cruzada.
A proposta de Mendel de que a prole F , consiste em he
terozigotos é fundamental para a proposta de que os ga
metas que produzem a prole F2 terão a mesma chance de
conter um ou outro dos alelos. Com base em sua hipótese
de segregação, Mendel previu que a metade dos gametas
derivados da F , heterozigota portaria o alelo dominante e
que a metade restante portaria o alelo recessivo.
Para testar essa previsão, Mendel realizou a análise
do cruzamento- teste, cruzando F t suspeitas de serem he-
terozigotas com uma planta recessiva de linhagem pura
(Figura 2.7). Os cruzamentos teste, utilizados incontáveis
vezes por Mendel, são estruturalmente idênticos aos em
pregados em análise genética. Com base na hipótese de
segregação, Mendel previu que os fenótipos da prole do
-
cruzamento teste seriam 50% dominantes e 50% recessi
vos. O cruzamento teste diagramado na Figura 2.7 é feito
-
entre uma planta cultivada a partir de uma semente F, lisa
e uma planta de semente rugosa de linhagem pura. Nesse
teste, a planta de semente rugosa é homozigota rr e pro-
duz apenas gametas contendo r. Portanto, se a planta F ,
for heterozigota, o cruzamento deve produzir gametas R
e r em uma frequência de Vi cada. Consequentemente, a
prole do cruzamento seria j /?re ‘ rr, resultando em uma
razão 1:1 de lisa : rugosa. Como a figura indica, Mendel
fez esse cruzamento e observou 193 ervilhas lisas e 192
ervilhas rugosas na prole do cruzamento-teste, Mendel
fez esse tipo de aná lise do cruzamento- teste para vá rios
de seus traços e observou de modo consistente uma razào
-
1:1 na prole do cruzamento teste (Tabela 2.2).
Os resultados do cruzamento - teste de Mendel va -
- lidam dois componentes de sua hipótese de segregação.
- Primeiro, os resultados mostram que as plantas da gera -
ção F, com fenótipo dominante têm um gen ótipo hetero-
zigoto. Segundo, os resultados validam a proposta de que
o acaso determina a frequência dos gamelas contendo
cada alelo. Se Mendel estivesse errado a respeito do ge-
nótipo heterozigoto da F , ou se estivesse errado a respeito
do papel do acaso na produção da frequência dos alelos
nos gametas, o resultado do cruzamento-teste seria dife-
rente. Se a planta de semente lisa fosse homozigota RR cm
vez de Rr, toda a prole do cruzamento teria um genótipo
- Rr c produziria ervilhas lisas. Se a localização dos alelos
nos gametas nào fosse aleatória, os fenótipos da prole do
cruzamento- teste não exibiriam uma razão 1:1.
34 Aná lise gen é tica: uma abordagem integrada

Pura Pura
Tabela 2.2 Resultados do cruzamento-teste dos RR rr
experimentos de Mendel
x
Cruzamento-teste Prole do cruzamento-teste Razão \ /
Dominante Recessivo
Fértil
Ilação cryizada
Semente lisa (Rr) x 193 lisas ( Rr ) 192 rugosas 1 ,01 :1 Heterozlgota
semente rugosa (rr) ( rr ) Rr
Semente amarela 1% amarelas 189 verdes 1 ,04:1 F,
(Gg ) x semente ( Gg ) (99 > I
Autofertilizaçáo
verde (gg)
Ror roxa [ Pp ) x flor 85 roxas { Pp ) 81 brancas 1 ,05:1
i
RR Rr Rr rr
branca (pp) (PP) Cada ervilha resulta
Plantas altas ( ff ) x 87 altas ( Tf ) 79 baixas ( ff ) 1 ,10:1 de um evento de
plantas baixas (ff ) fertfcaçáo diferente

TOTAL 561 541 1 ,04:1

Observa çã o gen é tica A aná lise do cruzamento-teste

feita por Mendel mostrou que as plantas da gerarão F . sáo he -
terozigotas . Essa constatação apoia a hipótese de que os ale-
los segregam quando a geração F , forma os gametas.
Teste de hipótese pela autofertilizaçáo de F2
Um segundo componente fundamental da hipó-
tese de segregação de Mendel diz respeito aos genó-
.
tipos da prole de F2 Especificamente, a hipótese de
Mendel prevê que as plantas da geraçã o F 2 com fenó -
tipo dominante podem ser tanto homozigotas como
heterozigotas. Sua hipótese ainda prevê que as plantas
são duas vezes mais propensas a ser heterozigotas do
que homozigotas. Examine a Figura 2.6, por exemplo,
e repare que a metade da prole de F 2 consiste em plan
tas heterozigotas, enquanto um quarto da prole de F2
consiste em plantas homozigotas para o alelo domi
.
nante Desse modo, entre as plantas da geração F, com
fenó tipo dominante ( isto é, excluindo as plantas da ge-
raçã o F2 com fenó tipo recessivo ) , dois terços das plan -
tas sã o heterozigotos e um terço é homozigoto para o
alelo dominante.
Mendel usou um experimento de autofertiliza
ção para testar a validade de sua proposta de que os
heterozigotos e homozigotos ocorrem em uma raz ão
2:1 entre as plantas dominantes da ¥ , ( Figura 2.8). Ele
argumentou que as plantas da F2 autofertilizadas po-
deriam ser identificadas como homozigotas se produ -
zissem apenas prole com o mesmo fen ótipo. Por outro
lado, a autofertiliza çáo das plantas heterozigotas da F >
produziria alguma prole com o fenó tipo dominante e
um n ú mero menor com o fenótipo recessivo, em uma
razão 3:1.
Mendel testou sua hipótese de segregação pela
autofertilizaçáo das plantas da geraçã o F 2 do fenótipo
dominante, examinando a prole de cada uma dessas
autofertilizaçòes para determinar se exibiam apenas o
fenótipo dominante ou ambos os fenótipos. Os resulta
Autofertilizaçáo Autofertilizaçáo Autofertilizaçáo
. I J
T i
F.v Todas as Razão de 3:1 de ervilhas Todas as
ervilhas lisas lisas para rugosas ervilhas rugosas
fcntre as ptontas da gera ção F? com fenótipo
dominante, \ teve prde F , apenas com o
fenótipo dominante e * tiveram fenótipos
dominantes e recess vos. .
F igura 2.8 Determinação do genótipo das plantas
da geração F , pela produção da prole FJ . As plantas
- da geraçã o F . são autofertilizadas e suas sementes sáo
classificadas. Entre as plantas F, dominantes ( ervilha lisa ),
- aproximadamente um terço deve ser homozigoto para o alelo
dominante ( RR), essas plantas produzem uma prole que tem
apenas ervilhas lisas. Os dois terços restantes da F . dominante
devem ser heterozigotos e produzir ervilhas tanto lisas como
rugosas na prole . Todas as ervilhas rugosas da geraçã o F 3
são homozigotas recessivas (rr) e produzem apenas ervilhas
rugosas na prole.
-
dos de seus sete experimentos de autofertilizaçáo da F ,
dominante são exibidos na Tabela 2.3. A maior amostra
de Mendel foi relativa ao formato da semente; ele au-
tofertilizou 565 plantas de semente lisa da Fr F.m seu
experimento, ele constatou que 193 das plantas (34,2%)
produziram apenas ervilhas lisas na prole, demons-
trando que essas plantas sáo homozigotas para o alelo
dominante ( RR ). A autofertilizaçáo das outras 372 plan
tas produtoras de sementes lisas da geração F2 (65,8%)
-
produziu sementes lisas e rugosas nas plantas da prole.
A razã o 372:193 é muito próxima da razã o 2:1 dos ge-
nótipos hclerozigoto e homozigoto que Mendel previu
que constituiriam as plantas dominantes produtoras de
- sementes lisas da geração F2.
 Capítulo 2 Transmissão genética 35

T abeia 2.3 Resultados dos experimentos de Mendel para identificar os genótipos das plantas F } através de sua prole Fâ

Traço* ,
Plantas F heterozigotas* Plantas F3 homozigotas' Razã o11

Formato da semente 372 193 1.93:1

Cor da semente 353 166 2,13:1
Cor da flor 64 36 1,78:1

Formato da vagem 71 29 2,45:1

Cor da vagem 125 75 1 ,67:1

Posição da flor 67 33 2,03:1
Altura da planta 72 28 2,57:1
TOTAL 1.124 560 2,01:1
* Mendel autofertlllrou « penas « ptantas f } com o fenòttpo dom nante n*sse experimento
*
.
* As plantas F eram hrtaronfotas se a prole F, que produiiram pela autofert l laçio tinha ambos os fendtipos dominante e recessivo.
}

* As plantas ft e^am heterculgotas se a prole F que procunram pHa autnfprtili /açJJo tinha apenas o frnotipo dominante .
(

4 A raiSo prevista de plantas F} heteroz otas para homongotas foi da 2,001.

^

Os resultados da autofertilização de Mendel exibem
de modo consistente uma razão 2:1 entre as plantas F2 do-
minantes para cada um dos sete traços examinados. Esses
resultados validam a proposta de que os gametas se unem
aleatoriamente para produzir prole. Juntos, os experimen -
tos de cruzamento- teste e as experimentos de autofertili
zação da F, dominante representam experimentos inde-
pendentes concebidos e executados com êxito para testar
os componentes da hipótese de segregação de Mendel
Nesses testes, ele fez previsões sobre os resultados experi
mentais e depois verificou os resultados contando a prole
produzida. Os dados resultantes sustentaram sua hipótese
de segregação e ilustram como Mendel antecipou as mé-
todos científicos modernos usando abordagens que não
seriam aplicadas de modo consistente aos experimentos
genéticos por várias décadas (Análise genética 2.1).
Observa ção gen ética A autofertilização das plantas F 2
portadoras de fenótipo dominante valida a proposta de que
sua razão de heterozí gotas para homozigotas é 2:1 e apoia a
sugestão de que os gametas se unem aleatoriamente para
produzir prole.
ou mais tra ços simultaneamente? Existe um padrão ou
razão de fen ótipos que permitiu a Mendel propor um
mecanismo de transmissã o quando dois ou mais genes
sâo examinados ao mesmo tempo?
- Análise de cruzamento diibrido de dois
genes
Para testar a transmissão simultânea dos dois tra -
- ços na planta de ervilha , Mendel realizou uma série de
cruzamentos diíbridos, cruzamentos entre organismos
que diferem quanto a dois traços. Esses testes seguiram
uma estratégia experimental que acompanhou sua in-
vestiga ção da segrega ção alélica de traços individuais.
Como ilustra a Figura 2.9, Mendel começou cada
cruzamento diibrido com linhagens puras. Tendo de -
terminado, por exemplo, que a ervilha de formato liso
é dominante em relação ao formato rugoso e que a
ervilha de cor amarela é dominante em relaçã o à cor
.
Lisa amarela Verde, rugosa
pura pura
RRGG rrçg

2.3 Cruzamentos diíbridos e

' V\ x /
Formarão do ameta
triíbridos revelam a segregação
independente dos alelos
Cada um dos sete traços investigados por Men -
RG rg
Y ^
Fertilização cruzada
del exibiu o mesmo padrão de transmissão hereditária i
RrGg
explicado pela lei da segregação. A uniformidade das
proporções fenot ípicas nas proles Ft e F2, cruzamento-
teste e autofertilização sugere que o mesmo mecanismo Figura 2.9 Análise dê cruzamento diibrido. As plantas
é responsá vel pela segregaçã o alélica em cada um dos parentais que são de linhagem pura para dois traços sofrem
traços selecionados; mas, e no caso da herança de dois fertilização cruzada para produzir prole F. di íbrida e exibir os
dois fenótipos dominantes: semente lisa e amarela.
36 Análise gen é tica: uma abordagem integrada

ANÁ LISE GEN ÉTICA

A presença de pelos curtos nas folhas das plantas do tomate
Cruzamento Número da prole
é um traço dominante controlado pelo alek> H . O traço reces
sivo correspondente, folha lisa, é encontrado nas plantas com Folha peluda Folha lisa
o genótipo hh. A tabela à direita mostra a prole de três cruza-
mentos independentes de plantas parentais com genótipos e 1 32 11
fenótipos desconhecidos.
2 42 45
Examine as distribuições dos fenótipos na prole de cada cruza-
mento e determine os genótipos parentais de cada cruzamento. 3 0 24
Use um quadrado de Punnett para diagramar o Cruzamento 1.

Estraté gias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
1. Identifique o tópico abordado por esse pro- 1. 0 problema apresenta os fenótipos de formato da folha da prole pro-
blema e explique a natureza da resposta soli- duzida por trê s cruzamentos diferentes de plantas parentais com ge-
citada. nótipos e fenótipos desconhecidos. A resposta precisa identificar os
genótipos e fenótipos parentais de cada cruzamento e usar um qua-
drado de Punnett para diagramar o Cruzamento 1.

2. Identifique as informações criticas fornecidas 2. A informaçã o fornecida por cada cruzamento é o nú mero de integran-
no problema. tes da prole com folhas peludas (dominante) e lisas (recessivo). A inter-
pretação da razáo do fenótipo da prole é necessária para determinar
IK 0 nurwro ct nt gram« os genótipos e fenótipos parentais.
* *
da prole com cada ftnótipo pode
Deduzir aprvstntado corro u-na razão. AftMAÍMLHA: 0» axpenman -
lo genético produzem quantda-
* *
de finta de prole, entío 0« fcnó-
3. Examine a prole do Cruzamento 1 e determine 3. Razão dos fenótipos na prole do Cruzamento 1: * *
a razão aproximada dos fenótipos dessa prole.
tipo
* podem vanar em reiaçlo is
nuàes prevista . Mo espere obter
-
- 2,91:1 *
luões precisas ros dados reais

" ^
E uma razáo aproximada de 3:1.0 fenótipo recessivo aparece em apro
J
ximadamente da prole j |
e os restantes possuem o fenótipo
dominante.
4. Examine a prole do Cruzamento 2 e determine 4. Razáo dos fenótipos na prole do Cruzamento 2:
a razão aproximada dos fenótipos dessa prole.
— = 0, 93 : 1
45
E uma razão aproximada de 1:1, na qual o fenótipo dominante é visto
em aproxímadamente metade da prole e o fenótipo recessivo é
visto na outra metade da prole

5. Examine a prole do Cruzamento 3 e determine
a razáo aproximada dos fenótipos dessa prole.
Solucionar
6. Com base nos resultados do Cruzamento 1,
Identifique os genótipos e fenótipos das plan-
h tas parentais no cruzamento. Construa um qua-
drado de Punnett para ilustrar esse cruzamento.
.
DICA. Existrn dois aiecn para nsegroe etfèsgmócjposski pontais. 0
fenótipo rccenvo i encontrado em plante com o genótipo hh, enquante
*
o fenótipo dominante será encontrado nas piartas que são Hh e HH.
5. O Cruzamento 3 produziu apenas o fenótipo recessivo, então a razáo
é fcl .
6. A prole recessiva nesse cruzamento tem o genótipo hh, então cada pai
no Cruzamento 1 precisa carregar uma cópia de h.
A prole dominante é HH ou Hh. A razão fenotípica 3:1 da
prole é coerente com um cruzamento parental Hh x Hh. H
O quadrado de Punnett para esse cruzamento é coe- h
rente com a razáo observada de 3:1.

7. Com base nos resultados do Cruzamento 2, 7. As duas plantas parentais no Cruzamento 2 carregam pelo menos
identifique os genótipos e fenótipos parentais. uma cópia de h. A razáo de 1:1 da prole é coerente com a razáo pre-
vista para um cruzamento-teste de um organismo heterozigoto para
um homozigoto recessivo. Esse cruzamento é Hh x hh.

6. Com base nos resultados do Cruzamento 3, 8. O Cruzamento 3 produz apenas prole hh . Isso é o previsto para um
identifique os genótipos e fenótipos parentais. cruzamento de linhagem pura entre dois organismos homozigotos.
Esse cruzamento é hh x hh.

Para praticar mals, ver Problemas 10, 14 e 29 .

 Capítulo 2 Transmissão genética 37

verde, Mendel propôs que as plantas de linhagem pura Quadrado de Punnett Resumo
que produzem ervilhas lisas e amarelas tém o genótipo \RG \ Rg \ r<3 \ rq Genótipos Fenótipos
RRGG e que as plantas de linhagem pura para os fe - i*G 4 RRGG 4*#Gg 4 *rGG 4 ** * # RGG = á
*
-
16
-<*-
#
nótipos recessivos rugoso e verde tèm o genótipo rrgg. *rGG = <fe
Os gamelas produzidos pela planta de semente lisa e c c G
amarela contêm um alelo para cada tipo de gene e são
RrGg = ft
RG . Por outro lado, os gametas da planta de semente kRR99 4 RrCg 4 Rr99

rugosa e verde sào rg. O modelo de Mendel prevê que c

«rw à - 16

toda a prole terá , portanto, o genótipo diíbrido RrGg.

Essas Fj são heterozigotas para dois traços e exibem os
fenótipos parentais dominantes: liso e amarelo.
Os diíbrí dos heterozigotos da geração F , ( RrGg )
receberam alelos R e G d a planta parental de linhagem
irG 4 RrCC, 4 RrCg 4 rrGG 4 ^9
C
"
<y
rrGG
rrGg
- b
ã.
16
rrC

<y
-

pura com ervilha amarela e lisa e alelos r e g da planta

parental de linhagem pura com ervilha rugosa e verde. Se
irg h *rGg 4 R*99 4 nCg 4 ” 99 ” 99 = 4 k " 99 ID

a segregação dos alelos para cada tipo de gene for inde -

pendente , os gametas produzidos por essas plantas Fj são
e <0
igualmente propensos a conter qualquer combina ção de Figura 2.11 Segregação independente dos alelos em dois
um alelo para a forma da semente e um alelo para a cor l òcus. A autofertlllzaçãoou cruzamento entre os integrantes da
da semente. As probabilidades de cada combinação de geração F, diibrida (RrGg) produz nove genótipos distribu ídos
alelos para cada tipo de gene sào previstas pelo reconhe- em uma razão fènotí pica 9*33:1 entre a prole Fr
cimento de que quatro combinações de alelos serão en -
— —
contradas nos gametas RG, Rg, rG e rg e de que cada os fenótipos recessivos. Os fenótipos de ? , aparecem na
combinação deve ocorrer com uma frequência de .
A Figura 2.10 mostra uma ferramenta diagramática
chamada diagrama de linha bifurcada , utilizada para
^ razão 77:77 :i7 A -
Examinando as proporções fenotí picas de F , pode-
mos ver a relação entre a razão 3:1 de cada traço e^a razão
determinar os genótipos e as frequências dos gametas.
9:3:3:1 quando os dois traços são considerados simulta -
O diagrama de linha bifurcada ilustra que a metade de
neamente. Quando o formato e a cor da ervilha são con-
todos os gametas produzidos por uma planta RrGg vai
siderados individualmente, os cruzamentos mono íbridos
conter Re a outra metade vai conter r. Se a segregação
de G e g for independente dos alelos R e r, então a me -
tade dos gametas contendo R também vai portar G e a
outra metade vai portar O mesmo vale para os game -
de dois diíbr« ^
produzem Fn - dominante e recessivo. O cruzamento
íâos também produz proporções de * do-
minante e 4 recessivo para cada traço, transformando a
previsão das razões fenotípicas entre os integrantes de F2
\
tas portadores de r; a metade vai portar G e a metade
para ambos os traços combinados em um problema de
restante vai portar g . A frequê ncia de cada um dos qua - aritmética combinatória. A Figura 2.11 nos lembra de que
tro genótipos dos gametas
^[ X )
2 2 = T*
Um quadrado de Punnett pode ser usado para ilus -
os genótipos que se enquadram nas classes /?- e G- ocor-
rem cada um em|da prole, enquanto as classes genotí -
trar a união aleatória desses quatro gametas diferentes picas rregg ocorrem cada uma em j da prole. Os traços
para produzir prole F 2 ( Figura 2 ,11 ). Cada gameta tem nos genótipos R- e G- sào como um "espaço em branco",
uma frequência prevista de ‘ e cada célula do quadrado que pode ser preenchido por uma segunda có pia do alelo
de Punnett tem uma frequência prevista de JI \ dominante ou uma cópia do alelo recessivo. Em qual -
quer um dos casos, o genótipo resultante por exem -—
Entre a prole F2, quatro fenótipos são observados, exi -
bindo ( 1) ambos os fenótipos dominantes, (2) o fenótipo
dominante para um traço e o fenótipo recessivo para
—
plo, RR ou Rr produz o fenótipo dominante. Portanto,
a ocorrência simultânea dos dois fenótipos dominantes
outro (existem duas versões de fenótipos) ou ( 3) ambos (liso, amarelo) deve ter uma frequência de ,
os dois fenótipos recessivos (rugoso, verde) vão ocorrer
Genótipo Frequ ência com uma frequência de ( Jj
* £ e as duas classes feno-
J C~ C <})( J ) = 1 tí picas que exibem um traço dominante e um traço re-
Heterozigoto
H
* cessivo ( liso, verde c rugoso, amarelo ) serão encontradas
RrCg ^3 i9 *9 ( W) = l
(
G Formação
dogameta
ir ^
jG
)f
^
V
( }K })

( JK
- 1
}) = J
cada uma em uma frequência de = .

dente de Mendel , também conhecida como segunda

^
Esse resultado ilustra a lei da segregação indepen-

Figura 2.10 M étodo da linha bifurcada para determinar
a frequê ncia do genótipo do gameta . O acaso é
responsável pela segregação independente dos alelos
inclu ídos nos quatro gametas geneticamente diferentes.
lei de Mendel .
Lai da segregação independente Durante a formação dos
gametas, a segregação dos alelos em um lócus é Independente
da segregação dos alelos em outro lócus.
38 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Mendel chegou às suas conclusões relativas à segre - A razão 423:133 se reduz para 3,18:1. De modo similar,
gação independente com base em vários cruzamentos para a cor da ervilha ele constatou uma razão de 416 (315
diíbridos. O cruzamento de plantas de linhagem pura
de ervilha lisa e amarela com plantas de linhagem
+ 101) amarelas para 140 ( 108 + 32) verdes —
uma razão
de 2,97:1. Considerando cada traço individualmente, o
pura de ervilha rugosa c verde foi fundamental. Após cruzamento das plantas F, heterozigotas produziu uma
cruzar os pais de linhagem pura e permitir a autofer - geração em que - da prole têm o fenótipo dominante
tilizaçào da prole F(, Mendel contou os fenótipos entre e tem o fenótipo recessivo.
|
os integrantes da prole F. e constatou que os dois fenó - Segundo, Mendel previu que, se os alelos de cada um
tipos parentais ( liso, amarelo e rugoso, verde) estavam dos lócus se unirem aleatoriamente para produzir a prole
presentes junto com fenótipos não parentais: liso, verde F2, então os fenótipos previstos para as plantas de F, ocor-
e rugoso, amarelo. Entre as plantas da F , produzidas em rerão em frequ ências previsíveis. Ele admitiu a hipótese de
seu experimento, Mendel constatou 315 plantas lisas e que a prole F exibindo os dois traços dominantes (liso e
amarelas; 108 lisas e verdes; 101 rugosas e amarelas; e
32 rugosas e verdes ( Figura 2.12 ).
amarelo) ocorrerá em uma frequê ncia de | j ] Jj
|
= De
modo similar, a prole portando os dois tráçòs recessivas
Essa observação da prole F 2 conté m duas caracte -
risticas de importância fundamental para a hipótese de
Mendel. Primeiro, os fenótipos parentais e não parentais
( rugoso e verde) deve ter uma frequência de
e cada um dos fenótipos não parentais deve ter uma fre
( j( J j
= . A segregação independente dos ale-
^-
sâo vistos em frequ ências diferentes umas das outras.
A classe mais numerosa da prole F2 exibe os fenótipos
parentais dominantes para cada traço, liso e amarelo. A
quência de
^
los nos dois genes leva, portanto, a uma distribuição pre
vista entre a prole F2 de
-
menor classe da prole F2 tem os dois fenótipos parentais
.
liso, amarelo R-G-
recessivos, rugoso e verde; e as duas classes não paren- ifi

rias
-
tais da F2 ( liso, verde e rugoso, amarelo ) são intermediá
e em quantidades aproximadamente iguais. A partir
liso, verde
rugoso, amarelo
R-gg
rrG -
16

16
desses n ú meros, Mendel reconheceu que as razões entre
as formas dominante e recessiva de cada traço acompa - rugoso, verde rrS 16
nhavam o padrão 3:1 familiar. Ao examinar o formato A contagem de Mendel de 315 lisas e amarelas; 108
da ervilha, por exemplo, Mendel constatou que 423 (315 lisas e verdes; 101 rugosas e amarelas e 32 rugosas e ver-
+ 108) plantas eram lisas e 133 (101 + 32) eram rugosas. des (ver Figura 2.12) pode ser convertida para uma razão
dividindo cada n ú mero por 32, o valor da menor classe.
A divisão por 32 reduz a razão observada de Mendel para
Heterozigoto Heterozigoto 9,84 : 3,38 ; 3,16 ; 1, que corresponde bem à razão de
RrGg RrCg 9:3:3:1 prevista pelo seu modelo. A partir desse resultado,
x Mendel admitiu a hipótese de que a segregação indepen -
I
Formação dos gametas
^ dente em um organismo d ííbrido produz quatro genóti-
pos de gameta diferentes em frequências iguais. A união
aleató ria dos gametas produz quatro classes fenotí picas
RG Rg rG rg como resultado das relações de dominância em cada

Geração F,:
Lisa, amarela
.
Autofertillzaçâo

R-G- 315 Parental

lócus, e a razão dessas classes fenot
ser 9:3:3:1 ( Anali se gen ética 2.2).
ípicas da prole F, deve

Lisa, verde R~99 108 Não parental Observa çã o gen é tica Prevé-se uma razão de 93:3:1
-
Rugosa, amarela rrG 101 Não parental
Rugosa, verde rrgg 32 Parental
entre a prole F3 de um cruzamento d ííbrido como consequê n-
cia da segrega ção independente dos alelos em dois lócus.
Razão fenotfpíca de F, por traço:
a) Lisa 315 + 108 = 423
Rugosa 101 + 32 = 133 0 experimento de cruzamento
dííbrido de Mendel produziu Testando a segregação independente pela
423 :133 = 3,18:1
uma razão 3:1 para cada traço

Verde
-
b) Amarela 315 + 101 = 416 e uma razão 9.3 3:1 para os
108 + 32 140 fenótipos combinados.
416: 140 = 2,97: 1
Razão fenot ípica de F, por traço:
análise de cruzamento-teste
Para testar sua hipótese de que as combinações de
forma e cor da ervilha sâo determinadas pela segrega ção
315 :108 : 101: 32 = 9,84 : 3,38: 3,16:1 independente dos alelos, Mendel mais uma vez recorreu
à análise do cruzamcnto- tcste. Tendo proposto que as
Figura 2.12 Propor ções fenot í picas na prole de um
cruzamento díí brido realizado por Mendel . Para cada
plantas da geração F, com sementes lisas e amarelas eram
traço considerado individualmente, a prole exibe uma razão diíbridas e tinham o genótipo RrGg, ele previu que o cru
zamento-teste de uma planta diíbrida { RrGg ) com uma
-
aproximada de 3:1 do fenótipo dominante para o recessiva
Quando os dois tra ços sâo considerados simultaneamente, planta de linhagem pura rugosa e verde [ rrgg ) produziria
prevê se uma razão fenotipica de 9.33:1. quatro fenótipos na prole em uma frequência de cada.
*
 Capítulo 2 Transmissão genética 39

AN ÁLISE GENÉTICA
Em uma espécie de mamí fero, o pelo lor>go e o surgimento de manchas brancas Macho Fémea
são produzidos pelos alelos dominantes F e 5, respectivamente, que sáo encon
trados em dois lócus que segregam independentemente. Nesses lócus, o genó- Cruzamento 1: FFSs x Ffss
tipo ff produz pelo curto e o genótipo ss produz uma cor sólida no pelo. Dados Cruzamento 2 : ff Ss x FfSs
os genótipos parentais para cada um dos seguintes cruzamentos, determine as Cruzamento 3: FfSs x FfSs
proporções previstas de todos os fenótipos da prole .
Estrat égias de solução Etapas da solução
Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por 1 Esse é um problema de transmissão genética no qual os genótipos parentais
esse problema e explique a natureza sáo fornecidos. As respostas precisam prever os fenótipos da prole e suas pro-
da resposta solicitada. .
por ções esperadas Esses dados são previstos pela determinação dos gametas
parentais e suas proporções.

.
2 Identifique as informações críticas 2 Os genótipos parentais são fornecidos para cada cruzamento Os genótipos são .
fornecidas no problema. utilizados para prever os genótipos dos gametas parentais e as proporções dos
gametas .
Deduzir
.
3 No Cruzamento 1, identifique os .
3 Cada um dos progenito- Cruzamento 1

—
gametas geneticamente diferentes res pode produzir dois Macho Fémea
que podem ser produzidos por cada
progenitor e calcule a proporção pre-
vista de cada gameta.
gametas geneticamente
diferentes nas frequèrv
cias previstas de j cada.
1F
- <
}S FS ~ 1 Mj) = i
<I
}F
ií
— 1i~ fs ( jXDH
- >
U ~ fc ( i (lM
. X
DICA O diagrama de inhe bifurcada é
uma fenamenca útil para prever os aleios
nos gametas e as hec Jé nelas dos gametas.
Cruzamento 2
.
4 Identifique o conteúdo e a frequên - 4. O macho produz dois
Macho Fêmea
cia dos gametas geneticamente di - tipos de gametas em
!*•
'< } -
ferentes produzidos pelos progenito- uma frequência pre- i
res no Cruzamento 2.
^
vista de cada. A fémea
produz quatro gametas
geneticamente diferen-
\K }
*
S
A -axjM

.
5 Preveja o conteúdo e a frequência .
tes nas frequências de
cada.
5 Os dois progenitores são
^ Macho
Cruzamento 3
Fémea
dos gametas das plantas progenito- diíbrido5 que produzem JS -FS- fJMJ) = J ! JS--FS-. <})<!) = ]
ras no Cruzamento 3. quatro gametas geneti-
i
'< } Js - Fs — <J >(J) = J '< } Fs • <$)( }) = 1
í« " •*

<JMJ> = J jsfs - <

camente diferentes nas S 75
* <!> =1
)
frequências de ~ cada. i '< \f < }i
Solucionar
. .
>? FS
6 Construa um quadrado de Punnett 6 A prole prevista para o Cruzamento 1 é j pelo comprido e F FFSs FFss
*
para o Cruzamento 1 e preveja os fe
nótipos e as proporções da prole .
- manchado e pelo comprido de cor sólida *
fs FfSs Ffss

.
7 Construa um quadrado de Punnett .
7 A prole prevista para o Cruzamento 2 é * pelo comprido e man-
para o Cruzamento 2 e preveja os fe-
nótipos e as proporções da prole.
’
chado; pck> comprido de cor sólida; ? pelo curto e manchado
e pelo curto de cor sólida .
FS FfSS FfSs
B Fs FfSs Ffss
.
8 Construa um quadrado de Punnett .
8 A prole produzida pelo Cruza- - Fs fS fs
fS ffss ffSs
para o Cruzamento 3 e preveja os fe-
nótipos e as proporções da prole.
mento 3 deve ser pelo comprido
e manchadoj pelo comprido de
cor sólida; —
~
^
pelo curto e man-
FS FFSS FFSs FfSS FfSs
Fs FFSs FFss FfSs Ffss
fs ffSs ffss

chado e - pelo curto de cor sólida. fS FfSS FfSs ffss ffSs

16

fs FfSs Ffss ffSs ffss

Para pratkar maí s, ver Problemas 6, 12 e 27 .

40 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Pura Pura resultado confirmou o genótipo diíbrido da planta F, e

RRGG rrgg apoiou a hipótese de que os alelos relativos ao formato da
P fc) ervilha segregam independentemente dos alelos relativos à
\ / cor da ervilha durante a formação dos gametas e que esses
Fértili açáo cryzada
^
Hctcrozigota Pura
gamctas se unem aleatoriamente para formar a prole.

Observa çã o gené tica A razão de é o resultado

RrGg rrgg
-
previsto de um cruzamento teste entre um organismo di í -
bhdo e um homozigoto recessivo para alelos em dois lócus
Fert lizaçâo cruzada Frequência entre as 207 independentes.

F,
I
rg
plantas de Mendel:
Prevista Observada
-*-\ RG \ RrGg
Usa, 55 (0.266)
Testando a segregação independente pela
0.25
amarela análise de cruzamento triíbrido
Mendel testou ainda mais a hipótese da segregação
+ \ Rg \ Rrgg independente examinando os resultados de um cruza-
Lisa, 0,25 51 (0,246) mento tri íbrido, um cruzamento envolvendo três tra -
verde
—
ços nesse caso, a forma e a cor da semente e a cor da

- ;
1* \ rrGg
O
Rugosa,
amarela
0,25 49 (0,237)
flor. Ele começou seu experimento cruzando uma planta
de linhagem pura de semente lisa , amarela e com flores
roxas ( RRGGWW ) com uma planta de linhagem pura de
semente rugosa, verde e com flores brancas (nggMw) A .
*
1 rrgg
Rugosa, 0,25 52 (0,251)
Figura 2,14 ilustra o cruzamento das cepas parentais de
linhagem pura e a prole F, resultante, que exibe os fenó-
tipos dominantes de semente lisa, amarela e flor roxa.
verde fjOO 207 1
( ,000)
Presume-se que os integrantes da prole F , sejam tri íbri-
dos ( RrGgWw ). As plantas da prole Fj presuniidamente
Obseva se que a prole do cruzamento teste exibe tri íbridas foram cruzadas para produzir uma prole F2 e os
quatro fenôtipos em frequências Iguais, conforme resultados foram comparados com as expectativas.
o previsto pela apí caçào das leis deMendel. O diagrama de linha bifurcada na Figura 2.14 mos-
tra o n ú mero e a frequência esperada dos genótipos de
-
F ig u ra 2.13 Cruzamento teste de Mendel para verificar
gamela. No caso geral, o n ú mero de genótipos de gameta
a segrega çã o independente. Mendel previu e observou
uma razão aproximada de 1:1:1:1 entre a prole, apoiando sua diferentes é expresso como 2", onde n = n ú mero de genes
hipótese de segregação independente. envolvidos. Neste exemplo, existem três genes ( w 3) c
23 = 8 possíveis combinações diferentes de alelos para os
A Figura 2.13 mostra que a planta F, diíbrida deveria três traços nos gametas da planta triíbrida. A frequência
produzir quatro genótipos de gametas diferentes. Relem
brando a lógica do diagrama de linha bifurcada, lembre se -
- de cada genótipo de gameta é determinada como
ou ( j = Para prever o n úmero de gametas genetica -
(\ J
de que a metade dos gametas deve conter R e a outra me - mente diferentes e suas frequências, o expoente 3 é usado
tade deve conter r. Os gametas carregam G e g indepen - porque existem três genes sendo examinados no experi-
dentemente de R ou r, o que significa que sã o possíveis
quatro combinações diferentes desses alelos nos gametas:
mento. Em cálculos aritm éticos como esse, o valor do ex -
poente normalmente indica o n ú mero de genes.
RG, rG,Rg e uma delas ocorrendo em uma fre-
rg , cada A Figura 2.14 ilustra uma maneira de usar o método
quência prevista de Por outro lado, a planta da linha bifurcada para prever a frequência das oito classes
homozigota recessiva verde e rugosa ( rrgg) pode produ - fenotí picas desse cruzamento triibrido. No caso geral em
que existem dois fenôtipos (dominante e recessivo) para
zir apenas um gameta rg. Na figura, vemos que a prole
do cruzamento- teste deve ter quatro genótipos, cada um cada traço, existem 2* fenôtipos na prole F;. Mais uma vez,
deles correspondendo a um fenótipo diferente. A prole n = n úmero de genes. Neste exemplo, existem 2* = 8 fenó-
J
prevista deve ser RrGg (lisa e amarela ) , Rrgg (lisa e J
verde) , rrGg ( rugosa e amarela ) e rrgg ( rugosa e verde).
tipos na prole Fr O cálculo de cada frequência fenotí pica
prevista se baseia nas frequências esperadas dos [ domi-
£ ~

nantes e - recessivo de cada traço. A frequência esperada

Mendel fez esse cruzamento e seus resultados corres
pondem quase exatamente às previsões. Ele constatou que
207 plantas da prole do cruzamento-teste eram compostas
de 55 plantas com ervilhas lisas e amarelas; 51 plantas com
ervilhas lisas e verdes; 49 plantas com ervilhas rugosas e
amarelas e 52 plantas com ervilhas rugosas e verdes. Esse
- de cada classe triíbrida é o produto das três frações que
representam as probabilidades previstas da forma domi -
nante ou da forma recessiva de cada traço. Para os oito
fenôtipos da prole F2 de um cruzamento triíbrido, a razáo
fenotí pica esperada é
 Capítulo 2 Transmissão genética 41

Progenitofes de
linhagem pura Frequência entre as
RRGGWW
Prole Fj 639 plantas de Mervdel
Cor da flor Fenótipo Frequê ncia Esperada Observada Fenòtipo
(
4) w*
/
metas
Cor da semente
- - i-
R G W
UM)
(A m a r e l a )
( Roxa]
“8 269,6 .....269 •
Lisa
Amarela
Roxa
(UM) Usa
- -1
Wrgw Forma da
R G ww Amarela ). Amarela
Y
Fertilização
semente
hr 1 ^
••
(Branca )
89.9 98
Branca

i -
I
-
(UM)
-
Usa

*- =â
( )(l)(i)
Tri íbrido
RrGgWw
R ggW ( Verde)
( Roxa) * 89.9 86 Verde
Roxa

1 (Lisa ) Usa
R ggww i ~ 0fcrde) ~ ! -
( )(D( j) « & •'•••"29,9 . . »« »« 27 Verde
Fi V ( Branca) Branca
( Rugosa ) Rugosa

/ --
Cor da semente rrG W -<Amarela ) -(l|
)( )( í) » £ 89.9 88 Amarela
i ( Roxa) Roxa

Tri íbndo
RrGgWw
Forma da
semente rr -w w
A

*
---
( Rugosa )
(Amarela )
( Branca)
-(l)(i)(i) - à -29.9 34
Rugosa
Amarela
Branca

—
I X
rrgç »
5
- A — MNI
( Rugosa )
( Verde )
( Roxa)
U)(i)(J) = á • ê
*» •• « •« ....29.9 30
Rugosa
• Verde
Roxa

• — —
rrqq
« X rrggww
» _ t
( Rugosa )
( Verde) (i)(i)(i) =à 10,0 7
Rugosa
Verde
V* ( Branca! Branca
Figura 2.14 Cruzamento tri íbrido para verificar a segregarão independente. 0 método da linha bifurcada pode ser
utilizado para determinar as frequências fenot í plcas esperadas produzidas por um cruzamento tri íbrido. Os resultados esperados
e observados para a geração Fa do experimento de cruzamento triíbrido de Mendel apoiam sua hipótese de segregação
independente.

Mendel usou esse raciocínio combinat ório para
prever o resultado de um cruzamento triíbrido experi
mental. Seus resultados experimentais para esse teste
são fornecidos na Figura 2.14 para 639 plantas da prole
F 2 resultantes do cruzamento de plantas da prole F, com
sementes lisas e amarelas e flores roxas. Mendel previu
o n ú mero esperado de integrantes da prole em cada
classe fenotípica multiplicando a proporçã o esperada
.
pelo tamanho da amostra, 639 Seus resultados foram
notavelmente parecidos com os resultados esperados. A
correspondência próxima desses resultados observados
e esperados fornece uma segunda evidê ncia indepen
dente para apoiar a lei da segregação independente.
Juntas, as análises de Mendel da transmissão dos tra
ços individuais e da transmissão conjunta de dois ou três
traços independentes representaram um grande avanço
na compreensão científica da transmissão hereditária.
A lei da segregação e a lei da segregação independente
sào os princí pios fundamentais da transmissão genética
nos organismos diploides e formam a base da nossa com
preensão da transmissão genética e da genética molecu
lar e populacional. Veremos repetidamente o>s resultados
dessas duas leis à medida que explorarmos os detalhes
da transmissão hereditária nos organismos diploides
organismos que, como os seres humanos e as plantas de
ervilha, possuem duas có pias de cada cromossomo.
— usar a mesma abordagem para prever a razão entre a prole
Cálculos probabilí sticos na resolução de
- problemas de genética
A razão fenotípica prevista para a prole a partir Fa
de um cruzamento tri íbrido parece complicada e, em
primeiro lugar, você pode nã o ver claramente por que
essa é a distribuição prevista. A chave para compreender
o cálculo, demonstrada na Figura 2.14, é perceber que
cada lócus de segregação independente pode ser tratado
verdadeiramente de modo independente dos demais.
Vamos examinar a distribuição do fenótipo de uma
prole de um cruzamento diíbrido. Esperamos que, para
- cada traço individualmcnte, da prole exibirão o fenótipo J
dominante e o fenótipo recessivo. Poderíamos usar o
- quadrado de Punnctt para determinar a distribuição feno-
tí pica dos dois traços combinados, como fizemos na Figura
2.11, mas a independê ncia de cada gene nos proporciona
uma maneira mais rá pida para calcular a distribuição dos
fenótipos: por sua probabilidade. Neste caso, as propor-
--
—
ções fenotípicas esperadas para a prole podem ser obtidas
multiplicando as duas razões
duzir a razão prevista de ou
para pro
Podemos
— -
Fj de um cruzamento triíbrido ou de qualquer outro tipo
de cruzamento envolvendo genes segregados de modo
independente.
42 Análise gené tica: uma abordagem integrada
Outra vantagem de usar a probabilidade para solucio
nar problemas de genética é sua fácil adaptabilidade aos
diferentes tipos de questòes. Por exemplo, qual proporção
da prole produzida pela autofertilização de uma planta trii-
brida amarela, lisa e de flor roxa (GgRrWw ) terá o mesmo
genótipo da planta progenitora? Para determinar a res - conhecidos por 34 anos, os resultados experimentais e
posta, identificamos a probabilidade do genótipo de cada
traço individual e depois multiplicamos essas très probabi-
lidades juntas. Em cada lócus o cruzamento é heterozigoto
por heterozigoto, então a metade da prole deve ser hetero-
zigota. A probabilidade de a prole de uma autofertilização
( |]( ]
| { * j*
de triíbrido vir a ser triíbrida é, portanto,
^^
Se quiséssemos determinar a proporção da prole de um
cruzamento triíbrido com gen ótipo rrGGWw, novamente
tratamos os lócus de maneira independente e calculamos a
( \ ]{ j
probabilidade como
^ = }2.
Os problemas no final deste capitulo, bem como a
Análise gené tica 2.3, fornecem uma série de oportunida -
des para você praticar usando os princí pios da transmis-
são genética. Como aponta a Observação Experimental
2.1, porém, as oportunidades para coletar evidências das
Observa çã o Experimental 2.1
Mendelismo no corredor do mercado
Muitas das caracterí sticas atraentes das frutas e legu- adjacentes. Isso significa que cada espiga de milho madura
mes disponíveis nas mercearias e nos mercados resultam de
cruzamentos seletivos intensos. Por exemplo, nos últimos
anos, multas variedades novas de legumes foram Introdu -
zidas no mercado. Entre essas, há uma variedade de milho
chamada de diversos nomes, incluindo "bicolor", "pêssegos
e creme' e 'amarelo e branco". A maioria dos gr á os em uma
espiga de milho bicolor é amarela, mas uma quantidade
consider ável é branca. Com uma observação atenta e um
pouco de análise quantitativa, você consegue identificar o
mecanismo genético que produz essa variação na cor . A semente costuma ser rotulada como *hibrida", significando
Uma espiga de milho é um miniexperimento genético;
cada grão na espiga, como cada ervilha em uma vagem, é uma
semente diferente, produzida por um evento de fertilização
independente dos demais eventos que produziram os grãos
- leis da hereditariedade de Mendel podem ser tão pareci -
das quanto o corredor de produtos de sua mercearia locaL
A redescoberta do trabalho de Mendel
Em 1900, após permanecerem praticamente des-
as interpreta ções de Mendel foram redescobertos quase
simultaneamente por três botâ nicos que trabalhavam
independentemente uns dos outros. Cari Correns e
Erich von Tschermak trabalhavam na IHsum satiwm , a
mesma planta que Mendel usou, e Hugo de Vries traba -
lhou em uma espécie de planta diferente. Cada um dos
três identificou os princí pios da hereditariedade que
Mendel descreveu pela primeira vez em 1865. Com o
apoio das descobertas contemporâ neas do comporta-
mento dos cromossomos durante a divisão celular mei-
ótica, seguida rapidamente pela evidência confirmadora
de outras espécies de plantas e animais, os princí pios
bá sicos da segregação e da segregação independente
foram r á pida e amplamente disseminados na primeira
década do século XX. Os dados de Mendel, Correns,
Von Tschermak e outros que investigaram posterior -
carrega centenas de descendentes para análise,
O milho bicolor surge com o cruzamento de duas linha-
gens de milho puras, uma produzindo gràos amarelos e a outra
.
produzindo grãos brancos A planta amarela é WW e a planta
branca é ww . Quando os geneticistas da empresa de sementes
cruzam esses estoques parentais, os gráos nas plantas da prole
F. são amarelos e possuem genótipo heterozigoto Ww. Essa se-
,
mente F é deixada amadurecendo e é embalada para venda aos
agricultores e jardineiros que a plantam para produzir uma safra,
"monoíbrlda", para refletir a natureza heterozigótica no lócus da
.
cor do grão Devido à segregação dos alelos no lócus da cor do
grão, as plantas cultivadas a partir dessa semente F, produzem
gráos tanto amarelos (IV-) como brancos ( ww) em cada espiga.
Se você visse algum desses milhos no mercado, como
você verificaria que a base genética de seus gr áos amarelos e
|brancos é a segregação de dois alelos em um único lócus? A
I resposta é que você contaria o número de grãos amarelos e o
I número de gr áos brancos nas espigas de milho bicolor com a
I expectativa de encontrar uma razão 3:1, aproximadamente,
I entre os gr áos amarelos e brancos.
Recentemente, uma turma de estudantes de genética
I examinou várias dúzias de espigas de milho bicolor e contou
J .
7.506 gr áos amarelos e 2.376 grãos brancos Entre o total de
9.882 grãos, 75,96% são amarelos e 24,04% são brancos, uma
*
.
£ razão de 3,16:1 Você vai usar esses dados no Problema 20, no
L final do capítulo, para fazer um teste estatístko para constatar
1 se os dados observados correspondem è hipótese de que esse
I traço é o produto da segregação dos alelos em um único lócus.
Da pr óxima vez que vocè comprar frutas e legumes, lembre-
I se de que está olhando para a genética mendeliana em ação!
 Capítulo 2 Transmissão genética 43

AN ÁLISE GENÉTICA
Na mesma espécie de mamífero com os mesmos traços descritos na Análise Genética 2.2, um cruza-
mento entre um macho com pelos compridos e de cor sólida e uma fémea com pelos curtos e man
chados produz oito filhotes. A prole consiste em 2 filhotes com pelo comprido e manchado, 2 com pelo
curto e de cor sólida, 2 com pelo comprido e de cor sólida e 2 com pelo curto e manchado. Dados os
fenótlpos dos pais e a distribuição dos fenótipos da prole, determine os genôtipos dos pais e da prole .
Estrat égias de soluçã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por esse pro- .
1 O problema exige a determinação dos genôtipos parentais e dos genóti-
blema e explique a natureza da resposta so - pos da prole com base nos fenótipos parentais e nas propor ções da prole
licitada. com fenótipos diferentes .
.
2 Identifique as informações críticas forneci
das no problema.
- 2. Nessa espécie de mamífero, o pelo comprido é dominante em relação ao
curto e a cor manchada é dominante em relação à cor sólida. Cada pro-
genitor é homozigoto recessivo para um traço e dominante para outro
• KA: lhe o gervótopo conhecido e o espaço
reservado para os progenitores e as razões .
traço A prole exibe uma razão 1:1:1:1 dos fenótipos.
fenotípicas para a prole, a Am de identificar
ARMADILHA: VocÉ níopcde
Deduzir compíetamente os genôtipos parentais
pwsumèr que conhece o ge

.
3 Registre o que >á é conhecido a respeito dos
.
nrttipc fif um OR}mKmr> cnm
.
3 0 progenitor de pelo comprido e cor sólida é f-ss,
fmceçm domnjrt wm as
genôtipos parentais escrevendo os alelos *
informações de vgregjçfa. portando peb menos um alelo dominante (f-) para
Use formas grr» do fenó-
homozigotos recessivos para o traço reces- Úpo F- e S tomo «paços
o pelo compnòo e alelos homozigotos recessivos (ss)
sivo e escrevendo um alelo dominante e para a cor sólida. O progenitor de pelo curto e man-
reservados para as genôtipos
um “espaço em branco' como um espaço hcmadgoto dominante ou chado é fl$-, portando alelos homozigotos recessivos
hetefodgoto.
reservado para o traço dominante . (fl) para o comprimento do pelo e peto menos um
aleto dominante (S-) para a cor manchada.
.
4 Infira o que é conhecido sobre os genôtipos .
4 Os genôtipos inferidos para a prole são
da prole escrevendo os alelos homozigotos
recessivos ou os alelos dominantes com um
--
f S comprido, manchado
ffss curto, cor sólida
espaço reservado 'em branco".
f -ss comprido, cor sólida
DKA: 0 traço segregado ò fortra indtpendtot podem
lar * * . * * *
analisados irdr se jalmentc- Avalie a segregação cair oavt
nas razões fencdptcas da srole para um traço de cada vez.
ffS- curto, manchado

.
5 Determine a razão fenotípica do pelo com-
.
5 Quatro de pelo comprido e quatTO de pelo curto, uma razão 1:1 dos fenó-
prido em relação ao pelo curto entre a prole
tipos dominante e recessivo.
do cruzamento .
.
6 Determine a razão fenotípica do pelo man - 6. Quatro integrantes da prole possuem pelo manchado e quatro possuem
chado em relação ao pelo de cor sólida
pelo de cor sólida, uma razão 1:1 dos fenótipos.
entre a prole.

Solucionar
.
7 Determine os genôtipos parentais neces- 7. Para produzir o fenótipo recessivo de peto curto, cada progenitor precisa con-
sários para produzir a prole com a razão tribuir com um alelo recessivo (/). Entre os progenitores, a fémea com peto
observada do pelo comprido para o pelo curto é ff e o macho com peto comprido precisa ser heterozigoto (ff) para esse
curto. gene. O genótipo do macho com peto comprido de cor sólida é ffo.

.
8 Determine os genôtipos parentais neces- .
8 O progenitor com fenótipo recessivo de cor sólida contribui com um
sários para produzir a razão observada de alelo recessivo (s). A progenitora com pelo manchado precisa ser hetero-
pelo manchado para pelo de cor sólida . .
zigota (Sí) A f êmea com pelo curto e manchado tem o genótipo ffSs .
.
9 Verifique os genôtipos parentais nesse cruza- 9. No cruzamento ffss x ffSs, cada progenitor fs fs
.
mento usando uma análise do quadrado de produz dois gametas geneticamente diferen- fs ffSj ffSs
i Punnett ‘
tes nas frequências de cada. O quadrado de
Punnett prevê quatro genôtipos e fenótipos
Comprido, Curto,
manchado manchado
AMAOIIMA: Para evitar errov jsr
L n quadrada de Punnett para veri-
*
ficar se os genôtipos parentais que
diferentes na prole, em uma razão 1:1:1:1 fs . ffss ffss
votè atribuir produzir ão urra prole Comprido, Curto,
rvr razão observada. cor sólida cor sólida

Para praticar mals, ver Problemas 3, 16 e 40 .

44 Análise gené tica: uma abordagem integrada
Observa çã o Experimental 2.2
Genética naudiniana, alguém conhece ?
Antes de Mendel, muitos "hibridizadores de plantas" fi
zeram experiências com plantas de ervilha e outras, tentando
discernir os mecanismos da reprodução e o processo de
transmissão hereditária dos traços. Mendel citou o trabalho
de vários hibridizadores em seu ensaio de 1866.
Vários desses hibridizadores de plantas chegaram perto
de descobrir os princípios da hereditariedade que hoje levam
.
o nome de Mendel mas nenhum deies teve pleno sucesso. Por
exemplo, em 1823, Thomas Andrew Knight determinou que o
tegumento cinzento é dominante em relação ao tegumento
branco e que a autofertilização de certas plantas de semente
cinzenta produz sementes cinzentas e brancas nas plantas da
prole. Em 1822, John Goss, trabalhando com uma variedade de
ervilha que tinha sementes azuis e brancas, relatou que o cruza-
mento de uma planta de linhagem pura e semente branca com
uma planta de linhagem pura e semente azul produziu apenas
sementes azuis na primeira geração de plantas e que a autofer-
tilização produziu uma segunda geração com uma mistura de
sementes brancas e azuis nas plantas. Cari Friedrich Gaertner
chegou tentadoramente perto de explicar a segregação em
1827, quando relatou os resultados de um cruzamento entre um
milho de linhagem pura e gráos dourados com um milho de li-
nhagem pura e grãos vermelhos listrados. Toda a F, teve gráos
dourados e, entre as plantas da Fy 328 tinham apenas grãos
dourados e 103 tinham grãos vermelhos listrados. Se Gaertner
tivesse conseguido interpretar seus dados corretamente, ele
teria identificado uma razão 3,18:1 na Fr Infelizmente, ele nunca
conseguiu e perdeu uma oportunidade "de ouro" para explicar a
hererfitariedade simples.
Destinos similares sucederam a outros hibridizadores de
plantas, mas indiscutivelmente o que chegou mais perto de
mente a segregação das cores amarela e verde da ervilha
na prole F2 da Pisum sativum foram combinados para
fornecer uma razão de 3,01:1 entre as mais de 200 mil
sementes amarelas e verdes que eles analisaram.
A abordagem para a an álise genética que descreve
mos neste capítulo costuma ser apelidada de genética
mendeliana, por razões óbvias de que Gregor Mendel
foi o primeiro cientista a oferecer um mecanismo para
explicar os padr ões hereditários que observou. Entre
tanto, como foi observado na introdução do capítulo,
Mendel não foi a primeira pessoa a fazer essas observa
ções. A Observação Experimental 2.2 mostra que, se
não tivesse deixado de quantificar os resultados de seus
cruzamentos de plantas de ervilha , Charles Naudin ,
contemporâ neo de Mendel, poderia ter sido o primeiro
cientista a conseguir explicar a hereditariedade . do outro, sua probabilidade conjunta, ou seja, a proba
2.4 A teoria da probabilidade prevê
as razões mendelianas
Mendel reconheceu que o acaso (ou probabilidade
aleatória, o mesmo processo que determina o resultado
dos lançamentos de moeda e da rolagem de dados) é o
princípio aritmético subjacente à segrega çã o dos alelos
- explicar a hereditariedade antes de Mendel foi Charles Nau -
din, que em 1863 parecia prestes a antecipar -se a Mendel em
dois anos. Naquele ano, Naudin relatou o seguinte:
I Os resultados dos cruzamentos reciprocos são idênticos.
(Observações similares feitas por Mendel foram Importan
tes em sua identificação da natureza particulada dos fato-
res hereditários.)
I A prole F, exibe um único fenótipo. (Como Mendel relatou
dois anos ma Is tarde.)
I A prole FJ exibe dois fenótipos. (Essas observações são o
resultado da segrega ção de alelos.)
I As unidades hereditárias para os traços são separadas na
formação do pólen e do ovo. (Esse conceito foi fundamen-
tal para a observação da segregação de Mendel.)
I As combinações não parentais dos fenótipos aparecem na
geração F2. (Essa observação é idêntica à da segregação
independente dos alelos feita por Mendel.)
Após fazer essas observações, por que Naudin nâo foi
capaz de propor um mecanismo hereditário para explicá-las?
A resposta é que Naudin, como seus predecessores e outros
que ainda viriam, não quantificou seus resultados. Naudin
não relatou o número de plantas que caiam nas diferentes ca-
tegorias fenotípicas e, portanto, náo conseguiu reconhecer as
razões entre as classes fenotípicas que são fundamentais para
interpretar a transmissão hereditária. Sem dados quantitati-
.
vos Naudin náo conseguiu formular uma hipótese tcstável.
Pobre Naudin! Não fosse sua incapacidade de enxergar
a necessidade de quantificar os resultados experimentais, po-
deríamos muito bem estar discutindo a genética naudiniana
neste capitulo, em vez da genética mendeliana!
de um determinado gene e que ele governa a segregação
independente dos alelos nos genes em diferentes lócus.
As discussões anteriores demonstraram que as regras
básicas da heran ça mendeliana sào, na realidade, as re-
- gras da teoria da probabilidade aleatória. Na verdade, as
probabilidades mendeliana* que discutimos anterior-
mente sào expressas mais claramente por quatro regras
- —
da teoria da probabilidade regra do produto, regra da
soma, probabilidade condicional e probabilidade bino-
.
mial Nesta seção, examinamos mais atentamente essas
- regras que descrevem e preveem o resultado dos eventos
genéticos governados pelas regras do acaso.
Regra do produto
Se dois ou mais eventos forem independentes um
-
bilidade de sua ocorrência simultâ nea ou consecutiva, é
o produto das probabilidades de cada um deles. A regra
do produto, também chamada regra da multiplicação,
descreve essas circunstâncias.
Você já utilizou vá rias vezes a regra do produto na
determinação dos resultados dos cruzamentos genéticos.
Por exemplo, nas Figuras 2.6 e 2.7, a regra do produto é
utilizada para determinar se a chance de produzir uma

planta F. com o fenótipo recessivo pelo cruzamento de
( ) )
plantas heterozigota?» que são Gg ou Rr é 2 2 = i *
^
De modo similar, na Figura 2.10, a probabilidade de pro -
duzir gametas com cada genótipo diferente é prevista
pela aplicação da regra do produto no diagrama de Linha
bifurcada. Da mesma forma, na Figura 2.11, a probabili-
dade de a prole F2 vir a ser homozigota recessiva a partir
de um cruzamento das plantas diíbridas da F , com genó -
tipo RrGg é prevista pela aplicação da regra do produto.
Regra da soma
A regra da soma . também chamada regra da adi
ção, define a probabilidade conjunta da ocorrência de
dois ou mais eventos mutuamente exclusivos somando
as probabilidades de cada um deles. Essa regra é apli -
cada quando mais de um resultado satisfaz as condições
da questão probabil ística.
Você aplicou a regra da soma em vários cálculos ge -
néticos na seção anterior. Por exemplo, na Figura 2.6, a
probabilidade de a prole F2 do cruzamento Gg x Gg vir
a ser heterozigota é determinada pela soma da chance
de obter qualquer uma das duas maneiras possíveis de
ter uma prole heterozigota: | i | |
| * . De modo si
milar, na Figura 2.11, a probabilidade de a prole F2 do
cruzamento de diíbridos heterozigotos { RrGg ) ter os
dois fenótipos dominantes é obtida pela aplicação da
regra da soma . A partir da Figura 2.11 , a probabilidade é
Observa ção genética A regra do produto é usada para
determinar a probabilidade conjunta de dois ou mais eventos
ocorrerem simultânea ou consecutivamente. A regra da soma
é usada quando dois ou mais resultados equivalentes satisfa-
zem as condições da questão probabilistka.
Probabilidade condicional
As questões de probabilidade nos experimentos
genéticos podem ser feitas antes da realização de um
cruzamento. A regra do produto e a regra da soma po -
deriam , por exemplo, ser utilizadas para prever a proba
bilidade de obter um determinado genótipo ou fenótipo
a partir de um cruzamento. Certas questões de probabi -
lidade são feitas após um cruzamento ter sido realizado
e poderiam abordar a probabilidade de um organismo
ter um determinado genótipo. Esse tipo de probabili
dade é chamado probabilidade condicional e é apli -
cado quando informações espec íficas sobre o resultado
modificam ou “condicionam ” o cálculo probabillstico.
Um exemplo genético tí pico de probabilidade
condicional seria considerar a prole F2 do cruzamento
como Gg x Gg e perguntar “Qual é a probabilidade de
as plantas da prole com semente amarela serem hete -
rozigotas Gg como as progenitoras?" ( ver Figura 2.6). A
semente amarela está presente em ] da prole, mas essa
Capítulo 2 Transmissão genética 45
classe fenotí pica contém dois genótipos, GG e Gg, que
não são igualmente frequentes. Nesse caso, o genótipo
Gg é encontrado em j da prole F2 de semente amarela.
As outras plantas da prole F2 sào GG. Sob o critério con -
dicional de que o único fenótipo da prole considerado é
a semente amarela , a resposta da pergunta apresentada
anteriormente é que a prole de semente amarela do cru -
zamento tem y de probabilidade de ser Gg.
Outra aplicação da probabilidade condicional é a
pergunta “Se for permitido que as plantas de semente
amarela da prole F2 autofêrtilizem , qual proporção delas
deve ter linhagem pura ?". Essa pergunta é similar à que
- Mendei fez quando concebeu um teste independente de
sua hipótese de segregação (ver Tabela 2.3). A prole F de
^
linhagem pura precisa ser homozigota e, em seu experi -
mento de cor da semente , apenas a prole com genótipo
GG satisfaz essa contingência condicional. Uma vez que o
genótipo GG é encontrado em um terço das plantas de se-
mente amarela da prole F2, a mesma proporção de plantas
de linhagem pura deve resultar da autofertilizaçâo.
Observação genética Uma probabilidade condicional é
a probabilidade de um evento ocorrer subordinado a deter-
- minada circunstância adicional ou conjunto de circunstâncias
adicionais. Em análise genética , 0 requisito adicional frequen
temente diz respeito ao fenótipo da prole de um cruzamento.
0 efeito da circunstância adicional é alterar o número de resul-
tados possíveis ou a probabilidade dos resultados reprodutivos.
Probabilidade binomial
Na determinação dos resultados de certos eventos
genéticos, apenas um evento precisa ser previsto. Um
exemplo é a questão “Qual é a chance de um casal gerar
uma Filha?". A resposta é obtida presumindo que o pai
tem uma chance de - de doar um cromossomo X e produ-
zir uma filha e uma chance igual a - de doar um cromos-
somo Y para produzir um filho e que a prole masculina
e feminina é igualmente provável. Outras questões rela -
tivas aos resultados genéticos requerem que avaliemos a
probabilidade de uma combinação ou sequência de tais
eventos (eventos para os quais existem dois resultados
- possí veis de cada vez ). Por exemplo, determinar as proba -
bilidades das diferentes combinações de meninos e meni -
nas em grupos de irmãos, ou o risco do fenótipo recessivo
em um ou mais filhos de um casal de portadores hetero-
zigotos de uma doença recessiva, requer o cálculo de uma
- determinada combinação de eventos que têm dois resul -
tados alternativos cada. Para fazer essas determinações,
usamos cálculos de probabilidade binomial, expandindo
a expressão binomial para refletir o número de combina-
ções de resultado e a probabilidade de cada combinação.
Construção de uma f órmula de expansão binomial Uma
expressão binomial contém duas variáveis, cada uma re-
presentando a frequência de um ou dois resultados alter-
nativos. Podemos expressar a probabilidade de um resul -
tado tendo uma frequência p e do resultado alternativo
46 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

tendo uma frequência q. Uma vez que os eventos p e q sâo
os únicos resultados possíveis, a soma das duas frequências
é ( p + q ) * 1. Se estivermos examinando as probabilidades
dos resultados para uma série de dois eventos alternativos,
como os vários resultados cara ou coroa de uma moeda ou
os vários filhos sucessivas de um casal, podemos expandir
o binómio para a potência do n úmero de eventos sucessi-
vos (n ) a fim de calcular as probabilidades. A fórmula de
expansão binomial é escrita como ( p q )*.
Em alguns tipos de problema de probabilidade, os
valores das variáveis binomiais p e q serão iguais; ou seja,
\
p = q - , como na probabilidade de gerar um menino ou
uma menina. Em outros casos, os dois valores binomiais
não serão iguais, como na probabilidade de que pais he-
terozigotos venham a gerar um filho com um traço re
cessivo. Vamos usar uma probabilidade combinató ria
para prever a probabilidade de diferentes quantidades de
meninos e meninas gerados quando um casal tem três
filhos. Uma abordagem combinatória nos permite listar
todas as possíveis ordens de nascimento de meninos e
meninas e agrupá - las de acordo com os n ú meros totais
de meninos e meninas em cada grupo de três irmãos. A
tabela a seguir mostra que existem 23 ou oito diferen -
tes ordens de nascimento de meninos e meninas. Essa
conclusão é determinada com base em dois resultados
possí veis ( um menino ou uma menina ) para três eventos
consecutivos. Supondo que as probabilidades de ter um
menino ou uma menina sâo cada ordem diferente
(
tem uma probabilidade de | = . Os resultados podem
^ ^
ser agrupados em quatro grupos, cada um contendo um
n ú mero total diferente de meninos e meninas.
0 Meninos 1 Menino 2 Meninos 3 Meninos
3 Meninas 2 Meninas 1 Menina 0 Meninas
GGG GGB GBB BBB
GBG BGB
BGG3 BBG
i 3 1
Probabilidade. A a 8 A
Podemos ver que existe apenas uma ordem na
qual teremos três meninos ( BBB) ou três meninas
( GGG ) e cada uma delas tem uma probabilidade de
Repare que usamos a regra do produto para obter cada
probabilidade. Mas, c nos casos de 2 meninos e 1 me
nina ou 2 meninas e 1 menino, em que existem três or
dens de nascimento diferentes (as ordens de meninos
e meninas entre os irmãos ) para cada resultado? Aqui,
reconhecemos que cada ordem de nascimento tem
\j J
uma probabilidade de j * e que precisamos somar
todos os resultados similares para determinar a pro-
babilidade de 1 ou 2 meninos ou meninas em trés ir-
mãos consecutivos. Em cada um desses casos, usando
) 81
a regra da soma , a probabilidade é ( ) + ( j | = *.
^
Aritmeticamente, usamos a expansão binomial na
terceira potência \ { p + <7)*) para representar os três irmãos
sucessivos. Supondo que a probabilidade de um resultado
seja p e a probabilidade do outro resultado seja q, então o
caso geral do binómio se expande da seguinte forma:
- ( p + q )s = /r* 3p*q + 3 pq1 + q*
Os valores que estão sendo somados no lado direito
da equa ção são as frequ ências dos quatro grupos de re-
sultados p e q.
Aplica çã o da probabilidade binomial aos fenótlpos da
prole A probabilidade binomial e a expansão binomial
podem ser usadas sempre que uma questão probabil ís-
tica tratar de uma série de eventos repetidos que pos-
suem dois resultados alternativos. Vamos examinar a
produção de ervilhas amarelas e verdes nas vagens com
seis ervilhas cada. Nesse exemplo, o alelo dominante G
determina a cor amarela e o alelo recessivo g determina a
cor verde. O cruzamento que produz as ervilhas da prole
é a autofertilizaçâo de uma planta heteroz ígota ( Gg) de
semente amarela. A probabilidade de uma semente ser
amarela é já que o gen ótipo seria GG ou Gg e a pro-
babilidade de a semente ser verde e, portanto, ter o ge-
nótipo gg é 4. Vamos usar a variável p para representar a
probabilidade das sementes amarelas e a variável q para
representar a probabilidade das sementes verdes.
Em nosso exemplo das vagens de ervilha com seis
sementes em cada uma, produzidas pelo cruzamento de
plantas parentais heterozigotas ( Gg), existem dois resulta -
dos possíveis relativos à cor de cada ervilha e seis ervilhas
em cada vagem, perfazendo um total de 26 ou 64 combi -
- nações. Contando o n ú mero total de ervilhas amarelas e
- verdes em cada vagem, existem sele categorias em que

n ( n ú mero de eventos! Coeficientes binomiais N úmero total de combinações

0 1 1
1 1 1 2
2 1 2 1 4
3 1 3 3 1 8
4 1 4 6 4 1 16
5 1 5 10 10 5 1 32
6 1 6 15 20 15 6 1 64
7 1 7 21 35 35 21 7 1 178
8 1 8 28 56 70 56 28 8 1 256
9 1 9 36 84 126 126 84 36 9 1 512
10 1 10 45 120 210 252 210 120 45 10 1 1024
11 1 11 55 165 330 462 462 330 165 55 11 1 2048
12 1 12 66 220 495 792 924 792 495 220 66 12 1 4096
Figura 2.1 5 Triângulo de Pascal dos coeficientes binomiais (p f q ) elevados à n-éslma pot ência . Cada linha da tabela
«

mostra a distribui ção do n ú mero total de combinações para um dado valor de n ( n ú mero de eventos). Por exempio, para
(p q )2, use a linha n 2, que prevê um total de quatro combinações de resultado distribu ídas em uma razão 1:2:1 ou *: *
=
As aplicações que usam as linhas realçadas, n * 4 e n » 6, sáo discutidas no texto.
 Capítulo 2 Transmissão genética 47

- *
U t C( C Figura 2.16 Cálculo da
uccu
ctcctt
probabilidade binomial
CUICCO do fenótipo da cor da
l U l t t C< f c u c CVCCLC
CU( t i i ( i u (i c u c i c semente nas vagens
U «^
C
| | cot t i o
U t l l ACciCti ClfcCCO com saí s ervilhas. O
t t u Ci CU Uietc
U U i (. CICC ^. C Ittl l triâ ngulo de Pascal tem sido
fctictc ( tilfilL C U CC
utilizado para encontrar os
l i c i t e Í CCUC cccttt
t t CU v d «u tttttt coeficientes da equa ção
cttcct t t t t c t t c t t c t cccttt t t t t c t
c c c ccc c c u c uu binomial expandida para
CUIrLi ( CU . CC tctctc t c t t c t ttcttt
t t t t c t cccttt t c t t c t t t c t t t
Cttttt ttttct tt - ttc tcttct
ttcccc
ttttct
n = 6. Os 64 resultados
ttcttt ttttct ttttct ttcttt ttcttt CCCCCt ttttct diferentes são exibidos em
Classe do resultado 6 amarela 5 amarela 4 amarela 3 amarela 2 amarela 1 amarela 0 amarela sete classes e a equação é
da cor da semente 0 verde 1 verde 2 verde 3 verde 4 verde 5 verde 6 verde empregada para calcular
N ú mero de
combinações
que levam
S ocorr ência
1 6 15 20 15 6 1
- a frequência prevista de
64 cada classe.

Probabilidade de
ocorrência da classe
de resultado
p* 6 fy 1 5 p*tf 20pV 15p?q4 6 pq' q*
- 1,00

-
Frequência de
ocorrência da classe 0,178 0,356 0,297 0,132 0,033 0,004 0.0002 1,00
de resultado
=
(P ird D=
cada unia tem um número diferente de ervilhas amarelas
e verdes por vagem, como discutiremos por um instante. Observa çã o gen é tica A probabilidade binomial prevê
A aplicação da expansão binomial nos cálculos ge- a probabilidade das combina ções possí veis em uma amostra
de tamanho especificado quando cada membro da amos-
néticos complexos requer repetição e precisão no uso da
tra pode representar um de dois resultados. As variáveis p e
regra do produto e da regra da soma. No entanto, um ata -
q representam as frequências globais dos dois resultados e a
lho conveniente, chamado triângulo de Pascal, elimina os
fórmula binomial (p + q ) pode ser expandida para a n-ésima
cálculos repetitivos necessários para as várias expansões
potê ncia [(p + qY ] para corresponder ao tamanho da amostra .
da equação da probabilidade binomial, podendo ser usado
0 triâ ngulo de Pascal é uma ferramenta ú til para determinar 0
para qualquer número de expansões entre 0 e a w -ésima n ú meroe a frequência das classes de resultado.
potência para produzir o tamanho de cada classe possí vel e
o número total de classes possíveis (Figura 2.15 ). Voltemos
ao nosso exemplo da probabilidade binomial da vagem de 2.5 A aná lise do qui- quadrado testa
ervilha para vermos como o triângulo de Pascal é utilizado.
A Figura 2.16 usa os valores extraídos da linha n - 6 a adequaçã o entre os valores
do triângulo de Pascal ( destacada na Figura 2.15). Esses observados e os resultados
-
coeficientes da expansão binomial para n 6 fornecem previstos
as proporções de cada uma das sete classes de resultado
para esse exemplo. Os coeficientes são 1 , 6, 15, 20, 15, 6 As Seções Z 1 a 2.4 cont êm muitos exemplos de como
e 1 . somando um total de 64 combinações diferentes. Os os princípios da probabilidade, que fazem previsões sobre
coeficientes são usados para multiplicar a probabilidade eventos aleatórios, podem ser usados para prever a proba-
binomial de cada classe de resultado. Nesse caso, em que bilidade de diferentes resultados dos cruzamentos genéti -
cos. Os experimentos genéticos como os descritos e como
/* * 4 Ctf * 4» * frequência prevista para obter seis ervi- os que Mendel realizou fazem previsões baseadas na hi -
lhas amarelas em uma vagem , por exemplo, é calculada
pótese de que o acaso determina a transmissão dos traços.

^ jj
como 1O*6) ou 6 = 0,178; para as vagens com ervilhas
amarelas e 3 verdes, a frequência é 20 | Jj = 0,132;
a proporção de vagens contendo 2 ervilhas amarelas e 4
( )[
No entanto, para avaliar a validade dessa hipótese, os ge-
netidstas precisam ser capazes de comparar os resultados
que obtêm em seus experimentos com os resultados que
se poderiam prever. Por exemplo, os resultados da F2 de
7 ) * 0,033 etc. O conjunto completo
verdes é 15
^
de frequências previstas para as diferentes combina-
ções de cor da semente é exibido na parte inferior da Fl-
Mendel na Tabela 2.1 são compatíveis com sua hipótese
de segregação que prevê uma razão fenotípica de 3:1?
Os cientistas precisam ser capazes de fazer compa -
gura 2.16. Repare que a soma das probabilidades de cada rações objetivas dos resultados observados e esperados
categoria e a soma das frequências de cada categoria são para testar hipóteses genéticas. As afirmações qualitati-
1 ,00 cada uma. Essa correspondência confirma que todos vas como "os resultados observados parecem próximos
os resultados possíveis foram levados em conta. dos resultados que esperamos" são inaceitáveis para o
48 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
trabalho científico. Em vez disso, uma abordagem quan
titativa, ou, nesse caso, uma abordagem estat ística, é
necessária para comparar objetivamente os resultados
obtidos de um cruzamento com os resultados previstos
pela probabilidade. Mendel náo tinha ferramentas esta -
tsticas adequadas à sua disposiçã o. Mas, no inído dos
í tatisticamente significante entre o resultado observado
-
anos 1900, o teste do qui quadrado foi derivado como
um teste estatístico para a comparação de resultados ex
perimentais observados com os resultados que podem
ser esperados quando o acaso está encarregado de gerar
o resultado. Esta seção descreve o teste do qui -quadrado
e sua aplicação aos dados de análise genética, incluindo
alguns resultados da F.; de Mendel. Porém, começamos
com uma breve descrição de uma distribuição normal ou
-
gaussiana , na qual a análise do qui quadrado se baseia.
Distribuição normal
Nas amostras grandes, os resultados previstos pelo
acaso t êm uma distribuição normal (gaussiana ). Uma
distribuição normal é uma distribuição binomial cha -
mada frequentemente de “curva em forma de sino”,
devido ao formato geral da curva que os dados formam
quando são representados graficamente ( Figura 2.17 ).
Uma distribuição normal contém todos os resulta
dos experimentais possíveis. A média ( p ) é o resultado
médio e os outros resultados são distribuídos em torno
da m édia. O segmento central alto da curva mais pró-
ximo da média representa os resultados dentro da pro-
babilidade de ocorrência mais alta. A probabilidade dos
resultados experimentais fica menor na direção das ex
tremidades esquerda e direita da curva. A probabilidade
de um determinado resultado experimental é quantifi
cada por uma medição chamada desvio padrão (o). Em
uma distribuição normal, aproximadamente 68,2% de
todos os valores de resultado caem em um desvio pa -
drão da média, 95,4% dos resultados caem em dois des-
vios padrão da média e 99,8% dos resultados caem em
três desvios padrão da média ( Figura 2.17). O resultado
observado de um determinado experimento pode ser
comparado com a distribuição normal para determinar
a probabilidade dessa observação experimental especí-
fica em compara ção com todos os resultados possíveis
na distribuição usando ci , o desvio padrão, como guia.
s8 iX Distribuição normal
idealizada
c tendem a ter valores de qui-quadrado maiores do que os
li
-3o -2o -o |i o 2o 3o
68,2%
95,4%
993%
Figura 2.17 A representa ção gr áfica da distribuição dos
resultados casuais produz uma distribui ção normal. 0
desvio padrão (o ) é usado para caracterizar a dispersão dos
possíveis resultados em torno da m édia ( p).
- Por convenção, os resultados experimentais obser -
vados que tenham uma probabilidade menor que 5%
—
(< 0,05) isto é, uma probabilidade que é mais de dois
—
desvios padrão afastada da m édia costumam ser con -
siderados como aqueles que exibem uma diferença es-
-
e o resultado esperado. A análise do qui quadrado testa
- o desvio estatisticamente significante nos resultados ge
néticos experimentais.
-
-
Aná lise do qui quadrado
O teste do qui - quadrado (x2) é o método estatístico
utilizado com mais frequência nos experimentos genéti -
cos para comparar resultados experimentais observados
com resultados previstos com base na hipótese da pro-
babilidade. O teste do qui -quadrado quantifica o grau de
correspondência entre uma observação experimental c
o resultado previsto determinando a probabilidade do
resultado observado. O teste do qui- quadrado é apro-
priado para essa tarefa quando a hipótese experimental
empregada para prever o resultado depende do acaso,
como acontece com as razões mendelianas. Assim,
quando é feito um teste do qui -quadrado, esse teste está
- medindo o grau de correspondência entre as observa-
ções experimentais e as previsões experimentais. C ) teste
do qui quadrado se provou flexível e preciso para medir
a adequação entre os resultados experimentais observa
dos e previstos em uma ampla gama de experimentos.
-
O valor do qui-quadrado para a análise de um de-
- terminado experimento é obtido em duas etapas. Pri -
meiro, a diferença entre o n ú mero observado e o n ú -
- mero previsto em cada categoria de resultado é elevada
ao quadrado e dividida pelo n ú mero previsto na cate-
goria; e segundo, os valores obtidos para cada classe de
resultado são somados. A fórmula Y2 é
Et
em que O é o n ú mero observado da prole em cada classe
de resultado, £ é o n úmero previsto para cada classe e o
-
somatório (£ ) é feito ao longo de todas as possíveis clas
ses de resultado.
O tamanho do valor do qui-quadrado para um expe-
rimento depende de três parâ metros: tamanho da amos-
tra experimental, quantidade de classes de resultado c
quantidade de observações em cada classe de resultado;
então, é logico que os experimentos com grandes quan
tidades de classes de resultado ou com mais observações
-
experimentais registradas para cada classe de resultado
encontrados nos experimentos com n ú meros menores
em cada classe. Simplesmente, a adição de mais valores
ou de valores maiores para obter um valor de qui-qua-
drado leva a somas maiores. Consequentemente, os valo -
res de qui- quadrado náo são diretamente compará veis de
um experimento para o outro. Em vez disso, cada valor
experimental do qui-quadrado é interpretado em termos
da distribuição normal dos resultados previstos para um
experimento desse tamanho.
 Capítulo 2 Transmissão genética 49

A interpretação é feita por meio de um valor da pro
habilidade (valor P), que é uma expressão quantitativa
da probabilidade de que os resultados de outro experi
mento de mesmo tamanho e estrutura vão se desviar
tanto ou mais dos resultados previstos pelo acaso. Os
valores P na análise do qui -quadrado estão diretamente
relacionados com a probabilidade de resultados experi
mentais em uma distribuição normal. Altos valores de
P (valores próximos de 1) estão associados com baixos
x-
valores de 2 Baixos valores do qui - quadrado ocorrem
quando os resultados observados e os previstos são muito
parecidos. Um alto valor de P indica que provavelmente
o acaso de forma isolada pode explicar os desvios das ob-
servações experimentais em relação aos valores previs-
tos. Desse modo, um experimento que produza um valor
de P igual a 0,90 significa que os resultados observados
e previstos são próximos e que 90% de todos os valores
x
possíveis de 1 são iguais ou maiores que o valor obtido
no experimento. Por outro lado, baixos valores de P cor-
respondem a altos valores de qui-quadrado. Eles indicam
uma diferença substancial entre os resultados observados
e os previstos. Quanto maior a diferen ça entre os valores
observados e os previstos para um experimento, maior o
valor de tf e menor o valor de P . seia no valor de P correspondente. Um resultado estatis-
A interpretação estat ística de um valor do qui-qua
drado é determinada identificando o valor de P para cada
experimento, e esse valor depende do n úmero de graus
de liberdade ( d/ ) no experimento que está sendo exa -
minado. Para cada experimento, o valor de df é igual ao
n ú mero de classes de resultado ( n ) menos 1 , ou ( w - l ).
No sentido estatístico, df é igual ao n úmero de variáveis
independentes em um experimento. Por exemplo, supo-
nha que estivéssemos fazendo um teste do qui-quadrado
- de 100 lançamentos de moeda. Existem duas classes de
resultado, caras e coroas, cada uma delas com uma pre-
- visão de 50 ocorrências. No entanto, depois de registrar -
mos o n úmero de eventos em uma classe, digamos que
54 caras, o número de eventos na segunda classe passa
a depender desse primeiro número. Em nosso exemplo
- de lançamento de moeda, se lançarmos uma moeda 100
vezes e houver 54 caras registradas, os outros 46 lança
mentos devem ser coroas. Aqui o n úmero de graus de
liberdade é um, pois, embora haja dois resultados possí-
veis, o valor de um sempre depende do valor do outro.
A Tabela 2.4 apresenta valores de qui-quadrado para
diferentes graus de liberdade, que são exibidos ao longo
da margem esquerda da tabela. Os valores de P corres-
pondentes são apresentados ao longo da margem supe-
rior. Para determinar o valor de P para o valor do qui -qua -
drado de um experimento, a primeira etapa é determinar
o n úmero de graus de liberdade. A segunda etapa é loca-
lizar o valor do qui-quadrado na linha horizontal à direita
desse n ú mero de graus de liberdade. O valor de P para o
resultado do experimento em questão é encontrado no
topo da coluna contendo o valor do qui -quadrado .
A interpreta çã o dos valores do qui-quadrado se ba -
- ticamente significante da análise do qui-quadrado é de-
finido como o resultado para o qual o valor de P é menor
que 0,05. Isso significa que h á menos de 5% de chance
( < 0,05) de obter a observaçã o experimental por acaso.
Por convenção, quando qualquer resultado experimental
tem menos de 5% de probabilidade, a hipótese do acaso
é rejeitada. Em outras palavras, se o valor de P for menor
que 0,05, a diferença entre os resultados observados e os
previstos é considerada estatisticamente significante e a

Tabela 2.4 Tabela do qui-quadrado

Valor da probabilidade (P)
df 0,95 0,90 0,70 030 0,30 0,20 0,10 0,05 0,01 0,001
1 0,004 0,016 0.15 0,46 1,07 1,64 2,17 3.84 6,64 10,83
2 0,10 0,21 0,71 1,39 2,41 3.22 4,61 5,99 9,21 13,82
3 0,35 0,58 1.42 237 3,67 4,64 6,25 7,82 1135 16,27
4 0,71 1,06 2,20 336 4,88 5,99 7,78 9, 49 1338 18,47
5 U5 1,61 3,00 435 6,06 7,29 9,24 11,07 15,09 20,52
6 1.64 2,20 3,83 535 7,23 8, 56 10,65 12,59 1631 22,46
7 2,17 2,83 4,67 635 8,38 9,80 12,02 14,07 18,48 24,32
8 2,73 3,49 5.53 734 9,52 11,03 1336 15,51 20,09 26,13
9 333 4,17 6,39 8,34 10,66 12,24 14,68 16,92 21,67 27,88
10 3,94 4,87 7,27 934 11,78 13,44 15,99 18,31 23,21 29,59
11 4, 58 5,58 8,15 1034 12,90 14,63 17,28 19,68 24,73 31,26
12 5.23 6,30 9,03 11.34 14,01 15,81 18,55 21,03 2632 32.91
13 5,89 7,04 9,93 12,34 15,12 16,99 19,81 22,36 27,69 34,53
14 6,57 7,79 10,82 13,34 16,22 18,15 21,06 23,69 29,14 36,12
15 7,26 8,55 11,72 14,34 1732 19,31 2231 25,00 3038 37,70
N ão rejeição da hipótese do acaso | Rejeição da hipótese do acaso |
-
Nota: Os valores do qui quadrado estio no corpo da tabela , os graus de liberdade estio IU extrema esquerda e os valores da probabilidade estio
-
no topo de cada coluna dos valores do qui quadrado.
50 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

hipó tese experimental é rejeitada, inversamente, valores

Tabela 2.5 Análise do qui -quadrado dos dados de
de P maiores que 0,05 indicam um desvio insignificante
cruzamento trllbriòo de Mendel
entre os valores observados e previstas. Esses valores re-
sultam na nào rejeição da hipótese do acaso. Observa çã o de Mendel ' N ú mero previsto
Fenótlpo Número
Análise do qui-quadrado dos dados de .
Lisa amarela, roxa 269 269,58
Mendel Lisa, amarela, branca 98 89.86
Os métodos estatísticos modernos nos permitem Lisa, verde, roxa 86 89,86
fazer algo que Mendel nào podia fazer —
testar seus
dados experimentais quanto à sua compatibilidade com
Lisa , verde, branca
Rugosa , amarela , roxa
27
88
29,95
89,86
as previsões das leis da segregação e da segregação inde- Rugosa, amarela , branca 34 29,95
pendente. A Tabela 2.1 contém dados de Mendel para a Rugosa, verde, roxa 30 29,95
segregação da F2 relativos a sete traços testados por ele.
Na primeira linha da tabela , vemos que Mendel classifi
cou 7.324 sementes nos fenótipos liso e rugoso. Entre
- Rugosa, verde, branca
639
7
638,99
9,98

essas, ele contou 5.474 lisas e 1.850 rugosas. Com base nas - - -
X = ( 269 269,58)7269,58 4 ( 98 89,86)789.86
3

+ (86 - 89,86)789,86 (27 - 29,95)729,95

previsões de sua hipótese de segregação, Mendel previu
que 75% da prole Fv seriam de sementes lisas e os 25% res- + (88 - 89.86)789,86 + (34 - 29,95)729,95
- -
+ ( 30 29,95)729,95 + (7 9,98)79,98

=—
tantes seriam de sementes rugosas. Isso significa que ele

=
-
previu (7324)(0,75) 5.493 sementes lisas e (7324)(035)
1.831 sementes rugosas. O grau de liberdade é igual a 1
df 7
2,67

Valor de P > 0,90

-
no experimento e o qui quadrado é calculado como Os dados s5o extra ídos da Figura 2 14.
'

X = (5.474 - 5.493) /5.493 ( 1.850 - 1.831) / 1.831

1 2 2

0,066 4- 0,197 » 0,263

Observa çã o gen é tica 0 teste do qui quadrado (x7)
Para dF = 1, o valor dc P fica entre 0,50 c 0,70 (ver Ta - determina se os dados experimentais está o em conformidade
bela 2.4). Isso é bem acima do valor de corte de 0,05
com as expectativas de uma hipótese casual calculando um
e, consequentemente, representa um desvio insignifi - valor de P ( probabilidade) para o experimento. Valores altos
cante. Portanto, os dados da F , de Mendel relativos ao
de P correspondem a valores baixos de x2 e indicam uma cor-
formato da semente são coerentes com as previsões da
respond ência próxima das observações experimentais com as
lei da segregação.
expectativas, A hipótese casual é rejeitada se o valor de P para
A Figura 2.12 fornece os dados que Mendel coletou
um resultado experimental for menor que 0,05.
sobre o formato e a cor da semente que podemos usar
para testar se seus resultados foram coerentes com suas
previsões de segregação independente. Com base na
razão prevista de 9:3:3:1, as 556 F2 produzidas por Men - 2.6 A herança autossômica e a
del deveriam ter a seguinte distribuição: genética molecular se comparam
Lisa, amarela (556)(0,5625) 312,75
= à s previsões dos princípios da
Lisa, verde (556)(0,1875) = 104,25
Rugosa, amarela (556)(0,1875) = 104,25 hereditariedade de Mendel
(556)(0,0625) = _ 34,75
Rugosa , verde
556,00
Durante a primeira década do século XX, imedia
tamente após a redescoberta das regras da transmissão
-
O valor do qui -quadrado é calculado como hereditá ria de Mendel, biólogos começaram a estender
- -
X = (315 312,75)7312,75 (108 104,25)7104,25
2 as descobertas de Mendel para espécies diferentes das
- -
+ (101 104,25)7104,25 + (32 34,75)734,75 plantas de ervilha . Eles também identificaram exce
ções aos princí pios hereditá rios de Mendel ( Capítulo
-
= ,016 + 0,135 + 0,101 + 0,218 = 0,470
0
-
Nesse caso, df 3 e o valor de P fica entre 0,90 e 0,95. 4). Nesta seçã o final, aplicamos os princí pios mendelia -
Isso indica um desvio insignificante, já que o valor de nos à transmissão de certos traços nos seres humanos.
P está acima do valor de corte 0,05. Os dados da F;. de Além disso, consideramos a correspond ência dos acha -
Mendel relativos à cor e à forma da semente também são, dos genéticos moleculares com a herança mendeliana e
portanto, coerentes com as previsões da segregação in - exploramos as causas subjacentes de quatro dos traços
dependente. Um terceiro exemplo da análise do qui-qua
drado, usando resultados de cruzamentos triibridos de
- estudados por Mendel.
Herança autossômica se refere à transmissão dos
um dos experimentos de Mendel, é exibido na Tabela 2.5. genes que são carregados em autossomos, os cromos-
A partir da análise estatística desses dados, conclu ímos somos (22 pares nos seres humanos) que são encontra -
que os resultados de Mendel são coerentes com as previ- dos tanto nos homens quanto nas mulheres. Em razão
sões da segregação e da segregação independente. das duas cópias de cada autossomo em nosso genoma,
 Capítulo 2 Transmissão genética 51

Sí mbolos heredograma são numerados por um algarismo romano

Fémea Macho .
(1, 11, 111 etc ) para indicar sua geração, combinado com
L
O _] N ào expressa o traço um algarismo ará bico (1, 2, 3 etc.), que identifica cada
9| Expressa o traço organismo em uma geração.

<3 Cl Portadores heterozigotos de um alelo recessivo Heran ça autossômica dominante

0 0 Falecido (d. 0000 - data do falecimento) O heredograma na Figura 2.19 mostra as caracter ís-

^
<>
Linhagens
Sexo nâo especificado

Gera ção
Pais
Pais (consangu í neos)
; Adoção
1 I I Irmãos
cfb Gémeos idênticos
óh G ê meos fraternos
Algarismos
LII, III etc. Romanos * gerações
1, 2.3 etc Ará bicos = indiv íduos em uma geração
Figura 2.18 Sí mbolos geneal ógicos comuns
cada organismo carrega duas có pias (alelos) de cada
gene autossômico. Os alelos nos cromossomos homó-
logos podem ser idênticos, situação em que uma pes -
soa tem um genótipo homozigoto; ou os alelos podem
ser diferentes, produzindo um genótipo heterozigoto.
A herança autossô mica nos permite ver as leis da se -
gregaçã o e da segregação independente de Mendel em
ação. Os autossomos são diferentes dos cromossomos
sexuais (cromossomos X e Y) e a herança autossô mica
segue padrões diferentes dos encontrados na herança
dos genes nos cromossomos sexuais (ver Capítulo 3).
Os heredogramas, ou árvores genealógicas, são um
tipo de abreviatura simbólica usada para traçar a he -
ran ça dos traços em seres humanos e animais, como ca -
valos, cã es, gatos, gado e outros. Na notação genealógica
padrão, os machos são representados por quadrados
e as fêmeas, por círculos ( Figura 2.18) Um círculo ou .
quadrado preenchido indica que o fenótipo de interesse
está presente. Uma linha cruzando um símbolo indica
que a pessoa faleceu. Os pais estão conectados uns aos
outros por uma linha horizontal a partir da qual desce
uma linha vertical até a sua prole. Os indivíduos em um
ticas observadas frequentemente na herança autossô-
mica dominante de uma doença. Repare nas seis carac
terfsticas seguintes:
-
1. Cada indivíduo portador da doença tem pelo
menos um dos pais afetados . Qualquer portador de
um alelo dominante vai exibir o fenótipo dominante.
Portanto, qualquer doença ou transtorno causado
por um alelo dominante aparece nas gerações suces-
sivas (essa característka é descrita como um padrão
vertical de transmissão). Na Figura 2.19, todas as 13
crianças afetadas nas gerações II , III c IV têm pelo
menos um dos pais afetados. As únicas exceções a
essa regra são ( 1) a ocorrência de uma nova mutação
em uma criança e ( 2) uma pessoa com a mutação do-
minante entrando na fam ília através do casamento.
. O heredograma nâ o exibe nenhuma evidê ncia de
uma nova mutaçã o, mas o indivíduo III-16 entra na
família pelo casamento e tem a mutação dominante.
2. Machos e fémeas são afetados em quantidades
iguais. As mutações portadas por um autossomo
tém ocorrência igualmente provável em ambos os
sexos. Entre o total de 15 indivíduos afetados na fi -
gura, 7 sào machos e 8 sã o fêmeas .
3. Qualquer um dos sexos pode transmitir o alelo
da doença . Oito pais na Figura 2.19 transmitiram a
doença para um ou mais filhos. Três dos pais trans-
missores são machos e quatro são fémeas.
4. Em cruzamentos em que um dos pais é afetado e
o outro não, aproximadamente metade da prole
expressa a doença . As doenças causadas por mu -
tações dominantes normalmente sà o raras nas po-
pula ções e a maioria dos indivíduos afetados é he-
terozigota. Um cruzamento entre um progenitor
afetado e um progenitor n âo afetado quase sempre
pode ser interpretado geneticamente como um
cruzamento heterozigoto- homozigoto, devendo
produzir uma raz ão de 1:1 entre os fenótipos.
Nessa fam ília , existem seis cruzamentos entre uma

I d 1956 d 1960
2 4 6 8
d 1988 d 1990 OTI
» o^ár D rã à‘ t r o o’
d. 1972
5
To"
*fa”ã Éf« ó”ò
4 ,6 18
——
• 19

4 5 12
IV

Figura 2.19 Herança autossômica dominante.

52 Análise gen é tica: uma abordagem integrada
pessoa afetada que é heterozigota e uma pessoa não
afetada que é homozigota para o alelo recessivo.
Dentre as 19 crianças geradas por esses cruzamen -
tos, 10 delas sã o afetadas e 9 n ão sã o afetadas.
5. Dois progenitores não afetados não terão filhos
com a doença. Os fenótipos dominantes requerem
a presença de pelo menos uma cópia do aJelo domi-
nante. Se cada progenitor tiver o fenótipo recessivo
("normal"), eles precisam ser homozigotos para o
alelo recessivo e toda a sua prole também deve ser
homozigota. Três cruzamentos desse tipo são exibi-
dos no heredograma e todos os sete filhos resultan
tes tém o fenótipo normal. A nova mutação é uma
exceção a essa regra, mas não é vista nessa fam ília.
6. Dois progenitores afetados podem gerar filhos
não afetados. Se cada progenitor for heterozigoto,
a razão prevista entre filhos afetados e não afetados
é 3:1. Há um cruzamento como esse exibido no he-
redograma e três dos quatro filhos resultantes são
afetados. O cruzamento de dois progenitores hete-
rozigotos afetados apresenta uma chance de uma
em quatro de gerar um filho homozigoto para o alelo
mutado e uma chance de uma em quatro de produzir
um filho homozigoto para o alelo do tipo selvagem . subsequentes do casal é Se os dois progenito-
Herança autossômica recessiva
A Figura 2.20 mostra um heredograma humano
exibindo as características observadas frequentemente
na herança autossômica recessiva de uma doença.
Existem seis caracter ísticas a ser observadas:
1. Os indivíduos portadores da doença geralmente
nascem de pais não portadores. Um filho com a
doença (o fenótipo recessivo) precisa ter herdado
uma cópia do alelo recessivo de cada progenitor.
Além disso, é comum os filhos com a doença terem
sido gerados por progenitores com o fenótipo domi
nante ( normal) que são heterozigotos. Quatro mem
- - - -
bros da família afetados, IV 5, IV 6, IV 10 e V 3, são
filhos de progenitores portadores heterozigotos.
2. Se apenas um dos progenitores tiver o trans -
torno , o risco de o filho té- lo depende do genó-
tipo do ontro progenitor. O progenitor afetado é
homozigoto recessivo e deve passar uma cópia do
alelo recessivo para cada filho. Se o progenitor n ão
Figura 2.20 Herança
autossômica recessiva.
I Ojg
II
III
3
nvó ú 6 èyè ú
» 2 3
* *
» a ó ó‘ á è‘
! s
afetado for heterozigoto, o risco de um determi -
nado filho vir a ser afetado é Se o progenitor n ão
afetado for homozigoto para o alelo dominante,
todos os filhos serão heterozigotos n ão afetados.
3. Se ambos os progenitores tiverem o transtorno,
todos os filhos terão o transtorno. Se ambos os
progenitores forem homozigotos recessivos, toda a
sua prole terá o mesmo genótipo homozigoto. Desse
modo, os quatro irmãos afetados na última geração
do heredograma idealizado herdam esse transtorno.
4. A proporção entre os sexos na prole afetada deve
- ser igual. Machos e fé meas tém a mesma chance de
serem homozigotos para o alelo recessivo. O sexo
de um filho independe da probabilidade de ocor-
rência do genótipo homozigoto recessivo no lócus
-
autossômico. ( Lembre se de que as proporções
iguais entre os sexos també m são observadas nos
transtornos autossómicos dominantes.) No exem -
-
—
plo do heredograma, existe um total de oito indiví
duos afetados quatro machos e quatro fê meas.
5 A doença normalmente nã o aparece em cada
.
geração; mas, se um filho afetado for gerado por
progenitores nâo afetados, o risco para os filhos
res tiverem o fenótipo dominante, eles podem gerar
um filho com o fenótipo recessivo apenas se cada
um deles for heterozigoto. Normalmente isso é raro
em uma população, então o nascimento de filhos
afetados é raro. Porém, se um filho afetado nascer
de um casal saudável, cada progenitor é um porta -
dor heterozigoto do alelo recessivo da doença e o
J.
risco da doença para cada outro filho é No exem -
plo do heredograma, a condição recessiva está con
finada à quarta e quinta gerações.
-
6. Se a doença ou transtorno for raro em uma po-
pulação, o§ progenitores não afetados de um
- filho afetado são mais propensos a ser relacio-
- nados entre si . Os indivíduos relacionados entre
si podem portar alelos idênticos em consequ ência
de sua ancestralidade compartilhada. Se o alelo
recessivo estiver presente na família , o compar
tilhamento dos alelos através da ancestralidade
-
comum aumenta a probabilidade de os indivíduos
relacionados poderem ser portadores do alelo re-
cessivo em comparação com a população total. Na
oi ns
rá ,,ò,
• ^^ ^
7 * "t 15
* ós ó,‘,ú"ó' á’ ú ò s ! !

Figura 2.20, os dois progenitores afetados de quatro
irmãos afetados são relacionados entre si.
Genética molecular dos tra ços de Mendel
A investigação dos traços de Mendel continua até
hoje por meio de métodos de genética molecular para
identificar os genes responsá veis pela variação feno-
tí pica que Mendel estudou em seus traços. Essas an á
lises moleculares, a primeira delas publicada em 1990,
descrevem a variação do ácido nudeico ( DNA e RNA )
veis pelos traços de Mendel. Um elemento fundamen
e a varia ção polipeptidica ( proteína e enzima ) responsá
tal da gen ética moderna é a integração ininterrupta dos
princí pios de transmissão genética com os princí pios
de análise da genética molecular. Na mente dos gene
ticistas atuais, a transmissão dos alelos que produzem
variação morfológica é equiparada com a transmissã o
das sequências de DNA variáveis que agem através do
RNAm para produzir variantes de proteína responsá -
veis pelas diferentes formas morfológicas de um tra ço.
Partindo dessa perspectiva, a análise da transmissão ge -
nética e a análise da genética molecular não são ocupa -
ções distintas. Em vez disso, sã o abordagens científicas
paralelas que permitem diferentes formas de examinar
o mesmo resultado —
dois lados da mesma moeda, se
—
preferir com o padr ã o de transmissão das variantes
morfológicas podendo ser seguido através do exame das
moléculas hereditá rias de DNA, RNA e prote í na.
Identificar esses genes e determinar como a varia
ção molecular destes produz variação morfológica nas
plantas de ervilha requer a demonstração de que ( 1 ) a
variação alélica coincide com a variação morfológica,
( 2) a variação do DNA nos alelos produz produtos pro
teicos diferentes, (3) os produtos proteicos de cada alelo
t ém estruturas diferentes que levam a capacidades fun
cionais diferentes e (4) as diferenças funcionais entre os
alelos contribuem para a variação morfológica nas plan -
tas de ervilha. As diferenças moleculares entre os alelos
também costumam esclarecer por que os alelos são do
minantes ou recessivos uns em relação aos outros.
Mendel não deixou nenhum pacote de sementes
bem rotulado para os pesquisadores posteriores analisa
rem, ent ão o processo de localização dos traços exatos
que ele examinou e dos genes e proteínas responsá veis
por esses traços tem sido complicado. Contudo, até
hoje os pesquisadores tiveram êxito na identificação dos
genes responsá veis por quatro dos sete traços de Men -
del. Além disso, para cada gene, as mutações específicas
que produzem os alelos mutados foram determinadas.
Em cada caso, as muta ções reduzem significativamente
ou eliminam por completo a produção ou função do
polipeptídeo do tipo selvagem. Como resultado dessa
perda de função, os alelos mutados dos traços de Men
del são recessivos em relação aos alelos dominantes do
tipo selvagem. Para cada gene, uma planta que herda
um alelo do tipo selvagem e um alelo mutado produz
1 N.T.: cm traduçã o livre, “fique verde"
Capítulo 2 Transmissão genética 53
uma quantidade suficiente de polipeptídeos normais
para gerar o fen ótipo do tipo selvagem. Por outro lado,
as plantas homozigotas para o alelo mutado tém o fen ó-
tipo mutado recessivo (Tabela 2.6).
Formato da semente ( lisa ou rugosa, gene R ) Em 1990,
uma pesquisa publicada por Madan Bliattacharyya e co-
laboradores descreveu a análise de um gene responsável
pela forma lisa e rugosa da semente. Chamado original -
- mente gene R e mais tarde renomeado para Sbel , o gene
produz a enzima de ramificação do amido que ajuda a
converter uma forma linear prevalente do amido, cha -
-
- mada amilose, em uma forma ramificada complexa do
amido, chamada amilopectina . Nas plantas homozigotas
ou heterozigotas para o alelo do tipo selvagem, é produ-
zida uma quantidade suficiente de enzima de ramifica -
- ção do amido para converter a maior parte da amilose
disponível em amilopectina. No entanto, nas plantas ho-
mozigotas para o alelo recessivo, apenas uma pequena
porcentagem da amilose é convertida cm amilopectina.
O fenótipo recessivo da semente rugosa é produzido
como um resultado indireto da alta concentração de
amilose nas sementes rugosas. A amilose perde facil -
mente as moléculas de açúcar e, no desenvolvimento
das sementes rugosas, a alta concentração de açúcar
livre leva as sementes a importarem uma quantidade
excessiva de água , que incha as sementes em desenvol -
vimento. À medida que as sementes amadurecem , elas
desidratam naturalmente. As sementes rugosas em pro-
cesso de amadurecimento perdem muito mais água do
- que as sementes lisas que passam pelo mesmo processo,
resultando em um colapso parcial das membranas das
sementes rugosas que nào ocorre nas sementes lisas.
- Tamanho do caule ( alto e baixo, gene Le ) Em 1997,
dois grupos de pesquisa , um liderado por David Mar-
-
tin e o outro por Diane Lester, determinaram que um
gene chamado Le produz a variação no comprimento
do caule, que Mendel considerou como plantas altas e
baixas, controlando o crescimento do caule principal da
- -
planta. Esse gene Le produz giberelina 3 ($ hidroxilase,
uma enzima que catalisa uma etapa da via bioquímica
multietapas que sintetiza o hormò nio de crescimento
- da planta , a giberelina As plantas do tipo selvagem são
capazes de produzir giberelina e podem ficar altas, mas
uma mutação por substituição de base no alelo mutado
resulta em uma substituição de aminoácido na enzima
mutada. A mudança do aminoácido inativa a função
da enzima mutada e resulta em um bloqueio da via de
síntese da giberelina . A perda de função dessa enzima
produz plantas com fenótipo mutado de baixa estatura.
Cor da semente ( amarela e verde, gene /) Dois estudos
publicados em 2007, um por Ian Armstead e colabora -
dores e o outro por Sylvain Aubry e colaboradores, iden-
- -
tificaram o gene Sgr, conhecido como stay greeti 1 , que
produz sementes mutadas verdes em vez das sementes
amarelas do tipo selvagem nas plantas homozigotas para
uma mutação do gene. Nesse caso, o produto polipep -
54 Análise gené tica: uma abordagem integrada

Tabela 2.6 Identificação e caracterização molecular dos traços de Mendel

Traço Gene e produto Aleio do tipo Aleio mutado e função Referência

gènico selvagem e função
Formato da O gene è oSàef , que O aleio dominante O alek> mutado BHATTACHARYYA, M .
semente produz a enzima de do tipo selvagem (R) recessivo (r) contém um K. et al. 1990. Ce // 60:
(sementes lisas e ramificação do amido . produz a enzima de segmento inserido com -
115 122.
rugosas) ramificação do amido aproximadamente 800 pares
que converte amilase . de base de comprimento. O
um amido linear, em transcrito do aleio mutado
amilopectlna, um não produz um produto
amido ramificado enzimático, resultando em
complexo . uma perda de função
Comprimento O gene é o Le, A G30H produzida O aleio mutado recessivo /e LESTER, D. R. et al.1997.
do caule (plantas produzindo giberelina pelo aleio dominante contém uma substituição Plont Cell 9: 1435-1443 .
altas e baixas) 3-0 hidroxilase (G30H). Le converte um de base que resulta em uma
precursor na sintese mudança de aminoácido A . MARTIN, D. N. et al.
do hormònlo de G3(JH mutado tem menos
1997. Proc. Natl. Acad.
crescimento da planta,
a giberelina, fazendo
de 5% da atividade do
produto do tipo selvagem
Sd^ USA 94: 8907- 8911 .
que a planta fique alta. e produz menos giberelina,
levando a plantas de
estatura mais baixa.
Cor da semente O gene se chamava O aleio dominante O aleio mutado recessivo (/) .
ARMSTEAD, I et al .
(semente amarela originalmente / e mais do tipo selvagem ( /) contém duas substituições .
2007 Sdence 315: 73 .
e semente verde) tarde foi renomeado produz uma enzima de base e uma inserção de
Sgr ( stay green ). O gene que catalisa uma par de bases. O polipeptfdeo AUBRY, S. et al. 2008.
produz uma enzima etapa na via de mutado resultante não tem Plont Mol. BioL 67:
que ajuda a decompor decomposição da função, levando ao bloqueio 243-256.
a clorofila. clorofila, que torna da via de decomposição da
amarelas as sementes clorofila e fazendo que
do tipo selvagem as sementes mutadas
à medida que retenham sua cor verde
amadurecem . Imatura.
Cor da fior (roxa e Chamado O aleio dominante O aleio mutado recessivo HELLENS, R. Retal.
branca) originalmente gene Ac do tipo selvagem (A ) (o) contém uma 2010. PLoS One 5: 1 -8.
renomeado para bHLH, produz uma proteí na substituição de base que
o gene produz uma que ativa a transcrição resulta na produção de
proteína que ativa a dos genes necessários RNAm anormal. O RNAm
transcrição dos genes- para sintetizar o mutado não produz a
- alvo. pigmento roxo da proteína de ativação da
planta, chamado transcrição, bloqueando
antocianina . assim a produção de
antocianina e resultando no
desenvolvimento de flores
brancas.

tídico do Sgr é uma enzima que catalisa uma etapa na
decomposição da clorofila , um composto de cor verde.
A decomposição da clorofila ocorre normalmente à
medida que as sementes amadurecem e resulta na cor
amarela das sementes do tipo selvagem. Uma mutação
impede a produção de uma enzima funcional, e a ausê n -
cia de sua atividade na via de decomposição da clorofila
resulta na retenção da cor verde nas sementes mutadas.
Cor da flor (roxa e branca, gene A ) Mais recentemente,
em 2010, o gene responsá vel pela mutação da flor
branca nas plantas de ervilha de Mendel , um gene origi
nalmente designado gene A , foi identificado. Um grupo
de pesquisa liderado por Roger Hellens determinou que
a mutação do gene bHLH nas plantas de ervilha produz
flores mutadas brancas em vez de flores roxas do tipo
selvagem. O produto proteico do bHLH é uma proteí na
do fator de transcrição que interage com outras proteí -
nas para ativar a transcrição de certos genes. Nesse caso,
os genes visados para a ativação da transcrição estã o
ativos na via que normalmente produz o pigmento roxo
antocianina da planta. As plantas do tipo selvagem pro -
duzem uma quantidade suficiente do produto gè nico
( a proteí na do fator de transcrição) para ativar a trans-
crição dos genes produtores de antocianina. As plantas
homozigotas para as mutações desse gene, porém, são
incapazes de ativar a transcrição dos genes produtores
- do pigmento. Essas plantas não possuem antocianina e,
portanto, suas flores são brancas.
Uma caracter ística comum a cada um dos genes que
controlam os traços de Mendel é que os alelos do tipo
selvagem são dominantes em relação aos alelos mutados,
que são recessivos. Isso é uma consequência da perda de

função pelos alelos mutados. Para cada gene, uma ou duas
cópias do alelo do tipo selvagem resultam no fenótipo do
tipo selvagem, enquanto o fenótipo mutado é produzido
nas plantas homozigotas para o alelo mutado. ( Desenvol -
vemos essa relação entre os alelos c exploramos outros
tipos de relações de dominâ ncia na Seção 4.1.)
As principais conclusões desses estudos molecula
res que identificam os genes examinados por Mendel
em seus cruzamentos são que (1) a herança das varian
tes alélicas acompanha com precisão os padrões de
transmissã o da varia ção morfológica e (2 ) as variações
morfológicas nas plantas de ervilha resultam de diferen -
ças na estrutura e na fun ção das proteí nas produzidas
ESTUDO DE CASO
Herança da anemia faldforme nos seres humanos
O Online Mcndclian Index of Man ( Omim ) é um catá
logo de informações pú blicas atualizadas permanenteinente
que fornece informações sobre mais de 18 mil traços heredi
tá rios humanos. O Omim pode ser accssado em < www.ncbi .
.
nlm.nih.gov/omim> Cada traço apresentado no catálogo
Omim possui um numero identificador exclusivo. Um traço,
chamado anemia falciforme ( SCD), n úmero Omim 603903,
.
é o objeto da última discussã o ( ver Capítulo 10) que intro
duz vá rias t écnicas de pesquisa importantes e as utiliza para
descrever a descoberta e aná lise da base molecular da SCD
c a evolução do alelo mutado. Aqui, examinamos a transmis
são hereditária da SCD, que é provocada por uma mutação
por substituição de base no gene f) globina. A substituição
de base altera a proteína -globina e resulta na herança da
^
SCD como uma condição autossòmica recessiva. A heran ça
da variante p5 e da SCD pode ser rastreada pela identifica
ção dos fen ó tipos dos membros da família e peia sua exi
bição em um heredograma ou á rvore genealógica. Os here-
dogramas exibidos na Figura 2.21 identificam as mulheres
com círculos e os homens com quadrados, sendo típicos de
uma família na qual a SCD é herdada. Os círculos e quadra
dos azuis indicam membros da fam ília que n ão têm o traço
rastreado; um círculo ou quadrado rosa preenchido indica
.
uma pessoa com o traço (nesse caso a SCD ). O acasala
mento é identificado pela linha horizontal que conecta um
símbolo masculino e um símbolo feminino. A prole de uma
união está conectada a essa linha horizontal pelas linhas
verticais da descendê ncia. Os grupos de irmãos são unidos
uns aos outros por linhas enquadradas Os indivíduos em
um heredograma recebem n ú meros que indicam sua gera-
ção ( algarismos romanos ) e sua ordem de nascimento na ge-
.
raçã o (algarismos ará bicos) Na Figura 2.21a , o pai e a mãe
são identificados como 1-1 c 1-2. Sua filha 11-4 6 afetada pela
SCD. conforme indicado por um círculo preenchida Seus ir
- - - .
mãos, os indivíduos II 1, II 2 c II 3, são saudá veis
O heredograma na Figura 2.21a identifica o genótipo
para o gene p globina. Cada pessoa 6 portadora dc duas có
-
pias do gene P-globina em cada membro dc uma determi -
nada família. Repare que a pessoa II- l é homozigota para (3\
o alelo do tipo selvagem. De modo alternativo, os irmãos II 2
- - -
e II 3 e os pais no heredograma, 1 1 e 1 2, são heterozigotos e
portadores dos alelos $ A e do alelo mutado pv.
Capítulo 2 Transmissão genética 55
pelos alelos. A análise da genética molecular levou (3) à
identificação das diferenças na sequência do DNA entre
os alelos, à determinação do impacto dessas diferenças
no RNAm e descrição da alteração das estruturas das
proteínas resultantes de cada RNAm c (4) à análise fun-
cional do produto proteico de cada alelo para descrever
- o papel que ele exerce na produção do fenótipo.
- Observa çã o gen é tica A identificação dos genes res
ponsáveis pelos traços de Mendel amplia a compreensão da
transmissão hereditá ria ao estabelecer uma base molecular
para a variação observada rvos fenótipos das plantas.
- -
O filho 11 4 é homozigoto para (35 c tem SCD. fcssc
transtorno é um traço recessivo porque o fenótipo é exibido
- apenas em uma pessoa que é homozigota para o alelo que
o produz. Por outro lado, o fenótipo dominante do tipo sel -
vagem é produzido pela presença de uma ou duas cópias
do p*. Nessa família , cada progenitor tem o fenótipo domi-
nante do tipo selvagem, mas o surgimento de um filho com
- o traço recessivo significa que cada progenitor deve ser por -
tador heterozigoto de um alelo recessivo.
A Figura 2.21 b ilustra a transmissão idealizada dos ale -
- los dc progenitores heterozigotos para a prole na geraçã o
II usando um quadrado dc Punnelt. Cada um dos dois ale -
los portados por um heterozigoto tem uma chance de ser
transmitido para uma prole. O acaso dita as quatro com -
binações diferentes de alelos que podem ser transmitidas
-
- (a ) ,2 A prole dos dexs
I
progenitores
portadores
heterozigotos deve
- 2
W3 i4 ser { dominante ei
' recessiva
L- $ dominante JI |recessivo
-
L ada alelo parental tem uma chance igual a }
de ser transmitido para um filho.
M ãe Cada combinação de alelos
nos genôtioos da profe
tem uma probabilidade de
Pai
iw W w® ». «
IW 1fV 1da prole deve ter SCD.
- Quadrado de Punnett
Os filhos devem ter três
genótipos nas proporções
- |
Figura 2.21 Transmissão hereditá ria da anemia
faldforme. ( a ) Cada progenitor passa um alelo para cada
filho ( b ) ê esperada a ocorrência de três genótipos entre os
,
filhos nas proporções exibidas.
56 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
desses progenitores para seus filhos. As setas na figura indi
cam a origem parental dos alclos nos filhos homozigotos c
- heterozigoto tem uma chance de Vi de ser transmitido para
heterozigotos desse casal. Repare que três dos quatro filhos
possuem o ícnótipo dominante, sendo homorigotos para o
alelo dominante ( f fV4 ) ou heterozigotos ( f p1). e que um
^
dos quatro filhos tem o gen ótipo homozigoto ^ .
e por-
tanto, sofre dc SCD,
A razão dos % dominantes para V4 recessivo é a razão
3:1 dos fenótipo* que, como vimos repelidas vezes neste capí-
tulo, é o resultado estat ístico previsto dos cruzamentos entre
dois organismos heterozigotos. Cada alelo transmitido de um
RESUMO
2.1 Gregor Mendel descobriu os princípios bá sicos
da transmissão genética
Uma forma ção abrangente em ciência e matem á tica
preparou Gregor Mendel para conceber experimentos
de hibridiza ção que puderam revelar os princípios da
transmissão hereditá ria.
2.2 Os cruzamentos monoíbridos revelam a
segregação dos alelos
A concepçã o experimental de Mendel tinha cinco
caracteristicas importantes: cruzamentos controlados,
uso de cepas parentais de linhagem pura, exame de
caracteristicas distintas, quantificaçã o de resultados e uso
de cruzamentos repetidos e reciprocos.
Os cruzamentos entre plantas parentais de linhagem pura
,
com diferentes fenótipos produzem prole F monoibrida
com o fenótipo dominante.
Os cruzamentos monoí bridos produzem uma razão de 3:1
do fenótipo dominante para o recessivo entre a prole Fá e
demonstra a operação da lei da segregação.
A lei da segregaçã o afirma que dois alelos em um lócus vão
se separar um do outro durante a formaçã o do gameta ,
cada alelo tem uma probabilidade igual de inclusão em
um gameta e os gametas se unem aleatoriamente durante
a reprodu ção.
Mendel usou a an á lise do cruzamento teste para - O resultado do teste do qui -quadrado determina o grau
demonstrar que as plantas da prole F, são monoibridas
e usou a autofertilizaçáo das plantas da prole f 2 com o
fenótipo dominante para demonstrar que elas têm uma
razão de 2:1 de heterozigotas para homozigotas.
2.3 Cruzamentos diíbridos e triíbridos revelam a
segregação independente dos alelos
A prole F; das plantas diibridas da prole F , exibem uma
razão fenotipica de 93:3:1 que demonstra a operação da
lei da segregação independente.
I Mendel usou a aná lise do cruzamento triíbrido para
demonstrar que os alelos de vá rios genes são transmitidos de
acordo com as previsões da lei da segregação independente.
um filho. Qualquer uma das quatro combinações dc alclos
transmitidas para um filho deve ocorrer com uma frequê n -
cia de IJ )[ .
* 7; desse modo a frequê ncia dos filhos com
SCD gerados pelos progenitores portadores heterozigotos é
Os três genólipos nos filhos devem ocorrer na razão {$4 p4
: - ^
: (rp5. Esses genótipos podem ser claramcntc iden
tificados usando a aná lise baseada no DNA e na proteína .
-
(Descrevemos essas técnicas moleculares e exploramos ou -
tros detalhes da SCD no Capítulo 10.)
2.4 A teoria da probabilidade prevê as razões
mendelianas
A regra do produto da probabilidade é usada para
determinar a probabilidade de dois ou mais eventos
independentes ocorrerem simultâ nea ou consecutivamente.
A probabilidade conjunta é determinada pela multiplicação
das probabilidades dos eventos independentes.
I A regra da soma da probabilidade é aplicada quando
dois ou mais resultados são poss í veis. As probabilidades
individuais dos resultados sáo somadas para determinar a
probabilidade conjunta .
Probabilidade condicional é a probabilidade dos resultados
que dependem de condições particulares.
A teoria da probabilidade binomial descreve a distribuição
dos resultados de um experimento em termos do n ú mero
de classes de resultado e da frequ ê ncia de cada classe. O
triâ ngulo de Pascal é uma ferramenta conveniente para
determinar a distribuiçã o dos resultados binomiais.
2.5 A aná lise do qui-quadrado testa a adequa-
ção entre os valores observados e os resulta-
dos previstos
x
O teste do qui-quadrado ( 1) compara os resultados
observados com os resultados previstos por uma hipótese
genética que se baseia no acaso .
em que as previsões correspondem aos resultados.
A importâ ncia do valor de um qui-quadrado é determinada
pelo valor de P ( probabilidade) correspondente ao n ú mero
de graus de liberdade no experimento.
2.6 A herança autossômica e a gen ética molecu-
lar se comparam à s previsões dos princípios
da hereditariedade de Mendel
Os traços transmitidos por herança autossô mica são
ígualmente prová veis em homens e mulheres.
I A herança autossômica dominante produz um padrão de
transmissão vertical no qual cada organismo com o tra ço
dominante tem pelo menos um progenitor com o tra ço.
 Capítulo 2 Transmissão genética 57

I Os traços transmitidos em um padrão autossòmico
recessivo normalmente são distribuídos em um padrão
horizontal no qual a prole com o traço recessivo descende
frequentemente de progenitores que sào heterozlgotos e
tém o fenótipo dominante.
A aná lise molecular dos quatro traços de Mendel ilustra
como a análise da transmissão genética e a aná lise
genética molecular caracterizam os mesmos processos
hereditários em diferentes níveis.

T E R M O S- C H A V E

Cepas de linhagem pura (cepas
verdadeiras) (p.29)
Cruzamento diibrido (p. 35)
Cruzamento genético controlado (p. 29)
Cruzamento monoibrido (p 32 ).
Cruzamento recíproco (p. 30)
Cruzamento repetido (p.29)
Cruzamento-teste ( análise do
cruza mento-teste) (p. 30)
.
Cruzamento triibcido {p 40 )
Desvio padrão (s) (p. 48)
Diagrama de linha bifurcada (p. 37)
Distribuição normal (gaussiana) (p. 48 )
Fenótipo dominante (p. 30)
Fenótipo recessivo (p. 30)
Fertilização cruzada artificial (p. 28 )
Gametas (p, 32)
Genótipo heterozigoto (p. 31 )
Genótipo homozigoto (p. 31 )
.
Geração Ff, Fy f 3 (p 29 )
Geração parental (geração P) (p. 29)
Graus de liberdade (df) (p 49 ).
Herança autossômica (p 50) .
Herança autossômica dominante (p 5 J)
Herança autossômica recessiva (p. 52 )
Herança particulada (p. 31 )
.
Heredograma {p 5 F )
Lei da segregação (primeira lei de
.
Mendel) (p 32)
Lei da segregação independente
(segunda lei de Mendel) (p. 37 )
Média (p) (p. 48)
Probabilidade binomial (p.45)
Probabilidade condicional (p. 45)
Quadrado de Punnett (p. 32 )
Razão fenotipica (razão 3:1 e razão
933:1) (p. 32 )
Razão genotipica (razão 13:1) (p. 32 )
Regra da soma ( regra da adição) (p. 45)
. Regra do produto (regra da
multiplicação) (p. 44 )
Teoria da hereditariedade por
combinação (p. 27)
leste do qui quadrado (x1) (p. 48)
Transmissão genética (p. 25)
Triângulo de Pascal (p. 47 )
Valor P (valor da probabilidade) (p. 49)

PROBLEMAS
Para obter as respostas dos problemas pares .
ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Compa re e confronte os seguintes termos:
a. dominante e recessivo
b. genótipo e fenótipo
.
c homozigoto e heterozigoto
d. cruzamento monoibrido e cruzamento-teste
e. cruzamento diibrido e cruzamento triíbrido
2. Para o cruzamento B8 x 8bf qual é a razão genotlpica pre-
vista ? Qual é a razão fenotipica prevista ?
3. Para o cruzamento Aabb x aabb, qual é a razão genotí-
pica prevista? Qual é a razão fenotipica prevista ?
4. Em camundongos, o pelo de cor escura é dominante em
relação ao pelo de cor branca. No heredograma a seguir,
os camundongos com pelo escuro são representados
por símbolos escuros e os com pelo branco são exibidos
como símbolos vazados. Usando os símbolos de alelo B e
.
b determine os genótipos de cada camundongo.
1 a probabilidade de lançar uma moeda duas vezes e
u Pi
b. Use um quadrado de Punnett para prever a razão feno-
típica da prole.
c Use o método da linha bifurcada para prever a razão
fenotipica da prole .
7. Se um teste do qui-quadrado produzir um valor de qul-
-quadrado de 7,83 com 4 graus de liberdade,
a. em que faixa de valores cai o valor PI
b. o resultado é suficiente para rejeitar a hipótese do
acaso?
c. acima de qual valor do qui- quadrado você rejeitaria a
hipótese do acaso para um experimento com 7 graus
de liberdade?
8. Determine se as afirmações a seguir são verdadeiras ou
falsas. Se uma afirmação for falsa, forneça a informação
correta ou revise a afirmação para torná-la correta .
a. Se um cruzamento diibrido for realizado, a razão geno-
tipica prevista é 933:1 .
b. Um aluno usa a regra do produto para prever que

5.
ò É é 6 ié è i i c è *
Um casal planeja ter trés filhos. Qual é a probabilidade de
obter uma cara e depois uma coroa é j
c Um cruzamento-teste entre um progenitor heterozi-
.
goto e um progenitor homozigoto recessivo deve pro-
duzir uma razão genotlpica e fenotipica de 1:1 .
os filhos virem a ser duas meninas e um menino?
.
d O resultado de um cruzamento triíbrido é previsto pela
lei da segregação.
6. Considere o cruzamento AaBbCc x AABbCc e. Os cruzamentos recíprocos que produzem resulta -
a. Quantos genótipos de gametas diferentes cada orga - dos idênticos demonstram que uma cepa é de linha-
nismo consegue produzir? gem pura .
58 Análise gené tica: uma abordagem integrada
f. Se uma mulher for heterozigota para o albinismo, uma
condição autossômica recessiva que resulta na ausên-
cia de pigmento na pele, a proporção de seus game-
tas portando o alelo que permite a expressáo do pig-
mento deve ser 75%.
g. A prole de um cruzamento triíbrido deve ter um de 27
genótipos diferentes . de linhagem pura de semente rugosa e verde. A F, lisa
h. Se uma planta F, diibrida for autofertilizada,
1. ~ .
da prole terão o mesmo genótipo da progenitora F,
2.4 da prole será de linhagem pura.
3. da prole será heterozigota em um ou em ambos os
9.
^
lócus.
Na planta estramônio, a cor roxa da flor é controlada por
um alelo dominante P. As flores brancas são encontradas
nas plantas homozlgotas para o alelo recessivo p. Uma
planta estramônio com flores roxas é autofertilizada e
sua prole consiste em 28 plantas de flor roxa e 10 de flor
branca.
a. Qual é o genótipo da planta original de flor roxa?
b. Se a prole de 28 plantas de flor roxa for autofertilizada,
qual proporçáo dessa prole ser á de linhagem pura?
.
10 O padrão de pigmentação dorsal dos sapos pode ser
'leopardo* (pigmento branco entre manchas escuras)
ou 'pintado* (o pigmento entre as manchas aparece sa-
rapintado). O traço é controlado por um gene autossô-
mlco. Machos e fémeas sáo selecionados a partir de po
pulações de linhagem pura, sendo realizado um par de
cruzamentos recíprocos. Os resultados dos cru7amentos
sáo exibidos a seguir.
Cruzamento 1: P:macho leopardo x fémea sarapintada
F,: Todos sarapintados
F3: 70 sarapintados, 22 leopardos
Cruzamento 2: P:macho sarapintado x fémea leopardo
Ft: todos sarapintados
F;: 50 sarapintados, 18 leopardos
a. Qual dos fenótlpos é dominante? Explique.
b. Compare e confronte os resultados dos cruzamentos re-
cíprocos no contexto da herança genética autossômica.
,
c Na prole F de ambos os cruzamentos, qual é a propor -
ção prevista para ser homozigota? Qual é a proporção
prevista para ser heterozigota ?
d. Proponha dois cruzamentos genéticos diferentes que
lhe permitiriam determinar o genótipo de um sapo sa-
rapintado da geração Fy
.
11 A cor negra da pele é dominante em relação á cor rosa nos
porcos. Dois porcos heterozigotos negros sáo cruzados.
a. Qual é a probabilidade de que sua prole venha a ter
pele rosa?
b. Qual é a probabilidade de que a primeira e a segunda
proles venham a ter pele negra ?
c Se esses porcos produzem um total de trê s filhotes,
qual é a probabilidade de dois virem a ser rosa e um
ser negro?
.
12 Um camundongo macho com pelo marrom é acasalado
com duas fêmeas de pelo negro. A fémea negra 1 produz
uma ninhada de 9 filhotes negros e 7 marrons. A fémea
negra 2 produz 14 filhotes negros.
a. Qual é o modo de herança do pelo negro e marrom no
camundongo?
b. Escolha os símbolos para cada alelo e identifique os ge -
nótipos do macho marrom e das duas fêmeas negras.
13. A Figura 2.13 mostra os resultados da análise da segre
gaçáo independente do cruzamento- teste de Mendel.
Nesse experimento, primeiro ele cruzou plantas de li-
nhagem pura de semente lisa e amarela com plantas
e amarela foi cruzada com plantas de linhagem pura de
semente rugosa e verde. Use a análise do qui-quadrado
para mostrar que os resultados de Mendel não sáo consi -
deravelmente diferentes dos previstos.
.
14 Uma criadora experiente de peixe dourado recebe dois
machos incomuns. Um deles é preto em vez de dou-
rado e o outro tem uma barbatana caudal única em vez
de uma barbatana caudal dividida cm duas A criadora .
cruza o macho preto com uma fémea dourada. Toda a F ,
é dourada. Ela também cruza o macho de barbatana cau-
dal única com uma fémea de barbatana caudal dividida .
Toda a F, tem barbatana caudal dividida. Depois ela cruza
o macho preto com as fêmeas douradas da F, e. separa
damente, cruza o macho de barbatana caudal única com
as fémeas de barbatana caudal dividida da F Os resulta- ,.
dos dos cruzamentos sáo exibidos a seguir.
Macho preto X Fêmea dourada da F
Dourado Preto
32 34
Macho com barbatana v Fémea da Ft com barbatana
caudal única caudal dividida
Barbatana dividida Barbatana única
41 39
a. O que os resultados desses cruzamentos sugerem
a respeito da herança da cor e da forma da cauda no
peixe dourado?
b A cor preta é dominante ou recessiva? Explique. A barba -
tana caudal única é dominante ou recessiva ? Explique,
c Use a análise do qui -quadrado para testar sua hipótese
de hereditariedade para cada traço.
15. O heredograma a seguir mostra a transmissão do albi-
nismo (ausência de pigmento na pele) em uma família
humana.
3
I
•ú
ó J
o* ós ú* ó 7
* *
a. Qual é o modo de transmissão do albinismo mais pro-
vável nessa família ?
b. Usando os símbolos alélicos de sua prefer ência, Identi-
fique os genótipos do homem e de suas duas parceiras
na geração 1.
- -
c. A mulher 1 1 e seu parceiro, o homem 1 2, tiveram qua-
tro filhos, um deles portador de albinismo. Qual é a
probabilidade de eles poderem ter um total de quatro
filhos com qualquer outro resultado, exceto um filho
com albinismo e três com pigmentação normal?
d. Qual é a probabilidade de a mulher 1-3 ser uma porta-
dora heterozigota do alelo para o albinismo?

e. Um filho da mulher 1- 3 tem albinismo. Qual é a proba -
bilidade de os outros quatro filhos sefem portadoces
do alelo para o albinismo?
16. Um geneticista cruza uma cepa de linhagem pura de
ervilhas produzindo sementes amarelas e rugosas com
uma de linhagem pura para sementes verdes e lisas.
a. Use um quadrado de Punnett para prever a prole F , es-
perada se as plantas da F, fossem autofertllizadas.
.
b Qual proporção da prole F3 deve ter sementes amarelas?
Sementes rugosas? Sementes verdes ? Sementes lisas ?
.
c Qual é a distribuição fenotípica prevista entre os inte -
,
grantes da prole F ?
,
17. Suponha que uma planta da F do Problema 16 seja
cruzada com uma cepa parental de linhagem pura e se-
mente verde e lisa. Use um diagrama de linha bifurcada
para prever a distribuição fenotipka da prole resultante
18. Nas plantas de ervilha, o surgimento de flores ao longo
do caule principal é um fenótipo dominante chamado
"axial* sendo controlado por um alelo T. O fenótipo re
cessivo, produzido por um alelo t, possui flores apenas
na extremidade do caule e se chama "terminar A forma .
.
da vagem exibe um fenótipo dominante liso controlado
por um alelo C, e uma forma recessiva rugosa, produzida
Aplica ção e integra ção
20. A Observação Experimental 2.1 descreve dados sobre a
distribuição da cor dos grãos do milho bicolor, coletados
por uma turma de genétka como a sua. Para testar a hi-
pótese de que a cor do gr ão no milho bicolor é resultado
da segregação de dois alelos em um único lócus gené -
tico, a turma contou 9.882 grãos e constatou que 7.506
eram amarelos e 2.376 eram brancos. Use a análise do
qui-quadrado para avaliar a adequação entre a hipótese
de segregação e os resultados da turma.
.
21 O heredograma a seguir mostra a transmissão de uma ca-
racterí stica fenotípica.
í 4
Usando B para representar um alelo dominante e b para
representar um alelo recessivo,
a. forneça o(s) genótipo(s) possível(eis) para cada mem-
bro da família, supondo que o traço seja autossômico
dominante.
b. forneça o(s) genótipo( s) possível(eis) para cada mem-
bro da famí lia, supondo que o traço seja autossômico
recessivo.
.
c amplie o heredograma concedendo um(a) parceiroía)
-
para 11 4 e 4 filhos. Modifique o heredograma con-
forme o necessário para torná-lo coerente com a trans-
missão de um fenótipo dominante. Faça o mesmo para
a transmissão de um fenótipo recessivo.
22. As sementes nos arbustos de vagens são, cada uma, pro-
duto de um evento de fertilização independente. A cor
verde da semente é dominante para a cor branca da se -
mente nos arbustos de vagens. Se uma planta heterozi-
Capítulo 2 Transmissão genética 59
.
pelo alelo c Uma planta axial e rugosa de linhagem pura
é cruzada com uma planta terminal e lisa de linhagem
pura.
,
a. A prole F desse cruzamento sofre autofertilizaçáo.
-
Qual é a distribuição fenotípica prevista entre os inte
grantes da prole Fa?
,
b. Todos os integrantes da prole F com flores terminais
são poupados e autofertllizados para produzir uma
geração F,parcial. Qual é a distribuição fenotipka pre-
,
vista entre essas plantas da prole parcial F ?
c Se uma planta da prole F, proveniente do cruzamento
inicial descrito anteriormente for cruzada com uma
planta terminal e rugosa, qual é a distribuição prevista
entre os integrantes da prole resultante?
d. Se as plantas com flores terminais produzidas pelo
.
cruzamento na parte (c) forem poupadas e autofertill -
zadas, qual é a distribuição fenotípica prevista entre a
prole?
19. Se forem rolados dois dados de seis lados, qual é a proba-
- bilidade de que o número total de pontos exibidos seja
a. 4?
b. 7?
c maior que 5 ?
d. um número ímpar?
gota com sementes verdes sofrer autofertilizaçáo, qual é
a probabilidade de 6 sementes em uma única vagem da
planta da prole consistirem em
a. 3 sementes verdes e 3 sementes brancas ?
.
b todas as sementes verdes?
c pelo menos 1 semente branca?
23. Apresente todos os gametas diferentes e possíveis a par-
tir dos seguintes genótipos.
a. AABbCcDd
b. AabbCcDO
c. AaBbCcDd
d. AabbCCdd
24. Organismos com os genótipos AABbCcDd e AaBbCcDd
guinte prole?
a. A—B—C—D—
.
são cruzados Quais são as proporções previstas da se-
b. AobbCcDd
.
c um fenótipo idêntico a um dos progenitores
—
d. A —B ccdd
25. No ser humano, a capacidade para inclinar o pole-
gar para tr ás além da vertical se chama polegar do
caroneiro e é recessiva em relação à incapacidade de
fazé-lo (Omim 274200). Além disso, a presença de ló-
bulos da orelha presos é recessiva em relação aos lóbu-
los soltos (Omim 128900). No heredograma a seguir, a
metade esquerda do circulo ou quadrado é preenchida
se a pessoa tiver o polegar não caroneiro dominante e
vazada se tiver o polegar de caroneiro. A metade direita
do símbolo é preenchida se a pessoa tiver lóbulos sol-
tos e vazada se os lóbulos forem presos. Use os símbo -
los alélicos He h para o polegar e os s ímbolos alélicos
Be e para os lóbulos. Identifique os genótipos de cada
membro da família.
60 Análise gené tica: uma abordagem integrada

ff. São feitos dois cruzamentos diferentes entre plantas

.
parentais de genótipo e fenótipo desconhecidos Use as
razões fenotípicas da prole para determinar os genótipos
e fenótlpos de cada planta parental.
Prole do cruzamento 1: ] bilobado, vermelho
26. Na mosca-da-fruta Drosophila, uma asa rudimentar, cha- bilobado, amarelo
mada 'VestigiaT, e uma cor de corpo escura, chamada
'ébano*, são herdadas em lócus independentes e sáo multilobado, vermelho
8
recessivas em relação às suas contrapartes do tipo selvagem
dominantes, a asa completa e o corpo cinzento. Machos e J .
multilobado amarelo
I
fémeas diibridos do tipo selvagem são cruzados, sendo Prole do cruzamento 2: bilobado, vermelho
4
produzida uma prole de 3.200 moscas. Quantas moscas da i
bilobado, amarelo
prole devem ser encontradas em cada classe fenotípica? 4

.
27 Nas plantas de ervilha, a altura da planta, a forma da se-
i
4
.
multilobado vermelho
i
mente e a cor da semente são governadas por três lócus 4
multilobado, amarelo
de segregação independente. Os tré s lócus exibem do-
30. Um homem e uma mulher sào heterozigotos para fibrose
minância e recessividade com alta (7) dominante em rela-
cística (CF) e fenilcetonúria (PKU). Ambas as condições sáo
ção a baixa (f), lisa (fl) dominante em relação a rugosa (r)
e amarela (6) dominante em relação a verde (g).
autossómicas recessivas e segregam independentemente .
a. Qual proporção dos filhos desse casal não terá ne-
.
a. Se uma planta de linhagem pura alta rugosa e amarela
nhuma das duas condições ?
for cruzada com uma planta de linhagem pura baixa,
b. Qual proporção dos filhos ter á PKU ou CF, mas não
lisa e verde, quais são as razões fenotípicas previstas ambas?
nas proles F, e F3 ?
c. Qual proporção dos filhos será portadora de uma ou
.
b. Qual proporção da F; deve ser alta rugosa e amarela?
ambas as condições?
ííf Cg ?
ttf
c Qual proporção da F3 que produz sementes lisas e ver - .
31 Em uma amostra de 640 famílias com 6 filhos cada, a distri-
des (independentemente da altura da planta) deve ser buição de meninos e meninas é exibida na seguinte tabela:
de linhagem pura?
Número de famílias 9 63 147 204 151 56 10
28. Uma variedade de planta de ervilha chamada Blue Per- Número de meninas 0 1 2 3 4 5 6
sian2 produz uma planta alta com sementes azuis Uma . Número de meninos 6 5 4 3 2 1 0
segunda variedade de planta de ervilha chamada Spa - a. O número de meninos e meninas nessas famílias é
nish Dwarf* produz uma planta de baixa estatura com
sementes brancas. As duas variedades são cruzadas e coerente com a razão prevista 1:1? Justifique sua res-
as sementes resultantes são coletadas. Todas as semen- posta com a análise do qui - quadrado.
tes sáo brancas e produzem plantas altas. Essas plantas b. A distribuição dos números de meninos e meninas nas
altas da prole F. sofrem autofertlllzaçáo. Os resultados famílias é coerente com as expectativas da probabili
dade binomial? Justifique sua resposta .
-
para a cor da semente e estatura na geração F. sáo:
Fenótipo da planta F , Quantidade 32. Uma amostra de 120 famílias com 4 filhos cada, nas quais
ambos os progenitores sáo portadores de uma mutaçáo
Semente azul, planta alta 97 autossómica recessiva para a fibrose cística (CF), produz a
Semente branca, planta alta 270 seguinte distribuição de filhos com e sem fibrose cística:
Semente azul planta baixa 33
Número de famílias 16 52 32 18 2
Semente branca, planta baixa 100
Filhos com CF 0 12 3 4
TOTAL 500
Filhos sem CF 4 3 2 1 0
a. Quais sào os fenótipos dominantes e quais sào os re-
a. O número total de filhos com CF nessas famílias é coe
cessivos ? Por quê?
rente com a razão prevista? Justifique sua resposta.
b. Qual é a distribuição fenotípica prevista na geração F. ?
b. Qual é a distribuição prevista do número de famílias
c Indique a hipótese que está sendo testada nesse expe-
rimenta com 0 a 4 filhos portadores de CF nessa amostra sob os
pressupostos da probabilidade binomial?
d. Examine os dados na tabela peio teste do qul-qua-
drado e determine se eles estão em conformidade c A distribuição das famílias com 0 a 4 filhos portadores
com as expectativas da hipótese. de CF é coerente com as razões previstas pela probabi-
lidade binomial? Justifique sua resposta.
.
29 Nos tomateiros, a produção da cor vermelha do fruto
33. Uma mulher que expressa um fenótipo dominante é he-
está sob o controle de um alelo R. Os tomates amarelos
.
sào rr O fenótipo dominante para a forma do fruto está terozigota (Dd ) no lócus .
sob o controle de um alelo T, que produz dois lobos A . .
a Qual é a probabilidade de o alelo dominante portado
fruta multilobada, o fenótipo recessivo, tem o genótipo peia mulher vir a ser herdado por um neto?

2 N.T.: em tradu ção Uvre, "iranlaiui atui”

3 N.T.: em tradu ç&o livre, *anâ espanhola"

b. Qudl é a probabilidade de dois netos da mulher que
são primos em primeiro grau entre si virem a herdar,
cada um, o alelo dominante?
c. Desenhe um heredograma que ilustre a transmissão
do traço dominante da avó para dois de seus netos,
primos em primeiro grau.
34. Dois progenitores reconhecldamente portadores de um
alelo autossômico recessivo tém quatro filhos. Nenhum
dos filhos tem a condição recessiva.Qual é a probabilidade
de um ou maí s filhos serem portadores do alelo recessivo?
35. Um organismo com o genótipo AaBbCcDdEe é autofertl-
lizado. Supondo que os kxus segreguem independente-
.
mente determine as seguintes propor ções:
a. gametas previstos para serem portadores apenas dos
alelos dominantes.
b. prole prevista para ter um genótipo idêntico ao parental.
c. prole prevista para ter um fenótlpo idêntico ao parental
d. gametas previstos para serem ABcde.
e. prole prevista para ter o genótipo AaàbCcDdE —.
36. Um homem e uma mulher são portadores heterozigotos
de uma mutação autossômica recessiva de um transtorno
fatal na infância. Os dois querem ter muitos filhos, mas
estão preocupados com o risco de ocorr ência do trans-
torno em um ou mais de seus filhos. Em cálculos separa-
dos,determine as probabilidades de o casal ter cinco filhos
com 0, 1, 2, 3, 4 e 5 deles sendo afetados pelo transtorno.
37. Ao rolar um único dado, há uma chance de g de surgir
qualquer um dos seis números possíveis. Para um par de
dados, cada combinação numérica específica tem uma
probabilidade de ocorrência de A maioria dos valores
totais dos dois dados pode ocorrer de mais de uma ma-
neira. Como um teste da teoria da probabilidade aleató
ria, uma aluna decide rolar um par de dados de seis lados
300 vezes e tabular os resultados. Ela tabula o número
de vezes que cada valor total diferente ocorre nos dois
dados. Seus resultados são:
Valor total dos dois dados Número de roladas
dos dados
2 7
3 11
4
5
23
36
6 42
7 53
8 40
9 38
10 30
11 12
12 8 41.
TOTAL 300
A aluna lhe diz que seus resultados não conseguem pro-
var que a aleatoriedade é a explicação para o resultado
desse experimento. Ela está certa ou errada? Justifique
sua resposta . em pimenteiras, descobre um gene chamado Pun f que ele
38. Você tem quatro porquinhos-da-índia para um estudo ge-
nética Um macho e uma fêmea são de uma cepa de linha-
gem pura para pelo marrom curto. Um segundo macho e
uma segunda fémea são de uma cepa de linhagem pura
Capítulo 2 Transmissão genética 61
para pelo longo e branco. Vocé é solicitado a realizar dois
experimentos diferentes para testar a proposta de que o
pelo curto é dominante em relação ao pelo longo e que
o marrom é dominante em relação ao branco. Você pode
usar qualquer um dos quatro porquinhos-da-índia de li -
nhagem pura ou qualquer um dos integrantes de suas
proles nos acasalamentos experimentais. Crie dois experi-
mentos diferentes (cruzando animais diferentes e usando
combinações de fenótipos diferentes) para testar as rela-
ções de dominância dos alelos para comprimento e cor
do pelo e faça previsões para cada cruzamento com base
nas relações propostas. Preveja que o tamanho da ninhada
será igual a 12 para cada acasalamento e que as fêmeas
conseguem produzir três ninhadas durante a vida.
39. A galactosemia é um transtorno autossômico recessivo
provocado pela Incapacidade para metabolizar a galac-
tose, um componente da lactose encontrado no leite dos
mamíferos. O transtorno pode ser parcialmente contro-
lado peia eliminação da ingestão alimentar de lactose e
galactose. Amanda é saudável assim como seus pais, mas
seu irmão André tem galactosemia. Bruno tem uma his-
tória familiar parecida. Ele e seus pais sâo saudáveis, mas
sua Irmã Blanca tem galactosemia. Amanda e Bruno estão
planejando constituir família e procuram aconselhamento
genética Com base nas informações fornecidas, complete
as seguintes atividades e responda às perguntas.
a. Desenhe um heredograma que inclua Amanda, Bruno
e seus irmãos e pais. Identifique o genótipo de cada
pessoa, usando G e g para representar os alelos domi-
nante e recessivo, respectivamente.
b. Qual é a probabilidade de Amanda ser portadora do
alelo para a galactosemia ? Qual é a probabilidade de
Bruno ser portador? Explique sua lógica para cada res-
posta.
c Qual é a probabilidade de o primeiro filho de Amanda
e Bruno ter galactosemia? Mostre o seu trabalho,
d. Se o primeiro filho tiver galactosemia, qual é a proba-
bilidade de o segundo filho ter galactosemia? Explique
a lógica de sua resposta.
40. Os tomates doces amarelos com forma de pera proporcio-
.
nam um alto lucro para os produtores A forma de pera, a
cor amarela e a posição terminal da flor são traços recessivos
.
produzidos pelos alelos f r e t, respectivamente. Os fenóti-
—
pos dominantes para cada traço forma completa,cor ver
—
meiha e posição axial da flor são o produto dos alelos do-
.
minantes F, ReT Um agricultor tem duas linhagens puras
de tomate. Uma é completa, amarela e terminal e a outra é
pera, vermelha, axial. Crie um experimento de reprodução
que venha a produzir uma linhagem de tomate pura para a
forma de pera, cor amarela e posição axial da flor.
Um cruzamento entre uma variedade picante da pimenta
Capsicum annum e uma variedade doce [não picante) pro-
duz uma prole de plantas Ft, todas com pimentas picantes.
, ,
As plantas da F são cruzadas e entre as plantas da F exis-
tem 56 que produzem pimentas picantes e 20 que produ -
zem pimentas doces. O dr. Ara B. Dopsis, um especialista
acredita ser o responsável pelo sabor picante vénus doce
das pimentas. O dr. Dopsis propõe que um alelo domi -
nante P produz pimentas picantes e que um alelo mutado
recessivo p produz pimentas doces.
62 Análise gen é tica: uma abordagem integrada
a. Os dados do cruzamento parental e das proles F , e
sáo coerentes com a proposta feita pelo dr. Dopsis? Ex-
plique usando P e p para indicar os prová veis genóti-
pos das pimenteiras.
b. Supondo que a proposta esteja correta, qual propor-
ção de pimenteiras picantes da F 3 você prevê como li-
nhagem pura ? Explique sua resposta.
42. A alcaptonúria é uma condiçã o autossómica recessiva
rara, observada pela primeira vez em recém nascidos
quando a urina em suas fraldas fica na cor preta ao ser
exposta ao ar. A condiçáo é provocada por um transporte
deficiente do aminoáddo fenllalaní na através das pare-
des intestinais durante a digestão. Cerca de quatro pes-
soas em cada mil sáo portadoras de alcaptonúria.
Sara e Jaime nunca ouviram falar de alcaptonúria e
ficaram chocados quando descobriram que seu primeiro
filho tinha a condição. A irmá de Sara, Maria, e seu marido
Fábio estão planejando uma família e estão preocupados
com a possibilidade da alcaptonúria em um de seus filhos.
Os quatro adultos (Sara, Jaime, Maria e F ábio) bus-
cam informa ções com um vizinho que é médico aposen-
tado. Após discutirem suas histórias familiares, o vl2inho
diz "Nunca estudei genética, mas sei, pelos meus muitos
anos de prática, que Sara e Jaime são portadores dessa
condiçáo recessiva. Como seu primeiro filho teve a condi
çào, há muito pouca chance de o próximo filho também
ter, pois as probabilidades de ter dois filhos com uma
condição recessiva sá o muito baixas. Maria e Fábio não
têm chance de ter um filho com alcaptonúria, pois Fábio
nâo tem história familiar da condiçáo". Os dois casais têm
filhos e ambos os filhos têm alcaptonúria.
a. Quais são os genótipos dos quatro adultos?
b O que há de errado com a informação fornecida a Sara
e Jaime? O que há de errado com a informação forne-
cida a Maria e Fábio ?
c Qual é a probabilidade de o segundo filho de Maria e
Fábio vir a ter alcaptonúria ?
d. Qual é a chance de o terceiro filho de Sara e Jaime não
vir a ter a condiçáo ?
e. Os casais estão preocupados com um de seus netos vir
a ter alcaptonúria. Como você avaliaria o risco de um
dos integrantes da prole de um filho com alcaptonúria
vir a herdar a condiçáo?
43. Os seres hu manos variam uns dos outros de muitas manei-
ras. Entre as muitas diferenças fenotípicas menos impor -
tantes, existem cinco traços de segregação independente
que têm um fenótipo dominante e um fenótipo recessivo.
Os traços são ( 1) pelos no antebraço (alelos F e f ) — a pre-
sença de pelos no antebraço é dominante em relação à
ausência de pelos no antebraço; (2) a forma do lóbulo da
orelha (alelos E e e) — os lóbulos soltos sáo dominantes
em relaçã o aos lóbulos presos; (3) o bico de viúva (alelos
W e w ) — uma forma de "V" distinta na linha do cabelo na
parte superior da fronte é dominante em relação à linha
do cabelo reta; (4) o polegar de caroneiro (alelos H eh ) — a
capacidade para curvar o polegar para trá s além da verti-
cal é dominante e a incapacidade para fazê-lo é recessiva;
e ( 5) as sardas (alelos D e d) — o surgimento de sardas é
dominante em relação à ausência de sardas.
Se um casal com os genótipos FfEe W \ Hh Dd e Ff
*
Et Ww Hh Dd tiver filhos, qual é a chance de eles virem a
herdar as seguintes caracterí sticas?
a. O mesmo fenótipo dos pais.
b. Quatro traços dominantes e um recessivo.
c. Todos os tra ços recessivos.
d. O genótipo FfEE Ww hh dd
44. Nas galinhas, a presença de penas nos pés se deve a um
alelo dominante (F) e a ausência de penas nos pés se
deve a um alelo recessivo (0- A cristã no alto da cabeça
pode ser em forma de ervilha, um fenótipo controlado
por um alelo dominante (P), ou uma cristã única contro-
lada por um alelo recessivo (p). Os dois lócus segregam
independentemente. Suponha que um galo de linhagem
pura com penas nos pés e uma cristã única seja cruzado
com uma galinha de linhagem pura sem penas nos pés
e uma cristã em forma de ervilha. A prole F , é cruzada
para produzir a prole Fr No entanto, entre os integrantes
da Fy apenas as aves com cristã única e pés com penas
podem acasalar. Essas galinhas acasalam aleatoriamente
para produzir a prole Fr Quais são as razões genotípicas e
fenotípicas previstas entre os integrantes da prole F 3?
45. Uma mosca da- fruta de linhagem pura com a mutação
recessiva de asa cortada, provocada pelo genótipo ho-
mozigoto cc, é cruzada com uma mosca de linhagem
pura e asas normais, genótipo CC. Sua prole F , tem asas
normais. As moscas da F, são cruzadas e a prole F 3 tem
uma razão 3:1 de asas normais para asas cortadas. Uma
mosca macho da F ? com asas normais é selecionada
aleatoriamente e acasalada com uma fémea da F , com
asas normais. Usando todos os genótipos possíveis das
moscas F. selecionadas para esse cruzamento, apresente
todos os cruzamentos possíveis entre as duas moscas
envolvidas nesse acasalamento e determine a probabili-
dade de cada cruzamento.
Divisão celular e hereditariedade
cromossômica
* 3.4 A determinação do sexo é cromossômica e
•i
7 ®
A forma mais comum de daltonismo é uma condição recessiva ligada
ao X detectada em indivíduos que náo conseguem enxergar o nú-
mero 22 nessa imagem .
A Igumas décadas atrá s, mais ou menos, no momento da con-
cepção que culminou em seu nascimento, dois gametas se
uniram para formar uma única célula fertilizada — o zigoto
partir da qual você se desenvolveu. Seu sexo foi determinado na-
quele instante pelo cromossomo sexual portado pelo esperma-
tozóide fertilizador — um cromossomo X se você for mulher ou
um cromossomo Y se você for homem. Logo apó s a fertilização,
começou a divisão celular e, nas horas seguintes, foi produzido
um minúsculo zigoto consistindo em duas células, depois quatro,
oito e assim por diante, enquanto se deslocava pela tuba uterina
e seguia na direção do útero. Nos primeiros dias de seu desenvol-
vimento, essas divisões celulares produziram centenas de réplicas
genéticas exatas da célula original. Aproximadamente uma sema-
na após a fertilização, o zigoto é implantado na parede uterina,
e após duas semanas de concepção, os processos geneticamente
controlados da diferenciação celular e especialização celular co-
meçaram a formar os primeiros órgãos e estruturas embrionários.
Esses processos acabaram determinando a estrutura e a função de
cada célula em seu corpo (ver Capítulo 20).
Capítulo
APRESENTAÇÃO
3.1 A mitose divide as células somáticas
3.2 A meiose produz gametas para a reprodução
sexual
3.3 A teoria cromossômica da hereditariedade
propõe que os genes são transportados nos
cromossomos
genética
3.5 A transmissão humana ligada ao sexo segue
padrões distintos
3.6 A compensação da dosagem equaliza a dosagem
dos genes ligados ao sexo
a
I O dck> celular consiste em interfase, durante
a qual as células desempenham funções re-
gulares e repikam seu DNA, e em uma fase
NA o segmento de divisão celular do eido.
I A mitose divide as células somáticas e produz
duas céiulas-ftlhas geneticamente idênticas.
I A meiose ocorre nas células germinatlvas e
produz quatro células haploides genetica-
mente diferentes que amadurecem e for
mam gametas.
-
I A separação de cromossomos e cromátides
Irmãs durante a meiose é a base mecânica
das leis da segregação e segregação inde-
pendente de Mendel.
I A teoria da hereditariedade cromossômica
identificou os cromossomos como as estru-
turas celulares que contém os genes.
I A determinação de sexo é controlada por
fatores cromossòmicos e genéticos que va-
riam de acordo com a espécie .
I A compensação da dosagem iguala a ex-
pressão dos genes ligados ao sexo dos ma -
chos e fémeas das espécies animais.
64 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Desde então, seu cofpo produziu milhares de ge-
rações de células. O mecanismo da divisão celular que
produziu a maioria delas, a mitose, é um processo per-
manente que, com cada divisão, cria duas células-filhas
idênticas e que são réplicas gen éticas exatas da célula
progenitora. A mitose é responsá vel pelo crescimento
do seu corpo; ela repara danos e lesões corporais e man
tém seu corpo pela produçã o de novas células para subs-
tituir as que sofrem morte celular programada (apopto-
se ). Enquanto você leu este trecho, aproximadamente
200 células no seu corpo sofreram divisão mitótica.
Dos trilhões de células em seu corpo, a maioria con
siste em células somátkas, as que formam todos os
seus ó rgãos, estruturas e tecidos. As células som á ticas da
maioria dos eucariotos contêm vá rios conjuntos de cro-
mossomos. O m ú ltiplo mais comum dos conjuntos de
cromossomos é dois, e o n ú mero de cromossomos pre-
sentes como pares homólogos nesses n úcleos se chama
número diploide. Seus n úcleos celulares somá ticos con-
tém 46 cromossomos cada , em 23 pares hom ólogos, en-
tão seu n ú mero diploide é 46.0 n ú mero diploide varia de
acordo com a espécie (cada espécie tem seu n ú mero de
pares caracter ístico) e, portanto, é identificado de forma
não especifica como 2n, O valor n representa o número
haploide de cromossomos, um valor que é a metade do
n ú mero diploide e o n ú mero de cromossomos contidos
nos n úcleos dos gametas, as células não som á ticas.
Os gametas, produzidos a partir das células germi-
nat í vas, sã o células germinais ou reprodutivas: esper-
matozóide e ovo nos animais ou pólen e ovo nas plan-
tas. As células germinativas se dividem pelo processo
conhecido como meiose, que tem vá rias diferenças em
relação à mitose.
Neste capítulo, examinamos tanto a mitose quanto
a meiose e observamos atentamente a conexáo entre a
divisã o celular meiótica e as leis da hereditariedade de
Mendel. També m exploramos os padrões de determina-
çã o do sexo nos eucariotos e os processos que igualam a
expressão dos genes transportados nos cromossomos
sexuais, os cromossomos que determinam o sexo. Além
disso, estudamos os padrões especiais de heran ça dos
genes no cromossomo X e descrevemos como a des-
coberta dos genes nesse cromossomo apoiou a teoria
da hereditariedade cromossômica, a teoria segundo
a qual os cromossomos sã o as estruturas celulares que
transportam os genes.
3.1 A mitose divide as células
somáticas
A mitose, processo de divisáo celular que produz
-
duas células filhas geneticamente idênticas a partir de
uma ú nica célula progenitora, está entre os processos
fundamentais e mais importantes que ocorrem nos eu -
cariotos. Ela é geneticamente controlada com um ro-
teiro preciso que habilita os organismos a crescerem e
se desenvolverem normal mente, bem como a manter
as estruturas e funções de seus órgãos, tecidos e outros
componentes corporais. A vida depende da evolução
ordenada e da regulação adequada da divisão celular . Se
- ocorrerem muito poucas divisões celulares ou se a divi -
são celular ocorrer com muita lentidão, um organismo
pode não se desenvolver complctamcnte ou pode ter
anomalias morfológicas. Por outro lado, a divisão celu -
lar excessiva pode levar ao crescimento das estruturas
além de seus limites normais, produzindo, assim, outros
tipos de anomalia morfológica, possivelmente levando
à morte.
Estágios do cí clo celular
A divisão celular é regulada pelo controle genético
do ciclo celular, o ciclo de rida pelo qual as células pre-
cisam passar para replicarem seu DNA e se dividirem.
Uma vez que a divisão celular bem regulada é parte in -
.
tegrante da vida você não vai se surpreender ao apren -
der que os ciclos celulares de todos os eucariotos são
similares e que grande parte do maquin ário molecular
que controla o ciclo celular é conservada durante a evo-
lu ção em plantas e animais. A impressionante seme-
lhança dos genes e processos de controle do ciclo em
plantas e animais, e o compartilhamento de muitos des-
ses genes com os integrantes dos domínios Bactéria e
Archaea, é uma evidê ncia poderosa de que toda a rida
evoluiu a partir de um único ancestral comum.
O ciclo celular eucariótico é dividido em duas fases
principais — a fase M, um segmento curto do ciclo
celular durante o qual as células se dividem, e a inter-
fase, o período mais longo entre uma fase M e a pró-
.
xima ( Figura 3.1a ) A interfase consiste em três estágios
-
sucessivos: G (, S e G 2. Durante esses estágios, respecti
vamente, a célula expressa sua informação genética, re
plica seus cromossomos e se prepara para a entrada na
-
fase M. Esta é dividida em subestágios que correspon -
dem à evolução da célula durante sua divisão.
Quando visualizadas no microscópio ótico, as cé-
lulas somá ticas na interfase podem parecer um tanto
tranquilas, mas sua aparê ncia externa fornece poucas
indicações da atividade complexa que ocorre em seu
interior . Durante a fase G , { Gap 1) da interfase, por
exemplo, as células transcrevem e traduzem ativa -
mente todos os produtos proteicos necessá rios para a
estrutura e funçã o celulares normais ( Figura 3.1 b ). A
expressão génica também ocorre por todo o resto do
ciclo celular, mas o processo é mais ativo durante o

<•) ^^
G0
G,
Gap 1
I Met áfase
Fase S
I Síntese
do DNA
G,
Gap 2
Figura 3.1 Ciclo celular, (a ) O ciclo celular se divide em interfase e fase M, com cada uma delas com suas subdivisões,
(b) Visão global das atividades do cklo celular.
.
estágio Gj Naturalmente, as células de tipos diferen
tes variam quanto ao n úmero de genes que expressam ,
a seu funcionamento no corpo e quanto à sua forma
de interagir com outras células. Consequentemente, a
duração do est ágio G { varia. Alguns tipos de células se
dividem rapidamente e passam apenas um curto perí-
odo, talvez tão pequeno quanto algumas horas, no G ,
Outras células demoram no G , por períodos de dias,
semanas ou mais.
À medida que se aproximam do final do G,, as cé-
lulas seguem um entre dois caminhos alternativos. A
maioria delas entra na fase S, ou fase de síntese, du -
rante a qual ocorre a replicaçào do DNA (síntese do
DNA ). Por outro lado, um pequeno subconjunto de cé-
lulas especializadas faz a transição do G , para um estado
de não divisão chamado G0 (“G zero") , um tipo de es-
tado G , semiperpétuo no qual as células expressam sua
informação gen ética e desempenham funções normais,
mas não avançam no ciclo celular ( ver Figura 3.1b). Vá
rios tipos de células em seu corpo, incluindo certas cé-
lulas nos seus olhos e ossos, atingem um estado maduro
de diferenciação, entram no Gc e raramente se dividem
novamente, se é que chegam a se dividir. A maioria das
células no G0 manté m suas fun ções especializadas até
entrar em morte celular programada (apoptose ) e mor
rer. Apenas raramente as células saem do Gt e retomam
o ciclo celular.
A replicação do DNA ocorre durante a fase S e
resulta em uma duplicação da quantidade de DNA
em cada n úcleo e na criação de duas cromátides irmãs
para cada cromossomo. A entrada na fase S quase sem -
pre obriga a célula a passar pelo restante do ciclo e se
dividir depois. A conclusão da fase S leva à transição
para a fase Ga, ou Gap 2, do riclo celular, durante a qual
.
as células se preparam para a divisão A interfase ter
mina quando a célula entra na fase M, a partir da qual
surgem duas células-filhas.
Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 65
G,: cxpreuão genica ativa e
atividade celular; prepara ção
para a sí ntese do DMA
Gc,: diferencia ção terminal e
parada da drvisão celular
Fase S: replicação do DNA e
duplicação dos cromossomos I
A célula Consequente
permanece morte celular
G,: preparação pa a divisão celular
especializada
mas não se
. íapoptose)
^
divide
FasaM: divisão celular
Mitose (células somá tkas)
Meíose (células germinativas)
- As gerações sucessivas produzidas através da mi
tose à medida que um ciclo celular se sucede a outro são
-
conhecidas como linhagens celulares. Cada linhagem
celular contém células idênticas ( isto é, clones) que são
todas descendentes de uma ú nica célula fundadora. A
mitose assegura que a informação genética nas células
. seja passada fielmente para as gerações sucessivas de li -
nhagens celulares. No entanto, ocorrem mutações oca -
sionais em células isoladas que também são perpetua
das durante a proliferação da linhagem celular.
-
Subestágios da fase M
A fase M se segue após a interfase c é dividida cm
cinco subest ágios —
prófase, prometá fase, metá fase,
—.
an áfase e telò fase cujas caracter ísticas principais são
descritas na Figura 3.2 Esses cinco subestá gios desem -
penham duas funções importantes da divisão celular
cariocinese e citocinese. A cariocinese é a divisão igua -
—
- litária do material cromossô mico no n úcleo da célula
progenitora entre os n úcleos das duas células-filhas.
Esse processo exige primeiro que cada um dos cromos-
somos no n úcleo seja total e precisamente duplicado
e, depois, que as cópias duplicadas de cada cromos-
somo sejam separadas, de modo que uma cópia vá para
- -
o n úcleo de uma célula filha e a outra vá para o outro
n úcleo - filho. A cariocinese é seguida pela citocinese,
a divisão dos conteúdos citoplasm áticos da célula pro -
genitora entre as células filhas. A citocinese não exige
o mesmo grau de equivalência da cariocinese. O cito -
plasma das células progenitoras contém uma quanti
dade abundante de proteínas e organelas que as células-
-
-filhas exigem para funcionar , então a divisão desse
material não precisa ser igual.
As células que entram na mitose sào diploides ( 2n )
- e também são diploides no final da mitose.
Os cromossomos sào tão difusos durante a inter-
fase que não podem ser visualizados pelo microscópio
66 Análise gené tica: uma abordagem integrada

Centrossomos
(com pares
Interfase (G2)

de centrfolos)
Cromatina
(duplkada)
Fuso mltòtko
primordial
Prófase

>
Fragmentos do
envoltório
Promet á fase

Microtúbulo
não cinetócoro
>
nuclear

Nucléolo

Envoltório Cromossomo, consistindo Centrômero Cinetócoro Mkrotúbulo

Membrana nuclear em duas cromátides irmãs do cinetócoro
plasmática Microtúbulos astrais

A célula da Interfase 62 retratada aqui
passou pelas fases G1 e $, durante as
quais os cromossomos foram duplicados.
Apesar disso, os cromossomos séo
difusos e não são visíveis dentro do
núcleo. Um envo tório nuclear intacto
envolve os cromossomos e um ou mais
.
nucléolos. Dois centrossomos cada um
.
contendo um par de centrfolos estão
situados no citoplasma. Microtúbulos
começam a se estender a partir dos
centrossomos em padrões radiais que
formam á steres.
Figura 3.2 Interfase e os cinco estágios da mitose.
A condensação cromo&sòmka começa e
.
avança ao longo da prófase tornando os
cromossomos compactados cada vez
.
mais visíveis no microscópio ótico No
citoplasma, os pares de centrossomos
começam a migrar para poios opostos da
c élula, estendendo seus mkrotúbulos
para formar o fuso mitótlco primordlaL
.
No final da prófase as duas cromátides
irmãs que formam cada cromossomo
.
podem ser visualizadas Os centrômeros
também podem ser visualizados nos
cromossomos ao final da prófase. O
nucléolo desaparece.
O rompimento do envottóno nuclear
durante a promet áfase expõe os
cromossomos cada vez mais condensa-
.
dos á ação no citoplasma Após atingirem
polos opostos na célula, os centrossomos
estendem microtúbulos de cinetócoro
que se conectam aos dnetócoros nos
centrômeros cfomossòmkos.Cada
cinetócoro é ligado por feixes de
microtúbulos que se estendem de polos
opostos, exercendo uma for ça de tração
em ambas as direções. A rela ção
recíproca entre os microtúbulos de
cinetócoro move o cromossomo para o
melo da célula. A coesão da cromátide
.
irmã vtabiltzada pela ação da proteína
coesina, resiste ãs forç as de tração dos
microtúbulos de cinet ócoro para evitar a
separação prematura da cromátide irmã .
Os centrossomos também produzem
microtúbulos não cinetócoro que se
^
estendem na direçào do polo oposto, e
microtúbulos astrais, que se estendem
para longe do centrossomo, na cfireçáo
da parede celular mais próxima .

Met á fase
Placa
metafásica
Centrossomo
Fuso em um polo
do fuso
A condensação cromossómica completa
é alcançada na metáfase e os cromosso-
mos plenamente condensados se
alinham para que as cromátides irmãs de
cada cromossomo se situem em ambos
os lados da placa metafásica. As
cromátides irmãs de cada cromossomo
estão ligadas aos mícrotúbulos de
dnetócoro que emanam dos centrosso-
mos nos polos opostos da c élula. Os
microtúbulos de dnetócoro não
dnetócoro e astrais se estendem
totalmente a partir dos centrossomos,
instaurando um fuso mitótico completo.
Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka
Aná fase
Cromossomos-filhos
A separação (disjunção) da cromátide
Irmã ocorre através do rompimento da
coesão da cromátide irmá e da despoU-
meriza çáo dos microtúbulos de
.
dnetócoro Os cromossomos filhos,
presos aos microt úbulos de dnetócoro
em despollmerizaçào, movem- se para
polos opostos e congregam perto dos
.
centrossomos A pollmertzaçáo dos
microtúbulos não cinet ôcoros acompa-
nha o movimento dos cromossomos - células vegetais, ou de um anel contr*átil
filhos, conferindo á célula um formato
alongado no final da anáfase.
67
> Teló fase e Citocí nese
Recomposição
do nucléolo
>
Sulco de
clivagem
Recomposição
do envoltório
nudear
A polimenzaç ao do mlcrotúbulo náo
c netócoro continua a alongar a célula na
telófave, distanciando os polos. O
envolt ório nuclear começ a a remontar e
logo vai envolver os cromossomos. A
descondensação cromossómica
acompanha a remontagem do envoltório
nudear. A citocínese divide o citoplasma,
criando duas novas células pela
formação de novas paredes celulares nas
e um suko de clivagem, nas células
animais. O nucléolo se forma novamente.
68 Análise gen é tica: uma abordagem integrada

.
ótico No entanto, a condensaçã o cromossômica pro
gressiva, que começa no início da prófase, condensa os
cromossomos em cachos cada vez mais coesos até ser
alcan çado um n ível máximo de condensação na metá -
fasc. A ruptura do envoltó rio nuclear ocorre na prófase.
A condensação progressiva dos cromossomos os torna
visíveis na prófase, assim como as cromá tides irmãs de
cada cromossomo. O centròmero é uma sequência de
DNA especializada em cada cromossomo e sua localiza
ção é identificada como uma constrição na qual as cro-
- mente descrito ) que se reúnem no centrò mero de
cada cromátide. Os microtúbulos de cinetócoro são
responsáveis pela movimentação do cromossomo
durante a divisão celular.
2. Microtúbulos polares se estendem na direção do
polo oposto de seu centrossomo e se sobrepõem
aos microt ú bulos polares desse polo. Esses micro-
tú bulos contribuem para o alongamento da célula e
- para sua estabilidade durante a divisão.

— —
mátides irmãs as duas cópias que foram duplicadas
na fase S sâo reunidas. A sequência de DNA centro-
mérico liga um complexo proteico especializado, cha - O cinetócoro, um complexo proteico com uma
mado cinetócoro. que facilita a divisão cromossômica
no final da fase M.
A definição e o uso dos termos cromossomo, cro - mero e é ligado pelas extremidades "positivas" dos mi
mátide e cromátide irmã à s vezes provocam confusão e
este é um bom momento para apresentar as defini ções
que vamos empregar no restante da discussão sobre di-
visão celular. O termo cromossomo é usado por todo o
ciclo celular para identificar cada estrutura que conte-
nha DNA e que possua um centròmero. No final da G » f
um cromossomo consiste em um único DNA duplex
com as proteínas associadas. Após a conclusão da fase
S, um cromossomo consiste em dois DNAs duplex re-
plicados com as proteínas associadas. As duas molécu -
las de DNA que compõem um cromossomo sâo id ê n -
ticas. Individualmente, essas moléculas de DNA sào
identificadas como cromá tides e, juntas, sào identifica -
das como cromá tides irmãs.
Distribuição dos cromossomos
Além das mudanças visíveis nos cromossomos, as
mudanças celulares são aparentes na prófase. Em célu - cocsina que se situa entre as cromá tides irmãs e as man -
las animais, embora não na maioria das plantas, fungos
ou algas, duas organelas chamadas centrossomos pare-
cem migrar durante a fase M para formar os dois polos
opostos da célula em divisão. Cada centrossomo contém
um par de subunidades chamadas centr íolos ( Figura 3.3).
Os centrossomos sào a origem dos microtúbulos das
fibras do fuso que emanam de cada centrossomo. Os
microtú bulos das fibras do fuso são pol ímeros de subu -
nidades da proteína tubulina que se alongam pela adição
de subunidades de tubulina e se contraem pela remoção
das subunidades de tubulina. Os microt ú bulos sào pola -
-
res; eles têm uma extremidade "negativa " ( ) ancorada
no centrossomo e uma extremidade “ positiva" ( + ) que
cresce longe do centrossomo. Proteínas especializadas
chamadas proteínas motoras estão associadas aos mi -
crot úbulos. As proteínas motoras movem os cromosso-
mos e outras estruturas celulares ao longo dos microt ú -
bulos usando a energia química.
As fibras do fuso emanam dos centrossomos em
um padrão de 360°, identificado como áster. Três tipos
de microtú bulos são identificados em células:
1. Microtúbulos de cinetócoro incorporados no
complexo proteico chamado cinetócoro ( breve-
3. Microtúbulos astrais crescem na direçã o da mem -
brana da célula , onde se conectam e contribuem
para a estabilidade celular.
placa externa e uma placa interna , se reú ne no centró -
-
crotúbulos de cinetócoro. No final da prometáfase, os
microt ú bulos de cinet ócoro de cada centrossomo est ão
conectados ao cinetócoro de cada cromá tide do par de
cromá tides irmãs (ver Figura 3.3).
Os cromossomos da metáfase se condensaram mais
de 10 mil vezes desde o início da prófase, o que os torna
facilmente visíveis ao microscópio e lhes permite ser mo-
vidos facilmente dentro da célula. Os microt úbulos de ci-
netócoro estão presos ao cinetócoro em cada centròmero
das cromá tides irmãs. Como estão presas aos microtú bu -
los de cinetócoro de centrossomos opostos, as cromá ti-
des irmãs sofrem forças contrárias que são criticas para
o posicionamento dos centrossomos ao longo de uma
linha média imagin ária no equador da célula. Essa linha
imaginária se chama placa metafásica . A tensão chada
pela tração dos microtú bulos de cinet ócoro é compen -
sada por um processo simultâ neo conhecido como co-
esão da cromátide irmã. Esta é produzida pela proteína
tém juntas para resistir à tração dos microtú bulos de ci-
netócoro [ Figura 3.4 ). A coesina é uma proteína de quatro
subunidades; seu componente central é um polipeptídeo
mais conhecido como Scc 1 (do inglês sister chromatid
cohesion, que significa “coesão da cromá tide irmã"). A
coesina reveste as cromá tides irmãs ao longo de todo o
seu comprimento, mas está mais centralizada perto dos
centrômeros, onde a tração dos microtú bulos é maior.
À medida que os microt ú bulos se movem para a linha
média da célula, a coesina ajuda a manter as cromá tides
irmãs unidas para assegurar o posicionamento adequado
do cromossomo e impedir sua separa çã o prematura.
A anáfase faz parte da fase M, durante a qual as cro-
má tides irmãs se separam e começam a se mover para
polos opostos na célula. A aná fase inclui duas ocorrê n
cias distintas vinculadas às ações do microtú bulo. Essas
-
ocorrências costumam ser identificadas como anáfase
A, caraterizada pela separaçã o das crom á tides irmãs,
e aná fase B, caracterizada pelo alongamento da célula
em um formato ovalado. A aná fase A começa abrupta -
mente com dois eventos simultâ neos.
Na anáfase A, a enzima separase inicia a clivagem do
polipeptídeo Scc 1 em coesina, rompendo assim a conexão
 Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 69

Figura 3.3 Os
/
/ Conectado microtúbulos nas células
/ ao centriolo cm divisão emanam
.
/
/
4 Extremidade dos centrossomos Os
Centrossomo / © Microtúbulo
/
/ microtúbulos astrais e os
/ Fibras polares controlam o formato
Microtúbulo d </
cinetócoro /
/
Extremidade
o ^
' / contendo
proteínas
da célula e os microtúbulos
de cinetócoro ligam-se aos
/ motoras
Microtúbulo /
cinetócoros do cromossomo.
polar / — Placa externa
Polimenraçáo t
4
/
/
/

Cinetócoro
— Placa interna

(um em cada cromátide)

©
Cromátides
Irmãs Cromátides irmás
®
Proteí na
i® motora
«
V Despolimenzaçào
Subunidades
de tubulina
adquiridas e
perdidas

Despolimerteaçio Microtúbulo
astral

(a) Prófase Figura 3.4 Coesão da

cromá tide irmã durante
Microtúbulo Cromátides
irmãs
.
a mitose A proteína
coesina gera coesáo entre as
Proteína
.
cromá tides irmãs (a) e (b)
coesina Na aná fase ( c ), a proteína
Cinetócoro separase digere a coesina
e permite a separação das
cromá tides irmãs.

(b) Metáfase (c) Anáfase

70 Análise gen é tica: uma abordagem integrada

entre as cromá tides irmãs. Ao mesmo tempo, os microtú - .

a célula e a transforma em duas ( Figura 3.5 ) Nas células
bulos de cinetócoro começam a despolimerizar para iniciar vegetais, a citocinese acarreta a construção de novas pa -
a movimentação cromossómica na direção dos centr íolos. redes celulares perto da linha média celular. Nas células
A separação das cromá tides irmàs na anáfase A chama se - vegetais e animais, a citocinese divide o fluido e as orga -
disjunção cromossómica. Com o avanço da anáfase, as nclas citoplasmá ticas.
cromá tides irmãs completam sua disjunção e acabam con - A mitose separa as cópias replicadas das cromá ti-
gregando em volta dos centrossomos nos polos da célula. des irmàs em n úcleos idênticos, formando, assim, duas
A anáfase B é caracterizada pela polimerizaçào dos micro - células-filhas geneticamente idênticas. A Figura 3.6 mos-
túbulos polares que aumentam seu comprimento e fazem tra quatro cromossomos em uma célula de um organismo
que a célula adote um formato ovalado. Esse formato faci -
lita a citocinese no final da telófase, levando à formação de
duas células- filhas.
FaseG,
Conclusã o da divisão celular Esta célula contém dois
pares de cromossomos
Na telófase, as membranas nucleares começam a homólogos com o
se remodelar em volta dos cromossomos reunidos em çenótpoAaBà.
cada polo , acabando por envolver esses cromossomos
em envolt órios nucleares. A descondensação cromos -
só mica começa e acaba devolvendo os cromossomos
a seu estado difuso da interfase. Ao mesmo tempo, os
microt ú bulos se desfazem . À medida que a telófase
chega ao fim, sã o observados dois n úcleos id ê nticos
FaseS
dentro de uma ú nica célula alongada que está pres-
tes a ser dividida em duas células- filhas pelo processo A replk.ação do DNA cria
de citocinese. cromátides irmãs
idênticas para cada
Nas células animais, um anel contrátil composto de cromossomo
microfilamentos de actina cria um sulco de clivagem em
volta da circunferência da célula; o anel contrá til aperta

Metáfasc
Os cromossomos se
afinham aleatoria-
mente ao tango da
placa metafòsica
com a ajuda do
fuso mltótico.

Anel contrátil
e sulco

Placa celular

Telófase
IXias células-fiihas s3o produzidas pela mitose. Cada

-
Figura 3.5 Citocinese em células animais (a ) e em células
.
vegetais ( b)
urra aelas é Ac8b após a separação da cromá tde
Irmã, formando cromossomos-filhos.

Figura 3.6 Visão global da mitose.

 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 71

diíbrido ( AaHb ) para os genes nos cromossomos exibidos. (a )

A figura acompanha os principais eventos do rido celu - Ponto de Ponto de checagem da
lar, mostrando a geração das cromatides irmãs na fase S, checagem G metáfase: aprovado sc
*
aprovado se o todos os cromossomos
o alinhamento dos cromossomos na placa metaíásica e a
produção de duas células-filhas idênticas ( AaBb ) no final tamanho da célula estiverem conectados ao
for adequaco e a fuso míóttico
da telófase. Repare que o n ú mero diploide ( 2n ) dos cro- repiicaçao
mossomos é mantido por todo o ciclo celular. cromossômica for
concluída com
éx?to
Observa çã o gen é tica 0 odo celular é dividido em in
.
—
terfase e fase M. A Interfase contém os está gios G, S e Gr A fase
M consiste em cinco subestá glos prúfase, prometáfase, me-
táfase, anáfase e telófase. A mitose separa as cromátides irmãs
para formar duas células-filhas geneticamente idênticas.
Ga
M

G,
-
D

S
9
Pontos de controle do ciclo celular
Os biólogos celulares acham que, independente - %
mente da duração do ciclo celular, a maioria das células Ponto de checagem Ponto de checagem G: ,
segue o mesmo programa básico; isso sugere que sinais da fase S: aprovado se aprovado seo tamanho da
comuns geneticamente controlados conduzem o ciclo arepí ca âot íoDNA célula for adequado a
^
estiver completa e se dfcponitolktede dp
celular. A identidade dos genes e proteínas que contro- ttver sido feita a triagem nutrientes for suficiente e
lam o ciclo celular n ão vem das células normais, mas do para remover os fatores do crescimento
estudo das linhagens celulares possuidoras de mutações incompatibilidades ou (sinais de outras células)
erros nos oares de base esdverem presentes
que afetam sua progressão pelo ciclo celular. Esses es-
tudos produziram conhecimentos importantes sobre o
controle genético do ciclo celular e, nas últimas déca - ( b)

das, os biólogos descobriram as identidades e fun ções

de muitos genes responsá veis pelo controle do ciclo ce- 2
a
lular. O que tem sido aprendido a respeito do controle 4» D2 A
genético do ciclo celular pode ser aplicado ao estudo da TJ B
*1
5 f
y
divisão celular normal, bem como ao estudo das ano -
j/

malias da divisão celular, como as exibidas no câncer.

À medida que as células passam pelo ciclo celular, a
I /
\
\
disponibilidade para passar de um estágio para o outro \
é avaliada regularmente. Vá rios pontos de checagem
do ciclo celular, quatro dos quais estão ilustrados na
5
o G, s
/

G, [ M
Figura 3.7a, são monitorados quanto à disponibilidade Fases do ciclo celular
da célula pelas proteí nas de interação. Um mecanismo Figura 3.7 Pontos de checagem do ciclo celular e
comum para esse monitoramento é executado pelos proteínas ciclina. (a ) Eventos nos quatro principais pontos
complexos proteicos que unem uma proteína cinase de checagem do ddo celular ( b) As quantidades relativas de
,

com uma segunda proteína conhecida como ciclina. As
proteínas cinases catalisam a fosforilação da proteí na
— a adiçã o de um grupo fosfato transferido de um nu
deotídeo trifosfato, como o ATP ou o GTP, para uma
proteí na - alvo. A fosforilação muda a conformação das
proteínas- alvo e pode ativar ou inativar a proteína - alvo.
As prote í nas cinases normalmente estão presentes de
forma contínua nas células em concentrações relativa
mente estáveis. As proteí nas ciclina , poré m , têm esse
nome porque suas concentrações sã o cíclicas e ligadas
ao estágio do ciclo celular. A produção de proteína d-
clina é estimulada por proteínas de fator de crescimento
produzidas por outras células. Os componentes da
prote í na cinase desses complexos são ativados apenas
quando se associam com a ciclina; assim, as proteínas
cinases sã o chamadas cinases dependentes de ciclina
ou Cdks. Em seu estado ativado, os complexos ciclina -
prote í nas dclina variam durante o eido celular.
-Cdk fosforilam
- gress várias proteínas-alvo c regulam a pro-
ão do ciclo celular em vá rios pontos de checagem.
Várias Cdks e ciclinas formam uma série de comple-
xos ciclina -Cdk Figura 3.7b). Por exemplo, a ciclina B se
une com uma Cdk conhecida como Cdkl para formar o
- complexo ciclina B-Cdkl necessário para fosforilar vá-
rias proteínas necessá rias para iniciar a fase M do ciclo
celular. Além de estimular a divisão celular, o complexo
ciclina B-Cdkl também ativa uma enzima que degrada
a ciclina B, causando a rápida diminuição no nível de ci-
clina B exibida no lado direito da Figura 3.7b.
As proteínas Cdk2 e Cdk4 formam outros comple -
xos ciclina -Cdk que regulam outros pontos de checagem
no ciclo celular. À Cdk2 se une à ciclina F para formar
um complexo ciclina E-Cdk 2 que é ativo no ponto de
72 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
O A produção da prote í na
dclina é estimulada pelas O A cjclina ** 1*9» e ativa as
proteínas do fator de cinases dependentes de
crescimento de outras cidina (Cdks) .
células.
ADP
Figura 3.8 Complexos cklina -Cdk regulam o ciclo celular. O complexo cidina Dl Cdk4 interage específicamente com o
complexo pRB-E 2 F para regular a entrada na fase S.
checagem G , -S. Separadamente, a Cdk 2 se une à cidina
A para formar o complexo dclina A -Cdk2 que é ativo
-
no ponto de controle S G 2. De modo similar, a Cdk4 se
une à cidina Dl , formando o complexo cidina Dl Cdk4
-
que é ativo no ponto de checagem G , S. Separadamente,
a Cdk4 pareia com a dclina D2, formando o complexo
dclina D2-Cdk 4 que é ativo mais tarde no dclo celular.
Um alvo proeminente do complexo dclina Dl -Cdk4
é a proteína retinoblastoma ( pRB), produzida pelo gene
.
retinoblastoma 1 ( RB1 ) Nas células normais, a pRB se
liga a uma proteína ativadora da transcrição, conhecida
como E2 F, e o complexo pRB- E2F bloqueia o avanço do
.
eido celular da fase G { para a fase S ( Figura 3.8) O com -
plexo ciclina Dl-Cdk4 fosforila a pRB, fazendo que libere
a E2F. A E2F livre se liga ao DNA e ativa a transcrição de
vários genes que produzem proteínas essenciais na fase
S. Fm outras palavras, o complexo ativo cidina Dl Cdk4
permite que a célula passe pelo ponto de checagem G, e
entre na fase S liberando a E2F que de outro modo está
ligada à pRB não fosforilada.
Da maneira descrita, a presença da pRB não fosfori
lada em uma célula age como um freio no eido celular,
interrompendo-o no ponto de controle G ( e impedindo a
progressão para a fase S. A pRB é uma das várias proteí-
nas conhecidas como supressoras tumorais por seu papel
no bloqueio do ciclo celular . O gene RB1 que produz a
pRB é conhecido como gene supressor tumoral. Muitos
outros genes também são classificados como supressores
tumorais porque, em um sentido funcional, seus produ -
tos proteicos normalmente bloqueiam a progressão do
ciclo celular. Por outro lado, a expressão da dclina Dl,
pelo gene ciclina Dl , leva à formação do complexo d
dina Dl - Cdk4, que estimula a progressão do ciclo celu
L E2F j, O Nas células normais, a pRB
se liga à proteí na ativadora
da tranxriçáo E2 F para
manter a célula na G».
O O complexo cidina
D 1 -Cdk4 se liga ao
complexo pRB E2F e Q A E2F se liga ao DNA e ativa
fosforila a pRB. a tranxriçáo de vá rios
genes, produzindo
O AE 2F é proteí nas necessárias para a
liberada. fase S.
I DNA
1
RNAm AAAAA/
Proteí nas necessá rias
para a fase S
lar da fase G , para a fase S. A cidina Dl é um dos muitos
exemplos de proteínas produzidas por genes conheddos
como proto- oncogenes. Quando expressos, os proto-
- -oncogenes estimulam a progressão do eido celular. C)s
proto oncogenes que sofrem mutação, designados onco-
genes, estão associados ao desenvolvimento do câncer.
Mutações do ciclo celular e câncer
O controle da frequência da divisão celular é uma
atividade essencial do crescimento e desenvolvimento
normais. As células normais são infundidas com um su -
primento sangu íneo que leva oxigénio e nutrientes, mas
cias só se proliferam quando sinais emitidos pelas pro-
teínas, chamados fatores do crescimento, ativam o cres-
cimento. As células normais também são responsivas às
células vizinhas e seu crescimento é moderado, de modo
- que o que for melhor para os organismos como um todo
possa ter precedência. O câncer, por outro lado, é caracte-
rizado pela proliferação da célula fora de controle que leva
à formação de tumor e ao supercrescimento de células
cancerosas que invadem e desalojam as células normais.
A perda de controle sobre o eido celular é um mecanismo
fundamental que leva ao desenvolvimento do câ ncer.
Como exemplos da perda de controle do eido ce-
lular no câncer, vamos considerar dois tipos de muta -
ções que alteram a interação normal da cidina Dl Cdk 4
com a pRB. A primeira categoria de mutações inclui as
que aumentam o n úmero de cópias da ciclina Dl du -
plicando o gene ciclina Dl ou as que aumentam signi-
ficativamente o nível de transcrição da ciclina DL F^sas
mutações levam a níveis de cidina Dl acima do normal.
- Uma vez que a Cdk4 está sempre dispon ível nas células, a
- superprodução de ciclina Dl provoca a entrada descon -

trolada na fase S pela fosforilação contínua da pRB e pela
liberação da E2F, estimulando a transcrição do gene rela
cionado à fase S. As mutações desse tipo são identificadas
frequentemente em tumores da paratireoide, linfomas da
célula B c outros câ nceres nos seres humanos. Observa -
ções paralelas da produção significativa mente maior pela
mutação do gene ciclina E são detectadas no câncer de
mama, no câncer de cólon e em certas leucemias.
Um segundo tipo de mutação dessa interação e que
pode levar ao câncer é a mutação do gene RBl e a produ
ção de uma quantidade anormal de pRB. A mutação do
RBl que produz a proteína pRB que se liga fracamente
(ou náo se liga ) à E2F contribui para o desenvolvimento
de vários cânceres, incluindo os de pulmão, bexiga, mama
e osso. O mecanismo causador do câncer é a entrada des
controlada na fase S pela E2F livre ( não ligada ). A mutação
do RBl também é a causa de um câncer das células fotos-
sensíveis da retina ocular. Esse câncer, chamado retino-
blastoma, ocorre no início da inf ância e forma tumores de
células em rá pida proliferação na retina. O retinoblastoma
é raro, ocorrendo em 1 em 15 mil crianças. Ele ocorre de
duas formas: um tipo hereditário, significando que uma
criança herda uma mutação do RBl de um progenitor, e
um tipo esporádico, no qual as mutações do RBl não são
herdadas. O retinoblastoma ocorre apenas quando ambas
as cópias do RBl sofrem mutação; desse modo, o desen -
volvimento do retinoblastoma é um exemplo de fenóripo
canceroso recessivo. No retinoblastoma hereditário, uma
mutação do RBl é herdada; isso significa que todas as cé-
lulas do corpo, incluindo as células da retina, portam um
alelo mutado. A aquisição da segunda mutação da cópia
do tipo selvagem do RBl ocorre no nível somático: o gene
RBl do tipo selvagem sofre mutação em qualquer uma dos
milhões de células em uma das retinas. Essa segunda mu-
tação produz o genótipo recessivo que leva ao desenvol-
vimento do retinoblastoma. C ) retinoblastoma esporádico
também requer que ambos os alelos do gene RBl sofram
mutação. Entretanto, no retinoblastoma esporádico, as
duas cópias do gene são do tipo selvagem na fertilização
e a mutação precisa alterar as duas cópias do gene na
mesma célula da retina. Se ambas as cópias do RBl forem
atingidas pela mutação, o retinoblastoma se desenvolve.
Observa çã o genética A divisão celular é rigidamente
controlada pela sinaliza ção baseada em proteí na e por interações
em vários pontos de checagem que marcam a transição de um
estágio do ddo celular para o próxima A perda de controle do
òdo celular ocorre quando as mutações alteram a atrvidade nor
mal da proteína do ponto de checagem e essas mutações estão
frequentemente associadas com o desenvolvimento do câncer.
3.2 A meiose produz gametas para a
reproduçã o sexual
A reprodução é um requisito básico dos organismos
vivos. Em mais de três séculos de observação, biólogos
Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 73
identificaram uma variedade atordoante de métodos,
- mecanismos e comportamentos reprodutivos em ani -
mais, plantas e micróbios. Mesmo assim, a reprodu ção
pode ser dividida em duas categorias amplas: (1) repro-
dução assexuada , na qual os organismos sc reproduzem
sem acasalar , originando progé nie geneticamente idên -
tica à do progenitor; e ( 2) reprodução sexuada , em que
células reprodutivas chamadas gametas são produzidas
e se unem durante a fertilização.
- Os integrantes dos domínios Bactéria e Archaea
reproduzem -se exclusivamente pela reprodução assexuada.
Esses organismos são haploides; normalmente eles têm
apenas um ú nico cromossomo. A divisão celular se sucede
logo após a duplicação cromossómica, quando cada célula
- -
produz duas células filhas geneticamente idênticas. Os eu
cariotos unicelulares, como a levedura, conseguem se re
--
produzir de maneira tanto sexuada como assexuada. A re-
produção assexuada na levedura é similar à divisão celular
nas bactérias. Uma célula haploide se submete à replicaçào
do DNA e distribui uma cópia de cada cromossomo para
células- fillias idênticas. Embora a levedura passe a maior
parte de seu eido de vida em um estado haploide e se re -
produza ativamente como haploide, também é comum
que duas células haploides da levedura se fundam e for-
mem uma célula diploide que produz gametas (chamados
esporos) através de meiose.
Em contraste com os eucariotos unicelulares, os euca -
riotos pluricelulares reproduzem -se predominantemente
por meios sexuais. Na maioria das espécies animais e nas
plantas dioicas, machos e fêmeas são portadores cada um
de teddos e estruturas reprodutivas diferentes. O acasala -
mento requer a produção de gametas haploides pelas es-
truturas masculinas e femininas. A união dos gametas ha-
ploides produz progénie diploide. Em espécies de plantas
monoicas, incluindo a Pisum sativum com a qual Mendel
trabalhou, os teddos reprodutivos masculinas e femini-
nos estão presentes em cada planta e a autofertilizaçào é o
modo comum de reprodução. Nos organismos que se re -
produzem de modo assexuado, células germinativas espe-
cializadas sofrem meiose para produzir gametas haploides,
as células reprodutivas. Os gametas femininos são produ -
zidos pelo ovário nas fêmeas de animais ou pelo óvulo nas
plantas. As células germinativas masculinas estão situadas
nos testículos dos animais, onde produzem espermatozói -
des, e nas anteras das plantas, onde produzem pólen. Essas
descrições geralmente são verdadeiras para a maioria das
plantas e animais, mas existem muitas exceções, incluindo
a observação de reprodução assexuada em vá rias espécies
de peixes, rotíferos (pequenos organismos aquá ticos) e sa -
lamandras. As formigas, abelhas e vespas macho também
possuem células somá ticas haploides e seus processos de
produção de gametas são diferentes.
Meiose versus mitose
A meiose compartilha muitas características simi
lares ou idê nticas aos eventos na mitose. Por exemplo, a
-
interfase de todas as células é igual. A interfase do ciclo
74 Análise gené tica: uma abordagem Integrada

Tabela 3.1 Comparado da mitose com a melose

Caracteristica Mitose Meiose

Finalidade Produzir células geneticamente idênticas Produzir gametas geneticamente diferentes para a repro-
visando ao crescimento e à manutenção duçáo sexuada
Localização Células somáticas Células germinativas
Mecanismo Uma rodada de divisão após uma rodada de Duas rodadas de divisão (meiose I e meiose II) após uma
replicaçáo do DNA única rodada de replicaçáo do DNA
A base mecânica das leis da hereditariedade de Mendel
Cromossomos Nào pareiam Sinapse durante a prófase I
homólogos Raramente recombinam Precisam recombinar durante a prófase I
Cromátides Ligam-se às fibras do fuso em polos opostos ligam- se às fibras do fuso no mesmo polo na metáfase I
irmã s na metáfase Migram para o mesmo polo na anáfase I
Separam-se e migram para polos opostos na Ligam - se às fibras do fuso em polos opostos na metáfase II
anáfase Separam-se e migram para polos opostos na anáfase II
Produto Duas células-filhas diploides e geneticamen- Quatro células haploides geneticamente diferentes que
te idênticas que continuam a se dividir por amadurecem para formar gametas e se unem para formar
mitose zigotos diploides

das células germinativas contém estágios Gl, S e G2
indistinguíveis dos estágios nas células somá ticas. De
modo similar, as ações c funções das estruturas subcclu -
lares, como os centrossomos e microtú bulos que produ
zem, são as mesmas em todas as células. Nem a mitose é
exclusiva das células somá ticas. As células germinativas
de plantas e animais são criadas e mantidas pela divi
são mitótica. Essas células sofrem meiose apenas com
a finalidade de produzir gametas. A meiose é diferente
da mitose quanto às atividades que ocorrem durante a
fase M meiótica e quanto à produção de quatro gametas
haploides. A Tabela 3.1 compara e confronta vá rias dife-
renças nos processos e resultados da mitose c da meiose
- descritos nas próximas seções.
A interfase meiótica é seguida por dois estágios su
cessivos de divisão celular , conhecidos como meiose 1 e
-
- meiose 11. Não há replicaçáo do DNA entre essas divisões
celulares meióticas, então o resultado da meiose é a pro-
dução de quatro células-filhas haploides {Figura 3.9). Na
meiose 1, os cromossomos homólogos se separam um do

Figura 3.9 Visão global da meiose .

Diploide ( 2/i) — RepicaçãocoDKA

Separação óe homólogos
/ Meiose I \
(divHáo por redução)

Separação das
Meiose II cromátides
Haploide (#») — (divisã o equitativa) irmãs

vò
0'
^
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 75

MEIOSEI: Separa cromossomos homólogos

Pr ófase I
Lept óteno

Centrossomos
£ Prófase I
Zigóteno
Fuso mltótko
Pr ófase I
Paqu í teno

Centrômero
Bivalente
Prófase I
Dipl óteno

Cromá tldes
irmã s
>

Cromossomos Envoltório Par homólogo ( bivalente) Microtú bulos Quiasmas

nuclear dos cromossomos

Prófase I: leptóteno Prófase I: zigóteno Prófase I: paqufteno Pr ófase I: diplóteno

As células que entram no
primeiro subestágio da prófase I
meiótica passaram pela
interfase e tiveram seus
cromossomos duplicados, A
condensação cromossômica
progressiva começa no
lept óteno, mas os cromosso-
mos permanecem difusos
demais para ser visualizados
nesse est ágio. Os centrossomos
começam a migrar para polos
opostos da célula c são
produzidos ésteres de
mkrot ú bulo das fibras do fuso a
partir de cada centrossoma
Os cromossomos continuam a
condensar e os cromossomos
homólogos entram em slnapse.
O complexo slrvaptoné rrwco se
forma entre os homólogos. A
migraçã o centrossômka para
polos opostos continua à
medida que a polimeriza çá o
dos microt ú bulos avança.
Forma -se o fuso mei ótica
A condensa ção cromossômka
est á parcialmente completa e
os cromossomos homólogos
em sinapse são visualizados
como estruturas bivaleotes 0
cruzamento ocorre entre
cromá bdes não irm ãs de
cromossomos homólogos. Os
mkrot ú bulos de dnetócoro
llgam-se aos dnet ócoros e os
mkrot úbulos astrais emanam
dos centrossomos que est ã o
quase em polos opostos na
célula. Começa o rompimento
do envolt ório nuclear.
O cruzamento está completo e
o complexo sinaptonèmico se
dissolve, deixando os quiasmas
que mant é m as rromá tides
irmãs unidas, A condensa ção
cromossômica evoluiu e as
tétrades compostas de quatro
cromá tides de pares homólo-
gos de cromossomos são
visíveis. O rompimento do
envolt ório nuclear continua.

Figura 3.10 Estágios da melosa.

outro, reduzindo o n ú mero diploide dos cromossomos

.
( 2n ) para o n ú mero haploide ( n ) Na meiose II, as cromá-
tides irmãs se separam para produzir quatro gametas ha-
ploidcs, cada um com um cromossomo do par diploide.
Após a conclusã o da meiose, cada gameta con
tém um único n úcleo que abriga um conjunto de cro -
- sào geneticamente diferentes, ao contrá rio das células
mossomos haploides. No entanto, os gametas dos dois
sexos costumam ser radicalmente diferentes quanto
ao tamanho e à morfologia. Os gametas femininos ge-
ralmente são muito maiores que os masculinos e pos-
suem um n úcleo haploide, uma grande quantidade de
citoplasma e um conjunto completo de organelas. Por
outro lado, os gametas masculinos conté m um n úcleo
haploide, mas muito pouco citoplasma e praticamente
nenhuma organela. Quando o ovo fertilizado começa a
divisão mitótica, as organelas e estruturas citoplasmá ti-
cas fornecidas pelo gameta materno suportam seu cres-
cimento zigótico inicial.
mente, rccombinaçâo — —
na mitose, a meiose apresenta contato e, frequente-
entre cromossomos homólo-
gos. Esses eventos ocorrem raramente, se é que ocor-
rem, na mitose. As células- fillias produzidas pela meiose
filhas geneticamente idênticas produzidas pela mitose.
-
Essas diferenças importantes entre a mitose e a meiose
estão enraizadas em três eventos caracter ísticos que
ocorrem na meiose I:
1. Pareamento de cromossomos homólogos.
2. Crossing over entre cromossomos hom ólogos.
3. Segregação (separação) dos cromossomos homó-
logos, que reduz os cromossomos para o n úmero
haploide.
A meiose I é dividida em quatro estágios: prófase I,
metáfase 1, anáfase I e telófase L O pareamento e a recom
binação dos cromossomos homólogos ocorrem na prófase
-
I; assim, esse estágio é subdividido em cinco subestágios

Meiose I
Além das duas rodadas sucessivas de divisão celu -
lar meiótica , contrastando com a divisã o celular ú nica
——
leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese
para traçar de modo ma ís preciso as interações e a r e-
combinaçâ o das cromossomos hom ólogos. A Figura 3.10
descreve esses estágios e subestágios em detalhes.
76 Análise gen é tica: uma abordagem integrada

MEIOSEI: Separa cromossomos homólogos

£ Jv

>
Ny

Pr ófase I Metãfase I Anãfase I Tel ófase I e Citocinese

Dlacinese

Centrômero com Placa Mlcrot ú bulo As cromá tides irmãs

metaf ásica náo cinetócoro permanecem conectadas

Sulco de
clh/agem

Fuso
mit ótico
Mlcrot ú bulo
conectado ao cinetócoro
Prófase I: dlacinese
O fuso meiótko está bem
estabelecido, com feixes de
microtú bulos de cinet ócoro
amarrando os cromossomos
homólogos das tétrades nos
polos opostos. O envolt ório
nuclear está totalmente
degradado. As t étrades sáo
movidas para o meio da célula.
Microt ú bulos astrais
Metãfase I
As tétrades estão afinhadas ao
lorgo da placa metaf ásica, com
cada cromossomo de um par
homólogo amarrado aos
mkrot ú butos de cinetócoro que
emanam dos centrossomos nos
polos opostos da célula. Os
cinetócaros das cromátides irmàs
estão conectados ao mesmo
centrossomo e as cromátides
Irmãs estão unidas peia coesina
para evitar sua separação
prematura. Os quusmas que
ligam as cromátides náo irmãs
são rompidos.
Os cromossomos
homólogos se separam
Anãfase I
A despolimerizaçào dos
microtú bulos de cinetócoro
começa a disjunção dos
cromossomos homólogos, que
começam a se mover para
polos opostos. As cromátides
irm ãs permanecem unidas pela
coesina.
O envoltório
nuclear se forma novamente
Telófase I e Citocinese
As membranas nucleares se
formam novamente em volta
dos cromossomos agrupados
em cada polo. Cada nú cleo
•ecém-formado contém um
conjunto haploide de
cromossomos. Os cromosso-
mos podem descondensar
oarciaimente. A citocinese
divide o material dtoplasmá ti-
co da célula separando os
n úcleos A divisão c ítoplasmá ti-
ca pode ser desigual

Figura 3.10 Estágios da meiose (continuação).

A condensação cromossómica começa durante o é alinhar adequadamente os cromossomos homólogos

leptóteno, o primeiro subestágio da prófase I , quando o
fuso meiótico é formado pelos microt ú bulos que ema -
nam dos centrossomos, que estão se movendo para
posições em extremidades opostas da célula. A mem
brana nuclear se rompe no zigóteno e ocorre a primeira
- teno e as cromá tides irmàs de cada cromossomo podem
peculiaridade da meiose
—a sinapse dos cromosso-
mos homólogos, o alinhamento dos pares de cromos-
somos homólogos. A sinapse inicia a formação de uma
ponte proteica , chamada complexo sí naptonêmico,
uma estrutura proteica de três camadas que mantém
a sinapse ligando rigidamente as cromátides nào irmàs
dos cromossomos homólogos uma à outra ( Figura 3.11 ).
Cromátides nã o irmãs são cromá tides pertencentes
a membros diferentes de um par homólogo de
cromossomos. A ligação das cromá tides não irmãs
por um complexo sinaptonêmlco provoca um contato
íntimo entre os homólogos (sinapse). O complexo
sinaptonêmico contém dois elementos laterais, cada
um consistindo em proteínas aderidas a uma cromá tide
de um membro diferente de um par de cromossomos
homólogos, bem como um elemento central que une os
elementos laterais. A fun ção do complexo sinapton êmico
antes de sua separaçã o e depois facilitar a recombinaçâo
entre os cromossomos homólogos.
A condensação cromossómica continua no paquí -
ser distinguidas visualmente pelo microscópio ótico.
Nesse estágio, os homólogos pareados são chamados de
tétrade em reconhecimento às quatro cromá tides mi -
croscopicamente visíveis em cada par homólogo. Den -
tro do elemento central do complexo sí napton êmico,
novas estruturas, chamadas nódulos recombinantes,
aparecem em intervalos.
Os nódulos da recombinaçâo desempenham um
papel fundamental no crossing -over ou permuta de
material genético entre as cromá tides não irmãs de cro-
mossomos hom ólogos. O n ú mero de nódulos de re-
combina çâ o está intimamente correlacionado com o
n ú mero médio de eventos de cruzamento ao longo de
cada braço do cromossomo homólogo. Foram feitas
duas observações importantes a respeito dos nódulos de
recombinaçâo. A primeira é que seu surgimento e loca -
lização dentro do complexo sínapton êmico coincidem
com o momento e a localização do crossing over, a se- -
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 77

__
MEIOSEII: Separa as cromá tides irmás

Prófase II

Ruptura do envoltório nuclear

Mctãfase II
Placa metaf áska
i
:
Js
Anáfase II

Microt ú bulo náo cinetócoro

> Tel òfase II e Citocinese

0 envoltório nuclear
se forma novamente
>
*
:
iL.
I

!
-/A1 Sulco de divagem
:
i
ii \
r
i
Microt ú bulos Microt úbulo de cinetócoro
(dos centrossomos)

Pr ófase II Mctáfaie II Anãfase II Telòfase II eCltodnese

O envolt ório nuclear se rompe
e os centrossomos duplicam e
começam a migrar para poios
opostos da célula. Microt ú bulos
emanam dos centrossomos . tração do microt úbulo e a
produzindo microt ú bulos de
cinetócoro, n áo cinetócoro e
astrais. Ocorre a condensa ção
cromossômka.
As cromá tides irmás est ão
conectadas aos microt ú bulos
de cinet ócoro a partir de poios
opostos da célula . A força de
resistência criada pela coesina
levam ao alinhamento do
cromossomo ao longo da placa
metafá sica.
A separa ção das cromátides
irmãs começa com o
rompimento da coesina pela
separase e a despolímeriza çáo
dos microt ú bulos de cinetócoro.
A medida que as cromá tides
irmãs se movem para polos
.
ooostos a polí meriza ção dos
microt ú bulos não cinetócoro
alonga a célula.
A migra ção cromossômka está
conduida e os cromossomos
começam a descondensar. O
envolt ório nuclear se forma
novamente em volta dos
cromossomos. A citocinese
separa os n úcleos recém -
formados e divide o material
citoplasmático, talvez de modo
desigual

gunda é que os nódulos recombinantes parecem estar
presentes nos organismos que sofrem crossing-over e
ausente nos que não sofrem. Os biólogos celulares con -
clu íram que os n ódulos de recombina çáo sã o agregados
de enzimas e proteí nas necessá rios para realizar a troca
genética entre as crom á tides nâo irmás dos cromosso-
mos homólogos durante o paquíteno. Discutimos as
-
consequê ncias genéticas do crossing over (Capítulo 5) e
os processos moleculares do crossing-over (Capítulo 12).
Os cromossomos continuam a condensar no dipló-
teno à medida que o complexo sinaptonèmico começa a
se dissolver. A dissolução permite que os homólogos se
afastem ligeiramente, revelando pontos de contato entre
as cromá tides não irmãs. Esses pontos de contato se cha
mam quiasmas e estão situados ao longo dos cromosso
mos onde ocorreu o crossing owr. Os quiasmas marcam
as localizações da troca de fita do DNA entre as cromáti
des não irmãs dos cromossomos homólogos.
A proteína coesina está presente entre as crom á -
tides irm ás para resistir às forças de traçã o dos micro -
t ú bulos de cinetócoro ( Figura 3.12 ). Na diacinese, os
microt ú bulos de cinetócoro movem produtivamente
os pares de cromossomos sinapsados em direçã o à
placa metaf ásica, onde os homólogos se alinharão
lado a lado.
Os quiasmas entre os cromossomos homólogos são
dissolvidos com o inicio da metáfase I. Esse processo
completa o crossing-over entre cromossomos homólogos.
Os cromossomos homólogos se alinham em lados
opostos da placa metafásica na metá fase I. Os microt ú-
bulos de cinetócoro de um centrossomo ligam -se aos d -
netócoros de ambas as cromá tides irmás de um cromos-
-
somo. Nesse meio tempo, os microtú bulos de cinetócoro
do outro centrossomo se conectam aos cinetócoros das
cromá tides irmãs do homólogo. A cariocinese acontece
na an áfase I à medida que os cromossomos homólogos se
separam uns dos outros e são arrastadas para polos opos-
tos da célula (ver Figura 3.10). As crom á tides irmás de
- cada cromossomo permanecem firmemente unidas pela
- coesina. A recomposição da membrana nuclear ocorre
na telòfase 1, quando um conjunto haploide de cromos-
- somos está envolvido em cada polo da célula. A citoci -
nese se segue à condusão da telòfase I.
A disjunção (separa ção) das cromossomos homó-
logos na meiose I reduz o n ú mero de cromossomas em
cada polo para o n ú mero haploide, de modo que um
representante de cada par homólogo de cromossomos
está presente. A primeira divisão meiótica é conhecida
como divisão por redução, significando a reduçã o do
n ú mero do cromossomo de diploide para haploide.
78 Análise gené tica: uma abordagem integrada

DNA

Complexo sinaptonèmko
Cromossomo
materno _IX/ «
J\ i? 9 Montagem
— Recombinaçào
Nódulo de recombinaçào
Desmontagem
~ — DNA
Mm
—
Cromátide M2

* Cromátide PI
laterais
^ ^ raÉsr ]
Elementos < Filamentos
\ uansversos
/ / / ll.Elemento
central

liW
—
'
'V - r ( í •k Espaço central

r>
DNA Nódulo de
Cromátide P 2 recombinaçào
Elemento
lateral DNA
Elemento Filamento
central transverso

Leptóteno Zlgóteno Paqulteno Diplóteno

I Diaclnese

Interfase
2 Prófase

Figura 3.11 Complexo sinaptonèmko. Desenho detalhado do complexo sinaptonémico e dos nódulos de recombinaçào
Met á fase >

associados,com base em fotomicrografias eletrónicas.

( a) Diplóteno/diacinese (b) Metáfase I (c) Anáfasel

r
:
Fibras do fuso
até os centrlolos

:
Microtúbulo|
de cinet ócoro
A/
Ouiasma
M Proteína

Qnetócoro
\ coesína

I
f I

Fibras do fuso
at é os centrlolos

.
Figura 3.12 Separação dos homólogos na meioseI (a) No diplóteno e na diacinese da prófase I, o crossing -over entre os
.
homólogos está concluido e o contato entre os homólogos (quiasmas) é resolvido (b) As fibras do fuso puxam os cromossomos
para alinhá-los na placa metafásica . A proteína coesina adere à s cromátides irmãs contra a tração das fibras do fuso. (c) Os
cromossomos homólogos se separam na anáfase I.

Meiose II
A segunda divisão meiótica divide cada produto ha -
ploide da meiose 1 separando as cromá tides irm ãs uma
da outra em um processo reminiscente da mitose, ex-
ceto que o n ú mero de cromossomos em cada célula é a
metade do n úmero observado na mitose. Os produtos da
meiose II amadurecem e formam os gametas que con
estágios da meiose 11
— —
têm um conjunto haploide de cromossomos. Os quatro
prófase II, metáfase II, anáfase
11 e telófase II são exibidos e descritos na Figura 3.10.
A meiose II tem uma semelhança geral com a mi
tose quanto ao fato de os microt ú bulos de cinetócoro
de ccntrossomos opostos se conectarem aos cinetó-
coros das cromá tides irmãs. Alé m disso, assim como
acontece na mitose, na meiose 11 os cromossomos se
alinham aleatoriamente ao longo da placa metafásica e a
separação da cromátide irmã é acompanhada pelo rom
pimento da coesina, pela a ção das proteínas motoras e
pela despolimeriza ção dos microtú bulos. A citocinese
ocorre no final da telófase II. Quatro células haploides
geneticamente distintas, cada uma portando um cro-
mossomo que representa cada par homólogo, sào os
produtos da meiose 11.
Observa çã o genética A meiose ocorre na fase M
do cklo da célula gcrmlnativa . Os cromossomos homó
logos formam sinapses e podem cruzar no Iní cio da pró-
fase I. Os homólogos segregam na meiose I, produzindo
duas células haploides. As cromátides irmã s se separam
.
na meiose II produzindo quatro gametas haploides gene-
ticamente distintos.
Interfase
Cromossomos
não reolicados
teçlicaçao
‘cromoss ômica
Metáfase I na faseS
Snapsc do par
homóogo
Meiose I
Metáfase II A separação do par
homòogo é abase
da segregação.
Meiose II
Gametas
i T
r íKB
1*
Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 79
Base mecankista das razões mendelianas
A separação dos cromossomos homólogos e das
crom á tides irmãs na meiose constitui a base mecânica
das leis da segregação e da segregação independente de
Mendel. A conexão entre a meiose e os princí pios men-
delianos da hereditariedade foi sugerida pela primeira
- vez, de modo independente, por Walter Sutton e Theo-
-
dor Boveri em 1903. Com base em observações micros
cópicas de cromossomos durante a meiose, Sutton e
Boveri propuseram duas ideias importantes. A primeira
foi que a meiose era o processo que teria gerado as re-
-
gras da hereditariedade de Mendel; e a segunda foi que
os genes estavam situados nos cromossomos. Ao longo
das duas décadas seguintes, o trabalho em muitas espé-
cies provou que essas hipóteses estavam corretas.
-
Podemos compreender a segregação acompa
nhando um par de cromossomos homólogos durante
-
a meiose em um organismo heterozigoto. O organismo
na Figura 3.13, por exemplo, possui o gen ótipo heterozi-
goto Aa . A replicaçào do DNA na fase S cria cromá tides
irmãs idênticas para cada cromossomo. Na metáfase 1,
os homólogos se alinham em lados opostos da placa
metaf ásica; e na anáíase 1, os homólogos se separam
uns dos outros. Esse movimento segrega o cromossomo
composto de duas cromá tides portadoras de A do cro-
mossomo portador de duas crom á tides contendo a.
Acompanhando essas células ao longo da separação das
cromá tides irmãs na meiose 11, descobrimos que, entre
os quatro gametas, existem dois contendo o alelo A e
dois contendo o alelo a. Esse resultado explica a razão
1:1 dos alelos que a lei da segrega ção prevê para os ga
metas de um organismo heterozigoto.
-
Figura 3.13 Meiose e lei da segregação.
Nos gametas .
cada alelo tem
frequência igual
80 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
A segregação independente dos alelos é ilustrada pelo
comportamento dos dois pares de homólogos durante
a divisão meiótica em um organismo, como é demons-
trado na Figura 3.14 usando o genótipo diíbrido AaBb.
Mais uma vez, a fase S cria duas cromá tidcs irmãs idên-
ticas para cada cromossomo. No entanto, na metáfase I,
podem ocorrer dois arranjos igualmente prováveis dos
dois pares homólogos. Em cada arranjo, os cromossomos
homólogos estão em lados opostos da placa metafásica.
Obviamente, quando uma célula sofre meiose, apenas um
ou o outro desses arranjos alternativos vai ocorrer; desse
.
modo cada célula submetida à metá fase I da meiose terá
o "arranjo I" ou o “arranjo II ** Ao longo de um grande
n úmero de divisões meióticas, o arranjo 1 e o arranjo II
são igualmente frequentes. O arranjo 1 tem cromossomos
portando alelos dominantes em um lado da placa metafá -
sica e os cromossomos portadores de alelos recessivos no
lado oposto. O arranjo II tem um cromossomo portador
de alelo dominante e um cromossomo portador de alelo
recessivo em cada lado da placa metaf ásica. A primeira
divisão meiótica segrega A de a c B de b para criar os pro-
dutos haploides da divisão meiótica L
P r o f a s e II
Metáfase I
Arranjo I
Metáfase II
Gamelas
I I
1 AB
São necessá rias vá rias meioses para nreduzir gametas nas proporções previstas peia lei da segregação independente.
Figura 3.14 Meiose e lei da segregação independente.
Se acompanharmos agora cada produto haploide
da meiose I durante a divisão meiótica II, vemos que os
quatro gametas produzidos pelo arranjo I têm os genó-
tipos AB e ab em frequência igual. Por outro lado, os
quatro gametas produzidos pelo arranjo II têm os gc-
n ó tipos Ab e aB em frequ ência igual. Levando em conta
os dois possí veis arranjos de cromossomos homólogos
na metáfase I , são gerados oito gametas com quatro ge-
nótipos igualmente frequentes. Cada um dos genótipos
— —
do gameta AB, Ab, aB e ab é produzido em uma
frequência de 25%. O resultado de um grande n ú mero
de divisões meió ticas em um diíbrido AaBb é uma razão
1:1:1:1 entre os gametas, conforme o previsto pela lei da
segregação independente de MendeL
Observa çã o gen ética As leis da segregação e da se-
gregação independente de Mendel sáo produtos da organi -
zação e separação de cromossomos homólogos e cromá tldes
kmás na meiose. Os genótipos dos gametas produzidos pela
meiose correspondem às frequências de gen ótipos de gameta
previstas pelas leis da hereditariedade de Mendel.
Dois arranjos artema Jvos
*
de homótogos na metáfase l
Arranjo II
1
A o o
v
A
lAb \ aB
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossómka 81

Segregação em dí ploí des unicelulares
Vimos que em plantas e animais com reprodução se - mostra que cada um dos esporos haploides no asco car
xuada (1), a segregação dos alelos pode ser explicada pela
disjunção de cromossomos homólogos na meiose I e ( 2)
que a segregação independente resulta de diferentes com -
binações de alelos encontradas entre os muitos gametas
produzidos por um organismo. O suporte direto dessas
conclusões é observado na reprodução sexuada dos orga - para identificar os princí pios da transmissão mende -
nismos unicelulares como a levedura, que formam geno-
mas diploides com a finalidade de reprodução sexuada.
A espécie de levedura Saccharomyces cerevisae
( també m conhecida como levedura do padeiro ) é um
exemplo de organismo que consegue viver e se reprodu - hereditariedade propõe que os
zir como haploide, mas que também forma um genoma
diploide e produz gametas. A meiose na S. cerevisae
produz quatro gametas haploides, chamados esporos ,
contidos temporariamente em uma estrutura similar a
uma bolsa , chamada asco. Cada gameta haploide con - pansão do conhecimento genético, alimentado pela re
tido em um asco pode ser separado e crescer individual -
mente para revelar os alelos que conté m.
A 5. cerevisae , como toda levedura, consegue se re -
produzir de modo sexuado ou assexuado ( Figura 3.15 ).
A reprodução assexuada ocorre nas células haploides
por um processo chamado brotamento, no qual uma
célula -filha haploide evolui a partir da célula progeni-
tora ( parental ). Após a replicaçáo do DNA, as cromá ti-
des irmãs se separam e migram para n úcleos diferentes.
Um n ú cleo se move para um pequeno broto que forma
a célula - filha e é espremido da célula progenitora pela
-
citocinese. O broto recém formado tem o mesmo genó-
tipo haploide de sua célula progenitora.
A reprodução sexuada na S. cerevisae é induzida
por condições de inanição e envolve a união de duas cé -
lulas haploides de levedura que são de tipos de acasala -
mento diferentes. Os tipos de acasalamento, chamados
MATa e MATa, resultam de uma diferença na expres - para examinar. Então, ele e seus alunos saíram de seu la -
são gênica. Apenas o cruzamento MATa x MATa pro -
duz uma cepa diploide, e a meiose nas cepas diploides
produz o asco contendo quatro gametas.
Para demonstrar esses eventos, vamos examinar
um marcador visível da variação alélica na levedura . O
alelo do tipo selvagem ( A D E' ) para a síntese do amino
ácido adenina leva ao crescimento de uma coló nia de
leveduras brancas. Por outro lado, os alelos mutados
( ode ) que bloqueiam a sí ntese da adenina produzem o
crescimento de colónias de cor vermelha. Essa cor apa
rece nos mutantes ade em razão do acú mulo de um
- Hoje usamos o termo tipo selvagem para indicar o fenó-
produto intermediário na via de síntese da adenina que
é metabolizado nas células ADE\
Quando o cruzamento haploide MATa ADE* x
MATa ade é realizado, o diploide resultante tem o ge-
nótipo heterozigoto ADE' / ade~ . A meiose na cepa hete-
rozigota produz um asco contendo quatro esporos ha -
ploides que podem ser separados e crescer de maneira
independente para formar colónias. A placa ilustrada na
Figura 3.14 mostra duas colónias de levedura vermelha
e duas colónias de levedura branca , coerentes com uma
razão igual de 1:1 de alelos segregados durante a meiose
no organismo heterozigoto. Essa demonstração simples
-
rega uma cópia de um gene dos cromossomos-filhos
produzidos durante a meiose c, assim, oferece evid ê ncia
direta de que a disjunção cromossô mica na meiose é a
base das razoes mendelianas.
A An á lise Genética 3.1 proporciona uma prá tica
liana na divisão celular meiótica.
3.3 A teoria cromossômica da
genes são transportados nos
cromossomos
O início do século XX foi uma época de rá pida ex -
-
descoberta dos princípios hereditá rios de Mendel e pela
proposta de Sutton e Boveri de que o comportamento
cromossó mico na meiose espelha a transmissão heredi -
tária dos genes. Os biólogos trabalharam duro testando
a nova “hipótese gênica* de segregação e segregação
.
independente Eles examinaram a hereditariedade em
uma série de organismos, buscando evidências que con -
firmassem os primeiros achados e exceções que permi -
-
tiriam esclarecer e expandir as regras recém articuladas
da hereditariedade.
Thomas Hunt Morgan, inicialmente cético quanto
à hipótese gênica, começou a trabalhar na min úscula
mosca -da -fruta Drosophila meJanogaster. Morgan pre-
tendia testar rigorosamente as regras de Mendel em uma
espécie natural, não em uma espécie domesticada como
a Pisum sativum. No entanto, ao contrário de Mendel,
Morgan não possuía variantes fenotí picas disponíveis
boratório na Universidade Columbia, na cidade de Nova
York, e foram para a área rural de Long lsland a fim de
atrair mosca-da-fruta pendurando baldes de frutas podres
em á rvores. Depois de capturadas e transportadas para o
laboratório, as moscas eram examinadas no microscópio
para identificar as variantes fenotípicas. As moscas
capturadas na natureza tinham quase invariavelmente o
mesmo fenótipo para cada traço examinado e o grupo de
Morgan se referiu a esses fenótipos como “tipo selvagem".
tipo que é mais comum em uma população.
Morgan achou a Drosophila um organismo fádl de
manter e reproduzir em laboratório. Ele as manteve em
pequenas garrafas de vidro cheias com uma mistura se
missólida de farinha de milho, açúcar e água. O ciclo de
vida da Drosophila dura entre 12 e 14 horas, dependendo
das condições de crescimento, então de 25 a 30 gerações
poderiam ser geradas em um ano. Morgan aproveitou
essa reprodução rá pida para criar grandes quantidades
de moscas ao longo de muitas gerações, buscando a rein -
cidência de fenótipos mutados em suas populações cria-
82 Análise gené tica: uma abordagem integrada

Qclo de vida da levedura haplolde

Célula Célula
haploide Kaploide
da levedura da levedura
\ /
MATa Crescimento MATa
Levedura Levedura
Levedura por brotamento Levedura

+ Broto Broto +
A divisáo completa Célula - Célula- A divisáo completa
produz células haploldes - f lha
* -filha produz células haplo » des

i l
A cultuta de haploidcs AD£' produz A cultura de haploldes ode produz
colónias brancas do tipo sevagerr colónias mutadas vermelhas

A união de MATa e MATa produz leveduras diploides.

i i w
MATa x MATa
Gdo de vida da levedura diploide (AOF) { ode )

ADF* ode '

Célula diploide
da levedura

i Duplicação do DMA

ADT
ode As leveduras diptoides sào
heterozigotas ADt / ode

Melose I Separaçàc dos homólogos

Merose II Separação das cromátdes Irmás

J

A meose produz umasco contendo

quatro esporos haplodes

A dissecaçáo do asco e a cultura dos

esporos produzem djas colónias
Colónias na brancas do tpo selvagem e duas
placa de Petri Vermelha colónias vermelhas mutadas.
Branca Vermelha

F i gura 3.15 Observado direta da base cromossômica da segregação alélica no ddo de vida haploide-diploide da levedura.
 Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 83

AN ÁLISE GENÉTICA
Um organismo dipkãde tem o genótipo Dpj: rEr O gene D e o gene E estão emcromossomos diferentes .
Nos diagramas requisitados, rotule cada cópia de cada alelo nos cromossomos e nas cromátides Irmá s.
a. Faça um diagrama de toda metáfase mitótica correta, Hustre esses cromossomos e rotule os alelos .
b. Faça um diagrama de toda metáfase I meiótica correta, ilustre esses cromossomos e rotule os alelos .
.
c Descreva as diferenças entre os diagramas quanto aos homólogos e ao alinhamento dos cro -
mossomos .
d. Compare o resultado da mitose com o resultado da meiose em termos do número de cromosso-
mos e do genótipo das células produzidas.

Estratégias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por esse pro- .
1 Este problema diz respeito à s comparações da mitose e da meiose As .
blema e explique a natureza da resposta so - partes (a) e (b) requerem a ilustração dos alinhamentos cromossômicos
licitada. .
na metá fase A parte (c) requer uma explicaçào das diferenças mrtóticas e
meióticas da metáfase I e a parte (d) requer a comparação dos resultados
da mitose e da meiose.

.
2 Identifique as informações críticas forneci- .
2 O organismo é identificado como um diibrido para um par de genes
das no problema. autossômkos em cromossomos diferentes.
D4CA: 0% orgaravrot hrtmuigo
tos portam jlefcn dtftmtn nos cn>
Deduzir mcKMMncn homóioçov m «oa alefcn
nas cromátidei irmài %áo èdéniicov

.
3 Identifique o posicionamento dos alelos em
cromossomos homólogos e nas cromá tides
irmãs no organismo descrito após a condu-
são da fase S.
.
3 As cromá tides irmã s portam alelos idênticos como resultado da replka -
.
ção do DNA na fase S Assim, as cromátides irmãs de um único cromos-
somo, por exemplo, portam uma cópia de Dl cada. De modo similar, ale-
los idênticos sáo portados em cada conjunto de cromátides irmás.

.
4 Faça uma revisão dos padr ões globais de . .
4 Durante a metáfase mitótica os cromossomos se alinham em uma
alinhamento cromossômlco ao longo da única fila e em uma ordem arbitrária ao longo da placa metafásica. Na
placa metafá sica durante as divisões mitó- fase meiótica I, os homólogos se alinham frente a frente ao longo da
tica e meiótica . placa metafá sica.

Solucionar Resposta a

.
5 Faça o diagrama do alinhamento cromossô- .
5 Qualquer ordem dos quatro
mico durante a metáfase mitótica . cromossomos em uma única
fila ao longo da placa metafá
sica está correta. Um exemplo
é exibido na figura ao lado.
Resposta b
.
6 Faça o diagrama de todo alinhamento cro- .
6 Os cromossomos homólogos
mossômko correto durante a metáfase 1 se alinham frente a frente na
meiótica. .
metá fase I meiótica Os dois
arranjos corretos da ordem
dos cromossomos homólo
gos são exibidos na figura .
Resposta c
.
7 Descreva as diferenças nos diagramas em .
7 Os cromossomos homólogos formam sinapses na meiose, mas não na
relação aos homólogos. mitose. A consequência da sinapse é que os homólogos se alinham perto
um do outro e em lados opostos da placa metafásica na metáfase I. A au -
sência de sinapse na mitose leva ao alinhamento dos cromossomos em
qualquer ordem ao longo da placa metafásica na metá fase mitótica.
Resposta d
.
8 Descreva os diferentes resultados da mitose .
8 A mitose produz duas células- filhas diploides geneticamente idênticas
e da meiose. entre si e à célula progenitora da qual derivaram . A meiose produz qua -
tro células-filhas haploides geneticamente diferentes.

Para praticar mals, ver Problemas 1,5 e 33 .

84 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
das em laborató rio e também em moscas capturadas na
natureza. Ao longo de vários anos, ele encontrou muitas
variantes fenotipicas que utilizou para realizar e analisar
cruzamentos genéticos controlados entre moscas machos
c fémeas selecionadas. Em breve vamos examinar um
conjunto de cruzamentos que levaram Morgan a concluir
que os genes sào portados pelos cromossomos. Porém,
primeiro discutimos algumas outras informações básicas
para a teoria de que os genes estão nos cromossomos.
Heran ça ligada ao X
Enquanto Sutton e Boveri observavam os movi
mentos dos cromossomos durante a meiose, uma pes
quisadora chamada Nettie Stevens estava começando
um estudo microscópico para determinar se as diferen -
ças nos cromossomos eram evidentes entre machos e
fêmeas de uma espécie de besouros, Tenebrio ntolitor
.
Na T molitor, Stevens descobriu que as células diploi
des dos besouros fémeas continham 20 cromossomos
grandes, mas as células diploides dos machos conti
nham apenas 19 cromossomos grandes e um cromos-
somo pequeno. Durante o exame dos cromossomos nos
ovos e espermatozóides da T. molitor , Stevens observou
que todos os ovos continham 10 cromossomos grandes.
No entanto, sua análise do espermatozóide mostrou
que a metade deles continha 10 cromossomos gran
des, enquanto a outra metade continha 9 cromossomos
grandes e um cromossomo pequeno.
Stevens continuou o estudo dos cromossomos nas
células somá ticas e nas gametas de outros insetos e con -
cluiu que as diferenças hereditárias dependentes do sexo
deviam -se à presença de dois cromossomos X grandes nas
fémeas e um cromossomo X e um cromossomo Y muito
menor nos machos. A herança ligada ao sexo refere-se à
transmissão hereditária dos genes nos cromossomos se-
xuais. Stevens propôs que os cromossomos sexuais nos
—
ovos da T. molitor sâo sempre do mesmo tipo cada ovo
contém uma cópia de cada cromossomo autossôrnico e um
cromossomo X. Por outro lado, os espermatozóides podem
portar uma cópia de cada autossomo, além de um cromos-
somo X ou um cromossomo Y. Stevens sugeriu que a pre-
sença de um cromossomo X ou Y em um espermatozóide
determina o sexo da progénie e que a frequência igual dos
espermatozóides portando X e Y contribui para as propor-
ções iguais de machos e fêmeas na progénie observadas nos
cruzamentos. Stevens foi uma das primeiras biólogas a exa
minar a transmissão dos traços ligados ao sexo, e seus es
.
tudos da T molitor foram os primeiros a propor uma base
cromossõmka para a determinação do sexo.
Em 1910, Thomas Hunt Morgan começou uma série
de experimentos na Drosophila que validariam a pro-
posta de Nettie Stevens de que os cromossomos X e Y
ajudam a determinar o sexo e também forneceriam evi
dências sugerindo que os genes são portados pelos cro-
mossomos. Os experimentos começaram quando Lilian
Morgan (esposa de Thomas Hunt Morgan e importante
colaboradora do grupo de laboratório) encontrou uma
Drosophila macho mutada com olhos brancos em um
frasco de moscas do tipo selvagem que havia sido man -
tido no laborató rio por aproximadamente um ano. Esse
macho de olhos brancos destacou -se como mutante por -
que, na Drosophila, as moscas do tipo selvagem possuem
olhos da cor de tijolos vermelhos ( Figura 3.16 ).
O macho mutado de olhos brancos foi cruzado
com uma fémea do tipo selvagem de olhos vermelhos.
O cruzamento produziu 1.237 moscas na progénie F,
—
com olhos vermelhos um resultado que indica a do
minância do tipo selvagem sobre o tipo mutado. Sub-
sequentemente, os integrantes da progénie F , foram
-
cruzados entre si para produzir uma F? prevista para ter
- uma razão de 3:1 entre olhos vermelhos e olhos bran -
- cos. Dentre os integrantes da F2, 2.459 eram fêmeas de
olhos vermelhos, 1.011 eram machos de olhos verme
lhos e 782 eram machos de olhos brancos ( cruzamento
-
A na Figura 3.17). N ão surgiu nenhuma fémea de olhos
. brancos na progénie F2. Claramente, o resultado da F3
- diferiu bastante da expectativa e os olhos brancos pare-
ceram estar ligados ao sexo masculino.
- O resultado inesperado desse cruzamento estimu -
lou uma análise mais atenta da transmissã o dos olhos
brancos. Quando Morgan cruzou o macho original de
olhos brancos e uma das filhas de olhos vermelhos da
progénie F,, esse cruzamento produziu frequê ncias
aproximadamente iguais de machos c fémeas com olhos
- brancos e vermelhos (cruzamento B na Figura 3.17). O
cruzamento final foi um cruzamento recíproco entre
uma fémea de olhos brancos e um macho do tipo selva
gem de olhos vermelhos. A progénie F, do cruzamento
-
recí proco consistiu em fê meas de olhos vermelhos e
machos de olhos brancos (cruzamento C na Figura
3.17). A F 2 continha proporções iguais de machos e fê-
meas de olhos vermelhos e olhos brancos.
Os diagramas dos cruzamentos na Figura 3.17 sào
ilustrados na Figura 3.18, onde w representa o alelo reces-
sivo para o olho branco e »V, o alelo dominante para o olho
vermelho. As diferenças entre os cruzamentos recí procos
observados por Morgan não são previstas pelas leis da
hereditariedade de Mendel. Na verdade, recordamos que
-
-
Figura 3.16 Fenòtlpos ligados ao X da cor do olho na
Drosophila melanoç aster . Os olhos vermelhos (à esquerda )
sào produzidos por um alelo dominante do tipo selvagem.
Os olhos brancos (à direita ) são produzidos por um alelo
recessivo mutado.
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 85

( a ) Cruzamento A - -
macho da mosca da fruta. Os cromossomos X das fé meas
T'
p
^ x

9 Vermelho . cf Branco
\i
'
portam iim alelo dominante w* cada, que produz olhos
vermelhos. A F 2 desse cruzamento consiste em machos de
olhos vermelhos que são H^ Y e fêmeas de olhos vermelhos
que são w* w. A F , desse cruzamento contêm proporções
F, 0
/7 \\
x
/
t
7 \ \
Mcrqar produziu 1237
moscas na progCrie R.
totí ascomohos
iguais de machos de olhos brancos ( wY ) e machos de olhos
vermelhos ( >v* Y) e fêmeas de olhos vermelhos que são,
verrTelhos. em proporções iguais, w* w* e w* w. Pela mesma lógica, no
9 Vermelho i <3 Vermelho
\ cruzamento B o macho original de olhos brancos com sua
A progénte F, dc Mcrgan
filha de olhos vermelhos da Fj deve produzir pro-
F, 0 consstu em 2.459 fémeas
de 0* -
05 ve meí ho 1 JOI 1
*
porções iguais de machos e fêmeas com olhos vermelhos
machos de olho» e brancos. O cruzamento C entre uma fémea de olhos
9 Vermelho 9 Vermelho tfVermdho <3 Branco venrebos e 782 mocho»
de otx» brancos
brancos e um macho de olhos vermelhos proporciona um
teste genético dessa hipótese. O cruzamento produz uma
( b ) Cruzamento B
Fémea de cíhas
,
progénie F com fêmeas de olhos vermelhos e machos de
, olhos brancos, bem como proporções iguais de machos e
venreí hos ca F cruzada
com macho progenitor fêmeas com olhos vermelhos e brancos na progé nie F2.
de ofros brancos. A aná lise de Morgan quanto a esses experimentos
,
( F )9 Vermelho . ( P) tfBranco descreve a herança ligada ao X , um termo que identifica
i Morgan produzo 129
a transmissão dos genes portados pelo cromossomo X.
Q
'í fv
0 O fT
^
® r\
Iji
f"
fémeas de Ohos
wrmefhoi 132 machos Morgan propôs a herança ligada ao X como o modo de
.
9 Vermelho 98ranco
òeohosvemeí bo 88
*
tfVerroelho tfBranco fémeas de obos brancos
transmissão da cor do olho na Drosophila Em seu mo -
e 86 machos de otxx delo de herança ligada ao X, Morgan propôs que os ma
brancos. chos são hemizigotos, um termo que significa “ metade
zigoto", para os genes ligados ao X. Esse termo é empre-

m
(c) Cruzamento C

® »
9Branco tfVermelho
1 X. Os machos hemizigotos herdam seu cromossomo X
A ® * diferem dos fenôtipos do
9 Vermelho . dBranco
I cromossomos X e podem exibir genótipos heterozi -
m
9 Vermefho 9Branco dVermelho dBranco
* n
Figura 3.17 Três cruzamentos de Drosophila realizados
por Morgan para determinar a ligação ao X do gene da
cor do olho. (a ) O cruzamento A determina que todas as
moscas da F, e todas as fémeas da F2 têm olhos vermelhos ( tipo
selvagem ). A metade dos machos da F2 tem olhos vermelhos e
a outra metade tem olhos brancos, ( b) O cruzamento B verifica
que as fémeas da F , são heterozigotas para os alelos da cor do
olho pela constatação de uma razão de 1:1 da cor vermelha
para a branca entre os machos e fémeas da progénie. (c) 0
cruzamento C é o recí proco do cruzamento A produzindo um
resultado diferente nas gerações F, e ?r
Mendei realizou muitos cruzamentos recí procos e não
constatou diferenças nas proporções fenotipicas. Morgan
percebeu que a transmissão dos cromossomos X na Dro
sophila podia contribuir para o surgimento de olhos bran -
cos e vermelhos em seus cruzamentos se o cromossomo
X portasse um gene para a cor do olho. \ o cruzamento
A, o ú nico cromossomo X de um macho de olhos bran -
cos porta um aldo recessivo designado w. O cromossomo
X está presente com um cromossomo Y no genoma do
Reciproco do
cruzamento A
OsferôtlposdaF .
cruzamento rec íproco
Proporções svrilares
àsdo cruzamertcB.
- Análise da não disjunção
'
gado porque os machos têm um ú nico cromossomo X;
portanto, ao contrá rio das fémeas, os machos não podem
ser homozigotos ou heterozigotos para genes ligados ao
de sua m ãe; alé m disso, eles expressam qualquer alelo em
seu cromossomo X, já que o cromossomo Y não pode
portar genes que sejam homólogos aos do cromossomo
X. Ao contrário dos machos, as fêmeas possuem dois
gotos e homozigotos para os genes ligados ao X assim
como ocorre nos genes autossòmicos. Repare também
que os machos podem transmitir o cromossomo X ou o
cromossomo Y, mas o cromossomo X é transmitido ex-
.
clusivamente para a progénie feminina e o cromossomo
Y, para a progénie masculina. Por outro lado, as fêmeas
podem transmitir qualquer um das cromossomos X para
qualquer integrante de sua progénie.
Observa çã o gen é tica A herança dos traços ligados ao
X produz resultados diferentes nos cruzamentos recí procos.
Os machos são homozigotos para os traços ligados ao X ao
passo que as fêmeas são homozigotas ou heterozigotas. Os
machos herdam cromossomo X de suas mães e o transmitem
.
exclusivamente para sua progé nie feminina
O trabalho de Morgan sobre a cor do olho da Dro
sophila o le\ ou a propor a teoria cromossómica da he -
reditariedade, levantando a hipótese de que os genes são
portados pelos cromossomos. As observações de Morgan
quanto à herança da cor do olho foram coerentes com a
86 Análise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Cruzamento reciproco A Figura 3.18 Modelo genético ligado ao X dos

experimentos de Morgan sobre a herança da cor do olho
p 0 ®
-
na Drosophila . A segregação dos cromossomos X e Y no
( a ) cruzamento A, (b ) cruzamento B e (c ) cruzamento C (da
x~ x 9 ry
.. .
\ Figura 3.17).
Vermelho Branco \

\ H/x * \.
F,
-
*
teoria cromossómica, mas a validação da hipótese exigiu a
/ X JÍ*o
/ Vermelho
X"' Y
Vermelho \ descoberta de uma liga ção indiscutível entre um fenótipo
único e a presença ou ausê ncia de um determinado cro-
I 1 *
t
( \ mossomo. Calvin Bridges, um aluno de Morgan, estudou
/
I F, X~ Y \
\
as moscas-da -fruta com fcnótipos dc cor do olho impre-
® 9 \: vistos e n ú meros de cromossomos anormais, produzindo
uma prova da teoria cromossómica da hereditariedade.
-* X~ X~X~ X ~Y Q
:
I As fémeas da Bridges concentrou seu estudo no cruzamento C
Vermelfi?
. Vermelho l F, têm olhos (ver Figuras 3.17 e 3.18), entre uma fé mea de olhos bran -
cos ( HW) e um macho de olhos vermelhos (H^ Y). Quase
!> •
•
I
vprrr Hhn«vOS
*
machos sáo toda a progénie desse cruzamento teve o fenótipo pre-

(b)
I
\

F,
\• k
^ ~
X rr ç >TY
Vermelho Branco

x P
/
/
' j
! vermetios :
brjrx.os. visto, consistindo em fêmeas de olhos vermelhos { w* w)
ou machos de olhos brancos ( wY), mas cerca de 1 em

—
cada 2 mil moscas da F, teve uin “fenó tipo excepcio-
nal" termo utilizado para identificar a progénie com
caracter ísticas imprevistas. Especificamente, as moscas
Vermelho
X Y
Branco*
-
I
excepcionais eram fêmeas de olhos brancos ou machos
de olhos vermelhos. A detecção da progénie excepcional
f *Y feita por Bridges o deixou com duas perguntas a ser res-
F, X* pondidas: ( 1) como a progénie excepcional podia ser ex-
plicada e ( 2) o surgimento de uma progénie excepcional
fornece as informações necessá rias para testar a hipótese

-~ X -
X VTç rr I
Vermelho Vermelho
\
\ Os machos e as
fémeas da
de que os genes estão nos cromossomos?
A resposta à primeira pergunta veio quando Bridges
examinou no microscópio os cromossomos da progénie
ff V ; progénie são
! J vermelhos :
excepcional. Ele viu que as fêmeas excepcionais tinham

Branco
/ } brancos. três cromossomos sexuais
— dois cromossomos X e
um cromossomo Y (XXY) (Figura 3.19). Como discuti-
remos na próxima seção, as moscas-da -fruta com dois
(c ) Cruzamento
cromossomos X são fêmeas, mesmo se também houver
recíproco C
um cromossomo Y, como ocorre nesse caso. Bridges
P também observou um n úmero anormal de cromosso-
-
X X" ç
Branco
X *Y
Verme!IK>
~ mos nos machos excepcionais. Eles portavam um ú nico
cromossomo X , mas nenhum cromossomo Y ( XO). As
moscas-da-fruta com um cromossomo X sào machos, in -
\
F, X dependentemente de portarem ou não um cromossomo
x~x*ç X* Y Y. Com base em suas observações, Bridges propôs que o
Vermelho Vermelho cromossomo Y portado pelas fé meas excepcionais veio
I
f do progenitor ( macho), a única fonte de um cromossomo
Fa X* Y Y no cruzamento, e que ambos os cromossomos X nes -
sas fémeas excepcionais vieram da mãe, concedendo às
fémeas excepcionais duas cópias do alelo w e olhos bran-
Os cruzamentos
recíprocos AeC
fornecem resultados
diferentes na F, e na
- X* ~ X**X Q
Vermelho Vermelho
X Y
Os
ntegrantes
cos. Bridges usou uma l ógica similar para sugerir que o
único cromossomo X nos machos excepcionais veio do
progenitor ( macho) que transmitiu o alelo w\ Os machos
F* os quais são da progénie excepcionais com um único cromossomo X expressaram
Fj sáo o alelo w* como olhos vermelhos.
explicados peia
çàoaoXdogene
‘daigacor do olha
^x - xwxw ç
Branco
X”Y
Brarvcé *
} vermelhos:
j brancos,
Segundo a proposta de Bridges, os fenótipos excep-
cionais e os cariótipos incomuns resultaram de erros
raros na meiose, provocados pela separa ção inadequada
dos cromossomos X na primeira ou na segunda divisão
meiótica nas fé meas. A falha na separação dos cromos -
somos é chamada não disjunção. Repare que, na Figura
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 87

progenitor heterogam ético, enquanto o sexo fenotí pico

x é uma questào de expressão genica adequada e desen -
-
>rx ç
Branco
-
* *a
Vermelho
-
Gameras mascu nos normais
volvimento das características sexuais. Nesta seção, exa
minamos os padrões e processos da determinação sexual
cromossô mica e fenot í pica em vá rios organismos.
-
I

Determinaçã o do sexo na Drosophila

Nàodisjnçáodos
cromossomos X Os estudos de Bridge sobre disjunção cromossô-
f mica e sua prova da teoria cromossômica da heredita -
Y riedade també m forneceram informações sobre a deter -
minaçã o do sexo na Drosophila. Bridges constatou, de
& maneira consistente, que as moscas com um cromos-

Gamela» femininos
--
X X X"
Letal
JTX Vç
Branco
- somo X são machos e que as com dois cromossomos X
são fêmeas. Na Drosophila , o n ú mero de cromossomos
X parece ser um componente cr ítico na determina ção
do sexo e o n ú mero de cromossomos Y, ou mesmo a au -
Nenhum ^
O sência de um segundo cromossomo sexual, parece não
cromossomo YO afetar o padrão de determinação sexual. Desse modo, na
sexual
O
Vermelho Letal Drosophila , as moscas com constituições cromossòmi
cas sexuais XY , YYY e XO são todas machos, enquanto
-
Os qametas possuem as moscas XX ou XXY são fé meas.
dois cromossomos X
ou r ã o possuem
Os dados da Drosophila reunidos por Bridges iden -
cromossomos sexuais tificaram a razã o entre os cromossomos X e o n úmero
de conjuntos haploides de autossomos (1X:2A nos ma -
Figura 3.19 A progénie excepciorval observada por Calvin
Bridges resulta da não disjun ção do cromossomo X .
chos e 2X:2A nas fêmeas) como uma informaçã o fun -
damental para determinar o sexo. Bridges chamou isso
de razão X / A , ou razão X / autossomo. Na realidade, a
3.19, a não disjunção também produz progénie XXX ou razã o X/ A é simplista demais para explicar a determi -
YO. No entanto, Bridges nunca viu essa progé nie, pois nação do sexo na Drosophila. O sexo da Drosophila é
a YO não se desenvolveu e a XXX normalmente é letal. determinado por proteínas regulatórias que se baseiam
As observações de Bridges fornecem provas conclusivas no n ú mero de cromossomos X presentes nos n úcleos
da teoria cromossômica da hereditariedade, mostrando das células nos embriões da Drosophila. Essas proteí nas
que o alelo branco ( tv) segrega com o cromossomo X -
controlam a expressão do gene sex lethal (Sxl ) nas mos-
durante a meiose normal e a não disjunção. A An á lise cas XX. Como discutimos no último capítulo, a pro-
Gen ética 3.2 proporciona a você alguma prá tica apre-
sentando a herança ligada ao X.
teí na Sxl controla a expressão de outros genes que im -
pulsionam o desenvolvimento sexual (ver Capítulo 8).

Observa çã o gen é tica A teoria cromossômica da here-
ditariedade afirma que os genes são portados pelos cromos-
somos. A teoria é suportada pela descoberta de Drosophibs
com fenótipos excepdonals para a cor do olho e anomalias no
numero de cromossomos sexuais.
3.4 A determinação do sexo é
cromossômica e genética
O termo determinação do sexo abrange os proces -
sos genéticos e biológicos que produzem as caracter ís-
ticas masculinas c femininas de uma espécie. O sexo da
maioria dos organismos é identificado em dois n í veis:
como sexo cromossòmico, a presença de cromossomos
sexuais associados aos sexos masculino e feminino em
uma espécie; e como sexo fenotí pico, a morfologia in
terna e externa encontrada em cada sexo. O sexo cro
mossômico é determinado no momento da fertiliza ção e
é controlado pelo cromossomo sexual transmitido pelo
Determinaçã o do sexo dos mamíferos
Assim como a Drosophila , os mam íferos placen -
tirios possuem dois tipos de cromossomos sexuais,
identificados como X e Y. Ao contrá rio da Drosophila ,
porém , a determinação do sexo nos mamíferos placen -
tários depende da presença ou não do cromossomo Y.
Um único gene no cromossomo Y, abreviado como SRY
( região determinante do sexo do Y), inicia uma série
de eventos que levam ao desenvolvimento do fen ótipo
sexual masculino no embrião. Consequentemente,
os embriões dos mam íferos que possuem um ou mais
cromossomos Y ( XY, XXY e XYY, por exemplo) e, por -
tanto, expressam o SRY, vão se desenvolver como ma -
chos. Inversamente, os embriões que portam apenas
cromossomos X ( XX, XO e XXX, por exemplo) e que
n ão expressam o SRY vão se desenvolver como fêmeas.
- -
O SRY é uma proteína de fator de transcrição que dis
- para uma cascata de transcrição gênica e eventos evoluti-
vos que acabam produzindo estruturas masculinas inter -
-
nas e externas Os embriões primordiais nos mamíferos
88 Análise gené tica: uma abordagem integrada

ANÁ LISE GENÉTICA

Uma fêmea de mosca -da-fruta de um estoque de linhagem pura com corpo amarelo e asas com-
pletas é cruzada com um macho de um estoque de linhagem pura com corpo cinzento e asas ves
.
tigiais A progénie do cruzamento consiste em machos com corpo amarelo e asas completas e fé-
meas com corpo cinzento e asas completas.
a. Determine o modo de herança de cada traço .
.
b Forneça os fenótipos das moscas progenitoras e da progénie masculina e feminina usando desig-
nações de alelos claramente definidas de sua escolha.

Estratégias de solu çã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por esse pro- .
1 Os padrões de transmissão dos dois traços da Drosoçbila e os genótipos
blema e explique a natureza da resposta so - dos organismos devem ser determinados com base no número e nas
licitada . ,
proporções entre machos e fémeas da progénie F com os traços .
2. Identifique as informações críticas forneci- .
2 Os fenótipos parentais de linhagem pura são fornecidos com os fenóti -
das no problema. pos da progénie masculina e feminina na geração F ,.
Deduzir
3. Considere os resultados fenotípicos da F , à .
3 Toda a progénie Ft possui asas completas e nenhum integrante possui
luz dos fenótipos parentais. asas vestigials, sugerindo que a asa completa é dominante. Os machos
da F, são exclusivamente de corpo amarelo, enquanto as fêmeas da F,
DICA: Os resutraòos do cruzamento cje aparecem
tyuafcncrKe em ambos os sexos s o coerentes com a he-
são exdusivamente de corpo cinzento. A cor do corpo do macho na F é ,
*
rança autossÁmíca As dAprenças cve dependem do sexo idêntica à da fêmea progenitora, enquanto a cor do corpo das fémeas na
F, é idêntica à do macho progenitor.
em um cruzamento sugerem a herança ligada ao sexo.

.
4 Estabeleça as hipóteses dos modos de he .
4 A observação de uma cor do corpo nos machos da F, e outra cor nas fé -
rança da cor do corpo e do formato da asa a meas sugere que se trata de um traço ligado ao X. Uma vez que os ma-
partir dos dados da Fr chos homozlgotos têm corpo amarelo e as fémeas têm corpo cinzento,
é provável que o corpo cinzento seja dominante e o corpo amarelo seja
DICA: Tcslr a hlpAti^r do recessivo.Os resultados da F, quanto à forma da asa são os mesmos para
modo dr herança comparando ambos os sexos, sugerindo que se trata de um traço autossómico.
as raròes proia» r abvrvadm
na progónie f ,.
Solucionar
.
5 Teste o modo de transmissão proposto para . ,
5 Os integrantes da F de ambos os sexos possuem asas completas, coe-
a forma da asa. rente com um traço autossómico. 0 progenitor de linhagem pura e asa

DICA: Compare á orogínk? observada e

completa transmite os alelos dominantes para toda a progénie e o pro -
prewsta na geraçk» F . para testa a hipó-
*
genitor de linhagem pura e asa vestigial transmite o alelo recessivo A .
tese do modo de transir«ssia. ,
previsão é que a F seja heterozigota e exiba o traço dominante.

.
6 Teste o modo de transmissão da cor do
corpo.
.
7 Determine os genótipos das moscas pro
genitoras e das integrantes da progénie F
Use y* para o corpo amarelo, y para o corpo
cinzento, v* para asa completa e v para asa
vestigial.
.
6 A diferença dependente do sexo na cor do corpo entre os machos e fé-
.
meas da F, sugere fortemente que esse traço é ligado ao X Os machos da
F, herdam o alelo recessivo materno para o corpo amarelo e expressam
o traço porque são hemizigotos. As fémeas da F, herdam um alelo reces-
sivo no cromossomo X materno e um alelo dominante no cromossomo X
.
paterno, sendo heterozigotas Assim, elas exibem o fenótipo dominante .
- 7. Os genótipos dos progenitores de linhagem pura sáo X / X; +/+ para as
,. fêmeas de corpo amarelo e asa completa e X* / Y; v /v para os machos de
,
corpo cinzento e asas vestigiais. As fémeas da F são X / X * ; +/v e os ma -
,
chos da F sáo X /Y; +/v.

Para praticar mais, ver Problemas 6.12 e 15 .


Gônada ná o
diferenciada
Duto de Wolff -— Duto de Muller
W ausente
l basta para controlar o desenvolvimento sexual. As
Ovários
i pécies de pássaros, em alguns ré pteis, em certos peixes e
Próstata
O dores de dois cromossomos iguais. Para evitar confusão
Útero / Ová rios
Vaso
deferente
Vaginal - Pénis
Test ículo
Mulher Homem
Figura 3.20 A determina çã o do sexo nos mam íferos é
.
iniciada pelo gene SRY ligado ao Y
contêm agrupamentos gêmeos de tecido, identificados
como gónadas não diferenciadas, que podem se desen -
volver como ovários ou testículos. Conectados às gôna -
das não diferenciadas, existem dois conjuntos de tecidos,
chamados dutos de Wolff ou mesonéfricos e dutos de
Muller ou paramesonéfricos. Somente um desses tecidos
se desenvolve. Os dutos de Wolff podem se desenvolver e
formar estruturas sexuais masculinas. De modo alterna -
tivo, os dutos de Muller podem se desenvolver e formar
estruturas sexuais femininas. Nos embriões masculinos, a
expressão do SRY inicia o desenvolvimento testicular das
gô nadas nã o diferenciadas por meio da ação do MPG. As
células intersticiais nos test
ículos em desenvolvimento
sintetizam dois hormònios androgênicos masculinos, a
testosterona e a di-hidrotestosterona ( DHT), que ajudam
a impulsionar o desenvolvimento do duto de Wolff e, fi
nalmente, levar à formação das estruturas sexuais mas-
culinas internas e externas. Separadamente, nas células
especializadas, chamadas células de Sertoli, o SRY esti
mula a produção do fator inibidor de Muller ( MIF), que
degrada os dutos de Muller para evitar o desenvolvimento
das estruturas sexuais femininas ( Figura 3.20).
Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 89
Os embriões femininos não são portadores de um
cromossomo Y e, portanto, não expressam o SRY. O
modelo atual sugere que a ausência do SRY suprime a
expressão dos genes que levam ao desenvolvimento
masculino e, em vez disso, leva à expressão dos genes
que estimulam o tecido gonadal não diferenciado a se
desenvolver em ovários e faz que os dutos de Muller
se desenvolvam em estruturas sexuais femininas.
Embora o SRY seja um gene necessá rio no desen -
volvimento sexual dos mam íferos, por si só ele não
mutações ligadas ao X e os genes autossò micos men -
cionados na Observação Experimental 3.1 foram
identificados como as causas das anomalias no desen-
volvimento sexual humano.
Diversidade da determinação sexual
Você está familiarizado com a designação cromos-
só mica XX e XY significando que as fémeas sã o por -
tadoras de dois cromossomos X e os machos são
portadores de um X e um Y. Entretanto, em muitas es -
nas traças e borboletas as fémeas sã o portadoras de dois
cromossomos sexuais diferentes e os machos são porta -
com o sistema XX / XY, é utilizado um sistema de letras
diferente, chamado sistema Z /W. No sistema Z/W, os
machos são identificados como portadores de dois cro-
mossomos sexuais Z ou uma composição de cromos
somos sexuais ZZ. Por outro lado , as fêmeas possuem
-
dois cromossomos sexuais diferentes e são identificadas
como ZW. As letras Z e W são utilizadas para destacar
as composições cromossô micas sexuais diferentes asso-
ciadas a cada sexo na espécie em questão.
As diferenças cromossômicas sexuais no sistema
Z/ W produzem resultados diferentes a partir dos cru -
zamentos recí procos envolvendo genes ligados ao Z,
assim como há diferen ças decorrentes dos cruzamen -
tos recí procos envolvendo genes ligados ao X. A igura
3.21 mostra cruzamentos recí procos entre galinhas de
linhagem pura ( fêmeas) e galos de linhagem pura ( ma -
chos) envolvendo um alelo dominante ligado ao Z para
penas listradas ( ZB ) e sua contraparte recessiva, que
.
sã o as penas náo listradas (Z*) Os resultados da F, dos
cruzamentos recí procos revelam diferenças. O cruza
mento A produz galinhas listradas ( ZÍ U'/) e galos lis-
-
trados ( Z*7? ) na Fj, enquanto o cruzamento B produz
galinhas não listradas (Z* W) e galos listrados ( ZBZk ). Os
resultados da F7 desses cruzamentos também produ -
zem diferenças. Entre a F3 do cruzamento A , todos os
galos são listrados, enquanto as galinhas exibem uma
- razão 1:1 de listradas : não listradas. Entre a F2 do cru -
zamento B, existe uma razão 1:1 de listradas para não
listradas em ambos os sexos. Podemos concluir que o
- mecanismo de transmissã o dos genes ligados ao Z no
sistema Z / W é o mesmo que o do sistema XX / XY, ex-
ceto que os padr ões sào o inverso dos encontrados nos
mamíferos placentirios.
90 Análise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Cruzamento A
Figura 3.21 A herança ZW da forma da pena nas aves
é revelada pela análise dos cruzamentos recí procos.
(a) A fémea hemizigota (galinha ) com penas não listradas
recessivas, cruzada com um macho de linhagem pura (galo)
possuindo penas listradas dominantes, produz progénie
rw ZrZr F , e machos de progénie F 2 com penas listradas. As fêmeas
da F ? exibem uma razão 1:1 de listrada para não listrada .
F, Galinha Galo ( b) O cruzamento reciproco produz resultados diferentes nas
Toda a progénie F, é listrada. gerações F , e F , coerentes com a transmissão ZW ligada ao
2*W
^
sexo relativa à forma da pena.

F, r r O conteú do cromossômico sexual é ainda mais in-

comum nos monotremados, como o orn ítorrinco, mam í-
fero nativo da Austrália que pòe ovos. Como os mono-
-
tremados sào mam íferos, acreditava se que eles tinham
um mecanismo de determinação do sexo similar ao do
zaza z*z* sistema XX / XY dos mamíferos placentános. No entanto,
Galo Galo quando os cromossomos do orní torrinco foram exami-
listrado listrado Todos os galos da
f } são listrados; nados, os biólogos descobriram que os machos tinham
gainhassào cinco conjuntos de cromossomos sexuais X e Y, enquanto

v ‘4
z*w
Galinha
¥ z*w
Galinha não
Isrradas
não listradas. as fêmeas tinham cinco conjuntos de cromossomos X.
Os cromossomos sexuais do orn ítorrinco macho sào re
presentados como XlYlX2Y 2X3Y3X4Y4XsY. e os cromos-
somos sexuais da fé mea de omitorrinco são representa
-
-
listrada listrada dos como XlX1X7X2XJX3X4X4X5Xs. Vários conjuntos de
cromossomos sexuais també m foram documentados em
(b) Cruzamento B algumas espécies de plantas, térmitas e aranhas.

Observa çã o gené tica A determinação do sexo na Dro-

sophiia se baseia na proporção X/A 0 sexo masculino nos ma-
míferos placentários é determinado pela presença ou ausên-
rz* cia de um cromossomo Y e pelo gene SRY .0 sistema Z/W nas
aves, peixes e alguns Insetos, e os vários cromossomos sexuais
F, Galinha Galo , nos monot/emados e outros organismos, são exemplos de ou-
Z*W | Todas as galinhas da F são não
listradas; os galos são Ibtrados. tros mecanismos de determinação do sexo.
i
f 1
Fa z* 7"
3.5 A transmissã o humana ligada ao
sexo segue padrõ es distintos
- Z*
ZaZ* z*z*
A herança dos alelos mutados no cromossomo X
humano produz fcnótipos mutados cm dois padròcs
Galo
listrado
Galo nào
listrado As galinhas e os simples. A herança recessiva ligada ao X é o padrã o he -
aaiosda F? sáo reditá rio que determina o olho branco na Drosophiia.
Jlstrados: Com esse modo de herança , as fêmeas homozigotas

z*w
¥ z*w
j não listrados
para o alelo recessivo e os machos hemizigotos, cujo
cromossomo X é portador do alelo recessivo, exibem o
fenótipo recessivo. O modo alternativo de transmissão
ligada ao X é a herança dominante ligada ao X, na qual
Galinha Galinha não
listrada listrada as fêmeas heterozigotas e os machos hemizigotos para o
alelo dominante expressam o fenótipo dominante.
í jzem resultados diferentes
Os cruzamentos recíprocos A e B prot
na F, e F mdfcando que a forma da pena é ligada ao sexo.
Tenha em mente que os termos recessivo e domi
nante referem -se especificamente à expressão dos tra -
-
* ços nas fêmeas homozigotas ou heterozigotas para cada
gene ligado ao X. Machos hemizigotos expressam qual -
quer alelo em seu cromossomo X, independentemente
do padrão hereditá rio nas fê meas. Alé m disso , a proba -
bilidade de transmissão do cromossomo para a progê *

Observa çã o Experimental 3.1
Mutações que alteram o desenvolvimento sexual humano
Muitos genes, alem do SAY , coordenam o desenvolvi-
mento sexual humano. Aqui identificamos três outros genes
cuja mutação afeta a produção ou a capacidade de smaliza-
çáo celular dos hormômos androgémeos testosterona e DHT
(di-hidrotestosteronal e resulta em desenvolvimento sexual
anormal. Essas condições têm causas e consequências Afe-
rentes. Partindo de uma perspectiva medica, a identificação
ambí gua do género é uma consequência das condições. Em
termos pessoais, importantes questões psicossociais da per
sonalidade e da identidade de gênero confrontam os indiví -
duos com cada uma dessas condições.
A sindrome de insensibilidade androgêmea (AIS) (Omim
300068) é provocada por mutações ligadas ao X do gene Af í
(receptor do androgènío). O Af í é fundamental na produção
dos receptores do androgènío nas células sensíveis a esse
.
hormõnio. Os indiví duos com AIS são XY têm um gene SRY
totalmente funcional e produzem quantidades normas de
testosterona e DHT. No entanto, na ausência dos receptores
de androgènío, a testosterona e o DHT não conseguem se
ligar á s células, não mciando a expressão genica que acom-
panha o desenvolvimento sexual masculino. Em decorr ência
desse déficit, os indivíduos com AIS têm um fenotipo externo
.
que parece feminino listo e inversão sexual): mas as estru-
turas reprodutivas internas não se desenvolvem como mas
culinas ou femininas, coníenndo esterilidade aos indivíduos
portadores da sindrome A insensibilidade androgénea xrv-
pede o desenvolvimento das estruturas sexuais masculinas,
enquanto a produção de MIF iniciada pelo Sf íY degrada os
dutos de Muiler e bloqueia o desenvolvimento das estruturas
sexuais femininas.
Ouando os genes que atuam na via bioquímica que con-
trola a testosterona e o DHT sofrem mutações, ocorrem níveis
inadequados de androgènío e os indivíduos podem cxAxr
pteudo-hermcfrodiTivno um termo que se refere ao surgi-
mento de formas não funcionais das estruturas masculinas e
.
r
í Y inprf
Sf w
.
nos d nãonas 9)
Duto de Wotff
Q
Tesòcuto
Carregando l
Fator
Colesterol
antimulertano
Mutação
docvpzr
Degeneração do
Testosterona
dutodeMiAer
^
_ Mutação
do SKD5A2
DHT (dehidro-
testosterona)
Capitulo 3 Dfvrsão celular e hereditariedade cromossómica 91
femininas em uma unica pessoa. Os pseudo-hermafroditas
são estéreis. O transtorno autossómko recessivo de defici
ênoa da 5-atfa-redutase (Omim 607306) produz uma forma
de pseudo-hermafrod»tismo decorrente da mutação do gene
.
do esteroide 5 -afía-redutase- 2 ( 5RDSA2 ) Esse gene produz a
.
enzima S alfa redutase que ajuda a converter a testosterona
em DHT. Os individuos com deficiência de 5-alfa redutase são
.
XY têm um gene SPT do tipo selvagem, passam pek) desen -
- volvimento do duto de Wolff e expressam MIF.O desenvolvi -
mento do <kito de Wolff produz estruturas internas masculi
.
nas mas a incapacidade de converter a testosterona em DHT
resulta na ausência de estruturas masculinas externas Ao .
nascimento, os indivíduos com deficiência de 5 alfa redutase
parecem mulheres Porem, na puberdade, as glândulas
adrenais começam a produção de testosterona, que leva à s
caracíensticas sexuais masculinas secundárias, como o en
.
grossamento da voz o crescimento dos pelos faciais e o de
senvolvimento de uma ps*que masculina.
Por fim, a mutação do CYP21, um gene que produz a
.
enzima 21-hidroxilase causa a forma mais comum de hiper -
plasia adrenal congénita autossõmica recessiva (CAH) (Omim
201910). A 21-h»droxilase funcional participa do esgotamento
da testosterona e da DHT; desse modo, sua mutação leva ao
acumulo de testosterona e DHT. A mutação do CPY21 produz
pseudo hermafroditismo em homens e mulheres em razão
.
dos altos nrvers de androgènío Meninos com CAH entram
na puberdade com até 3 anos de idade e exibem museu la
tura masculina, pénis aumentado e crescimento testicular .
Meninas com CAH nascem com um dttòris aumentado, que
pode ser confundido com um pequeno pénis. Embora esteja
presente a anatomia reprodutiva feminina interna normal,
mulheres com CAH estão sujeitas ao crescimento de pelos
faoars similares aos masculinos, c ao engrossamento da voz
na puberdade. Não ocorre menstruação, como consequência
dos nrvets excessivos de androgènío.
leva a
deficiênciade
- -*
> o educa^e
(Akàts senswers Estruturas
ao androgènío masculina externas
*
í
Le- a ã hperptau
endcongêrea
i
Mutação
leva ã sindrome
de (nsensib&dade
ardrogênica e á
** do AP
nversão sexuã
CéMassensws Estruturas
^
aoandrogéno masculinas internas
92 Análise gené tica: uma abordagem integrada

Tabela 3.2 Breve lista dos traços humanos dominantes e recessivos ligados ao X *

Doença Sintoma
Transtornos dominantes ligados ao X
Amelogênese imperfeita (Omim 301200) Desenvolvimento e distribuição anormais do esmalte dentário
Hlpertricose generalizada congénita (Omim 307150) Ampla distribuição dos pelos na face e no corpo
Hlpofosfatemia (Omim 307800) Deficiência de fosfato que provoca raquitismo
Síndrome de Rett (Omim 312750) Retardamento mental e defeitos neuroevolutivos
Transtornos recessivos ligados ao X
Displasia ectodérmka anidrótica (Omim 305100) Ausência de dentes, pelos e glândulas sudor
íparas
Daltonismo (Omim 303800) Deficiência na percepçáo de cor
Sindrome do X frágil (Omim 300624) Retardamento mental e defeitos neuroevolutivos
Hemofilia A (Omim 306700) Anomalia da coagulação sanguinea
Síndrome de Lesch-Nyhan (Omim 300322) Retardamento mental com automutllaçáo e paralisia cerebral
espá stica
Distrofia muscular (tipo Becker, Omim 300376) e tipo Duchen- Fraqueza muscular progressiva
ne (Omim 310200)
Deficiência de ornitina transcarbamilase (Omim 311250) Deterioração mental decorrente do acúmulo de amónia com a
ingestão de proteínas
Retinite plgmentosa (Omim 300029) Cegueira noturna, constrição do campo visual
'Omim = Online Mendelian InherItarvce of Man (ver a discussão no Capitulo 1).

.
nie não é a mesma nos dois sexos A transmissão femi
nina ligada ao X é idê ntica à transmissão autossòmica,
ao passo que os machos hemizigotos sempre transmi
tem seu cromossomo X para a progénie feminina e seu
cromossomo Y para a progénie masculina.
Expressão dos tra ços recessivos ligados ao X
Os traços recessivos ligados ao X são expressos nos
machos hemizigotos portadores do alelo recessivo e nas
fêmeas homozigotas para o alelo recessivo. Como os ma
chos hemizigotos expressam a ú nica có pia de um alelo
recessivo ligado ao X em seu fenótipo, uma das peculiari
dades da herança recessiva ligada ao X é a observa ção de
que há muito mais machos do que fêmeas expressando
os traços. A Tabela 3.2 apresenta vá rios transtornos liga
dos ao X, incluindo o daltonismo, que afeta a percepçáo
- das cores vermelha e verde (ver a foto de abertura do ca -
pítulo) e que é o assunto do Estudo de Caso ao final do
- capítulo, e a hemofilia A, um transtorno de coagulação
sanguínea que discutimos em mais detalhes posterior-
mente. Quatro aspectos que caracterizam a herança re-
cessiva ligada ao X sào ilustrados na Finura 3.22.
1. Muito mais machos do que fémeas têm o fenótipo
recessivo, em decorrê ncia de os machos serem he-
mizigotos. Existem 10 machos recessivos e 2 fê-
meas recessivas.
- 2. Se um macho recessivo acasalar com uma fêmea
- homozigota dominante, toda a progénie tê m o fe-
nótipo dominante. Toda a progénie feminina con -
siste em portadoras heterozigotas e toda a progénie
masculina é homozigota para o alelo dominante.
-
- -
Ver a progénie resultante do cruzamento 1 1 * 1 2.

Figura 3.22 A herança I

recessiva ligada ao X produz
quatro aspectos caracterí sticos.
II

Or
"
é
x x° x v
*
Ó xàv Ó
xx*
É è> Ó
-
rr
ÔB DÓ
rv >
* ICY CY ric CY
6
>
«
CJC
T
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X°Y

V
àòàó
X*Y X* X° >TY
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômka 93

3. Os acasalamentos de machos recessivos e fé meas
portadoras produzem o fenótipo recessivo em me-
tade da progé nie e o fenótipo dominante na outra
metade. Ver os resultados dos cruzamentos III-13
-
* III -4 e III 1 x III 2. -
4. O acasalamento de uma fê mea homozigota reces -
siva e um macho hemizigoto dominante produz
uma progénie masculina com o fen ótipo recessivo
e uma progénie feminina com o fenó tipo domi-
nante, sendo portadores do alelo recessivo. Ver os
resultados do cruzamento IV 5 x IV 6 - -.
A hemofilia A, um grave transtorno de coagulação
sangu í nea, é causada pela mutaçã o de um gene ligado ao
X, chamado fator VIII ( F8 ), que produz uma proteína de
coagula ção sangu í nea chamada prote í na do fator VIII.
A hemofilia A é transmitida de modo recessivo ligado
ao X, na maioria das vezes por uma m ãe portadora que
transmite o alelo mutado a um filho afetado. De uma
maneira recessiva ligada ao X típica, aproximadamente
a metade dos filhos das portadoras tem a doen ça . Nes-
sas fam ílias, a doença frequentemente parece “saltar*
uma geração, pois o alelo mutado é transmitido do pai
afetado para a filha portadora e para um neto afetado.
Em algumas famílias, uma mutação recorrente do
gene F8 è responsável pelo surgimento da hemofilia. Um
exemplo ocorreu nas famílias reais da Inglaterra e da Eu
ropa: uma aparente mutação recorrente do gene F8 afetou
a rainha Vitória da Inglaterra (Figura 3.23). Vitória teve
quatro filhos, um dos quais era hemof ílico, e cinco filhas,
duas delas portadoras conhecidas. As filhas portadoras
tinham coagulação sanguínea normal, mas introduziram
uma mutação nas famílias reais da R ússia, Alemanha e Es-
panha, através do casamento misto. Essas filhas transmi -
tiram a mutação para seus filhos, que tiveram hemofilia,
e para suas filhas, que eram portadoras como suas mães.
Transmissão de traço dominante ligado ao X
A transmissão dos traços controlada pelos alelos do -
minantes ligados ao X possui trés características especiais:
1. Fêmeas heterozigotas acasaladas com machos do
tipo selvagem transmitem o alelo dominante para a
metade de sua progénie de cada sexo .
2. Machos hemizigotos dominantes acasalados com
fémeas homozigotas recessivas transmitem o traço
dominante para todas as suas filhas, mas para ne
nhum dos filhos.
-
3. O traço parece ser igualmente frequente em homens
e mulheres , pois apenas uma ú nica cópia do alelo é
necessária para produzir o fenótipo dominante.
A hipertricose generalizada congénita (CGH) é um
- transtorno dominante ligado ao X, raro e dramá tico nos

Edward '"N Vitória

Duque de Kent
^VitóPrincesa
ria
de Saxe-Coburg
II
Rainha da Inglaterra

111 O —
Victona Fredenck Edward VII
da da
Alemanha Inglaterra
éhO
Alice
Ò è) Ò Ò É-rO
Leopold
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Beatrice

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( Nenhum rh
descendente afetado) U l
GeorgeV
- o o éhO ú éhu ó ò OT4> ú ò DrO é é
Irene Henry da Alix Nikolas II Alice Alfonso XIII Victona Leopold Maurke
Pr ússia da R ússia da Espanha

V Éúè ò ò ò ò i é «iha E © èáòro

/* / /
Fam í lia real russa

VI
Margaret
OTO
Elizabeth II Juan Carlos
da Espanha
] Homem normal
VII óà o Anne Charles Andrew Edward
Ò O Mulher normal
Fam ília real
espanhola

|Homem afetado
VIII âo & O ó
Peter Zara William Harry Beatrice Eugenie
•
( ; Mulher portadora
, Possí vel mulher
/'Ts

Fam ília real brttfnka ^ portadora

Figura 3.23 Hemofilia nas fam ílias reais europeias.

94 An á lise gen é tica: uma abordagem Integrada

seres humanos que exibem cada uma dessas caracteris
ticas. A condição aumenta substancialmente o n úmero
de fol ículos pilosos no corpo e produz muito mais pelos
corporais do que o normal, tanto nos homens quanto
nas mulheres ( Figura 3.24 a ). Mulheres com CGH têm
um fenó tipo reconhecí vel, mas os pelos da face e do
corpo são menos extensos e tendem a se apresentar em
placas, por razões que discutiremos no final do capitulo.
Uma genealogia parcial de uma família com CGH ilustra
a transmissão dos alelos dominantes pela mulher III-1
para a metade de seus filhos e a transmissão do alelo pelo
homem II- 2 para todas as suas filhas, mas para nenhum
dos filhos ( Figura 3.24b}. A Aná lise Genética 3.3 examina
a segregação dos alelos ligados ao X na Drosophiht .
Observaçã o genética A transmissão da herança recessiva
ligada ao X leva ao fenótipo recessivo em muito mais homens
hemizigotos que mulheres. Os alelos dominantes ligados ao X
são transmitidos das mulheres para a progé nie em um padrã o
idêntico ao da transmissão autossômica dominante. Os ho-
mens transmitem alelos dominantes ligados ao X para todas
as fithas, mas não para os filhos.
Herança ligada ao Y
O cromossomo Y é encontrado apenas nos ho-
mens, e os genes ligados ao Y sã o transmitidos em um
padrão homem para homem . Nos mamíferos, menos de
50 genes são encontrados no cromossomo Y e, como o
SRY, esses genes provavelmente exercem um papel na
determinação sexual masculina ou no desenvolvimento
(a )
-
Figura 3.2 ' Hipertrkose
generalizada congé nita
( CGH ), um tra ço
dominante ligado ao X
nos humanos, ( a ) Menino
com CGH. ( b ) Genealogia
modificada de uma fam ília
grande com CGH. No ú nico
caso de transmissão de um
homem afetado
(11-2 ), repare que todas as
filhas (111-5 at é 111-8) são
portadoras de CGH. O
menino de 6 anos de idade
.
na foto (a ) é o IV-5
( b)
I
- sexual masculino. Além do SRY, o cromossomo Y hu -
mano contém várias cópias dos genes na família YRRM
( motivo de reconhecimento do RNA no cromossomo Y,
do inglês X chromosome &YA zecognition motij) e um
gene apelidado DAZ ( deletado na azoospermia , a inca-
pacidade de produzir espermatozóides). Um segmento
do cromossomo Y contendo o DAZ é deletado em al
guns homens incapazes de produzir espermatozóides.
-
As mulheres nunca são portadoras de um cromos-
somo Y; então, partindo de uma perspectiva evolutiva,
faz sentido que os genes portados por um cromossomo
Y devam ser específicos para os homens, tendo a ver com
a determinação do sexo masculino ou com a reprodução.
Como os homens são portadores de apenas uma cópia do
cromossomo Y , acreditava -se que eles fossem hemizigo-
tos para esses genes, como o são para os genes em seu
cromossomo X. No entanto, o sequenciamento recente
do cromossomo Y humano revelou que a maioria dos
genes nesse cromossomo é duplicada, já que o Y foi for-
mado a partir de dois segmentos contendo a mesma série
de genes. Como essas duas regiões estão no mesmo cro-
mossomo, elas não recombinam durante a meiose, como
acontece com as regiões nos cromossomos homólogos.
Os cromossomos X e Y humanos possuem poucos
genes em comum localizados em duas regiões de homo-
logia, chamadas regiões pseudoautossômicas ( PAR ),
que permitem que os cromossomos formem pares ho-
.
mólogos durante a meiose ( Figura 3.25 ) Essas regiões,
designadas PARI e PAR2, estão situadas nas extremida-
des dos cromossomos X e Y. Elas são “ pseudoautossômi -
cas" porque seu padrão de herança assemelha -se ao da
transmissão autossômica
—
existem duas cópias homó-
logas de cada região por genoma, embora as regiões cro-
mossôm ícas estejam nos cromássemos sexuais em vez
de nos autossomos. Durante a meiose nos homens, os
cromossomos X e Y formam sinapses entre si usando os
segmentos PAR. Há evidê ncias de que, como as demais
regiões de homologia cromossômica na sinapse, os seg
mentos PAR do X e do Y sofrem cruzamento.
-
Observação genética A transmissão do cromossomo Y é
de homem para homem . Poucos genes, exceto os específicos
para a determinação masculina, são encontrados no cromos-
somo Y. Os cromossomos X e Y compartilham homologia de
sequénda apenas nas regiões pseudoautossômicas ( PARs )
que permitem sinapse.
01995 Mucmilan PuUfetoit Ltd

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12 3 4 5 6 79 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
 Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 95

AN ÁLISE GENÉTICA
Nas moscas-da-fruta, o corpo amarelo (y) é recessivo em relação ao corpo cinzento (y* ) e o traço da cor
do corpo é herdado no cromossomo X. A asa vestigial ( v) é recessiva em relação ã asa completa (v*) e
.
o traço tem herança autossómka É realizado o cruzamento de um macho de corpo amarelo e asas
completas com uma fémea de corpo cinzento e asas completas. Com base na análise da progénie do
cruzamento exibido a seguir, determine os genótipos das moscas progenitoras e da progénie .
Fenótipo Número de machos Número de fémeas
Corpo amarelo, asa completa 296 301
Corpo amarelo, asa vestigial 101 98
Corpo cinzento, asa completa 302 298
Corpo cinzento, asa vestigial 101 103
800 800

Estrat égias de solu ção Etapas da solu ção

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado
por esse problema e explique a
.
1 Os genótipos dos progenitores e da progénie para um traço autossómico e um
traço ligado ao X devem ser determinados com base no número e nas propor ções
natureza da resposta solicitada . de machos e fêmeas da progénie portadores dos traços .
.
2 Identifique as informações críticas .
2 Os fenótipos parentais sáo fornecidos com o número de machos e fêmeas da pro -
fornecidas no problema . génie portadores de cada fenótipo .
Deduzir
.
3 Identifique as razões fenotípicas .
3 fcntre a progénie, a razão entre as asas completas e vestigiais é aproximadamente 3:1
da cor do corpo e da forma da asa
na progénie .
em cada sexo —
598202 nos machos e 599201 nas fêmeas Por outro lado, a razão
entre o corpo amarelo e o corpo cinzento é aproximadamente 1:1 em cada sexo
.
—
397:403 nos machos e 399:401 nas fémeas.

4. Determine as propor ções fenotí- .

4 Entre os 1.600 integrantes da progénie, as frequências fenotípicas são as mesmas
picas na progénie. para machos e fêmeas:
Fenótipo Proporção numérica
Amarelo, completa 296/800 e 301/800 =|
Amarelo, vestigial 101/800 e 98/800 = J
MCA: Cenas razões fenotí picas da pro- Cinzento, completa 302/800 e 298/800 =|
.
gér - e sk> caracter sticas dos cruzamentos
«nim genótipos espedKeos . Cinzento, vestigial 101/800 e 103/800 = J
.
5 Deduza as origens das razões na .
5 Uma razão 3:1 para um traço autossómico é o resultado previsto do cruzamento de dois
progénie . .
heterozigotos Uma razão 1:1 dos fenótipos ligados ao X envolvendo um progenitor
masculino com traço recessivo é o resultado previsto se a fémea dominante for hete-
.
rozigota Para os traços autossòmicos ligados ao X nesse cruzamento, uma proporção
fenotípica de| é prevista para o traço autossómico dominante ( ) e para qualquer um J
J
dos fenótipos ligados ao X ( ). A proporção de é prevista para o traço autossómico
J
J
recessivo ( ) e para qualquer um dos fenótipos ligados ao X ( \\
Solucionar
.
6 Atíibua genótipos às moscas da .
6 Com base nas informações anteriores, os genótipos sào:
fr Genótipo Genó tipo
Fenótipo masculino feminino
~

Amarelo, completa m+/

Amarelo, vestigial Xy / Y; v /v Xy / Xy; v/v

Cinzento, completa X>* / Y; +/ _ Xn/Xy;+/ _

Cinzento, vestigial XyVY; v /v Xy 4 / Xy; v/v

Para pratkar mais, ver Problemas 20, 22 e 28 .

96 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

quanto os machos têm apenas uma ú nica có pia de cada

gene ligado ao X. Nos animais, o equilíbrio da dosagem
génica é essencial para o desenvolvimento embrio-
ná rio normal e para os processos biológicos normais.
Qualquer mecanismo que compense as diferenças no
Centrômero n ú mero de cópias de genes em decorrência das consti
tuições cromossó micas diferentes dos machos e fêmeas
-
é chamado compensação de dosagem. Existem pelo
menos três mecanismos de compensação de dosagem
que igualam a expressão dos genes ligados ao X entre
animais machos e fêmeas. A Tabela 3.3 mostra os meca -
nismos de compensação de dosagem nos animais. Nesta
seção, concentramos a atenção na compensação de do-
Cromossomo Y sagem em mamíferos placentários.

Inativa çã o aleatória do cromossomo X nos

Figura 3.25 Regiões pseudoautossômicasdos
cromossomos X Y. • tade das células somá ticas em um embrião feminino,
3.6 A compensa ção da dosagem
equaliza a dosagem dos genes
ligados ao sexo
Nos organismos com cromossomos sexuais, há um
desequilíbrio entre os sexos no n ú mero de cópias dos
genes nos cromossomos sexuais. Na DrosophiLi e nos
mamíferos placentários, as fêmeas tém duas có pias de
cada gene ligado ao X, uma em cada cromossomo X, en
mamíferos placentários
Os mam íferos placentá rios usam a inativação
aleatória do X como mecanismo de compensação de
dosagem. No inicio do desenvolvimento gestacional
dos mam íferos, cerca de 2 semanas após a fertilização
nos seres humanos, quando o zigoto feminino con -
siste em algumas centenas de células, um dos dois cro-
mossomos X em cada célula somá tica de uma fé mea é
inativado aleatoriamente. Essa ideia foi proposta pela
primeira vez em 1962 por Mary Lyon, em sua hipó -
tese da inativação aleatória do X, també m conhecida
como hipó tese de Lyon. Em aproximadamente me-
o cromossomo X derivado da m ã e é inativado e, na
outra metade das células som á ticas, a inativaçã o silen -
cia o cromossomo X derivado do pai. Ao final desse
processo, cada célula som á tica de uma f ê mea possui
um cromossomo X ativo com probabilidade igual de
ser o X materno ou o X paterno.
A inativação aleatória do X ocorre em cada cé -
lula com dois ou mais cromossomos. A partir da í, o
cromossomo inativo pode ser visualizado como uma
- massa bem condensada aderindo à parede nuclear. O

Tabela 3.3 Mecanismos de compensaçã o de dosagem nos animais

Animal Cromossomos sexuais Mecanismo de compensação de dosagem

Machos Fêmeas

- -
Mosca da fruta XY XX A expressão dos genes ligados ao X é dobrada em
relação à expressão feminina do gene ligado ao X.
Nematóòeos XO XX * A expressão génica de cada cromossomo X no
hermafrodita ('fê mea') é reduzida para a metade da
expressã o génica do cromossomo X no macho.
Mam íferos marsupiais XY XX O cromossomo X de origem paterna é inativado em
.
todas as células somá ticas femininas
Mam íferos placent á rios XY XX Um cromossomo X é inativado aleatoriamente em
cada célula somática feminina.
*
Os nematodeos XX são hermafroditas.
 Cap í tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossòmka 97

cromossomo X inativo é conhecido como corpúsculo

de Barr, visualizado pela primeira vez por Murray
Barr em 1949.
Uma vez que ocorre em uma célula ancestral, a
inativação do X é permanente nos descendentes da
célula som á tica. Como consequ ência da inativa ção
aleató ria do X, a fémea normal de mamífero placen
tá rio é, em termos dos cromossomos X, um mosaico
-
de dois tipos de células. Um tipo de célula expressa
o cromossomo X derivado da mãe e o outro expressa o
cromossomo X derivado do pai (Figura 3.26). Cada cé-
lula individualmente expressa a informação alélica de
apenas um desses cromossomos. Entretanto, no orga
nismo como um todo, os alelos de ambos os cromos -
-
somos são expressos em concentrações aproximada
mente iguais.
-
Na maioria dos casos, o silenciamento de um cro -
mossomo X em cada célula de uma fê mea n ã o tem
efeito detectável no funcionamento de um tecido ou
no fen ótipo. Ocasionalmente, poré m, as fêmeas por
tadoras de traços recessivos ligados ao X exibem uma
-
manifesta ção fenot í pica do alelo recessivo. Os padrões
de pelagem malhada e casco de tartaruga em gatas são Figura 3.27 Pelo malhado, produzido pela inativação
produto do mosaicismo criado pela inativação alea - do X em gatas.
tó ria do X (Figura 3.27). Fêmeas com um alelo para o
pelo preto em um cromossomo X e pelo amarelo no
cromossomo X hom ólogo tê m manchas pretas e ama -
células em que cada cromossomo X estava original
mente inativado. O padrã o específico da inativação do
-
relas no pelo que correspondem às porções da pele X é exclusivo de cada embrião de gata e os padrões de
onde cada cromossomo X está ativo. Os tamanhos e migração celular també m sã o variáveis. Como resul -
a distribuição dos setores laranja e preto desses gatos tado, cada fémea adulta malhada ou casco de tartaruga
refletem as localizações dos descendentes clonais das tem um padrão exclusivo de setores pretos e laranja
marcando seu pelo.
A inativação aleatória do X requer um gene no

--
cromossomo X, chamado transcrito específico de ina
tivação do X ( XIST ), que codifica uma grande molé
cula de RNA. O XIST RNA se dispersa do gene, "mar -
cando" o cromossomo X à medida que se acumula. Os
cromossomos X marcados com o XIST RNA possuem
todos, ou quase todos, os seus genes silenciados. O
\ XIST RNA se acumula apenas no cromossomo que
p transcreve o gene e não se espalha para o cromossomo
c°dp X hom ólogo. Em outras palavras, o XIST age apenas
pd uk> ~ M

^
~
em cis ( no mesmo cromossomo ) , mas n ão em trans
/ ( no cromossomo hom ólogo ). O exame dos cromosso-
Cromossomo
Inativo
\VCromossomo
X ativo Xatrvo mos inativados no n úcleo detecta o XIST RNA reves -
tindo o corpúsculo de Barr em um n ú cleo.

Observa çã o gen é tica A compensaçã o das diferenças

na dosagem dos genes ligados ao X resultante das diferentes
constituições dos cromossomos masculinos e femininos é ro-
tineira em animais. Mecanismos de compensa çã o diferentes
são observados em diferentes espécies. Os seres humanos c
outros mam íferos placentá rios são submetidos à inativaçã o
aleatória do X, a qual silencia um cromossomo X aleatoria -
mente em cada célula feminina .

Figura 3.26 Inativação aleató ria do X nos mamíferos

placentários do sexo feminino.
98 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

ESTUDO DE CASO

Os olhos de John Dalton ajudam a solucionar o mistério do daltonismo Qgl

John Dalton (1766- 1844 ) foi um químico, mais conhe - (a ) Opsina Opsina
cido pelo seu desenvolvimento da teoria atómica da maté - verde vermelha
ria . Em reconhecimento às suas realiza ções embrionárias
na química , uma unidade dc medida de massa at ómica
recebeu o nome dalton em sua homenagem. John Dalton
Cromossomo X
do tipo selvagem
Cromossomo X
do Upo selvagem
__
7 j

uX
u
i
também cra daltónico 1 . Ele escreveu muito sobre sua falta Opsina Opsina
de percepçào completa da cor, mas nada sabia sobre here- verde vermelha
ditariedade ou sobre a base molecular de seu daltonismo. Cruzamento desigual
Dalton ficou t ão interessado em sua condição que deu ins - entre cromossomas X
truções para que, após sua morte, seus olhos fossem preser- homótogos
vados para que um dia pudessem ser úteis na investigação Opsina Opsina Opsina
do daltonismo. Cromossomo X verde verde vermelha
A forma de daltonismo de Dalton —
a mais comum,
que afeta a capacidade para perceber a cor na parte do es -
mutaòo
(duplicação) 1 U
pectro visível com comprimento dc onda medio — c uma Cromossomo X
condi ção recessiva ligada ao X. A foto de abertura do capí-
tulo é uma carteia dc cores do tipo utilizado para dctcctar
mutaòo
(deteção)
Opsina
n
esse tipo de daltonismo. Se você estiver entre os cerca de vermelha
8% da população que possui uma deficiê ncia de percepçào
das cores vermelha e verde, você não conseguirá ver o n ú - ( b) Tipo selvagem Oalton
mero 22. Gene da opsina: Verde Vermelha Verde Vermelha
Dois genes ligados ao X c intimamente relacionados que n n n
produ/cm proteínas íolossensí veis, chamadas opsinax, são
a fonte do daltonismo vermelho verde . Um gene produz a
prote ína opsina vermelha e o outro, a proteína opsina verde.
As opsinas estão incorporadas à membrana dos cones da re-
tina. onde sua sensibilidade à luz nas diferentes partes do es-
pectro visível é responsável por nossa capacidade dc enxer- Figura 3 28 Genética molecular do daltonismo de John
gar cor. A opsina verde é sensível à luz na parte do espectro Dalton , (a ) Os genes do tipo selvagem das opsinas verde
visível de comprimento de onda médio, e a opsina vermelha e vermelha rvo cromossomo X sofrem cruzamento desigual,
absorve a luz nos comprimentos de onda longos. A opsina produzindo cromossomos mutados com um gene da opsina
azul, codificada por um gene autossômico no cromossomo 7, verde duplicado ou sem o gene da opsina verde, ( b) A análise
é sensí vel à luz dc compnmcnto dc onda curto. As mutações do DNA isolado dos olhos preservados de Dalton revela a falta
desse gene são muito mais raras que as dos genes vermelho e do gene da opsina verde.
verde e produzem um tipo diferente de daltonismo.
Os genes das opsinas vermelha e verde est ã o situa -
dos perto um do outro no cromossomo X. Esses genes são verde. A transmissão do cromossomo sem um gene da op-
98% idênticos cm suas sequê ncias dc DNA c produzem sina verde pode produzir a forma dc daltonismo da qual
proteínas que diferem em apenas 15 dos 329 aminoácidos. Dalton sofria.
Mutações ocasionais dos genes das opsinas vermelha e O desejo de John Dalton de contribuir para a compre -
verde produzem prote ínas opsinas anormais que alteram ensão do daltonismo tomou -sc realidade cm 1995 — 150
a percepçà o da cor. Mas as mutações mais comuns que
provocam o daltonismo para as cores vermelha e verde
—
anos após sua morte por meio de um relatório de David
Hunt c colaboradores sobre sua análise do DNA extraído
devcm-sc a um dcsalinhamcnlo c a um cruzamento de- dc um dos olhos de Dalton , preservados havia muito tempo.
sigual dos genes das opsinas vermelha e verde durante a Hunt e colaboradores examinaram o DNA de Dalton
prófasc I da meiose feminina ( Figura 3.28a ). O desalinha quanto à presença dos genes das opsinas vermelha c verde.
mento resulta de um alto grau de similaridade na sequên- Eles demonstraram que Dalton possuía o gene da opsina
cia dc DNA entre os genes. Os resultados desses eventos vermelha, mas não o gene da opsina verde , confirmando o
dc cruzamento desigual são um cromossomo X materno, autodiagnóstico dc Dalton quanto a seu daltonismo IFigura
com material gené tico extra que porta um gene da opsina 3.28 b ). O cromossomo X de Dalton era capaz de usar o
vermelha e duas cópias do gene da opsina verde , e um cro - gene intacto da opsina vermelha para produzir a proteína
mossomo X que carece do material genético c tem um opsina vermelha, mas a falta do gene da opsina verde o dei-
gene da opsina vermelha , mas não um gene da opsina xou sem a prote ína opsina verde.

1 N.T.: em português, a deficiê ncia na percepçào de cores foi nomeada daltonismo, també m em homenagem a Dalton.
 Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômica 99

RESUMO

3.1 A mitose divide as células somá ticas
O ciclo celular consiste em duas fases principais: interfase,
.
cujos estágios sâoG., S e G,, e fase M durante a qual ocorre
a divisão celular.
Mitose é o processo de divisão das c élulas somáticas. A
mitose contém cinco subest ágios: prófase, prometáfase,
metáfase, anáfase e telófase.
1 A mitose contém uma única divisão celular e separa as
cromátides irmãs em células-filhas diploides geneticamente
idênticas entre si e à célula progenitora da qual derivaram.
O eido celular está sujeito a controle genético rigoroso.
Moléculas regulatórias controlam a transição de um
estágio do ciclo para o próximo, agindo como pontos de
checagem geneticamente controlados para monitorar as
transiçòes do ciclo celular.
A mutação dos genes de controle do ciclo celular está
associada ao desenvolvimento de câ ncer.
32 A meiose produz gametas para a reprodução
sexual
II A meiose contém duas divisões celulares, designadas
meiose I e meiose II .
Durante a meiose I (a 'divisão por redução"), cromossomos
homólogos são separados para produzir células -filhas
haploides portadoras de um cromossomo de cada par
homólogo de cromossomos.
A divisão meiótica II separa as cromátides irmãs e produz
quatro células-filhas haploídes geneticamente diferentes
que formam os gametas.
.
Durante a prófase I os cromossomos homólogos formam
sinapses com o auxílio do complexo sinaptonémico. Os
cromossomos homólogos podem cruzar e trocar material
genético durante esse subestágio .
I As lets da segregação e da segregação independente deMendel
encontram sua base mecânica nos padrões de separação dos
cromossomos e cromátides irmãs durante a meiose.
33 A teoria cromossô mica da hereditariedade
propõe que os genes são transportados nos
cromossomos
I A teoria cromossômica da hereditariedade propõe que os
genes são transportados nos cromossomos e fielmente
transmitidos através dos gametas para as gerações
sucessivas.
A identificação da transmissão ligada ao X da cor dos olhos
na Drosophila, realizada por Thomas Hunt Morgan, e a
análise dos fenótipos excepcionais produzidos pela não
disjunção do cromossomo X, realizada por Calvin Bridges,
demonstraram a validade da teoria cromossômica da
hereditariedade.
3.4 A determina ção do sexo é cromossômica e
genética
Os mecanismos da determinação do sexo assumem muitas
formas nos animais. O sexo da Drosophila é determinado
pela razão da expressão dos genes ligados ao X e os genes
autossòmicos, enquanto o sexo nos seres humanos é
determinado pela presença do SRY no cromossomo Y .
Os padróes do cromossomos sexuais são diversos entre
os organismos. Pá ssaros, peixes e alguns insetos possuem
cromossomos sexuais Z e W e os monotremados possuem
vários cromossomos sexuais.
3 J A transmissão humana ligada ao sexo segue
padrões distintos
I A herança dominante humana ligada ao X e a herança
recessiva humana ligada ao X são identificáveis,
respectivamente, pelo padrão de transmissão masculina e
pelo padrão de expressão masculina dos traços.
Os genes no cromossomo Y são transmitidos
exclusivamente de homem para homem.
3.6 A compensação da dosagem equaliza a do-
sagem dos genes ligados ao sexo
1 A compensação da dosagem equilibra o nível de
expressão dos genes ligados ao sexo e é fundamental para
.
o desenvolvimento animal normal Os mecanismos para a
obtenção da compensação da dosagem variam entre as
espécies.
I A inativaçâo aleatória de um cromossomo X em cada
célula das fémeas placentá r ías dos mamíferos é controlada
por um centro de inativaçâo do X no cromossomo X .

T E R M O S- C H A V E

Asco (esporos) (p. 81) Ciclo celular (pontos de checagem do .

Cromá tide não irmã (p 76)
Aster (p. 68 ) dck> celular ) (p. 64, 71) .
Cromossomo sexual (p 64)
Cariocinese (p. 65 ) Cinetócoro (p. 68 ) Croising over (permuta) (p.76 )
Cdks (dnases dependentes de ddína) Citocinese ( p. 65) .
Determinação do sexo (p 87)
-
(P 71 ) Coesão das cromátides irmãs (p. 68 ) .
Disjunção (p 70)
Célula somá tica (p. 64 ) Compensação da dosagem (p. 96) Dominante ligada ao X (p. 90)

. .
Célula- filha (p. 64 ) Complexo sinaptonémico (p. 76 ) Fase M (prófase prometáfase, metáfase,
Centrômero (p. 68 ) Corpúsculo de Barr (p. 97 ) anáfase telófase) (p. 64, 65 )
Centrossomo (p. 68) Cromá tide irmã (p. 68) Gameta (célula germinativa) (p. 64 )
100 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Gene supressor tumoral ( p. 72 ) Mitose (p. 64 ) Proto-oncogene (p. 72)

Hemlzlgoto (p. 85 ) .
Não disjunção ( p 86 ) Qulasma ( p. 77)
Herança ligada ao sexo (herança ligada ao Nódulo recombinante (p 76) . Razão X/autossomo (razão X/ A ) (p. 87)
.
Xr herança ligada ao Y) (p 84,85, 94) Número diploide de cromossomos (2n) Recessiva ligada ao X (p. 90)
Inativaçáo aleat ória do X (hipótese de fp. 64 ) Região pseudoautossômica (PAR) (p. 94 )
Lyon) (p. 96 ) Número haploide de cromossomos (n) Sinapse (p. 76 )
, .
Interfase (fase G , fase S, fase G2) (p 64 ) .
(p 64) Sistema Z/W (p. 89)
.
Meiose (meiose I, meiose II) ( p 64, 74 ) .
Oncogene (p 72) Teoria da hereditariedade cromossô
Microtúbulo da fibra do fuso (microtúbuk) Placa metafá sica (p 68) . mka (p. 64 )
de cinetócoro, polar e astral) (p.68) .
Proteína ciclina (p 71)

Rara obter as respostas dos problemas pares, ver o

PROBLEMAS Apêndice; Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Examine os seguintes diagramas das células de um or
ganismo com número diploide 2 n = 6 e identifique qual
estágio da fase M é representado.
(a)
A 5. O número diploide do animal hipotético Geneticus intro-
o cromossomos e a quantidade de DNA presente por cé-
O-
051 ^
2. Nosso parente primata mals próximo, o chimpanzé, pos-
suí um número diploide 2n = 48. Para cada um dos se-
guintes estágios da fase M, identifique o número de cro-
mossomos presentes em cada célula.
a. Fim da telófase mitótica.
b. Metáfase I meiótica .
c. Fim da anáfase meiótica II.
d. Início da prófase mitótica
e. Metáfase mitótica
f. Início da prófase I.
3. Em um teste de sua teoria cromossômka da hereditarie-
dade, Morgan cruzou uma fémea de DrosopbHa da F.,
portadora de olhos vermelhos, com um macho portador
de olhos brancos (ver Figura 3.17, cruzamento B) . Morgan
presumiu que a fêmea era heterozigota para o alelo reces-
sivo ligado ao X relativo aos olhos brancos e o macho era
bemizigoto para olhos brancos. Os resultados do cruza-
mento foram 129 fémeas e 132 machos de olhos verme-
lhos, 88 fémeas e 86 machos de olhos brancos.Teste esses
dados pela análise do qui-quadrado e determine se os re-
sultados são coerentes com a hipótese de Morgan de que
a cor dos olhos na Drosopbiki é um traço ligado ao X .
- 4. A tensão entre as cromátldes irmãs é essencial para garan -
tir sua separação eficiente na anáfase mitótica ou na aná-
fase II meiótica. Explique por que a coesão das cromátides
Irmãs é importante e discuta o papel da proteína coesina e
da proteína separase na separação das cromátides irmã s.
ductus é 2 n = 36. Cada núcleo diploide contém 3 ng de
DNA na G ,.
a. Qual é a quantidade de DNA contida em cada núcleo
no final da fase S?
b. Explique por que uma célula somática do Geneticus in-
troductus possui o mesmo número de cromossomos e
a mesma quantidade de DNA no Início da fase mitótica
que uma das células germinativas no inicio da prófase I
da meiose.
c Complete a tabela a seguir fornecendo o número de
lula ao final de cada estágio listado.
Fim do estágio Número de Quantidade de
do ddo celular cromossomos DNA
Telófase I
Anáfase mitótica
Telófase II
6. Um organismo tem alelos Rf e fi em um par de cromos-
somos homólogos e possui alelos ^ .
Tt e T } em outro par
Faça um diagrama desses pares de homólogos ao final da
met áfase I, no final da telófase I e no final da telófase II e
mostre como a meiose nesse organismo produz gametas
nas proporções mendelianas previstas. Suponha que não
haja cruzamento entre cromossomos homólogos.
7. Explique como o comportamento dos cromossomos ho-
mólogos na meiose se compara com a lei da segregação
de Mendel para os alelos autossômicos De d. Durante qual
estágio da fase M esses dois alelos segregam um do outro?
8. Suponha que o cruzamento ocorra entre os cromosso-
.
mos homólogos no problema anterior Em qual estágio
da fase M os alelos De d segregam ?
9. Os alelos Aea estão em um par de autossomos e os ale-
los B e b estão em um par de autossomos diferente. O
cruzamento entre um par de homólogos afeta as propor -
ções previstas para os genótipos dos gametas ? Explique.
O cruzamento entre os dois pares de cromossomos afeta
as proporções previstas para os gametas? Explique .
 Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômlca
10. Quantos corpúsculos de Barr são encontrados em um nú-
cleo feminino humano normal? E em um núcleo mascu-
lino normal?
.
11 Descreva o papel das seguintes estruturas ou proteínas
na divisão celular
Aplica ção e integração
12. O pai de uma mulher é portador de deficiência de orni-
tina transcarbamilase (OTD), um transtorno recessivo li
gado ao X que, se nào tratado adequadamente, produz
.
deterioração mental A mãe da mulher é homozigota
para o alelo do tipo selvagem.
a. Qual é o genótipo da mulher? (Use D para representar o
alelo dominante e d para representar o alelo recessivo )
b. Se a mulher tiver um filho com um homem normal
qual é a chance de o filho ter OTD?
c. Se a mulher tiver uma filha com um homem que não
tem OTD, qual é a chance de a filha ser portadora hete-
rozigota da OTD? Qual é a chance de a filha ter OTD?
d. Identifique um homem com o qual a mulher poderia
gerar uma filha com OTD.
e. Para o caso que vocè identificou na parte (d), qual pro-
porção de filhas geradas pela mulher e pelo homem
deve ter OTD? Qual proporção de filhos da mulher e do
homem deve ter OTD?
.
13 Nos seres humanos, a hemofilia (Omim 306700) é um trans-
torno recessivo ligado ao X que afeta o gene para a pro
teína do fator VIII, essencial para a coagulação sanguínea
Os alelos dominantes e recessivos para o gene do fator Vtll
são representados por H e h. O albinismo é uma condição
autossómica recessiva que resulta da mutação do gene que
produz a tiroslnase, uma enzima na via de síntese da mela-
.
nlna. A e a representam os alelos da tiroslnase Uma mulher
saudável chamada Clara (11-2), cujo pai (1-1) tem hemofilia e
cujo irmão (I11) tem albinismo é casada com um homem
saudável, chamado Charles (11-3), cujos pais são saudáveis O .
irmão de Charles (11-5) é hemofílico e sua irmã (11-4) é albina
A genealogia é exibida a seguir . filhas possuem esmalte descolorido, mas todos os meninos
WI Hemofilia
3 Albinismo
i
K 2
} )4
< dr óvú cr ts
J Todos os outros recém-nascidos do sexo masculino nào
Clara Charles
?
-
a. Quais são os genótipos dos quatro pais 0*1 a 1 4) nessa
genealogia?
b. Determine a probabilidade de o primeiro filho de Clara
e Charles ser
.
i um menino com hemofilia
ii. uma menina com albinismo
iii.uma menina saudável
.
iv um menino com albinismo e hemofilia
v. um menino com albinismo
vl.uma menina com hemofilia
101
a. microtúbulos;
.
b cí nases dependentes de cidlna;
c. cinetócoros;
d. complexo sinaptonêmko.
c Se o primeiro filho de Clara e Charles for albino, qual é
- a chance de o segundo filho ser albino ? Explique por
que essa probabilidade é mais alta do que a calculada
na parte (b).
.
14 Um macho do tipo selvagem e uma fêmea do tipo selva-
gem de Drosophila com olhos vermelhos e asas comple-
. .
tas são cruzados A progénie é exibida a seguir.
Machos Fémeas
| asas completas, olhos j asas completas, olhos
vermelhos vermelhos
| asas vestigiais, olhos
* vermelhos \ olhos roxos, asas com-
pletas
i
é
olhos roxos, asas com-
pletas
1 asas vestigiais, olhos
roxos
a. Usando símbolos aléllcos claramente definidos à sua
escolha, forneça o genótipo de cada progenitor.
- b. Qual é (ou quais são) o(s) genótipo(s) das fêmeas com
. olhos roxos? E dos machos com olhos roxos e asas ves-
tigiais ?
.
15 Uma mulher com descoloração grave do esmalte dentário
tem quatro filhos com um homem com esmalte dentá -
rio normal. Dois dos filhos, um menino (B) e uma menina
(G), têm esmalte descolorido. Cada um deles tem um par-
ceiro com esmalte dentário normal e gera vários filhos. G
tem seis filhos, quatro meninos e duas meninas. Dois dos
meninos e uma das meninas têm esmalte descolorido. B
. tem sete filhos, quatro meninas e três meninos. As quatro
têm esmalte normal. Explique a herança dessa condição.
16 . Em um grande hospital metropolitano, as células de
bebés recém-nascidos são coletadas e examinadas mi-
croscopicamente durante um período de 5 anos. Entre
aproximadamente 7.500 meninos recém -nascidos, um
corpo de Barr é observado nos núcleos de seis bebés.
possuem corpúsculos de Barr. Entre os 7.500 bebés do
sexo feminino, quatro possuem corpúsculos de Barr em
cada núcleo, dois não possuem corpúsculos de Barr e o
.
restante possui um Qual é a causa do número incomum
de corpúsculos de Barr em um pequeno número de
bebés dos sexos masculino e feminino?
.
17 Nos gatos, o pelo da cor do casco de tartaruga (Calico)
surge nas fêmeas. Um pelo cor de casco de tartaruga pos-
sui manchas de pelo marrom escuro e manchas de peio
laranja, com cada uma das coces cobrindo uma metade
do corpo, mas que possuem um padr ão exclusivo em cada
fémea. Os machos podem ter peí agem marrom-escura ou
laranja, mas um gato com pelo cor òe casco de tartaruga
102 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

raramente é gerado. Dois cruzamentos de amostra entre b. Determine que outro(s) padr âo(òes) de transmissão
machos e fémeas de linhagem pura produziram as fémeas é/ são possíveis. Para cada modo de transmissão pos-
com pelo cor de casco de tartaruga exibidas a seguir. sível, especifique os genótipos necessários para que a
transmissão ocorra.
Cruzamento I P: macho marrom-escuro x fémea laranja
c. Identifique qual(is) padr ào( ões) de transmissã o é/
F,:machos laranja e fémeas casco de tartaruga
são possíveis. Especifique por que a transmissão é
Cruzamento II P: macho laranja x fêmea marrom-escura impossí vel.
F,: machos marrom-escuros e fémeas casco Genealogia A
de tartaruga OTQ
.
a Explique a herança dos pelos marrom-escuro, laranja e r<5 OrS Dró ÒrO
casco de tartaruga nos gatos.
.
b Por que os gatos casco de tartaruga são fémeas? òò óàóòÉóòó
c. O serviço de genética de um grande hospital veteriná- Genealogia B
rio recebe encaminhamento de três ou quatro gatos Ori
. ò OTÉ Dy DTO
ó o*t ó o ó
com pelo tipo casco de tartaruga a cada ano Esses l
gatos são invariavelmente estéreis e possuem testí -
.
culos subdesenvolvidos Como sào produzidos esses oò 6
gatos com pelo tipo casco de tartaruga? Por que você Genealogia C
acha que eles são estéreis? OTO
18. O gene causador da sindrome de Coffin-lowry (Omim DrÔ OTD Dró OTO
303600) foi identificado recentemente e mapeado no
.
cromossomo X humano A sindrome de Coffin-Lowry é
ó à ò ò è ò é ò à oi
Genealogia D
um transtorno raro que afeta a morfologia e o desenvol-
TO
vimento do cérebro. A sindrome também produz ano
malias esqueléticas e de crescimento, bem como anoma-
lias de controle motor. A sindrome de Coffin-Lowry afeta
TO OTO D " 1
homens que herdam uma mutação do gene ligado ao
.
X A maioria das portadoras não exibe sintomas da do-
.
21 Use as genealogias a seguir para retratar a transmissão
ença, mas algumas portadoras exibem. Essas portadoras
de (a) um traço recessivo ligado ao X e (b) um traço do-
sempre são menos gravemente afetadas que os homens . minante ligado ao X. Forneça os fenótipos para cada
Ofereça uma explicação para essa constatação.
.
pessoa em cada genealogia Projete cuidadosamente
19. Quatro mutados da cor do olho na Drosophita — da- cada padrão de transmissão para que a genealogia (a)
masco, marrom, cor de marrom avermelhado e roxo não possa ser confundida com transmissão autossómica
—são herdados como traços recessivos. O vermelho é
a cor do tipo selvagem dominante dos olhos da mosca-
recessiva e a genealogia (b) não possa ser confundida
com transmissão autossómica dominante. Identifique os
- -
da fruta. Oito cruzamentos (A a H) são feitos entre eventos de transmissão que eliminam a possibilidade de
progenitores de linhagem pura. transmissão autossómica em cada genealogia.

Cruza- DTO
Progenitores Progénie F,
mento
Fêmeas Machos Fêmeas Machos UTO CI Ò Ó DTO
A Damasco Vermelho Vermelho Da masco ÒÚ Ó Ó6Ó
B Marrom Vermelho Vermelho Vermelho
C Vermelho Roxo Vermelho Vermelho DTO
D Vermelho Damasco Vermelho Vermelho
c Marrom
Vermelho Vermelho
Marrom DTO ’ Ú Ò Ò DrO
avermelhado avermelhado
F Roxo Vermelho Vermelho Vermelho
ÒÒ Ó ÓÚ
G Vermelho Marrom Vermelho Vermelho 22. Em uma raça de gado doméstico, podem aparecer chi -
Marrom
H Vermelho
avermelhado
Vermelho Vermelho fres em machos e fémeas. Os machos e fémeas também
podem não ter chifres. Os seguintes cruzamentos são re-
a. Quais desses mutados da cor do olho são recessivos
ligados ao X e quais são autossômicos recessivos? Ex - alizados com progenitores de linhagens puras.
plique como você distingue a hereditariedade ligada Cruzamento I Cruzamento II
ao X da hereditariedade autossómica.
Progenitores : macho com Progenitores: macho sem
b. Preveja as razões fenotípkas da F} resultante dos cru- chifre * fémea sem chifre chifre x fémea com chifre
zamentos A, B, D e G.
,
F : machos com chifre, F,: machos com chifre,
20. Para cada genealogia a seguir, fémeas sem chifre fêmeas sem chifre
.
a Identifique qual padrão simples de transmissão heredi- F,:Idos machos com chifre, F,: l dos machos com chifre,
tária (autossômico dominante, autossômico recessivo,
dominante ligado ao X ou recessivo ligado ao X) tem
\ dos machos sem chifre \ dos machos sem chifre
mais probabilidade de ter ocorrido. Forneça os genóti- \ das fêmeas com chifre,| \ das fêmeas com chifre, \
pos dos indivíduos envolvidos na transmissão do traço. das fêmeas sem chifre das fêmeas sem chifre
 Capí tulo 3 Divisão celular e hereditariedade cromossômlca
Explique a herança desse fenótipo no gado e atribua
genótipos a todo o gado no cruzamento L
23. Nas galinhas domésticas, o sexo é determinado pelo sis
tema ZW. Um gene ligado ao Z que determina a forma-
ção de penas possui dois alelos: F produz penas de cres-
cimento rápido e f produz penas de crescimento lento.
Forneça os genótipos dos machos parentais e da progé-
nie de galos e galinhas nos seguintes cruzamentos:
a. Progenitores:galo com penas de crescimento rápido x
galinha com penas de crescimento lento.
Progénie: V> dos galos e galinhas com penas de cres-
cimento rápido, Vs dos galos e galinhas com penas de
crescimento lento.
b. Progenitores: galo com penas de crescimento lento x
galinha com penas de crescimento rápido.
Progénie: todos os galos com penas de crescimento rá-
pido; todas as galinhas com penas de crescimento lento.
24. Em uma espécie de peixe, uma mancha preta na nada-
deira dorsal é observada em machos e fémeas. Um cria-
dor realiza um par de cruzamentos recíprocos e observa
os seguintes resultados.
macho com mancha preta
Cruzamento I Progenitores:
x fêmea sem mancha
22 machos com mancha
Progénie:
preta
24 fémeas com mancha
preta
25 machos sem mancha
21 fémeas sem mancha
macho sem mancha x
Cruzamento II Progenitores:
fêmea com mancha preta
Progénie: 45 machos com mancha
53 fémeas sem mancha
a. Por que essa evidência sustenta a hipótese de que
uma mancha preta está ligada ao sexo?
b. Identifique qual sexo é homogamétko e qual é hetero-
gamético. Forneça os genótipos dos progenitores e ex
plique as proporções da progénie em cada cruzamento.
25. A sindrome de Lesch-Nyhan (Omim 300322) é um raro
transtorno recessivo ligado ao X que produz retardamento
mental grave, paralisia cerebral espá stica e automutilaçáo.
a. Qual é a probabilidade de que o primeiro filho de uma
mulher cujo irmão tem a sindrome de Lesch -Nyhan
venha a ser afetado?
.
b Se o primeiro filho da mulher descrita em (a) for afetado,
qual é a probabilidade de o segundo filho ser afetado?
c. Qual é a probabilidade de o primeiro filho de um homem
cujo irmão tem a sindrome de Lesch-Nyhan ser afetado?
26. Nos seres humanos, o SRY está situado perto da região
pseudoautossômica (PAR ) do cromossomo Y, uma re
gião de homologla entre os cromossomos X e Y, que
lhes permite formar sinapse durante a meiose nos ho-
mens, e de cruzamento entre os cromossomos O dia- .
grama a seguir mostra o SRY em relação á região pseu
doautossômka . genética, que a pelagem cor de casco de tartaruga é
103
-
Aproximadamente 1 em cada 25 mil recém-nascidos
nasce com inversão sexual; o bebé aparenta ser um me-
nino, mas possui dois cromossomos X, ou aparenta ser
uma menina, mas com um cromossomo X e um cromos-
.
somo Y Explique a origem da inversão sexual em ho-
.
mens e mulheres envolvendo o gene SRY ( Dica: Ver Ob-
servação Experimental 3.1 para obter uma pista sobre o
mecanismo de mutação ) .
27. Em um livro de 1889,Intitulado Natural Inherltance (Mac -
.
millan Nova York), Francis Galton, que investigou a he-
rança dos traços mensuráveis (quantitativos), formulou
uma lei de "herança ancestral*. A lei afirmava que cada
pessoa herda aproximadamente a metade dos seus tra -
ços genéticos de cada progenitor, cerca de um quarto
dos traços de cada avô, um oitavo de cada bisavô etc
 luz da teoria cromossômica da hereditariedade, argu -
mente em favor da lei de Galton ou contra essa lei.
28. Na Drosophila, o fenótipo do olho de ouriço ligado ao X
perturba a formação das facetas e é recessivo em relação
ao olho do tipo selvagem. Os traços autossòmicos reces-
sivos da asa vestigial e do corpo negro segregam inde-
.
pendentemente um do outro Examine a progénie dos
trê s cruzamentos exibidos na página seguinte e identifi-
que o genótipo dos pais em cada cruzamento.
.
29 Um macho de Drosophila e uma fémea com genótipo do
tipo selvagem são cruzados, produzindo uma progénie
com 324 fêmeas e 161 machos. Toda a progénie é do tipo
selvagem.
a. Proponha uma hipótese genética para explicar esses
dados.
b. Projete um experimento que teste sua hipótese
usando a progénie do tipo selvagem identificada an -
terí ormente. Descreva os resultados previstos se sua
hipótese for verdadeira.
30. O daltonismo para as cores verde e vermelha nos seres hu-
manos é herdado como uma condição recessiva ligada ao
.
X Considere os cruzamentos recíprocos entre um proge-
nitor daltónico e uma progenitora com visão normal em
que o alelo dominante é identificado como Ceo alelo re-
.
cessivo, como c O cruzamento I é Cc x cY e o cruzamento
.
II é cc x CY Determine os fenótipos e suas proporções na
.
progénie produzida em cada cruzamento Explique por
que os resultados do cruzamento recíproco sào coeren-
.
tes com uma herança recessiva ligada ao X mas não com
uma herança autossòmica recessiva de daltonismo .
-
.
31 Durante o exame de uma gatinha com pelo cor de casco
de tartaruga, você e o veterinário que está sob a sua
orientação têm uma surpresa —
o gato é macho e não
fêmea! Vocè se recorda, de seu curso de graduação em
104 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Fenótlpoparental Fenó tipo da progénie Proporçáo

Fémea Macho Fémea Macho

a. Tipo selvagem Ouriço Tipo selvagem I i
I
Ouriço
Vestigial
Ouriço, vestigial
!i i
b. Tipo selvagem Tipo selvagem Vestigial, preto è à
Vestigial h S
Preto £ £
8
Tipo selvagem
Ouriço, vestigial, preto 0 ^
3
i

Ouriço, vestigial 0 £
Ouriço, preto 0 £
Ouriço 0 £

Fenótipo parental Fenótipo da progénie Propor çáo

Fémea Macho Fémea Macho

.
c Preto Ouriço Ouriço, vestigial, preto £
Ouriço, vestigial £ £
Ouriço, preto è £
Ouriço £ £
Vestigial, preto £ 15
Vestigial £ £
Preto £ £
Tipo selvagem n

produzida pela inativação aleatória do X que ocorre nas
fémeas de mamíferos. O veterinário solicita uma análise
cromossòmica do gato e descobre que ele é XXY: possui
dois cromossomos X e um cromossomo Y. Ajude o vete-
rinário a descobrir como um gato com pelo cor de casco
de tartaruga pode ser macho. (D/ca:pense na inativaçáo
do X em mamíferos com dois cromossomos X.)
.
32 A Drosophila tem um número de cromossomo diploide
.
2n = 8 que inclui um par de cromossomos sexuais (XX
nas fémeas e XY nos machos) e trés pares de autosso-
mos. Considere um macho de Drosophita que possua
uma cópia do alelo A , em seu cromossomo X (o cromos-
somo Y é o homólogo) e que seja heterozlgoto para os
aleios 8, e 8 C, e C; e O, e D , de genes situados em um
^ diferente cada um. Nos diagramas so-
par autossômico
licitados a seguir, Indique os aleios portados em cada
cromossomo e cromátide irmà. Suponha que não ocorra
cruzamento entre cromossomos homólogos.
a. Qual é o genótipo das células produzidas pela divisão
mitótica nesse macho ?
b. Diagrame qualquer alinhamento correto de cromosso -
mos na metá fase mitótica.
c Diagrame qualquer alinhamento correto de cromosso
mos na metá fase I da meiose.
d. Para o alinhamento da metáfase I exibido em (c), quais
genótipos de gameta são produzidos ao fim da meiose ?
e. Quantos alinhamentos diferentes de cromossomos
são possíveis na metá fase I nesse macho ? Quantos
gametas geneticamente diferentes esse macho pode
produzir ? Explique seu raciocínio piara cada resposta.
Intera çã o gênica Capítulo

APRESENTAÇÃO
4
4.1 As Interações entre alelos produzem relações de
dominância
4.2 Alguns genes produzem fenótipos variáveis
4.3 A interação gênica modifica as razões mende-
lianas
4.4 A análise de complementaçáo distingue as
mutações no mesmo gene das mutações em
genes diferentes

Vários genes interagem para produzir traços facilmente observáveis

em tomates, como a cor, o tamanho e a forma. Vários genes e fatores
ambientais contribuem para caracteristicas como o sabor do tomate.

PONTOS ESSENCIAIS

A s leis da segregação e da segregação independente de Men-

del sintetizam as regras básicas da transmissão genética em
organismos diploides. Observamos os resultados dessas regras
por meio da análise das proporções relativas da progénie com
diferentes fenótipos decorrentes de cruzamentos.Também pode-
mos perceber a transmissão hereditária do DNA, RNA e a variação
proteica por meio das aná lises de Southern, Northern e Western
blots. Em um nível mecâ nico, retratamos a base física dessas regras
por meio de movimento e segregação dos cromossomos homólo-
gos e das cromátides irmãs durante a meiose.
O sucesso de Mendel na identificação e descrição dessas duas
leis hereditárias deveu-se parcialmente a seu uso de traços cujas ca-
racterísticas fenotípicas são determinadas exclusivamente pela he-
rança de alelos para genes únicos. Interpretando a herança desses
traços, ele não teve de lidar com a variação fenotípica introduzida
por outros genes ou por fatores ambientais (não genéticos). Nos
experimentos de Mendel, cada traço foi decidido por um único par
de alelos, um totalmente dominante e um totalmente recessivo, em
cada um de sete genes. No entanto, o caso simples em que apenas
I As relações de dominância entre os alelos
têm uma base molecular. 0 efeito biológico
dos produtos gènkos determina o tipo de
dominância observado.
I A expressão gênica pode ser afetada por fa-
tores não genéticos (ambientais) e também
como uma consequência de fatores relacio-
nados ao sexo.
I A expressão gênica pode ser afetada por
interações com outros genes, provocando
mudanças caracteristicas em razões mende-
lianas.
I A muta ção de diferentes genes pode produ-
zir o mesmo efeito no fenótipo. O número
de genes que provocam a mutação de um
fenótipo é descoberto pela análise de com-
plementaçáo genética.
106 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
dois alelos influenciam um traço é bastante raro na natu-
reza. Embora um organismo diploide possa ter não mals
que dois alelos em um lócus ( já que esses indivíduos têm
apenas duas cópias de cada cromossomo), pode haver
muitos alelos para um ú nico l ócus dentro de uma popu-
laçã o. Raramente os geneticistas observam apenas dois
alelos segregando em um lócus, com um alelo comple
tamente dominante em relaçã o ao outro, com apenas os
alelos em um ú nico lócus controlando o fenótipo e com
os fatores ambientais desempenhando um papel mínimo
na determina ção das caracter ísticas fenot í picas. Na maio-
,
ria dos casos a determina o do fen ótipo é mais com
çã
plicada porque uma ou mais circunstâ ncias adicionais
afetam o resultado. Coletiva mente, essas circunstâ ncias
são identificadas como interações genicas; esse termo se
refere a qualquer uma das vá rias maneiras em que os di-
ferentes genes podem colaborar ou interagir entre si ou
com fatores não genéticos (ambientais) para influenciar a
expressão de uma caracter ística fenot í pica . Entre as mais
importantes dessas intera ções, temos o seguinte:
I pode haver mais de dois alelos para um determina-
do lócus dentro da popula ção;
I a dominâ ncia de um alelo em rela çã o a outro pode
não ser completa;
I dois ou mais genes podem afetar um ú nico tra ço;
I a expressã o de um traço pode depender da intera-
ção de dois ou mais genes, da intera çã o de genes
com fatores n ã o genéticos ou de ambos.
Neste capítulo, examinamos padrões da variação
fenot í pica que resultam da ocorrência de cada uma des-
sas circunstâ ncias. Nossas discussões demonstram que,
embora os tra ços que surjam através das interações gê-
nicas nem sempre exibam as razões mendellanas clá ssi
cas ( descritas no Capítulo 2), as razões observadas po-
dem ser explicadas pelos princí pios mendelianos.
4.1 As interações entre alelos
produzem rela ções de
dominância
Mendel sabiamente optou por examinar os traços
que se apresentam em uma de duas formas alternativas.
Uma forma de cada traço que ele estudou exibe domi -
n ância completa sobre a outra forma. A domin â ncia
completa toma o fen ótipo de um organismo heterozigoto
indistinguível do fenótipo de um organismo homozigoto
para o alelo dominante; assim, apenas os organismos
homozigotos para o alelo recessivo exibem o fenótipo
recessivo. A dominância completa de um alelo també m
resulta na expressão exclusiva do fenótipo dominante
entre a progénie Fl heterozigota de um cruzamento entre
progenitores homozigotos de linhagem pura, enquanto a
progé nie F, exibe uma razão 3:1 entre os fenótipos do -
minante e recessivo. Sabemos agora que os fenótipos dos
sete traços que Mendel estudou são controlados por dois
alelos alternativos em sete genes diferentes. Nos casos
examinados no nível molecular, os alelos dominantes re-
fletem a função do tipo selvagem do gene, enquanto os
alelos recessivos codificam produtos gènicos com ativi-
dade reduzida ou ausência de atividade.
As questões pertinentes à base molecular dos alelos
dominantes e recessivos impulsionaram a pesquisa ge-
n ética no início e em meados do século XX, incluindo
- questões de como a domin â ncia de um alelo pode ser
verificada , por que certas muta ções sào recessivas en -
quanto outras sã o dominantes e se as mutações sempre
fazem que os genes percam função ou se podem trans-
mitir novas funções aos alelos.
Base molecular da dominância
Uma característica é dita dominante se for obser -
vada nos genótipos homozigotos e heterozigotos e se
chama recessiva se for observada apenas em um genó-
tipo homozigoto. Nesse sentido, a domin â ncia e a reces-
sividade tê m uma base fenotípica. No entanto, os fenó-
tipos sâo uma consequência das atividades das proteínas
produzidas pelos alelos de um gene. Nesse sentido, a
dominâ ncia e a recessividade têm uma base molecular.
A dominâ ncia de um alelo em relação a outro é deter-
minada pela atividade dos produtos proteicos do alelo —
pela maneira como os produtos proteicos dos alelos fun -
cionam para produzir o fen ótipo.
Comparemos dois exemplos para ilustrar a base mo-
lecular da dominâ ncia e da recessividade. Em ambos os
exemplos, um alelo do tipo selvagem produz uma enzima
ativa e um alelo mutado produz muito poucas enzimas
ou nenhuma- No primeiro exemplo, o alelo mutado é
recessivo, mas no segundo, o alelo é dominante. No pri -
- meiro exemplo, o gene R tem um alelo R~ dominante do
tipo selvagem e um alelo r recessivo mutado. O gene R
produz uma enzima que precisa gerar 40 ou mais uni -
dades de atividade catalítica para acionar uma etapa de
reação cr ítica. A execução bem - sucedida dessa etapa
produz o fenótipo do tipo selvagem, enquanto a nào exe -
cução da etapa gera um fenótipo mutado. Cada cópia do
alelo /? * produz 50 unidades de atividade enzimática. C )
alelo mutado r nào produz enzimas funcionais e tem 0
unidades de atividade. Os organismos homozigotos /?* /? *
produzem 100 unidades de atividade enzimática (50 uni -
dades a partir de cada cópia de /?* ), ultrapassando muito
o minimo necessário para obter o fenótipo do tipo sel -
vagem. Os organismos heterozigotos (/?* r) produzem
um total de 50 unidades de atividade enzim ática, o que é
suficiente para produzir o fenótipo do tipo selvagem. No
entanto, os organismos homozigotos rr não produzem
ação enzimática e exibem o fenótipo mutado. Com base

em sua capacidade de catalisar a etapa de reação crítica
e produzir o fenótipo do tipo selvagem tanto em um ge -
nótipo homozigoto ( /?* /? * ) como em um genótipo hete
rozigoto ( R~r ), R* é dominante em relação a r. Os alelos
dominantes do tipo selvagem dessa natureza são identifi
cados como haplossuficientes, já que uma cópia ( haplo)
é suficiente para produzir o fenótipo do tipo selvagem.
O segundo exemplo envolve o gene T, para o qual o
alelo do tipo selvagem é recessivo em relação a um alelo
mutado. O gene T produz uma enzima necessária para
catalisar uma etapa de reação crítica que produz um fe-
nótipo do tipo selvagem se estiver incompleta. A inca
pacidade para executar a etapa da reação resulta em um
fenótipo mutado. Na etapa de reação em questão, são
necessá rias 18 unidades de uma atividade enzimática. O
r
alelo , do tipo selvagem produz 10 unidades de ativi
dade. Um alelo mutado, T2 gera 5 unidades de atividade
$
enzimá tica. Os organismos homozigotos 7*, T , geram 20
unidades de atividade enzimá tica catalítica, o suficiente
para catalisar a etapa de reação cr ítica e produzir o fenó-
tipo do tipo selvagem. Por outro lado, organismos hete-
rozigotos produzem apenas 15 unidades de atividade en
zimá tica e tém o fenótipo mutado porque ficam aquém
das 18 unidades necessárias para catalisar a etapa de rea -
ção. De modo similar, os organismos homozigotos TfT
que produzem 10 unidades de atividade enzimá tica, tam^-
bém tém um fenótipo mutado. Nesse caso, o alelo mu -
tado T } é dominante em relação ao alelo do tipo selvagem
Tx , já que os organismos heterozigotos ( TtT2 ) e homozi
gotos ( TJ 2 ) tém um fenótipo mutado. Em casos como
esse, o alelo do tipo selvagem é identificado como ha
ploinsufíciente, pois uma única cópia não é o bastante
para produzir o fenótipo do tipo selvagem.
Efeitos da mutação
A análise genética se concentra nas mutações raras
e em outros fenó menos pouco frequentes. Em muitos
casos, o estudo desses eventos raros produz pistas para
as causas subjacentes de eventos que ocorrem com fre
quência e que não ainda não foram compreendidos. No
caso de qualquer mutação genética, uma questão cen
tral diz respeito ao mecanismo preciso por meio do qual
a mutação perturba a função gênica normal.
A partir de uma perspectiva funcional , o fenótipo
do tipo selvagem é produzido em organismos com duas
.
cópias do alelo do tipo selvagem ( Figura 4.1 a ) Em com
paração com o nível de atividade dos produtos protei
cos do alelo do tipo selvagem, os alelos mutados muitas
vezes podem ser colocados em uma categoria de perda
.
de função ou de ganho de funçã o Uma mutação de
perda de fun çã o resulta em uma diminuição significa
tiva ou na perda completa da atividade funcional de um
produto génico. Essa categoria de mutaçã o comum con -
tém mutações como as descritas no exemplo do gene
R anteriormente citado. Os alelos mutados de perda de
função geralmente são recessivos, mas, sob certas cir
cunstâ ncias, podem ser dominantes.
Capí tulo 4 Interação gênica 107
As mutações de ganho de função identificam os
alelos que adquiriram uma nova função ou que foram
- alterados para expressar substancialmente mais ativi -
dade do que o alelo do tipo selvagem. Essas mutações
- quase sempre são dominantes e em geral produzem fe-
nótipos mutados dominantes em organismos heterozí -
gotos. Como uma consequência de suas funções recém-
-adquiridas, certas muta ções de ganho de fun ção são
letais em um estado homozigoto.
Muta ções de perda de função Como a discussão anterior
sugere, as mutações que resultam em uma perda de fun -
- ção variam quanto ao grau da perda de atividade normal
do produto génico. Uma mutação de perda de função
que resulta em uma perda completa da função gênica em
comparação com o produto génico do tipo selvagem é
- identificada como uma mutação nula , também conhe-
cida como mutação am ó rfica ( Figura 4.1 b ). A palavra
nula significa “zero" ou “ nada" e a palavra amórfica sig-
nifica "sem forma". Esses alelos mutados não produzem
nenhum produto génico funcional e costumam ser letais
em um genótipo homozigoto. A eliminação de produtos
- -
gé nicos funcionais pode resultar de vários tipos de even
tos mutacionais, incluindo os que bloqueiam a transcri
ção, produzem um produto génico sem atividade ou re-
-
sultam na deleção de todo ou parte de um gene.
De modo alternativo, uma mutação resultante na
perda parcial de função gênica pode ser identificada
como uma mutação leaky , também conhecida como
- mutação hipomó rfica ( Figura 4.1c ). Hipomórfica sig-
nifica "forma reduzida "; assim como o termo leaky,
- implica que uma pequena porcentagem da capacidade
funcional normal é retida pelo alelo mutado, mas em
um nível inferior ao encontrado no alelo do tipo selva -
gem . A gravidade da anormalidade fenotí pica depende
do nível de atividade residual do alelo mutado hipo-
mó rfico. Uma porcentagem maior de atividade de um
alelo hipomórfico resulta em um fenótipo afetado com
menos gravidade do que quando a mutação incorre em
- uma perda de função mais substancial. As mutações de
perda de função nulas e hipom órficas costumam ser re-
- cessivas e letais nos homozigotos. É sabido que também
ocorrem mutações de perda de fun ção dominantes.
Certas mutações de perda de fun ção produzem fe-
nótipos mutados dominantes por meio de alterações na
fun çã o de uma proteína multim érica da qual o polipep-
- tídeo mutado forma uma parte ( Figura 4.1d ). As proteí-
- nas multiméricas, compostas de dois ou mais polipept í -
deos que se unem para formar uma proteína funcional,
estão particularmente sujeitas às mutações negativas
dominantes em consequência de alguma mudança que
- impeça os polipeptideos de interagirem normalmente
para produzir uma proteí na funcional. Uma proteína
multimérica que contenha um polipeptídeo anormal
pode sofrer uma redução ou perda total da capacidade
funcional. Mutações desse tipo são dominantes em vir -
- tude da perda substancial de função da proteína mul
timé rica. Essas muta ções são caracterizadas como “ ne-
-
108 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

(a ) Tipo selvagem
Homozigoto

Alelos
A expressão dos produtos dos alelos do tipo
selvagem produz fpnótipo do tipo seVagem
Produtos

(b) Perda de funçào: mutação nula/amórfica AJelos nulos não geram produtos funcionais.
Orgarismos nulos homazigotas têm ferótipo

—
Homozigoto Heterozigoto mutado (amòrfico) em razão da ausércia do
Alelos X
*
—
> produto gèníco. Oganismos hereragotos
produzem menos produtos génicos funcionais do
j que organismos homozkjotos do tipo selvagem e
Produtos Nenhum podem ter um fenótipo rr orado. Ver no texto
uma discussão sobre mutações dominantes
(c ) Perda de função: mutaçã o feoJry/hipomórfica .
VCV3U5 recessivas

Homozigoto

—
Heterozigoto
Alelos
• ( X CEE AJelos mutados hipomórficos produzem uma
x
pequena quartídade de orodutos génicos do
tipo selvagem. Oganismos homozlgotos tém um
Produtos .
fenótipo mutaao hlpomórfvco) Organismos
heterozigoíos também podem ser mutados .
(d) Perda de função: mutação negativa dominante

Alelos — Homozigoto
—x—
Heterozigoto

A formação das proteínas muitiméricas é

alterada pelos mutados rvegatrvos dominantes
cujo produtos interagem arormalmente com
Produtos *
os produtos proteicos de outros genes,
gerando proteínas multiméricas malfòrmadas.
Produto gênico
do segundo gene
Interação Interação
anormal normal
Produtos multimérlcos
anormais HB a» _ Produtos muitimérícos
normais

(e) Ganho de funçã o: mutação hipermórfica

Homozigoto Heterozigoto
X X
Alelos A expressão excessiva do produto gémeo leva à
XT
ação génlca excessiva O fenótipo mutado pode
ser mais grave ou letal no genótpo homozigoto
Produtos co que no hetetotfgoto

(f ) Ganho de função: mutaçã o neomórfka

——
Homozigoto Heterozigoto

Alelos X ~
X
0 aleto mutado tem uma função nova que
C JL
produz um fer ótipo mutado nos organisnnos
homozlgotos e he.*erozigotos e que pode ser
Produtos mais grave em organismos homozigoTos

Figura 4.1 Consequências funcionais da mutação, (a ) Tipo selvagem, ( b ), (c) e (d ) Mutações de perda de função, (e) e (f )
Mutações de ganho de função.

gativas” em razão do efeito destruidor do polipept ídeo
anormal na proteína multimérica.
Um exemplo de mutação negativa dominante
é observado no transtorno humano hereditá rio da
osteogéncsc imperfeita (Omim 116200, 116210 c
116220), causada por defeitos na proteí na óssea colágeno
e que tem muitas formas de gravidade diferentes. A
entrelaçadas
—
proteína colágeno é composta de três fitas polipeptidicas
dois polipeptídeos do gene COL1A1 e
um polipeptídeo do gene COL1A2. A proteína trimé rica
do colágeno está sujeita a uma mutação negativa domi -
nante como consequência das mutações do COL1A 1
que produzem um polipept ídeo defeituoso. A estrutura
trimérica do colágeno e a razão 2:1 da incorporação
do polipeptídeo COL1A1 em relação ao polipeptídeo
COL1A2 significa que, nos indivíduos que são homozi
gotos do tipo selvagem para o COL1A2 e heterozigotos
para a mutação do COL1 A /, a maioria da proteína cola -
genosa contém uma ou duas proteínas COL1 A1 muta -
das. Em consequ ência, a maioria da proteí na colagenosa
é defeituosa e a osteogênese imperfeita se desenvolve.
Mutações de ganho de função Mutações que resultam
em um ganho de função caem em duas categorias que
dependem do comportamento funcional da nova muta
ção. As mutações hiperm ó rfleas (“maiores que a forma
do tipo selvagem”) produzem mais atividade genica por
•
alelo que o tipo selvagem ( Figura 4.1 ) e normalmente
são dominantes. O produto génico de um alelo hiper-
mórfico é indistinguível do produto génico de um alelo
do tipo selvagem, mas está presente em uma quantidade
maior e, portanto, induz um nível maior de atividade.
A concentração excessiva é o equivalente funcional da
superexcitação, impulsionando os processos com mais
rapidez, no momento e/ou no lugar errado ou por um
tempo maior que o normal. Os mutados hipermó rficos
frequentemente resultam de mutações regulatórias que
aumentam a transcrição génica , bloqueiam a resposta
normal aos sinais regulatórios que silenciam a transcri -
ção ou aumentam o n ú mero de có pias de genes pela du
plicação génica. A gravidade do efeito fenot í pico pode
coincidir com o genótipo, de modo que os homozigotos
da muta ção exibam um fenótipo mais gravemente afe-
tado do que o observado nos heterozigotos.
As mutações de ganho de função resultantes de mu -
tações ncomórficas (“ nova forma*) adquirem atividades
gé nicas inéditas no tipo selvagem Figura 4.1f ] e normal
mente são dominantes. Os produtos génicos de mutados
neomórficos são funcionais, mas tém estruturas que di
ferem do produto génico do tipo selvagem. As estruturas
alteradas levam a proteína mutada a funcionar de modo
diferente da proteína do tipo selvagem. Homozigotos
para um alelo neomórfico podem exibir um fenótipo
mais gravemente afetado que os heterozigotos.
Nossa descrição da base molecular da dominância e
das mutações de ganho e perda de fun ção fornece uma
base conceituai para compreender como os diferentes
padrões de relações de dominâ ncia podem se desenvol-
ver entre os alelos de um gene. Esses conceitos se apli-
Cap í tulo 4 Interação génica 109
cam a todos os organismos diploides, mas os sistemas
notacionais que identificam genes e alelos variam entre
as espécies. Esses diferentes sistemas notacionais foram
desenvolvidos nos primeiros anos da pesquisa genética,
quando os experimentos eram realizados em grupos
taxonómicos distintos. Os geneticistas que estudam as
moscas-da - fruta desenvolveram um sistema de notação
para identificar alelos do tipo selvagem e mutados, os ge-
neticistas que estudam a levedura desenvolveram outro
e os geneticistas que estudam plantas desenvolveram
outro. Como ilustra a tabela na parte final do livro, cada
organismo- modelo tem seu estilo ú nico de descrição e
nomenclatura genica. Os diferentes sistemas de notação
causam confusão em alunos de genética porque seguem
regras diferentes para denominar e identificar genes e
- alelos. A tabela na parte final do livro contém o sistema
de regras que seguimos em todo este livro.
Observa çã o gen é tica As relações de dominâ ncia entre
os alelos são determinadas pelas ações ou pela eficácia dos
produtos génicos na produção dos íenótipos. Os n íveis de
atividade das mutações de perda e de ganho de função sá o
determinados por comparações com o nível de atividade dos
produtos do alelo do tipo selvagem correspondente.
-
Dominância incompleta
A descrição de Mendel da herança de traços con-
trolada por um alelo dominante e um recessivo de genes
individuais é um processo hereditário simples e relativa
mente raro na natureza. No entanto, frequentemente a
-
dominâ ncia de um alelo sobre outro não é completa. A
dominância incompleta, também conhecida como do-
minância parcial, identifica essas circunstancias. Quando
existe dominância incompleta entre alelos, o fenótipo do
organismo heterozigoto é característico; ele se enquadra
entre os íenótipos dos homozigotos em um continuum
de algum tipo e normalmente é mais parecido com um
- fenótipo homozigoto que com o outro. Quando os traços
exibem dominância incompleta, dois progenitores de li-
nhagem pura com íenótipos diferentes produzem hete-
rozigotos F , com um fenótipo diferente do encontrado
nos progenitores. O fenótipo da F, é intermediário entre
as formas parentais, embora possa ser mais parecido com
um fen ótipo parental que com o outro.
-
Nas discussões anteriores, usamos um sistema de
- letra A
—— —
notação no qual a letra maiuscula
—por exemplo, a
indica um alelo dominante e a mesma letra
min ú scula a designa um alelo recessivo. Nos sis -
temas de dominância incompleta , a rela ção entre os
alelos é diferente, de modo que um sistema notacional
—
diferente um que evite a indicação de dominâ ncia ou
—
recessividadc é utilizado. No sistema de nomencla-
tura de dominâ ncia incompleta , os alelos são simboliza
dos por letras maiusculas ou min úsculas mais um sufixo
-
que pode ser um n ú mero ou uma letra. Por exemplo,
pares de alelos com dominâ ncia incompleta podem ser
designados Ale A2, íf l e BJ , d e d7 e e »v\
110 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
0,0 1 JQ 2,0 3JD
Dias da primeira floração
Fig ura 4.2 Dominâ ncia incompleta no tempo de floração das plantas de ervilha, (a ) O alelo T é incompletamente
dominante sobre o alelo 7, , conforme Indicado pelo tempo de floração tardio das plantas 7 (b ) Segregaçã o dos alelos 7, e
A pesquisa genética identificou incontáveis exem -
plos de dominância incompleta em animais e plantas; um
exemplo é o traço descrito como tempo de floração nas
.
plantas de ervilha de Mendel ( Pisum sativum ) Nas ervi-
lhas, o primeiro surgimento das flores ocorre sob o con -
trole genético de um l ócus que chamaremos T. A cepa
de floração mais precoce das plantas de ervilha tem o ge
-
nótipo homozigoto T Ty , o tempo de floração dessa cepa
é descrito como dia 0,0. A cepa de floração mais tardia
tem genótipo homozigoto TJT1 e floresce 5,2 dias mais
tarde, em média, do que as plantas TXT.. Um cruzamento
entre cepas de linhagem pura de floração precoce e de
floração tardia gera progénie heterozigota T , Tf que, em
média , começa a florescer 3,7 dias mais tarde que a cepa
de floração mais precoce (Figura 4.2a).
Genetidstas podem dizer que, nesse caso, o tempo
de floração é controlado por um único lócus, porque a
autofertilização das plantas TlTz produz a raz ão 1:2:1
entre as plantas de floração precoce, intermediá ria e
tardia da progénie (Figura 4.2b). Dizemos que o alelo T2
é parcíalmente dominante em rela ção a Tx porque o fe-
nótipo heterozigoto é diferente de ambos os íenótipos
homozigotos, porém é mais parecido com o fenótipo da
cepa de floração tardia.
Observa çã o gen é tica A dominâ ncia incompleta entre
alelos produz um fenótipo h íbrido na F, que é intermediá rio
entre os fenótipos parentais, mas normalmente é mais pare-
cido com um dos pais.
Codominâ ncia
A codomin â ncia, assim como a dominâ ncia in -
completa, leva a um fen ótipo heterozigoto diferente
do fenótipo de ambos os pais. Entretanto, diferente da
dominância incompleta, a codominância é caracteri
zada pela expressão detectável de ambos os alelos nos
heterozigotos. A codominância é identificada com mais
clareza quando os produtos proteicos de ambos os ale-
los são detectá veis em organismos heterozigotos, nor-
malmente por meio de algum tipo de análise molecular,
como eletroforese em gel ou ensaio bioqu ímico, que
conseguem distinguir entre proteí nas diferentes. Explo-
ramos os detalhes desses tipos de análise molecular em
uma discussão posterior ( ver Capítulo 10).
( b) T J t X T J,
Tt 7,
r, 7,7,
Ti 7,7, ,,
77
4,0 5,0 6,0 Í 7,7, Horaçâo precoce (Dia 0.0)
,
j T T2 Floração intermediá ria (Dia 3,7)
* ,,
7 7 Fkxaçào tardia ( Dia 52)
Jr Jr
Sob certas circunstâncias, pode ocorrer mais de um
padrão de dominâ ncia entre os alelos de um gene. Na
seção a seguir, examinamos a codominâ ncia de dois ale -
los e a recess í vidade de um terceiro alelo do gene que
determina o tipo sanguíneo humano.
Relações de dominância dos alelos ABO Um atributo fi -
-
siológico que muitos conhecemos a respeito de nós mes
mos é o nosso tipo sanguíneo, que é tipo A, tipo B, tipo
AB ou tipo O. Todos nós temos um desses quatro tipos
sanguíneos comuns, que resultam de alelos no gene do
grupo sangu íneo ABO situado no cromossomo 9 (Omim
110300). Existem três alelos em todas as populações hu -
manas e podem ocorrer combinações desses alelos. A
maioria das combinações de diferentes alelos do gene
ABO resulta na dominância incompleta de um alelo, mas
uma combinação resulta em codominância.
Os trés alelos do gene ABO são identificados como F ,
F ei, e os quatro grupos sanguíneos são fenótí pos produ -
zidos por diferentes combinações desses alelos. Com base
na correlação genótipo- fenótipo (isto é, tipo sanguíneo),
os genetidstas conclu íram que F e F têm dominâ ncia
completa sobre i e que F e F são codominantes um em
relação ao outro. A dominância completa de F e F em re-
lação a i é indicada pela identificação do tipo sanguíneo
A nos indivíduos cujo genótipo é FF ou Fi e do tipo san -
guíneo B nos indivíduos cujo genótipo é FF ou Fi A na . -
tureza completamente recessiva do alelo i é confirmada
pela observação de que apenas os homozigotos ii tèm tipo
sanguíneo O. Por fim, a codominância de F e F um em
relação ao outro é confirmada pela observação de que o
tipo sanguíneo AB ocorre apenas em indivíduos que têm
genótipo heterozigoto FF .
— —
O tipo sanguíneo ABO é identificado por uma re-
ação entre um antígeno ABO uma porção de açúcar
- corpo
—
incorporada à superfície dos eritrócitos e um anti
uma molécula produzida pelo sistema imune
que se liga a uma proteí na antigé n íca específica. A ti
pificação do sangue usa uma reação antígeno- anticorpo
-
-
para determinar se um antígeno específico está presente
nos eritrócitos. Uma reação positiva ocorre quando
o anticorpo detecta seu antígeno- alvo. O anticorpo se
liga ao antígeno e também a outros anticorpos de li -
gação ao ant ígeno, fazendo que os eritrócitos formem
aglomerados visíveis. A aglomeração indica que o an -
ticorpo detectou seu antígeno- alvo, enquanto uma au -

sé ncia de aglomeração indica que o sangue não contém
o antígeno -alvo do anticorpo.
Para testar o tipo sangu íneo ABO, dois antisso
ros — -
um chamado "antissoro anti A*, contendo an
ticorpo anti - A purificado, c outro chamado "antissoro
-
anti- B", contendo anticorpo anti B purificado
colocados em depressões diferentes em unta lâ mina
são
de microscópio e uma gota do sangue a ser tipificado
é adicionada a cada depressão. Uma pessoa com tipo
sanguíneo A exibe aglomeração com o antissoro anti A,
mas n âo com o antissoro anti-B (Figura 4.3), Por outro
lado, o tipo sanguíneo B é identificado quando a aglo
-
meração ocorre com o anti B, mas n ão com o ant í A Se
ocorre aglomeração com os dois antissoros, o tipo san
guí neo é AB. A não aglomeração com ambos os antisso
ros identifica o tipo sanguíneo O . atividade de uma enzima produzida pelo gene H (Figura
A compatibilidade adequada do tipo sanguí neo
é essencial para a transfusã o segura . Na realidade, vá
rios ant ígenos produzidos por diferentes genes deter
minam a adequabilidade entre o sangue do doador e
o do receptor para transfusão, e os hospitais e clínicas
precisam comparar atentamente o sangue do doador e
do receptor para identificar a possibilidade de reações
adversas antes de a transfusão ser feita. A regra para a
transfusão sanguínea segura é que o sangue do recep -
tor n ão deve conter um anticorpo que reaja com um
ant ígeno no sangue doado. Quando tal rea ção ocorre,
pode haver hem ólise e formam -se coágulos sanguíneos
produzidos pela aglomeração de células sanguí neas no
sítio da transfusão. Essas reações adversas têm potencial
para provocar complicações fatais.
Os anticorpos anti -A e anti-B se desenvolvem nos
seres humanos desde o nascimento, mas as pessoas n ão
carregam um anticorpo se també m carregarem o antí
geno correspondente. Assim, pessoas com tipo sangu í
neo A, que possuem o ant ígeno A, também carregam
-
o anticorpo anti B. As pessoas com tipo sanguíneo B
-
tê m o antígeno B e o anticorpo anti A. Aquelas com o
Tipo sangu íneo Aglomera ção com Poss íveis genótlpos
Anti-A Anti- B
fVou IAi
ff
AB
O h
.
Figura 4.3 Tipo sangu í neo ABO O tipo sangu í neo é
determinado pela mistura de uma gota de sangue com uma
gota de antissoro anti-A ou antl- B.
Cap í tulo 4 Interação gènlca 111
tipo sanguí neo AB tém ambos os antígenos e nenhum
-
dos anticorpos anti A ou anti- B. Finalmente, as pessoas
- com tipo sanguíneo O n ão possuem ant ígeno A ou B e
- possuem os dois anticorpos, anti- A e anti- B.
— Base molecular da dominâ ncia e codomin â ncia dos alelos
ABO Os dois antígenos do grupo sanguíneo ABO nas
superf ícies dos eritrócitos possuem estruturas molecu -
lares ligeiramente diferentes. Os antígenos são glicoli -
- pideos que contêm um componente lipidico e um com
ponente oligossacarídeo. A porção lipídica do antígeno
-
está presa na membrana do eritródto e o segmento que
- se projeta para fora da célula conté m o oligossacarídeo.
- . Inicialmente, o oligossacarídeo é composto de cinco mo-
- léculas de açúcar e se chama antígeno H. Ele resulta da
-
4.4 ). O ant ígeno H está presente nas superf ícies de todos
- os eritrócitos e pode ser mais modificado, de duas ma
neiras alternativas, pela adição de um sexto açúcar, ou
-
-
pode continuar inalterado. A modificação final do antí -
geno H depende da atividade enzim á tica do produto pro-
teico do lócus do grupo sanguíneo ABO.
Dois açúcares alternativos podem ser adiciona -
dos ao ant ígeno H pelos produtos gênicos dos alelos P
e P , respectivamente. Se o alelo P estiver presente no
-
genótipo, ele produz o produto génico a-3 N-acetil-D -
-galactosaminiltransferase, ou simplesmente “ A-trans-
. -
ferase" A A transferase catalisa a adição do açúcar
N acetilgalactosamina ao antígeno H, produzindo
um oligossacarídeo de seis açúcares conhecido como
antígeno A. O alelo /®, por outro lado, produz a -3-
- D-galactosiltransferase, chamada frequentemente
“ B- lransferase", que catalisa a adição de um açúcar di-
- ferente, a galactose, e produz um oligossacar ídeo de seis
açúcares conhecido como antígeno B. A base molecular
-
das diferenças entre os alelos A e B são várias diferenças
de nucleotídeos que mudam quatro aminoácidos das en -
zimas transferase resultantes e alteram a atividade enzi
má tica. Por outro lado, o alelo i se dev e a uma única dele
-
-
çào de par de bases e é um alelo nulo que não produz um
produto génico funcional capaz de adicionar um sexto
açúcar ao antígeno H.
No n ível celular, o anticorpo anti- A reconhece a
adição da N-acctilgalactosamina mediada por IA e o an-
ticorpo anti - B identifica a adição de galactose produzida
.
pela ação de P Nenhum desses anticorpos tem qualquer
reatividade com o antígeno H não modificado; então o
ou i*i antígeno H não modificado, presente nos indivíduos com
tipo sanguíneo O, não é reconhecido por nenhum anti
corpo. Uma ou duas cópias do alelo P ou P em um ge-
-
Iaf nótipo são suficientes para produzir um ant ígeno ABO
detectá vd pelos anticorpos anti- A e anti-B. Ambos os
alelos P e P são dominantes em relação a /, já que P e P
produzem enzimas que modificam o antígeno H, mas i
não produz essas enzimas. Por outro lado, o genótipo PP
leva à produção de A - transferase e B- transferase, resul -
-
tando na adição da N acetilgalactosamina a alguns ant
genos H e na adição de galactose a outros ant
í
ígenos H.
-
112 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Prod Jtos enzí mãttcos
do gene ABO podem
moJftcar o antígeno H
ooooo
/ N
A-transforase
codificada por t\
/ Nenhuma
Ant
ígeno H
transíerase
funcional
codificada por /
Lipídeo
B-transferase
codificada por f
0 antfgeno H é produzido peia açâo do gene H
Figura 4.4 Produ ção de ant ígenos do grupo sangu í neo ABO.
No genótipo lAPt todos os eritrócitos carregam ambos os
tipos de modificações do antígeno H; aproximadamente
a metade dos antígenos de superfície dos eritrócitos são
antígenos A e o restante sâo antígenos B. No genótipo
heterozigoto IAIA, portanto, a a çâo dos dois alelos é detec-
tada no fenótipo, levando à conclusão de que IA e F são
codominantes um em relação ao outro.
Muitos primatas não humanos têm um sistema
de grupo sanguíneo essencialmente idêntico ao sistema de
grupo sanguíneo ABO humano. Os grupos sanguíneos
ABO foram identificados nos grandes primatas (chim-
panzé, gorila e orangotango), bem como em muitas espé-
cies de antropoides do Mundo Antigo, incluindo macacos
(gênero Macaca ) e babuínos (gênero Papio ). Duas obser-
vações evolutivas importantes derivam dessa descoberta.
Primeiro, o grupo sanguíneo ABO é uma característica
antiga da genética do sistema imune nos primatas e foi
preservada durante dezenas de milhões de anos enquanto
os primatas se diversificaram. Segundo, a preservação do
sistema de grupo sanguíneo ABO nos primatas demonstra
a importâ ncia dessa resposta do sistema imune na prote
ção dos primatas contra infecções e antígenos estranhos.
- lise genética da pelagem nos mamíferos revela que muitos
A seleção natural desempenhou um papel de destaque na
manutenção desse sistema. Os genes do grupo sanguíneo
ABO são um exemplo da história evolutiva compartilhada
que pode ser identificada pelo exame da distribuição ta -
xonò mica dos genes em linhagens. A Analise Genética 4.1
examina a herança dos fenótipos do grupo sangu í neo, em
que os alelos têm uma série de relações de dominância.
Observa çã o gené tica A codominància entre os alefos
ocorre quando a expressão de ambos os alelos é detectada
nos organismos hetero2>gotos que possuem um fenótipo dis-
tinguível do encontrado nos homozlgotos.
Antfgeno A
/ A ttansferase do t acrescenta
lipí deo
// N-acelilgal «Klosamira ao ar tigeno
.
H convertendo-o cm antígeno A
Ant
ígeno H
O O o, o.
Lipídeo
0,
Antigeno H não foi moc ficada
Antfgeno B
O. o. o. o, o.
Lipí deo
O. A transferase do t acrescenta galaaose ao
antigeno H, convertendo-o em antfgeno &
Sé ries al élicas
Os genomas diploides contêm pares de cromosso-
mos homólogos: desse modo, cada organismo possui
no má ximo dois alelos em um lócus. No entanto, em
populações o numero de alelos é teoricamente ilimi
tado e alguns genes têm dezenas de alelos. No n ível da
-
população, considera -se que um lócus que possui três
ou mais alelos tem m últiplos alelos. O lócus do grupo
sanguíneo ABO, com seus três alelos, é um exemplo de
alelos m últiplos. Assim como o gene ABO, outros lócus
dc m ú ltiplos alelos exibem uma série de relações de do-
min â ncia entre eles. Frequentemente, surge uma ordem
de domin ância entre os alelos, baseada na atividade de
cada produto proteico, formando uma sé rie sequencial
conhecida como série alélica . Os alelos em uma sé rie
alélica podem ser completamente dominantes, comple-
tamente recessivos ou podem exibir várias formas de
dominâ ncia incompleta ou codomin à ncia.
Sistema do gene C para a pelagem dos mamíferos A an á -
genes são necessários para produzir e distribuir o pig -
mento para os foliculos pilosos ou células epiteliais, onde
sâo exibidos como cor da pelagem ou cor da pele. Embora
vá rias interações entre esses genes possam modificar a
-
expressão da cor, concentramo nos aqui em apenas um
gene, o gene C (cor), responsável pela pelagem nos mamí -
feros como gatos, coelhos e camundongos. Esse gene tem
dezenas de alelos que foram modificados em mais de 80
anos de análise genética, mas limitamos nossa discussão
a apenas quatro alelos que formam uma série alélica. O
gene C produz a enzima tirosinase, que é ativa nas duas
primeiras etapas de uma via bioquímica de várias etapas,
que transmite a cor da pelagem nos animais com pelos e a
cor da pele nos seres humanos. Nas etapas iniciais da ria
da mclanina, a tirosinase é responsá vel pela decomposi-
ção (catabolismo) do aminoácido tirosina.
 Capí tulo 4 Interação gênlca 113

AN Á LISE GEN ÉTICA

O grupo sanguíneo MN nos seres humanos é um sistema autossômico codominante com dois ale-
.
los, Me N Seus tr és fenótipos do grupo sanguíneo, M, MN e N, correspondem aos genótipos MM,
MN e NN. O grupo sanguíneo ABO segrega de maneira independente do grupo sanguíneo MN .
Um homem com tipo sanguíneo O e tipo sanguíneo MN tem uma parceira com tipo sanguíneo AB
.
e tipo sanguíneo N Identifique os tipos sanguíneos que poderiam ser encontrados nos filhos e as
proporções de cada tipo.

Estrat é gias de solu çã o Etapas da solu çã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado
por esse problema e explique a
natureza da resposta solicitada
.
1 Este problema diz respeito à herança de dois tipos sanguíneos. 0 gene que determina
o tipo sanguíneo ABO possui três dlelos: A* e I* sâo codominantes entre si e dominan-
. .
tes em relação a / O gene grupo sanguíneo MN possui dois dlelos codominantes. A res-
posta exige a descoberta dos possíveis tipos sanguíneos» e suas proporções previstas,
dos filhos de pais cujos tipos sanguíneos são fornecidos.

2. Identifique as informações cr
íti- .
2 Os tipos sanguíneos dos pais são fornecidos,
cas fornecidas no problema.
Deduzir
.
3 Deduza os genótipos do grupo .
3 O pai tem tipos sanguíneos O e MN. 0 tipo O resulta da homozigosidade para o alelo
sanguíneo do pai. recessivo i, enquanto o MN é produzido nos heterozigotos que possuem ambos os
alelos. O genótlpo do pai é li MN.

4. Deduza os genótipos do tipo .

4 A màe tem os grupos sanguíneos AB e N. O tipo sanguíneo AB é encontrado nos he-
sanguíneo da mãe. .
terozigotos e o tipo sanguíneo N nos homozigotos. O genótipo do grupo sanguíneo
da mãe é A4 /* NN.
Solucionar
.
5 Identifique os genótipos dos ga- .
5 A segregação independente prevê dois genótipos de gameta para o pai: todos os
metas e suas frequências no pal. gametas contêm I, a metade tem Me a outra metade tem N.

.
6 Identifique os genótipos dos ga- .
6 A segregação independente prevê dois genótipos de gameta para a mãe: todos os
metas e suas frequências na mãe. gametas cont êm N , a metade contém A* e a outra metade contém /*.

.
7 Faça uma previsão dos genóti- 7. ç
Ml Ni
pos e fenótipos da progénie. MNI Âi NNfl
NI* Tipos sanguíneos : Tipos sanguí neos:
Dica: Use um qujeouto de Pun MN e A Ne A
-
letl pjr 4 jvjliar esse auzame ita
•
MNI*1 NNfi
Nf Tipos sanguí neos : Tipos sanguí neos:
MN e B NeB

Para praticar mais, ver Problemas 6, 9 e 21 .

Os alelos do gene C forniam uma série alélica deter
minada pelos fenótipos da prole de vários acasalamentos.
O alelo C é dominante em relação a todos os outros ale
los do gene, e qualquer genótipo com pelo menos uma
cópia de C produz a cor da pelagem do tipo selvagem.
Esses genótipos sào escritos como C- para indicar que,
independentemente do segundo alelo no genótipo, o fe-
nótipo é dominante. Trés outros alelos que produzem
enzimas tirosinase com pouca ou nenhuma atividade de
tirosinase formam uma série alélica com C (Figura 4.5 ).
O alelo c* produz um fenótipo chamado chinchila, uma
pelagem de cor diluída. O alelo c* produz o fenótipo hi -
- malaio, caracterizado pelas extremidades ( patas, cauda,
focinho e orelhas) totalmente pigmentadas, mas pigmen
tação praticamente ausente em outras partes do corpo. O
-
fenótipo himalaio é o padrã o de pelagem “siamês”, visto
frequentemente em gatos, coelhos e camundongos. Fi-
nalmcntc, o alelo c produz um produto proteico sem ati-
vidade enzimá tica. Esse alelo é nulo e totalmente reces-
sivo e sua homozigosidade produz um fenótipo albino.
Os cruzamentos entre animais com genótipos dife -
rentes no gene C revelam as relações de dominância dos
alelos. Por exemplo, nos cruzamentos A, B e C na Figura
4.6, a dominância completa de C em relação aos outros
114 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Figura 4.5 Série alélica
para determinaçã o da cor da
pelagem em mam í feros.
Totalmente colorido
cç c-
alelos na série é demonstrada pela constatação de que
toda a progénie de um animal com genótipo CC tem a
pelagem totalmente colorida, independentemente do ge - têm o fenótipo himalaio. O alelo final na série, c, é um alelo
n ótipo do parceiro. A ordem de domin â ncia dos alelos na
série é revelada pelo padrão de razòes 3:1, obtido a partir
dos cruzamentos de vá rios genótipos heterozigotos exi-
bidos na Figura 4.6. No cruzamento D, o padrão chin - condição conhecida como albinismo.
chila é parcialmente dominante em relação ao himalaio.
A maior parte da pelagem desses animais tem cor di
luída (chinchila ) e o padrão himalaio apresenta cor mais
- Observa çã o gen é tica Os fenótipos produzidos pelas
escura nas patas, face e cauda. O cruzamento E mostTa
que o padrão chinchila é completamente dominante em
rela ção ao albino. O padrã o himalaio é completamente
dominante em relação ao albino (cruzamento F). As re-
lações de dominâ ncia dentro desse lócus da série alélica
podem ser expressas como C > d* > d > c .
Base molecular da série alélica do gene C As enzimas ti -
rosinase produzidas por diferentes alelos do gene C tém
níveis característicos de atividade catabólica, que são a
base das relações de dominância entre os alelos. O alelo
C é dominante do tipo selvagem, produzindo tirosinase
plena mente ativa , definida com 100% de atividade. A
porcentagem da atividade de tirosinase do tipo selvagem
produzida por cada alelo explica a ordem observada na
série alélica. O exame bioquí mico revela que a enzima
produzida pelo alelo hipomórfico (d tem menos de 20%
da atividade da enzima do tipo selvagem. No genótipo
homozigoto c*V* ou nos genótipos heteroz ígotos d* d ou
c^c, apenas uma pequena quantidade de melanina é sin-
tetizada. Isso leva a uma menor quantidade de pigmento
e tem como efeito o silenciamento da cor da pelagem.
A enzima tirosinase produzida pelo alelo hipomórfico
d ( padrão himalaio) é instável e inativada a uma tempera -
tura próxima da temperatura corporal normal da maioria
dos mam íferos. Esse tipo de produto gênico é um exemplo
de alelo termossensível. Os gatos com o padrão de pe-
lagem siamês sâo exemplos familiares da açào desse alelo
termossensível. As partes dos gatos mais distantes do cen-
tro do corpo ( patas, orelhas, cauda e ponta do focinho),
na maioria das vezes, tendem a ser ligeiramente mais frias
que o tronco. Nessas extremidades mais frias, a tirosinase
termossensível produzida pelo alelo d permanece ativa,
produzindo pigmento nos pelos ali existentes. No entanto,
na porçã o central mais quente do corpo, a temperatura lí-
geiramente mais elevada é suficiente para fazer que a ti-
rosinase produzida pelo alelo d desnature ou se desfaça.
Chinchila Hlmalaio Albino
c*c*,c*c dd, dc cc
Isso inativa a enzima e leva a uma ausência de pigmento
na porção central do corpo. Os animais que sâo dd ou dc
nulo, que não produz tirosinase funcional. Os homozigo -
tos para esse alelo são incapazes de iniciar o catabolismo
da tirosinase. Isso leva à ausência de melanina e produz a
interações de m ú ltiplos alelos em uma série alélka revelam
relações hierá rquicas que dependem da ação biológica dos
produtos al élicos. A dominância est á associada ao alelo que
produz o produto génico mais ativo e a colocaçã o dos outros
alelos na série depende da ativ »dade relativa de seus produtos
gênlcos respectlvos.
Mutações letais
Certas mutações de um único gene sâo tâo prejudi-
ciais que provocam a morte precoce ou interrompem o
desenvolvimento gestacionaL Essas mutações são catego
rizadas como letais, provocadas por uma mutação letal.
Os alelos letais frequentemente são herdados como muta -
dos recessivos, alelos letais recessivos que matam apenas
homozigotos. Em geral , os alelos letais recessivos tém fre-
quências variá veis nas populações c podem persistir em
algumas delas ao longo de um vasto per íodo. A seleção
natural pode eliminar cópias do alelo quando ocorrerem
nos genótipos homozigotos; no entanto, os alelos letais re
cessivos são "escondidos" pelos alelos dominantes do tipo
-
selvagem nos genótipos heterozigotos, escapando, assim,
da seleçã o natural. Sob determinadas circunstâ ncias, os
portadores heterozígotos de um alelo letal recessivo têm
uma vantagem na seleção natural (ver Capítulo 10).
Os alelos letais costumam ser detectados como
distorções nas razões de segregação, em que uma ou
mais classes da progé nie prevista estão ausentes. Por
exemplo, nos cruzamentos de plantas e animais entre
dois organismos heterozigotos para um alelo letal re-
cessivo, o fen ótipo da progénie é 3:1 ( viá vel : morto ) A .
progénie morta é homozigota para uma mutação letal
recessiva. Essa progénie pode não chegar a ser vista , em
razão da letalidade embrionária, pode ser natimorta ou
pode morrer muito cedo. Entre a progénie viá vel, dois
terços devem ser heterozigotos para o alelo letal e um
 Capí tulo 4 Interação gènlca 115

( a ) Cruzamento A ( b ) Cruzamento B (c) Cruzamento C

\4

Colando Himalaio Colorido

Cc*
Colorido Colorido Colorido Colorido Colorido Colorido

f ( 1
F, C C * F, C *
c* Fj C c

- C cc Cc*
Colorido Colorido
- C CC Cc*
Colorido Colorido - c CC a
Colorido Colorido

ê
t
C* * Cc* c* c* Cc* c Cc cc
Colorido Chinchila Colorido Himalaio Colorido Albino

( d ) Cruzamento D
•
( ) Cruzamento E (f ) Cruzamento F

\é \é
P x P x P X
/
c«c* cV c*c* cc cV cc
Chinchila Himalaio Chinchila Albino Himalaio Albino \4
\
x
a
\
F,
'
/
x r
\
F,
•/
Fi X
FF c^c* c*c c*c cV cc ”
Chinchila Chinchila Chinchila Chinchila Himalaio Himalaio
i
f f I f 1
Fj c* c* F , c* c Fj c* c

- c* FF
i
Fà
Chinchila Chinchila
*
ir
- c* FF
Chinchila Chinchila
r
Fc c*
\4

cV
*
Himalaio Himalaio
é

^ c*
*-
c *V
4
*

cV
Chinchila Himalaio
\i

c c^c
Chinchila
cc
Albino
c
\i

cV
Himalaio
cc
Albino
Figura 4.6 Genética da dominância do gene C. (a ) a (f ) Os cruzamentos A a F ilustram a dominância completa do C e a
recessividade completa do c e estabelecem as séries alélicas como C > F > c* > c

terço deve ser homozigoto para o alelo dominante do dade embrionária na Arabidopsis thaliana e em outras
tipo selvagem (Figura 4.7) . espécies de planta. Em um cruzamento RPNla/ rpnla
Em plantas com flores, os efeitos dos alelos letais X RPNla/ rpttla, a razão de 3:1 na segregação entre as
podem ser observados diretamente. Por exemplo, a mu- sementes vivas ( RPNla ) c as mortas (rpnla/ rpnla) pode
tação do gene RPNla que codifica uma subunidade do ser observada na fruta. Quando as sementes vivas são
proteossomo 26S, um complexo multiproteico envolvido plantadas, aproximadamente dois ter ços são heterozigo -
na degradação das proteínas, é um exemplo de mutação tas para o alelo letal ( RPNla/ rpnla ) e um terço é homo -
nula de perda de função ( rpnla) que resulta em letali - zigota para o alelo do tipo selvagem (JRPNLA/RPNla) .
116 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Letal Idade embrionária
( RPN 1 a/ rpn 1 a x Letalidade gametofitica
Tipo selvagem RPNIa /rpnla ) 3:1 [ FER/ fer x macho) 1:1
Figura 4.7 Evidência de mutações letais am plantas. A
letalidade gametofitica é detectada pela observação da
razáo 1 :1 entre as sementes vivas e mortas. As setas indicam
sementes não desenvolvidas .
As mutações letais que resultam na letalidade ga -
metofítica feminina també m são detectáveis em plantas
com flores. Considere uma planta heterozigota para um
alelo gametofltico feminino, FER/ fer, na qual o alelo FER
do tipo selvagem derivou de sua progenitora e o alelo fer
mutado veio de seu progenitor. Durante a megasporogé
nese, a metade dos megásporos vai herdar o alelo FER e
a outra metade, o alelo fer. Os sacos embrioná rios deri-
vados dos megásporos que herdam o alelo fer vào mor-
rer, de modo que apenas a metade de todos os óvulos se
desenvolve em sementes. Os alelos segregam na razão
1:1, observada entre as sementes que se desenvolvem
cm uma fruta. Repare que a razão 1:1 é uma observação
direta das razões mendelianas nos gametas de um orga -
nismo heterozigoto. Assim, a razão 1:1 distingue a leta
lidade gametofitica feminina da letalidade embrionária,
que resulta na razão 3:1 entre as sementes. Normalmente
as plantas produzem uma quantidade excessiva de pólen,
similar à produção excessiva de espermatozóides em re-
lação à produção de ovos nos animais; assim, a letalidade
gametofitica masculina não é observá vel examinando as
sementes em desenvolvimento na fruta. No entanto, ela
pode ser detectada examinando as plantas em que a me
tade de todos os grãos de pólen está morta.
Por outro lado, os alelos letais em animais geralmente
são detectados por uma distorção nas razões dc segre-
gação. O primeiro caso de um alelo letal foi identificado
em 1905 por Lucien Cuenot, que estudou uma mutação
letal nos camundongos portadores de mutação domi -
nante para a cor amarela da pelagem. Nos camundongos,
a cor da pelagem do tipo selvagem é marrom, chamada
agouti , produzida pela presença de pigmentos amarelo e
.
preto em cada haste pilosa (Figura 4.8a ) Os pelos agouti
sào pretos na base e na ponta, com pigmento amarelo na
parte central da haste. A cor amarela da pelagem é vista
quando o pigmento amarelo é depositado ao longo de
todo o comprimento da haste pilosa, nào apenas na parte
média, como acontece no padrão Agouti [Figura 4.8b). O
gene Agouti produz o pigmento amarelo encontrado nos
pelos. O alelo do tipo selvagem para a cor agouti da pela-
gem é designado A , e sua atividade normal leva à produção
de uma quantidade moderada de pigmento amarelo. O
alelo mutado, designado Ar, é uma mutação dominante de
ganho de função que produziu muito mais pigmento ama -
relo do que o alelo do tipo selvagem.
A mutação A r é dominante, mas não podem ser pro-
duzidos camundongos amarelos de linhagem pura. A partir
de uma perspectiva genética , isso significa que os camun-
dongos com pelagem de cor amarela sào heteroz.igotos
(AA *) e que o genótipo ArAr é letal no desenvolvimento
embrionário. A partir dessas informações, podem ser
feitas duas observações importantes a respeito da genética
do alelo amarelo. Primeiro, o cruzamento de um camun -
dongo agouti e um camundongo amarelo sempre vai re-
sultar na razão 1:1 entre agouti e amarelo na progé nie
( Figura 4.9a ). Segundo, os cruzamentos entre dois ca-
mundongos amarelos (ambos necessariamente hetero-
zigotos) produzem evidências da natureza letal recessiva
do alelo A * ( Figur» 4.9 b ). O resultado desses cruzamentos
é a razão 2:1 entre amarelo e agouti, em vez da razão 3:1
- (a ) Pelagem agouti
." ^WÈLr >
* : ijpf
^
f. C /
- ( b ) Pelagem amarela
-
Figura 4.8 Cor da pelagem em camundongos, ( a ) A
cor agouti da pelagem do tipo selvagem é uma mistura de
pigmento preto e amarelo nas hastes pilosas. (b) A pelagem
amarela ocorre quando o pigmento amarelo produzido
pelo alelo mutado AY excessivamente ativo toma o lugar do
pigmento preto.
 Cap í tulo 4 Interação gênica 117

(b) Figura 4.9 Dominância e letalidade

x do A\ (a ) A razão 1:1 identificou Ay
•• P •• a •
como um alelo mutado dominante, (b) A
AAf AAr AA' letalidade de Ay no genótipo homozigoto
Amarelo Amarelo Amarelo resulta na razão 2:1 entre amarelo e
f agouti no cruzamento de camundongos
.
F A Av Fi A A heterozigotos de pelagem amarela.
•• •• ••

* A AA AA' -* A AA AA
Agouti Amarelo Agouti Amarek)

a • a »

^ A AA
Agouti
AA
Amarek)
^A AA
Amarelo
AA
(Letal )

•ÍM ] AA Agouti

• • \ AA’ Amarelo

prevista quando sào cruzados heterozigotos que expres - razão mendeliana 2:1 distorcida que caracteriza a progénie
sam um alelo dominante. A interpretação genética dessa de dois camundongos heterozigotos de pelagem amarela.
observação é que os alelos do camundongo amarelo hete-
rozigoto segregam normalmente na formação dos game Tra ços limitados ao sexo
tas e se unem aleatoriamente para produzir a razão 1:2:1
na concepção, mas que os zigotos A * Ak nâo sobrevivem à O sexo de um organismo pode exercer influência
gestação. A letalidade recessiva de A‘ impede o desenvol- sobre sua expressão gênica. Uma consequê ncia de tal
vimento embrioná rio dos homozigotos, eliminando essa influê ncia é a potencial limitação da expressão gênica a
classe entre a progénie e resultando na razão 2:1 observada um sexo, mas nã o ao outro, em um padrão chamado ex -
entre a progénie de pais heterozigotos. pressão gênica limitada ao sexo. As diferenças na ex-
Quase um século após Cuenot identificar pela pri - pressão gênica entre os sexos podem resultar no surgi-
meira vez a letalidade homozigótica do alelo A* mutado, mento desses traços limitados ao sexo. Normalmente
a base molecular da letalidade foi identificada. Para sur- ambos os sexos portam genes para traços limitados ao
presa dos geneticistas, a letalidade pouco tinlia a ver com sexo, mas os genes são expressos em apenas um deles.
a pelagem amarela em si; em vez disso, a pelagem amarela Nos mam íferos, por exemplo, o desenvolvimento
era uma consequência quase involuntária de uma muta das mamas e a capacidade de produzir leite sào traços
limitados às fêmeas. O desenvolvimento de chifres é um
çào que deletava parte de um gene perto do gene respon - traço limitado aos machos em algumas espécies de car-
sável pela cor da pelagem . A mutação que produz o alelo
neiros, vacas e outros animais com casco.
Ar resulta de uma deleção que afeta dois genes, o Agouti
( agouti) e um gene vizinho, identificado como Raly. Este Os traços comportamentais em algumas espécies,
produz uma proteína essencial para o desenvolvimento particularmente os relacionados ao acasalamento, tam
bém são muito influenciados pelo sexo. Por exemplo, o
-
embrioná rio do camundongo. Cada gene tem o seu pró-
prio promotor. O promotor do Raly do tipo selvagem
incita um alto nível de transcrição, enquanto o promotor Promotor Promotor
do gene Agouti é transcrito de modo consideravelmente do Raly do Agouti
.
menos ativo { Figura 4.10) A mutação dominante que pro- Alelo A
[i QeneRaty I Gene Agouti
duz a pelagem amarela entra em cena por meio da deleção
de aproximadamentc 120 mil pares de base que delctam o Cromossomos portadores dos aletos
A do Tipo selvagem produzem a
gene Raly inteiro e o promotor do gene Agouti, cotocan- 120.000 pares proteína Paty, necessá ria para o
do-o sob o controle do promotor do Raly. Este incita um de bases desenvolvimento embrionário dos
alto nível de transcrição do gene Agouti , resultando em detetados por camundongos, e uma quantidade
Promotor mutação moderada de pigmento amamlo.
um excesso de pigmento amarelo que toma o lugar do pig -
mento preto nas hastes pilosas e leva ao fenótipo amarelo
do Raly l
Alelo A rL Cromossomos portadores do alelo
mutado. Heterozigotos com o genótipo AAr possuem pe- Gene Agouti mutado 4 rnão produzem proteína
lagem amarela e sobrevivem em razão da haplossuficiência Roty ç produzem um nível muto
.
da ú nica cópia do Raly Camundongos homozigotos A y A r alto de pigmento amarela
sào incapazes de produzir o produto proteico essencial a Figura 4.10 Mutação do Raly e do Agouti produzindo
partir do gene Raly e não se desenvolvem , resultando na pelagem amarela.
118 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
comportamento de fazer a corte dos grous coroados inclui
uma exibição elaborada do posicionamento corporal, en
trelaçamento de pescoços e vocalização, que são executa
dos de modo diferente pelos machos e f êmeas da espécie.
O mecanismo que limita a expressão de um traço a
apenas um sexo costuma ser a influê ncia diferencial dos
hormó nios que agem como reguladores intercelulares
da expressão gé nica. No caso da vocalizaçã o do caná rio
macho, por exemplo, as alterações no padrão de canto
são iniciadas no final do inverno por um aumento nos
hormónios masculinos liberados pelo cé rebro em res-
posta à maior duração do dia e às temperaturas mais
quentes. Esses hormónios estimulam o aumento dos
testículos e a maior produção de testosterona , que, por
sua vez, estimula o desenvolvimento dos neurònios no
cérebro, o que elabora o centro de canto, induz ao de
senvolvimento dos m úsculos na á rea de vocalização da
garganta e permite que os machos produzam vocaliza -
ção limitada ao sexo para atrair as parceiras.
Traços influenciados pelo sexo
Os traços influenciados pelo sexo são aqueles em
que o fen ótipo correspondente a um determinado genó-
tipo é diferente, dependendo do sexo do organismo por -
tador do genótipo. Acredita -se que os hormónios influen
ciem a expressão diferencial dos genótipos nos sexos.
O surgimento de um cavanhaque versus sua ausê n
cia, o fen ótipo imberbe, em certas raças de caprinos, é
um exemplo de traço influenciado pelo sexo. A barba
é um traço autossómico herdado, determinado por dois
alelos, B e bt presentes em três genótipos em cada sexo.
Em ambos os sexos, os homozigotos BB são imberbes e
os homozigotos de ambos os sexos com genótipo bb são
-
barbados. Acredita se que os horm ónios androgé nicos
sejam o principal fator de influ ê ncia do fenótipo bar -
bado. O efeito de diferentes n íveis de hormó nios andro-
génicos no surgimento de barba nos sexos é observado
pela comparação de fêmeas e machos com o genó-
.
tipo heterozígoto ( Bb ) Os machos heterozigotos tê m
barba, enquanto as fémeas heterozigotas são imberbes.
A iguri 4.11 ilustra os resultados de um cruzamento
entre dois heterozigotos que produz razões diferentes
9 cf
Bb
Imberbe
x Bb
Barbado
f 4
B b
- B
9
B8
cf
imberbe Imberbe Imberbe
^b 9
Bb
<T
Imberbe Barbado Barbada
Figura 4.11 Herança influenciada pelo sexo do
surgimento de barba em caprinos. O alelo da barba ( b) é
expresso de modo diferente em machos e fêmeas.
- entre machos e fé meas barbados e imberbes. Ocorre a
- herança mendeliana, mas, como consequência da ex -
- pressão influenciada pelo sexo, o cruzamento produz a
razão 3:1 de machos barbados para imberbes e a razão
3:1 dc fê meas imberbes para barbadas.
Idade de início tardia
A partir de uma perspectiva evolutiva , 6 fácil com -
preender que um alelo letal dominante pode ser eli -
minado eficientemente pela ação da seleção natural.
Mesmo assim, existem muitos exemplos de condições
hereditá rias letais dominantes e uma questão gen ética
evolutiva pertinente diz respeito a como essas mutações
persistem nas populações. Uma resposta possível é que
alguns alelos letais dominantes evitam a seleção natural
- por terem uma idade de in ício tardia; as anomalias que
produzem não aparecem até os organismos afetados
terem uma oportunidade de se reproduzir e transmitir a
mutação para a próxima geração .
Um exemplo de destaque da idade de início tar -
dia de um alelo letal dominante nos seres humanos é
a condição chamada doen ça de Huntington ( HD). Esse
transtorno neuromuscular progressivo, normalmente
fatal em um per íodo de 10 a 15 anos após o diagnós-
- tico, é provocado pela mutação de um gene perto da
extremidade do cromossomo 4. (Temos muito mais in -
- formações sobre os sintomas e a progressão da HD no
Capítulo 5, no qual também discutimos o mapeamento
do gene HD, e no Capítulo 16, no qual discutimos a clo-
nagem do gene HD.) O alelo mutado do HD persiste na
população porque os sintomas não começam, na me -
tade dos casos, antes do final da terceira década de vida
de uma pessoa ou inicio da quarta, bem depois que a
maioria das pessoas começou a ter filhos iFigura 4.12 ) .
Observa çã o gen é tica Os alelos letais causam a morte
dos organismos e podem ser dominantes ou recessivos. A
morte pode ocorrer no inicio ou no fim da vida . Ouando a morte
ocorre durante a gestação, a presença de um alelo letal costuma
ser detectada pela ausência de uma classe da progénie prevista
ou pela alteração da proporção de sementes ou semeadura.
100 -
ll
«U I
50 -
9
Bb
cf
Barbado
9
bb
cf
Barbado 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Idade ( anos)
F igura 4.12 Curva de idade de in ício da doença de
Huntington ( HD) .
 Capí tulo 4 Interação gènlca 119

4.2 Alguns genes produzem

fenótipos variáveis
Para interpretar as razões fenotípicas e identificai a*

distribuição dos gen ótipos entre as classes fenot ípicas,

geneticistas pressupõem que os fen ótipos são diferentes
porque seus genótipos subjacentes também são diferen -
tes. Esse pressuposto só é válido até o ponto em que um
determinado genótipo sempre produz o mesmo fenó-
tipo. Se a correlação estrita entre o genótipo e o fenótipo
—
não for consistentemente verdadeira se, em vez disso,
o genótipo conseguir produzir fenótipos diferentes as
—-
razões comuns são a interação gene -ambiente ou as in
terações com os alelos de outros genes no genoma. Figura 4.13 Polldactllla , um traço autossômico
Nesta seção, descrevemos dois fenômenos, cha - dominante com penetrâ ncia incompleta .
mados penetrância incompleta c expressividade variá -
vel, nos quais ocorre variaçã o fenotí pica entre organis-
mos com o mesmo genótipo. Além disso, examinamos quatro pessoas com o alelo mutado não apresenta poli -
exemplos específicos de influência ambiental na expres - dactiiia. O gene modificado para gerar a polidactilia foi
são génica que, muitas vezes, est á associada com a pe identificado recentemente (ver Capítulo 20) .
netr â ncia incompleta ou com a expressividade variável. A Figura 4.14 mostra uma família na qual a poli -
dactilia segrega como uma mutação dominante. Nove
Penetrância incompleta indivíduos na família carregam uma cópia do alelo da
polidactilia. Seis deles são penetrantes para o fenótipo
Quando o fenótipo de um organismo é coerente (significando que expressam o fenótipo), mas pelo menos
com o genótipo do organismo, diz-se que esse orga -
nismo é penetrante para o traço. Nesse caso, se o orga -
nismo portar um alelo dominante para o traço em ques-
três membros da família
—
penetrantes. Cada um desses indivíduos tem um filho —
II- 6, IMO e III-10 são não

ou neto com polidactilia; desse modo, cada um deles é

.
tão o fenótipo dominante é exibido. Algumas vezes um
organismo com um determinado genótipo produz o fe
nótipo correspondente, situação em que o organismo é
não penetrante para o traço.
Os traços para os quais os indivíduos n ão pene -
trantes ocorrem de maneira esporádica ou rotineira são
identificados como penetrâ ncia incompleta . A con
dição humana conhecida como polidactilia (“ muitos
dedos”) é uma condição autossó mica dominante que
exibe penetrâ ncia incompleta. Os indivíduos com poli
dactilia tê m mais de cinco dedos nas mãos e pés
n ú mero alternativo mais comum é seis ngura 4.13). A
— o
polidactilia ocorre em centenas de famílias no mundo
inteiro e, nessas fam í lias, o alelo dominante é n ão pene-
trante em aproximadamente 25% a 30% dos indivíduos
portadores. A maioria das pessoas que possui o alelo
tem mais de cinco dedos, mas pelo menos uma em cada
portador do alelo dominante para a polidactilia, mas
- é não penetrante para a condição. Quando os indivíduos
não penetrantes são relativamente comuns, a magnitude
da frequência de penetrâ ncia pode ser quantificada. Os
valore» da penetrância variam entre as diferentes famílias;
-
mas, no caso da família exibida na Figura 4.14, a penetrân
cia da polidactilia é f , ou 66,7%, que é aproximadamente
-
a média observada no mundo entre centenas de famílias
com polidactilia.
-
Expressividade variá vel
Algumas vezes a discrepâ ncia entre o genótipo e o
fenótipo é uma questão de grau em vez de presen ça ou
ausência. No fenômeno da expressividade variável , o
mesmo genótipo produz fenó tipos que variam em grau
ou magnitude de expressão do alelo de interesse.

Figura 4.14 Penetrância

incompleta para a
polidactilia. Trê s indivíduos não

.4 1
K) 3 4 s~\5 —17 penetrantes (11-6, 11-1Oe 111-10) são
observados nessa família.

III <y ò‘ & y ú*

IV
2
Ô‘ D4
•Indrviduo não penetrante
120 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
A sindrome de Waardenburg é um transtorno
autossômico recessivo humano que exibe expressividade
variável. Os indivíduos com sindrome de Waardenburg
podem ou nâo ter as quatro características principais
da sindrome: (1) perda de audição, (2) olhos de cores
diferentes, (3) uma mecha de cabelos brancos no topo da
cabeça e (4) cabelos prematuramente grisalhos. Na ge
nealogia de Waardenburg exibida na Figura 4.15, repare
que os círculos e quadrados que representam os mem
bros da família com sindrome de Waardenburg podem
ser inteira ou parcialmente coloridos. Cada quadrante
dos símbolos representa uma das características prin -
cipais da sindrome. A diversidade do escurecimento do
símbolo demonstra a variação na expressividade da sín -
drome de Waardenburg nessa família. A análise genética
molecular nos diz que cada membro da família com a
sindrome carrega exatamente o mesmo alelo dominante;
contudo, entre os membros da fam ília afetados, existem
seis padròes diferentes de expressão fenot í pica.
Muitas vezes é dif ícil apontar a causa da penetrâ n -
cia incompleta ou da expressividade variá vel. Trés tipos
de interações podem ser responsáveis: (1) outros genes
que agem de maneira a modificar a expressão do alelo
mutado, ( 2) fatores ambientais ou evolutivos (isto é, não
genéticos) que interagem com o alelo mutado, modifi -
cando sua expressão e (3) alguma combinação de outros
genes e fatores ambientais que interagem e modificam
a expressão da mutação. Nas cepas laboratoriais endo-
gâ micas de organismos genéticos modelo, a variação
nos fatores genéticos pode ser eliminada experimen
talmente para permitir a diferenciação da variabilidade
gene-gene e gene-ambiente, algo que n ão pode ser feito
em organismos como os seres humanos.
Intera ções gene -ambiente
Os genes controlam praticamente todas as dife-
renças observadas entre as espécies. O genoma de um
organismo estabelece o plano corporal e as vias bioquí-
micas desse organismo e controla o progresso do de
senvolvimento desde a concepção até a morte. Mas os
genes sozinhos não são responsáveis por toda a variação
observada entre os organismos. O ambiente, a mir íade
de substâ ncias químicas e condições que um organismo
Figura 4.15 Expressividade
variá vel da sindrome de I
Waardenburg.
II
IV
Grisalho prematuro
Mecha branca no topo da cabeça
encontra em vários estágios da vida, é outro fator essen -
cial para a variação observável entre os organismos. A
interação gene-ambiente é o resultado da influ ê ncia
dos fatores ambientais ( isto é, fatores nâ o genéticos ) na
expressão dos genes c nos fenótipos dos organismos.
- Observa çã o gené tica Na penetrâ ncia incompleta, um
genótipo náo é expresso por todo organismo no qual está
- presente. Na expressividade variável os organismos que com
partilham um genótlpo expressam o fenótipo correspondente
em graus diferentes. Ambas são explicadas pelas interações
genéticas e/ou náo genéticas que modificam ou impedem a
expressão consistente de um genótipo.
Como exemplo, considere as linhagens puras das
plantas de ervilha altas e baixas estudadas por Mendel.
A variação genética herdada determina que uma linha -
gem vai produzir plantas altas e a outra linhagem vai pro-
duzir plantas baixas, mas o ambiente no qual as plantas
são cultivadas tem uma influência importante na altura
da planta. Fatores ambientais como as variações na água ,
luz, nutrientes do solo e temperatura influenciam o cres
cimento da planta. N ão é dif ícil imaginar que plantas
-
geneticamente id ênticas e de um tipo adaptado às zonas
temperadas poderiam crescer com alturas diferentes se
uma tiver um ambiente de crescimento ideal e a outra
enfrentar um ambiente quente e árido com solo pobre.
A expressão fenot ípica dos gen ótipos também pode
- depender da interação de programas de desenvolvimento
controlados geneticamente e de fatores externos que ope-
ram nos organismos. Por exemplo, a mudan ça sazonal na
cor da pelagem observada em mamíferos do ártico, que
são praticamente brancos no inverno, mas apresentam
pelagens mais escuras na primavera e no verão, resulta de
uma interação entre muitos genes e sugestões ambien-
tais externas, como a duração do dia e a temperatura.
De modo similar, as sugestões ambientais que induzem
as plantas a desabrocharem na primavera desencadeiam
- mudanças na expressão génica que estimulam o cresci-
mento e o desenvolvimento de vá rias estruturas vegetais,
incluindo as flores c as estruturas reprodutivas. Tais ca-
pacidades para fazer mudanças sazonais evolu íram para
ajudai' na sobrevivência desses organismos e elas suge -
hO ITOBTÍ
mo DOO
Perda de audição
Olhos de cores diferentes

-
rem que a interação gene ambiente é fundamental para
compreender e interpretar a variação fenotí pica.
Modificação ambiental para evitar doenças hereditá rias
-
Um grande exemplo de interação gene ambiente nos seres
humanos é, na verdade, um caso de intervenção ambiental
praticada frequentemente para evitar o desenvolvimento
da condição autossómica recessiva humana conhecida
como fenilcetonúria (PKU ). Esse caso ilustra que os mes -
mos alelos podem produzir fenótipos diferentes em am -
bientes diferentes. A PKU é provocada pela ausência da
enzima fenilalanina hidroxilase, que catalisa a primeira
etapa da via que decompõe o aminoácido fenilalanina , um
componente comum da proteína alimentar.
Há algum tempo, a PKU contribuiu para milhares
de casos de insuficiência intelectual grave a cada ano.
A doença ocorria em 1 a cada 10 mil até 1 a cada 20
mil recém - nascidos na maioria das populações mun -
diais. Bebés com PKU são normais ao nascer, mas, ao
longo dos primeiros meses de vida, a incapacidade do
corpo para decompor a fenilalanina se torna tóxica para
os neurônios em desenvolvimento. À medida que os
neurônios morrem, as capacidades mentais e motoras
são perdidas de modo irreversível, tornando inevitável
a plena manifestação da doença. Nos anos 1960, um
simples exame de sangue foi disponibilizado para detec - se prende ao caule) resultam da produção do pigmento
tar a PKU nos primeiros dias de vida. O exame identi-
fica a doença antes que ela tenha chance de se mani-
festar e começar a danificar o corpo. A PKU é uma das
dezenas de transtornos hereditá rios raros pesquisados
rotineiramente nos recém - nascidos em hospitais norte-
-americanos e brasileiros (através do teste do pezinho).
A chave para prevenir a PKU, após a detecçào pre-
coce da doença nos recém- nascidos, é a restrição severa
da fenilalanina na dieta. Como a fenilalanina é um ami
noácido e componente de muitas proteínas, bebés com
- (JH ) que é ativo durante todo o ciclo de vida da Droso
PKU recebem uma dieta que consiste em proteínas espe-
cialmente selecionadas e processadas com a fenilalanina
removida. Um bebé que recebe dieta sem fenilala
nina logo após o parto e a mantém durante a adolescên
--
cia evita as complicações da PKU e vai se desenvolver e
funcionar normalmente, apesar de ter a doença. Milhares
de pessoas estão tendo vidas plenamente normais e pro-
dutivas hoje, graças a essa simples modificação ambiental
que impede a expressão do fenótipo devastador da PKU.
Nesse caso, pessoas homozigotas recessivas para o alelo
mutado da PKU não expressam o traço se forem criadas
em um ambiente praticamente livre de fenilalanina.
Os riscos alimentares são abundantes para crianças e
jovens com PKU, particularmente na forma do adoçante
artificial conhecido como aspartame. Esse adoçante é
feito por meio de uma reação química que funde os ami - sô mica recessiva provocada pela mutação do gene da
noácidos fenilalanina e ácido aspártico, formando um
composto que percebemos como um gosto doce. Depois
de consumido, o aspartame é decomposto rapidamente
em seus dois aminoácidos constituintes e a fenilalanina é
liberada. A ingestão regular de aspartame é perigosa para
portadores de PKU; por essa razão, uma advertência ali - .
Capí tulo 4 Interação gènlca 121
mentar dizendo “ Fenilceton úricos: contém fenilalanina"
aparece nas embalagens de produtos alimentícios que
contêm aspartame. Procure essa advertência no próximo
produto adoçado artificialmente que você escolher!
Genes pleiotrópicos
A pleiotropia é a alteraçã o de vá rios traços di-
ferentes de um organismo por uma mutação em um
ú nico gene. A maioria das mutações que exibe pleio-
tropia ocorre alterando o desenvolvimento das carac -
ter ísticas fenotí picas através da ação direta da proteína
mutada ou como resultado secundá rio de uma cascata
de problemas origin ários da mutação. Mendel encon -
trou inadvertidamente um caso de pleiotropia. Dois
dos traços que ele considerou em seus estudos foram
a herança da cor roxa versus branca em flores (ver Fi-
gura 2.1) e a herança de um tegumento cinzento versus
branco. Depois de observar que as plantas com flores
brancas invariavelmente também possuem tegumentos
brancos, enquanto as plantas com flores roxas sempre
têm tegumentos cinzentos, ele supôs acertadamente
que a herança desses traços tinha a mesma base gené-
tica. Hoje sabemos que a cor da flor, a cor do tegumento
e a aparência da cor nas axilas das folhas (onde a folha
roxo antocianina. As mutações que bloqueiam a produ -
ção da antocianina são pleiotrópicas, pois deixam vá -
rias estruturas da planta sem cor e produzem fen ótipos
brancos mutados em vá rios traços.
A pleiotropia por meio da ação direta de um pro-
duto proteico mutado é frequentemente encontrada em
.
estudos de desenvolvimento Um exemplo é a atividade
do hormònio da Drosophila , chamado hormó nio juvenil
f
phila e influencia vários atributos do desenvolvimento
-
.
e da reprodução A maior produção ou atividade do JH
mostrou -se capaz de prolongar o per íodo de desenvolvi -
mento, reduzir o tamanho corporal adulto, promover a
maturidade sexual precoce, aumentar a fecundidade ( a
capacidade de gerar prole) e reduzir o tempo de vida. Um
dilema evolutivo está associado a mudanças no nível ou
.
na atividade do JH Por um lado, a produção de mais JH
pode levar à produção de mais prole por meio da matu-
ridade sexual precoce e da maior fecundidade. Por outro
lado, o tamanho corporal diminui e a expectativa de vida
é menor em virtude da maior atividade do JH.
A pleiotropia na anemia falciforme (SCD) é um
exemplo de efeitos secundários fenotipicamente di -
versos que podem ocorrer em decorrência de um alelo
.
mutado A SCD (Omim 603903) é uma condição autos-
P globina que, por sua vez, afeta a estrutura e a função
da hemoglobina, a principal molécula de transporte do
oxigé nio nos eritrócitos (ver Capitulo 10). Muitos dos
eritrócitos das pessoas com SCD assumem uma forma
de foice e provocam muitos problemas í f sicos e compli -
cações ( Figura 4.16 )
122 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Mutaçã o
Normal Célula falciforme

7
S' /rCfcT 6 AA 6 A 6 // 3, "
5' 7[ C t T / r 3’
"

GliA G A 6
r l f W &k CTT CT C / / S DNA 3 7
"
'
Cs -
5' 7 £ 3' RNAm 5'7 £ 3'
it Pio I Glu T Glu
Hemoglobina normal
^ ' Prote í na ' ií Pro

Hemoglobina anormal
ATH fc Glu ]i '
I
i i
Desenvolvimento Desox ígenaçáo da
normal hemoglobina no tecido

Formato falciforme dos eritr ócitos

—
Aglomeração de células
e interferência na — ) í
Maior
-dosdestrui ção -

Acú mulo
de células
faldformes
no baço
circulação sanguínea

Dano
Falhas locais no suprimento sanguineo

í I
Anemia
1
eritrócitos

Decomposição
da hemoglobina

Dano
urogenital Dano muscular
e articular
Problemas Dilatação
t
Superatlvidade
cerebral
Isquemia.
i card íacos card íaca da medula óssea
e aumento na
Aumento necrose quantidade
Dano Dano de medula Ac úmulo de
e posterior ósseo bilirrubina

I
hbrose pulmonar
I
do baço
AVC Atraso na
i Fraqueza "Crânio em
e maturidade Osteomielite Pneumonia e Cá lculos
forma de
paralisia sexual cansaço torre'
Ultra

Capacidade
Prejuízo
prejudicada Crises Insuficiência Menor da função Icterícia
de combater renal óssea de dor card íaca mental
infecções

Figura 4.16 Plelotropia na anemia falciforme. 0 formato falciforme dos eritrócitos tem uma gama de consequências
fenot ípicas.

um traço ou estrutura. Nos n íveis celular e molecular, a

Observa çã o gen é tica Um alelo pleiotrópico é aquele dependência m ú tua dos genes requer que cada um exe-
que afeta muitos traços pleiotrópkos. Os alelos pleiotrópicos cute sua atividade no lugar e momento certos e no nível
podem atuar diretamente, influenciando o desenvolvimento adequado. Por exemplo, os produtos de vários genes inte-
de vá rios processos, ou indiretamente, danificando órgãos e ragem para gerar a cor da flor. De modo similar, um atri-
estruturas corporais. buto fenotí pico complexo, como a capacidade de ouvir,
exige que muitos genes produzam as vá rias estruturas que
convertem as vibrações acústicas em impulsos elétricos
4.3 A interação génica modifica as que percebemos como som. Nesta seção, examinamos em
detalhes a interação génica , que é a colaboração de vários
razões mendelianas genes na produção de uma única caracter ística fenot
ípica
Nenhum gene trabalha sozinho para produzir um ou de um grupo de caracter ísticas relacionadas. Entre-
traço fenotípico. Pelo contrário: os genes trabalham tanto, primeiro vamos examinar o controle genético dos
juntos para criar as estruturas complexas e os sistemas
fenótipos por uma perspectiva que ainda não exploramos.
orgânicos de plantas e animais. O que vemos como um
fenódpo é a manifestação í f sica da ação de muitos genes Interação génica nas vias
que desempenham um papel cada um e que trabalharam É comum biólogos descreverem as caracter ísticas
de maneira complexa, porém coordenada, para produzir fenotí picas como traços de um único gene. Essa
 Cap í tulo 4 Interação gènlca 123

designaçã o significa que diferentes formas de um traço (a ) Tipo selvagem Acorcotipc

podem ser transmitidas para a progé nie pela segregação _ Pigmento
seh/agem resulta
dos alelos de um ú nico gene. Caracter ísticas fenot í picas quandoc»
|
PreoinoresJ^ venne|ho.
da via pigmentos
como a cor da flor e a forma da ervilha sào exemplos de „ claro marrom e
tra ços de um ú nico gene, herdados em consequência da Precursores j pimento vermelho-caro
>
variação alélica em lócus ú nicos. da via marrom Olhos vermelhos sào produzidos e
O termo traço de um único gene resume convenien - transportados
para as células
.
temente a observação de que a variação herdada de um
gene pode produzir um fenótipo mutado em vez de
.
um fenótipo do tipo selvagem No entanto, o termo Precursores
da via
_.
( b) Mutações de um único gene
b
L ,
l l piqm^n
oculares

A mutação do
gene marrom
não retrata com precisão a realidade gen ética, como o
v* resulta na cor
exemplo a seguir esclarece. Muitos genes contribuem Precursores j Pigmento marrom mutado.
para a produção da cor do olho do tipo selvagem na da via ^ marrom Olhos marrons
Drosophila . Os geneticistas sabem que é isso que acon - b‘
Precursores 1 Ç
^
^nto A mutação do
tece, pois muitos fenótipos de cor do olho diferentes
foram mapeados para diferentes genes. Vamos consi - da via vermelho - gene verme,(ho-
<kxo resulta na
derar apenas três desses genes. Dois dos genes produ - _
Precursores L i ,
claro
cor vermeho -
zem pigmentos de cor do olho diferentes e o terceiro da via 11 Olhos vermelho
-daros
--
daro mutado.
gene transporta os pigmentos para as células oculares.
O gene marrom produz uma enzima que opera em uma Precursores
da via
\ vermelho - A mutação do
gene bronco
via sintetizadora do pigmento vermelho- claro. O gene v- -claro resulta na cor
carrega um alelo dominante do tipo selvagem b e um 4
Precursores \ Pigmento branca mutada.
alelo mutado recessivo b e as moscas que são bb têm da via marrom Olhos brancos
olhos marrons. O gene recebe o nome do mutado a ele (c ) Mutações de dois genes
-
associado. O gene vermelho claro produz uma enzima
ativa em uma via sintetizadora de um pigmento mar- Precursores
b _L , nr*
A mutação do
marrom e do
rom . O alelo do tipo selvagem v* é dominante em rela - da via
_
11 pigmento \ | vermelho cloro
ção ao alelo mutado v. As moscas que sào w tém olhos Precursores J , , resulta na cor
vermelho-claros. O gene branco produz uma prote í na
transportadora de pigmento do alelo dominante w\ que
da via -
í f pi .. n una Olhos brancos
branca mutada

Figura 4.17 Genes interagentes controlam a cor dos

carrega pigmentos para o olho. Uma proteína mutada
do alelo w é incapaz de transportar pigmento e as mos-
cas que não produzem a proteína têm olhos brancos.
A produçã o de proteínas do tipo selvagem de todos
os très genes é necessária para produzir a cor do olho
do tipo selvagem, e as muta ções hereditá rias da cor do
olho resultam da mutação de um ou mais genes ( Figura
.
4.17) A cor do olho do tipo selvagem é o resultado da
sí ntese dos pigmentos marrom e vermelho-claro e do
transporte de ambos os pigmentos para as células ocu -
lares, onde se misturam. A mutação de qualquer um
ou de mais de um desses genes resulta em um fenó tipo
mutado. Esse exemplo demonstra que vá rios genes são
ativos nas vias que determinam propriedades bioló
gicas diferentes. A varia ção herdada de um gene pode
- resposta a um sinal intra ou extracelular,
bloquear um segmento de uma via e produzir mutação
atribuível a um ú nico gene, mas esse tipo de achado não
nega a importâ ncia da a çã o de vá rios genes que afetam
cada traço.
Trés tipos distintos de vias genéticas podem ser iden -
tificados. O exemplo da cor do olho recém - descrito ilus-
tra uma via biossintética. As rias biossintéticas são redes
de genes interagentes que produzem uma molécula ou
composto como seu produto final. Compostos como os
pigmentos, aminoácidos, nudeot ídeos e horm ônios, entre
outros, sào exemplos de produtos das vias biossintéticas.
olhos na Drosophila. ( a ) A cor do olho do tipo selvagem
(vermelho) requer a atividade de três genes, ( b) A muta ção
de qualquer gene produz um fenótipo mutado caracteristko.
( c ) A mutação dupla do marrom e do vermelho-claro produz
olhos brancos.
As vias de transdução de sinal sào um segundo tipo de
ria multigènica. Essas vias são responsáveis pela recepção
dos sinais químicos, como os hormônios, que são gerados
fora da célula e iniciam uma resposta dentro dela. A trans-
duçã o de sinal opera pela liberação de uma molécula de
sinalização que faz parte de uma sequência de etapas que
culmina na ativação ou repressão da expressão gênica em
l inalmente, as vias ewlutivas consistem em genes
que dirigem o crescimento, desenvolvimento e diferen -
.
ciação das partes e estruturas do corpo Muitas rias evo -
lutivas foram identificadas nos organismos, e as funções de
seus genes foram determinadas por análises experimentais
de fenótipos mutado*. Geneticistas usam essa abordagem
analítica, conhecida como dissecação genética , para iden-
tificar os eventos passo a passo que compõem uma via ge -
nética. O uso da dissecação genética para analisar uma via
biossintética é explorado na próxima seção. Exemplos de
transdução de sinal e vias evolutivas são apresentados em
discussões posteriores (ver Capítulo 20) .
124 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
Observa çã o gené tica A interação génica é a regra, não a
exceção, na produção do fenótipo: nenhum gene opera sozinho
para produzir um fenótipo, embora a variação hereditária em um
lótus possa levar a padrões de segregação coerentes com traços
de um único gene. As redes de genes em colaboração compõem
as vias biossintéticas, de transdução de sinal ou evolutivas.
A hipótese um gene-uma enzima
O conceito das vias biossintéticas surgiu com a
sugestão de Archibald Garrod, em 1908, de que a inca
pacidade para produzir a enzima ácido homogentisico
oxidase é a causa da condição hereditá ria humana co-
nhecida como alcapton úria. No entanto, só depois de
meados do século XX que os detalhes das vias biossin -
té ticas específicas começaram a surgir. George Beadle e
Fdward Tatum foram alguns dos primeiros a investigar
as vias biossintéticas na pesquisa que lançou as bases
para definição e exame posteriores das vias de transdu
ção de sinal das vias evolutivas.
O experimento de Beadle e Tatum estudou as varian
tes do crescimento do fungo Neurospora crassa, e seus de-
talhes estão descritos na Observação Experimental 4.1,
A ideia por trás de seus experimentos era simples gerar
mutações de um único gene no Neurospora e interpretar
— gênica
a função normal dos genes observando as consequências
fenot ípicas de sua mutação. A famosa proposta hereditária
Observa çã o Experimental 4.1
Hipótese um gene -uma enzima
Os experimentos de George Beadle e Edward Tatum tinham
o objetivo de descrever a função gênica. Seu trabalho aconteceu
aproximadamente na mesma época que o DNA estava sendo
identificado como molécula hereditária e mais de uma década
antes de a estrutura do DNA ter sido identificada . Para fornecer
.
informações para análise Beadle e Tatum conceberam um ex-
perimento que Induziria mutações de um único gene no fungo
filamentoso Neurospora crassa e depois estudaram os mutados
para determinar como as mutações alteraram o crescimento do
Neurospora. Lembre-se de que o Neurospora pode crescer como
um haploide, ou duas células haploides podem se fundir e cres-
cer como diploides para sofrer meiose (ver Capitulo 2).
Na primeira etapa de seus experimentos, Beadle e Tatum
cultivaram muitas culturas geneticamente idênticas de fungos
haploides do tipo selvagem que foram irradiadas para induzir
.
mutações aleat órias O Seus conidios irradiados (esporos fún-
gicos produzidos de forma assexuada) foram acasalados com
haploides do tipo selvagem. Os diploides resultantes sofreram
meiose,produzindo esporos cultivados em um processo de duas
etapas para identificar mutados. Os diploides também podiam
ser testados para confirmar a presença de mutação de um único
gene pela observação da razão 3:1 em sua progénie. Os esporos
haploides irradiados foram cultivados primeiro em um meto de
cultura completo que contém uma mistura rica em nutrientes e
suplementos e que é capaz de suportar o crescimento dos fun-
gos do tipo selvagem e mutados O. Na segunda etapa, os fun-
gos cultivados eram escolhidos nas colónias do meio completo
conhecida como hipótese um gene- uma enzima emergiu
desses experimentos. Segundo essa hipótese, cada gene
produz uma enzima e cada enzima tem um papel funcio-
nal especial em uma via biossintética que produz um fenó-
tipo. Beadle e Tatum observaram que as mutações de um
único gene bloqueiam a execução das vias biossintéticas
e levam à produção de fenótipos mutados. Sua hipótese
propôs que cada fenótipo mutado era atribuível à perda ou
função defeituosa dc uma enzima específica. Como cada
defeito enzimá tico era herdado como defeito em um ú nico
gene, a hipótese um gene- uma enzima identifica a cone-
- xão direta entre genes, proteínas e fenótipos.
O conceito um gene uma enzima sofreu ajustes, já
que sua proposta leva em conta trés observações: (1) alguns
genes que produzem proteínas não produzem enzimas,
mas sim proteínas de transporte, estruturais e rcgulatórias;
(2) alguns genes produzem RNAs em vez de proteínas e (3)
algumas proteínas ( por exemplo, (1-globina ) precisam se
unir a outras proteínas para adquirir uma função. Apesar
- dessas modificações, a conclusão fundamental de Beadle e
-
Tatum ligando cada gene a um determinado produto é vá -
lida e forma a base para a compreensão da função gênica.
Dissecação genética para investigar a ação
Os experimentos de Beadle e Tatum abriram ca
minho para a investigação de papéis das muta ções de
-
e transferidos para um meio de cultura mínimo que fornece ape-
nas os constituintes mí nimos necessários para suportar o cresci-
.
mento dos fungos do tipo selvagem O Os fungos mutados são
identificados porque crescem em um melo completo, mas são
incapazes de crescer em um meio de cultura mínimo.
Com muitos mutados em mãos, Beadle e Tatum consegui-
ram abordar questões sobre quais genes sofreram mutação por
outro processo em duas etapas. Eles identificaram a categoria
química do composto que não pode ser produzida e depois
determinaram o composto específico que estava faltando. Um
exemplo dessa análise é ilustrado nas etapas O e O, em que
a análise da cultura testa um mutado quanto á sua capacidade
para crescer em vários tipos de meios mínimos suplementados.
São meios de cultura que tiveram um ou mais compostos adi-
cionados para suportar o crescimento de tipos específicos de
mutados. A etapa 4 mostra um mutado que cresce apenas no
meio que foi suplementado com todos os 20 aminoácidos co -
muns; esse resultado Indica que a cepa não tem capacidade
para sintetizar um ou mais aminoácidos. 0 defeito especifico
.
nessa cepa mutada é testado na etapa O usando 20 meios
mínimos diferentes suplementados com um aminoácido. Um
mutado cresce no meio mínimo suplementado com metionina
(met), identificando, assim,a cepa como capaz de sintetizar me-
tionina. Essa cepa é descrita como Met- ("Met menos' ou "me-
tionina menos"), para identificar a via defeituosa. O tipo selva-
gem é capaz de sintetizar a metionina, sendo identificado como
Mer+ ('Met mais" ou 'metionina mais").
 Capí tulo 4 Interação gènlca 125

Observa çã o Experimental 4.1 continuaçã o

Testando centenas de mutados independentes dessa ma .

oeira, Beadle eTatum descobriram que a maioria dos mutados
carregava mutações únicas que podiam ser vencidas pela su-
plementaçáo de um meio de cultura mínimo com um deter
.
minado composto Essa constatação os ievou a propor que as
mutações únicas impediam os mutados de realizar uma etapa
específica de via bioquímica. Com base nesse resultado eles
propuseram que as mutações de um único gene alteravam a
capacidade dos mutados para produzir uma enzima crítica em
- uma determinada via bioquímica. A correlação entre as muta-
ções de um único gene e os defeitos individuais nas vias sinté-
ticas é a base da hipótese um gene-uma enzima.

Raios X O Irradiação do Neurospora

crassa prototr ófico cultivado
em meio mínimo.

© Transferência dos conídios irradiados

para o meio completo, onde os
protótrofos (tipos selvagens) e os
auxótrofos (mutados) crescem.

O Transferência dos fungos cultivados

para o meio mínimo, onde os
protótrofos crescem, mas os
auxótrofos, não.

O Transferência dos
í I I 1 auxótrofos para
diferentes meios
mínimos supiementados
Mínimo Mínimo + Mínimo + Mínimo + Completo e controles.
aminoácidos vitaminas ácidos .
nucleicos \
U
Controle negativo Crescimento Sem Sem Controle
Sem crescimento crescimento crescimento positivo
Crescimento

0 Transferência dos auxótrofos

rTTTTTTTTTTTTTTTTTTl para os meios minimos
suplementados com um
aminoáddo para identificar a
via defeituosa .

«n
80 .£ C ç
E S
* «
0
126 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
genes individuais em vias biossintéticas. Essas investi
gações começaram com trés pressupostos sobre as vias
biossintéticas que provaram ser corretos: (1) as vias
biossintéticas consistem em etapas sequenciais, ( 2) a
execução dc uma etapa gera o substrato para a próxima
etapa na via e (3) a realização de cada etapa é necessá ria
para a geraçào do produto final da via. Esses pressupôs
tos suportam a conclusão de que as cepas do tipo selva
gem sã o capazes de executar cada etapa da via e que as
cepas mutadas são incapazes de completá -la, pois uma
ou mais etapas dessa via estão bloqueadas pela mutação.
A dissecação genética nesse contexto é uma abor-
dagem experimental que testa a capacidade de um mu
tado para executar cada etapa de uma via biossintética
e reúne as etapas de uma via determinando o ponto em
que ela é bloqueada em cada mutado. A estratégia de
dissecação genética é ilustrada para uma cepa met na - 3. O Met 3 cresce em meio m ínimo suplementado com
F i q u r a 4.18 usando dados experimentais coletados em
1947 por Norman Horowitz sobre quatro mutados met - em meio m ínimo acrescido de cisteína. Isso nos diz
de Neurospora crassa Isolados de maneira independente.
Os objetivos da análise da dissecação genética de
Horowitz eram (1) determinar o n ú mero de etapas in
termediárias dentro da via biossintética da metionina,
( 2) determinar a ordem das etapas na via e (3) identifi
car a etapa afetada por cada mutação. Ao conceber seu
experimento, Horowitz se baseou em um trabalho bio-
qu ímico prévio que identificava a homoserina como o
primeiro composto na via biossintética da metionina e
identificava a cisteí na, a homocisteí na e a cistationina
como intermediá rios posteriores na via. Horowitz tes
tou o protótrofo de controle ( met + ) e quatro auxótro
fos que exigiam a metionina ( Met 1 a Met 4) quanto à
sua capacidade para crescer em um ( 1) meio m ínimo,
( 2) meio m ínimo acrescido de cisteína , (3) meio m í nimo
acrescido de cistationina, (4) meio m ínimo acrescido
de homocisteína e (5) meio m ínimo acrescido de me-
tionina. A Figura 4.18a mostra crescimento ( + ) ou não
-
crescimento ( ) de quatro mutados met- e da cepa do
tipo selvagem ( wet+ ) em cada um dos meios experi
mentais. A cepa do tipo selvagem cresce em todos os
meios, já que a suplementaçá o do meio m ínimo com
qualquer um dos intermediários não surte efeito em
Figura 4.18 Dissecação genética (a ) Dados experimentais
da via de biossí ntese da metionina.
(a ) Crescimento de uma cepa do tipo
selvagem e de quatro cepas mutadas Cepa Meio
met- Independentes em meio mutada m í nimo cisteína
m ínimo e em vá rios meios m ínimos Protótrofo
suplementados. Para cada mutado, de controle
o composto que se acumula é o que Meti
Met 2
precede imediatamente o ponto de
Met 3
bloqueio, (b) A ordem dos compostos
intermediá rios na via biossintética da
Met 4
metionina e a etapa bloqueada em (b) Ordem dos Intermediá rios na via
cada cepa mutada met -.
Met 4
Homoserina -L Cisteí na i* Cistationina -L Homocisteí na -L Metionina
- seu crescimento. Cada mutado metionina cresce no
meio mí nimo acrescido de metionina, o produto final
da via biossintética, mas exibe padrões de crescimento
diferentes com outros meios suplementados. A seguir,
temos a análise dc cada mutado:
1. O Met 1 cresce apenas em meio mínimo acrescido
*
de metionina, indicando, assim, que uma mutação
- na última etapa da via impede a conversão do pro-
duto intermediá rio final em metionina. Apenas a
adição da metionina ao meio m ínimo contorna o
bloqueio da via.
2. O Met 2 exibe crescimento com suplementaçá o por
*
metionina ou homocisteí na , indicando, assim, um
bloqueio na etapa que produz homocisteína. Esse
resultado nos diz que a homocisteína é o substrato
convertido em metionina na via biossintética.
metionina, homocisteína ou cistationina, mas não
que o Met 3 é bloqueado na etapa que produz cista -
tionina e que esta precede a homociste ína na via.
- 4. O Met 4 cresce com qualquer suplementaçá o do
- meio mínimo. Isso nos diz que o Met 4 é imperfeito
na etapa que precede a produção de cisteína.
A Figura 4.18b mostra as etapas da via biossintética
da metionina, conforme determinado pela análise desses
mutados. A etapa da via bloqueada no mutado é identi-
ficada com base na lógica de que a suplementaçáo por
-- um composto necessá rio após o bloqueio vai permitir o
crescimento, enquanto a adição de um composto utili -
zado antes do bloqueio não vai auxiliar no crescimento.
A etapa bloqueada també m é identificada pela substâ n -
cia que se acumula no auxótrofo: em cada mutado, uma
substâ ncia intermediá ria diferente se acumula porque a
etapa que a converteria no próximo intermediário na via
é imperfeita. C) acú mulo da cisteí na pelo met 3, da cista -
tionina pelo met 2 e da homocisteína pelo met 1 suporta
a atribuição desses mutados a etapas específicas na via.
- A Análise Genética 4.2 ilustra a dissecação genética de
uma via biossintética pela avaliação dos hábitos de cres-
cimento dos auxótrofos.
Meio de crescimento
Composto
Minimo + -
M ínimo f M í nimo + M í nimo acumulado
cistationina homocisteí na metionina no mutado
+ + + Nenhum
f Homocisteí na
+ Cistationina
f f Cisteína
+ + - f + Homoserina
Met 3 Met 2 Meti
 Cap í tulo 4 Interação génica 127

que o fenótipo do tipo selvagem seja produzido. Dados

Observa çá o gen é tica Os genes mutados codificam
proteínas defeituosas que bloqueiam etapas individuais de uma
via biossintética. A dissecação genética analisa os requisitos de
nutrientes dos mutados para determinar a ordem das etapas na
via biossintética e identificar a etapa bloqueada em cada mutada
os possíveis resultados dos cruzamentos di íbridos, exis-
tem seis maneiras de organizar as proporções fenotí pi
cas da F2 pela epistasia. Todas as seis razões alteradas
-
podem ser observadas em plantas ou animais. A Figura
4.19 fornece uma visão geral desses padrões, exibindo a
modificação das razões di íbridas que caracterizam cada

Epistasia e seus resultados

Os genes que contribuem para diferentes etapas de
uma via trabalham juntos para produzir o produto final
dessa via. Em virtude dessa interação, a mutação de um
gene pode impedir a execuçã o da via e a geração do pro-
duto fmal. Em outras palavras, a interação génica pode
resultar em um gene influenciando se e como outros
genes da via são expressos e como eles funcionam.
As interações gênicas ocorrem de várias formas e a
maioria delas produz razões fenot ípicas características
na progé nie em consequência de mecanismos dc inte-
ração específicos. Essas razões alteradas dos fen ótipos
dos tipos selvagem e mutados são provocadas pela epis
-
forma de epistasia O restante dessa discussão fornece
uma descrição resumida e um exemplo de cada um dos
padrões epistáticos. No entanto, primeiro descrevemos
um cruzamento diíbndo envolvendo os genes que con -
tribuem para a cor dos olhos na mosca -da -fruta Droso-
phila melanogaster, na qual há uma interação entre os
genes que alteram a razão fenotípica 9:3:3:1 resultante.
Nenhuma interação ( razã o 9:33:1) A epistasia é iden -
tificada mais facilmente por meio de desvios específi -
cos da razão 9:3:3:1 prevista entre a progénie F2 de um
cruzamento diíbrido envolvendo alelos dominantes e
recessivos. Essa razão prevista para a F , resulta da ação
de dois genes que segregam independentemente na
—

interações epistáí
—
tasia, nome dado às interações gênicas
—
chamadas
tcas nas quais um alelo modifica
ou impede a expressão dos alelos em outro gene É ne .
-

cessário um m ínimo de dois genes para a epistasia. Os
genes que interagem pela epistasia estão envolvidos na
produçã o de uma determinada característica fenot í pica
e normalmente participam da mesma via. A epistasia
é detectada mais facilmente entre a progénie de cru
zamentos diíbridos na qual ambos os genes são porta
dores de alelos dominantes e recessivos. Nesses casos,
a segrega ção independente prevê uma razão 9:3:3:1 de
quatro fenótipos na progénie F2, mas a epistasia resulta
em menos de quatro fenótipos. Essa redução no n ú
mero de classes fenotí picas da F, ocorre porque diferen
tes classes genotipicas possuem o mesmo fenótipo. Em
outras palavras, a marca registrada da interação epis -
tática em um cruzamento diíbrido é a modificaçã o da
razão 9:3:3:1 em razão da combinação de duas ou mais
classes genotipicas em uma ú nica classe fenot í pica.
A epistasia resulta da mutaçã o nas vias que reque-
rem uma atividade específica de cada gene na via para
-
ausê ncia de epistasia ou seja , quando os genes não
interagem para mudar a expressão de um ou de outro.
As contribuições dos genes marrom, vermelho-claro e
branco para a cor dos olhos do tipo selvagem (verme-
lho ) da Drosophila são ilustTadas na Figura 4.17 Nesse .
exemplo, limitamos nossa consideração à variação do
-
gene marrom e do gene vermelho claro para mostrar o
resultado previsto da segrega ção independente de dois
- genes que contribuem para uma caracter ística fenotí-
- pica específica. Em outras palavras, não há interação
entre os genes e o resultado é previsto pelo acaso.
A análise começa com o acasalamento entre uma
mosca de linhagem pura com olhos marrons ( h/h;
- v* / vr ) e uma mosca de linhagem pura com olhos verme-
- lho-claro ( h* / b*; v/v). Escrever os genótipos nas formas
exibidas separa os alelos nos cromossomos homólogos
por uma barra ( / ) e separa os genes dos diferentes cro-
mossomos por ponto e vírgula. Nesse exemplo, presume-
-se que as moscas progenitoras tenham a função do tipo
selvagem do alelo w~ , embora o genótipo desse e de ou-
tros genes não seja exibido. A progénie F ( tem olhos com
a cor do tipo selvagem e consiste em integrantes diíbri-

Epistasia Epistasia Supressão

Interaçã o g énka: Nenhuma Complementar Duplicada Dominante
recessiva dominante dominante
Razão fenotí pica: 9:33:1 9:7 15:1 9:6:1 9:3:4 12:3:1 13:3

ti MBB
h
ti AoBB
ÁABb h*« -- ft --
A S h A fl-- h A-«- --
A B

4 AaBb
Razão
ti M àb
genotfpica
h Aabb A A-bb A-bb H A- 6
* A-bb ti A-bb A-bb -
1Í A bb
h
ti OOBB
ti acBb ti ««8- ti OCB- aaB - aaB- aaB- ti -
«»8 aaB-

& °°hh i aabb

Figura 4.19 Padrões resultantes da interaçã o g é nica epistá tica .

aabb ti aabb aabb
^ aabb aabb
128 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
-
Quatro mutados bacterianos zmf ízmt - 1 a zmt 4), cada um com uma Cepa mutada Acrescentado ao meio mínimo
mutaçào em um único gene, est ão disponíveis para estudo Gnco in- .
termediários na via de síntese da zmt foram identificados (D,F,M R e S), . Tipo selvagem
D F M R S Nada zmt
+ + + + + +
mas sua ordem na via é desconhecida. Cada mutado é testado quanto
à sua capacidade para crescer em meio mínimo suplementado com um -
zmt 1 + +
.
dos compostos intermediários Todos os mutados crescem quando a -
zmt 2 -
4 + 4* +
zmt é adicionada ao meio mínimo e a cepa do tipo selvagem cresce -
zmt 3 + + +
em todas as condições de cultura testadas. Encontre a ordem dos in- -
zmt 4 + + +
termediários na via de síntese da zmt e identifique a etapa bloqueada
em cada cepa mutada. Na tabela de crescimento à direita, +' indica
crescimento e indica que não houve crescimento .
-
Estrat égias de soluçã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 identifique o tópico abordado .
1 Este problema lida com mutados da via de síntese da zmt e exige a análise do defeito
por esse problema e explique a em cada mutado, bem como a ordem dos intermediários na via de síntese da zmt
natureza da resposta solicitada.

.
2 identifique as informações crf
ticas fornecidas no problema
- 2. Ovagem
.
problema fornece informações sobre o crescimento das bactérias
e também das cepas mutadas
- do tipo sel-
- quando cultivadas em placas de meio de
zmt
zmt f

cultura mínimo e de meios suplementados individualmente com zmt ou um dos cinco

intermediários na via de síntese da zmt.
Deduzir
3. Comparar e avaliar D4ca; A avl é o 3. Todos os mutados crescem com suplementação de zmt e suplementaçâo pelo
os padrões de cres- proos.o flTMl dá vté composto S. Nenhum deles cresce sem qualquer suplementação e nenhum deles
cimento suportados e suporta o cresci- obtém suporte ao crescimento do composto D. Os compostos F, M e R suportam o
mento de todos os
pelos suplementos. mutados /mf . crescimento de um ou mais mutados.

.
4 Identificar o produto flnaF da
via e o próximo e último com-
posto intermediário da via.
.
4 A zmt é o último composto sintetizado. O composto S também suporta o crescimento
de todos os mutados e provavelmente é o precursor imediato da zmt .

Solucionar
.
5 Identificar o primeiro com - 5. O composto D náo suporta o crescimento de qualquer um dos mutados zmr e prova -
posto sintetizado na via . velmente ocorre antes de qualquer uma das etapas da síntese afetadas por mutações .
O composto D é o primeiro composto na via.

® Identificar o segundo, terceiro 6. O composto R suporta o crescimento do mutado zmt-2, indicando que o composto
e quarto compostos sintetiza- contorna a etapa bloqueada no zmt-2. O composto R provavelmente se segue ao mu-
dos na via. tado D na via e o zmt -2 é incapaz de converter D em R. O zmt -2 cresce nos compostos
intermediários que ocorrem apó s esse ponto de bloqueio da via, mas não no com-
suplementado com um com-
posto D que vem antes do bloqueio zmt 2.
Dlu: 0 freio
posto imermedUrt© que ocorre apos a etapa
da via ser bloqueada por um mutado vai dar O composto M suporta o crescimento do zmr 2 e zmr 4 e contorna o bloqueio em ambos os
suporte ao cresdmento,
. -
mutados O crescimento do zmt 4 náo é suportado pelos compostos D ou R que ocorrem
antes da etapa de conversão bloqueada no zmt-4. A conclusão é que o composto M
se segue ao composto R e que o zmt -4 é Incapaz de converter R em M.Os compostos F, Me
Dica: Para confirmar essa solução, verifique S suportam o crescimento do zmt-4 e cada um deles contorna o bloqueio.
se o crescimento dc cada mutado suportjdo O composto F suporta o crescimento do zmt -3 e se segue ao composto M na via. O zmt-3
*
pela suplementa çào com compostos que vêm
é incapaz de converter M em F. O composto S suporta o novo crescimento do zmr - 7, indi-
após o bloque* o, mas r»4o pela suplementação
com compostos que artecedem o bloqueio. cando que se segue ao composto F na via e que o zmt- 1 não converte o composto F em S.

.
7 Montar a via de síntese da zmt ® zmt-2 zmt-4 zmt-3 zmt- 1
e identificar os mutados em
D R M F S zmt
cada etapa da via.

Para praticar mais, ver Problemas 4, 16, 17 e 27 .


dos ( b' / b; vW) (Figura 4.20). A progénie na geração F2
possui quatro fenótipos para a cor dos olhos, conforme
previsto pela segregação independente. Os olhos verme
lhos (tipo selvagem ) sâo observados em da progénie, £
os olhos marrons c vermelhos sào observados, cada , em
^ à F• c o fenótipo para os olhos brancos aparece em
-jé da progénie F2. Essa última progénie consiste em mu
i
tados duplos incapazes de sintetizar qualquer pigmento
colorido. O fenótipo para a cor dos olhos é branco, mas,
nesse caso, a base mutacional do gene branco é diferente
da encontrada nas moscas com mutação do gene branco
que transporta o pigmento para o olho ( ver Figura 4.17).
A razão fenotí pica 93:3:1 fornece evidências de que dois
genes que segregam de modo independente contribuem
para o fenótipo da cor dos olhos. Essa razã o indica que os
genes não têm interação epistá tica entre si.
Os exemplos mais simples de epistasia são as
interações entre dois genes, cada um com um alelo
dominante e um recessivo. A Figura Bá sica 4.21 ilustra
seis padrões de epistasia para a interação de dois genes. À
medida que descrevermos esses padrões aqui, e enquanto
vocé examina a Figura 4.21, repare que as razões fenotí pi
cas observadas para cada traço resultam da combinação
das categorias genotipicas 9:33:L (Consulte a Figura 4.19
para obter uma visão geral desses padrões epistáticos.)
Interação gènica complementar (razão 9:7) William
Bateson e Reginald Punnett (do famoso quadrado de
Punnett ) foram os primeiros biólogos a documentar o
desvio da razão prevista de 9:3:3:1 na progénie F2 de um
cruzamento di í brido resultante da interaçã o epistá tica
de dois genes. Nos experimentos realizados em ervilhas
doces { Lathyrus odoratus ) , uma planta ornamental dife
rente da ervilha comestível de Mendel ( Pisam sativum ),
Bateson e Punnett começaram a cruzar duas linhagens
r independente de dois genes, C c P, que gera produtos gê-
16 Precursor Marrom
Precursor Vermelho
claro
&•
9 etapas precisam ser realizadas com êxito para a produção
b‘ / b: r / y
1
16
b/ b; v' /
_ Precursor
Precursor
Marrom
Sem pigmento
Vermelho
x
I Marrom
—
¥
© 16
3
Precursor Sem pigmento
by_ j¥/ ¥
Precursor ; » Vermelho-
b7 b; r / y
6*
-claro
Vermelho
i
16 Precursor Sem pigmento
b/ b: y/ y Precursor Sem p«gmento
T Branco
Figura 4.20 Nenhuma interação génica na produção
da cor dos olhos na DrosophUa. A razão 9:33:1 resulta da
segregação independente dos alelos em um cruzamento
diíbrido de moscas de olhos vermelhos com genótipo b' /b; r / y.
Cap í tulo 4 Interação gènica 129
- —
puras de ervilhas de flores brancas. A geração Ft pro
duziu uma surpresa todas as plantas da progé nie
tinham flores roxas. Quando Bateson e Punnett cruza
ram plantas da Fjt a F , produziu a razão de plantas de
-
-
flor roxa para plantas de flor branca.
-
Bateson c Punnett reconheceram que seus resulta -
dos podiam ser explicados se dois genes interagissem
entre si para produzir a cor da flor na ervilha doce. Su -
pondo que dois genes sejam responsáveis por um ú nico
— —
pigmento que confere a cor roxa à flor da ervilha doce,
cada linhagem parental representada pelos genótipos
ccPP e CCpp é de linhagem pura para as flores bran -
cas em consequência da homozigosidade para os alelos
recessivos em um dos genes. O cruzamento dessas duas
linhagens de progenitores brancos de linhagem pura
produz plantas difbridas de cor roxa na progénie Ft
genótipo CcPp — porque o alelo dominante em cada
—
l ócus permite a realização de cada etapa da via que leva
à síntese do pigmento roxo. A segregação independente
dos alelos resulta em quatro classes genotipicas, C-P , -
- -
c c P C p p e ccpp , produzidas na razão 9:3:3:1 prevista
para um cruzamento diíbrido. No entanto, entre a F2,
--
apenas carregam o genótipo C P que confere a ca -
^
pacidade para produzir pigmento roxo. Os restantes
da F , são homozigotos para um dos alelos recessivos c e
p ou para os dois conjuntos de alelos. Nenhuma dessas
plantas é capaz de sintetizar pigmento, em razão da au -
sência de produtos gè nicos funcionais de um ou ambos
os lócus, e todas elas t êm o mesmo fenótipo mutado.
A razão fenotí pica 9:7 resulta da interação génica
complementar que exige que os genes trabalhem em
- conjunto para gerar um único produto. A Figura 4.21 O
mostra que, no nível molecular, a cor roxa da flor nas er-
vilhas doces é produzida quando o pigmento antocianina
é depositado nas pétalas. A produção da progénie F. de
flor roxa e a razão 9:7 da F., são explicadas pela segregação
9 nicos que controlam diferentes etapas da via de síntese da
- Vermelho
antocianina. Como a produção da antocianina requer a
ação do produto de C e também do produto de P, as duas
e a deposição da antocianina nas pétalas das flores. Por
outro lado, qualquer genótipo homozigoto recessivo no
lócus C, no lócus P ou nos dois lócus resulta no bloqueio
da via e na produção de flores brancas sem pigmento.
A capacidade de os dois mutados com o mesmo fe-
© nótipo mutado produzirem progénie com fenótipo do
tipo selvagem se chama complementaçào genética e in-
Vermelho -
claro dica que mais de um gene está envolvido na determina -
ção do fenótipo. Discutimos os detalhes da complemen -
tação genética na última seção deste capítulo.
Ação gènica duplicada (razão 15:1) Dois genes que dupli-
cam a atividade um do outro constituem um sistema ge-
nético redundante, no qual qualquer genótipo que possua
pelo menos uma cópia de um alelo dominante em qual-
quer lócus vai produzir o fenótipo dominante. Somente
quando os alelos mutados recessivos homozigotos estão
130 An á lise gen ética: uma abordagem integrada

FIGURA B Á SICA 4.21

Razões epistáticas

O Interação géníca complementar

9:7 Exemplo: cor da flor da ervilha doce 9:7

C P
Precursor I -L Precursor II Antocianlna

*
Roxa

-
A bò
CePp C
j_
P
Nenhum
Roxa C-pp Precursor I Precursor II —
h x — A
pigmento Branca

L
_cL P

*
16 Nenhum 1 Nenhum lyt 16
ceP- Precursor I precursor II * pigmento Branca
A interação géníca complementar ocorre
quando os genes precisam agir em conjunto CcPp
1 f P
para produzir um fenòlipo. A ação do tipo Roxa
-L_ Nenhum
16
Precursor I
X Nenhum
sefvagem deambos os genes é necessária ccpp * pigmento Branca
precursor II
para produzir o fenótipo do tipo selvagem
A mutação de um gene ou de ambos os
genes produz im fenótipo mutado.

0 Ação génica duplicada Exemplo: cor da flor do feijã o 15:1

15:1
Precursor I
P
Antocianina w
R Roxa
P
15
li PpRr Precursor I Antocianina 16
Roxa r Roxa
x — P
A "** W
A ação géníca cupfccada permite que os alelos
qominantes de qualquer um dos geres duplicados
f
PpRr
ppR-
J.
16 Precursor I
R
Antocianina
Roxa
Roxa P
produzam o fenótipo do tipo selvagem. Apenas os 1
Nenhum 1
16 Precursor I 16
crganrsmos com mutações homozí góticas de ambos T pigmento
os genes tèm um fenótipo mutado. pprr f Branca

O Interação génica dominante Exemplo: forma da abóbora

A
9:6:1
9 :1
*
rJ,
Precursor Proteína A
Precursor Proteína B
‘
B Discoide

- A
ÍHtQ A òb

'
AaBb
3
16
Precursor
A bb Precursor
Proteína A
Nenhuma
Discoide
- p proteína B
A eaòb Esfénra
x — a ^16
Nenhuma

A interação génica dom nante ocorre entre genes que

contribuem para a produção de um fenótipo Um fenótipo
'
AaBb
Precursor
Precursor
T
proteína A
Proteína B

Discoide B
se os alelos dominantes estiverem presentes em cada
gene;um segundo fenótipo se os alelos recessivos forem a
Nenhuma
homoagoTos para qualquer um dos genes e um terceiro L
Precursor proteína A
se ocorrer homozigosiddde recessiva em ambos os genes 16
aabb Precursor Nenhuma
p proteína B
 Capí tulo 4 Interação gènlca 131

Exemplo: cor da pelagem de um cão da raça labrador 93:4

B
Eumelanina
O Epistasia recessiva
«14
^- -
B E
Precursor M
Precursor P i
preta
« Deposição •

\
de eumelanina
E
ft *-*-

=4
m BbEe
Preta
2
bbE -
Precursor M
Precursor P
b
Eumelamna
marrom
Deposição
de eumelanina
—
Chocolate
x
A B Eumelanina
3.
'
t-
BbEe
1
-
16
8 M
Precursor M
Precursor P
preta
r-* Nenhuma
deposição de
e eumelanina Amarela 4
A epistasia recessiva occxre c anCo a etos Preta
^
recessivos em um gene mascaram ou reduzem Eumelanina
a expressão dos alelos no lócus da nteraçãa ± Precursor M marrom
16
bbee Precursor P Nenhuma —
deposição de Amarela
* eumelanina

O Epistasia dominante Exemplo: cor da flor da dedaleira 12:3:1

12:3:1 D W
Precursor . Vermelho- -L > Distribuição

b
16
D-W- ncolor
t
-escuro do pigrrento
confinada a
* *,
Branca 12

* *n %
OdWw
3
16 Precursor
d
Vermelho- -i-
w manchas na
corola
17
rx l
6

Branca ddW - incolor

t
>
•daro *
A "*-
-
A 000 / x —
Precursor
o
I %
w
Vermelho- _L_ , Flor
*
Branca

Na epistasia dominante, um a ?elo dominante de

**
DdWw
incolor escuro pigmentada Vermelho

um gene mascada ou reduz a expressão dos

alelos de um segundo gene.
Branca
JL
Precursor
16
ddww Incolor
d
» (
Vermelho
- claro
w
1 t Flor
pigmentada
:
*
Vermelho
-
1
16

•claro

O Supressão dominante Exemplo: cor das penas da galinha 133

-
133 C

4 *+
Precursor
incolor
Sem
pigmento f
Branca
r
fr» L J
4** -

M9 -
Ccil
Branca
Precursor
incolor Pigmento
A Au
Colorida
16

4 X

r Precursor
incolor
Cl
JJ_ Sem
pigmento f
Branca
Cdl
A supressão dominante ocorre quando o aleto
dominante de um gene suprime a expressão de um
.
aldo dorr nante de um segundo gene.
Branca
1
16
ccii
Precursor j_
incolor
c I
Sem
pigmento
r
Branca
132 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
presentes nos dois l ócus o fenótipo recessivo aparece.
Diz'se que os genes em um sistema redundante têm ação
genica duplicada; eles codificam o mesmo produto gê'
nico ou codificam produtos gê nicos com o mesmo efeito
em uma única via ou em vias compensatórias.
A Figura 4.21 fornece uma ilustração e explicação
da ação génica duplicada identificada inadvertidamente
por Gregor Mendel em um experimento envolvendo a
.
cor da flor nos feijoeiros Perto do final de seu famoso
ensaio de 1866 descrevendo a herança nas ervilhas, Men -
del descreveu um experimento com feijões que começou
com o cruzamento de um feijoeiro de linhagem pura e
flores roxas com um de linhagem pura e flores brancas.
As plantas da F tinham flores roxas e Mendel provavel - forma de intera ção génica, na qual a homozigosidade
mente presumiu que a determinação da cor da flor nos
feijoeiros seguia o mesmo padrão das ervilhas. No en-
tanto, entre 32 plantas da F. que Mendel produziu , 31
tinham flores roxas e apenas 1 tinha flores brancas. Entre
as plantas da FJf tinham um genótipo contendo pelo
menos uma cópia de P ou R e apenas tinha um genó-
tipo pprr e o fenótipo de flores brancas.
>
A Figura 4.21 mostra que um alelo dominante
em qualquer lócus é capaz de catalisar a conversão de
um precursor para a antocianina e produzir o fenótipo
dominante. Inversamente, se houver alelos recessivos
homozigotos em ambos os l ócus, nenhum produto gè-
nico funcional é produzido e a via de síntese não é con --
clu í da. As flores brancas resultam da ausê ncia do pig
mento em da progénie F2 recessiva homozigota para
alelos de ambos os genes.
Interação g ènka dominante ( razão 9:6:1 ) O formato do
finto da abóbora é classificado como longo, esférico ou
discoide. As plantas com fruto longo são sistematicamente
de linhagem pura, indicando que são homozigotas para os
genes que controlam o formato da fruta . Por outro lado,
as plantas que produzem frutos discoides ou esféricos às
vezes são de linhagem pura e às vezes não, indicando que
essas plantas podem ser homozigotas ou heterozigotas
para os genes que controlam o traço. A Figura 4.21 O ilus-
tra e descreve a interaçã o dominante entre dois genes
que controlam o formato do fruto da abóbora. A interação
dominante é caracterizada pela razão 9:6:1 dos fenótipos
na progénie de um cruzamento di íbrido.
Um cruzamento de plantas de linhagem pura produ -
zindo fruto esférico pode gerar uma F1 com fruto discoide.
Esse resultado indica uma interação entre os genes que
controlam o formato da fruta c sugere que as plantas da
F, que produzem o formato discoide são diíbridas. A pro-
^
génie F2, que exibe as proporções fenotípicas 7 discoide,
esférica e longa, confirma a hipótese. Qual dos três
fenótipos ocorre depende da presença do alelo dominante
nos dois genes, em um gene ou em nenhum dos genes.
Na geração F as plantas com pelo menos um alelo domi
nante em cada ^ lócus ( A B ) têm fruto discoide, as com
--
- o alelo w é do tipo selvagem e distribui o pigmento por
alelos recessivos em cada lócus (aabb ) produzem fruto
longo e as plantas homozigotas recessivas em qualquer
um dos lócus [ A bb ou aaB- ) produzem frutos esféricos.
~ epistasia dominante é revelada na F2 pela raz ão 12:3:1 de
O modelo molecular dos eventos subjacentes à intera -
ção dominante supõe que cada gene produz uma prote ína
.
diferente que contribui para o formato do fruto Quando
a ação alélica dominante produz ambas as proteínas, o
fruto discoide é gerado. Sc apenas uma das proteínas for
produzida, são produzidos frutos esfé ricos, como nas clas -
.
ses genotipicas aaB- e A-bb Plantas homozigotas para os
alelos recessivos de ambos os genes { aabb ) não produzem
nenhuma das duas proteínas e geram frutos longos.
Epistasia recessiva ( razão 9:3:4) As pelagens preta ,
chocolate e amarela nos cães da raça labrador resultam
da interação de dois genes, um que produz pigmento
e outro que o distribui para os fol ículos pilosos. Essa
para um alelo recessivo em um lócus pode mascarar
a expressão fenotípica de um segundo gene, se chama
epistasia recessiva e tem a razão 9:3:4 característica
dos fenótipos, ilustrada pela Figura 4.21 O.
Cruzar progenitores de linhagem pura da cor choco-
late com progenitores de linhagem pura de cor amarela
produz uma progénie F com pelagem preta. O fato de a
(
progénie FJ ser diíbrida é revelado pela genaçào Fy na qual
’
7 da progénie carregam os genótipos na classe B E e --
possuem pelagem preta, tém um genótipo bbE , resul -
^
tando em pelagem cor chocolate, e 7 carregam genótipos
B ee ou bbee e possuem pelagem amarela.
A explicação molecular para esse sistema gené-
tico est á vinculada à produ ção do pigmento do pelo, a
melanina. Os cães produzem eumeianina, que confere
a cor preta ou marrom ao pelo, e a feomelanina, que
confere um tom avermelhado ou amarelado O gene E.
é o TYRP1 , que controla a distribuiçã o da eumeianina.
O alelo do tipo selvagem E produz deposição plena da
eumeianina, mas o alelo e bloqueia a deposição. O gene
B é o MCI R, que controla a síntese da eumeianina preta
ou marrom, com B produzindo eumeianina preta e b
produzindo eumeianina marrom. Os cães que são B £ _ _
produzem e depositam grandes quantidades de eumeia
_ -
nina e têm pelagem preta. Os cães que são bbE produ -
zem eumeianina, mas a depositam menos em decorrê n -
cia de seu genótipo bb. Esse cães têm pelagem chocolate
( marrom ). Os cães homozigotos ee são incapazes de
produzir eumeianina e, em vez disso, produzem apenas
feomelanina. Fsses cães têm pelagem amarela.
Epistasia dominante ( razão 12:3:1) A determina çã o da
cor da flor nas dedaleiras fornece um exemplo de epis-
tasia dominante, em que um alelo dominante em um
lócus mascara a expressão dos alelos em um segundo
.
lócus, descrito na Figura 4.21 O Nas dedaleiras, um alelo
d do tipo selvagem produz um pigmento vermelho-claro
observado nas flores e um alelo mutado D produz um
pigmento vermelho-escuro nas flores. Em outro gene,
toda a flor. Um alelo mutado W restringe o pigmento à
corola da flor. As plantas diíbridas da Fj ( DdWw ) têm flo-
res brancas com manchas vermelho - escuras na corola. A

plantas com flores brancas e manchas na corola ( D W
-
-
e ddW ), plantas com flores vermelho-escuras { D-ww ) e
- .
plantas com flores vermelho claras ( ddww ) Nas dedalei
ras, o alelo Wexerce um efeito epistático evitando a dis -
tribuição da cor da flor fora da corola.
Supressão dominante ( razão 13:3) Nosso exemplo final
de interação gênica epistã tica é a supressão dominante,
ilustrada na Figura 4.21 O. A supressão dominante é si-
milar à epistasia dominante, mas ocorre quando um alelo
dominante do gene suprime completamente a expressão
fenotípica dos alelos de outro gene. Nas galinhas, por
exemplo, a cor da pena requer um alelo dominante C. As
galinhas homozigotas para um alelo recessivo c tém penas
brancas. O alelo C tem sua ação de produzir a cor supri -
mida por um alelo supressor dominante, /. O alelo reces-
sivo i não exerce supressão. Os cruzamentos entre galinhas
coloridas dc linhagem pura ( CCii ) e galinhas brancas de
linhagem pura ( ccl!) produzem F, de penas brancas difbri
.
das ( Cclí ) A produção da F2 resulta na razão 13:3 que é
característica da supressão dominante. As galinhas porta -
doras de um genótipo cc são incapazes de produzir cor nas
penas e as portadoras de C- com /- tem a produção da
cor da pena suprimida. Apenas as galinhas com genótipo
C-ii são capazes de produzir penas coloridas.
A Figura 4.21 O mostra que o produto do alelo C
converte um precursor incolor em pigmento, enquanto
o produto do alelo c é inativo e não converte o precursor,
.
resultando em penas brancas nos genótipos cc A supres
são dominante de C pelo produto de / impede a produ
ção de pigmento nas galinhas com genótipo C-I-. O ge-
nótipo homozigoto i< é incapaz de suprimir a cor no C-.
A An á lise Genética 4.3 testa sua capacidade de analisar os
cruzamentos envolvendo a interação génica epistã tica.
4.4 A análise de complementação
distingue as mutações no mesmo
gene das mutações em genes
diferentes
Suponha que vocé seja um geneticista que trabalha
na Califórnia e que identificou uma mutação recessiva
que faz que as flores da petúnia sejam brancas em vez
de roxas ( tipo selvagem). Uma amiga sua, també m ge -
neticista, está trabalhando com pet únias na Holanda e
entra em contato com vocé porque ela também identifi -
cou uma mutação recessiva que resulta em flores bran -
cas. Como nâo houve nenhum contato entre as pet ú nias
califomianas e holandesas, as mutações surgiram de ma
neira independente. Quando os geneticistas encontram
organismos com o mesmo fenótipo mutado, duas ques
tões iniciais são (1) esses organismos têm mutações do
mesmo gene ou de genes diferentes e (2 ) quantos genes
são responsáveis pelas mutações observadas?
Já vimos que as mutações de diferentes genes podem
produzir fenótipos iguais ou muito parecidos. Esse fe-
nô meno é conhecido como heterogeneidade genética.
Também vimos que um acasalamento de dois organis-
Cap í tulo 4 Interação gènlca 133
- mos com fenótipo anormal igual ou similar às vezes pode
produzir progénie com fenótipo do tipo selvagem. Esse
- fenómeno se chama complementação genética e ocorre
quando organismos mutados carregam mutações de dife-
rentes genes que produzem o mesmo fenótipo anormal.
Por outro lado, se as duas mutações forem no mesmo
gene, a progénie de um cruzamento entre os dois muta-
dos terá um fenótipo mutado; essa situação é conhecida
como falha da complementação genética. Nesta seção,
descrevemos como distinguir se duas mutações indepen -
dentes estão no mesmo gene ou em genes diferentes.
Uma abordagem anal ítica chamada teste de com-
plementação genética examina a relação entre duas ou
mais mutações recessivas que afetam um atributo feno-
tí pico. Os pesquisadores a utilizam para determinar se
duas mutações recessivas ocorrem no mesmo gene ou
em genes diferentes. Ela també m fornece informações
- sobre o n úmero de diferentes genes que podem produ-
zir o fenótipo mutado. Aqui, limitamos nossa discus-
são ao teste dos genomas eucarióticos, usando a cor do
olho na Drosophila como exemplo. As estratégias para
o teste dc complementação em bactérias e vírus bactc-
r anos ( bacteriófagos) diferem um pouco das utilizadas
í
em plantas c animais (Capítulo 7).
O teste de complementação genética cruza mutados
de linhagem pura para uma mutação recessiva e examina
o fenótipo da progénie do cruzamento. A progé nie F, he-
- terozigota desses cruzamentos é examinada quanto aos
- fenótipos do tipo selvagem e mutados. Se for produzida
progénie do tipo selvagem, ocorreu complementação ge
nética e a conclusão é que os alelos mutados são de genes
diferentes. Por outro lado, se os alelos mutados forem do
mesmo gene, a progénie de dois mutados de linhagem
pura terá um fenótipo mutado. Esse resultado indica que
não ocorreu nenhuma complementação genética.
Como exemplo, examinamos o teste de comple-
menta ção genética usando dois genes que afetam a cor
dos olhos na Drosophila , ambos os quais já foram dis-
-
cutidos anteriormente: o gene vermelho claro, cujo pro-
duto é o pigmento da cor do olho, e o gene hranco, cujo
produto é a proteína de transporte do pigmento para o
olho. Os dois genes estão situados no cromossomo X na
Drosophila. A ação sequencial dos produtos génicos na
produ ção da cor dos olhos é ilustrada na Figura 4.22a. A
complementação gen ética é ilustrada pela produ ção da
progé nie feminina do tipo selvagem (vermelho) resul -
tante do cruzamento de uma fé mea de linhagem pura
com olhos vermelho-claros e um macho de linhagem
- pura com olhos brancos. Nenhuma complementa ção
genética ocorre quando uma fé mea de linhagem pura
- com olhos cor de damasco é cruzada com um macho de
linhagem pura com olhos amarelo- claros. Toda a pro-
génie tem cor dos olhos mutados.
A análise da complementação genética utiliza vá -
rios cruzamentos para determinar se a progénie é mu -
tado (sem complementação genética ) ou do tipo selva -
gem (com complementaçã o genética ). Uma tabela de
dados de teste de complementação genética exibida
134 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
. .
O dr Ara B Dopsis, um famoso genetkista de plantas, decide se aventurar na propagação da flor
íris. Ele seleciona íris de linhagem pura, uma vermelha e outra azul, e promove seu cruzamento.
Para sua surpresa, todas as plantas da F, tém flores roxas. Ele decide criar mais íris de flor roxa peia
autofertilizaçáo das íris da Fr O Dr. Dopsis produz 320 plantas da F , consistindo em 182 plantas
com flores roxas, 59 com flores azuis e 79 com flores vermelhas. ^
a. A partir das informações disponíveis, descreva o fenômeno genético que produz a razão fenotf -
Fr
pica observada nas plantas da Identifique o número de genes envolvidos nesse traço.
b. Usando símbolos claramente definidos de sua própna escolha, identifique os genótipos das plan-
.
tas parentais e da F (

Estrat égias de soluçã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado . ,
1 Este problema diz respeito à interpretação dos resultados da F e da Fy à identificação
por esse problema e explique a do mecanismo genético responsável pela observação e á atribuição dos genó tipos á s
natureza da resposta solicitada. plantas parentais e da F, de uma maneira coerente com o mecanismo genético .
.
2 Identifique as informações crí
ticas fornecidas no problema .
- . 2 O problema afirma que as plantas parentais de flores azuis e vermelhas são de linhagem
.
pura e que sua F, consiste exclusivamente em plantas de flores roxas Entre as plantas da
Fy as flores roxas são predominantes, mas também são observadas, em menor grau, as
plantas com flores vermelhas e azuis.
Deduzir
.
3 Deduza os possíveis mecanis- .
3 Dois mecanismos possíveis são sugeridos por esses dados. Primeiro, um único gene
mos genéticos que poderiam com dominância incompleta poderia gerar um fenótipo nas plantas heterozigotas da
contribuir para a produção de F ) # o qual é diferente do fenótipo de qualquer uma das plantas parentais homozigotas.
plantas com flores roxas na F , Segundo, dois genes exibindo uma interação epistática poderiam contribuir para um
a partir das plantas parentais fenótipo em uma planta diíbrida da F(,o qual é diferente do fenótipo de qualquer uma
de linhagem pura com flores das plantas parentais de linhagem pura.
vermelhas e azuis .
.
4 Determine as proporções fe 4- . Um modelo de único gene prevê que a autofertilizaçáo de uma planta heterozigota da F,
notí picas relativas resultará na razão 1:2:1 (25%c50%:25%) na Fr Um modelo de epí stasia de dois genes pro-
^ Dica: Com-
previstas pelos duzindo três fenótipos da F poderia ser uma interação gênica dominante {razão 9 >:1),
pare a» porterv
possí veis mecanis- tagens relativas
(te caca teoô-
^ *
uma epí stasia dominante (razão 123:1) ou uma epí stasia recessiva (razão 9:4:3). As previ-
mos genéticos e ava- ttpo para veri- sões da epí stasia recessiva são uma correspondência mais próxima com as observações do
lie a razáo fenotípica ficar qual mo- que as previsões da epistasí a dominante. A epí stasia recessiva prevê porcentagens fenotí -
observada. delo gmêtko
prevê com mal
picas de aproximadamente 56%:25%:19%. A razão observada nos fenótipos da F 3 é =
*
Solucionar
prrmio
porcentagem
otnervjdav
i 56,8% com flores roxas,

Resposta a
^ = 24,7% com flores vermelhas e = 18,4% com flores azuis.

.
5 Identifique os mecanismos
genéticos mais prováveis que
contribuem para os resulta -
dos desses cruzamentos
.
5 A comparação das previsões da F2 do modelo de dominância Incompleta de um único
gene e dos modelos de epí stasia recessiva de dois genes determina que a epí stasia re-
cessiva é uma previsão melhor das proporções relativas da progénie. O provável ma
. delo genético para explicar esses dados é a epí stasia recessiva. (Repare que o número
de plantas da F, observadas em cada categoria pode ser comparado com o número pre-
visto pela análise do qul- quadrado.)

.
6 Atribua genótipos às plantas .
6 Usando os símbolos A e a para um gene e B e b para o segundo gene, os genótipos das
parentais e da F ,. plantas são
Progenitores: aaBB (vermelho) e AAbb (azul)
,
F : AaBb (roxo)

Para praticar mais, ver Problemas 5, 10, 22 e 31 .

 Cap í tulo 4 Interação gènlca 135

(a ) Gene Gene Figura 4.22 Complementação

-
virm+lho claro branco genética e não complementação
genética envolvendo os genes
Produto precursor Pigmento Cor dos olhos
vermelho-claro e branco,
Complementação Sem complementaçã o responsá veis pela cor dos olhos
genétka genética na Drosophila. ( a ) O cruzamento
P: 9 VW7VW x d / w/ F
4
P: 9 V*nr“/W x cfi de vermelho-claro de linhagem pura
Vermelho-claro Branco Damasco
. Amarelo daro
com branco de linhagem pura exibe
F,: 9 vmriv *
Tipo selvagem
(vermelho)
4
<fvw* fY
-
Vermelho claro
4

-
F »: 9 v nr /v* ie*
Damasco-claro Damasco
complementação genética pela
produção da cor do olho do tipo
selvagem na Ft,0 cruzamento entre a
cor de damasco de linhagem pura com
( b) o amarelo-claro de linhagem pura não
Amarelo- Marrom Cor de Vermelho-
produz complementação genética na F ,
Muttçio Damasco Marrem ctaro avermelhado Cereja vinho tinto Coral -daro Branco
que tem a cor dos olhos mutados.
Damasco + + + ( b) O teste de complementação
Marrom •f + genética entre nove Drosophilas
Amarelo
claro
- + + +
diferentes com cor dos olhos
Marrom + + + + mutados revela cinco grupos de
avermelhado complementação, correspondendo
Cereja + + a cinco genes. Cinco alelos mutados
Cor de do bronco não se complementam
vinho tinto + +
Coral + mutuamente e são atribuídos ao
Vermelho- mesmo gene. Os outros quatro mutados
-claro + complementam a si e aos mutados do
Branco gene branco , sendo atribu ídos ao seu
Complementação próprio gene.
Grupo Mutado ( alelo)
I Damasco ( iv*), amarelo-claro ( ar*), cereja ( »0, coral iW" ), branco (*)
II Marrom avermelhado (c)
III Cor de vinho tinto (c/)
IV Marrom ( b )
V Vermelho -claro ( v)

na Figura 4.22 b indica se o cruzamento de fen ótipos
mutados parentais produz progénie do tipo selvagem
( indicada na tabela pelo sinal de mais: + ) ou progénie
mutada ( indicada na tabela pelo sinal de menos: -).
Qualquer par de mutados que complemente um ao
outro produzindo progénie do tipo selvagem consiste
em mutações de genes diferentes. ( Lembre se dos resul
tados da interação génica complementar, ilustrados na
Figura 4.21 O.) Por outro lado, o cruzamento de pais
mutados produz apenas o fen ótipo mutado na progénie
quando as muta ções nâo complementam uma à outra e
são mutações do mesmo gene.
A análise da complementação da mutação da cor dos
olhos na Drosophila , exibida na Figura 4.22b, se concentra
nos cruzamentos que não se complementam, já que são
o resultado das mutações no mesmo gene. As mutações
que não se complementam mutuamente são identificadas
como um grupo de complementação, consistindo em
um ou mais alelos mutados de um único gene Um grupo
de complementação consiste em mutados cujos fenóti
pos não se complementam de maneira sistemá tica e que
complementam mutados em outros grupos. No contexto
genético, um “grupo de complementação" é sinónimo
de "gene", pois os alelos mutados de cada grupo afetam
a mesma característica fenotípica. Desse modo, na aná -
lise da complementação genética, o n ú mero de grupos de
complementação é igual ao número de genes.
Nos dados de teste de complementação na Figura
4.22b, damasco, amarelo-daro, cereja, coral e branco exi-
bem uma nâo complementação m ú tua. Esse resultado
identifica os cinco mutados ocorrendo no mesmo gene.
( Historicamente, o branco foi a primeira mutação identifi -
cada c o gene se tornou conhecido por esse nome.) Os ge-
- - -
neticistas concluem que damasco, amarelo claro, cereja,
coral e branco são alelos mutados do gene branco { w ) na
Drosophila. Essas mutações formam o grupo de comple-
mentaçâo I. Por outro lado, as mutações marrom, cor de
cravo, cor de vinho tinto e vermclho-daro complemen-
tam todos os outros mutados. Essa observação transmite
aos observadores a informação de que eles não são alelos
de outro mutados, mas sim que cada mutado representa
um gene diferente. Cada um desses mutados forma seu
pró pno grupo de complementação (isto é, os grupos de
complementação II a V). Dentre os nove mutados da cor
dos olhos da Drosophila examinados, cinco genes (cinco
grupos de complementação) são identificados. Um gene
- é representado por cinco mutados e os outros quatro são
representados por uma mutação cada.
Observa çã o gen é tica A complementação ocorre
quando dois mutados produzem progénie do tipo sefvagcm,
indicando que os organismos parentais carregam mutações de
genes diferentes. Por outro lado, a não complementação ocorre
quando dois organismos carregam mutações no mesmo gene.
136 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

ESTUDO DE CASO

j {
Identificaçã o de grupos de complementa ção do xeroderma pigmentoso
Neste estudo dc caso, examinamos o uso da aná lise da
complementação genética para identificar o n úmero de genes
^
cé lula h íbrida com dois núdcos» Um hctcrocário contem toda
a informação genética das duas células formadoras. A lógica
.
envolvidos em uma condição humana rara mas genetica - experimental é que, se as duas células contiverem mutações
mente heterogé nea , chamada xeroderma pigmentoso ( XP). de genes diferentes , o hctcrocário vai sofrer complementação
O XP é caracterizado pela sensibilidade grave à radiação genética que seria dctcctada como níveis normais ou quase
ultravioleta ( UV ) da luz solar c por um aumento dc até mil normais dc NER; mas, se as mutações forem no mesmo gene,
vezes na taxa dc câ ncer dc pele induzido pelo sol. Embora a NER seria mais ou menos a mesma no heterocário e nas li-
as abordagens experimentais para o teste de complementa - nhagens celulares individuais Essa análise dos níveis de NER
ção nos seres humanos sejam necessariamente diferentes das nos hetcrocá rios do XP indicou, no final das oontas, sete gru -
empregadas nos organismos cm laboratório, as interpretações pos de complementação de genes XP.
dos cruzamentos “seguem” os mesmos processos . Cada um dos sete genes associados ao XP teve sua fun -
As pessoas com XP são deficientes cm um tipo dc re - ção identificada c sua posição mapeada no genoma humano
paração do DNA. chamado reparação por excisão de nu - na última década, mais ou menos. Quatro dos genes produ -
cleot ídeos ( NER ), que. caso contrá rio, protegeria a pele dos zem proteínas necessá rias para remover um segmento da fita
danos induzidos pelo IJV que levam ao câ ncer. Na NER . do DNA danificada pela radiação UV como parte integrante
um pequeno trecho de DNA contendo a lesão induzida
pelo UV é removido c a lacuna é preenchida pelo novo
do processo de reparação do DNA. As prote ínas de dois ou
tros genes associados ao XP são necessárias para reconhecer
-
DNA (ver Capítulo 12). o dano ao DNA induzido pela radiação UV, depois de locali-
O trabalho de pesquisa que começou no final dos anos zado. O conhecimento da identidade dos sete genes associa -
1970 identifioou sete grupos de complementação, represen - dos ao XP levou à descoberta de que outras doenças heredi-
tando sete genes diferentes que sofreram mutação nas dife - tárias associadas ao câncer també m envolvem mutações de
rentes formas da XP. Duas abordagens identificam a existên - um ou outro dos genes associados ao XP ( ver Capítulo 12).
.
cia dc sete grupos de complementação Anthony Andrews e
seus colegas obtiveram cé lulas de pele cultivadas de pacientes 100
com XP e de controles normais c testaram a capacidade das foorroíes rmwnh
células para crescer após a exposição a doses medidas de ra-
.
diação UV ( Figura 4.23) As cé lulas foram expostas à luz UV
cm um comprimento dc onda dc 254 nm durante intervalos
diferentes e seu crescimento foi medido como a porcentagem
das cé lulas originais capazes dc formar colónias após a expo -
sição à radiação UV. Esses pesquisadores identificaram cinco
padrões diferentes de resposta à exposição aos raios UV que
são designados como grupos dc complementação A até E.
Outros pesquisadores mediram a resposta à exposição
ao UV de cé lulas de XP cultivadas, determinando o n ível de
NER ocorrido nessas culturas extra ídas de diferentes indi -
v íduos portadores de XP em comparação com células nor -
mais. Os resultados mostraram que as linhagens dc células
de XP variam quanto a seus níveis de NER , dc menos dc
5 % a aproximadamente 50% do normal . Esses resultados
podem scr uma decorrência dc sua presen ça cm genes dife-
rentes ou , como alternativa, de alelos hipomórficos diferen- *
Dose de UV (J/m )
tes no mesmo gene. •Escalo logarí tmica
A aná lise da complementação gené tica foi utilizada no Figura 4.23 Crescimento das culturas celulares de
estudo das culturas de células de XP com NER baixa para pacientes com xeroderma pigmentoso ( XP ) Cinco .
identificar as linhagens celulares portadoras dc diferentes mu - grupos de complementação do XP são identificados com
tações no gene do XP. Para isso, duas cé lulas de linhagens com base na capacidade de crescimento.
NER baixa foram fundidas para formar um hctcrocário uma .

RESUMO

4.1 As interações entre alelos produzem podem provocar expressão excessiva CHJ resultarem novas
relações de dominância funções.

As muta ções de perda de função diminuem ou eliminam

A dominâ ncia incompleta produz heterozigotos com fervó -
tipos diferentes dos encontrados nos homozigotos, porém
.
a atividade génica As mutações de ganho de função
 Capí tulo 4 Interação génica 137

mais parecidos com um íenótipo homozigoto que com o
outro.
Alelos codominantes são igualmente detectados no fenó-
tipo heterozigoto.
A interação dos produtos alélicos determina a relação de
dominância entre alelos.
4*3 A interação g énica modifica as razões
mendelianas
A epistasia é revelada por seis razões alternativas que mo-
dificam a razão 9:3:3:1 prevista entre a progénie de um cru-
zamento diibrido.

Os tipos sanguíneos ABO são produzidos por alelos cujos
produtos proteicos geram dominância ou codominància,
dependendo do genótipo.
I Vários alelos de um único gene podem exibir uma série de
relações de dominância que estabelecem uma série alélica.
.
Os alelos letais podem matar os gametas Impedir o desen-
volvimento gestacional de certas classes de progénie ou
podem surtir seu efeito letal mais tarde durante a vida.
Nos traços limitados e Influenciados pelo sexo, os alelos se
manifestam de modo diferente em cada sexo.
4.2 Alguns genes produzem fenó tipos variá veis
Na penetrância Incompleta, um alelo nem sempre tem o
efeito esperado sobre o fenó tipo.
I Na expressividade variável, organismos com o mesmo ge-
nótipo tém diferentes graus de expressão fenotlpica .
Mutações pleiotrópicas afetam dois ou mais atributos de
fenótipo independentes e aparentemente distintos.
I Os tipos e razões da epistasia são a interação génica
complementar (9:7), a ação génica duplicada ( 15:1), a
interação génica dominante (9:6:1), a epistasia recessiva
(9:3:4), a epistasia dominante (12:3:1) e a supressão do-
minante (13:3) .
4.4 A análise de complementa çáo distingue as
mutações no mesmo gene das mutações em
genes diferentes
I Na heterogeneidade genética, mutações em diferentes
genes podem produzir o mesmo fenótlpo.
I A complementaçáo genética produz progénie com fenó-
tipo do tipo selvagem dos progenitores de linhagem pura
para fenótlpos mutados similares. A detec çá o da comple-
mentaçáo genética significa que as mutações ocorrem em
genes diferentes.
I A não detecção da complementaçáo genética a partir do
cruzamento de dois organismos mutados similares identi-
fica os alelos mutados como pertencentes ao mesmo gene.

T E R M O S- C H A V E

Alelo termossensivel (p. 114 )
Codominància (p. 110)
Complementaçáo genética (p. 133 )
Dissecação genética (p. 126 )
Dominância incompleta (dominância
.
parcial) (p 109)
Expressividade variável (p. 119)
Grupo de complementaçáo (p. 135)
Haploinsuficiente (p. 107 )
Haplossuficientes (p. 107 )
Heterogeneidade genética (p. J3J)
Hipótese um gene-uma enzima (p. 124 )
Idade de Início tardia ip. 118)
Interação epistática (epistasia) (p. 127 )
ação génica duplicada (razão 15:1)
(P- T 29)
epistasia dominante (razão 123:1) Mutação letal (alelo letal) (p, 114 )
(p. 132) Muta ção negativa dominante (p. 107 )
epistasia recessiva (razão 93:4) (p. 132 ) Muta ção neomórfica (p. 109)
interação dominante (razão 9:6:1) (p . Mutação nula (mutação amórfica)
132 ) (p. 107)
interação génica complementar Penetrância incompleta (não pene-
(razão 9:7) (p. 129) trante, penetrante) {p. 119)
supressão dominante (razão 133) Pleiotropia (p. 121 )
.
(p 133 ) Série alélica (p. 112)
Interação gene-ambiente (p. 120 ) Traç o Influenciado pelo sexo (expressão
Interação génica (p. 122 ) influenciada pelo sexo) (p. 118 )
Mutação de ganho de função (p 107 ) . Traç o limitado ao sexo ( expressão gé-
Mutação de perda de função (p 107 ) . nica limitada ao sexo) (p. 117)
.
Mutação hipermórfica (p 109 ) Via biossintétlca (p. 123 )
Mutação leaky (mutação hipomórfica)
(p. 107)

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Defina e diferencie penetrância incompleta e expressivi-
dade variável.
2. Defina e diferencie epistasia e pleiotropia .
3. Durante o trabalho com plantas de cevada, dois pesqui
sadores identificaram independentemente uma mutação
de planta baixa e desenvolveram linhagens recessivas
homozigotas de plantas baixas. Medições cuidadosas
da altura das plantas baixas mutadas versus plantas altas
normais indicam que as duas linhagens mutadas têm a
mesma altura. Como você determinaria se essas duas li-
nhagens mutadas carregam a mutação do mesmo gene
ou de genes diferentes?
4. Quinze colónias bacterianas cultivadas em um meio
- completo sâo replicadas em um meio mínimo. Doze das
colónias crescem no meio mínimo,
a. Utilizando a terminologia do capítulo, caracterize as 12
colónias que crescem no meio mínimo e as três coló-
nias que não crescem.
138 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
b. As trés colónias que náo crescem no meio mínimo são
replicadas em meio mínimo acrescido do aminoácido
serina (min + Ser) e as trés crescem. Caracterize essas
trés colónias.
c A via biossintética da serina é uma via de trés eta-
pas na qual cada uma delas é catalisada pelo produto
enzimátko de um gene diferente, identificado como en-
zimas A, B e C no diagrama a seguir.
Enzima A Enzima B
3-Fosfoglicerato — 3-Fosfo-hidroxipiruvato
(3-PHP)
EnaTia C
3-Fosfoser í na Serina
-
(3 PS) (Ser)
O mutado 1 cresce apenas em min + Ser. Além do cresci-
mento em min + Ser, o mutado 2 também cresce em min
3-PHP e min 3-PS. O mutado 3 cresce em min + 3 -PS
.
e min + Ser Identifique a etapa da via de biossíntese da
serina na qual cada mutado é defeituoso.
5. Em um tipo de periquito conhecido como budgie, a cor
das penas é controlada por dois genes. Um pigmento
amarelo é sintetizado sob o controle de um alelo domi-
nante Y. Os periquitos bomozigotos para o alelo reces-
sivo y náo sintetizam pigmento amarelo. Em um gene de
segregação independente, o alelo dominante B dirige a
síntese de um pigmento azul. Os homozlgotos recessi-
vos com o genótipo bb náo produzem pigmento azul.
Os periquitos que produzem os dois pigmentos, amarelo
e azul, tèm penas verdes; os que produzem apenas
pigmento amarelo ou azul tém penas amarelas ou azuis,
respectivamente; e os periquitos que não produzem
nenhum dos dois pigmentos são brancos (albinos).
a. Apresente os genótipos dos periquitos verdes, amare-
los, azuis e albinos.
b. É feito um cruzamento entre um periquito verde e
um periquito albino de linhagem pura. Quais são os
genótipos dos periquitos progenitores?
c Quais são os genótipos e fenótlpos da progénie T , do
cruzamento descrito na parte (b) ?
d Se os machos e fémeas da F, forem acasalados, quais são
os fenótlpos previstos para a F2 e em quais proporções?
e. O cruzamento de um periquito verde e um amarelo pro-
duz uma progénie com 12 verdes, 4 azuis,13 amarelos e
3 albinos.Quais sào os genótipos dos progenitores ?
6. Os grupos sanguíneos ABO e MN são fornecidos a seguir
para quatro conjuntos de progenitores (1-4) e quatro fi-
lhos ( a d). Lembre - se de que o grupo sanguineo ABO
.
possui trés alelos,t , Ia e / O grupo sanguíneo MN tem dois
alelos codominantes, M e N. Usando seu conhecimento
sobre esses sistemas genéticos, faça a correspondência
entre cada filho com cada conjunto de progenitores que
poderiam ter concebido esse filho e exclua qualquer con-
junto parental que não poderia tê-lo concebido.
Mãe Pai
ABO MN ABO MN
1
2
0
B
M
N
B
B
M
N
3 AB MN B MN
4 A N B MN
Filhos
ABO
a B
MN
M
b O M
c AB MN
d B N lócus, o genótipo C- permite a expressão do pigmento
7. A cor do tipo selvagem dos besouros cornudos é preta,
embora outras cores sejam conhecidas. Um besouro cor-
nudo preto de uma cepa de linhagem pura é cruzado com
uma fémea verde de linhagem pura. Toda a sua progénie
. ,
Ft é preta Os integrantes da F cruzam aleatoriamente
entre si e são produzidos 320 besouros na Fr A F consiste
^
.
em 179 besouros pretos, 81 verdes e 60 marrons Use esses
dados para explicar a genética da cor do besouro cornudo .
8. Dois genes interagem para produzir razões fenotípicas
entre a progénie F, de um cruzamento diíbrido.Projete uma
via diferente explicando cada uma das razões da F? a seguir
usando genes hipotéticos Re Te supondo que o alelo do-
minante em cada lócus catalise uma reação diferente ou
desempenhe uma ação que leve à produção de pigmento .
O alelo recessivo em cada lócus é nulo (perda de função) .
Comece cada via com um precursor incolor que produz um
fenótipo branco ou albino se não for modificada As razões
são da progénie F , produzida peio cruzamento de organis -
mos do tipo selvagem da F, com genótipo RrTt .
.
^ ^,'
a azul-escuros : azul-claros : brancos
b. brancos : verdes : - amarelos
c. £ verdes : amarelos : azuis : 6 brancos
d. vermelhos : brancos
e. pretos :- jV brancos
f. pretos : -jV cinzentos : albinos
g. brancos: verdes ^
9. O grupo sanguíneo ABO segrega de modo independente
do grupo sanguíneo Rhesus (Rh) e do grupo sanguíneo
.
MN Três alelos, f9 e /, ocorrem no lócus ABO Dois ale-.
los» R, um alelo dominante que produz Rh+, e r, um alelo
-
recessivo para o Rh , são encontrados no lócus Rh e os
alelos codominantes M e N ocorrem no lócus MN. Cada
gene é autossómico.
a. Uma criança com tipos sanguíneos Af Rh- e M nasce
de uma mulher cujos tipos sanguíneos são O, Rh e -
MN e de um homem cujos tipos sanguíneos são A, Rh+
e M. Determine os genótipos de cada progenitor.
b. Qual propor ção de filhos nascidos de um homem com
genótipo f4 /* Rr MN e de uma mulher com Rr NN terá
os tipos sanguíneos B, Rh- e MN ? Explique.
c Um homem com os tipos sanguíneos B,Rh+ e N afirma que
não poderia ser o pai de uma criança com tipos sanguí -
neos O,Rh- e MN. A mãe da criança tem upos sanguíneos
.
A, Rh+ e MN O homem está certo? Explique .
10. Em ratos, o gene B produz a pelagem preta se o genótipo
for B-, mas o pigmento preto não é produzido se o genó-
.
tipo for 66 Em um lócus independente, o gene D produz
pigmento amarelo se o genótipo for D-, mas nenhum pig -
.
mento é produzido quando o genótipo é dd A produção
de ambos os pigmentos resulta na pelagem marrom. Se
nenhum dos dois pigmentos for produzido, a pelagem
é da cor creme. Determine os genótipos dos progenito-
res da ninhada com as seguintes distribuições fenotípicas .
a. 4 marrons, 4 pretos, 4 amarelos, 4 creme
b. 3 marrons, 3 amarelos, 1 preto, 1 creme
c. 9 pretos, 7 marrons
.
11 Nos ratos identificados no Problema 10, um terceiro gene
que segrega de modo independente envolvido na deter-
minação da cor da pelagem nos ratos é o gene C Nesse

dos genes BeD. Ho entanto, o genótipo cc impede a ex-
pressão da cor da pelagem e resulta em ratos albinos. Em
cada um dos seguintes cruzamentos, determine a razão
fenotíplca prevista para a progénie,
a . BbDDCc X BbDdCc
b. BBDdccXBbddCc
c. bbDDCc X BBddCc
d. BbDdCC X BbDdCC
12. Usando as informações fornecidas nos Problemas 10 e
11, determine o genótipo e o fenótipo dos progenitores
que produzem a seguinte progénie:
15. Uma linhagem de plantas com fertilidade reduzida
b. ^I
a. marrons : pretos : albinos
pretos :|creme : jj albinos
c.
*4
creme
marrons : & albinos :
^ amarelos : *
4 pretos : ãí
J
d. marrons : > amarelos
13. O colesterol total no sangue é apresentado como o nú
mero de miligramas (mg) de colesterol por 100 mililitros
(ml) de sangue. A faixa normal é 180-220 mg/ 100 ml. Uma
muta ção genética que altera a função dos receptores de
colesterol da superfí cie celular restringe a capacidade das
células para coletar o colesterol do sangue e levá-lo para as
células. Esse defeito resulta em ní veis elevados de coleste-
rol no sangue. Indivíduos heterozigotos para um alelo mu-
16. No gado, uma mutação autossômica dominante cha-
tado e um alelo do tipo selvagem tém níveis de 300-600
mg/100 ml e os homozigotos para a mutação têm níveis
de 800- 1.000 mg/ 100 ml. Identifique o termo genético que
melhor descreve a herança dessa forma de ní vel de coles
terol elevado e justifique sua escolha.
14. A cor da flor na boca-de-dragão resulta da quantidade de
pigmento antocianina nas pétalas. As flores vermelhas são
Aplica ção e integra ção
17. A cor da pelagem na marta é controlada por dois alelos
codominantes em um único lócus. A pelagem vermelha
é produzida pelo genótipo # ,/? ,, a pelagem prateada é
produzida pelo genótipo RtR2 e a cor platina, pelo Rflr
As manchas brancas da pelagem são um traço recessivo
encontrado com o genótipo ss. A pelagem de cor sólida é
encontrada com o genótipo S-.
a. Quais são os fenótipos previstos para a progénie e suas
proporções para o cruzamento Ssrt ( /?2 X ssRJt
*
b. Se for feito o cruzamento 5sRfR2 X 5 sR ,Rr quais são os
fenótipos da progénie e em que proporções estão pre-
vistos para ocorrer ?
c. Dois cruzamentos são feitos entre as martas. O cruza-
mento 1 é de uma marta de cor prateada sólida com uma
de cor platina sólida. O cruzamento 2 é entre uma marta
prateada manchada e uma prateada sólida. A progénie é
descrita na tabela a seguir. Use esses dados para determi
nar os genótipos dos progenitores em cada cruzamenta
Cruza - Progénie
mento
Platina Prateada Vermelha Platina Prateada Vermelha
manchada manchada manchada sólida sólida sóãda
1 2 3 0 6 5 0
2 3 7 2 4 5 3 com petúnias azuis de linhagem pura e toda a progé-
18. As cepas de petúnias vêm em quatro cores de linhagem
pura: branca, azul, vermelha e roxa. As petúnias brancas são
produzidas quando as plantas não sintetizam pigmento. As
Capí tulo 4 Interação gènlca 139
produzidas por plantas que têm produção plena de anto-
cianina e a flores cor de marfim são produzidas por plantas
incapazes de produzir antodanina. O alelo An J tem ativi-
dade plena na produção de antocianina e o alelo An2 é nulo.
O Dr. Ara B. Dopsis, um famoso pesquisador de genética,
cruza bocas-de-dragáo de linhagem pura vermelhas com
flores de linhagem pura cor de marfim e produz uma pro
génie F, com plantas de flor rosa. Ele propõe que esse resul-
tado é a consequência da dominância Incompleta e cruza
a F, para testar sua hipótese. Quais fenótipos o Dr. Dopsis
prevê que serão encontrados na F2 e em quais proporções?
chama a atenção de um criador de plantas que observa
que as vagens das sementes costumam conter uma mis-
tura de sementes visíveis que podem ser plantadas para
produzir novas plantas e sementes murchas que não
brotam. O criador examina várias vagens de sementes na
linhagem de fertilidade reduzida e conta 622 sementes
viá veis e 204 inviáveis.
a. Qual mecanismo de um único gene explica melhor a
observa ção do criador?
b. Proponha outro experimento para testar o mecanismo
genético proposto por vocé. Se sua hipótese estiver
certa, qual resultado experimental você prevê ?
mada Oexfer produz bezerros de baixa estatura e mem-
bros curtos. Os embriões homozigotos para essa mu-
ta ção têm um desenvolvimento bastante atrasado e
abortam espontaneamente ou nascem mortos. Quais
fenótipos da progénie você prevê a partir do cruzamento
de dois exemplares de gado Dexterl Quais são as propor-
ções previstas para esses fenótipos?
petúnias azuis e as vermelhas são produzidas quando as
plantas sintetizam apenas pigmento azul ou vermelha As
petúnias roxas são produzidas nas plantas que sintetizam
pigmento vermelho e azul. A mistura do vermelho com o
azul cria a cor roxa. Os pigmentos das flores são sintetiza-
dos pela ação gémea em duas diferentes vias bioquímicas
produtoras de segmentos. A via I contém o gene A, que
produz uma enzima para catalisar a conversão de um pig-
mento incolor designado branco, em pigmento azul. Na
via II o produto enzimático do gene B converte o pigmento
,
Incolor designado branco em pigmento vermelho. Os dois
genes segregam de modo independente.
gene A
Via I: Branco! Azul
+ = Roxo
Via II: Branco; Vermelho
geneB
a. Quais são os possí veis genótipos das petúnias verme-
lhas de linhagem pura ?
b. Quais são os possí veis genótipos das petúnias azuis de
linhagem pura ?
c As petúnias vermelhas de linhagem pura são cruzadas
nie F, tem flores roxas. Se a F , autofertilizar e produzir
a Fy qual é a distribuição fenotípica prevista para essa
progénie F3 ? Apresente seu trabalho.
140 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

19. A cor das penas em periquitos é produzida pela mistura
de pigmentos produzidos por duas vias biossíntéticas
exibidas a seguir. Quatro genes que segregam de modo
Independente (A, B, C e 0) produzem enzimas que catali-
.
sam etapas diferentes nas vias Para as questões a seguir,
use uma letra maiuscula para indicar um alelo dominante
produzindo atividade enzimá tíca plena e uma letra mi-
núscula para indicar um alelo recessivo que não produz
enzimas funcionais. As cores das penas produzidas pela
mistura de pigmentos são verdes {amarelo + azul) e roxas
{ vermelho + azul). As penas vermelhas, amarelas e azuis re-
sultam da produção de um pigmento colorido e as penas
brancas resultam da ausência de produção de pigmento
Enzima A Enzima B
Via I: Composto I — Composto II —* Composto III
(Incolor) (vermelho) (amarelo)
Enzima C Enzima D
Via IK; Composto X
(incolor)
— Composto Y
(incolor)
Composto Z
(azul)
.
a Qual é o genótipo de uma cepa de periquito de linha-
gem pura com penas roxas?
.
b Qual é o genótipo de uma cepa de periquito de linha-
gem pura com penas amarelas ?
c Se uma cepa de periquito de linhagem pura com
penas azuis ( aa BB CC DO ) for cruzada com uma linha-
gem pura de penas roxas, preveja os genótipos e fenó-
.
tipos da F, Explique . celulares compartilham os mesmos genes modificados.
d Se os pássaros da F, identificados na parte (c) forem cruza-
dos aleatoriamente, quais fenótipos você prevê na gera -
ção F?? Quais são as razões entre os fenótipos? Explique
20. A braquidactilia do tipo D é uma condição autossômica
dominante na qual os polegares são anormalmcnte
curtos e largos. Na maioria dos casos, os dois polegares
b. Qual fenómeno genético explica os resultados da F 2 ?
Use símbolos alélicos de sua escolha para explicar os
resultados da
22. O xeroderma pigmentoso (XP) é uma condição aulossômica
recessiva caracterizada peia sensibilidade que vai de mode-
rada a grave à luz ultravioleta (UV ). Os pacientes desenvol-
vem multas lesões na pele exposta ao UV e frequentemente
desenvolvem câncer de pele como consequência dessa
exposição. O XP é provocado pela reparação deficiente dos
danos ao DNA provocados pela exposição è luz UV .
.
a Sabe - se que muitos genes estão envolvidos no reparo
dos danos ao DNA induzidos pela luz UV e vários des-
.
ses genes estão Implicados no XP. Qual fenómeno ge -
nético é ilustrado pelo XP?
b. Uma série de 10 linhagens de células epiteliais foi culti
vada a partir de diferentes pacientes portadores de XP .
As células dessas linhagens foram fundidas e os hetero-
cários foram testados quanto á complementação gené -
tica pelo teste de sua capacidade para reparar danos ao
DNA provocados por uma quantidade moderada de ex-
posição à luz UV. Na tabela a seguir, + Indica que a linha -
gem celular da fusão executa uma reparação normal
dos danos ao DNA por mutação e - indica uma repara-
ção defeituosa. Use essas informações para determinar
quantos genes de reparação do DNA sofreram mutação
nas 10 linhagens celulares e identifique quais linhagens
1
2 4 -
.
3 -
4
4 +
O
3 5 4- - - -
I 4

são afetados, mas á s vezes apenas um deles está envol- 25 6 4 - - - - -

4 4

.
vido A genealogia a seguir mostra uma família em que 7 - 4- - 4-
4 4
a braquidactilia do tipo D estâ sendo segregada. Os cír-
culos e quadrados preenchidos representam mulheres
8 4 - + + + +
9
e homens que tiveram os dois polegares envolvidos. Os
símbolos preenchidos pela metade representam mem-
10 4 - 4- 4- 4- - - 4- -
4

bros da família com apenas um polegar afetado. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

Mutado
23. Tr ês cepas de plantas de lentilha com sementes verdes
aparentam ter o mesmo fenótipo. As cepas sã o designa-
,
das G , Gj e G #. Cada cepa de semente verde é cruzada
com uma cepa de linhagem pura com sementes amare -
las, designada Y. A F, de cada cruzamento é amarela; no
entanto, a autofertilizaçáo das plantas da F, produz uma
a. Existe alguma evidência de expressividade variável F2 com proporções diferentes de plantas com sementes
nessa família? Explique. amarelas e verdes, como é demonstrado a seguir .
b. Existem evidências de penetrância incompleta nessa Cepa parental Fenótipo da F, Fenótipo da F.
família? Explique.
.
21 Um camundongo macho e um camundongo fêmea são Verde Amarela Verde Amarela
de cepas albinas de linhagem pura. Eles geram uma pro- G, Y Todas amarelas 2
génie com 10 filhotes, todos eles com pigmentação nor - * i
4
.
mal. Os filhotes da F. são cruzados entre si para produzir
56 camundongos da F ,, dos quais 31 são normalmente
G
G,
2 Y
Y
Todas amarelas
Todas amarelas ^ 16
27
64

pigmentados e 25 são albinos.
a. Usando símbolos claramente identificados para os ale-
los, de sua própria escolha, forneça os genótipos dos
,
camundongos parentais e da F . Qual fenômeno gené-
tico explica esses fenótipos parentais e da Ft ?
a. Para que quantidade de genes existem alelos segregando
no cruzamento G, X Y? E no cruzamento G X Y? E no cru-
, ^
zamento G X Y? Explique sua lógica para cada resposta.
b. Usando os símbolos de alelo A c a, B e b c D c d para
representar os alelos nos genes que est ão segregando,
 Capí tulo 4 Interação gènlca 141

forneça os genótipos das plantas parentais e da F , em c Se a F , dos cruzamentos I e II for acasalada, preveja a
cada cruzamento. razão fenotipica da progénie.
c. Para cada conjunto da progénie Fy forneça uma expli- 27. A sí ndrome de Marfan é um transtorno autossômico do-
ca ção genética para a razã o amarelo : verde. Quais são minante presente em seres humanos. Ela resulta da mu-
os genótipos das plantas de lentilha amarelas e verdes ta ção do gene no cromossomo 15, que produz a proteína
da f 2 no cruzamento G2 X Y ? fibrilina do tecido conjuntivo. Em sua forma do tipo selva-
d. Se as cepas de semente verde G, e G, forem cruzadas, gem, a fibrilina confere elasticidade ao tecido conjuntivo,
quais são o fenótipo e o genótipo da progénie F,? como a cartilagem. No entanto, submetida à mutação,
e. Qual proporção da F , deve ser verde ? Explique. a fibrilina é r ígida e produz uma gama de complicações
f. Se as cepas G 3 e G, forem cruzadas, qual ser á o fenó- fenotipicas, incluindo o crescimento excessivo dos ossos
tipo da F,? longos da perna e do braço, depressão torácica, desloca-
g. Qual proporção da F? terá sementes amarelas? Explique. mento do cristalino e susceptlbllklade ao aneurisma aór -
24. A flor de cor azul é produzida em uma espécie de ipo- tico, que pode levar á morte súbita em alguns casos.
meias quando os alelos dominantes estáo presentes em São observados diferentes conjuntos de sintomas
dois lócus génicos, A e B. (Plantas com genótipo A B - entre vários membros da família, como mostra a genea-
tém flores azuis.) As flores roxas resultam quando um logia a seguir. Cada quadrante de círculos e quadrados
alelo dominante está presente em apenas um dos dois representa um sintoma diferente, como indica a legenda.
.
lócus génicos, A ou B (Plantas com genótipos A-bb e
grO
oaB- são roxas.) As flores são vermelhas quando a planta
é homozigota recessiva para cada gene (isto é, aobà ) .
a. Duas cepas roxas de linhagem pura são cruzadas e
todas as plantas da F, tèm flores azuis. Quais são os
t õúò
genótipos das plantas parentais?
b. Se duas plantas da F, forem cruzadas, quais são os fe-
nótipos previstos e as frequências na F3?
c. Se uma planta da F1 for cruzada com uma das plantas
Ossos longos
Deslocamento do cristalino s Depressão torácica
Aneurisma aòrtico
Como todos os casos de síndrome de Marfan são provo-
cados pela mutação do gene da fibrilina e todos os mem-
parentais de linhagem pura, qual é a razão fenotípica
bros da família com essa síndrome são portadores do
prevista para a progénie? Por que a razão fenotípica é
mesmo alelo mutado, como você explica as diferenças
.
igual Independentemente de qual cepa parental for exibidas na genealogia ?
escolhida para o cruzamento?
28. As leveduras são organismos eucar íótlcos unicelulares
25. Os cruzamentos a seguir são realizados em ipomeías cuja
que crescem em uma cultura como haploides ou diploi-
cor da flor é determinada conforme a descrição no Pro-
des. As leveduras diploides são geradas quando duas
blema 24. Use os dados de segregaçã o para determinar o
cepas haploides se fundem. Sete cepas haploides de le-
genótipo de cada planta parental.
vedura exibem hábitos de crescimento similares: a 25* C
Fenótipos parentais Fenótipos da progénie cada cepa cresce normalmente; mas, a 37* C, elas exibem
a. azul x azul azul: 4 roxo capacidades de crescimento diferentes. A tabela a seguir
4
exibe o padrão de crescimento.
b. roxo X roxo l azul: \ roxo: \ vermelho Crescimento da cepa
c. azul x vermelho $ azul: \ fo*o: 4 vernr>elho A B C D E F G
d. roxo X vermelho ] roxo:\ vermelho 25*C
37*C O I O O O O I
e. azul X roxo |azul: \ roxo: J vermelho
% Crescimento normal
26. Duas cepas de linhagem pura de abóbora produzindo
£ Crescimento lento
O Sem crescimento
fruto amarelo, Y , e Y , são cruzadas com uma cepa de li-
^ bora produzindo fruto verde, G , e a. Descreva a natureza da mutação que afeta cada gene
nhagem pura de abó , dessas cepas de levedura mutadas. Explique por que,
também são cruzadas entre si. São obtidos os seguintes
a 37* C, as cepas B e G exibem hábitos de crescimento
resultados:
diferentes das outras cepas.
Cruzamento P Fi Fz b. Cada um dos pares mutados de leveduras haploides é
I ,
Y ( amarelo) todas ! amarelo : 4 verde fundido e os diploides resultantes são testados quanto
x G| (verde ) amarelas à sua capacidade para crescer a 37° C Os resultados do
experimento de crescimento são exibidos a seguir.
II Y2 (amarelo) todas verdes ] verde : J amarelo
x Gx ( verde ) Dados de crescimento a 37° C
Cepa
III ,
Y ( amarelo) todas
XY2 (amarelo ) amarelas
amarelo :

a. Examine os resultados de cada cruzamento e preveja

^ verde A B C D E F G
AO
quantos genes serão responsáveis pela determinação
da cor da fruta na abóbora. Justifique sua resposta .
b. Usando símbolos claramente definidos à sua escolha,
forneça os genótipos das plantas parentais, da F ( e da
DO ••O
F3 em cada cruzamento.
fommomo
G
142 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Quantos genes diferentes sofrem mutação entre essas
sete cepas de levedura? Identifique as cepas que repre-
sentam cada mutação gènica.
29. Durante seu trabalho como assistente de laboratório nas
. .
instalações de pesquisa do Df O Sophila, um geneticista
mundialmente famoso, você se depara com uma garrafa
Incomum, cheia de moscas -da - fruta. Todas as moscas na
garrafa parecem normais quando estão em uma incuba-
dora configurada a 22* C. No entanto, quando sào passa
das para uma incubadora a 30* C algumas das moscas
lentamente vão ficando paralisadas; e apó s 20 a 30 minu-
tos, elas não conseguem se mexer. Voltando para 22* C,
as moscas restabelecem sua capacidade para se mexer
após 30 a 45 minutos.
Com o incentivo do Dr. Sophila, você estabelece 10
cruzamentos entre moscas que exibem comportamento
incomum. Dentre a progénie de 812 moscas, 598 exibem
o comportamento incomum e 214 não o exibem. Quando
você deixa uma dessas garrafas de teste em uma incuba-
dora a 30* C por tempo demais, descobre que mais de 2
horas em alta temperatura matam as moscas paralisadas.
.
Quando vocé conta isso ao Dr Sophila, ele diz:'Ah ha! Eu
sei qual é a explicação genética para essa condição* Qual é
a explicação dele?
30. O Dr. Ara B. Dopsis e o Dr. C EJlie Gans est ão realizando
cruzamentos genéticos em margaridas. Eles autofertili-
zam uma margarida de flor azul e criam uma progénie de
100 plantas que consistem em 55 de flor azul, 22 de flor
. .
roxa e 23 de flor branca O Dr Dopsis acredita que isso
é o resultado da segregação de dois alelos em um iócus
.
e que a razão da progénie é 1:2:1 O Dr. Gans acha que
os fenótipos da progénie são o resultado de dois genes
* :4.
epistátkos e que a razão é 93
Os dois dentistas pedem para que você resolva seu
cL Usando qualquer uma das 100 plantas da progénie, pro -
ponha um cruzamento que verifique a conclusão que
você propôs na parte (c). As plantas podem ser auto-
fertllizadas ou uma planta pode ser cruzada com outra.
Qual resultado será coerente com a hipótese 1:2:1? Qual
resultado será coerente com a hipótese 93
* :4?
.
31 O tipo sanguíneo ABO humano é determinado por três
alelos (?*, f e i ) cujos produtos génicos modificam o anti-
geno H produzido pela atividade proteica de um gene H
que segrega de modo independente. Uma anomalia rara,
conhecida como'fenótipo Bombaim' é o resultado da in-
teraçã o epist á tíca entre o gene do grupo sanguíneo ABO
e o gene H. Os indivíduos com o fenótipo Bombaim pa-
recem ter tipo sanguíneo O baseado na incapacidade de
os anticorpos anti- A e anti-B detectarem um antígeno. O
tipo sanguíneo O aparente no fenótipo Bombaim deve-
-se á ausência do antígeno H em consequência das muta-
ções recessivas homozigotas do gene H. Indivíduos com
fenótipo Bombaim têm genótipo hh. Use as informações
anteriormente citadas para fazer previsões sobre o resul -
tado do cruzamento exibido a seguir.
WHhXWHh
32. Em coelhos, o albinismo é uma condição autossòmica re-
cessiva provocada pela ausência do pigmento melanina
.
na pele e no pelo A pigmentação é um traço dominante
.
do tipo selvagem Três cepas de linhagem pura de coelhos
albinos, Identificadas como cepas 1, 2 e 3, sáo cruzadas
. ,
entre si Na tabela a seguir, as progénies F e F: sào exibidas
para cada cruzamento. Com base nos dados disponíveis,
proponha uma explicação genética para os resultados .
Como parte integrante de sua resposta, crie genótipos para
cada cepa albiria usando símbolos claramente definidos de
.
sua própria escolha Use seus símbolos para diagramar cada
cruzamento,fornecendo os genótipos da F e da F .
{

conflito realizando uma análise do qunquadrado nos dados Cruzamento Progénie F1 Progénie F2
.
de ambos os mecanismos genéticos propostos Para cada
56 albinos
mecanismo proposto, preencha os valores solicitados no for- Cruzamento A cepa 1 192 albinos
mulário que os pesquisadores forneceram para sua análise, Xcepa 2
Cruzamento B cepa 1 72 pigmentados 181 pigmentados,
.
a Use o formulário a seguir para calcular o qui-quadrado
Xcepa 3 139 albinos
da hipótese 1:2:1 do Dr. Sophila . Cruzamento C cepa 2 34 pigmentados 89 pigmentados,
Fen ótipo Observado Previsto Xcepa 3 72 albinos
Azul 55
Roxo 22
.
33. O Dr. O. Sophila, um amigo intimo do Dr Ara B. Dopsis,
examina os resultados da F2 que o Dr. Dopsis obteve em
Branco 23 seu experimento com a flor íris, descrito na Análise Gené-
Valor do qui-quadrado: dt Valor de p > tica 43. O Dr. Sophila acha que a progénie F 2 demonstra
.
b Use o formulário a seguir para calcular o qui-quadrado que um único gene com dominâ ncia incompleta produ-
da hipótese 93:4 do Dr. Gans. ziu a razão 1:2:1.0 Dr. Dopsis insiste que sua proposta de
Fenótipo Observado Previsto
epistasla recessiva produzindo uma a 9:4:3 est á correta .
Azul 55
.
Para testar sua proposta, o Dr Dopsis examina os dados
da F2 partindo dos pressupostos do modelo de domi-
Roxo 22 nância incompleta de um único gene usando análise do
Branco 23 qui-quadrado. Calcule e interprete esse valor do qui-qua-
Valor do qui-quadrado: df.- Valor dep > drado. O Dr. Dopsis pode rejeitar o modelo de dominân-
c Qual é sua conclusão a respeito dessas duas hipóteses cia incompleta de um único gene com base nessa aná-
genéticas? lise? Explique por quê.
Ligação e mapeamento Capítulo
genético nos eucariotos

APRESENTAÇÃO
5
5.1 Os genes ligados nào segregam de maneira
independente
5.2 O mapeamento da ligação gènica se baseia na
frequência de recombinaçâo entre os genes
5.3 A aná lise do cruzamento-teste de três pontos
mapeia os genes
5.4 A recombinaçâo resulta do Crossing over
5.5 Os genes humanos ligados sáo mapeados
usando a análise do lod score
5.6 A análise da ligaçáo gêmea investiga a evolução
do genoma
5.7 A ligação gènica nos eucariotos haploides é
identificada pela análise das tétrades
5.8 O crossing-over mitótico produz fenótipos
característicos

Thomas Hunt Morgan, laureado com o Prémio Nobel (1933), desco-

briu a herança ligada ao sexo, identificou a ligação gènica, propôs
o crossing-over dos cromossomos homólogos e desenvolveu o con-
ceito de mapeamento genético pela análise de recombinaçâo . dos tão perto uns dos outros nos cromosso-
E m 1933, Thomas Hunt Morgan ganhou o Prémio Nobel de Fi-
siologia ou Medkina — parcialmente pelo seu trabalho esta-
belecendo a teoria cromossômica da hereditariedade (Capítulo 3),
mas também por seu papel na identificação e explicação de liga-
ção e recombinaçâo genética e sua aplicação no mapeamento da
ligaçáo gènica, que discutimos neste capítulo. Morgan, como todos
os cientistas bem- sucedidos, foi auxiliado por colegas dedicados,
incluindo muitos alunos excepcionais e outros cientistas. Entre eles
estava Calvin Bridges, cujo trabalho discutimos na conexão com a
teoria cromossômica da hereditariedade (Capítulo 3), e Alfred Stur-
tevant que, na qualidade de pesquisador-aluno no laboratório de
Morgan, tomou-se o primeiro a usar os dados de ligação gêníca
para montar um mapa genético. Um número de pesquisadores
menos renomados, incluindo a esposa de Morgan, Lilian, também
foi importante na empreitada de pesquisa.
O trabalho de Morgan, de seus colegas e de muitos outros le-
vou à validação de très teorias fundamentais na genética. Primeiro,
validou a teoria cromossômica da hereditariedade (ver Capí tulo 3)
I A ligaçáo gènica ocorre entre genes situa-
mos que os alelos sáo incapazes de segre-
gar de modo independente .
I A ligaçáo gènica produz muito mals progé
nies com fenótipos parentais e muito menos
progénies com fenótipos não parentais que
-
o previsto pelo acaso.
I O crossing-over dos cromossomos homólo-
gos resulta na recombinaçâo dos alelos nos
cromossomos dos gametas.
I Genetícistas usam a frequência de recombF
naçào entre os genes para construir mapas
genéticos identificando a ordem relativa e a
distância entre os genes nos cromossomos.
I Evidências citológicas demonstram que a
recombinaçâo resulta de crossing -over entre
cromossomos homólogos.
I Métodos estatísticos especializados ajudam
no mapeamento dos genes humanos.
I A evolução do genoma pode ser estudada
examinando a ligaçáo génka.
I O crossing-over mitótico é raro e pode resul-
tar no surgimento localizado de fenótipos
característicos.
144 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
e expandiu a teoria mostrando que cada cromossomo
.
carrega vários genes em uma ordem especí fica Segun-
do, validou o conceito de gene como uma entidade físi
ca que é parte integrante de um cromossomo, levando
a um trabalho que ampliou a compreensão da estrutura
gênica e demonstrou que os genes s ão compostos de
nucleotídeos entre os quais pode ocorrer recombinaçâo
Terceiro, o trabalho validou a teoria evolutiva, confir -
mando que as espécies intimamente relacionadas tém
um número similar de cromossomos e uma organização
similar dos genes nos cromossomos. O trabalho levou
a uma expansão da teoria evolutiva que mostrou que a
recombinaçâo proporciona um mecanismo pelo qual a
variação no número de cromossomos e a organização
dos genes nos cromossomos podem advir com a diver-
gência das espécies a partir de um ancestral comum.
As observações e a análise da ligação gènica, recom-
binaçáo e o mapeamento da ligação gênica são o foco
deste capítulo. Também mencionamos a conexão entre
a investigação do mapeamento genético e a evolução
dos cromossomos, mas postergamos a maior parte da
discussão.
5.1 Os genes ligados não segregam
de maneira independente
Os genes situados no mesmo cromossomo sào
chamados genes sinténicos. Quando dois genes sintê-
nicos estão tão próximos um do outro que seus alelos
não conseguem segregar de modo independente, diz -se
que estão ligados um ao outro. Essa ligação gènica pro
duz um padrão caracter ístico de genótipos de gameta
que podem ser quantificados e analisados para mapear
.
as localizações dos genes nos cromossomos Os alelos
dos genes sinténicos podem ser reformulados pelo cros
sing-over de cromossomos homólogos para produzir
cromossomos recombinantes. Nos estudos de ligação
gènica, os cromossomos não submetidos a crossing-
over para reformular os alelos cm estudo sào identifi-
cados como cromossomos parentais ou cromossomos
não recombinantes. Essa descoberta, feita há mais de
um século, abriu as portas para o desenvolvimento do
mapeamento da ligação gènica, que representa grafi
camente as posições dos genes nos cromossomos. Ao
longo do século passado, novos métodos para identificar
e mapear os genes foram acrescentados ao arsenal ana -
l ítico da genética, mas a importância da ligação gènica e
das suas aplicações ao mapeamento continua inalterada.
As razões genéticas mendelianas, como 3:1 e
9:3:3:1, são os produtos da segregação e da segregação
independente dos alelos, para os quais o acaso deter
mina as probabilidades dos genótipos do gameta e os
.
resultados da união dos gametas Mesmo quando esses
genes de segregação independente estão sujeitos a inte-
rações epistá ticas, as leis da probabilidade descrevem a
- distribuição dos alelos participantes e podem ser usadas
para interpretar as razoes resultantes ( ver Seção 4.3).
Muitas vezes, dois genes que segregam de modo inde-
pendente o fazem porque estão situados em cromosso-
mos diferentes.
. Genes sinténicos també m segregam de modo inde-
pendente, se estiverem bem distantes em um cromos-
-
somo. Nessa situa ção, o crossing over ocorre com fre-
quê ncia suficiente entre os genes para randomizar as
combinações dos alelos produzidas durante a meiose.
Entretanto, genes sinténicos muito próximos uns dos
outros não segregam de modo independente, mas con
tinuam a residir no mesmo cromossomo à medida que
-
ele segrega de seu homólogo durante a divisão celular.
Os alelos dos genes ligados tendem a segregar juntos
em vez de segregar de modo independente.
A conexão que faz que os alelos dos genes ligados
segreguem juntos durante a meiose pode ser quebrada
- -
pelo crossing owr. Lembre se de que os cromossomos
homólogos formam sinapses e, consequentemente, o
complexo sinaptonémico na prófase 1 ( ver Figura 3.11).
Os n ódulos de recombinaçâo consistindo em proteínas
e enzimas, que formam parte desse complexo, podem
gerar crossing-over pela fadlitaçào de rompimento, troca
e reunião dos segmentos de cromossomos homólogos.
Essa recombinaçâo dos segmentos cromossô micos refor
mula os alelos portados pelos genes ligados, resultando
-
em gametas haploides que contêm combinações de ale-
los nos genes sinténicos diferentes das que existiam na
célula diploide que começou a meiose.
As observa ções e conclusões a seguir sobre a li -
gação gênica sào essenciais para compreender o fenô-
meno. Nós as discutimos nos pró ximos parágrafos e
- depois expandimos as ideias fundamentais durante o
restante do capítulo.
1. Genes ligados sempre são sinténicos e sempre est ão
situados próximos uns dos outros em um cromos-
- somo. Quando os genes sinténicos estão tão dis -
tantes no cromossomo que seu Crossing over gera
segrega ção independente dos alelos, os genes n ão
est ão ligados .
2. A ligação gènica leva à produção de um n ú mero
bem maior de gametas contendo cromossomos
com combinações parentais de alelos, o que seria
- esperado sob os pressupostos da segregação inde-
pendente, e a um n ú mero bem menor de gametas
contendo cromossomos com alelos que são dife-
rentes das combinações parentais.
3. O crossing-over tem menor probabilidade de ocorrer
nos genes ligados mais próximos entre si do que nos
genes mais distantes entre si em um cromossomo. A
frequê ncia de crossing- over é aproximadamente pro-
- porcional à distâ ncia entre os gametas, uma relação
que permite que os genes sejam mapeados.
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 145

Indicações da ligação génica
A ligação génica pode ser reconhecida comparando
as frequências observadas dos genótipos dos gametas,
ou dos fenó tipos da progénie, com as frequências pre-
vistas sob os pressupostos da segregação independente.
Se os genes forem ligados, os gametas parentais tam-
bém conhecidos como gametas não recombinantes
que contém combinações parentais dos alelos ser ão
produzidos com muito mais frequência do que o pre
.
visto pelo acaso O excesso de gametas parentais tam-
bém pode resultar em uma progénie na qual os fenóti
pos parentais para os genes ocorram com muito mais
frequência do que o previsto pelo acaso . de alelos parentais costumam ficar juntas durante a
A Figura 5.1 ilustra a identificação da ligação génica
pela comparação das frequências dos genótipos de ga
meta para dois cruzamentos, um ilustrando a segrega
ção independente e outro ilustrando a ligação génica.
Na Figura 5.1a, os genes A e B estão em cromossomos
diferentes e os alelos segregam de modo independente.
Os organismos parentais são AABB e aabb e seus game-
tas AB e ab são os gametas parentais. A progénie F ( con
siste em diíbridos ( AaBb ) e a segregação independente
prevê que esses diíbridos produzirão quatro gametas
geneticamente diferentes em uma razão de 1:1:1:1 Re -
pare que a frequência dos gametas parentais ( AB e ab ) é
50% e que a frequência dos gametas não parentais { Ab e
aB ) também é 50%.
A Figura 5.1b ilustra a produção dos genótipos dos
gametas nos genes sintènicos De E ligados. O progeni-
tor DDEE produz gametas parentais DE e o progenitor
ddee produz gametas de. A progénie F, diíbrida consiste
— cm DdEe , portando os genes D e E cm um cromossomo
— e d e e. no homólogo. Essa organização de alelos pode
ser escrita na forma DE/det com a barra (“O separando
- os alelos portados pelos membros do par de cromos-
somos homólogos. Com a ligação génica, a taxa de re-
- combinação entre os alelos é baixa e as combinações
meiose, levando à produção de gametas parentais ( DE e
- de ) em uma frequência combinada bem maior que 50%.
-
- A baixa frequência de crossing over nos genes intima-
mente ligados resulta na produção de gametas recombi-
nantes, ou não parentais (De e dE) , em uma frequência
combinada bem menor que 50%.
A ligação génica completa é observada quando não
- ocorre qualquer recombinação entre genes ligados. A li-
gação génica completa pode ser identificada, por exemplo,
nos casos em que um diíbrido produz dois gametas igual-
. mente frequentes contendo apenas combinações de alelos
parentais e nenhum gameta recombinante (Figura 5.2a).

( a ) Segrega ção independente (b) Ligação génica

Centr ómero
A
Os gene sintènicos
P *
estão próximos uns
dos outros.
DOEE (DE/ DE ) ddee (de/de)

.
I I
Formação do gameta Formação do gameta Formação do ga meta Formação do gameta
1
AB
B
ab
b
DE
^ DE
União dos
* de
d
*
União dos gametas
oametas

A B
Os genes segregam de O oossing-cvpr pode
F, modoíndependente. ocorer entre homólogos.
a b
AaBà Ddte (De/de)

Formação do gameta Formação do gameta

i I
Genótipo Fenótipo Frequência Genótipo Fenótipo Frequência
A B DE
AB = 25% DE » 25%
a b - Gametas de - Gametas
ab = 25% parentais ( ** 50%) de » 25% parentais (» 50%)
aB

Ato
a
A
B
b - 25%

= 25%
- Gametas não
parentais ( “ 50%)
De
dE
De
dE
« 25%
« 25%
- Gametas não
parentais {« 50%)

A segregação independente prevê 25% de cada tipo de gameta com Os gametas parentais são bem mais frequentes
gametas parentais e não parentais, com cada um totalizando 50% . e os não parentais oem menos frequentes do
que o previsto pela segregação independente.

Figura 5.1 Segregação independente versos ligação génica. (a) Para esse dilbrido, a previsão é de quatro gametas geneticamente
diferentes na proporção de 25% cada um quando os genes segregam de modo independente, (b) Quando os genes estão ligados,os
gametas parentais são muito mais frequentes do que o previsto peio acaso e são mais frequentes que os gametas não parentais.
146 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

( a ) Liga çã o gê nica completa (sem crossing-over ) ( b ) Liga ção gé mea incompleta [crossing-overem 20% òos gametas)
Centrómero
RT r t
Os genes sintênicos
.
são ligados P x
r t
Genes ligados

fg/fg RT/RT rt/rt

A barra OH separa
I
Formação do gameta Formação do gameta os alebs em cada Formação do gameta Formação do gameta
homólogo. I RT J
FG f rt
FG União dos RT União dos rt
'
^^ - aametas gametas

Nenhum
FG -
crossing aver R T O Crossing cuerocone
F, entre Fi em 20% cias meioses;
9
cromossomos
homóicços. r t -
nenhum crossing o^er
ocorre nos outros 80%.
FG/ fg KTM
I I
Formação do gameta Formação do gameta
\ l
Genótipo Fenótipo Frequência Genôti Fenótii Frequência
FG RT
FG
f
= 50% — Gametas RT
r f
= 40% - Gametas
f9 = 50% parentais ri
R t
= 40% =
parentais ( 80%)

Todos os gametas contém cromossomos parentais. Rt = 10% - Gametas

r T
rT = 10% recombinantes (* 20%)

-
(c) Ligação génka incompleta ( crossing over em 40% dos gametas) Os gametas parentais são 80% e os recombinantes são
20% nesses geres
M n m N
P x i i O Genes ligados F igura 5.2 Ligação génka completa versus
i i o incompleta, (a ) Os genes que exibem ligação génka
M n m N
Mn/ Mn mN / mN completa não recombinam e todos os gametas são parentais.
I ( b) Os genes ligados com frequência de 20% de recombinaçáo
Formação do gameta Formação do gameta produzem 20% de gametas n ão parentais e 80% parentais.
M n m N \ (c) Os genes ligados com frequência de 40% de recombina çáo
à i O produzem 60% de gametas parentais e 40% não parentais.
Mn mN
iniá o dos gametas
A ausência dc recombinaçáo entre os homólogos normal-
mente tem uma base biológica específica. Certos organis-
M n
O cmssirsg-orer ocorre mos, incluindo os machos de Drosophila e outros machos
em 40% das meioses na ordem dos insetos Diptera (da qual a Drosophila é
i O •
m N
Mn/ mN
membro), exibem ligação génka completa. Não há recom -
I binaçáo entre os cromossomos homólogos nessas moscas
Formação do gameta macho. A base biológica da ausência de recombinaçáo
i nesses organismos ainda é desconhecida.
Genótipo Fenótipo Frequência A ligaçã o génica incompleta é bem mais comum
M n
Mn = 30 - Gametas
% nos genes ligados. A recombinaçáo resultante entre os
m N homólogos produz uma mistura de gametas parentais e
mN i IO = 30% parentais ( 60%) não parentais. No diíbrido da exibido na Figura 5.2 b, Ft
M N
MN

m/i
m n
»
i O = 20%
20%
Gametas
—
recombinantes (= 40%)
a recombinaçá o produz quatro gametas geneticamente
diferentes, dos quais dois são parentais e dois sã o n ã o
parentais ( recombinantes) Os dois gametas parentais .
Os gametas parentas são 60% e os t êm , cada um, aproximadamente a mesma frequ ê ncia
recombinantes são 40% nesses geres. e seu total é muito maior que 50% de todos os game -
.
tas Nesse exemplo, a frequência de cada gameta pa
rental ( RT e rt ) é 40% e a frequência total dos gametas
-
parentais é 80%. Os gametas recombinantes, que tê m
combinações de alelos n ã o parentais, são aproxima -
damente iguais cm frequência entre si c constituem
muito menos de 50% de todos os gametas. Nesse caso,
 Cap ítulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 147

um total de 20% dos gametas é recombinante: 10% dos
gametas são Rt e 10% são rT. Como as proporções rela -
tivas dos gametas parentais e recombinantes dependem
-
da frequência do crossirtg over dos genes ligados, as pro-
porções sào diferentes entre os pares de genes ligados.
Repare que as porcentagens de gametas diferentes obti
das para o cruzamento na Figura 5.2c são diferentes das
encontradas na Figura 5.2b.
A frequência de recombinação, expressa como a va
riável r , define a taxa de recombinação de um determinado
par de genes ligados. O valor de r é expresso como
n ú mero de gametas recombinantes
r=
n ú mero to9 £ iBoni
A frequê ncia de recombinação varia entre os dife
rentes pares de genes sintênicos, dependendo aproxi
madamente da distâ ncia que separa os genes no cro
mossomo. Comparando a Figura 5.2b com a Figura 5.2c,
por exemplo, vemos que a frequência de recombinação
é 20% ( r = 0,20) na Figura 5.2b e 40% (r = 0,40) na Figura
5.2c. A maior frequência de recombinaçã o na Figura
5.2c, em comparação com a Figura 5.2b, é mais prova
velmente a consequência de uma distâ ncia maior entre
os genes N e Aí do que entre os genes T e R. A corre
lação entre a frequência de recombinaçã o e a distância
entre os genes pode ser expressa de duas maneiras equi -
-
valentes: ( 1) o crossing over ocorre em uma taxa maior
entre os genes separados por uma distâ ncia maior e em
uma taxa menor nos genes mais próximos uns dos ou -
tros; e ( 2) os genes ligados com frequências de recom
binação mais altas sào mais distantes uns dos outros do
que os genes ligados com frequências de recombinação
mais baixas. Existem algumas advertências a essa gene -
raliza ção, como discutimos nas seções posteriores.
Observa çã o gen é tica Quando os genes são ligados,
os gametas carregam combinações parentais de alelos com
muito mais frequência do que o previsto pelo acaso e carre-
gam combinações nã o parentais com muito menos frequên -
cia que o esperado. A frequência de recombinaçã o (r) entre
genes ligados expressa a proporção dos gametas recombinan
tes ( não parentais) e as frequências de recombina ção aumen -
tam com a distâ ncia entre os genes.
Quando os traços foram estudados separadamente,
os genes da cor da flor e do formato do pólen obedece-
—
ram às regras da segregação gerando razões fenotí pi
cas 3:1 entre a F por exemplo. Mas Bateson e Punnett
^
-
partiram para o estudo de ambos os traços nas mesmas
- plantas, com a intenção de testar a lei da segregação in
dependente. Eles cruzaram plantas de linhagem pura,
-
-
flores roxas e grão de pólen comprido { PPLL ), com plan
tas de linhagem pura, flores vermelhas e grão de pólen
-
-
redondo { ppll ) Conforme previsto, a F, consistiu exclusi-
vamente em plantas de flores vermelhas e grão de pólen
comprido, e essas plantas foram cruzadas para obter a
progénie F.r Mas, então, em vez da razão 9:3:3:1 prevista
- pela hipótese da segregação independente, uma parcela
-
-- muito maior que o esperado da progénie F2 exibiu com
binações parentais de fenótipos e muito menos plantas
exibiram combinações não parentais (Tabela 5.1 ).
Na F2, Bateson e Punnett observaram que os dois fe-
— —
nótipos parentais roxo comprido e vermelho redondo
estavam muito acima das frequências previstas e que
- melho comprido
— —
os dois fenótipos não parentais roxo redondo e ver-
estavam muito abaixo das frequên -
cias previstas. Essa obser\ração levou Bateson e Punnett a
- sugerirem que as duas combinações de alelos carregadas
— —
pelos progenitores PLepl permaneciam juntas fre-
quentemente quando eram transmitidas pelos gametas
para as gerações subsequentes por intermédio de um me-
canismo desconhecido. Bateson e Punnett descreveram
- esses alelos como “ unidos". Eles descreveram o surgi
mento de novos genótipos não parentais na F2 como um
-
indicativo de "repulsão” dos alelos parentais para produ -
zir fenótipos n ão parentais na progénie.
Em 1911, Morgan realizou o primeiro de muitos
cruzamentos que confirmaram e explicaram a observa -
ção de união e repulsão identificadas por Bateson e Pun-
nett. Morgan , nessa época, identificou vários genes no
cromossomo X da mosca-da -fruta, incluindo o w ( olhos
brancos) e o m ( asa vestigiais). A Figura 5.3 ilustra que
Morgan cruzou uma fémea de linhagem pura de olhos
brancos e asas vestigiais ( wm/ wm ) com machos ho-
- mozigotos do tipo selvagem de olhos vermelhos e asas
completas ( w^ m^ /Y ). A barra , /, usada nesses genótipos,
separa os alelos carregados pelos cromossomos X homó-

Tabela 5.1 Bateson e Punnett observaram e previram

A descoberta da ligação gênica
-
fenótipos nas ervilhas de-cheiro da F,
William Bateson, um dos primeiros defensores da
genética mendeliana, e Reginald Punnett, cujo nome Fen ótlpo Genótipo Quantidade na prog é nie
batizou o quadrado de Punnett, divulgaram uma sé rie Observados Previstos ( razão 9.33:1)
de experimentos em ervilhas-de-cheiro em 1905, 1906 Roxo,
P-L- 4.831 (6.952 )(9/16) = 3.910,5
e 1908. Esses experimentos inauguraram um novo ca - comprido
Roxo,
pítulo na genética chamando a atenção para a ligação P-ii 390 (6.952 )( 3/16) = 1.303,5
gênica. Bateson e Punnett estudaram os traços da cor redondo
da flor e do formato dos grã os de pólen nas ervilhas- de - Vermelho,
ppL- 393 (6.952)( 3/16) * 1.303,5
-cheiro, primeiro como traços independentes e depois
juntos nas mesmas plantas.
comprido
Vermelho,
ppll 1.338 (6.952)0 /16) = 434,5
redondo
6.952 6.952,0
148 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

K
Figura 53 Análise de Morgan da
ligação gênica dos genes ligados ao
X para a cor dos olhos ( w ) e o formato
.
das asas ( m ) O nú mero da progé nie
-
do cruzamento teste com cada fenótipo
é comparado com os valores previstos, w m m*
que sáo determinados pela suposição da P
segregação independente dos genes. w m
wm/wm 9 w*m*/ f a
Olhos brancos Olhos vermelhos
Asas vestigiais Asas completas

l I

9 wm /Y <3
Olhos vermelhos Olhos brancos
Asas completas Asas vestigiais

Fenótipos/Genótipos
N ú mero N ú mero
Fêmeas Machos observado previsto
w m’ *
w' m *

kv m
*
791 (2.441)( ) • 610,25

*v'm‘Avm w*m 7V
Olhos vermelhos Olhos vermelhos
Asas completas Asas completas

750 (2.441)(J) = 610,25

wm /wm wm/V
Olhos brancos Olhos brancos
Asas vestigiais Asas vestigiais
w' m w’ m

iv m
445 ( 2.441)( )
^ 610,25

w' m /wm w' m /Y

Olhos vermelhos Olhos vermelhos
Asas vestigiais Asas vestigiais
w m' w m *

455 (2.441)(i) = 610,25

iv m
wm’ /wm wm' /Y
Olhos brancos Olhos brancos
Asas completas Asas completas 2.441

445 455
Porcentagem de recombinantcs 0369
2.441

logos na fêmea ou separa o cromossomo X e o cromos

somo Y no macho. A progénie F, consistiu em fémeas
diíbridas do tipo selvagem e machos homozi-
.
gotos de olhos brancos e asas vestigiais { wm/Y )
Depois, Morgan produziu uma geração F2, pre-
vendo uma razã o 1:1:1:1 baseada no pressuposto da se-
gregação independente dos genes. Em vez disso, Mor
gan encontrou um desvio substancial das previsões.
Assim como no experimento de Bateson e Punnett,
- Morgan observou que os fenótipos parentais predomi
naram (791 + 750 = 1.541 ou 63,1%) e que foi produ
--
zido um n úmero de fenótipos não parentais menor que
o previsto. A frequência de recombinação nesse experi -
mento é r = 445 + 455/2.441 = 0,0369 ou 36,9%. Repare
que os dois fenótipos parentais são observados em uma
- razão aproximada 1:1 (791:750), assim como os fenó-
tipos não parentais (455:445), conforme o esperado a
partir da segregação.
 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 149

m* m* m m m' m' m m m* m’ m m m* m m' m

w 1
w w w w' w' w w w' w w w w w w w‘

Cromossomos homólogos Formação do complexo Conclusão do crossing-over Formação dos gametas (final
(início na pr ófase I) sina ptonémico (início da prófase I) ( final da metáfase I ) da telófase II. quatro gametas)

-
Figura 5.4 Hipótese de crosslng ovtr de Morgan. Cada homólogo contém Iniclalmente
cromátides irmãs idênticas. Um ú nico crotsing -over produz duas cromátides recombinantes.
O aosiing^Jrtraiò gametas
parentais e não parentas
após a segregação
A realização da meiose produz dois gametas parentais e dois recombinantes.

Com base nesse resultado, Morgan propôs que os
fenótipos parentais são produzidos quando os gametas
da fémea F, carregam cromossomos com os mesmos ale-
los que os progenitores, neste caso, w* m' e wm. Os ovos
contendo alelos parentais se unem com espermatozóides
que carregam i v e m n o cromossomo X ou que carregam
o cromossomo Y e os fenótipos parentais (os mesmos
fenótipos das moscas da geração P) são produzidos. De
modo oposto, fenótipos não parentais são o resultado da
recombí naçào entre cromossomos X homólogos durante
a meiose da fémea da F, ( Figura 5.4). A produção de cro-
mossomos recombinantes portadores de w* m ou wm*
exigiu a reorganização ( recombínaçào) dos cromossomos
X homólogos. A união de ovos contendo cromossomos X
recombinantes com os espermatozóides produziu uma F2
com fenótipos não parentais. Morgan confirmou essa ex
cessiva contribui apenas com os alelos recessivos para a
progé nie do cruzamento- teste. Por outro lado, a mosca
diíbrida pode contribuir tanto com um alelo dominante
de um gene, situação em que a progé nie exibe o fen ó -
tipo dominante, como com o alelo recessivo, produ -
zindo, assim, a forma recessiva do traço.
Em um experimento, Morgan usou a análise do cru -
zamento-teste para examinar a ligação gênica dos genes
autossòmicos que afetam a cor dos olhos e o formato das
asas. A cor dos olhos na DrosophiLi é vermelha se um alelo
autossômico dominante pr' estiver presente, enquanto a
cor dos olhos roxa recessiva é produzida quando o único
alelo presente é o pr. A asa completa é o produto de um
alelo autossômico dominante vg* e sua contraparte reces-
siva, a asa vesrigial, é determinada pelo alelo vg. Morgan
- cruzou moscas-da fruta de linhagem pura, para olhos ver-
'

plicação através do exame de muitos outros pares de genes
ligados no cromossomo X da mosca-da- fruta.
Detecção da ligação gênica autossõmica
por meio da análise de cruzamento-teste
Voltando sua aten ção para os genes autossòmicos
e empregando um retrospecto 20/ 20, Morgan percebeu
que Bateson e Punnett detectaram a liga ção génica, mas
não conseguiram explicá - la porque, com relação à con -
cepção do experimento, eles fizeram o cruzamento er
rado! A progénie F2 no experimento de Bateson e Pun
nett caiu em quatro classes fenotipicas, mas três dessas
classes continham vá rios gen ótipos, em consequência
das relações de dominância entre os alelos (ver Figura
2.11 ). Bateson e Punnett não conseguiram determinar
quais alelos na progénie derivaram de cada progenitor
da F; porque não tinham meios para apurar a alta fre
qu ência das combinações parentais dos alelos e a baixa
frequência de recombinantes nos gametas da Fr
Morgan percebeu que a ligação dos genes autossô
micos na Drosophila poderia ser totalmente interpre-
tada pelo uso da an álise do cruzamento- teste de dois
pontos , na qual uma mosca diíbrida da Ft é cruzada
com um parceiro de linhagem pura com os fenótipos
recessivos. Os “dois pontos" nessas análises são os dois
genes que estão sendo testados. Na análise do cruza
mento- teste de dois pontos, a mosca homozigota re -
melhos e asas completas com moscas de linhagem pura,
.
olhos roxos e asas em miniatura Figura 5.5a ) A F, consis-
tia uniformemente em olhos vermelhos e asas completas
( pr \>g / pr vg). Depois, Morgan fez um cruzamento-teste
de fêmeas diibridas da F, com machos de olhos roxos e
asas vestigiais ( pr vg/ pr vg). Nesse cruzamento, os ma -
chos contribuíram apenas com alelos recessivos ( pr e vg),
mas as fémeas podiam produzir qualquer um dos quatro
genótipos de gameta. Os alelos do gameta feminino con -
- trolaram, assim, o fenótipo da progénie do cruzamento-
teste. Se a fémea contribuía com um alelo dominante
- para a progénie, o fenótipo para o traço era dominante;
de modo oposto, se o alelo doado pela fêmea fosse reces-
sivo, o fenótipo era recessivo. Os fenótipos da progénie do
cruzamento- teste corresponderam diretamente aos ale-
los doados pelas fémeas da F ( , com isso tornando possí -
- vel identificar de forma inequívoca o conteúdo alélico dos
cromossomos nos gametas femininos.
Sob o pressuposto da segregação independente, as
- fé meas diibridas produziriam quatro gametas igualmente
-
frequentes e a progénie do cruzamento teste deveria ter
os fenótipos distribuídos em uma razão 1:1:1:1 (ver Fi -
gura 2.13). No entanto, com a ligação génica, as combi-
nações parentais dos alelos ocorrem preferencialmente
nos gametas, produzindo uma progénie do cruzamento-
- - teste com um excesso significativo de fenótipos paren-
tais e um grande déficit de fenótipos não parentais.
 150 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) (b)
F, íèmeas de asas Machos òe asas vestlgials
p completas do cruzamento-teste
pr
pr
vg pr formação
vg' pT
Olhos vermelhos
vg pr
Olhos roxos
j?- :pi >C > dos
gametas
Asas completas Asas vestigiais vg pr

\ / F, Gametas femininos Gametas masculinos

F,
Frequência
i Frequência
vg pr observada vg pr prevista

pr
*
' pr Olhos
vg pr vg pr 0,4015 'vermelhos 0,25
Olhos roxos
Asas completas
Olhos vermelhos vg pr
Asas completas Asas vestigiais Parentais
89,3% w
Pr Olhos roxos
. [0.4015 Asas vestigiais 0 25
,

—
F, i I I vg pr

** *** •*» Recombinantes

0,0535
pr

vg pr
roxos
Asas completas

Olhos
0,25

vg pr vg pr vg pr vg pr
Olhos vermelhos Olhos roxos Olhos vermelhos Olhos roxos
Asas completas Asas vestigiais Asas vestigiais Asas completas
L
1.339 1.195 151
T feito um cruzamento-teste de f êmeas difbridas da F i
1.339 + 1.195 151 + 154
2.839 0,893
2.Ã39
Parentais Recombinantes
A progénie do cruzamento- teste de Morgan exibiu
os quatro genótipos previstos, mas em n ú meros que se
desviaram radicalmente das proporções mcndclianas
esperadas. Entre a progénie do cruzamento- teste, 89,3%
era parental e apenas 10,7% cra recombinante. As clas-
ses n ã o recombinantes da progénie foram encontradas
em uma razão aproximada de 1:1 (1.339:1.195), assim
como as classes recombinantes ( 154:151 ); desse modo,
os dois cromossomos parentais foram transmitidos com
igual frequência , assim como ocorreu com os cromos-
somos recombinantes. A Figura 5.5b mostra que, entre
os 89,3% de gametas femininos parentais, a metade, ou
44,65%, deve ser de cada tipo parental. De modo simi
lar , entre os 10,7% de gametas recombinantes, cada tipo
10,7% pr*
0.0535 vermelhos 0,25
Asas vestigiais
vg pr
1 ,0000 1,000
Figura 5.5 Análise do cruzamento-teste de Morgan
154 I da ligarão gênica entre genes autossó micos. (a) É
{ pr vgVpr vg ) com machos homozigotos para olhos
•0,107
roxos recessivos mutados e asas vestigiais (pr vg/ pr vg ),
permitindo a identificação da progénie como portadora de
um cromossomo parental ou recombinante. (b) Um ú nico
crossing -over durante a meiose das fémeas leva a gametas
parentais e recombinantes nas frequ ências especificadas
pela recomblnação ou pelo acaso, e a união dos gametas
produz a progé nie do cruzamento-teste .
das divisões meióticas. Muito mais de 50% dos ga -
metas contêm combinações parentais de alclos.
3. A frequência de recombinaçào varia entre os genes
ligados e é aproximadamente proporcional à dis-
tâ ncia entre os genes cm um cromossomo.
A An álise Genética 5.1 leva você através da identifi -
cação da progénie parental e recombinante e da deter -
- minação da frequência de recombinaçào.

recombinante deve ter uma frequê ncia de 5,35%.
Nos anos imediatamente seguintes à explicação da
ligação génica de Morgan , outros biólogos que trabalha
vam com espécies de plantas e animais usaram a análise
do cruzamento- teste para verificar essa hipótese. Os
resultados coletivos dessas observações experimentais
podem ser resumidos da seguinte forma:
1. A ligaçã o gênica é uma relação f ísica entre os genes
situados perto um do outro em um cromossomo.
2. A recombinaçào ocorre entre os genes ligados nos
cromossomos homólogos em muito menos de 50%
5.2 O mapeamento da ligação gênica
se baseia na frequência de
- recombinaçào entre os genes
Um resultado importante dos estudos de Morgan
sobre os genes ligados na Drosophila foi o reconheci -
mento da ocorrê ncia de mais progénie parental do que
recombinante e de que a proporção dos recombinan -
tes variava consideravelmente de um par para o outro.
Morgan resumiu essa ideia cm 1911, afirmando que “ As
proporções resultantes nào são tanto a expressão de um
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 151

AN ÁLISE GENÉTICA
Nos tomateiros ( Lycopenkon esculentum ), a cor vermelha do fruto (T-) é dominante em relação à
.
cor tangerina ( tt ) e a folha lisa (H-) è dominante em relação à folha peluda [ hh) Os dois genes estão
situados no cromossomo 7 e tém uma frequência de recombinaçào de 20% Uma planta de linha- .
gem pura que produz frutos cor de tangerina e folhas lisas é cruzada com uma planta que produz
. ,
frutos vermelhos e folhas peludas As plantas da F partldpam de um cruzamento-teste com uma
.
planta de linhagem pura de frutos cor de tangerina e folhas peludas Quais são os genótipos, fenóti-
pos e proporções fenotípicas previstas para a progénie do cruzamento- teste?

Estrat égias de solu çá o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado
por esse problema e explique a
natureza da resposta solicitada
.
1 Este problema diz respeito à previsão da progénie do cruzamento teste para genes -
ligados. A resposta exige previsão da frequência de cada possí vel categoria da pro -
. génie do cruzamento -teste a partir das informações fornecidas sobre a frequência
de recombinaçào entre os genes.

2. Identifique as informações crfti- .

ç as fornecidas no problema.
Deduzir
.
3 Identifique os genótipos das
plantas parentais e seus gametas
2 Os fenótipos dominante e recessivo, os genótipos das plantas parentais de linha-
gem pura e a frequência de recombinação entre os genes que controlam os dois
traços são fornecidos no problema .
.
3 Cada planta progenitora é de linhagem pura para um traço dominante e um traço
. recessivo:
Tangerina, lisa « ttHH
Vermelha, peluda = TThh
Gametas parentais = todos tH de uma planta progenitora e todos Th da outra

4 Identifique o genótipoe o fenótipo 4. As plantas da F. são diíbridas ( tH/Th ) e têm os dois fenótipos dominantes ( vermelho
das plantas da F, e determine a or- e Uso). As plantas progenitoras de linhagem pura doaram cromossomos portadores
ganização dos aletos parentais. detHeTh.
Solucionar

.
5 Determine o número e a frequên- .
5 Quatro gametas geneticamente diferentes são possíveis: tH, Th, TH e th Entre .
cia dos gametas da Ft, dada a fre- esses gametas, 20% serão recombinantes e 80% parentais (100% - 20% = 80%) O .
quência de recombinaçào de 20% acaso prevê que os dois gametas parentais (fHe Th ) são produzidos com a mesma
.
frequência Do mesmo modo, os dois gametas recombinantes ( TH e th ) são produzi-
Dtca: cotr a .
çêfKà as com- dos com igual frequência. As frequências previstas para os gametas são
bustões parentais dos «4©s vao bem
*
maores que SC <Jos gametas . <
Parentais: íH = 0,80)(1/2) = 0,40
* Th * (0,80)0 /2) 0,40
Recombinantes: TH * (0,20){l/2) = 0,10
th = (0,20)0 /2) m 0,10
.
6 Determine o resultado esperado .
6 A progénie do cruzamento-teste deve ter 40% de tangerina, liso e 40% de verme -
para o cruzamento teste. lho, peludo; 10% de vermelho, liso e 10% de tangerina, peludo.
Progéniedo
th 0.0) -
cruzamento teste
Tangerina
0,40 fW tHAh 0,40 40%
iso
Parentais
Vermelho,
0.40 Th Th/th 0.40 40%
peludo

0,10 TH 0,10 Vermelho,

THAh 10%
liso
Recombinantes -
Tangerina
0,10 th thAh 0,10 10%
peludo

Para pratkar mais, ver Problemas 5, 6 e 12 .

152 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
sistema numérico quanto a localização relativa dos fa
.
tores ( genes) no cromossomo" Morgan estava dizendo
que o acaso (segregação independente) nã o era o único
fator a determinar as proporções relativas dos gametas
produzidos por um organismo, pois a grande proximi
dade dos genes ligados em um cromossomo levava a
uma proporção muito mais alta de gametas parentais
e a uma proporção muito mais baixa de gametas não
parentais que o previsto pelo acaso. Sua intuiçã o estava
correta. Nesta seção, examinamos métodos para cons
truir mapas genéticos a partir de dados de recombina
çào de dois genes ligados e, na próxima seção, passare-
mos a considerar o mapeamento de três genes ligados.
O primeiro mapa de ligaçã o gênica
No contexto da biologia do in í cio do século XX, a
ideia de Morgan de que os genes estavam nos cromos-
somos não era inédita. Por exemplo, Sutton, Boveri e
outros tinham observado a ligação entre a transmis
são hereditá ria e a divisão cromossô mica. Mas os bi
ólogos da época n ão conheciam a estrutura dos genes
ou como eles eram codificados nos cromossomos (ver
Seção 3.4 ). Morgan foi o primeiro a demonstrar que os
genes estão nos cromossomos, e sua proposta de que a
frequê ncia de recombinação de um par de genes liga
dos poderia corresponder à distância entre esses genes
em um cromossomo era uma ideia inédita.
Morgan considerava os genes como habitantes de
posições fixas nos cromossomos. Assim como as cida
des ao longo de uma rodovia , a ordem dos genes podia
ser determinada e suas distâncias podiam ser quantifi
cadas. Se essa hipótese estivesse correta, ele pensava , as
frequências de recombinação poderiam ser usadas para
produzir um mapa de ligação gênica retratando a ordem
dos genes ao longo de um cromossomo e para calcular
um índice quantitativo das distâ ncias lineares entre os
genes. F.nquanto Morgan discutia suas ideias sobre fre-
quência de recombinação e distâncias entre genes, Alfred
Sturtevant, então um aluno de graduação que trabalhava
no laboratório de Morgan, teve uma epifania. Em um
livro de 1965, Sturtevant recordou o momento:
No final de 1911, em uma conversa com Morgan,
percebi repentinamente que as variações na força da
ligação, já atribuídas por Morgan ás diferenças na se
paração espacial dos genes, ofereciam a possibilidade
de determinar as sequências na dimensão linear de
um cromossomo. Fui para casa e passei a maior parte
da noite (em detrimento da minha outra tarefa de gra-
duação) produzindo o primeiro mapa cromossõmico.
Sturtevant usou os resultados de vários experimen -
tos de cruzamento-tcstc de dois pontos em cinco genes
ligados ao X na Drosophila para criar o primeiro mapa
de ligação gênica. Ele baseou sua abordagem de criação
dos mapas na ideia de que as frequências de recombina
ção menores indicavam genes residindo mais próximos
uns dos outros no cromossomo e de que as frequências
de recombinação maiores indicavam distâ ncias maio-
- Tabela 5.2 Dados de recombinação de Sturtevant para
dnco genes ligado ao X na Drosophlla
*
Pares de genes Frequência de
- recombinação
Amarelo (y) e branco M 214/ 21.736 * 0,010
Amarelo (y) e vermelho-daro ( v) 1.464/4.551 = 0,322
Vermelho-claro ( v) e branco ( w ) 471 /1.584 = 0.297
- Vermelbo-claro ( v) e vestigials ( m ) 17/573 0,030
- Vestigiais ( m ) e branco ( w) =
2.062/6.116 0.337
Branco ( w) e rudimentar ( r) 406/898 = 0,452
Rudimentar (r) e vermelho-claro (v) 109/405 0,269 =
res entre os genes no cromossomo. Para construir seu
mapa gen ético, Sturtevant usou os dados na Tabela 5.2.
Ele terminou o mapa de recombinação conforme ilus-
- .
trado na Figura 5.6 Ao longo do século desde que Stur-
tevant compilou seu mapa pela primeira vez, milhões de
- - -
progénies da mosca da fruta foram analisados quanto à
recombinação do cromossomo X. Os dados acumula -
dos levaram a ligeiras modificações nas frequências de
recombinação estimadas por Sturtevant, mas n ão ne-
cessitaram de quaisquer alterações na ordem dos genes.
- Sturtevant montou seu mapa usando a lógica do tipo
demonstrado nas quatro etapas a seguir:
1. Dos genes testados , o par com a menor frequência de
- recombinação e, portanto, em maior proximidade,
consiste no gene que produz olhos brancos ( w) e no
gene que produz o corpo amarelo (y). Com uma fre-
- quência de recombinação de apenas 1%, eles devem
estar praticamente no mesmo ponto no cromossomo.
2. O gene vermelho-claro ( v ) é mais distante do
amarelo (32,2% de recombinação) que do branco
(29,7%), sugerindo a ordem y- w - v.
3. O gene vestigial ( m ) é mais próximo do vermelho-
claro (3% de recombinação), mas é mais distante
do branco (33,7% de recombinação) que o verme-
lho-claro. A adição do vermelho-claro ao mapa dos
genes produz a ordem y - w -v -m.
4. O gene rudimentar ( r) é muito distante do branco
(45,2% de recombinação) e também é bastante
- -
distante do vermelho daro (26,9% de recombina -
Mapa de
Sturtevant <T .
0,01,0
vm
30,7 33,7
vm
57,6
r Centrômero
r Centrômero
Mapa
contemporâ neo
0,01,5 33,0 36,1 54,5 67,7
.
Figura S 6 Primeiro mapa de ligação. O mapa original
do cromossomo X da Drosophila, com cinco genes, montado
- por Alfred Sturtevant (superior ) e o mapa contemporâ neo
do cromossomo X da Drosophila baseado nos dados atuais
(inferior ). O mapa de Sturtevant se baseia em parte nas
frequências de recombinação fornecidas na Tabela 5.2.
 Cap ítulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos
ção). Essa informação coloca o rudimentar no lado
oposto do mapa em relação ao branco, produzindo
- - - -.
o mapa final y w v m r
Unidades de mapeamento
Conforme examinamos o nosso mapa do cromos
somo X da Drosophila ( Figura 5.6), a correlação entre a fre-
quência de recombmação e a distância í f sica nos cromos-
somos se toma mals f ácil de compreender. As frequências
dc recombinaçào entre os genes em um cromossomo
podem até ser convertidas em unidades de distância í f sica
usando o conceito de unidade de mapeamento (ID.IL, do
.
inglês map unit ) Uma unidade de mapeamento também é
conhecida como cent íMorgan (cM), em reconhecimento
à contribuiçã o de Thomas Hunt Morgan para o mapea
mento da recombinaçào. Ê comum ( pelo menos em cur-
sos de genética introdutórios) usar a equivalência:
1% de recombina çào 1 m.u. ou 1 cM de distâ ncia
entre genes ligados
Isso é uma aproximação, não muito boa , para certas re
giões de determinados genomas, como discutimos em
uma seção posterior. No entanto, apesar de suas des -
vantagens, ela é suficientemente acurada para nossa fi -
nalidade instrutiva neste livro.
Observa çã o gené tica Os mapas de ligação génica for-
necem as posições relativas dos genes ao longo de um cromos-
somo. Supondo que a frequência de recombinaçào seja propor-
cional á distâ ncia entre os genes, uma unidade de mapeamento
(ou 1 cM ) é aproximadamente igual a 1% de recombinaçào.
Análise do qui-quadrado dos dados de
ligação génica
Em nossa discussã o sobre os dados de liga çã o gé
nica , observamos que, quando os genes são ligados,
encontramos muito mais fenótipos parentais do que
recombinantes na progé nie. Mas como podemos afir
mar se os dados observados constituem evidências de
liga ção génica em vez de um simples caso de variação
ao acaso em relação aos valores previstos? A questão é
-
resolvida pelo uso da an á lise do qui quadrado dos valo
res observados e previstos para identificar as diferenças
estatisticamente significantes. ( A Seção 2.6 descreve o
-
teste do qui quadrado e demonstra o cálculo e a inter
pretação dos valores p, ou probabilidade) .
Como exemplo, vamos rever os dados obtidos por
Morgan sobre o gene w, que afeta a cor dos olhos, e o
gene m, que controla o formato das asas na Drosophila,
apresentados na Figura 5.3. O cruzamento das f êmeas
di í bridas da F, ( wm/ w* m* ) com machos de olhos bran
cos e asas vestigiais ( wm/ Y ) produz uma geração F2 que
deveria exibir uma razão fenotí pica 1:1:1:1. Essa razão
se baseia no pressuposto de que a segregação indepen -
dente determina os alelos contidos nos gametas femini -
nos. Usando os valores observados e previstos, calcula -
mos o valor do qui- quadrado da seguinte forma:
153
2 (791 - 610.25) + (750 - 610.25)
2 2
* = 610,25 610,25
(445 - 610,25)2 (455 - 610,25) 2
I
610.25 610.25 = 169,79
Existem trés graus de liberdade (df = 3) nesse pro-
- blema, e o valor p correspondente é p < 0,005 ( ver Ta -
bela 2.4). Esse resultado indica um desvio significativo
dos dados observados em relação aos previstos, suge-
rindo que o acaso não é responsá vel pela distribuição
observada. Combinados com a observação de que os
dois fenótipos que excedem o n ú mero previsto são pa -
rentais, esses dados são coerentes com a presença de li
ga ção génica entre os genes.
-
- 5.3 A aná lise do cruzamento-teste de
trê s pontos mapeia os genes
-
A análise do cruzamento teste de trés pontos é uma
maneira eficaz para calcular a distância entre dois genes
- ligados, mas não é a maneira mais eficaz para construir
.
mapas genéticos contendo vários genes No entanto,
-
expandindo a ideia da análise do cruzamento teste para
-
a análise do cruzamento teste de trés pontos, os ge -
neticistas podem mapear três genes ligados simultanea
mente de maneira eficiente.
-
Descobrindo a ordem relativa dos genes
pelo mapeamento de trés pontos (triíbrí do)
-
Consideremos um cruzamento teste de trés pon
tos entre um organismo triibrido ( a' ab' bc' c ) e um
-
organismo homozigoto recessivo para os trés traços
.
( aabbcc) A configuração dos alelos no triibrido não
precisa ser conhecida no inicio, já que a análise dos trés
- pontos deduzirá a configura çã o dos alelos nos cromos -
somos parentais como parte do processo.
A ligação génica incompleta de trés genes em um
- ído produz oito genótipos de gamela geneticamente
tri íbr
diferentes. F„sse é o mesmo n ú mero previsto de gametas
geneticamente diferentes, se supusermos a segregação in-
dependente; mas, ao contrá rio das expectativas da segre-
- gação independente, as frequências de gametas são desi-
guais se os genes estiverem ligados. Entre os oito genótipos
de gameta existem dois genótipos parentais que são muito
- mais frequentes que o previsto pelo acaso, bem como seis
genótipos recombinantes, cada um deles detectado com
menos frequência que o previsto. Supondo, para a finali
dade deste exemplo, que os trés genes ligados estejam na
--
ordem a ò c, podemos identificar os gametas parentais e
recombinantes pelas frequências relativas das classes cor -
- respondentes da progénie do cruzamento teste.
Imagine que o cruzamento-teste 1 promova o aca -
salamento de um organismo triibrido com o genótipo
a' b*c* /ahc com um organismo abc/abc ( Figura 5.7a ). O
cruzamento- teste 2 mostra uma organização alternativa
dos alelos em cromossomos parentais, cruzando o trií-
brido a* bc* /ab c com um organismo com genótipo abc/
'
154 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Cruzamento - teste 1 ( b ) Cruzamento teste 2-

a o* a a o lodosos
b 6' b gamelas .
A recombinação
produz oito ger ótipos
^ Tocos os gametas, A recombinação ^ rpconbí -
c recombinantes OJ produzoito c 4
c c c names ou
Cogamcta. nàot MO iguais gcnôtipos dc garrota rvãasàO

í iguais.

f t 1
i * t

—
s »
a
* o 4
o 4
a 4
o o 0 <a 0
*
M0 0 0 40

l ò*
b
c •c‘* — b'
C •
b' 6
c
b
C
b
c
4 b
Parental
( sem recombina ção) •
b
‘ “ c*
b*
c ^
”
b4
c
6*
c
4

fC
6

o o o I o í
— —
o o o r
0 0 0 *
04 4 0 0 0 0
4 4
•0
6 4 t>* b 4
4 b ò 4 b b b b b 4
b
4
•b
Cruzamento simples
c ic
44
c 4
4 C c * c (recombinação c c
44
c
4
c “ *c
1
entre a e b)

o o o o
4
0
b
c
40

jb
4C
44
*“ c
0

b
4
.
• 04
b
c
*
0*

b
c
4
40

b
Cruzamento simples
c ( recombinação
ú

b
L
1
entre b e c)

O o o
0 o* 04
!a
b
c
b
c* c
44

— b
4
Cruzamento duplo
(recombinação
entre os dois pares)
b

o
Homólogos
Gametas
Genótipos da progénie Genótipos da progénie

-
Figura 5.7 Cruzamentos teste de três pontos para diferentes configura ções de alelos em um progenitor tri (brido
cruzado com um progenitor triplo recessivo, (a ) No cruzamento- teste 1, os cromossomos parentais carregam tr ês alelos
do tipo selvagem e três alelos recessivos. Os gametas com esses alelos sáo parentais e produzem progénie com fenótipos
parentais. Os gametas recombinantes simples e duplos levam a progénie do cruzamento-teste a exibir recombinação. ( b) Uma
configuração diferente dos alelos nos cromossomos parentais do triíbrido no cruzamento-teste 2 produz progénie parental e
recombinante diferente da encontrada no cruzamento- teste 1 .

abc ( Figura 5.7 b ). No cruzamento- teste 1, os gametas pa- O cruzamento-teste 2 produz os mesmos oito genó-
rentais { a b C e abc ) são produzidos quando não ocorre
4 4
tipos de gameta obtidos pelo cruzamento- teste 1 , mas os
nenhum crossing-over do«s genes e a progénie resultante alelos partem de um arranjo diferente nos cromossomos
tem três fenótipos do tipo selvagem ou três fenótipos reces- parentais. Desse modo, os genótipos de gameta parentais
sivos. Um crossing over simples ocorrendo entre os genes
- e recombinantes nesse cruzamento teste são diferentes -
a e b produz dois gametas recombinantes, a’ bc e ab*c' , e .
dos encontrados no primeiro Nesse cruzamento teste, -
uma progénie com os padrões fenotípicos corresponden - os gametas parentais são a' bc* e ab*c Os gametas de .
tes. Do mesmo modo, o crossing over simples dos genes b - cruzamento simples sáo a' b* c e abc no cruzamento dos 4

e c também produz dois gametas recombinantes, a b c e 4 4

genes a t b. Q crossing-over simples dos genes b e c pro-
abc , e uma progénie correspondente. Um evento de cros- duz os gamelas a bc e ab' c*. Um crossing-over duplo que
4

-
sing over duplo que provoque o crossing over entre a e b e - provoca a recombinação entre cada par de genes produz
entre õ e c vai produzir um par de gametas de Crossing over gametas de Crossing over duplo a b' C e abc. 4

duplo, a' bc' e ab c,e uma progénie com as misturas corres- Conforme o previsto quando os genes são ligados,
pondentes de traços do tipo selvagem e recessivos. cada um dos seis gametas recombinantes é observado em
 Cap ítulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 155

uma frequência muito menor que o previsto pelo acaso.
Os gametas de crossing-over simples se formam em fre-
quências determinadas pelas distâ ncias relativas entre
os pares de genes. Dentro de cada classe de crossing over - produzida pela uniào dos gametas; assim, uma ú nica es-
simples, os dois gametas serão igualmente frequentes. Os
-
gametas de crossing over duplo serão a classe menos fre-
quente, porque devem ocorrer ambos os eventos de cros
- -
sing over. Assim como acontece dentro de cada classe de
crossing owr simples, os dois tipos de gametas do cros
-
sing over duplo são produzidos em frequê ncias iguais.
Observa çã o gen é tica A progénie do cruzamento-teste
de trés genes ligados cai em oito classes fenotípicas. As classes
parentais são mais comuns e frequentes do que se poderia prever
peio acasa Todas as classes recombinantes sào menos frequentes
do que se poderia prever peto acasa Os recombinantes duplos
são as dasses menos frequentes e os n ú meros de recombinantes
simples ocorrem proporcionalmente ã distâ ncia entre os genes.
Construção de um mapa de recombinaçã o
de três pontos
Para ilustrar o uso dos dados do cruzamento- teste
de três pontos na constru ção de um mapa genético,
agora vamos analisar os dados de um estudo de 1935,
realizado por Rollins Emerson, sobre a ligação génica
.
no milho ( Zea mays ) Emerson testou três genes: o
gene que produz os fenótipos de semente verde ( V ) e
semente amarela ( w ), o gene que produz folha áspera
( G/-) e folha brilhante (glgl ) e o gene da fertilidade nor-
mal ( Va-) e fertilidade variá vel ( va va ).
O milho foi um organismo de experimentação ge-
nética importante na primeira metade do século XX, em
razão de seu grande n úmero de traços genéticos variá veis,
da facilidade com a qual grandes quantidades de plantas
podem ser cultivadas em uma única estação, da capaci
dade dos pesquisadores para controlar os acasalamentos
de uma maneira similar à de Mendel e da produção de
grandes quantidades de sementes a partir de cada cruza-
mento. Em uma espiga de milho, cada grã o é uma semente
piga pode carregar centenas de sementes na progénie, cada
uma delas sendo produto de fertilização independente, e
- um pequeno número de plantas é capaz de produzir deze-
nas de milhares de sementes na progénie para análise.
- Emerson cruzou plantas de linhagem pura do tipo sel-
vagem portando os fenótipos dominantes de sementes ver-
des, folhas ásperas e fertilidade normal (VGl Va/VGl Va )
com plantas de linhagem pura portando os fenótipos reces-
sivos de sementes amarelas, folhas brilhantes e fertilidade
variável ( v gl va/ v gl va ). O cruzamento produziu uma F,
consistindo em plantas triibridas com os fenótipos domi -
nantes e o genótipo V Gl VaA' gl va , que carrega três alelos
dominantes em um cromossomo e três alelos recessivos no
homólogo. As plantas da F, foram submetidas a um cru -
zamento- teste com plantas de linhagem pura, de sementes
amarelas, folhas brilhantes e fertilidade variá vel (v gl va/v
gl va ). A progénie do cruzamento- teste é exibida na Tabela
5.3. Para criar um mapa genético que coloque os trés genes
na ordem relativa correta e para calcular as frequências de
recombinação entre os pares de genes, fazemos cinco per-
guntas sobre esses dados e as respondemos:
1. Os dados sào coerentes com a proposta de ligação
génica ?
2. Quais são os alelos nos cromossomos parentais?
3. Qual é a ordem dos genes no cromossomo?
- 4. Quais são as frequ ências de recombinação dos
pares de genes?
5. A frequência dos crossing-overs duplos é coerente
com a independê ncia dos crossing- overs simples?
Pergunta 1: Os dados são coerentes com a proposta de li -
.
gação génica? Sob os pressupostos da segregação inde -
pendente, as plantas triibridas produzem oito gametas
- geneticamente diferentes em uma frequê ncia de 0,125
ou 1/8 cada e a progénie do cruzamento- teste deve ter

Tabela 5.3 An álise do cruzamento-teste de trés pontos de Emerson

Cruzamento V Gl Va/V Gl Va vglva/ vglva

X
parental: Verde, áspera, normal Amarela, brilhante, variável
Cruzamento- VGIVo/ vglva vglva/vglva
X
teste: Verde, á spera, normal Amarela, brilhante, variável
Progénie do cruzamento-teste:
N ú mero N ú mero Genótipo
Fenótipo observado previsto ( gameta /gameta )
1. Amarela, á spera , normal 60 90, 75 vGI Va/vglva
2. Amarela, brilhante, normal 48 90,75 vglVa/vglva
3. Amarela, á spera, variá vel 4 90,75 vG! va/ vglva
4. Amarela, brilhante, variá vel 270 90, 75 vglva/ vglva
5. Verde, áspera, normal 235 90,75 VGI Va/vglva
6. Verde, brilhante, normal 7 90, 75 Vgl Va/vglva
7. Verde, á spera, variável 40 90,75 VGI va/vglvo
8. Verde, brilhante, variá vel 62 90,75 Vglva/vglva
726 726
156 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
oito classes fenotí picas igualmente frequentes. Nesse ex
perimento, com uma progé nie do cruzamento- teste com
726 integrantes, o n ú mero de integrantes dessa progénie
em cada classe seria (726)(0,125) = 90,75. A análise do
qui-quadrado comparando os n ú meros observados c os
previstos na progénie em cada classe produz um valor
-
qui- quadrado acima de 800. Existem (8 1) 7 graus de
liberdade e o valor p correspondente é p < 0,005. A partir
desse resultado, concluímos que a distribuição observada
da progénie do cruzamento- teste se desvia bastante do
esperado e rejeitamos a hipótese da segregação indepen -
dente como explicação para esses dados.
.Se o desvio nesse experimento fosse consequência da
ligação gènica, então poderíamos prever que os números
da progénie portando fenótipos parentais seriam exces
sivamente altos. A comparação dos valores observados e
previstos em cada classe de cruzamento- teste mostra que
somente duas classes fenotípicas ultrapassam os n ú meros
previstos: a classe de plantas com sementes verdes, folhas
ásperas e fertilidade normal e a classe de plantas com se-
mentes amarelas, follias brilhantes e fertilidade variável
Esses são os dois fenótipos parentais. A partir dessa análise,
concluímos que os dados são coerentes com a ligação gé
-
nica: a distribuição da progénie do cruzamento teste se des -
via bastante das previsões e somente os fenótipos parentais
são vistas com mais frequência que o previsto pelo acaso.
Pergunta 2: Quais são os ai «k>s nos cromossomos parentais?
Podemos responder a essa pergunta de duas maneiras. A
abordagem mais simples é usar as informações fenotípicas
disponíveis a respeito das plantas parentais de linhagem
pura no cruzamento. As plantas parentais eram dominan-
tes de linhagem pura e recessivas de linhagem pura . A par-
tir dessas informações, sabemos que as plantas triíbridas
da F , tém os alelos dominantes em um cromossomo e os
recessivos no cromossomo homólogo. A estrutura gené-
tica do cruzamento- teste é V Gl Va/ v gl v a X v gl va/ v gí
va , então os alelos nos cromossomos parentais devem ser
V Gl Va c v gl va. As Classes 4 c 5 da progénie do cruza-
mento- teste na Tabela 5.3 são parentais.
A segunda abordagem é necessária quando não co
nhecemos os fenótipos dos progenitores ou quando os
alelos em cada cromossomo são desconhecidos. Nessa
abordagem, os dados do cruzamento-teste são usados
para determinar os cromossomos parentais. Os dados
na Tabela 5.3 indicam que as progé nies do cruza -
- ——
mento teste na Classe 5 verde, áspera , normal ( V Gl
— -
—
Va/ v gl va ) e na Classe 4 amarela, brilhante, variá
vel ( v gl va/ v gl va ) ultrapassam a frequê ncia prevista
e, portanto, são classes parentais. As duas abordagens
nos contam a mesma história: os cromossomos paren
tais carregam os alelos V Gl Va e vgl va.
Pergunta 3: Qual é a ordem dos genes no cromos-
somo? Com os cromossomos parentais identificados,
as seis classes restantes precisam ser recombinantes:
quatro sã o classes de crossing- over simples e duas são
crossing- overs duplos. A progé nie do Crossing - ovtr duplo
será a menos frequente de todas as classes , pois ambos
- os eventos de cruzamento precisam ocorrer simultanea -
mente para produzir recombinantes duplos ou Cros -
sing - overs duplos. A partir dos n ú meros da progénie,
podemos presumir que as classes menores, Classe 3
— —
amarela , áspera , variá vel e Classe 6 verde, áspera,
—
—
normal , são os prová veis recombinantes duplos. Po-
demos usar essas previsões para testar as possíveis or-
dens dos genes nos cromossomos parentais.
Para esses trés genes, existem apenas trés ordens
-- - -
possíveis: (1) va v gl, ( 2) v va gl ou (3) va gl v Não - -.
existem dados para nos ajudar a determinar a orientação
da esquerda para a direita do cromossomo, então a dife-
- —
ren ça entre essas ordens génicas é definida inteiramente
por qual gene está no meio v, va ou gl e quais dois
genes ladeiam o gene do meio. Cada ordem dos genes
—
poderia ser escrita no sentido oposto, já que são ordens
--
relativas dos três genes. Por exemplo, va v gl e gl v va --
são ordens génicas equivalentes porque cada uma delas
tem o v como gene do meio.
Existem duas maneiras de determinar a ordem dos
genes. Um procedimento é listar cada ordem dos genes
possível para os cromossomos parentais, desenhar os
cromossomos correspondentes do crossing-over duplo
e depois determinar se os gametas produzidos por
essa atividade correspondem à progé nie prevista para
o crossing-over duplo. Se n ão houver correspondência,
a ordem dos genes está incorreta, mas, se houver, a
ordem dos genes foi identificada.
1. Possível ordem dos genes va v-gl -Gametas previstos para
Cromossomos parentais o crossing-over duplo
Va v G
va V 91
Resultado: os gametas do crossing-over duplo, obti -
dos a partir dessa ordem dos genes, n ão são os pre-
vistos pelos dados.
Conclusão: a ordem dos genes proposta está incor-
reta; v não é o gene do meio.
- 2. Possível ordem dos genes v va gl -Gametas
- previstos para
Cromossomos parentais o crossing-over duplo
V va 61
Va 9l
-
-
- Resultado: os gametas do crossing over duplo, obti
dos a partir dessa ordem dos genes , não são os pre-
vistos pelos dados.
Conclusão: a ordem dos genes proposta está incor-
reta; va não é o gene do meio.
3. Possível ordem dos genes va gl v - previstos para
-Gametas
Cromossomos parentais o crossing -over duplo
V £ Vo
G va

-
Resultado: os gametas do crossing over duplo, obti
dos a partir dessa ordem dos genes, correspondem
aos previstos pelos dados.
Conclusão: a ordem dos genes proposta está correta;
gl é o gene do meio e a ordem dos genes pode ser es
crita como v -gí -va ou va-gi-v. Essa an álise confirma
que as Casses 3 e 6 da progénie do cruzamento- teste
são uma progénie de crossing-over duplo.
O segundo método para determinar a ordem dos
genes é uma abordagem abreviada que requer alguma fa
miliaridade com a recombinaçào. Olhando novamente a
Figura 5.7, repare que, se compararmos os cromossomos
parentais e os do crossing-over duplo, os alelos dos genes
externos parecem continuar os mesmos, enquanto o
alelo do meio parece mudar. Em outras palavras, quando
comparamos um cromossomo parental com um recom-
binante duplo, dois alelos correspondem e um nào. O
alelo que não corresponde é o do meio. Se um progenitor
trifbrido tiver os alelos dispostos como a' b’ cVabc , então
o crossing-over duplo produz gametas a* bc' /ab*c Os ale-
los parentais a* e C correspondem a um recombinante
duplo e os alelos b e h* sâ o trocados. De modo similar,
o segundo gameta parental tem alelos a e c que corres-
pondem a outro recombinante duplo. Os alelos do gene
do meio, b e b\ foram trocados no recombinante duplo
comparado ao cromossomo parentaL
Lembre-se de que já definimos os grupos fenotípi -
cos parental e de crossing-over duplo por meio de seus
n ú meros. Agora examinamos os crossing-overs duplos
para ver quais são os dois alelos que correspondem
aos fenótipos parentais e qual alelo muda e, portanto,
é o gene do meio. Em nosso conjunto de dados, os cro-
mossomos recombinantes duplos são Vgl Vaev Gl va
Nesse caso, os alelos do gene gl mudaram, indicando
que gl é o gene do meio. Com base nessa abordagem, os
cromossomos parentais são VGIVae vgl va . -
Pergunta 4: Quais são as frequências de recombinaçào dos
pares de genes? Considerando os pares de genes um
de cada vez, calculamos as frequências de recombinaçào
-
contando o número total de Crossing overs que ocorrem
-
entre os genes do par. Cada evento de crossing over de dois
genes é contado, independentemente de o evento ocor -
rer de forma isolada (simples) ou simultânea com outro
.
evento (duplo) Nesse caso, existem 11 recombinantes du -
plos, cada um com um crossing-over entre vegle um entre
gl e vij, perfazendo um total de 22 eventos. A progénie do
-
crossing over simples é prevista com base nos cromosso-
--
mos parentais que têm a ordem dos genes v gl va. Entre v
-
e gl, um crossing over simples produz o seguinte:
Gametas previstos para
Cromossomos parentais o crossing-over duplo
V gi va
Gl
-
A progénie do cruzamento teste que carrega esses
cromossomos recombinantes tem os fenótipos ama
rela, áspera, normal ( Classe 1) e verde, brilhante, variá
Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 157
vel (Classe 8). A frequência de recombinaçào é calculada
como a soma de todos os recombinantes simples e duplos
desse par de genes, dividida pelo n úmero total da progé-
nie: 60 + 62 + 4 + 7/726 = 0,183 ou 183%. Portanto, a dis-
- tâ ncia entre esses genes é de aproximadamente 18,3 cM.
-
O crossing over simples entre gl e va produz o
seguinte:
Gametas previstos para
Cromossomos parentais o crosiingover duplo
V Gl va
-
v 9l Va
A progénie do cruzamento - teste que carrega esses
cromossomos é encontrada na Classe 2 ( amarela, bri
lhante, normal ) e na Classe 7 ( verde, áspera, variável ). A
-
frequ ê ncia de recombinaçào r = 48 + 40 + 4 + 7/726 =
0,136 ou 13,6%. A distâ ncia entre os genes é de aproxi -
madamente 13,6 cM.
A recombinaçà o entre os marcadores laterais, va e
. v, é calculada pela contagem de todos os Crossing ox^ers-
dos genes. Para esses genes, a recombinaçào entre v e va
é r = 6 0 + 62 + 48 + 40 + 22 /726 = 0,320 ou 32%.
Pergunta 5: A frequê ncia dos crossing -overs duplos é co-
erente com a independência dos crossing -overs simples?
Na maioria dos testes de liga ção génica, o nú mero de
-
crossing overs duplos é menor que o n ú mero previsto. A
redução é provocada por um efeito chamado interferê n -
cia ( /), que limita o n úmero de crossing-overs que podem
ocorrer em um trecho curto do cromossomo. A interfe -
rência, que discutimos mais na Seção 5.4, é quantificada
pela comparação do número ou frequência dos eventos
de crossing-over duplo observados com o n ú mero ou fre-
. quência previstos, supondo que cada evento ocorra de
maneira independente. No conjunto de dados de Emer-
son , existem 11 crossing- overs duplos na progénie do
cruzamento teste, ou (11 /726) = 0,015 (1,5%). Se cada
Crossing over fosse independente, a frequência prevista
-
para o crossing over duplo seria o produto das duas fre
-
quê ncias de crossing owr simples, (0,183)(0,136) = 0,025
-
(2,5%). O n úmero previsto para a progénie do crossing-o-
ver duplo seria , portanto, (0,025)(726) = 18,2. Os recom -
binantes duplos observados são divididos pelos recombi-
nantes duplos previstos, produzindo um valor conhecido
como coeficiente de coincidência (c). Os n úmeros ou
frequências dos recombinantes observados e previstos
podem ser utilizados para determinar c .
recombinantes duplos observados
c=
recombinantes duplos previstos
ou
= 11/18,2 = 0,60 ( usando quantidades)
= 0,015/0,025 = 0,60 ( usando frequências)
A interferência é definida como / 1 c, então,-
-
nesse conjunto de dados, / = 1 0,60 = 0,40. A interfe
rê ncia identifica a proporção de recombinantes duplos
-
Va
previstos, mas que não são produzidos no experimento
( a diferen ça entre previsão e realidade ). Nesse caso, o
- n ú mero de recombinantes duplos foi 40% mais baixo
- que o previsto. A interferência é uma observação muito
158 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

comum na maioria das regiões da maioria dos genomas.
No entanto, às vezes certas regiões de alguns genomas
geram mais recombinantes duplos que o previsto. Nes-
ses casos, / < 0, situação chamada interferência nega -
tiva. A interferência ser á 7 = 0 quando os crossing-overs
duplos observados e previstos forem iguais. A base mo-
lecular da interferência nào é bem compreendida, em
bora a pesquisa atual mostre que há um limite mecâ nico
que restringe o n úmero de eventos de recombinação em
uma determinada região de um cromossomo.
Observa çã o gen é tica Os mapas de ligação gènica são
constru ídos em um processo de cinco etapas que determina (1)
um desvio significativo dos resultados observados em compara-
ção com os resultados previstos, (2) genõtipos de cromossomos
parentais, (3) genõtipos de cromossomo crossing-over duplo e
ordem dos genes, < 4) frequê ncias de recombinação entre pares de
genes e (5) interferência na formação dos Crossing overs duplos.
Determinando as frequências dos gametas
a partir de mapas genéticos
O mesmo princípio utilizado para construir os mapas
—
de ligação gènica a relação entre as distâncias relativas
—
e a frequência de recombinação pode ser aplicado para
fazer previsões no sentido oposto, ou seja, para determi -
nar as frequências previstas dos gametas recombinantes
com base no<s mapas de ligação gènica realizados.
Na Figura 5.8a, dois genes ligados têm uma frequê n
cia recombinante de 10%. No organismo diíbrido AB/ab ,
dois gametas { AB e ab ) são parentais e dois { Ab e aB )
são recombinantes. Os gametas recombinantes equi
valem a 10% dos gametas totais e cada recombinante
deve ocorrer com a mesma frequência. A probabilidade
é calculada como (1/ 2)( 0,010) = 0,05 para cada gameta
.
recombinante. Nesse cálculo Vi é a probabilidade de
cada cromossomo recombinante ter metade da chance
de aparecer em um gameta e 0,010 é a probabilidade de
recombinação entre os genes. De forma contrá ria , os ga
melas parentais AB e ab sào formados em uma frequên-
-
cia igual a 100% menos 10%, ou 90% dos gametas totais.
Os gametas parentais també m devem ter uma frequê n-
- cia igual
— nesse caso, ( l /2)(0,90) ou 45% cada.
As frequências de gametas dos três genes ligados sào
previstas de modo similar. Na Figura 5.8b, os genes atb
sào exibidos com um terceiro gene, c, situado a 20 cM
do gene h. Para prever as frequências de gametas, pres-
supomos que a interferência seja 7 = 0 para simplificar o
cálculo do n ú mero de recombinantes. No tri íbrido ABC/
abc, os gametas parentais são produzidos quando o cros -
-
sing over n ão ocorre em nenhum dos intervalos entre os
genes. A probabilidade de nenhum crossing-over entre os
genes ae b é 90% (0,9) e entre os genes bec é 80% (0,8).
Considerando os dois pares de genes, a proporção de ga -
metas recombinantes é (0,9)(0,8) = 0,72.
Existem dois gametas parentais igualmente fre -
quentes, cada um com uma frequência prevista de
(0,72)(0,5) = 0,36. A frequência de recombinação é 10%
(0,1) entre a e b. Dois recombinantes simples entre os
genes a e b têm uma frequência prevista de (0,1)(0,8)
(0,5) * 0,04 cada. De modo similar , os recombinantes
simples entre os genes b e c têm frequências previstas
de (0,9)(0,2)(0,5) = 0,09 cada. Cada um dos gametas re-
combinantes duplos, AhC e aBc, deve ter uma frequê n -
cia dc (0, l )(0,2)(0,5) = 0,01. A soma das frequências dos
- oitos genótipos de gameta previstos é 1,0, indicando
que todos os gametas foram contabilizados.
- 5.4 A recombina ção resulta do
crossing -over
A hipótese da recombinação de Morgan pelo
crossing-over entre cromossomos homólogos resistiu ao

(a )

F,
r a» o,10
A

o b
B
(b)

F,
A

a
——
r » 0,10 r = 0,20
B

b
1 i
C

Gameta Frequência
Meiose e produção
cios gametas
Tipo Gameta
I
Frequê ncia
Meicse e produção
dos gametas
Tipo
A B A B C
( }) (0.90) = 0.4S i
( ) (0.9) (0,8) = 036
a b
( ]) (0,90) = 0,45
— Parental o b c
5
( ) (0,9) (0,8) = 036
- Parental
A b A b c
= 0^»S
a B
( }K0.10)

( j)(0.10)
1,00
= 0.05 J
— Recombinante a B
A B
C
c
( J ) (0,1) (0,8) = 0,04
( } ) (0.1 ) (0.8)= 0,04 — Recombinante
simples (a-b)
( J ) (0.9) (0,2) = 0,09
Figura 5.8 Frequências d* gen ó tipo dc gameta a b C - Recombinante simples (b-c)
calculadas a partir dos dados de Itgaçio g è nica. (1 ) (0,9) (0,2) = 0,09
(a ) Frequências de gameta previstas a partir de um A b C
>
( } (0,1) (0,2) = 0,01
mapa de dois genes ligados, ( b) Gametas previstos a
partir de um mapa de três genes ligados, supondo que
a B
0 ) (0,1 ) (0,2) = 001
— Recombinante
duplo
a interferência seja zero (f = 0). 1 ,00
 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 159

teste do tempo e hoje é universalmente aceita. Quando ( a ) cl Wx/CI wx heterozigoto

ele a propôs, seu modelo se encaixou muito bem com d Wx Crorrwssomo 9 normal
uma observação de 1909 feita por F. A. Janssens, que cap-
turou uma visualização dos cromossomos meióticos no Transiocaçào do
O wx cromossomo 9
microscópio c sugeriu que os quiasmas observados entre
Botão Segmento do
os cromossomos homólogos poderiam ser pontos de re- cromossomo 8
combinação. A prova clara da hipótese da recombinaçào Marcadores citológicos
génica pela troca de cromossomos só foi obtida 20 anos ( b ) Recombina çào dos homólogos
após a proposição de Morgan. Em 1931, uma pesquisa
cl Wx
publicada por Harriet Creighton e Barbara McClintock,
sobre crossing-over no milho ( Zea mays ), e um relatório
d
quase simultâ neo divulgado por Curt Stem, sobre cros - a
-
sing over na DrasophUa, forneceram evidências diretas
de que a recombinaçào gé nica e a troca í f sica entre os a wx
cromossomos homólogos andavam de mãos dadas.
Ga metas I
d Wx
Evidência citológica da recombinaçào
Parentais
Creighton e McClintock estudaram a recombinaçào a
-
——
IVX
entre cópias homólogas do cromossomo 9 no milho, dife d wx
renciadas por dois marcadores genéticos os genes que
Recombinarites
controlam a cor do grão (c/) eo tipo de amido ( wx ) no Zea
—
mays e por dois marcadores citológicos diferenças
estruturais nas cópias homólogas do cromossomo 9 que
O Wx
Figura 5.9 Prova citológica da Zea mays de que a
foram observadas no microscópio. Uma cópia do cromos- recombinaçào resulta do crossing-over , A progénie
somo 9 tinha aparência microscópica normal e carregava exibindo fenótipos recombinantes também é vista
carregando cromossomos fisicamente reorganizados.
os alelos cl e Wx. A cópia homóloga do cromossomo 9 car -
regava os alelos Cl e wx e era alterada citologicamente de
duas maneiras. No Cl mais próximo, o cromossomo tinha dois genes ligados em um cromossomo influencia a fre-
uma região de coloração escura, chamada "botão”; na quência de recombinaçào entre eles. Duas questões impor-
outra extremidade, perto do wx, o cromossomo carregava tantes sobre a probabilidade e a frequência de crossing over
derivam dessas observações. Primeiro, por que a distância
-
um fragmento do cromossomo 8 que havia sido transfe-
rido por um evento de reorganização cromossómica cha - entre os genes influencia a frequência de recombinaçào? E,
mado transiocaçào (exploramos esse evento no Capitulo segundo, existe um limite superior para a frequência dos
13). Creighton e McClintock obtiveram evidências citoló gamelas recombinantes para um par de genes Ligados?
gicas de que a recombinaçào envolvia a troca í f sica entre A resposta para a primeira pergunta é que, no iní -
cromossomos homólogos detectando os recombinantes cio da prófase 1, são estabelecidos pontos de Crossing over
genéticos (cromossomos que carregam os alelos Cl e Wx em nódulos de recombinaçào que ocorrem ao longo do
ou que carregam os alelos d e ua ), que também eram cro- complexo sinaptonêmico. Dois genes próximos um do
mossomos reorganizados citologicamente ( Figura 5.9). outro são menos propensos a ter um nódulo de recom -
Apenas algumas semanas após Creighton e Mc - binaçào entre eles e menos propensos a recombinar do
- Clintock divulgarem suas evidências de uma ligação que um par de genes separados por uma distância maior
entre a reorganização dos cromossomos e a recombi
nação genética , Curt Stern divulgou achados similares
- em um cromossomo.
A recombinaçào ocorre após a replicaçào do DNA
na Drosophila. A combinação da análise genética com ter sido concluída , quando cada membro de um par de
a an álise da recombinaçào cromossó mica no milho e cromossomos homólogos é composto de duas cromá ti '

na mosca -da - fruta forneceu evidê ncias convincentes
de que a recombinaçào genética entre os cromossomos
homólogos é acompanhada pela troca f ísica entre os
cromossomos em plantas e em animais.
Limites da recombinaçào ao longo dos
cromossomos
Creighton, McClintock e Stem demonstraram de
modo convincente que o crossing-over é acompanhado
pelo rompimento e reunião do cromossomo. O trabalho
de Morgan e Sturtevant, apoiado pelos dados de vá rios
contemporâneos, estabeleceu que a distância relativa entre
des irmãs. Esse é o estágio de quatro fitas. Os Crossing-
-overs simples envolvem uma cromátide de cada homó-
logo. Existem quatro maneiras equivalentes pelas quais
esse processo pode ocorrer, e os quatro eventos pro-
duzem o mesmo resultado —dois gamelas parentais c
. -
dois recombinantes ( Figura 5.10a ) Os Crossing overs que
ocorrem entre cromá tides não irmãs, mas não entre os
lócus testados, não deixarão evidências genéticas de re-
combinaçáo ( Figura 5.10b).
-
Existem três padrões de crossing over duplo entre
os genes. Os resultados de cada padrão são ú nicos com
relação ao n úmero de gamelas recombinantes produzi -
-
dos. O crossing over duplo de duas filas nào produz re -
160 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
( a ) Possíveis crossing -nven simples
a b
i i
Meiose Meiose
Parental *
A B A B
o b a b
Recomblnante
A b A b
a B a B
O crowng cuer simples produz 50% dc gametas rccombinantcs .
Fí g ura 5.10 Resultados do crossing-over simples, (a ) Os crossing overs simples ocorrem entre os cromossomos homólogos
de vá rias maneiras. Cada meiose produz dois cromossomos parentais e dois recomblnantes, assim 50% dos gametas podem
carregar cromossomos recombinantes. ( b) O crossing -over simples que ocorre fora da região cromossômica que está sendo
testada não revela cromossomos recombinantes.
combinantes, como dois eventos de recombinaçâo entre
um par de genes não produzem evidências genéticas de
recombinaçâo na forma de um gameta recombinante ( Fi-
gura 5.11a ). Um crossing -over duplo de três fitas, envol -
vendo três das crom á tides irmãs, pode acontecer de duas
maneiras, cada uma delas produzindo o mesmo resul
—
tado genético dois cromossomos parentais e dois cro-
mossomos recombinantes nos gametas ( Figura 5.11 b )
Quando ocorre um crossing -over duplo de quatro fitas,
todos os quatro cromossomos nos gametas são recombi
nantes ( Figura 5.11c) . .
Na resposta à segunda pergunta que apresentamos
anteriormente, a recombinaçâo entre um par de genes liga -
dos limita-se a 50% dos gametas. Como vimos, dos quatro
-
gametas produzidos pelo crossing owr simples, dois são re
combinantes ( não têm genódpo parental ) e, então, resultam
em um total de 50% recombinantes. Do mesmo modo, a
soma dos resultados dos crvssing-overs duplos de duas, três
e quatro fitas exibidos na Figura 5.11 fornece um total de
8/16 (50%) de gametas recombinantes. Isso estabelece um
limite superior de 50% como a frequência de genótipos pa -
rentais e não parentais nos gametas. A maioria dos casos de
ligação génica produz muito mais que 50% de cromossomos
parentais e muito menos que 50% de cromossomos não pa -
rentais. As menores proporções de cromossomos recom -
binantes estão associadas com os genes mais infimamente
ligados (isto é, os genes mais próximos um do outro), e as
proporções de recombinantes aumentam com a maior
distâ ncia entre as genes. As frequências de recombinaçâo
entre geives ligados podem aumentai para até 50% com o
*
aumento da distância entre os genes, e a frequência corres
pondente de cromossomos parentais diminui para 50%.
Desse modo, as frequências de recombinaçâo entre os genes
ligados sâo sempre menores que 50%. Uma vez que haja dis-
tância suficiente entre os genes sintènicos, o crossing-over
( b) Nenhuma detecçâo de
crossing -over nas regiões laterais
a b
i
Meiose Meiose Meiose
A B A B A B
a b a b A B
A b A b a b
a B a B a b
Nenhum gameta
recomblnante é produado.
-
randomiza as combinações de aJelos nos cromossomos e o
padrão passa a ser o da segregação independente. Em outras
palavras, os genes sintènicos muito distantes segregam de
modo independente,
A An á lise Genética 5ã apresenta os resultados dos
- cruzamentos- teste envolvendo três genes ligados e
.
mostra como acontece a determinação das frequências
de recombinaçâo entre os genes.
- Observa çã o gen é tica A frequência de recombinaçâo
entre dots genes tem um limite superior de 50% independen
temente do distanciamento entre os genes em um cromos-
somo. A frequência de recombinaçâo entre genes nóo Hgaóos
é igual a 50%, mas é menor que 50% nos genes ligados.
-
Recombinaçâo intragênica
Até agora, nossa discussão descreve como a ordem
linear dos genes ao longo dos cromossomos pode ser
determinada com base no crossing-over entre genes. Ele
ocorre dentro dos genes? A resposta é afirmativa.
-
O crossing over dentro dos genes, chamado recom
binação intragê nica, é um evento raro, detectado pelo
-
exame de grandes quantidades de progé nie, normal
mente em busca de evidências de recombinaçâo entre
-
homólogos portadores de alelos mutados diferentes do
mesmo gene. Como o sítio de mutaçã o dentro do gene
é diferente para cada alelo, a recombinaçâo intragê nica
produz um cromossomo recombinante do tipo selva -
- gem e um cromossomo mutado duplo.
Melvin e Kathleen Green foram os primeiros a relatar
a recombinaçâo intragênica em um estudo de 1949 sobre
o gene da Drosophila para um fen ótipo de olho mutado
recessivo ligado ao X, chamado “ lozenge", que afeta o
 Cap ítulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 161

(a) Crossing-over duplo de duas fitas n úmero e o padrão das facetas no olho da mosca. Várias
( três maneiras equivalente
* uma posição sempre constante) mutações diferentes do gene lozenge produzem, cada uma,
Gametas Recombinantes ístico. O casal Green, dando
um fenótipo lozenge caracter
A 8 continuidade a um trabalho iniciado alguns anos antes por
Clarcncc Olivcr, usaram fémeas com olho lozenge , cada
a b 0 uma portando dois alelos produtores de lozenge diferentes,
A B 4
lz* e l&, nas cópias de seus cromossomos X ( Figura 5.12) .
As mutações do lozenge estão situadas em posições dife-
a b
rentes dentro do gene; desse modo, cada alelo mutado tem
Nenhum gamela recomairwme é produddo uma sequência de DNA mutada no sítio de mutação, mas
por qualquer crossiogoverdu pio de duas fitas tem uma sequência de DNA do tipo selvagem no resto do
gene. A rara recombinação intragênica leva a um cromos-
(b) Crossing -over duplo de três fitas somo X mutado duplo portando as duas mutações lozenge
( uma posição sempre constante)
em um único gene e um cromossomo X do tipo selvagem
Gametas Recombinantes
com um gene lozenge que não contém nenhuma das duas
A B
mutações. Os cromossomos mutados duplos produzem
um fenótipo diferente de qualquer uma das mutações
A b 2
a B 4 individualmente. Os Green detectaram menos de 20 cro-
mossomos X mutados duplos e o cromossomo X do tipo
a b
selvagem em mais de 16 mil progénies de fémeas com
A B olhos lozenge, mas o resultado foi insuficiente para verifi-
car a recombinaçào intragênica.
A b 2
o b 4 Fatores biológicos que afetam a precisáo
dos mapas genéticos
a B
O pressuposto de que as distâ ncias genética e f ísica
Vetace dos gametas é recombinante. sâo proporcionais no genoma inteiro e de que as fre-
quências de recombinaçào de determinados genes são
(c ) Cross /ojT-overduplodequatrofitas
constantes entre todos os membros de uma espécie é
( uma posiçã o sempre constante)
Gametas Recombinantes inerente ao uso da frequência de recombinaçào como
A b uma medida da distância aproximada entre os genes
ao longo de um cromossomo. No entanto, estudos em
A b 4
vá rias espécies indicam que a idade, o ambiente e o
a b 4 sexo podem afetar a frequ ência de recombinaçào. Por
exemplo, a idade avançada das fêmeas de mosca - da -
o B - -
fruta diminui a frequência de crossing over dos pares
de genes; são observados mais crossing-overs em um par
Todos os gametas são recombinantes 8
16 específico de genes nas fê meas mais jovens do que nas
O limite de mais velhas. A frequ ência de crossing-over da fê mea da
recombinaçào Drosophila també m é afetada pela temperatura. O cres-
é 5096 . cimento de uma colónia de moscas-da - fruta a 22° C é
Figura 5.11 Resultados do crossing -over duplo. Os ideal para recombinaçào, e os aumentos ou diminuições
crossing-overs duplos entre dois genes envolvendo duas, três da temperatura em relação ao ideal podem mudar a fre -
ou todas as quatro crom á tides resultam coletivamente em
uma frequência má xima de 50% de gametas recombinantes.
-
quência de crossing over. A restrição dos níveis alimen
tares de cálcio e magnésio, cofatores importantes para
-
as enzimas que interagem com o DNA, també m dimi -
-
nui a frequê ncia de crossing over nas moscas-da -fruta.
No entanto, o impacto mais radical na frequência de
recombinaçào dos animais está ligado ao sexo. A frequén-
Gene lozenge

+ Izm tz9 *-
Cromossomos X
mutados na
f émea lozenge
^ + +

Recombinaçào
• Cromossomo X
-
duplo tazenge mutado
Cromossomo X com o
cf + Iz* v Intrag ênica cf + v gene lozenge do tipo selvagem

Figura 5.12 Recombinaçào intragênica no gene lozenge da Drosophila. A progé nie resultante da recombinaçào
intragênica pode ser detectada por um fenótipo lozenge caracter ístico, produzido pelo cromossomo mutado duplo, ou por ter
olhos do tipo selvagem. Os genes ct e v sáo usados para verificar a recombinaçào intragê nica.
162 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

ANÁ LISE GENÉTICA

.
O Dr O. Sophila, um geneticista famoso, está avaliando a fegaçáo gênica entre três genes ligados ao X na
Drosophíla.Nesses genes, o olho vermelho (ir ) é dominante em relaçáo ao olho vermelho<laro (vk a asa
completa (r) é dominante em relação è asa vestigial (r) eo corpo cinzento (y*) é dominante em relação
ao amarelo (y).O Dr. Sophila tem os resultados de três cruzamentos-teste. Ajude o Dr. Sophila a identifi -
car quais pares de genes sáo ligados e a cakular a fraçáo de recombinação entre os genes ligados .
Cruzamento - teste I: -
Cruzamento teste II: -
Cruzamento teste III:
¥ yv/++ (corpo cinzento, olhos verme
lhos) X & yWY (corpo amarelo, olhos
- V w/+*f (olhos vermelhos, asa completa) $ yr/++ (corpo cinzento, asa completa)
X c? vr/Y (olhos vermelho claros, asa X 3 yr/Y (corpo amarelo, asa vestigial)
vermelho- claros) vestigial)
Progénie Número Progénie Número Progénie Número
Amarelo, vermelho-claro 338 Vermelho - daro, vestigial 396 Amarelo, vestigial 246
Cinzento, vermelho 332 Vermelho, completa 389 Cinzento, completa 252
Amarelo, vermelho 160 Vermelho- daro, completa 110 Amarelo, completa 259
Cinzento, vermelho claro - 170 Vermelho, vestigial 105 Cinzento, vestigial 243
1.000 1.000 1.000

Estrat égias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado .
1 Este problema envolve a avaliação de trés cruzamentos-teste envolvendo genes li-
por esse problema e explique a .
gados ao X A resposta requer a determinação da ligação gênica versus segregação
natureza da resposta solicitada. independente de cada par de genes e, para os genes ligados, o cálculo da frequên
da de recombinação.

.
2 Identifique as informações criti- .
2 Os genótipos e fenótipos das moscas do cruzamento-teste são forneddos assim .
cas fornecidas no problema. como o tamanho da progénie do cruzamento-teste em cada categoria fenotfpica.

Deduzir
3. Determinar os resultados previs- .
3 Em cada cruzamento, a fémea diíbrida deve produzir quatro gametas genetica-
tos para o cruzamento- teste sob mente diferentes nas frequências de 25% cada e a progénie deve exibir quatro fe -
o pressuposto da segregação in- .
nótipos em uma razão 1:1:1:1 (250 cada) No cruzamento-teste I, por exemplo, são
dependente. previstos os seguintes resultados, que são similares em cada cruzamento teste .
Fenótipo Fêmea Macho Número
Amarelo, vermelho-daro yv/yv yv/Y 250
Cinzento, vermelho yv/y* v* yV/ Y 250
Dica: A análise do qul-qu Amarelo, vermelho yv/yv' yr ( Y 250
*
drado poderia ser v.i izada para
a Importância estatistxa
testar Cinzento, vermelho-claro yv/yV yvfY 250
dos devdos entre os rrsufearios
obsrrvados e os prrvhtos.
Solucionar
jr
4. Examine cada cruzamento e deter- .
4 Os cruzamentos-teste I e II exibem um desvio daro das razões previstas, com as ca-
mine se há evidências de ligação tegorias parentais muito maiores que 250 cada e com as categorias não parentais
gênica entre os pares de genes. muito menores que 250 cada. A progénie do cruzamento-teste III está distribuida
em um número coerente com a previsão de segregação independente Essas afir . -
mações se baseiam na análise do qui-quadraòo que não é exibida .

5. Cakule as frações de recombina - .

5 No cruzamento teste I, a progénie recombinante é amarelo vermelho e cinzento
ção entre os pares de genes liga- .
-vermeiho-claro r = 160 + 170/1.000 = 0,330, indicando que esses genes estão liga-
dos. dos e que estão separados por 33 m u ..
No cruzamento-teste II, os fenótipos recombinantes são vermelho-claro-completa
e vermelho-vestigial. A frequência de recombinaçâo é r 110 + 105/1.000 = 0,215,
ou aproximadamente 21,5 m.u.

Para praticar maí s, ver Problemas 2, 4 e 28 .

 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 163

cia de recombinação é diferente nos machos e fêmeas da
maioria das espécies de animais e segue um padrão geral
no qual o sexo heterogamético, com dois cromossomos
sexuais diferentes ( mais frequentemente masculinos), tem
uma taxa de recombinação menor que o sexo homogamé-
tieo, com dois cromossomos sexuais totalmente homólo-
.
gos ( mais frequentemente femininos) A maior frequência
de recombinação no sexo homogamético é um fenômeno
genómico e não se limita aos cromossomos sexuais. As
moscas-da-fruta exibem uma versão radical desse fenô-
meno — as fêmeas sofrem recombinação de homólogos,
enquanto os machos não sofrem recombinação!
Essas observações ocorrem em todo o espectro ta
xonò mico, incluindo os seres humanos. As mulheres
- Arabidopsis que nos seres humanos.
mapa masculino, aproximadamente 2.700 cM. Os geneti -
cistas que estudam o genoma humano costumam produ -
zir um mapa genético humano "com a média dos sexos",
que é ligeiramente maior que 3.500 cM.
Entre as diferentes espécies, o n ú mero de pares
de base de nucleotídeos por unidade de mapeamento
varia. Por exemplo, o genoma humano consiste em um
pouco menos que 3 bilhões de pares de base de DNA e
o genoma médio dos sexos contém aproximadamente
830.000 bp / cM. Por outro lado, o genoma da Arabidop -
sis contém cerca de 200.000 bp/cM; desse modo, a re-
combinaçã o é cerca de quatro vezes mais frequente na

-
estão sujeitas a mais Crossing overs do que os homens,
resultando em um mapa de recombinação maior. Uma
Observa çã o gen ética A frequência de crosswig-over na
maioria dos organismos é afetada pelos fatores idade, sexo e
análise detalhada da recombinação e do sequenciamento
do genoma no cromossomo 19 humano exemplifica esse
ambiente. 0 sexo heterogamético geralmente sofre menos re -
combinação dos homólogos que o sexo homogamético.
fenômeno. O cromossomo 19 é composto de aproxima -
damente 65 megabases ( Mb ), ou 65 milhões de pares
de base, tanto nos genonias masculinos quanto nos fe-
.
mininos ( Figura 5.13) No entanto, o comprimento do Correção das distâ ncias do mapa genético
cromossomo, conforme determinado pela soma das dis
tà ncias de recombinação estimadas ao longo de todo o
Em razão de tantas fatores que afetam o crossing -
over e a recombinação nos genomas eucariólicos, é
comprimento do cromossomo, tem um n ú mero de uni - razoá vel perguntar se as frequ ências de recombinação
dades de mapeamento maior nas mulheres que nos ho- e as distâncias de mapeamento calculadas com base na
mens. Repare também que, nos homens, as frequências recombinação observada entre os pares de genes são,
de recombinação são maiores nas regiões situadas nas na verdade, representações precisas do n ú mero real de
extremidades do cromossomo, mas nas mulheres essas eventos de recombinação. A resposta é negativa. Evidên-
frequê ncias são maiores nas regiões cromossòmicas cen
trais. No genoma humano como um todo, o mapa gené
-- cias experimentais indicam que as distâ ncias de mapea -

tico feminino conté m aproximadamente 4.400 cM, e o

mento calculadas entre dois genes escolhidos aleatoria -
mente normalmente subestimam a distância í f sica entre
os genes, em grande parte por causa dos Crossing overs
CentiMorgans ( cM ) Mapa não detectados entre os genes. Quanto mais distanciados
por ragiâo Físico Genético dois genes sintênicos estiverem, maior a imprecisão, pois
( Mb) Mulheres Homens os crossing-overs duplos entre um par de genes não são
Região Mulheres Homens detectados como recombinantes nos marcadores laterais.
Um Crossing- over simples entre os genes A e B em
p133 14,9 43,1
um diibrido ( AB/ ab ) produz dois gamelas parentais
p13,2
pi 3,1
20,6
14,8
12,7
3,8
{ AB e ab ) e dois recombinantes { Ab e ab). Porém, con
-
forme ilustrado na Figura 5.11, um crossing over duplo
-
pl 2 6,0 0,0 entre os mesmos genes produz gametas cruzados não
cen recombinantes nos marcadores laterais e indistinguíveis
q12 12,0 0,0 dos parentais. Esses gametas cruzados não recombi -
q 13,1 20.4 3.4 nantes não são contabilizados quando a frequência de
recombinaçã o entre os genes é calculada , pois não são
q 13,2
q133
10,7
12,4
2,3
15,5
observados. Distâ ncias maiores entre os genes propor
-
cionam mais oportunidade para o crossing over duplo e,
-
ql 3,4 16,2 33, 7
portanto, maior probabilidade de gametas cruzados não
recombinantes.
©1999 Ru» So*nllk Publirfw*» 65 Mb 128 cM 114 cM
Teoricamente, a rela ção entre a frequência de re-
combinação e a distâ ncia de mapeamento é linear, mas
Figura 5.13 Distâ ncia f ísica versus distâ ncia dc
não é o que acontece na realidade. A linha 1 na Figura
recombinaçã o no cromossomo 19 humano masculino
.
feminino Na maioria dos organismos que se reproduzem de
• 5.14 retrata uma relação linear entre a frequ ência de re -
forma sexuada , o sexo heterogamético tem menos eventos combinação e a distâ ncia em unidades de mapeamento
de recombinaçã o e um mapa de recombinação menor que (cM ). Por outro lado, a linha 2 ilustra que a relação é
o sexo homogamético. Dados adaptados de J. L. Weber e medida nos organismos. As linhas divergem em aproxi -
colaboradores (1993) . madamente 8 cM, indicando que a relaçã o entre a fre-
164 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
50 -i
ri-
E
Õ 30
£
w cia da categoria zero- recombina ção é ln -**. Essa função
r
LT
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Dist â ncia em unidades de mapeamento JcM]
Conclusão:a frequência de recomtoiraçáo metida nos
organismos subesSma a distâ ncia real entre os genes
Figura 5.14 Relação entra a frequência de
recombinaçáo e a distância fí sica entre os genes. A
linha 1 ti aça uma relação linear entre a frequência de
recombinaçáo e a distâ ncia f ísica entre genes ligados. A linha
2 traça a correspondência observada entre a frequência de
recombinaçáo e a dist â ncia f ísica .
quéneia de recombinaçáo e a distância de mapeamento
é linear somente nos genes ligados que estão separados
por menos de 8 cM e que as frequências de recombi -
naçá o observadas normalmente subestimam a distâ ncia
f ísica entre os genes.
O problema central em correlacionar a frequên
cia de recombinaçáo com a quantidade de eventos de
recombinaçáo é a dificuldade em identificar a quanti-
dade de meioses que produzem cada n ú mero possível
—
de crossing-overs zero, um, dois, três, quatro etc. Em
uma tentativa de modelar corretamente as diferentes
classes de recombinaçáo e avaliar precisamente a corre
lação entre a frequê ncia de recombinaçá o e o Crossing
-over, em 1919 J. B. S. Haldane desenvolveu uma f u n
ção de mapeamento, que correlaciona a distâ ncia de
mapeamento e a frequência de recombina çáo entre os
pares de genes. A função de mapeamento de Haldane se
baseia na distribuição de Poisson, uma fórmula que ex
pressa a probabilidade de um evento raro, supondo que
os eventos sucessivos sào independentes. A distribuição
de Poisson prevê a probabilidade de zero, um, dois, três,
quatro ou mais eventos de recombinaçáo em uma re-
— -
già o cromossômica, onde cada crossing over durante a
meiose é contabilizado. A fó rmula de Poisson é
fn = ( ln nf )! n\
onde
}n - a frequência de amostras com um n úmero n de
eventos
n - o n ú mero real de eventos (isto é, crossing overs ) na-
amostra
In = a base dos logaritmos naturais (aproximadamente
2,72)
m * o n ú mero médio de eventos na amostra
S * símbolo do fatorial ( isto é, 41 = 4 X 3 X 2 X 1)
Usando a fó rmula da distribuição de Poisson, podemos
expressar a frequência da categoria zero-Crossing- over
( n = 0) como
ln ~“ ( m^/O!)
Nesse caso, m° c 0! sào iguais a 1, então a frequê n -
pode ser usada para correlacionar a frequência de re
combinação com o n ú mero real de eventos de Crossing
-
-over. Se identificarmos 1 In " como a frequência de
"1
meioses com maís de zero ( um, dois, três, quatro etc.)
crossing-overs e reconhecermos que, nessas meioses,
-
-
50% (1/ 2) de todos os produtos serão recombinantes,
80
podemos expressar a função como
r = i (l ln ) - -
Com essa fórmula , as frequências de recombinaçáo
são convertidas para um n ú mero corrigido de eventos de
recombinaçáo expressos em unidades de mapeamento.
Por exemplo, se a distância entre os genes for medida
como r = 0,20, a aplicação da correção de 1 laldane produz
uma distâ ncia corrigida de 26 m.u. entre os genes.
Uma preocupa ção levantada sobre a fun ção de ma -
peamento de Haldane é que ela pode superestimar a
frequê ncia de recombinaçáo real quando ocorre inter -
ferência. Damodar Kosambi desenvolveu uma função
de mapeamento modificada para corrigir a distâ ncia de
mapeamento nas espécies com Interferê ncia, a qual se
tomou um dos apr í moramentos mais aplicados. A for-
mulação de Kosambi supóe que a interferê ncia diminui
- como uma fiinçào linear da distância entre os genes. A
Figura 5.15 compara a relação linear não corrigida entre
o crossing-over e a frequê ncia de recombinaçáo ( r = cM )
com a função de mapeamento de Kosambi e com a fun -
ção de mapeamento de Haldane.
Diferentes funções de mapeamento foram con -
- cebidas especiftcamente para lidar com determinados
-
-
tipos de dados de recombinaçáo em várias espécies. Por
OSn O
- ^2 0
, o o
,4 - knçáode Halaare
2 (nenhuma interferência )
?
8O 0r3 - Fjnçáo de Kosambi (a interferência
diminui com a distâ ncia)
£
« 0,2'
Relação linear
i
!
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 160
Dist â ncia em unidades de mapeamento (cM )
Figura 5.15 As funções de mapeamento corrigem as
estimativas de distâ ncia entre os genes ligados. A rela çã o
linear O e as correções de mapeamento feitas por Kosambi
O e Haldane se baseiam em pressupostos diferentes sobre
a relação entre a frequência de recombinaçáo e a distâ ncia
f ísica entre os genes ligados.

exemplo, as funções de mapeamento que corrigem efi
cientemente os dados de mapeamento de organismos
como a Drosophila , que produz grandes quantidades
de progénie, podem não ser totalmente adequadas para
corrigir os dados de mapeamento humanos, nos quais a
quantidade de progé nie é muito menor.
Observa çã o genética As funções de mapeamento cor-
rigem a baixa avaliação da distância ífsica entre os genes, que
é gerada pela análise dos dados de mapeamento genético. As
distâ ncias genética e í
fsica são similares em intervalos curtos,
mas se tomam mais desiguais à medida que a distância entre
os genes aumenta.
5.5 Os genes humanos ligados são
mapeados usando a aná lise do
lod score
Até relativamente pouco tempo, o mapa genético
humano era um tanto esparso. Os seres humanos não
podem ser estudados por meio de acasalamentos contro -
lados e, de qualquer modo, produzem uma prole muito
menor que os organismos como a Drosophila e o Zea
mays. Consequentemente, os métodos de mapeamento
dos genes desenvolvidos e utilizadas com sucesso para
mapear os genes em organismos- modelo são dif íceis de
aplicar ao mapeamento de genes humanos. Historica
mente, os genes ligados ao X , em virtude de seus padrões
de transmissão exclusivos, foram os primeiros genes hu
manos a serem mapeados, alé m de serem os mais fáceis,
enquanto o progresso no mapeamento dos genes autos-
sômicos humanos foi atrasado pela escassez de marcado-
res genéticos polimórficos conhecidos, como os antige-
nos do grupo sanguíneo e as proteínas sangu í neas.
O mapeamento do genoma humano mudou signi
ficativamente em meados dos anos 1980, facilitado pelo
surgimento dos métodos de genética molecular para
identificar marcadores de DNA polimórficos e pelos
avanços no software de mapeamento genético. Diferen -
tes tipos de marcadores de DNA polimórficos, incluindo
as variantes do comprimento do fragmento de restrição
(a ) (b)
Família A
I O «PA 2 I
II 1 PA
1
PA
02
PA
II
111
•à •é ò è ò ú
PA PA PA PA PA PA PA PA
111
A fase a éftca é conhecida na fam a A rastmando
*
a transmissão do aieto da doença (CJ eo aáeio
111-3 e IIM;u -6 é um provável recombinante
-.
marcador genético P } de 1*2 para IH e para III 1
Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 165
- (RFLPs) e os polimorfismos de nucleotfdeo único (SNPs)
(descritos no Capitulo 10), acabaram disponibilizando
milhares de novos marcadores genéticos humanos para o
estudo da ligação genica. Combinados com técnicas esta -
t ísticas sofisticadas e o poder computacional moderno, o
uso dos marcadores de DNA polimórficos deu aos genc-
ticistas a capacidade para mapear eficazmente os genes
humanos por meio da an álise da ligação genica.
A disponibilidade de grandes quantidades de mar-
cadores de DNA em cada cromossomo levou primeiro
à identificação dos grupos de ligação, agrupamentos de
genes sintê nicos que estão ligados uns aos outros, e de-
pois à atribuição de localizações cromossòmicas aos gru -
pos de ligação. A descoberta da ligação gé nica entre um
marcador com uma localização cromossómica conhecida
e qualquer membro de um grupo de ligação atribui esse
grupo a uma localização cromossómica perto do mar-
cador genético. Diferentes grupos de ligação no mesmo
cromossomo podem ser organizados em mapas de seg-
mentos cromossómicos e cromossomos inteiros.
Fase alélica
Os esforços para mapear os genes humanos fre -
quentemente se concentram em descobrir as localiza
ções cromossòmicas dos genes causadores de doença.
-
Essa é uma primeira etapa comum para a eventual
clonagem e sequenciamento de um gene que pode ser
- a causa de uma doen ça hereditá ria . Uma estrat égia co-
nhecida como clonagem funcional , ou genética reversa
- ( discutida no Capítulo 17), pode ser usada para mapear
um gene cuja função é desconhecida. Uma vez que a
localização do gene é identificada, o gene pode ser clo-
nado e sequenciado, e a sequê ncia pode ser examinada
em busca de pistas para a função normal do gene para
os mecanismos por meio dos quais a mutação gé nica
- produz anomalias herdadas.
Para mapear os genes, os cromossomos parentais e
recombinantes precisam ser identificados e um dos pri-
meiros obstáculos que os pesquisadores encontram no
esforço para mapear os genes humanos é a dificuldade
de determinar a fase alélica, a disposição dos alelos dos
genes ligados nos cromossomos parentais homólogos. A
Figura 5.16 Análise da fase
Fam ília B alélica nas famílias humanas
10 « 2 A e B.
1
1
PA
02
PA
èPA úPA é é ti ò ú
PA PA PA PA PA PA
i
A rase alélica não é conhecida na família B pcrcjue
o áelo oa doença portado por II-1 poder á estar
tarvto no cromossomo portador doalelo marcador
genético P, ou no cromossomo portador de Ph
166 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Fiqura 5.16 ilustra o problema de determinar a fase alé
lica nas famílias e a importância dos indivíduos-chave no
processo. As duas genealogias na figura são idênticas em
estrutura e distribuição de uma doença hereditá ria autos-
sô mica dominante , indicada pelos símbolos sombreados.
Os alelos do gene que determinam o fenótipo da doença
são De d. Além das informações alélicas para o lócus da
doença, as genealogias mostram as informações alélicas
de um marcador de DNA polimórfico intimamente li
gado que possui seis alelos identificados como Ps a P6.
A fase alélica é conhecida como PtD na Fam ília
A, pois a mulher afetada na geração 1 (1-2) transmite o
alelo marcador P ( com o alelo dominante da doença { D )
para sua filha, 11-1.0 pai não afetado na geração 1 ( I-1) é
homozigoto para o alelo recessivo do tipo selvagem ( dd )
no lócus da doença e heterozigoto para os alelos mar
cadores do DNA P, e Ps. A fase alélica em 11-1 é Pt D/
P } d; o cromossomo à esquerda da linha inclinada ( / ) é
materno e o cromossomo à direita é paterno. Conside-
rando que o parceiro dela ( II -2) é Pt d / P4 d , podemos
identificar a transmissão dos gametas parentais e rc-
-
combinantes de II 1 para os filhos dela na geração 111.
Os filhos III 1, III 3 e 111 4 herdaram um cromossomo
' -
materno portador de PSD para produzir a doença e o
alelo P } ou P4 junto com d em seu cromossomo paterno.
Por outro lado, III -2, III-5, III -7 e III-8 herdaram os ale-
los P 2 e d em seu cromossomo materno e P , ou P4 com
d em seu cromossomo paterno. O filho 111-6 aparente-
mente herdou um cromossomo recombinante portador
dos alelos P3 e D de sua mãe, com um cromossomo pa
terno portador de P3 ed no cromossomo paterno.
A genealogia da Família B n ão permite a identifica
ção da fase alélica. Nessa fam ília, não há informações de
marcador para a gera çã o I e, assim , a fase alélica de II -1
é desconhecida. Ela poderia ser Pt D/ P2 d ou PJ d/ P . D.
Para a finalidade da análise de ligação gé nica, cada fase
possível precisa ser tratada como igualmente provável.
-
Como a fase alélica em 11 1 é desconhecida, não pode
mos afirmar quais dos filhos dela herdaram os cromos
somos parentais e quais deles são recombinantes. Se
II - l for P , U / P7 d , seus filhos III - l a III -5 e III -7 e III -8
são parentais e I1I -6 é recombinante. De modo alterna -
-
tivo, se ela for Pf d / P } D, então 111-1 a III-5 e III 7 e 111-8
são recombinantes e 111- 6 é parental.
Análise do lod score
Embora não seja possível identificar inequívoca
mente e contar os recombinantes em genealogias como a
Família B, um método estatístico desenvolvido por New
ton Morton em 1955, e refinado e ampliado desde então,
permite que os geneticistas calculem a probabilidade glo
bal da ligação génica. O método dc Morton determina
se a ligação génica existe entre os genes para os quais a
fase alélica é desconhecida comparando a probabilidade
de obter os genótipos e fenótipos observados em uma ge-
nealogia se dois genes estiverem ligados versus a proba
bilidade de obter os mesmos resultados da genealogia se
- os genes segregarem independentemente. A razão dessas
duas probabilidades fornece as “chances” de ligação gè -
nica e o logaritmo da razão ( odds ratio ) das chances gera
o lod score, um valor estat ístico que representa a proba-
bilidade dc ligação génica entre os genes.
O numerador da razão das chances que produz o
lod score é a probabilidade de os fenótipos e genótipos
na genealogia serem produzidos pela ligação génica entre
- os genes. O denominador é a probabilidade dos mesmos
resultados da genealogia, supondo a segregação indepen -
dente entre os genes ( isto é, sem ligação génica ). A análise
do lod score avalia cada genealogia e determina a probabi-
lidade de ligação génica de muitas frequências de recom-
binaçào diferentes, cada uma delas expressa como uma
variável chamada valor 0 (“valor teta"). Usando dados de
- entrada sobre cada membro da família que identifiquem a
presença ou ausência da doença e o genótipo em um gene
marcador potencialmente ligado, programas de compu -
tador calculam as probabilidades de ligação génica versus
nenhuma ligação entre os genes e calculam os lod scores
de cada valor 0 especificado pelo pesquisador. Os valores
0 são qualquer frequência de recombinaçào entre 0 * 0
(ligação génica completa ) e 0 * 0,5 (segregação indepen-
.
dente) Os programas determinam os lod scores e, como
são valores logar ítmicos, os lod scores para um determi -
nado valor 0 nas diferentes famílias podem ser somados.
Após analisar todos os dados familiares dispon íveis, os
lod scores de cada valor 0 são somados e o valor mais alto
para o lod score obtido em um estudo é designado Z .O
- Z corresponde ao valor 0 que é a frequência de recom -
binaçáo mais provável entre os genes testados.
- Para cada valor 0 testado, o lod score será positivo se
a probabilidade de ligação génica for maior que a proba-
bilidade de segregação independente, pois, nesse caso, o
valor do numerador ( probabilidade de supor uma ligação
génica) é maior que o valor do denominador (probabili-
dade de supor segregação independente ). Inversamente, se
-- a genealogia tiver mais chance de ser produzida pela se
gregação independente do que pela ligação génica, a pro-
-
babilidade de segregação independente será maior que a
probabilidade de ligação génica e o lod score será negativo.
Os lod scores são calculados usando o pressuposto
de que, se dois genes têm uma frequência de recombina -
çào igual a 0, a probabilidade de um determinado gameta
ser recombinante também é igual a 0 e a probabilidade
de um gameta ser n ão recombinante é 1 - 0. A Tabela 5.4
mostra os valores calculados para o lod score das duas
fam ílias exibidas na Figura 5.16. Para cada filho na gera -
-
Tabela 5.4 Valores do lod score das fam ílias na
- Figura 5.16
Família A [ F ase conhecida )
Valor 0 0 0,1 0 ,2 03 0,4 0,5
lod score - oo 1,09 1,03 0,80 0,46 0.0
Família B ( Fase desconhecida )
- Valor 0 0 0,1 03 03 0,4 0,5
Lod score - oo 0.79 0,73 0,50 0,19 0,0
 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 167

ção 111, a probabilidade de o gameta da mãe ser parental Lod score Resultado sigpfic3TM>
-
é 1 0 e a probabilidade de um gameta recombinante
ser transmitido da mãe para o filho é 0. Como a fase alé-
5 máximo (£ J
Intervalo
favorecendo a liçaçáo

^0
significativo
lica é conhecida para a Família A, apenas a fase conhe - 4
M
cida é testada. Por outro lado, a Família B não tem uma
fase alélica conhecida; desse modo, presume se que cada
3 + 3,0
fase possível é igualmente provável. No cálculo do lod
score da Família B, cada fase é testada e faz parte do nu
merador. Como uma fase alélica conhecida produz mais
- 2
O
Resultado
informações de ligação génica, os lod scores da Família A Inconclusivo
são maiores que os lod escores da Família B. No contexto 1
da análise do lod score, a Família A é identificada como a
mais informativa entre as duas genealogias. ao O e
Um lod score é uma estatística que pode argumentar 5 1 CU 0.3 JíA 0.5
em favor da ligação génica , se a probabilidade dessa liga
ção for suficientemente maior que a probabilidade de se-
- -1 -
O
gregação independente, ou pode argumentar contra a liga
ção, caso a probabilidade de segregação independente seja
- - 2 -2,0
suficientemente maior que a probabilidade de ligação. ( )s
lod scores podem ser interpretados para cada família ou -3
podem ser somados conforme várias famílias forem ana - Resultado sigrvficaTivo
lisadas. Em qualquer um dos casos, a importância do lod -A argumentando contra
score é interpretada pelos seguintes parâmetros: a ligação
1. Um lod score igual ou superior a 3,0 é considerado
-5
uma evidência importante em favor da ligação gê - Figura 5.17 Amostra de curvas do lod score. Os valores
nica. Um lod score igual ou superior a 3,0 indica
chances de ligação génica em cada valor 0 em que do lod score (eixo vertical ) são plotados contra as frações de
ocorre. Os valores 0 identificados como importan - recombinação (valores 0; eixo horizontal ) para três aná lises
hipotéticas do lod score.
tes indicam o n úmero mais provável de centiMor
gans entre os genes ligados.
-
pontos, foi desenvolvida para analisar simultaneamente
2. Os valores do lod score menores que -2,0 repre- os dados de ligação gé nica de vários genes e marcado-
sentam evidências importantes contra a ligação res genéticos. A análise de ligaçã o de vá rios pontos testa
gé nica. Quaisquer valores de lod score, em uma ou todas as possíveis ordens dos genes para identificar a
em vá rias fam ílias, menores que -2,0 rejeitam a li - ordem mais prová vel dos genes ligados. A Observa çã o
gação génica em cada valor 0 com esse resultado. Experimental 5.1 discute a aplicação da análise do lod
-
3. Os valores do lod score entre 3,0 e 2,0 são incon - score no mapeamento do BRCA 1, um gene cuja mutação
clusivos, ou seja, não afirmam nem rejeitam a liga
ção gé nica entre os genes examinados. Os resulta-
- pode aumentar a suscetibilidade aos cânceres de mama e
ovariano em mulheres. A Aná lise Genética 5.3, guia você
dos inconclusivos podem ser revisados à medida através da interpretação dos valores do lod score para a
que mais dados são coletados. ligação entre um gene causador de doença e um marca-
dor genético de DNA ligado.
As três curvas de lod score exibidas na Figura 5.17
ilustram que os resultados do lod score podem produzir
padrões diferentes, dependendo do nível de informa
ção dispon ível para a genealogia e da relação real entre
- Observaçã o genética A análise do lod score identifica
a probabilidade de ligação génica entre os genes possuidores
os genes testados. A curva C exibe dados com um valor de uma determinada frequê ncia de recombinaçáo versos a pro-
máximo (Z J do lod score aproximadamente igual a 4,0 babilidade de esses genes segregarem de modo independente.
^
=
em 0 0,23, sugerindo que os dois genes estão separados
por 23 cM. Os lod scores são significativamente positi
vos no intervalo de 18 a 30 unidades de mapeamento. A
- 5.6 A análise da ligaçã o génica
curva fornece evidências importantes contra a ligação gé- investiga a evolução do genoma
nica em 0 < 0,5. A curva O resulta do fato de haver muito
pouca informação sobre ligação génica e seus lod escores A evolução altera os genomas à medida que as popu -
são inconclusivos em todas as distâ ncias. A curva O re
jeita a ligação génica nos valores 0 menores que 0,12, mas
- lações evoluem e as espécies divergem dos ancestrais co-
muns. Essas alterações incluem mudanças nas frequên -
é inconclusiva pelo resto do intervalo de ligação. cias alélicas ( Capítulo 22), mudanças no n ú mero e na
Uma série de programas de computador mais abran
gentes, que permitem a análise da ligação em vários
- estrutura dos cromossomos (Capítulo 13) e aquisição
de novos genes ou funções génicas (Capítulos 12 e 21).
168 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Observa çã o Experimental 5.1
Mapeando um gene para a suscetibilidade aos cânceres de mama e ovariano
A maioria dos casos de câ ncer se desenvolve por meio
da aquisição de vá rias mutações nas células somá ticas, signifi-
cando que não há uma mutação herdada que aumente a pro
babilidade de desenvolvimento da doença. No entanto, em
algumas fam ílias, a ocorrência frequente de um determinado
tipo de câ ncer em um padrão coerente com a heran ça de
um ú nico gene pode sugerir a transmissão hereditá ria de um
alelo mutado que aumente a suscetibilidade dos indivíduos. A
identidade, na verdade a própria existência desses genes, não
é conhecida até eles se mostrarem conclusivamente respon-
sá veis pelo desenvolvimento do câ ncer. Uma estratégia de
pesquisa para Identificar os genes de suscetibilidade ao câ n
cer busca a ligação gé nica dos genes da suscetibilidade com
os marcadores genéticos que possuem uma localização cro
mossômica conhecida.
No final dos anos 1970, Mary Claire King e vários colabo-
radores conceberam uma estratégia na busca de um gene cuja
mutação poderia aumentar a suscetibilidade aos câ nceres de
mama e ovariano nas fam ílias. King e seus colegas procuraram
maximizar a chance de encontrar esse gene de suscetibilidade
Dados do lod score da ligaçã o do BRCA 1 ao cromossomo 17q nos seres humanos
Marcador genético Lod score nos valores de recombinaçáo (0 )
0,001 0,01 0,05
D17S250
D17S579
--1.43
11,98 -8,96
1 ,62
-U0
8,55
D17SS88 8,23 11,39 18,35
NME1 -1.41 0,75 6,01
D17S74 -39,15 -
31,73 -13,34
toitr. dados d« J. H»l «t al. (1994 .
)
São exibidos cinco marcadores genéticos que fazem
parte de uma an á lise de ligaçã o de vá rios pontos. O BRCA }
provavelmente está ma ís perto do meio desse grupo de liga
ção, perto do gene marcador do DNA D17S588.
Estudos subsequentes identificaram e clonaram o gene
BRCA 1 e determinaram que ele participa com um segundo
gene, chamado BRCA2, na reparaçã o da mutação do DNA.
Um grande n ú mero de mutações do BRCA J foi identificado
e algumas delas aumentaram radicalmente a probabilidade
Nesta seção, discutimos uma aplicação da ligação gênica
ao estudo da evolução.
À medida que as populações envelhecem, pode se
prever que a recombinaçáo randomiza as combinações
- —
dos alelos nos cromossomos. Quando não ocorre essa
randomizaçáo prevista, a evolução costuma ser a causa.
O conjunto específico de alelos em um grupo de genes
ligados cm um único cromossomo se chama haplótipo
( uma contraçã o de “gen ótipo haploide", do inglês “ ha
ploid genotjpe" ). Como os alelos em um haplótipo per
tencem a genes ligados, eles tendem a ser transmitidos
simultaneamente durante a meiose. Os cromossomos
hom ólogos portados por um organismo podem conter
haplótipos diferentes. Os haplótipos podem consistir
ao câ ncer selecionando culdadosamente as famIHas em que
surgiram vários casos de câ nceres de mama e ovariano em indi-
- v íduos )ovens e em que ocorreram casos esporádicos de câ ncer
bilateral (afetando as duas mamas ou os dois ová rios em um
ú nico paciente) em padrões coerentes com uma heran ça autos-
sômica dominante de suscetibilidade á doença.
Inidalmente, KJng procurou a llgaçáo gênica entre a susce-
tibilidade ao câ ncer herdada e marcadores bioqu í micos, como
as proteí nas sangu í neas polimórficas e as enzimas. Nenhum
dentre as dezenas de marcadores biológicos utilizados na tria-
gem produziu evidências relevantes de ligação gènica com um
- gene de suscetibilidade aos câ nceres de mama e ovariano. No
entanto, no inicio dos anos 1990, King e seus colegas recorre-
* ram ao uso dos marcadores genéticos de DNA Então, em 1994,
eles identificaram a ligação génica entre um grupo de marca-
dores de DNA intimamente agrupados no cromossomo 17 hu-
mano e um gene batizado como Câncer de Mama 1 (BRCA /, do
inglês Breast Câncer ). A aná lise do lod score do cromossomo 17,
conforme resumido na tabela a seguir, revelou que o gene can
didato tem um valor Z de 21,68 em (0) = 0,13.
0,10 0,20 0,30 Z 8rm «
3,81
12,08
7,30
12,55
6,65
9.17
7,42
13,02
0,23
0,16
21,33 20,15 14,79 21,68 0,13
8,70 9,13 6,76 9,45 0,16
-2,73 6,32 7,50 7,67 0,27
de uma mulher vir a desenvolver câ ncer de mama ou ova -
riano. Outras muta ções do BRCAJ não parecem aumentar
- significativamente o risco de câ nceres de mama e ovariano.
Ainda há muito a ser feito para esclarecer o papel desse
gene no desenvolvimento desses tipos de câ ncer, mas a
estratégia de pesquisa concebida por King demonstra o
poder da aná lise da ligação g ê nica para localizar genes de
interesse. ( Discutimos mais sobre o BRCA 1 e o BRCA2 no Ca
pítulo 12.)
em qualquer combinação de genes ligados que produ-
zam variação gen ética molecular
—
SNPs, por exem
plo ou variação morfológica. Os haplótipos definidos
pelos lócus SNP geralmente abrangem regiões de 10 mil
-
a 100 mil pares de base, enquanto os haplótipos para os
genes que produzem variação morfológica tendem a ser
muito maiores, abrangendo at é vá rios milhões de pares
de base. Usando as letras A a F para especificar lócus
- SNP ligados, e letras com apóstrofo O e sem apóstrofo
- para distinguir os alelos dessas sequê ncias, podemos es-
pecificar dois haplótipos de exemplo para a mesma re -
gião nos cromossomos hom ólogos como
~ ABCDEF ...
...A 8' C £> £'£...
*
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 169

AN ÁLISE GENÉTICA
Em um estudo de famílias humanas com uma doença autossòmica dominante causada por um
gene cuja localização é desconhecida, os geneticistas usam a análise do lod score para testar a liga
ção entre o gene da doença e um marcador genético de DNA variável Forneça uma interpretação .
completa dos dados do lod score exibidos na tabela apresentada a seguir e identifique a distância
mais prová vel entre o gene marcador e o gene da doença.
Valore
0.0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,10 0,15 0,20 0,30 0,40 0.50
-6,95 -1,10 0,20 1,22 2,25 7,23 7,02 5,11 4,23 -2,01 -6,84 -9,91 0.0

Estrat é gias de solução Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema diz respeito á análise do lod score que avalia a ligação géníca entre
esse problema e explique a natu- um marcador genético de DNA variável e um gene portador de uma mutação do-
reza da resposta solicitada. minante que produz uma doença. A resposta requer a interpretação dos valores do
lod score, a identificação da possível ligação génica e a determinação da distância
mais provável entre o gene marcador de DNA e o gene da doença.

.
2 Identifique as informações cnti- .
2 Os valores do lod score são fornecidos para 14 valores 6 (unidades de mapeamento
cas fornecidas no problema. entre os genes).
Dic«; Um lod suxe iyuil ou superior a 43,01 Lomkleraòo i#na evidência imporUnte
em favor ca fcgaçào çfrnka dos çenev erquanco um lod score menor que -2.0 fornece
Deduzir evldénoas contra a Ujaçêo dos penes Os lod sco*es entre * 3,0 e -2,0 nfc> s4o re «vantes .
.
3 Identifique os valores relevantes .
3 Ocorrem evidências importantes contra a ligação génica e m 0 á 0.01 e em 0 0.20.
do lod score na tabela e localize De modo oposto, resultados importantes em favor da ligaçáo génica sào observados
em 9 = 0,06 a 0 = 0,15.0 valor é 7,23 e corresponde a 0 = 0,06 (6 m u ) . ..
Solucionar
4. Interprete o significado dos lod 4. Os dados suportam a ligação génica entre o gene marcador e o gene da doença
scores para a ligação génica . .
nas distâncias de recombinaçáo entre 6 m.u e 15 m u. A ligação entre os genes é.
Olc»: 0 valer máximo do lod score cor-
.. .
rejeitada em menos de 2 m u e em mais de 20 m u. Os resultados do lod score entTe
. .
responde a uma dntincia especifca entre 2 m u. e 5 m u. são inconclusivos.
os genes que é idemif cada po* seu valor 0.

.
5 Identifique a distância mais pro* 5. O valor é 7,23 em 0 « 0,06, identificando assim a distâ ncia mais provável entre o
vável entre o gene marcador de gene da doença e o gene A como 6 m.u.
DNA e o gene da doença.

Para praticar mais, ver Problemas 18, 22, 29 e 30 .

Em o crossing-owr deve ocorrer
várias gera ções,
entre os haplótipos originais para produzir novos ha -
plótipos que ocorrem nas frequências determinadas
pelo acaso. Em outras palavras, nos genes em uma po -
pulação, o genótipo de um cromossomo em um gene
deve ser independente de seus genótipos em outros
genes. Quando isso ocorre, diz-se que a regiã o cromos -
só mica está em equilíbrio de liga çã o. Isso significa que
conhecer os alelos em um gene não ajuda a prever os
alelos presentes em outros genes no cromossomo.
Como exemplo, vamos considerar dois genes SNP,
A e B , nos haplótipos anteriormente citados. Supondo
que as frequê ncias dos alelos no SNP A sejam A = 0,70
-
e A‘ 0, 30 e que no SNP B sejam B = 0,20 e & = 0,80,
podemos usar probabilidade para prever os haplóti
pos. Para o SNP Aeo SNP B , os haplótipos e frequên -
cias previstos sà o
A’ B' = (0,30)(0,80) = 0,24
A‘ B = (0,30) (0,20) = 0,06
A B' = (0,70) (0,80) = 0,56
A B = (0,70) (0,20) = 0.14
1,00
-
Quando o equilíbrio de ligação náo é observado, as
frequências de certos haplótipos em uma população se
desviam significativamente das frequências previstas.
Essa situação é identificada como desequilíbrio de li -
gação e ocorre frequentemente como consequência dos
processos evolutivos que operam em uma população.
Dois processos evolutivos diferentes sào causas comuns
do desequilíbrio de ligação. A migração pode produzir
desequilíbrio de ligação se os haplótipos tiverem sido
- introduzidos recentemente em uma população e se não
tiver havido um n ú mero suficiente de gerações para que
o crossing-over randomize os alelos. A seleção natural é a
170 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

segunda causa comum de desequilíbrio de ligação. Se um Ascósporos (/ifc podem ser

alelo em um haplótipo for favorecido pela seleção natu
ral, esse alelo vai ter uma frequê ncia maior na população.
- cultivados individualmente
para descobrir seus
gen ótipos
Os outros alelos no haplótipo també m serão favorecidos
em razão de sua grande proximidade com o alelo favore
cido. A recombinação pode ser lenta para randomizar os
alelos nos haplótipos contendo um alelo favorecido pela
seleção natural, mas o desequilíbrio de ligação persistirá
- a

Esporula çé o
— Tipo de
acasalamento
a do ascósporo
haploide
Tipo de
acasalamento
a do ascósporo
haploide
o

E i por u da ção
durante um n úmero maior de gerações. Meiose
/ \
Observa çã o gen ética Os haplótipos sáo combina - a
a
a — Cédula
parental
Célula
parental
ções de alelos dos genes ligados ou de outros marcadores Ciclo de vida Ciclo de vida
genéticos que ocorrem em um segmento definido de um da célula ( n ) vegetativo ( n )
cromossomo. Os haplótipos devem ocorrer nas combinações 0
e frequê ncias previstas pek» equilíbrio de ligaçáo, mas podem *
ocorrer no desequilí brio de ligaçáo quando tiver passado
-
muito pouco tempo para que o crosslng over os randoml2e ou
quando a seleçã o natural opera em favor de certos hapl ótipos.
Ciclo de vida
a/ <
vegetativo ( 2n )
5.7 A ligaçã o gênica nos eucariotos O
haploides é identificada pela
aná lise das tétrades ©
Os experimentos de mapeamento genético rea - Indução por Indu ção por
lizados no milho, na Drosophila , nos seres humanos e fatores sexuais fatores sexuais
em outros organismos diploides permitiram aos biólo
gos desenvolver amplos mapas genéticos para muitas O
espécies. Eles são o triunfo do pensamento científico e
uma execução cuidadosa do projeto experimental. No
entanto, por mais que esses experimentos tenham sido Fusão para formar
-
bem sucedidos, certos organismos têm ciclos de vida o zigoto diploide
que permitem o estudo mais direto dos genótipos de F ig ura 5.18 Cldo de vida da Saccharomyces cerevisiae,
cada gameta individualmente, sem exigir a interpreta - O As leveduras haploides crescem por propagação vegetativa.
ção da expressão dos traços entre a progénie dos expe- 0 As leveduras de diferentes tipos de acasalamento podem se
rimentos controlados. Para essa pesquisa, os geneticis - fundir para produzir diploides.© Os ascósporos haploides são
produzidos por meiose nas leveduras diploides. O As cepas
tas dependem de microrganismos eucarióticos como a
classe Ascomycetes , que inclui o bolor do pão ( Neuros- diploides se propagam por crescimento vegetativo.
pora crassa ) e a levedura (Saccharomyces cerevisiae ) . esporos são liberados para crescer como haploides. Em es -
Espécies de ascomicetos passam a maior parte do seu
tudos laboratoriais, os ascósporos maduros podem ser re-
ciclo de vida em um estado haploide, dividindo se por mi -
movidos de seu asco e crescer como haploides em cultura
tose para produzir novas células. Por exemplo, as células
para descobrir seus genótipos. Esse processo se chama
de levedura haploides da Saccharomyces cerevisiae sofrem
análise da tétrade.
divisão mitótica durante a parte vegetativa do ciclo de vida,
reproduzindo novas células haploides que brotam das cé-
lulas parentais Figura 5.18 ). A levedura diploide se forma Análise de t étrades não ordenadas
pela união de dois tipos de acasalamento haploides geneti - Suponha que uma célula de levedura di íbr í da com o
camente diferentes. ( Discutimos a genética desse processo genótipo a ab' b seja produzida peta fusão de duas células
'

no Capítulo 15.) As células diploides sofrem meiose, pro .

duzindo quatro ascósporos haploides contidos em uma
estrutura em forma de bolsa chamada asco. Os quatro
ascósporos em um asco se chamam tétrade. Na levedura,
os ascósporos não são organizados em uma ordem parti -
cular, então a estrutura se chama tétrade não ordenada .
Dentro de cada tétrade, dois dos ascósporos são do tipo de
acasalamento a e dois são do tipo a. Na maturidade, o asco
se rompe em um evento conhecido como esporulação, e
haploides com genótipos a* b* eab Se os genes estiverem
em cromossomos diferentes, ocorrem dois arranjos igual -
mente prováveis desses cromossomos na metáfase 1, cha -
mados " Alternativa I ” e "Alternativa II", na Figura 5.19a .
Se não ocorrer nenhum Crossing-over entre os homólogos,
cada tétrade contém ascósporos com dois genótipos. Os
ascósporos produzidos pelo arranjo da alternativa I dos
cromossomos da metáfase contêm os mesmos alelos en -
contrados nos haploides parentais ( a‘ b' eab, nesse caso).
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 171

( a ) Nenhum crossing -over

Alternativa I
Cromossomo A Cromossomo B Produtos de gameta Tétrade
a '
b* o* b *

+
o’
a
6
b
- Meiose
I e II a'
a
+
b'
6
a~b*
ab
Drtipo parental
(PO) 4 gamelas parentais
+
ãJ + ab
a b a 6

Alternativa II
Cromossomo A Cromossomo B Produtos de gameta Tétrade
a* 6
Meiose
a* b lell Drtipo não parental
a 6* (NPO) = 4 gametas parentais

a b*
A segregação independente do cromossomo A e do cromossomo B produz tétrades PO e
NPD contendo um total de 50% de gametas parentais e 50% dc gametas recombinantes.

(b) Um crossing-over
Crossing - over simples do cromossomo A
Cromossomo A Cromossomo B Produtos de gameta Tétrade
a* b*
a b'
Meiose
I e II a Tetratipo
(TT) = 2 parentais e
a* 2 recombinantes

Crossing -oversimples do cromossomo B

Cromossomo A Cromossomo B Produtos de gameta Tétrade
a* o 6‘
'

Meiose
lell o* 6 Tetratipo
o* ( TT) 2 parentais e
a ab 4
2 recombinantes
ab
a b a b
-
O crossing over de um piar homólogo dos cromossomos produz tétrades TT
contendo um total de 50% de gametas parentais e 50% de gametas recombinantes
Figura 5 . 1 9 Resultados da tétrade de genes não ligados, (a) As tétrades de ditipo parental (PD) e não parental (NPD) são os
produtos da segregaçã o e da segrega ção Independente. Cada asco contém dois tipos geneticamente diferentes de ascósporo.
(b) Os crossing-overs simples entre qualquer um dos pares homólogos de cromossomos produzem tétrades tetratipo (TT) que
contém quatro ascósporos geneticamente diferentes.

As tétrades com esses dois genótipos de ascósporo são co

nhecidas como ditipos parentais ( PD). As tétrades que
-
podem ocorrer entre os cromossomos homólogos em
-
vimos que vá rios tipos de crossing over simples e duplo

se submetem ao arranco
cromossómico da alternativa II
na metá fase produzem ascósporos com gen ótipos dife-
rentes dos encontrados nos progenitores. Essas tétrades
se chamam ditipos não parentais ( NPD). Se o crossing
-over ocorrer entre qualquer um dos pares de cromosso-
mos homólogos, a tétrade contém ascósporos com quatro
genótipos diferentes e é conhecida como um tetratipo
(TT) ( Figura 5.19b) . As tétrades PD são mais comuns, sendo produzidas
Agora, vamos considerar o que é observado
quando os genes são ligados. Nas Figuras 5.10 e 5.11,
diploides; a Figura 5.20 ilustra as combinações de t étra -
-
des que resultam do nâ o crossing over e de um crossing -
-par de cromossomos homólogos portadores dos alelos
over simples e de vá rios crvssing-overs duplos entre um
-
a*b* /ab em lócus ligados. A figura ilustra que nesses
genes ligados se formam os très tipos de tétrade, mas
as tétrades PD e TT são mais frequentes do que a NPD.
quando nã o ocorrem crossing-overs entre os genes e
quando ocorrem crossing-overs duplos de fita dupla. As
172 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a) Nenhum crossing -over Produtos Tétrade Resultado

a b a b
ob
a
o*
b
b*
a
a *
b
b
ob .
Ditipo parental ( PD)
4 parentais
a* b*

a* b* o* b* a* b*

(b) Oossrng-oversimples

ob
ob* Tetratipo (TO,
o‘b 2 parentais, 2 recombinantes

fl * b*
<3* b' n* b
(c) Crossing -over dvpto (duas fitas )
ob
ob .
Ditipo parental ( PD)
4 parentais
C* b*

a* b *
o*
b *
a* b*

(d) Crossingover duplo (três fitas )

Uma maneira
a b
ob

o b* ob * Tetratipo (TT),
0 b <3'b* 2 parentais, 2 recombinantes

o‘ b
o‘b
Segunda maneira
o b*

ob *

o b ob Tetratipo (TO,
b o‘b 2 parentais, 2 recombinantes

0’ b - a *
b‘ o' b*

-
( e) Crossing overduplo (quatro fitas)
o b *

ob'

o b - ob' Ditipo nào parental ( NPD),

o* b o' b 4 recombinantes

o* b
a* b

Figura 5.20 A forma ção das tétrades com genes ligados é determinada pela ocorr ência ou tipo de crossing -over . ( a ) A
ausência de crossing-over produz o ditipo parental, ( b) O crossing-over simples produz o tetratipo. (c) O crossing -over duplo de
-
duas fitas produz o ditipo parental, (d) 0 crossing - over duplo de três fitas produz o tetratipo. ( e) O crossing over duplo de quatro
fitas produz o ditipo n áo parental.

té trades TT são menos frequentes do que a PD, ocor
rendo quando h á os crossing-overs simples ou os duplos
de três fitas. As tétrades NPD sà o menos frequentes,
-
formando se quando ocorre o crossing over duplo de
quatro fitas. A ligação genética produz a tétrade PD >
- n ú mero total da progé nie
TT > NPD. A ligação génica produz a avaliação de pro-
babilidade das t étrades de cada membro da progé nie. A
fórmula utilizada para determinar a frequência de re-
- combinação na an álise das t étrades (conhecida a partir
das nossas avaliações anteriores da ligação gêmea ) é
n úmero de recombinantes (100)
Um exemplo dessa análise vem de um estudo que
examinou as tétrades produzidas pela fusã o das cepas
haploides pdx pan* X pdx' pan. Os dados na Tabela S.5
 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 173

Tabela 5.5 Cálculo da recombinaçá o nas té trades

óctade dos Neurospora e a óctade se chama asco or -
denado. Consequentemente, a organização dos espo -
Genótipo: pdx pan' / pdx' pan ros- filhos reflete a identidade e a orientação dos alelos
Tipos de t étrade portados por cada cromá tide na metá fase I Um asco .
ordenado pode sor dissecado antes da csporula ção c os
PD TT NPD
esporos haploides podem ser removidos um a um para
pdx pan' pdxpan' pdx pan determinar seu genótipo. Dessa maneira, cada produto
Ascósporo pdxpan* pdxpan pdxpan da meiose é identificado e se determina sua relação es -
Genótipos pdx' pan pdx' pan‘ pdx* pan * pacial com outros produtos meióticos.
pdx* pan pdx* pan pdx' pan' A análise dos ascos ordenados pode ser usada para
mapear a distâ ncia entre os genes ligados e a posiçã o de
N ú mero 28 20 1 « 49
um gene em relação ao centrômero de seu cromossomo.
A distâ ncia do gene para o centrômero é calculada com
base na segregação dos cromossomos homólogos na
mostram que, entre as 49 tétrades analisadas, 28 são meiose 1 e nas cromá tides irmãs na meiose 11. Hm um
PD, 20 são TT e 1 é NPD. Um exame atento da Figura meiócito a* a no qual não ocorre crossing owr entre o -
5.20 revela que, nas tétrades, os cromossomos recombi - gene e o centrô mero, os alelos segregam na meiose 1 A .
nantes sã o encontrados na metade dos ascósporos das conclusão da meiose e a divisão mitótica produzem um
tétrades TT e em todos os ascósporos das NPD. Com asco ordenado com quatro esporos de um tipo agru -
base nisso, a frequência de recombinaçáo das tétrades é pado na metade superior do asco e esporos de outro
determinada usando tipo preenchendo a metade inferior ( Figura 5.22 ) Esse .
rm U
TT) > NPD
tétrades totais
padrão de segregação é chamado segregação na pri
meira divisão, significando a separação dos alelos a* e
-
A frequência de recombinaçáo para esse exemplo a na primeira divisão meiótica. Na ausê ncia de Crossing-
é, portanto, -over, nenhum dos esporos nos ascos da segregação na
[( j)(20) + l ] primeira divisão é recombinante.
r= 0,224 (22,4% ) Se ocorrer crossing-over , os alelos a* e a nâ o se
49
separam até a segunda divisão meió tica , um padrão
chamado segregação na segunda divisão. Se ocorrer
Análise de ascos ordenados
Crossing over entre o gene e o centrômero, um Crossing-
Fungos como o Neurospora crassa acompanham o -over simples produz um de quatro padrões de óctade
mesmo ciclo de vida básico haploide -diploide da leve - diferentes, dependendo da orientação das cromá tides
dura, mas produzem um asco com oito ascósporos ha - durante a meiose. Um exemplo é ilustrado na Figura
ploides em vez de quatro. Nos Neurospora , a fusã o de 5.23a, em que o asco ordenado tem uma razão 2:2:2:2.
dois fungos haploides forma um meiócito diploide que As orientações cromossô micas alternativas acompa -
sofre divisões meióticas para gerar quatro produtos ha - -
nhadas por crossing over simples produzem trés ou -
ploides alinhados em um asco ( tétrade). A divisão mitó
tica dos ascósporos se segue imediatamente à conclusão
- tros padrões de asco ordenado que agrupam produtos
mitóticos idênticos uns após os outros ( Figura 5.23b ) .
da meiose, formando um asco de oito membros ( Figura Em cada caso, a raz ão global 1:1 dos dois alelos é vista
5.21 ). Os dois membros de cada par de esporos- filhos
produzidos pela mitose são adjacentes um ao outro na
—
entre os oito ascósporos apenas a ordem dos esporos
é diferente. A proporção relativa dos ascos da segrega -

a*
«*

\ Meiócito
o
a
*

o
a*
a
„ • O -
>
Meiose I *
Meiose II ' Mitose *
'a (2
__ ^ ° Cromossomos
/ Células homólogos
a Cromá tides
irmãs se
a a
a ° <Z>
a*
dipkxdes se separam separam
Q

Células a
haploides
a

Duas células haploides A meiose sepa os cromossomos

^ A mitose produz Aesporulação
sc fundem para formar homólogos c as cromátides, um asco ordenado ibera esporos .
ummeóeto oiploída formando haplofoes em uma tétrade. de oito membros.
Figura 5.21 Produção de ascos ordenados no fungo Neurospora crassa .
 174 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Figura 5.22 Segregação na primeira divisão

a* *
na formaçã o dos ascos ordenados.
a*
"
( a*
a*
<J*
o* ( D
a 4 o'
Meiose I Meiose II Mitose
a o o
o O
<7
(3 O
O
O

Asco
ordenado
(4:4)

çào na segunda divisão é usada para calcular a distancia
de mapeamento (em centiMorgans) entre um gene e o
centròmero por meio da fórmula
xcM =
|( n úmero de ascos da segregação de segunda divisão)
número total de ascos
X 100
Esse c álculo é equivalente a contar o n ú mero de
esporos recombí nantes e dividir pelo n ú mero total da
progénie, pois a metade dos esporos nos ascos da se
gregação na segunda divisão é recombinante. A Figura
5.24 fornece um exemplo usando o Neurospora crassa.
5.8 O crossing -over mitótico produz
fenótipos característicos
-
Nossa discussão sobre o crossing over e a recom
binação se limitou aos eventos que ocorrem durante a
-
meiose. Você deve ter querido saber se o crossing-over
ocorre durante a mitose e, se for o caso, quais são as suas
consequências. A sinapse dos cromossomos homólogos
- durante a mitose ocorre apenas ocasionalmente nos ani-
mais, desse modo, há pouca oportunidade para a ocor-
*

Os fungos do tipo selvagem cultivados como coló nias
de cor amarelo-clara e padrão de crescimento normal
são acasalados com mutados cultivados como coló nias
alaranjadas e padrão de crescimento felpudo. Conforme
calculado na figura , a distância do centròmero até o
gene de cor é 16,5 cM e a distâ ncia do centrò mero até
o gene do padrão de crescimento é 50,7 cM.
Observa çã o genética Nos eucarlotos cujos gdmetas
est ão contidos em um únko asco, as proporções dos gametas
são usadas para calcular as frequências de recombinaçã o
rência de recombinação. No entanto, em certos casos a
recombinaçào dos homólogos não ocorre durante a mi
tose. A taxa de crossing-over mitótico varia considera
velmente entre os organismos, mas suas consequências
-
foram reveladas por meio dc alguns exemplos fascinantes.
O primeiro exemplo bem documentado de Crossing-
-over mitótico surgiu em 1936, quando Curt Stern estu-
dou os cruzamentos da Drosophila relativos a dois traços
recessivos ligados ao X: o corpo amarelo (y) e as cerdas
curtas retorcidas, chamadas chamuscadas (sn). Stern
cruzou fêmeas homozigotas para o corpo de cor do tipo
. selvagem ( cinzento) e cerdas chamuscadas (y* sn/ y* sn )

(a) (b)

a a
a a a* o• a
a* ; <r Q a a

Meiose I Meiose II Mitose

*•
a
a
o*
a
a
O -
<3 O
í
o a a a a*

a4
o*
a o o - a
& 0' o o '
a
Asco (222:2) (2222) (2:42) (2:42)
ordenado
(222:2)

Figura 5.23 Segregação na segunda divisão na formação do asco ordenado, ( a) O crossing -over simples produz um
asco ordenado 222:2. (b) Podem ocorrer vários resultados da segregação na segunda divisão, dependendo das cromátides
envolvidas no Crossing over.
 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 175

Dist á ncia do centr ômero

Primeira Segunda até o tra ço
divisão divisã o Combinadas ffl x 100 = cM
P ( genótipo) F1 ( genótipo ) Traço ( Dl ) ( D2 ) ( 01 + D2) [Dl 02] Mapa genético

109-]
c g* C g / cg Cor (c) 73 36 109 ffl x 100 = 16 5
-[^ ,
30,7 cM
r 1
16,5 cM
r
( ¥1
cg Crescimento (g ) 42 67 109 x 100 « 30,7 C g
[109]

Figura 5.24 Cálculo da distâ ncia do centrômero ao gene no Neurosporo crassa.

com machos de corpo amarelo e cerdas normais {ysn' fí )
e obteve fémeas diíbridas na F que tinham corpo de cor
do tipo selvagem c cerdas normais (y sn/ y sn ). O exame
4 4
atento de um pequeno n ú mero de fémeas da F , revelou
um fenótipo inesperado. Essas fémeas tinham o corpo de
cor do tipo selvagem e cerdas do tipo selvagem na maior
parte do corpo, mas pequenas manchas amarelas pelo
.
corpo ou cerdas chamuscadas Ainda mais surpreendente
é que algumas fémeas tinham uma mancha corporal ama -
rela e uma mancha de cerdas chamuscadas e, quando isso
aconteceu , as manchas eram sempre adjacentes umas
às outras, em um padrão chamado manchas gémeas ( F é
gura 5.25). Entre esses três padrões de manchas inco-
muns, as manchas gê meas eram cerca de duas vezes mais
comuns que as manchas amarelas individuais, que, por
Heterozigosidade do fenótipo
do tipo selvagem para sn e y
sn *
sua vez, eram muito mais comuns que as manchas únicas
chamuscadas.
Na formulação de uma explicação para as manchas
desiguais e suas diferentes frequências, Stern considerou
que, conto as manchas gémeas estavam sempre lado a
lado, elas devem resultar de eventos recíprocos. Ele per -
cebeu que o raro crossing-over entre cromossomos ho-
mólogos durante a mitose poderia explicar as manchas
gé meas e também poderia ser uma fonte de manchas iso-
ladas. Stern propôs que os eventos de crossing-over mitó-
tico como os ilustrados na Figura 5.25 eram responsáveis
por manchas isoladas e gé meas na Drosophila. A forma
ção de manchas gê meas é explicada pelo crossing over -
-
mitótico entre o sn e o centrômero, se o padr ão parti
cular de segregação cromossô mica ilustrado na Figura
-
y

sn Y*
I
O -
Crcming OYer mitótico
entre o centrômero e osn
O Crossing -over mitótico
entre osneoy
O .
Crosiinq-a vr mitótico
em ambos os intervalos

1
* sn *
y
2
sn *
y
sn
3
4
sn y* sn r
i
Segrega ção mitótica Segregação mitótica Segregação mitótica
sn 4
y sn4
y sn *
y
i í í
> Amarelo » Amarelo Tipo selvagem
3
sn 4 y
3
sn y
3
sn ‘
y* ^
sn f sn* sn y
*
^
2
4 Chamuscado Tipo selvagem Chamuscado
sn r sn r sn r
Manchas gêmeas produzidas Mancha amartf a isciada produzida Mancha chamuscada isoíada produzida
Figura 5.25 Crossing -over mitótico. Nos Crossing -overs na Drosophila analisados por Curt Stern , manchas gémeas O,
mancha amarela isolada 0 e mancha chamuscada isolada 0 foram produzidas pelo crossing over mitótico seguido por um
padrão de segregação particular durante a divisã o celular mitótica . Em cada caso, as cromátides e seus centrómeros são
-
numerados antes do crossing -over.Os n úmeros utilizados após o crossing-over mostram os padrões de segregação que produzem
os fenótipos de Crossing over mitótico identificados.
176 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

-
5.25 ocorrer. O crossing over mitótico de y e sn, seguido
pela segrega ção cromossòmica exibida , produz manchas
-
amarelas isoladas. O crossing over duplo e o padrão de
segregação cromossòmica exibidos são necessá rios para
produzir manchas chamuscadas individuais. A formação
de manchas gémeas é a observação mais comum porque
a distância de mapeamento entre o w e o centròmero é
45 cM. Por outro lado, a distância entre y e sn é 21 cM,
então a formação de manchas gêmeas é aproximada
mente duas vezes mais comum que a mancha amarela
-
isolada. O crossing over duplo que produz a mancha cha -
muscada isolada é menos frequente que o crossing -over
simples, portanto a mancha chamuscada Isolada é o fe-
nótipo menos frequente.

ESTUDO DE CASO

Mapeando o gene da doen ça de Huntington

No outono de 1934, uma jovem aluna de graduação marcadores genéticos dc DNA c o gene HD cm duas gran -
-
chamada Lenore Sabin passou a integrar o laboratório de des fam ílias norte americanas que continham, cada uma ,
gené tica de Thomas Hunt Morgan para iniciar um projeto muitos casos dc HD. Em 1983, uma análise combinada do
dc dois anos estudando a gcnctica da reprodução nas mos- lod scorc das fam í lias venezuelana c nortc-amcricana iden -
- -
cas da fruia. Logo após se formar , Sabin se casou com Mil- tificou a ligação gê nica entre o gene HD e um marcador
ton Wcxlcr e eles tiveram duas filhas, Alice e Nancy. Sem gené tico de DNA conhecido como D4S10, localizado em
.
saber na época , Ixnore Sabin Wcxlcr portava uma bnmba- uma extremidade do cromossomo humano ( Figura 5.26 ) .
-relógio genética
— uma mutação transmitida por seu paít A ligação do gene HD com o D4S10 é apoiada pelo cálculo
para ela c seus três irmãos, que produziria o transtorno neu -do valor Zmo dc 8*53 cm 0 = 0,0 para as fam ílias venezue -
romuscular autossômico dominante fatal, chamado doença lana c norte-americanas combinadas .
de Huntington , em cada um deles . Na década que se seguiu , outras análises da ligaçã o gê-
O diagnóstico de Lenore, sua luta contra a doença e, no nica em mais fam ílias refinaram a localização do gene HD
fim das contas, sua morte foram o incentivo para seu ma - em relação ao D4S10. Com base na an álise ampliada, um
rido Milton Wexler criar a Hereditary Disease Foundation , valor =
em 0 0,03 determinou que a dist â ncia de ma -
que cxcrccu um papel proeminente no financiamento c na peamento entre o D4S10 c o gene HD é dc aproximada -
promoção da pesquisa gené tica que mapeou o gene HD. mente 3 cM. Muitos outros marcadores gené ticos de DNA
A condiçã o dc Lenore inspirou sua filha Nancy a sc tornar ligados ao gene HD também foram identificados e utiliza -
uma pesquisadora de gené tica e uma defensora da pesquisa dos para construir um mapa gené tico complexo dessa re-
do HD. A experiê ncia da família com o HD levou Alice a
cscrcvcr um livro narrando a luta dc sua fam ília contra a ( a ) Fraçáo de recombinação (0)
doença e o envolvimento da família Wexler na busca pelo Fam ília 0.0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4
gene da doen ça ( Wexler, 1995). Americana 1,81 1.59 1.36 0.90 0.48 0.16
Nas primeiras tentativas para mapear o gene l / D por Venezuelana 6,72 5.96 5.16 3,46 1,71 0,33
meio da análise da ligação gênica. os pesquisadores procu - Total 8,53 7,55 6,52 4,36 2,19 0,49
raram a ligação entre o gene e os marcadores bioqu ímicos ( b) 10
(genes dc prote ínas no sangue e genes de enzimas ). Os resul-
- ,
9
tados dessas investigações foram sistematicamente negativos,
8
produzindo lod scorc acima dc -2,0. No entanto, esses resulta - 7-
dos negativos eliminaram cerca de 20% do genoma humano
como a possível localização do gene HD. Os resultados nega
tivos do lod scorc dizem aos pesquisadores onde o gene não
- 6-
5-
está situado, mas, para identificar o gene e caracterizar suas 4
anormalidades, sua localização coneta precisa ser encontrada. 3- +3
No início dos anos 1980, parcialmente sob os auspí - 2-
.
cios da Hereditary Diseasc Foundation Nancy Wcxlcr e
um grande grupo dc colaboradores iniciaram uma jornada jç 0 Valor 0
para mapear o gene HD usando lod score para testar a li-
gação gê nica entre o gene HD e uma grande quantidade £ -
3 1 0.05 - 0.1 0,2 03 0,4

-
dc marcadores genéticos dc DNA recém dcscobcrtos que
2- -
possuíam localizações cromossòmicas conhecidas. Os par - 3- -
ticipantes da pesquisa eram membros dc uma grande fa - 5 1-- 01963 Mncm ílan PuWulw* Ud
mília venezuelana que continha centenas de casos de HD.
Os pesquisadores coletaram e analisaram a varia ção do Figura 5.26 Dados do lod score para o marcador D4S10
marcador genético dc DNA dc 3 mil indivíduos c mon -
taram uma grande genealogia contendo mais de 12 mil
•
o gene da doença de Huntington. (a ) A tabela do lod
score indica evidê ncias importantes de liga ção genética de
membros. Dois membros do grupo colaborador dc Wcxlcr, = =
0 0,00 até 0 0,20, no minimo. ( b ) Curva de valores do lod
James Gusclla e Michael Connealy, usaram separadamente score sobre valores de 0 mostra ZTOí em 0 = 0,00 e lod scores
a análise do lod score para testar a ligação gê nica entre os significativamente positivos até 0 = 0,25 .
 Cap í tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos
gião do cromossomo 4. Armados com um mapa gené tico
.
apontando a localização do gene // £> os pesquisadores
conseguiram isolar c clonar o gene cm meados dos anos
1990. Isso levou à eventual identificação do gene huntin-
gtina ( HTT ), à identificação da prote ína huntingtina pro
tacional
—
duzida pelo gene HTT c à determinaçã o do processo mu
um processo chamado expansão de tripletos do
D NA (Capítulo 12).
RESUMO
S.1 Os genes ligados não segregam de maneira
independente
A ligação g ênica identifica genes tão próximos uns aos ou
tros em um cromossomo que seus alelos não segregam de
maneira independente.
.
1 Com a ligação gênica as combinações parentais em fre
quências bem maiores que as previstas pelo acaso e as
combinações não parentais são muito menos frequentes
que o previsto.
I Wllllan Bateson e RegmaId Punnett observaram a liga ção
gênica pela primeira vez quando notaram grandes quanti-
dades de fenótipos parentais na progénie Fr
I Thomas Hunt Morgan realizou aná lise de cruzamonto
-teste de genes ligados para demonstrar que a liga ção
-
viola a segregaçã o independente e que o crossing over dos
cromossomos homólogos é responsá vel pela produção de
gametas recombinantes.
A frequência de crossing-over dos genes ligados está corre-
lacionada com a distâ ncia entre os genes em um cromos-
-
somo. O crossing over ocorre com menos frequência entre
genes multo próximos do que entre genes mais distantes.
Nos crossing -overs que envolvem genes ligados, os dois
fenótipos parentais são observados na progénie em
frequências apcoxlmadamente iguais, assim como os fenó
tipos recombinantes.
52 O mapeamento da ligação gênica se baseia na
frequência de recombinaçào entre os genes
I A correlaçã o entre a distâ ncia f ísica de mapeamento e a
frequência de recombinaçà o permite o mapeamento ge-
nético com base na frequê ncia de recombinaçào.
53 A aná lise do cruzamento-teste de
tr ês pontos mapeia os genes
Três ou mais genes podem ser mapeados pela aná lise do cru-
zamento-teste. Em um crosung -over de trés pontos, os fenóti-
pos parentais são mais frequentes, os recombinantes duplos
são menos frequentes e os quatro fen ótipos resultantes de
dois eventos de recombinaçào simples têm frequência inter-
mediá ria, dependendo da distâ ncia real entre os genes.
Os mapas de ligação gênica são constnjidos em cinco
etapas:
.
1 encontrar proporções significativamente mais altas de
fen ótipos parentais do que o previsto pelo acaso;
177
Lenore Sabin Wexler, que trabalhou proximamente a
Thomas Hunt Morgan , em cujo laborat ório a ligação gê nica
.
foi desenta c explicada pela primeira vez desempenhou um
papel importante no estudo da ligação gê nica que mapeou
- o gene da doença do qual ela era portadora. Por meio do
- apoio de sua família e dos esforços exaustivos de seu ma
rido e suas filhas, Lenore Wexler esteve no centro da aná
lise da ligação gênica que mapeou o HTT.
-
-
.
2 identificar os alek>s nos cromossomos parentais (as
classes mais comuns);
3. identificar os recomblnantes duplos (as classes menos
- frequentes ), comparando-os com os cromossomos pa -
rentais, para determinar a ordem dos genes;
4. calcular as frequê ncias de recombina çào entre os genes;
- 5. calcular a interferência com a ocorrê ncia de crossing-
-
overs duplos.
I A frequ ê ncia de recombinaçào normalmente subestima a
distâ ncia f ísica entre os genes. As funções de mapeamento
são utilizadas para corrigir essas estimativas.
5.4 A recombinaçào resulta do crossing -over
- I Os estudos que correlacionam a recombinaçào genética
com a recombinaçào visível das estruturas f ísicas caracte
rísticas nos cromossomos apoiam a ideia de que o crossing-
-
over provoca recombinaçào.
I O crossing -over ocorre no estágio de quatro fitas na prófase
I da meiose, após a conclusã o da replicaçáo do DNA. Duas
cromátides n ã o irmãs de cromossomos homólogos tro-
cam partes nos Crossing overs simples de duas fitas. Duas,
três ou quatro cromá tides podem estar envolvidas nos
crossing -overs duplos.
A recombinaçào ocorre dentro dos genes e também entre os
- genes. Vá rias propriedades biológicas dos organismos afetam
a recombinaçào. Nos animais, o sexo heterogamético sofre
menos recombinaçào genômica que o homogamétko.
5.5 Os genes humanos ligados são mapeados
usando a análise do lod score
As abordagens estat ísticas como a aná lise do lod score de-
tectam evidências de ligação em fam ílias pequenas.
A aná lise do lod score determina a probabilidade de liga
çáo gênica entre os genes em valores de recombinaçào
especificados (valores 0). Um lod score cumulativo de + 3,0
ou superior é uma evidência estatisticamente significante
em favor da ligação gê nica entre dois genes. Os lod scores
-
de 2,0 ou menos representam evidências estatistica-
mente significantes contra a ligação gênica.
5.6 A análise da ligação gênica investiga
a evoluçã o do genoma
O desequil íbrio de ligação entre os alelos de genes liga
dos pode indicar que a evolução está agindo na região do
genoma.
178 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

5.7 A ligação gê nica nos eucariotos haploides é
identificada pela análise das t étrades
Em certos microrganismos eucariótkos, os produtos das
divisões celulares meióticas individuais estào contidos em
um asco. Os gametas parentais e recombinantes contidos
em um asco podem ser analisados para mapear os genes.
5.8 O crossing -over mitótico produz fenótipos
caracterí sticos
O crossing- over mitótico é um evento raro que produz frag -
mentos de tecido com fenótipo incomum.

T E R M O S-C H A V E

Analise da tétrade ( p. 170)
Análise do cruzamento-teste de dois
pontos (p. 149)
Análise do cruzamento-teste de tr ès
.
pontos (p 153 )
Asco (ascósporo) (p 170) .
.
Asco ordenado (p 173 )
Coeficiente de coinddência (c) (p. 157 )
Cromossomo ou gameta parental (náo
recombinante) p 144 ) <.
Cromossomo ou gameta recombinante
(náo parental) (p. 144)
.
Crossing-over mitótico (p 174 )
Ditipo não parental (NPD) (p. 171 )
Ditipo parental (PD) (p. 171 )
Equilibrio e desequilíbrio de ligação
(p. 169 )
Fase aléllca (p. 165 )
Frequência de recombinação (r) (p. 147)
Função de mapeamento (p. 164 )
Genes sintènicos (p. 144 )
Grupo de ligação (p. 165)
Haplóí tpo, (p. 168)
Interfer ência (/), (p. 157 )
Interferência negativa (p. 158)
Ligação gênica (mapeamento da liga-
ção gênica), completa e incompleta,
(p. 144, 145)
Lod score (logaritmo da razão de
chances) (p. 766)
Recombinação intragênica (p. 160)
Segregação na primeira divisão (p. 173)
Segregação na segunda divisão (p. 173)
Tétrade (p. 170 )
Tétrade não ordenada (p. 170)
Tetratipo (TT) (p. 171 )
Unidade de mapeamento (m.u.),
centíMorgans (cM) (p. 153 )
Valor teta (valor 0) (p. 766)
.
(P 166 )

Para obter as respostas dos problemas pares, ver o

PROBLEMAS Apêndice: Respostas.
Conceitos do capítulo

1. Faça um diagrama ilustrando os alelos nos cromossomos 4. Os genes E e H são sintènicos em um organismo expe
homólogos para os seguintes genótipos, supondo, em .
rimental com o genótipo EH/eh Suponha que durante
cada caso, que os genes residem no mesmo cromossomo cada meiose ocorra um crossing - over desses genes. Ne -
na ordem escrita: nhum cromossomo homólogo escapa do crossing -over e
.
a AB/ab nenhum deles sofre crossing -over duplo. Os genes E e H
b. aBc/abC sáo ligados geneticamente? Por quê? Qual é a proporção
c DFg/DFG de gametas parentais produzidos pela meiose?
.
d os gametas produzidos por um organismo com o ge- 5. Em tomateiros, a folha roxa é controlada por um alelo do-
nótipo Rt/ rT
minante A e a folha verde, por um alelo recessivo a. Em
.
e a progénie do cruzamento Rt/ rT X rt/ rt outro tócus, a folha peluda H é dominante em relação à
2. Nas espécies de plantas diploides, os genes da altura da folha lisa h. Os genes da cor e da textura da folha são se-
planta e do formato do fruto são sintènicos e separados por parados por 16 m.u. no cromossomo 5. No cromossomo
.
18 moj 0 alelo D produz plantas altas e é dominante em 4, um gene que controla o formato da folha possui dois
relação a d para plantas baixas e o alelo R produz um fruto alelos: um alelo dominante C,que produz o formato serri-
redondo e é dominante em relação a r para frutos ovais. .
lhado da folha, e um alelo recessivo c que produz a folha
.
a Uma planta com genótipo DR/dr produz gametas. em formato arredondado .
Identifique os genótipos dos gametas, indique os ga- a. O cruzamento de uma planta roxa, peluda e serrilhada
metas parentais e não parentais e forneça a frequência heterozigota em cada gene com uma planta verde, lisa e
de cada genótipo de gameta . em forma arredondada produz a seguinte progénie:
.
b Forneça as mesmas informações para uma planta com
Fenótipo Frequênda, %
o genótipo Dr /dR.
Roxa, peluda, serrilhada 21
3. Uma planta alta de linhagem pura que produz frutos ovais,
Roxa, peluda, arredondada 21
conforme descrito no Problema 2, é cruzada com uma
planta baixa de linhagem pura que produz frutos redondos. Verde, lisa, serrilhada 21
Verde, lisa, arredondada 21
a. As plantas da F1 são cruzadas com plantas baixas que
produzem frutos ovais. Quais são as propor ções previs- Roxa, lisa, serrilhada 4
tas para os fenótipos da progénie? Roxa, lisa, arredondada 4
b. Se os Integrantes da F identificada em (a) forem cru - Verde, peluda, serrilhada 4
zados entre si, qual é a proporção prevista de plantas Verde, peluda, arredondada 4
baixas e frutos redondos na F ? Qual é a proporção 100
^
prevista de plantas altas com frutos redondos?
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos
Forneça os fenótipos das plantas parentais e da progé -
nie nesse experimento.
b. Explique em detalhes o número e a frequência de cada
classe fenotípica.
6. Na Drosophila, as posições de mapeamento dos genes
são fornecidas em unidades de mapeamento, de uma
extremidade do cromossomo até a outra. O cromos
.
somo X da Drosophlla tem 66 m u. de comprimento O . integrantes, determine o número de integrantes da
—
gene ligado ao X para a cor do corpo com dois alelos,
y* para corpo cinzento e y para corpo amarelo reside —
em uma extremidade do cromossomo na posição de
.
mapeamento 0,0 Um lócus próximo para a cor do olho,
com os alelos w para olhos vermelhos e w para olhos
brancos, está situado na posição de mapeamento 1,5
.
Um terceiro gene ligado ao X que controla a forma da
cerda, com t para cerdas normais e f para cerdas bifur-
cadas, está situado em uma posição de mapeamento
.
56,7 Cada gene reside no cromossomo X e em cada
lócus o alelo do tipo selvagem é dominante em relação
ao alelo mutante.
a. Em um cruzamento envolvendo esses três genes liga-
dos ao X, você espera que qualquer par de genes exiba
ligação gênica ? Justifique.
b. Você espera que qualquer um desses pares de genes
segregue de modo Independente? Justifique.
.
c Uma mosca-da-fruta fémea do tipo selvagem com
o genótipo y* w*f/ywf é cruzada com um macho de
corpo amarelo, olhos brancos e cerdas bifurcadas. Pre-
veja a frequência de cada classe fenotí pica da progénie
produzida por esse cruzamento.
d. Explique como é produzida cada uma das classes pre-
7 .
vistas para a progénie.
Os genes A Be Csão ligados em um cromossomo e en-
.
contrados na ordem A -8-C Os genes Ae B recombinam
com uma frequência de 8% e os genes B e C recombi-
nam com uma frequência de 24%. Para o cruzamento
o' b*c/ abc* X abc/ abc, preveja a frequência da progénie .
Suponha que a interferência seja zero .
8. O gene G recombina com o gene T em uma frequência
de 7% e o gene G recombina com o gene R em uma fre-
quência de 4%.
a. Desenhe dois possíveis mapas genéticos para esses
três genes e identifique as frequências recombinantes
previstas para cada mapa.
b. Supondo que qualquer genótipo desejá vel esteja dis-
ponível, proponha um cruzamento genético cujo re
Aplica ção e integração
13. Pesquisadores cruzam um pé de milho de linhagem pura
para os traços dominantes aleurona colorida ( cl ), grão in-
teiro (Sh ) e endosperma ceroso ( Wx ) com uma planta de
linhagem pura para os traços recessivos aleurona incolor
(d), grão encolhido ( sh ) e endosperma amiláceo ( wx). As
,
plantas da F resultantes foram cruzadas com plantas de
.
linhagem pura incolores, encolhidas e amiláceas A con-
tagem dos grãos de aproximadamente 30 espigas de
milho produziu os seguintes resultados.
179
sultado poderia ser utilizado para determinar qual dos
mapas genéticos propostos está correto .
.
9. Os genes A B Q D e E são ligados em um cromossomo e
ocorrem na ordem fornecida. O cruzamento-teste Ae/ aE
X ae/oe indica que os genes recombinam com uma fre-
quência de 28% .
- a. Se o cruzamento-teste produzir uma progénie com mil
progénie em cada classe de resultado .
b. Os cruzamentos de ligação gênica anteriores determi -
naram que as frequências recombinantes para esses
genes são 6% para os genes A e 8, 4% para os genes
B e C, 10% para os genes C e D e 11% para os genes D
. .
e E A soma dessas frequências entre os genes A e E é
.
31% Por que a distância de recombinação entre esses
genes, determinada pela soma dos intervalos entre
os genes ligados adjacentes, é diferente da distância
-
determinada pelo cruzamento teste?
.
10 Genes sintênicos podem segregar de modo indepen-
.
dente Explique essa observação .
11. A frequência de recombinação entre os genes ligados
é menor que 50%. Por que a recombinação de 50% é o
valor máximo?
12. No cromossomo X da Drosopbila, o alelo dominante
y* produz corpo dnzento e o alelo recessivo y produz
corpo amarelo. Esse gene está ligado a outro gene que
controla o olho de formato cheio por um alelo domi-
nante Ire o olho em formato lozenge com um alelo re-
cessivo /z. Esses genes recombinam com uma frequên-
cia de aproximadamente 28%. O gene Lz é ligado ao
gene F que controla a forma da cerda, em que o domi
nante é a cerda comprida e o recessivo é a cerda bifur -
-
cada. Os genes Lz e F recombinam com uma frequência
de aproximadamente 32%.
a. Usando quaisquer genótipos á sua escolha, projete dois
cruzamentos diferentes, um para testar a recombinação
.
entre os genes Y e L z e o segundo, entre os genes Lz e
F. Suponha que seja produzida uma progénie de mil In-
tegrantes em cada auzamento e forneça os números da
progé nie em cada categoria de resultado. ( Ao configu-
rar os seus cruzanr>entos, lembre-se de que os machos
de Drosophib não sofrem recombinação.)
b. Algum dos cruzamentos pode revelar ligação entre o
gene Yeo gene F7 Por quê?
c Por que a "segregação independente* é o termo gené-
^
tico que melhor descreve as observações de um cruza-
mento genético entre o gene Y e o gene f?
Fenótipo do grão Quantidade
Colorido, encolhido, amiláceo 116
Colorido, cheio, amiláceo 601
Colorido, cheio, ceroso 2.538
Colorido, encolhido, ceroso 4
Incolor, encolhido, amiláceo 2.708
Incolor, cheio, amiláceo 2
Incolor,cheio, ceroso 113
Incolor, encolhido, ceroso 626
6.708
180 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

a. Por que esses dados são coerentes com a ligação gê- b. Existem evidências de segregação independente entre
nica entre os très genes7 qualquer um desses pares de genes ? Se existirem,
b. Realize um teste do qui-quadrado para determinar se identifique as evidências.
esses dados exibem desvios significativos em relação á c Usando os símbolos de genes fornecidos anterior-
distribuição fenotípica prevista. mente, escreva os genótipos das plantas da F, e da F7.
c Qual é a ordem desses genes no milho ? d. Se houver alguma evidência de ligação, calcule as fra-
d. Calcule a fração de recombinação entre os pares de ções de recombinação a partir dos dados apresentados.
genes. e. Os três genes poderiam ser portados pelo mesmo cro-
e. Qual é o valor de interferência desse conjunto de mossomo? Por quê?
dados? .
16 Em uma espécie de planta diploide, uma F, com genó-
14. A síndrome da unha-patela é um transtorno autossômico tipo Gg LI Tt sofre um cruzamento-teste com uma planta
que afeta o formato das unhas nos dedos das máos e dos recessiva de linhagem pura, com o genótlpo gg II tt. Os
pés, bem como a estrutura das patelas A genealogia a . genótipos da progénie são:
seguir mostra a transmissão da síndrome da unha pateta Genótipo Quantidade
em uma família, junto com o tipo sanguíneo ABO.
GgUTt 621
2
I ôm * o GgLItt
GglITt
3
64
,1
II
A O
2
< drá rfé
B A
4

O A
6

O A
àk )°
A A
Gglltt
gg LI Tt
109
103
ggUtt 67
gg II Tt 7
A O A A8 B O A O A A A A O
gglltt 626
.
a A síndrome da unha-patela é uma condição domi- 1.600
nante ou recessiva ? Explique. a. Qual é a ordem desses tr ês genes ligados?
b. Essa fam ília fornece evidências do ligação genica entre b. Calcule as frações de recombinação entre cada par de
a síndrome da unha-patela e o grupo sanguíneo ABO? genes.
Porquê? c Por que a fração de recombinação do par de genes ex-
c Usando N e n para representar os alelos no lócus da terno não é igual à soma das frações de recombinação
unha-patela e /*, f e i para representar os alelos ABO, entre os pares de genes adjacentes ?
escreva os genótipos de 1-1 e 1- 2, bem como os de seus d. Qual é o valor de interferência desse conjunto de
cinco filhos na geração II . dados?
d. Por que 111 6 tem a síndrome da unha-patela e 111 8 não
- - e. Explique o significado desse valor de /.
tem? Forneça os genótipos desses dois Indivíduos.
e. Por que 111-11 tem a síndrome da unha-patela e 111-12 .
17 O mapa a seguir indica a ordem dos genes em um cro-
não tem ? Forneça os genótipos desses dois indivíduos. mossomo e o número de unidades de mapeamento
entre os pares de genes adjacentes. Forneça a frequência
.
15 Tr ês traços dominantes das plântulas de milho, semente de gametas prevista, produzida pelos organismos com
tunicada ( T- ), aspecto brilhoso (G-) e caule ligulado ( L- ), os seguintes genótipos. Suponha que uma unidade de
são estudados com suas contrapartes recessivas, não mapeamento seja igual a 1% de recombinação e que a
tunicada ( tt ), não brilhoso ( gg ) e não ligulado (?/). Uma interferência seja zero .
planta triíbrlda com os três traços dominantes é cruzada Frequência
com uma planta não tunicada, não brilhosa e sem lígulas. de recombinação: 10 18 8 24 16
Os grãos nas espigas das plantas da progénie são classifi-
cados para os traços, com os seguintes resultados: Gene: A B D E F G

Fenótipo Quantidade
.
a De/ dE
b. Ad / aD
Tunicada, brilhosa, ligulado 102 c DeF/dEf
Tunicada, brilhosa,não ligulado 106 d. BdE/ bde
Tunicada, não brilhosa, ligulado 18 e. AEG/atg
Tunicada, não brilhosa , náo ligulado 20 .
t ABDE/abde
Náo tunicada, brilhosa, ligulado 22 18. O grupo sanguíneo Rh nos seres humanos é determinado
Náo tunicada, brilhosa,não ligulado 23 por um gene no cromossomo 1. Um alelo dominante pro-
Náo tunicada, náo brilhosa, ligulado 99 duz o tipo sanguíneo Rh+ e um alelo recessivo produz o
Náo tunicada, não brilhosa, não ligulado 110 Rh-. A eliptocitose é um transtorno autossômico domi
nante que produz eritròcitos de formato anormal, com
500
uma expectativa de vida curta e que resultam em anemia
a. Existem evidências de ligação genica entre qualquer
um desses pares de genes? Se existirem Identifique as
evidências .
. hereditária. Uma grande família com ellptocitose é testada
quanto à ligação gênka do grupo sanguí neo Rh e a doença.
Os dados do lod score a seguir são obtidos para a família.
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 181

d. Determine os genótipos dos gamelas produzidos por

um crossing-over duplo de quatro fitas nesse diibrido.
.
22. Os dados de T H. Morgan sobre a cor dos olhos e a forma
.
das asas exibidos nas figuras 5.3 e 5.5, revelam a ligação gê-
nica entre os dois genes.Teste esses dados de ligação genica
-
com a análise do qu» quadrado e mostre que os resultados
são significativamente diferentes dos resultados esperados
sob o pressuposto da segregação independente .
Valor 0 23. Uma planta de soja triibrida do tipo selvagem é cruzada

.
J2 0
3
2 1 -
0.05 0.1 0,15 0.20 0.25 0.30 0,35 0,40 0,45 0,50 com uma planta de soja de linhagem pura com fenótipos
recessivos de folha clara {/), semente oval (r ) e baixa esta-
tura (f). Os resultados do cruzamento-teste de três pon-
-2 -
tos sáo exibidos a seguir. Os traços não apresentados são
-3 - do tipo selvagem.
a. A partir desses dados,você pode conduir que os lócus
Fenótipo Quantidade
do Rh e da eliptocitose sâo geneticamente ligados
Clara
. _
nessa família? Por quê?
b Qual é o Z dessa família ? Clara, oval
Clara, baixa
648
64
10
c. Em quais intervalos de 6 os lod scores indicam evldèn
cias importantes em favor da ligação génica? Clara, oval, baixa 102
19. 0 mapeamento da ligação gênica de um grande número Oval 6
de famílias identifica 4% de recombinaçào entre os genes Oval, baixa 618
para o tipo sanguíneo Rh e para a eliptocitose No lócus . Baixa 84
do Rh, os alelos Re r controlam os tipos sanguíneos Rh-f Tipo selvagem 98
-.
e Rh O alelo E que produz a eliptocitose é dominante 1.630
em relação ao alelo e recessivo do tipo selvagem Tadeu . a. Quais sáo os alelos em cada cromossomo homólogo
.
e Taí s têm eliptocitose e cada um deles é Rh+ A mãe de da planta de soja triibrida parental do tipo selvagem ?
Tadeu tem eliptocitose e é Rh-, enquanto o pai é saudá- Coloque os alelos na ordem correta dos genes. Use L, R
vel e tem Rh+. O pai de Taí s é Rh+ e tem eliptocitose- a . .
e T para representar os alelos dominantes e l r e t para
mãe é Rh- e saudável . representar os alelos recessivos.
a. Qual é a probabilidade de o primeiro filho de Tadeu e b. Calcule a fraçáo de recombinaçào entre os pares de
Tais vir a ser Rh- e ter eliptocitose? genes adjacentes.
b. Qual é a probabilidade de um filho de Tadeu e Taís que .
c Calcule o valor de interferência para esses dados.
é Rh+ vir a ter eliptocitose?
24. O chefe do seu laboratório acaba de ouvir uma sugestão
20. Um Neurospora com o genótipo a* forma tétrades nas se- feita por outro laboratório de que os genes responsáveis
guintes frequências: pela cor dos olhos e pelo comprimento das cerdas corpo-
Tétrade Número .
rais podem ser ligados na Drosophila Seu laboratório pos-
cra' aa 192 sui muitas reservas de Drosopbila de linhagem pura que
poderiam ser utilizadas para verificar ou refutar a ligação
a a a' cr 208
a a‘ a am 23
.
gênica Na Drosophila, os olhos vermelhos (c+) sáo domi-
nantes em relação aos olhos marrons (c) e as cerdas lon-
a cr a' a 27 gas (d+) são dominantes em relação às cerdas curtas (d).
a o a’ a 29 O chefe do seu laboratório pede para você conceber um
ara a cr 21 experimento para testar a ligação gênica dos genes da cor
500 dos olhos e do comprimento das cerdas e a começar pelo
cruzamento de um exemplar homozigoto de linhagem
a. Qual é a distância entre o gene e o centrômero ?
b. Faça um diagrama da meiose que produz a classe a a
pura para olhos vermelhos e cerdas curtas com um exem
plar de linhagem pura para olhos marrons e cerdas longas.
-
a4 o da tétrade.
#

.
c Faça um diagrama da meiose que produz a classe a* a
a cr da tétrade .
21. Os genes R e T sáo ligados geneticamente. Responda à s
seguintes perguntas pertinentes a um organismo dií-
brido com o genótipo Rt/ rT\
a. Se r = 0,20, forneça as frequências previstas dos game-
tas produzidos pelo diibrido.
b. Determine as frequências dos gametas se ocorrer um
crossmg -over duplo de duas fitas entre os genes.
c. Determine os genótipos dos gametas produzidos por
um crossing-over duplo de três fitas nesse organismo
diibrido.
a. Forneça os genótipos das moscas parentais de linha-
gem pura e o{s) genótipo( s) e fenótipo( s) da progénie
F , que elas produzem.
.
b Na sua concepção experimental, quais são o genótipo
e o fenótipo da linhagem que você propõe cruzar com
,
a F para obter as informações mais úteis a respeito da
ligação génica entre os genes da cor dos olhos e do
comprimento das cerdas ? Explique por que você fez
essa escolha.
.
c Suponha que os genes da cor dos olhos e do compri-
mento das cerdas sejam separados por 28 m u. Quais .
são as frequências aproximadas dos fenótipos previstos
a partir do cruzamento que você propôs na parte (b)?
182 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

d. Em que aspecto os resultados do cruzamento seriam alelo recessivo r para fruto alongado. Os genes que con-
diferentes se os genes não forem ligados? trolam esses traços são ligados no cromossomo 1 no ge-
25. Em coelhos, o pelo cor de chocolate (i +) é dominante noma do tomate e os genes são organizados na ordem e
*
em relação ao pelo branco M, o pelo liso (c+) é domi- nas frequências de recombinaçáo exibidas.
nante em relação ao pelo cacheado (c) e a orelha comprida Gene T P R
-
(s f ) é dominante em relação à orelha curta (s).O cruzamento
de um coelho trilbrido com pelo liso,cor de chocolate e ore-
Frequência de 0,04 0,18
lhas compridas com um coelho com pelo cacheado, branco
e orelhas curtas produz os seguintes resultados: recomblnação
a. Uma planta de linhagem pura alta, com penugem e
Fenótipo Quantidade fruto redondo é cruzada com uma planta de linhagem
Branco, curta, liso 13 pura anã, com casca lisa e fruto alongado. Quais são os
Chocolate, longa, liso 165 genótipos dos gametas produzidos por cada uma des-
Chocolate, longa, cacheado 13 sas plantas?
Branco, longa, liso 82 b. Quais são o genótipo e o fenótipo da progénie F , desse
Chocolate, curta, liso 436 cruzamento?
c Quais são os genótipos dos gametas produzidos pela
Chocolate, curta, cacheado 79
F, e qual é a frequência prevista para cada gameta ?
Branco, curta, cacheado 162
d. Os integrantes da Ft sáo cruzados com plantas anãs,
Branco, longa, cacheado 450 com penugem e fruto alongado, sendo produzida uma
1.400 progénie do cruzamento teste com mil integrantes.
-

.
a Determine a ordem dos genes no cromossomo e iden- Quais são os fenótipos da progénie do cruzamento-
tifique os alek>s que estão presentes em cada um dos teste e quantos integrantes da progénie devem estar
cromossomos homólogos nos coelhos trifbridos. em cada classe ?
b. Calcule as frequências de recombinaçáo entre cada um
28. A neurofibromatose 1 (NH) é um transtorno autossó
dos pares de genes adjacentes.
c Determine o valor de interferência desse cruzamento.
mico dominante herdado no cromossomo humano 17 .
Parte da análise que mapeia o gene NF1 no cromossomo
26. A seguinte progénie é obtida a partir do cruzamento- 17 veio de estudos de ligação gènica que testam a se-
-teste de uma planta triíbrida do tipo selvagem com uma gregação do NF 1 e os marcadores genéticos de DNA em
planta com os fenótipos recessivos de folhas compostas vários cromossomos. Um marcador de DNA com dois ale-
.
(c), folhas pequenas intercalares (fl e frutos verdes (g) (Os los, designados 1 e 2, é ligado ao NF 1. A genealogia a se-
traç os não apresentados são do tipo selvagem.) A progé- guir mostra a segregação do NF J (símbolos escurecidos)
nie do cruzamento-teste é: e fornece os fenótipos do marcador de DNA para cada
Fenótipo Quantidade
membro da família .
Folhas compostas 324
Folhas compostas, folhas pequenas 32 I
intercalares
Folhas compostas, frutos verdes 5 II
Folhas compostas, folhas pequenas 51

• •*
intercalares, frutos verdes
Folhas pequpnas intercalares
Folhas pequenas intercalares, frutos
3
309
III
É
1, 2
'
1.2
Ó
1
É‘ í t
2.2 1, 2 2, 2 2, 2 1, 2
Ó "
2, 2
verdes a. Determine os alelos do gene Nf J e do gene marcador de
Frutos verdes 42 DNA em cada cromossomo portado pelos quatro mem-
Tipo selvagem 49 bros da família na geração I e na geração II. Use N para o
815 alelo dominante NF 1 en para o alelo recessivo e suponha
a. Determine a ordem dos três genes e construa um que M seja heterozigoto para o alelo da doença (Nn).
mapa genético que identifique a ordem correta e os b. Com base na fase dos alelos nos cromossomos na
alelos portados por cada cromossomo na planta pa- geração II, existe alguma evidência de recombinaçáo
rental triíbrida. entre os oito Integrantes da progénie na geração III?
b. Calcule a frequência de recombinaçáo entre os pares Explique.
de genes adjacentes no mapa. c. Qual é a frequência de recombinaçáo estimada entre o
c Quantos integrantes da progénie do crossing -over gene NF 1 e o marcador de DNA ?
duplo sáo previstos entre toda a progénie do cru- 29. Um estudo genético de 2006, realizado em uma grande
zamento- teste ? Calcule a Interfer ência desse cruza-
mento.
família americana (Ikeda e colaboradores, 2006), iden -
tificou a ligação gênica entre os marcadores de DNA no
27. Em tomates, o alelo Tpara a altura da planta é dominante cromossomo 11 e o gene que produz o transtorno neuro-
em relação ao alelo r, o alelo P para casca lisa é domi- muscular autossômico dominante ataxia espinocerebelar
nante em relação ao alelo p para casca com penugem, e do tipo 5 (5CA5). Os seguintes dados do k>d score foram
o alelo R para fruto redondo é dominante em relação ao extraídos do estudo de 2006:
 Capí tulo 5 Ligação e mapeamento genético nos eucarlotos 183

Valor teta (8) que tinham olhos vermelhões e formato fozenge Os cro- .
mossomos dessas moscas são retratados a seguir .
0,01 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40
SCA5 e marca-
Cf + Iz* V

dor A do DNA 11,02 12.26 11,94 10,04 7,26 3,77

SCAS e marca- cf + Iz4 v
dor B do DNA 0,35 0,94 1,07 0,99 0.75 0,43
a. Faça um diagrama do evento de recombinaçáo dentro
a. Algum dos grupos de lod score indica chances esta-
tisticamente signlficantes de ligação gènica? Explique
do gene tz e desenhe os cromossomos X recombinan -
tes resultantes, Ilustrando os alelos Iz e os marcadores
sua resposta. laterais em cada cromossomo.
b. Qual é o valor máximo de cada conjunto de lod escore ? b. Quais são os fenótipos das moscas macho da progénie
c. Com base nas informações disponíveis, o marcador A portadoras dos recombinantes intragênicos Izl (Um
do DNA é ligado ao gene que produz a SCA5? Explique cromossomo X mutado duplo portando Iz4 e tz4* pro-
sua resposta. duz um olho lozenge composto com aspecto diferente
d. Com base nas informações disponí veis, o marcador 8 do olho derivado de Iz4 ou tz*4.)
do DNA é ligado ao gene da SCA5 ? Explique sua res-
posta. 32. Em experimentos publicados em 1918 que procuravam
verificar e expandir a teoria da ligação gênlca e da recom-
30. Um experimento na Drosophila examinando a possível binaçáo proposta por Morgan, Thomas Bregger estudou
ligação genica de genes ligados ao X estuda um mutante a possí vel ligação gêmea no milho iZea mays) nos genes
recessivo dos olhos (echinus), uma mutação recessiva das que controlam a cor do grão (o grão colorido é dominante
veias das asas (crossveinless) e uma mutação recessiva em relação ao incolor) e o conteúdo de amido (o amilá-
das cerdas (scute). Os fenótlpos do tipo selvagem são .
ceo é dominante em relação ao ceroso) Bregger realizou
dominantes. As fémeas triibridas do tipo selvagem (todas dois cruzamentos. No cruzamento 1, plantas de linhagem
têm o mesmo genótipo) são cruzadas com machos he- pura com gr ãos coloridos e amiláceos (Cl Wx/CJ Wx ) foram
mlzigotos exibindo os trés fenótipos recessivos. Entre os cruzadas com plantas de linhagem pura de grãos incolo-
20.785 integrantes da progénie produzidos a partir desse . ,
res e cerosos ( d wx/d wx ) A F desse cruzamento-teste foi
cruzamento, encontram-se os fenótipos e as quantidades submetida a um cruzamento- teste com plantas Incolores e
apresentados na tabela. Qualquer fenótipo não forne- cerosas. A progénie do cruzamento-teste é:
cido é do tipo selvagem.
Fenótipo Quantidade
Fenótipo Quantidade
Colorido, ceroso 310
.
1 Echinus 8.576
Colorido, amiláceo 858
2. Scute 977
Incolor, ceroso 781
3. Crossveinless 716
Incolor, amiláceo 311
4. Echinus, scute 681
2.260
5. Scute, crossveinless 8.808
No cruzamento 2, plantas de linhagem pura e gr ãos co-
6. Scute, crossveinless, echinus 4
loridos e cerosos ( Cl wx/CI wx ) e plantas de grãos incolo-
7. Echinus, crossveinless 1.002
res e amiláceos (d Wx/d Wx ) foram cruzadas e sua F foi ,
8. Tipo selvagem 1 submetida a um cruzamento-teste com plantas de gr ã os
20.764 Incolores e cerosos. A progénie do cruzamento- teste é:
a. Determine a ordem dos genes e identifique os alelos
Fenótipo Quantidade
nos cromossomos X homólogos nas fêmeas triibridas.
b. Calcule as frequências de recombinaçáo entre cada par Colorido, ceroso 340
de genes. Colorido, amiláceo 115
c Compare as frequências de recombinaçáo e especule Incolor, ceroso 92
sobre a fonte de quaisquer discrepâncias aparentes Incolor, amiláceo 298
nos dados de recombinaçáo. 845
d. Use a análise do qul-quadrado para demonstrar que os a. Para cada grupo da progénie do cruzamento-teste,
dados nesse experimento não são resultado da segre- determine se a ligação gènica ou a segregação inde-
gação independente. pendente é mais fortemente apoiada pelos dados. Ex -
.
31 Como parte integrante de sua análise da recombinaçáo in- plique a lógica de sua resposta.
tragénica, Melvin e Kathieen Green estudaram as fêmeas .
b Calcule a frequência de recombinaçáo de cada um dos
de olhos lozenge com a mutação Iz* no cromossomo X e a grupos da progénie.
mutação 1? no cromossomo X homólogo. O cromossomo c Os resultados desses dois experimentos são mutuamente
X portador da tz9 também era portador de mutações reces- compatíveis com a hipótese da ligação gènica ? Por quê?
.
sivas para asa serrilhada (cr) e olhos vermelhões ( v) Essas .
d Misture os dois conjuntos de dados da progénie e de-
fêmeas foram acasaladas com machos de asas serrilhadas termine a frequência de recombinaçáo conjunta .
 Capítulo Aná lise e mapeamento genético

6
APRESENTAÇÃO
nas bactérias e bacteriófagos

6.1 As bactérias transferem genes por conjugação

6.2 A análise de conjugação interrompida produz
mapas de momento de entrada
6.3 A conjugação com cepas F' produz diploides
parciais
6.4 A transformação bacteríana produz recombinaçáo
genética
6.5 A transdoçáo bacter íana é mediada por
bacteriófagos
6.6 Os cromossomos de bacteriófagos são mapeados
pela análise da estrutura fina

As bactérias transferem DNA de uma para outra por meio de vários

mecanis mos, incluindo o processo de transferência genética, cha-
mado conjugação, exibido aqui O "doador" bacteriano ( á esquerda
no centro ) transfere DNA através de um tubo que o conecta ao recep-
tor "bacteriano" ( inferior á direita).

I A conjugação bacter íana é uma transferên-

cia de mão únka do material genético de
uma célula doadora para uma receptora.
Três tipos de cékilas doadoras podem con-
jugar com receptoras para transferir DNA.
I Os mapas genéticos dos doadores bactéria -
nos são derivados da análise da conjuga ção.
I Um determinado tipo de conjugação bacte-
r ana consegue produzir bactérias com ge-
í possuem uma massa de mais de 1 kg. Sem essas bactérias intesti-
nomas parcialmente diploides.
I Transformação é a absorção de DNA extra-
celular através da parede celular e da mem-
brana de uma célula bacterí ana receptora, e
sua análise leva ao mapeamento dos genes
bacterianos doadores.
I A transdução, mediada pelos bacteriófagos,
é a transferência de DNA de uma célula bac-
teriana doadora para uma célula receptora e
sua análise leva ao mapeamento dos genes
bacterianos doadores.
I A análise genética da estrutura fina de um
genoma de bacteriófago demonstrou que
os pares de base de nudeotídeos do DNA
sáo as unidades fundamentais de mutação
e da recombinaçáo.
A qui temos um segredinho perturbador sobre a vida humana:
seu corpo contém aproxímadamente 100 trilhões de células,
mas apenas 10 trilhões delas sáo suas! Os outros 90% de células
que você carrega sáo bactérias, fungos e outras formas de vida mi-
croscópica. Muitos desses "caroneiros” biológicos desempenham
funções úteis, até mesmo vitais. Por exemplo, você carrega cente-
nas de espécies de bactérias em seu intestino que, coletivamente,
nais, sua digestão dos carboidratos seria prejudicada e sua capaci -
dade para produzir nutrientes essenciais (como a vitamina B, 2 e a
vitamina K) seria desativada. As bactérias que habitam em seu tra -
to digestório também ajudam a deter as bactérias potencialmente
nocivas ao competirem resolutamente pelos nutrientes disponí-
veis. De modo similar, os milhões de bactérias que residem na sua
pele (sim, mesmo que você tenha tomado banho recentementel)
ajudam a manter a pele saudável ao competirem com as bactérias
infecciosas. Apesar dessa competição normal e saudável, as bacté-
.
rias nocivas podem conseguir entrar em nossos corpos À s vezes,
até mesmo os nossos passageiros microbianos, que normalmente
sáo úteis, voltam-se contra nós e provocam doença, infecçáo ou,
em casos extremos, morte .
 Cap í tulo 6 Análise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos
Dada a importância biológica, médica e tecnológi-
ca das bactérias e de outros microrganismos, náo é de
admirar que sejam estudados de maneira intensa na
genética moderna, usando a bactéria Escherichia coli e
a levedura Saecharomyces cerevisiae como organismos
genéticos modelo. A facilidade relativa de estudar os
microrganismos impulsionou a mudança revolucioná-
ria na genética na última metade do século XX. Grande
parte das informações Iniciais na genética molecular e
muitos dos métodos de análise genética pioneiros no
estudo das bactérias provaram- se valiosos no estudo
dos organismos mais complexos.
Neste capítulo, examinamos a genética das bactérias
e aprendemos como os mapas de seus genomas sáo cons-
truídos. Adotamos uma abordagem genética em nossa
discussão, concentrando-nos nas técnicas genéticas uti-
lizadas para mapear os genes nos genomas bacterianos.
O sequenciamento do genoma se tornou disponível em
mais de mil genomas bacterianos nos últimos anos e es-
ses bancos de dados de sequenciamento têm uma enor-
me utilidade (Capitulo 18). No entanto, nosso foco aqui é
na investigação e compreensão de como aplicar a análise
genética ao estudo de transferência e mapeamento ge-
nético nos genomas bacterianos e bacteriófagos.
Começamos examinando três mecanismos pelos
quais o DNA pode ser transferido de uma bactéria para ou-
tra. Após mostrarmos como a aná lise desses processos aju-
da os geneticistas microbianos a localizarem as posições
dos genes no cromossomo bacteriano, o capitulo passa
para uma discussão sobre bacteriófagos, os vírus que in-
fectam as células bacterianas. Ele descreve experimentos
que levaram a um mapa da estrutura fina de um genoma
bacteriófago e forneceram uma ponte essencial entre a
transmissão genética e a genética molecular moderna.
6.1 As bactérias transferem genes por
conjuga ção
As bact érias se propagam por fissão biná ria, um
processo no qual o cromossomo bacteriano replica e
uma cópia é distribu ída para cada uma das células da
progé nie, com uma parte do conteúdo da célula divi
dida. Em uma questão de horas, essa forma de propa
gação clonal consegue gerar uma “coló nia” contendo
milhares de células bacterianas geneticamente idê nti
cas. No entanto, a capacidade das bactérias para pro -
duzir coló nias de clones náo significa que elas nunca se
recombinam geneticamente. Vá rios estudos nos anos
1940 e 1950 identificaram e descreveram os três meca -
185
nismos de transferência genética e recombinaçào entre
as bactérias que são o foco deste capítulo.
As bactérias sã o um grupo taxonómico altamente
diverso, sendo essenciais para o estudo genético. Entre
as caractcr ísticas que tomam as bacté rias tào ú teis para
os geneticistas, temos:
I Simplicidade genò mica. A maioria dos genomas
bacterianos contém menos genes e pares de base em
seus genomas haploides que os outros organismos.
I Gen ótipos descomplicados. O genoma haploide da
maioria das bactérias permite que todas as mutações
sejam observadas diretamente, sem a interferência
das interações de dominâ ncia entre os alelos.
Tempos de geraçã o rápidos. As bactérias se repro -
duzem de maneira prolífica; seus tempos de geração
podem ser medidos em minutos.
Progénies numerosas. Quantidades imensas de
progé nie clonal podem ser examinadas, aumentando
a probabilidade de que eventos estatisticamente
raros venham a ser observados.
Facilidade de propagação. Os micróbios podem
ser cultivados em um meio de cultura líquido ou em
placas de cultura . As culturas são f áceis e baratas de
manter e exigem pouco espaço no laborató rio.
I Muitas diferenças herdáveis. Os mutantes são fa
cilmente criados, identificados, isolados e manipula
--
dos para exame.
Uma atividade de interesse central neste capítulo
é a propensão das bactérias para transferirem material
gen ético de uma para outra. A transferê ncia ocorre
por meio de três processos: conjugação , a transferên
cia de DNA replicado de uma bactéria doadora para
-
uma receptora; transformação, a captação do DNA do
ambiente por uma bact éria receptora; e transduçào, a
transferê ncia do DNA de uma bacté ria doadora para
uma receptora por meio de um vetor virai. Cada um
desses mecanismos envolve uma transferê ncia de
mão ú nica do material genético de uma célula doa
dora bacteriana para uma célula receptora. O DNA
-
transferido é um plasmideo extraclonal ou uma parte
do cromossomo bacteriano doador. Muitas vezes, os
plasm ídeos transferidos para as células receptoras tra -
zem novos genes que mudam o comportamento de
crescimento das células receptoras. Alternativamente,
os plasmídeos podem carregar uma segunda có pia
dos genes que já existem no cromossomo bacteriano.
Quando o DNA do cromossomo bacteriano da célula
doadora é transferido para uma bact é ria receptora, as
- partes hom ólogas das moléculas de DNA do doador
- e do receptor podem sofrer recombinaçà o, levando
a uma mudan ça no genótipo da célula receptora . In -
- dependentemente da natureza do DNA transferido
das células doadoras para as receptoras, a chave para
compreender o processo é lembrar que se trata de uma
via de m ão ú nica: o material genético passa do doador
para o receptor.
186 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Caracterí sticas dos genomas bacterianos
Os genomas bacterianos normalmente são compos-
tos de um ú nico cromossomo que carrega basicamente
genes essenciais — os genes necessários para as ativi-
dades metabólicas e de crescimento da espécie. O cro-
mossomo bacteriano normalmentc é uma molécula de
Condizente com o pequeno tamanho do genoma de
—
DNA de fita dupla circular e fechada covalentemente.
algumas centenas de milhares a vários milhões de pares
—
de base o cromossomo bacteriano também costuma
ser bastante pequeno, variando também de algumas cen -
tenas de milhares a vá rios milhões de pares de base. São
encontradas exceções ocasionais. Por exemplo, o gê nero
bacteriano Vibrio tem um genoma contendo dois cro-
mossomos bacterianos, designados cromossomo I e cro - por conta própria, já que sua replicação está vinculada à
mossomo 11, com o primeiro sendo consideravelmente
maior que o segundo (ver Capitulo 11) .
Além do cromossomo bacteriano principal, a
maioria das bactérias também carrega vá rias cópias de
plasmídeos, pequenas moléculas de DNA de fita dupla
circulares contendo genes não essenciais, usadas rara -
mente ou em condições muito específicas e que não são
encontradas normalmente pelas espécies ( Figura 6.1 ). Os
plasmídeos variam amplamente quanto a seu n úmero de
genes e seu n úmero total de pares de base, mas sempre
são consideravelmente menores que os cromossomos
bacterianos. Os plasm ídeos sâo descritos como DNA ex-
tracromossômico, significando que geralmente sâo sepa -
rados do cromossomo bacteriano, embora encontremos
algumas exceções no decorrer deste capítulo.
Muitos tipos diferentes de plasmídeos que ocorrem
naturalmente são encontrados nas bactérias e cada um
deles contém vários genes. Um plasmídeo que iremos
discutir, chamado plasmídeo F (fertilidade ), contém
genes que promovem sua própria transferência de uma
bactéria doadora para uma receptora. Outro tipo de plas -
mídeo que discutimos, conhecido como plasmídeo R
Célula rompida
da E. coli
Figura 6.1 Cromossomo bacteriano plasm ídeos.
•
Uma célula rompida de £ coli liberou seu DNA
cromossômko com vá rios plasm ídeos ( vermelho).
( resistência ), carrega genes de resistência antibiótica que
podem ser transferidos dos doadores para os receptores.
Os plasmídeos são modificados facilmente no laborató rio
para produzir características específicas ou para carregar
determinados genes ú teis em uma ampla gama de aplica-
çóes do DNA recombinante (ver Capítulos 16 e 17).
Muitos plasmídeos são capazes de replicar por conta
própria, de modo independente da replicação do cro
mossomo bacteriano. Consequentemente, o n úmero de
plasmídeos em uma única célula bactenana pode aumen -
tar rapidamente e esses plasm ídeos costumam ser identi-
-
ficados como plasm ídeos de "alto n ú mero de cópias". O
n ú mero real é variá vel e depende em grande parte do tipo
de plasmídeo em questão. Os plasmídeos de baixo n ú-
mero de cópias frequentemente são incapazes de replicar
do cromossomo bacteriano. Esses plasmídeos, conheci -
dos como “de baixo n ú mero de cópias", estão presentes
em 1 ou 2 có pias por célula bactenana, enquanto 50 ou
mais plasm ídeos de alto n ú mero de cópias podem ser en-
contradas em cada célula. Como você verá em breve, os
plasm ídeos de alto n ú mero de cópias desempenham um
papel fundamental na conjugação e na análise da transfe
réneia e mapeamento genético bacteriano.
Conjugação identificada
A transferência do DNA bacteriano foi identificada
pela primeira vez por Joshua Lederberg e Edward Tatum
em 1946. Eles usaram duas cepas auxotróficas triplas dc £
coli que tinham requisitos nutricionais diferentes para o
crescimento (ver Seção 43 para obter uma revisão de pro-
totrofia e auxotrofia ). Primeiro os pesquisadores estabe-
leceram trés culturas bacterianas diferentes, inicialmente
cultivadas em um meio completo ( Figura 6.2). Na cultura
O, eles cultivaram uma cepa auxotrófica chamada Y-24,
.
que tem o genótipo bio leu* cys phr thr* thi* Em razão
' '
-
de seu genótipo, a cepa Y 24 requer a adição da vitamina
biotina ( bio ) e dos aminoácidos cisteína (çjes) e fcnilalanina
( phe) a um meio mínimo para crescer. Na cultura £), eles
-
colocaram uma cepa auxotrófica chamada Y 10, que tem
-
o genótipo bio’ leu cys' phe’ thr thi . A cepa Y 10 requer
a adição da vitamina tiamina ( thi ) e dos aminoácidos leu -
dna ( leu ) e treonina ( thr ) para crescer. A cultura O conti-
nha uma mistura igual de Y-10 e Y-24.
Eles deixaram que cada cultura crescesse. Depois,
aproximadamente 10* células de cada cultura foram co
locadas em placas de meio mí nimo, onde é necessário
-
um genótipo prototrófico ( tipo selvagem ) para o cresci-
mento. Lederberg e Tatum não observaram crescimento
nas placas 1 e 2, que continham células transferidas da
cultura O e da cultura O, respectivamente. Esses resul
tados foram coerentes com os requisitos nutricionais da
-
Y-24 e da Y-10 e indicaram que todas as células transfe-
ridas dessas placas eram auxótrofas. No entanto, a placa
3 desenvolveu cerca de cem colónias! Essas colónias
cresceram a partir de células bacterianas que tinham
adquirido de algum modo o genótipo prototrófico ( bio*
leu * cys' phe thr' thi ).
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos 187

Cultura O Cultura 0 mitiam a passagem de pequenas moléculas como os nu -

trientes, mas não as células bacterianas. Uma bola de al
god ão tampando uma extremidade do tubo em U
-
e uma
rolha de borracha conectada a uma linha de ar na outra
extremidade permitiram que Davis movesse o material
no tubo alternando sucção e pressão. O tubo continha
Cultura
Y-24 -
~ met' bio' leu Ycys10' phe' thr thi~ uma cultura da cepa Y- 10 da £ coli em um lado do disco
meT bio leu' cys pbe thr' thi'
' '

5 '

de vidro e uma cultura da cepa 58-161, auxotrófica para a

Crescimento em Crescimento em
meio completo. meio completo.
i i
Transferênca para Transferência para
meiominímo. meio mínima
- -
Y 24 e Y 10
Crescimento em meio completo.
I traindo essas amostras de cada lado do tubo cm U e colo-
Transferência para meio m ínimo.
Nenhum Cresorrvento Nenhum
crescimento da colónia crescimento
As células
Todas as prototróficas Todas as
células sáo
auxotrófica*
crescem
/ bic* leu' cys \
'
células sáo
auxotróficas
\ phe* thr' thT l
Figura 6.2 Detecçào da recombinaçào entre as células
auxotr óficas da £ coU feita por Lederberg e Tatum. As
cepas bacterianas auxotróficas ( > Y-24 e 0 Y- l 0 contém vá rias
mutações cada uma e crescem em meio completo, mas náo
em meio mínima A mistura das cepas leva à formação de
bactérias prototróficas que crescem em meio m í nimo.
Lederberg e Tatum estavam certos de que esse re
sultado náo resultou da reversão (mutação reversa ) dos
auxótrofos para protótrofos ( reversão é a mutação que
produz um alelo do tipo selvagem a partir de um alelo
mutado). Primeiro, as chances de que muitos genes re-
vertam de uma só vez são proibitivamente pequenas. Se-
gundo, as placas 1 e 2 serviram como placas de “controle
negativo". Se a reversão fosse a responsá vel, essas placas
exibiriam crescimento de colónias. Em vez da reversão,
os pesquisadores alegaram que houve uma transferência
de material gen ético. Maís especificamente, eles pro-
puseram que uma cepa auxotrófica estava transferindo
parte de seus alelos prototxóficos para a outra cepa au-
xotrófica quando as duas cepas foram misturadas e que a
segunda cepa estava substituindo seus alelos auxotróficos
ao incorporar a informação prototrófica da primeira.
Lederberg e Tatum formularam a hipótese de que
o contato íf sico entre as bactérias era necessário para a
transferência genética, mas seu experimento original não
forneceu evidências diretas de que poderia ser assim.
Quatro anos mais tarde, Bemard Davis replicou o traba -
lho de uma maneira que mostrou a necessidade de con
tato entre as células bacterianas para ocorrer a transfe
rência genética. Para esse experimento, Davis construiu
um tubo em forma de U com um filtro de vidro fino
separando um braço do outro (Figura 6.3 ). O filtro era
um disco de vidro com poros muito pequenos que per-
síntese da metionina { met ), no outro lado do disco.
A partir dos experimentos anteriores, Davis sabia
que, sem uma barreira, as bactérias prototróficas são pro-
duzidas pela transferência genética entre essas duas cepas
bacterianas. Após alternar sucção e pressão durante várias
horas, Davis colocou amostras bacterianas em placas, ex
cando em meio mínimo, descobrindo que não houve cres-
cimento em nenhum dos dois lados do tubo. Essa ausência
de crescimento foi uma indicação de que as células em
ambos os lados do disco retiveram sua auxotrofia. Davis
conduiu que o contato í f sico entre as células bacterianas é
necessário para ocorrer transferê ncia genética.
Estudos microscópicos confirmaram a união í f sica
entre as bactérias, hipótese aventada por Lederberg e
Tatum e apoiada por Davis. Esse processo de transferên
.
cia de genes se chama conjugação Figura 6.4 ) Uma das
-
bactérias participantes, conhecida como célula doadora,
transfere parte de sua informação genética para a outra cé-
lula, conhecida como célula receptora. A informaçã o ge-
nética é transmitida por meio de um tubo oco, conhecido
como “ pelo” de conjugação ou tubo de conjugação, que
conecta fisicamente a célula doadora e a receptora.
Transferência do fator F
- Em 1953, William Hayes descobriu que as bactérias
que interagiram no experimento de Lederberg e Tatum
e no experimento de Davis náo contribuíram igualmente
para o resultado genético, como o fazem em um cruza -
mento genético entre eucariotos. Em vez disso, o processo
foi desigual: uma das bactérias, a doadora, pareceu trans-
ferir parte de sua informação genética para a outra bacté-
ria, a receptora. Hayes identificou essa diferença quando
se deparou com uma cepa bacteriana que antes agia como
doadora, mas que perdeu sua capacidade doadora por um
motivo desconhecido. Em cruzamentos subsequentes de
sua cepa antes doadora e agora “esterilizada ”, Hayes cons-
tatou que a cepa era capaz de readquirir seu estado de doa -
dora se fosse conjugada com outras doadoras. Essa consta-
tação levou Hayes a concluir que ocorre uma transferência
genética de mão única entre doadores e receptores.
Hayes propôs ainda que a capacidade para agir
como doador era hereditá ria e determinada por um
“ fator de fertilidade" ( fator F) que era intransfer ível dos
doadores para os receptores. As células doadoras são
- designadas como F* (células F*) para indicar que pos-
- suem um fator F e as receptoras sáo identificadas como
F (células F ) e não possuem o fator F. Nos anos após
a proposiçã o da exist ência do fator F por Hayes, micro
biólogos identificaram o fator F como o plasm ídeo F
-
( plasm ídeo da fertilidade).
188 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 6.3 Experimento do tubo

em U de Davis mostrando que
a recombina çã o genética exige
contato entre as células. As cepas
-
bacterianas auxotróficas Y 10 e 58 -
161 não conseguem crescer em
meio mínimo, mas produzem alguns
protótrofos que crescem nesse meio
m ínimo quando entram em contato
após a mistura . Os protótrofos não sáo
produzidos quando os auxótrofos são
colocados em um tubo em U, indicando
Cultura pura de Y 10
thr ku~ thT mtt*
- -
Cultura pura de 58 161
thr* teu* thT mer
que o contato direto é necessá rio para
Sjcçáoe
gerar bactérias prototróficas. 1
1 pressão
r O ©
Algod ã o 1
a
alterradas

Y-10
— Mistura
de Y-10
-
e 58 161
58-161
— -
Y 10
— — 58-161
Pequeras
moléculas vão e

i i
Transferénca para o meio mínimo
r\ vém através do
fttrai mas ascélulas
bacterianas, não.

Nenhuma Col ó nias Nenhuma Nenhuma Nenhuma

colónia prototr óficas colónia colónia colónia
j
Experimentos de controle Experimento do tubo em U

Hoje os microbiólogos sabem que a conjugação é con-
trolada pelos genes portados pelo plasm ídeo F. Cximo con-
sequência, apenas ascélulas doadoras iniciam a conjugação.
As células receptoras (células F ) são incapazes de iniciar a
conjugação. Consequentemente, a conjugação ocorre entre
uma célula doadora e uma receptora, mas não entre duas
células doadoras. Os genes do fator F dirigem a construção
de pelos que têm funções sensoriais. Um pelo se especializa
Célula doadora Pelo de conjuga çã o Célula receptora
Figura 6.4 Conjugação bacteriana. A bactéria doadora
faz contato com a receptora c transfere DNA através do pelo
de conjugação.
para servir como o pelo (tubo) de conjugação que conecta
a doadora à receptora, formando o conduto através do qual
o DNA da célula doadora é transferido (ver Figura 6.4). Por
fim, três tipos de células sáo observados na conjugação:
uma célula doadora que contém um plasmídeo F e doa
informações genéticas, uma célula receptora que recebe o
DNA de uma célula doadora, mas não contém um fator F
funcional, e a célula exconjugante, que é produzida pela
conjugação. Uma célula exconjugante é essendalmente
uma célula receptora que teve seu conteúdo genético mo-
dificado ao receber o DNA de uma célula doadora.
O fator F tem aproximadamente 100 kb de compri -
mento e 35% de sua sequência é dedicada a aproximada -
mente 40 genes que controlam a conjugação ( Figura 6.5) .
Os genes do plasmídeo F que desempenham um papel na
conjugação da £ coli recebem designações de quatro le-
tras, consistindo no prefixo Ira ou Irb, seguido por uma
letra maiuscula. Grande parte do resto do fator F consiste
em quatro elementos de sequência de inserção (IS): uma
cópia do 1S2, duas cópias do 1S3 e uma cópia do 1S1000
muito grande. Os elementos de sequ ê ncia de inserção
(IS) sáo segmentos móveis de DNA bacteriano capazes de
transpor a si mesmos por todo o gennma bacteriano e que
têm um papel funcional importante na transferência gené-
tica bacteriana ( ver Capítulo 12) .
A conjugação entre uma célula F* doadora e uma
célula F receptora transfere uma cópia do fator F e pro -
duz exconjugantes que são células F + doadoras, conforme
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos
( a ) Genes Importantes na transfer ência do fator F
oriT
Plllna -QroA
trolj- Relaxase
Proteí nas
exportadoras -
Jjjt/ oK
<
Fator F
íop troO }- Proteí nas
de ligação
( b) Sequência oriT
Pares de base
1 10 20 30
5“
t
3'
Sítio de clivagem
Figura 6.5 Estrutura do plasm ídeo F. (a ) Vá rios genes
importantes na transferência do fator F sào mostrados, bem
como a origem da transferê ncia { oriT ). ( b ) A sequência de 38
pares de base do oriT , incluindo o sítio de clivagem.
ilustrado na Figura 6.6 . A conjugação começa com o con -
tato entre a célula F‘ e a célula F , contato iniciado pela
' as duas extremidades da oriT se unem para tomar a molé-
formaçã o de um pelo de conjugação. Estes são compos-
tos de proteína pilina, produzida pelo gene traA no fator
F (ver Figura 6.5). Elementos do DNA circular, como o
fator F, que podem se replicar independentemente do
cromossomo bacteriano ou, como discutiremos na pró-
xima seção, podem vir a integrar o cromossomo bacte-
riano e se replicar como parte integrante desse cromos-
somo, também são chamados epissomos.
Logo após o estabelecimento do contato através do
pelo de conjugação, a expressão gênica do fator F pro -
duz um complexo proteico chamado relaxossomo. Esse
complexo proteico se liga a uma sequência especializada
do fator F, chamada origem de transferê ncia ( oriT ) . Na
oriT, o relaxossomo catalisa a clivagem de uma ligação
fosfodiéster em uma fita do DNA, chamada fita T, para
indicar que essa é a fita transferida para a célula recep-
tora. A clivagem do DNA na oriT define uma extremi -
dade 3' c uma extremidade 5’ na fita T e inicia algum de-
senrolamento do DNA duplex nas vizinhanças da oriT.
O dcscnrolamcnto da fita T libera a maioria dos com-
ponentes do relaxossomo, mas uma proteína, chamada
relaxase, o produto do gene trai, se liga à extremidade 5'
livre da fita T do DNA para formar um complexo nucleo-
proteico. Esse complexo nucleoproteico fornece um sinal
de reconhecimento crítico para uma proteí na chamada
proteína de ligação, o produto do gene traD, que assume
uma posição perto da entrada do pelo de conjugação. O
complexo nucleoproteico se liga brevemente à proteína de
ligação e depois se afilia a várias proteínas do complexo ex
portador que movem o complexo nucleoproteico e a fita
T através do pelo de conjugação e para a célula receptora.
A transferência da fita T através do pelo de conjuga -
ção é acompanhada por um processo especializado de re-
plicaçào do DNA, conhecido como replicação por dreu
los rolantes, dentro da célula doadora. Nesse processo de
replicação unidirecional especializado, uma Fita do DNA é
enrolada através do pelo de conjugação ao mesmo tempo
189
que, dentro da célula doadora, a fita de DNA restante serve
como um modelo para a síntese unidirecional de uma fita
de DNA substituta. Na célula receptora, a fita de DNA en -
rolada age como um modelo para a síntese do DNA. Dis-
cutimos os detalhes da replicação do DNA no Capítulo 7.
A replicação por círculos rolantes começa na oriT ,
onde a ruptura da fita ú nica no DNA expôs a extremi -
dade hidroxila 3' da fita T. Nessa extremidade exposta,
a DNA polimerase adiciona novos nudeotídeos, utili
zando a fita de DNA complementar intacta como mo-
-
delo. A replicação do novo DNA que ocorre durante a
replicação por círculos rolantes acaba deslocando a ex
tremidade 5' da fita T, liberando- a para ser transferida
-
através do pelo de conjugação para a célula receptora.
A conclusão da replicação por dreulos rolantes na cé-
lula doadora restaura o fator F da fita dupla da célula doa-
dora , deixando intacto o estado de doadoras das células F\
Nesse meio tempo, dentro da célula receptora, a fita T im -
portada age como um modelo dirigindo a síntese de uma
fita de DNA complementar. Na conclusão desse processo,
cula dreular, completando a criação de um fator F na célula
receptora. Com a presença de um fator F, a célula F , que "
era receptora, é convertida para uma célula F doadora.
4
A Ta beia 6.1 enfatiza duas características dignas de
nota da conjugação F x F~. Primeiro, a transferência com -
4
pleta do fator F converte a célula F receptora em uma cé-
"
lula F doadora. Segundo, nenhum gene cromossòmico
4
bacteriano doador é transferido durante esse processo de
conjugação. Apenas o DNA do fator F é transferido para
uma célula F receptora por uma célula F‘ doadora. Você
pode se lembrar que Lederberg e Tatum forneceram evi
dências claras da transferência genética cromossômica de
-
uma cepa bacteriana para outra e que Davis mostrou que
a conjugação era necessária para a transferência ocorrer.
No entanto, a conjugação F x F não é responsá vel pelas
4 "
observações de Lederberg e Tatum; a conclusão lógica é
que deve haver algum outro tipo de conjugação, talvez en -
volvendo tipos diferentes de células doadoras bacterianas,
para transferir genes cromossômicos bacterianos de uma
célula doadora para uma receptora.
Observação genétka A conjugação bacteriana è contro-
lada pelos genes do fator F que dirigem a formação de um tubo
de conjugação entre as células doadoras e as receptoras. A con-
juga ção doadora receptora leva à transferência de DNA pela re
pllcaçáo por círculos rolantes. As células F doadoras tra nsferem
4
apenas o DNA do fator F para as céí ulas F~ receptocas.
- Formaçã o de um cromossomo da Hfr
A evidência experimental descrita até este ponto
demonstra que a E coli possui a capacidade de trans
ferir genes do cromossomo da bactéria doadora para o
- cromossomo da receptora . O contato entre as bactérias
doadoras e receptoras é necessá rio para a transferê n-
cia genética . No entanto, essa capacidade nã o pode ser
explicada pela conjugação envolvendo uma F“ doadora
190 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Célula Origem da Célula receptora

doadora (P) transferência { orfT ) IF )
Desenvolvimento
do pelo de
conjugar ão
A cê ula doadora (F ) monta um pelo de
*

conyjgaçào oara farer contato com a

Exportadora céu la 'pceptora (F ).
Fator de ligação /

Relaxossomo

0 complexo do reiaxosscmo se liga ao

fator f na oríTe clfva a f ta T do DMA

Relaxossomo
degradado
Replica ção -
0 relaxossomo degrada pa nalmente,
^ ^*
deixando a relaxase ligada á extremi-
dade 5'da f ta T. 0 complexo retaxase-
-fita T se bga a jm fator de Igação para
se preparar para a exponaçáa A
rcpr cação do DNA por círculos rolantes
começa na célula doadora

A exportadora movimenta o complexo

relaxase-frra T para a célula receptora.
A replicação por círculos rolantes na
céluia doadora enrola a fita T na célula
.
receptora onde serve como modelo
para a rep «ração do DMA.

0 térmiro da replicação em ambas as

céu las detxa a doadora (F ) intacta e
converte a célula receptora para um
estado P de célula doadora.

.
Figura 6.6 Conjugação das c élulas P e F A replicação por círculos rolantes transfere uma única fita do fator F, começando
'

na orfT, de uma célula doadora para uma receptora, onde é replicada para converter a célula receptora (F~) em uma doadora F\

doador. O dilema com o qual os biólogos se depararam

Tabela 6.1 Resultados da conjugação bact é ria na
foi como conciliar os resultados do experimento de Le-
Conjugação Resultado derberg e Tatum e do experimento de Davis com o que
Exconjugante Genes bacterianos se sabia até então sobre as F’ doadoras.
convertida para o doadores transferidos
estado de doadora? para a exconjugante ?
A solução veio em 1953, em um experimento rea
lizado por Luigi Luca Cavalli Sforza, que descobriu que
-
F+ xF Sim, P F~ Não uma forma da bactéria doadora antes desconhecida era
Não Sim responsável pelas transferências genéticas observadas
Hfr x F "

por Lederberg, Tatum e Davis. Trabalhando com uma

P x F‘ Sim, F F' Sim
-
£ coli doadora mutagenizada, Cavalli Sforza identificou
cepas doadoras que transferiam genes de bactérias doa -
porque, na conjuga ção F* x F , apenas os genes no plas-
~
doras para receptoras em uma taxa extraordinariamente
m ídeo F são transferidos, nâo os genes no cromossomo alta. Cavalli-Sforza chamou essas cepas bacterianas de
 Cap í tulo 6 Aná lisee mapeamento genéticonas bactériase bacteriófagos
cepas de recombinação em alta frequê ncia, ou cepas
Hfr, para indicar a alta taxa em que os genes doadores
das Hfr recombinavam com o cromossomo das F recep
-
toras. Cavalli Sforza também determinou que a conjuga
ção envolvendo as doadoras Hfr e as rcceptoras F quase “
nunca convertiam as receptoras para doadoras F ou Hfr.
4
O exame microscópico da cepa Hfr de Cavalli Sforza -
e de outras cepas Hfr isoladas da natureza revelou uma
diferença importante na configuração do fator F. Em vez
de ser um plasmídeo extracromossòmico, o fator F nas
cepas Hfr está integrado no cromossomo bacteriano, for
mando um cromossomo da Hfr Figura 6.7 ). A formação
dos cromossomos da Hfr é rara: apenas 1 em cada 100 mil
células F* é convertida para uma célula Hfr. O evento de
integração que forma o cromossomo da Hfr ocorre nos
elementos IS. Os plasmídeos F podem ter vários elemen
tos IS, e os cromossomos bacterianos tém vários desses
elementos. Com base nisso, 20 a 30 cromossomos da Hfr
diferentes podem ser formados em algumas espécies bac
téria nas. O n ú mero atual varia entre as cepas bacter
íanas.
Dois atributos de seus fatores F integrados nos cro-
mossomos da Hfr distinguem uma Hfr da outra. Pri
meiro, a localização da integração do fator F varia entre
as cepas Hfr: isso pode ocorrer em qualquer um dos
sítios de IS presentes no cromossomo bacteriano. Se-
gundo, o fator F integrado pode ter uma de duas orien-
tações diferentes em cada local de integração. A integra
ção de um fator F para formar um novo cromossomo da
Hfr ocorre apenas uma vez, estabelecendo uma cepa Hfr
com um sítio de inserção do fator F e uma orientação do
fator F que são características fixas de todas as bactérias
Cromossomo bacteriano Fator F
Célula F4 oriT
9\
Elemento
delS
I
Recombinação do cromossomo bacteriano
e do fator F em um elemento de IS
Integra ção do fator F
.
Figura 6.7 Cromossomos da Hfr As células da Hfr carregam
um cromossomo da Hfr criado quando um fator F se integra a
uma sequência de inserção ( IS) no cromossomo bacteriano.
191
da linhagem Hfr resultante. Tanto a localização quanto
a orientação do fator F sã o importantes de se considerar
- no mapeamento dos genes bacterianos nos cromosso-
- mos da Hfr, como discutimos na Seção 6.2.
Transferência do gene da Hfr
As bactérias Hfr transferem material genético para
as células receptoras pelo mesmo processo de replicação
por círculos rolantes encontrado na conjugação F' x F . '
Assim como na conjugação F* x F , o relaxossomo se liga
- à oriT e corta a fita T para iniciar o desenrolamento e a
transferência dessa fita para a célula receptora. Uma parte
do fator F integrado é transferida em primeiro lugar , se-
guida pelos cromossomos bacterianos e, finalmente, pelo
restante do fator F integrado. Teoricamente, o cromos-
- somo da Hfr inteiro poderia ser transferido durante a
conjugação Hfr x F , mas na realidade isso é impossível.
‘
O movimento normal das bactérias vai romper o pelo de
- conjugação bem antes de a transferência da Hfr ter sido
completada. A transferê ncia completa da Hfr levaria
-
aproximadamente 2 horas para acontecer — um inter -
valo que ultrapassa muito a duração da conjugação. Nos
experimentos de conjugação, sua duração é estocástica.
Alguns eventos de conjugaçã o são muito curtos, outros
bem longos, e outros ainda são de duração intermediária.
O segmento de DNA da fita T que é transferido com
- êxito para a célula receptora é utilizado como um modelo
de DNA para gerar um fragmento linear de fita dupla.
Em qualquer ponto que o pelo de conjugação se romper,
essa conjugação é interrompida , cessando a transferência
e a replicação da fita T. A Figura 6.8 ilustra a conjuga -
ção entre uma Hfr com o genótipo thr* leu stor* e uma
*
F- com o genótipo thr leu 4 S/T* (a função do s/r* e do s/r*
é explicada momentaneamente). Dentro da célula recep-
tora, o DNA da doadora é um fragmento de DNA linear
de fita dupla contendo uma parte do fator F e um seg-
mento do DNA bacteriano da doadora que era adjacente
à oriT. Sem a sequência completa da oriT , o DNA linear
não pode se tornar circular; e como apenas uma parte
do fator F é transferida , as doadoras I ífr não conseguem
converter as células receptoras F para um estado doador
"
(ver Tabela 6.1). No entanto, antes de o segmento linear
do DNA doado sofrer degradação enzimá tica na célula
receptora, ele pode sofrer recombinação homóloga com
o cromossomo receptor. A nova célula exconjugante, que
antes era a célula receptora, pode adquirir, assim , um ou
mais genes do cromossomo bacteriano doador.
Os experimentos de conjugação misturam uma cepa
de bactérias doadoras em um recipiente de cultura com
uma cepa diferente de bactérias receptoras. As exconju-
gantes produzidas dentro do recipiente podem ser iden
tificadas pela aquisição de genes da célula doadora. As
-
exconjugantes são identificadas por seus genótipos, que
sáo diferentes dos genótipos da cepa doadora ou da re -
ceptora. As exconjugantes são identificadas por seu cres-
cimento em um meio seletivo de cultura, um meio con -
tendo compostos que permitem o crescimento apenas das
exconjugantes com genótipos específicos e que também
impedem o crescimento de células doadoras e receptoras.
192 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 6.8 Conjugação da Hfr e Mistura na cultura de corvjgaçáo.

detec çã o da axconjuganta. Um
fragmento cromossô mko da Hfr Doadora Hfr thr teu sfr* Receptora F" thr teu’ strA
transferido durante o pareamento Plasmideo R
interrompido entre uma célula doadora Cromossomo
Hfr com uma célula receptora F pode
*
bacteriano thr
— oriT x
sofrer recomb í naçã o homóloga teu*
com o cromossomo receptor. As teu thT I
str *
exconjugantes sá o detectadas no
meio seletivo de cultura, como o meio Conjugação e transferência parcial da faa
m ínimo exibido aqui. T em razão do pareamento interrompida
Sitios de croiií nç-over Segmento do fator F

Reccmbinaçâo
IxxnóOga

/ Fragmento
cromossômico
doador

Degradação
enõmá tka
Em experimentos desse tipo, a sensibilidade e a re - thr ,
sistência aos antibióticos sào utilizadas como ferramentas I
para controlar o crescimento de bactérias. Nas células re - leu '
str
ceptoras, a resistência ao antibiótico estreptomicína { str*)
é proveniente de um gene portado por um plasmídeo R Tipo de célula
extracromossô mico (ver Figura 6.8). A célula doadora é exconjugante

.
sensível à estreptomicina (str*) mas isso se deve à ausên
cia de um plasmídeo R, e não à presen ça de um alelo para
- thr * teu * ífr *

a sensibilidade à estreptomicina. Portanto, a resistência à thr

estreptomicina é um atributo gcnot í pico das células recep-
teu*
toras e exconjugantes, mas não das células doadoras, e sua I
presença no meio seletivo de cultura vai eliminar as células str *
doadoras, de modo que elas não crescem e possivelmente
-
confundem a análise. Na pesquisa de Cavalli Sforza, os an
tibióticos foram utilizados no meio seletivo para permitir
- Me o mínimo acrescido de estrepromicma

o crescimento das células bacterianas portadoras de genes

de resistência e para eliminar as bactérias não portado
ras de resistê ncia. Do mesmo modo, os compostos nutri
cionais como os aminoácidos foram utilizados para apoiar
o crescimento de certas cepas auxotróficas.
Como exemplo, considere um experimento de con
juga çã o envolvendo uma cepa Hfr suscet ível à estrep-
tomicina (str*) portadora dos alelos thr* e leu ( para a
biossíntese do aminoácido treonina e a incapacidade de
sintetizar a lcucina ). Imagine que a cepa F seja incapaz
de sintetizar a treonina ( thr ) , mas capaz de sintetizar
a leucina ( leu* ) e resistente à estreptomicina (str*). O
meio seletivo necessá rio para cultivar e isolar as excon
jugantes nesse caso é uma placa de meio m í nimo com
adição de estreptomicina. A estreptomicina no meio se
letivo elimina as células doadoras str* , e a ausência da
treonina impede o crescimento das células receptoras
.
não recombinantes Todas as células em crescimento na
-
-
-
Somente as excorjugantes thr teu' str* crescem.
Na Figura 6.8, um segmento do DNA doador con -
tendo thr leu é exibido alinhado com sua contraparte
homóloga no cromossomo bacteriano receptor, con-
- tendo thr leu* . A recombinaçâo homóloga pode substi-
tuir um segmento do cromossomo receptor por um seg-
- mento de DNA homólogo do cromossomo doador. No
caso mostrado aqui, dois Crossing overs transferem o thr
do DNA doador para o cromossomo receptor, de modo
que as exconjugantes têm o genótí po thr leu str* '

placa seletiva são thr leu* str* , um gen ót í po que pode - Com ou sem a recombinaçâo homóloga para formar
ria ocorrer apenas nas exconjugantes. uma exconjugante, o destino final do DNA linear nas cé-
 Cap í tulo 6 Análise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos
lulas bacterianas é a degradação enzimá tica pela ação das
enzimas nucleases. Se as nucleases alcançarem o DNA
doado antes que ele possa se ligar e recombinar com o
cromossomo receptor, a formação da exconjugante é
bloqueada. Sc a recombinaçáo não ocorrer, forma-se um
cromossomo exconjugante e o segmento do cromos
somo receptor emendado durante a recombinaçáo é de
gradado junto com o restante do DNA doado.
Para nossa finalidade, a conjugação entre uma célula
doadora Hfr e uma célula receptora F tem dois resul
"
tados fundamentais. Primeiro, a transferência de um ou
ma is alelos doadores para o cromossomo receptor pela
recombinaçáo homóloga forma um cromossomo excon
jugante. Segundo, o fator F não é transferido totalmente
durante a conjugação e, portanto, a célula receptora F‘
não é convertida para um estado doador (ver Tabela 6.1).
Observa çã o gené tica Nas doadoras Hfr, o fator F foi
Integrado a uma sequência de inserçã o. Essas doadoras sáo
capazes de transferir genes, mas não conseguem converter a
receptora para um estado doador.
6.2 A análise de conjuga ção
interrompida produz mapas de
momento de entrada
Observamos que os cromossomos da Hfr são com
pridos demais para serem totalmente transferidos de uma
célula doadora para uma receptora. Em consequência
disso, uma conjuga ção interrompida, a cessação da con -
jugação provocada pelo rompimento do tubo de conjuga -
ção, ocorre durante a conjugação de ocorrência natural.
Os paramentos interrompidos param a conjugação antes
de o cromossomo da Hfr poder ser transferido completa
mente da doadora para a receptora. Várias décadas atrás,
os pesquisadores perceberam que, se a conjugação expe-
rimental fosse testada para a transferência genética em
intervalos regulares, seria possível mapear a ordem dos
genes doadores e determinar a distâ ncia entre esses genes.
Essa estratégia experimental se chama mapeamento do
momento de entrada. Cada cepa Hfr utilizada nos ex
perimentos de mapeamento do momento de entrada vai
transferir genes em uma ordem específica que é carac
teristica da cepa. A ordem da transferência dos genes e o
momento do primeiro surgimento de recombinantes para
cada gene são funções da proximidade do gene em rela-
ção à origem da transferência ( oriT ). Consequentemente,
os genes mais próximos da extremidade 5' da fita T atra
vessam o pelo de conjugação logo após o início da conju
gação, enquanto os genes que estão mais distantes da ex
tremidade 5’ da fita T vão atravessar o pelo de conjugação
mais tarde. Os genes mais próximos da oriT també m são
transferidos com mais frequência que os genes mais dis-
tantes. O resultado é que os genes mais próximos da oriT
recombinam mais cedo nos cromossomos exconjugantes
e em maiores quantidades do que os genes mais distantes.
193
O n úmero de minutos entre o início da conjugação e o
surgimento de um determinado recombinante é identifi-
cado como “ momento de entrada " do gene de interesse.
Essa medida, expressa em minutos de conjugação, pode
ser utilizada para determinar a ordem dos genes no cro-
- mossomo da Hfr em um mapa de momento de entrada.
-
Experimentos de mapeamento do
momento de entrada
- Em 1956, EUie Wollman , François Jacob e William
Hayes usaram dados de conjugação da cepa F ~ P678 e da
- cepa Hfr HfrH para demonstrar a utilidade da conjugação
interrompida no mapeamento do momento de entrada.
Nesse experimento, a P678 é str* , resistente ao antibiótico
estreptomicina, e a HfrH é str5, sensível à estreptomicina.
Os genótipos doador e receptor dos seis genes estudados
são fornecidos na Tabela 6.2. Dois desses genes tinham
localizações conhecidas: os genes da síntese da treonina
c leucina (thr c leu ) , que são ruais próximos da origem de
transferê ncia na HfrH do que qualquer um dos genes testa-
dos. O objetivo desse experimento era mapear as posições
do azi , tonA, lacegalB em relação ao thr, leu e determinar
a distância entre os genes em minutos de conjugação.
O experimento começa pela mistura das cepas bac-
terianas doadoras e receptoras para iniciar a conjuga -
ção. Em intervalos de minutos, uma pequena amostra
de cultura é removida e agitada para romper os pelos de
conjugação, interromper a conjugação e parar o pro-
- cesso de transferê ncia do DNA. As bactérias da amostra
são colocadas em placas de cultura contendo diferentes
compostos suplementares no meio para determinar se
as exconjugantes se formaram pela recombinaçáo entre
o cromossomo receptor e o DNA hom ólogo doado. Os
primeiros alelos recombinantes nas exconjugantes são,
como sc poderia prever, thr* e leu* . Os pesquisadores
selecionam essas exconjugantes colocando células em
- placas de cultura com um meio isento de leucina e treo-
nina , mas que contém estreptomicina e, portanto, vai
permitir o crescimento apenas das exconjugantes leu '
thr* str*. A ordem dos outros quatro genes é determi -
nada usando essas exconjugantes leu* thr* str*.
- Tabela 6.2 Genótipos das cepas F P678 e HfrH da
C. coU
-
HfrH F P678
thr (prototrófica para a thr (auxotrófica para a
treonina) treonina )
leu* (prototrófica para a leir (auxotrófica para a
-
-
leucina)
azi 9 (resistente è azida de
leucina )
azis (suscetível à azida de
- sódio) sódio)
tonA' (resistente á infecçáo tonA' (sensí vel à infecçào do
òofagoTI ) fagoT!)
lac (capaz de utilizar a lac (incapaz de utilizar a
lactose) lactose)
golB* (capaz de utilizar a galfr ( incapaz de utilizar a
galactose) galactose )
194 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 6.9 Mapeamento do momento de entrada.

(a ) Os recombinantes sã o identificados pela triagem das
exconjugantes para a aquisição do alelo doador em intervalos
_
(ai Surgimento do alelo doador

t
100 -
regulares e representando graficamente seu momento de rr
azi
entrada no cromossomo da exconjugante. (b) Os alelos 80
doadores leu* e thr aparecem nas exconjugantes em até Ti-3!
OJ O
V.
3 minutos desde o in ício da conjugaçã o. Outros alelos tonA

Ie SI -
5 60
doadores seguem de acordo com sua ordem no cromossomo,
(c) O mapa do momento de entrada do cromossomo da Hfr é
montado a partir dos dados de recombinaçáo. n C
-§51 40 -
%

Amostras da mistura de conjugação são obtidas em

lí 20 -
intervalos de minutos e colocadas em placas de cultura
com meio seletivo que identifica as células com gen ó-
tipo leu' thr* str*. As exconjugantes com esse gen ótipo 0
0
são colocadas em uma segunda placa para determinar
Tempo de conjugação (minutos)
quais outros alelos doadores sofreram recombinaçáo.
A Figura 6.9 mostra os resultadas desse experi -
mento, os quais estão interpretados na Ficjura 6.9b: as
exconjugantes que carregam o alelo doador azi apare
cem 8 minutos após o início da conjugação, os recombi-
- (b ) Progressão da conjugação
Célula Hfr Célula F '

nantes tonA surgem em 10 minutos, os recombinantes

lac , em 16 minutos, e os recombinantesgalB sâ o os ú lti- 0
mos a aparecer, em 25 minutos. A ordem desses quatro
genes e as distâncias em minutos entre eles são combi
nadas para produzir o mapa genético do momento de
-
entrada da HfrH { Figura 6.9c).
O mapeamento do momento de entrada é uma abor
dagem eficaz para mapear os genes próximos da extremi
-- 5
thr leu

dade 5’ da fita T. No entanto, as informações do mapea-

—
mento genético que podem ser obtidas a partir de uma
única cepa Hfr são limitadas. Primeiro, como o pelo de 1 8
conjugação é rompido e o pareamento é interrompido, a
probabilidade da transferência genética cai rapidamente
!, - 0
O/ B
com a distância da oriT. Segundo, uma cepa Hfr conse-
gue transferir genes em apenas um sentido.
Para obter informações experimentais sobre a ordem <u>
e a distância entre os genes no cromossomo bacteriano 1
de uma determinada espécie, vá rias cepas Hfr com dife- * 15 - too

rentes sítios de inserção e orientações de epissomos são I

I
examinadas. Cada elemento de IS no cromossomo bacte -
riano constitui uma posição de integração do fator F dife -
rente e cada posição de integração transfere primeiro um
20
lac *
0 0
gene diferente. O cromossomo doador exibido na Figura
6.10* ilustra seis genes e seis elementos de IS. Cada ele
mento de IS é um possível sítio para a integração do fator
F, e o primeiro gene a ser transferido será diferente em
cada sítio de integração. Além disso, em cada elemento
-
25
^
de IS, o epissomo pode estar orientado em qualquer um
.
dos dois sentidos ( Figura 6.10b) Desse modo, a orien
tação do fator F é um segundo aspecto que determina
-
a ordem da transferência genética de uma cepa Hfr. A
ocorrência da posição de inserção e a orientação do fator
F são caracter ísticas fixas e imutáveis da cepa Hfr. Isso (c) Mapa cromossóm íco da Hfr

confere à cepa Hfr uma ordem sistemá tica e determiná

vel da transferência dos genes.
- i leu thr azi too fac gol

A Figura 6.10b ilustra a integra ção do fator F e a

transferência de genes da IS1 na orientação 1. Nessa Minutos 0 5 8 10 1516 20 25
orientação, a ordem de transferência dos genes ser á
Dist â ncia 8 2 6 9
leu-thr-gal- phe-cys- val . Na figura, as quatro extremi-
 Cap í tulo 6 Aná lisee mapeamento genéticonas bactéflase bacteriófagos 195

Figura 6.10 Os fatores F se integram nos sítios

Integração do de IS em uma de duas orientações possí veis.
epéssomo no Primeiro gene ( a ) Modelo de cromossomo bacteriano com seis
elemento de IS a ser transferido sequências de inserção (IS1 a IS6) e seis genes
IS1 levou vai marcadores vizinhos, (b) Uma orientação do fator F
IS2 thr ou leu para IS1 transfere primeiro o gene leu. (c) A orientação
IS3 gol ou thr alternativa do fator F em IS1 transfere primeiro o gene
IS4 phe ou gal
IS5 cysou phe vai. A relaxa se se liga à extremidade livre da oriT no
IS6 vai ou cys In ício da transferência.

(b) Orienta çã o 1
vai cys phe gal thr leu
1
Ú ltimo gene
1 M ! =
Primeiro gene

vai
5'
ll
Fator F
integrado
Ligação do
e«
. Replica ção
doDNA Para a receptora

relaxossomoe
cys /
>1113' clivagem da frta T
.
i
/

orií' 5' II 3*
\ i
phe \ / FitaT
s y
'v
leu

gol thr
Na orientação l as .
extremidades da onTe
da fita T se chamam I e II.

(c) Orienta çá o 2
vai cys phe gol thr leu
i
Primeiro gene Último gene
5* Fator F 5' Para a receptora
integrado IV
vai Lgação do vai % Relaxase
reiaxossomoe \
clivagem da 6taT II y \
cys A / 3' cys 3' \
\
/ oriT
r Rt3 T / 5' III 3* 5'IAIII 3’
phe
i
\
\
f
/
' phe
V /
leu leu

gal thr gal thr

Na orientação 2 as»
extremidades da onTe da
fita T se chamam Me IV.

dades dos ep isso mos da fita dupla sflo chamados I, II, sua extremidade 5' passa através do pelo de conjugação,
III e IV; a polaridade 5 -3' das fitas também é indicada. o primeiro gene marcador a ser transferido será vai , se-
Lembre-se de que o relaxossomo que se liga à oriT leva .
guido por cys- phe-gal-thr-leu A Analise Gen ética 6.1 vai
à clivagem da fita T, que na Figura 6.10b está ilustrada -
guiá lo durante o mapeamento do momento de entrada
de um experimento de conjugação de Hfr.
com as extremidades I e II. A extremidade 5' da fita T
se move através do pelo de conjuga ção com leu sendo o
primeiro gene após o fragmento de epissomo. A Figura Consolidação dos mapas de Hfr
6.10c mostra o mesmo cromossomo bacteriano simpli
ficado com a inserção em IS1 na orientação 2, onde a
- Nos mapas de Hfr utiliza - se uma cabeça de seta para
fita T é a mais interna ( ainda com as extremidades I e
II ). A orientação 2 é oposta à orientação 1 e transfere os
indicar a orientação do fator F integrado. Você pode con
siderar a cabeça de seta como uma indicação da ponta
-
genes na ordem contrária. Quando a fita T é clivada e de uma Fita de DNA, ou seja, a primeira parte a entrar e
196 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

ANÁ LISE GENÉTICA

Um experimento de conjugação interrompida é realizado na £ coli £ 100 -
para mapear os genes para a blossíntese dos amlnoáddos treonina J glw
.
(frir), leucina (/eu), ácido glutámico ( g /u ) e alanina ( a /a ) Uma cepa Hfr ~ thr
com o genótipo hís* thr leu* gtif ala* sfr* transfere o ri/s muito cedo « -c
*
^
e é sensí vel ao antibiótico estreptomidna. Ela é cruzada com uma 5 £ 50 - ^ ala'
cepa F com genótipo ri/s frir /eu gtu ala str*. Um perfil do mo-
mento de entrada de thr , leu, g /u e ala é exibido à direita. ! /eu*
.
a Os exconjugantes ri/r e sfr* são selecionados inècialmente para
2
mais análise experimental. Quais compostos devem estar pre- 0
sentes ou ausentes nas placas e cultura para permitir que os ex -
10 20 30 40 50 60 70
conjugantes contendo esses marcadores selecionados cresçam? Tempo de conjugação (mln)
.
b Use os dados fornecidos para deduzir a ordem dos genes trans-
feridos nessa cepa Hfr e para identificar as distâncias em minu-
.
tos Identifique a ordem dos genes no cromossomo doadoc e indique a localização aproximada do gene ri/s.

Estrat égias de soluçã o Etapas da solu ção

Avaliar
.
1 Identifique o tópko abordado por esse pro- .
1 Este problema diz respeito à conjugação entre uma doadora Hfr e uma
blema e explique a natureza da resposta so - .
receptora F A resposta (a) requer a Identificação dos constituintes do
licitada . meio de cultura para uma exconjugante ri/s4, str* e a resposta (b) requer
um mapa dos genes doadores com base em seu momento de entrada.

.
2 Identifique as informações criticas forneci- .
2, Os genótipos doador e receptor são fornecidos Um perfil do momento
das no problema. de entrada identifica os minutos de conjugação necessários para transfe-
rir cada gene da célula doadora para a receptora.

Deduzir
.
3 Determine a relevância da transferência muito .
3 A transferência muito precoce do ri/r indica que o gene está perto da
precoce do his* no contexto do desenvolvi- oriT e será o primeiro a atravessar o tubo de conjugação .
mento de um mapa do momento de entrada.

0 ICA: Os gewj *nais práwno»í t j orrTtém opcrtuntda-

de» mis precoces e frequentes de se transferirem para
cUiáò recepto* e de aparecerem como recombiruntes *
*
nas «oonfbigftnles que os gene dteurtfes da oríT.
*
Solucionar Resposta a

.
4 Identifique os componentes necessários para .
4 A placa de cultura utilizada para selecionar esses marcadores conteria
permitir o crescimento das exconjugantes estreptomicina e os aminoácidos treonina, leucina, ácido glutámico e
com os marcadores selecionados ri/s* e str*. .
alanina A placa não teria histidina, exigindo, assim, que a cepa cultivada
A seja ri/r .
DICA: Para selecionar as euconjugartes que sAo hir e
consoes
str*, as placas de cbttuta precisam fornecer nas
qua apenas as exconfugartes resistentes à estreptomi-
*
cina e capam de slrtetcnr a histidina consoam crescer,
Resposta b
5. Construa um mapa do momento de en- .
5 Sabendo-se que o ri/s ê transferido primeiro e que a ordem dos genes e
trada com base nos dados de conjugação. suas distâncias são identificadas pelo momento em que as recombinarv
tes aparecem nas exconjugantes, o mapa da Hfr para essa cepa é:

Origem de
transferência
g /u thr ala Itu
Mapa 11
Minutos r
0 8 16 29 42

ri/s

Para praticar mais, ver Problemas 15, 16 e 26 .

 Cap í tulo 6 Aná lisee mapeamento genéticonas bactériase bacteriófagos 197

passar através do pelo de conjugação. O primeiro gene £ coli . A Figura 6.11b compara um segmento do mapa do
após a cabeça de seta a entrar na célula receptora está momento de entrada da £ coli com o segmento corres-
mais perto da oriT e atravessa o pelo de conjugação antes pondente do cromossomo produzido por sequenciamento
e com mais frequência que todos os genes doadores. Isso gen ómico. A comparação revela a correlação exata do po-
o leva a scr o primeiro gene a rccombinar e que o faz com sicionamento e da ordem dos genes.
a maior frequência. A Figura 6.11a mostra as posições e a Vamos praticar a consolidação dos mapas do mo-
orientação dos fatores F em seis cepas Hfr da £ coli. Cada mento de entrada em um mapa maior de um cromos-
cepa foi utilizada para construir um mapa do momento somo circular usando os dados apresentados a seguir
de entrada e os mapas são consolidados pela identificação sobre transferê ncia genética de quatro cepas Hfr dife -
das regiões sobrepostas para formar um mapa circular do rentes. Para cada cepa, os genes são apresentados na
cromossomo doador. Repare que, como consequência ordem de transferência . O primeiro gene transferido
das duas possíveis orientações nas posições de IS, algumas é o mais superior e o ú ltimo é o mais inferior, com os
Hfrs transferem genes em um sentido, enquanto outras minutos de conjugação de cada gene sendo fornecidos
transferem genes no sentido oposto. Por exemplo, a HfrH entre parênteses. Os genes mencionados na discussão a
transfere genes no sentido oposto ao de Hfr 2 e Hfr3. seguir sã o apresentados em cores.
O mapeamento do momento de entrada foi praticado
durante décadas antes de o sequenciamento genòmko se
tomar realidade. Durante esse per íodo, muitos cromos- Cepa Hfr
somos bacterianos foram mapeados pelo momento de Hfrl Hfr 2 Hfr 3 Hfr4
entrada, incluindo o cromossomo do organismo gené-
serR [ 2 ) nadB (8) TyrT { A ) serR (4)
tico modelo, a £ coli. Porém, com o advento do sequen -
ciamento genómico, tornou se possível identificar todos - leuY (10) proL (17) fumC (12) póefl {12)
os pares de base de nudeotídeos e todos os genes em um asn0 (15) fumC (29) proL ( 24) cys£ (25)
genoma. A precisão e a validade do mapeamento de Hfr
5erC ( 20) tyrT ( 37 ) nadB ( 33) leuU ( 37 )
podem ser demonstradas comparando um pequeno seg-
mento da sequência gcnômica da £ coli com o segmento ryrT (?7 ) serÇ (44) leuU ( 46) nadB ( 50)
correspondente do mapa do momento de entrada da fumC (35) as/ifl (49) cysf (58) proL (59)

(a ) Dados coletados das cepas Hfr para a construção Figura 6.11 Mapa de Hfr consolidado da E. coli . ( a ) Os
do mapa do momento de entrada dados de seis cepas Hfr Identificam as orientações do fator
90 minutos F e a ordem de transferência dos genes. As Hfrs sobrepostas
f /ir produzem um mapa consolidado do cromossomo.
(eu 10
,
( b) Compara ção do segmento de um mapa do momento
rfw aa de entrada da Hfr com um mapa da sequê ncia genómka.
'me f ,
Um segmento de 5 minutos ( minutos 40 a 45) do mapa do
lon momento de entrada da £ coli é exibido em comparação
7l 20 com um segmento de aproximadamente 500 mil pares de
Hfr 4 toc .
base do genoma da £ coli derivado do sequenciamento
genòmko dessa bactéria. Os genes selecionados entre
imtí
Hfrl 42,5 minutos e 44,5 minutos no mapa do momento de
tu
entrada (superior ) estão alinhados com suas posi ções no
xyi
Hfr3 30 mapa de sequenciamento genómico (inferior) para ilustrar a
HfrH 90i compatibilidade das duas abordagens de mapeamento.
I fr 2
*
ftr Iam

ACDFGHIJKLMNOPQR
50 40
( b) Compara ção dos segmentos dos mapas do momento de entrada da Hfr e do genoma sequendado da Hfr
_
o
«o
» GDCBHAFI A, B, D
( ABCDE ) ( FGH )

f l l i f i i t i i l j 11 Ei í l &fI Ht II 1I

—
44 < < <
\ \ \ ( *\ ( ( ( II (

Tempo em 43 45
minutos
/ \
asnU asnV
íf it rcsA osnT qmn sbcB hisLhnB
vsr cobU sbmC gnd rfc rfbX galF cpsG
»1 111
Genes c11 —1J
nAmii IMtll

Pares de base 1.800.000 2-000.000 2.200.000

198 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O conjunto de dados de cada cepa Hfr é utilizado

para gerar um mapa parcial mostrando a ordem dos
genes, a distâ ncia em minutos entre eles e a orientação
do fator F integrado. Os mapas de cada Hfr sào consoli -
dados para mostrar o sítio dc integração do fator F, sua
orientação e a ordem e distâ ncia dos genes em minutos.
Prevemos que os minutos de conjugação entre um de -
terminado par de genes serão os mesmos em cada cepa
Hfr que transfere o par. Por exemplo, as cepas Hfr 1, 2 e
3 transferem o par de genes tyrT fumC e em cada cepa -
os genes estão separados por 8 minutos, independente-
mente da orienta ção do epissomo.

Origem de transferência
\ -
Gene mr* hufawã vtK lyrT famC
Hfrl , f B I i r i
Minutos 2 B S S 7 B
amfl itfC ryr7 hxnC prol nadS
Hfr 2 ZI I
5 7 8 12 4 Embora o mapa de conjugação seja uma maneira
Wrf tumC peoL nada leuL' cyif
Hfr3 4 1 precisa de determinar a ordem dos genes e calcular a
4 ê 17
ped
9
nodB
1)
fcuU
17
cy%t KT#
distâ ncia aproximada entre eles, ele não é suficiente -
Hfr4
o 17 U
mente preciso para mapear acuradamente os genes in -
fimamente ligados. A taxa rá pida em que as cepas Hfr
transferem o DNA dificulta a medição exata entre os
A continua ção do processo de sobreposição acaba genes ligados. Por exemplo, na conjugação da L coli,
levando ao fechamento do círculo e à conclusão do o cromossomo transfere dezenas de milhares de n ú -
mapa cromossòmico (assim como a compilação das so- cleotídeos por minuto. A análise do genoma da E. coli
breposições apresentada na Figura 6.11a ) Na tabela an - . diz aos biólogos que o gene médio tem aproximada -
teriormente mostrada, por exemplo, repare que a Hfrl mente mil pares de base de comprimento, significando
e a Hfr4 compartilham o gene serR como o gene mais que muitos genes podem ser transferidos durante
próximo do sítio de inserção. Essa é a conexão que nos .
cada minuto de conjugação Como as diferenças no
permite fechar o mapa circular . Para começar a cons- momento de entrada dos genes intimamente ligados
trução do mapa, vamos supor que a Hfrl transfira genes podem ser de apenas alguns segundos, a ordem desses
no sentido horá rio. genes pode n ão ser solucionável pelos experimentos de
mapeamento da conjuga ção isoladamente. Dois outros
mecanismos de transferê ncia de DNA entre bacté rias, a
transformação e a transdução, facilitam o mapeamento
de alta resolução dos genes intimamente ligados. A
Seção 6.4 discute o mapeamento genético por meio da
transformação e a Seção 6.5 descreve o mapeamento
genético por meio da transdução. No entanto, primeiro
terminamos nossa exploração das vá rias configurações
possíveis para o fator F.

Observação gen ética 0 mapeamento do momento de en-

trada identifica a ordem e a distâ ncia entre os genes transferidos
de cada cepa Hfr doadora. Os mapas individuais das Hfrs são
consolidados em um mapa composto do cromossomo da espé -
cie doadora pela sobreposição dos segmentos correspondentes
dos mapas parciais realizados para as diferentes cepas.

6.3 A conjuga ção com cepas F'

produz diploides parciais
Depois de concluído, o mapa da Hfr identifica a A Tabela 6.1 apresenta uma terceira configuração
ordem dos genes, o n úmero cumulativo de minutos, o do fator F nas bact é rias doadoras, a configuração das
sitio de integração de cada fator F e a orientação: conhecidas doadoras F\ que cont é m um fator F fun -
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos 199

cional, porém alterado, derivado da excisão imperfeita (a ) Cromossomo da Hfr

do fator F do cromossomo da Hfr. O evento de integra -
oriT
ção que cria um cromossomo da Hfr depende das inte-
rações entre os elementos de IS compat íveis do fator F
e do cromossomo bacteriano c, quando esse processo Cromossomo Fator F
é invertido, mais uma vez o fator F consegue se tornar bacteriano lac'
um fator F* extracromossòmico. No entanto, às vezes

neste caso, o conhecido fator F'

—
o evento de excisão é impreciso e o fator F excisado
contém todo o seu
pró prio DNA, além de um segmento do DNA cromos
—- Excisão normal
Um segmento do
DNA bacteriano
Excisão aberrante

sô mico bacteriano da regiã o adjacente ao sítio de in - forma um laço

para fora durante
tegração ( Figura 6.12a ). Um fator F’ pode carregar um a excisão
trecho variá vel de DNA bacteriano. As células doadoras
que carregam um fator F' se chamam células F\ çã
Forma o do fator F* Forma çá ojdo fator F
‘

Assim como as outras formas de conjugação des -

critas anteriormente, a conjugação entre uma doadora
F e uma receptora F segue o agora familiar processo
do complexo do relaxossomo ligando-se à oriT, cliva -
gem da fita T e movimento da fita T através do pelo de
conjuga ção com sua extremidade 5' na liderança. As Cromossomo Plasm ídeoF* Cromossomo Plasm ídeoF'
células com fatores F pequenos sào mais propensas a bacteriano bacteriano
transferir o fator F inteiro do que as células com gran - -
0 fator ' 'contém o toe* doador,
des inclusões do cromossomo bacteriano. Como conse
qu ência, as inclusões pequenas em geral são transferi
-- além de um conjunto completo
de genes do fator F,
das inteiramente.
Se o cromossomo F‘ inteiro for transferido, as duas ( b) Célula F‘ Célula F
partes da oriT sâ o transferidas, permitindo que o fator
F' se tome circular na célula receptora. No término da
transferê ncia do fator F, nesses casos, a célula recep- x
tora, agora contendo um fator F completo, é conver
.
tida para uma doadora F' (ver Tabela 6.1) Ela adqui
-
-
riu có pias de todos os genes cromossômicos doadores Cromossomo Fator Fr Cromossomo
.
portados pelo fator F Como os genes cromossômicos bacteriano bacteriano
recém - recebidos são hom ólogos dos genes já presentes
Cresce em um meio com lactose Incapaz de crescer em
no cromossomo bacteriano receptor, as exconjugantes um meio com lactose
resultantes são diploidcs parciais. A porção diploide
do genoma limita -se aos genes presentes nas duas có
pias, uma no cromossomo da exconjugante e a outra
- CélulaF Conjugação Célula F
no fator F. Na recombinaçã o homóloga , é necessá rio
produzir esses genótipos parcialmente diploides e a di -
ploidia parcial é retida como uma característica dessas
exconjugantes e de suas células descendentes.
A Figura 6.12b ilustra a criação de uma exconju - Célula F
Transferência
completa
gante diploide parcial portadora de dois alelos do gene Exconjugante F
.
lac O alelo lac* no fator F permite que a célula use a
lactose para crescer, enquanto o alelo mutado lac no'

cromossomo da exconjugante é incapaz de funcionar

na utilização da lactose. Nessa diploide parcial, o alelo
lac* é dominante em rela ção ao alelo lac~. As diploides
parciais desse tipo têm sido utilizadas nos estudos ge - A exconjugante é uma dtpkxte pare al tatVtor e adquiriu capacida-
néticos para examinar o modo de ação dos genes nas
bactérias e para dissecar a regulação da ação gênica
coordenada no metabolismo e crescimento bacteriano
( ver Capítulo 14).
A Analise Genética 6.2 vai guiá -lo na análise de
cepas bacterianas doadoras e receptoras e na identifica -
çã o dos tipos de doadoras por meio da an á lise de três
experimentos de conjugação.
de para crescer cm um meio com lactose. Como a transferência do
plasmídoo F' fó conc uida, a exconjugante consegue agir como uma
doadora P
Figura 6.12 Excisão do fator F a partir da integra ção
da Hfr. (a ) A excisão normal (esquerda ) reconstitui uma Hfr
para uma F \ enquanto a excisã o aberrante (direita ) forma um
plasm ídeo F'em uma célula doadora F*. ( b) A conjugação F' x F
produz uma exconjugante laC / fac parcialmente diploide .
200 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
.
Na £ coli as capacidades para utilizar o açúcar lactose, sintetizar o aminoácido metionina e resistir ao antibiótico estrepto-
micina são conferidas pelos alelos loC , mer e str*. Os alelos mutados produzem bactérias suscetíveis à estreptomicina (sfr4),
são incapazes de crescer em meio contendo lactose (toc) e requerem a suplementação com metionina para crescer (mer) As .
cepas de £ cotí são identificadas como doadoras ou receptoras na primeira tabela, que também contém informações sobre sua
capacidade de crescer sob várias condições. A segunda tabela contém informações de crescimento para as exconjugantes do
cruzamento entre as cepas doadoras e receptoras. Em cada tabela, "+" indica crescimento e indica ausência de crescimento.
*Min* significa um meio mínimo e as placas de meio mínimo suplementadas são indicadas, por exemplo, como "Min 4mef
(meio mínimo suplementado com metionina).'Lac* in-
dica uma placa contendo apenas lactose como açúcar. Cepa Tipo Crescimento da cepa
a. Utilize as informações de crescimento na primeira Min lac Min+met Min-f-mef+str ioc+mef+sír
tabela para determinar o genótipo de cada cepa A Doadora 4- 4 +
nos lócus locr met e str.
B Doadora
.
b Utilize as informações de crescimento na segunda
C Doadora
4
4
4
4
4
4
tabela para determinar os genótipos das exconju-
gantes produzidas por cada cru - D Receptora 4 4

zamento . As exconjugantes
c Compare os genótipos e o com-
Cruzamento Crescimento da exconjugante são doadoras?
portamento de cruzamento das
doadoras, receptoras e exconju- Min +sfr Min 4mer+sír lac+str tac+mer+srr
gantes para determinar se cada AxD 4 4 5im
.
doadora é F4, Hfr ou P Explique BxD 4 Sim
seu raciodnio para a identifkação CxD 4 4 Não
de cada cepa doadora.

Estrat égias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por esse pro- .
1 Este problema díz respeito à conjugação em que os genótipos das cepas doa-
blema e explique a natureza da resposta so- doras e de uma receptora são determinados pelas características de cresci-
licitada. .
mento Os tipos doadores {F \ Hfr,F) são identificados pelas caracterí sticas de
crescimento das exconjugantes. As respostas requerem a identificação dos
genótipos para loc, met e str de cada doadora, receptora e exconjugante.
. .
2 Identifique as informações críticas forneci- 2 As duas tabelas identificam as características de crescimento A primeira .
das no problema. contém informações de crescimento sobre tr és doadores (A B e C) e um .
.
receptor {D) A segunda contém informações de crescimento sobre as ex-
conjugantes do cruzamento entre cada cepa doadora e a receptora .
Deduzir
.
3 Compare as características de crescimento . .
3 As caracteristicas de crescimento das três cepas doadoras ( A B e C) são
das cepas doadoras e da receptora na pri- .
idênticas em cada tipo de meio Essas très cepas tèm o mesmo genótipo.
meira tabela e deduza quais genótipos pro- A receptora, cepa D, tem um conjunto diferente de caracterí sticas de cres-
vavelmente são os mesmos. cimento e, portanto, um genótipo diferente .
.
4 Examine as exconjugantes na segunda ta .
4 A doadora A e a doadora B transferem uma sequência F completa para
bela e determine quais foram convertidas de a receptora e convertem a exconjugante para doadora. A doadora C não
receptoras para doadoras. transfere a sequência F completa, então a exconjugante C x D não é con
.
-
•ICA: Quando uma exconjugante
foi corvertida para uma condi çio de
vertida para doadora

doadora, sabemos que ela recebeu

Solucionar uma cópia completa do fator F Resposta a
. .
5 Determine os genótipos das cepas doadora e 5 O genótipo compartilhado pelas cepas doadoras A, B e C é mer lac* sfr* O .
receptora a partir das informações de cresci- meio mínimo de cultura contém glicose. O crescimento das cepas doadoras
mento apresentadas na primeira tabela. .
nesse meio indica sua prototrofta para a metionina { mer ) O crescimento no
.
meio que contém lactose indica que são lac* A incapacidade das doadoras
de crescer em um meio contendo estreptomicina indica que são strs .
.
O genótipo da receptora é met lac str * Ela é incapaz de crescer no meio
mínimo (contendo glicose), mas consegue crescer em um meio com glicose
e metionina, indicando que é mer . Ela também cresce no meio mínimo su-
plementado com metionina e estreptomicina, indicando que é st /*. A utili -
zação da lactose é testada no mek) contendo lactose, metionina e estrepto-
.
micina Aqui ela não consegue crescer, indicando que é loc .
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos
AN Á LISE GEN É TICA
6. Determine os genótipos das exconjugantes
a partir das informações de crescimento na
segunda tabela.
7. Identifique cada doadora pelo tipo doador e
explique o raciocínio para cada identifica ção.
DICA: Gompèie os genótipos das eiconjugarra
coai o genô t po óà receptora par determinar se
* vertidas para um estado doador. As doadoras F* produzem esse resultado,
um ou mais a tetos doadora forem transferidos du-
rante a cortugaçto Use a Tabela 6.1 pai ajudar a
cada doadora.
Para pratkar mais, ver Problemas 17 e 21 .
Observa çã o gen é tica As células doadoras Frsão criadas
pela excisáo aberrante de um fator F integrado a partir de um
cromossomo da Hfr. 0 cromossomo da F' contém a sequência
completa do fator F, além de um ou mais genes bactorianos
que eram adjacentes ao fator F. A conjuga ção das células F' e
F produz exconjugantes com estado doador F’e parcialmente
"
diploides a partir da transferência dos genes doadores.
6 . 4 A transformação bacteriana
produz recombinação genética
A transformação ocorre quando uma célula recep
tora recebe um fragmento do DNA da célula doadora
proveniente do meio de cultura circundante. O frag
mento do DNA passa pela parede e pela membrana da
célula receptora e é incorporado no cromossomo da cé
lula receptora por recombinação hom óloga. A transfor-
ma ção é um mecanismo de ocorrê ncia natural que pode
ser utilizado para produzir mapas precisos dos genes
bacterianos, incluindo os que são intimamentc ligados e
não mapeados diretamente pelos experimentos de con
jugação. A célula receptora que recebe um DNA trans
formante é identificada como competente, significando
que é capaz de intemalizar o DNA exógeno (doador ).
A transformação també m é utilizada como uma téc-
nica laboratorial por biólogos moleculares que buscam
introduzir DNA nas bactérias. Nesses casos, a transfor
ma ção é utilizada para introduzir plasmideos nas bac
térias. Uma aplicação comum da transformação com
plasmideos é a clonagem do DNA (ver Capítulo 16).
Etapas na transformação
A transformação é um processo de quatro etapas,
como ilustra a Figura 6.13. Ela é precedida pela lise, ou
201
continuação
Resposta b
6. Usando uma aná lise similar è empregada anteriormente, conclu í mos que
os genótipos das exconjugantes são
.
A x D mer lac str* conversão para doadora
B x D mer toc str*, conversã o para doadora
C x D mer lac* sfrJ, nenhuma conversão
Resposta c
.
7 As exconjugantes A x D adquiriram mer e sofreram conversão para um es -
tado doador. As doadoras F' conseguem transferir um alelo e convertem
.
para receptora, então conclu í mos que a cepa A é uma doadora F As ex-
conjugantes do cruzamento BxD retêm o genótipo receptor, mas são con-
entã o a cepa B é uma doadora F . A conjugação C x D produz exconjugan-
*
tes que adquiriram lac* , mas não sofreram conversão. Essa é uma caracte-
r ística das doadoras Hfr, então conclu ímos que a cepa C é Hfr.
rompimento, de uma célula doadora e pela libera ção
do DNA fragmentado do cromossomo doador. O DNA
transformante tem fita dupla e pode ser captado por
uma célula bacteriana receptora.
A passagem do DNA transformante de fita dupla
através da parede da célula receptora e da membrana
celular é acompanhada pela degradação de uma das fitas
(etapa O da Figura 6.13). A fita restante do DNA trans-
formante se alinha com a região complementar do cro-
.
mossomo receptor ou “ invade" essa região O O alinha-
mento desencadeia a ação de várias enzimas que excisam
uma fita do cromossomo receptor e a substituem pela
fita transformante. Esse evento de recombinação forma
um DNA heterod ú plex: uma fita é derivada da célula re-
- ceptora e a fita transformante aproximadamente comple-
mentar é derivada da doadora bacteriana O. Após a sub-
- sequente replicaçâo do DNA e o dclo de divisão celular
O, uma célula filha é uma célula transformada, também
- chamada transformante. Ela contém um cromossomo
portador da fita transformante e de sua fita complemen -
tar recém -sintetizada. A outra célula -filha retém o cro-
mossomo receptor e n ão é alterada geneticamente.
- Mapeamento por transforma ção
O DNA transformante normalmente é menor que
100 mil pares de base ( 100 kb). Em uma espécie bac-
teriana como a E coli , que tem um genoma de 4 x 10*
bp de DNA e aproximadamente 5 mil genes, o DNA
transformante pode ter 1, 2 ou até 50 genes. Mesmo no
-
- comprimento máximo, o DNA transformante da célula
doadora representa apenas 1% a 2% do genoma total da
célula receptora. Consequentemente, a transformação é
ú til para mapear genes intimamentc ligados. Para serem
mapeados por transformação, dois ou mais genes pre-
cisam ser transferidos para a receptora no mesmo frag-
mento do DNA transformante. Desse modo, a análise
genética se concentra na cotransformação, a trans
202 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

formação simultâ nea de dois ou mais genes. Para que

a cotransformaçâ o ocorra, os eventos de crossing-over
precisam incorporar genes intimamente ligados em um
ú nico fragmento de DNA transformante.
ONA de fita dupla Cromossomo Para explorarmos como funciona o mapeamento
da bactéria doadcva receptor
.
por cotransformaçâo primeiro vamos considerar os
genes tyrP e purA da £ coli, separados por quase 3 mi -
lh ões de pares de base no cromossomo e, portanto, dis-
Sitio tantes demais para serem cotransformados no mesmo
receptor fragmento de DNA transformante. Suponha que cada
gene individualmente seja transformado em uma
frequê ncia de 0,002 ( isto é, 2 células a cada 1.000). Como
esses genes não são ligados, a única maneira de eles
serem cotransformados é por meio de dois eventos de
O doadora
O DNA da bacté ria
se liga ao sitio transformação independentes, cada um deles provocado
receptor. Uma fita é
degradada quando entra
por um pedaço diferente de DNA transformante. Por -
tanto, prevemos que a taxa de cotransformaçâo do tyrP
na célula receptora.
e do purA seja o produto das duas frequências de trans -
formação, ou (O,OO2)(0,OO2) = 4 x IO-6. Essas duas trans-
f f: formações independentes requerem um total de quatro
DNA da
doadora !II=:: Fita eventos de crossing- over , dois para cada fragmento de
transformante DNA transformante.

—
«w v
PV / Por outro lado, dois genes ligados e bem próximos
7Nudeotideos
' degradados um do outro no cromossomo doador podem acabar fa-
Complexo de
ligaçã o ao DNA cilmente no mesmo fragmento do DNA transformante.
brama degradadera
na receptora do DNA Então, um único par de eventos de crossing-over pode
integrar ambos os genes no cromossomo receptor com
T uma frequência de cotransformaçâo aproximadamente
Parede da Membrana da mesma ordem de grandeza da transformação de
célula receptora cltoplasmá tlca
.
um único gene Alé m disso, a frequência de cotrans-
0 com
A fita transformante se une formaçào sempre será substancialmente maior que o
a região homóloga do
cromossomo receptor. produto das frequê ncias de transformação isoladas A .
Figura 6.14 fornece os dados de cotransformaçâo de três
Fita transformante genes ligados na E coli: purR, vai e pdxH . Esses genes
são encontrados em uma região de aproximadamente
DNA heterod ú plex 25 mil pares de base de comprimento. Mais uma vez,
suponha que a frequência de transformação isolada de
0 A fita transformante desloca ,uma cada gene seja 0,002. Se os genes não fossem ligados,
fita do cromossomo receptor uma frequência de cotransformaçâo independente de
formando um DNA heterod ú plex
complementar (a /a* ).O excesso aproximadamente 10 é seria prevista para qualquer
de fita é degradado. par desses genes. No entanto, como mostra a figura, as
frequências de cotransformaçâo observadas sâ o bem
maiores, apoiando a hipótese da forte ligação desses
Replica çá o do DNA genes no cromossomo da £. coli.
e divbáo celular Os dados na Figura 6.14 també m fornecem pistas
para a ordem desses três genes. Prevemos que os genes
i laterais ( os genes em cada extremidade do mapa ) terão
a menor frequê ncia de cotransformaçâo e que o gene
intermediá rio terá a maior frequência de cotransfor
mação quando ligado a qualquer um dos genes laterais.
-
Nossos dados mostram que pdxH e vai têm a menor
frequência de cotransformaçâo; desse modo, sabemos
que eles são os genes laterais. purR é o gene intermediá -
Nã o transformante Transformante rio e sua frequência de cotransformaçâ o com pdxH ou
vai é bem maior que a frequê ncia de cotransformaçâo
0 A mplfccaçlo do DNA e a divháo celular produzem
uma transformante e uma não transformante dos dois genes laterais. Alé m disso, como a frequên -
cia de cotransformaçâo de purR e vai é maior que a de
Figura 6.13 Transformação de uma bacté ria competente purR e pdxH , supomos que a distâ ncia entre purR e vai
( a ) pelo DNA da bactéria doadora (o4) . seja menor que a distâ ncia entre purR e pdxH .
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos 203

Genes da Frequência de Ciclos de vida dos bacteriófagos

Experimento cotransformaçào cotransformaçào
1 pdxHeval 0.08 As part ículas de bacteriófago geralmente são
2 purRevol 0,81 menores que 1% do tamanho das células bacterianas
3 purRepdxH 0.68
que atacam. Sua estrutura externa é uma camada pro-
teica composta de uma cabeça icosa édrica, uma bai -
nha de proteí na oca e, em alguns fagos, um conjunto
Mn p, 25.000 pb de apê ndices chamado fibras caudais (Figura 6.15). A
Cromossomo
purR
MM cabeça do fago abriga seu genoma rudimentar , com
posto de um ú nico cromossomo que varia de 5 mil a
-
da E. coli
100 mil pares de base, aproximadamente. A replica
çã o do DNA, a transcrição dos genes e a tradu çã o que
-
Cromossomo produz as proteínas do fago dependem de muitas pro-
pdxH purfí vai da £ coli
teí nas c enzimas encontradas nas células bacterianas
25.000 pb
hospedeiras, que os fagos precisam infectar para que
possam se reproduzir.
F i gura 6.14 Mapeamento da cotransformaçào entre os
genes pdxH , purR vai. Esses três genes sáo codificados em
•
Os bacteriófagos empregam uma sé rie de meca
nismos para atacar as bacté rias. Todos os mecanismos
-
um segmento de aproximadamente 25 mil pares de base. A
frequência de cotransformaçào é menor para o par de genes
utilizam prote í nas bacterianas que evoluíram nas bac -
térias para outras finalidades que n ão um meio de en -
mais distante (pdxH e vof ) e maior para o par de genes mais
próximo ( pvrR e vat).
trada para o fago. Por exemplo, um fago usa a proteína
de ligaçã o à maltose da £ coli como sítio de acopla -
mento. A proteína de ligação à maltose salpica a su -
perf ície das células da £ coli, que a utilizam para sen
tir a presença do açúcar maltose no meio de cultura.
-
Desse modo, durante o estudo da infecção da £ coli
pelo fago X, os microbiólogos adicionam maltose ao
Observação gen ética As células receptoras são transfor- meio de cultura como uma forma de melhorar a taxa
madas pela captação do DNA doador proveniente do meio de de infecção do fago.
cultura. A ordem e a ligação dos genes em um cromossomo
doador são mapeadas com base nas frequências de cotransfor-
maçâo. As frequências bem maiores que as previstas a partir da Fago T4

—
transformação independente implicam ligação genética.
/ Cabeç
a
»

DNA

6.5 A transdução bacteriana é Bainha

mediada por bacteriófagos J

Transdução é a transferência de material genético

de uma célula bacteriana doadora e a integraçã o desse
Fibras
material em uma célula bacteriana receptora por meio Placa - base caudais
de um bacteriófago que age como vetor. Para obter essa
transferência, um bacteriófago precisa infectar a célula Fago A
doadora c alguns fagos da progé nie precisam empaco- / Cabeça
-
tar, de forma errante, um fragmento do cromossomo
bacteriano doador em vez de uma có pia completa do
$ i) — DNA
«rjr

cromossomo do fago. Bainha

Após a lise da célula hospedeira bacteriana original, ?•
os fagos portadores do DNA bacteriano mal embalado
se acoplam a uma nova célula hospedeira (a célula re -
ceptora ) e injetam o fragmento cromossòmico doador.
Dentro da receptora, a recombinaçâo hom óloga pode
ocorrer entre o fragmento doado e o cromossomo re-
ceptor. Nesta seção, revemos os ciclos de vida dos
bacteriófagos [ fagos , para abreviar ) que infectam a £
.
coli Depois, consideramos o mapeamento da cotrans - Figura 6.15 Estruturas do bactariófago T4 e do fago X.
duçã o , uma técnica poderosa para mapear os genomas O bacteriófago consiste em uma cabeça proteica preenchida
bacterianos. com DMA uma bainha e fibras caudais em alguns fagos .
204 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Cldo Iftico +-
« Infec çã o Qck> lisogê nico

DNA

FagoX © Ohospedeira
fago X se acopla à célula ©
.

O O fago X Injeta DNA ©

através da cauda oca.

' Ciclo lisogênko

O Osã*ofagos X da progénie
liberados pela lise DNA
da bactéria hospedeira. do fago

O cromossomo do faga
assume a forma circular
protegWo da degradação. © Integra çãpro do
DNA do ó fago X
no cromossomo
hospedeiro.
t i
0 DNA e proteí nas são
reunidos nos fagos X da Podem oconer vánas
progénie. Ciclo Irtico divtsôes e mJtas gerações
I
nesse estado: o DNA do
pr
ófago é copiado
© Ocorre replica ção do
cromossomo do fago; o
quando a célula se divide,
DNA hospedeiro se rompe.

O fago
Sob a direção dos genes do
, a transcri ção e a
tradu çã o produzem
— cr f %
,
© O ciclo Iftico
.
continua

—
O Excisão do prófago
• X do cromossomo
novas part ículas de fago.
\
GO \ J hospedeiro .

Fig ura 6.16 Ciclo de vida lítko e lisogênico de um bacteriófago temperado. O cicio lítico evoluiu diretamente da inf ècçáo,
passando pela reprodução do fago e chegando à lise. O eido lisogénko apresenta a integração do fago rvo cromossomo
hospedeiro, onde ele reside até a exdsão e retomada do cldo lírico.

Os bacteriófagos procuram incessantemente e se cromossomo do fago é necessária para cada uma

acoplam às células hospedeiras, dando início a um pro-
cesso de seis etapas chamado ciclo litíco, o que leva à
lise da célula hospedeira . A lise libera até 200 partículas
de fago da progénie. As etapas que compòem o ciclo lí
tko são retratadas na Figura 6.16«
Acoplamento da part ícula de fago na célula
hospedeira.
>Injeção do cromossomo do fago na cé lula hospe -
deira. A injeção é seguida imediatamente pela C íT
cularização do cromossomo do fago, a fim de pro
tegê-lo da degradação enzimá tica.
O Replicação do DNA do fago, usando vá rias proteí
nas e enzimas da célula hospedeira. Uma cópia do
das part ículas de fago da progé nie, que geralmente
somam algo entre 50 e 200.
O Transc ri çào e tradução dos genes do fago, usando
- muitas proteínas e enzimas do hospedeiro e ribos-
somos. Cabeças, bainhas e fibras caudais de todas
as partículas da progénie precisam ser sintetizadas
e montadas.
O Empacotamento dos cromossomos do fago nas
cabeças de fago. Essa etapa é normalmente acom -
'
panhada pela fragmentação do cromossomo hos-
- pedeiro. O mau empacotamento ocasional de um
fragmento do cromossomo hospedeiro em uma
- cabeça de fago pode se seguir à fragmentação do
cromossomo.
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos
O Lise da célula hospedeira , resultando na morte
dessa célula e na liberação de uma progénie de par
tculas de fago.
í
Certos bacteriófagos classificados como fagos
nhecido
—
temperados, dos quais o fago X é o exemplo mais co
são capazes de se submeter a um ciclo de
vida temporário, alternativo, que leva à integração do
cromossomo do fago no cromossomo hospedeiro bac
teriano. O processo de integração se chama lisogenia .
As condições ambientais e de crescimento são, em
grande parte, o que inicia um ciclo Lisogénico. A lisoge
nia pode persistir por muitos ciclos de replicação e divi
são bacteriana, mas ela acaba chegando ao fim e o ciclo
lítico é retomado. ( Discutimos os detalhes e a regulação
genética dessa alternâ ncia entre os ciclos de vida no Ca
pítulo 14.) Cinco etapas que caracterizam o ciclo lisogé
nico são exibidas na Figura 6.16.
O Acoplamento da partícula do fago à célula hos-
pedeira.
0 Injeção do cromossomo do fago na cé lula hospe -
deira, seguida pela circularizaçáo do cromossomo
do fago.
O Integração do cromossomo do fago no cromos-
somo hospedeiro. Esse processo é específico para
o sítio, o que significa que ocorre em uma sequência
de DNA específica, encontrada nos cromossomos do
fago e da bactéria. Depois de integrado no cromos-
somo hospedeiro, o DNA do fago se chama prófago.
O prófago permanece integrado de maneira estável
no mesmo local em vários ciclos da replicação cro-
mossòmica bacteriana e da divisão celular.
O Excisão do prófago. Em resposta a um sinal am
biental, como uma alta dose de radiação ultravio
leta, o prófago reverte sua integração e é excisado
intacto. Esse evento normalmente é uma reversão
exata da integraçã o espec ífica para o sítio, mas
erros raros na excisão do prófago levam a um tipo
específico de fago anormal que pode conter mate
rial genético do hospedeiro.
© Retomada do ciclo l í tico, começando com a replica -
ção do cromossomo do fago.
Observa çã o gen é tica Os bacteriófagos infectam e pro-
vocam a lise da célula bacteriana hospedeira após invadirem
a célula e usarem prote ínas, enzimas e estruturas bacterianas
para replicação, transcrição e tradu ção do DNA do fago. Os
fagos temperados são capazes de se submeter a um ciclo de
vida alternativo chamado ciclo lisog ènka no qual os prófagos
se integram ao cromossomo hospedeiro.
Descoberta da transdução
Na transdução, a transferê ncia do material genético
de uma célula doadora para uma receptora é seguida
pela recombinaçào homóloga do fragmento doador e do
205
cromossomo receptor. A execuçã o desse processo cria
- uma cepa transdutante , que é o produto da transdução.
As condições que levam à transdu ção são raras e exi-
gem um erro no empacotamento de um cromossomo
- do fago durante infecçáo lítica. Ocorrem dois tipos de
-
transdução. A transdução generalizada é a transfe-
rência de qualquer gene bacteriano e pode ser reali -
zada pelos bacteriófagos que não discriminam entre o
DNA do fago e o da célula hospedeira. Por outro lado,
a transdução especializada é realizada apenas pelos
- fagos temperados, e os genes transferidos limitam -se
- aos muito próximos do sítio de integraçã o do fago.
A transdução foi identificada pela primeira vez em
um experimento de 1952 realizado por Norman Zinder
e Joshua Lederberg. O experimento foi concebido para
-
- examinar a conjugação entre duas cepas da bactéria
Salmonella typhimurium. Em seu experimento, Zinder
e lederberg misturaram a cepa duplamente auxotrófica
his~ met phe~ trp* tyr\ que exige histidina e metionina
para crescer, com a triplamente auxotrófica his* metr
phe ~ trp~ tyr , que cresce apenas com suplementaçào de
fenilalanina, triptofano e tirosina. Conforme o previsto,
Zinder e Lederberg encontraram uma baixa frequência
de recombinantes prototróficos, coerente com a sua hi -
pótese de que a conjugação era um processo de trans-
ferência de genes de células doadoras para reccptoras.
Zinder e Lederberg realizaram então um experi-
mento com tubo em U usando as mesmas cepas auxo-
tróficas que tinham estrutura similar às do experimento
do tubo em U de Davis, descrito na Seção 6.1 ( ver Figura
6.3). Eles não esperavam nenhum protótrofo como re -
sultado do experimento, pois o disco de vidro no tubo
-
-
em U impediria a passagem das células bacterianas pelo
disco. No entanto, para sua surpresa, Zinder e lederberg
constataram que seu experimento do tubo em U produ-
ziu protótrofos. Esse resultado indicou que os genes es-
tavam sendo transferidos por um mecanismo que não
exigia o contato de conjugação entre as células. Aparen -
- temente, o agente responsável pela transferê ncia era su -
ficientemente pequeno para passar pelo filtro de vidro e,
portanto, era necessá ria apenas uma pequena fração do
tamanho das células de Salmonella no experimento.
Zinder e Lederberg sabiam que uma das culturas
de Salmonella estava contaminada com um bacterió-
fago identificado como P22 e especularam que o fago
poderia ter desempenhado um papel na transferência
genética incomum no experimento do tubo em U. Os
pesquisadores realizaram outros experimentos de tubo
em U com filtros de vidro possuindo vários tamanhos
de poros e constataram que os protótrofos eram pro-
duzidos quando o tamanho do poro era maior que o
tamanho do P22, mas não quando o tamanho do poro
era menor que o do P22. Eles também conseguiram
mostrar que o material que passava através do filtro de
vidro era maior que uma molécula de DNA, excluindo
assim a transforma ção como o processo criador dos
protó trofos no experimento do tubo em U. Zinder e I e-
derberg concluíram que a presença do P22 e a exclusão
-
206 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

da transformação como mecanismo de transferência
genética significavam que o fago P22 era portador de
DNA bacteriano. Eles batizaram o processo recé m -des-
coberto como transduçáo por transferência gen ética.
Transdu çáo generalizada
Nas seis d écadas desde que Zinder e Lederberg
descobriram a transduçáo generalizada, vários tipos de
fogos de transduçáo generalizada foram identificados.
Os fagos de transduçáo generalizada são formados
quando um pedaço aleatório do DNA bacteriano doador
do tamanho adequado é empacotado por engano na ca *
O A lise da célula hospedeira libera fagos normais e de
transduçáo generalizada.
O O fogo de transduçáo generalizada se acopla às novas
células receptoras e injeta o fragmento de DN A doador.
O Em cada célula receptora ocorre a recombí nação ho-
m óloga entre o fragmento do DNA doador e o cro-
mossomo receptor. Pares de eventos de crossing -
- over são necessá rios para unir o fragmento doador
Fago PI O 0doadora
f*9 P 1 Inlecta uma célula
° mer
, hir

beça do fago em vez de um DNA do fago de tamanho Bactéria doadora

o~
DNA ,, , ( mer, h /54)
similar. Esse erro ocasional no empacotamento do DNA do PI ^
,meV

ocorre porque o mecanismo de empacotamento que in-

sere o DNA na cabeça do fago discrimina o DNA por seu Cromossomo
bacteriano
tamanho (em pares de base) em vez de discriminar pela Fragmentos do
sequência. Os fagos de transduçáo generalizada podem cromossomo
portar qualquer segmento do DNA doador, uma vez que bacteriano
o processo de empacotamento equivocado é aleató rio. mer O Oreplicado
cromossomo do fago é
e as proteinas do
O fago PI é um bacteriófago bem estudado que fago são expressas.
infecta a E. coli e é um produtor prolífico de fogos de O cromossomo doador se
transduçáo generalizada. Esse fago foí escolhido ini - fragmenta.
cialmente para o estudo intensivo de sua capacidade de Fago Pi Fago PI
transduçáo porque tem um genoma grande de quase transdutante I normal
O A montagem dos fagos da
100 mil pares de base (100 kb). Para produzir uma pro progénie produz fagos
gènie de fogos de transdu çáo generalizada, o PI precisa normais portadores do
cromossomo do fago e fagos
capturar segmentos do DNA bacteriano doador com transdutantes portadores de
quase 100 kb, um comprimento que é aproximada - um fragmento do
mente 2% do cromossomo da E coli. A aná lise das in - Fago PI I
cromossomo doador.
,lbera fa9°s normais e
fecçôes do PI nos diz que cerca de 1 em 50 integrantes da progé nie u O transdutantes
A
da progénie de uma infecçào do PI consiste em um fogo na progé nie
de transduçáo generalizada.
1
A Figura 6.17 ilustra a transduçáo generalizada em
sete etapas (combinando o acoplamento e a injeção em
uma primeira etapa única ):
O Um fogo P1 normal se acopla à célula bacteriana doa
dora e injeta seu cromossomo nessa célula.
-
O Um fago transdutante mer Infecta
O A replicação do cromossomo do fago é seguida pela uma célula receptora mer e injeta o
fragmento de DNA doador.
transcriçã o e tradução para produzir proteí nas de
éria receptora
fogo. A fragmentação do cromossomo bacteriano mef x (Bact
met , hrs )
' '

precede o empacotamento dos cromossomos nas DNA

cabeças dos fogos. doador
( mer) Cromossomo
O A montagem do fogo da progé nie, incluindo o em - bacteriano
pacotamento das cabeças, é praticamente normal ,
mas alguns fagos da progé nie recebem um frag -
mento aleató rio do cromossomo bacteriano doador O Ahom
recombí na ção
óloga em dois
com aproximadamente o mesmo tamanho do cro- pontos de Crossing -ove/
mossomo do fago. Esses fogos anormais da progé- troca segmentos entre
o fragmento doador e o
nie sâo fagos de transduçáo generalizada. cromossomo receptor.

.
Figura 6.17 Transduçáo pelo fago PI Os fagos
transdutantes são gerados pelo empacotamento equivocado
O O transdutante é mer, f»/r.
O DNA excitado contendo
de um fragmento do DNA da bactéria doadora em uma cabeça mer é degradado.
.
de fago 0 As bactérias transdutantes são produzidas pela
recombí nação homóloga entre o fragmento de DNA doador
introduzido e o cromossomo bacteriano receptor (O e O). Bactéria transdutante (mel*, hrs )
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos
ao cromossomo reoeptor e excisar o segmento ho
mólogo do cromossomo. O fragmento cromossô -
mico excisado é degradado por enzimas.
O O resultado é uma cepa transdutante estável.
Cotransduçáo
A célula doadora no experimento de transduçào exi -
bido na Figura 6.17 tem o genó tipo met his* e a célula
receptora é metr his . A cultura bacteriana na qual esse
~ (b) Mapa do ôperon f /p
experimento ocorre vai conter milhões de bactérias, a
maioria das quais não é transduzida. Além disso, muitas
células podem ser transduzidas com alelos doadores que
não são testados no experimento. Os transdutantes de
tectados nesse experimento em particular são aqueles em
que um ou ambos os alelos met ou his* são transduzidos.
Os transdutantes com o genótipo met his ou com o
genótipo mctr his* fornecem evidências de que cada alelo
pode ser transduzido individualmente. Além disso, um de
terminado n úmero de transdutantes vai sofrer transduçào
simultânea de ambos os genes para produzir transdutan
tes met his* . Essas células sofreram cotnuisduçáo dos
dois alelos doadores. A frequência de cotransduçáo de-
pende da proximidade dos genes no cromossomo doador.
Quanto mais próximos os genes estiverem, maior é a pro-
babilidade de cotransduçáo ( portanto, quanto maior for a
frequência de cotransduçáo), e quanto mals distantes esti-
verem os genes, menor é a probabilidade de cotransduçáo.
Se, por exemplo, um pesquisador executou o cruzamento
de transdução na Figura 6,17 e identificou 200 transdu
tantes para met , ele poderia determinar a frequência de
cotransduçáo identificando quantos desses transdutantes
met também foram transduzidos (isto é, cotransduzidos)
.
para his* Se a análise determinou que 28 dos 200 trans-
dutantes met também foram transduzidos para his* , a
frequência de cotransduçáo desses genes é 14% ( /£,).
Para conseguir achar os transdutantes em um expe
rimento, os pesquisadores podem ter de determinar o ge
nótipo de grandes quantidades de colónias. Para reduzir o
número de colónias que precisam ser genotipadas nesses
experimentos, utiliza -se uma estratégia de duas etapas que
primeiro identifica as células transduzidas com um alelo
doador e depois faz uma triagem dos transdutantes quanto
à aquisição de mals alelos doadores. A primeira etapa em -
prega uma triagem de marcador selecionado para iden
tificar os transdutantes quanto a um das alelos de doado-
res. Os transdutantes para o marcador selecionado passam
por uma segunda triagem em busca de um segundo alelo
doador em uma triagem de marcador não selecionado.
O objetivo é determinar a porcentagem de transdutantes
para o marcador selecionado que também são transduzi-
dos para o marcador nào selecionado, enquanto se reduz a
genotipagem desnecessá ria das colónias.
Mapeamento da cotransduçáo
A construção do mapa gen ético nas bactérias usa as
frequências de cotransduçáo para determinar a ordem
207
- (a ) Frequê ncias de cotransdu çáo Porcentagem
decotransduçâo
do marcador
selecionado
Genótipo Genótipo Marcador Marcador nà o
doador receptor selecionado selecionado com
cys* trpT cyVtrpF cys' trpC 63
cys* trpC cys trpC cys*
'
trpC 53
cys' trpÕ cys trpB cys trpB' 47
cys* trpA* cystrpA' cys' frpA * 46
cys trpE trpC trpB trpA
Figura 6.18 Análise da frequência de cotransduçáo de
- Yanofsky e mapeamento dos genes do óperon trp na f.
.
coli (a) As frequências de cotransduçáo do cys* e de um
gene do óperon frp são estimadas em experimentos distintos
-
de marcador selecionado marcador não selecionado, (b)
Mapa do ó peron trp proposto por Yanofsky.
-
- relativa de três ou mais genes. No mapeamento da co -
transdução , a frequência é maior nos genes mais próxi
mos uns dos outros e menor nos genes mais distantes.
-
O motivo é que dois genes quaisquer no cromossomo
doador tê m duas chances de serem separados por um
evento cromossômico. A primeira chance de separa çã o
ocorre quando o cromossomo doador se fragmenta.
Os genes mais próximos uns dos outros são mais pro-
pensos a estarem no mesmo fragmento cromossômico
- doador que os genes mais distantes. A segunda chance
de separaçã o ocorre durante a recombinaçáo hom óloga.
Mais uma vez, os genes mais próximos uns dos outros
no fragmento doador sã o menos propensos a se sepa -
-
rarem durante um evento de crossing over do que os
genes mais distantes.
Vamos examinar dois estudos que testam a ordem
dos mesmos quatro genes na E coli. A Figura 6.18 for-
- nece os dados de cotransduçáo dos experimentos rea -
lizados em 1959 por Charles Yanofsky em genes que
fazem parte do ó peron triptofano, um agrupamento de
genes envolvido na sí ntese do aminoácido triptofano
e que compartilham um único promotor. ( Discuti-
mos os ó perons em detalhes no Capítulo 14.) Para esta
discussã o, você só precisa saber que os genes em um
- ó peron são transcritos sob o controle de um ú nico pro-
motor e que são muito mais pró ximos uns dos outros
que os genes que possuem seus pr óprios promotores.
Yanofsky' usou a abordagem de marcador sele -
cionado - nào selecionado para determinar as frequên
cias de cotransduçáo de cada um dos quatro genes no
-
ó peron triptofano ( trpA , trpB, trpC e trpE) e um gene
fora do óperon, o cys. Yanofsky realizou quatro cruza -
mentos, cada um com uma cepa doadora que era cys*
c prototrófica para o gene trp. Suas cepas rcccptoras
eram cysr cada uma e auxotróficas para o gene do trp
sendo testado. No momento em que começou seus ex -
perimentos, Yanofsky sabia que o cys está situado fora
do óperon triptofano e construiu seus experimentos
208 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

para medir a frequência de cotransdução entre o cys e Aná lise de crossing-over dos dados de cotransdu ção
o gene do trp em questão. Em cada experimento, o cys* cys* trpC trpB *

foi o marcador selecionado utilizado para identificar os Doador = F

transdutantes informativos. O marcador n ào selecio-
nado foi o alelo trp do doador. Yanofsky obteve dados
Receptor
OX ©>
cys trpC* trpB*
para determinar a frequência de cotransdução do cys* e
do marcador trp não selecionado.
Em seu primeiro experimento, ele determinou que Classe Genótipo
entre os transdutantes cys* , 63% são cotransduzidos transdutante Eventos de crossing-over transdutante

--
.
para o trpE* Em seu segundo experimento, ele consta cy? trpC trpB
tou 53% de transduçâo entre cys* e trpC* . Yanofsky con
cluiu que o trpE é maLs próximo do cys do que o trpC 1
ÓX o: cys* trpC trpB
' '

com base nas frequ ências de transdu çâo mais altas para
.
cys e trpE do que para cys e trpC As frequências de co- cys trpC * trpB*

transdução para cys e trpB e para cys e trpA não são su

ficientemente diferentes para determinar a ordem dos
-
cys* trpC trpB
genes, mas com base nas frequências de transduçâo o
trpA e o trpB são mais distantes do cys do que o trpE e 2
ÕX oX cys' trpC trpB *
'

.
o trpC Yanofsky propôs um mapa genético do óperon
-
triptofano com a ordem cys trpE trpC trpA. - - cys trpC ‘ trpB '

O segundo estudo foi realizado para testar a ordem

desses genes, visando corroborar ou refutar o mapa ge
nético proposto por Yanofsky. Nesse estudo, o genótipo
- cys* trpC '
trpB '

da bactéria doadora é cys’ trpC trpB e o genótipo da 3 o: 3 cys* trpC * trpB*

bactéria receptora é cys~ trpC* trpB\ Os transdutantes cys trpC’ trpB 4

são selecionados para transduçâo do cys* e, então, pas-

sam por uma triagem a fim de determinar seus genótipos
para trpC e trpB. Os genótipos de 302 transdutantes cys* cys’ trpC trpB
.
são exibidos na Tabela 63 Os cotransdutantes dos ale
los doadores cys e trpC têm o genótipo cys* trpCu e são
- 4
=
d o: F
cys* trpC’ trpB

encontrados na classe I, que possui 139 cotransdutantes, cys- trpC* trpB*

e na classe 2, que tem 18. A frequência de cotransdução
cys-trpC é, portanto, + = 0,52, ou 52%. De modo si-
^^
milar, a cotransdução do cys e do trpB é identificada pelo
genótipo cys* trpB\ As classes transdutantes 1 e 4 pos-
suem esse genótipo cotransdutante e a frequ ência de co
transdução é + .jJj = 0,47, ou 47%.
Para testar o mapa do óperon Trp proposto por
Yanofsky, os eventos de cmssing-over necessá rios para
produzir cada classe de cotransdutante são identifica -
dos. A Figura 6.19 ilustra as posições de quatro pontos
-
de crossing over em diferentes combinações para cada
classe de cotransdutante. Os transdutantes que adqui-
rem cys* devem sofrer crossing-over no ponto 1, além de
pelo menos um ponto adicional. A localização precisa
-
do ponto de crossing over pode variar sobre uma grande
Ta bela 6.3 Teste da ordem dos genes do óperon trp
proposta por Yanofsky
Classe transdutante Genótipo transdutante N ú mero
cys* trpC~ trpB~
1
2 cys* trpC trpB*
'
3 cys* trpC* trpB*
4 cys* trpC* trpB-
TOTAL
F igura 6.19 Teste do mapa gen étko do óperon trp
proposto por Yanofsky. As posições aproximadas dos
-
possíveis crossing overs estão numeradas de 1 a 4. Para
- cada genótipo cotransdutante, são identificados os s ítios de
crossing -over necessá rios.
extensão do cromossomo à esquerda do cys. O segundo
ponto de crossing-over deve ocorrer à direita do cys em
qualquer uma das trés posições: na posição 2, dentro de
uma distâ ncia relativamente grande entre o cys , que está
fora do óperon , e o trpC dentro do óperon; no ponto 3,
um lugar muito pequeno no ó peron entre o trpC e o trpB;
ou no ponto 4, uma grande região à direita do trpB. Três
combinações de Crossing over duplo diferentes geram
classes de transdutantes 1, 2 c 3, e a classe de transdu -
tante 4 é produzida por uma recombinaçào quádrupla
-
que exige o crossing owr em todos os quatro pontos. O
-
crossing over quádruplo deve ser a menos frequente das
combina ções que produzem cotransdutantes. Esse es-
tudo verifica o mapa do óperon Trp proposto por Ya -
nofsky, por duas razões: A primeira é que as frequências
139
18
-
de cotransdução paia cys trpC e para cys trpB são quase
idênticas nos dois estudos (53% versus 52% para cys trpC
- -
141 -
e 46% versus 47% para cys trpB ), colocando o trpC mais
4
perto do cys em ambos. Segundo, o evento de recombi
naçào quádrupla deve ocorrer com menos frequência
-
302 que qualquer um dos eventos de crossing-over duplo.
 Cap í tulo 6 Aná lise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos 209

Observação genética A cotransduçào ocorre quando dois

ou mais genes sáo transduzidos simultaneamente de uma célula DNA òoftgo

doadora. A frequènõa de cotransduçào é utilizada para construir j attP

mapas genéticos com base no princí pio de que as frequências de GCTTMTTATACTAA
ÇJ
cotransduçào são mais altas para os genes mais próximos uns dos T
outros e menores para os genes mais distantes. I
GCTTTTTTA I AC IAA
«ummKQi
ottB T
Transduçã o especializada
Conforme a descrição anterior, bacteriófagos tem -
%V DMA becteriano

* $ X ê Xl
êA9 X 0X 9 X 9 X\ 8
perados, como o fago lambda (X), t ê m a capacidade de li-
sogenizar seu hospedeiro integrando-se ao cromossomo
desse hospedeiro para criar um prófago. O sítio de inte-
gração é uma sequência de DNA chamada sí tio de att
(do inglês “attachmenf ou acoplamento), que é idêntica
nos cromossomos bacteriano e do fago. A sequência de 15
pares de base chama -se attP no fago lambda (o P significa
fago em inglês, " phage” ) e attB { B de bactéria ) em sua bac-
téria E coli hospedeira Figura 6.20 ). Uma enzima de fago
especializada reconhece os sítios de att e realiza um corte
escalonado nesse ponto. As extremidades complemen -
tares de fita única do DNA clivado no att recombinam à
medida que o prófago se integra, criando uma sequência
de att em cada extremidade do prófago integrado.
Uma vez que as sequências attB e attP sáo idênticas,
a excisá o de um prófago quase sempre é a inversão exata
da integra ção do prófago. No entanto, às vezes a excisão
é imperfeita: ela remove apenas uma parte do prófago
e, junto com ela, uma parte do cromossomo bacteriano
adjacente. A excisão aberrante de um prófago forma um
fago de transdução especializada ( Figura 6.21 ). Na £.
coli , a attB está situada entre os genes galK e bioA; desse GCTTTTT MI» T A A -y v > K /y G C T T T i TTATACTA Ã ,
(

CGAAAAAA í A I VXA‘C 6 À AAAAATAT 6 A

modo, a excisão aberrante do prófago que ocorre em
um sentido vai capturar o gene bacteriano gal* para for-
mar o fago de transdução especializada\dgal* ( d signi-
fica defeituoso ) e, no outro sentido, vai capturar o gene
bacteriano bioA , formando o fago de transdu ção espe
cializada\dbio\
Os dois tipos de fago de transdu çã o especializada
são defeituosos quanto a certos atributos de cresci -
mento e comportamento do fago. O fago\dgal * não
possui vá rios genes essenciais, entâo, embora ele
possa infectar as células hospedeiras, não consegue
concluir o ciclo lítico ou lisogê nico. Por outro lado,
os fagos \dbio* n ão carecem de quaisquer genes es
senciais, mas nã o possuem os genes necessá rios para a
lisogenia. Desse modo, os fagos\dbio* sã o exclusiva
mente l íticos.
O estudo do fago de transdução especializada levou
à descoberta de uma fonte importante de transferência
gené tica entre as bacté rias. Além dos mecanismos que
discutimos neste capítulo, hoje os microbiólogos sabem
que a transdução especializada é uma fonte de transfe
rência genética entre bactérias da mesma espécie e até
mesmo entre bactérias de espécies diferentes.
A Aná lise Genética 6.3 vai guiá - lo por uma análise
da transdução a fim de determinar a ordem dos genes
em uma cepa doadora.
PTOfago
-
XXX5000000000ooc
Figura 6.20 Criação do prófago X pela recombinaçáo
£
entre sequê ncias de DNA attB e attP idênticas.
6.6 Os cromossomos de
bacteriófagos são mapeados pela
aná lise da estrutura fina
- Antes de o DNA ser identificado como o material
- hereditá rio, muitos biólogos consideravam os genes
como unidades de hereditariedade indivisíveis» que não
podiam ser subdivididas pela recombinaçáo. Essa ideia
deriva da descrição original de Mendel da “ herança
particulada ” dos traços. Antes de conhecer a estrutura
molecular do DNA, os biólogos tinham dificuldade de
- descrever como a recombinaçáo dentro de um gene
poderia ocorrer. Os geneticistas sabiam que mutações
diferentes podiam afetar um ú nico gene e tinham dados
de um estudo de 1949 sobre a recombinaçáo intragé
nica da muta ção do olho loztnge da Drosophila , feito
-
por Melvin e Kathleen Green , mostrando que diferentes
210 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

muta ções podem ocupar posições exclusivas dentro de

Cromossomo um gene (ver Figura 5.12). Mas o que ainda faltava era
do fago\
uma compreensão refinada da estrutura interna
—
da estrutura fina dos genes.
— ou

A partir do inído dos anos 1950, Scymour Benzer

mudou a compreensão que os cientistas tinham dos genes
com uma série de experimentos que revelaram a existência
Cromossomo de uma estrutura genética fina, termo que faz referência
bacteriano
à composição dos genes no nivel de seus elementos mo-
leculares básicos. Benzer demonstrou que os elementos
básicos dos genes eram responsáveis pela mutaçã o e pela
recombmaçâo. A publicação de suas principais conclusões
coincidiu com a identificaçã o da estrutura molecular do
Integração Indução normal DNA. Quando as subunidades funcionais do DNA foram
reveladas como nucleotídeos, foi impossível não perceber
qalK Prófago a conexão entre eles e a estrutura fina de Benzer.
Benzer se concentrou em duas questões. Primeiro, o
gene era a unidade fundamental da mutação ou os com -
ponentes dos genes poderiam sofrer mutações? Segundo,
a recombinação era um processo que ocorria apenas
entre os genes ou também entre os componentes dos
genes? Benzer estudou essas questões usando a região rll
do bacteriófago T4. Os genes na região rll determinam se
e como o fago vai provocar a lise de sua hospedeira £ coli .
Induçã o aberrante A lise é examinada usando um tecido bacteriano uma —
cobertura sólida de bactérias na superfície de um meio de
cultura. Se as bactérias em cultura forem expostas a um
bacteriófago, as células infectadas sofrem lise e é liberada
uma progénie de fagos. Esta infecta as novas células hos-
pedeiras e, com a continuação do ciclo infecção- lise -in -
fecção, aparece no meio de cultura uma mancha isenta de
—
bactérias, chamada placa um furo no tecido bacteriano.
Benzer mostrou que dois genes, rllA e rllB , con -
trolam a capacidade dos fagos T4 para provocar lise das
células hospedeiras de £ coli. Os fagos T4 portadores
de cópias do tipo selvagem de rllA e rllB provocam a
lise de várias cepas de £ coli , levando à produção de
pequenas placas ( Figura 6.22). Por outro lado, os fagos
com mutação do rlLA ou do rllB formam placas grandes
Fago de transduçáo e irregulares na cepa B da £ coli , mas não conseguem
especializada \àgaf‘ formar quaisquer placas na Kl 2 da £ coli ( X ).

X DNA AC NA

Cromossomo
bacteriano Placa
mutada

Placa do tipo
selvagem

Figura 6.21 Padrões de indução do prófago X. O fago X Tecido

se integra à bactéria hospedeira para formar o prófago pela
recombtnaçao espec ífica para o s ítio entre os sítios artP e attB
(superior). A indu ção normal do prófago reverte a integra ção
de forma precisa e restaura as sequê ncias attPeattB ( meio).
A indução aberrante (inferior ) produz fago de transduçáo
especializada\dbio* ou Xdgal\ dependendo do sentido da
indu ção aberrante.
bacteriano
Figura 6.22 Formaçã o de placa pelos tipos selvagens
.
e mutantes da rll Em um tecido bacteriano de cepa 6
da E. cofí ,formam-se pequenas e semicirculares placas do
tipo selvagem pelos fagos T4 com uma regi ão rtl do tipo
selvagem . Grandes placas mutadas Irregulares sáo formadas
pelos fagos T4 com as mutações da rll.
 Capí tulo 6 Análisee mapeamento genéticonas bactériase bacteriófagos 211

AN ÁLISE GENÉTICA
Na £ coii, o thr e o leu' são alelos prototróficos que controlam a síntese dos aminoácidos treonina e
.
leucina Os alelos auxotróficos são deficientes quanto à sua capacidade de sintetizar esses aminoácidos.
As bactérias portadoras do alelo azf são resistentes ao composto antibiótico azida, e as portadoras do
alelo azf sào suscetíveis a esse composto. A £ coti com qenótipo thr leu* aà* é infectada com o faqo PI.
Os fagos da progénie sáo coletados e utilizados para infectar bactérias
com genótipo thr leu azf e as céluias são colocadas em meto sele- Marcador( es) Marcador ( es ) não
tivo para um ou dois marcadores doadores em um experimento de Experimento selecionado( s) selecionado(s)
transdução. A tabela á direto identifica os marcadores selecionados e 1 /eu* azf = 50%, thr = 4%
fornece a frequência de cotransduçâo dos marcadores não seleciona-
dos para cada experimento. A partir das Informações fornecidas, de- 2 thr azf = 0%, leu* = 4%
termine a ordem dos trés genes no cromossomo doador. 3 leu* e thr azf * 2%

Estrat é gias de solu ção Etapas da soluçã o

Avaliar
. .
1 Identifique o tópico abordado por esse pro 1 Este problema diz respeito à cotransduçâo, com frequências de cotransdu -
blema e explique a natureza da resposta çáo usadas para determinar a ordem dos très genes na bactéria doadora.
solicitada.
2. Identifique as informações cr
íticas forneci- .
2 São fornecidos os resultados de três experimentos de transdução. Cada
das no problema. experimento tem um gene diferente como marcador selecionado.

Deduzir
.
3. Descreva a vantagem de usar a abordagem 3 A escolha da transdução de um dos genes de interesse e a subsequente
experimental de marcador selecionado-não avaliação dos transdutantes de outros genes reduz o número de placas
selecionado. que precisam ser avaliadas e simplifica a análise experimental.
.
4 Interprete os resultados dé cada experimento . .
4 O experimento 11ndica grande proximidade de leu e azi e uma maior dis -
.
tância entre leu e thr O experimento 2 sugere a mesma relaçã o mais dis-
V
DICA: As frequências de covans-
tante entre thr e leu, mas também não exibe cotransduçâo entre thr e azi.
O experimento 3 nos informa que a cotransduçâo de todos os tr ês alelos
duçáo sác maiores nos genes r\» fs
pcóiimos uns dos outros nocromos .
ocorre em uma frequência baixa Podemos interpretar isso como o fato
somo bacterWno . de que o segmento do cromossomo contendo esses genes é suficiente-
mente pequeno para formar um fragmento único para a transdução.
Solucionar
5. Combine as suas observações para identifi- 5. Reunindo os resultados dos experimentos, podemos identificar a cotrans-
car a ordem desses très genes . duçáo do thr e do azi (exibida em 0% no experimento 2) como o cotrans -
.
dutante de cross/ng-over quádruplo Todos os outros eventos resultam de
V
UCA: 0 r/osring OMY OCDTT rm pam
crossing-over duplo. O evento de crossing-over quaádruplo deve ser o menos
frequente entre os cotransdutantes.Com base nesse fato, o leu pode ser iden-
durante a rccofrbinaçán homóloga que tificado como o gene intermediário dentre os trés testados.O mapa genético
acompanha a transduçJa Quando trés
.
genes estio emohidos um crmúng-ovei
é exibido a seguir e os quatro intervalos de croninq-over são Identificados.
quádruplo é menos frequente que qual-
quer um dos crouing-ovtrs duplos
azi 9 leu * thr *

o :«*:
Doador

Receptor
> < ox o:
azi í leu thr

Os eventos de crossing -over que contribuem para cada cotransduçâo de -

tectada nos experimentos são exibidos na tabela a seguir .
Cotransduçâo -
Crosslng overs
azf e leu* 1e3
leu* e thr 2e4
azf , leu* e thr 1e4

Para praticar mais, ver Problemas 9.18 e 22 .

212 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Benzer usou vários mutágenos diferentes para pro - (a) Complementa çào das muta ções em genes diferentes
duzir quase 20 mil mutantes de rll que ele estudou de Mutação Mutação
três maneiras. Primeiro, usou a análise da complemen- Lócus rti m Gene A I Genefl 1 x I Gene A
tarão genética , que mostrou que existem dois genes na í i
região rll . Segundo, de mapcou diferentes muta ções Produtos A B A B
do rllA e diferentes mutações do rllB , mostrando, com virais: defeituoso funcional | funcional defeituoso
isso, que a recombinação intragênica era possí vel e po-
deria ser utilizada para estabelecer as posições das di - 1
ferentes mutações em cada gene. Finalmente, Benzer
desenvolveu o mapeamento das deteções para refinar o
Tecido da Kl 2 QO
de E. coh - Placas T4 do
tipo selvagem

mapa genético. As discussões a seguir examinam cada

uma dessas realizações individualmente. Durante a infocçào simult â nea ocone complementaçào porque
as formas funcionais das proteínas A e B estão presentes
Análise de complementaçào genética (b ) Nenhuma complementaçà o das mutações nos mesmos genes
Para identificar o n úmero de genes na região rll, Ben- Mutação Mutaçào
zer realizou a análise da complementaçào genética, coinfec - Lócus rll 3 x BcfTíTTJ l gSElJI
^ i
tando a bactéria K12 (X) com diferentes pares de mutantes i
da rll. Quando dois mutantes da rll exibindo complemen - Produtos A B
virais: defeituoso funcional
* A B
defeituoso funcional
taçào genética coinfectam a bactéria Kl 2 (X ), formam -se
placas no tecido bacteriano, indicando que a lise do tipo
selvagem foi restabelecida. Esse resultado identifica os mu-
Tecido da K12 W
1 Nenhuma placa
tantes como mutações de diferentes genes. As coinfecçôes de E. cotl
por mutantes da rll que náo levaram à formação de placas
na Kl 2 (X) representaram uma náo complementaçào e
esses pares foram identificados como mutações do mesmo Durante a nfecçào simultânea, nâo ocorre complementa-
gene. Esses mutantes de um único gene são alelos uns dos çào porque nenhuma pnotena A funconal está presente
outros. Benzer identificou dois grupos de complementaçào
genética, nomeando-os como A e B, os quais levaram - no a Mutação Muta çã o

—
identificar dois genes na rll rllA c rllB .
A aná lise subsequente revelou que cada gene pro-
Lócus rfJ J Gene A
* *
L x
;
f 5ênê flf 1

duz uma proteína e que ambas as prote í nas sào neces

sá rias para a lise. A Figura 6.23a ilustra a complementa -
- Produtos
virais:
AL 0
funcional defeituoso
A B
funcional defeituoso

çào genética de um par de mutantes da rll . Um mutante

produz a proteína funcional A e o outro produz a proteína
funcional B, fornecendo, assim, todos os componentes
proteicos necessá rios para realizar a lise. A complemen -
taçà o genética produz um grande n ú mero de placas nos
tecidos bacterianos infectados, mas cada fago da progé-
nie liberado após a lise continua mutado. A Figura 6.23 b
ilustra uma incapacidade dos mutantes para comple
mentação. Nesse exemplo, ambos os mutantes sào por
tadores de uma mutaçà o do rllB.
Observa çã o gen é tica A aná lise da complementaçào
Tecido da Kl 2 (\) Nenhuma placa
de E. coh
Durante a infecçáo simult â nea, não ocorre renhLma compe-
mentação porcue nenhuma proteína B funcional está presente.
- Figura 6.23 Análise da complementaçào genética
- para a lise da rll, ( a ) A complementa çào genética de dois
mutantes de fago defeituoso da lise ocorre quando os
mutantes são portadores de mutações de genes diferentes.
A complementaçào genética é revelada pela formação de
placas do tipo selvagem nas bactérias Kl 2 (A) ( b) Não ocorre
,

genética dos mutantes da lise da rll revela dois grupos de
complementaçào. Isso significa que os alelos mutados per-
tencem a dois genes diferentes, designados rllA e rllB, que são
necessá rios para a lise do tipo selvagem pelo bacteri ófago T4.
Análise de recombinação intragênica
Em raras ocasiões, Benzer observou que dois mu
tantes da lise que nâo conseguem complementar ( isto
é, mutantes do mesmo gene) produzem, contudo, algu -
mas placas de K 12 ( X ). Ele propôs que essas placas eram
produzidas pelo fago do tipo selvagem que resultou de
complementaçào genética em mutantes defeituosos da lise
que carregam mutações do mesmo gene.
uma recombinação intragênica rara entre os dois mu -
tantes, cujos cromossomos carregam mutações em po-
sições diferentes de um ú nico gene ( Figura 6.24). Um
dos cromossomos recombinantcs resultantes carrega
uma mutaçào dupla e o outro é do tipo selvagem. ()s
- cromossomos do tipo selvagem sào encontrados nos
fagos da progé nie que realizam a lise do tipo selvagem .
Com base na determinação do n ú mero de células
em um frasco experimental e contando o n ú mero de
placas de K12 ( X ) produzidas subsequentemente, Ben -

Gene /4 Gene A
Muta ção da rll
Y
Coirvfecçdo
Mutação da ril
'\
Comrjrvseoi .
3ara aDssmg-cv«y
compementação nfragénco
A
1A i
A 0,013
Delituoso
1
Fago da
Defeituoso
Fago da
i II
Gene 4
II
A Gene A
progénie progénie Mutante duplo
mutante da rll mutanto
dã ír f
l l
Fago da
progé nie
mutante da ril
Figura 6.24 Coinfec ção simultânea de uma
célula hospedeira por dois mutantes do rlIA sem
complementação. Nenhuma complementa ção (esquerda )
é o resultado comum e previsto. No entanto, em casos raros,
a recombinaçáo intragênica (esquerda ) produz uma progé nie
de fagos do tipo selvagem e mutantes duplos.
zer conseguiu calcular a frequência de recombinaçáo
intragê nica dentro do gene rll para um determinado
par de mutações. Raciocinando que a recombinaçáo
recí proca era mais propensa a ocorrer entre duas mu
tações distantes dentro de um gene e menos provável
entre mutações mais próximas, Benzer conseguiu con -
verter o n ú mero observado de placas em uma frequ ên -
cia de recombinaçáo com a qual mapeou as mutações
da rll ( Figura 6.25). Em virtude do grande n úmero de
observações feitas, Benzer conseguiu concluir que, se
não foram obtidos recombinantes do tipo selvagem, as
mutações ocorreram no mesmo nucleotídeo.
Observa çã o gen é tica A recombinaçáo intragênica ocorre
entre mutantes da Use da rll sem complementação. As frequên
cias de recombinaçáo calculadas são usadas para criar mapas de
recombénaçào detalhados dos genes da Irse do fago.
Aná lise de mapeamento de deleçã o
A mutagê nese da rll de Benzer gerou dois tipos de
mutantes: mutantes reversíveis, que poderiam sofrer
reversão espontânea para o tipo selvagem, e mutantes
irreversíveis, que nunca revertiam. As mutações re
versíveis são provocadas por substituições da sequê n
-
cia base do DNA (mutações pontuais), que podem ser
revertidas para a sequência do tipo selvagem por meio
da reversão. Por outro lado, as mutações irreversíveis
são mutações por deleçào parcial nas quais uma parte
da sequê ncia gé nica é perdida. Uma sequência de DNA
deletada não pode ser restaurada pela reversão.
Cap í tulo 6 Aná lisee mapeamento genéticonas bactéfiase bacteriófagos 213
47
312 145
Mutantes da rll 295
168
282 228
0,10
Frequências de 0,08
0,10
recombinaçáo 0,16
Intragénlca 0,14
0,29
I I
V 0,00
L
0,037
Figura 6.25 Frequências dê recombinaçáo intragênica
Tipo selvagem entre as mutações que ocorrem em um segmento do gene
rlIA no bacteriófago T4.
Fago da
progénie do Usando uma técnica chamada mapeamento das
tipo selvagem
deleções, Benzer tirou proveito dessa diferença entre
da rll
mutantes reversíveis e irreversíveis para mapear a posi
çâo de cada mutação da rll. O mapa de deleções se baseia
-
na produção de fogos do tipo selvagem pela recombina-
çáo intragênica entre um mutante reversível e um irre-
versível (ver Figura 6.24). Quando um mutante é rever-
sível e o outro é irreversível, a capacidade para formar
recombinantcs intragênicos do tipo selvagem depende
dos locais das mutações. A Figura 6.26a ilustra a reversão
para o tipo selvagem por meio da recombinaçáo intra
genica entre uma mutação pontual e uma mutação por
deleçào, cujos locais não se sobrepõem. Por outro lado, a
- Figura 6.26 b mostra que, sc os locais da mutação pontual
e da mutação por deleção se sobrepuserem um ao outro,
a produção de recombinantcs do tipo selvagem é impos-
sível. Os recombinantes do tipo selvagem não são forma
dos nesse caso, já que o mutante por deleção não corise-
-
gue fornecer a sequê ncia do tipo selvagem para substituir
a sequência modificada na mutação pontual.
Na pesquisa publicada entre 1955 e 1962, Benzer rea-
lizou o mapa de deleções de quase 20 mil mutantes da rll.
Ele infectou bactérias com o fogo portador de mutações
- rev ersíveis individuais (mutações pontuais), unidos um de
cada vez com fogos portadores de mutações irreversíveis
( mutações por deleção) . Após analisar os padrões de for-
mação dos recombinantes do tipo selvagem, ele produziu
um mapa genético de estrutura fina retratando mais de
300 sítios distintos dentro dos genes rllA e rllB.
Em 1961, Benzer publicou um mapa de estrutura
fina contendo 1.612 mutações pontuais do rlIA e do
rllB ( Figura 6.27). Duas caracter ísticas desse mapa são
.
de nosso interesse Primeiro, as mutações estão disper -
- sas por todo o rlIA e o rllB, sugerindo que os genes são
- compostos de subunidades individualmente mutáveis.
Segundo, a distribuição das muta ções não é aleatória.
Mais de 100 mutações pontuais se aglomeram na re-
gi ã o A6c e a regiã o B4 é o sítio de mais de 500 muta ções
pontuais independentes. Esses sítios são pontos de mu
tação ativos que podem ser viabilizados por vá rias cir
--
cunstâncias ( Capítulo 12).
214 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 6.26 Mapeamento (a ) Mutações não sobrepostas» (b ) Muta ções sobrepostas, nenhum
das deleções dos recombina çáo do tipo selvagem recomblnante do tipo selvagem
mutantes na região rll . Os
Regi ão rll Região rll
recombinantes do tipo
selvagem se formam se o
A B A B A B A B
sítio da muta ção pontual
não se sobrepuser ao sitio de ZD--H
I E *1 1 l~ x ! | í
deieçáo, mas se os dois sítios Mutação Mutação Mutação Mutaçao
de mutação se sobrepuserem , por deieçá o pontual por deieçáo pontual
Colnfec çáo Coinfec çéo
a formação de recombinantes I
do tipo selvagem é impossível.
A B A B
JD ’ ZO -
EI I
A I B A I B
Recombina çáo Recombinaçáo

XI
A B
_7 A B
xi -t
A B A B
^ ii
Mutante duplo
e
Tipo selvagem Mutante por deieçáo
e
Mutante pontual

As mutações náo sobreoostas permitem a As mutações se sobrepõem e não são

recombinaçáo para gera'- recombirantes produzdos recombirantes do tipo selvagem.
do tipo sévagem e mutartes duptos.

Várias das deleções de Benzer são exibidas e sua es

tratégia de mapeamento é descrita na Figura 6.28. Trinta
e dois mutantes por deieçá o em dois grupos, chamados
Série I e Série II, são exibidos na Figura 6.27a. Na Figura
6.27b, um mutante pontual rlIA é testado quanto à sua
capacidade para formar recombinantes do tipo selva-
gem com sete mutantes por deieçáo da Série 1 e um sub
conjunto de trés mutantes por deleção da Série 11. Os
mutantes da Série I são usados primeiro para determi
nar qual dos seis segmentos da rlIA ( AI até A6) conté m
o mutante pontual. Neste exemplo, o mutante pontual
forma recombinantes do tipo selvagem com o mutante
por deieçáo 638 , mas nào com qualquer um dos outros
- seis mutantes testados. A única região do rlIA presente
no 638 que está ausente nos demais mutantes é o seg -
mento A6, levando à conclusã o de que a mutação pon -
tual ocorre no segmento A6 do rlIA. A região A6 é sub-
dividida em quatro segmentos ( A 6a até A6d ). Os trés
mutantes por deieçáo parcial da Série II sào, entà o, sele-
- cionados para a etapa final do mapeamento. Na análise
da Série II , vemos que o mutante pontual nào forma re -
- combinantes do tipo selvagem com PB230 e P18, mas é
capaz de fazê-lo com o 164. O menor intervalo faltante
no PB230 e PI 8, mas que está presente no 164, é a re-
giã o a 2 do rlí A6. Portanto, essa mutação pontual ma -
peia para rllA6a2.

Figura 6.27 Mapa genético

mostrando a posição dos mutantes
> 111 11111 , i
Ala A 1bl
» .
ITIT 1 , . ,
Atb?
1

Ala A2b A?d

A2cA2e ,
• í i ii f
A?f
ii 11

A?g A2 h
reversí veis ( pontuais) da região rll .
A2h
Esse mapa de mutações montado por A4d A4c A4a A3h A3q A3f A3e A3a-d A2h3
Benzer coloca ma is de 1.600 mutantes 11 ' • ' J i »
‘ I IH ' TT ’
I ' * T ' t || i i i l J : l l i i l| TTTTT
na regiáo rll e identifica pontos ativos
onde as mutações sào particularmente
A4e.
' A4b
* A3i

comuns. A4f
A4g
, . iiiTi . t n TIT 11111 nl 111 i 111111111n i . 11 h 111
MI i ..
ASa A5b A5c 1 A5c2 Ã5d A6a I A6a2 A6b
A6c

.
v 11 jlj ' i
B6 B5 B4
«T
m
B3 B2
i < 11 ' < 11
BI A6d

Ponto de mutação ativo

B7 \
Ponto de mutação ativo

il ui 11 T 11 11 !11 11111
58
.09TiÕ iT M—BIO
11 Ll 1
)
 Capí tulo 6 Análise e mapeamento genético nas bactérias e bacteriófagos 215

•
( )
1272
Mutantes por 1241
deleção da Série I J3
PT1
PB242
Mutantes por A 10S
1364 638
deleção da Série II FM66
386,
168 ,1993
1695i
Ptl 53
i

1231
25
?33 221

PB28
1589
I
P 18
196
W8- 33
1519
> 5 £ £6 6 £ 5 £££ £ £ £T £ £T 5 5 s S £ £ £ £ £ £ £ £ £ ? P3* 2
KJ U
I o
0 P
i
ú
- O
-
O ^ Q.T> Q rr ir
•o u»
a a - "*
ZJ •Q cr n Q. <2 Q cr r »
z *.
C O Q cr O Q cr

Gene rllA Gene rtlB

(b) Resultados da
recombinação
s
1272
1241
J3
PT1
PB742
Série I A 105
638 +

Série II P8230
PT8 ,
164
N +

333333333333333333333333333333333333 3333333331
-
Zl333 £2213212322E2E233H3E2SEILE2 213G3H3EI2SI '«lHEIEISSIESHHHHHHHH
i i rri i r II hrru
H
r n m rnin i n 1111111 m i - ^
Uma mutação pontual reversível é mapeada para a região riiA6 por sua capacidade de *crmar Tcombinantes do too se agem
* *
com mutantes irreversíveis da Série I que contém essa região. A focaização do mutante reversível no mapa é rvais preosarrente
Traçada usando mutantes da Série II que mostram suas fonrrvas recomninantes do tipo serragem com mutantes da Séne II
contendo a região níA6a2.

.
Figura 6.28 Mapeamento das deleções na região rll (a) Sete mutantes por deleção parcial da Série I da região rile 25
mutantes por deleção parcial da Série II subdividem a região rll em 47 segmentos, (b) A análise do mapeamento das deleções de
um mutante pontual rllA (reversível) para a região rllA6a2 por sua capacidade de formar recombinantes do tipo selvagem ( ) e
-
sua incapacidade para formar recombinantes do tipo selvagem ( ) com mutantes por deleção parcial das Séries I e II .
216 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
ESTUDO DE CASO
A evolução da resistência aos antibióticos
Um dia , cm 1929, Aicxandcr Fleming foi um pouco
desleixado com sua técnica estéril e cometeu um erro que
desde ent ão salvou milhòes de vidas. Fleming estava traba
lhando com a Staphylococcus, uma cepa bacteriana comum
que provoca uma infecçâo grave e potenrialmente fatal
quando entra no corpo através dc um corte ou escoriação.
No dia fatídico, Fleming contaminou inadvertidamente sua
cultura de Siaphylococcus com um fungo.
Normalmente, as células f úngicas se reproduzem cm cul
tura junto com cé lulas hacterianas e são notadas quando a cul-
tura é espalhada em placai O fungo contaminante de Fleming
era diferente, pois, quando Fleming espalhou sua cultura con
—
taminada nas placas, apenas as colónias de fungo cresceram
nào havia colónias bacterianas! O fungo tinha eliminado as
células bacterianas na cultura Reconhecendo isso como uma
descoberta importante, embora inadvertida. Fleming identi
ficou rapidamente o fungo como Pmicillium c deu ao com-
posto que eliminou a Staphylococcus o nome de penicilina.
Nos anos 1930, Howard Florey mostrou que a penici
lina era um antibiótico eficaz contra um amplo espectro de
bactérias infecciosas. No início da Segunda Guerra Mun
dial , Florey dirigiu um importante projeto dc “expansão”
para viabilizar a produção em massa da penicilina. Esta se
provou tremendamente eficaz na prevenção de infecçòes
bacterianas que, de outro modo, poderiam ter sido fatais.
Hoje, a penicilina e outros antibió ticos continuam a
salvar vidas, mas um problema médico importante e cres
cente associado ao seu uso sc desenvolveu nos últimos anos:
as cepas bacterianas resistentes a antibióticos sào cada vez
mais a causa dc infccçõcs dc difícil tratamento c até mesmo
de morte. Mais de 95 % das cepas de Staphylococcus en -
contradas nos hospitais atuais são resistentes à penicilina
e algumas cepas são portadoras dc alclos de resistê ncia a
.
vários antibióticos Essas cepas se chamam Staphylococcus
.
aurcus resistentes à meticilina ( MRSA ) já que a meticilina
é o composto básico de vá rios compostos antibióticos rela
cionados à penicilina. As cepas de MRSA são comuns em
ambientes pú blicos. Elas infectam pessoas nos hospitais, clí
RESUMO
6.1 As bact érias transferem genes por conjugação
As bactérias transferem material genético em um processo
unidirecional (da célula doadora para a receptora ) chamado
conjuga ção. A aná lise experimental determinou que a conju-
gação exige o contato direto entre a doadora e a receptora .
A conjugação é controlada pelos genes em um plasm ídeo
conhecido como fator F. As bactérias doadoras que carre - cria um cromossomo Hfr ( recombinaçâo de alta frequência ).
gam um fator F extracroroossômko sâo células Ff e as bac
térias sem um fator F sâo cé lulas F- ou receptoras.
- Muitos tipos diferentes de cromossomos da Hfr podem
I A transferência do fator F começa com a liga ção de um
complexo proteico de relaxossomo na origem de transfe-
rência (onT) e a clivagem de uma fita de DNA do fator F,
a fita T. A replicaçáo do DNA pelo mecanismo de c írculos
rolantes transfere o fator F da célula doadora para a recep-
tora através de um pelo de conjugação.
nicas medicas c vestiá rios, matando milhares de pessoas cm
todo o mundo anualmente. As cepas sâo t ão comuns que
- você pode ter a MRSA em sua pele neste momento!
O que aconteceu para provocar essa mudança ? Onde
antes a ci ê ncia médica tinha a capacidade de eliminar a
maioria das bactérias infecciosas, a situação atual é que qual -
quer um de nós pode incorrer em uma infecçâo de MRSA
potencialmente fatal. A resposta tem duas partes: a evolução
- da resistência aos antibióticos e a transferência rá pida dos
genes de resistê ncia aos antibióticos dentro e entre as espé-
cies bacterianas por conjugação, transduçào e transformaçã o.
- A evolução da resistência aos antibióticos nas bacté -
-
rias é um exemplo realista da evolução pela seleção. Nesse
caso, a pressão seletiva c aplicada pelo uso (c às vezes mau
uso e abuso) dos antibióticos utilizados para tratar seres hu-
.
manos e animais Pór exemplo, o tratamento com antibióti -
cos consegue eliminar as bactérias sensíveis ao antibió tico,
mas pode deixar uma reserva residual de bacté rias resisten -
- tes aos antibi óticos no corpo após o tratamento. O uso roti -
neiro de antibi óticos em raçáo animal també m pode incen -
- .
tivar a proliferação das bactérias resistentes a antibi óticos
Para piorar as coisas, a propensão das bactérias a troca
rem o DNA por conjugação, transformação e transduçào pos-
-
sibilita a disseminação rá pida da resistência aos antibióticos,
mesmo sem a tendência da seleção natural para aumentar as
.
frequências de alelos resistentes nas populações Particular-
- mente problemá tica é a capacidade das bactérias dc receber
genes de resistência antibiótica por transformação e a capa -
cidade de algumas espécies bacterianas de se conjugar com
membros dc outras cspccics c ate mesmo com bactérias per-
tencentes a outros gê neros. Os genes resistentes a medicamen -
-
tos encontrados nos plasmídcos R ( resistê ncia ) espalham sc
rapidamente c dc modo eficaz nas populações bacterianas.
As cepas resistentes a vários medicamentos frequentemente
são portadoras de mais de um tipo de plasmídeo R . O ponto
- principal é que as cepas bacterianas de MRSA c outras cepas
bacterianas resistentes a vários medicamentos são uma amea-
- ça importante c crescente a todos nós.
A conjugação entre uma doadora Ff e uma receptora F
transfere apenas o fator F. A célula F- é convertida para
uma célula F\ mas n ão recebe nenhum material genético
do cromossomo bacteriano doador.
A Integraçã o do fator F no cromossomo doador ocorre por
recombi nação nas sequências de inserção (IS) encontradas
no fator F e no cromossomo doador. A integração do fator F
ocorrer em uma ú nka espécie bacteriana Cada Hfr tem uma
orientação particular e um determinado sítio de integração.
A conjugação entre uma doadora Hfr e uma receptora F
transfere uma parte do fator F e um segmento do DNA
doador. 0 segmento doador sofre recombi naçã o homó-
loga com o cromossomo receptor. As exconjugantes rece-
 Capí tulo 6 Análisee mapeamento genéticonas bactériase bacteriófagos 217

bem genes bactérianos doadores, mas não sáo converti-
das para um estado doador.
62 A aná lise de conjugação interrompida
produz mapas de momento de entrada
Os mapas do momento de entrada sáo criados por cada cepa
Hfr pelos estudos de conjugação interrompida que identifi-
cam a ordem de entrada dos genes doadores e determinam a
.
distância (em minutos) entre os genes transferidos
Os mapas de Hfr para uma determinada bactéria sáo con-
solidados para formar um mapa genético do cromossomo
doador como um todo.
63 A conjugaçã o com cepas F' produz diploides
parciais
As cepas doadoras P são criadas quando a excisão de um
fator F da integração da Hfr remove o DNA do fator F com
o DNA do cromossomo doador adjacente.
I A conjugação entre uma doadora F e uma receptora F"
gera uma diploidia parcial nas exconjugantes.
6.4 A transformação bacteriana produz
recombinaçã o genética
.
Os fragmentos extracelulares do DNA liberados quando
há lise de uma célula bacteriana doadora, podem ser ab-
sorvidos através da membrana celular de uma célula re-
ceptora competente como DNA transformante.
6.5 A transdução bacteriana é mediada
por bacteriófagos
I A infecção por bacteriófago de uma célula bacteriana hos-
pedeira pode levar à lise dessa célula .
I Os bacteriófagos temperados podem sofrer integração es-
pecífica para o sítio no cromossomo hospedeiro por meio
de lisogenia.
Os fagos de transdução generalizada são criados quando
uma partícula do fago empacota equrvocadamente um
segmento do cromossomo bacterlano durante a lise da cé-
lula hospedeira.
As células receptoras sofrem transdução generalizada
quando o DNA doador introduzido por um fago de trans
dução generalizada recombina com o cromossomo recep-
tor. Quaisquer genes doadores podem ser transduzidos
durante a transdução generalizada.
I O mapeamento da cotransduçào determina a ordem dos
genes no cromossomo doador .
I Os fagos de transdução especializada são produzidos pela
excisão aberrante de um prófago lisogènico que remove
uma parte do prófago e um segmento adjacente do DNA
.
hospedeiro A transdução especializada se limita à transdu-
çáo dos genes adjacentes ao sítio de integração do prófago.
6.6 Os cromossomos de bacteriófagos são
mapeados pela aná lise da estrutura fina
I Seymour Benzer usou a análise da complementaçào gené-
tica para determinar que dois genes compóem a regiã o rtl

0 DNA transformante sofre recombinação homóloga com

* o cromossomo receptor para produzir transformantes que
adquiriram DNA doador.
Os genes intimamente ligados podem ser cotransforma-
dos e os mapas genéticos desses genes podem ser gerados
pela análise de transformação.
que controla a lise do bacteriófago T4 da £ coli .
I A análise da recombinação intragênica e o mapeamento
das deteções de maí s de 1.600 mutantes rllA e rlíB levaram
à condusâo de que os nucleotídeos do DNA sáo a unidade
fundamental da recombinação.

T E R M O S- C H A V E

Cepa Hfr (recombinação de alta
frequência)
(doadora Hfr) (cromossomo da Hfr)
(P m
Célula doadora (doadora bacteriana)
(p. 187)
Célula exconjugante (p. 166)
.
Célula F* (doadora F*) (p 187 )
.
Célula P (doadora FT (p 198, 199 )
Célula receptora (célula F') (p. 187)
Ciclo lisogènico (lisogenia) (p. 205 )
Ciclo lítlco (lise) (p. 201, 204)
Conjugação (p. 187 )
Conjugação Interrompida (p. 193 )
Cotransduçào (frequência de cotransdu-
.
çào mapeamento da cotransduçào)
ip. 207)
Cotransformação (p. 201 )
Cromossomo bacteriano (p. 186 )
Diploide parcial (p. 199)
Elemento de IS (sequência de inserção)
(p. 166)
Epissomo (p. 189 )
Estrutura genética fina (p.210 )
F- (células F ) (p. 187 )
Fago temperado (p. 205 )
Fator F (fertilidade) (plasmídeo F) (p. 186)
Fator F' (p. 199)
Fita T (p. 189)
Mapeamento das deleções (p. 213 )
Mapeamento do momento de entrada
(p. 193 )
Meio seletivo de cultura (p. 191 )
Mutante reversível [p. 213 )
Mutantes irreversí veis (p. 213 )
Origem de transferência (onT) (p. 189)
'Pelo* de conjuga ção (tubo de
conjugação) (p. 187)
Plasmídeo (p. 186 )
Plasmídeo R (resistência) (p. 186)
Prófago (p. 205 )
Replkaçào por círculos rolantes (p. 189)
Sítio de acoplamento (sítio de att ) (p. 209)
Transdução (p. 203 )
Transdução especializada (fago de trans-
dução especializada) (p.205, 209)
Transdução generalizada (fago de trans-
dução generalizada) (p. 205, 206 )
Transdutante (p. 205 )
.
Transformação (p 201 )
Transformante (p. 201 )
Triagem de marcador não selecionado
(p. 207 )
Triagem de marcador selecionado (p. 207)
218 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Para as bactérias que são F\ Hfr, F’ e F , responda:
'
a. a origem de transferência;
a. Descreva o estado do fator F. b. o pelo de conjugação;
b. Quais dessas células são doadoras? Qual é a receptora? c a recombinaçáo homóloga;
c Quais dessas doadoras podem converter exconjugan d. o relaxossomo;
tes para um estado doador ? e. a relaxase;
d. Quais dessas doadoras podem transferir um gene doa- f. DNAdafltaT;
dor para as exconjugantes? g. proteí na pilirva.
e. Descreva os resultados da conjugação (isto é, altera- 6. Descreva a diferença entre o eido litico e o ciclo lisogê-
ções na receptora e na exconjugante) que permitem a nico do bacteriófago.
detecçáo do estado do fator F em uma cepa doadora.
f. Descreva uma 'diploide parcial* e como ela se origina. 7. Descreva o significado do termo recombinaçáo específica

2. O diagrama de fluxo a seguir identifica as possíveis rela-

ções entre as cepas bacterianas em vários estados do fator
F. Para cada uma das quatro ligações no diagrama, forneça
uma descriçáo dos eventos envolvidos na transição.
1 2 4
F~ — F* — Hfr ->F
3 prevista das frequências de cotransduçâo para o mapa.
3. A conjugação entre uma célula Hfr e uma célula F~ não
costuma resultar na conversão das exconjugantes para o
estado doador. No entanto, às vezes o resultado dessa con
jugação é duas células Hfr. Explique como isso acontece.
4. As bactérias transferem genes por conjugação, transdução
e transformação. Compare e diferencie esses mecanismos
Em sua resposta, identifique se qualquer um dos processos
envolve recombinação homóloga e quais não envolvem.
5. Explique a importância das seguintes caracterí sticas nas
bactérias doadoras conjugantes:
para o sitio conforme é utilizado na identificação dos proces -
sos que levam á integração dos bactehófagos temperados
nos cromossomos bacterlanos hospedeiros durante a liso-
genia ou a formação do fago de transdução especializada.
8. O que é um prófago e como ele é formado?
9. Como a frequência de cotransduçâo está relacionada com
as posições relativas dos genes em um cromossomo bacte
rlano? Desenhe um mapa de três genes e descreva a relaçáo
10. Descreva as diferenç as entre complementação e re -
combinaçâo genética no que tange a sua relação com
- a detec ção da lise do tipo selvagem por um bacterió -
fago mutado.
.
.
11 Entre os mecanismos de transferência gené tica nas bac -
térias, qual deles é capaz de transferir o maior segmento
cromossòmico da doadora para a receptora? Qual pro
cesso geralmente transfere os menores segmentos cro-
mossómicos para a receptora? Exponha sua lógica para
as duas respostas .

Aplicação e integração
12. Sete mutantes por deleção (1 a 7 na tabela a seguir) são
testados quanto à sua capacidade para formar recombé-
nantes do tipo selvagem com cinco mutações pontuais
(a até e). O símbolo + Indica que ocorre recombinaçáo do
tipo selvagem e - indica que os tipos selvagens nâo são
formados. Use os dados para construir um mapa gené-
tico da ordem das mutações pontuais e indique o seg-
mento detetado por cada mutação por deleção.
mação de recombinantes do tipo selvagem e - indica
que os tipos selvagens não se formam.Na primeira parte
de sua resposta, use os dados da Série I exclusivamente
para identificar o segmento da região ril contendo o mu
tante de lise testado. Na segunda parte da resposta, use
os dados da Série II para refinar a localização da mutação
pontual. Explique seu raciocínio para as atribuições de
posição das mutações nos dados de ambas as séries.

Mutação por deleção Série I Série II

Mutação pontual J_ 2 3 4 5 6 7 Mutação por Mutação por
a -f + deleção Resultado deleção Resultado
b 4 + + 1272 1364 +
c + -f + + 1241
J3
EM66
386 +
d + +
e + + PT 1 + 168
PB242 + 1993
13. Uma mutação de lise da rll provocada por uma muta- A 105 + 1695
ção pontual é testada contra várias deleções por muta- 638 + PT153
ção exibidas na Figura 6.28 quanto è sua capacidade para
formar recombinantes do tipo selvagem Os mutantes . 1231
C33
por deleção são divididos em dois grupos, Série I e Série
II. Na coluna 'resultado'da tabela a seguir, + indka a for- 250
 Capí tulo 6 Análisee mapeamento genéticonas bactériase bacteriófagos 219

14. Suponha que você tenha um mutante de lise da rll que conjugação e depois colocadas em trés meios de seleção
mapeia para um segmento A2h2. Use os mutantes por diferentes, compostos da seguinte forma:
deleçáo da Série I e da Série II identificados no problema
Meio 1:meio minimo mais leucina, metionina e estrepto-
anterior e preencha as colunas'resultados' com as desig-
mkina.
nações e - previstas para o mutante A2h2 .
Meio 2: meio mínimo mais cisteína, metionina e estrepto-
15. Cinco cepas Hfr da mesma espécie bacteriana são anali-
mkina .
sadas quanto à sua capacidade de transferir genes para
.
bactérias receptoras F" Os dados exibidos a seguir apre- .
Meio 3: meio mínimo mais cisteína leucina e estrepto
sentam a origem de transferência ( oriT ) de cada cepa e mklna.
fornecem a ordem dos genes, com o primeiro gene à es- a. Qual gene doador é o marcador selecionado em cada
.
querda e o último à direita Use os dados para construir meio?
um mapa circular da bactéria. .
b Apresente todos os genótipos bacterianos possíveis
em cada meio .
Cepa Hfr Genes transferidos .
c Qual é o propósito de adicionar estreptomkina a cada
Hfrl oriT met ala lac gal melo de seleção ?

Hfr 2 oriT met leu thr azi A tabela a seguir mostra o número de colónias cultivadas
em cada meio de seleção. 0 tempo de amostragem in-
Hfr 3 oriT galprotrpazi dica quantos minutos se passaram desde o Início da con -
Hfr 4 oriT leu met ala lac jugação.
Hfr 5 oriT trp azi thr leu met
Tempo de amostragem
16. Um estudo de conjugação interrompida é executado nas (minutos) Número de colónias
cepas Hfr 1, 2 e 3, Identificadas no problema anterior . Placa 1 Placa 2 Placa 3
Após o estabelecimento da conjugação, uma pequena
3 0 0 0
amostra da mistura é coletada a cada minuto, durante 20
minutos, para determinar a distância entre os genes no 6 0 0 0
cromossomo. Os resultados de cada uma das trés cepas 9 0 62 0
.
Hfr são exibidos a seguir A duração total da conjugação
12 0 87 0
(em minutos) é fornecida para cada gene transferido.
15 51 124 0
Cepa Hfr 1 oriT met ala lac gal 18 79 210 62
Duração (min) 0 2 8 13 17 21 109 250 85
Cepa Hfr 2 oriT met leu thr azi 24 144 250 111
Duração (min) 0 2 7 10 17 27 152 250 122
Cepa Hfr 3 oriT gal pro trp azi 30 152 250 122
Duração (min) 0 3 8 14 19
d. Determine a ordem dos genes cys, leu e met a partir
a. Para cada cepa Hfr, desenhe um perfil do momento de dos dados de conjugação interrompida.
entrada como o da Figura 6.9a. e. Suponha um quarto melo de seleção contendo leucina
b. Usando o mapa cromossômico que você preparou na e estreptomkina. Em qual tempo de amostragem voc ê
sua resposta para o Problema 15, determine a dist ân- espera que apareçam as primeiras colónias? Explique.
cia em minutos entre cada gene no mapa . .
18 Uma cepa triplamente auxotrófica de £ coli com o genó-
c. Explique por que o azi é o último gene da cepa 2 a ser tipo phe- mer ara- é utilizada como cepa receptora em um
transferido nos 20 minutos de tempo de conjugação. experimento de transduçâo. A cepa é incapaz de sintetizar
Quantos minutos de tempo de conjugação seriam ne- sua própria femlalanina ou metionina e carrega uma muta -
cessários para permitir que o próximo gene no mapa ção que a torna incapaz de utilizar o açúcar arabinose para
fosse transferido da cepa Hfr 2? crescer. A receptora é cruzada com uma cepa prototrófica,
d. Escreva os resultados da conjugação interrompida que com genótipo phe* mer ara*. A tabela a seguir mostTa o
você prevê após 20 minutos de conjugação para as marcador selecionado e fornece as frequências de cotrans-
cepas Hfr 4 e 5. Use o formato exibido no início deste dução dos marcadores não selecionados .
problema.
.
e Em minutos, qual é o comprimento total do cromos- Colónias selecionadas contendo
somo na espécie doadora? Marcador selecionado o marcador não selecionado (%)
.
17 Uma cepa Hfr com o genótipo cys* leu* mer stf* é cru- phe* mer ara*
zada com uma cepa F portadora do genótipo cys leu mer 4 7
met st /*. Em um experimento de conjugação interrom-
pida, pequenas amostras de bactérias conjugantes são phe* 2 51
retiradas a cada 3 minutos, durante 30 minutos. As célu- mer , phe* 79
las retiradas são sacudidas vigorosamente para parar a ara* 68 5
220 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

a. Identifique os compostos presentes em cada um dos d Uma nova mutação, designada 9, não complementa os
meios seletivos. mutantes 1, 3, 5, 7 e 8. Formam-se recombinantes do
b. Use os dados de cotransduçáo para determinar a tipo selvagem entre o mutante 9 e as mutações 3, 5 e
ordem desses genes. 8;no entanto, nà o se forma nenhum recomblnante do
.
19 A arabinose é um açúcar usado pela bactéria ora * como tipo selvagem entre o mutante 9 e as mutações 1 e 7 .
única fonte de carbono em um meio de cultura. Duas Que tipo de mutação é o mutante 9 ? Explique.
mutações diferentes, ara ') e ara2~ , impedem a utilização e. A nova mutação 10 não complementa os mutantes 1, 4,
da arabinose para o crescimento das bactérias auxotr ófi- 5, 6, 8 e 9.0 mutante 10 forma recombinantes do tipo
cas. Sáo realizados experimentos de conjugação usando selvagem com os mutantes 1, 5 e 6, mas não com 4 e 8.
bactérias doadoras e receptoras auxotróficas para utiliza- O mutante 9 e o 10 formam recombinantes do tipo sel-
ção da arabinose, mas que de outro modo sâo prototr ófi- vagem. Que tipo de mutação é o mutante 10? Explique.
cas. Após a conjugação, 10* exconjugantes sáo colocadas f. A informação de mapeamento genético identifica os
mutantes 2 e 3 como os marcadores laterais nesse
no meio de cultura contendo apenas arabinose como
fonte de carbono. Os resultados sáo exibidos a seguir. grupo de genes. Supondo que essas mutações estejam
em extremidades opostas do mapa genético, determine
Número de a ordem das mutações na região do cromossomo .
Experimento
1
Doadora Receptora colónias ara*
araim arai' 0
21. A sí ntese do aminoácido histidina é uma via anabólica
de várias etapas que usa os produtos de 13 genes (hisA a
2 craT araT 0 .
hisM ) na £. coli Dois mutantes his da E.coli isolados inde-
pendentemente, designados his 1' e hls2~t são estudados
3 arai ara2 7
.
em um experimento de conjugação Uma cepa doadora
a. Qual é a explicação biológica mais provável para a pre- F* his* que carrega uma c ópia do gene hisJ no plasmídeo
sença de colónias prototróficas no experimento 3, mas é cruzada com uma cepa receptora his 1~ no experimento
nào nos outros experimentos? 1 e com uma cepa receptora ht$2 no experimento 2 As .
b. Suponha que em um experimento de acompanha- exconjugantes sáo cultivadas em placas sem histidina. O
mento usando ara 1, aro2 e uma terceira mutação de crescimento é observado entre as exconjugantes do ex-
arabinose, aro3, as frequências de cotransformaçào perimento 2, mas não entre as do experimento 1 .
sejam determinadas para cada par de mutantes. Para .
a Por que o crescimento é observado no experimento 2,
a arai e a ara2, a frequência de cotransformaçào é mas náo no experimento 1?
0,00008; para arai e ara3 , a cotransformaçào ocorre .
b Qual é o genótipo das exconjugantes no experimento 2?
em uma frequência de 0,00018; e a cotransformaçào
22. O fago PI é utilizado como faqo de transduçáo genera-
da ara2 e aro3 ocorre em uma frequência de 0,00014 . lizada em um experimento que combina uma cepa doa-
Coloque as mutações em ordem no gene da arabinose.
.
dora de E coli de genótipo leu phe* o/a* e uma cepa
.
20 Um atributo do comportamento de crescimento de oito receptora de genótipo leu phe ala . Em experimentos se -
bacteriófagos mutados (1 a 8) é investigado em expe- parados, os transdutantes são selecionados para /eu* (ex-
rimentos que estabelecem a coinfecçáo por pares de perimento A), phe* (experimento 8) e ala* (experimento
.
mutantes Os experimentos determinam se os mutantes .
C) Após a seleção, os genótipos transdutantes para os
complementam um ao outro (+) ou nào complementam marcadores não selecionados são identificados .
-. -
( ) Sabe se que esses oito mutados resultam de mutação a. Qual(is) composto( s) é(sáo) adicionado( s) ao meio mí-
.
pontual Os resultados dos testes de complementaçào nimo para selecionar os transdutantes nos experimen -
sáo exibidos a seguir . .
tos A Be C ?
Mutações Os resultados do experimento de seleção abaixo mostram
~~
í 2 3 4 5 6 7 8 a frequência de cada genótipo.
1 + + + + +
Experimento A Experimento B Experimento C
2 + + + -
4 +
phe ala 26% leu - ob 65% leu phe ~
71%
3 + + + +
phe' ala 50% leu* akr 48% leu* phe 21%
- -
~

4 4 4 +
5 + + ph<r ala* 19% letrola* 0% leu phe*
~
0%
6 f + phe‘ ala* 3% leu* ola* 4% leu* phe* 3%
7 + b. Determine a ordem dos genes no cromossomo doador,
8 c Diagrame os eventos de Crossing over que formam
cada um dos transdutantes no experimento A.
.
a Quantos genes são representados por essas mutações ? d. No experimento B, por que náo existem cotransdutan-
b. Identifique os mutados de cada gene. tes com o genótipo leu- ala* l
c. Em cada coinfecçáo anteriormente identificada como
incapaz de complementar (-), os pesquisadores en- 23. Uma série de sete mutações pontuais é mapeada ao
xergam evidências de recombinaçáo produzindo cres- longo do gene rlIA e depois testada quanto à sua capa-
cimento do tipo selvagem. Como os pesquisadores cidade de formar recombinantes do tipo selvagem com
distinguem entre o crescimento do tipo selvagem re- .
mutantes por deleçáo parcial da rll. Na tabela '4-' indica
sultante da complementaçào e o crescimento do tipo a formação de recombinantes do tipo selvagem e * " in- -
selvagem decorrente da recombinaçáo? dica que os tipos selvagens náo se formam. Use os dados
 Capí tulo 6 Análisee mapeamento genéticonas bactériase bacteriófagos 221

para mostrar o comprimento e os pontos finais de cada c Com base nos dados e em sua aná lise, desenhe uma
deleçáo com a maior precisão possível. tabela de complementaçáo para os cinco mutantes
pontuais 55, 67, 74, 82 e 85. (Pule o mutante 91 neste
Mutantes pontuais rMA 37 46 21 19 34 27 12
problema.)
Mapa dos mutantes: I I I I I I d. Acrescente o mutante 91 à sua tabela de complemen-
taçáo ( suponha que ele mapeia para rl / A ).
Mutantes
por deleçá o Mutantes pontuais .
25 Três genes, pip, zap e rag, estão situados perto do minuto
32 no cromossomo de uma espécie bacteriana. Para de-
12 19 21 27 34 37 46 terminar a ordem desses genes, você realiza um experi-
6622 + + + + + mento de cotransformação e calcula as frequências de
CT48
cotransformação das três combinações possí veis de dois
+ f + +
desses genes. Os resultados são exibidos a seguir.
«

MB101 + + + + +
VG14 + ¥ •f
Experimento Genes Frequência de
N220 + + + + cotransformados cotransformação
24. Cinco mutantes por deleçáo parcial da ír l são mapeados 1 zap e rag 0,84%
e depois testados quanto à sua capacidade de formar re- 2 zap e pig 0,14%
combinantes do tipo selvagem com seus mutantes pon-
tuais. A extensão e os pontos finais dos mutantes por de 3 rag e pip 0,62%
leção são exibidos abaixo da região rll do cromossomo . a. Qual é a ordem dos genes?
.
a Use os dados na Tabela A para posicionar a mutação .
b Quais são os dois genes mais Intlmamente ligados?
pontual com a maior precisão possível ao longo do
cromossomo.
.
c Um gene recém-descoberto, zig , é testado quanto à
sua ligação ao rag. Uma cepa bacteriana auxotrófica
b. Use os dados de complementaçáo na Tabela B para de- dupla com o genótipo rig- rogr é transformada por
terminar onde está situada a divisão entre rllA e rllB na uma cepa bacteriana prototrófica (zig' rag ). As fre-
região rll . quências de transformação individuais dos genes são
rll região 0,018% para o zig e 0,012% para o rag. Em uma tria-
gem de 10* células, existem duas cotransformantes
Mutações
zig* rag* . Os resultados indicam que o zig e o rag são
por deleçáo
ligados? Por qué?
M12 j 26. Cepas Hfr que diferem quanto à orientação e ao sítio de
integração do fator F são utilizadas para construir mapas
09 j
cromossômicos bacterianos consolidados. Os dados a
W42 J seguir mostram a ordem de transferência dos genes nas
cinco cepas.
L36
R22 Ordem de transferência dos genes
Cepa Hfr - último)
(primeiro
Tabela A
Hfr A oríT - thr - leu - azi - ton - pro - lac - ade
Mutantes pontuais Mutantes por deleçlo
09 L36 Ml 2 R22 W 42
Hfr B -
oriT - mti - xyl - mal str - his
HfrC oríT - lle - met - thi - thr - leu - azi - ton
55 + + + +
67 + +
Hfr D - - - -
oriT hls trp gal ode - loc - pro ton -
74 + + + Hfr E oríT - thi - met - He - mtl - xyl - mal - str
82 + + a. Identifique as sobreposições entre as cepas Hfr. Iden-
85 + + + + tifique as orientações dos fatores F uns em relação aos
91 + + + outros .
b. Desenhe um mapa consolidado do cromossomo bac -
terlano. (Dka: comece colocando o sitio de inserção
Tabela B
da Hfr A na posição de 2 horas e organizando os genes
Mutante por deleçáo Complementado por thr -ieu - azi-.„ no sentido horária)
r// A r // B
09
L36
M12 +
R22 4-
W 42
 Capítulo Estrutura e replicaçã o do DNA

7
APRESENTAÇÃO
7.1 O DNA é a molécula hereditá ria da vida
7.2 A dupla -hélice do DNA consiste em duas cadeias
complementares e antiparalelas
7.3 A replicação do DNA é semiconservativa e
bidirecional
7.4 A replicação do DNA duplica precisamente o
material genético
7.5 Os métodos analí ticos genéticos moleculares
utilizam o DNA nos processos de replicação

O método laboratorial conhecido como reação em cadeia da polí -

meras# ( PCR ) é viabilizado pela polimerase Taq , que foi isolada peia
primeira vez na bactéria Thermus aquaticus , que vive em condições
de quase ebulição no Parque Nacional de Yeilowstone ( localizado em
ES SENC AIS .
Wyowing, Montaria e Idaho, Estados Unidos) A foto do detalhe (no
.
alto à esquerda) mostra uma colónia de T aquaticus
I Setenta e cinco anos de observações e aná-
lises culminaram na identificação do DNA
como a molécula da hereditariedade.
I O DNA é uma molécula de frta dupla con-
sistindo em quatro tipos de nudeotídeos,
0 dogma central da biologia identifica o DNA como repositório
da informação genômica dos organismos e seu papel central
na produção dos transcritos de RNA dos genes e dos polipeptidios
abreviados como A,T,C e G,que se mantém produzidos pela tradução do RNAm. O papel do DNA nesses proces-
unidos por um mecanismo de pareamento
de bases complementares.
.
sos requer sua replicação fiel que é o assunto deste capítulo.
No Capítulo 1, revisamos as estruturas primá rias e secundá rias
I A replicação do DNA duplica o genoma de
maneira fiel por um processo semkonserva - do DNA e do RNA e os princípios bá sicos da replicação do DNA.
trvo que avança bidirecionalmente a partir Neste capítulo, discutimos a estrutura do DNA em profundidade
de cada origem de duplicação
e ampliamos a descrição anterior para incluir os processos mo-
I As origens da replicação são definidas por
.
sua sequência de nudeotfdeos Muitas leculares que ocorrem na replicação. Também examinamos dois
•
proteínas enzimas agem de maneira or-
questrada para produzir dois DNA duplex
métodos analíticos — a reação em cadeia da polimerase ( PCR) e
o sequenciamento do DNA pelo método didesoxi — que foram
idênticos.
desenvolvidos como um resultado da compreensão da replicação.
I Técnicas laboratoriais baseadas em uma
compreensão molecular da replicação do O Estudo de Caso no final do capítulo descreve o uso da PCR e
DNA executam a replicação direcionada de do sequenciamento didesoxi para identificar e analisar a mutação
sequências de DNA curtas e sequenciam o
DNA . associada à doenç a de Huntington (Omim 143100), um transtorno
autossômico dominante em seres humanos.

7.1 O DNA é a molécula hereditá ria
da vida
Quando os cientistas falam da “ molécula hereditá
-
ria" de uma espécie, eles referem se à substâ ncia mole
cular que carrega e transmite a informação gen ética da
espécie. Nossa compreensão contemporâ nea da trans-
missã o hereditá ria e da evolu ção das espécies está ar-
raigada no conhecimento de que o DNA é a molécula
hereditá ria de todos os organismos. Muito antes de o
papel hereditário do DNA ter sido estabelecido, porém,
pesquisas identificaram cinco características essenciais
do material hereditá rio. O material hereditário precisa:
1. estar situado no n úcleo c ser um componente dos
cromossomos;
2. estar presente em uma forma estável nas células;
3. ser suficientemente complexo para conter a infor
mação genética que dirige a estrutura, função, de
senvolvimento e reprodução dos organismos;
4. ser capaz de se replicar com precisão de modo que
-
as células filhas contenham as mesmas informa
ções que as células parentais;
5. ser mutá vel, sofrendo mutações a uma taxa baixa ,
que introduza variação genética e sirva como base
para a mudança evolutiva.
Os cromossomos contêm DNA
A substâ ncia ligeiramente ácida conhecida hoje
como DNA foi observada pela primeira vez em 1869,
quando Friedrich Miescher a isolou dos n úcleos dos
leucócitos em uma mistura de ácidos nucleicos e proteí-
nas que ele batizou de "nucleina". No entanto, Miescher
fez pouco progresso na determinaçã o da composição da
nucleina e a substâ ncia foi pouco estudada durante vá -
rias d écadas seguintes.
- Eles observaram que a prote í na é composta de 20 ami
Nos anos 1870, estudos microscó picos identifica
ram a fusão dos n úcleos masculinos e femininos du
rante a reprodução. Logo em seguida, os cromossomos
foram observados pela primeira vez nos n úcleos das
células. Os avanços na microscopia levaram à obser-
vaçã o dc que os n úcleos de diferentes espécies contêm
quantidades diferentes de cromossomos e també m le-
varam a descrições precisas das contribuições iguais
dos cromossomos masculinos e femininos para a re
produção. A primeira sugestão de que o DNA era o
material hereditário veio de um estudo realizado por
Edmund Wrilson em 1895. Após documentar com pre -
cisão que os espermatócit05 e ovócitos contribuem
com o mesmo n ú mero de cromossomos durante a
reproduçã o, Wilson especulou que “A equivalência
precisa dos cromossomos fornecidos pelos sexos é fi
sicamente correlata ao fato de que os dois sexos de
sempenham, no todo, papéis iguais na transmissão
hereditá ria e isso parece mostrar que a substâ ncia cro -
mossômica, a cromatina, deve ser considerada como a
base física da herança. Hoje, sabe-se que a cromatina
Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 223
é bastante similar, se nâo idê ntica , a uma substâ ncia
conhecida como nucleina (C29 Ht9 N,, P2 , segundo
022
Miescher ), cuja análise mostra ser quimicamente com --
- posta de ácidos nucleicos ( um ácido orgâ nico com
-
- plexo rico em fósforo ) e albumina. E, portanto, chega
mos à conclusão notá vel de que a herança talvez possa
ser afetada pela transmissão f ísica de um determinado
composto químico dos pais para a prole" .
Em 1900, os princí pios da hereditariedade de Men -
.
del foram redescobertos (ver Capítulo 1) Logo depois,
em 1903, Walter Sutton, aluno de Wilson, e, de maneira
independente, Theodor Boveri, descreveram precisa
mente o paralelo entre, por um lado, a separação dos
-
cromossomos hom ólogos e das cromátides irmãs e, por
outro, a heran ça dos genes.
Durante os 20 anos seguintes, o n úcleo e os cromos -
somos foram o foco das investigações biológicas da he -
-- reditariedade. Em 1920, o principal constituinte da nu -
cleína foi identificado como DNA e sua qu í mica básica
foi decifrada. Determinou -se que a molécula era um po -
-
- —
linucleotídeo consistindo em quatro subunidades repe
tidas os quatro nucleotídeos do DNA — unidos por
ligações covalentes. Os quatro nucleotídeos do DNA são
adenina ( A), timina (T ), citosina ( C ) e guanina (G).
Em 1923, o DNA foi localizado nos cromosso -
mos. Essa descoberta fez do DNA um candidato a ma
terial hereditá rio, mas ele não é o ú nico constituinte
-
dos cromossomos. As proteínas estão presentes em
altas concentrações; o RNA está presente no n úcleo
e em volta dos cromossomos; e outros compostos, in -
cluindo lipídios e carboidratos, també m foram consi
derados como potenciais candidatos a material here
--
ditá rio em um momento ou outro. Na verdade, alguns
dos primeiros pesquisadores, incluindo Edmund Wil
son, achavam que a prote í na fosse possivelmente uma
-
candidata a material hereditário melhor que o DNA.
-
- noá cidos diferentes, enquanto o DNA tem apenas qua
tro tipos de nucleot ídeos. Os proponentes da proteí na
-
sugeriram que o “alfabeto de 20 letras” das proteí nas
podia conter mais informações que o “ alfabeto de
quatro letras" do DNA. Foi contra esse pano de fundo
que os resultados dos trés experimentos realizados
- —
entre 1928 e 1952 se combinaram para identificar o
—
DNA não o RNA, as proteínas ou outro constituinte
químico das células como material hereditá rio dos
organismos.
Fator de transformação
Frederick Griffith, um m édico britâ nico interessado
em epidemiologia, estudou a infecçâo de pneumonia em
- camundongos e publicou um extenso relatório dc pes-
- quisa em 1928 descrevendo suas descobertas. A biologia
moderna se concentra em apenas algumas páginas do
longo relat ório de Griffith que fornecem evidências indi -
retas de que o DNA é a molécula responsá vel por trans -
ferir as caracter ísticas hereditá rias em bact érias.
224 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Griffith estudou cepas da bactéria Pneumococcus ,

que causa pneumonia fatal nos camundongos, e consta -
tou que as cepas tém um aspecto liso (S) no microscópio
em decorrê ncia da presença de uma cá psula protetora
( Figura 7.1 ). Por outro lado, as cepas de Pneumococcus
que náo causam doença são identificáveis por seu as-
pecto áspero ( R ) , As cepas bacterianas ásperas té m um
alelo mutado do gene polissacarídeo que resulta em
uma cápsula enfraquecida e de fácil rompimento. Essa
mutaçã o de um ú nico gene deixa as bactérias R vulne-
rá veis ao ataque pelos anticorpos do sistema imune dos
camundongos.
As formas S e R da Pneumococcus ocorrem em qua -
tro tipos antigênicos da bacté ria , identificados como I , Figura 7.1 Aspecto liso veruis á spero das colónias de
U, III e IV. Cada tipo antigénico desperta uma resposta Pneumococcus .
imune diferente do sistema imune do camundongo em
consequência da presença de várias diferenças genéti- duz doença e morte 0. Ele cultivou sangue extraído de
cas. Uma ú nica mutaçào do gene polissacar ídeo pode camundongos mortos e identificou a presen ça de bac-

RII —
converter uma cepa S em uma R do mesmo tipo anti
gènico por exemplo, converter uma cepa SII em uma
mas o tipo antigénico não pode ser modificado
por uma única mutação. Em outras palavras, a mutaçào
isoladamente náo consegue transformar uma bact éria
RII em SUL
As observa ções mais importantes de Griffith de-
rivam de quatro testes de infecção que ele realizou
usando cepas bacterianas S e R de tipos antigênicos di -
ferentes ( Figura 7.2 ). Griffith mostrou que injetar a cepa
SIII nos camundongos, por exemplo, rapidamente pro-
térias SIII. Griffith també m determinou que a injeção
de bactérias SIII “ mortas pelo calor", que são mortas
utilizando calor e pressão elevados, não induz doen ça
.
0 nem o uso de qualquer cepa R 0 O resultado mais
importante de Griffith O ocorreu quando ele injetou a
mistura de uma cepa Slll morta pelo calor e uma cepa
RII viva. Ele constatou que a maioria dos camundongos
morreu de pneumonia e, quando testou culturas de san -
gue de camundongos mortos, detectou bactérias SIII
vivas. Sabendo que seu resultado não poderia ser a con -
sequ ência de um evento mutacional simples, Griffith

o o o o
Tipo Slll viva Tipo RII viva Tipo Slll morta pelo
Tipo Slll morta pelo calor
calor e tipo RII viva

*4» 4>

Injeção, Injeção. Injeção .

camundongo camundongo vive camundongo vive camundongo morre
morre

Bactérias vivas do Nenhuma bacté ria Nenhuma bactéria Bactérias vivas do

tipo Slll recuperadas recuperada recuperada tipo Slll recuperadas

Conclusão a molécula da
,

hereditariedade transformou as
bactérias RJI em bactó^as Sft

Figura 7.2 Experimento de Frederkk Griffith identificando um "fator de transforma ção" responsá vel pela
hereditariedade. O A injeção de bacté rias Slll vivas mata os camundongos. 0 As Slll mortas pelo calor não matam os
camundongos nem as bactérias RU vivas 0, 0 A injeção concomitante de uma mistura de bactérias Slll mortas pelo calor e RII
vivas resulta na morte dos camundongos por infecçáo de Slll.
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 225

propôs que um componente molecular chamado fator
de transformação era responsável por transformar RI1
em SIII .
Griffith concluiu que o fator de transformaçã o era
uma molécula que carregava a informa ção hereditá ria ,
mas não foi capaz de sugerir a classe da molécula. Hoje
os biólogos sabem que o processo identificado por Grif -
fith ocorre naturalmente e se chama transformação,
sendo utilizada pelas bactérias para transferir o DNA
( ver Seção 6.4).
O DNA é o fator de transformação
Logo após GrifFith publicar seu relató rio sobre o
fator de transforma ção, Martin Dawson, que trabalhava
com Oswald Avery, desenvolveu um procedimento de
transformação xn vitro para misturar células R vivas
com um extrato purificado de material celular deri -
vado de células SIII mortas pelo calor contendo o fator
de transformaçã o. Ensaios bioqu í micos indicaram que
o extrato de SIII consistia basicamente em DNA, com
uma pequena quantidade de RNA e traços de proteínas»
lipídeos e polissacar ídeos.
A evidência mais direta de que o DNA era o fator
de transformação veio de um experimento realizado por
Avery e seus colegas MacLeod e McCarty ( Figura 7.3).
Esse experimento identificou o papel do DNA na trans-
formaçã o ao eliminar lipídeos, polissacar ídeos, proteí-
nas, RNA e DNA, um de cada vez, do extrato de SIII.

Extrato de bactérias SIII mortas pelo calor

o o o o
I I Protease
I 1
Controle, Lipídeos e
nenhum componente polissacar ídeos
adicionada,
proteí nas
RNase adicionada
RNA destru ído
. DNase adicionada,
DNA destru ído
destru ído destru ídos
destruídas

Tipo RI «Jadonado Tipo Ml doonado Tipo Wl adkionado Tipo Ali adkiorwdo

I
Tipo Wl adicionado
*
I i ; i 1
3 w
Sem lipí deos,
•Iterações tolissacarídeofj l Sem proteínas Sem RNA Sem DNA

Injeção
camundongo
. Injeção,
camundongo
Injeção,
camundongo
Injeção
camundongo
. Injeção,
camundongo
morre morre morre morre vive

••
I

•*
Bacté rias tipo Sll Nenhuma bacté ria
vivas recuperadas recuperada

Conclusão: a transformação não è Conclusão; o DNA é a

perturbada peia remoção de molécula hereciTá ria
Ipfóeos, pollssacatáeos, proteínas necessária para a
ou RNA; portanto, nenhum dees é transformação
o lator de transformação.
Figura 7.3 Avery, MacLeod e McCarty usaram a transformação in vitro para Identificar o DNA como a molécula
hereditária mais prová vel. 0 extrato purificado de bactérias SIII mortas pelo calor consegue transformar células Rll no
experimento de controle O. A destrui ção dos lipídeos e polissacarídeos 0, proteí nas O ou RNA O não afeta a transforma ção;
entretanto, a destrui ção do DNA O impede a transformação.
226 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Em cada ensaio experimental, o extrato de S1I1 foi tra

tado para remover um componente de cada vez e esse
- do fago se replica e suas prote ínas são produzidas ( Fl
.
gura 7.4) Essas proteínas são reunidas na progénie de
extrato tratado foi misturado com células Rll. Permitiu
se a ocorrência da reação de transformação in vitro e
- fagos e são preenchidas, cada uma, com uma có pia do
cromossomo do fago. Os fagos da progénie sã o libera -
as células resultantes foram injetadas em camundongos. dos pela lisc da célula bactcriana hospedeira.
Então, o sangue desses camundongos foi cultivado para Em seu experimento, Hershey e Chase tiraram pro-
determinar se as células SUI estavam presentes
indicação de que a transformação havia ocorrido.
— uma veito de uma diferença essencial entre a composição
química do DNA e da prote í na para confirmar o papel
A Figura 7.3 mostra que a transforma ção in vitro hereditá rio do DNA ( Figura 7 .S). As proteínas contê m
ocorre e que os camundongos são mortos pela infecçào grandes quantidades de enxofre, mas quase nenhum
da SIII no experimento de controle O, e quando os lipí
deos e polissacar ídeos 0, proteínas O ou RNA O são re-
- fósforo; de modo oposto, o DNA conté m uma grande
quantidade de fósforo, mas nenhum enxofre. Para pre-
movidos do extrato. Ao contr á rio dos outros resultadas,
o experimento O, que utiliza a DNasc para degradar cs-
pecifícamente o DNA, nâ o resulta em transforma ção. O Os fagos T2 infectam as
sangue extra ído dos camundongos com extrato tratado bactérias injetando DNA
através de caudas ocas
com DNase injetado revela a ausência de bactérias SIII
vivas — uma indicaçã o clara de que a transformação é
bloqueada pela destruição do DNA. Com base nessas
observações, Avery, MacLeod e McCarty concluí ram
corretamente que o DNA é o fator de transforma ção e o DNA do fago
provável material hereditário. I

DNA bacteriano
O DNA é a molécula hereditária
0 DNA do fago se torna drcjlar
O trabalho de Avery, MacLeod e McCarty con
venceu muitos biólogos de que o DNA era o material
- e ocorre repkaçào do
cromossomo do fago
hereditá rio que há muito tempo se buscava, e uma
grande parte das pesquisas no final dos anos 1940 e
início dos anos 1950 foi dedicada a deduzir a estru
tura física do DNA. Os biólogos perceberam que, de-
- DNA do fago
pois que a estrutura do DNA fosse conhecida , a natu
reza qu ímica dos genes seria identificada c a pesquisa
-
biológica iria para os dom í nios da biologia molecular Sob a dàeção dos genes do fago, a
gen ética. Porém , por mais claro e convincente que o transcrição e a tradu ção produzem
trabalho de Avery e seus colegas parecesse em retros- novas proteínas de fago.
pectiva, havia vá rias perguntas nã o respondidas a res-
peito do papel do DNA na hereditariedade. També m
havia a necessidade de demonstrar diretamente que a
presen ça de uma molécula de DNA espec ífica induz
o surgimento de um determinado gen ótipo. Essa evi-
d ê ncia surgiu em um relatório de 1952, produzido por
Alfred Hershey e Martha Chase, que mostrou que o
DNA , mas n ão a proteí na, é responsável pela infecçà o
de bacteriófago das células bacterianas.
Os bacteriófagos, também conhecidos como fagos,
^ i
( A*
O DNA e as proteí nas são
reunidos nos fagos da progénie.

são vírus que infectam as bactérias. Fagos como o T2,

por exemplo, consistem em um envoltório proteico
com um segmento de cauda que se acopla à célula bac -
teriana hospedeira e um segmento de cabeça que con - i Os fagos da progénie são . betados
té m DNA. Os fagos T2 estão entre os muitos bacterió - pela Kse das bacté rias hospedeiras.
.
fagos que não carregam qualquer RNA Como os outros
vírus, o T2 precisa infectar as células hospedeiras, que
são as bacterianas nesse caso, a fim de se reproduzirem.
A infecçào por um fago começa com a injeção de seu
DNA em uma célula bactcriana; o envoltó rio do fago es- 7J
vaziado permanece acoplado ao exterior da célula bac
teriana. Dentro da célula bactcriana infectada , o DNA
- F í gu ra 7.4 Infecçào de bactérias pelo bacteriófago T2.
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçâo do DNA 227

0 cultivando
Marcação do DNA do fago O fago
Marcaçã o da proteí na do
-o em um meio cultivando-o em um
contendo WP. melo contendo “Sw

Meio
ák
— i Meio
contendo "P contendo S”

^ I © Infec çào das novas bactérias

n ão marcadas
marcado com “P.
com
fago
0 Infec çào das novas bacté rias
não marcadas
marcado com S
com
“.
fago

AÂ Â
^ 0 em
Após a infecção, a agita ção
um misturador separa as
part ículas de fago vazias
(fantasmas) das bacté rias.
O Apóum
s a Infecção, a agitação
em misturadorsepara
partículas de fago vazias
(fantasmas) das bacté rias.
as

r /V) 7
\
N
\
O Centrifugação da mistura
agitada de bactérias e
.
fantasmas As bactérias
P
^ t O Centrifugação da mistura
agitada de bactérias e
fantasmas. As bactérias
\
formam uma pelota no
fundo do tubo; as
part ículas fantasmas
KJ fr formam uma pelota no
fundo do tubo; as
partículas fantasmas
permanecem suspensas Quase todo o marcador permanecem suspensas
Quase todo o marcador yP no líquido. "S está no sotxenadante no líquido.
está na pelota e contido e permanece com as
nas bactérias infectadas partculas fantasmas.

Conclusão: o ONA é a molécula heredit á ria

transmitida pelo fago infectante para a célula
hospedeira e herdado pelos faças da progé nie.

Figura 7.5 Experimento de Hershey-Chase mostrando que o DNA é a molécula nos bacteriófagos que causa a lise das
células bacterianas infectadas.

parar os fagos para o experimento, Hershey e Chase
inicialmente mantiveram culturas de fagos em meios de
cultura diferentes. Um meio de cultura continha ótS, a
forma radioativa do enxofre, para marcar as proteínas
O; o outro ambiente continha fósforo radioativo, KP,
para marcar o DNA O. Os pesquisadores usaram fagos
marcados radioativamente de cada meio para infectar
células bacterianas hospedeiras não marcadas em expe
rimentos paralelos O O.
Após um curto per íodo, cada mistura foi agitada
em um misturador para separar as células bacterianas
dos envoltórios de fago agora vazios. Esses envoltórios
-
de fago vazios chamam se "fantasmas" O O As célu
las bacterianas relativamente grandes foram separadas
. -
facilmente dos fantasmas por centrifugação. As bacté
rias mais pesadas foram recolhidas em uma pelota no
fundo do tubo da centr ífuga, enquanto os fantasmas
mais leves permaneceram suspensos sob a superf ície da
água. O teste de radioatividade de cada fração revelou
que praticamente todo o marcador se associou às
células bacterianas recém -infectadas e quase nenhum
deles se associou com partículas fantasmas O. Por outro
lado, o marcador *S foi encontrado na fração de part í
culas fantasmas e apenas traços foram encontrados em
-
- associação com a pelota bacteriana O. Esse resultado
demonstra que o DNA do fago, mas n ão sua proteína, é
transferido para as células bacterianas hospedeiras e di-
rige a síntese do DNA do fago e das proteínas, a reunião
das part ículas dos fagos da progénie c, por fim, a lise
das células infectadas. O experimento demonstrou que
o fator de transformação identificado previamente por
- Griffíth era o DNA; ele també m mostrou que Avery,
MacLeod e McCarty estavam certos em concluir que o
DNA é o material hereditá rio .
228 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Nucleotldeos purfnkos
Observa çã o gen é tica Griffith identificou o fator de Fosfato Base nitrogenada
transformação como uma molécula portadora de informa
çôes hereditá rias. Avery. MacLeod e McCarty mostraram que
apenas a degrada çã o enzimática do DNA perturba a transfor -
mação in vltro. Hershey e Chase demonstraram que a transfe-
f sica do DNA do íago para a bactéria hospedeira inicia
rê ncia í
o eido litico.

7.2 A dupla- hélice do DNA consiste Descxirribose

em duas cadeias complementares Desoxiadenosina Desoxiguanosirva
e antiparalelas -
5' monofosfato
ídAMP)
-
5' monofosfdto
(dG m
O modelo da estrutura secundá ria do DNA criado
Nucleotídeos pirtmJdfnitos
por Wat &on e Crick indica que, em alguns aspectos, a
molécula é simples (ver Seção 1.2), sendo composta Fosfato Base rvtrogenada
de quatro tipos de nucleot ídeos unidos por ligações
fosfodiéster covalentes que formam cadeias de polinu - 0
cleot ídeos. Duas cadeias de polinucleot ídeos se juntam
ao longo dc seus comprimentos para formar uma du - H

-
pla hélice, també m chamada DNA duplex, pelo parea
mento complementar e pela ligação de hidrogé nio entre
as bases de nucleot ídeos de cada fita. Contudo, mesmo
——
em sua simplicidade sendo composto de apenas qua
tro tipos de nucleot ídeos o DNA é uma molécula in
formacíonal complexa, que serve como um repositó rio
permanente de informação genética nas células e que
dirige a produção das moléculas de RN A que executam
ações nas células ou transportam informações para a
montagem das proteínas. Essas funções essenciais do
DNA derivam de sua estrutura molecular.
Nucleotídeos do DNA
Um nucleotídeo tem três partes: (1) um açúcar, (2)
uma de quatro bases nitrogenadas e (3) até três gru -
pos fosfato ( Figura 7.6 ), A desoxirribose, o açúcar dos
nucleotídeos do DNA, contém cinco carbonos, identi-
ficados como 1’, 2*, 3*, 4’ e 5*. Um á tomo de oxigénio
conecta o carbono 1’ com o 4' para formar um anel de
cinco lados ( pentose) e o carbono 5' se projeta para fora
do carbono 4’ (e do anel). Uma base de nucleotídeo
está presa ao carbono T; um grupo hidroxila (OH ) está
preso ao carbono 3'; e uma ú nica molécula de fosfato,
ou uma cadeia de fosfatos com até três moléculas de
.
comprimento, está presa ao carbono 5’ A desoxirribose
carrega uma molécula de hidrogénio no carbono 2' em
vez de um grupo hidroxila (OH ). Essa é a base para cha
mar o açúcar de desoxirribose.
As bases nitrogenadas no DNA são de dois tipos es
—
truturais uma forma em anel simples, chamada pirimi -
dina, e uma forma em anel duplo, chamada purina. A ci-
tosina (C) e a timina ( T) sà o pirim ídinas, e a adenina ( A) e
a guanina (G ) sào purinas. Os nucleotídeos do DNA que
fazem parte de uma cadeia polinudeotídica possuem um
grupo fosfato que forma a ligação fosfodiéster covalente
com o nucleotídeo adjacente na fita. A desoxiadenosina
-
-
-
OH H
Desoarribose
Desoxitimidina Desoxkitidina
-
5' monofosfato
(dTMP)
5'-morvofosfato
( dCMP)
F igura 7.6 Componentes e estruturas dos monofosfatos
de nucleot ídeos do DNA.
5' monofosfato ( dAMP) e a desoxiguanosina 5’- mono
fosfato (dGMP) carregam as bases purínicas adenina e
guanina, e a desoxicitidina 5’- monofosfato ( dCMP ) e
a desoxitimidina 5'- monofosfato (dTMP ) carregam as
bases pirimid ínicas citosina e timina. Coletiva mente,
elas sào identificadas como desoxinudeotídeus mono-
fosfato ( dNMPs ), em que .\r pode ser qualquer uma das
quatro bases de nucleotídeos. Por outro lado, os n úcleo-
tideos de DNA livres ( reativos ), que não fazem parte de
uma cadeia polinudeotídica, carregam uma sequência
de trés grupos fosfato no carbono 5’ e são identificados
como dATP, dGTP, dCTP e dTTP. Coletivamente, eles
sào chamados desoxinudeotídeos trifosfato ( dNTPs).
Cada nucleot ídeo é inserido em uma cadeia pol í nu -
deotídica pela enzima DNA polimerase, que catalisa a
- formação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo hi
droxila 3' de um nucleotídeo e o grupo fosfato 5' de um
-
- nucleotídeo adjacente í Figura 7.7 ), Dois dos três fosfatos
de um dNTP sào removidos (como um grupo pirofos-
fato) durante a formação da liga ção fosfodiéster , dei-
xando os nucleot ídeos de uma cadeia polinudeot ídica
em sua forma de monofosfato. Cada cadeia polinucleo-
tidica tem uma espinha dorsal de açúcar-fosfato con
sistindo em grupos alternados de açúcar e fosfato por
-
todo seu comprimento.
 Capí tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 229

( a) Nova fita Fita-moíde

9 HjC

Oi O-

> liga
/
ções
fosfodiéster
v KjC
O

Tnfosfato O
* \

OdATP é recrutado
peia DNA poèmerase

Em uma reação catalisada pela CNA poSmerase e

usando a timina nas fitas-molde como gula, o dAl P
ataca o 3'OH da cltosirw na nova fita.

( b) Nova fita Fita-molde

i
r
5'

o\-
P
// \
O
Hlc
H
0

Nova ligação
fosfodiéster

Grupo pirofosfato extremidade 3’da nova frta.

(descartado).

Figura 7.7 Prolongamento da fita do DNA. (a) Nucleotideos complementares à fita-molde são adicionados à extremidade 3'
da nova fita pela DNA polimerase. (b) Os trifosfatos de nucleotídeo do DNA sâo recrutados pela DNA polimerase, que utiliza ação
catalítica para remover dois fosfatos (o grupo fosfato) e formar uma nova ligação fosfodiéster.
230 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Três pontes de hidrogénio
se formam entre GeC
Grupo
fosfato 5'
*Uy-
Citosiru
|
Grupo
....
hidroxila 3'
liga ção "
fosfod éster
,çucares
A
desoxirribose
Pontes de
hidrogénio
Duas pontes de hidrogénio
seformamentreTeA
Figura 7.8 Forma ção de pontes de hidrogénio entre
nudeotldeos complementares.
Pareamento de nucleotí deos
complementares no DNA
O DNA é mais está vel como uma dupla - hélice e
as duas fitas polinudeotídicas que compõem o duplex
têm uma relação específica que segue duas regras: (1) a
organização dos nudeotídeos é tal que as bases de nu
cleotídeos de uma fita são complementares às bases de
nudeotídeos correspondentes na segunda fita (A forma
par com T, e G forma par com C ) e ( 2) as duas Fitas
tém orientação antiparalela ( urna fita é, por exemplo,
- -
5' ATCG 3' e a fita complementar é 3' TAGC - 50. - planos são paralelos e transmitem uma torção à dupla
A formação de pares de bases complementares une
um nucleotideo pur í nico em uma fita com um nucleotí
deo pirimidínico na outra. A base química desse parea -
mento é a formação de um n ú mero está vel de pontes
de hidrogénio ( H) entre as bases de fitas diferentes. As
pontes de hidrogénio são não covalentes e se formam
entre cargas parciais que estã o associadas aos á tomos de
hidrogénio, oxigé nio e nitrogé nio das bases de nucleo
.
tídeos ( Figura 7.8) Duas pontes de hidrogénio estáveis
-
se formam para cada par de bases A T e três pontes de
hidrogénio são formadas para cada par de bases G C.
A orienta ção antiparalela das Fitas é essencial para a
formação de pontes de hidrogénio está veis. Nas Figuras
7.7 e 7.8, repare que os nucleotídeos em uma fita estão
orientados com seu carbono 5 ' para cima e seu car
bono 3' para baixo. Os nucleotídeos complementares na
outra fita são antiparalelos; ou seja, suas orientações 5'
para 3' seguem no sentido oposto. A orientação antipa -
ralela das fitas complementares leva as cargas parciais
dos nucleotídeos complementares ao alinhamento para
formar pontes de hidrogénio. .Se as fitas complementa -
res se alinhassem em paralelo (isto é, com seus carbo-
nos 5’ e 3’ voltados para a mesma direção), as cargas dos
nucleotídeos complementares se repeliriam e as pontes
de hidrogé nio não se formariam.
Observa çã o gen é tica O DNA é composto de quatro
nudeotldeos contendo bases de dois tipos estruturais: purlnas
(adenina -
e guanina ) e pirimidlnas (citosina e timina ). As liga
ções fosfodi éster entre o OH 3' e o fosfato 5’ dos nudeotldeos
adjacentes formam fitas polinudeot ídicas simples. O parea-
mento de bases complementares (A com T, C com G ) nas fitas
antiparaleias forma moléculas de ácido nudeico de fita dupla.
Dupla-hélice torcida
A dupla - h élice do DNA tem um eixo de simetria
helicoidal, uma linha imagin á ria que passa longitudi -
nalmcntc pelo interior da dupla - hélice c marca o centro
da molécula. As dimensões moleculares do DNA são
medidas usando a unidade chamada angstrom (À). Um
angstrom é igual a 1010 metros ou 1 décimo bilionésimo
de metro. No DNA, a distâ ncia do eixo de simetria até
a borda externa da espinha dorsal de açúcar-fosfato é
10 À e o diâmetro molecular é 20 À em qualquer ponto
ao longo do comprimento da hélice ( Figura 7.9a ). O diâ -
metro molecular de 20 À resulta do pareamento com -
plementar de cada purina com a pirimidina correta (A
com T, G com C ) e confere a mesma dimensão a cada
par de bases.
- Os pares de bases de nucleotídeos sã o espaçados
em intervalos de 3,4 A ao longo dos duplex de DNA.
Esse acondicionamento apertado das bases do DNA na
dupla fita leva ao empilhamento de bases, a compen -
sação dos pares de base adjacentes de modo que seus
-
hélice. A Figura 7.9b é um modelo de preenchimento
- de espaço que ilustra o empilhamento de pares de base
e a torção das espinhais dorsais de açúcar- fosfato. A
Figura 7.9c é um modelo de bolas e varetas ilustrando
como os pares de base torcem em torno do eixo de si -
metria para criar a espiral helicoidal.
O empilhamento de pares de base cria dois sulcos
- -
na dupla hélice, lacunas entre as espinhas dorsais de
açúcar-fosfato espiraladas, que expõem parcialmente
os nucleotídeos. Os sulcos alternados são conhecidos
- como sulco maior e sulco menor . O sulco maior tem
aproximadamente 12 À de largura, e o sulco menor tem
aproximadamente 6 À de largura. Os sulcos maior e
menor são regiões onde as proteí nas de ligaçã o ao DNA
- conseguem fazer contato direto com os nucleotídeos
expostos. Neste capítulo e em capítulos posteriores,
discutimos as funções realizadas pelas proteínas de liga -
ção ao DNA, como a regulação da expressão gènica e o
controle do in ício e progressão da replica çào do DNA.
A maioria dessas funções depende da presença de se-
qu ências característ ícas de nucleot ídeos do DNA. As
proteí nas de ligação ao DNA ganham acesso aos nucle-
otídeos do DNA nos sulcos maior e menor da molécula.
A Aná lisa Genética 7.1 explora as relações entre as fitas
de DNA complementares.
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçâo do DNA 231

(a ) Diagrama de fita (b) Diagrama de preenchimento de espaços (c) Diagrama de bolas e varetas
Par de bases Par de bases
complementares Extremidade 31
da fita 1 complementares Extremidade 5’
Extremidade 3* ^
rde bases Fxtremidade
da fitai complementares 5' da fita 2
Extremidade da fita 2
Extremidades*
3 dafTtal \
^ dafrta 2 1
TA > GruP° s
fosfato
Grupos
fosfato
Eixode
simetria Anéis
helicoidal
Anéis
de açúcar

Sulco - Sulco Sulco

menor menor menor
3.4 A
T #
T

Sulco
maior
- <
ias

t #
T
Suko
maior — ç A r w
Sulco
maior

64 ' 9

5* 3' 5*
| I I
T T i
20 A 20 A 20 A

.
Figura 7.9 Dupla-hélice do DNA. (a) Diagrama de fita (b) diagrama de preenchimento de espaços e ( c) diagrama de bolas e
varetas mostrando as espinhas dorsais de açúcar-fosfato, os pares de base, os sulcos maior e menor e as dimensões da fita dupla
do DNA.

7.3 A replicaçâo do DNA é 1. cada fita da molécula de DNA parental permanece

semiconservativa e bidirecional
Dado o papel do DNA como reposit ório de in -
formações e transmissor dessas informações, a inte-
gridade da sequ ência de nucleot ídeos do DNA é de
importâ ncia fundamental. Cada vez que o DNA é co-
piado, a nova versão precisa ser uma duplicata precisa
da versão original. A alta fidelidade da replicaçâo do
DNA é essencial para a reprodução e o desenvolvi
mento normal de estruturas e fun ções biológicas. Sem
a replicaçâo fiel do DNA, a informa ção da vida seria
truncada pelo rá pido acú mulo de mutações, que ame-
açaria a sobrevivência.
Considerando a importâ ncia do DNA por todo o
mundo biológico, não é de surpreender a descoberta
de que o mecanismo geral da replicaçâo do DNA é o
mesmo em todos os organismos. Esse processo univer -
sal evoluiu nas primeiras formas de vida e tem sido re -
tido por bilhões de anos. Porém, à medida que os orga -
nismos divergiram e se tornaram mais complexos, uma
série de diferenças se desenvolveu entre as proteínas e
as enzimas de replicaçâo do DNA. Apesar da diversifi
cação desses componentes específicos da replicaçâo do
DNA, três atributos dessa replicaçâo são compartilha
dos por todos os organismos:
íntacta durante a replicaçâo;
2. cada fita parental serve como um molde para diri -
gir a sí ntese de uma fita - filha complementar e anti-
paralela;
3. a realização da replicaçâo do DNA resulta na forma •
ção de duas fitas duplas-filhas idênticas, cada uma
delas composta de uma fita parental e uma fita -filha.
- Tr és modelos de replicaçâo concorrentes
Em seu famoso ensaio de 1953 descrevendo a estru -
tura do DNA, Watson e Crick concluí ram com a obser-
vação: “ Nã o deixamos de perceber que o pareamento de
bases específico que propusemos sugere imediatamente
um possível mecanismo de cópia do material genético”.
Especificamente, Watson e Crick reconheceram que
uma consequ ência do pareamento de bases comple-
mentares era que os nucleotídeos de uma das duas fitas
poderiam ser utilizados para identificar os nucleotídeos
da outra fita. Watson e Crick presumiram que a replica
çào do DNA usava a sequência de nucleotídeos de cada
-
- fita para formar uma nova fita dupla e previram que
cada fita do DNA podia agir como um molde. Watson e
- Crick não conheciam o mecanismo preciso pelo qual a
replicaçâo baseada em modelo ocorria , mas o reconhe-
232 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
-
Uma parte de uma das fitas duplas do DNA tem a sequência 5' ACGACGCTA 3'
.
a Identifique a sequência e a polaridade da outra fita do DNA.
- .
b. Identifique o segundo nudeotWeo adicionado se a sequência fornecida for utilizada como um
molde para a replicaçáo do DNA.

Estrat égias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado .
1 A quest á o diz respeito à sequência de DNA e exige uma resposta fornecendo a sequêrv-
por este problema e explique a cia e a polaridade da fita complementar.
natureza da resposta solicitada.
2. Identifique as informa ções cri- 2. A sequência e a polaridade são fornecidas para uma parte de uma fita de DNA.
ticas fornecidas no problema.

Deduzir
.
3 Analise a relação entre as fitas .
3 O DNA é uma dupla - hélice composta de fitas simples que contém pares de bases comple-
de um DNA de fita dupla. mentares ( A forma par com T, e G forma par com C). As fitas complementares são antipara-
-
lelas (isto é, uma fita é orientada de 5' para 3' e seu complemento é orientado de 3' para 50

Solucionar
4. Identifique a sequê ncia da fita 4. A sequência complementar é TGCTGCGAT.
complementar .
5. Forneça a polaridade da fita
complementar.
. -
5 A polaridade da fita complementar é 3' TGCTGCGAT 5' - .

.
6 Identifique o segundo n úcleo- .
6 O segundo nucleotideo adicionado à fita recém -sintetizada é a adenina, que é comple-
tídeo adicionado durante a f ta - molde
mentar à timina na í .
replicaçáo do DNA da sequên
cia fornecida .
- Dica : A DMA puiimerdM* cMailu a ddL
-
çio de um ncr»o nudeotideo na extremi
dade 3'de uma fta em descimenta

Rara praticar mais, ver Problemas 5, 9, 17 e 19 .

cimento da probabilidade de que ele ocorra levantou
uma questã o crucial de qual seria o mecanismo exato
da replicaçáo.
Quase imediatamente após a estrutura do DNA ter
sido identificada, surgiram trés modelos concorrentes
de replicaçáo do DNA ( Figura 7.10). Os modelos com
partilhavam a ideia de que as duas fitas originais (as
- F,m 1958, Matthew Meselson e Franklin Stahl ti-
fitas parentais) da fita dupla agem como moldes para
dirigir a montagem do DNA recém -sintetizado por
meio do pareamento de bases complementares. Os mo-
delos também previram que a realização da replicaçáo
do DNA produzia duas fitas duplas de DNA idênticas
(fitas duplas filhas). No entanto, os modelos diferiam
quanto à composição das fitas duplas filhas. O modelo
—
de replica çá o semiconservativa do DNA
provou correto —
que se
propunha que cada fita dupla filha
continha uma fita parental original do DNA e uma fita
filha complementar recém -sintetizada. O modelo de ©
replicaçáo conscrvativa do DNA prevê que uma fita
dupla filha conté m as duas fitas da molécula parental
e a outra contém duas fitas filhas recém -sintetizadas.
Finalmente, o modelo de © replicaçáo dispersiva do
DNA prevê que cada fita dupla filha é uma combinação
de segmentos parentais de fitas duplas entremeados e
segmentos de fitas duplas filhas.
Experimento de Meselson -Stahl
raram proveito do método recém -desenvolvido de ul -
tracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto
de césio (CsCl) para decifrar o mecanismo de replica
çào do DNA em um experimento de bela simplicidade.
-
Nesse método anal ítico, um tubo preenchido com uma
mistura de CsCl é submetido a altas velocidades em ul-
tracentrifuga, o que exerce milhares de gravidades de
—
força de separação, criando uma variação gradual na
densidade um gradiente de densidade — por toda a
mistura de CsCl. Quando as substâ ncias são colocadas
no gradiente de CsCl e acontece a ultracentrifugaçào, as
substâ ncias migram em uma taxa determinada por sua
densidade molecular. Essa técnica é capaz de separar
apenas as moléculas que têm pesos moleculares ligeira -
mente diferentes.

Q Replicaçào semiconservativa 0 Replicaçào conservatlva
Rta dupla parental Rta dupla parental
l i
Primeiro ciclo Primeiro eido
/ \
Segundo eido Segundo ddo
Figura 7.10 Trés mecanismos propostos de replicaçà o do DNA testados por Meselson e Stahl. Os resultados previstos
para dois ciclos de replica çào do DNA sâo exibidos para cada modelo.
O experimento de Meselson e Stahl tirou proveito
da intensa sensibilidade da ultracentrifuga çâo de CsCI
para comparar as moléculas de DNA parentais e filhas.
Eles começaram cultivando a Escherichia coli em um
meio de cultura contendo isótopo pesado de nitrogê
nio, lsN, por muitas gerações, para saturar plenamente
o DNA parental com nitrogénio de alto teor de isótopos
pesados. No fim das contas, todas as fitas duplas de DNA
nas bactérias cultivadas nesse meio continham apenas o
isótopo pesado do nitrogénio. Essas fitas duplas foram
,
designadas SN /15N para indicar a incorporação do l 5N
em ambas as fitas duplas. (Seguindo a mesma filosofia ,
a fita dupla de DNA composta de duas fitas contendo
apenas J 4N, o isótopo normal do nitrogénio, é designada
,
,4N/ 4N, e uma fita dupla com uma das fitas contendo
,
cada isótopo é designada SN / 4 N.) O DNA colhido para
a análise do gradiente de CsG a partir dessa geração ini-
cial, designada gera ção 0, era exclusivamente l5N / l5N.
Em seguida, algumas dessas £ coli indicadas como l 5N
foram transferidas para um novo meio de cultura con
,
tendo apenas 4N. Em vários intervalos através de ciclos
sucessivos de replicaçào do DNA, o DNA foi colhido de
,
algumas células no meio 4N para análise.
A parte inferior da Figura 7.11 mostra os resultados
da análise do gradiente de CsCI do DNA colhido na ge
ração 0 e após cada um dos trés ciclos de replicaçào do
DNA. Como mostram as representações moleculares
na parte superior da figura, os resultados foram coeren
tes apenas com o modelo semiconservativo. O modelo
conservativo previu moléculas de DNA com duas den
sidades distintas após a geração 1 ( N/ ^N e UN /14N).
“ uma película de raios X para produzir uma imagem au-
Os resultados rejeitam esse modelo. De modo similar,
o modelo dispersivo previu uma única densidade de
DNA em todas as gerações. Os resultados da geração 2
rejeitam esse modelo de replicaçào. Após alguns anos
da identificaçã o da replicaçào semiconservativa nas
Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçào do DNA 233
O Replicaçào dispersiva
Rta dupta parental
\
Primeiroddo
/ \ / \
Segurvdoddo
bacté rias feita por Meselson e Stahl, o mecanismo tam -
bém foi identificado experimentalmente nos eucario-
tos, solidificando a ideia de que todas as formas de vida
compartilham o mesmo processo geral de replicaçào do
- DNA, como consequência da origem única da vida e das
conexões evolutivas entre os organismos vivos. A Aná-
lise Genética 7.2 explora a an álise da replicaçào do DNA
do “ micróbio marciano" com uma abordagem experi
mental similar à de Meselson e Stahl.
-
Origem da replicaçào no DNA bacteriano
A solução do enigma do mecanismo básico da repli -
caçâo do DNA introduziu novas questões sobre como
a replicaçà o é iniciada e como evolui. A replicaçào co-
meça em pontos específicos em cada cromossomo? Se
começar, quantos desses pontos um cromossomo pos-
sui? A replicaçào do DNA evolui em uma direção ou em
ambas as direções a partir de uma origem de replicaçào?
- A evidê ncia experimental demonstra claramente que,
na maioria das vezes, a replicaçào do DNA é bidirecio-
nal , evoluindo em ambas as direções a partir de uma
única origem de replicaçà o nos cromossomos bacte -
rianos e a partir de m últiplas origens de replicaçào nos
- cromossomos eucarió ticos.
Em 1963, John Cairns relatou a primeira evidência
de uma origem única de replicaçào do DNA na £ coli.
- Cairns cultivou bactérias em um meio contendo um isó -
-
topo radioativo da timina (3H timina ) e depois colocou
- seus cromossomos, extra ídos durante a replicaçào, em
torradiográ fica ( Figura 7.12 ). O decaimento radioativo
do *H é lento e levou vá rios meses para produzir uma
imagem. Depois que a exposição foi concluída, Cairns
examinou suas autorradiografias por microscopia e en-
controu linhas escuras que revelaram o padrão de repli-
234 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Geração 0 Odo 1 Ciclo 2 Ciclo 3

Culturas de E. coH
Transwas células
paraomeode
cultura "N

\s
Meio de ? Meio de Meio de
, Meio de
cultura “N cultura MN cultura 4N cultura WN

l 1 1 1
Amostras de DNA © 19

A
/
N
\
\ soooooòr
xxxxxxx - L» *
\
V

Híbrido sooooood
V/W\
Híbrido \ j\f\/\ Hlbndo
Análise do DNA
Faixas
Faixas de DNA densitométricas

b-
Leve

", NTN
, --
SN/ 4N
nH / nH -

Pesado
Resultados Apenas DNA pesaoo Apenas DNA hlífldo 1:1 de DNA leve para híbndo 3:1 de DNA leve para híbddo
Figura 7.11 Resultados experimentais de Meselson-Stahl. Fotografias das bandas de DNA nos tubos da centrífuga e nas
varreduras de densitometria (parte inferior da figura ) identificam a composição da fita dupla do DNA em cada estágio e são
coerentes apenas com a replicaçá o semiconservatlva do DNA. O processo de replicaçá o semiconservativa é interpretado em
cada ciclo de replicaçáo.

cação das moléculas do DNA. Ele concluiu que a alça A DNA replicado
e a alça B na fotografia são DNA replicado, que a al ça C é
Forquilha
DNA não replicado e que a replicaçáo se deu a partir de de replicaçáo
uma origem de replicaçáo ú nica. Nas imagens de Caims,
a forma do cromossomo replicado era reminiscente da Forquilha c., DNA
de replicaçáo não replicado
letra grega teta; por isso o nome aplicado a esses cromos-
somos replicados é estrutura 0 (“estrutura teta"). DNA V
replicado
V •
Figura 7.12 Replicaçáo do DNA bacteriano. A imagem
autorradiográ flca de Caims captura o DNA replicado O DNA é prolongado na fcxqu ha de replicaçáo. com as duas htas de
( vermelho) e o DNA nâo replicado (azul). A estrutura DNA nâo replicado (azul) sendo ul <&»das como modela Essa
cstrutixa ó coerente com a replicaçáo do DNA a partir de urna
cromossômica replicada indka que a replicaçáo se inicia a
origem única.
partir de uma origem única.
 Capí tulo 7 Estrutura e replicaçào do DNA 235

AN Á LISE GEN ÉTICA

Suponha que investigações futuras identifiquem um mécróbio que vive na calota polar de Marte. A aná-
lise revela que esse micr óbio contém DMA de fita dupla.Um experimento como o de Meselson e Stahl
é realizado para determinar como esse DNA é replicado. A seguir, temos uma varredura densitométrica
de controle e vaneduras densitométricas do DNA colhido após cada um dos três ddos de replicaçào. As
posições e alturas dos picos refletem as quantidades relativas de DNA de diferentes densidades em cada
amostra colhida. Qual é o mecanismo de replicaçào do DNA nesse micróbio marciano hipotético?
,
'
N 4/N 4

N VN' 4
’
Mais leve

>
Mais
pesado
Controle
>
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3

Estrat égias de solu ção Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por este
problema e explique a natureza da res
.
1 A questão diz respeito ao mecanismo de replkaçáo do DMA de um organismo
extraterrestre hipotético. A resposta vai identificar como o DNA replica.
posta solicitada.
2. Identifique as informações críticas .
2 Um experimento com uma concepção similar á de Meselson e Stahl gera in-
fornecidas no problema . , .
formação sobre a composição do DNA replicado Um grá fico de controle mos-
,
trando os resultados da densitometria para N 5/N 5,N 5/Nu e N 4/N 4 é fornecido,
’ ’ ’
* * ao longo dos resultados de trés cklos de replicaçào do DMA no organismo.
Dic«: Arwa» prpvhô^ dos rood k
*
—v.
dr rrpl caçio do DNA corwfvativo, w»mi
carvK"vitM3 e dKpmuxj
Deduzir
.
3 Inspecione e avalie os resultados do .
3 São observados dois picos com alturas iguais, indicando que o DNA de duas
primeiro ciclo de replkaçáo do DNA. densidades diferentes está presente em quantidades iguais apôs um ciclo de
,
replicaçào. As densidades indicam as composições de DNA * N/’VN e 4 N/’ 4N. Ne
nhum DNA N /N é detectado.
15 14
*
Solucionar
4. Deduza o s) possrvel(e»$) mecanis-
< .
4 Esse resultado é coerente com as previsões da replicaçào conservativa e incoe-
mo{s) de replicaçào do DNA com rente com as previsões da replicaçào semiconservativa e da replicaçào dispersiva.
base no resultado do primeiro ciclo
de replicaçào.

.
5 Inspecione e avalie o resultado do
segundo áclo de replicaçào baseado
na conclusão da etapa anterior.
.
5 As mesmas duas formas de DNA estão presentes, mas agora há aproximada-
, , ,
mente trés vezes mais DNA 5N/ 15N que DNA 4N/ 4N. Isso é coerente com a pre-
visão do modelo conservador de replicaçào do DNA.

.
6 Avalie o resultado do ciclo 3 de re-
plicaçáo do DNA e confirme se sua
interpretação está correta.
6. Após a conclusão do cklo 3, a razão das moléculas de DNA é distorcida substan-
.
cialmente em favor de ^N/^N Após trés ciclos de replicaçào, o modelo cooser
, ,
' .
vador prevê uma razão molecular de 7:1 entre N 5/N s e N 4 /N14 Portanto, con-
cluímos que o micr óbio tem um modo de replicaçào conservador.

Para praticar mais, ver Problemas 20 e 22.

Evidência da replicaçào bidirecional do DNA
As estruturas 0 nas autorradiografias de Cairns sào
coerentes com a replicaçào unidirecional ou bidirecional
do DNA, embora poucos anos depois o mecanismo de
replicaçào do DNA tenha se mostrado bidirecional. Na
replicaçào bidirecional do DNA dos cromossomos bac
terianos circulares, novo DNA é sintetizado em ambas
as direções a partir de uma origem de replicaçào única,
criando uma bolha de replicaçào em expansão, como
mostra a :lgura 7.13a. Em cada extremidade da bolha de
replicaçào existe uma forquilha de replicaçào, em que
novos nucleotídeos de DNA sào adicionados às fitas-fi -
Ihas prolongadas. O crescimento da bolha de replicaçào
forma a estrutura teta capturada nas imagens autorra-
- diográíicas de Cairns. A replicaçào é conclu ída quando
as duas forquilhas de replicaçào se encontram no lado
oposto do cromossomo circular a partir da origem da re -
236 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

plicação. Com o término da replica çã o, as duas fitas du
plas filhas são cromossomos separados.
A localizaçã o da origem de replicação e das sequê n -
cias de término da replicação em lados opostos do cro-
mossomo proporcionou a Raymond Rodrigucz e cola -
boradores, em 1973, apoio para o modelo de replicação
bidirecional (Figura 7.13b).
Em 1968, Joel Huberman e Arthur Riggs usaram uma
-
técnica chamada marcação pulse chase para produzir a
primeira evidência experimental da replicação bidirecio-
nal em bactérias (Figura 7.14 ). Nos experimentos de mar -
cação pulse- chase, as células são expostas alternadamente
a altos níveis { pulse ) e a baixos níveis ( chase ) de um mar-
cador radioativo. O marcador nesse caso é a 3H- timina.
O marcador é utilizado de modo que as imagens autorra
diográficas possam detectar onde a radioatividade está in
corporada nas moléculas de DNA replicadas. Nos perío-
dos de pulso do experimento, quando a concentra ção da
* H - timina é elevada, uma grande quantidade de radioati-
vidade está incorporada ao DNA replicado; inversamente,
nos per íodos de perseguição (chase ), quando o nível de
3
-
H timina é baixo, pouca radioatividade está incorporada
ao DNA replicado. A autorradiografia mostra trilhas es
curas onde os altos níveis estão presentes, e trilhas claras,
onde os níveis são baixos. O modelo de replicação bidire-
cional prcvc trilhas escuras e claras alternadas em ambas
as direções a partir das origens de replicação durante o ex -
-
perimento de marcação pulse chase , que serão simétricas
em tomo da origem de replicação. Esse é o resultado ob-
tido por Huberman e Riggs. Experimentos subsequentes
em vários eucariotos e bactérias forneceram evidências
- inequ ívocas de que a replicação do DNA segue bidirecio -
nalmente a partir das origens de replicação .
Mais suporte da orientação bidirecional da replica -
ção do DNA provém de estudos bioquímicos da DNA
polimerase responsável pela maior parte da replicação
do DNA da £ colL Essa DNA polimerase é capaz de in -
corporar cerca de mil nucleotídeos por segundo na fita
-
recém sintetizada. Nessa taxa de síntese, os 4 X 106 nu -
cleotídeos do genoma podem ser replicados em aproxi
madamente 2 mil segundos (33 minutos). Isso é quase o
-
tempo de gera ção m ínimo da £ colL A taxa enzimá tica da
molécula teria de ser duas vezes tão rá pida se a replicação
fosse unidirecional para concluir a replicação dentro do
tempo de geração. Ao contrário das bactérias, a taxa de
- atividade catalítica da DNA polimerase eucariótica é de
- aproximadamente 2 mil a 4 mil nucleotídeos por minuto,
menos que um décimo da taxa na £ colL Muitas vezes os
eucariotos possuem genomas maiores que a £ coli e vá-
rios cromossomos para replicar, entã o pode-se concluir
logicamente que eles replicam seus genomas a partir de
vá rias origens de replicação em cada cromossomo.
Origem da replicação múltipla nos
eucariotos
A análise autorradiográfica revela vá rias origens de
replicação nos cromossomos eucarióticus. c a observação
direta por microscopia eletrónica confirma isso (Figura
.
7.15) A maioria dos grandes genomas eucarióticus contém
milharesde origens de replicação, separadas, em média, em
cada cromossomo, por 40 mil a 50 mil pares de base (pb).

(a ) Modelo bidirecional de replica ção

Bolha de
Origem (ori ) replicação

Forquilhas de
replicação
(b) Prova da replicação bidirecional

/ v -
Origem

Cromossomo
Término
da E. coli
Figura 7.13 Replicação bidirecional do DNA. (a ) As imagens autorradiográficas de Cairns são coerentes com um modelo
bidirecional de replicação do DNA. (b) Os locais da origem de replicação e das regiões de término da replicação em lados opostos
do cromossomo da £ coli ( RODRIGUEZ, R. L. et aL 1973.)
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 237

-
(a) Resultados da marcaçáo pulse chase rimental identifica os segmentos de “ replicaçáo precoce"
Origem Origem (isto é, no inicio da fase S) e os segmentos de "replicaçáo
da replicaçáo da replica çáo tardia" ( no final da fase S) dos grandes genomas eucarió -
ticos. Os segmentos genômicos de replicaçáo precoce pa -
recem conter muitas genes expressos, enquanto as regiões
de replicaçáo tardia contém muito menos genes expressos.
Na Drosophila , por exemplo, as regiões de replicaçáo tardia
Baixa Alta Afta Baixa Alta Afta Baixa incluem segmentos cromossòmicos em volta dos centrò -
Concentração meros, onde estão situados poucos genes expressos.
do marcador Independentemente de sua iniciação, sincroniza -
( b ) Interpretação segundo o modelo bidirecional çã o e ritmo, todo o DNA em cada célula eucariótica é
Origem Origem 1
replicado no final da fase S. Os produtos finais da re-
da replicaçáo da replica çáo
. , plicaçào de cada cromossomo eucariótico são um par
de fitas duplas de DNA idênticas que são cromá tides
Baixa Alta Alta Baixa Baixa Alta Afta Baixa irmãs. Estas permanecem unidas durante a G, e serão
Concentração separadas na anáfase da fase M subsequente.
do marcador A simetria do padrão em
ambos os lados da origem
mostra çJC a replicaçáo Observa çã o gen ética A replicaçáo do DNA nos cro
avança em duas direções mossomos bacterianos tem uma ú nica origem de replicaçá o
e avança bídirecionalmente em volta da molécula de DNA cir-
Figura 7.14 Evidência da replicaçá o bidirecional do DNA
pela marcação pulse-chase . (a) Resultados da marca çáo
cular. Os genomas eucarióticos sofrem replicaçáo bidirecional
a partir de vá rias origens de replicaçáo que podem iniciar essa
-
pulse chase. (b) Interpreta ção dos resultados segundo o
replicaçáo em momentos diferentes durante a fase S. A repli -
modelo bidirecional .
caçáo do DNA eucariótico produz cromátides irm ãs.
As estimativas atuais indicam que o genoma humano con -
tém mais de 10 mil origens de replicaçáo, espaçadas por 30
a 300 quilobases (kb). As origens de replicaçáo eucarióticas 7.4 A replicaçá o do DNA duplica
não são todas iniciadas no mesmo momento e, entre os di - precisamente o material genético
ferentes tipos de célula, a duração da fase S é variável, sig -
nificando que a taxa de progressão da replicaçáo do DNA Uma grande parte do que os biólogos sabem sobre
varia entre as células de tipos diferentes. As células que se a replicaçáo do DNA vem do estudo das bactérias, par-
dividem rapidamente replicam seu DNA com mais rapi - .
ticularmente a £ coli Analisamos algumas das etapas
dez ( isto é, têm uma fase S menos demorada ) que as células básicas da replicaçáo do DNA (Capítulo 1) c nesta seção
que se dividem lentamente. Além disso, a evidência expe- fornecemos mais detalhes do processo. Grande parte
dessa informação também é aplicável aos eucariotos, em
virtude da história evolutiva compartilhada dos domí
nios Bactéria, Archaea e Eukarya. No entanto, apesar das
-
fortes semelhanças entre os grupos taxonômicos, o pro-
cesso de replicaçáo do DNA nas bactérias n ão é idêntico
ao dos eucariotos. À medida que discutirmos a mecâ nica
molecular da replica çáo do DNA nesta seção, vamos ob-
servar as características importantes que diferem subs-
tancialmente entre os membros dos dois domínios.
Também queremos oferecer uma nota de advertên -
cia sobre as discussões da replicaçáo do DNA. Embora as
partes iniciais da nossa discussão sobre a replicaçáo identi -
fiquem enzimas e proteínas individuais, não se deixe enga-
nar pensando que essas proteínas são os ú nicos atores que
entram e saem da forquilha de replicaçáo à vontade. Em
vez disso, essas proteí nas fazem parte de grandes e com -
plexos agregados de proteínas e enzimas, chamados reptis
somos, que se reúnem em cada forquilha de replicaçáo. Na
£ coli , por exemplo, os replissomos ativos na replicaçáo do
DNA contêm aproximadamente 30 proteínas e enzimas
Figura 7.1 S Várias origens de replicaçáo em um diferentes. Mais adiante nesta seção, descrevemos como
único cromossomo da Drosophila mtlanogcuter . As
um replissomo em cada forquilha de replicaçáo realiza a
setas apontam para as bolhas de replicaçáo, que estào se
expandindo bídirecionalmente.
replicaçáo quase simultâ nea das duas fitas- molde.
238 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Sequências do DNA nas origens de nucleotideos encontrados maisfrequentemenU em cada

replicação posição do DNA na região conservada.

As origens de replicaçã o do DNA contêm sequê n -

cias que atraem enzimas de replica çã o. A sequência de
origem de replica ção mais bem caraterizada é a da £
coli, sendo designada oriC. Essa sequência contém apro-
ximadamente 245 pares de bases de DNA, é rica em AT
( isto é, tem uma preponderâ ncia de pares de bases ade-
nina e timina , presumivelmente porque menos energia
é necessá ria para a desnatura çã o) e é subdividida por
três sequ ê ncias de 13 pares de base, conhecidas como
13- mers, seguida por quatro sequências de 9 pares de
base, conhecidas como 9- mers ( Figura 7.16a )
Em comparação com a oriC, outras espécies bacte
rianas têm origens de replicação contendo sequê ncias de
DNA similares, mas não idênticas. Essa semelhança das
sequências de DNA nas origens de replicação é um pro-
duto da conservação evolutiva das sequências de DNA.
A seleção natural age para manter a semelhança das se-
quências porque a função da região da sequência conser-
vada é essencial para a sobrevivência do organismo. Em
outras palavras, a seleção natural mantém sequências de
DNA dentro de uma região que desempenha uma fun -
ção essencial As comparações de tais sequências dentro
e dentre as espécies relacionadas costuma levar à identi-
ficação de sequ ê ncias de consenso, que consistem em
Uma sequência de consenso é a parte de uma re -
gião conservada que desempenha a função essenciaJ que
é o foco da seleçã o natural. As sequéndas de consenso
-
13 mer e 9- mer, que fazem parte da oriC, foram manti-
das pela seleção natural porque tém papéis funcionais es-
senciais na iniciação da replicação, como explicamos na
seção a seguir. Além da presença das próprias sequências
de consenso, a seleção natural também age na manuten-
çã o do espaçamento específico entre as sequências de
consenso. O espaçamento é importante porque as pro-
teínas de ligação ao DNA precisam se reunir nos sítios
. onde as sequências de consenso estão situadas. Proteínas
- diferentes são atraídas para diferentes sequências de con-
senso e cada proteína precisa ter o espaço í f sico para se
ligar ao DNA e interagir com as outras proteí nas Ligadas à
região da sequê ncia de consenso. Resumindo, as sequên -
cias de DNA que desempenham papéis funcionais essen -
ciais têm sua composição global da sequência conservada
pela seleção natural. Segmentos curtos dessas regiões
das sequ ências conservadas são sequências de consenso
em que as prote ínas de DNA se ligam para iniciar suas
ações. O espaçamento entre os elementos das sequências
de consenso também é importante para deixar espaço na
molécula de DNA visando à ligação das proteínas e à in -
teração entre as proteínas ligadas.

( a ) oriC da E. cotí

— Cromossomo
da £ coli

245 pb

7, — — — — — —
I
-
I 13 mer j i -
13 mer i j -
13 mer ] - -]
p9 mer
/
- -
9 mer j -
p9 mer-| - -]
p9 mer
I

Sequência GATCTATTT À TTT Sequência TTATCCACA

-
13 mer CTA 6 ATAAATAÀ A -
9 mer AATAGGTGT
Sequência de consenso Sequência de corsecso
L j
l T
Arranjo de repetição em tandem 13-mer Arranjo de repetição em tandem 9-mer

.
( b ) Sequê ncia de replica ção autónoma 1 (ARS1) da S cerevisioe
95 pb

B, Ba Bi — 11 pb
—
r^> A 7 TTCGTCA ^AATrT4fT.T?ra/.T^ifAt UlATTTAAGTATTGTT|í:«
^«i -
Í jT &AAAA&CAA6CAT 'mTOÍÍ TAAACA M ^lWíãíJJJACTX'f
B
; *

.
Figura 7.16 Sequ ências da origem de replicação na £ co/re nas leveduras, ( a ) A A / T TTTAT A / Q TTT A / T
oriC na £ coli contém três sequ ências de consenso 13-mer e quatro sequências 9-mer em T / A AAATA T / C AAA T / A
uma região de 245 pares de base de sequê ncia conservada , (b) A origem de replica ção Sequê ncia de consenso
da levedura ARS1 contém um segmento de consenso com 11 pares de base e as regiões
B,, Bj e B, abrangendo 95 pares de base de sequ ência conservada. Uma barra obl íqua (/)
entre os nucleotideos das sequências de consenso ( por exemplo, A/T) indica que os dois
nucleotideos são igualmente comuns nessa posição.
 Cap í tulo 7 Estrutura ereplicaçàodo DNA 239

Entre os organismos eucarióticos, a levedura Saccha - -

romyces cerevisiae tem as sequências da origem de repli
carão mais bem caracterizadas. Nas leveduras, as várias
origens de replicaçào são identificadas como sequência de
replicarão autónoma (ARS). Existe uma conservação glo-
bal da sequê ncia de DNA, e a organizaçã o das ARSs é si
milar por todo o genoma da levedura. A ARS1 na levedura
foi totalmente sequenciada (Figura 7.16b ). Dentro de 95
pares de base da ARS1, há uma sequência de consenso de
11 pares de base e três outras regiões ( B,, B. e Bs) de sequ
ências de DNA conservadas que diferem um pouco entre
si e da região da sequência de consenso de 11 pares de
base. Sabe-se muito menos sobre as sequências de DNA
nas origens de replicaçào em outras espécies eucarióticas,
-
mas presume se que elas contenham sequências de con
senso nos sítios de ação das prote ínas de ligação ao DNA
que iniciam a replicaçào do DNA.
nucleotídeos às fitas filhas, que são complementares e
- antiparalelas às fitas- molde do DNA. Esses novos nu -
cleot ídeos sã o adicionados à extremidade 3' da fita -filha
em crescimento e a direçã o global do prolongamento
da fita - filha é de 5’ para 3*. No entanto, curiosamente
- as DNA polimerases são incapazes de iniciar por conta
própria a síntese da fita de DNA. Para realizar sua ativi
dade catalítica, uma DNA polimerase requer a presença
-
de uma sequência iniciadora, um segmento curto de fita
-
simples que começa a fita -filha e fornece uma extremi-
dade 3'-OH à qual o novo nucleotídeo de DNA pode
ser adicionado pela DNA polimerase. Para satisfazer o
requisito de uma sequê ncia iniciadora, a replicaçà o do
DNA é iniciada por uma RNA polimerase especializada,
- chamada primase, que sintetiza um RNA iniciador
curto, descrito no próximo parágrafo.

Iniciação da replicaçào nas bactérias

A replicaçào do DNA na £ coli requer que as enzi - Repetições 13 mer - -
Repetições 9 mer
mas de iniciaçã o da replicaçào localizem e se liguem às
sequências de consenso na oriC. Na £ coli, três enzimas, oriC
DnaA, DnaB e DnaC, l í gam -se à oriC e iniciam a replica -
çào do DNA ( Figura 7.17). A primeira enzima a se ligar
é a DnaA, vinculando-se aos componentes 9 mer da -
oriC. A DnaA dobra o DNA e quebra (hidrolisa ) as pon
-
tes de hidrogénio na região 13- mer rica em A T da oriC ,
- r Proteína DnaA
criando um complexo aberto, uma região curta onde as
fitas duplas são separadas. Depois, a DnaB, transportada SSB
9- mer
para a oriC pela DnaC, liga -se às duas fitas no complexo Complexo 13- mer
\ -
13 mer
aberto. A DnaB é uma proteína helicase que usa ener - aberto \ .
gia do ATP para hidrolisar as pontes de hidrogé nio que
unem os nucleotídeos complementares. Essa hidrólise 9- mer
-
separa as fitas do DNA e desenrola a dupla hélice. As 13-mer
r
fitas de DNA desenroladas buscam a estabilidade má - HIW
xima reenrolando, formando novamente o DNA com -
plementar de fita dupla , exceto quanto à presença da A proteína DnaA I qa-se ã 9-mer
proteína de ligação de fita simples ( SSB). A proteína -
região 9 mer,for
çando o

r pç
desen^lamento da regiSo
de ligação de fita simples impede o reenrolamento das 13 -mer e formando um
fitas separadas, mantendo as disponíveis para servir
*
complexo aberto.
como modelos para a síntese do novo DNA. Proteí nas
Nas fitas de DNA de um cromossomo circular, o DnaC e DnaB
desenrolamento cria um estresse de torção que se acu - A DnaC leva a proteha DnaB
mula à medida que a região desenrolada fica maior e a
ao complexo aberto para
replicaçào do DNA avança. Sem extremidades livres, o iniciar a atividade da helicase.
Proteína DnaB
DNA circular fechado covalentemente acumula rapida - ( helicase) j
mente enrolamentos super - helicoidais, chamados DNA
superenrolado, que se assemelha a uma tira de borra
cha excessivamente torcida (Figura 7.18a ). O acú mulo
- Proteína de
liga ção de fita
simples
de estresse poderia quebrar a molécula em posições
aleatórias, possivelmente levando a um rompimento da
replicaçào do DNA. Esse evento potencial mente letal é
evitado pelas enzimas conhecidas como topoisomera -
ses, que catalisam uma clivagem controlada e rejuntam
CXitras proteinas se unem e
o DNA, permitindo, assim, que as fitas excessivamente Proteína DnaB formam o primossomo,
enroladas desenrolem (Figura 7.18b). (helicase)
A enzima DNA polimerase, que é basicamente res - Figura 7.17 Iniciação da replicaçào na oriC , exigindo as
ponsá vel por sintetizar novas fitas de DNA, adiciona proteínas DnaA, DnaB e DnaC.
240 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
(a ) Fita-molde Forquilha de
Forquilha de -
replicação j
replicaçáorf
Fitas -filhas
- Bolha de
replica ção
Fí ta- molòe
- superenrolado
DNA
Fig ura 7.1 8 Superenrolamento do DNA nas bactérias (a ) e seu corte e liberação pela topoisomerase ( b).
Na replicação do DNA da £ coli , a primase e uma
série de proteínas unem a DnaA à oriC para formar o
primossomo . O papel funcional do primossomo é levar
a primase e suas proteínas acessórias necessá rias a uma
origem de replicaçã o, onde sintetizam uma fita simples
curta de RNA, chamada primer de RNA . Medindo ape-
nas de uma a duas d úzias de nucleotídeos de compri
mento, os primers de RNA fornecem a 3’ OH necessá -
ria para a atividade da DNA polimerase. Os primers de
RNA contém a base de nucleotídeo uracila ( U) no lugar
da timina. Consequentemente, os primers de RNA não
conseguem se manter como parte integrante do DNA
plenamente replicado. Desse modo, embora sejam es-
senciais para permitir que a DNA polimerase comece
sua sí ntese do DNA, os primers de RNA são temporá
rios e removidos das fitas de DNA recém -sintetizadas
por um processo que descrevemos na próxima seção.
Observa çã o gen é tica A replicação do DNA na £ coli ê
iniciada em sequências de DNA espec íficas, designadas oriC.
As proteí nas DnaA e DnaB ligam -se à oriCe iniciam a atividade
helicase que desenrola as fitas de DNA na preparação para a
replica ção. 0 primossomo leva a primase à oriC para a sintese
de um primer de RNA curto que é utilfcado para iniciar a repli -
cação do DNA.
Replicação contínua e descontínua das fitas
Cada fita de DNA parental age como um molde
para a síntese de uma nova fita - filha de DNA. Na £ coli ,
-
as fitas filhas de DNA são sintetizadas na forquilha de
replicação pela holoenzima DNA polimerase 111 ( pol
111), a principal enzima sintetizadora do DNA. Holoen
zima è o termo geral utilizado para os complexos mul
tiproteicos com componentes proteicos adicionais que
completam sua estrutura e levam à sua funçã o. A holo-
enzima pol III inicia seu trabalho na extremidade 3'-OH
(b)
Forquilha de
replicação
Q A topoisomerase g © A fita de DNA gira © A topoisomerase
corta a fita para remover os re)unta a fita
de DNA enrolamentos de DNA
Superenrolamento
do DNA
de um primer de RNA e rapidamente sintetiza o novo
DNA com uma sequência complementar à dos nucleo-
tídeos da fita - molde. A pol III acrescenta novos nucleo-
tídeos a uma fita -filha, contanto que haja nucleotídeos
complementares na fita - molde para dirigir a adição dos
-
nucleot ídeos à fita filha.
- A evidência experimental indica que a maioria das
- enzimas que estamos descrevendo como participantes na
replicação do DNA faz parte de um ú nico complexo pro-
teico grande em cada forquilha de replicação, chamado
replissomo. H á um rcplissomo em cada forquilha de re-
plica çào e cada um deles contém, entre outras compo-
nentes, duas cópias da pol III. Em cada rcplissomo, uma
pol III executa continuamente a síntese 5' para 3' de uma
- íita - íilha, na mesma direção em que a forquilha de repli-
ca çà o evolui. A segunda enzima pol 111 em um replissomo
-
- -
executa a síntese da outra fita filha. A fita filha continua
mente prolongada chama se fita líder ( Figura 7.19). Re -
pare que a Figura 7.19 divide a bolha de replicação em
quatro quadrantes. Os quadrantes superior direito e infe
rior esquerdo contêm fitas- líder.
-
-
As fitas filhas nos quadrantes superior esquerdo e
inferior direito exibidas na Figura 7.19 tê m uma dire-
ção de prolongamento 5’ para 3’ que segue em sentido
oposto ao movimento da forquilha de replicação. Essas
fitas-filhas são prolongadas de modo descontínuo, em
segmentos curtos, cada um deles iniciado por um pri -
mer de RNA. A fita -filha sintetizada de modo descon
tínuo chama -se fita atrasada. Assim, na Figura 7.19, os
-
quadrantes inferior direito e superior esquerdo da bolha
de replica ção contêm fitas atrasadas.
Reiji Okazaki detectou a sí ntese de fragmentos cur-
tos de DNA na replica ção da fita atrasada. Ele observou
-
-
que, no início da replicação bacteriana, os segmentos
de DNA recém -sintetizados em uma fita têm de mil a 2
mil nucleot ídeos de comprimento, enquanto no final da
replicação os segmentos recém -sintetizados são muito
maiores. A descoberta de Okazaki sugeriu que os seg -

Fragmentos
de Okazaki
Reg Ȉo do replissomo
r
Forquilha de
replkaçâo (kxal
3* 5
de um replissomo) V 5'
5'
3' Fita atrasada
5' Fita -líder
3'
Figura 7.1 ‘ Bolha de replka çâo. A expansão bidirecional é impulsionada pela sí ntese do DNA em cada forquilha de
replicaçào. Um replissomo contendo duas enzimas de DNA pol III opera em cada forquilha para replicar cada fita filha.
mentos curtos do DNA são sintetizados e que sâo reu
nidos à medida que a replicaçào avança. Os segmentos
-
curtos do DNA recém replicado chamam se fragmen -
tos de Okazaki e são o resultado da sí ntese descontínua
do DNA na fita atrasada.
Na Figura 7.19, repare que cada fita -filha contém
um segmento caracterizado como fita -l íder adjacente
a um segmento caracterizado como fita atrasada. Todas
as fitas filhas sáo compostas de segmentos líder e atra
sado adjacentes que, no fim das contas, serão estrutu
ralmente idênticos.
Remoção do RNA iniciador ( primer ) e
ligação dos fragmentos de Okazaki
Para concluir a replicaçào do DNA , os primers de
RNA precisam ser removidos e substituídos por DNA
e os fragmentos de Okazaki precisam ser reunidos para
formar fitas de DNA completas. Essas tarefas são rea -
lizadas pelas enzimas DMA polimerase I e DMA ligase,
que fazem parte do complexo do replissomo em cada
forquilha de replica çào.
Quando a DNA pol 111 na fita atrasada alcança um
primer de RNA, saindo assim do molde, ela deixa uma
lacuna de fita simples entre o último nucleot ídeo de
DNA da fita - filha recém -sintetizada e o primeiro nucleo -
tdeo do primer de RNA [ Figura 7.20 ). A pol III, tendo
í
muito pouca afinidade com essas lacunas DNA - RNA de
fita simples, é substituída pela DNA polimerase I ( pol 1),
que tem alta afinidade com essas lacunas ( Figura 7.20,
.
O) A DNA pol I remove os nucleotídeos do primer de
RNA um a um e os substitui por nucleot ídeos de DNA,
começando com o nucleot ídeo 5’ do primer de RNA e
avançando na direção 3*, até que todos os nucleotídeos
de RNA no primer tenham sido substituídos por nucleo-
tídeos de DNA complementares aos da fita - molde.
Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçào do DNA 241
Molde de DNA
DNA -filho
oriC
Região do replissomo
3' 5 > Forquilha de
replicaçào {k>cal
de um replissomo)
imer de RNA y
Fita l í der 5'
Fita atrasada y
5'
;
5' 3
5* 3’ 5' y
oriC Fragmentos de Okazaki
Expansão bidirecional
da bolha
- A enzima pol I possui duas atividades que realizam a
remoção dos nucleotídeos de RBA e sua substituição por
- nucleotídeos de DNA. Primeiro a DNA pol 1 utiliza sua
atividade exonuclease 5' para 3’ para remover o nucleo-
tídeo mais 5' do primer de RNA. Isso cria um espaço
aberto oposto ao molde, que depois é preenchido com o
nudeotídeo de DNA correto pela atividade polimerase 5*
para 3' da DNA pol I. A pol 1 remove cada nucleot ídeo do
- primer de RNA e os substitui por um nudeotídeo de DNA.
- -
Ao fazé lo, a pol 1 empurra continuamente a lacuna de fita
simples na direção 3', acabando por substituir todos os nu-
ídeos do primer de RNA por nucleotídeos de DNA.
cleot
Depois que todo o primer de RNA for substitu ído,
uma lacuna de fita simples se situa entre os dois nucleo-
tídeos de DNA. Nesse ponto, a DNA ligase, tendo afini-
dade exclusiva e muito alta com as lacunas DNA - DNA
de fita simples, é atra í da para a lacuna e ali realiza sua
tarefa única de formar uma ligação fosfodiéster entre
os dois nucleot ídeos de DNA que unem dois fragmen-
tos de Okazaki. Tanto a pol I quanto a DNA ligase são
ativas nas fitas l íder e atrasada. O nível de atividade é
maior nas fitas atrasadas, em que, a cada mil a 2 mil nu -
cleotídeos, elas são necessá rias para unir os fragmentos
de Okazaki durante a replicaçào do DNA da E coli. A .
Figura 7.21 incorpora todas as caracteristicas recém -
-descritas em uma visão global da replicaçào do DNA.
Observaçã o gen é tica A DNA polimerase III sintetiza o
DNA da £ coh começando nas extremidades 3’-0H dos primers
de RNA e realiza a maior parte da replicaçà o do DNA. A DNA
polimerase I substitui a pol III na remoção dos nucleotídeos do
primer de RNA e os substitui por nucleotídeos de DNA. A DNA
ligase catalisa a formação das ligações fosfodiéster que unem
os segmentos de DNA e concluem a replicaçào.
242 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Lacuna de fita Primer de RNA 5' 3'

simples ( DNA-RNA ) r
DNA
0 A ONA pol I liga-se UG ÇfcGATG-
a uma lacuna de Rta-filha 0 éOrelaxado
DNA superenrolado
pela DNA
fita simples entre o
DNA e um primer . CCTAGACGCCfAC-
-
Fita molde topoisomefase.
de RNA. Q A helicase ( proteína DnaB)
rompe as pontes de hidrogénio
DNA polimerase I
^^ para desenrolar as fitas de DNA.

0 A pol I remove um
nucleot ídeo do
primer de RNA...
ti
m
—
.0 simples para impedir o
0
reveste o DNA de fita

reeorolamento.
A pcí mase sintetiza os
C '" prwners
^ RNA
de nas fitas
líder e atrasada .
5'
0 A DNA polimerase III'
Fragmento '' y sintetiza o DNA de 5
O - e preenche a de Okazaki \ / para 3’ continuamente
ao longo da fita-líder e
lacuna com um
nucleot ídeo de de forma descontínua
DNA. ao longo da fita atrasada.
0 Aremove
DNA polimerase I
os nudeotídeos
ll 7^ dos pnrners d ê HNA.
"

0 A pol I remove
cada nucleot ídeo
h8 -
-
XIj kr v 0- asA DNA
substituindo os por
nudeotídeos e DNA
ligase catalisa
do primer de RNA.. . I 3 ^
liga ções fosfodi éster
para unir os segmentos
de DNA
3* 5' 3' 5'
Fita l íder Fita atrasada

0 -ume onucleot
Papei
substitui por
DNA topoisomerase Relaxa o superen rolamento
DNA.
ídeo de
Helicase ( DnaB)
SSB
-
Desenrola a dupla hélice
Impede o reenroiamento de fitas separadas
Primase Sintetiza os primers de RNA
DNA pol Itl Sintetiza o DNA
DNA poli Remove e substitui o primer de RNA por DNA
0 Quando a remoção Lacuna de fita DNAfigase Une segmentos de DNA
do primer estiver simples {DNA ONA)
condufda, a DNA Figura 7.21 Prinapais proteínas da replicaçào do DNA e
ligase substitui a
pol I nas lacunas
-GGAT seus papéis.

DNA- RNA de fita

.. tetiza a fita -l íder e a outra, a fita atrasada. Cada complexo
simples e. -CCTAGACG de replLssomo executa a replicaçào da fita - líder e da fita

_ ^
DNA ligase atrasada, simultaneamente. O replissomo também inclui
pol 1 e ligase, bem como muitos outros componentes
0 catalisa a G G A r aTfiCGG
que, coletivamente, executam a replicaçào do DNA.
formação de uma
liga ção fosfodiéster A própria holoenzima DNA pol III contém 11 su-
para unir os
fragmentos de -
.CCTAGACfiCCT , bunidades proteicas. As duas polimerases principais da
pol III sào amarradas a uma cópia diferente da proteína
Okazaki.
r (tau ) (Figura 7.22). As proteí nas T sào unidas a um com -
Figura 7.20 Remoção e substituição dos nudeotídeos
do primer de RNA ligação dos fragmentos de Okazaki.
plexo de cinco proteínas conhecido como clamp loader
• ( carregador de bra çadeira ). Duas outras proteínas for -
mam o sliding clamp ( braçadeira deslizante ), uma es-
Síntese simultânea das cadeias líder e trutura proteica que pode se fechar em torno do DNA de
fita dupla durante a replicaçào. O sliding clamp, com seu
atrasada diâ metro de aproximadamente 50 A, tem um “ buraco dc
Como vimos, as componentes do replissomo in - rosca ” de aproximadamente 35 A que circunda o DNA
cluem duas holoenzimas DNA pol III, uma das quais sin - ( Figura 7.23a ) .

Polimerase - 1%0 por Arthur Kornberg para explicar a observação ex-
central pol III
Clamp loader
Sliding clomp
Proteí na T
Polimerase - qual um único replissomo consegue prosseguir com a for
central pol III
Figura 7.22 Holoenzima DNA polimerase III O . nas acessórias que operam de maneira rápida e altamente
complexo contém duas enzimas DNA polimerase principais
vinculadas aos bra ços x ( tau ) e ao clamp loader, exibido na
imagem segurando uma estrutura sliding clamp.
Cada sliding clamp aprisiona uma fita- molde de DNA
e se afilia a uma enzima central DNA pol III, prendendo
com firmeza a enzima ao molde para executar a maior
parte da replicação ! Flgura 7.23b ). A braçadeira é a chave
para o alto nível de atividade da enzima. A pol 111 no DNA
sem uma estrutura sliding clamp tem um nível de proces-
samento muito baixo. Quando não há mais moldes dispo-
níveis, a DNA pol III é solta pela estrutura sliding clamp
e substitu ída por DNA pol I que, como vimos, remove os
primers dc RNA e os substitui por DNA.
A Figura Bá sica 7.24 apresenta um modelo de como
a holoenzima DNA pol III coordena a síntese simultânea
( a ) Duas visualiza ções da estrutura sliding clamp
Sliding clamp
75 A
( b ) Opera ção do Sliding damp
Sliding clamp
Fita molde
Direção da replicação
Fita recém-replicada DNA polimerase
Figura 7.2 3 Sliding clamp do DNA. (a) Duas visualizações
da estrutura sliding damp, uma mostrando o clamp e a DNA
polimerase no DNA em perfil (esquerda) e a outra mostrando
o DNA através do “'buraco de rosca" da estrutura sliding damp
(direita ) , (b) O complexo sliding clamp-ONA polimerase tem
uma alta processabí lidade durante a replicação.
Cap í tulo 7 Estrutura e replicação do DNA 243
das fitas líder e atrasada em uma forquilha de replicarão.
A descrição desse modelo foi proposta no início dos anos
perimental de que um único complexo proteico grande
cm cada forquilha dc replicação realiza a rcplicaçào das
duas fitas de DNA. Conhecido como modelo de Kornberg
e também como modelo de “trombone”, ele foi revisado
e atualizado nas décadas seguintes à sua proposição ini
cial. O modelo de trombone retrata a atividade do clamp
-
loader ao proporcionar um mecanismo para a síntese
contínua das regiões da fita -líder e para a captura, síntese
e liberação das regiões da fita atrasada pelos complexos
-
DNA pol \\\ sliding clamp afiliados a cada braço do damp
loader. Esse modelo proporciona um mecanismo pelo
-
quilha de replicação e sintetizar as duas fitas-filhas à me-
dida que avança. Em suma, os replissomos contêm várias
enzimas DNA polimerase e um grande n ú mero de proteí-
coordenada para realizar a síntese do DNA.
As bactérias e eucariotos possuem várias polimcra -
ses para a replicação do DNA (Tabela 7.1 ). Outras po -
limerases estão basicamente envolvidas no reparo das
mutações ou recombinações de DNA. Por exemplo, a £.
coli possui três DNA polimerases que estão envolvidas
principalmente no reparo de mutações, e os eucariotos
possuem oito DNA polimerases envolvidas no reparo
de vários tipos de mutação.
Revisão do DNA
A replicação precisa do DNA é essencial para a sobre -
vivência dos organismos. A introdução de erros em uma
sequência de DNA durante a replicação poderia criar mu
.
tações potencialmente letais Embora às vezes isso acon
-
-
teça, a replicação do DNA é notavelmente precisa e n ão
é uma fonte importante de mutação, em grande parte
porque as DNA polimerases geralmente sào capazes de se
responsabilizar por uma revisão do DNA para se certifi -
Tabela 7.1 Propriedades das DNA polimerases de
replka çáo de bactérias e eucariotos
Polimerase Funções
Polimerases bacter
í anas
Primase Sí ntese do primer de RNA
I Remoção do primer de RNA correçã o de
erros, reparo de mutações
III Replkaçáo do DNA, correção de erros
Polimerases eucariótkas
Q Sí ntese do primer
6 Sí ntese da fita atrasada, correção de erros,
reparo de mutações do DNA
-
Síntese da fita líder, correção de erros, repa -
ro de mutações do DNA
Y Replkaçáo do DNA mitocondrial e reparo
de muta ções
244 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

FIGURA B Á SICA 7.24

Modelo de trombone da replicação do DN A

Fita atrasada Fha atrasada

5' DNA poiimerase 3'
Fragmento 3' da fita atrasada 5'
de Okazaki G |Rta dupla 3'OH Fragmento 3'OH
filha de Okazaki
5'
Primer de RNA ' 5'
SS8 ligada ao DNA
5' SSBliberacla Novo primer de RNA

Duplex parental .f if s Sltding

Primase
Af

DMA helècase
Vx Camp loader
Proteínas T

* •^ 4
Fita-lí der Fita-lí der
DNA polimerase 3' SS8 liberada 3*
da fita-líder 5* l 5*
3'OH
Fita dupla 3'OH
filha
{ l A DNA helicase desnatura a duplex parental e a SSB reveste 0 A primase se liga ao molde da fita atrasada e sintetiza umnovo
.
os moldes da fita líder e da fita atrasada O complexo DNA primer de RNA. A SSB é liberada á frente da síntese da fita líder c da
pol I\ l-shding damp da fita-líder sintetiza a fita-líder fita atrasada e à frente da síntese do primer de RNA.
continuamente. O complexo pol III-sWíngdamp da fita
attasada sintetiza um fragmento de Okazaki.

Fita atrasada

A pol I se liga
aosHdmg ciamp.
DNA ligasc Fita

Primer A pol III é 5' 3‘ OH

de RNA liberada.

A primase Novo primer de RNA

-do sliding damp ^Ç

Transferência
é liberada.
&
C
C

damp loader

C Fita-líder Fita -lí der

C
4» 3' 3'
5' 5'
3'OH 3'OH

A DNA pol III da fita atrasada completa a síntese de um fragmento
.
de Okazaki, sendo liberada pelo sitdrng damp A DNA pol I substitui
a pol III para começar a remoção dopnmer àe RNA e a substituição
dos nudeotideos de RNA por nudeotideos de DNA.
O A DNA ligase une os fragmentos de Okazaki. O damp tooder
coloca uma nova estrutura sMirrg damp perto da
extremidade 3' do primer de RNA na fita atrasada
recentemente iniciada. A DNA pol III da fita atrasada liga-se à
estrutura sliding ciamp e inicia a síntese de um novo
fragmento de Okazaki.

carem de que a replicarão é precisa. Em consequência do
mecanismo de correrão do DNA, as mutarões decorren
tes de erros na replicarão do DNA ocorrem aproximada
mente em um a cada bilhão (1(P) de nudeotídeos na £ coii
do tipo selvagem. Colocando esse número em pcrspectiva,
considere este livro como uma analogia. Ele contém apro-
ximadamente 800 páginas, cada unta delas com aproxima
damente 5 mil “ pedaços" de informarão (letras, pontua
rão, esparos etc.), perfazendo um total de 4 X 10^ pedaros
por livro. Seriam necessários 250 livros, cada um do tama-
nho deste, para equivaler a 10* pedaços de informarão. Se
cada pedaço fosse igual a um nudeotídeo de DNA, a taxa
de erro da replicaçâo do DNA provavelmente seria de um
erro tipográfico em todos os 250 livros!
Essa precisã o extraordiná ria é o trabalho das DNA
polimerases multifuncionais que tê m capacidade não só
para sintetizar o DNA (atividade de polimerase 5' para
3'), mas também para ‘'corrigir os erros" do DNA re-
cém -sintetizado, visando à precisão e remoção dos nu -
cleot í deos erróneos (ver Tabela 7.1 ). Essa capacidade de
correrão de erros reside na atividade de exonudease 3’
para 5' das DNA polimerases capazes de remover parte
da sequência da fita filha recém -constituída.
As polimerases como a pol 111 e a pol I têm estrutura
um pouco parecida com uma mão aberta: um "polegar ”
e os “dedos” seguram as fitas- molde e filha na " palma",
onde a atividade de polimerase 5‘ para 3’ está centrali
zada [ Figura 7.25 ). Quando ocorre um erro de replicaçâo,
as bases de DNA incompat íveis das fitas- molde e filha
são incapazes de formar pontes de hidrogénio adequa
-
das. Em consequência, a extremidade 3’ OH da fita - filha
fica deslocada, bloqueando a adição posterior de n úcleo -
t ídeos e induzindo a rotação da fita - filha no sítio da exo-
nuclease 3' para 5' na “ base da mão". Vá rios nudeot ídeos,
incluindo o incompatível, sâo removidos da extremidade
3' da fita- filha , após o que essa fita gira de volta para o
sítio da polimerase na palma e a replicaçâo continua.
Como suas contrapartes nas bactérias, as principais po
limerases de replicaçâo do DNA nos eucariotos també m
t êm capacidade de correção de erros para ajudar a asse-
gurar a predsâo da replicaçâo do DNA.
Observa çà o gen é tica A repficação do DNA é executada
pelos complexos de repSssomos localizados em cada forquilha de
replica çâo Os replissomos carregam muitas peoteinas e enzimas
que agem de maneira rá pida e eficiente para sintetizar o DNA
A atividade da DNA polimerase é impulsionada pelas proteínas
da estrutura sMirtg clamp, que prendem a polimerase nas fitas
-molde; essas polimerases são capazes de corrigir erros em seu
trabalho para assegurar a alta fidelidade da replicaçâo do DNA
DNA polimerases eucarióticas
A histó ria evolutiva comum das bactérias e euca
riotos é refletida nas semelhanças gerais de seus me -
canismos de replicaçâo do DNA. Mesmo assim, à me-
dida que os genomas se diferenciaram com o passar do
Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçâo do DNA 245
(a ) Erro da DNA polimerase
- Par de bases
- incompat ível , "Polegar"
Sitio ativo de
polimerase
ilma "
- Fita -filha 5'
- Fita-molde 3'
Sítio ativo de
exonudease
(b ) Remoção do par de bases incompat í vel pela exonudease
A fita-filha gira para fora do
sito da polimerase e para
dentro do sitio de exonucease
ns *
5’
3'
Clivagem de
exonudease
(c ) A fita filha continua a sintese do DNA
-
-
Figura 7.25 Atividade de revisão da DNA
.
polimerase (a ) Erro de replicaçâo pela polimerase. ( b) A
polimerase se desloca no DNA recém - sintetizado para utilizar
sua atividade de exonudease 3' para 5.' (c) A polimerase
- continua a sí ntese 5' para 3.'
tempo, enzimas específicas desenvolveram funções es -
pecializadas que não são compartilhadas pelo outro do-
m ínio. Por exemplo, os eucariotos adquiriram mais de
uma d ú zia de tipos de DNA polimerase no n úcleo. Três
dessas polimerases, a (alfa ), Ô (delta ) e £ ( é psilon ), de-
sempenham papéis centrais na replicaçâo do DNA eu
cariótico. Uma quarta DNA polimerase, y (gama ) , está
-
limitada às mitocò ndrias, onde replica o cromossomo
mitocondrial (ver Tabela 7.1) .
A síntese dos primers de RNA é executada pela DNA
polimerase a , que contém quatro subunidades cujos ta-
manhos variam de 48 quilodá ltons ( kD) a 180 kD. A po-
limerase ô executa a síntese da fita atrasada de DNA e a
polimerase £ executa a síntese da fita- líder de DNA. Cada
uma dessas polimerases interage com uma proteína co-
- nhecida como antígeno nuclear de proliferação celular
(PCNA )f que funciona como sliding clamp na replica-
ção do DNA eucariótico. O complexo DNA polimerase-
-PCNA é reminiscente do complexo DNA pol Ill - holo-
246 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Tabela 7.2 Proteínas e enzimas de repJIcaçfo

cados até suas extremidades! Em vez disso, os cromos -
somos eucarióticos ficam cada vez mais curtos em cada
bactenana e eucarfótlca
ciclo de replicação.
Bactenana Eucariótica Papel Esse defeito aparente no processo de replicação é uma
Topoisomerase Topoisome- Relaxa o superenrola- consequência do fato de um prirner de RNA estar situa-
rase mento do em uma extremidade da fita atrasada e, portanto, não
Helicase ( DnaB) Helicase Desenrola a dupla-hé lice poder ser substituído por DNA. Isso resulta em uma fita
(Mcm ) atrasada mais curta que sua fita- molde, fazendo que o cro-
SSB RPA Impede o reenrolamento mossomo fique mais curto em cada ciclo de replicação ( Fi -
de fitas separadas .
gura 7.26) Como a fita -filha tem falta de nucleotídeos, a
Primase Pr imase Sintetiza os primers de fita parental complementar ( molde) tem uma protuberân -
RNA cia de fita simples correspondente que é facilmente rom-
DNA pol III DNA pol a, Sintetiza o DNA pida. O mesmo destino não recai sobre a fita-líder, que
pol Ô, pol £ pode ser totalmente replicada até sua extremidade.
DNA poli RNaseH Remove e substitui o A perda de DNA em cada ciclo de replicação soa
primer de RNA ameaçadora, mas o problema é solucionado pela pre-
DNA ligase DNA ligase I Une os segmentos de sença , nas extremidades do cromossomo, de sequên -
DNA cias de DNA repetidas, chamadas tclómcros. Estes não
Siiding domp PCNA Liga a poli mera se possuem genes codificadores de proteínas, mas, em vez
disso, sào compostos de repetições que na maioria das
Complexo y RFC Conecta as polimerases,
coordena o cíamp loader vezes consistem em sequências de seis pares de bases
e que sào repetidas centenas ou milhares de vezes para
conferir ao telômero um comprimento de 2 a 20 kb, de-
enzima que encontramos na replicação da £ coli. Assim
pendendo da espécie. Uma vez que suas sequências são
como na replicação da £ coli, a replicação do DNA nos
repetitivas e não contêm informação genética, partes do
eucariotos utiliza a DNA helicase para desenrolar o DNA
telô meros podem ser perdidas sem consequências para
nas origens de replicação e as DNA ligases para unir os
o organismo em cada ciclo de replicação. A eletroforese
fragmentos de Okazaki. No entanto, diferente do cro-
em gel do DNA telomérico documentou o encurtamento
mossomo com sua origem de replicação ú nica na £ coli ,
progressivo do telômero durante a cultura celular.
o genoma eucariótico tem origens inicial e final de repli-
Os telô meros sã o sintetizados pela ribonucleopro-
caçào do DNA. Essa descoberta levanta questões sobre
como a iniciação e a sincronização nessas origens de re
plicação são reguladas. Os pesquisadores identificaram
- teína telomerase, uma combinação de vá rias proteínas
e uma molécula de RNA. A molécula RNA telomerase é
várias proteínas e enzimas de replicação do DNA equiva
lentes pela comparação das bacté rias com os eucariotos
- codificada por um gene distinto e age como molde para
a sequência repetida do DNA telomé rico. Elizabeth
e continuam a abordar questões não resolvidas sobre a Blackburn e Carol Greider descobriram os telômeros
replicação do DNA eucariótico (Tabela 7.2 ). e a telomerase em 1987 e, junto com Jack Szostak, re-
ceberam o Prémio Nobel de Fisiologia ou Medicina de
2009 pelo seu trabalho.
Telômeros
A Figura 7.27 retrata o mecanismo de ação da te-
Os cromossomos lineares, como os dos n úcleos das lomerase deduzido a partir do estudo do protozoá rio
suas células, apresentam um problema peculiar com re- ciliado Tetrahymena. A sequência repetida 5' T T G - -
—
lação à replicação do DNA eles não podem ser repli - GGG 3' é a sequência telomérica repetida caractertstica

Fita parental
Até o Até o
centrômero telômero 3*1
llllllllllllll 5' 3'
lllllllllll 5'
Fita atrasada
Duplex 5 Replicação do DNA Primer de RNA
Protuber â ncia de fita simples
parental 3 llllllllllllllllll deixada pela remoção do
^
X.llllllllllllll
5*1
Fita parental primer de RNA no telômero

llllllllllllll
-
Fita lider
Primer de RNA Primer de RNA removido
e substitu ído por DNA
Figura 7.26 Perda de DNA nos telômeros. As fitas-l íder são sintetizadas até as extremidades dos cromossomos lineares, mas
as fitas atrasadas são encurtadas em cada ciclo de replicação, quando a sequência primer de RN A na extremidade do telômero
da fita- molde é removida.
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 247

O Acoplamento da telomerase
Lacuna deixada
lomerase ), o gene que codifica a telomerase. Esses ca
mundongos mutados homozigotos são relativamente
-
peta remoçào do Telomerase normais quando intercruzados por até três gerações,
prtmerdeR NA
mas são detectados defeitos evolutivos e de fertilidade
na quarta c quinta gerações intereruzadas. A homozi-
DNA gosidade de perda de função do TERT é letal na sétima
- nminiiii '
-.
TTGGGGTTGG âiTTGGGG 3 geração, significando que nenhum camundongo com
0 Prolongamento do DNA
deficiência de TERT pode ser mantido pelo intereruza
mento por mais de seis gerações.
-
-AACCCC | AACCCCAAC
.15' A explicação molecular para o efeito fenotípico retar-
3
TTrmr 5 3
dado da inativação do TERT é que cada geração sucessiva
5* 3' do intereruzamento na linhagem mutada homozigota
- rGGGGI IGGUSTTGGGGTT leva à perda de DNA telomérico. Hoje é evidente que os
Sí ntese do mecanismos genéticos monitoram o comprimento do te-
novo DNA lômero e que esse comprimento é um tipo de cronómetro
0 Translocação da telomerase que acompanha a idade de uma célula. Depois que o en -
-AACCCC
yTTTFfTTs
Aç
*. curtamento alcança um ponto critico, a célula é direcio-
nada para a ria apoptótica, o mecanismo de morte celular
3* programada que remove as células velhas ou danificadas
-TTG66GTTGGGGTTGG

O Prolongamento do DNA
-.AACCCC - AACCCCAAC
5'
-T GGGGTTGGGGTTGGGlTTGGGGTTG
’
Figura 7.27 A telomerase sintetiza a sequência
telom é rica repetida . Telômeros, envelhecimento e câ ncer
do Tetrahymena.O molde de RNA na telomerase do Te-
trahymena contém a repetição AACCCC, utilizada para
prolongar o telômero de uma fita o suficiente para a a
polimerase cucariótica sintetizar mais primers de RNA
(ver Tabela 7.1), permitindo a nova replicaçào do DNA
que pode preencher as extremidades do cromossomo.
Nas décadas após Blackburn e Greider terem iden
tificado a estrutura telomé rica e seu mecanismo de ma -
nutenção, outras sequências teloméncas repetidas si-
milares foram detectadas em todos os eucariotos. Por
exemplo, a sequência telomérica humana repetida é
5' - TTAGGG - 3', que é codificada por uma molécula de
RNA telomérico com a sequência repetida complemen
- - .
tar 3' AAUCCC 5' Em seres humanos, a sequê ncia
telomérica é repetida de 250 a 1.500 vezes nas extremi -
dades cromossómicas. A mesma sequência telomérica e
a sequência -molde do DNA são encontradas em verte-
brados, protozoários (Trypanosoma ), leveduras ( Saccha
romyees ) , fungos ( Neurospora ) e plantas ( Arabidop&is ).
Isso representa um exemplo de evolução convergente das
sequências de DNA. A evolução convergente é um me
canismo que produz traços similares ou, nesse caso, se-
quências de DNA entre organismos pouco relacionados
em razã o da adaptação similar ou pressão seletiva natural.
A importância da atividade de telomerase nas cé-
lulas germinativas foi demonstrada em linhagens de
camundongos experimentais que sofrem muta ção para
se tomarem homozigotos para mutações por perda
de fun ção do gene TERT ( transcriptase reversa da te
de um organismo. Acredita -se que esse fen ómeno seja a
explicação para uma observação antiga na biologia celular
de que a maioria das células normais sobrevive em cultura
entre 30 a 50 divisões celulares antes de entrar em uma
fase de crise, na qual sua divisão primeiro desacelera, de-
pois para totalmente e as células morrem.
Considerando a importâ ncia do comprimento do
tciômcro para a estabilidade cromossô mica, a longevi -
dade celular e o sucesso reprodutivo, você pode se sur-
preender ao aprender que a atividade de telomerase se
limita a apenas alguns tipos de células nos eucariotos. A
telomerase é ativa nas células germinativas, onde atua
para assegurar que os gametas passem por todo o com -
- primento dos cromossomos. A atividade de telomerase
também é detectada em algumas células- tronco, permi -
tindo, assim, que as células se diferenciem dessas célu -
las- tronco para terem cromossomos de comprimento
integral. Por outro lado, a atividade de telomerase é pra
ticamente inexistente nas células somáticas diferencia -
-
- das, os tipos de células que té m ridas finitas e compõem
quase todas as células da maioria dos órgãos e tecidos do
corpo. Nas células somá ticas, os genes responsá veis pela
produ ção da telomerase são desligados e quase nenhuma
atividade de telomerase é detectáveL Isso contribui para
- a vida finita das células somá ticas em cultura celular,
observada pela primeira vez em 1965 por Leonard Hay-
flick, que descobriu que o n úmero de divisões celulares
- das células cultivadas depende da origem das células.
Essa limita ção no crescimento da maioria das células em
cultura é conhecida como limite de Hayflick.
A conexão entre a inatividade de telomerase e o enve-
-
lhecimento normal das células instou os geneticistas a exa
minarem as condições de envelhecimento humano pre-
maturo em busca de evidências de mutações que afetem
a formação dos telômeros ou a atividade de telomerase.
- Pessoas com uma condição conhecida como síndrome
243 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
de Werner (Omim 277700) sofrem embranquecimento
precoce dos cabelos, enrugamento da pele, osteoporose
e vá rias outras alterações associadas a indivíduos várias
décadas mais velhos. Os geneticistas moleculares identi-
ficaram uma mutação do RECQLZ um gene que produz
uma proteína helicase necessá ria para a atividade de te-
lomerase, como a responsável pela síndrome de Werner.
Os pacientes com a síndrome sofrem de instabilidade cro
mossó mica e envelhecimento prematuro em consequên -
cia dos telômeros anormalmente curtos. Na condição
humana chamada disceratose congénita (Omim 305000),
os pacientes têm anomalias de pele e unhas, perda ocasio-
nal da visão e audição e anomalias na produção de célu
las sanguíneas, constituindo causa frequente de morte. O
gene DCK 1 , responsável pela disceratose congénita, afeta
a atividade dos genes responsáveis pelo funcionamento
normal da telomerase. Acredita-se que a atividade de telo-
merase defeituosa e os telômeros encurtados sejam a raiz
da disceratose congé nita. Em contraste com a atividade de
telomerase para manter o comprimento telomérico nor-
mal à medida que os cromossomos sào transmitidos pela
linhagem germinativa , qual é a consequência da reativa
ção anormal da atividade de telomerase em células somá
ticas? Um evento como esse pode levar as células envelhe
cidas a continuarem a proliferar, permitindo que escapem
da morte celular programada pela apoptose. t exatamente
isso que parece ocorrer em muitos tipos de câ ncer, nos
quais mutações reativam a expressão do TERT e rcintro-
duzem a atividade de telomerase em células nas quais o
TERT normalmente é silencioso.
Estudos recentes da expressão genica em células can
cerosas humanas descobriram que as mutações que rea -
tivam o TERT estão entre as mais frequentes em todos
os tipos de câ ncer. Nos câ nceres de órgãos internos, in-
cluindo pulmão, mama, estômago, ovário, rim, bexiga,
ículo e próstata, de 78% a 100% das células can-
ú tero, test
cerosas avançadas exibem evidê ncias de reativação da ati
vidade de telomerase. Isso representa um aumento muito
significativo em relação à taxa de 0 a 3% de reativação da
telomerase nas células somáticas normais. Nas células
cancerosas, a reativação da atividade de telomerase parece
estabilizar o comprimento telomérico, perturbando o pro-
grama normal de encurtamento telomérico progressivo
que levaria à apoptose. Essa vida estendida pode permi
tir que as células afetadas adquiram outras mutações asso-
ciadas ao desenvolvimento e à progressão do câncer.
Observa çã o gen ética Telômeros sáo sequências de
DNA repetidas e acrescentadas âs extremidades dos cromos-
somos lineares por meio da atividade de telomerase, uma ribo-
nixleoproteína que sintetiza os telômeros. A telomerase nor-
malmente é ativa nas células germinativas e inativa nas células
somá ticas. Os telômeros encurtam em cada ciclo de replicação
e esse encurtamento leva à morte celular por apoptose. As mu -
tações da telomerase causam síndromes de envelhecimento
prematuro e a reativa ção aberrante da atividade de telomerase
é comumente encontrada em células cancerosas.
7.5 Os métodos analíticos genéticos
moleculares utilizam o DNA nos
processos de replicação
Os biólogos moleculares utilizaram seu conheci
mento sobre enzimas e processos de replicação do DNA
-
para desenvolver novos métodos de an álise gen ética
- molecular. Dois métodos amplamente utilizados que
foram desenvolvidos diretamente a partir desse conhe-
cimento sào a reação em cadeia da polimerase (PCR ) e o
sequenciamento do DNA por didesoxirribonucleotídeos .
Nesta seção, examinamos esses dois métodos e seu uso
- na decifração da variação do DNA.
Reação em cadeia da polimerase
A reaçã o em cadeia da polimerase ( PCR) é uma
versã o automatizada da replicação do DNA que produz
milhões de cópias de um segmento curto e específico
do DNA a partir de uma min úscula quantidade de DNA
original. Os usos quase ilimitados da PCR na pesquisa
- biológica moderna incluem a coleta de DNA de espé-
cies já extintas para estudos evolutivos; a comparação
- do DNA entre as espécies vivas; aplicações de gen ética
forense, como teste de paternidade, per ícia criminal e
identificação individual; e a produçã o de segmentos dc
DNA para projetos de sequenciamento do genoma .
As reações em cadeia da polimerase são reações de
replicaçã o do DNA in vitro realizadas normal mente em
pequenos volumes de liquido de menos de 100 pl (1/10
- de um mililitro). As reações PCR exigem DNA de fita
dupla contendo a sequência -alvo que deve ser copiada,
um suprimento de quatro de nucleot ídeos de DNA,
uma DNA polimerase termicamente está vel e dois pri-
mers de DNA de fita simples diferentes (descritos a se-
guir ). Esses componentes da PCR são misturados com
- uma solução- tampão no início da reação.
A DNA polimerase utilizada com mais frequência na
PCR chama -se polimerase Taq e foi batizada em referên -
cia à espécie bacteriana termofílica Thermus aquaticus,
que foi colhida pela primeira vez no Parque Nacional de
Yeilowstone. Essa bactéria vive nas fontes termais em
condições de quase ebulição, tendo desenvolvido proteí-
nas termicamente estáveis que permanecem ativas nes
sas temperaturas. A estabilidade térmica da Taq DNA
polimerase é importante para a eficiência da PCR.
A reação PCR em si lembra bastante a replicação do
DNA e, assim como a reação de replicação nas células,
usa duas sequências de DNA diferentes, curtas e de fita
simples, chamadas primers de PCR, para proporcionar
o ponto de partida para a síntese da Taq polimerase. Os
primers de PCR, como os primers de RN A na replicação
celular, geralmente consistem em 12 a 24 nucleotídeos.
Eles formam pares de bases com fitas de DNA diferentes,
ligando-se a lados opostos da região do DNA a ser co-
piada na PCR. Os sítios de ligação dos primers estão nos
limites 5’ e 3' da maioria dos produtos da replicação.
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 249

Reglão-alvo madamente, para permitir a hibridação do primer,

que é a hibridação dos dois primers em sequências
111111111 11 n 1111 ITT 111111 i; n 11111111 complementares que delimitam a sequé ncia -alvo.
ummiHiiiniiiiiiiiumimimn
O Extensã o do primer. A elevação da temperatura da
DNA reação para 72° C permite a extensão do primer,
genômico O Desnaturação do DNA
.iiiiiiiiiuinnniiiiiiiiuiii ”
por aquecimento 95° C)
( durante a qual a Taq DNA polimerase sintetiza o
wwwij 5 DNA , começando na extremidade 3’ de cada pri
mer e levando aproximadamente um minuto para
-
cada mil pares de base sintetizados.
A PCR tem uma enorme variedade de aplicações, mas
O Hibridação do primer também tem limitações, sendo as mais importantes delas
(45°-68° Q (1) a necessidade de algum conhecimento das sequências
Reglão-alvo
necessá rias para os primers e ( 2) o fato de os produtos da
amplificação maiores que 10 a 15 kb serem difíceis de pro-
duzir. Na maioria dos casos, as limitações de tamanho na
PCR restringem seu uso no estudo de segmentos de DNA
Primer A selecionados ou de genes individuais. A necessidade de in -
Primer B formações da sequência do primer pode ser satisfeita pebs
conjecturas informadas a respeito das sequê ncias de pro -
vável ocorrência nos sítios de ligação de primer ou utili -
zando primers de uma espécie para amplificar sequências
O (Extens)ão do primer similares em outra espécie. Por exemplo, um biólogo que
72° C queira estudar a similaridade da sequência de DNA entre
Região-alvo as espécies poderia usar um par de primers que amplificam
um gene da Drosophí la a fim dc examinar o genoma hu-
iimiiiii TTPTT mano quanto a um gene relacionado. Pode haver uma ou
mais incompatibilidades de pares de base entre os primers
DNA recém- sintetizado da Drosophíla e as sequências de DNA humano às quais se
DNA recém- sintetizado ligam, mas as incompatibilidades não precisam impedir a
hibridação do primer se a temperatura de reação da PCR
3' 4
mTTTnTTI m Tf m i!n * i mtrfT
111111111 ir
^
Primeirocldo concluído. Até 35 ddos
! IIIIIMIII
for diminuída durante a etapa 2 da reação. A temperatura
mais baixa pode aumentar a estabilidade da hibridação dos
primers e de suas sequências-alvo o suficiente para permi -
adicioneis dupicam a quant dade oe DNA tir que os primeiros iniciem a amplificação da PCR.
replicado a partir da região alvo em caaa ciclo
A reação em cadeia da polimerase toma prá tico
Figura 7.28 Cklo em três etapas da reação em cadeia da obter grandes quantidades dc DNA a partir de um de-
.
polimerase ( PCR ) terminado gene para an á lise molecular. A técnica da
PCR costuma ser executada cm pequenos tubos pl ás-
As reações em cadeia da polimerase ocorrem como ticos que são especialmente projetados para essa fi-
nalidade e revolucionou muitos aspectos da biologia,
uma série de ciclos de replicaçâo do DNA em três eta - incluindo a genética molecular, a análise do DNA re-
pas que resultam em “amplificação", significando a re - combinante, a genética evolutiva e a biologia forense.
plica çà o em grandes quantidades da sequéncia - alvo do
.
DNA ( Figura 7.28 ) Cada etapa de um ciclo tí pico da PCR
Separa çá o dos produtos da PCR
dura de 30 segundos a vários minutos, com o n ú mero
t í pico de ciclos variando de 30 a 36. Cada ciclo de PCR O processo da PCR amplifica de maneira seletiva ape
completo duplica o n úmero de cópias da sequência alvo - nas o fragmento de DNA delimitado pelos dois primers.
do DNA, então, começando com uma ú nica có pia da Esses fragmentos amplificados são separados do resto da
sequé ncia -alvo de fita dupla, 30 ciclos de PCR podem
produzir 2®, ou mais de 10 bilhões, de cópias da sequên -
mistura da reação por meio da eletroforese em gel (ver Ca -
pítulo 10) e visualizados pela coloração com EtBr ( brometo
cia-alvo! As etapas de cada ciclo de PCR são: de etídio ). O tamanho dos produtos da PCR é medido em
O Desnaturação. A mistura da reaçã o é aquecida até pares de base, e qualquer variabilidade em seu compri-
aproximadamente 95° C, fazendo que a dupla í f ta mento resulta das diferenças no n úmero de nucleotídeos
do DNA desnature em fitas simples à medida que entre os dois sítios de ligação de primer. Essas diferen ças
as pontes de hidrogénio entre as fitas complemen
tares são rompidas.
- podem ser exploradas na análise genética. Como exem-
plo, vamos examinar uma análise das sequências de DNA
0 Hibridação do primer. A temperatura da reaçào é re- repetidas curtas que frequentemente sào utilizadas como
duzida para um valor entre 45° C e 68" C, aproxi - um tipo de marcador genético. Conhecido como repeti -
250 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

ção em tandem de n úmero variável (VNTR ), esse tipo de (a ) Cada alelo produz um fragmento de PCR de comprimento diferente.
marcador contém sequências de DNA repetidas de uma Alelo VNTRs Cada boco
extremidade a outra que possuem, cada uma, até 20 pares Primer A numerado
de base de comprimento. Esses tipos de marcadores gené- representa Lma
ticos também são conhecidos como polimorfismos curtos V, I 1 I 2 repetição de uma
repetidos em tandem (STRPs). sequência de DMA
curta.
A Figura 7.29a mostra quatro alelos VNTR hipoté
ticos [ Vj a V 4 ) que poderiam ser encontrados em uma
- Primer A
Primer B
V, nnnnnnii
população. Os alelos diferem quanto ao n úmero de repe - Primer A
tições da sequência de DNA que carregam. As repetições
Primer B
estão numeradas consecutivamente na figura. Os primers
de PCR ligam -se às mesmas sequências para cada alelo.
V* nonnononn
Os primers ligam - se fora da região de repetição, então Primer A
Primer B
a amplificação de cada alelo produz um fragmento de
DNA de tamanho característico que é determinado pelo iiiiuniiniinnruiiEi
n úmero de repetições do DNA que o alelo contém.
Existem quatro alelos VNTR para esse gene e 10 ge - (b) Padrões de banda do VNTR
Primer B
n ótipos possí veis. Na Figura 7.29 b, a eletroforese em gel Genótipo
das faixas do fragmento de DNA amplificado pela PCR
tem um n ú mero de faixas e uma composição caracter ís-
nV ,VinV'V, -W ,nV V ' 4 nW ,- V,V ,nW nW ,- V ,V -W
4 4 4

ticos. Cada genótipo homozigoto tem uma única faixa

e cada genó tipo heterozigoto tem duas faixas. As faixas
12 -
são identificadas por seu n úmero de repetições.
9 -
A herança dos alelos VNTR segue um padrão co
dominante, no qual ambos os alelos são detectados nos
- 7 -
genòtipos heterozigotos ( Figura 7.29c ). Nessa fam ília ,
cada progenitor transmite um alelo a cada filho e, em
(c) Herança da varia ção do VNTR
consequência dos genòtipos heterozigotos diferentes
- • Or 2

VtV, ^
dos progenitores, cada alelo em um filho pode ser reme
tido a um dos pais. v,v 4

Observa çã o gen é tica A reação em cadeia da polime -

II
rase (PCR ) produz grandes quantidades da sequência copiada
de determinados genes em uma pequena reação de replka- .
v v, vtv4 vtv vyt

.
4

ção do DNA in vitro. 0 DNA gerado pela PCR é utilizado em
vá rias aná lises genéticas moleculares.
Sequenciamento de DNA pelo método de
didesoxirribonudeotídeos
A descrição definitiva de qualquer molécula de DNA
consiste em sua sequência precisa de bases. Essa sequê n -
cia contém não só os códons dos genes que podem ser
transcritos e traduzidos em proteínas, mas também
todas as informações necessárias para expressar e regu
lar os genes e para a replicação do próprio DNA. As tec-
- sequências de DNA repetidas e idênticas, ( b) Dez genòtipos
nologias de sequenciamento do DNA revolucionaram
a biologia disponibilizando facilmente as informações
de sua sequência. Embora as implicações para a biolo-
gia molecular e a gen ética sejam óbvias, a tecnologia de
sequenciamento do DNA também encontrou amplas
aplica ções na agricultura , medicina e biologia evolutiva.
As tecnologias de sequenciamento do DNA mudaram
rapidamente à medida que a tecnologia laboratorial e a
tecnologia computacional combinaram -se para tomar o
sequenciamento mais rá pido c barato em várias ordens
de grandeza. Um objetivo de longo prazo da cié nda ge-
M F2 IM IF2 IF3 „ 114
n n n
V« -
V, -
V ,-
F ig ura 7.29 Amplificação da PCR dos alelos com repetição
em tandem de n ú mero variá vel (VNTR) (a ) Quatro alelos .
VNTR (V, a V ) sáo caracterizados por diferentes n ú meros de
VTNR são possíveis no gene, cada um possuindo um padrão
exclusivo de tamanhos de fragmento da PCR. Uma banda é
observada para cada genótipo homozigoto e duas bandas para
cada genótipo heterozigoto. (c) A transmissão hereditá ria dos
alelos VNTR segue um padrão codominante.
n òmica é o "genoma de mil d ólares ” um termo que
significa o desenvolvimento de tecnologias moleculares
—
e computacionais capazes de produzir sequências genò-
micas individuais completas para cada um de nós por
aproximadamente mil dólares cada uma. Em 2010, dois
grupos de pesquisa independentes deram um grande
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 251

passo na direção desse objetivo realizando os primeiros

projetos concebidos para sequenciar completamente
•
( )
Estrutura química
o genoma de uma única pessoa . O custo foi de aproxi - 0 O O
madamente 50 mil dólares, muitas vezes menor que os
milhões necessários para produzir o esboço do genoma
humano no ano 2000. Os avanços no sequenciamento
-o — P
o-
O P
o-
O

/
II
P
o
— cr
Base
nitrogenada
gen òmico devem continuar inabalá veis e o custo vai
continuar a cair. É provável que durante sua vida você
ainda tenha a oportunidade de ter seu próprio genoma Reage para fo mar a
ligação fosfodiéster.
- OH H
sequenciado. Na verdade, vocé poderia ser até mesmo
uma dessas pessoas que fazem o sequenciamento! Desoxlnudeot
í deo trifosfato (dNTP )
Os primeiros protocolos de sequenciamento do
DNA foram desenvolvidos em 1977, um por Allan
Maxam e Walter Gilbert e outro por Fred Sanger Dos .
dois métodos, o de Sanger era mais condizente com a au
tomação e é a base do desenvolvimento das abordagens
- Base
nitrogenada

de alto rendimento para o sequenciamento do genoma, Nenhum grupo hidroxila;

que é o m étodo preferido hoje. Esses tipos de marcadores não consegje formar
ligação fosfodiêster
genéticos também são conhecidos como polimorfismos
curtos repetidos em tandem (STRPs). Aqui, descrevemos DídesoxinucJeotldeo trifosfato (ddNTP)
a técnica de sequenciamento do DNA pelo método dide- (b )
soxi de Sanger. Os Capí tulos 16 e 18 discutem os avanços
mais recentes no sequenciamento do DNA.
O sequenciamento do DNA pelo método de di -
desoxi nucleotideos
— — sequenciamento didesoxi , para
abreviar é o método de replicaçáo de DNA dc Sanger.
Ele se baseia nas reações de replicaçáo do DNA celular e
usa a DNA polimerase para replicar o novo DNA a partir
de um molde de fita simples (a fita a ser sequenciada ), co-
meçando em uma sequência primer acoplada â fita molde.
Nas reações de sequenciamento didesoxi, os quatro com -
ponentes desoxinucleotídeo (dNTP) padrão do DNA são
misturados em grande quantidade com volumes pequenos
de um didesoxinudeot ídeo trifosfato ( ddNTP). Os dide-
soxinudeotídcos diferem dos dcsoxinudeotídeos pela au -
sência de dois á tomos de oxigénio ( didesoxi significa “dois
O

sítios desoxigenados") em vez do sítio usual desoxigenado.

Enquanto os dNTPs são desoxigenados no carbono 2’
JÍTTP

-
JVííJ ptii
DHA poè ietace

e tê m um grupo hidroxila (OH) no carbono 3', os ddNTPs CM ,

rtrtp&tçho áo OdKTT14
té m á tomos de hidrogénio (H) em vez de grupos hidro- i na rwçáo de
* ctçfto de
xila em 2' e carbonos 3‘ (Figura 7.30a). A ausência de um caco* que para a

grupo hidroxila no carbono 3' no ddNTP impede que ele

forme uma ligação fosfodiêster para prolongar uma fita de
DNA. A incorporação de um ddNTP pela DNA polime
rase em uma fita em crescimento é um evento terminador
- Figura 7.30 Nucleotideos utilizados nas reações de
de cadeia que bloqueia o prolongamento posterior da fita
(Figura 7.30b ), Portanto, o sequenciamento didesoxi pro-
duz uma grande quantidade de produtos pardais da repli -
caçâo, cada um deles terminado pela incorporação de um
ddNTP em um sítio diferente na sequência.
Na preparação para o sequenciamento didesoxi ,
muitas cópias do fragmento de DNA a ser sequenciado
são obtidas na forma de fita simples, normalmente des -
naturando o DNA de fita dupla. Amostras do fragmento
sào colocadas em quatro reações de replicaçáo paralelas.
Cada mistura da reação contém um primer dc DNA de
fita simples, DNA polimerase, grandes quantidades de
cada um dos quatro nucleotideos padrão ( dATP, dGTP,
9
sequenciamento do DNA. (a ) Os didesoxinudeotídeos
(ddNTPs) são desoxigenados nos carbonos 2' e 3' e
nã o podem ser utilizados para prolongar o DNA. (b) A
Incorporação de um didesoxinudeotídeo de dtoslna (ddCTP)
termina a reaçã o de replica çáo.
dCTP e dTTP) e uma pequena quantidade de um di -
desoxinudeotídeo, o da adenina (ddATP), da timina
(ddTTP), da citosina (ddCTP ) ou da guanina ( ddGTP).
As quatro reações paralelas de sequenciamento do
DNA exibidas na Figura 7.31 sào utilizadas para sequen -
ciar o fragmento dc DNA exibido no topo da figura. À
medida que cada reação começa, o primer 18- mer de
fita simples liga -se ao molde de DNA. Usando os cinco
 252 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

( a ) Reação ddCTP ( banda 'C*} A incorpora ção do dCTP permite nucleotideos disponíveis em cada reação, a DNA poli -
que a cadeia continue a crescer, mas merase replica o fragmento de DNA adicionando nu -
a incorporação do ddCTP termina o cleotídeos a partir da extremidade 3’-OH do primer. Os
prolongamento da cadeia prí mers utilizados no sequenciamento didesoxi sào mar-
É G '46 KW I f.1 G HPl
. i * G Mi tf
. ,£ 5' cados com fósforo radioativo (**P) ou com um marca-
51i J » fnT TTtmffHl dor fluorescente em suas extremidades 5’ para facilitar a
Tamanho do detecçào dos fragmentos de DNA produzidos na reação
fragmento de sequenciamento. Na Figura 7.31a, a síntese do DNA
sintetizado a partir de uma fita - molde avan ça até a incorporação do
23 51 18- mer A Á TGR ddCTP da mistura da reação terminar o prolongamento
25 5 18- mer A A T G C 6H da cadeia. Alguns fragmentos de replicação incorporam
28 5 18- mer C o ddCTP na primeira oportunidade (o C mais próximo
31 5 'gF
!ll!!fAA i \ 10 da extremidade 3* do primer ) , mas a maioria incorpora o
36 V 18-mer r.T.líHHÍ M.liHn - dCTP nesse sítio e continua a replicação. Alguns desses
Produtos da replicação parcial terminam
fragmentos incorporam o ddCTP na primeira oportuni -
em cada ciiosna da cadeia em virtude da dade e param de replicar, enquanto a maioria dos outros
incorpora ção do ddCTP incorpora o dCTP e continua a replicação. A replicação
avança dessa maneira, parando por alguns fragmentos
( b) Rea ção ddGTP [banda G )
Tamanho do
--
Produtos da
cada vez que uma G aparece na fita - molde e uma C é in -
corporada no fragmento recém -sintetizado. O resultado
fragmento replicação dessa reação é uma série de fragmentos parcialmente re-
sintetizado parcial plicados, cuja replicação é interrompida em cada sítio de
22 51 30 incorporação da C.
24 5 As outras trés misturas de reação contendo ddGTP,
27 5 18 merl A A T G C G C T ddTTP e ddATP também produzem uma série de pro-
32 5 18- mer A A T G C C C T G C A T C dutos da replicação parcial que terminam todos com
35 5 18-mer rHIHWW.IiiHI.I[3 seu ddNTP particular ( Figura 7.31b-d ). No té rmino das
-
--
quatro reações de sequenciamento paralelas, os produ
(c) Reação ddTTP ( banda T) tos do DNA da replicação parcial ocorrerão para cada
Tamanho do Produtos da nucleotideo no molde.
fragmento
sintetizado
replicação
parcial
Após a conclusão das reações de replicação, o con -
teúdo de cada reação é carregado em vias separadas
21 5 de uma eletroforese em gel. Após a conclusão da ele-
26 5’ 1 8 mer fT.% f troforese em gel, a sequência de DNA pode ser deter-
30 5 18 mer minada examinando os produtos da replica ção de ta-
33 5' j j
£2S» 22í222£Ll 2íí
!
5 ' 18-mer r.T.lfWWfW.imf.W T
manhos diferentes espalhados pelas quatro vias de gel.
38
^ As faixas exibidas na Figura 7.32a são visíveis em uma
autorradiografia porque os primers que começam cada
(d) Reação ddATP ibanda TV) fragmento são rotulados na extremidade. O fragmento
Tamanho do Produtos da mais curto observado está na banda A, indicando que
fragmento replicação
sintetizado pardal o primeiro nucleotideo ddNTP adicionado à extremi -
19 5 ' 18 mor
dade 3' do primer foi o ddATP. O segundo fragmento
mais curto também está na banda A, indicando que as
20 5 18 mor m cadeias às quais o ddATP foi adicionado na segunda
29 51 18 - mer HTI
. í WSBS posição terminaram o prolongamento nesse ponto. O
34 51 18-mer ff.lf HWIWIHl
LE . terceiro fragmento mais curto no gel está na banda T
38 5 is-mer
e o quarto fragmento mais curto nesse exemplo está
Figura 7.31 Reações de sequenciamento do
na banda G. Até agora, a sequ ência de nucleotideos no
DNA. (a ) Uma região-alvo do DNA é localizada pela liga ção
DNA sintetizado é AATG.
Pela continuação desse processo analítico, a sequên -
de um primer de fita simples de 18 nucleotideos ( um •18 - cia de DNA da fita sintetizada é “ lida" no gel no sentido
mer') portador de um marcador 5' Os produtos da replicação
terminada pelo ddCTP possuem, cada um, um comprimento 5' para 3 (o sentido em que uma fita replicada é prolon
J

diferente, (b) Produtos da replica ção terminada pelo ddGTP.
(c ) Produtos da termina ção gerados pek) ddTTP. (d) Produtos
da terminação gerados pelo ddAl P.
-
gada ), como demonstra a Figura 7.32a. A "fita inferida”
é a fita- molde, que é complementar e antiparalela à fita
sequenciada. A Figura 732 b mostra uma autorradiogra -
fia de um gel de sequenciamento didesoxi e também uma
parte da sequ ência lida perto do meio do gel à esquerda.
 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 253

(a) (b)
Banda
Quatro dNTPs 4 quatro ddNTPs
C G T A © Origem
J 3' 5'
A AN Maior
O Combine os dNTPs e os
T T ddNTPs. Cada ddNTP é
C G marcado com
G A fluorescência usando um
A G comprimento de onda
T T diferente em uma ú nica
G A mistura de rea ção.
C G
T T 3-
LA

-
A
C
A
C I
5
G T
T
c
G
? C
T
G
A O Utilize uma ú nica n n
II

$—
banda da eletroforese T
Menor em gel para separar
© todos os fragmentos 6
de DNA. A
SJ T
E Fita Autorradiografia G
-
de um gel de
CL Inferida sequenciamento
5* ;
Fita sequenciada extraída
da autorradiografia
Figura 7.32 Interpretação de um gel de sequenciamento o
.
do DNA ( a ) A replica çá o de cada fragmento termina com Faça uma varredura nos
fragmentos com laser à
a adi ção de um ddNTP. Os nudeot ídeos da 'fita recém- medida que eles passam
slntetizada ’ são lidos na autorradiografia e a polaridade por uma janela e registre ©
5' para 3' da fita corresponde ao sentido do menor para com uma fotocélula.
-
o maior fragmento. A *fita inferida' é a ftta molde, que
Fotocélula
é complementar e antiparalela à "fita sequenciada' .
(b ) Fotografia de um gel de sequenciamento didesoxi .

O sequenciamento didesoxi manual, conforme

descrito anteriormente, é um processo trabalhoso que
hoje foi praticamente suplantado pelo sequenciamento
automatizado e de alto desempenho do DNA e por O Interprete digitalmente a
sequência a partir do
softwares e hardwares poderosos que podem funcionar comprimento de onda das
24 horas por dia , 365 dias por ano e montar a sequên
cia genó mica em uma taxa de 10 mil a 20 mil pares de
- emissões fluorescentes.

A A T G C 6 C T G C A T C G T A C C T A
base por hora! Os sequenciadores automatizados do
DNA usam uma ú nica mistura de reação contendo os
quatro dNTPs e os quatro didesoxinucleot ídeos, com
cada tipo marcado com um composto fluorescente de
comprimento de onda diferente. Uma luz de laser é
utilizada para excitar o marcador fluorescente em cada
fragmento de replicaçáo à medida que ele passa por um
Figura 7.33 Sequenciamento automatizado do DNA. O
determinado ponto na eletroforese em gel e os com - As reações de sequenciamento contêm os quatro dNTPs e os
primentos de onda são registrados por uma fotocélula
quatro ddNTPs. Cada ddNTP é marcado com uma etiqueta
e transmitidos para a memó ria do computador. Var- fluorescente diferente. O Os produtos da replicaçáo são
reduras sucessivas de cada banda do gel de sequencia - separados pela eletroforese em gel e, à medida que cada
mento sào feitas para criar um padrào de fluorescência banda passa por uma janela, um laser excita a etiqueta
acumulado que identifica a sequência de DNA do frag- fluorescente O. A excitação é capturada por uma fotocé lula e
mento (Figura 7.33 ). Descrevemos avanços recentes na o software Interpreta o nudeotideo correspondente e re ú ne
tecnologia de sequenciamento do DNA no Capitulo 18. as Informações da sequência O.
A Análise Genética 7.3 testa sua habilidade de interpre-
tação dos resultados do sequenciamento didesoxi.
254 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

ANÁ LISE GEN ÉTICA

A partir do gel de sequenciamento do DNA peio método didesoxi exibido a seguir, deduza a
sequência e as polaridades das fitas do fragmento de DMA de fita dupla.
ddATP ddGTP ddTTP ddCTP
©

Estrat é gias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Esta questão diz respeito ao sequenciamento de DNA pelo método didesoxi.
este problema e explique a natureza A resposta requer a interpretação de um gel de sequenciamento do DNA para
da resposta solicitada. determinar a sequência de fita dupla de um fragmento de DNA, incluindo as
polaridades das fitas.

.
2 Identifique as informações críticas 2. É exibido um gel de sequenciamento do DNA pek) método didesoxi.
fornecidas no problema.

Deduzir
.
3 Faça uma revisão das etapas essen- 3. A DNA pollmerase incorpora os nucleotídeos em quatro reações paralelas. Cada
ciais do sequenciamento do DNA reação inclui os quatro nucleotídeos do DNA normal (dNTPs) e um didesoxinu-
pelo método didesoxi. deotideo (ddNTP) marcado. A incorporação de um dNTP permite a síntese con
tínua da fita, mas a incorporação de um ddNTP termina a síntese.

• 4. : Examine o gel e identifique o “início* .

4 A extremidade 3' do primer é utilizada para iniciar a síntese do DNA. O primeiro
K da síntese do DNA. nucleotídeo incorporado durante a síntese é a citosina, conforme determinado
pela identificação da localização do menor fragmento sintetizado: a banda “C*.
Dice: Os fragmentes de DKA na direção infe-
.
O segundo e o terceiro nucleotídeos são adenina Os três primeiros nucleotí -
rior do gel <m s perto do polo positivo] sáo mais
* -
deos são, portanto, 5 ' CAA - 3'.
curtos que os fragmentos mais acima no geL A
sequência da fita sintebxada exibida no gel está 5'
na pane inferior e 3’na parte superior.

Solucionar
5. Escreva o resto da sequência (com 5. A fita sintetizada é
a polaridade) da fita sintetizada exi - - -
5' [ pri»er ] CAATAGCTGAGGAGTCGATTCATGCCGATA 3' - .
bida no gel.
.
6 Determine a sequência e a polari- .
6 A flta-mokle do DNA é
dade da fita-molde utilizada na sín- 3' - GTTATCGACTCCTCAGCTAAGTACGGCTAT - 5 \
tese do DNA.

Para praticar mais, ver Problemas 28, 29, 30 e 34 .

 Cap í tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 255

ESTUDO DE CASO

Uso da PCR e do sequenciamento do DNA para analisar as muta ções da doença de Huntington
Tanto a PCR quanto a aná lise do sequenciamento do doença é heterozigota e carrega um alclo do tipo selvagem
DNA têm sido utilizadas para estudar o gene identificado com menos de 36 repetições da sequência CAG e um alelo
como H D , que sofre mutaçá o na doença dc Huntington .
expandido com mais dc 36 repetições Em contrapartida , os
(Omim 143100). O H D codifica a proteína huntinlina, que c membros da família que não têm a doença sáo homozigotos
expressa nas oé lulas cerebrais e em outras células do corpo. ou heterozigotos para os alelos com menos de 36 repetições
A função normal da huntintina do tipo selvagem é desco- CAG. Esse e outros mé todos moleculares similares sáo utili-
nhecida, mas ela interage com dezenas de outras proteí- zados para avaliar o n ú mero de repetições CAG no H D para
.
nas Na forma mutada , a huntintina parece agregar consigo o teste gené tico pré-sintomá tico das pessoas cm risco dc
mesma c com outras proteínas, precipitando a morte dos herdar a doença de Huntington.
neurôoios cerebrais que leva a anomalias motoras perda
—
progressiva do controle motor pc-lo movimento involunt á rio
Os indivíduos em risco podem ser testados antes de
os sintomas da doença aparecerem e podem ser informa-
—
e incontrolá vel que sáo características da doença.
A doença dc Huntington é um dos vários transtornos
dos se sáo portadores de um alelo do H D expandido. Esses
métodos também podem ser empregados para identificar a
humanos dc repetiçã o dc trinuclcotfdeo provocados por presença de uma expansão CAG do H D nos indivíduos diag -
aumentos no comprimento das seções gênicas contendo re - nosticados com doença de Huntington pelos médicos.
.
petições de ponta a ponta dos três nucleot ídeos A região
trinuclcot ídica CAG do H D que codifica o aminoácido glu- AGCT A G C T
tamina produz um trato poliglutamínico no alelo do tipo
selvagem. O comprimento do trato poliglutamínico é maior
na proteína huntintina mutada em consequê ncia de um n ú-
mero maior de repetições CAG em alelos mutados.
Os genes H D do tipo selvagem variam quanto ao n ú-
mero de repetições CAG. variando de 6 a 28 repetições na po-
pulação geral. Os alelos do H D com 28 a 35 repetições CAG
não provocam a doença, mas, em consequência do maior
.
n úmero de CAG os alelos sáo instá veis e propensos ã expan-
são posterior. Os alelos que possuem 36 a 40 repetições CAG
-
expandiram se além da faixa normal e a prote ína huntintina
produzida por esses alelos pode sc comportar de modo anor
mal c resultar em sintomas da doença que exibem pcnctrâ n-
-
cia reduzida. Os indivíduos portadores de 36 a 40 repetições
CAG podem ou n ão desenvolver a doença de Huntington. Região de
repetição CAG
Caso desenvolvam a doença, os sintomas sc manifestam cm
idade tardia e evoluem lentamente. Os indivíduos com alelos
do H D contendo mais dc 40 repetições CAG tê m a doença dc
Huntington que poik se desenvolver a qualquer momento Região de
a partir dos últimos anos da adolescência. A figura 734
mostra a aná lise do sequenciamento do DNA pelo método
didesoxi do segmento de repetição CAG do gene H D para
um alelo do tipo selvagem com 21 repetições CAG c para um
alelo mulado com 48 repetições CAG.
A reação em cadeia da polimerase proporciona um
meio de visualizar a expansã o da repetição tripla CAG e de
acompanhar a transmissão dos alelos nas famílias de pes -
soas com doença dc Huntington. Empregando pol í meros
que sc ligam a lados opostos da região de repetição CAG,
os pesquisadores amplificam os fragmentos do DNA pela
-
PCR e separam nos pela eletroforese em gel. Os sítios de
ligação dos primerx da PCR são idê nticos para lodos os ale-
los, mas são observadas diferen ças nos comprimentos dos
produtos da PCR amplificados cm ra/áo dos diferentes n ú-
meros de repetições CAG entre os sítios de ligação de primtr.
Alelo CAGi, do Alelo CAG,
tipo selvagem mutado
.
Os fragmentos de DNA amplificados contendo os primers F igura 7.34 Sequenciamento do DNA do gene HD pelo
sáo mais curtos sc forem gerados a partir de sequências de método didesoxi . Resultados da eletroforese em gel do
DNA do tipo selvagem do que a partir dos alelos mutados, sequenciamento didesoxi de um alelo do HD do tipo selvagem
pois os alelos do tipo selvagem tê m um n ú mero menor dc com 21 repetições CAG sáo comparados com os resultados de
repetições que os alelos mutados. Na família com doen ça um alelo HD com 48 repetições CAG. Dados provenientes do
de Huntington exibida na Figura 7.35, cada pessoa com a Huntington Disease Collaborative Research Group (1993).
256 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Figura 7.35 Expansão CAG do gene HD detectada
pela análise do Southern blot do DNA amplificado
pela PCR. Cada membro da família representado por
um círculo ou quadrado preenchido tem a doença de
Huntington. A análise da PCR do gene HD revela que cada
pessoa é heterozigota para a doença de Huntington e
portadora de um alelo que produz a doença que tem mais
de 36 repetições CAG. M _ 1-2
100
S -3 45
50 -
~S- c
o
40
- -
36 —
li 30 -
£ 25 -
tf --
20
z 15
RESUMO
7.1 O DNA é a molécula hereditária da vida
Em 1928, F. Griffith determinou que um fator de transfor-
ma ção molecular era responsá vel pela transformação das
bactérias R vivas para uma forma S.
Em 1944, o estudo realizado por 0. Avery, C. Macteod e M. Mc-
-Carty sobre a transformação in vitro provocada por um extrato
de células S identificou o DNA como fator de transformação e o
sugeriu veementemente como o material hereditário
Em 1952, A. Hershey e M. Chase determinaram que o bac-
teriófago T2 usa o DNA. nào as proteínas, para se reprodu-
zir dentro das células hospedeiras da £ coli .
7.2 A dupla-hélice do DNA consiste em duas
cadeias complementares e antiparalelas
Os nucleotídeos do DNA consistem em açúcar desoxirri-
bose de dnco carbonos, um grupo fosfato e uma de quatro
bases de nucleot í deo contendo nitrogénio.
I As bases de nucleotídeo do DNA sào as purinas adenina e
guanina e as pirimidlnas cítoslna e timina.
As ligações fosfodléster formam-se entre os grupos fosfato 5' e
3X)H para unir os nucleotídeos em cadeias polínudeotidicas.
Os pares de base complementares consistem em uma pu-
rina e uma pirimidina. No DNA, A e T formam duas pontes
de hidrogénio estáveis, enquanto G e C formam trés pon-
tes de hidrogénio está veis.
As fitas de ácido nudeico complementares são antiparalelas.
0 empilhamento de pares de base no DNA transmite a
contagem helicoidal do número e repetições triplas que
caracterlzam cada alelo. Isso também provoca a torção que
cria os sulcos maior e menor na fita dupla .
7.3 A replicaçào do DNA é semiconservativa e
bidirecional
A evidência experimental demonstra que a replicaçào do
DNA é semiconservativa, significando que cada molécula-
filha recebe uma fita parental e uma fita recém- sintetizada
que foi produzida usando a fita parental como molde.
2
I
Orfi
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í '
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Faixa de
- tamanhos
dormitado
Faixa de
- tamanhos
normal
A maior parte da replicaçào do DNA é bidirecional. Uma
bolha de replicaçào com forquilhas de replicaçào em cada
extremidade expande-se à medida que a replicaçào avança.
Os genomas bacterianos têm uma única origem de repli-
caçáo, enquanto os genomas eucariòtlcos tém muitas ori-
gens de replicaçào.
As origens de replica çào eucarióticas iniciam-se assincro-
namente durante a fase 05.
A replicaçào do DNA eucariótico produz cromátides irmãs.
7.4 A replicaçào do DNA duplica precisamente o
material gené tico
A replicaçào começa em locais espec íficos que sà o defini-
dos pelas sequências de DNA conservadas e pelas sequên-
cias de DNA de consenso.
A replicaçào do DNA começa com a síntese de um primer
de RNA pela primase, seguida pela síntese das fitas de DNA
líder e atrasada, realizada pela DNA polimerase.
Para concluir a replicaçào, os primers de DNA são removi-
dos pela DNA polimerase e os segmentos de DNA sã o uni-
dos pela DNA ligase.
As DNA polimerases não só replicam o DNA, mas também cor-
rigem erros do DNA recém-sintetizado para obter precisão.
Os cromossomos eucarióticos possuem em suas extremi-
dades sequências repetidas chamadas telômeros, que en
curtam a cada replicaçào nos ciclos celulares somáticos.
A telomerase é uma ribonudeoproteina que sintetiza sequên-
cias teloméricas repetidas para manter o comprimento do te-
lòcnero nas células germinatlvas e nas células- tronco.
7.5 Os métodos analíticos genéticos moleculares
utilizam o DNA nos processos de replicaçào
A reaçáo em cadela da polimerase (PCR) é utilizada para
produzir grandes quantidades de cópias das sequências-
alvo de DNA.
O sequenciamento do DNA pelo método de dldesoxinu-
cleot ídeos é utilizado para determinar a sequência dos
fragmentos de DNA.
 Capí tulo 7 Estrutura e replicaçâo do DNA 257

T E R M O S- C H A V E

Antigeno nuclear de proliferação celular Estrutura 6 (teta) ip. 234)
.
(PCNA) ip 245) Fita atrasada ip. 240 )
Bacteriófagos (fagos) ip 226 ). .
Fita -líder ip 240)
.
Bolha de repíicação ip 235) Forquilha de replicaçâo ip 235 ).
Cktmp loader ip 242 ) . .
Fragmento de Okazaki (p 241 )
Desoxinucleotideos monofosfato .
Helkase ip 239)
(dNMPs) ip 228). .
Origem de replicaçâo ip 233 )
Desoxinudeotideos trifosfato (dNTPs) Primase ip. 239 )
Íp.228) Primer de RNA (p. 240 )
Didesoxinucleotideos trifosfato Primers de PCR ip. 248)
(ddNTPs) ip. 251)
DNA ligase ip. 241 )
.
Primossomo (p 240)
Proteína de ligação de fita simples (SSB)
DNA polimerase (pol I, pol III, atividade (p. 739)
polimerase 5' para 3') ip. 240, 241 ) Reação em cadeia da polimerase (PCR)
DNA superenrolado ip. 239) .
ip 248)
Empilhamento de bases ip.230 ) Replicaçâo bidirecional do DNA (p 235)
Espinha dorsal de açúcar-fosfato ip. 226) Replicaçâo conservativa do DNA ip. 232 )
Replicaçâo dispersiva do DNA ip. 232)
Replkaçào do DNA (semiconservativa,
.
conservativa, dispersiva) ip 232 )
Replicaçâo semiconservativa do DNA
.
ip 232)
.
Replissomo ip 237, 240)
Revisão do DNA (atividade exonuclease
.
3’ para 51) ip 241, 245)
Sequencíamento do DNA didesoxi ip.251 )
.
Sequências de consenso (p 238 )
-
Slldlng damp (antigeno nuclear de proli
.
feração celular [PCNA ]) ip 242 )
Suko maior ip. 230)
Suko menor ip. 230)
Telomerase ip.246)
. Telômero ip. 246)
.
Topolsomerase ip 239 )

PROBLEMAS
Para obter as respostas dos problemas pares .
ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Quais resultados dos experimentos de Frederick Griffith em um duplex são universais para a formação das fitas
forneceram o maior suporte para sua conclusão de que duplas de ácido nudeico. Qual é a base química para essa
um fator de transformação é responsável pela heredita- universalidade?
riedade?
7. Para o seguinte fragmento de DNA, determine o número
2. Explique por que o experimento de transformação in de pontes de hidrogénio e o número de ligações fosfodi-
vitro de Avery, MacLeod e McCarty mostrou que o DNA, éster presentes:
mas não o RNA ou a proteína, é a molécula hereditária . -
5 ’ ACGTAGAGTGCTC 3 * -
3. Hershey e Chase selecionaram o bacteriófagoT2 para seu -
3 * TGCATCTCACGAG 5 * -
experimento de avaliação do papel do DNA na heredita - 8. As Figuras 1.6 e 1.7 apresentam representações simplifi-
riedade porque o T2 contém proteínas e DNA, mas não cadas dos nudeotideos que contêm desoxirribose, uma
RNA.Explique por que oT2 foi uma boa escolha para esse base de nucleotídeo e um grupo fosfato (ver páginas 7 e
experimento. 10). Use esse método simplificado de representação para
4. Explique como o experimento de Hershey e Chase identi -
ilustrar a sequência 3' AGTCGAT 5' e sua parceira -
ficou o DNA como a molécula hereditária . complementar em um DNA duplex.

5. Uma fita do fragmento da fita dupla de DNA tem a sequên-

-
cia 5' ATCGACCTGATC 3 \ - b. Que tipo de ligações une C em uma fita a G na fita
a. Qual é a sequência da outra fita no duplex?
b. Identifique a ligação que une um nucleotídeo ao outro
na fita do DNA.
c. A ligação na parte (b) é covalente ou nào covalente?
d. Quais grupos químicos de nucleotídeos reagem para
formar a ligação na parte (b)?
e. Quais enzimas catalisam a reação na parte (d) ?
f. Identifique a ligação que une uma fita de um DNA du-
plex com a outra fita.
g. A ligação na parte (f) é covalente ou não covalente?
h. Qual termo é utilizado para descrever o padr ão de pa-
reamento de bases entre uma fita do DNA e sua par-
ceira no duplex ?
i. Qual termo é utilizado para descrever a polaridade de
duas fitas de DNA em um duplex ?
6. Os princ ípios do pareamento de bases complementares
e da polaridade antiparalela das fitas de ácido nudeico
a. Que tipo de ligação une C e G dentro de uma fita sim -
ples?
complementar ?
.
c Quantas ligações fosfodiéster estão presentes nesse
DNA duplex ?
d. Quantas pontes de hidrogénio estão presentes nesse
DNA duplex ?
9. Considere a sequência 3' - ACGCTACGTC - 5 ' .
a. Qual é a sequência da fita dupla ?
b. Qual é o número total de ligações covalentes que
unem os nucleotídeos em cada fita?
c Qual é o número total de ligações não covalentes que
unem os nucleotídeos das fitas complementares?
10. A DNA polimerase III é a principal enzima sintetizadora
de DNA nas bactérias. Descreva como ela desempenha
seu papel de prolongar uma fita do DNA.
.
11 Você está participando de um grupo de estudos em
preparo para uma prova de genética, e um membro do
258 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

grupo propòe que cada um de vocês desenhe a estrutura 15. Faça o diagrama de uma forquilha de replicaçâo no DNA
de dois nudeotideos de DNA unidos em uma fita sim- bacteriano e indique as seguintes estruturas ou moléculas .
ples. As figuras são desenhadas e trocadas visando à sua a. DNA pol III
correção. Você recebe o desenho abaixo para corrigir. b. helicase
O c prlmer de RNA
I
O -P - O d. origem de replicaçâo
I e. fita-líder (indique sua polaridade)
-
OH CH C
H
.
f DNA pol I
g. topoisomerase
H h. proteína SSB
H O .
I fita atrasada (Indique sua polaridade)
I .
j primase
I k. fragmento de Okazaki
OH - CH C
16. Quais das seguintes equações são verdadeiras quanto à
H
H porcentagem de nudeotideos no DNA de fita dupla ?
a. (A + G)/(C + T) = 1,0
H O
b. ( A + T)/{G + C) = 1,0
a. Identifique e corrija pelo menos dnco coisas que estáo c (A)/(T) = (G)/(0
erradas na representação de cada nucleotídeo.
b. O que está errado com a maneira como os nudeoti- -
d. (A )/(C) (GV(T)
e. (A)/(T) = (G)/(Q
deos estáo unidos?
c Como você desenharia esse segmento de fita simples? 17. Qual das seguintes igualdades não é verdadeira para o
DNA de fita dupla ?
.
12 Explique como o RNA participa da replicaçâo do DNA.
.
a (G T) = (A + C)
13. Constata-se que uma amostra de DNA de fita dupla con- .
b (G + C) = ( A + T)
tém 20% de citosina. Determine a porcentagem dos ou- c (G + A) = (C + T)
tros trê s nudeotideos de DNA na amostra . 18. Apresente a ordem em que as seguintes proteínas e enzi-
14 . A DNA polimerase I e a DNA polimerase III bacterianas .
mas são ativas na replicaçâo do DNA da E coli : DNA pol I,
desempenham funções diferentes durante a replicaçâo SSB, ligase, helicase, DNA pol III e primase.
do DNA . 19. Dois genomas virais sâo sequenciados e as seguintes
.
a Identifique as funções principais de cada molécula . porcentagens de nudeotideos sâo identificadas:
.
b Se a mutação inativou a DNA polimerase I em uma cepa . .
Genoma 1: A = 28% C = 22% G = 28% T = 22%
de £ coli, a célula seria capaz de replicar seu DNA ? Se for,
que tipo de anomalias vocé esperaria encontrar na célula?
.
f

. .
Genoma 2: A = 22% C = 28% G = 28% T = 22%
Qual é a estrutura do DNA em cada genoma?
c Se uma cepa de £ coli adquiriu uma mutação que inati-
vou a função da DNA polimerase III, a célula seria capaz
de replicar seu DNA ? Explique.

Aplicação e integraçã o

20. Matthew Meselson e Franklin Stahl demonstraram que a
replicaçâo do DNA é semiconservativa nas bactérias Des-
creva resumidamente seu experimento e seus resultados
para dois ciclos de replicaçâo do DNA e identifique como
os modelos alternativos de replicaçâo do DNA foram ex-
cluídos pelos dados.
.
21 Qual é a import ância das estruturas 6 observadas por
John Cairns em seus experimentos na replicaçâo do DNA
bacteriano? O que as estruturas 0 nos dizem sobre o pro-
cesso de replicaçâo do DNA em bactérias ?
22. Joel Huberman e Arthur Riggs usaram a marcação de
pulso para examinar a replicaçâ o do DNA nas células
de mamí feros. Descreva abreviadamente o experi-
mento de Huberman -RIggs e identifique como os re-
sultados excluem um modelo unidirecional de replica-
çâo do DNA.
23. Por que os genomas dos eucariotos, como a Orosophila,
precisam ter várias origens de replicaçâo, enquanto os
.
genomas bacterianos, como os da E coli, têm apenas
uma única origem?
24. A sindrome de Bloom (Omim 210900) é um transtorno
. autossômico recessivo provocado pela mutação de uma
DNA helicase. Entre os principais sintomas da doença
est áo a instabilidade cromossômica e a propensão para
o desenvolvimento de câncer. Explique esses sintomas
com base na mutação da helicase.
25. Em que a replicaçâo por círculos rolantes (ver Capí tulo 6 .
página 189) difere da replicaçâo bidirecional?
.
26 Os telõmeros sâo encontrados nas extremidades dos cro-
mossomos eucarióticos .
.
a Qual é a composição da sequência dos telõmeros?
b. Como a telomerase monta os telõmeros ?
c Qual é o papel funcional dos telõmeros ?
d. Por que a telomerase normalmente é ativa nas células
germmativas, mas nào nas células somáticas ?
.
27 Uma família que consiste em uma mãe (l-l)r um pai (1-2)
e três filhos (11-1, 11- 2 e 11-3) é genotipada pela PCR para
uma região de um autossomo contendo repetições
de uma sequência de 10 pares de bases, A mãe é por-
tadora de 16 repetições em um cromossomo e 21 no

cromossomo homólogo. O pai é portador dos números
de repetições 18 e 26.
a. Seguindo o estilo de ilustração da Figura 7.29c, que
alinha os membros de uma genealogia com seus frag-
mentos de DNA em um gel, desenhe um gel de DNA
contendo os fragmentos da PCR gerados pela ampli-
ficação do DNA dos pais (1-1 e 1-2). Indique o tamanho
de cada fragmento.
b. Identifique todos os possíveis genótipos dos filhos
desse casal especificando os comprimentos dos frag-
mentos da PCR em cada genótipo.
c. Qual termo genético descreve melhor o padrão de he-
rança desse marcador de DNA ? Explique.
28. No experimento de sequenciamento do DNA pelo mé-
todo didesoxi são executadas quatro reações diferentes
para fornecer o material replicado para os géis de sequen
ciamento do DNA. Os produtos da reação normalmente se
situam em bandas de gel diferentes, chamadas A, T, C e G.
a. Identifique os nudeotfdeos utilizados na reação de
sequendamento do DNA pelo método didesoxi que
produz moléculas para a banda A do gel de sequencia-
mento.
b. Qual é o papel desempenhado pela PCR no sequencia
mento do DNA pelo método didesoxi?
c. Por que a incorporação de um didesoxinucleotideo
durante o sequendamento do DNA é identificada
como evento de "terminação da replicaçáo'?
29. O seguinte gel de sequenciamento do DNA pelo método
didesoxi é produzido em um laboratório.
ddATP ddTTP ddCTP ddGTP
n n
© Origem
Qual é a sequência de DNA de dupla fita desta molécula?
Indique a polaridade de cada fita.
30. Usando um estilo de ilustração e indicações similares á s
do Problema 29, desenhe o gel da eletroforese contendo
os fragmentos do sequendamento didesoxi da fita-
-molde de DNA 3' - AGACGATAGCAT - 5' .
.
31 Uma reação de PCR começa com um segmento de fita
dupla do DNA. Quantas cópias da fita dupla estão pre-
sentes após a realização de 10 ciclos de amplificação? E
após 20 ciclos? E após 30 dclos?
Capí tulo 7 Estrutura e replicaçáo do DNA 259
32. A replicaçáo do DNA nos embriões primordiais da Droso-
phila ocorre a cada 5 minutos, aproximadamente O ge- .
noma da Drosophita contém aproximadamente 1,8 X 10a
pares de base. As DNA pdimerases eucarióticas sintetizam
o DNA a uma taxa de aproximadamente 40 nudeotfdeos
por segundo. Aproximadamente quantas origens de repll-
caçào são necessárias para essa taxa de replicaçáo?
33. Trés marcadores miní ssatélite autossômicos que segre-
gam independentemente são utilizados para avaliar a
paternidade de um potro (C) nascido recentemente de
uma égua quarto de -milha (M). Amostras de sangue
são extraídas da égua, do potro e de tr és possí veis ga-
, .
ranhões (S S. e S}) O DNA em cada lócus marcador é
#
amplificado por PCR e é feita uma eletroforese em gel
para cada marcador. As bandas de DNA amplificadas são
visualizadas em cada gel pela coloração com brometo
de etídio. Os resultados do gel s ão exibidos a seguir para
cada marcador.
_ Éç ua.Potro _
n_ r_ nJlr
* Marcador A
Égua Potro
,
n
^ n ** r
*
Marcador B
Si r: n
Marcador C
Avalie os dados e determine se qualquer um dos pos-
sí veis garanhões pode ser excluído. Explique a base de
sua conclusão, se houver, em cada caso.
34. Uma quantidade suficiente de um pequeno fragmento
de DNA está disponí vel para o sequendamento pelo mé-
todo didesoxi. O fragmento a ser sequendado contém
20 nucleotídeos após o sítio de ligação do primer, como
mostra a coluna a seguir .
5* - ATCGCTCGACAGTGACTAGC -[Sitio do pri»er] 3' -
O sequendamento pelo método didesoxi é executado e
os produtos das quatro reações de sequendamento são
separados pela eletroforese em gel. Desenhe as bandas
que vocè espera que apareçam no gel a partir de cada
uma das reações de sequendamento.
 Capítulo Biologia molecular da transcrição

8
APRESENTAÇÃ O
e processamento do RNA

8.1 Os transcritos do RNA transportam as mensagens

dos genes
8.2 A transcriçã o bactéria na é um processo de
quatro estágios
8.3 A transcrição eucariótica usa várias RNA
polimorases
8.4 O processamento pós transcrição modifica as
moléculas de RNA

Fotomicrografia eletrónica dos splkeossomos envolvidos no splidng

intrônko.

PONTOS ESSENCIAIS
I As moléculas dê áddo rfbonudeico (RNA)
são transcritas dos genes e classificadas
como RNA mensageiro ou como um dos vá-
rios tipos de RNA funcional.
I A transcrição bacteriana é um processo de
quatro estágios que começa com o reco-
nhecimento do promotor pela RNA polime-
rase e termina com a finalização da síntese
do transcrita
I Os eucariotos usam diferentes RNA pollme-
rases para transcrever diferentes tipos de
RNA. Cada tipo de polimerase Inkia a trans-
crição em um tipo diferente dc promotor.
I Os RNAs eucarióticos se submetem a três
etapas de processamento após a transcri-
ção. Eventos alternativos durante e após a
transcrição permitem que diferentes trans-
critos e proteínas sejam produzidos a partir
da mesma sequência de DNA.
W ilhelm Johansson introduziu o termo gene em 1909 para
descrever a “unidade fundamental da herança'. A definição
de Johansson abrange a compreensão de que os genes contém in-
formações genéticas e sáo transmitidos de uma geração para ou-
tra e que os genes são a base das propriedades estruturais funcio-
nais, evolutivas e reprodutivas fundamentais dos organismos. Essa
definição básica do gene continua válida nos dias de hoje, mais de
um século após ter sido cunhada; mas o nosso conhecimento da
gené tica molecular se expandiu tremendamente, refinando nossa
compreensão da estrutura e função dos genes e esclarecendo os
papéis que eles desempenham na produção dos traços.
Anteriormente introduzimos o dogma central da biologia, que
descreve o fluxo da informação genética partindo do DNA, passan-
do pelo RNA e chegando à proteína (ver Figura 1.8). Essa fórmula
nos diz que o DNA é o repositório da informação genética, que é
convertida através da transcrição em RNA e depois traduzida em
proteínas. A transcrição é o processo pelo qual as enzimas RNA
polimerase e outras proteínas e enzimas transcricionais usam a fi-
ta-molde do DNA para sintetizar uma fita de RNA complementar.
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA
A tradução é o processo pelo qual o RNA mensageiro é
utilizado para dirigir a sí ntese proteica.
O assunto deste capítulo é a transcriçã o e a produ-
ção de RNA . Esse tópico está fortemente vinculado ao
processo de tradu çã o, que é o assunto do próximo capí
tulo. Como consequência da histó ria evolutiva e da an-
cestralidade comuns de bacté rias, archaea e eucariotos
e do cará ter fundamental da transcrição e da tradu ção
para a expressão gènica, esses processos nas bacté rias
têm uma série de caracter ísticas gerais em comum com
os eucariotos. Por outro lado, as diferen ças entre os
membros desses reinos, incluindo as diferenças nas es-
truturas celular e gênica e a organiza çã o do genoma, le -
vam a diferen ças importantes em como seus genes são
transcritos e traduzidos.
Muitos tipos de RNA sã o introduzidos e descritos
aqui, mas o foco principal da discussão é o RNA mensa -
geiro, a molécula transitória que transporta Informa çã o
genética na forma do código que é traduzido em pro
teínas. A descoberta do RNAm e de seu papel no dog-
ma central levantou muitas questões: como um gene é
reconhecido pelo maquin áí r o da transcriçã o? Onde co-
meça a transcriçã o? Qual fita do DNA é transcrita ? Onde
termina a transcriçã o? Quanto de transcrito é produzi
do? Como o RNA é modificado após a transcri ção? Res-
pondemos a essas perguntas no capítulo e colocamos
as respostas em um contexto que compara e diferencia
o processo de transcrição nos genomas bacterianos e
eucarióticos.
8.1 Os transcritos do RNA transportam
as mensagens dos genes
No final dos anos 1950, com a estrutura do DNA
em mãos, os pesquisadores de biologia molecular con -
centraram -se em identificar e descrever as moléculas e
os mecanismos responsá veis por transmitir a mensa -
gem gen ética do DNA. Sabia -se que o RNA era quimi -
camente similar ao DNA e abundante em todas as célu
las, mas sua diversidade e seus papéis biológicos ainda
não haviam sido descobertos. Alguns papéis eram
veementemente sugeridos pela estrutura celular. Por
exemplo, nas células eucarióticas, o DNA está situado
no n úcleo, enquanto a síntese proteica ocorre no cito-
plasma, sugerindo que o DNA n ã o poderia codificar di -
retamente as proteínas, mas talvez o RNA pudesse. No
entanto, as bactérias nã o tê m n úcleo, ent ã o uma ques-
tão em aberto para a pesquisa era se as bactérias c os
eucariotos usavam mecanismos similares e moléculas
parecidas para transmitir a mensagem genética para a
261
.
síntese proteica Foram feitas pesquisas para identifi -
car os tipos de RNA nas células e os mecanismos pelos
quais a mensagem genética do DNA é transmitida para
a síntese proteica.
- Nucleot ídeos e estrutura do RNA
Tanto o DNA quanto o RNA são moléculas poli-
nudeotfdicas compostas de nucleot ídeos elementares.
Uma diferença importante entre as moléculas é a estru -
tura de fita simples do RNA versus a estrutura de fita
dupla do DNA. A estrutura de fita simples das molécu-
las de RNA pode levá - las a adotar estruturas secundá -
rias dobradas pelo pareamento de bases complemen -
tares dos segmentos da molécula. Em certos casos, as
estruturas secundárias dobradas são essenciais para a
funçã o do RNA , conforme discutimos a seguir.
Os nucleot ídeos do RNA, como os do DNA, são
compostos de um açúcar, uma base nucleotídica e um ou
mais grupos fosfato. Cada nucleotí deo do RNA tem duas
diferenças químicas críticas em comparação com os nu -
cleot ídeos do DNA. A primeira diferença diz respeito à
identidade das bases nudeolídicas do RNA. As purinas
- adenina e guanina no RNA são idê nticas às purinas no
.
DNA. Do mesmo modo a pirimidina citosina é idê ntica
no RNA e no DNA. No entanto, no RNA a segunda pi -
rimidina é a uradia ( U ) cm vez da timina transportada
pelo DNA. Os quatro ribonucleot ídcos do RNA são exi -
.
bidos na Figura 8.1 A estrutura da uracila é similar à da
- timina; mas, perceba , comparando a estrutura da uracila
na Figura 8.1 com a da timina na Figura 7.6, que a timina
tem um grupo metila (CHj) na posição 5 do anel de piri-
midina, enquanto a uracila n ão tem. Em todos os outros
aspectos, a uracila corresponde à timina e, quando a ura-
cila sofre pareamento de bases, sua parceira complemen
tar é a adenina.
-
A segunda diferen ça química entre o RNA e o DNA
é a presença do açúcar ribose no RNA em vez da de -
soxirribose que ocorre no DNA. A ribose confere seu
.
nome ao RNA (ácido ribonucleico) Compare as ma
l éculas de ribose exibidas na Figura 8.1 com as de de
soxirribose na Figura 7.6 e repare que a ribose carrega
-
um grupo hidroxila (OH ) não encontrado na desoxir -
ribose no carbono 2 ' do anel. Exceto por essa diferença,
a ribose e a desoxirribose são idê nticas, tendo uma base
- nucleotídica presa ao carbono 1' e um grupo hidroxila
preso ao carbono 3'.
A semelhan ça entre os açúcares do RNA e do
DNA leva à formação de espinhas dorsais de a çúcar -
- fosfato basicamente idênticas nas moléculas. As fitas
do RNA sã o reunidas pela formaçã o de liga ções fosfo-
- -
diéster, entre o 5'- fosfato de um nucleotídeo e o 3' hi
droxíla do nucleotídeo adjacente, que são idê nticas à s
.
encontradas no DNA ( Figura 8.2 ) O RNA é sintetizado
a partir da fita - molde de DNA usando o mesmo pa
reamento de bases complementares purina - pirimidina
-
descrito para o DNA, exceto quanto ao pareamento
262 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Nucleotideos purina Em 1957, o microbiólogo Elliot Volkin e o geneti-

fosfato Base nudeotídica -
cista Lazarus Astrachan usaram o método pulse chase
para examinar a transcrição nas bactérias imediata -
mente após a infecçào por um bacteriófago. Expondo
-
bactérias recém infectadas à uracila radioativa , eles
observaram a incorporaçã o rá pida do marcador, in -
dicando um surto de atividade transcrirional. Na fase
H H
chase do experimento, quando a uracila radioativa foi
OH
Ribose
OH removida, Volkin e Astrachan constataram que a ra -
dioatividade desapareceu rapidamente, indicando que
Adenosina Guanosina o RNA recém - sintetizado se decompôs rapidamente.
-
5' fnor»ofosfato
(AMP)
-
5 morvofosfato
(GMP)
Eles conclu íram que a síntese de um tipo de RNA com
uma expectativa de vida muito curta era responsá vel
pela produçã o de proteínas do fago que impulsionam o
Nudeotideos pirimidina
avan ço da infecçào.
Fosfato Base nudeot ídica
Experimentos pulse -chase similares logo foram
O - realizados com as células eucarióticas. Nesses expe -
o"\
f rimentos, as células foram pulsadas com uracila ra
dioativa que, depois, foram removidas com uracila n ão
-
radioativa . Imediatamente após o pulso, a radioativi-
dade se concentrou no n ú cleo, indicando que o RNA
recém -sintetizado tem uma localização nuclear. Ao
Ribose
longo de um curto período, a radioatividade migrou

Urtdlna atidina
5'-monofosfato 5'- monofosfato
( UMP) (CMP)
Figura 6 Quatro nudeotfdeos do RNA. Exibidos em sua
forma monofosfato, cada ribonucleot ídeo consiste no açúcar
ribose, um grupo fosfato e uma das bases nucleotfdicas
adenina, guanina, cítosina e uracila.
entre a adenina do DNA e a uracila do RNA. As en
zimas RNA polimerase catalisam a adição de cada
ribonucleotídeo à extremidade 3’ da fita nascente
e formam ligações fosfodiéster entre um grupo tri-
fosfato no carbono 5' de um nucleotídeo e o grupo
hidroxila no carbono 3’ do nucleotídeo adjacente,
eliminando dois fosfatos (o grupo pirofosfato), assim
como na síntese do DNA. Compare a Figura 8.2 com
a Figura 7.7 para verificar a semelhança desses proces
sos de síntese de ácido nucleico.
Identificação do RNA mensageiro
No final dos anos 1950, os pesquisadores usaram a
técnica de pulse-chase ( ver Seção 73) para acompanhar
o rastro do RNA recém -sintetizado nas células euca
rióticas. A etapa pulse dessa técnica expõe as células a
nucleotideos radioativos que se incorporam aos ácidos
nucleicos recé m -sintetizados (ver Capítulo 7). Após um
curto período de incubação para incorporar os nucleo-
tídeos marcados, a etapa chase remove os nucleotideos
radioativos não incorporados, substituindo-os por nu -
cleot ídeos n ão marcados. Ent ã o um pesquisador pode
observar a localização e a movimentação do ácido nu-
cleico marcado a fim de determinar o padrão de sua
movimentação e sua posição e destino definitivos.
para o citoplasma, onde a traduçã o ocorre. A radioati-
vidade se dissipou após persistir no citoplasma por um
período. Esses experimentos levaram os pesquisadores
a concluir que o RNA sintetizado no n úcleo tendia a
agir como um intermediá rio transportando a mensa -
gem gen ética do DNA para o citoplasma para ser tra -
duzida em proteínas.
A descoberta do RN Am culminou em 1961,
- quando um experimento realizado pelos biólogos Syd -
ney Brenner, François Jacob e Matthew Meselson iden
tificou uma forma instá vel do RNA como o mensageiro
-
genético. Brenner e seus colegas conceberam um expe-
rimento usando o bacteriófago T2 e a Escherichia coli
para Investigar se a síntese da proteína do fago requer
ribossomos recém-constru ídos ou se as proteínas do
fago poderiam ser produzidas usando os ribossomos
- bacterianos existentes e uma molécula mensageira
para codificar as proteí nas. O experimento descobriu
-
que o RNA do fago recé m sintetizado se associa com
os ribossomos bacterianos para produzir proteínas do
fago. O RNA que dirigiu a síntese proteica se formou
c degradou rapidamente, levando os pesquisadores a
concluir que um RNA " mensageiro" do fago com uma
- expectativa de vida curta é responsá vel pela sí ntese
proteica durante a infecçào.
Classificação do RNA
Todos os RNAs são transcritos a partir de genes
codificadores de RNA. Os diferentes tipos de RNA são
construídos a partir dos mesmos elementos básicos,
mas desempenham uma série de papéis nas células.
Com base nesses diferentes papéis, os RNAs são divi
didos em duas categorias gerais RNA mensageiro e
-
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA
(«)
Fí ta- mokie do DNA
I Rta do transcrito de RNA 0 I OH
Ligação fosfodiéster =- P 0
^ r,XH
CH
o Grupo pirofosfato
rtJTP recrutada peia I (descartado)
RNA poímerase
o = p -cr
0
0 =
cr
Trifosfato
Figura 8.2 Sí ntese do RNA .
.
RNA funcional Os genes que transcrevem o RNA men -
sageiro ( RNAm ) são os genes produtores de proteínas
e seus transcritos dirigem a síntese proteica pelo pro-
cesso de tradu ção. O RNA mensageiro é a forma inter-
mediá ria de vida curta do RNA que transmite a men-
sagem genética do DNA para os ribossomos visando à
tradução. O RNA mensageiro é a única forma de RNA
.
que sofre tradu ção A transcrição do RNAm e o proces
samento pós - transcrição do RNAm são as principais
áreas de foco neste capítulo.
Os RN As funcionais desempenham uma série de
papéis especializados na célula. Eles executam suas ati
vidades na forma de ácido nucleico e n âo são traduzi
dos. Duas categorias importantes de RNA funcional são
ativas na tradução bacteriana e eucariótica. O RNA de
transferência ou transportador ( RNAt) é codificado
em dezenas de formas diferentes em todos os genomas.
Cada RNAt é responsável por se ligar a um determi
nado aminoácido que ele conduz até o ribossomo. Ali
o RNAt interage com o RNAm e deposita seu amino-
ácido para inclusão na cadeia proteica em crescimento.
O RNA ribossômico ( RNAr ) se combina com muitas
( b)
Fita-molde do DMA
Fita do transcrito de RNA Nova liga ção
fosfodiéster
proteínas para formar o ribossomo, o maquinário mo-
lecular responsável pela tradução. Certas moléculas de
RNAr bacteriano interagem com o RNAm para iniciar
a tradu ção. (Os papéis do RNAt e do RNAr na tradu ção
são tratados no Capí tulo 9.)
Três outros tipos de RNA funcional desempenham
funções especializadas apenas nas células cucarióticas.
- O pequeno RNA nuclear ( RNAsn ) de vá rios tipos é en -
contrado no n úcleo das células eucarióticas, onde par
ticipa do processamento do RNAm. Certos RNAsn se
-
unem com proteínas nucleares para formar complexos
- ribonucleoproteicos que sã o responsáveis pela remoção
- intrônica. Discutimos essas atividades em seções pos-
teriores deste capítulo. O RNAmkro (RNAmi)v uma
categoria recentemente reconhecida de RNA regulató-
rio, é ativo nas células vegetais e animais, mas nâo nas
células bacterianas. Os RNAmicros tê m um papel dis-
- seminado e importante na regula ção pós- transcrição do
RNAm, regulando a produção de prote í nas por meio de
um processo chamado interferência por RNA ( ver Ca -
p ítulo 15). Finalmente, o pequeno RNA interferente
( RNAsi) é um tipo especializado de RNA funcional que
264 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
ajuda a proteger os genomas vegetais e animais da pro
dução de vírus e da disseminação de elementos genéti
cos transponíveis dentro do genoma ( ver Capítulo 12)
Por fim, certos RNAs nas células eucarióticas tém
atividade catalí tica. Ao contrá rio do DNA, que é exclu
sivamente um repositório de informaçã o genética , as
moléculas de RNA com atividade catal ítica conseguem
catalisar reaçòes biológicas. Chamados ribozimas, os
RNAs com atividade catal ítica conseguem ativar um
processo identificado como auto- splicing, descrito mais
adiante neste capítulo.
Observa çã o gen é tica Muitos tipos de RNA são trans-
critos nas células. As duas categorias principais são o RNA
mensageiro e o RNA funcional. Os RNAs funcionais desempe-
nham papéis espec í ficos relacionados ã tradução, ao proces-
samento do pré-RNAm ou à regulação da expressão gênica.
Somente RNAm é traduzido . Nas cepas bactcrianas sensíveis à rifampicina ( rif ), a
8.2 A transcrição bacteriana é um
processo de quatro está gios
Transcrição é a síntese de uma molécula de RNA
de fita simples pela RNA polimerase. A polimerase usa
uma fita do DNA, a fita - molde, para montar uma fita
antiparalela complementar de ribonucleotídeos (ver
Figura 1.9). A fita codificadora do DNA, também co-
—
nhecida como fita não molde, é complementar à fita
- molde. O gene ou seja, o trecho de regiòes do DNA
que produz um transcrito de RNA
—
conté m vá rios
segmentos com funções distintas (Figura 8.3 ). O pro
—
motor do gene está imediatamente a montante ou
seja , imediatamente 5’ ao início da transcrição, que é
identificado como correspondente ao nucleot ídeo + 1. A
sequência do promotor é uma sequência de regulação
da transcrição que controla o acesso da RNA polime-
rase ao gene. A região codificadora é a parte do gene
transcrita em RNAm e contém a informação necessá ria
para sintetizar o produto proteico do gene. A regiã o de
terminaçã o é a parte do gene que regula a cessação da
transcrição. A região de terminação está situada ime
diatamente a jusante —ou seja, imediatamente 3’ ao
segmento codificador do gene.
A transcriçã o é compreendida e descrita com mais
clareza nas bactérias e a £ coli é o organismo experi -
mental modelo de onde deriva a maioria das informa -
F í gura â .3 Diagrama r Gene
geral da estrutura gênica e Sequência do
nomenclatura associada. promotor +1
* 7.
DMA
*1
u Inicio da
*A montante*
do gene
- ções sobre a transcrição bacteriana. Nesta seção, exa -
.
- minamos os quatro estágios da transcrição na £ coli
que servem como um modelo geral para transcrição em
todas as bactérias. Também comparamos e diferencia -
- mos a transcrição bacteriana e as atividades de transcri
ção nos genomas eucarióticos. Os estágios essenciais da
-
transcrição na £ coli são ( 1 ) o reconhecimento do pro-
motor, ( 2) a iniciação da cadeia, (3) o prolongamento da
cadeia e (4) a terminação da cadeia.
RNA polimerase bacteriana
Um único tipo de RNA polimerase da £ coli cata -
lisa a transcrição de todos os RNAs. O suporte experi
mental para essa conclusão brota da análise do efeito do
-
antibiótico rifampicina na sí ntese do RNA bacteriano.
A rifampicina inibe a síntese do RNA evitando a forma -
ção da primeira ligação fosfodiéster na cadeia do RNA.
síntese dos três tipos principais de RNA ( RNAm, RNAt
e RNAr) é inibida na presença do antibiótico. Por outro
lado, as bactérias resistentes à rifampicina ( rif ) trans-
crevem ativamente o DNA nos três principais RNAs
quando a rifampicina está presente. A análise molecular
identifica uma única mutação da RNA polimerase nas
cepas rif que lhes permite permanecer com atividade
catalítica quando expostas ao antibiótico. Esse resultado
é coerente com a conclusão de que uma ú nica RNA po-
limerase é ativa na transcrição bacteriana. Estudos mo-
- leculares subsequentes confirmaram a presença de uma
-
ú nica RNA polimerase bacteriana.
A RNA polimerase bacteriana é composta de uma
enzima principal pentà mera ( cinco polipept ídeos ) que se
liga a um sexto polipeptídeo, chamado subunidade sigma
(a ), quando a polimerase se toma ativa. Em sua forma
ativa, a RNA polimerase é descrita como uma holocn -
zima , significando um complexo intacto com plena capa -
cidade enzimática. A figura 8 4 mostra um tipo comum
de subunidade sigma, conhecido como o °, mas existem'
outras subunidades sigma na £ coli.
A enzima principal é grande, pesando aproxima
da mente 390 mil dáltons (390 kD) e consistindo em
-
- duas subunidades a idênticas: uma subunidade cada
das subunidades p e [V e uma subunidade u> (ómega ).
Ela é a porção sintetizadora de RNA da holoenzima
RNA polimerase. Por conta própria , a enzima principal
pode transcrever a sequência da fita - molde de DNA na
sequência de RNA, mas ela é incapaz de se ligar a um
Região de
Região codificadora termina çã o
// “
3'Fita codificadora (nào molde)
5'Fita-molde
transcrição
u Terminação da
transcrição
*A jusante”
do gene
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 265

Enzima principal Subunidade Holoenzima da
da RNA polimerase sigma RNA polimerase
36.5 kD 4 kD 155 kD
151 kD
* 390 kD
de peso
molecular
Dm dos quatro
tiposna £ coA; os
pesos moleculares
Subunidades sigma
alternativas conferem
à holoenzima a
vão de 27 a 70 kD. especificidade para
promotores
^
dlre entes
Figura 8.4 Enzima principal da RNA polimerase
bacterlana mais uma subunidade sigma (o) formam a
holoenzima plenamente ativa.
promotor ou de iniciar a sí ntese do RNA sem uma su
bunidade sigma. A união da subunidade sigma com a
enzima principal para formar uma holoenzima induz
uma mudan ça de conformação no segmento principal
que lhe permite ligar-se especificamente a sequê ncias
de consenso promotoras específicas (definidas a seguir ).
Vá rios tipos de subunidades sigma diferentes, conhe-
cidas como subunidades sigma alternativas, foram
identificados nas bactérias. As subunidades sigma al-
ternativas transmitem tipos diferentes de mudan ças
de conformação à enzima principal que, em cada caso,
permitem que se ligue a diferentes sequê ncias de con
senso promotoras, como discutimos a seguir.
Promotores bacterianos
Um promotor (ou sequência promotora ) é uma se
qu ência de DNA de dupla fita que é o sitio de ligação
da RNA polimerase. Os promotores regulam a trans -
crição, j á que a RNA polimerase náo consegue iniciar
a transcrição sem se ligar à sequência promotora. Os
promotores bacterianos estão situados a uma curta dis -
tâ ncia a montante da sequência codificadora, normal -
mente a alguns nudeotídeos do início da transcrição ( o
nucleotídeo + 1 ). A RNA polimerase é atra ída para os
promotores pela presen ça das sequê ncias de consenso,
regiões curtas de sequências de DNA altamente pare-
cidas e situadas na mesma posição relativa ao início da
transcrição nos diferentes promotores gê meos.
Embora os promotores sejam de dupla fita, as se
quéncias de consenso promotoras são escritas em uma
forma abreviada de fita simples que fornece a sequência
5’- para - 3’ da fita codificadora do DNA ( Figura 8.5 ). Na
posição -10 do promotor da E. coli encontra -se a se-
quê ncia da caixa de Pribnow, ou sequ ência de consenso
-10, consistindo cm 6 pares de bases tendo a sequência
- -
de consenso 5' TATAAT 3'. A caixa de Pribnow é se-
parada por aproximadamente 25 pares de bases de outra
regi ão de 6 pares de bases, a sequ ência de consenso -35,
- -
identificada pelos nudeotídeos 5' TTGACA 3'. As se-
qu ências de nudeotídeos que ocorrem a montante, a ju -
sante e entre essas sequências de consenso sào altamente
variáveis c não contêm outras sequências de consenso.
Desse modo, em um sentido funcional, as sequências de
- consenso -10 ( Pribnow ) c -35 são importantes em razão
de seu conteú do nucleot ídico, sua posição relativa uma à
outra e sua localização relativa ao inicio da transcrição.
Ao contrário das sequências de consenso em si, os nu
deot ídeos entre -10 e -35 sào importantes como espaça-
-
dores entre os elementos de consenso, mas suas sequên -
cias específicas náo são criticas.
A seleçã o natural atuou para reter uma grande se-
melhan ça das sequências nas regiões de consenso e para
reter a posição das regiões de consenso relativas ao in í-
cio da transcrição. A eficácia da evolução para manter
- as sequências de consenso promotoras é ilustrada pela
comparação com as sequ ências entre e em torno de
-10 e -35, que não sào conservadas e exibem variação
considerável. Além disso, o espaçamento entre as se-
qu ências e sua colocação relativa ao nucleotldeo +1 é
- estável. A RNA polimerase é uma grande molécula que
- -
se liga às sequências de consenso 10 e 35 e ocupa o
espaço entre e imediatamente em volta dos sítios. Os
modelos de estrutura cristalina mostram que a enzima
abarca DNA suficiente para lhe permitir entrar em con -
tato com as regiões de consenso promotoras e alcançar
o nucleot ídeo +1. Depois de ligada dessa maneira a um
promotor, a RNA polimerase pode iniciar a transcrição.
A Aná lise Genética 8.1 vai guiá - lo pela identificação das
regiões de consenso promotoras.

Gene
+1
DNA Promotor Região codificadora de RNA
Fita codificadora 5* [ l Éíf.W.IBIf .lf .T.l í U
-
Fita molde 3' [ n r.T.Ufií lDf.Uf.1
Sequência Sequ ê ncia [
n 3P *
dc consenso de consenso » Inicio da Região de
-
35 10 -
(caixa de |
transcrição
Códon
Transcriçã o
Códon
terminação

Pribnow ) i de in ício de parada

RNAm 5 * E
5' UTR
n
3' UTR
Figura 8.5 Estrutura do promotor bacteriano. Duas sequências de consenso promotoras, a caixa de Pribnow em -10 e a
-
sequência 35, são elementos regulatórios do promotor essenciais.
266 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
Sâo exibidas sequências de DNA na região promotora de 10 genes da £ coti As sequências nos .
- -
sítios 35 e 10 estão marcadas por retângulos.
.
a Use a informação de sequência fornecida para deduzir as sequências de consenso - 35 e -10 .
b. Especule sobre os efeitos relativos na transcrição, decorrentes de uma mutação em uma região de
consenso promotora versas uma mutação na sequência entre as regiões de consenso .
Região Região +1
Gene -35 10-
A2 XUi*kA((fX4i[4 n HHiSif .lÍIlCtimUCHÍW
bio f.m.T> [ iniiiiÉiiiinÉ y.T.iÉ<'f !Hiiny.Miiii
|
bis
loc inntl WDH cfv.lá i
locl
leu -
A A A A GjT T G A C A|T C C 6 T T T T T 6 T A T C C A 6 I T A A C T C r A A A A G C - X T T T~
recA --
A A C A q T T G A T A Ç T G T A T G A G C A T A C A G ÍT A T A A T f G C T T C - - Ã ÃC Ã~
'* « • 1 A -v • ? » I J
^ A T a -v
trp
RNAt
XI

Estrat égias de solução Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado
por este problema e explique a
natureza da resposta solicitada.
.
1 A questão diz respeito aos promotores bacterianos. A resposta exige a identificação
das sequências de consenso das regiões -35 e -10 dos promotores e a especulação
sobre as consequências das mutaçóes do promotor.

2. Identifique as informações cri- .

2 O problema fornece informações da sequência promotora para 10 genes da £ coii e
ticas fornecidas no problema. identifica o segmento de cada promotor contendo as regiões -10 e -35.

Deduzir
.
3 Examine as sequências 10 e - . -. -
3 Os sítios 10 e 35 são o local de ligação da RNA polimerase durante a iniciação da
-35 desses promotores e pro- transcrição Conte as quantidades de A, T, C e G em cada posição nas regiões envolvi-
cure padrões comuns a ambas. das por retângulos.
»1 4 ; Urr setjuéncrt te conservo rferv-
-
(
*
tlflca o rvjcleoikfco mais co num em cada
posiçAo em um segmento d OtsK
*
Solucionar Resposta a

.
4 Determine a sequência de con- .
4 No sitio -10, e movendo-se da esquerda para a direita ( na direção + 1), os nucleotideos
-
senso nas regióes 10 e -35. mais comuns em cada posição na região de consenso e a quantidade de vezes que eles
ocorrem nessa posição são
T A T A A T
01(4; Identtfkjo* o nudootkfeo de maior
otoTéncia em cada (toiiçho da «egUo de (9) (9) (6) ( 5) (5) (9)
consenso composta de 6 nodeotiòeos
nesses oenes. No sitio -35, e seguindo da esquerda para a direita (na direção 41), os nucleotideos
mais comuns em cada posição na região consenso e o número de vezes que eles ocor -
rem nessa posição são:
T T G A C A
(8) (9) (8) (6) (6) (6)

Resposta b
.
5 Compare e diferencie os pro- .
5 A mutação em uma sequência de consenso tende a alterar a eficiência com a qual
váveis efeitos das mutaçóes da uma proteí na liga -se ao promotor e a diminuir a quantidade de transcrição gênica .
sequência de consenso com Por outro lado, as mutações entre as sequências de consenso não tendem a alterar a
os das mutaçóes que ocorrem transcrição gênica, pois as sequências nessas regiões Intervenientes não se ligam for-
entre as regiões de consenso. temente à RNA polimerase.

Para praticar mais, ver Problemas 4, 7 e 18 .

 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 267

Iniciação da transcrição
A holoenzima RNA polimerase inicia a transcrição
através de um processo que envolve duas etapas. Na pri
meira etapa, a holoenzima prende se pouco à sequência
-
promotora de dupla fita e depois prende se fortemente
a ela para formar o complexo promotor fechado O Fl -
.
gura 8.6 ) Na segunda etapa, a holoenzima ligada desen -
rola aproximadamente 18 pares de bases de DNA em
-
volta da sequência de consenso 10 para formar o com-
- plexo promotor aberto (O na Figura 8.6). Após a forma -
ção do complexo promotor aberto, a holoenzima avança
a jusante para iniciar a síntese do RNA no nucleotídeo + 1
-
na fita molde de DNA (O na Figura 8.6) .

O A enzima principal da RNA polimerase e Promotor fechado Sitio de inicio

a subunidade sigma ligam se às 1 Sequência de
sequências de consenso r
RNA polimerase Transcrição terminação
promotoras -10 e -35.
Codificadora 5'
Molde 3'

-35 -10

0 O DNA desenrola perto do in ício Sitio de inicio

I
da transcrição
para formar o Sequência de
complexo promotor aberto. Transcrição terminação

Codificadora 5'
Molde 3'

Promotor aberto

Sitio de inicio
O A holoenzima RNA polimerase iniòa a transcrição e 1 Sequência de
+1 Transcrição terminação
começa a sí ntese do RNA. A subunidade sigma se
dissocia logo após a iniciação da transcrição e a enzima
principal cont í nua a transcrição
Codificadora 5'
V
l
Molde 3' 5'

5' 3*
-35 0
RNA

Sítio de inicio
O A enzima principal sintetiza até encontrar a sequência de *
Transcrição
Sequência de
terminação
terminação. À medida quea síntese do RNA avan a a
ç , dupla fita
do DNA desenrola para permitir que a frta-molde dirija a
montagem do RNA. A dupla fita se fecha após a síntese.
Codificadora 5'
Molde 3'
> 5*

3'

Sitio de in ício
0 A transcrição termina na sequência de +1
. Sequê ncia de
terminação e a enzima pnncipal e o terminação
transcrito de RNA são liberados.
Codificadora 5'
Molde 3' 5'

Figura 8.6 Transcri ção bactéria na .

11111 UIII 1111111111 H 111111111111 IIIIIIII 11111111111

Transcrito de RNA

0
268 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Os promotores bacterianos costumam diferir das
sequências de consenso em um ou mais nucleotídeos
e alguns sã o diferentes em vá rios nucleotídeos. Como
ocorre uma variação considerável na sequência de
DNA entre os promotores, é razoá vel perguntar como
a RNA polimerase é capaz de reconhecer os promoto-
res e iniciar de modo confiá vel a síntese do RNA. Para
obter uma resposta, recorremos às subunidades sigma
que conferem ao promotor a capacidade de reconheci
mento e iniciação de cadeia na RNA polimerase.
Quatro unidades sigma alternativas identi íicadas na
£ coli são batizadas de acordo com seu peso molecular
(Tabela 8.1 ). Cada subunidade sigma alternativa leva ao
reconhecimento de um conjunto diferente de sequê n -
- -
cias de consenso 10 e 35 pela holoenzima. Esses di
ferentes elementos de sequência de consenso são en
contrados nos promotores de diferentes tipos de genes;
desse modo, a subunidade sigma á qual ela se acopla
determina os promotores génicos específicos que uma
holoenzima reconhecerá.
A subunidade sigma a70 è a mais comum nas bacté-
rias. Ela reconhece os promotores dos “genes de manu
tenção” ( genes housekeeping), cujos produtos proteicos
são continuamente exigidos pelas células. Pela necessi
dade constante de seus produtos, os genes de manuten
ção são expressos ininterruptamente. As subunidades O54
c o*2 reconhecem os promotores dos genes envolvidos no
metabolismo do nitrogé nio e os genes expressos em res-
posta ao estresse ambiental, como o choque térmico, e são
utilizadas quando a ação desses genes se faz necessária. A
quarta subunidade sigma, o2*, reconhece os promotores
dos genes necessá rios para a quimiotaxia bacteriana ( de-
tccçáo qu ímica c motilidade).
A especificidade de cada tipo de subunidade sigma
para diferentes sequê ncias de consenso promotoras
produz holoenzimas RNA polimerase que têm diferen
tes especificidades de liga ção ao DNA. Os geneticistas
microbianos estimam que cada célula de E coli contém
aproximadamente 3 mil holoenzimas RNA polimerase
em qualquer dado momento e cada um dos quatro tipos
de subunidades sigma é representado em graus diferen -
tes entre elas. Como as subunidades sigma se prendem
e desprendem facilmente das enzimas principais em
resposta a mudanças nas condições ambientais, o or
ganismo é capaz de mudar seus padrões de transcrição
para se ajustar a diferentes condições.
Tabela 8.1 Subunidades sigma da RNA polimerase da Escherkhio coli
Subunidade Peso molecular (dá ltons) Sequ ência de consenso
-35
o" 28 TAAA
o“ 32 CTTGAA
O” 54 CTGGPyAPyPu
o" 70 TTGACA
Prolongamento e terminação da transcrição
Ao chegar ao nucleotideo « 1, a holoenzima começa
a síntese do RNA usando a fita - molde para dirigir a
montagem do RNA. A holoenzima permanece intacta
até os 8 a 10 primeiros nucleot ídeos do RNA terem sido
unidos. Nesse ponto, a subunidade sigma se dissocia
da enzima principal, que continua seu avanço a jusante
(O na Figura 8.6). A subunidade sigma em si continua
- intacta e pode se associar com outra enzima principal
para transcrever outro gene.
O avanço a jusante da enzima principal da RNA
polimerase é acompanhado pelo desenrolamento do
DNA à frente da enzima para manter aproximada -
-
-
mente 18 pares de bases de DNA desenrolados (O na
Figura 8.6). À medida que a RNA polimerase passa,
avan çando a uma taxa aproximada de 40 nucleotídeos
por segundo, a dupla hélice do DNA se forma nova
mente em sua esteira. Quando a transcrição do gene é
-
concluída, a extremidade 5' do RNA esgota a enzima
principal (0 na Figura 8.6).
- O produto final da transcrição é um RNA de fita
-
simples que é complementar e antiparalelo à fita molde
-- de DNA. O transcrito tem a mesma polaridade 5’- para 3'
da fita codificadora de DNA, a fita complementar à fita -
- molde. A fita codificadora e o recém formado transcrito
também têm sequências nucleotídicas idênticas, exceto
quanto à presença da uracila no transcrito em vez da ti -
mina na fita codificadora. Por essa razão, as sequências
-
génicas são escritas na orientação 5’- para -3' com sequên
cias de fita simples baseadas na fita codificadora de DNA.
Isso permite a rá pida identificação da sequência de
RNAm de um gene simplesmente substituindo U por T.
A transcrição gênica não é um evento ocasional e,
logo após uma rodada de transcrição ser iniciada, começa
- uma segunda rodada com nova interação entre a RNA
polimerase e o promotor. Após a dissociação da subuni-
dade sigma e a síntese de 50 a 60 nucleotídeos de RNA
pela enzima principal, uma nova holoenzima pode se ligar
ao promotor e iniciar uma nova rodada de transcrição,
enquanto a primeira enzima principal continua ao longo
do gene. Além disso, se o transcrito em construção for de
RNAm, a extremidade 5’ fica imediatamente disponível
- para começar a tradução. Por outro lado, os transcritos
que são RN As funcionais, como o RNA de transferência
e o RNA ribossómico, precisam aguardar a conclusão da
Função
-10
GCCGATAA Síntese flagelar e quimiotaxia
CCCCATTA Genes do choque térmico
TTGCA Metabolismo do nitrogénio
TATAAT Genes de manutenção
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 269

transcrição antes de sofrerem o dobramento em estrutu

ras secundárias que os habilita para a ação celular.
- Sequência de terminação
Repetição Repetição
—
invertida 1 Invertida 2
5' 7/TTATfctit fctfcAttAAAf At é fi é t GATtt í M j f 3 *

Observa çã o gen é tica A holoenzima RNA polimerase

da Escberichia coii é uma enzima principal de cinco subu -
DNA
3‘ Bl».1ÍÉ nHW<«
7/AAtA é Ufc éSequ | A A A A A A Íií s
ência espa çadora Sequência de
-
nidades com um dos quatro tipos de subunidades sigma poliadenina
que confere a cada polimerase a especificidade para certas O As sequ ências de terminação intrínsecas conté m repetições
sequ ências de consenso de DNA localizadas nas posições invertidas separadas por uma sequência espaçadora e
seguidas por uma sequência de poliadenina .
- -
10 e 35 relativas á posiçã o 41, onde inicia a transcrição. A
ligação da RNA polimerase ao DNA de dupla fita leva ao de -
senrolamento dessa dupla fita, à formação de um complexo
promotor aberto e à iniciação da transcrição.
5 7/ T T A C G C C C GA (fTTvl Cadeia poii-U AJtr
3' 7 / A A r, ç G G G C t GA t, Cr
::
U U A. U C.G C C C
R N A m 5' /11177 i

Mecanismos de terminação da transcrição

O A transcrição da fita-molde forma RNAm.
A terminação da transcrição nas células bacterianas
é sinalizada por uma sequê ncia de terminação de DNA
que normalmente contém uma sequência repetida pro-
duzindo sequências de RNA 3' características. As sequên - S
,
7 / T T A T C 6 C C C G A C T A A A T A C G~G G C Cr
cias de terminação estão a jusante do códon de parada; 3' 7/ A À t A G t S á G C T f i A n T A Y GTCTGj ir
assim, elas são transcritas após a região codificadora do A
C G
RNAm e, portanto, não são traduzidas. Dois mecanismos G C
de terminação da transcrição ocorrem nas bactérias. O MMfei C G
maLs comum é a termina ção intrínseca, um mecanismo O As sequ ências repetidas C G
que depende apenas da ocorrência de sequê ncias repeti - invertidas no transcrito
-
dobram se em uma haste
CG

das especializadas no DNA que induzem a formação no

RNA de uma estrutura secundária que leva à terminação
da transcrição. Mais raramente, a transcrição genica bac
teriana termina por meio do mecanismo de terminação
-
complementar separada
por uma alça de
fita simples.
Ansa -

i.
O
dependente de rho, um mecanismo caracterizado por
uma sequência terminadora diferente e que exige a ação *11' i nHMMty.Wf ÍWiiWTlii t ifci] Cr
de uma proteína especializada , chamada proteína rho. 3' 7 £ 5'
Terminação intrí nseca A maior parte da transcrição
A U U U U U U 3'
bacteriana ocorre exclusivamente como uma consequên
cia das sequências de terminação codificadas no DNA
- c
G
G
C
isto é, peia terminação intr ínseca. As sequências de ter-
O As pontes de hidrogénio C G Transcrito
entre os pares de bases C G de RNA
minação intrínseca têm duas características. A primeira -
A U se rompem, liberando
o transcrito e terminando
C
G, kC
G
é que elas são codificadas por uma sequência de DNA a transcrição.
contendo uma repetição invertida , uma sequência de C
DNA repetida em sentidos opostos, mas com a mesma
polaridade 5’ para 3! A figura 8.7 mostra as sequências
invertidas ( “repetição 1” e “ repetição 2”) em uma sequên - Figura 8.7 A termina ção intrínseca da transcrição é
cia de terminação, separadas por uma curta sequência acionada pela presença de sequéndas de DNA repetidas
espaçadora que não faz parte de nenhuma das duas repe- e invertidas.
tições. A segunda caracter ística das sequências de termi-
nação intrínsecas é uma cadeia de adeninas na fita - molde que a RNA polimerase desacelere e se desestabilize. Além
de DNA que começa na extremidade 5’ na região da re- *
-
disso, a região 3 U A do duplex RNA - DNA contém os
petição 2. A transcrição das repetições invertidas produz menos estáveis dos pares de bases complementares. Juntos,
RNAm com segmentos complementares que são capazes a instabilidade criada pela dcsaceleraçào da RNA polime-
de se dobrar em uma haste de dupla fita terminando com -
rase e os pares de bases U A induzem a RNA polimerase a
uma alça de fita simples. Essa estrutura secundária se liberar o transcrito e a se separar do DNA. Fazendo uma
chama estrutura de haste em alça, também conhecida analogia simples, o comportamento da RNA polimerase
como hairpirt . Uma cadeia de uradias complementares durante a terminação intr ínseca da transcrição é como o de
às adeninas na fita - molde vem imediatamente após a es - um ciclista em baixa velocidade. O momento lento para a
trutura de haste em al ça na extremidade 3' do RNA. frente cria instabilidade c o ciclista acaba perdendo o equi -
A formação de hairpin seguida imediatamente por l íbrio. De modo similar, a RNA polimerase é desestabili -
-
uma sequê ncia poli U perto da extremidade 3’ do RNA faz zada à medida que desacelera quando transcreve as sequén -
270 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
cias repetidas invertidas e cai do DNA quando o transcrito
é liberado onde se formam os pares de bases A - U.
Terminação dependente de rho
nação intr
Ao contrá rio da termi
ínseca mais comum, certos genes bacterianos
requerem a ação da proteína rho ligando- se ao RNAm
nascente e catalisando a separa ção do RNAm em re-
la ção à RN A polimerase para terminar a transcrição.
Os genes cuja transcrição é dependente da rho têm se-
quências de terminação diferentes das sequências dos
genes que utilizam terminação intrínseca. As estruturas
de hairpin costumam se formar como parte integrante
da terminação dependente de rho, mas as sequências
terminadoras dependentes de rho não têm uma cadeia
de resíduos de uracila. Em vez disso, as sequências con -
té m um sido de utilização da rho, ou sítio rut , que é
um trecho de aproximadamente 50 nucleot ídeos rico
em citosina e pobre em guanina .
A proteína rho é composta de seis polipept ídios
idênticos e tem dois domínios funcionais, ambos utili
zados durante o processo de duas etapas da terminaçã o
da transcrição. A primeira etapa é iniciada quando a
proteína rho é ativada por uma molécula de ATP que se
liga a um domínio funcional da rho. A proteína rho ati
vada utiliza seu segundo dom ínio para se ligar ao sítio
rut do transcrito de RN A. Usando a energia derivada do
ATP, a rho se desloca ao longo do RNAm na direção 3',
acabando por alcançar a RNA polimerase que desacele
rou perto de uma sequ ê ncia terminadora. À medida que
a rho se desloca, ela catalisa o rompimento das pontes
de hidrogénio entre o RNAm e a fita - molde do DNA.
O rompimento das pontes libera o transcrito da RNA
polimerase e induz essa polimerase a liberar o DNA.
Observa çã o gen é tica A terminação da transcrição
bacteriana depende da presença de certas sequências de
DNA. Na terminação intr ínseca, as sequê ncias de DNA repe
tidas invertidas, seguidas imediatamente por uma cadeia de
.
adenlnas produzem uma estrutura de halrpln de RNAm se
guida poc uma cadeia pol»-U. Na terminação dependente de
rho, uma proteína rho liga -se ao RNAm e catalisa a liberação
do transcrito da RNA polimerase.
8.3 A transcrição eucariótica usa
vá rias RNA polimerases
A transcrição eucariótica passa pelos mesmos está -
gios da transcrição bacteriana, mas vários fatores tornam
o processo mais complexo. Primeiro, os promotores eu
carióticos e as sequências de consenso são consideravel -
mente mais diversos do que na £ coli , e os eucariotos
têm três RNA polimerases diferentes que reconhecem
promotores diferentes, transcrevem genes diferentes e
produzem RNAs diferentes. Segundo, o aparato mole-
cular montado nos promotores para iniciar e prolongar
a transcrição é mais complexo nos eucariotos. Terceiro,
os genes eucarióticos contêm íntrons e éxons, exigindo
o processamento intensivo pós- transcrição do RNAm.
Finalmente, o DNA eucariótico está permanentemente
associado com uma grande quantidade de prote ínas
- para formar um composto conhecido como crvmatina.
A composição de cromatina dos genomas eucarióticos
afeta a transcrição diretamente. A cromatina desempe -
nha um papel central na regulação da transcrição euca -
r íótica mudando a força de associação da proteína com o
DNA, que pode permitir ou bloquear a RNA polimerase
e o acesso do fator de transcrição aos promotores. Em
capítulos posteriores, discutimos a estrutura de croma -
tina e introduzimos o papel que a cromatina desempe-
nha ao permitir ou bloquear a transcrição (Capitulo 11)
e exploramos o papel funcional da cromatina na regula -
çã o da expressã o gè nica nos eucariotos (Capítulo 15). No
entanto, nesta seção não consideramos o papel da cro-
matina na transcrição; em vez disso, nossa discussão se
limita aos processos moleculares da própria transcrição.
- Polimerases eucarióticas
Três RNA polimerases diferentes transcrevem clas-
ses diferentes de RNA codificadas pelos genomas euca -
- rióticos: a RNA polimerase 1 ( RNA pol 1) transcreve
três genes de RNA ribossòmico, a RNA polimerase II
( RNA pol II ) é responsá vel por transcrever os RNAs
mensageiros que também codificam polipeptideos para
- transcrever a maioria dos genes do pequeno RNA nu
clear e a RNA polimerase III ( RNA pol III ) transcreve
-
todos os genes do RNA de transferê ncia , bem como um
gene do pequeno RNA nuclear e um gene do RNA ri
bossó mico. A RNA pol II e a RNA pol III são responsá
--
veis pela síntese do RNAmi e do RNAsi.
As RNA polimerases eucarióticas compartilham
semelhanças de sequência e função com a RNA poli
merase da £ coli e com a RNA polimerase dos archaea.
-
Cada uma das RNA polimerases eucarióticas contêm
grandes subunidades homólogas às cinco subunida -
des da enzima principal da RNA polimerase da £. coli
- (Tabela 8.2 ). A RNA polimerase dos archaea també m
contém cinco subunidades que tem homologia com as
subunidades da RNA polimerase bacteriana. As RNA
polimerases eucarióticas e archaeais são mais comple -
xas que a RNA polimerase bacteriana pelo fato de con
terem de 6 a II subunidades proteicas adicionais. No
-
entanto, em geral todas as RNA polimerases têm um
formato similar: elas são reminiscentes de uma “ mã o"
com "dedos" proteicos para ajudar a pegar o DNA
'
e com uma " palma " na qual ocorre a polimerização (ver
Figura 7.21). Essas semelhan ças de estrutura e função
- da RNA polimerase são um resultado direto da história
evolutiva comum de bactérias, archaea e eucariotos.
Sequências de consenso para a transcriçã o
da RNA polimerase II
A RNA polimerase U transcreve genes codificado-
res de polipeptideos cm RNAm. Os promotores desses
genes são numerosos e altamente diversificados, com
diferentes tamanhos globais e diferenças no n úmero e
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 271

Tabela B.2 Subunidades proteicas da RNA pollmerase

Núcleo bactériano Núcleo archaeal Núcleos eucarióticos

RNA pol I RNA pol II RNA pol III
V A7A* RPA 1 RPBI RPC1

P B RPA 2 RPB2 RPC2

& D RPC 5 RPB3 RPC 5
a1 L RPC9 RPB11 RPC9
(0 K [+6 subunidades RPB61+9 subunidades RPB6 1+7 subunidades RPB6 [+11 subunidades
adicionais] adicionais] adicionais] adicionais]

no tipo de sequências de consenso proeminentes entre
as fontes de variação do promotor. Dadas essas caracte
rísticas, é razoável perguntar como as RNA polimerases
localizam o DNA do promotor para diferentes genes.
Três linhas de investigação ajudam os pesquisa -
dores a identificar e caracterizar os promotores dos
diferentes genes codificadores de polipept ídeos: ( 1 ) os
promotores são identificados determinando quais se -
quèncias de DNA estão ligadas às proteínas associadas
- à RNA pol II durante a transcrição, (2) as supostas se -
quências promotoras são comparadas para avaliar suas
semelhan ças e (3) as mutações que alteram a transcri -
ção genica são examinadas para identificar como as
mudanças nos pares de bases do DNA afetam a trans-
crição. A Técnica de Pesquisa 8.1 discute a identifica -
ção experimental e a análise dos promotores.

T ÉCNICA DE PESQUISA 8.1

Ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA )

Finalidade A ação funcional dos promotores na transcrição Ensaio de mudança de mobilidade eletroforética
depende das sequências de consenso do DNA que se ligam
à RNA polimerase e às proteínas do fator de transcrição. Para
O Controle G Experimental
localizar os promotores, primeiro os biólogos moleculares 350 pb 350 pb
fazem uma varredura no DNA em busca de possíveis sequên- DNA 1 r
cias de consenso promotoras e depois determinam se a se- Idêntico
quência se liga a proteínas ativas em termos de transcrição. Nenhuma proteína Proteína de transcrição
adicionada ao DNA adicionada ao DNA.
Materiais e procedimentos Fragmentos de DNA contendo
sequências de consenso promotoras suspeitas são examina- 1 1
dos por meio de dois métodos experimentais. O primeiro, cha-
mado ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, identifica
a posição exata da sequência de ligação à proteína. O segundo, DNA
chamado ensaiode proteção da impressão digital do DNA, iden-
tifica a localização exata da sequência de ligação à proteí na.
No ensaio de mudança de mobilidade eletroforética,
Se as sequências de
conspnso promoto
ras estiverem no
- ^35
duas amostras de fragmentos de DNA idênticas, que conte- fragmento de DNA
nham sequências de consenso suspeitas, são analisadas. Uma as proteínas vão se
ligar a elas
amostra de DNA é um controle ao qual as proteínas de trans-
.
crição são adicionadas Tanto a amostra de controle quanto a e
amostra de DNA experimental são submetidas à eletroforese.
A proteção química do DNA footprint também co- §
meça com duas amostras idênticas de fragmentos de
DNA contendo sequências de consenso suspeitas Todos . »
5
os fragmentos são marcados na extremidade com WP O . 9
DNA experimental é misturado com proteínas transcricio-
nais, mas a amostra de controle não. Ambas as amostras
1
A migração mals lena Indica um peso
são expostas à DNase I, que corta aleatoriamente o DNA molecular maior produzido pela
que nã o está protegido por proteina. As amostras são co- ligação das proteínas transcnoonais às
locadas em faixas separadas de uma eletroforese em gel sequências promotoras no DNA
e cada fragmento produzido com extremidade marcada é
identificado por autorradiografia.
Descrição No resultado do ensaio de mudança de mobili -
dade eletrofor ética, repare que a mobilidade eletroforética (continua )
272 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

T É C N I C A D E P E S Q U I S A 8 . 1 continua çã o

do DNA experimental é ma is lenta que a do DNA de controle.
Esse é o resultado previsto se a amostra experimental conti-
ver uma sequência de consenso ligada por proteínas trans-
orlckmals. A proteína ligada aumenta o peso molecular da
amostra experimental e desacelera sua mkjra çAo em relação
ao mesmo DNA sem proteína ligada. No ensaio de proteção
química do DNA footprint, repare que a faixa do DNA expe-
rimental contém uma lacuna na qual nenhum fragmento
de DNA aparece. A lacuna representa "proteção química do
footprinf para a parte do fragmento que está protegida con-
tra a digestã o da DNase I pelas proteínas transcricionais liga-
das. Nenhuma proteção desse tipo ocorre para o fragmento
de controle, que é clivado de modo aleatório.
Conclusão Os resultados desses dois métodos constituem
evidência necessária, porém Insuficiente, de que o frag-
mento de DNA contém um promotor. A evidência final de
que o fragmento de DNA contém um promotor reside na
análise mutacional que identifica as mudanças funcionais
provocadas por mutações de nucleotideos específicos das
sequências de consenso promotoras ( ver Figura 8.11).

Ensaio de proteção quí mica de DNA footprint

O Controle Q Experimental
DNA
idêntico
I
DNA marcado na extremidade com

1
DNA marcado na extremidade

Nenh jma proteína Complexo de proteínas de

adicionada ao DNA transcrição adicionado ao DNA

l
© o
i
DNase I adkrcnada: d-va DNaseIadxtonada cliva
o DNA desprotegido. o DNA desprotegido.

i i
-
inibiu©
I , I
Fragmentos marcados com } P Fragmentos marcados com ”P

l ©
Eletroforese em gel
i
©
:
© ©
© c
© Região protegida por
proteína; possível
região promotora

x> =©
A proténa transcricíonal Igada protege a região
promotora centra a divagem cnamática.
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 273

GC box CAAT box TATA box Figura 8.8 Trés elementos da sequência de
DNA
GGGC GG
*.ni
[ .
I U.T.T. 3' consenso promotora eucariótica. ATATA box
CCCGCC GTTA ATATTT 5' e a CAAT box sã o comuns; a montante GC box é
-9 0 -8 0 -2 5 +1 mais variá vel.

A sequência de consenso promotora eucariótica mais Reconhecimento do promotor

comum, a TATA box , c exibida na Figura 8.8 como parte
integrante de um conjunto de três segmentos de con -
senso que foram os três primeiros elementos promotores
eucarióticos identificados. Uma TATA box, també m co-
nhecida como caixa de Goldberg - Hogness, está situada
-
aproximadamente na posição 25 relativa ao início do
sítio de início da transcriçã o. Consistindo em 6 pares de
bases com a sequência de consenso TATAAA, c o elemento
promotor mais fortemente conservado nos eucariotos. A
figura mostra dois outros elementos de sequência de con -
senso que são mais variáveis em sua frequência nos pro-
motores. Uma sequência de consenso de 4 pares de bases
identificada como CAAT box está mais frequentemente
situada perto da posição -80 quando existe no promotor.
Uma região GC a montante, chamada GC box, com uma
sequência de consenso GGGCGG situada na posição -90
ou mais a montante do in ício da transcrição, tem uma fre-
quência menor que a das sequências da CAAT box.
A comparação dos promotores eucarióticos revela
um alto grau de variabilidade no tipo, n úmero e localiza
ção dos elementos da sequência de consenso ( Figura 8.9).
Alguns promotores contém as trés sequ ências de con -
senso identificadas acima, outros contêm um ou dois des-
ses elementos de consenso, alguns nâo contêm nenhum
deles e muitos contêm outros tipos de elementos de se-
quência de consenso no todo. Por exemplo, o gene timi
dina cinase contém as TATA, CAAT e GC box com uma
sequ ência octamérica (OCT), chamada OCT box. O gene
histona H 2B contém duas OCT boxes além dc uma TATA
box e um par de GC boxes. Cada um desses elementos de
sequ ê ncia de consenso desempenha um papel importante
na ligação dos fatores de transcrição, um grupo de proteí-
nas transericionais descrito a seguir.
Início da transcrição
A RNA polimerase II reconhece e se liga às sequên-
cias de consenso promotoras nos eucariotos com a ajuda
de proteínas chamadas fatores de transcrição ( TF). As
-
prote ínas TF ligam se às sequências regulatórias pro -
motoras e influenciam a iniciação da transcrição intera -
gindo, direta ou indiretamente, com a RNA polimerase.
Os fatores de transcrição que influenciam a transcrição
do RNAm e, portanto, interagem com a RNA pol II re-
cebem a designação TFIL Cada proteína TF1I também
carrega uma designação alfabética, como A, B ou C .
Na maioria dos promotores eucarióticos, a TATA
box é o principal sítio de liga ção dos fatores de trans -
crição durante o reconhecimento do promotor. Na
TATA box, uma proteína chamada TFIID, uma pro-
teí na com várias subunidades contendo a proteína de
-
ligação à TATA ( TBP), liga se à sequê ncia da TATA
box e às subunidades de uma proteína chamada fator
associado à TBP ( TAF). A TFIID montada liga se à -
região da TATA box para formar o complexo com -
- .
prometido inicial ( Figura 8.10 ) Em seguida, a TFIIB,
a TFIIF e a RNA polimerase II unem -se ao complexo
comprometido inicial, formando o complexo de ini
ciaçã o mínimo, que, por sua vez, une-se à TF1IE e à
-
TF11H, formando o complexo de iniciação completo.
- Este contém várias prote í nas identificadas normal
mente como “fatores de transcrição gerais". Depois de
-
montado, o complexo de iniciação completo direciona a
RNA polimerase II para o nucleot ídeo +1 na fita - molde,
onde começa a montagem do RNA mensageiro.
Embora a maioria dos genes eucarióticos exami
nados tenha uma TATA box e se submeta à liga ção da
-
TBP, há evidências de que alguns genes de metazoá
rios podem usar um fator relacionado, chamado TLF
-
(fator similar à TBP, do inglês 7BP- /ikeyàctor ). A com-
plexidade da TBP, do TLF e das prote í nas associadas
é aná loga à dos diferentes fatores sigma em sistemas

5’ vp
-globina
procarióticos, permitindo, assim, o reconhecimento di
ferencial dos promotores em eucariotos.
-
r<

3' Timidina Detecçã o dos elementos de

5* cinase consenso promotores
3’ Histona A diversidade dos promotores eucarióticos levanta
5* H 2 B uma questão importante: como os pesquisadores veri-
i 3' Promotor
ficam se um segmento do DNA é um componente fun -
y inicial SV40 cionalmente importante de um promotor ? A pesquisa
tem dois componentes; o primeiro, descrito na Téc -
-
160 - 120 -80 -40 41 nica de Pesquisa 8.1, é descobrir a presença e a posição
TATA box GC box das sequências de DNA às quais as proteínas do fator de
CAAT box Octamé rica box (OCT) transcrição vão se ligar. O segundo componente envolve
Figura 8.9 Exemplos de variabilidade dos promotores a análise mutacional para confirmar a funcionalidade da
eucarióticos.
274 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O TAF e TBP formam a TFIID e ligam-se à TATA box. sequência. Os pesquisadores produzem muitas mutações
pontuais diferentes na sequência de DNA que está sendo
TBP TFIID
estudada e depois comparam o nível de transcrição ge-
Complexo comprometido rado por cada sequência promotora mutada com a trans-
inicial crição gerada pela sequência do tipo selvagem ( intacta ).
DNA +1
1 A Figura 8.11 mostra uma sinopse da an álise de mu -
l TATAxgjjg) '
l tação no promotor a partir de um experimento realizado
pelo biólogo molecular Richard Myers e seus colegas em
box Complexo de Iniciação m í nimo um promotor do gene da (J - globina nos mamíferos. Esses
pesquisadores produziram mutações de pares de bases
individuais nas sequê ncias das TATA, CAAT e GC boxes
© A adição deTFIIB. RN A polimerase II eTFIIF forma o complexo c nos nudeotideos entre as sequências de consenso para
de iniciação m ínimo.
identificar o efeito de cada mutação no n í vel de transcri -
+ ção relativo do gene. Eles constataram que as mutações de
5' IIF } 3‘ pares de bases em cada uma das três regiões de consenso
3' 5’ diminuíram significativamente o nível de transcrição do
RNA polimerase II gene. Por outro lado, as mutações fora das regiões de con -
senso tiveram efeitos insignificantes no n ível de transcri -
ção. Esses resultados mostram a importâ ncia funcional dc
I
TFIIH unem -se e formam o complexo de
Complexo de inicia çã o completo
sequências de DNA específicas na promoção da transcri-
ção e confirmam um papel funcional na transcrição das
0 A TF1IEçãeoacompleto . sequências das TATA, CAAT e GC boxes.
Inkia

C + Observa çã o gen é tica A RNA polimerase II eucarióttca

IIF
5' /
3'
3'
5*
transcreve genes codificadores de proteína em RNA mensa -
RNA polimerase II geiro. Os fatores de transcrição agregam-se ã TATA box para
preparar um sitio de ligação para a RNA polimerase II. Os ele-
mentos promotores a montante desempenham um papel cru-
L j
T
Fatores de transcrição gerais cial na elevação do nível de transcrição.

0 completo
A RNA polimerase II é liberada do complexo de inicia ção
Ativadores e silenciadores
para começ ar a
transcri çã o .

+
Os promotores sozinhos muitas vezes não são sufi -
cientes para iniciar a transcrição de genes eucarióticos,
3* sendo necessárias outras sequê ncias regulatórias para
RNA
5' acionar a transcrição. Esse é o caso particular de eucario -
polimerase II
tos multicelulares que tê m quantidades e padrões dife -
rentes de genes expressos em diferentes células e tecidos
e que mudam seus padrões de expressão gênica à medida
F i ura 8.10 Transcrição eucariótka pala RNA polimarasa II. que os organismos crescem e se desenvolvem. Esses tipos

4.0 -i F igura 8.11 Análise de mutação do promotor do gene

da fi-globlna. As sequências de consenso funcionais
são identificadas pela detecçáo das mutações em três
I
.2
1
J - regiões contendo as sequências das TATA, CAAT e GC
boxes a montante (sombreadas na figura ) que reduzem

I.-
y i o
substancialmente o n í vel de transcriçã o relativo.

e
1
z

0
-100 -80 -80 -40 -20 1 20
n
01999 AAA
GC box CAAT box -37 TATA box !
— Inicio da
transcrição (+1)
'£ 3'
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA
de regulação da transcrição, específicos do tecido ou evo
lutivos , são plenamente discutidos em capítulos posterio-
res (Capítulos 15 e 20 ), mas aqui destacamos duas cate-
gorias de sequências de regula ção da transcrição do DNA
que levam à expressão diferencial dos genes.
As sequências ativadoras são um grupo impor
tante de sequências regulatórias do DNA que aumen
tam o nível de transcrição de genes específicos. As se
qu ências ativadoras ligam -se a prote í nas específicas que
interagem com as proteínas ligadas aos promotores gê-
nicos e, juntos, os promotores e ativadores acionam a
transcrição de certos genes. Em muitas situações, os ati-
vadores estão situados a montante dos genes que regu
lam; mas os ativadores podem estar situados a jusante
també m. Alguns ativadores estão relativamente pró xi
mos dos genes que regulam, mas outros estão a milha
res ou dezenas de milhares de pares de bases distantes
de seus genes-alvo. Desse modo, é importante que os
biólogos saibam quais são as prote í nas ligadas aos ativa -
dores e como as sequências ativadoras regulam a trans-
crição do gene, considerando suas diferentes distâ ncias
em relação ao início da transcriçã o.
As respostas são que os ativadores ligam se às pro
te ínas ativadoras e às proteínas coativadoras associadas,
formando uma "ponte" que dobra o DNA e liga o com
plexo de iniciação completo no promotor ao complexo
ativador-coativador no ativador ( Figura 8.12). A dobra
produzida no DNA pode conter dezenas até milhares de
pares de bases. A ação dos ativadores e das proteínas que
ligam aumenta radicalmente a eficiência da RNA pol II na
iniciação da transcrição e, consequentemente, aumenta o
nível de transcrição dos genes regulados pelos ativadores.
No outro lado do espectro de regulação da trans -
crição estão as sequências silenciadoras, elementos de
DNA que* podem agir a uma grande distâ ncia para re-
primir a transcrição de seus genes-alvo. As sequ ê ncias
Ativadof
5'
3'
tf Proteínas ativadoras
g Ponte
Proteínas coativadoras
proteica -
^ RNA polimerasell
Y Inicio da
' eventos sequenciais que liberam uma molécula regula-
éSB ) IIF +1 transcrição
; rJ
V
IID
Dobra do TATA
UH
DNA (de box
dezenas a
milhares de
T da célula e uma região transmembrana que atravessa a
pares de bases )
Complexo de iniciação completo
Fi gura 8.12 Os ativadores ativam a transcriçã o em
cooperação com os promotores. Uma ponte proteica
composta òe proteínas transcricionais se forma entre as
sequências do ativador e do promotor, que podem estar
separadas por milhares de nudeot ídeos.
275
- -
silenciadoras ligam se a fatores de transcrição chama
dos proteínas repressoras, induzindo dobras no DNA
-
que são similares às que observamos quando os ativa-
dores e coativadores ligam -se aos ativadores exceto
pela consequê ncia de reduzirem a transcrição dos ge
— -
- nes-alvo. Assim como os ativadores, os silenciadores
-- podem estar a montante ou a jusante de um gene-alvo
e podem residir a até vários milhares de pares de bases
de distância desse gene. Assim, os ativadores e silencia
dores podem operar por mecanismos gerais similares,
-
mas com efeitos opostos na transcrição.
- Fatores de transcrição e transdução de sinal
-- Outros dois fatores afetam as transcrições gênicas
eucarióticas específicas para o tecido e evolutiva: a pre -
sença de proteínas de fator de transcrição específicas e as
vias de Lransduçâo de sinal que comunicam a necessidade
de moléculas regulatórias específicas, como os fatores de
transcrição. Se um determinado fator de transcrição ne-
cessá rio para a transcrição de um gene estiver disponível,
o gene pode ser transcrito, supondo que os outros com -
ponentes proteicos do aparato transcricional estejam pre
sentes. Por outro lado, se o fator de transcrição específico
estiver ausente, a transcrição génica não ocorrerá, mesmo
- se todos os demais componentes necessários do aparato
transcricional estiverem reunidos. Diferentes proteínas
do fator de transcrição desempenham um papel funda -
mental na regulação da transcrição génica eucariótica.
Por sua vez, a disponibilidade do fator de trans -
crição depende da síntese dos pró prios fatores de
.
transcrição e de sua disponibilidade na célula A síntese
do fator de transcrição pode ser rigidamente regulada e
diferentes tipos de células podem conter diferentes con
juntos de fatores de transcrição. Isso leva a diferentes
-
padrões de expressão génica nas células. Por exemplo,
as células musculares longas têm um padrão caracter ís-
tico de transcrição génica que produz estruturas e fun
ções celulares específicas. Por outro lado, os neurô nios
-
que excitam as células musculares longas tê m estrutura
e função diferentes, alé m de transcreverem um padrão
de genes diferente. A presença de fatores de transcrição
diferentes nessas células contribui parcialmente para
seus diferentes padrões de transcriçã o génica .
Além da síntese regulada dos fatores de transcrição,
a disponibilidade de fatores de transcrição ativados é
controlada por meio das vias de transduçã o de sinal,
,,
tória dentro das células em resposta aos sinais recebidos
5 - de fora das células. As vias de transdução de sinal utili -
zam proteínas transmembrana que têm um domínio de
interação fora da célula, um dom ínio de ligação dentro
.
membrana celular ( Figura 8.13 ) O domínio de interação
é o receptor que recebe uma mensagem de estímulo.
Os estímulos podem ser moléculas como os hormônios
ou os fatores do crescimento ou podem ser agentes í
sicos, como a luz ou a temperatura. A estimulação do
f -
domínio de interação sinaliza que a transcrição de um
276 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O Estimulo Promotores da RNA polimerase I

Proteí na Os genes para o RNAJ são transcritos pela RNA
Dom í nio de integração transmembrana polimerase I, utilizando um mecanismo de iniciação da
Extracelular transcrição similar ao utilizado pela RNA pol 11. A RNA
polimerase I é a mais especializada nos eucariotos, já que
Regi ão Membrana transcreve um n ú mero de genes limitado. Ela é recru-
transmembrana celular tada para os elementos promotores a montante, após a
xxxxxxi ligação inicial dos fatores de transcrição, e transcreve os
Citoplasma
genes do RNA ribossòmico encontrados no nucléolo,
Dom í nio de ligação -T' uma organela nuclear contendo RNAr e várias cópias
de genes que codificam os RNAr. Os nucléolos contê m
0 do
Liberação da proteí na Proteí na do fator
muitas cópias repetidas em tandem (significando de
fator de transcrição de transcrição Inativo
“ extremidade a extremidade’) dos genes de RNAr. Na
Q Ativação do fator
de transcrição
I Fator de
Arabidopsis , por exemplo, cada nucléolo contém cerca
de 700 cópias dos genes de RNAr. Os nucléolos desem --
penham um papel fundamental na produção dos ribos
transcrição ativo somos. Nos nucléolos, os genes de RNA ribossòmico
0 Transporte para
on údeo

y O ativador
Ugiçlo ao
h RNA
Membrana
nuclear
transcritos são empacotados com proteí nas para formar
as subunidades ribossòmicas grandes e pequenas.
Os promotores reconhecidos pela RNA pol I con-
têm duas sequ ências funcionais similares perto do in í -
cio da transcrição. A primeira é o elemento principal ,
Fator de transcrição ativo
polimerase
\ -
que vai da posição 45 à + 20 e se conecta ao inicio da
transcrição, e a segunda é o elemento de controle a
montante , que abrange os nucleotídeos -100 até -150
-
41
.
( Figura 8.14 ) O elemento principal é essencial para a ini -
Ativador In ício da
Promotor transcrição ciação da transcrição, e o elemento de controle a mon -
tante aumenta o n ível de transcrição gênica. Esses dois
N úcleo O Iniciação da
transcri ção / elementos são ricos em guanina e citosina; as compara
ções das sequências de DNA mostram que todos os ele
-
-
mentos de controle a montante tê m os mesmos pares de

Figura 8.13 Transdu çá o de sinal. A estimula ção O

recebida por uma proteína receptora transmembrana induz
a liberação de um fator de transcrição O, que é ativado 0 e
.
transportado para o n úcleo O onde se liga a uma sequê ncia
ativadora O e participa da iniciação da transcrição de um
gene-alvo O . fator tipo sigma 1 (SL1), liga - se ao elemento principal.
determinado gene (ou genes ) é necessária. Na estimula
ção, o domínio de ligação que detém um fator de trans
-
-
crição ou outra molécula regulatória libera a molécula
no citoplasma. Depois de ativado, o fator de transcrição
é transportado para o n ú cleo, onde sc liga à sequência de
DNA regulatória como, por exemplo, um ativador, para
ajudar a iniciar a transcrição do gene- alvo. Os fatores de
transcrição e as vias de transduçào de sinal são bem di
versos; discutimos mais sobre seus papéis na transcrição
- desses genes tem uma estrutura de promotor que di-
em capítulos posteriores (Capítulos 15 e 20).
Observa çã o gen é tica 0 controle da transcrição gè-
nica eucariótica requer a liga ção de proteí nas regulatónas a
sequências de DNA, como os silenciadores e ativadores. As
proteí nas do fator de transcrição são essenciais para a trans-
crição e sua sí ntese difere de acordo com o tipo de célula. As
vias de transduçào de sinal sã o um caminho importante para
a liberação de fatores de transcrição específicos.
bases em aproximadamente 85% das posições nucleot
dicas e o mesmo vale para todos os elementos principais.
í -
Duas proteínas do fator dc ligação 1 ( UBF1) a montante
ligam -se ao elemento de controle a montante. Um se-
gundo complexo proteico, conhecido como proteína do
Esse complexo recruta a RNA pol I para o elemento
principal para iniciar a transcrição dos genes de RNAr.
Promotores da RNA polimerase III
A RNA polimerase restante, RNA polimerase III, é
responsá vel principalmente pela transcrição dos genes
de RNAt. No entanto, ela també m transcreve um gene
de RNAr e outros genes codificadores de RNA. Cada um
fere bastante da estrutura dos promotores reconhecidos
pela RNA pol 1 ou pela RNA pol 11. Os genes do pequeno
RNA nuclear têm três elementos a montante, enquanto
os genes do RNA ribossò mico 5S e do RNA de transfe-
rê ncia contém, cada um, dois elementos promotores
internos que estão a jusante do in ício da transcrição.
Os elementos a montante dos genes do pequeno
RNA nuclear sào a TATA box, um elemento especí -
fico para o promotor ( PSE) e uma sequência octamé -
.
rica (OCT) ( Figur» 8.15a ) Uma pequena quantidade de
fatores de transcrição — TFIIIs, nesse caso — liga -se
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 277

O controle
O elemento principal inkia a transcrição e o elemento de (a ) GeneRNAsn Montante I Jusante
a montante aumenta a eficiência da transcrição
OCT PSE TATA i
Elemento de controle
5'
a montante Elemento pr ncipal
3' f
1 í +1 I
-
150 -
100 45 1 + 20
Os genes RNAsn
têm promotores a
.
Transcrição

0 UBF
I
1 e SL1 ligam-se aos elementos de controle a montante
montante do mico
da transação. RNAsn

e
principal . (b) Gene RNAr 5$ Região de
- 1
controle interna
1
7 v Caixa A Caixa C
SL 1 3'
IF 1 5'
+1

-100
1
SL1
5'
3’
Os genes RNAr 55 e
RNAt têm prerroto^s
internos a jusante do
inido da transcrição.
.
Transcrição

RNAr 5S
3'
-45 +1 +20

O A RNA apol I é recrutada

I
para o elemento principal para
(c) Gene RNAt Região de
controle interna
iniciar transcrição. Caixa A Caixa B
150 - 3'
5'
.7 , 3’ +1

1
1
SL 1

5*
i
i .
Transcrição

RNAt
3'
SL 1
- 100
+1
5’
3* F igura 8.15 Variação dos promotores quanto aos genes
transcritos pela RNA polí meras# III .

Figura 8.14 Sequências d# consenso promotoras para a
iniciação da transcrição pela RNA polimerase I.
a esses elementos e recruta a RNA polimerase III , que
inicia a transcriçã o de um modo similar ao das outras
polimerases.
Os genes do RNA ribossómico 5S e do RNA de trans
ferência possuem elementos promotores internos chamados
regiões dc controle internas ( ICRs ); ver Figura 8.15 b e c.
As ICRs são duas sequências de DNA curtas designa -
das caixa A c caixa B cm alguns genes c caixa A c caixa C
— bacteriana (ver página 269) No entanto, a sequência
Aqui descrevemos brevemente a terminação na trans-
crição pela RNA pol I ou RNA pol 111, deixando a termi -
nação da transcrição da RNA pol 11 para uma discussão
mais abrangente em uma seção posterior. A transcrição
pela RNA polimerase III é terminada em uma maneira
reminiscente da terminaçã o da transcrição da £ coli.
A RNA pol III transcreve uma sequ ência terminadora
- que cria uma cadeia de uracilas no transcrito A cadeia .
-
poli U é similar à que ocorre na terminação intr ínseca
.
terminadora da RNA pol III nào contém uma repetição

—
em outros situadas a montante do inido da transcrição,
entre os nudeotídeos + 55 e * 80 ( Figura 8.16) Para iniciar
a transcrição, a caixa B ou a C liga-se ao TFIIIA, facili
tando a ligação subsequente do TFIIIC à caixa A. O TF11IB
liga-se a outros fatores de transcrição. Na etapa final da ini
ciação, a RNA polimerase III liga se ao complexo do fator
de transcrição e sobrepõe o nudeotídeo +1. Com a RNA
polimerase posidonada corTetamente, a transcrição começa
aproximadamente 55 pares de bases a jusante do inicio da
caixa A, no nudeot ídeo + 1.
Termina ção na transcrição da RNA
polimerase I ou III
Cada uma das RNA polimerases eucarióticas utiliza
um mecanismo diferente para terminar a transcrição.
.
invertida, entã o a estrutura de haste em alça se forma
perto da extremidade 3' do RNA .
A transcrição pela RNA pol 1 é terminada na se -
- quência de consenso de 17 pares de bases que se liga ao
- fator I dc terminação da transcrição (TTF1). O sítio
de ligaçã o do TTFI é a sequência de consenso de DNA
AGGTCGACC AGA / / 7NTCG
/
Nessa sequência, a adenina e a timina tê m probabi
lidades iguais de aparecer em dois sítios adjacentes,
-
conforme indicado pelas linhas diagonais; N significa
uma posição em que os quatro nudeot ídeos têm uma
frequ ê ncia mais ou menos igual. Um grande transcrito
precursor do RNAr é clivado cerca de 18 nudeotídeos a
montante do sítio de liga ção TTFI, entã o a sequê ncia de
consenso não aparece no transcrito maduro.
278 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O Os promotores internos
contêm a caixa Aea
-
Nesta seção, discutimos o processamento pós trans-
cricional de vários tipos de RNA, mas enfatizamos três
caixa C de +55 a +80. Inicio da etapas de processamento sequenciais que modificam o
transcnçáo Caixa A Caixa C
transcrito de RN Am inicial do gene eucariótico, chamado
3' | pré- RNAm, em RNAm maduro, o RNAm totalmente
+1 processado que migra do n úcleo para o citoplasma para
Q O TF1IIA liga- se è caixa C tradução. Essas etapas de modificação são (1) capea -
e facilita a ligação do mento da extremidade 51, adiçã o de um nucleotídeo
TFIKC à calxaA.
modificado à extremidade 5' do RN Am; (2) poliadenila -

JxXXXXXXXXXXXJCOodBB
O OTF1IIB liga-se aoTFIIIA
+i +55 +80
çáo da extremidade 3', clivagem na extremidade 3' do
RNAm e adição de uma cauda de vá rias adeninas para
formar a cauda poli - A; e (3) splicing intrônico, splicing
do RNA para remover íntrons e ligar éxons.
eaoTFIIIC . TFIIIB
Capeamento da extremidade 5' do RNAm
l v . \ v .
^
5*
34 Após a RNA pol 11 ter sintetizado os primeiros 20
+1 +55 +80 a 30 nucleotídeos do transcrito de RNAm, uma enzima
Q A RNA polimerase III liga-se especializada, a guanilil transferase, adiciona uma gua -
aos TFs e posiclona-se em
+1.
l TFIIIB _
nina à extremidade 5' do pré-RNAm, produzindo uma
liga ção incomum de 5* para 5’ que forma uma ligação
RNA
polimerase III IIICYTFIIIA trifosfato. Outra ação enzimá tica metila a guanina re-
5' 5'
cé m -adicionada e também pode metilar o pró ximo ( ou
3' 3'
+1 55 +80 próximos) nucleotídeo do transcrito. Essa adição de
guanina ao transcrito e a subsequente metilação são co-
nhecidas como capeamento da extremidade 5'.
F igura 8.16 Reglòes de controle internas do promotor
A guanilil transferase inicia o capeamento da ex-
para transcriçã o pela RNA polimerase III.
tremidade 5’ em trés etapas retratadas na Figura 8.17 .
Antes do capeamento, o nucleotídeo 5' terminal do
RNAm cont ém trés grupos fosfato, rotulados a, |5 c y
Observa çã o gen é tica A RNA pol I e a RNA pol lll ini - na Figura 8.17. Primeiro, a guanilil transferase remove
ciam a transcrição a partir de promotores diferentes um do
o fosfato y, deixando dois fosfatos no nucleotídeo ter-
outro e dos promotores utilizados pela RNA pol II. Os meca
minal 5' O. O trifosfato de guanina contendo a guanina
nlsmos de terminação da transcrição também são diferentes
para cada tipo de RNA polimerase.
que deve ser adicionada perde dois fosfatos (y e (V), for -
mando um monofosfato de guanina O. Depois, a guani -
lil transferase une o monofosfato de guanina e o nucleo-
tídeo terminal do RNAm , formando a ligação trifosfato
8.4 O processamento pós-transcrição de 5' para 5’ O. A enzima metil transferase adiciona
modifica as moléculas de RNA um grupo metila (CH3) ao nitrogénio 7 da guanina, for
-
mando a 7 metilguanosina ( nvG ). A metil transferase
-
Os transcritos bacterianos e eucarióticos diferem também pode adicionar grupos metila aos nucleotídeos
de vá rias maneiras. Por exemplo, os transcritos euca - -
próximos da 2' OH do RNAm.
rióticos são mais estáveis do que os transcritos bacte-
rianos. A meia - vida de um RNAm eucariótico tí pico é
A capa da extremidade 5' tem várias funções, in
cluindo (1) proteger o RNAm da degradação rápida , (2)
-
medida cm horas até dias, enquanto os RNAm bacte- facilitar o transporte do RNAm através da membrana
rianos tê m uma meia- vida média medida em segundos nuclear, (3) facilitar o splicing intrônico subsequente e
até minutos. Uma segunda diferença é a separação, em
tempo e posição, entre a transcrição e a tradu ção. Lem -
(4) aumentar a eficiência da tradução orientando o ri
bossomo no RNAm.
-
bre-se de que, nas bactérias, a falta de um n úcleo leva à
união entre a transcrição e a tradução. Nas células euca - Poliadenilaçâ o da extremidade 3' do
rióticas, por outro lado, a transcriçã o ocorre no n úcleo
pr é-RNAm
e a tradução ocorre mais tarde nos ribossomos livres ou
nos ribossomos presos ao ret ículo endoplasmá tico ru
goso no citoplasma. Uma terceira diferença é a presença
- A terminação da transcrição pela RNA pol 11 não
é totalmente compreendida. O que se sabe é que a ex-
de í ntrons nos genes eucarióticos ausentes dos genes tremidade 3' do RNAm nã o é gerada pela terminação
bacterianos. Cada uma dessas diferenças entra em cena da transcrição. A extremidade 3‘ do pré- RNAm é criada
quando consideramos as modificações pós-transcrição pela açã o enzimá tica que remove um segmento da extre-
do RNAm nas células eucarióticas. midade 3’ do transcrito e o substitui por uma cadeia de
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 279

Figura 8.17 Capeamento da extremidade 5' do

pdimerdse II pré-RNAm eucariótko.
s'
y

RNAm 5'
Até a
/ Extremidade 5 do RNAm !
' extremidade 3'
/
Base 1 Base 2
O O 5 7 fosfato édo primeiro.
*

nudeotideo removido

o" xXo H'

O Os íosfatosYepsão
removidos do trifosfoto
de guanina.

O O monofosfato de
guanina se une à
extremidade 5' do
RNAm por meio de uma
ligação trif òsfato de 5'
para 51Também ocorre Metilaçáo adicional
a metllação adicional do
nudeotídea Base 1
Ligação trifosfato de 5’ para 5

r r r
o- P - O- P - O- P -O
a II
O O

nucleolídeos adenina, a cauda poli- A. Acredila - se que
-
essa etapa do processamento do pré RNAm esteja asso
ciada com a subsequente terminação da transcrição.
A Figure 8.18 ilustra essas etapas. A poliadenilaçáo
começa com a liga ção de um fator chamado fator de es-
pecificidade de clivagem c poliadenilaçáo (CPSF) perto dc
uma sequência de RNAm de sets nudeotídeos, AAUAAA,
que fica a jusante do códon de parada e, portanto, não faz
parte da sequência codificadora do gene. A sequência de
seis nudeotídeos é conhecida como sequ ê ncia de sinal de
poliadenilaçáo. A ligação de um fator estimulador da cli
vagem (CstF) com uma sequ ência rica em uradla vá rios
nudeotídeos a jusante da sequência dc sinal dc poliade-
nilaçáo vem rapidamente a seguir e a ligação de outros
dois fatores de clivagem, CFI e CFII , e a poliadenilato
polimerase ( PAP) aumentam o complexo O. Depois, o
- pré- RNAm é clivado 15 a 30 nudeot ídeos a jusante da
sequência de sinal de poliadenilaçáo 0. A clivagem li -
bera um fragmento de transcrito ligado pelo CFI, CHI e
CstF, que mais tarde é degradado O. A extremidade 3’ do
pré-RNAm cortado sofre a adição enzimá tica de 20 a 200
nudeotídeos adenina que formam a cauda poli - A 3’ por
meio da açâo do CPSF c da PAP O. Após a adição das 10
primeiras adenina*, as mol éculas da proteína II de ligação
à poli - A ( PABII ) juntam -se à cauda poli- A e aumentam a
- taxa de adição de adenina 0. A cauda poli- A 3’ tem vá rias
funções, incluindo (1) facilitar o transporte do RNAm ma
duro através da membrana nuclear, ( 2) proteger o RNAm
da degradação e (3) melhorar a tradução habilitando o re-
conhecimento ribossômico do RNA mensageiro.
280 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Sequência de sinal
Sequência codificadora de polipeptídeo de poJiadenild çáo Sítio de clivagem
J
pré - RNAm 51
Códon
de In ício
IC
Códon
de parada
3 UTH AAUA Ã A
T
15 a 30 nucleotideos
U reoiàorka /
^ 3*

O °poliadenila
complexo de clivagem e
ção é constituído.
CPSF
5' U II

3'
*
71
A
PAP

CStf CStf

O Pré-RNAm clivado, deixando G Fragmento 31

a PAP na extremidade 31 degradado no núdeo.
CPSF
5'

C A RAP adiciona' novas adeninas à

extremidade 3
CPSF
5' AAAAAAA

G Moléculas de PABM sepoliadenila

l*gam para
aumentar a taxa de ção.

CPSF
5' AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

1 Sequência
Sequência codificadora de polipeptideo de consenso Cauda poli A

=
i 1
r r 1 1
pré- RNAm S | 7£ LYJjfemW»3>K0I 3'
Códon Códon
de in ício de parada
Figura 8.18 Poliadenilação da extremidade 3' do pr é-RNAm eucariótico.

Certos transcritos de RNAm eucarióticos não sofrem
poliadenilação. Os mais destacados dentre esses transcri
tos são os dos genes que produzem proteí nas histona, que
são componentes-chave da cromatina , o complexo DNA
-proteína que compõe os cromossomos eucarióticos (ver
Capítulo 11). Nesses e em outros RNAm "sem cauda", a
extremidade 3’ contém uma curta estrutura hairpin re
miniscente das estruturas observadas no mecanismo de
terminação intrínseca da transcrição das bactérias. Pode
haver uma conexão evolutiva entre a terminação da trans
criçào bacteriana e a formação do hairpin nos RNAm eu
carióticos “ sem cauda".
- formando palavras de trés letras, interrompidas por ou
Splicing intrônico do pré- RNAm
A terceira etapa do processamento do pré- RNAm é
a remoção dos íntrons ( splicing intrô nico), que consiste
na remoção dos segmentos intrònicos do pré- RNAm
e na liga ção dos éxons. O splicing intrô nico exige uma
- precisão extrema para remover todos os nucleotideos
intrònicos sem perturbar os éxons e sem deixar para
- trás outros nucleotideos, de modo que a sequência de
RNAm codificada pelos éxons ligados venha a dirigir
completa e fielmente a síntese do polipeptideo correto.
- Como exemplo da necessidade de precisão na remo -
çã o intrô nica, considere a seguinte "cadeia precursora ”
composta de blocos de letras fazendo papel de éxons e
tros blocos de letras ininteligíveis que fazem o papel de
-
íntrons. Se a edição remover os “ íntrons" de maneira
precisa, a "cadeia editada" pode ser dividida em suas pa -
lavras de três letras para formar uma "frase". Se um erro
da edição fosse remover letras demais ou de menos, o
resultado seria uma frase sem sentido.
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 281

íntron (ntron

Cadeia precursora: youmaynoxpghrcyeomtpwtipthepf xvubij rdlxacol xotandsipthetea

Cadeia editada: youmaynowtipthepotandsipthetea
Frase: you may now tip the pot and sip the tea

A constata ção de que os íntrons interrompem os
segmentos geneticamente informá ticos das genes eu -
cariólicos foi uma descoberta impressionante dos bió-
logos moleculares Richard Roberts e Phillip Sharp em
1977. Nada que se sabia sobre a estrutura dos genes
eucarióticos à é poca sugeria que a maioria desses
genes era subdividida em elementos intró nicos e exó ni
cos. Roberts e Sharp dividiram o Pré mio Nobel de Fisio -
logia ou Medicina de 1993 por sua descoberta conjunta
dos “ genes divididos" no genoma eucariótico.
O grupo de pesquisa de Sharp descobriu a natu
reza dividida dos genes eucarióticos usando uma téc
- .
nica conhecida como R looping Nesse método, o DNA
que codifica um gene é isolado, desnaturado para uma
forma de fita simples e depois misturado com o trans -
crito de RNAm maduro do gene. As regiões do gene que
codificam sequê ncias no RNAm maduro serão comple-
mentares às sequências no RNAm e vão hibridar com
elas, formando um duplex DNA - RNAm. No entanto, os
segmentos de DNA que codificam íntrons não encon
trarão sequências complementares no RNAm maduro e
permanecerão na forma de fita simples, formando uma
alça entre as sequências hibridizadas.
A Figura 8.19 mostra um mapa do gene hexon es-
-
tudado nos experimentos de R looping realizados por
Sharp e colaboradores. Os resultados experimentais,
dc ramificação, está situada 20 a 40 nuclcotídcos a jusante
do sítio de splicing 3\ Essa sequência de consenso é rica em
pirimklina e contém uma adenina invariante, clianiada ade
nina do ponto de ramificação, perto da extremidade 3* .
A análise mutacional mostra que essas sequências
de consenso são críticas para a remoção precisa dos
- íntrons. As mutações que alteram os nucleot ídeos em
qualquer uma das três regiões de consenso podem pro-
duzir RNAm maduro com splicing anormal. Os RNAm
-
anormais —curtos demais se a sequência cxònica for
removida por engano, compridos demais se a sequência
- intrônica for deixada para trás, ou alterada de outra ma
neira que resulte na leitura inadequada da sequê ncia de
-
RNAm — produzem proteínas com sequências incor-
retas de aminoácidos (ver Capítulo 12).
Os íntrons são removidos do pré- RNAm por um
complexo RNAsn- proteína chamado spliceossomo. O
spliceossomo é parecido com uma bancada de trabalho
molecular à qual o pré- RNAm se acopla enquanto os
- componentes de subunidade do spliceossomo cortam
e remendam esse pré-RNAm em um processo de qua -
(a )
Intron A B C
r _ j l Gene
~

hexon
Éxon 4
fotografados por microscopia eletrónica, revelam qua -
tro regiões híbridas DNA-RNAm, onde a sequência de
DNA exônica forma par com a sequência de RNAm
maduro. Três sequências de al ça em R de fita simples
são íntrons que não formam pares com o RNAm.

Splicing das sequê ncias de sinal

O pré- RNAm eucariótico contém sequências curtas
específicas que definem as junções 5’ e 3' entre as íntrons
e seus éxons vizinhos. Além disso, há uma sequência de
consenso perto da extremidade de cada íntron para auxi-
liar em sua identificação precisa. O sítio de splicing 5’ está
situado na extremidade intrônica 5’, onde se encosta em
.
um éxon ( Figura 8.20) Esse sítio contém uma sequência
dc consenso com um dinudcotideo GU praticamente inva-
riante formando a extremidade mais 5' do í ntron. A sequên -
cia de consenso inclui os três últimos nucleotídeos do éxon
adjacente, bem como os quatro ou cinco nucleotídeos que Figura 8.19 Análise experimental da alça em R. (a ) O
se seguem à GU no intron. No sítio de splicing 3* na extre - gene hexon contém quatro éxons (1 a 4) e tr ês íntrons (A a C).
midade oposta do íntron, uma sequência de consenso de 11 (b) As fotomicrografias eletrónicas mostram a hibridação do
nucleotídeos contém uma região rica em pirimidina e um RNAm maduro com sequências exònicas do DNA com hexon
dinuclcot ídco AG quase invariante na extremidade mais 3' desnaturado. As sequências intrònicas não são hibridizadas e
do íntron. A terceira sequência dc consenso, chamada sítio permanecem na forma de fita simples.
282 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Sitio de Sítio de Sítio de

iplrdng 5' ramificação splicing 3'
Éxon 1 i í ntron 1 r 1 1 Éxon 2
5' J (
faUxAGlJ rJ 3‘
|

O A RNPsn 'UI liga-se ao- sitio de Adenina do ponto

sptiúng 5 e a U 2 liga se ao sítio de ramifica çã o
de ramifica ção.

5'
=r
© As RNPsn U4, U5 e U6 ligam-se
ao complexo e formam o
spliceossomo inativa Forma -se 5'
uma estrutura intrònka em la ço. U Éxon 1

í ntron Éxon 2
em laço

O A spliceossomo
U4 se dissocia para formar O O íntron em laço se forma por
o ativo, uma
liga çãofosfodiéster 2 -5
'
seguido pela clivagem da 5'e entre a guanina 5'e a adenina O
a formação de uma ligação do ponto de ramifica ção. i
o- p = o
-
fosfodiéster 2 5' para
estabilizar o í ntron em la ça HO
I
0

í ntron
em laço
8a se Py
Base Pu
© Antron
extremidade 3’ do
í é clivada, deixando
um monofosfato 5' na
extremidade exònica 5.

íntron
em la ço Sítio de sptidng 3'

É xon 1 É xon 2
íntron
em la ço
5' 7/ ^ AGlS ff "
3f

Dagradacflo Mais spliúng

i
© A clivagem libera o íntron em laço e os éxons são Kgados .
Figura 8.20 Splicing intrônko no pré RNAm eucariótico. Montagem do spliceossomo e remoção dos íntron*.
-

tro etapas que, primeiro, cliva o sítio de splicing 5'; se
gundo, forma uma estrutura de laço (lariat) intr ônico
que liga a extremidade 5' do íntron à adenina do ponto
de ramificação; terceiro, cliva o sitio de splicing 3*; e, fi
nalmente, liga os é xons e libera o í ntron em laço para
ser degradado em seus componentes nucleotídicos.
Uma fotomicrografia eletrónica dos spliccossomos em
ação é vista na foto de abertura deste capítulo.
A Figura 8.20 ilustra as etapas de splicing do pré-
- RNAm nuclear, começando com a agregação de cinco
pequenas ribonucleoproteínas nucleares ( RNPsn ) para
- formar um spliceossomo. As RNPsn são subunidades
-
RNAsn protelna designadas UI a U6. O spliceossomo
é um grande complexo composto de vá rias RNPsn, mas
- sua composição é dinâmica; ele muda durante os difer
entes estágios do splicing , quando cada RNPsn entra
-
e sai à medida que determinadas etapas da reação são
executadas.
Os componentes do spliceossomo são recrutados
para os sítios de splicing 3' e 5' por proteínas especializa-
das, chamadas proteínas SR. Essas proteínas são ricas em
serina (abreviada como S) e arginina (abreviada como R) e
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA
ligam - se a sequências nos éxons conhecidas como ativa-
dores de splicing ex ònico ( ESEs) ( Figura 8.21 ). A ligação
das prote ínas SR com os ESEs ajuda a assegurar que os
componentes do spliceossomo se liguem de modo eficiente
a sítios de splicing 3' e 5' autênticos nas vizinhanças, cm vez
de se ligarem a sítios de splicing longe dos éxons. As pro-
teínas SR são essenciais para o splicing e são produzidas
em formas variadas, algumas estando presentes em todas
as células e outras apenas em certas células. Essas proteínas
podem desempenhar um papel no splicing intrônico alter
nativo que discutimos em uma seção posterior.
Etapas de processamento do acoplamento
do pré-RNAm
Cada junção íntron -éxon está sujeita às mesmas re
ações de spliceossomo, levantando a questã o de haver
ou não uma determinada ordem na qual os íntrons são
—
removidos do pré- RNAm ou se a UI e a U2 buscam
de modo mais ou menos aleató rio as sequências de con-
senso do sítio de splicing 5' e do sítio de ramificação,
induzindo a formação do spliceossomo quando conse
guem encontrar um í ntron. A resposta é que os íntrons
parecem ser removidos um a um, mas n ão necessaria -
mente em ordem ao longo do pré- RNAm. Por exemplo,
um estudo do splicing intrônico do gene ovontucoide
dos mamíferos demonstra as etapas sucessivas da remo-
ção do í ntron. ( ) gene ovomucoide conté m oito éxons
e sete íntrons. O transcrito de pré- RNAm tem aproxi
madamente 5,6 kb e o RN Am maduro é reduzido para
1,1 kb. A análise do Northern blot dos pré - RNAm de
ovomucoide em vários estágios de remoção intrònica
ilustra que cada íntron é removido separadamente e
não que todos os íntrons são removidos de uma vez. A
ordem de remoção intrònica não corresponde precisa -
mente à sua ordem 5' para 3* no pré- RNAm.
As três etapas de processamento do pré RNAm são - mero de genes variavam de 80 mil a 100 mil genes h á
fortemente associadas. Nos métodos abrangentes desen
volvidos aproximadamente ao longo da última década, o
domínio carboxiterminal (CTD) da RNA polimerase II
desempenha um papel importante nessa associação, fun-
cionando como uma plataforma de montagem e regula
dor do maquinário de processamento do pré- RNAm. O
CTD está situado no sítio de surgimento do RNAm a par
tir da polimerase e conté m várias repetições em septeto
(sete vezes) de aminoácidos que podem ser fosforilados. A
A fejação da proreina SR aos FSFs foriKta o rpconhpci-
men:o dos sítios de spUcIng intrônico ye 31
-
Pré RNAm 5' ZJ ÍM IGU
, ESE n BE „ partida + 1 distintos nos diferentes tipos de células; e
I I
íntron Éxon íntron Éxon
Figura 8.21 Recrutamento da proteí na SR dos
componentes do spliceossomo para os sítios de splicing
5' e 3'.
283
ligação das proteínas de processamento ao CTD permite
que o RN Am seja modificado enquanto é transcrito.
Os modelos atuais propõem que os "maquin ários de
expressão gêmea", que consistem em RNA polimerase
II c uma série dc proteínas de processamento do pré-
-RNAm, são responsá veis pela associação entre a trans-
crição e o processamento do pré - RNAm. A Figura B á sica
8.22 ilustra esse modelo de maquinirio da expressão
gé nica. O CTD e a RNA polimerase II associam -se com
- várias proteínas que executam o capeamento (CAP), o
splicing intrô nico (SF) e a poliadenilaçào ( pA ), de modo
que os processos de transcrição e processamento do
pré- RNAm ocorrem simultaneamente. Na iniciação da
transcrição, a fosforilaçào ( P) ao longo do CTD auxilia
na liga ção das enzimas de capeamento da extremidade 5’,
- que executam sua função de capeamento e depois se dis-
sociam. Durante o prolongamento da transcrição, fatores
específicos para o prolongamento da transcriçã o ligam -
-se ao CTD e facilitam a ligação do fator de splicing. Essa
associação entre a transcrição e o splicing ajuda a explicar
a eficiência com a qual os íntrons são identificados.
-
Observa çã o gen é tica 0 processamento do pré-RNAm
eucariótieo ocorre no n úcleo e é necessá rio para produzir
RNAm maduro para a traduçao. Enzimas especializadas adi -
-
cionam uma capa 5) produzem uma cauda poli A 3" e remo -
vem os í ntrons do pré- RNAm . Esses processos são controlados
- por proteínas e fortemente associados em decorrência da for -
mação de grandes complexos proteicos que executam o pro-
cessamento do pré-RNAm.
Transcritos alternativos de genes isolados
Antes de completar o sequenciamento do genoma
humano, no início dos anos 2000, as estimativas do n ú -
- 20 anos, aproximadamente. A razão principal para essa
previsão era que as células humanas produzem bem
mais de 100 mil polipeptí deos diferentes. Então, sur -
preendeu um pouco quando a anotação génica do ge-
- noma humano revelou pouco mais que 22 mil genes. A
- diferen ça entre o n ú mero de genes e o n ú mero de poli -
pept ídeos é espelhada por achados similares em outros
genomas eucariótkos, cspccialmcnte os dos mam íferos.
É comum que os grandes genomas eucarióticos expres -
sem mais proteínas que os genes existentes em seus
genomas. Três mecanismos associados à transcrição
podem contribuir para a capacidade de as sequências
de DNA isoladas produzirem mais de um polipept ídeo:
(1) o pré-RNAm pode sofrer splicing em padrões alter-
nativos nos diferentes tipos de células; (2) promotores
alternativos podem iniciar a transcrição em pontos de
íntron (3) as localizações alternativas da poliadenilaçào podem
produzir RNAm maduros diferentes. Coletivamente,
esses processos variados são identificados como pro-
cessamento alternativo do pré-RNAm .
284 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

FIGURA B Á SICA 8.22

Modelo do maquinário de expressão g ènica para a associa ção da transcrição com o

processamento do pré-RNAm

O Um complexo de pré-inkiaçáo (PtC) RNA

com capeamento (CAP), polia- poHmtftt» II
.
denilaçáo (pA) fator de fpÈCÊna (SF)
e proteínas do fator de transcrição
3'
5*
(TF] associados ligam-se ao
domínio carboxitcrminal (CTD) da
RNA pol II.

O A RNA pol II inicia a transcrição, o

PtC se dissocia, deixando •limense K
proteínas de processamento do y y
pré - RNAm no CTD. As proteí nas 3' 5'
CAP executam o capeamento da Pr é-RNAm
extremidade 5'

O As proteínas de capeamento se
dissociam e o pré-RNAm
aumenta de tamanho. y
I IA
polí merase II
3*
3' A 5'

©
O Os complexos de splkeossomo
-
se associam com o pré RNAm,
com a ajuda das proteínas SF O . 5'
I IA '
pollmerase II
3*
sptictng intrônico ocorre à 3' 5'
medida que a RNA pol continua a
prolongar o RNAnru 5plk ossomo
*
Cap
9
O As proteínas de poliadenilaçáo /' RNA \
identificam a sequência de sinal de I

XXXfe,,HJ,jj ^
pA e executam a poliadenilaçáo.
Jgollrri 3*
A transcriçáo termina. y XXXXXXXXXJOOOQÇ 5'
O splicing continua até o fim .

Cap
VVV ^ RNA
polimeme II

O O RNAm maduro totalmente

processado se dissocia da RNA
pol II e é transportado para o
citoplasma para traduçáo .
Si Núcleo
RNAm maduro
Cauda poli- A

Citoplasma
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 285

O splicing intrónico alternativo é o mecanismo

pelo qual o processamento pós -transcrição de pré -
-RNAm idênticos em células diferentes pode levar a
RNAm maduros com diferentes combina ções de éxons.
Esses RNAm maduros alternativos produzem polipeptí-
deos diferentes. Em outras palavras, o splicing alterna
tivo é um mecanismo pelo qual uma sequência de DNA
aproximadamente 70% dos genes humanos sofram - no —
isolada pode produzir mais de uma proteí na. O splicing
alternativo é comum nos mam íferos acredita -se que
— - mas ele é menos comum nos outros animais e raro
nas plantas.
Os produtos do peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina (CT/CGRP ) exemplificam o processo de
splicing alternativo ( Figura 8.22a ). O gene CT / CGRP
-
produz o mesmo transcrito de pré RNAm em mui
tas células, incluindo as da tireoide e as neuronais. O
-
transcrito conté m seis éxons e cinco íntrons e inclui
dois sítios de poliadenilaçà o alternativos, um no éxon
4 c o outro após o éxon 6. Nas células da tireoide, o
- pré- RNAm do CT /CGRP sofre splicing para formar
RNAm maduro contendo os éxons 1 a 4, usando o pri
meiro sí tio poli- A para a poliadenilaçào. A tradução
-
produz calcitonina, um hormònio que ajuda a regular
o cá lcio. Nas células neuronais, o mesmo pré- RNAm
sofre splicing , formando RNAm maduro que contém
os éxons 1, 2, 3, 5 e 6. A poliadenilaçà o ocorre no sítio
após o éxon 6, pois o é xon 4 sofre splicing como se
fosse um íntron. A tradução nas células neuronais pro-
duz o horm ònio CGRP.

(a ) A tradução produz
o hormònio calcitonina.

RNAm maduro do CT 5' CAPOE 3| 4 .

I AAA 13*

Processamento do pré- RNAm

nas células da tireoide
Splicing intrónico
para a calcitoninax .
\ Poli-A Poli-A
Pré- RNAm
do CT / CGRP
Splicing intrónico
para o CGRP
^
Processamento do
-
pré RNAm nas células
cerebrais e neuronais

Células neuronais
RNAm maduro
do CGRP 3 CAPQ 0 3 5 18 1 AAAj }
|

A tradução produz
o hormònio CGRP

( b) Éxon 4,
12 alternativas
Éxon 6 . Éxon 9 .
33 alternativas
Éxon 17,
Poli -A
48 alternativas 2 alternativas
-
Pré RNAm
110203 5[ [
r ~~
r rh
Ei íEiElElEl íBiEiiEiEiEiSlSllSiiSiil
13
áoDscam
5
-
TTT TTTTT
6 8 9 '

I
O processamento alternativo do pré-RNAm pode produzir
38.016 transcritos diferentes submetidos ao spiicing.

RNAm maduro
I
doDscom s CAP 1121314 [ 5 CTHnniTOIiy,íFígli T1 T,lTlTr7 FrrT T r:T:
^ ^ 3'
^
>

1
A tradução produz
proteína do Dscam .
Figura 8.23 Splicing alternativo (a ) O gene CT/CGRP é transcrito em calcitonina ou CGRP. ( b) O pré-RNAm do Dscom contém
,

muitas alternativas para os éxons 4, 6, 9 e 17.0 splicing combinatório poderia gerar até 38.016 RNAm maduros diferentes.
286 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Um dos padrões mais complexos de splicing alter

nativo ocorre no gene Dscam da Drosophila , que pro-
duz uma proteína que controla o crescimento axonal
nas larvas da Drosophila. O RN Am maduro do Dscam
contém 24 é xons, mas, como mostra a Figura 8.23 b, vá -
rias sequ ências alternativas podem ser usadas, como os
éxons 4, 6, 9 e 17. No total, mais de 38 mil arranjos de
splicing do Dscam diferentes são possíveis, embora nem
todos sejam observados no organismo.
O splicing alternativo é controlado em grande parte
pela variação das proteínas SR nos diferentes tipos de
células. As proteínas SR específicas para o tipo de célula
podem controlar os padrões de splicing intrõníco exclusi
vos de certas células controlando a montagem dos com -
ponentes do spliceossomo nos sítios de splicing 3’ e 5' ne
cessários para a produção de um certo RNAm maduro.
O uso de promotores alternativos ocorre quando
mais de uma sequência a jusante de um gene pode ligar
fatores de transcrição e iniciar a transcrição. De modo
similar, a poliadenilaçáo alternativa é possível quando
os genes contém mais de uma sequência de sinal de po-
liadenila çào que pode ativar a clivagem do pré RNAm
3’ e a poliadenilaçáo. Os promotores alternativos e a
- .
poliadenila çáo alternativa são acionados pela expressão
variá vel das prote ínas transcricionais ou de poliadenila -
ção de um modo específico para o tipo de célula. Assim
como a expressão variá vel das proteínas SR que leva ao
splicing alternativo, a expressão variá vel das prote ínas
- transcricionais e da poliadenilaçáo gera RNAm madu
ros caracteristicos a partir de genes específicos em de-
-
terminadas células. O resultado é que a transcrição de
um ú nico gene pode levar à produção de vá rios RNAm
maduros diferentes em diferentes tipos de células c à
sua tradu çã o em proteínas diferentes em cada um des -
ses tipos de células.
Um exemplo completo de um único gene no qual
operam três mecanismos alternativos para produzir
polipeptídeos diferentes em células diferentes é o do
gene da a-tropomiosina de rato (a-Tm ), que pro-
duz nove RNAm maduros diferentes e, consequente-
- mente, nove proteínas tropomiosina diferentes a partir
de um único gene. A Figura 8.24o mostra um mapa da
- -
a Tm. O gene contém 14 éxons, incluindo alternativas
para os éxons 1, 2, 6 e 9. O gene tem dois promotores
( identificados como Pt e P , bem como cinco sítios de
^
poliadenila çá o alternativos (identificados como A , a
Aj). Os nove RNAm maduros diferentes da a-Tm são
produzidos nas células musculares (duas formas), cere-
brais ( trés formas) c fibroblásticas (quatro formas); ver
Figura 8.24b Cada RNAm maduro diferente ilustra um
único padrão de seleção do promotor, splicing intrónico
e escolha do sitio de poliadenilaçáo. Todos os RNAm
maduros, e suas proteínas tropomiosina corresponden -
tes, contem a informa ção genética dos éxons 3, 4, 5, 7 e
8; entretanto, eles podem conter informações diferentes
nos éxons alternativos que dependem em grande parte

Figura 8.24 Processamento (a )

-
alternativo do pré RNAm Ia 2a 2 b 1 b 3 4 5 6a 6b 7 8 9a 9b 9c 9d

.
-
do gene da a tropomiosina 5' i m» uunan
do rato Os padrões de
spiicing alternativo são
I
p . f
p3
n
A Ag|
t t
Aj A
*
indicados pelas linhas
arqueadas que conectam os
éxons. Nove RNAm maduros ( b)
diferentes, produzidos por M úsculo AAAAAA
tipos diferentes de células estriado 5' imimin 3'
musculares, cerebrais e AAAA
fibroblásticas, produzem
M úsculo
liso 5' ma 3'
cada um uma proteína
tropomiosina diferente. TMBr-1 AAAA
Cerebral 5' Hllllll 3'

TMBr-2 '
AAAAA
Cerebral 5 nniiBi 3'

TMBr 3
Cerebral
- 5'
AAAA
um 3'

TM 2 -
Flbroblástka 5
AAAA
um 3'

TM 3 - AA
Flbroblástka ^ MUI 3'

TM-5a AAAA
Flbroblástka 5 llllll 3'

TM-5b AA
Flbroblástka IBM 3'
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 287

da seleção do promotor e do sitio de poliadenilaçáo es - O Pareamento de bases éxon-UpA

í ntron. O nudeotideo do sitio de
pecificamente para um tipo de célula . liga ção da C ataca a ponte , Hgando-se à adenlna e
clivando o éxon A.
Nas células musculares estriadas, por exemplo, sâo
utilizados o promotor P , e o sítio de poliadenila çáo
RNAm maduro inclui os éxons alternativos la. 2b, 6b, 9a
e 9b. Por outro lado, a tropomiosina nas células muscula -
O
§
Sitio de liga ção da G

É xon A íxon B
res lisas utiliza o promotor P e o sítio de poliadenilaçáo
e seu RNAm maduro contém os éxons la, 2a, 6b e 9d.
-C
5'
tmt É) J-3*
As células cerebrais produzem trés proteínas tropomio-
sina diferentes, cada uma delas sendo traduzida a partir
(£
de pré- RNAm submetidos diferencialmente a splicing que Intron
também utilizam diferentes sítios de poliadenilaçáo. Além
disso, duas formas de proteínas tropomiosina celular ce- 0 A extremidade 3’ do éxon A ataca a ponte Getl na junção
Intron-éxon.
rebral sào traduzidas dos RNAm que utilizam o promo-
tor P , e uma delas a partir de um RNAm que utiliza o Pt .
Entre as quatro proteínas tropomiosina diferentes pro
(í
duzidas nos fibroblastos, todos os RNAm usam o sitio de
Éxon A
poliadenilaçáo A., mas eles diferem quanto à seleção de Pt
versus P2, e o splicing alternativo também ocorre. A Aná- S'—l -
HPMiMil OH
iiun A6
Éxon B
—
3 3*
lise Gen ética 8.2 vai orientá -lo pela análise dos resultados
do processamento alternativo do RNAm. (C
Intron
Observa çã o gen é tica 0 spíkinç alternativo os pro-
^ O 0 intron é liberado e os éxons sào ligados.
motores alternativos e os sítios de poliadenilaçáo alternativos
podem produzir diferentes transcritos de RNAm maduro e dife -
rentes proteí nas a partir de um ú nico gene. Esses mecanismos
-OH
permitem que certos eocanotos produzam muito mais proteí-
nas que a quantidade de genes existente em seus genomas.

Auto - splicing intrônico intron linear

Al ém dos íntrons que sofrem splicing pelos spli - Éxon A Éxon B

ceossomos, os RN As podem conter í ntrons que auto -
catalisam sua remoção. Trés categorias de íntrons de
auto- splicing, designados íntrons dos grupos 1, II e III ,
foram identificadas. O biólogo molecular Thomas
Cech e seus colaboradores descobriram os íntrons do
grupo I em 1981 , quando observaram que um RNAm
com precursor de 413 nudeotídeos de um gene de
RNAr do protozoário Tetrahymena podia se submeter
a um auto - splicing sem a presença de qualquer proteína.
Dando seguimento a essa observação inicial, Cech e ou-
tros mostraram que os í ntrons do grupo I são grandes ri -
bozimas de auto-splicing ( RNAs ativos cataliticamente)
que catalisam sua própria excisã o de certos RNAm e
também formam precursores de RNAt e RNAr nas bac -
térias, eucariotos simples e plantas. O auto- splicing
intrônico ocorre por meio de duas reações de transes -
terificação ( Figura 8.25 O, O) que excisam o intron e
permitem que os éxons liguem 0. Cech e Sidney Altman
dividiram o Prémio Nobel em Fisiologia ou Medicina de
1989 por suas contribuições para a descoberta e descri -
çã o das propriedades catalíticas do RNA.
Os í ntrons do grupo II , que também sào ribozlmas
de auto-splicing , sào encontrados no RNAm , RNAt e
RNAr de fungos, plantas, protistas e bactérias. Os í n-
trons do grupo II formam estruturas secundárias alta -
CUCUC UI u
É xons submetidos a splicing .
Figura 8.25 Auto-splicing dos í ntrons do grupo I .
mente complexas contendo muitos arranjos de haste
em alça. Seu auto- splicing ocorre em modo laço, usando
um nudeotideo de ponto de ramificação que , em mui-
tos casos, é a adenina. Acredita - se que o splicing do pré -
-RNAm nuclear possa ter evoluído a partir de íntrons
de auto -splicing do grupo II .
Os í ntrons do grupo III e os do grupo II são simi -
lares por terem estruturas secundá rias elaboradas e es-
truturas de splicing tipo laço que utilizam um núcleotí-
deo de ponto de ramificação. Entretanto, os íntrons do
grupo 111 sào multo mais curtos que os do grupo II e
suas estruturas secundárias são diferentes das estrutu -
ras dos íntrons do grupo II .
Processamento do RNA r í bossômico
Nas bactérias e nos eucariotos, os RNAr são trans-
critos como grandes moléculas precursoras clivadas em
moléculas de RNA menores pela remoção ou pelo des-
carte das sequências espaçadoras intervenientes entre
as sequências dos diferentes RNAs. O genoma da E coli
contém sete cópias de um gene de RNAr. Cada có pia
283 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
O gene JLB- 1 , expresso em vários órgãos humanos, contém sete éxons 0 a 7) e seis íntrons ( A a F) .
Trés sondas oligonucleotídicas (I a III), hibridtzando para os éxons 2, 4 e 7, respectivamente, sao In
dicadas por asteriscos abaixo do mapa genético:
IntronA IntronB IntronC IntronD IntronE IntronF
Éxon 1 | Éxon 2 I Éxon 3 I Éxon 4 I Éxon 5 I Éxon 6 I Éxon 7
Gene 1 1 1 1 1 1 1
JLB- 1
I II
O RNAm maduro é isolado de tr és tecidos expressando o gene JLB- 1 e Sangue Fígado Rim
examinados pelo método de Northern blot usando as trés sondas oligo-
nucleotídicas indicadas anteciormente. As sondas ligam-se às sequências Sonda I
complementares no RNAm. Séo exibidos os padr ões de hibridação do
Northern blot entre cada sonda e o RNAm isolado das células sanguíneas,
hepáticas e renais. Para cada Northern blot:
a. Explique o significado do resultado da hibridação. Sonda II
b. Identifique os processos biológicos ou os processos que contribuem
para os padr ões de hibridação observados nos Northern blots.

Sonda III

Estrat égias de solução Etapas da soluçã o

Avaliar
1. Identifique o tópico abordado por
este problema e explique a natu
reza da resposta solicitada
2, Identifique as informações críticas
fornecidas no problema.
.
1 A questão diz respeito à produção de RNAm maduros a partir de um único gene
- .
humano expresso em diferentes órgàos A resposta exige a identificação dos meca-
. nismos específicos responsáveis pelos dados obtidos de cada órgão.
.
2 O problema fornece a estrutura gênica, o local de ligação de cada uma das trés
sondas moleculares que híbrkJizam o gene e os resultados de trés análises do Nor
thern blot do RNAm maduro de diferentes órgãos.

Deduzir
.
3 Identifique as regióes do JLB 1 que
devem fazer parte do pré-RNAm
4. Identifique as regiões que devem
ser encontradas no RNAm maduro.
Solucionar
.
5 Determine o padrão de hibrida-
cão das sondas moleculares em
cada órgão . Fígado: a sonda I náo hibridiza para o RNAm do fígado, indicando que o éxon 1 est á
sí.
Deca: A hibridação de uma sonda ocorre
quitdo a sonda encontra sua sequência-alvo. A
ausência de hibridação indka que a seqjênca-
aho de uma sonda não «ta presente.
.
6 Interprete os padrões de hibrida -
ção em cada tecido e identifique
o processo ou os processos que
contribuem razoavelmente para
os padrões observados.
9ka: 0$ promotora altematfvov os vbos
*
vos ot poiodendaçao o tpKang atomatrvo uo trés
mecanismos
•
que levam os genomas eucanòttcos a
gerarem proteirm diferentes a partir do mesmo gene.
.
3 O pré RNAm desse gene deve incluir todas as sequências de íntrons e éxons.
.
.
4 Os segmentos exònicos devem estar no RNAm maduro, com a modificação na ex-
tremidade 5' do RNAm (capeamento) e na extremidade 3' (cauda poli- A) .
Resposta a
.
5 Sangue: as sondas I e II hibridizam, mas a sonda III, não. Esse resultado indica que
os éxons 2 e 4 estão presentes no RNAm maduro do sangue, mas o éxon 7 não está.
.
ausente no RNAm hepático As sondas II e III hibridizam o RNAm hepático, indi -
cando que os éxons 4 e 7 estão incluídos no transcrito maduro.
Rim: a sonda II náo hibridiza o RNAm renal, indicando que o éxon 4 est á ausente
nele. As sondas I e III encontram alvos de hibridação, indicando que os éxons 2 e 7
.
est ão presentes no transcrito
Resposta b
.
6 Sangue: a ausência do éxon 7 é mais provável em razão do uso de um sítio alterna -
tivo de poliadenilaçáo que gera a clivagem da extremidade 3' do pré-RNAm antes
do éxon 7 ou do spiicing diferencial que remove o éxon 7 do pré-RNAm durante o
spitang intrômco.
Fígado: a ausência do éxon 2 é mais provável em razão do uso de um promotor
alternativo que inicia a transcrição em um ponto após o éxon 2 ou do splicing dife-
rencial do pré-RNAm hepático.
Rim: a ausência do éxon 4 é mais provavelmente o resultado do splicing diferencial
do pr é -RNAm.

Para praticar mais, ver Problemas 2, 3 e 8.

 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 289

do gene é transcrita em um RNA precursor 30S que é RNAr precursor 45S que contém uma sequê ncia de
processado pela remoção das sequências intervenientes, transcrição externa ( ETS) e duas sequê ncias de trans -
produzindo RNAr 5S, 16S e 23S, com vá rias moléculas crição internas ( ITS1 e 1TS2) que são removidas pelo
de RNAt (Figura 8.26a ). Todas as sete cópias gé nicas processamento. O transcrito é processado em vá rias
produzem os mesmos três RNAr, mas cada gene gera etapas para produzir três moléculas de RNAr pesando
um conjunto diferente de RNAt. .
5,8$, 18$ e 28S ( Figura 8.26b ) Os genomas eucarióticos
Os genomas eucarióticos possuem centenas de diferem um pouco nas etapas que processam o trans-
genes de RNAr agrupados em regiões de genes repe - -
crito do pré RNAr 45S. Em geral , porém, o transcrito
tidos em vários cromossomos. Cada gene produz um 45S é clivado para um intermediário 41S a partir do

( a ) E. coli Figura 8.26 Processamento do RNA

DNA 5* LU
16S
n
RNAt
—r
Gene codificador de RNA
i
235 RNAr 5S
I I 13'
RNAt
ribossòmico t de transferência, (a ) Um
grande transcrito é clivado para produzir
RNAr e RNAt na L coii (b) Genes de RNAr
RNAr RNAr humano fazem parte de uma sequência
repetida de 40 kb que produz três RNAr.
0 A transcrição produz um
transcrito de pré - RNA 30S
comendo três segmentos de Transcrição
RNAr e dois segmentos de RNAt

-
pré RNA 5' I T -
Transcrito de pré RNA 30S
16S RNAt 23S RNAr 5S RNAt
RNAr RNAr

0 trAêclivagem enzimá tica libera

s RNAr (5S, 16S e 23S) com Clivagem do RNA
transcritos de RNAt.

[ ] I I RNA rbossômico
16S 23S 55
e
I I + I I RNA de transferência
RNAt RNAt

( b) Humano
Unidade transcrkional Espa çador
de RNAr com 13 kb intergê nico

DNA 5'
ETS ITS1 ITS2
JLL
-27 U
kb
y Transcrito de pré RNA 305
18S 5.8S 28S

0 transcrito
A transcrição sintetiza um
-
de pré RNAr 45S de
Transcrição
três segmentos de RNAr 18S,
5,8S e 285.

Pré-RNAr 5 ] Li 3' :ranscito dc pré RNAr 45S

185 5.8S 28S

0 trAêclivagem enzimá tica produz

s RNAr; os RNAr 5,8S e 285 Clivagem do pré RNAr -
são unidos em uma região da
sequência complementar.

535
Q
0 ETS, nsi e ÍTS2 são removidos pela clivagem
18S 28S enzimática Os RNAr 53S e 28S se unem peto
pareamento de bases complementares
290 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

qual o transcrito 18S é removido, seguido pela cliva

gem que produz os transcritos 28S e 5,8S. Os produtos
5,8S e 28S formam pares entre si e passam a fazer parte
da mesma subunidade ribossòmica. Após o processa -
mento, os RN Ar resultantes dobram -sc cm estruturas
secundá rias complexas e sâo unidos por prote í nas, for
mando subunidades ribossômicas. Algumas modifica
ções químicas do RNAr, particularmente a metilação
de bases nucleot ídicas selecionadas, ocorrem após o
té rmino da transcrição.
- de RNAt. Nos eucariotos, os genes de RNAt ocorrem
aos grupos em cromossomos específicos. Cada gene
de RNAt eucariótico é transcrito individualmente pela
-
RNA polimerase III e um ú nico pré RNAt é produzido
a partir de cada gene.
- A quantidade de RNAt diferentes produzidos de-
- pende do tipo de organismo. Nas bactérias, o n ú mero
exato de RNAt diferentes varia, mas normalmente é
muito menor que 61, o n ú mero de códons encontra -
dos no RNAm. No mínimo, cada espécie precisa ter

Processamento do RNA de transferência

O processamento do RNAt é diferente nas bacté-
rias e nos eucariotos. Cada tipo de RNAt tem nucle-
otideos característicos e um padrão específico de do
bramento, mas todos os RNAt possuem estruturas e
funções similares ( Figura 8.27 ) Algumas moléculas de
RNA de transferê ncia bacteriana são produzidas simul
taneamente com os RNAr, conforme descrito anterior
.
mente (ver Figura 8.26a ) Outros RNAt são transcri
tos como parte de um grande transcrito de pré- RNAt
que depois é clivado para produzir vá rias moléculas
pelo menos 20 RNAt diferentes, um para cada ami
noácido, mas a maioria produz pelo menos 30 a 40
-
RNAt diferentes. O baixo n ú mero de RNAt diferentes
(em comparação com o n ú mero de códons ) resulta
- de um fen ó meno chamado oscilaçã o da terceira hase,
um relaxamento das " regras" do pareamento de bases
. complementares na terceira base dos códons (ver Ca -
-- pí tulo 9). Embora a oscilação da terceira base tenha
um papel na redu ção do n ú mero de genes de RNAt
- distintos necessários nos genomas eucarióticos, os
eucariotos produzem um n ú mero de RNAt diferentes
maior que as bactérias. Alguns genomas eucarióticos

——
Figura 8.27 Estrutura do RNA de
Wi
transferência. Cada RNAt tem uma i Aminoácido
HjC C H
íst íca.
estrutura caracter I (atanina )

Sítio de acoplamento
de aminoácido

(a) (b)

Quatro hastes de fita Braço e Extremidade 3'

dupla, três deas com alçaTVC ( término CCA )
alças de fita simples,
fbrmam a estrutura Extremidade 5'
C
hcY+
secundária das G C
moléculas de RNAt G
C - U
G
VTi ^liga
Sítiode

u; Braço e alça TVC

/ \'i ção 3'
para aminoácido
->
Braço e alça D u- r Braço e
GMe IG C alça D

C
GMe /
1
cl
U
C
—IGA A
G
3
° Braço extra
C G
Braço do . C G Bra ço do .
anticódon anticódon
0 IMe
Anticódon

Anticódon
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 291

conté m um conjunto completo de 61 genes de RNAt
diferentes, cada um correspondente a um códon do
código genético.
Os RNAt bacteríanos exigem processamento antes
de estarem prontos para assumir seu papel funcional de
transportar aminoácidos para o ribossomo. Os even
tos de processamento exatos sào um pouco diferentes
entre os RNAt, mas vá rias caracteristicas são comuns.
Primeiro, muitos RNAt são clivados de grandes trans
critos de RNAt precursor para produzir vá rias molé-
culas de RNAt individuais. Segundo, os nucleotídeos
sã o aparados nas extremidades 5' e 3’ dos transcritos
de RNAt para preparar a molécula madura. Terceiro,
certos nucleotídeos individuais nos diferentes RNAt
sã o quimicamente modificados para produzir uma mo
lécula característica. Quarto, os RNAt se dobram em
uma estrutura tridimensional precisa que inclui quatro
hastes de fita dupla , trés delas capeadas por alças de fita
simples; cada haste e al ça constituem um " braço" da
molécula de RNAt. Quinto, os RNAt sofrem a adição
de bases após a transcrição. A adição mais comum é
de três nucleot ídeos, CCA, na extremidade 3’ da mo -
lécula. A região é o sítio de ligação do aminoácido que
a molécula de RNAt transporta para o ribossomo. A
Figura 8.27 mostra o RNAt , que carrega a alanina.
A terminação CCA é indicada ^ , com nucleot ídeos mo-
dificados quimicamente em cada braço, os quais sã o
caracter ísticos desse RNAt. Sào exibidas as representa
ções bidimensional e tridimensional.
Os RNAt eucarióticos sofrem modificações de
processamento similares às dos RNAt bacter íanos. No
mado edição do RNA foi revelado como responsá vel
pelas modificações pós - transcrição que alteram a infor-
mação genética transportada pelo RNAm .
Ocorrem dois tipos de edição do RNA. Em um dos
tipos, as uracilas sào inseridas no RNAm editado com
- o auxílio de um RNA especializado, chamado RNA -
- guia ( RNAg). Um RNA - guia, transcrito de um gene
codificador de RNA separado, contém uma sequência
- complementar à região do RNAm que ele edita. Com o
auxílio de um complexo proteico, uma parte do RNA-
-guia forma par com os nucleotídeos complementares
do RNAm pré- editado e age como um molde para con -
trolar a inserção (e ocasionalmente a deleçã o) da uracila
( Figura 8.28). O RNA - guia libera o RNAm editado após
- o término da edição. As proteínas traduzidas do RNAm
editado podem diferir da proteína produzida a partir do
transcrito não editado.
O segundo tipo de edição do RNA é por substitui -
ção de bases e consiste frequentemente na substituição
da citosina pela uracila ( edição C para U) no RNAm. Esse
tipo de edição do RNA foi identificado nos mamíferos,
na maioria das plantas terrestres e em vá rios eucariotos
unicelulares. A consequência da edição do RNA C para
U é demonstrada pelo produto proteico do gene apoli -
proteina B dos mam íferos ( Figura 8.29 ). Um gene idên -
- DMA
5 AAAAGGCTTTAA 3' Fita codificadora
5 ' Fita - molde
I
Transcrição

entanto, além disso, os pré- RNAt eucarióticos podem 1

conter pequenos íntrons que são removidos durante o RNAm 5' A A A A G G C U U JA A
processamento. Por exemplo, um íntron com 14 nu - I
Pareamento com RNA-guia
cleotídeos de comprimento é removido da molécula
precursora por uma enzima nuclease especializada que I
cliva os sítios de splicing 5’ e 3’ dos íntrons de RNAt. O O RNA-guia oe fita simples forma par com uma parte do RNA
RNAt clivado se dobra novamente para formar a haste mensagei'0. Repare nos nucleot ídeos adenina nas al ças
nâo pareadas.
do anticódon e a enzima RNA ligase une as extremida -
des 5' e 3' do RNAt. RNAm 5'j y
RNAg 3' . u u lYU
“

C CVG ,A A A U U V

Observa çã o gené tica Os transcritos de RNA rlbos-

sômico e de transferência são processados pela a çã o enzi-
Edição do RNA
mática para formar RNAr e RNAt funcionais. Certos RNAm
-
sà o capazes de se submeter ao avto SpHdng para produzir l
RNAm maduro. A enzima nuclease corta o RNAm e a RNA pol í meras* usa o
RNA guia para adicionar uracilas ao RNAm complementar à s
adeninas do RNAg.

Edição pó s-transcriçã o do RNA RNAm 5 OTTPff TimiTITI ZI 3*

RNAg UUUlAAlICCAAAAGAA À UlJ ?
Um princí pio bem estabelecido no dogma central
da biologia é o papel do DNA como repositó rio e forne- Libera çà o do RNAm editado
cedor de informa ção genética. Não obstante as modifi - l
cações feitas pelos transcritos de RNA precursor após O RNAm maduro dc RNA ecrtado contém nucleotídeos uracila nâo
a transcrição, um princí pio fundamental da biologia é cod ócados pelo DNA
que o DNA dita a sequência de nucleot ídeos de RNAm RNAm 51 ilTlillHTlTU“ 3'
e controla a ordem dos aminoácidos nas proteínas.
Ainda em meados dos anos 1980, um fen ômeno cha - Figura 8.28 O RNA - guia controla a edição do RNA.
292 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

m
^ TAà
*

DNA
3’Z/ (í llillHB III l l l l IIIIHII nEiTSíriiiTiãM .
IIéI D'
Transcrição
. Códon de parada

i
Processamento do RNA
nas células hepáticas
I
RNAm maduro CAA U A A A A A r 3' RNAm maduro Sr|
^ Q| C A A|U A A A A A , 3’

Ediçã o do RNA (C-U )

nas células intestinais
i

Tradu ção
RNAm maduro S|
'
^ Q]
I
UAA

Tradução
B UAA

i l
Polipeptideo -IHIMMHMMItMMIHIIt]
4.563 amlnoáddos
Polipeptideo -íTTTIITIIIIIII^ T
2.l 52 aminoácidos
—
O processamento normal do A edição do RNA troca C por U no códon
pré-RNAm produz proteina
com 4563 aminoácidos.
.
2.153 criando um novo códonde parada.
A tradução para após sintetizar uma
proteína contendo 2.152 aminoácioos

Figura 8.29 Edição do RNA do transcrito de RNAm do gene da apoliprotefna B humana .

tico contendo 29 éxons é encontrado nas células dos
mamíferos e o mesmo RNAm é transcrito em todos os
tecidos. Parte dessa sequê ncia de RNA mensageiro inclui
o códon de n ú mero 2.153 que tem a sequência CAA e é
traduzido como glutamina na apoliproteína B hepá tica ,
uma proteína consistindo em 4.563 aminoácidos. No en
tanto, nas células intestinais, a edição do RNA muda a
citosina no códon 2.153 para uma uracila, convertendo
o códon para UAA. Essa mudan ça de C para U produ
zida pela edição do RNA cria um códon de “ parada ” que
interrompe a tradução após a montagem dos primeiros
2.152 aminoácidos da apoliproteína B intestinaL
Observa çã o gené tica A edição do RNA realiza mu-
danças pós transcrição na sequência de RNAm pela substitui-
- ção de bases (normalmente C para U) ou por inserçã o, mais
frequentemente da uracila, no transcrita Ambos os tipos de
edição do RNA podem alterar o produto proteico traduzido a
- partir do RNAm editado.

ESTUDO DE CASO

Splicing sexual: splicing alternativo do RNAm e determina ção do sexo na Drosophila

O n úmero de cromossomos X encontrado nos n úcleos
dos embriões da Drosophila é crítico na determinação do
sexo, mas a proporção X/autossomo ( X/ A ) proposta por
Calvin Bridges ( X/A - 1,0 nas f é meas e X/ A = 025 nos ma
chos ) não é precisa ( ver Seção 3.4). Em vez disso, o processo
cnvolve a expressão genica e o splicing do pré RNAm. A -
base molecular da determinação do sexo na Drosophila de
pende dc uma série dc etapas que começa com a ativação
-
da transcrição do gene sexo letal ( Sxí ), inclui o splicing al -
-
temativo do transcrito de pré RNAm do gene transformer
( Tra ) e culmina com uma de duas variantes de splicing
-
alternativo dos transcritos de pré RNAm do gene duplo
-sexual ( Ds.r ). A proteína Dsx controla a posterior ativaçã o
da transcrição e a repressão, levando a um desenvolvimento
feminino ou masculino.
- A proporção X/A nos embri ões da mosca influencia
inicialmcntc a transcriçã o c a tradução das proteínas ati -
vadoras ligadas ao X, chamadas SisA e SisB, e um gene
- autossômico que produz uma prote ína repressora da trans -
crição, chamada Dcadpan ( Figura 8.30 ). Como os genes que
produzem a SisA e a SisB sâo ligados ao X, os embriões
femininos iniciais produzem duas vezes mais cada ativadora
que os embriões masculinos iniciais, e a proporção de SisA
- + SisB para a Deadpan difere entre os embriões femininos
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 293

O determina
A proporção X/A O A proteína Sxl controla o spticing do
0 Transcrição epré-RNAm do Tra para produzir a
O O spHc íng alternativo
a propor ção
tradução do Sxl nos do pré-RNAm do Dsx
ativador repressor. embriões femininos, proteí na Tra nos embriões é controlado pela
2 cromossomos X
Embrião ^ SisA
K.
Sí sA
mas não nos
masculinos.
Pré - RNAm
femininos, mas nã o nos masculinos.

Proteí na Tra
proteína Tra.

feminino SisB SisB T

do gene Tra
=
( X/ A 1,0) Deadpan + Deadpan Proteí na Sxl
Proteína Tra-2
\ RNAm maduro
i A proteí na Dsx
especifica para as
2 autossomos gene Êxon 11 Éxon 31
do Tra f émeas atrva os genes
femininos e reprime os
masculinos .
I cromossomo X
7 Nenhuma atividade Sxl
Embrião SisA Nenhuma -
Pré RNAm Nenhuma proteína Tra
masculino SisB proteína Sxl do gene Tra íaytfllESHlKSHI
(X/ A = 0,5 ) Deadpan + Deadpan
Nenhum spitcing A proteína Dsx
\ produtivo específica para os
2 autossomos machos reprime os
genes femininos.
F igura 8.30 A propor ção X/ A determina o padr ão de transcrição génica e de splicing do transcrito para determinar o
sexo nas moscas- da -fruta.

.
e masculinos Nos embriões femininos iniciais, a proporção
-
de SisA f SisB para a proteína Deadpan leva à transcrição
do gene S r / e à produção da prote ína Sxl. A transcri ção do
Sxl é reprimida nos embriões masculinos c nenhuma pro
te ína Sxl é produzida.
A prote ína Sxl é uma reguladora do splicing que opera
no transcrito de pré- RNAm do gene Tra. Nos embriões
-
femininos, o pré RNAm do Tra sofre splicing para produ
zir uma prote í na Tra funcional. Nos embriões masculinos,
a ausência da prote ína Sxl leva ao splicing alternativo do
pré RNAm do Tra que n ão produz prote ína TVa funcional.
A prote ína Tra também é uma reguladora do splicing que
-
opera no pré RNAm do Dsx com uma segunda proteína
-
conhecida como Tra 2. Nos embriões femininos, as proteí-
nas TYa e Tira-2 promovem o splicing do pré- RNAm em
.
uma variante alternativa que quando traduzida , produz pro
. -
- teína Dsx específica para as f ê meas A Dsx específica para
as fêmeas ativa a transcrição dos genes específicos para as
fcrncas c reprime a transcrição dos genes específicos para
os machos, produzindo moscas fêmeas. A prote ína Tra está
- -
ausente nos embriões masculinos e o pré RNAm do Dsx
sofre splicing cm uma variante alternativa . A proteína Dsx
nos embriões masculinos reprime os genes específicos para
as f ê meas e permite a transcrição dos genes específicos
para os machos n ão reprimidos, levando ao desenvolvi -
mento sexual masculino.

RESUMO
8.1 Os transcritos do RNA transportam Os promotores bacterianos tèm duas regiões de sequê ncia
as mensagens dos genes de consenso situadas a montante do in ício da transcrição,

I As moléculas de RNA são sintetizadas pelas RNA polime-

I A enzima principal da RNA poiimerase bacteriana executa a
rases usando como elementos bá sicos os nudeot ídeos
do RNA A, G, C e U para formar sequências de fita simples
complementares à s fitas-molde do DNA.
I O RNA mensageiro é o transcrito que sofre tradu ção para
produzir proteí nas. Cinco outras formas importantes de
RNA funcional são transcritas e podem sofrer modificaçã o,
mas n ão sã o traduzidas.
- -
aproxlmadamente em 10 e 35.
síntese do RNA após a iniciação da cadeia pela holoenzima.
A transcrição da maioria dos genes bacterianos termina
por meio de um mecanismo intr í nseco que depende ape-
nas das sequências terminadoras de DNA. Certos genes
bacterianos possuem um mecanismo dependente da pro-
teí na rho para terminar a transcrição.

83 A transcrição bacteriana é um processo de 83 A transcrição eucari ótica usa várias RNA

quatro estágios
A transcrição tem quatro estágios: reconhecimento do pro-
motor, iniciação, prolongamento e terminação da cadeia .
Uma ú nica RNA poiimerase transcreve todos os genes bac
terianos. Essa poiimerase é uma holoenzima composta de
uma enzima principal com cinco subunidades e uma subu-
nidade sigma que ajuda no reconhecimento das diferentes
formas de promotores bacterianos.
polimerases
As cé lulas eucarióticas contém trés tipos de RNA poli-
merases que transcrevem o RNAm e as vá rias classes de
RNA funcional.
-
A RNA poiimerase II transcreve o RNAm pela interação
com vá rios fatores de transcrição que levam a enzima a re-
conhecer os promotores que controlam a transcrição dos
genes codificadores de polipeptídeos.
294 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

I Os promotores reconhecidos pela RNA polimerase II têm
uma TATA box e outros elementos regulatórios que se
ligam aos fatores de transcrição e à RNA pol II durante a
iniciação da transcrição.
I Os elementos regulatórios promotores eucarióticos são re-
conhecidos por suas sequências de consenso.
As modificações específicas para o tecido e evolutivas na
transcrição são reguladas por sequências ativadoras e si-
lenciadoras.
A RNA polimerase I usa fatores de transcrição exclusivos
para reconhecer sequências de consenso a montante dos
genes de RNA ribossômica
A RNA polimerase III reconhece as sequências de consenso
promotoras que estão a montante e a jusante do início
da transcrição.
8.4 O processamento pós- transcrição modifica
as moléculas de RNA
0 capeamento da extremidade 5' do RNA mensageiro eu-
cariótico adiciona uma guanina metllada por meio da ação
da guanilil transferase logo após o inicio da transcrição .
A poliadenilaçáo na extremidade 3' do RNA mensageiro
eucariótko é sinalizada por uma sequência AAUAAA e exe-
cutada por um complexo enzimático.
O splicing intrônico é controlado pelas proteínas celulares
que identificam íntrons e éxons e formam complexos de
spliceossomo que removem íntrons e ligam éxons.
As sequências de consenso nos sítios de spiidng 5' e 3' e no
ponto de ramificação servem como guias durante o spli -
cJng intrônico.
0 spiidng alternativo é regulado pela variação das proteí -
.
nas específica para o tipo de tecido, que identifica íntrons
e éxons.
Algumas moléculas de RNA têm atividade catalítica e são
capazes de se submeter ao auto- splidng dos íntrons sem
ajuda de proteínas.
As moléculas de RNA ribossômico e de RNA de transfe -
rência são geradas pela clivagem de grandes moléculas
precursoras, transcritas nos genomas bacterianos
e eucarióticos.
A edição do RNA é uma alteração pós-transcr íçâo da
sequência nucleotídica, fazendo que os transcritos sejam
diferentes da sequência-molde de DNA correspondente.

TERMOS-CHAVE

Adenina do ponto de ramificação (p.281)
Ativadores de spiidng exònico (ESEs)
lp. 283 )
Auto-splicing intr ônico { p. 287 )
CAATbox ( p. 273 )
Caixa de Pribnow (sequência de
consenso 10) (p. 265)
- Pequeno RNA interferente (RNAsO (p. 263)
Capeamento da extremidade 5' (p. 278)
Complexo comprometido inicial (p. 273 )
.
Complexo de iniciação completo (p 273)
Complexo de iniciação mínimo (p. 273 )
Complexo promotor aberto (p. 267)
Complexo promotor fechado (p.267)
Edição do RNA (p. 297)
Elemento de controle a montante (p. 276)
Elemento específico para o promotor
(PSE) (p. 276)
Elemento principal (p. 276 )
Elemento promotor interno (p. 276)
Enzima principal (p. 264 )
Estrutura de laço intrônico (lariat) (p.282)
Fator I de terminação da transcrição
(TTFI) (p. 277 )
Fatores associados à TBP (TAF) (p. 273)
Fatores de transcrição (TFs) (p. 273)
Fita codificadora (p. 264)
Fita não molde (p. 264)
GC box ( p. 273 )
Haste em alça (estrutura em “grampo de
cabelo' ou hairpin ) (p. 269 )
Jusante (p. 264)
Montante (p. 264)
Nucléolo (p. 276)
Pequeno RNA nuclear (RNAsn) (p. 263)
Poliadenilaçáo 3' (formação da cauda
poli- A na extremidade 30 (p. 278 )
Processamento alternativo do pré-
- RNAm ( spiidng intr ônico alternativo,
promotores, poliadenilação)
<p. 283, 286)
Promotor (p. 264)
Proteínas SR (p. 282 )
Proteína de ligação á TATA (TBP) (p. 273)
.
Região de controle interna (ICR) (p 277)
Região de terminação (p. 264)
Repetição invertida (p. 269)
Ribonucleotideos ( A, U, G e C) (p. 261 )
Ribose (p. 26í )
RNA de transferência (RNAt ) (p. 263)
RNAm maduro (p. 278)
.
RNA mensageiro (RNAm) (p 263)
RNA ribossômico (RNAr) (p. 263 )
RNA polimerase (RNA pol, RNA pol l (
RNA guia (RNAg) (p. 291)
RNAm precursor (pré-RNAm) (p.278)
RNAmicro (RNAmi) ip. 263 )
.
RNAs funcionais (RNAt RNAr, RNAsn,
RNAmi, RNAsi, ribozimas) (p. 263, 264)
Sequência ativadora (p. 275)
Sequência de consenso (p. 265)
Sequência de consenso -35 (p. 265)
Sequência de sinal de poliadenilação
ip.279)
Sequência silenciadora (p. 275)
Sítio de spiidng 3' (p. 281 )
Sítio de spiidng 5' (p. 281 )
Sítio de utilização da rho (sítio rut) (p. 270)
Spiidng intrônico (p. 278 )
Spliceossomo (p. 281)
Subunidade sigma (o) (subunidades
sigma alternativas) (p. 264, 265)
TATA box (caixa de Goldberg-Hogness)
(p. 273)
Terminação intrí nseca (p.269)
Terminação dependente de rho
(proteína rho) (p. 269)
Uracila (U) (p. 261 )
.
Via de transdução de sinal (p 275)

Fita-molde (p. 264) .

RNA pol II RNA pol III) (p. 262, 270)
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA
PROBLEMAS
Conceitos do capí tulo
1. Em termos do dogma central da biologia molecular,
a. O que é um gene?
b. Por que os genes de RNAr e RNAt são considerados
genes, embora náo produzam polipeptideos?
2. Com no máximo duas frases para cada um, descreva os
três processos que modificam o prê-RNAm eucariótico
3. Responda a estas perguntas relativas aos promotores . Gene 1
a. Qual é o papel exercido pelos promotores na transcrição?
b. Qual é a estrutura comum de um promotor bacteriano
com relação à s sequências de consenso?
c. Quais sequências de consenso são detectadas no pro-
motor do gene da (3 globina dos mamíferos ?
d. Os promotores eucarióticos são mais variáveis que os
promotores bacterianos. Explique por quê.
e. Qual é o significado do termo promotor alternativo? Como
o uso dos promotores alternativos afeta a transcrição?
4. O diagrama a seguir mostra um duplex de DNA. A fita
-molde é identificada assim como a localização do nucleo-
tideo + 1 .
1 que elas existem.
5' I 3' Flta-molde
3' 5’ Fita codificadora
a. Suponha que essa região contenha um gene transcrito
em uma bactéria. Identifique a localização das sequên-
cias de consenso promotoras e da sequência de termi-
nação da transcrição.
b. Suponha que essa região contenha um gene trans-
crito para formar RNAm em um eucar íoto. Identifique
a localização das sequências de consenso promotoras
mais comuns.
c. Se essa região for um gene eucariótico transcrito pela
RNA polimerase III, onde estão situadas as sequências
de consenso promotoras?
5. O trecho a seguir é parte de uma sequência de RNAm:
3' - AUCGUCAUGCAGA - 5'
a. Durante a transcrição, a adenina no lado esquerdo
da sequência foi o primeiro ou o último nucleotideo
adicionado à parte do RNAm exibido? Explique como
você sabe.
b. Escreva a sequência e a polaridade do dúplex de DNA
.
que codifica esse segmento de RNAm Indique as fitas-
molde e codificadora do DNA.
c. Identifique a direção na qual a região promotora desse
gene estar á situada.
6. Compare e diferencie as propriedades da DNA polime
rase e da RNA polimerase, apresentando pelo menos três
semelhanças e três diferenças entre as moléculas . 1
7. As sequências de DNA exibidas a seguir são das regiões
promotoras de seis genes bacterianos. Em cada caso o
295
Para obter as respostas dos probíemas pares,
ver o Apêndice: Respostas.
último nucleotideo na sequência ( destacado) é o nucleo-
tídeo -fl que inicia a transcrição.
a. Examine essas sequências e identifique a sequência
da caixa de Pribnow a aproximadamente -10 de cada
promotor .
. b. Determine a sequência de consenso da caixa de Prib-
now a partir dessas sequências.
. TTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGA ...
Gene 2 . CGTCATTTGATATGATGCGCCCCG .. .
Gene 3 . CCACTGGCGGTGATACTGAGCACA .
Gene 4 . TTTATTGCAGCTTATAATGGTTACA
Gene 5 . TGCTTCTGACTATAATAGACAGGG .
Gene 6 . AAGTAAACACGGTACGATGTACCACA
8. Entre os transcritos dos genes bacterianos e eucarióticos,
existem diferenças nos próprios transcritos, no fato de
- serem ou náo modificados antes da tradução e em como
.
os transcritos são modificados Para cada uma dessas três
áreas de contraste, descreva quais são as diferenças e por
9. Descreva os dois tipos de terminação da transcrição en-
contrados nos genes bacterianos. Em que a terminação
da transcrição é diferente nos genes eucarióticos?
10. Qual é o papel das sequências ativadoras na transcri -
ção dos genes eucarióticos? Especule o porquê de as
sequências não fazerem parte da transcrição dos genes
bacterianos.
11* Descreva a diferença entre as sequências Intrônicas e as
espaçadoras, como a sequência espaçadora retratada na
Figura 8.26b.
12. Desenhe um promotor bacteriano e indique suas sequên-
cias de consenso. Em que esse promotor é diferente de
um promotor eucariótico transcrito pela RNA polimerase
II? E pela RNA polimeraseI? E pela RNA polimerase III?
13. Como as proteínas SR ajudam a guiar o splicing intrònico
do prê-RNAm ? O que significa o termo spfklng alterna-
tivo e qual é o papel desempenhado pela variação na
produção da proteína SR ?
14. Três genes identificados no diagrama como A, 8 e C são
.
transcritos de uma região do DNA A transcrição 5' para
3' dos genes AeC prolonga o RNAm da direita para a es-
querda, e a transcrição do gene B prolonga o RNAm da
esquerda para a direita. Para cada gene, identifique a fita
A
-
codificadora de cada gene designando-a como 'fita su-
-
perior ou "fita inferior no diagrama .
R C
3'
.
3'
'
1 '
I 1 = 5'
296 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
Aplicação e integração
.
15 O gene eucariótico Gen - 100 contém quatro íntrons cha-
mados A a D. Imagine que o Gen- 100 foi isolado e seu
DNA foi desnaturado e misturado com o RNAm poliade-
nilado do gene.
a. Ilustre a estrutura de alça em R que seria vista na mi-
croscopia eletrónica.
b. Indique os íntrons.
c As regiões intrònicas são de fita simples ou dupla? Por què?
16. O segmento do gene TrpA bacteriano envolvido na ter - postas à DNase 1.0$ resultados são exibidos a seguir .
minação intrí nseca da transcrição é exibido a seguir . pb
-
3 ' TGGGTCGGGGCGGATTACTGCCCCGAAAAAAAACTTG - 5'
-
5' ACCCAGCCCCGCCTAATGACOGGGCTTTTTTTTGAAC - 3'
a. Desenhe a estrutura do RNAm que se forma durante a
transcrição desse segmento do gene TrpA.
b. Indique as fitas molde e codificadora do DNA.
c Explique como uma sequência desse tipo leva à termi-
nação intrínseca da transcrição.
.
17 Um fragmento de 2 kb do DNA da £ coli contém a se
quência completa de um gene piara o qual a transcrição
é terminada pela proteína rho. 0 fragmento contém a se-
quência promotora completa e também a região termi
.
nadora do gene 0 fragmento donado é examinado pelo
ensaio de mudança de mobilidade eletrofor ética (ver
Técnica de Pesquisa 8.1). Cada faixa de uma única eletro-
forese em gel contém o fragmento clonado de 2 kb nas
seguintes condições:
Faixa 1: fragmento de 2 kb isolado
Faixa 2: fragmento de 2 kb maisenzima principal
Faixa 3: fragmento de 2 kb mais holoenzima RNA polimerase
Faixa 4: fragmento de 2 kb mais proteína rho
.
a Diagrame as posições relativas previstas para os frag-
mentos de DNA nessa análise de retardo no gel.
b. Explique as posições relativas das bandas nas faixas 1 e 3.
c Explique as posições relativas das bandas nas faixas 1 e 4.
18. Um segmento de DNA de 3,5 kb contendo a sequência
completa do gene de um camundongo está disponível
O segmento de DNA contém a sequência promotora e se
estende para além do sitio de poliadenilaçáo do gene. O
DNA é estudado pelo ensaio de mudança de mobilidade
eletroforética (ver Técnica de Pesquisa 8.1) e as seguintes
bandas são observadas.
Faixa: 1 2 3 4 5 relação ao crescimento do tipo selvagem, caracterize a
n n rr n capacidade da cepa madura para realizar a transcrição a
Faça a correspondência entre essas condições e uma
faixa especifica do gel.
a. Fragmento de 3,5 kb mais TFIIB e TFIID
b. Fragmento de 3,5 kb mais TFIIB, TFIID, TFIIF e RNA poli -
merase II
c Fragmento de 3,5 kb isolado
d. Fragmento de 3,5 kb mais RNA polimerase II
e. Fragmento de 3.5 kb mais TFIIB
19. Um fragmento de DNA de 1,0 kb da extremidade 5' do
gene do camundongo descrito no problema anterior é
examinado pela análise da proteção do DNA footprint (ver
.
Técnica de Pesquisa 8.1) Duas amostras são marcadas nas
extremidades com J2P e uma das duas é misturada com
TFIIB, TFIID e RNA polimerase II. As duas amostras sáo ex -
i ©
1000
900 "
800
700 -
600
500 -
- 400 -
300 H
200 -
-
100 -
1 -
a. Que quantidade (comprimento) de DNA é ligada pelas
proteínas transcricionais? Explique como os resultados
do gel apoiam essa interpretação.
b. Desenhe um diagrama desse fragmento de DNA, li -
gado pelas proteínas transcricionais, exibindo a posi-
ção aproximada das proteínas ao longo do fragmento.
Use o estilo de ilustração da Técnica de Pesquisa 8.1
como modelo.
c. CxpHque o papel da DNase I. O DNA exposto à s proteí -
nas se encontra na faixa direita do gel. O DNA de con-
trole está na faixa esquerda.
20. O crescimento da £ coli do tipo selvagem é melhor a 37*C
mas ela consegue crescer eficientemente até 42°C Uma
. cepa de £ colt tem uma mutação da subunidade sigma
que resulta em uma holoenzima RNA polimerase, que é
estável e transcreve nos níveis do tipo selvagem a 37°C A
holoenzima mutada é progressivamente desestabillzada
conforme a temperatura aumenta e desnatura comple-
tamente, parando de realizar a transcrição a 42°C. Com
a. 37*C
b. 40C "
c. 42
^
d Qual é o termo que melhor caracteriza o tipo de mu
tação exibida pela cepa bacteriana mutada? [Dica: o
termo foi usado no Capítulo 4 para descrever o alelo
himalaio do gene C dos mamíferos.)
.
21 Uma cepa mutada da bactéria Salmonella carrega uma
mutação da proteína rho que tem plena atividade a 37*C,
mas é completamente inativada quando a cepa mutada
é cultivada a 40°C.
 Capitulo 8 Biologia molecular da transcrição e processamento do RNA 297

.
a Especule sobre as diferenças que você espera encon- c. Escreva a polaridade e a sequência do transcrito de
trar se comparar um amplo espectro de RNAm da RNA a partir da sequência de DNA fornecida.
cepa mutada cultivada a 37°C e o mesmo espectro de d. Identifique a direção na qual o promotor desse gene
RNAmsda cepa quando cultivada a 40°C está situado.
.
b Todos os RNAm são afetados da mesma maneira pela
Fita
mutação da proteína rho? Por quê? codificadora 5'
22. O alelo do tipo selvagem da (3-globina humana e um zxxX'
£smmzsss&
certo alelo mutado têm sequências idênticas, exceto
quanto a uma única substituição de pares de bases que
Frta-molde 3" '
*** 3'

altera um nucleotídeo na extremidade do intron 2. As se- 26. A proteção do DNA footprint (descrita na Técnica de Pes-
quências do tipo seh/agem e mutante da parte afetada quisa 8.1) é um método que determina se a proteína se
do pré-RNAm são liga a uma amostra específica do DNA e, assim, protege
parte do DNA contra a clivagem enzimá tica aleatória rea-
(ntron 2 | Êxon 3 lizada pela DNase I. Acredita-se que um segmento de 400
Tipo selvagem 5'- CCUCCCACAG | CUCCUG - 3
/ pares de bases de DNA clonado contenha um promotor .
O DNA clonado é analisado pelo ensaio de proteção do
Mutado -
5' CCUCCCACUG | CUCCUG 3' - DNA footprint para determinar se tem capacidade para
a. Especule sobre a maneira que essa substituição de agir como sequência promotora. O gel exibido a seguir
base provoca a mutação da proteína|V-globina. tem duas faixas, cada uma contendo o fragmento de DNA
.
b Esse é um exemplo de como a mudança na sequência de 400 pares de bases clonado e tratado com DNase I
de DNA que ocorre em algum lugar que não seja um para clivar aleatoriamente o DNA desprotegido. A faixa 1
éxon pode produzir mutação. Apresente outros tipos de é o DNA clonado que foi misturado com RNA polimcrase
alterações na sequência de DNA que ocorrem fora dos II e vários fatores de transcrição TFII antes da exposição à
éxons e que podem produzir mutação. Em cada caso, .
DNase I A faixa 2 contém DNA clonado que foi exposto
caracterize o tipo de mudança que você espera ver em apenas è DNase I. A RNA pol II e os TFIIs não foram mistu-
um RNAm mutado ou em uma proteí na mutada . rados com o DNA antes de adicionar a DNase I .
23. Os microbiólogos descrevem os processos de transcrição 1 2
.
e tradução como "associados* nas bactérias Esse termo
indica que um RNAm bacteriano pode sofrer transcrição 400 -
no mesmo momento em que sofre tradução. 350 -
a. Como a associação da transcrição e da tradução é pos-
sível em bactérias? 300 -
b. A associação da transcrição e da tradução é possível
.
280
-
em eucariotos unicelulares como a levedura? Explique
24. Um gene eucaríótico completo é inserido em um cro-
mossomo bacteriano. O gene contém uma sequência
5
200
-
5
promotora completa e uma sequência de poliadenilação <V
O
funcional, possuindo nudeotídeos do tipo selvagem em i/»
QJ
toda a região transcrita . No entanto, o gene não produz
uma proteína funcional .
a. Apresente três possí veis razões para esse gene eucarió-
KL
100
-
.
tico não ser expresso nas bactérias.
b Que mudanças você recomendaria para permitir a expres-
80 -
são desse gene eucaríótico em uma célula bacteriana?
50 -
i

25. A ilustração a seguir mostra uma parte de um gene sub-
.
metido à transcrição As fitas molde e codificadora do
gene são indicadas, sendo fornecido um segmento da
sequência de DNA. Para esse segmento do gene:
a. Superponha um desenho da RNA polimerase à medida
que ela se aproxima do final da transcrição da sequên-
cia de DNA.
b. Indique a direção na qual a RNA polimerase se desloca
à medida que transcreve esse gene.
1
a. Explique por que esse gel fornece evidências de que o
DNA clonado pode agir como uma sequência promotora.
b. Qual comprimento corresponde, aproximadamente, à
região de DNA protegida pela RNA pol II e pelos TFIIs?
c Quais outros experimentos genéticos você sugeriria
para verificar se essa região de DNA clonado contém
um promotor funcional?
 Capítulo Biologia molecular da tradução

9
APRESENTAÇÃ O

9.1 Os rlbossomos são máquinas de tradução

9.2 A tradução ocorre em três fases
9.3 A tradução é rápida e eficiente
9.4 O código genético traduz o RNA mensageiro em
polipeptídeo
9.5 Experimentos decifraram o código genético
9.6 A tradução é seguida pelo processamento
polipeptkJico e peia classificação proteka

Os ribossomos usam sequências de códons do RNA mensageiro para

I A tradução é o processo celular de produção
de polipeptídeos executado pelos ribosso-
mos sob o controle do RNAm .
I Os ribossomos se acoplam ao RNAm e Ini-
ciam a tradução no códon de Inlckx
I O prolongamento e a terminação do poli-
peptídeo no códon de parada são similares
.
nas bactérias e nos eucariotos
I As moléculas de RNA de transferência levam
amínoácidos para os ribossomos, que sinte-
tizam os polipeptídeos com a ajuda das pro-
teínas ríbossómkas .
I Um código genético praticamente universal
consistindo em 64 códons de RNAm con - que a variação hereditária estava intimamente associada com
.
trola a síntese dos polipeptídeos
I Nos eucariotos, os polipeptídeos sofrem
processamento pós-traduçáo e são classifi-
cados em vesículas para transporte para as
destinações celulares ou para secreção.
.
controlar a montagem dos polipeptídeos durante a tradução Essa ar -
te-final de umírbossomo envolvido na tradução se baseia na recente
análise da estrutura cristalina e exibe com precisão a subunidade maior
(em cima) e a subunidade menor (embaixo), a faixa de RNAm através da
subunidade menor, os espaços para os sítios E, P e A nos quais os RNAt
se encaixam e a salda do polipeptídeo pela subunidade maior .
B em antes da descoberta de que o DNA é a molécula here-
ditária, biólogos estabeleceram a relação entre genes e
proteínas. Em 1902, Archibald Garrod foi o primeiro a desenhar
explicitamente essa conex ã o quando propôs que a alcaptonú-
ria, um transtorno humano hereditário, era provocada por um
defeito herdado na enzima ácido homogent ístico oxidase. À
medida que Garrod e outros biólogos ampliaram sua explora-
çã o da conex ão gene-proteína, eles encontraram evidências de
varia ções nas proteínas. Entre os biólogos que desenvolveram
essa conexão, os principais foram George Beadle e Edward Ta-
tum, cuja pesquisa estabeleceu a hipótese "um gene -uma enzi-
ma" (Capitulo 5).
Neste capítulo, voltamos nossa atenção para a tradução, o
mecanismo pelo qual os transcritos do RNA mensageiro (RNAm )
 Cap í tulo 9 Bicdogla molecular da traduçã o 299

dos genes sá o utilizados para montar aminoácidos
em cadeias polipeptídlcas que formam proteínas. A
tradução é executada pelos ribossomos que reúnem
os transcritos de RNAm e transferem as moléculas de
RNA de transfer ência (RNAt) que transportam amino-
á cidos e facilitam a montagem de polipeptídeos, ca-
deias de aminoácidos.
As histórias de como os polipeptídeos são pro-
duzidos pela tradução e sobre como os cientistas
chegaram a compreender o processo oferecem ideias
intrigantes sobre a concepção dos experimentos ge-
néticos moleculares. Neste capítulo, descrevemos
alguns desses experimentos e examinamos a biolo-
gia molecular da tradução. Também examinamos os
processos pós-traduçáo fundamentais na produção
de proteínas funcionais e para guiá-las até suas des-
tinações adequadas nas células. O capitulo se encerra
com um estudo de caso descrevendo a ação dos anti-
bióticos utilizados frequentemente e que Interferem
na tradução bacteriana.
9.1 Os ribossomos são máquinas
de tradução
Os polipeptídeos são cadeias de aminoá cidos reu -
nidas por ligações peptí dicas covaientes. A ordem dos
aminoácidos em um polipeptídeo é controlada pelas
sequências de nuclcotídeos do RNAm. A montagem
polipept ídica é orquestrada pelos ribossomos, que sã o
" má quinas" de ribonucleoprote í nas contendo vá rias
moléculas de RNA ribossómico ( RNAr ) e dezenas de
proteí nas. Os ribossomos bacterianos e eucarióticos
são compostos de duas subunidades que se reúnem em
um ribossomo quando a tradução começa. Os ribosso-
mos ligam -se ao RNAm e proporcionam um ambiente
para o pareamento de bases complementares entre as
sequências de códons de RNAm e as sequências de
anticódon do RNAt. (No Capítulo 1 e na Figura 1.11,
examinamos essas caracter ísticas mecâ nicas básicas da
tradução.) A Figura 9.1 sintetiza os elementos essenciais
da tradução. Os ribossomos traduzem o RNAm na dire-
—
ção 5’ > 3\ começando com o códon de início e termi-
nando com um códon de parada. Em cada códon triplo,
o pareamento de bases complementares entre o RNAm
e o RNAt determina qual atninoácido é adicionado ao

Figura 9.1 Visão global da tradução em bacté rias e eucariotos.

t/
RNAt
f
£
/ Aminoácidos

%
Sitio de acoplamento
do aminoácido

saindo J Subunidade Aminoá cido ligado

maior

Sitio P Anticódon
do RNAt Sítio
it RNAt chegando

Subunidade
Códons
do RNAm

RNAm
300 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Figura 9.2 Alinhamento do DNA,
RNAm e polipeptideo. DNA
Fita codificadora 5' I I
Fita -molde 3' L
Polipeptideo H,N
Amino-terminal
.
polipeptideo nascente (em crescimento) O códon de
início e o códon de parada definem os limites do seg
mento de RNAm traduzido. Os polipept í deos resultan
- -
tes têm uma extremidade N terminal (amino terminal)
correspondente à extremidade 5’ do RNAm e uma ex
tremidade C-terminal (carboxiterminal ), que corres-
ponde à extremidade 3’ do RNAm ( Figura 9 2). *
A Figura 9.2 identifica dois segmentos de transcrito
de RNAm que não sofrem tradução. Entre a extremi
dade 5’ do RNAm e o códon de início há um segmento
conhecido como região não traduzida 5', abreviada
como 5' UTR . A região entre o códon de parada e a ex
tremidade 3’ da molécula é a região não traduzida 3’
ou 3’ UTR. Conforme descrevemos em seções posterio-
res, a 5' UTR contém sequências que ajudam a iniciar
a tradu ção e a 3' UTR contém sequê ncias associadas à
termina ção da transcrição e, nos eucariotos, à modifica -
ção da extremidade 3' do RNAm.
Estruturas dos ribossomos bacteriano
e eucariótico
As moléculas específicas que compõem os ribos-
somos bacterianos e eucar íóticos são diferentes, mas as
estruturas e funções globais dos ribossomos são simila
res. Os ribossomos em bactérias e eucariotos desempe
nham trés tarefas essenciais:
1. Ligar-se ao RNA mensageiro e identificar o códon
de inicio, onde começa a tradução.
2. Facilitar o pareamento de bases complementares
dos códons de RNAm e dos anticódons de RNAt
que determinam a ordem dos aminoácidos no poli-
pept ídeo.
3. Catalisar a formação da ponte peptídica entre os
aminoácidos durante a formaçã o do polipeptideo.
As diferenças na composição ribossómica entre bac-
térias e eucariotos incluem o n ú mero e a sequénda de mo -
léculas de RNAr e o número e o tipo de proteínas ribos
sô micas. Os ribossomos de ambos os tipos de organismos
têm semelhanças estruturais importantes, já que cada um
deles é composto de duas subunidades chamadas sub-
unidade ribossómica maior e subunidade ribossómica
menor. O tamanho de cada subunidade ribossómica é
Gene
+1
Regi ão codificadora do RNA
Promotor
n/
I
Transcri ç ã o
p
Terminador
Códon
Códon
de inicio 1 de parada
RNAm 5' I
5' UTR
u I 3' UTR
1 3’
Traduçã o
I
ia COOH
Carboxiterminal
( N - terminal ) (C-terminaO
medido em unidades de Svedberg (S), que descrevem a
-- velocidade da sedimentação de uma substâ ncia durante
a centrifugação. Lembre- se de que essas unidades de Sved-
berg não são aditivas quando as subunidades são combi-
- nadas, pois a sedimentação é uma propriedade composta
afetada pelo tamanho, formato e estado de hidratação.
Os ribossomos da £ coli são os r í bossomos bacter í a -
nos mais profunda mente estudados e servem como um
- modelo para a estrutura ribossómica geral ( Figura 9.3a )
A subunidade menor dos ribossomos bacterianos tem
.
-
um valor de Svedberg igual a 30S. Ela contém 21 proteí
nas e um único RN Ar 16S composto de 1.541 nucleotí
--
deos. A subunidade maior dos ribossomos bacterianos é
uma partícula de SOS composta de 31 proteínas, um pe
queno RNAr 5S contendo 120 nucleotídeos e um grande
-
RNAr 23S contendo 2.904 nucleotídeos. Quando total
mente montado, o ribossomo bacteriano intacto tem um
-
valor de Svedberg de 70S.
As unidades grande e pequena contribuem para a for
mação de três regiões que desempenham papéis funcio-
-
nais importantes durante a tradução: o sí tio peptidil, ou
sítio P, o sítio aminoacil, ou sitio A, e o sí tio de saída,
ou sí tio E. O sítio P abriga o RNAt ao qual o polipeptideo
nascente está acoplado. O sítio A se liga à nova molécula
-
- de RNAt que carrega o aminoáddo a ser adicionado ao
polipeptideo. O sítio E proporciona um caminho de saída
para os RNAt à medida que eles saem do ribossomo após o
aminoáddo ter sido adicionado à cadeia polipeptídica. Os
ribossomos também formam um canal através do qual o
polipeptideo surge. Além disso, há um canal através da su -
bunidade maior por meio do qual o polipeptideo nascente
é expulso do ribossomo ( ver Figura 9.1).
Entre os eucariotos, os ribossomos dos mamíferos
são os mais plenamente caracterizados ( Figura 9.3 b ). A
subunidade ribossómica menor de 40S contém aproxi -
madamente 35 proteí nas e um ú nico RNAr 18S com -
posto de 1.874 nucleot ídeos. A subunidade ribossómica
maior dos mamíferos tem um valor de Svedberg igual
a 60S e contém de 45 a 50 proteínas, com três molécu -
las de RNAr. As moléculas de RNAr têm valores de 5S
( 120 nucleot ídeos), 5,8S ( 160 nucleotídeos) e 28S (4.718
nucleot ídeos ). O ribossomo intacto dos mam íferos tem
um valor de Svedberg igual a 80S. Assim como o cro-
 Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 301

(a) Bactérias (£. cot

í) (b) Eucariotos ( mam íferos)
RN Ar 28S
(4.718 nucleotfdeos)
RNAr 23S
( 2.904 nudeot ídeos)
Subunidade maior Subunidade maior RNAr 5,8S
SOS (160 nucleotfdeos)
RNAr 5S
+

—
(120 nucleotfdeos)
RNAr 5S
e 31 proteínas (120 nucleotfdeos)
e 50 proteí nas

RNArde 16S RNArde 18S

(1.S41 nucleotfdeos) (1.874 nudeot ídeos)
e 21 proteí nas e =** 35 proteí nas

Sítio P Sítio P
Sítio E Sítio A Sítio E Sítio A
1
Vi /
&

Ribossomo 70S Ribossomo 80S

Figura 9.3 Rlbossomos da bactérias a aucariotos. (a) O ribossomo bacteriano mais estudado é o da £ coile (b) os
ribossomos eucarióticos mais estudados são os dos mam íferos.

mossomo bacteriano, o ribossomo intacto dos mam ífe-
ros possui um sítio P, um sítio A e um sítio E, além de
um canal para a sa ída dos pept ídeos.
As proteínas contidas nas subunidadcs ribossómicas
podem ser separadas umas das outras por um tipo espe-
cializado de eletroforese, chamado eletroforese em gel
bidimensional. As 21 proteínas que fazem parte da subu
nidade ribossómica menor na £ coli e as 31 proteínas en
--
contradas na grande unidade ribossómica são separadas
efidentemente por esse m étodo. A Técnica de Pesquisa
9.1 ( ver página 304) descreve como a eletroforese em gel
bidimensional é utilizada para caractertzar as prote í nas
encontradas nas subunidades ribossómicas da £ coli.
-EM ), desenvolvida por Robert Glaeser nos anos 1970
e aperfeiçoada por Jacques Dubochet nos anos 1980. A
-
crio EM usa nitrogénio l íquido ou etano líquido, com
temperaturas de aproximadamente -200“C, para con-
gelar instantaneamente as macromoléculas e assim pre -
servá las em seu estado nativo. Uma molécula congelada
é colocada em um microcalibrador e varrida a partir de
vá rios â ngulos por feixes de elétrons que usam software
especializado para criar uma imagem tridimensional da
estrutura molecular. A crio-EM cria imagens tridimen -
mica
- —
sionais requintadamente precisas da estrutura ribossó-

Estrutura tridimensional do ribossomo
—
de modo muito parecido com as imagens CAT
scan do corpo humano revelando detalhes no nível de
alguns àngstrõms de tamanho ( Figura 9.4 ) Essas imagens.
-
identificaram a localização e as dimensões dos sítios E, A

—
Os ribossomos são pequenos
—
meros 25 nanóme
tros ( nm ) de diâmetro , tão pequenos que quase 10 mil
deles podem caber no espaço ocupado pelo ponto no final
- e P, por exemplo, e esclareceram as atividades mecâ nicas
dos ribossomos durante a tradução.

desta frase. Ninguém )amais “viu" um ribossomo, mas nos 9.2 A tradução ocorre em três fases
ú ltimos anos os biólogos estruturais têm utilizado pode- A tradução ocorre em trés fases: iniciação, prolon -
rosas técnicas de obtenção de imagens moleculares para
explorar a configuração tridimensional de muitas molé-
gamento e terminação. As trés fases geralmente são si
milares nas bactérias e nos eucariotos e, contudo, são
-
culas e estruturas biológicas, incluindo os ribossomos e as diferentes de vá rias maneiras, particularmente durante
subunidades ribossómicas em níveis de resolução medi
dos em àngstrõms (À). Essas análises estruturais esclare -
- a iniciação da tradução, cm que mecanismos distintos
são usados para identificar o códon de in ício.
ceram como as subunidades ribossómicas se encaixam e
elas produziram uma compreensão detalhada das intera -
Iniciaçã o da tradução
ções ribossómicas com o RNAm e o RNAt
A análise estrutural dos ribossomos e de outros com - A iniciação da tradução em bactérias e eucario -
plexos moleculares nas células é viabilizada por uma téc
nica conhecida como criomicroscopia eletró nica (crio
-- tos começa quando a subunidade ribossómica menor
-
liga se perto da extremidade 5’ do RNAm e identifica
302 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
(a )
Sitio P Sitio de ligação
Proteína
Sitio E do RNAt de amlnoácido
do RNAt
Sitio A
S do RNAt
30S
Sítio do
/
I Sí tio A
anticódon
Proteí na RNAm
Figura 9.4 Interpretações tridimensionais geradas por computador dos dados produzidos por crio-EM retratam a
estrutura ribossômica.
a sequê ncia do códon de inicio. No próximo estágio, o
RNAt iniciador, o RNAt que carrega o primeiro ami
noácido do polipept í deo liga -se ao códon de início. No
estágio final da inicia ção, a subunidade maior une-se à
subunidade menor para formar um ribossomo intacto e
a traduçã o começa. Durante esses está gios, as proteínas
do fator de iniciação ajudam a controlar a formaçã o do
ribossomo e a ligação do RNAt iniciador, com o trifos-
fato de guanosina (GTP) fornecendo energia. Os RNAt
usados durante a tradução carregam um aminoácido
específico cada e são identificados como RNAt car
regados. Por outro lado, o RNAt sem um aminoácido
é descarregado. Enzimas especializadas discutidas em
uma seçà o posterior sào responsá veis por reconhecer
diferentes RNAt e por carregar cada um deles com o
aminoácido correto.
£ essencial iniciar a traduçã o em um códon de
início autêntico ( correto) para que ocorra a tradu
ção do polipept ídeo correto. A traduçã o errante ini
ciando no códon errado, ou at é mesmo no nucleotídeo
errado do códon de início, pode produzir um polipeptí-
deo anormal e resultar em uma prote ína n ão funcional.
Desse modo, as questões cr í ticas para os biólogos que
estudaram a iniciação foram: como esse ribossomo lo
caliza o códon de inicio autêntico? E se mais de uma
sequê ncia AUG (códon de in ício) ocorrer perto da ex
tremidade 5' do RNAm, como o códon de início aut ên -
tico é identificado? As bacté rias e os eucariotos usam
mecanismos diferentes para identificar o códon de in í
cio autêntico.
(b)
RNAr — ;
Proteí na
Sítio
do RNAt
do RNAt
Proteí na
Início da tradução bacteriana
- Na E. coli , seis componentes moleculares críti -
cos unem -se para iniciar o processo de tradução: (1) o
RNAm, ( 2) a subunidade ribossômica menor, (3) a subu -
nidade ribossômica maior, (4) o RNAt iniciador, (5) três
proteínas essenciais do fator de iniciação e (6) o GTP.
Na maior parte da iniciação da tradução em bactérias,
a subunidade ribossômica de 30S se afilia a uma proteína
do fator de iniciação (IF), chamada 1F3, impedindo que
- a subunidade 30S se ligue à subunidade 50S ( Figura 9.S) .
O complexo formado pela subunidade menor com a IF3
se liga perto da extremidade 5’ do RNAm , buscando a se -
quência AUG que serve como códon de início. O com-
-
plexo de pré iniciação se forma quando a sequê ncia do
códon de in ício autêntico é identificada pelo pareamento
dc bases que ocorre entre o RNAr 16S no ribossomo de
-
-
30S e uma curta sequência de RNAm localizada alguns
nucleotídeos a montante do códon de início na 5’ UTR do
RNAm ( Figura 9.5, 0). John Shine e Lynn Dalgamo iden -
tificaram a localização e a sequê ncia dessa região em 1974,
sendo batizada como sequê ncia de Shine- Dalgamo em
reconhecimento a seu trabalho.
- A sequência de Shine- Dalgamo é rica em purina com
aproximadamente seis nucleot ídeos localizada 3 a 9 nu -
- cleotídeos a montante do códon de início. Um segmento
complementar rico em pirimidina contendo a sequência
UCCUCC é encontrada perto da extremidade 3* do RNAr
- 16S e forma par com a sequência de Shine- Dalgamo para
posicionar o RNAm na subunidade 30S ( ver Figura 9.5).
 Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 303

O Formação do complexo de pré-iniciação

Sequência de
Shine-Oalgamo
I
—
Códon
de in ício
—
Sequência codificadora
de pollpept ídeo |

RNAm 5' J n 1' G C G U 703'

7 / lUCCUCC
RNAr 16» 3'
^^ 5'

O complexo da subunkidde menor IF3 se iga perto da extremidade 5'do

RNAm na iniciação da iraauçâo e busca a sequência de Shme-Dalgarro. A
sequência de Shne-Oalgamo do RNAm hrma pares de bases com o RNAr
!6S na subunidade menor para posicionar o códon de in íbo (ADG) no sft»
RNAt
P.OIF3 impede temporariamente o acoplamento da subunidade maior.
iniciador

© Formação do complexo de iniciação 30S

GTP RNAt iniciador

IF2

IF 1

P
E
IF 3 'M C *
A J G c
5' *ÍL
0 RNAt*'* carregado, o IFl e o IF 2 unem-se na formação do complexo de
Iniciação; o GTP fornece energia .
O Montagem do ribossomo

Movimento do ribossomo
ao longo do RNAm

A subjniddde maior se une ao complexo de Iniciação; os í Fs se

dissociam. O próximo RNAt carregado entra no sitio A

Figura 9.5 In ício da tradução bacteriana.

-
A sequência de Shine Dalgamo é outro exemplo de se-
quência dc consenso. Assim como as sequências de con
senso que descrevemos para os promotores (Capitulo 8),
a sequência de Shine- Dalgamo tem uma composição nu-
deotídica característica e uma posição precisa relativa ao
códon de início, mas sua sequência de nucleotideos exata
varia ligeiramente de um RNAm para outro ( Figura 9.6).
Na próxima etapa da iniciação da tradução ( Fi
-
gura 9.5, > ), o RNAt iniciador liga se ao códon de
inicio no que será parte do sítio P após a montagem
-
do ribossomo. O aminoácido no RNAt iniciador é
uma metionina modificada , chamada N - formil - me-
tionina ( fMet ); desse modo, o RNAt iniciador carre-
gado é abreviado para RNAtIMrt. Esse RNAt tem uma
sequência de anticódon 3' - UAC - 5', que é uma par -
ceira complementar da sequência do códon de início.
Uma proteína do fator de iniciação ( IF) designada IF 2 -
- e uma molécula de GTP ligam - se ao RNAl1*5*. O fator
-
de inicia ção 1 ( IF 1) também se junta ao complexo
para evitar a ligação da subunidade 50S. Nesse ponto,
 304 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
TÉCNICA DE PESQUISA 9.1
Eletroforese em gel bidimensional e a identificação de proteínas ribossô micas
Finalidade Todos os ribossomos sáo compostos de duas
subunidades, cada uma consistindo em uma mistura com-
plexa de RNAr e dezenas de proteínas Uma abordagem . %
para determinar o número de proteínas contidas em cada
subunidade ribossòmica usa um método de eletroforese
conhecido como eletroforese em gel bidimensional para
separar as proteí nas pela sua carga na primeira dimensão
e pela sua massa na segunda. A eletroforese em gel bidi-
mensional produz uma “impressão digitar caracteristica da
proteína que distribui cada proteína ribossòmica para uma
posição diferente no gel bidimensional .
Materiais e procedimentos Os ribossomos sáo isolados
das células, as subunidades são separadas e tratadas para
dissociar as proteinas que contém. A mistura contendo pro-
teínas ribossômicas liberadas é separada na primeira dimen-
são por uma versão da eletroforese em gel conhecida como
focalização isoelétrica Nesse procedimento, as proteínas
são separadas exdusivamente por sua carga. Ao contrário
da eletroforese em gel convencional, que usa uma solução
tamponada para manter o pH constante por todo o gel, os
géis de focalização isoelétrica contém um gradiente de pH O
ambiente de pH de uma proteína afeta sua carga e toda pro-
teína tem um pH
— chamado ponto isoelétrico
possui carga neutra e não consegue se mover em um campo
no qual —
elétrico. Na focalização isoelétrica, as proteinas migram pelo
gradiente de pH até seu ponto isoelétrico, onde param.
Uma vez conduída a focalização Isoelétrica, ocorre
a separação das proteínas na segunda dimensão, que usa
eletroforese em gel de SOS (dodecil sulfato de sódio} O
SOS é um forte detergente aniônico que desnatura as pro-
teínas pelo rompimento das Interações que as mantém do-
.
bradas As proteínas desnaturadas migram pelo gel a uma
taxa determinada por sua massa, ou seja, pelo número de
amlnoácidos que contém. Na dimensão de gel de SDS da
eletroforese em gel bidimensional, cada proteína tem um
único ponto de partida correspondente a seu ponto isoelé-
.
trico As proteinas com massa grande (mais aminoácidos)
migram por uma curta distância na segunda dimensão, en-
Sequência Códon
de Shme-Dalgamo de
araBàdEcoH ] 1': 7 T T T >í ; y T'TJTTIT-T,£ 3
.
.
laddaEcoti ]y.nnu«f.T :TT:iIL 6 GJI 7TTIH1HTW ITTT A.
iocZda £ coti ] IL
thrA óaLcok ] mir
trpA da £ coU ] ipr.Ti
trpS óà Ecok ] JÁ
.
cra do fogo > ] J&C-
Proteí na A do fogo RI 7 ]
Replicase A do fogo Ofi ] . v -Hrcmw: gTjr çg jgjn r IACA.
í acompanha a união das subunidades que cria o com -
PoãmeraseBdoRNA daLcoH AGCGAGCUGAGGAACCCUAUseiJUtiACucc
Figura 9.6 Sequência dt consenso da ligação da Shint-
-Dalgarno. A sequência AUG do códon de inicio (laranja)
está perto da região de Shine Dalgarno (dourada), que se liga
á extremidade 3' do RNAr 16S . aguardando o próximo RNAt carregado.
GeJS Gel L
”3
f!3 t:
o
li
- i%
**••
%>
I2 !
Jr
P.
O
•*A
** Vã
Segunda dimensão: massa
Eletroforese cm gel de SDS
quanto as proteínas com massa pequena (menos aminoáci-
dos) migram por uma distância maior .
. Descrição Um par de géis de eletroforese bidimensional,
um contendo proteínas da subunidade menor do ribossomo
da E. coti (gel S) e outro contendo proteínas da subunidade
maior (gel L), revela manchas de proteína (a Impressão digi -
tal proteica) correspondentes às posições das proteínas que
compõem cada subunidade ribossòmica. Cada mancha iden-
tifica a localização de uma única proteína que difere das de
mais proteinas no gel por uma combinação de carga e massa.
. As proteínas no gel S são identificadas como S 1 a S21 e,no gel
L como LI a L32. Esses resultados experimentais Indicam que
a subunidade menor dos ribossomos bacterianos contém 21
proteí nas e que a subunidade maior contém 32 proteínas.
Conclusão A eletroforese em gel bidimensional identifica
21 proteínas na subunidade menor do ribossomo da £. eoll
e 32 proteí nas na subunidade ribossòmica maior. Cada pro-
teína obtida pela eletroforese em gel bidimensional pode se
sujeitar a outro exame bioquímico para identificar especifica-
mente a proteína e investigar seu papel na tradução.
o complexo de iniciação 30S, consistindo no RN Am
ligado à subunidade 30S, no RNAttMrt situado no códon
de início, em três fatores de iniciação e em uma molé-
cula de GTP, se formou .
. Na etapa final da iniciação ( Figura 9.5, 0), a su -
bunidade SOS une-se à subunidade 30S para formar o
ribossomo intacto. A energia da união das duas subu -
nidades é derivada da hidrólise do GTP para GDP (di -
fosfato de guanosina ). A dissociação de IF1, 1F2 e 1F3
plexo de inicia ção 70S. F,sse complexo é um ribossomo
totalmente ativo com um sítio P, um sítio A, um sítio
E e um canal para a saída do polipept ídeo. O primeiro
RN At ( RNAt1*4**) já está pareado com o RN Am no sítio
P, e o sí tio A aberto conté m o segundo códon e está
 Capí tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 305

O Formação do complexo de pré-iniclaçáo 0 Forma ção do complexo de iniciação

GTP elF2 GTP elF2 ATP

E P A elF 3 E P A elF 3 E P A elF 3 L

elFIA UAC elF 1 UAC elFIA (IAC
1 ,
Subunidade
40S
5' «3Í1 ADP + P

3' 3'
menor 5 Cap RNAm
3'

Subunidade mcror forma um O complexo de prcinkiação Apôs dissociar os fatores dc

complexo com as proteí nas do é recrutado para 5'cap com iniodçfo o complexo ce
fator de iniciação eucariótico ajuda do complexo elFd. nica ção varre o RNAm
(elF) eoRNAf * carregado

0 Varredura 0 Montagem rlbossômica

elF6 GTP elF5 ATP

E P A L
.4
^
-

X r Movimento da subunidade
1
elF6 GDPelFS + P, ADP + P ,
40S ao longo do RNAm.
3*
/ V

5'
Códon
de início
ÃÍIMMIZ/ C 3' .
RNAm 5' P
^^ Sequência -
de Kozak *
Com a ajuda de outros eí Fs a
subunidade maior se acopla,
formando o ribossomo 905 que
começa com a tradução
A varredura localiza o códon de
in ício na sequéneu de Kozak

Figura 9.7 In ício da tradução eucariótica .

In ício da tradu ção eucariótica A subunidade ribossô-
mica 40S eucariótica forma complexo com as proteínas
do fator de iniciação eucariótico (elF) elFIA e elF3
e com um RNAt *4* carregado, formando o complexo
de pré-iniciaçã o ( Figura 9.7, O) O complexo de pré .
-iniciação é então recrutado para a região 5'-cap do
RNAm, situada na extremidade da 5' UTR . Na etapa O,
o complexo de pré-inicia çào une-se ao complexo eIF4,
um grupo de pelo menos quatro proteínas eIF4 que se
re ú ne na extremidade 5’ cap independentemente da
iniciação da tradução. Juntos, esses componentes com
põem o complexo de iniciação.
Uma vez formado o complexo de iniciação, ele
entra em um processo chamado varredura ( Figura 9.7,
O)* no qual utiliza a hidrólise do ATP para mover a su -
bunidade ribossômica através da 5' UTR em busca do
códon de início. Cerca de 90% dos RNAm eucarióticos
utilizam a primeira sequência AUG encontrada pelo
complexo de iniciaçã o como códon de início, mas os
10% restantes usam a segunda sequência ou, em alguns
casos, a terceira sequência AUG como códon de in ício.
O complexo de iniciaçã o é capaz de localizar com pre-
cisão o códon de início autêntico, já que o códon está
- inserido na seguinte sequê ncia de consenso
-
5' ACC À UOG - 3'
(o pró prio códon de início é exibido em negrito) .
Essa sequê ncia de consenso se chama sequê ncia de
Kozak , em homenagem a Marilyn Kozak , que a des -
- cobriu em 1978 .
A localização do códon de in ício leva ao recruta -
mento da subunidade 60S para o complexo, usando a
energia derivada da hidrólise do GTP. Essa etapa final
O na forma ção do ribossomo 80S é acompanhada pela
dissociação das proteínas elF. No ribossomo 80S, o
RNAtM'* iniciador está situado no sítio P; o sítio A está
vago, aguardando a chegada do segundo RN At ( Aná lise
Genética 9.1 ) .
306 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

ANÁ LISE GEN ÉTICA

Em uma investigação concebida para identificar a sequência de consenso contendo o códon AUG
que inicia a tradução do RNAm eucanótico, Marltyn Kozak (1986) comparou as quantidades de proteí
nas produzidas a partir de moléculas de RNAm possuidoras de mutações de base única ladeando a
sequência AUG. A produção de proteínas foi aferida pela densidade óptica (OD) das faixas de proteína
.
na eletroforese em gel Os valores mais altos da 00 Indicaram maior produção de proteína. Em todas
as sequências testadas, a AUG é o códon de início e sua adenina ( A) foi rotulada como nudeotideo 4-1
.
da região traduzida Kozak criou mutantes de base única nas posições nudeotídicas -4, -3, - 2 -1 e 4 . *
e mediu a 00 da proteína produzida pela tradução dos RNAm mutados resultantes .
Tabela A Mutados nas posições 3 e +4 - Tabela B - -
Mutados nas posições 2 e 1

-3 G A
c
T
c
C
c c
G A
c
-3 A A A A
-2 C -2 C C G G
-
1 C C C C C C -1 A A A A
+1 A A A A A A +1 A A A A
+2 U u u u u u +2 u u u u
43 - G G G G G G +3 G G G G
4 T T G G G G OD 3,3 1,8 1.9 2,0
OD 0,7 2,6 0,9 0,9 3,1 5,0
a .
Examinando apenas os nudeotídeos nas posições -3 e +4 (Tabela A), decida quais nudeotídeos
proporcionam o maior nível de produção proteica.
b. Descreva o impacto de cada nudeotideo ( A,T, C e G) na posição -3 .
c Examinando apenas os nudeotídeos na posição -2 e -1 (Tabela B), decida quais nudeotídeos pro-
porcionam o nível mals alto de produção proteica.
d. Por que Kozak utilizou apenas A na posição -3 para testar os efeitos dos nudeotídeos nas posi-
ções -2 e -1 ?
e. Juntando os dados das Tabelas A e 8, forneça a sequência da região do RNAm de 3 a f 4 que pro-
duz o nível mais alto de tradução.

Estrat égias de soluçã o Etapas da solu çã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por
este problema e explique a natureza
.
1 O problema envolve o exame e a interpretação dos efeitos sobre a tradução das
diferenças nas sequências de RNAm que circundam o códon de início. A resposta
da resposta solicitada. exige a identificação dos efeitos das substituições de base sobre a tradução e
a identificação da sequência de RNAm correspondente ao nivel de tradução
mais alto.

.
2 Identifique as informações críticas .
2 Duas tabelas fornecem a sequência de RNAm para diferentes variações da se-
fornecidas no problema. quência. Para cada variação, um valor de OD descreve o nível aproximado de
©k : ftotr qur a «quíncla AUG é a se
.
proteína produzida pela tradução da sequência Os valores de OD mais altos
*
quAnda do ródor dr nlrio rm lodos os correspondem a mais produção proteica.
.. .
mut iripi testados Como consequência,
a difenenças na 00 rrsuítim de ddemr
*
(as entre os nudeolideos circundante .
Deduzir *
3. Identifique os nudeotídeos constantes .
3 Na Tabeí a A, o nudeotideo C é constante nas posições -1 e -2 e a posição +3 é
e variáveis exibidos na Tabela A. -
sempre G. A variabilidade do nudeotideo se limita às posições 3 e +4 .
4, Identifique os nudeotídeos constan- 4, Na Tabela B, apenas o nudeotideo na posição -2 varia; todos os outros nudeotí-
tes e variáveis exibidos na Tabela B. deos são constantes.

Solucionar Resposta a

.
5 Especifique os nudeotídeos nas po-
sições -3 e +4 (Tabela A ) que propor -
. -
5 Na Tabela A, a presença de A na posição 3 e de G na posição +4 produz o valor
.
mais alto da OD Na posição +4, G produz dois valores de OD altos e dois valores
cionam a OD mais alta. de OD baixos, e T produz um valor de OD alto e um baixo.
Resposta b
.
6 Avalie como cada nudeotideo na po- . -
6 Na posição 3, A produz o valor de OD mais alto e o terceiro mais alto;G produz o
sição -3 afeta a OD . segundo mais alto e o mais baixo; T e C produzem o mesmo valor baixo de OD .

AN Á LISE GENÉTICA
.
7 Avalie como as diferenças dos núcleo
- -
t ídeos nas posições 1 e 2 ( Tabela B)
- -
afetam a OD.
8. Explique a decisão para basear as
avaliações da Tabela B apenas nas se
quências com A na posição -3.
9. Identifique a sequê ncia de consenso
do códon de início que resulta no
njvel mais alto de tradu ção.
-
(Hei: Confipjre oi víloftt de 00 e ai dHere içAi
doí n ucleot
ídecs de amfcas *i ubelas para deter -
minar a sequê ncia de consenso mais eficiente.
Para praticar mais, ver Problemas 32, 33 e 34
Observa çã o gen é tica A Iniciação da tradução é um
processo de vá rias etapas que monta o ribossomo a partir de
suas subunldades. No RNAm bacté ria na a sequência de Shine
-Dalgamo perto do códon de inicio inicial mente é ligada pela
subunidade ribossómka menor, que mais tarde é ligada
pela subunidade ribossõmka maior. No RNAm eocariótica
-
a subunidade ribossòmica menor se acopla nas proximidades
da 5' cap e'varre o RNAm em busca do códon de in ício autên
tico situado na sequência de Kozak.
Prolongamento polipept ídico
O prolongamento, que é a segunda fase da tradu
ção, começa com o recrutamento das proteí nas do fator
de prolongamento ( EF) para o complexo de iniciação.
Os fatores de prolongamento facilitam três etapas da
sí ntese polipeptídica:
1. recrutamento dos RNAt carregados para o sítio A;
2. formação de uma ligação peptídica entre os amino -
ácidos sequenciais;
3. translocação do ribossomo na direção 3' ao longo
do RNAm.
A hidrólise do GTP fornece a energia para cada
etapa do prolongamento nas bactérias ( Figura 941) e
nos eucariotos ( Figura 9.9). Alem disso, as etapas no
processo de prolongamento são as mesmas em ambos
os tipos de organismos: embora os fatores de prolon
gamento sejam diferentes, os sítios ribossômicos P, A
e E de ambos os organismos atendem a funções quase
idênticas. As taxas de prolongamento também são si -
Cap í tulo 9 Bicdogla molecular da traduçã o 307
continuação
Resposta c
-
-
7. Na Tabela Br um C na posição 2 e um A na posição 1 produzem o OD mais
alto. Considerando apenas a posi çã o vari á vel 2, C produz valores de OD
mais altos que G .
Resposta d
-
8. A adenina é escolhida como o nudeotideo na posiçã o 3 nas avaliações da
Tabela B com base no alto valor m édio de OD para esse nudeotideo em com
paraçã o com outros nucleotideos. O valor m édio de OD para A na posi ção 3 -
é = 3,8 versus a próxima média mais alta de &1 * = 1,9 para G na
^
-.
posi ção 3
Resposta e
9. Os dados das duas tabelas combinadas identificam a sequ ência ACCAUGG
(códon de in ício em negrito) como a sequência de consenso mais eficiente
para o códon de in ício. Para as por ções nucieot ídlcas Imediatamente em
volta do códon de in ício, A é mais eficiente em -3, C é mais eficiente que G
-
em 2, C é mais eficiente que A em -1, e G é mais eficiente que T em r 4. -
.
milares; as bactérias acrescentam aproximadamente 20
novos aminoá cidos por segundo a uma cadeia polipep-
tidica nascente, e os eucariotos prolongam o polipeptí-
deo a uma taxa de 15 aminoácidos por segundo. Enfim,
vários estudos indicam a alta fidelidade da tradução em
procariotos e eucariotos. Estima -se uma taxa de erro de
aproximadamente um aminoácido a cada 10 mil acres -
centados aos polipeptídeos para bacté rias.
- Prolongamento pept ídico em bacté rias Nas bactérias,
vá rias prote ínas do fator de prolongamento ( EFs ) e ou -
tras proteí nas ribossô micas realizam o prolongamento
em uma sé rie de etapas apresentadas na Figura 9.8. A
energia necessá ria para essas etapas é gerada por hi -
drólise, a clivagem das moléculas fosfato dos compos-
- tos trifosfato nucleotíd í cos. A hidrólise libera energia
e converte os trifosfatos nucleot íd í cos para difosfatos
nucleotíd ícos ( isto é, GTP — GDP). Na etapa O ( re-
crutamento do RNAt ), os RNAt afiliados a um EF ins-
pecionam o sítio A aberto. O RNAt com a sequ ência
de anticódon correta entra no sítio A. Na etapa 0, a
enzima peptidil transferase catalisa a formação da li -
gação pept ídica entre o aminoácido no sítio P e o ami-
noá cido recém - recrutado no sítio A . Isso prolonga o
polipept ídeo e o transfere para o RNAt no sítio A. O
RNAt no sítio P sai do ribossomo através do sítio E. Na
etapa O, os EFs translocam o ribossomo movimentan -
do-o na direção 3’ no RN Am . F.ssa etapa de transloca -
ção equivale a exatamente um códon de comprimento,
- ou seja, três nucleotideos. A translocaçã o move o
RNAt que estava no sítio A para o sítio P e abre o sítio
A para a ligaçã o de um RNAt carregado com a sequê n -
cia de anticódon correta.
308 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Q Recrutamento do RNAt N N
/
i i
i â
* n
p
* E E

Acompanhado peia proteína

do fator de prolongamento
( EFX o RNAt carregado entra
no sitio A
5' & 3' 5’
3’

Figura 9.8 Prolongamento da traduçã o bact é ria na .

Prolongamento dos polipeptideos eucari óticos Dife - Terminaçã o da traduçã o

rentes fatores de prolongamento executam o prolonga
mento polipept ídico em eucariotos. Mas, assim como
na tradução bacteriana, a hidrólise fornece a energia
para o prolongamento polipeptídico e as etapas desse
prolongamento sáo praticamente idênticas. A etapa O
na Figura 9.9 ilustra o recrutamento do RNAt carre
gado adequado para o sítio A ribossòmico eucariótico
Muitos RNAt carregados diferentes, cada um deles
associado a uma proteína de F.F, podem inspecionar
o sítio A. No entanto, apenas o RNAt com a sequên-
cia de anticódon correta se liga ao códon. Na etapa O,
a peptidil transferasc catalisa a formação da ligação
pept í dica. Isso passa o polipeptideo para o RNAt no
sítio A e libera o RNAt do sítio P. A translocação des
loca o ribossomo ao longo do RNAm na etapa 0 do
prolongamento polipept ídico. O sítio A recém - aberto
está pronto para abrigar o paramento de bases para a
próxima combinação códon - anticódon.
- O ciclo de prolongamento cont í nua até um dos três
códons de parada, UAG, UGA ou UAA, entrar no sítio
A do ribossomo. N âo existem RNAt com anticódons
complementares aos códons de parada , então a entrada
- de um códon de parada no sítio A é um evento que ter -
. mina a tradução. Bactérias e eucariotos usam fatores
de liberação ( RF) para ligar um códon de parada no
sítio A (Figura 9.10). A ligação poli pept ídica ao RNAt no
sítio P é liberada pela hidrólise do GTP, que forma um
complexo com o RF. A liberação do polipeptideo causa
a ejeção do RF do sítio P e leva à separação das subuni
dades ribossòmicas.
-
- Nas bacté rias, dois fatores de liberação, RF1 e
RF2, reconhecem os códons de parada. RF1 reconhece
UAG e UAA , e RF2 reconhece UAA e UGA. A tra -
dução cucariótica é terminada pela ação de um ú nico
fator de liberaçã o chamado eRF ( fator de libera ção

O Recrutamento do RNAt N

ií

0 RNAt carregado,
acompanhado pelo EFl,
ertraeselIgadosftioA

5' Cap

Figura 9.9 Prolongamento da tradução eucariótica.

 Capí tulo 9 Bicdogla molecular da traduçã o 309

O Formação da ligação O TranslocaçAo

peptídica

Os fatores de prolongamento
Apeptdlltransferase Translocam o rfcossomo; o
catalisa a formação de RNAt descategaCo é
uma ligação peptfdica cerado para o stoo E e um
entre os am noáudos novo RNAt é recrutado para o
nos sitos P e A. A sítio A.
cadeia peptdica se
dpdoca para o sítio A

Movimentação do ribossomo
ao longo do RNAm

eucariótico ) que reconhece todos os três códons de nário de tradução que ajudam a explicar a velocidade, a
parada ( Aná lis* Genética 9.2) . precisão e a eficiência da produção de polipept ídeos.

Observa çã o gen é tica Os polipeptídeos prolongam um Complexo de tradução

aminoácido de cada vez. Os RNAt carregados entram no sítio A
e usam sequências anticódon para formar pares de bases com
os códons de RNAm. As ligações pept ídicas se formam entre os
aminoácidos no sitio A e no sitio P. Os ribossomos se movem
de 5' para 3' ao longo do RNAm. A tradução é encerrada pela
ligação do fator de liberação a um códon de parada.
9.3 A traduçã o é rápida e eficiente
Com os transcritos de RNAm de centenas at é mi
lhares de genes nas células, a traduçã o é um processo
ativo e contínuo que precisa iniciar, prolongar e encerrar
a síntese polipept ídica de maneira eficiente. Nas últimas
décadas, a pesquisa revelou vá rios aspectos do maqui-
Biólogos celulares estimam que cada célula bac -
teriana contenha cerca de 20 mil ribossomos, cons -
tituindo coletivamente quase um quarto da massa da
célula. O n ú mero de ribossomos por célula eucariótica
é variável, mas também é da ordem de centenas de mi
lhares. Dados esses n ú meros, não é de surpreender que
-
a tradução quase sempre seja uma questão de um ri -
bossomo solitário traduzindo um único RNAm. Em vez
disso, as fotomicrografias eletrónicas revelam estrutu -
ras chamadas polirribossomos, contendo grupos de
- ribossomos que traduzem ativamente o mesmo RNAm
( Figura 9.11 ). Cada ribossomo na estrutura polirribos-
sô mica sintetiza de modo independente um polipeptí
deo, aumentando notavelmente a eficiência da utiliza
--
ção de um RNAm.

0 Formação da ligação O Transiocação N

peptfdica
A pppcidil transferase Os fatores de prolongamento
catalisa a formação
de uma ligação
$ transkxam o nbossomo; c
RNAt descarregado é
peptfdicô entre os liberado para osítio E e um
aminoácidos nos novo RNAt é recrutado para o
% sítios P e A A cadeia sítio A
peptidíca sedcskxa
para o sítio A
Movimentação do ribossomo
ao longo do RNAm
310 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O Recrutamento do fator de liberação •

( )

(b)

fatores de liberação são

à recrutados quando um
códon de parada ocorre no

5' Cap 3' *bA

O Liberação do polipept ídeo
C Polipeptídeo
RNAt liberado
descarregado
Figura 9.11 Polirribossomos. (a ) Fotomicrografia
N eletrónica de vá rios ribossomos traduzindo simultaneamente
as moléculas de RNAm. Os ribossomos rnais próximos do códon
de parada tèm os polipeptídeos mais longos, (b) Arte-final da
O eRF preenche o sito A fotomicrografia eletrónica do pofinibossomo. A transcrição
GTP e a tradução são associadas nas bacté rias. Mesmo que o
desencadeando a Ifeeração
do polipertídeo pela DMA esteja sendo transcrito no RNAm pela RNA polimerase,
hidrólise do GTP. os polirribossomos se acoplam às fitas de RNAm ainda em
.
crescimento e começam a traduzi-las para polipeptídeos

3' sul ta m na liberação do polipept ídeo e na dissociação

das subunidades ribossó micas.
O Dissociação do nbossomo e liberação do RNAm Nas bactérias, a associação da transcriçã o e da tra -
dução (Capítulo 8) permite que os ribossomos se envol -
vam na tradução da região 5’ dos RNAm cuja extremi
dade 3' ainda está em construção pela RNA polimerase.
-
Polipeptídeo Essa associação é observ ada na Figura 9.11. A transcri-
ção ocorre ao longo do DNA da esquerda para a direita.
A tradu ção dos transcritos de RNAm começa antes
do término da tradução. No entanto, nos eucariotos
a transcriçã o e a tradu ção são dissociadas. A transcri
ção ocorre no n úcleo, onde o pré - RNAm é processado
-
para formar RNAm maduro. A tradução ocorre no cito-
plasma após a liberaçã o do RNAm maduro.

5' Cap Tradu ção do RNAm polidstrônico bacteriano

Figura 9.10 Término da tradução pelas proteínas do
fator de liberação ( RF).
Os polirribossomos bacterianos têm uma densi-
dade máxima de um ribossomo a cada 80 nucleot ídeos,
resultando no espaçamento uniforme dos ribossomos
observado na Figura 9.11. Pode-se observar que os ri
bossomos mais próximos da extremidade 5' do RNAm
sintetizaram o menor comprimento do polipeptídeo,
enquanto os ribossomos mais próximos da extremidade
3' do RNAm vão mais longe na tradução. À medida que
cada ribossomo alcança um códon de parada , a ligação
do RF inicia os eventos de término da tradução que re
Cada gene produtor de polipept ídeo em eucariotos
produz RNAm monocistrônico, significando um RNAm
que controla a síntese de um ú nico tipo de polipept í-
deo. O modelo de varredura para a tradução descrito
anteriormente para os eucariotos implica que um ú nico
códon de inicio é identificado no RNAm eucariótico
- para iniciar a síntese de um tipo de cadeia polipeptídica.
Por outro lado, grupos de genes bacterianos costumam
compartilhar um único promotor, e o transcrito de
RNAm resultante contém informações que sintetizam
vá rios polipeptídeos diferentes. Esses RNAm policU-
trò nicos são produzidos como parte dos sistemas de
- óperon que regulam a transcrição de conjuntos de genes
 AN ÁLISE GENÉTICA
-
Uma parte do RNAm que codifica aminoácidos C terminais e o códon de parada de um polipeptí -
deo do tipo selvagem é
--
5' .CAACUGCCUGACCCACACUUAUCACUAAGUAGCCUAGCAGUCUGA 3'
A sequência de aminoácidos do tipo selvagem codificada por essa parte do RNAm usa o c ódon 5' - CAA - 3'
--
para codificar o aminoácido Asn. Os aminoácidos restantes seguem o mesmo quadro de leitura.
- -
N~Asn Cys Leu Thr His - Thr Tyr Hi* C - - -
As extremidades C-terminais das tr ês proteínas mutadas produzidas pelos alelos desse gene sã o:
- -
- - - -- - -
Mutante 1 N...Aen Cye Leu Thr Hie Thr C
Mutante 2 N...Asn Cys - Leu - Thr His - Thr - Tyr - His - Lys C
*
-
-
Identifique os eventos mutadonais que produzem cada uma das proteínas mutadas.
-
Mutante 3 N .Àfin - Cys - Leu - Thr - His - Thr - Tyr - HÍ8 - Tyr - Ser - Ser - Leu Ala - Val -C

Estrat é gias de solu çã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 O problema envolve a avaliação da extremidade C-termlnal de uma sequènda
este problema e explique a natureza de proteínas do tipo selvagem e o segmento de RNAm que a codifica a compa-
da resposta solicitada . ração da proteína do tipo selvagem com três proteínas mutadas para determi-
.
nar a alteração produzida por cada mutante As respostas exigem a identifica-
ção da sequência de RNAm especifica que leva a cada proteína mutada.

2. Identifique as informações críticas .

2 Neste problema, são fornecidas a extremidade C- terminal de uma proteína do
fornecidas no problema. tipo selvagem e a sequènda de RNAm que a codifica.Também são fornecidas as
sequências C-terminais de três proteínas mutadas codificadas pelas sequências
Dkt : QujAqWf um dos trè códon parac ,
* *
(JAG,UGA au UAA) termina a tradução imedtata
* de RNAm mutadas derivadas da alteração da sequènda do tipo selvagem.
mente apos o cõòor cue espeofo o amiroáodo
DedUZir ru«tremidade C termirul de um pofcprptklea

3, Use o código genético para identificar .

os códons correspondentes aos ami
noácidos do tipo selvagem e o códon
de parada.
3 Dois c ódons, AAC e AAU, codificam a asparagina (Asn). Se pularmos o nucleotí-
- deo mais 5' da sequência de RNAm e começarmos a leitura no A na segunda po-
sição, o primeiro códon é AAC, seguido por UGC - CUG - ACC - CAC - ACU - UAU -
-
CAC UAA. Esses códons codificam os aminoácidos do tipo selvagem e UAA é o
códon de parada.

.
4 Compare cada polipeptldeo mutado 4. Mutante 1 —
a sequènda polipeptídlea é truncada dois aminoácidos antes do códon
com o tipo selvagem e determine o de parada normaL O códon Tyr (UAU) parece ter mudado para códon de parada.
códon que contém a mutação . Mutante 2 — a sequência do tipo selvagem é ampliada pela adição de lísina (Lys),
Dica : ExanTne a s«Qu ncw de nuclcotídeos indicando que a mutação mudou o códon de parada para um códon especifi-
*
do tipo idvagem no local onde a mutação cando Lys e que agora é seguido imediatamente por um novo códon de parada.
deve ter ocomóo e identifique maneiras pelas
quais a substituição, inserção ou remoção Mutante 3 — a sequência do tipo selvagem é ampliada em seis aminoácidos.
de baie podena ter o eíerto observado na Isso sugere que outra mutação afetou o códon de parada.
*
sequènda de aminoácidos.
Solucionar
5. Identifique a mutação e sua conse- 5. Duas substituições de bases diferentes alterando o códon UAU da tirosina (Tyr)
quência para a tradução no Mutante 1 .
para um códon de parada poderiam causar o Mutante 1.0 c ódon UAU do tipo
selvagem provavelmente foi alterado pela substituição de bases para formar
um códon de parada UAA ou UAG .
.
6 Identifique a mutação e a sua conse - 6. A lisina (Lys), que foi adicionada ao polipeptídeo mutado, é codificada por AAA
quência no Mutante 2. ou AAG. A remoção do U do códon do tipo selvagem produziria um códon AAG
seguido por UAG, um códon de parada.
.
7 Identifique a mutação e a sua conse - 7. A tirosina, especificada pelos códons UAU e UAC, é encontrada no lugar do códon
quência no Mutante 3. de parada normal. Ela é seguida por um códon serina (UCN ou AGU / C), em vez
de GUA (Vai), que se segue ao códon de parada "enquadrado* no tipo selvagem.
Uma inserção de pares de bases que acrescenta um U ou um C na terceira posição
do códon de parada UAA normal forma um códon tirosina (Tyr) UAU ou UAC. O
quadro de leitura alterado a partir desse ponto seria lido então como AGU (Ser),
seguido por AGC (Ser), CUA (Leu), GCA ( Ala), GUC ( Vai) e UGA (parada).
Para praticar mais, ver Problemas 5, 11, 16 e 29 .
312 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
RN Am
Sequê ncia de
Shine Dalgarrvo de in ício parada de inicio parada • de inicio parada
policistr ònico 5'
^Jf IA6GA6G1 í
Figura 9.12 RNAm policistrò nico. Um RN Am policistrònico é um transcrito òe m ú ltiplos genes e vai produzir um polipept ídeo a
partir de cada gene. A necessidade de um ú nico ribossomo ou de vá rios ribossomos para produzir os polipeptideos vai depender do
comprimento dos espaçadores intercistrônicos entre as sequências codificadoras de polipeptideos.
bacterianos funcionando na mesma via metabólica ( uma
forma de regulação que discutimos no Capitulo 15).
Os RNAm policistrónicos consistem em vários seg-
—
mentos polipeptídicos vários cístrons que contém, —
cada um, um sítio de Shine-Dalgarno ( para a ligação ri
bossômica e a inicia ção da tradução) c códons de iní-
cio e parada. Uma sequê ncia espaçadora intercistrô nica
que não é traduzida separa os cístrons do RNAm poli
cistrônico ( Figura 9.12 ).
Os espaços intercistrônicos tém comprimento variá
vel: alguns têm apenas alguns nucleot ídeos de compri
mento e outros têm de 30 a 40 nucleotídeos de com -
primento. Se o espaçador intercistrô n íco tiver três ou
quatro nucleotídeos, curto o bastante para ser abrangido
por um ribossomo, este deve permanecer intacto após a
conclusão da síntese de um polipeptideo. Desse modo,
os ribossomos podem não necessariamente se dissociar
do RNAm após encontrarem um códon de parada. Em
vez disso, o ribossomo pode avançar imediatamente para
o próximo códon de início e começar a tradução de um
novo polipept ídeo. Por outro lado, se o espaçador interds-
trônico tiver mais de seis nucleotídeos de comprimento,
mais ou menos, o ribossomo se dissocia e precisa ocorrer
uma nova iniciação da tradução para traduzir o próximo
polipeptídeo codificado pelo RNAm policistrònico.
9.4 O código genético traduz o RNA
mensageiro em polipeptídeo
Os ácidos nucleicos e os aminoácidos são compos-
tos muito diferentes quimicamente e não há um meca
nismo direto pelo qual o RNAm possa sintetizar um po -
lipept ídeo. Contudo, a informação genética carregada
nas sequ ê ncias de nucleotídeos do RNAm fornece um
meio pelo qual as sequências de aminoácidos dos poli-
peptídeos podem ser especificadas. O "código genético”
é o nome usado para descrever a correspondê ncia entre
as sequê ncias de códon do RNAm e cada aminoácido.
Conforme mencionamos anteriormente, a trans
formação do código em polipeptideos específicos de
pende do RNA de transferência ( RNAt ) para levar os
.
aminoácidos para o ribossomo Ali, o RNAt forma par
com o RNAm por meio do pareamento de bases com
plementares entre os nucleotídeos de códon do RNAm
e os nucleotídeos de anticódon do RNAt. Depois que o
RNAt correto estiver ligado por um códon, ele transfere
Espanadores Interdstròntcos
Gene A Gene 6 Gene C
_
Códon Códon de Códon Códon de Códon Códon de
f
i
Polipeptideo A
i
Polipept ídeo B
i
Polipept ídeo C
seu aminoácido para o final de uma cadeia polipeptídica
.
crescente As moléculas do RN A de transferência facili -
tam a tradução da informação genética de uma lingua -
-
gem química (ácido nucleico) para outra (aminoácido)
Isto é, o RNAt é uma molécula adaptadora que interpreta
.
e depois age sobre a informação transportada no RNAm.
Nossa revisão básica da tradução e do código gené
- tico retratou um código triplo: grupos de três nucleotí
deos de RNAm consecutivos formam códons que corres-
-
- pondem, cada um, a um aminoácido. O código genético
- contém 64 códons diferentes, mais do que suficiente
para codificar os 20 aminoácidos comuns utilizados para
construir os polipeptideos. O n úmero de códons maior
que o de aminoácidos leva à redundância do código ge -
nético, conforme evidenciado pela observação de que
aminoácidos simples são especificados a partir de um
até seis códons diferentes. Essa redundância é explicada
pelos aspectos de como as moléculas de RNAt interagem
com os códons de RNAm, que é o assunto desta seção.
O código genético exibe oscilação da
terceira base
O código genético triplo é um exemplo biológico do
princí pio de que a hipótese mais simples tem a maior pro -
babilidade de estar certa: durante o final dos anos 1950, a
lógica aritmética levou muitos pesquisadores a concluí -
rem que o código genético provavelmente era triplo. Essa
solução simples para a questão de como as sequências de
aminoácidos podiam ser codificadas pelas sequências
- de ácidos nucleicos postula que um código genético duplo
(dois nucleotídeos por códon ) podia produzir apenas 16
(41) combinações de códons, o que não é suficiente para
produzir 20 aminoácidos. Por outro lado, um código gené -
tico quádruplo geraria 44, ou 256, combinações de códons
diferentes muita quantidade para as necessidades dos
genomas. Por sua vez, um código genético triplo, produ -
zindo 41, ou 64 códons diferentes, proporciona uma varie
dade suficiente para codificar 20 aminoácidos com alguma
-
- redundância, porém não excessiva ( Figura 9.13 e Tabela
9.1; ver também I abela 1.2). Dentre os 64 códons, 61 es -
pecificam aminoácidos e os trés restantes são códons de
- parada que terminam a tradução. Apenas dois aminoáci -
dos, a metionina (Met), com o códon AUG, e o triptofano
(Trp), com o códon UGG, são codificados por códons in -
dividuais. Os outros 18 aminoácidos são especificados por
 Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 313

G F Tabela 9.1 Redundâ ncia do código genético

L
E

±
i/i
C A G |C f f
S Aminoá cido Abreviaçã o
3 letras 1 letra
C ódons

Y
A
uc Alanina Ala A OCA . CCC. 000. CCU
Argmina Arg R AGA . AGG. CGA ,
CCC . CGG . CCU
A a* c
57 U / G u G
Asparagina
Ácido aspá rtico
Asn
Asp
N
D
AAC , AAU
GAC , GAL*

RSSGY C U /Aí / *•* / L Cisteina Cys C UGC , UGU

s xrx G A ^- GVWV
C 7~~
CÃ
Addo glutámico Glu
Glutamina Gin
E
Q
GAA
CAA
. GAC
. CAG
. GGG ,
\ NX 'LwJ ã P Glicina
Hlstldlna
Gly
Hls
G
H
GGA , GGC
CAC . CAL*
GGU

// 7 % H . AUU
T l Q
Isoleucina lie 1 AUA , AUC
M Leucina Leu L UUA , UUG . CUA ,
R CUC . CUG. CUU
Figura 9.13 Código genético. Para ler esta tabela circular Usina Lys K AAA . AAG
do código genético, comece pek) anel interno que contém Metionina Met M AUG
o nudeot ídeo na primeira posição ( nudeot ídeo 50 de um uuc , uuu
códon. O nudeotídeo da segunda posição está no segundo
Fenilalanina Phe F
anel e o nudeot ídeo da terceira posição está no terceiro anel. Prolina Pro P CCA . CCC.CCC. CCU
As abreviações de três ietras e uma letra para os aminoácidos Serina Ser S AGC ., AGU. UCA .
correspondentes ocupam os anéis mais externos. UCC UCG . UCU
Treonina Thr T ACA . ACC . ACG . ACU
dois até seis códons. Os códons que especificam o mesmo Triptofano Trp W UGG
aminoáddo se chamam códons sin ónimos. Tirosí na Tyr Y UAC , UAL *

Cada molécula de RNA de transferê ncia carrega

um determinado aminoá cido para o ribossomo, onde
Vallna Vai V GUA , GUC . GUG , GUU

ocorre o pareamento de bases complementares entre

cada sequência de códon de RNAm e a sequência de A oscilação da terceira base é o nome dado para o me-
anticódon correspondente de um RNAt correto. Repare canismo que relaxa a exigência de pareamento de bases
que esse pareamento de bases complementares requer complementares entre a terceira base de um códon e o
o alinhamento antiparalelo das fitas de RNAm e RNAt. nudeotídeo correspondente de seu anticódon.
Considere a sequência de códon para o ácido aspár - Como funciona essa oscilação da terceira base? A
- -
tico (Asp), 5' GAC 3'. As regras do pareamento de
bases preveem que a sequência de anticódon do RNAt
resposta se encontra nas estruturas qu ímicas dos nu
cleot ídeos ligados pelo hidrogé nio nas reações de pa
-
-
- -
é 3' CUG 5' ( Figura 9.14). O Asp também é especifi- reamento de bases. Um exame atento dos códons sin ó-
cado por um códon sinónimo, 5' - GAU - 3', que forma nimos revela um padrã o para a estrutura química das
par com o RNAt portador da sequência anticódon terceiras bases nos casos de oscilação. Com a exceção
- -
5' CUA 3'. As moléculas do RNA de transferência do códon AUA para a isoleucina (lie) e do códon UGG
com diferentes sequências de anticódon para o mesmo
aminoácido se chamam RNAt isoaceptores.
A presença dos códons sin ónimos e dos RNAt iso- Aminoácidos
aceptores significa que um genoma precisa fornecer 61
genes de RNAt diferentes e transcrever uma molécula
de RNAt para corresponder a cada códon? A resposta é
não. Na verdade, a maioria dos genomas tem de 30 a 50
genes de RNAt diferentes. Como um genoma que co - Antkódons 3'
difica menos de 61 moléculas de RNAt diferentes reco-
Códons de RNAm 5'
nhece todos os 61 códons funcionais? A resposta está no
relaxamento das regras estritas do pareamento de bases Figura 9.14 Pareamento códon -antic ódon. Um par de
complementares na terceira base do códon. O meca - RNAt isoaceptores de ácido aspá rtico Ilustra o pareamento
nismo da tradução proporciona flexibilidade no parea
mento da terceira base, o nudeotídeo mais 3', do códon.
- de bases antiparalelas complementares das sequências de
códon e anticódon.
314 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
para o triptofano (Trp), os códons sinó nimos podem ser
agrupados em pares que tém os mesmos dois nucleotí-
deos na primeira e segunda posições e que diferem ape-
nas na terceira base, onde os códons sinónimos carre-
gam uma purina ( A ou G ) ou carregam uma pirimidina
.
(C ou U) Por exemplo, considere os pares de códons
sinónimos para a histidina ( His) e a glutamina ( Gin;
ver Figura 9.13 e Tabela 9.1). As duas primeiras bases
de cada um desses códons são C e A. Os dois códons
His tém uma pirimidina na terceira posição, enquanto
os códons Gin t êm uma purina na terceira posiçã o. À
medida que você examinar outros pares de códons si-
nónimos na Tabela 9.1, repare que eles também diferem
apenas por carregarem o nucleotídeo alternativo purina
ou pirimidina na terceira posição.
Os aminoácidos especificados por quatro códons
sinónimos, como a alanina (Ala ), a valina (Vai) e a gli
cina (Gly), exibem um padrão análogo: cada aminoácido
é representado por dois pares de códons sinónimos e os
membros de cada par diferem apenas na terceira posição
pelo fato de carregarem a purina ou pirimidina alternada.
O padrão continua na arginina ( Arg), serina (Ser ) e leu
cina (Leu ), cada uma delas especificada por seis códons
sinónimos. Esses conjuntos de códons consistem cada
um em trés pares, cada par tendo os mesmos nucleo-
tídeos nas duas primeiras posições e diferindo na terceira
posição quanto à purina ou pirimidina alternadas.
A oscilação da terceira base ocorre por meio da fle-
—
xibiliza çào do pareamento de bases entre o nucleotídeo
oscilante isto é, o nucleotídeo 3’ de um códon e o
nucleot ídeo 5’ do anticódon. Na posição de oscila ção,
o pareamento de bases entre os nucleotídeos do códon
— ceptores pela RNAt sintetase é um processo complexo
e do anticódon não precisa ser complementar. No en -
tanto, esse pareamento precisa envolver uma purina e
uma pirimidina. Os pareamentos por oscila ção da ter-
ceira base são resumidos na Tabela 9.2. Os nucleot ídeos
oscilantes nos anticódons podem ser qualquer um dos
nucleotídeos de RN A ou o nucleotídeo inosina (1) mo
dificado. A inosina é estruturalmente similar à G, mas
não possui o grupo amina vinculado ao carbono 2 da
guanina. Em razão dessa diferen ça , a inosina forma
pares de bases com as purinas ou pirimidinas. A Fi-
gura 9.15 mostra trés exemplos de oscilação da terceira
base nos quais as moléculas de RNAt reconhecem cole
tivamente sete códons diferentes.
Observa çã o gen é tica 0 código genético triplo con - Anticódons
siste em 61 c ódons especificando 20 aminoá cidos comuns e
3 códons de parada. 0 código é redundante porque 18 dos
aminoácidos possuem dois ou mais códons sinónimos. Os có-
dons sinónimos são reconhecidos por RNAt isoaceptores que
podem utilizar a oscilação da terceira base.
Carregamento das moléculas de RNAt
As moléculas do RNA de transferência são trans
critas a partir dos genes de RNAt. l mbre-se da estru -
^
Tabela 9.2 Pareamento de oscilação da terceira
base entre os nucleotídeos do códon e
do antkôòon
Nucleot ídeo 3' do códon Nudeotideo 5' do anticódon
A ou G U
G C
U A
Uou C G
U, C OU A I
tura tridimensional dos RNAt ( ver Figura 8.35) e da
terminação CCA na extremidade 3' das moléculas de
RNAt como o sítio de ligação de um aminoácido Cada .
- RNAt carrega apenas um dos 20 aminoácidos e o carre-
gamento correto de cada RNAt é crucial para a integri
dade do código gen ético.
-
O carregamento dos RNAt é catalisado por enzi-
mas chamadas aminoacil- RNAt sintetases ou, mais
- simplesmente, RNAt sintetases. Existem 20 RNAt sin -
tetases diferentes, uma para cada um dos aminoácidos.
Para carregar um RNAt descarregado, a sintetase cata
lisa uma reação em duas etapas que forma uma ligação
-
entre o grupo carboxila do aminoácido e o grupo 3’ hi -
droxila da adenina na terminação CCA. A análise expe-
rimental revela que o reconhecimento dos RNAt isoa -
que não segue um conjunto único de regras. As muta
ções em qualquer um dos quatro braços do RNAt, ou na
própria sequência do anticódon, tomam o RNAt irreco-
-
nhecível para sua RNAt sintetase.
Estudos das interações estruturais entre as RNAt
sintetases e seus RNAt mostram que a RNAt sintetase é
uma grande molécula que entra em contato com vá rias
partes de um RNAt durante o processo de reconheci -
- mento. Esses pontos de contato podem incluir a sequên -
cia de anticódon e os outros braços e alças do RNAt
Aminoácidos
Códons de RNAm
Posição de Posição de Posição de
oscilação oscilação oscilação
Figura 9.15 Efeito da oscilação. A oscilação no pareamento
de bases reduz o n ú mero de RNAt diferentes necessá rios
durante a tradução. Neste exemplo, dois RNAt diferentes, cada
um carregando uma serina, usam a oscilaçã o para reconhecer
- dois códons diferentes. Um ú nico RNAt carregando isoleudna
utiliza a oscilação para reconhecer esses códons de isoleucina.

RNAt sintetase
ffe
- -
RNAt
* Vá rias perguntas tinham de ser respondidas sobre a
- Haste
1 aceptora 3'
v ''Glutamato
ATP
* 2. Quantos nudeotideos compõem um códon do
jfT
Haste do
antk ódon
Figura 9.16 Interação da aminoadl-RNAt sintetase com
o RNAt A aminoacii-RNAt sintetase entra em contato com
vá rios pontos do RNAt O ATP e a haste aceptora 3 òo RNAt se
encaixam em uma fenda que também acomoda o aminoácido.
(Figura 9.16). Depois de entrar em contato com a RNAt
sintetase, a haste do RNAt aceptor se encaixa em um
sítio ativo da RNAt sintetase. O sítio ativo contém o ami-
noácido que será adicionado à haste do RNAt aceptor e o
ATP fornece energia para a ligação do aminoácido.
As relações específicas entre os RNAt e as RNAt
sintetases são um aspecto crucial da tradução que é
básica e invariavelmente predso, além de subjacente à
função do código genético. Os erros no carregamento
dos RNAt são raros. Esses erros, chamados mau car
regamento, ocorrem em 1 em 50 mil até 1 em 100 mil
- bre se de que um código duplo não fornece códons su
RNAt carregados. O nível de mau carregamento é tão
baixo porque a RNAt sintetase opera um sistema de
“correção de erros" que normalmente descarta o ami -
noácido incorreto antes de sua vinculaçào ao RNAt.
Observa çã o gen é tica Vinte RNAt sintetases diferentes,
uma para cada aminoácido, sào responsá veis por reconhecer
os RNAt isoaceptores corretos aos quais cada sintetase vincula
seu aminoácido.
9.5 Experimentos decifraram o
código genético
Um notável conjunto de experimentos realizados
no início dos anos 1960 decifrou o código genético e
abriu o caminho para os biólogos compreenderem os
processos moleculares que convertem uma sequência
de nudeotideos do RNA mensageiro em um polipeptí-
deo. Na época , os biólogos sabiam qual era o material
Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 315
hereditá rio ( DNA ) e qual molécula transmitia a men
sagem genética para os ribossomos visando à tradu ção
-
(RNAm ), mas não sabiam como a informação de codifi
cação das proteínas transportada pelo RNA mensageiro
era decifrada durante a montagem dos polipeptídeos.
natureza estrutural do código genético antes de o pró-
prio código poder ser decifrado. As trés perguntas mais
importantes, apresentadas aqui, são examinadas nas se-
ções a seguir:
1. Os códons vizinhos se sobrepõem uns aos outros
ou cada códon é uma sequ ência separada ?
RNA mensageiro?
3. A informação codificadora de polipeptídeo do RNA
mensageiro é contínua ou interrompida por lacunas?
Nenhuma sobreposição no código genético
Para abordar a questão de se o RNAm portava có-
dons sobrepostos, os pesquisadores raciocinaram que,
se o código genético fosse não sobreposto, cada n úcleo
t ídeo do RNA mensageiro faria parte de um, e apenas
um, códon, enquanto em um código genético sobre-
posto, um nucleot ídeo podia fazer parte de vários có-
dons. Um código genético sobreposto forneceria uma
maneira eficiente para empacotar uma grande quan -
tidade de informação usando um pequeno n ú mero de
nudeotideos, mas ele també m restringiria a flexibili-
dade do código genético e possivelmente aumentaria o
impacto das mutações de um único nucleot ídeo.
Considere a sequência parcial do RNA mensageiro
... ACUAAG ...
-
Se o código genético é triplo e não sobreposto (lem-
-
ficientes para especificar 20 aminoácidos e um código
quádruplo fornece códons demais) , essa sequência par -
cial produz dois códons, cada um deles especificando
um aminoácido:
C ó don 1 2
...ACU AAG...
Aminoácido 1 2
Em um código genético triplo sobreposto, por
outro lado, esses seis nudeotideos soletrariam quatro
códons completos e dois parciais. A sequência codifica -
ria completa mente quatro aminoácidos e contribuiria
para codificar dois outros:
...ACUAAG...
Aminoácido 1 ACU
2 CUA
3 UAA
4 AAG
5 ...
AG
6 ...
G
Em 1957, com base em sua análise das informações
dispon íveis sobre as sequ ências de aminoácidos das pro-
teínas, Sidney Brcnncr se convenceu de que um código
genético triplo sobreposto era impossível porque era res-
tritivo demais. Podemos usar o códon AAG para ilustrar
316 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
o raciocínio de Brenner. Se o código genético fosse sobre
posto, o códon imediatamente a montante de um códon
AAG sempre teria de carregar dois nuclcot ídcos adcnina
nas posições nucleotfdicas intermediá ria e 3' para corres-
ponder às duas primeiras posições do AAG. O tripleto
precedente a um códon AAG poderia, portanto, ser AAA,
CAA, UAA ou GAA; porém , mesmo se todos esses qua -
tro códons especificassem um aminoácido diferente, uma
sobreposição restringiria o aminoácido a montante do
aminoácido especificado pelo AAG para que fosse um de
apenas quatro outros aminoácidos. Em um teste, Brenner
examinou o vizinho a montante de cada lisina AAG em
um polipeptideo e constatou 17 aminoácidos diferentes
nessa posição. A conclusão de Brenner foi que um código
genético sobreposto restringia a flexibilidade evolutiva e
nào era apoiado pelas observações bioquímicas.
A evidência conclusiva do código genético não so-
breposto veio de um estudo de 1960 sobre substitui
ções de um único nucleotídeo induzidas pelo composto
produtor de mutação, o óxido nitroso. Heinz Fraenkel-
-Conrat e colegas estudaram o efeito do óxido nitroso
na proteína de revestimento do vírus do mosaico do
tabaco (TMV). O óxido nitroso causa mutações indu
zindo substituições de pares de bases ú nicas no DNA
que levam a moléculas de RN Am mutadas com uma
mudança de base de nucleotídeo em comparação com
o RNAm do tipo selvagem. Uma única mudança de base
no RNAm alteraria três códons consecutivos se o código
genético fosse sobreposto, mas apenas um ú nico códon
se esse código genético nào fosse sobreposto ( Figura
9.17a ). Portanto, a substituição de uma ú nica base em
um código genético sobreposto poderia mudar três ami -
noáddos consecutivos em uma proteí na , ao passo que,
em um código genético n ão sobreposto, a substituição
de uma única base poderia mudar apenas um aminoá -
cido. A aná lise de Fraenkel-Conrat revelou que apenas as
mudanças de um ú nico aminoácido ocorriam em conse-
quência de uma mutação provocada pelo óxido nitroso
( Figura 9.17 b ). Esse resultado é coerente com o previsto
para um código genético não sobreposto e é incoerente
com a previsão para um código genético sobreposto.
Código genético triplo
A prova do código genético triplo veio em 1961,
quando Francis Crick, Leslie Barnett, Sidney Brenner e
R. J. Watts-Tobin usaram o composto proflavina para
criar mutações em um gene chamado rll no bacterió-
fago T4. A proflavina causa mutações inserindo ou re
movendo pares de bases individuais do DNA. Essa re-
moçã o leva à ausê ncia de nucleotídeos individuais do
RNAm, mudando, assim, o quadro de leitura do RNAm.
Quadro de leitura se refere à sequência de códon es-
pecífica conforme determinado pelo ponto em que co
meça o agrupamento dos nucleot ídeos nos tripletos.
Para compreender melhor a importâ ncia do expe-
rimento realizado por Crick c seus colegas, oferecemos
uma analogia para orientar a compreensã o dos resultados
experimentais. Assim como a série de palavras de trés le -
- (a ) Um c ódigo genético sobreposto mudaria tr és códons
consecutivos com cada muta ção de base.
Sequência do
tipo selvagem Sequência mutada
ACUCAGAUA A C u C ríG A U A
C ódon 1 ACU ACU
Códon 2 C UC cuc
Códon 3
Códon 4
Códon 5
C ódon 6
Códon 7
Códon 8
( b) Um código genético n ão sobreposto mudaria um códon
com cada mutação de base.
Sequência do
tipo selvagem Sequência mutada
- A C U C A G A UÃ A C U C [ :' G A U Ã
Códon 1
C ódon 2
Códon 3 V TITÃ 333
F igura 9.17 Prova de que o código genético é não
- sobreposto. A sequência dos 10 ú ltimos aminoácidos na
extremidade C-terminal de uma proteina TMV continha uma
ú nica mudança de aminoácido após a indução da mutação por
substitui ção de bases. Esse resultado está em conformidade
com a previsã o do modelo não sobreposto do código genético.
tras a seguir se torna ininteligível após a adição ou remo-
ção de uma ú nica letra , a mudan ça de um único nucleo-
tideo desloca, em uma posição nucleotídica, o quadro de
leitura do tripleto usado para decifrar a informação em
um gene. A adição ou remoção dos nucleotídeos muda o
quadro de leitura e produz uma mutação chamada mu-
tação por mudan ça no quadro (ou matriz ) de leitura.
As adições ou remoções de uma ú nica letra adulteram a
mensagem traduzida mudando o quadro de leitura:
tipo selvagem: YOUMAYNOWSIPTHETEA ("you may
now sip the tea")
mutado ( por adição): YOUMA C YNOWS1PTHETEA
( “you ma c yno wsi pth ete a")
mutado ( por remoção): YOUMAYNO||S1PTHETEA
("you may nos ipt het ea")
As mutações por mudança no quadro de leitura
—
podem ser revertidas ou seja, o quadro de leitura cor-
—
reto pode ser restaurado se uma segunda mutação em
um local diferente dentro do mesmo gene restabelecer o
- quadro de leitura. Essa segunda mutação, chamada mu -
tação por reversão, anula (“ reverte") a perturbação do
quadro de leitura inserindo um nucleot ídeo, se a muta -
ção inicial for uma remoção, ou removendo um nucleo-
tídeo, se a mutação inicial foi uma inserção. As mutações
- por reversão conseguem restabelecer a maior parte do
quadro de leitura do tipo selvagem , de modo que uma
parte da sequência de aminoácidos do polipeptideo co-
dificada pelo gene será do tipo selvagem. O quadro de
leitura e, portanto, a sequência de aminoácidos entre os
dois sítios de mutação será alterada. Por exemplo, aqui
 Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 317

temos como as duas mutações por mudança de quadro

exibidas anteriormente poderiam ser revertidas: Tabela 9.3 Fenótipo resultante de vá rias combina-
ções de mutações por inserção (+) ou re -
mutado (adiçã o): YOUMA C YNOWSIPTHETEÀ (you
mac yno wsi pth ete a )
-
moção ( ) de pares de bases induzidas por
proflavina no lócus rtl do bacteriófago T4
mutado por reversão ( remoção): YOUMA C YNO||
SIPTHETEA (“you mac yno sip the tea")
Mutações Designa ções + /- Resultado
combinadas
mutado ( remoção): YOUMAYNO||SIPTHETEA
("you may nos ipt het ea") FC 0, FC 1 +- Revertido para
o tipo selvagem
reversão (adição): YOUM AYNOSIP R THE TE A ( “you
may nos ipr the tea”) FC 0, FC 21 +- Revertido para
o tipo selvagem
Crick e seus colegas analisaram muitos mutantes do
gene-rll do bacterióíago induzidos por proflavina, desig-
FC 40, FC 1 + - Revertido para
o tipo selvagem
nando cada mutado por adição como ( • ) e cada mutado
-
*

por remoção como ( ). Sua abordagem para a interpre -

tação dos dados nessa aná lise foi incomum em dois as-
pectos. Primeiro, eles supuseram que o código genético
tinha uma estrutura tripla não sobreposta e interpretaram
seus dados a partir dessa perspectiva. Em outras pala
vras, eles já tinham fundamentado seu caminho para uma
conclusão sobre a estrutura do código genético e busca
ram dados que pudessem confirmar sua lógica. Segundo,
como as ferramentas disponíveis para a an álise molecular
não eram suficíentemente sofisticadas para dizer a Crick
e seus colegas se um determinado mutante resultava de
uma inserção ou remoção de pares de bases de nucleoti
deos, eles conjecturaram que o primeiro mutante do gene
rll que examinaram, uma mutação designada como FC 0,
resultou da inserção ("FC" significa Francis Crick). Desig -
nar FC 0 como uma mutação (+ ) acabou sendo um pal
pite correto. Com base em seus pressupostos de que (1)
o código genético é um tripleto não sobreposto e (2) FC 0
é uma mutação por inserção ( +), os dados relatados por
Crick e colegas apoiaram a noção de que o código gené-
tico se baseia em tripletos nucleotídicos.
Os dados sobre seis desses mutantes são exibidos na
Tab#la 9.3. Cada mutado é designado como ( +) ou (-).
Qualquer combinação de um mutado ( + ) com um mu -
tado (-) gera uma reversão para o tipo selvagem. Em
cada caso, a mutação inicial provoca uma mutação por
mudança do quadro de leitura e a mutação por reversão
restabelece o quadro de leitura. Por outro lado, quaisquer
-
dois mutados ( + ) ou quaisquer dois mutados ( ) juntos
deixam o gene rll em um estado mutante porque a se -
gunda mutação n ão restabelece o quadro de leitura. A
estrutura de tripleto do código genético é adicionalmente
demonstrada pela observação de que o quadro de leitura
é restabelecido pela presença de três mutações ( + ) ou três
mutações (-). Por exemplo, o total de trés inserções res-
taura o quadro de leitura na seguinte sentença:
mutante triplo (adição):
YOUMA C YNOW T S LIPTHETEA ("you ma c yno w
t s 1 ip the tea”)
Nenhuma lacuna no código genético
Em sua pesquisa de 1961, Crick e colegas também
sugeriram que o código genético é lido como uma cadeia
contínua de nucleotídeos de RNAm sem ser interrompida
FC 58, FC 1 + - Revertido para
o tipo selvagem
FC 0, FC 40, FC 58 +++ Revertido para
o tipo selvagem
FC 1, FC 21, FC 23 Revertido para
- o tipo selvagem
FC 0, FC 40 Mutante rtl
- FC 0, FC 58 Mutante rtl
FC 1, FC 21 Mutante rtl
FC 1, FC 23 Mutante rtl
- por qualquer tipo de lacuna, espaço ou pausa . Se uma la-
cuna ou espaçador estivesse presente entre os códons do
RNAm, o traascrito do RNAm poderia ser representado
como segue (x indica a lacuna entre os códons):
-
YOUxMAYxNOWxSIPxTHExTEAx ( “ you may now
sip the tea")
Se o código gen ético fosse estruturado dessa forma,
com cada códon separado dos seus vizinhos, a inserção
ou remoção de um nucleot ídeo não provocaria o tipo de
mutação por mudança de quadro de leitura que Crick e
colegas observaram. Em vez disso, a inserção ou remoção
de nucleotídeos poderia alterar o códon afetado, mas n ão
a identidade dos códons adjacentes. Por exemplo, consi-
dere a seguinte mutação por inserçã o, onde a separação
entre os códons limita a alteração a uma ú nica palavra:
YOUx,MA T Yx,NOWx,SIPx ,THEx ,TEAx,(“ you ma t y
now sip the tea“)
Observa çã o gen é tica 0 código genético é um código
triplo composto de très nucleot ídeos por códon. Os códons
não se sobrepõem uns aos outros e não há lacunas ou marca -
dores entre os códons.
Decifrando o código genético
O código genético foi decifrado em uma serie de ex -
perimentos realizados entre 1961 e 1965. Esse notá vel pe-
ríodo de quatro anos na biologia foi acentuado pela ampla
pesquisa colaborativa e competitiva internacional que
culminou na montagem de uma tabela simples contendo
318 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
as instruções compartilhadas por todos os organismos
para traduzir as sequências de nucleotídeos do RNAm em
sequências polipeptídicas. Decifrar o código genético foi
um marco no estabelecimento do mecanismo do dogma
— —
central da biologia (DNA > RNA > proteína ) e assentou
a base da pesquisa genética moderna. Esse triunfo do ra
ciocínio dedutivo foi reconhecido instantaneamente por
seu significado profundo e resultou na concessão do Pré-
mio Nobel em Fisiologia ou Medicina para Har Gobind
Khorana e Marshall Nirenberg em 1968.
Depois de estabelecido que o código genético con -
siste em tripletos, os pesquisadores passaram para a ta
refa de estabelecer quais tripletos estão associados com
cada aminoácido no processo de tradução. Nirenberg e
Johann Heinrich Matthaei realizaram um experimento
simples em 1961 que lançou as bases para outros expe-
rimentos na decifração do código genético. Seu projeto
experimental foi direto: construir cadeias sintéticas de
nucleotídeos repetidos e usar um sistema de tradução
in vitro para traduzir a sequência em um polipept ídeo.
Por exemplo, Nirenberg e Matthaei sintetizaram um
RNAm artificial contendo apenas uracilas, conhecido
como poli ( U ). Eles conceberam um sistema de traduçã o
—
in vitro composto de componentes celulares de tradu
ção bacteriana conhecidos ribossomos, moléculas
de RNA de transferência carregadas e proteínas essen -
ciais para a traduçã o. Independentcmente de onde a
tradução pudesse começar ao longo do RNAm poli(U ),
o único códon possível que ele continha era o UUU. Os
pesquisadores, portanto, esperavam determinar qual
aminoácido corresponde ao códon UUU .
Vinte traduções diferentes in vitro do RNAm poli(U)
foram realizadas, cada vez usando uma reserva de 19 ami
noácidos não marcados e um aminoácido marcado com
carbono radioativo (C14). Para determinar qual aminoá -
cido é codificado pelo RNAm poli( U), Nirenberg e Mat-
thaei usaram um aminoácido radioativo diferente em cada
tradução. Eles detectaram a produção de um polipept ídeo
altamente radioativo após realizarem a tradução em um
sistema contendo fenilalanina radioativamente marcada
.
í Figura 9.18) O polipept ídeo radioativo era poli-fenilala-
nína ( poli- Phe). Uma vez que o único tripleto de códon
possível no RNAm é o UUU, Nirenberg e Matthaei pen-
saram que a sequência 5' - UUU - 3' codifica a fenilala -
nina. Eles partiram para a construção de RNAm sintéti-
cos poli( A), poli(Q e poli(G) e identificaram a sequência
- - -
5' AAA 3' como um códon da lisina (Lys), 5' CCC 3' - entre os códons e os aminoácidos.
como um códon da prolina (Pro) e 5' - GGG - 3' como um
códon da glicina (Gly) ( Tabela 9.4).
Khorana adaptou a estratégia experimental de Ni
renberg e Matthaei para sintetizar moléculas de RNAm
que continham repetições de dois, três e quatro nucle-
otideos. Sua constru ção dos RNAm de sequência repe-
tida lhe permitiu definir muitos outros códons ( ver Ta
bela 10.4) . Por exemplo, Khorana usou a repetição UC
de dois nucleotídeos para formar um RNAm sintético
com a sequência
-
5' UCUCUCUCUCUCUCUCUC 3' - cada um dos diferentes quadros de leitura produza um
(a ) Tradu ção in vitro do RNAm sint ético
RNAm poli(U ) sintético
a IIFITITITITIIIÍITrriTITITIÍIIITITIIf , £ 3'
-
Sistema de tradu ção
in vitro contendo
aminoécrdcs
marcados com CM.
-
"/£: Ph* Dh» I f >h
mi c
Anaiisaros polipeof íõeos
radtoatvot
( b) Incorpora ção da fenilalanina marcada com Cu em polipept ídeos
Radioatividade
RNAm sintétko (contagens/ minuto)
Nenhum 44
Poli( U ) 39.800
Poli( A) 50
Poll(C) 38
- F igura 9.18 Uso dos RNAm sintétkos para determinar
as possibilidades do código genético, (a ) O RNAm poll( U )
sintético é traduzido in vitro na presença de aminoácidos
marcados individualmente com C\ Um polipept ídeo
consistindo em fenilalanina é formado, ( b) Essas contagens
radioativas demonstram que apenas o RNAm poli( U ) sintético
incorpora a fenilalanina radioativa em um polipept ídeo.
- Esse RNAm pode ser traduzido em um quadro de lei
tura que começa com uracila ou com citosina. Em
-
ambos os casos, o quadro de leitura produz códons
UCU -CUC alternados. Khorana identificou os ami
noácidos do polipeptídeo resultante e constatou que
-
ele continha serina (Ser ) e leucina ( Leu) alternadas,
mas não tinha certeza de qual códon especificava a .Ser
e qual codificava a Leu. Seguindo uma estratégia simi -
lar, Khorana também examinou os polipeptídeos pro -
duzidos pelos RNAm compostos de dinucleotídeos AG
. -
repetidos (5 ' .. AGAGAGAG .. . 30, bem como di
nuclcotídcos de UG e AC. Ele descobriu que dois amino-
-
ácidos alternados compunham os polipept ídeos resul -
tantes , estreitando assim as possí veis correspondências
Quando Khorana usou RNAm contendo repetições
de trinucleot ídeo, a maioria desses RNAm produziu
- três polipeptídeos diferentes que consistiam, cada um,
em apenas um tipo de aminoácido. Por exemplo, o qua
dro de leitura do poli- UUC pode começar com qualquer
-
uma das uracilas ou com citosina . O RNA mensageiro é
- lido como códons UUC consecutivos se a primeira ura -
cila iniciar o quadro de leitura , como UCU se a segunda
uracila começar o quadro de leitura ou como CUU se a
citosina estiver no início do quadro de leitura. Embora
 Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 319

Tabela 9.4 Produção de polipept ídeos a partir dos RNAm sintéticos

RNAm sintético Sequ ência do RNAm Polipeptídeos sintetizados Observação

Nudeotideos repetidos PolMJ UUUU - Phe- Phe - Phe.. . Os polipept ídeos tèm um
.
-
Poli C CCCC
-
Poli A AAAA
-_ Pro- Pro- Pro
- -
Lys Lys Lys
aminoácido

-
Polr G GGGG - -
Gly Gly Gly
Dinudeot ídeos repetidos Poli-UC UCUC ... Ser-Leu-Ser-Leu Os polipeptídeos têm dois
Poli-AG AGAG... Arg- Glu -Arg Glu aminoácidos alternados.

Trinudeotídeos repetidos
-
Poli UG UGUG...
PolhAC ACAC...

Poli-AAG AAGAAGAAG
_
- - -
Cys Val Cys Val
Thr- Hts-Thr- His
-
PolKJUC UUCUUCUUC- Phe - Phe...e $er $er e Leu - Leu-.
_
Lys-Lys...e A/ g -Arg...e Glu -Glu
Três polipept ídeos têm um
aminoácido cada.
Poli -UUG UUGUUGUUG- Leu-Leu...e Cys Cys-.e Val -Val
Poli-UAC UACUACUAC
- —
Tyr-Tyr...eThr-Thr...e Leu - Leu
Tetranudeot ídeos repetidos Poli UAUC UAUCUAUC . Tyr - Leu -Ser-lle-Tyr - Leu -Ser-lle
- Alguns polipept ídeos têm

PolhGUAA GUAAGUAA
—
Poli-UUAC UUACUUAC Leu-Leu-Thr-Tyr-Leu - Leu-Thr-Tyr
-
Nenhum (códon de parada UAA)
quatro aminoácidos repetidos.
Deve incluir um ou mais
Poli-GAUA GAUAGAUA
Nota: dados adaptados de Khorana (1967).
—
Nenhum (códon de parada UAG ) códons de parada .

polipeptídeo contendo um aminoá cido, Khorana mais
uma vez não tinha certeza de qual códon especificava
qual aminoácido.
A análise de Khorana dos tetranudeotídeos repe
tidos confirmou a redund â ncia do código gen ético e
a exist ê ncia dos códons de parada. O poli- UUAC con-
tém quatro códons repetidos independentemente de
qual nucleotídeo inicia o quadro de leitura. Os códons
- - -
UUA UAC ACU CUU se repetem em um padrão
permanente. O produto polipeptídico conté m quatro
aminoá cidos repetidos, Lcu- Leu -Thr-Tyr. Estava claro
que dois dos quatro códons especificam a leucí na, em -
bora Khorana n ão pudesse determinar quais eram os
dois códons redundantes. A repetição tetranucleo -
tídica GUAA produz um RNAm com quatro códons
- -
repetidos, GUA UAA - AAG AGU, mas não gera poli
pept ídeos. A partir disso, os pesquisadores deduziram
que um desses códons é um códon de parada.
Nirenberg e Philip Leder contribu íram com a peça
final do quebra -cabeça do código genético em 1964,
quando conceberam um experimento para resolver as
ambiguidades da identidade do códon remanescentes
dos experimentos de Khorana. Nirenberg e Leder sin
-
tetizaram muitos mini RNAm diferentes com apenas
três nucleotídeos de comprimento cada ( Figura 9.19).
Os min úsculos RNAm foram adicionados individual -
mente a sistemas de tradução irt vitro contendo ribos -
somos junto com 19 aminoácidos n ão marcados e um
aminoá cido marcado com C14, todos ligados a dife
rentes moléculas de RNA de transferê ncia. O RNAm
formou um complexo com o ribossomo e o RNAt
carregado com o aminoácido correspondente. De -
pois, cada mistura ia vitro foi derramada através de
um filtro que capturou os grandes complexos ribos
-
somo RNAm RNAt, mas que permitiu que as molécu
*
las não complexas de RNAm ou RNAt passassem . Pos -
teriormente, o filtro foi testado para determinar se a
sequência de RNAm trinucleot ídica ligava um RNA de
- transferência com um aminoácido radioativo. Nirenberg
e Leder testaram todas as 64 combinações de nucleo -
tideos com seu sistema de min úsculos RNAm e con
seguiram identificar as correspondências entre códons
-
e aminoácidos para o código genético inteiro. Além
disso, eles identificaram a composição nucleot ídica
dos três códons de parada, UAA, UAG e UGA ( An á lise
Genética 9.3) .
Observa çã o gen ética 0 código genético foi decifrado
através de uma sé rie de experimentos que utilizaram RNAm
sintéticos e um sistema de traduçà o In vitro. Dos 64 códons
- .
possíveis 61 correspondem a um dos 20 aminoácidos comuns;
os três restantes são códons dc parada que sinalizam uma inter
rupçá o da tradução. O código é redundante, significando que a
maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um códon.
Código genético (quase ) universal
- Como uma prova surpreendente da origem ú nica da
vida na Terra e do poder da evolução para manter a uni -
formidade praticamentc completa ao longo de centenas
de milh ões de anos, todo organismo vivo usa o mesmo
código genético para sintetizar polipept ídeos. Em todos
- os seres vivos, das bactérias aos seres humanos, o roteiro
hereditário executado por um determinado RNAm é
traduzido por um mecanismo similar e produz o mesmo
polipeptídeo. A universalidade do código genético toma
possível o uso de sistemas bacterianos para expressar
- produtos proteicos biologicamente importantes encon -
- trados em plantas ou animais. A produção de insulina
320 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O Componentes misturados das células vegetais e animais, mas també m ocorrem

duas exceções nos organismos de vida livre (Tabela
lYlYl .
9.5) A quase universalidade do código genético apre-
senta duas quest ões evolutivas importantes. A primeira
ÍHH i
5 TTDT 3" +

um * é: por que o código genético permaneceu basicamente

intocado nos organismos vivos? A segunda é: por que

Mini- RNAm
sintéticos
Ribossomos
uu
19 aminoácldos 1 aminoáddo
náo marcados marcado com
as mudanças evoluíram nas mitocó ndrias ? A resposta
para a primeira pergunta é que a pressão seletiva natu
ral contra a mudança do códon é intensa. Uma única
mudan ça no códon alteraria radicalmente a composi
-
-
específicos ligados aos RNAt CM ligado ção de quase todos os polipept ídeos que um organismo
ao RNAt
produz. Incontá veis exemplos evolutivos nos dizem
Passar a mistura pela membrana de filtragem.
0 Testar que quase todas as mudan ças que ocorrem seriam pre-
o filtro e a solu ção em busca de radioatividade. judiciais e muitas seriam fatais. Simplificando, uma
Os HNAm específicos mudança no código genético alteraria as regras do jogo
I estão vinculados a da vida e a seleção natural impede tais mudanças.
.
ribossoírxA que poi
sua vez, são aprIsioca -
As exceções à universalidade do código genético
dos pelo filtro; os RNAt nas mitocóndrias sugerem que a seleçã o natural às
nâo espedficcs não vezes atua de forma menos intensa ? A resposta apa -
vinculados a ribossomos
/ passam pelo filtro. rentemente é sim. Os genomas das mitocóndrias en -
Membrana de filtragem contradas nas células vegetais e animais são pequenos
em comparação com os genomas nucleares. Eles car
regam até 25 genes, aproximadamente, e produzem
-
cerca de 10 a 15 polipeptídeos. Qualquer perturba ção
causada por uma mudan ça no código genético mi -
tocondrial tende a ser limitada, já que o n ú mero de
0 HNAm GUC não se
ligaaoaminoácido
0 HNAm GUC se
ligaaoaminoãcido
genes afetados é muito pequeno. Além disso, exis -
tem muitas mitocó ndrias por célula , fornecendo “có-
serina. A radoatM-
dade está na solução.
valinj. A radioatrv
dade está no filtro. pias de seguran ça ” do genoma mitocondrial. Se uma
mudança no código genético perturbar gravemente
a fun ção de uma mitocôndria, existem outras na cé -
lula para desempenhar as atividades normais. Assim,
as mudan ças podiam advir no código gen ético mito-
condrial, mais provavelmente nos códons que n ã o sã o
utilizados em alto grau.

Figura 9.19 Decifrando o código genético com mini-

RNAm sintéticos. Para o mini -RNAm sintético GUC Tabela 9.5 Genomas que usam modificações do
um serinaRNAt marcado com C4 náo hlbridiza dentro código genético universal
do ribossomo para formar um complexo e a radioatividade
est á situada na solução de filtragem. 0 valina - RNAt
Códon Código Código Genoma
universal Irvcomum
-
marcado com C14 hibridiza para o mini RNAm GUC
dentro do ribossomo. O complexo RNAm- ribossomo- AGA . AGG Arg Parada Mitocóndrias em
plantas, animais
- RNAt é capturado pela membrana de filtragem, onde a
radioatividade é detectada. e leveduras
AUA . AUU He Met Mitocóndrias em
plantas, animais
humana para tratar o diabetes e de proteína do fator VIII e leveduras
para tratar a hemofilia são dois dos muitos exemplos
UGA Parada Trp Mitocóndrias em
de clonagem genética humana recombinante, em parte
plantas, animais
possíveis porque as bactérias e os seres humanos usam o e leveduras
mesmo código genético para tradução.
CUN ® Leu Thr Mitocóndrias em
No entanto, assim como acontece com a maioria leveduras
das regras, existem algumas exceções à universalidade
do código genético; desse modo, os bi ólogos caracte - UAA . UAG Parada Gin Algas verdes,
protozoá rios
rizam o código genético como quase universal. As ex -
UGA Parada Cys Protozoá rios
ceções são encontradas principalmente nas m í tocó n -
drias, que são espccialmcnte adaptadas à vida dentro N* •qualquer nuclcotídco na terceira posição.
 Capí tulo 9 Biologia molecular da tradução 321

AN ÁLISE GENÉTICA
O segmento de DNA a seguir codifica um polipeptideo contendo seis aminoácidos Os tripletos de .
DNA que codificam o c ódon de início ( AGU) e o códon de parada estão incluídos na sequência.
5' - « CCCAGCCTAGCCTTTGCAAGAGGCCATATCGAC .. - 3'
3' -_ GGGTCGGÀ TCGG À AACGTTCTCCGGTATAGCTG
- - 5'
a. Identifique a sequência e a polaridade do RN Am codificado por esse gene.
.
b Determine a sequência de aminoácidos do polipeptideo e identifique as extremidades N e C terminais do polipeptideo.
.
c As mutações por substituição de bases alteram a primeira G transcrita da fita-molde para uma A. De que forma isso altera o
polipeptideo?

Estrat égias de solu çã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por 1. 0 problema envolve a Identificação das fitas codificadora e molde do DNA, da
este problema e explique a natureza proteína codificada pelo DNA e a avaliação de uma mutação da sequência de
da resposta solicitada. DNA. A resposta exige a identificação das fitas de DNA, a identificação dos có-
dons de início e parada e a determinação da sequência de aminoácidos das pro-
teínas do tipo selvagem e mutadas.

.
2 Identifique as informações críticas 2. é fornecida a sequência de DNA que inclui um c ódon de início (AUG) e um
fornecidas no problema. de parada.

Deduzir
.
3 Identifique o códon de Início inspe- .
3 A varredura das duas fitas do DNA em sua direção 3' para 5' identifica uma única
cionando ambas as fitas de - .
sequência 3' - TAC 5' Essa sequência está na fita superior da sequência, co-
DNA para 3' - TAC - 5 ' Dica: 0 côòon de meçando no sétimo nucleotídeo a partir da direita.
que possivelmente «nkio AUG é o mab
corn
codificam um códon ****
M

^ ZL XnUt
>

.
de inibo (AUG) na
fita-molde.
4 Examine a
DNA r T A C 3' ,
e

suposta fita -molde identi-

- - . ^.
4 Como apenas um tripleto de DNA que codifica um códon de início está pre-
ficada na etapa anterior e determine sente, uma varredura da fita encontra uma sequência tripla 3' TAC 5' codifi- - -
-
se os tripletos de DNA 3 ' ATC 5', - .
cando um códon de parada UAG Os tripletos de inicio e parada estão realçados
-
3' ACT - 5 ' e na fita-molde:
-
3' ATT 5' que- Dkj Os c ódons de
-da DAG. UCA e
por.
-
Parada Iní cio 3' CCCAGC CTA GCCTTTGCAAGAGGC CAT A7CGAC 3' -
codificam possíveis UAA são codificados

——
códons de parada wpéeios de
ONA 3 ATC • 5
'
-
ocorrem no sétimo ^ 3' * A C r'* 5 e ' .
códon de uma -
3 * A T T •5 \
sequência de RNAm. INiá: Substituir U por T Md fita codificadora produz urra sequência de
HAAm. De modo alternativo, organizar os nudeotkfeos do RNA corrple-

Solucionar RespOSta ò
mentares i fita-molde e atribuir polaridade anttparaMa produz RNAm .
Oirx A sequência dr RNAm
podr ur drcrroruda a pe- 3^
.
/1
5 Identifique a t» d» fita codfesdorj nu da A sequência de RNAm ti
fita -makle da ONA
sequência de
RNAm que codifica os seis aminoáci- -
5 ' AUG GCC OCU UGC AAA GGC UAG * 3 '

dos do polipeptideo.

Resposta b
.
6 Apresente a sequência de aminoád* .
6 A sequência polipeptldica é
dos do polipeptideo.
-
N - H«t - Àla - S«r * Cy « Ly « Gly C - -
Resposta c
.
7 Identifique o efeito no polipeptideo .
7 Substituir o primeiro G -* A altera o segundo códon do RNAm, mudando
da substituição de base G -• A . GCC -* GUC, e substitui a valina (Vai) pela alanina ( Ala) na segunda posição da
sequência polipeptídica .
Para pratkar mals, ver Problemas 1, 5, 29, 30 e 31 .
322 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
RNAs de transferência e especificidade do
código genético
Em nossa discussão sobre o código genético c a
montagem dos polipeptideos no ribossomo, descreve
mos a interação específica de pares de bases entre a se
quência do anticódon do RN At carregado e a sequência
do códon do RNAm como fundamental para incorpo-
rar o aminoácido correto no polipeptídeo. Mas como
os biólogos determinam que a especificidade do código
genético reside na interação RNAt- RNAm e nào no re
conhecimento do aminoácido carregado pelo RNAt ?
A resposta veio de um experimento simples e inteli -
gente realizado por François ChapeviUe e vários colegas
em 1962, Os pesquisadores começaram preparando RNAt
normais carregados de risteína. Esse complexo recebe o
nome de Cys-RNAt0**. Depois, os pesquisadores trataram
o Cys-RMAt01' com o composto níquel de Raney que re-
move o grupo SH da cisteína e a converte em alanina. Esse
-
tratamento produz Ala RNAtCy* no qual a alanina, em vez
.
da cisteína, está associada com o RMAtP* Quando Cha
peviUe e colegas usaram o complexo Ala - RNAC” em uma
reação de tradução in vitro, o polipeptídeo continha ala-
nina em vez de cisteí na nas posições do aminoáddo que
normalmente teriam cisteína. Em outras palavras, o com-
-
plexo Ala RN At0" formou pares eficientemente com os
códons do RNAm que especificam a cisteína e deposita -
ram alanina no polipept ídeo nascente, embora a sequência
de RNAm especificasse cisteína.
Duas conclusões importantes advieram desse expe
rimento. A primeira é que o código gen ético deriva sua
especificidade por meio da interação de pares de bases
complementares do RNAt e do RNAm. () aminoácido
levado pelo RNAt carregado não desempenha um papel
importante na determinação de quais aminoácidos são
incorporados aos polipeptideos. Em vez disso, o RNAt
—
isoladamente agindo através da interação de pares de
bases de seu anticódon com o códon de RNAm for-
nece especificidade para o código genético. A segunda
conclusão é demonstrar a importâ ncia da fidelidade
das aminoacil - RNAt sintetases em reconhecer correta
noácido adequado.
-
mente seus RNAt cognatos e em carregá los com o ami
Observa çã o gen ética 0 código genético é quase uni
versal e se baseia nos RNAt adequadamente carregados para
conduzir os aminoácidos corretos e ligar os códons para forne-
cer os aminoácidos para o polipeptídeo recém-formado.
9.6 A tradução é seguida pelo
processamento polipeptídico e
pela classificação proteica
A tradução produz polipeptideos, mas a produção
de proteínas funcionais a partir desses pept ídeos muitas
vezes não é concluída até os polipeptideos serem qui
micamente modificados e transportados para as posi -
ções celulares ou extracelulares onde são ativos. Duas
-
categorias de eventos pós tradução modificam e trans -
.
portam polipeptideos Uma delas é o processamento
- polipeptídico pós- tradução, que transforma os poli -
- peptídeos em prote ínas funcionais pela remoção ou al -
teração química dos aminoácidos após o término da tra -
du çã o. A outra , a classificação proteica , é um processo
diferente e geneticamente controlado que usa sequê n -
cias de sinal , também chamadas sequ éneias-líder,
- que são sequências curtas de aminoá cidos na extremi -
-
dade N terminal de um polipept ídeo, para classificar as
-
proteínas e direcioná las para seus destinos celulares.
Ambas as categorias de processamento sã o comuns em
bactérias e eucariotos. A classificação proteica é neces -
sá ria nas células bacterianas em razão das multas prote
ínas destinadas especificamente para a membrana celu
--
.
lar Entretanto, nos eucariotos a classificação proteica é
bem mais complexa do que nas bacté rias, despachando
proteínas para determinadas organelas celulares, como
- o cloroplasto, a mitocô ndria, o lisossomo e o n úcleo,
fazendo também que certas proteí nas sejam secretadas
pelas células.
Processamento pós-tradução
A remoção de um ou mais aminoácidos de um po-
lipept ídeo é uma forma comum de processamento poli -
peptídico pós- tradução. Anteriormente neste capítulo,
- identificamos o AUG como o códon de in ício usual e
observamos que ele codifica o aminoá cido modificado
N-formil- met íonina (ÍMet) nas células bacterianas e
a metionina nos eucariotos. Contudo, o fMet nunca
é encontrado nas proteí nas bacterianas funcionais c os
aminoácidos, exceto a metionina , são frequentemente o
primeiro aminoácido dos polipeptideos nos eucariotos.
—
A ausência do ÍMet das prote ínas bacterianas funcionais
-
resulta da clivagem pós tradução do fMet de cada poli -
peptideo bacteriano (Figura 9.20a ). De modo similar, a
metionina normalmente é removida como parte inte-
- grante do processamento pós-traduçã o nos eucariotos
- e o novo aminoácido N - terminal é acetilado como parte
desse processo.
Alé m dos aminoá cidos N- terminais, outros resí-
- duos de aminoácidos també m podem ser modifica-
dos. Uma das modificações mais comuns de cada ami -
noácido é realizada pelas enzimas conhecidas como
quinases, que executam a fosfor í laçâo das proteínas
adicionando um grupo fosfato a cada aminoácido ( Fi -
gura 9.20b). Esse é um processo regulatór ío importante,
que pode passar uma proteína da forma inativa para a
forma ativa e vice- versa. Outras enzimas podem adi
cionar grupos inetila, grupos hidroxila ou grupos ace
--
tila a cada aminoácido dos polipeptideos. A adição de
cadeias laterais de carboidratos aos polipeptideos para
formar uma glicoprote í na é outro tipo importante de
modificação pós - tradução. Por exemplo, em um tipo
- de modificação pós- tradução, a substância H é alterada
 Cap í tulo 9 Biologia molecular da traduçã o 323

(a ) Clivagem dos aminoá cidos N -terminais

NG 1 Leu Ihis T Vd ; Am
-
Durante o processamento pós tradução da pré pró in
sulina, os pré - aminoácidos da sequência de sinal são
- - -
removidos após o polipeptídeo ter sido transportado
através da membrana celular, formando pró-insulina.
Três pontes bissulfeto se formam dentro e entre os seg-
CTirirwiríif , 7c mentos das cadeias A e B, seguidas pela clivagem do po-
lipeptideo que remove o segmento pró- aminoácido. O
(b ) Modificação qu ímica dos aminoá cidos internos resultado é uma molécula de insulina funcional consis -
N T Uk T Vai T A«í Cf/ tindo em 20 aminoácidos no segmento da cadeia A e 31
aminoácidos no segmento da cadeia B.
Quinase

Classificação proteica
I
N 7c De modo an álogo ao dos passageiros em um ter-
minal aé reo movimentado, as proteínas em uma célula
tém destina ções diferentes para as quais devem se-
(c) Clivagem do polipept ídeo guir com a ajuda de um “ bilhete ” que diz à célula para
Pré-pró-insulina onde levá las. O destino muitas vezes é uma organela
N
Pré Cadeia B Pr ó Cadeia A
C ou a membrana celular; em certos casos, o polipep -
-aminoácidos -aminoácidos tídeo é destinado ao transporte para fora da célula. O
bilhete que comunica o destino de um polipeptídeo é
Clivagem dos uma sequência de sinal de 15 a 20 aminoácidos, mais ou
pré-aminoácidos menos, na extremidade N - terminal.
Pró-insulina Articulada pela primeira vez no início dos anos
1970 por Gunther Blobel , a hipótese dos sinais propõe
Cadeia A
que os 15 a 20 primeiros aminoá cidos de muitos poli
peptídeos contêm uma “etiqueta de endereço" na forma
-
S S Pontes bissulfeto se fornam
entro as cadeias A e 8. de uma sequência de sinal que designa a destina ção da
proteína na célula . A hipótese de Blobel propõe que a
Cadeia B sequência de sinal direciona as proteínas para o retículo
endoplasmá tico ( FR ), onde sâo classificadas segundo
Clivagem dos sua destinação celular ( Figura 9.21). De um modo algo
pró-aminoácidos
Insulina
Retículo endoplasmá tico rugoso
-
vs Cadeia A
(sítio de s í ntese das N úcleo
prote í nas secretadas)
Membrana piasmática

Figura 9.20 Exemplos de processamento pòs-tradu çã o.

pelos produtos proteicos dos alelos IA e P do gene do

grupo sangu í neo ABO (Capítulo 4).
O processamento pós- traduçào pode incluir a cliva
gem de um polipeptídeo em vários segmentos que for -
-
mam, cada um, proteí nas funcionais ou que se agregam o cisterna!
após a eliminação de um ou mais segmentos, formando do ret ículo Aparelho
uma proteína funcional. A produção do hormònio insu - má tico de Golgi
lina, que facilita o transporte da glicose para dentro das
células, inclui duas etapas de modificação pós- tradução
que removem os segmentos do polipeptídeo original ( Fi- Liberação das
proteí nas para
gura 9.20c ). O produto polipeptídico traduzido do gene Empacotamento das fora da célula
da insulina se chama pré- pró- insulina. É uma proteína proteí nas em vesículas
inativa que contém um segmento- líder, chamado seg - Figura 9.21 Sítios de empacotamento e processamento
mento pré-aminoácido, na extremidade N - termina! .
de polipeptfdeos Os polipept ídeos passam dos
e um segmento de conexão, chamado segmento pró- ribossomos para o ret ículo endoplasmá tico rugoso, onde
- aminoácido, que separa o segmento da cadeia A e o são empacotados em vesículas que os transportam para o
da cadeia B, as duas partes funcionais do polipeptídeo. aparelho de Golgi visando ao processamento adicional.
324 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

parecido com a maneira que a correspondê ncia é clas
sificada para entrega por seu código postal ou CEP, as
sequ ê ncias de sinal na extremidade N - terminal das pro-
te í nas recém -sintetizadas facilitam sua captação pelo
RE c identificam sua dcstinaçào final.
A hipó tese dos sinais de Blobel recebeu amplo
apoio experimental. Por exemplo, logo após ele propor
sua hipótese, Cesar Milstein e colegas confeccionaram
um sistema de tradução in vitro que não tinha RE e o
utilizaram para produzir proteínas que normalmente
sáo secretadas pelas células. Milstein constatou que
as proteínas em seu sistema in vitro tinham de 18 a 20
aminoácidos a mais no comprimento do que as mesmas
proteínas produzidas in vivo e posteriormente secre-
tadas pelas células. Os aminoácidos extras estavam na
-
extremidade N terminal das proteínas. Experimentos
de acompanhamento in vitro usaram o mesmo sistema ,
mas com o RE inclu ído, e, pelo contrá rio, produziram
proteínas que n ào possuíam os aminoácidos extras, mas
eram idê nticas às versòes secretadas das proteínas nor-
malmente encontradas nas células. O trabalho experi -
mental desde os anos 1970 tem documentado a com
posição e o processamento das sequências de sinal dos
polipeptídeos destinados à secreção.
O RE e o aparelho de Golgi são uma espécie de amplo
complexo industrial para a produção e a embalagem de
- proteínas ( Figura 9.21). Os polipept ídeos destinados à
secreção são sintetizados no ret ículo endoplasmático
rugoso, o nome dado às partes do RE onde os ribosso-
mos pontilham a superfície. O RE é composto de duas
membranas externas com um espaço interno entre elas,
chamado espaço cisterna!. Quando a tradução começa,
os polipept ídeos com uma sequência de sinal têm sua ex
-
tremidade N terminal empurrada para o espaço cisternal
-
através de receptores na superf ície da membrana do RE
.
( Figura 9.22 ) Os polipept ídeos sem uma sequê ncia de
sinal nào sã o empurrados para dentro do espaço cister-
nal e permanecem no citoplasma. No espaço cisternal, os
polipept í deos formam uma alça e sua sequência de sinal
é removida. Então o polipept ídeo sofre glicosilaçào (a
ligação de um açúcar) e, à medida que passa pelo RE, é
empacotado em uma vesícula para ser transportado por
uma curta distância até o aparelho de Golgi.
No aparelho de Golgi, ocorre mais glicosilaçà o,
que sinaliza a dcstinaçà o do polipeptídeo determi-
nando o receptor ao qual esse polipeptídeo vai se ligar
( Figura 9.23 ). A ligação ao receptor leva diretamente à
- inclusã o dos polipept í deos glicosilados nas vesículas de
transporte que brotam do aparelho de Golgi. As vesí -
culas se deslocam para suas destinações celulares, in
cluindo organelas e a membrana celular (é nesta última
-
que ocorre a secreção proteica ).

As proteínas entram no RE rugoso à medida AseQjê noadesinal é

que sào sintetizadas pelo rtoossomo. sintetizada peio ribossorro
RNAm (exibido em roxo) .
9b

m
Rlbossomo
"
JK % — Polipept ídeo
RNAm
A sequênoa de sinal se
liga ao receptor do RL
Ribossomo

RE rugoso
\
Sequê ncia
de sinal 4 r
iimHiiiiiiifj íinnmwMmJiinifj
Receptor do RE

iimiiiMimmiiiimuiiMimuiiMmiiii I r

Vesícula As proteínas sáo \ Espaço cisternal

* empacotadas em do RE
vesículas onde sáo
transportarias para o O pol peptidoo entra no RE após
acarehode Golgi . a clivagem da sequénea de sinal.

As proteínas entram em vesículas

secret
óras direcionadas para a
merrorana celular (proteína secreada)
ou para um local intracelular.
F i g ura 9.22 Proteínas entram no retículo endoplasmático
Membrana plasmática .
( RE ) As proteínas traduzidas entram no espaço cisternal do RE
Proteína seaetada
*< pela célula .
atravé s de receptores que clivam as sequências de sinal para
começar o processo de classificação proteica.
 Cap í tulo 9 Bicdogla molecular da traduçã o 325

Figura 9.23 Classificação

Interior do aparelho As proteínas do R£ entrarr no ( separação ) proteica no aparelho
de Golgi Glkosèla çào .
apareho de Golgi Diferenças deGoigi. As proteí nas são
ra gkosilaçào atribuem as direcionadas para diferentes destinos
proteinas a destinos diferentes.
na célula por diferentes‘etiquetas’
de carboidrato acopladas durante o
processamento no aparelho de Golgi .
As etiquetas se ligam a receptores
As proteínas g cosiladas se específicos, fazendo que as proteínas
ligam aos rpceptores para sejam empacotadas em ves ículas
serem empacotadas em
Receptores Proteí na ligada adequadas no aparelho de Golgi.
vesículas de transporte.

o ô ít a receptor
f As proteí nas nas ves ículas interagem
com receptores em seu local
de destino.
As vesículas
brotam na
membrana do

W <X> W
Citoplasma As vesículas tians-
-
aparelho de Golgi

. po tam as proteinas
para seu destoo.

Para um destino Para as organelas Para a membrana

intracelular plasmática visando à secreção

e se dissociam quando a estrutura corretamente do-

Observa çã o gen é tica Os polipeptideos sofrem cliva-
gem pós tradu çã o e modificação qu í mica dos aminoácidos. As
prote ínas eucarióticas são rotuladas para transporte para vá
rios locais celulares pela presença de uma sequência de sinaL
Esta permite que os pdlpept ídeos recém-formados entrem no
.
espaço cisternal do RE onde são embalados em vesículas para
serem transportados para o aparelho de Golgi. Neste, os poli
pept ídeos sofrem glkosila ção e são embalados em vesículas
de transporte para serem entregues nos destinos celulares.
Destruição das proteínas dobradas
incorretamente
As mutações provocam defeitos nas proteí nas ao
mudarem a sequência de aminoácidos de um polipep -
tideo. As proteínas defeituosas não funcionam nor
malmente, na maioria das vezes porque se dobram
inadequadamente, formando uma estrutura instá vel
ou desprovida de sítios funcionais de atividade enzim á
tica, ligação para transporte ou outras tarefas realizadas
pelas prote í nas. Dentro do RH , as prote í nas incorreta -
mente dobradas são identificadas e ligadas por molécu
las chamadas chaperonas, que desempenham um papel
importante na dobragem proteica no RE. As chaperonas
se afiliam a proteínas durante o processo de dobragem
brada é alcan çada . Se n ão ocorrer a dobragem correta,
as chaperonas permanecem irreversivelmente ligadas às
- proteínas mal dobradas, resultando no sequestro dessas
proteínas no RE Os complexos sequestrados, compos-
tos pelas chaperonas e pelas proteí nas mal dobradas,
geralmente sào destruídos.
- No entanto, existem algumas exceções a essa regra
que resultam na destruição de determinados tipos de
células que acumulam grandes quantidades de proteí
nas mutadas. As doenças resultantes da morte das cé-
-
lulas decorrentes do ac úmulo de proteínas mal dobra -
das são classificadas como doen ças conformacionais.
O nome dessa ampla categoria de doen ças genéticas é
proveniente do processo de "conformação proteica " por
meio do qual as proteínas atingem sua forma dobrada.
Vá rias doen ças conformacionais das proteínas
- humanas sào conhecidas, e frequentemente sào trans -
tornos degenerativos e dem ê ncias. Por exemplo, a
doen ça de Alzheimer é produzida pelo ac ú mulo de
- -
proteí na [J amiloide mal dobrada que leva à destrui
çã o de certas células cerebrais. Uma forma familiar da
-
doença de Parkinson , produzida pelo acú mulo de pro -
- -
teí na a sinucle í na mal dobrada , também resulta na
destruição de certas células cerebrais. De modo simi -
lar, a doença de Huntington é produzida pela destrui -
çã o dos neurônios em razã o do ac ú mulo de prote í na
326 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
huntingtina mal dobrada. Cada uma dessas doen ças
tem uma idade de in ício tardio, que se deve à morte
celular gradual causada pela presen ça de agregados
ESTUDO DE CASO
Antibióticos e interferê ncia na tradu ção
Todos nós já tomamos antibió ticos várias vezes du
rante nossas vidas para combater uma infccção microbiana
dolorosa ou persistente. Como resultado da eficiência des-
ses compostos» experimentamos um alívio r á pido dos sinto
mas e a eliminação da infccção. Esses efeitos ben é ficos são
obtidos pela morte celular seletiva. Especificamcnte, o an
tibiótico elimina os microrganismos sem prejudicar nossas
próprias células no processo. Qual é a base bioqu ímica da
açã o antibiótica? Como os compostos antibióticos se vol
tam cspcciíicamcnte paras as células microbianas visando à
sua destruição?
Provavelmente você nào vai se surpreender ao apren
der que diferentes antibióticos visam a diferentes aspectos
da biologia microbiana para eliminar microrganismos Mas . induz o pareamento entre um códon UUU e o RNAt porta
vocé pode sc surpreender ao aprender que muitos antibióti
cos diferentes visam à tradução microbiana como seu modo
de açào (Tabela 9.6 ). Os antibióticos rnais conhecidos, como
tetraciclina, estrcptomicina c cloranfenicol , visam a está gios
diferentes da tradução microbiana , do mesmo modo que os
antibióticos menos conhecidos, como a eritromicina, a puro
micina c a ciclohcximida. Cada antibiótico conté m um com
Tabela 9.6 Inibktores antibióticos da síntese proteica
Antibiótico Açã o inibitória
Cloranfenicol Bloqueia a formação dos polipeptideos
inibindo a peptidil transferase no ribos -
somo 70S (açã o antibacteriana )
Eritromicina Bloqueia a tradução se ligando à subu - fungos, també m podem provocar tnfecções humanas. Para
nidade 50S e inibindo a liberação do
polipeptídeo (ação antibactcriana )
Estreptomicina Inibe a iniciação da tradução e provoca
erro de leitura do RNAm ligando-se à
subunidade 30S (ação antibacteriana )
Tetracidina Liga-se à subunidade 305 e inibe a
ligação dos RNAt carregados (a çào
antibacteriana )
Cidobeximida Bloqueia a formação de polipeptideos ini-
bindo a atividade de peptidil transferase
no ribossomo 80S (ação antieucariótica )
Puromicina Provoca a terminação prematura da
tradução agindo como um an á logo do
RNAt carregado ( ação antibacteriana e
antieucariótica )
anormais de proteí na mal dobrada . Essas doen ças são
neuronais porque é onde os genes que codificam as
prote ínas sã o expressos.
- -
posto ativo diferente que tira proveito das caracter ísticas ex
clusivas da tradução bacteriana para perturbar a produçã o
de proteínas bacterianas e, ao mesmo tempo, sem interferir
- na tradução das proteínas nas nossas células .
A estreptomicina é um dos vá rios antibióticos cm
- uma classe de compostos bioquímicos, chamuda aminogU
eosídeos. A estreptomicina inibe a traduçã o bacteriana ao
-
interferir na ligaçã o da N -formil-mctionina RNAt com o
- ribossomo, impedindo assim a iniciação da tradução. A es -
treptomicina també m provoca erro de leitura do RNAm
durante a tradução ao gerar o pareamenlo incorreto entre
- .
os códons e os anticódons Por exemplo, o códon UUU nor
malmcntc especifica a fcnilalanina , mas a estreptomicina
-
-
- dor da isolcucina , cujo códon é AUU. Esse CITO leva a mu
danças nos aminoácidos das proteínas e potendalmente a
-
deficiê ncias na atividade proteica. Outros aminoglicosídeos .
como a neomicina, a canamicina e a gentamicina , também
causam erros de pareamento entre códons e anticódons, po -
- .
dendo gerar prote ínas defeituosas A eritromicina também
- prejudica a tradução bacteriana , mas o faz de um modo
diferente. Ela se liga à subunidade 50S (grande ) no t únel
-
pelo qual emerge o pdipeptideo recé m sintetizado. Dessa
maneira, a eritromicina bloqueia a passagem do polipeptí -
deo para fora do ribossomo. Isso faz que o ribossomo fique
paralisado no RNAm c leva à parada da tradução. A Tabela
9.6 fornece detalhes sobre essas e outras açues dos agentes
antibactcrianos.
Os microrganismos eucarióticos unicelulares, como os
.
combater essas infccçócs sã o utilizados antibióticos como
a puromicina e a cicloheximida, que visam às atividades de
.
tradução das células eucarióticas A puromicina tem uma
estrutura tridimensional similar à da extremidade V dc um
RNAt carregado. Ela interrompe a tradução dos RNAm
-
bacterianos e eucanóticos ligando se ao sítio A ribossômico
c agindo como um análogo do RNAt carregado. Ouando a
.
puromicina se liga no sítio A seu grupo amino forma uma
ponte pcpt ídica com o grupo carboxila do aminoácido do
sítio P. No entanto, a puromicina não contém um grupo
carboxila. Essa diferença impede a formação de quaisquer
outras pontes pcpt ídicas e leva à parada da tradução. A ci-
cluheximida bloqueia exclusivamente a tradução eucarió-
tica ligando se à subunidade 60S e inibindo a atividade dc
peptidil transferase, de modo bem parecido com o que o
cloranfenicol faz na peptidil transferase bacteriana .

RESUMO
9.1 Os ribossomos são máquinas de tradução
I A tradução ocorre no ribossomo, onde os códons de RNAm
sáo associados aos anticódons do RN A de transferência
pelo pareamento de bases complementares.
Os polipeptídeos sáo cadelas lineares de aminoácidos que
*se ligam através de pontes peptfdicas montadas nos ribos-
somos.
Os polipeptídeos têm uma extremidade N-termínal
(amino) e uma extremidade C-terminal (carboxila) . ria dos aminoácidos é especificada por mais de um códon.
I Os ribossomos sào compostos de duas subunidades que con-
sistem cada uma em RNA ribossómico e muitas proteínas,
Os ribossomos têm tr ês sítios de ação funcionais: o sítio R
onde o polipeptideo é mantido; o sítio A, onde as molé-
culas de RNAt se ligam para acrescentar seu aminoácido à
extremidade do polipeptideo; e o sitio E, que fornece um
ponto de saida para os RNAt descarregados . cada RNAt.
92 A tradução ocorre em tr ês fases
I A traduçáo bacteriana é iniciada com a ligação da sequên-
cia de Shine-Dalgamo na extremidade 5' do RNAm a uma
sequência complementar de nucleotídeos na extremi-
dade 3' do RNAr 16S na subunidade ribossômica menor. O
códon de início vizinho é o sítio onde começa a tradução.
No RNAm eucarlòtico, o 5' cap é o sítio de ligação dos fa-
tores de Iniciação eucarióticos que fazem que a subuni-
dade ribossômica menor comece a varredura em busca do
códon de início, que faz parte da sequência de Kozak.
A peptidil transferase une os aminoácidos na cadeia polí-
peptidica crescente, e as proteínas do fator de prolonga-
mento ajudam a translocar o ribossomo ao longo do RNAm.
Durante a síntese polipeptídica, os RNAt carregados en -
tram rvo sitio A e a peptidil transferase catalisa a formação
da ponte peptídica, transferindo o polipeptideo do RNAt
no sitio P para o RNAt no sítio A. As proteínas do fator de
prolongamento translocam o ribossomo, deslocando o
complexo RNAt -polipeptideo do sítio A para o sítio P e
abrindo o sítio A para o próximo RNAt carregado.
A tradução termina quando um códon de parada entra no
sítio A. As proteí nas do fator de liberação, em vez do RNAt,
ligam-se aos códons de parada. Os fatores de liberação
provocam a liberação do polipeptideo e levam è dissocia-
ção do ribossomo e do RNAm.
9J A tradução é rá pida e eficiente
Um RNAm sofre traduçáo simultâ nea por vários ribosso -
mos que se acoplam a ele sequencialmente, para formar
um polirribo5somo,
I Normalmente, um ribossomo vai se dissociar do RNAm ao
encontrar um códon de parada, mas pequenos espaçado-
Capí tulo 9 Bicdogla molecular da tradução 327
res intercistrônicos em alguns RNAm policistrônicos bacte-
rlanos permitem que um ribossomo traduza dois ou mais
polipeptídeos sequencialmente a partir do RNAm antes
que ele se dissocie.
9.4 O código genético traduz o RNA mensageiro
em polipeptideo
I 0 código genético é redundante, significando que a maio-
A redundância do código genético é viabilizada pela osci-
lação da terceira base que relaxa os requisitos rigorosos do
pareamento de bases complementares na terceira base do
códon .
I Enzimas especializadas, chamadas aminoacil-RNAt sinte-
tases, catalisam a adição de um aminoácido especí fico a
9.5 Experimentos decifraram o código genético
I A análise experimental fn vitro demonstra que o código
genético é triplo e não contém lacunas ou sobreposições.
Cada códon do RNAm é composto de três nucleotídeos
consecutivos. Dos 64 códons contidos no código genético,
61 especificam aminoácidos e 3 correspondem a códons
de parada.
0 código genético foi decifrado pela análise da tradução in
vitro do RNA mensageiro sintética
I 0 c ódigo genético é basicamente universal entre os orga-
nismos vivos. As poucas exceções ao código genético são
encontradas principalmente nas mitocóndrias.
I Os RNAt adequadamente carregados desempenham um
papel central na conversão da sequência de RNAm em se-
quência polipeptídica.
9.6 A tradução é seguida pelo processamento
polipeptídico e pela classificação proteica
A formação de proteí nas funcionais ocorre após a tradução
ser concluída. Os aminoácidos podem ser modificados qui-
micamente ou removidos dos polipeptídeos durante seu
processamento após a tradução.
I As proteínas nas células eucarióticas são classificadas se-
gundo suas destinaçóes celulares por sequências de sinal
em suas extremidades N-terminais. As sequências de sinal
são removidas dos polipeptídeos no RE, e os polipeptídeos
destinados a sítios diferentes na célula são glicosilados
de modo diferencial antes de serem empacotados para o
transporte para o aparelho de Golgi.
No aparelho de Golgi, os polipeptídeos são empacotados
em vesículas de transporte para serem entregues a seus
destinos celulares.
328 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

T E R M O S-C H A V E

Aminoadl RNAt sí ntetase (RNAt sinte
tase) [p. 314)
Chaperonas (p. 325)
Classificação proteica (p. 322 )
Códon sinónimo (p. 3 ) 3 )
Complexo de pré-iniciação (p. 302 )
Complexo de iniciação 30S (p. 304)
Complexo de Iniciação 70S (p. 304 )
Complexo de iniciação (p. 305)
Fator de iniciação < IF) (p. 302 )
Fator de iniciação eucariótico (elF> (p. 305)
Fator de liberação (RF) p. 308)
< Região não traduzida 5' (5' UTR) (p. 300)
Fator de prolongamento (EF) (p. 307)
Hipótese dos sinais (p. 323)
PROBLEMAS
Inosina (I) <p. 3 74)
Mutação por mudanç a no quadro
.
de leitura (p 3 J6)
Mutação por reversão (p. 316)
N-focmil-metionina ( fMet;RNAt1*1”) (p 303 )
Oscilação da terceira base (p. 3 73)
.
Polirribossomo (p 309)
Processamento pollpeptidico pós
.
-traduçào (p 322 )
Quadro de leitura (p 316 ) .
Região não traduzida 3'(3* UTR) (p. 300 )
RNAm policistr ônico (p. 370)
RNAt carregado (p 302 ) .
RNAt descarregado (p. 302 )
RNAt inidador (p. 302 )
RNAt isoaceptores [p. 313 )
Sequência de Kozak (p. 305)
. Sequência de Shine-Oalgarno (p. 302 )
Sequência de sinal (sequência-líder)
(p- 322)
- Sítio aminoadl (sítio A) (p. 300)
.
Sítio de saída (sitio E) (p 300)
Sitio peptídil (sítio P) (p. 300)
Subunidade ribossómica maior (p 300) .
Subunidade ribossómica menor (p 300) .
Varredura (p. 305)
Para oòfer as respostas dos problemas pares,
ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Algumas proteínas são compostas de dois ou mais poli-
-
peptídeos. Suponha que a sequência da fita molde do
-
DNA y TACGTAGGCTAACGGAGTAAGCTAACT 5' pro- - 6.
duza um polipeptídeo que se une em pares para formar
uma proteína funcional.
a. Qual é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo
produzida a partir dessa sequência?
b. Qual termo é utilizado para identificar uma proteína
funcional como essa formada quando dois polipepti-
deos idênticos se juntam?
2. Nos experimentos que decifraram o código genético,
muitas sequências de RNAm sintético diferentes foram
testadas.
a. Descreva como o códon da fenilalanina foi identifi-
cado.
b. Qual foi o resultado dos estudos dos RNAm sintéticos
compostos exdusívamente de citosina ?
c Qual resultado foi obtido para os RNAm sintéticos con-
tendo repetições AGr ou seja,
AGAGAGAG...?
d. Preveja os resultados dos experimentos examinando
repetições GCUA.
3. Várias linhas de evidência experimental apontaram para
um código genético triplo Identifique três informações
que apoiaram a hipótese da estrutura do c ódigo gené
tico em tripletos.
4. Descreva os eventos que ocorrem durante a iniciação da
. .
tradução na E coíi
5. Uma parte de uma fita-molde do DNA tem a sequência
de base
-
5' ...ACGCGATGCGTGATGTATAGAGCT...» 3'
a. Identifique a sequência e a polaridade do RNAm trans-
crito a partir desse fragmento de sequência da fita-moíde.
b. Determine a sequência de aminoácidos codificada por
esse fragmento. Identifique as direções N e C terminais
do polipeptídeo.
c. Qual é o terceiro aminoácido adicionado à cadeia poli-
peptidica?
Descreva três características das moléculas de RNAt que
levam ao carregamento correto pelas enzimas RNAt
sí ntetase.
7. Identifique o aminoácido carregado pelos RNAt com as
seguintes sequências de anticódon.
- -
a. 5' UAG 3'
- -
b.5' AAA 3'
- -
C. 5' CUC 3'
d. 5' AUG 3'
e. 5' - GAU - 3'
8. Para cada uma das sequências de anticódon fornecidas
no problema anterior, identifique a outra sequência de
códon à qual ela poderia se associar usando a oscilação
da terceira base .
9. Qual é o papel dos códons UAA, UGA e UAG na tradução?
Que eventos ocorrem quando um desses códons aparece
no sítio A do ribossomo?
10. Compare e diferencie a composição e a estrutura dos ri -
bossomos bactérianos e eucarióticos, identificando pelo
menos três caracterí sticas iguais e três exclusivas de cada
tipo de ribossomo.
- .
11 Considere a tradução da seguinte sequência de RNAm:
5' - .. . A U G Cà G A U C C A U G C C U A U U G A .. . - 3'
a. Faça um diagrama da tradução no momento em que
o quarto aminoácido é adicionado à cadeia polipep-
tidica. Mostre o ribossomo; rotule seus sítios A, P e
E; mostre sua direção de deslocamento e indique a
posição e a sequência do trlpleto de antic ódon dos
RNAt que atualmente est ão interagindo com os có-
dons do RNAm.
b. Qual é a sequência do tnpleto do anticódon do pró-
ximo RNAt a interagir com o RNAm?
c Quais eventos ocorrem para permitir que o próximo
RNAt interaja com o RNAm?
 Capí tulo 9 Bicdogla molecular da tradução 329

12. O diagrama de um r í bossomo eucariótico exibido a se- d. Em comparação com a estabilidade média do RNAm
guir contém vários erros. na E. coii, o RNAm na célula humana típica é mais ou
menos estável? Por quê?
16. A figura a seguir contém informações suficientes para
preencher cada linha. Use as informações fornecidas para
completar a figura.
DNA
N
Codificadora 5' 7f IA IW TI AI A /f 3’
tt Molde 3'7£ I A l 1
'

J ! //IS’
Códon de RNAm
5 - JZZZI 13'
ao longo do RNAm Antic ódon de RNAt
3'l , til |5'
'
Aminoácido
3 letrasí I Tc^I X X I T ..I
/U

1 letra Gí r" i .i m
a. Examine o diagrama cuidadosamente e identifique
cada erro.
17. A linha a seguir representa um RNAm eucariótico ma-
b. Refaça o diagrama e corrija cada erro usando a sequên-
duro. A lista abaixo da linha contém muitas sequências
cia de RNAm exibida.
ou estruturas que fazem parte do RNAm eucariótico. Al -
guns dos itens na lista, porém, não são encontrados no
13. A oscilação da terceira base permite que alguns RNAt RNAm eucariótico. Com a maior precisão que conseguir,
reconheçam mais de um códon de RNAm. Com base na mostre a localização na linha das sequências ou estrutu-
discussão sobre oscilação neste capítulo, qual é a quan- ras que pertencem ao RNAm eucariótico; depois, sepa-
tidade mínima de moléculas de RNAt necessárias para radamente, apresente os itens que não fazem parte do
reconhecer os seguintes aminoácidos? RNAm eucariótico .
a. Leucina
5' 3'
b. Arginina
a. Códon de parada
c. Isoleucina
b. Cauda poii A -
d. Usina
c. Intron
14. O código genético contém 61 códons para especificar os 20 d. 3' UTR
aminoácidos comuns. Muitos organismos carregam menos e. Promotor
de 61 genes de RNAt diferentes em seus genomas Esses . f. Códon de inicio
genomas tiram proveito dos RNAt isoaceptores e das regras g. AAUAAA
que governam a oscilação da terceira base para codificar h. 5' UTR
.
menos de 61 genes de RNAt Use essas regras para calcular a .
i 5 ‘ cap
quantidade mínima de genes de RNAt necessários para es- J. Sequência de terminação
pecificar todos os 20 aminoácidos comuns . 18. Após concluir o Problema 17, desenhe cuidadosamente
15. As trés formas principais de RNA (RNAm, RNAt e RNAr) In- uma linha abaixo do RNAm para representar seu produto
teragem durante a tradução . polipeptídico em alinhamento preciso com o RNAm. In-
a. Descreva o papel desempenhado por cada forma de dique as extremidades N-terminal e C-terminal do poli-
RNA durante a tradução. peptídeo. Desenhe cuidadosamente duas linhas acima e
b. Qual dos três tipos de RNA você poderia esperar que paralelas ao RNAm e chame-as de "fita codificadora'e'fi-
fosse o menos estável? Por quê? ta -molde". Indique a localização da sequência promotora
c. Qual forma de RNA é a menos estável nos eucariotos ? do DNA. Identifique as localizações do nudeotídeo +1 e
Por quê? de uma sequência de terminação da transcrição.

Aplica ção e integração

.
19 Em um experimento para decifrar o código genético é .
20 Identifique e descreva as etapas que levam à secreção
sintetizado um RNAm poli AC (ACACACAC ). Qual padrão das proteínas pelas células eucariótícas .
de aminoácidos apareceria se essa sequência fosse tradu-
zida por um mecanismo que lê o código genético como
21. A sequência de aminoácidos de parte de um polipeptídeo é

a. Um par sem sobreposições?

b. Um par com sobreposições ?
- - - - -
N~Cy ® Pro Al* M «t - Gly Hi « Lys C.
-
.
c Um tripleto sem sobreposições?
a. Qual é a sequência de RNAm que codifica esse frag -
mento polipeptídico? Use N para representar qualquer
d. Um tripleto com sobreposições?
nudeotideo, Pu para representar uma purina e Py para
e. Um quádruplo sem sobreposições ?
representar uma pirimidina. Indique as extremidades
í Um quadruplo com sobreposições ? 5' e 3' do RNAm.
330 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
b. Forneça as sequências das fitas codificadora e molde
do DNA correspondentes ao RNAm. Use os símbolos N,
Pu e Py como marcadores de posição.
22. Har Gobmd Khorana e seus colegas realizaram muitos
experimentos de tradução de RNAm sintéticos. Em um
deles, uma molécula de RNAm com uma sequência dinu-
cleotídica repetida UG foi montada e traduzida.
a. Escreva a sequência desse RNAm e forneça sua polari-
dade.
b. Qual é a sequência do poJipeptideo resultante?
c Como a composição do polipeptídeo ajuda a confir -
mar a natureza tripla do código genético?
d Se o código genético fosse um par em vez de um tripleto,
qual seria a diferença no resultado desse experimento?
.
e Se o código genético fosse sobreposto em vez de não
sobreposto, em que o resultado desse experimento
seria diferente?
23. Um experimento realizado por Khorana e seus colegas
traduziu um RNAm sintético contendo repetições do tri-
nucleotídeo UUG.
a. Quantos quadros de leitura são possíveis nesse RNAm ?
b. Qual é o resultado obtido a partir de cada quadro de
leitura ?
c Como o resultado desse experimento ajuda a confir-
mar a natureza tripla do código genético?
24. O polipeptídeo da (S -globlna humana contém 146 ami - 3 é indicada por adeninas em itálico
noácidos. Quantos nudeotídeos e RNAm são necessá rios
para codificar esse polipeptídeo?
25. O RNAm maduro transcrito do gene da (J-globina hu-
mana é consideravelmente maior que a sequência neces-
sária para codificar o polipeptídeo de 146 aminoácidos.
Forneça os nomes das três sequências localizadas no
RNAm maduro da (5 globina, porém não traduzidas.
26. A Figura 9.6 contém vários exemplos da sequência de
Shine-Dalgarno. Usando as sete sequências de Shine-
Dalgarno da £.cot í , determine a sequência de consenso
e identifique sua posição relativa ao códon de Início.
27. A Figura 9.20 mostra três etapas pó s- traduçáo necessá-
rias para produzir o hormónio insulina regulador do açú-
car a partir do produto polipeptídico de partida, a pré-
pró insulina.
a. Um cientista pesquisador está interessado em produ
zir insulina humana nas espécies bacterianas da E. coli.
O código genético permitirá a produção de proteínas
humanas a partir de células bacterianas ? Explique.
b. Para a insulina humana, explique por que não é viável
inserir o gene inteiro da insulina humana na £. coli e
antecipar a produção de insulina.
c. A insulina humana recombinante (feita pela inserção
de DNA humano codificador de Insulina na E. coli) é
um dos produtos farmacêuticos recombinantes mais
utilizados no mundo. Quais segmentos do gene da in-
sulina humana sào usados para criar bactérias recom-
binantes que produzem insulina humana?
.
28 Uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de
cinco aminoácidos é fornecida a seguir .
-ACGGCAAGATCCCACCCTAATCAGACCGTACCATTCACCTCCT-
..TGCCGTTCTAGGGTGGCATTAGTCTGGCATGGTAAGTGGAGGA.-
a. Localize a sequência que codifica os cinco aminoáci-
dos do polipeptídeo e identifique as fitas molde e co-
dificadora do DNA.
b. Forneça a sequência e a polaridade do RNAm que co-
difica o polipeptídeo.
c Forneça a sequência do polipeptídeo e identifique as
terminações N e C
d. Supondo que a sequência anteriormente dada é de
um gene bacteriano, identifique a região que codifica
a sequência de Shine -Dalgarno.
e. Qual é a função da sequência de Shine-Oalgamo?
.
29 Uma parte da fita codificadora do DNA para um gene
possui a sequência
5• - -GCACAGAATGAATCT- - 3 '
a. Escreva a sequência da fita molde do DNA e a polari
dade, bem como a sequência e a polaridade do RNAm
desse segmento génico.
b. Supondo que o RNAm esteja no quadro de leitura
correto, escreva a sequência de aminoácidos do poli-
ídeo usando abreviações de três letras e, separa-
pept
damente, a sequência de aminoácidos usando abre -
viações de uma letra,
30. Um RNAm eucariótico tem a sequência mostrada a se -
.
guir A 5' cap é indicada em itálico [ CAP ) e a cauda poll( A)
.
-
5 * CAPCCAAGCGUt/ ACAUGUAUGGAGAGAAUGAAACUG
AGGCUUGCCACGUUUGUUAAGCACCUAUGCUACCGAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAA 3 * -
a. Localize os códons de início e de parada nessa sequência.
b. Determine a sequência de aminoácidos do polipeptí -
doo produzido a partir desse RNAm. Escreva a sequên -
cia usando as abreviações de três letras e uma letra dos
aminoácidos.
.
31 Diagrame um gene eucariótico contendo três éxons e
dois íntrons, o pré RNAm e o transcrito do RNAm maduro
do gene e um polipept ídeo parcial que contenha as se-
guintes sequências e caracteristicas. Alinhe cuidadosa-
mente os ácidos nucleicos e localize cada sequência ou
característica na molécula adequada.
a. Os dinudeotideos AG e GU correspondentes á s jun-
ções fntron-éxon.
b. O nucleotídeo +1 .
.
c A 5' UTR e a 3' UTR .
.
d A sequência do c ódon de início .
.
e Uma sequência do códon de parada.
.
f Uma sequência para os aminoácidos Gly-His- Arg na
extremidade do éxon 1 e uma sequência de códon
para os aminoácidos Leu-Trp-Ala no início do éxon 2.
32. A seguinte tabela contém informações de sequência
de DNA compiladas por Marilyn Kozak (1987). Os dados
consistem na porcentagem de A, C, G e T em cada posi-
ção entre os 12 nudeotídeos que precedem o códon de
início em 699 genes de várias espécies de vertebrados
e o primeiro nucleotídeo após o códon de início. Este
ocupa as posições +1 até - - 3 e o nucleotí deo +4 ocorre
*
imediatamente após o códon de início. Use os dados
para examinar a sequência de consenso de 13 núcleo -
- -
tídeos ( 12 a 1 e +4) em volta do códon de início nos
genes dos vertebrados.
 Capí tulo 9 Bicdogla molecular da tradução 331

Posição -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -3 -2 -1 [Início] +4

%A 23 26 25 23 19 23 17 18 25 61 27 15 [AUGJ 23
%C 35 35 35 26 39 37 19 39 53 2 49 55 [AUG] 16
%G 23 21 22 33 23 20 44 23 15 36 13 21 [AUG] 46
%T 19 18 18 18 19 20 20 20 7 1 11 9 [AUG] 15

33. A tabela a seguir apresenta as sequências genicas da Use os dados nesta tabela para
a-globina e da P-globina para os 12 nudeotídeos que a. Determinar a sequência de consenso dos 16 genes se -
precedem o códon de Início e o primeiro nucleotideo lecionados da a-globina e da p-globina.
após o códon de inicio. Os dados sào de 16 genes globina b. Comparar a sequência de consenso desses genes glo-
.
de vertebrados relatados por Kozak (1987) As sequências bina com a sequénda de consenso derivada do estudo
sáo escritas de -12 a +4, com a sequência do códon de mais amplo com 699 genes de vertebrados no Pro-
inído em letras maiusculas. blema 32.
Sequência génica 34. Os seis nudeotídeos que precedem o códon de inído e o
-12 Inicio +4 primeiro nudeotideo após o códon de inído nos eucario-
tos exibem uma forte prefer ência de sequência conforme
Família da a- globina determinado pelas porcentagens de nudeotídeos nas
Adulta humana agagaacccaccATGg posições -6 a -1 e na posiçáo +4. Use os dados forneci-
Embrionária humana caccctgccgccATGt dos na tabela do Problema 33 para determinar os sete
nudeotídeos que circundam com mais frequência o iní-
Babuino ccagcgcgggcATGg
cio nos vertebrados.
Camundongo adulto caggaagaaaccATGg
Coelho adulto gaaggaaccaccATGg
Cabra embrionária tcagctgccaccATGt
Pato adulto ggagctgcaaccATGg
Galinha embrionária ctctcctgcacaATGg
Família da 0- globina
Fetal humana agtccagacgccATGg
Embrionária humana aggcctggcatcATGg
Coelho adulto aaacagacagaATGg
Coelho embrionário agaccagacatcATGg
Galinha adulta ccaaccgccgccATGg
Galinha embrionária cccgctgccaccATGg
Xenopus adulto tcaactttggccATGg
Xenopus larval tctacagccaccATGg
 Capítulo Integração das abordagens
genéticas: compreendendo a
anemia falciforme
APRESENTAÇÃ O
10.1 Uma variante da hemoglobina herdada
provoca a anemia falciforme
10.2 A variação genética pode ser detectada
examinando o DNA, o RNA e as proteí nas
10.3 A anemia falciforme evoluiu por causa da
seleçã o natural nas populações humanas

Erí tródtos normais mal passam pelos capilares estreitos, mas os er

í tró-
citos falciformes podem bloquear o fluxo sanguíneo nos capilares.

PONTOS ESSENCIAIS
I O progresso na compreensão da anemia
hereditária humana, chamada anemia fal-
ciforme, mostra o poder de combinar as
abordagens analógicas da genética de
transmissão, genética molecular e genética
evolutiva.
I Um alelo mutado de um dos dois genes que
formam a proteína hemoglobina do erltró-
cito provoca anomalias que levam à anemia
falciforme.
I A transmissão da anemia faldforme nas fa-
mílias pode ser observada pela análise ge-
nética molecular do gene globina e a varia-
ção das proteínas.
I A distribuição geográfica da mutação que
produz a anemia falciforme é atribuível à
pressão seletiva natural nos ambientes com
alta incidência de malária.
E m capítulos anteriores, descrevemos e analisamos a transmis-
são e a função dos genes, a estrutura e a função do DNA, os
processos de expressão génica e o papel da evolução na genética.
Cada um desses aspectos da genética moderna contribui para o
amplo poder explanatório da ciência, um poder alcançado espe-
cificamente pela integração desses princípios e abordagens Este .
capítulo é concebido para colocar cm foco a integração dessas
abordagens da análise genética usando o transtorno humano he-
reditário da anemia falciforme como exemplo.
O capítulo também tem uma segunda finalidade. Durante
a exemplificação de como as análises de transmissão heredi-
tária, variaçã o genética molecular e evolução contribuem para
uma compreensão mals ampla da anemia falciforme, também
descrevemos a eletroforese em gel e os métodos experimentais
relacionados frequentemente aplicados à análise de DNA, RNA
e variação proteica. Esses métodos fazem parte do •'conjunto de
ferramentas" bá sico de análise genética e podem ser utilizados
 Cap ítulo 10 Integra ção das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 333

para obter informações substanciais sobre o ácido nu- bom ponto para começar nossa discussão é com um
—
cleico e a variação proteica .

10.1 Uma variante da hemoglobina

—
evento que ocorreu mais de um século atrás
zembro de 1904, para ser exato quando Walter Noel,
em de -

um homem de 20 anos e origem africana , foi internado

no Hospital Presbiteriano de Nova York, sofrendo de
herdada provoca a anemia anemia grave e dor muscular debilitante. Noel havia
falciforme chegado à cidade de Nova York aproximadamente um
ano antes, proveniente da ilha de Granada , nas Antilhas,
A anemia falciforme (SCD, do inglês sickle cell e tinha acabado de começar o primeiro ano do curso de
disease ) tem sido intensamente investigada há mais de odontologia quando foi internado no hospital.
um século e seu estudo gerou uma revolução na gené- O médico encarregado do caso de Noel era um re-
tica. A SCD foi um dos primeiros transtornos genéticos sidente chamado Emest Irons, supervisionado por um
comprovados como uma consequência de um defeito médico mais experiente chamado James Herrick. Irons
herdado em uma molécula de proteína, mas também a
—
descoberta de sua causa vários anos antes da identi
fica ção do DNA como molécula heredit ária
— ajudou
a pavimentar o caminho para a era molecular na gené
-
-
tirou sangue de Noel , examinou -o em um microscópio
e ficou chocado ao constatar que muitos eritrócitos de
Noel tinham um formato alongado e faldforme peculiar
que contrastava absurdamente com o formato drcular e
tica. A identificação da anemia falciforme como uma bicôncavo dos eritrócitos normais ( Figura 10.1 ).
“ doença molecular" promoveu a ideia de que as doen ças Noel se recuperou desse episódio inicial da doença.
herdadas tê m uma base molecular e desempenhou um Durante os dois anos e meio seguintes, ele teve de ser
papel fundamental no estabelecimento da natureza mo- internado várias vezes e tratado para os mesmos sinto-
lecular das mutações. As investigações da SCD levaram
à descriçã o da base molecular da doen ça e, por fim, a
mas. Após completar seu curso de odontologia , ele vol -
tou a Granada , onde exerceu a odontologia até morrer
uma explicação do papel que a seleção natural desem
penha na evolução e na manutenção do alelo causador
- nove anos mais tarde, aos 32. Em 1910, Herrick publi
cou um artigo descrevendo o caso de Walter Noel. O
-
da doença nas populações. artigo foi a primeira descrição clí nica da SCD, embora o
A SCD é um transtorno autossòmico recessivo
potencialmente fatal, provocado por uma anomalia na
transtorno não tivesse nome no momento em que Her
.
rick o descreveu Seu nome original, “anemia da célula
-
estrutura e na função da hemoglobina ( Hb), a princi
pal proteí na transportadora de oxigénio nos eritrócitos.
- falciforme", foi criado vá rios anos mais tarde pela com
binação de faldforme, para a deformidade característica
-
O defeito na hemoglobina que produz a SCD reduz o
tempo de vida dos eritrócitos, produzindo anemia grave
dos eritrócitos, e anemia , para a escassez cró nica de eri
trócitos na maioria dos pacientes.
-
( um n ú mero anormalmcntc baixo de eritrócitos), que
reduz a capacidade do sangue para levar oxigénio aos
tecidos. A privação de oxigé nio provoca danos e morte
teciduais no corpo inteiro, acompanhados por uma dor
muscular importante e danos acumulados nos ó rgãos.
A variante da hemoglobina que causa a SCD é uma
das centenas de diferentes variantes dos alelos da he -
moglobina que ocorrem nas pessoas no mundo todo, e
as variações da hemoglobina herdadas são o tipo mais
comum de anomalia hereditá ria encontrada nos seres
humanos. Centenas de milhões de pessoas carregam
alelos mutados que alteram a estrutura ou a função das
moléculas de hemoglobina . A maioria desses alelos é
rara. Mas alguns deles, como o alelo mutado que causa
a SCD, são comuns em muitas populações em torno da
regiã o mediterrâ nea, no Oriente Médio e na África, e o
alelo mutado se formou e evoluiu independentemente
em cada uma dessas regiões.

O primeiro paciente com anemia falciforme

Vários princí pios da genética molecular têm sua
origem no estudo da hemoglobina e dos genes que a
produzem , incluindo o conceito de uma doen ça mo -
lecular
— uma designação conferida à SCD por Linus
.
Pauling em 1954 (e explicada a seguir ) No entanto, um
Figura 10.1 Formato do ritrócíto. Os eritrócitos
•
normais têm um formato bicôncavo, enquanto os eritr ócitos
falciformes sáo alongados.
334 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Os pacientes com anemia falciforme sofrem dor
muscular grave quando o n úmero de eritrócitos falci
formes em sua circulação é suficientemente grande
para impedir o fluxo nos pequenos vasos sanguí neos e
capilares. Esses vasos sanguíneos e capilares têm largura
suficiente apenas para a passagem em fila única dos eri
trócitos bicóncavos normais (ver a foto de abertura do
capítulo). O fluxo sanguíneo reduzido priva de oxigé
nio os tecidos circundantes, provocando dor imediata e
possíveis danos em longo prazo nos ó rgãos e tecidos em
decorrê ncia da privação de oxigé nio.
Os eritrócitos são especialistas no transporte de
oxigénio que são bombeados para os pulm ões, onde
captam oxigénio, e depois através do sistema circulató
rio, para levar o oxigé nio e outras moléculas por todo o
corpo. Os eritrócitos não contém n úcleos e não conse
—
guem se dividir. Eles circulam até serem danificados e
removidos da circulação em cerca de 100 a 120 dias,
em média. Os eritrócitos falciformes são danificados
mais rapidamente do que o normal e tém uma vida ú til
menor. Infelizmente, a capacidade do corpo para pro
duzir eritrócitos é limitada. A taxa de perda acelerada
dos eritrócitos na SCD resulta em anemia cró nica como
um dos sintomas do transtorno.
Estrutura da hemoglobina
As moléculas de hemoglobina sào tetrâ meros, es-
truturas de proteína que consistem em quatro proteí
.
nas reunidas ( Figura 10.2 ) O tetrà mero da hemoglobina
contém duas cadeias proteicas de cada um dos dois
diferentes genes das globinas que sào codificados em
cromossomos separados no genoma humano. Cada
molécula da forma mais comum de hemoglobina con
siste em duas proteí nas a - globina produzidas pelo gene
a- globina e duas proteínas p- globina produzidas pelo
gene P- globina. Essa composição em particular, indi
Proteí na Proteí na
B globina globina
r Grupo heme
Y ( nenhum 02 ligado)
j Figura 10.2 Estrutura da hemoglobina
Prote ína
Prote í na
a-globina P globina
cada como é identificada como hemoglobina A,
- ou HbA, em que Hb é uma abreviação para hemoglo-
bina e A designa a forma mais comum. Cada uma das
quatro proteínas na hemoglobina carrega uma molécula
de heme contendo ferro, um composto que sofre liga -
- ção reversível com uma molécula de oxigénio. Desse
modo, cada molécula de hemoglobina consegue se ligar
- e transportar quatro moléculas de oxigénio.
- -
Os genes da a globina e da p globina são mem
bros de um grupo de genes que compartilham fortes
-
semelhan ças estruturais e funcionais, além de pro-
duzirem proteínas globina similares. A organização
dos dois genes também é muito similar ( Figura 10.3) .
Ambos os genes contê m três éxons e dois í ntrons. O
gene a - globina codifica um polipeptídeo contendo
- 141 aminoácidos e o polipept ídeo codificado pelo gene
p-globina contém 146 aminoácidos.
Observa çã o gen é tica A hemoglobina consiste em
quatro polipept ídeos, dois do gene a globina e dois do gene
- P-globina. Esses genes sáo
-
membros de agrupamentos ge-
néticos que compartilham fortes semelhanças de sequência ,
estrutura e função.
Muta çõ es dos genes das globinas
- Os genes das globinas podem ser os mais estudados
no genoma humano, e a existência e distribuição das
variantes dos genes a - globina e P- globina são bem do-
cumentadas na maioria das populações humanas. Atual-
mente, sà o conhecidas quase 500 variantes alélicas dife-
- rentes dos genes a-globina e P-globina. Algumas sào tão
raras que existem apenas em uma única família. Existem
algumas exceções dignas de nota e essas variantes mais
- comuns fornecem exemplos bem pesquisados de alguns
Grupo heme (02 ligado )
- Ferro
.
A hemoglobina é uma proteína tetramé rica
composta de duas cadeias polipeptidicas de
-
a globina e duas cadeias polipeptidicas de
p-gk> bina. Uma molécula de hemo (ou heme)
ligada a cada cadeia facilita a ligação e o
transporte do oxigénio.
 Cap ítulo 10 Integra ção das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme
Éxon 1 Éxon 2
Promotor
Gene u - globí na 5' ~ [~1
J =?
Polipeptideo da «-globina
'
[
, Intron
T T T
, *
Intron
Aminoácidos 1-31 32-99 100-141
Éxon 1 Éxon 2
Promotor
Gene p-gk>b4 na 5' ~jf T
~
' ( ntron
Polipeptideo da fi-globina l i
I
T
I
Aminoá cidos 1-30 31 -104 105-146
processos hereditários que você provavelmente Já estu
dou em cursos de biologia anteriores. Elas també m nos
dã o a chance de explorar como as variantes do gene da
globina afetam a estrutura e a função da hemoglobina.
Em um século de pesquisa desde a descrição da SCD
de Walter Noel feita por Herrick, médicos e biólogos ex-
ploraram totalmente a hereditariedade, a base molecular
e a evoluçào do transtorno. Hoje, os biólogos sabem que
a SCD è uma anemia hereditária comum provocada por
uma ú nica substituição de par de base na sequência do
gene |3-globina. O alelo mutado, designado (3S, produz
-
uma prote í na (3 globina que contém uma diferença re
lativa a apenas um aminoáctdo em relação ao alelo (JA
normal. Indiv íduos com SCD carregam dois alelo* ps
e não possuem o alelo (3A. Eles têm o gen ótipo J3A (3S e
produzem apenas cadeias de (3-globina mutado. Quando
duas proteínas (3 globina mutados se unem a duas pro
teí nas a- globina normais, as moléculas de hemoglobina
formadas são anormais. A perda de função normal da
hemoglobina nos homozigotos para o alelo mutado re-
sulta na herança da SCD como condição autossómica
recessiva. (Ver Estudo de Caso no final do Capitulo 3.)
A hemoglobina contida nos eritrócitos de pessoas
com SCD é menos está vel que a hemoglobina do tipo
selvagem ( normal ) quando a concentra ção de oxigénio
é baixa . Essa instabilidade pode fazer que a hemoglo -
bina entre em colapso, transformando se em moléculas
lineares parecidas com cristais nos níveis de oxigénio
baixos. Em razão dessa alta concentração nos eritróci-
tos, o colapso da hemoglobina em estruturas lineares
deforma os eritrócitos, conferindo-lhes o formato falci
forme observado pela primeira vez por Ernest Irons.
Indivíduos heterozigotos portadores de SCD tém
o genótipo (V4 (J*. Todos os seus tetrâmeros de hemoglo-
bina contém duas proteínas a -globina normais, mas al-
guns contém duas proteínas (3a, outros, duas proteínas (3A
e outros contém um de cada tipo de proteína (3 globina.
Consequentemente, uma pequena porcentagem dos eri-
trócitos de indivíduos heterozigotos pode adquirir uma
forma falciforme quando o nível de oxigénio for baixo,
como acontece quando os eritrócitos estão voltando para
o coração. Essa condição diminui a expectativa de vida
335
Éxon 3 Figura 10.3 Proteínas globina e seus
! genes. Os genes da a-globina e da
Kr
í
>
t
(i-globina contêm, cada um, três éxons e
dois íntroos. Os aminoácidos codificados
por cada éxon são indicados pelos
n ú meros que descrevem suas posições
na cadeia polipeptfdica final.
Éxon 3
U*
Intron
- média dos eritrócitos nos heterozigotos; mas, como afeta
apenas uma pequena porcentagem dos eritrócitos, ela
não causa a anemia constatada nos portadores de SCD.
Os portadores heterozigotos às vezes são identificados
como portadores de "traço falciforme" e, embora os sin-
tomas geralmente sejam brandos, podem ocorrer compli-
cações graves em circunstâncias em que a disponibilidade
de oxigénio é reduzida ou a necessidade de oxigénio é alta.
Preocupações quanto a possíveis consequências para a
sa ú de de atletas portadores heterozigotos do traço fald
forme tém sido expressas de várias maneiras. Por exemplo,
-
- em 2010, após a morte de 10 alunos atletas com traço fal -
ciforme ao longo da década anterior, a National Collegiate
Athletic Association ( NCAA) implementou uma política
exigindo que os alunos atletas sejam testados quanto ao
traço falciforme ou assinem uma dispensa do teste.
-
10.2 A variação genética pode ser
detectada examinando o DNA,
o RNA e as proteínas
Tendo examinado a fisiologia e os padrões de he-
ran ça da SCD, agora podemos explorar algumas téc
nicas de gen é tica molecular para analisarmos os alelos
-
(3A e (3a, assim como o RNAm e as proteí nas produzidas
pelos alelos. Também consideramos a an á lise de tipos
específicos de variação na sequência de DNA. Os méto-
dos moleculares discutidos neste capítulo são ú teis em
uma ampla gama de análises gen éticas.
- Eletroforese em gel
Em 1949, James Neel usou a an á lise da transmissã o
genética para demonstrar que a SCD é um transtorno
recessivo. Nesse mesmo ano, Linus Pauling e seus co-
legas publicaram a primeira descrição da base molecu
lar da SCD e cunharam o termo doença molecular para
-
descrevé- la. Eles usaram o termo para indicar uma do-
ença provocada por uma variação na estrutura molecu -
lar de uma prote í na.
Pauling isolou a hemoglobina dos portadores de
vários genótipos e usou a técnica analítica da eletro-
336 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
forese em gel para separar as moléculas de hemoglo
bina de cada tipo. A eletroforese em gel é uma técnica
para separar moléculas de prote í nas e ácidos nucleicos
diferentes uns das outros em um campo elétrico, com
base em sua carga, tamanho e formato (Figura 10.4 )
Uma matriz de suporte em gel é criada moldando um l í
quido dentro de uma forma , normalmente uma bandeja
de moldagem de plástico. Um “ pente" é colocado no lí
quido enquanto este é derramado na forma para produ
zir "poços**, ou depressões, no gel. Na forma , o l íquido
solidifica em um semissólido flexível.
Os poços de amostra sào pequenos reservatórios
nos quais as amostras biológicas, como as proteínas ou o
ácido nucleico ( DNA ou RNA ), sfto derramadas. Normal -
mente são empregados vários poços, cada um marcando
a origem de migração de uma das amostras e, assim,
servindo como ponto de partida para uma das "pistas“ do
gel. Após as amostras biológicas serem derramadas nos
poços, aplica -se uma corrente elétrica no gel conectando
um eletrodo positivo a uma extremidade e um eletrodo
negativo à outra. As amostras migram através da matriz
de poros min ú sculos e a solidificação do gel cria passa -
gens. As moléculas seguem seu caminho da origem de
migração perto da extremidade negativamente carregada
para a carga positiva na extremidade oposta .
Os materiais mais utilizados para formar a eletro-
forese em gel são a agarose, uma forma de celulose, e a
poliacrilamida , um material sintético feito pela reaçã o
O Derrame agarose em uma O Deixe o gel solidificar.
bandeja plástica de moldagem.
Bandeja plástica
de moldagem
O Remova o gel da
bande>a de moldagem
e coloque em soluçáo
tamponada com
detrodos.
Figura 10.4 Material e procedimento para a eletroforese em gel
- de polimerizaçào entre compostos quí micos. Nenhuma
dessas substâ ncias interage com as proteínas ou os áci-
dos nucleicos enquanto se deslocam pelo gel, entã o as
taxas de migração são inteiramente determinadas pelas
. caracter ísticas das moléculas em cada amostra.
- Na eletroforese em gel, as moléculas biológicas que
possuem carga elétrica migram para a extremidade
- que possu í carga oposta. A maioria das moléculas bioló-
- gicas, incluindo o DNA, o RNA e a maior parte das pro-
teínas, possui carga negativa e migra para a extremidade
positiva. Portanto, a origem de migração normalmente é
posicionada perto da extremidade negativa. As proteínas
com carga positiva migram para a extremidade negativa,
entã o, quando estiverem sendo estudadas, a origem de
migração será colocada perto da extremidade positiva .
O movimento molecular através da eletroforese em
gel é impulsionado pelo fluxo de eletricidade. As mo-
léculas param de se mexer quando o fluxo de corrente
é desativado. Nos géis eletroforéticos, o movimento
molecular ocorre a uma taxa que depende de três pa -
râ metros de estrutura molecular. Cada um desses parâ
metros individualmente é importante para determinar
-
como uma molécula específica migra, mas eles também
podem interagir uns com os outros para produzir uma
taxa de migração caracter ística para cada molécula. Os
parâmetros são:
Peso molecular
—As moléculas menores (isto é,
prote ínas com menos aminoácidos ou ácidos nuclei -
) Remova o pente;
restam poços no gel.
As amostras migram
através do gel para a
carga positiva.
O Acrescente
amostras biológicas
aos poços e aplique
corrente.
.
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme
cos com menos nucleotideos) migram com mais ra
pidez que as moléculas maiores. Essa caracter ística é
um determinante importante da migração eletrofo -
rética de todas as moléculas biológicas e é o parâ me -
tro principal na migração do DNA e do RNA.
1 Carga molecular
—
As moléculas com carga nega
tiva maior migram para o polo positivo com mais ra
pidez que as moléculas com menos carga negativa.
A variação na carga molecular das proteínas é trans -
mitida pela composição de aminoácidos e é uma
caracter ística importante que influencia a migração
proteica. Por outro lado, os ácidos nucleicos têm
carga negativa derivada da espinha dorsal de açú car-
-fosfato. Essa carga negativa é proporcional à massa
e, assim , nâo contribui para as diferenças na taxa de
migração entre as moléculas de ácido nucleico de di
ferentes tamanhos.
Formato molecular (conforma ção molecular )
Moléculas globulares altamente condensadas mi-
gram com mais rapidez que moléculas lineares. A
migra ção proteica pode ser fortemente influenciada
pela conforma ção; no entanto, quando os á cidos nu
clcicos sã o comparados , apenas as diferenças de mi
gração causadas pela forma molecular ocorrem nas
comparações de DNA linear e circular.
A análise eletroforética das proteínas hemoglobina
purificadas a partir de eritrócitos, realizada por Pauling,
mostrou que as proteínas produzidas pelos indivíduos
com diferentes genótipos de P-globina possuem mobili -
dade eletroforética diferente, um termo que descreve a
taxa de migraçã o eletroforética de uma molécula ou a po-
sição final da proteína no gel. Vimos antcriormentc que o
tamanho da molécula de uma proteína ( peso molecular ),
a carga e o formato (conformação) determinam sua mobi-
lidade eletroforética. Na análise da proteína hemoglobina
realizada por Pauling, constatou - se que cada alelo produz
uma proteína diferente com uma mobilidade eletroforé
tica característica; em outras palavras, à medida que cada
-
tipo de prote í na migrou pelo gel, formou se uma faixa
diferente, uma aglutinação de proteínas com uma única
mobilidade eletroforética, que podia ser visualizada co-
rando o gel com corante de proteí nas (Figura 10.5a )
(a)
Eletroforese em gel de proteína
w w
P»
Origem
de migração Migração
© ©
Menor
mobilidade mobilidade
eletroforética eletroforética
337
- A faixa de proteí na observada na pista psp ç tinha
menos mobilidade eletroforética ( menor distância mi-
grada em relação à origem ) que a faixa de proteína de-
tectada na pista Apenas uma ú nica faixa é detec
tada em cada uma dessas pistas, sugerindo que todas as
-
-
-
proteí nas na faixa são id ênticas. Por outro lado, quando
uma pista de eletroforese contém proteína de um indi-
víduo heterozigoto ( P P*), a proteína nessa pista se di -
^
vide em duas bandas, cada uma correspondendo à mo-
bilidade eletroforética da faixa de proteína em uma das
pistas contendo proteína de um homozigoto.
Depois, Pauling usou uma técnica chamada densito-
metria para mostrar que um único tipo de prote ína p- glo -
bina está presente nas pistas que contém proteína de um
indivíduo homozigoto e que dois tipos de proteí na estão
- presentes nas pistas contendo proteína extraída de he-
terozigotos (Figura 10. Sb ). A densitometria quantifica a
— proteína presente em uma pista de gel medindo a quanti-
dade de luz que é impedida de passar pelo gel na presença
de uma faixa de proteína. A comparação das posições das
bandas de proteína e dos picos de densitometria em cada
- pista homozigota e a detecção de duas bandas e dois picos
- nessas posições na pista heterozigota confirmam que os
indivíduos homozigotos produzem uma ú nica forma de
proteína P-globina que pode ser diferente, dependendo
do genótipo homozigoto, e que os heterozigotos produ -
zem proteínas de ambos os tipos em concentração apro -
ximadamente igual.
A importância do trabalho de Pauling é dupla. Pri -
meiro, ele introduziu métodos de laboratório para a
detecção de formas distintas da proteína globina; e, se-
gundo, ele demonstrou que a variaçã o da hemoglobina
explica a herança da SCD como uma doença molecular.
O estudo de Pauling foi o primeiro a mostrar que os pa
drões de herança de transtornos nas genealogias se com
--
param com a transmissão da variação molecular. Seu
- trabalho também ilustra que, entre portadores heterozi -
gotos, a evid ência molecular muitas vezes apoia a expres-
são de ambos os alelos, mesmo se a morfologia anormal
característica de um transtorno estiver presente apenas
nos indivíduos homozigotos para um alelo recessivo. Em
. suma, Pauling foi o primeiro a chamar a atenção para
(b) Figura 10.5 Eletroforese em gel
Varredura por densitometria das proteínas hemoglobina .
(a ) São analisados indivíduos com
^ .
os três genótipos ( (P,P*PS e p*P*
As bandas simples nas pistas
e P4p* indicam que cada indivíduo
PP homozigoto produz um único
tfcpo de proteína. A detecção de
duas bandas de proteína na pista
PP
P^P5 indica que os dois alelos são
expressos nos heterozigotos.
0 © (b) Cada genótipo produz um padrão
único de mobilidade eletroforética
Maior
da proteína, que também é refletido
pelos resultados da densitometria.
338 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
um princí pio fundamental da genética: a variação mor
fológica hereditá ria tem uma base molecular.
Observa çã o gen ética A eletroforese em gel separa as
moléculas biológicas (ácidos nudcicos e prote ínas ) usando
um campo elétrico. Na eletroforese de proteí na, a mobilidade
eletroforética é função do tamanho, carga e formato de cada
molécula de proteí na.
Análise da impressão digital de peptídeos
da hemoglobina
Em 1957, Vernon Ingram publicou uma descrição
da base molecular da SCD baseada na aná lise da prote-
ína hemoglobina. Naquela época, a noção de que a SCD
é uma doença molecular provocada por uma alteração
herdada da estrutura da hemoglobina já estava bem es
tabelecida. O que Ingram tinha a intenção de esclare
cer era a diferença molecular na hemoglobina que pro
vocava a diferença em seu comportamento. Na é poca,
-
considerava se que a hemoglobina era composta de
dois "segmentos moleculares" idênticos, cada um con-
tendo quase 300 aminoácidos. Hoje sabemos que cada
"segmento molecular* possui duas partes
— uma cadeia
a-globina, com 141 aminoácidos, e uma cadeia p-glo-
bina, com 146 aminoácidos. Também sabemos que a
molécula de hemoglobina completa é um tetràmero
composto de duas cadeias polipept ídicas de u globina -
e duas cadeias polipeptídicas de (5- globina.
Ingram examinou a variação estrutural da hemo
globina com uma abordagem em duas etapas, cliamada
an álise da impressã o digital peptídica. Para preparar
a proteína hemoglobina para a an álise, primeiro ela é
decomposta em muitos fragmentos por um tratamento
químico. Os fragmentos proteicos são sujeitos à eletro-
forese para separar os fragmentos em uma direção, ou
dimensão, em um gel. Em seguida, os fragmentos de
hemoglobina são separados em uma segunda dimensão,
perpendicular à primeira, por meio de cromatografia ,
que usa um solvente para carregar os fragmentos com
composições de aminoácidos diferentes para posições
finais diferentes. No final dessas duas separações, as lo-
calizações das "manchas" de proteína servem como um
tipo de “ impressão digital" dela.
Quando Ingram comparou as manchas de impres
são digital de diferentes amostras de hemoglobina, ele
descobriu que apenas um único fragmento peptidico
da hemoglobina de pessoas com SCD (genótipo psprs)
era diferente na hemoglobina das pessoas homozigotas
para o alelo do tipo selvagem ( gen ó tipo (V^ fV4 ). A an á lise
posterior mostrou que a diferen ça cra uma mudança
em um ú nico aminoácido residual: nos portadores de
SCD, o aminoácido valina (Vai ) substitui o ácido glutã -
mico (Glu ) na posição 6 de aminoácido dentre os 146 na
-
cadeia da prote í na p globina. Como confirmação dessa
conclusão, Ingram descobriu que as impressões digitais
- da hemoglobina nos portadores heterozigotos da SCD
(genótipo tinham manchas correspondentes à
parte da hemoglobina do tipo selvagem contendo ácido
^
glutá mico (o produto do alelo [ ) e à parte contendo
valina da hemoglobina mutado ( produto do alelo [P). A
Aná lise Genética 10.1 vai orientá - lo na identificação do
genótipo pela eletroforese em gel das proteínas.
Observa çã o gen é tica 0 defeito eritrootá rlo responsá
vel pela anemia faldforme resulta da substituição de um ú nico
aminoácido na proteí na (J-globina. Essa mutação altera a mo-
-
bilidade eletroforética e é detect á vel pela aná lise eletroforé
tica e pela an á lise da impressão digital pept ídka.
Identificação de variação na sequência
do DNA
-
- Com a identificação da estrutura da proteína he-
- moglobina e das sequê ncias de aminoácidos das cadeias
de a-globina e (5 globina , os cientistas estavam prontos
para combinar a aná lise da variação da hemoglobina
com a análise das sequências de DNA e RNAm para ex-
plicar como a variação do ácido nucleico produz a SCD.
Entretanto, antes de podermos examinar essa pesquisa,
é necessário fazer alguma descriçã o adicional dos áci -
dos nucleicos e da análise eletroforética das proteínas.
Esta subseção e a próxima apresentam algumas infor -
mações básicas sobre a identificaçã o da variabilidade
da sequência de DNA usando enzimas de digestão do
- DNA e eletroforese em gel. Essas técnicas são ferramen -
tas com muitas aplicações na análise do DNA. Após a
discussão, voltamos para a aná lise da SCD.
As sequê ncias de DNA sã o cadeias lineares de nu -
cleotídeos adenina ( A), guanina ( G ), citosina (C) e ti -
mina (T). Os cientistas comparam as sequê ncias de dife-
rentes organismos alinhando- as lado a lado e anotando
n ú mero, localização e tipo das diferenças nas sequê ncias
de nucleotídeos. A análise genó mica determinou que o
tipo mais comum de diferença na sequência de DNA
entre os organismos da mesma espécie consiste em di-
ferenças de nucleotídeos individuais, chamadas poli
morfismo de nudeot ídeo ú nico (SNP). Os SNPs são
-
prevalentes nos genomas de todos os organismos. O ge-
noma humano, por exemplo, contém milhões de SNPs
- espalhados entre aproximadamente 3 bilhões de pares
de bases ( pb ) que constituem nosso genoma. Por sua
prevalência, os SNPs se tornaram uma categoria impor
tante de marcador genético (os marcadores gen éticos
-
são ferramentas importantes no mapeamento genético,
descrito no Capítulo 5). Os SNPs geralmente ocorrem
em regiões não codificantcs dos genomas e não tê m
efeito detectável no fenótipo. No entanto, às vezes os
SNPs ocorrem em regiões codificantes dos genes, onde
a variação pode afetar o fenótipo.
Independentemente de a variação da sequência em
um lócus de SNP afetar ou não unia característica fenotí -
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 339

AN Á LISE GENÉTICA
Os indivíduos homozigotos para o alelo p4 da hemoglobina recebem Desconhecido
.
o genótipo AA Os portadores de SCD são homozigotos para o aJelo AA SS CC 1 2 SC
mutado p\ sendo identificados como SS. Um indivíduo designado AS é ©
.
p*Ps Uma segunda mutação do gene da P-gk>bina, designada Pc, tem
uma substituição de par de bases de DNA que leva á substituição de
um único amínoácido na cadeia polipeptídica da p-globina Indivíduos .
.
PCPC são chamados CC As sequências de DNA pce P4 diferem quanto a
um único par de bases e os polipoptídeos diferem quanto a um único
amínoácido, assim como os polipeptídeos pse P4 diferem quanto a um
único amínoácido. ©
O diagrama à direita Ilustra a mobilidade eletroforétlca da proteína he-
.
moglobina dos indivíduos com os genótipos AA, SS e CC O diagrama também ilustra as bandas
de dois indivíduos com genótipos desconhecidos e tem espaço para preencher as bandas para o
genótipo SC .
a. Interprete o padrão de bandas da proteína hemoglobina para Desconhecido 1 e Desconhecido 2
e Identifique o genótipo de cada pessoa.
b. Desenhe a faixa da proteína hemoglobina prevista para um indivíduo SC .
Estrat égias de solu ção Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por 1. Este problema diz respeito à interpretação da migração da proteína hemoglo
este problema e explique a natureza .
bina na eletroforese em gel O problema exige a identificação dos genótipos
da resposta solicitada. com base na migração da faixa de proteína.Também exige a previsão do padrão
de bandas para um determinado genótipo .
2. Identifique as informações criticas .
2 O problema fornece exemplos de migração da proteína hemoglobina para trés ge-
fornecidas no problema. nótipos que são a base para determinar os genótipos de amostras desconhecidas.

Deduzir
.
3 Identifique os possí veis genótipos .
3 Para um gene com trés alelos, très dos genótipos possí veis são homozigotos
que envolvem os alelos A S e C . tAA, SS e CQ e trés são heterozigotos (A5, AC e SC) .
.
4 Determine os padrões de faixa da .
4 Os genótipos homozigo- AA SS CC AC AS SC
proteína hemoglobina associados a tos produzem uma faixa 0
cada genótipo. de proteína e os hetero -
zigotos produzem duas
bandas de proteína Os .
genótipos heterozigotos
vão exibir duas bandas
Dica: Faça a correspondên- de proteína em um gel
cia entre as baortes nas pistas
Desconhecidas com os aíeos eletroforético:
correspondentes dos ger ótt-
Soludonar Resposta a
— -
posidentrKados,

s. Identifique os genótipos que produ .

- 5 Desconhecido 1 tem uma banda de proteína compatível com a mobilidade ele-
zem os padrões de banda da proteí - troforética de P4 e uma segunda faixa de proteína compatível com pr. Desco-
na hemoglobina para as amostras .
nhecido 1 é AC Desconhecido 2 tem bandas de proteína compatíveis com p4 e
Desconhecido 1 e Desconhecido 2. .
P5 Desconhecido 2 é AS .
Resposta b
6. Desenhe o padrão de bandas para .
6 O padrão de bandas de proteína previsto para SC terá duas bandas, uma para p5
um Indivíduo com genótipo SC. e outra para Pc .
fDica: faça a correspondência das bandas dos
aiei os identificados para prever o padráo de oarv
das de um nevo genótipa

Para praticar mais, ver Problemas 4, 5 e 31 .

340 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
pica, a sequência alélica é transmitida de uma geração para
a outra. A Figura 10.6 mostra duas sequências de DNA re-
presentando dois alelos SNP idênticos, exceto quanto aos
pares de bases realçados na figura. Um par de bases A T se
situa no aielo Sf e um par G - C especifica o aldo ST Cada
organismo em uma população pode ser homozigoto (S/SJ
ou SjSJ ou heterozigoto (SjSJ para esses alelos SNP. O
padrão de transmissão hereditária dos alelos SNP segue o
mesmo padrão dos alelos dos genes expressos, com cada
pai contribuindo com um alelo para a prole.
O sequenciamento completo e a inspeçã o de um
genoma em busca da varia ção do SNP sã o realizados
pelo sequenciamento do genoma (Cap í tulo 18). No en
tanto, para certas análises gené ticas envolvendo SNPs,
n ã o é necessá rio examinar as sequê ncias gen ômicas
completas. Para essas análises, a variação do SNP pode
ser detectada usando uma classe especial de enzimas
digestoras de DNA que agem apenas em sequê ncias de
DNA específicas. Conhecidas como endonudeases de
restrição —
ou , mais frequentemente, como enzimas
dc restrição
—essas enzimas agem como tesouras
moleculares precisas. Primeiro, as enzimas reconhe
cem uma sequência nucleot ídica de DNA precisa, com
alguns pares de bases, chamada sequência de res -
<») ~
7 / C C T A G COT T C G A C~jT
Alelo S,
1/ SGATCGilAAGCTG ? /~
7
AletoS, -Ij C restrição EcoRI de dupla fita é
GGATCGftAAGCTG7/~
( b) Genótipo: Sequência:
7/ CCTA 6 CnTTC 6 AF7 r
J i
Indiv íduo 1 5,5,
c 7 / C C T A G C H T T C G A C /T~
"
' 7 / 6 G A T C G l A A 6 C f 7/
^
"
Í
I I C C T A G C f l T T C G A C7 r.
Indiv íduo 2 5,5,
' ~jl S G A T C G n Á A G C T 6 7
ç 7/ C C T A G C f r T T C 6 A C7 jr
' ~7 / G G A T C G R A A G C T G J f
ç 7 / C C T A G C n H T C G A C7
"
* 7/ G G A T C G B A A G C f G7
Indiv íduo 3 5,5,
c ILí LlbSiilãU í bÀ LjC
** 7/ 6 & À f C á(ãAA 6 Ctg7f
F í g ura 10.6 Polimorfismo de nudeotkleo ú nico
.
( SNP) ( a ) Em um iócus SNP, dois alelos diferem quanto a um
par de bases. O alelo 5, conté m um par de bases A - T (verde)
e o alelo S 2 cont ém um par de bases G C ( roxo), ( b) Três
genótipos são poss íveis a partir desses dois alelos.
trição da enzima , e depois cortam cada fita do DNA
na sequê ncia de restrição de uma maneira específica.
Quando moléculas de DNA longas contendo vá rias se -
- quê ncias de restri ção sã o tratadas com uma enzima de
restrição, muitos fragmentos de DNA são produzidos.
O n ú mero de fragmentos de restriçã o produzidos por
uma determinada enzima de restrição é caracter ístico
de uma determinada sequê ncia de DNA. A variabili
dade herdada no n ú mero ou no comprimento (em
-
pares de bases ) dos fragmentos de restrição se chama
polimorfismo do comprimento dos fragmentos de
restri ção ( RFLP ).
- Centenas de diferentes enzimas de restrição foram
identificadas desde sua descoberta, nos anos 1960, e cada
enzima de restrição compartilha três propriedades gerais:
1. Cada enzima reconhece exclusivamente sua própria
sequ ência dc restrição, consistindo cm uma ordem
precisa dos nucleot ídeos na direção 5' para 3’ em
cada fita do DNA. Por exemplo, a enzima de res-
trição £coRl reconhece exclusivamente a sequê ncia
-
- -
de restrição 5' GAATTC 3'. Como a sequência de
restrição de cada endonuclease de restrição é pre -
cisa , qualquer variação bloqueia a capacidade da en -
zima de restrição para reconhecer a sequência.
2. As sequências de restriçã o normalmente são palí n
dromos, significando que cada fita da sequê ncia de
-
restrição de fita dupla tem a mesma ordem dos nu-
cleotídeos ( segundo de 5’ para 3’). A sequência de
5* GAATTC 3*
3 * CTTAAG 5*
3. Uma enzima de restrição corta cada fita de sua se -
.
quência de restrição da mesma maneira Por exem
plo, a £coRl corta cada fita do DNA entre G e A da
-
.
sequê ncia de restrição (Figura 10.7) Algumas en -
zimas de restrição, como a £coRI, cortam as fitas
do DNA de modo sim étrico e produzem extremi -
dades curtas de fita ú nica , chamadas extremidades
coesivas. De modo alternativo, algumas enzimas
de restrição não geram cortes simétricos e os frag
mentos resultantes possuem extremidades cegas .
-
r As sequê ncias de restrição são apresentadas na Ta -
bela 10.1, que as agrupa de acordo com a extremidade
por elas produzida, ou seja, coesiva ou cega. As extremi -
dades coesivas são fitas simples e curtas que se projetam
a partir de cada extremidade do fragmento, capazes de
rr
formar pares de bases com extremidades coesivas com -
plementares em outros fragmentos. As enzimas de res -
trição também sã o utilizadas para formar moléculas de
DNA recombinante (Capítulo 16) .
‘
A variação do SNP é um dos tipos de alteração
na sequência de DNA que podem destruir ou criar uma
sequência de restrição. Quando isso ocorre
quando a variaçã o do SNP cria ou elimina uma sequên
—
ou seja,
-
—
cia de restrição o n ú mero de fragmentos dc restrição
produzidos a partir do DNA pode mudar e o compri -
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 341

Sítio de
restrição
Sítio de
restr ção
Observaçã o genética Os polimorfismos de nudeotf -
5 3C
' ['f.T.lt í
*
GAATTC 1T 3'
deos únicos ( SWPs) são diferenç as nos pares de bases de um
' único nudeotídeo que podem ocorrer em qualquer parte de
3' CTTAAG lf ~ 5' um genoma. A vanação do SNP pode afetar o número e o
Tratar o DNA com EcoRI . AfcoRI comprimento dos fragmentos de restrição.
reconhece a
seqjè ncia -aNo
do DNA GAATTC.
V
s' I7 c z UC 3' Sondas moleculares
3' a c t 5‘ O uso da análise clctroforética para detectar a va -
riação dos fragmentos de restrição do DNA, a varia ção
A EccR diva sua nos transcritos de RNAm a partir dos genes expressos
sequé nria -afvo ou a variação nos produtos polipept ídicos dos genes é
Digestão com enzima de restrição quebrando a
complicado pelo grande n úmero de fragmentos de res-
ligação entre G
e A no alvo. trição, moléculas de RNAm ou moléculas de prote í na
em uma amostra em análise. O tratamento do DNA ge-
Fragmento 1 í
Fragmento 2 i Fragmento 3
A A T T t IT 3*
nó mico humano com uma enzima de restrição como a
5'ZO AAT TC fi £coRl, cuja sequê ncia de restrição é comum no genoma,
=
3'l 4ir.T.l
7/ G

Os fragmentos de restr ção do DNA com

mt 5-
extremidades coesivas são gerados pela
digestão da fcofíí.
Figura 10.7 Digestã o com enzima dc restrição EcoRI .
mento dos fragmentos do DNA ( medidos pelo n ú mero
de pares de bases ) também pode mudar. Essa diferença
pode produzir centenas de milhares de fragmentos de
restrição. De modo similar , o isolamento das molé-
culas de DNA ou das moléculas de proteína das célu -
las produz um grande n ú mero de produtos diferentes.
Sem métodos para identificar substâncias específicas
sejam sequências de DNA específicas, sejam transcritos
—
tica seria irremediavelmente complexa.
—
de RNAm ou produtos proteicos a análise eletroforé-

Um composto chamado brometo de etídio ( EtBr )

baseada no SNP, que afeta qualquer sítio de restrição, é
uma variante genética herdada que pode ser identificada
observando-se a variação no n ú mero ou comprimento
dos fragmentos de restrição do DNA identificados após
a eletroforese em gel. O comprimento do fragmento de
restrição normalmente é registrado em quilobases ( kb ).
Um quilobase é igual a mil bases nucleotidicas. A Téc -
nica de Pesquisa 10.1 discute a origem e a herança da
variação no comprimento do fragmento de DNA.
permite que os pesquisadores identifiquem a localização
dos fragmentos dc DNA ou das moléculas dc RNA nos
géis da eletroforese. Como o EtBr cora todo o DNA ou o
RNA cm um gel, ele náo é específico para uma sequên -
cia de qualquer gene em particular. Quando o EtBr é adi
cionado aos géis de eletroforese contendo amostras de
-
DNA ou RNA, ele intercala nas moléculas. A exposição
à luz ultravioleta faz que o EtBr emita luz fluorescente, de
modo que o DNA ou o RNA corado com EtBr pode ser

— —
visualizado ( Figura 10.8a ). De modo similar, os corantes
de proteína genéricos corantes que se ligam a qualquer
Tabela 10.1 Exemplo de enzimas de restrição
proteína podem ser usados para descobrir a localização
Endonuclease Organismo Sequência das proteínas em um gel eletroforético ( Figura 10.8 b ).
de restrição de origem de restrição Duas inovações particularmente felizes na ele-
Produtores de extremidades coesivas troforese em gel tornaram possível a identificação de
EcoRI Escherichia coli -
5' CÀATTC 3' - proteínas individuais, RNAm e fragmentos de DNA.
3' - CTTÁA£ - 5' A primeira é o desenvolvimento de m étodos de blot -
ting , um nome gen é rico para a transferê ncia de ácidos
BamH I Baciilus 5' - GGATCC 3' - nuclcicos ou proteínas de um gel eletroforético para
omyloiiquifadens -
3' CCTAG£ 5' - uma membrana que pode suportar tratamento e an á -
Hind )II Haemophilus 5'- AAGCTT - 3'
lise rigorosos. O Southern blotting (em homenagem
í uen/ ae
inf -
3' TTCGAA 5' - ao seu inventor, F.dwin Southern ) é o termo aplicado à
Dde I Desulfovibrio 3' - CTTNAG 3' - transferência de DNA (ou transfer ê ncia de Southern );
desulfuricans
Produtores de extremidades cegas
3' - CANTAC - 5' o northern blotting ( batizado em analogia ao Sou -
thern blotting) identifica a transferê ncia do RNAm
Pvui\ Proteus vulgaris -
5' CAC&TG 3'- (ou transferência de northern ) e o western blotting
-
3' GTÇGAC 5'- é o termo que identifica a transferê ncia de proteínas
5' - CCd&GG - 3'
(ou transferê ncia de western ).
Srool Serratia
marcescens 3'- GGG£CC - 5'
A segunda inovação é o desenvolvimento das son -
das moleculares. Elas são anticorpos ou ácidos nucleicos
Nota: N * qualquer nudeotídeo ( A, T, C ou G );
de divagem.
A e v indicam locais
de fita simples que se ligam especificamente a molécu -
342 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

TÉ CNICA DE PESQUISA 10.1

Produção e detecçào dos polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição do DNA

Finalidade A digestão com enzimas de restrição seguida Sequência Sequência Sequência
pela eletroforese em gel do DNA é um método para detec- de restrição 1 de restrição 2 de restrição 3
tar a variação da sequência de DNA que altera o número de 5,1 kb li 4,2 kb
Alelo R 1 !
posições relativas das sequências RFLP. A varia ção no nú- i ,
5' ~JI 6 A A T T C 6AHT T C G A A T T Ç / f 3'
mero ou comprimento dos fragmentos de restrição pode
3'J/ tTT .
êilWli ’ C*
resultar de alterações na sequência de DNA que modificam Mji CUl AQ
* * *
uma sequência de restrição, tomando-a irreconhecível, ou
que criam uma nova sequência de restrição. As alterações Clivagem oela FcoRI
RFLP também podem resultar da inserção ou remoção do
DNA entre as sequências de restrição que aumentam ou di- f \
minuem o comprimento dos fragmentos de restrição. Fragmento 1 Fragmento 2
Materiais e procedimentos O DNA é isolado das células — 5,1 kb — r — 4,2 kb
e tratado com uma ou mais enzimas de restrição para pro- 5 A A T TC 13' 5' Af3 T T C í 3'
duzir fragmentos de restrição de DNA. Estes são separados 3'E C T àiA À 5’ 3'1[ C T T A A 5'
pela eletroforese em gel do DNA. fazendo que os fragmen-
tos sejam visualizados como "bandas* no gel. Os métodos 1* sequência 2* sequência
laboratoriais descritos na Técnica de Pesquisa 10.2 também de restrição de restrição
9,3 k b
podem ajudar na identificação de fragmentos de restrição Alelo R 2 r l
espec íficos. I I
5*7/ 6 A A Y Y C t Aíflt T r Cr
Descrição A variação na sequência de DNA que altera o
número ou o comprimento dos fragmentos de restrição
3*7/ 6 T T A A *5 C T MA A G pC 5'
•uml
(RFLPs) produz fragmentos de restrição caracteristicos para
Clivagem pela fcoRI
cada alelo. Os organismos homozigotos para a sequência
de DNA em um sítio de restrição produzem o mesmo frag-
mento de restrição a partir de cromossomos homólogos e r 9,3 kb
produzem uma banda de DNA no gel. Os organismos hete- 5'A A T T C Ç A 0T T Ç 53*
rozigotos têm sequências de DNA diferentes, produzem um 31' apeara C T T A A Sf
fragmento de restrição diferente a partir de cada cromos-
somo e têm duas bandas de DNA no gel. Alguns exemplos
.
Variação do RFLP Duas regiões do DNA homólogas são
idênticas, exceto quanto aum SNP que produz uma substituição
desses processos são exibidos à direita. de par de bases (destacada) no sítio de restrição 2 de um
cromossomo. O DNA tratado com FcoRI corta o alelo Rl em três
Conclusão As alterações por substituição de base no DNA sJtkx de restrição (1.2 e 3) e forma deis pequenos fragmentos de
que modificam uma sequência de restrição e a inserção ou restrição ce DMA de 5.1 kb e 43 kb A substituição de base na
remoção do DNA entre duas sequências de restrição são as sequência de DNA do alelo R1 elimina o sitio de restrição 2 e o
DNA é cortado apenas nos sidos 1 e 3,resultando em um único
principais maneiras pelas quais as alterações na sequência fragmento de restnçàc do DNA de 93 kb
de DNA conseguem produzir RFLPs. Os alelos RFLP formam
genótipos cujos fragmentos de restriçã o do DNA produzem
padrões caracteristicos na eletroforese em gel. Cada ge-
nótlpo tem uma combinação caracter ística de número de
banda e tamanho de banda no gel.

Figura 10.8 Visualização dos ácidos nucleicos e proteínas (a )

nos géis. (a ) As moléculas de á cido nucleico (DNA e RNA )
são visualizadas ligando brometo de et ídio (EtBr ] a elas. O EtBr
emite fluorescência quando excitado pela luz ultravioleta,
revelando bandas de DNA no gel. (b| Os corantes genéricos de
proteínas (como o azul de coomassie, exibido aqui) ligam- se às
proteínas nos géis eletroforéticos, revelando as posições das
bandas de proteína.
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 343

Ak4o V*
(a ) l 2,000 pb [
Sítios de Afeio ' Sítios de Alelo R*
restrição 1 2 3 * restrição 1 3 f T
—
f-5,1 fr-4,2 -|kb t 93 1 kb
T I f T T
f
Digestão com enzima de restrição Digestão com enzima de restrição FxdusàodeSOOpb Inserção de 500 pb

Resultado da cKagem do Resultado da clivagem Alelo V 7 A leio V 9

DNA e da hibridaçâo: dois do DNA e da hibridaçáo: »1.500 pb; | 2.500 pb |
pequenos fragmentos de urr grande fragmento
DNA com nordas nos stios de DNA com bordai nos 4
1 t
1 e 2 e sítios 2 e 3. Sítios le 3. i i
Digestão com Digest ã o com Digestão com
enzima de restrição enzima de restrição enzima de restrição
( b)

,A'*' A 'Aa R> Ra i

« rs 4
• 5.1 M. J
T '21 « r - 2-
R* 1
n ©

" T7HTT * 93 T
R*
I 93 1 kb
VJ 2,5

(c ) Genótipo: A 'A '

kb
93 -
'
A A* R’ R*
e
Dgestáodo
DMA .
execucãoda
eletroforese e
identificação
'
V 2,0
V 1,5
' - ©
Os RFLPs podem ser criados pela inserção ou remoção do
das bandas de DNA entre dois sítios de restriçãa O sítio 1 e o sitio 2 são
separados por 2 kb no alek> V . C alelos V* e V* são criados pela
5,1 - fragmentos
do DNA *
excusão ou inserção de 500 pb entre os sítios de restrição
43 -
©
Análise e herança dos RFLPs. (a) Do s alelos P e R , são
*
caractcrizados por quantidades diferentes de sequências de
restrição pragmertos de restrição do DNA de 5,1 kb e 43 kb são
produzidos para o aleí o R e um fragmento de resir ção de 9,3 kb
é produzido para o alelo A . (b) Cada um dos possíveis genótipos
* -
— —
dois homozigotc>5 e um heterozigo:o produz numeros e
tamanhos diferentes de fragmentos de restrição, (c) A
eletroforese do DNA digerido com enzimas de restrição
identifica um padrão de bandas único para cada genótipo: um
fragmento de 5.1 kb e um de 43 kb para o genótipo RR,um
único fragmento de 93 kb para o R R e todas as três bandas de
DMA par ã heterozigotos

las- alvo, tornando possível, assim , a identificação de uma
determinada proteína ou sequência específica de DNA
ou RNA. Localizar uma determinada sequê ncia de ácidos
nucleicos ou uma proteína específica de um conjunto he-
terogéneo de moléculas em um gel eletroforético é seme-
lhante a tentar encontrar uma única sequê ncia de letras
que compreenda uma série curta de palavras em um do-
cumento de texto volumoso. Varrer cada bloco de letras
em busca da sequência correta é quase impossível sem
uma ferramenta para visar à sequência desejada. Assim
como os programas de processamento de texto locali
zam uma determinada sequência de letras usando um
comando "buscar", que procura todas as sequências em
basca de uma correspondê ncia, os biólogos usam sondas
moleculares para identificar sequências- alvo de ácidos
-
nucleicos ou proteí nas alvo após a eletroforese.
Na busca pela molécula alvo do DNA em um Sou
thern blotting, a sonda molecular é um fragmento de
DNA curto de fita simples e a molécula alvo é uma re - -
gião do DNA que contém uma sequê ncia complemen -
tar à sequência da sonda. De modo similar, as sondas
moleculares de fita simples detectam RNAm -alvo nos
northern blotting pelo pareamento de bases comple-
mentares da sonda e de um segmento da sequê ncia de
nucleot ídeos visada. O pareamento das fitas de ácido nu -
cleico complementares da sonda e da sequê ncia - alvo se
chama hibridaçáo. Ao contrá rio das sondas de ácido
nucleico utilizadas para detectar sequências-alvo de
- DNA ou RNA, as sondas moleculares usadas para de-
tectar proteínas-alvo nos western blotting são anticor-
—
pos proteínas do sistema imune que se ligam apenas
a proteínas-alvo específicas. As descriçóes de Southern,
northern e western blotting e o uso de diferentes tipos
de sondas moleculares para identificar ácidos nucleicos
- ou proteínas específicos nas transferências sào forneci
dos na Técnica de Pesquisa 1031.
-
344 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

TÉ CNICA DE PESQUISA 10.2

Transferência e sondagem das moléculas de ácidos nudeicos e proteí nas

Finalidade Apó s a eletroforese em gel, os ácidos nu-
deicos ou prote ínas separados são transferidos (blotted )
para uma membrana que consegue suportar a manipu
laçáo vigorosa que acompanha a análise. Sáo aplicadas
sondas moleculares à s transfer ê ncias para detectar as
sequências portadas pelo DNA ou RNA e para detectar
prote ínas específkas.
Materiais e procedimentos O DNA digerido por enzimas
de restrição, o RNAm isolado ou as proteínas isoladas sáo
submetidos primeiro á eletroforese em gel. Padr ões conhe-
cidos e marcadores de peso molecular sáo executados com
as amostras experimentais como controles para identificar
o comprimento dos ácidos nudeicos ou a mobilidade ele-
troforética das proteí nas. Se o gel contiver DNA, este deve
ser desnaturado após a conclusão da eletroforese para
permitir que as sondas moleculares localizem sua sequên-
cia alvo em uma etapa posterior. A desnaturação do DNA
é realizada banhando o gel em uma solução de hidróxido
de sódio (NaOH) que rompe as pontes de hidrogénio entre
as fitas. Depois o gel é transferido com uma membrana de
ligação a ácido nucleico ou de liga çã o a proteína que vai
absorver as moléculas de amostra do gel. Em seguida, son-
das moleculares marcadas radioativa mente e capazes de se
ligar especifica mente à sequència-alvo de ácido nucleico

Eletroforese em gel, Southern blotting e marcação com sondas

Marcadores radioativos Bandeia
DNA cortado com enzima de restrição Y
DNA cortado com enzima de restrição Z
Esponja
1% 1 23

O Cortar amostras © Separar o O Desnaturar o DNA O O filtro de ligação ao DNA,

de DNA com DNA pela e colocar o gel no a pilha de toalhas de papel
enzimas de eletroforese filtro (esponja ) para e o peso sáo colocados no
restriçàoe em gei a transferência. gei o tampão passa para
carregar nos cima através da esponja
poços criados por meio da ação capilar,
no gel transferindo os fragmentos
de DNA para o filtro.

Hlbrkftaçáo da sonda com a sequência-alvo do DNA

Sonda dc DNA com citosinas
radioativamente marcadas (destacadas) Sonda de DNA
7 C 1rrnicHcpmccrtgiicRi3 ca!iL
7 cgJá c iwir C 6 TACGGCTA6C
Bolsa com Colisões aleatórias DNA na transferência
Adicionar a sonda vedação entre os fragmen-
ao Southern r- j r-r
blotting contendo
i tos de DNA nas
transferências e
w A hibridaçâo ocorre se a sonda e o fragmento
fragmentos de sondas podem carregarem sequências complementares.
DNA desnaturada levar á hfaridaçâa
Sonda de DNA
Sonda ctonada í 7/ A A THSflA T ÔHSG * THG
desnaturada \j
Soluçáo de
,
_L
! hibridação
Transferência de Southern ^
DNA na transferência
r~r r-T
Não ocorre nenhuma hibridaçào sem a
complementaridade da secuència .
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 345

ou à proteína - alvo são aplicadas na membrana preparada.
As moléculas da sonda molecular que não se ligam a uma
molécula - alvo na transferência são lavadas. Subsequen-
temente, a autorradíografia usando película de raios X
captura a localização de qualquer sonda molecular ligada,
detectando a radiação. De modo alternativo, os marcado-
res não radioativos ou fluorescentes podem ser ligados a
sondas moleculares para detecção subsequente. Métodos
similares sáo utilizados para preparar os Southern blotting
do DNA digerido por enzimas de restrição, northem blot-
ting do RN Am e western blotting das proteínas,exceto pelo
fato de o RNA e a proteína não serem desnaturados antes
da transferência.
Descrição O Southern blotting recebeu esse nome em ho-
menagem ao seu criador, Edwin Southern, e usa sondas mo-
leculares de fita simples para detectar DNA desnaturado na
transferência pelo pareamento de bases complementares.
O northern blotting detecta RNAm de ligação à membrana
usando sondas moleculares de fita simples de um modo si-
.
milar ao do Southern blotting O western blotting detecta
proteínas com o uso de anticorpos que se ligam especifica -
mente a proteínas -alvo .
Conclusão Os Southern, northern c western blotting são
produzidos por métodos similares e usam sondas molecu-
lares para detectar moléculas ou sequências de interesse
.
na amostra Sondas moleculares marcadas llgam-se a se-
quências ou moléculas especificas e são detectadas em
autorradiografias ou outras análises das transferências que
servem como registro permanente dos resultados da ele-
troforese em gel.

Película de raios X
1 2 3

Solução com
sonda radioativa

O Descasque o filtro de ligação ao Q 0 Wtro para Q Aplique a película Q Autorradiografia final, todos os
DNA do gel e coloque-o em remover a sonda de raios X sobre o marcadores de tamanho na
uma bolsa vedada a quente não ligada e filtro para a pista I aparecem porque são
contendo a sonda marcada; a depois seque. autorradiografia. radioativos; nas pistas 2 e 3,
sonda hí brida com as sequên
cias complementares .
- apenas as bandas que
hibridam com a sonda
radioativa sáo visíveis.

Análise da proteína por O Acrescente a solução

western blotting com anticorpo
radioativo ou sonda de
coloração histoquímica. O Exponha o filtro à película de
raios X ou use visualização de
Western
sonda fluorescente; as
blotting bandas indicam a localização
das ligações à sonda.
AA AS SS
0 Coloque o filtro em
O Separe a proteína uma bolsavedada a 0 Aguarde a ligação da
pela eletroforese quente com solução sonda de anticorpo
em gel e transfira tamponada. com a proteí na-alvo .
para um filtro de
ligação á proteína
( western bkx ) por
transferência.
346 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Análise eletroforética da anemia falciforme (a ) Alelo /5A

Assim como centenas de outras mutações dos DNA

~
Fita codificadora CAC CTG ACT CCT 6PG & A 6 AAB // 3‘
genes da a-globina e p-globina que afetam os seres hu - ~
Fita -molde y l ! c * C GTE SAC TGA EGA c f t c i c y t t r r/ f y
manos, a mutação que produz a SCD é uma altera ção da Tripleto de DNA 1 2 3 4 5 6 I 7 8
sequ ência de DNA que leva a um transcrito de RNAm
diferente do tipo selvagem c, no fim das contas, à pro- .
RNAm r mlf WWTOlW I4 Ali ICTTHI . . t*
Codon: 1 2 3 4 5 6 7 8
dução de uma forma mutado da proteína P-globina.
Especificamente, por meio de estudos genéticos que Proteína TVãLT HS T LEUTTHRTFRO ' TGLUTLYST/ /
abrangem um per íodo de 50 anos, os cientistas desco- Sequência de 1 2 3 4 5 6 ] 7 8
aminoácidos
briram que uma mudança em uma ú nica base de DNA
leva a uma diferença de uma ú nica base nos transcritos ( b) Alelo 0*
de RNAm e a proteínas P-globina que diferem em ape- DNA
nas um dos 146 aminoácidos que a compõem. Fita codificadora ii mw
í fwiwPTWw mwi . Cr
A Figura 10.9 mostra essa porção-chave das sequ ê n- Fita-molde 3* JjH.limTKHliyiB AHHmiHi
Tripleto de DNA 1 2 3 4 5 6 7 8
. . Cr
cias de DNA , RNAm e aminoácidos dos alelos do tipo
selvagem ( pA ) e mutados ( fF ). A diferen ça de um único
nucleotídeo entre os alelos é o resultado de um SNP do
RNAm rj
Códon:
,
1 2 3 4 5 I 6 I 7 8
n*
tipo que descrevemos anteriormente. Em comparação Proteína TVãLT HIS I LEU T THR T FRO GLUT irs T11
com o alelo do tipo selvagem , o alelo mutado con - Sequência de 1 2 3 4 5 8
té m uma ú nica substituiçã o de par de bases de DNA aminoácidos
no sexto tripleto do DNA da sequ ência codificadora. F igura 10.9 Mutação SCD na sequência de DNA do gene
Essa substituição leva à mudança de um ú nico n úcleo .
da p- globina. As sequ ências de DNA RNAm e aminoácidos
tldeo no còdon 6 do RNAm e a uma proteí na com va - que abrangem os oito primeiros aminoácidos do ( a ) alelo
lina (Vai), em vez de ácido glutá mico (Glu ), como sexto P' do tipo selvagem e do (b) alelo ps sáo exibidas. Ocorre
aminoácido na cadeia pohpept ídica da p-globina. polimorfismo de nucleot ídeo ú nico no tripleto 6 do DNA
(cercado pelo ret â ngulo ), provocando uma mudança no sexto
Análise da Southern blotting da variação do gano da
códon do RNAm e uma mudança no sexto aminoácido do
p-globina O SNP ps é incomum pelo fato de ocorrer polipept ídeo de Glu piara Vai.
na sequê ncia codificadora do gene, enquanto a maioria
dos SNPs ocorre em segmentos nã o codificadores do
genoma . Podemos detectar o SNP no alelo P5 porque sítios de restrição 1 e 3 da DdeI são clivados no DNA por-
ele destrói uma sequ ê ncia de restrição, levando a um tador do alelo Pi; o sítio 2 nào é reconhecido pela DdeI
RFLP que é revelado pela análise de Southern blotting. pela variação do SNP. Essa clivagem produz um ú nico
Duas ou três sequências de restrição para a endo - fragmento de restrição de 1.350 pb no DNA portador da
sequê ncia p5. O comprimento desse fragmento é a soma
nuclease de restrição DdeI podem ocorrer perto do gene
da P-globina, dependendo do alelo. A DdeI reconhece a dos comprimentos dos dois fragmentos de restrição de-
sequ ência de restrição de fita dupla 5' - CNTAG - 3', em tectados do alelo P ( isto é, 1.150 pb + 200 pb ). A an á-
^
que N indica que qualquer um dos quatro nucleot ídeos lise de Southern blotting do DNA do alelo ps produz um
( A, T, C ou G) pode ocorrer no meio da sequ ê ncia de único fragmento de restrição do DNA, medindo 1.350
5 pb contanto que o nucleotídeo variável seja ladeado pb (135 kb). Como o sítio 2 da DdeI é alterado pela va -
pelas combina ções de dinucleotídeos C T e A - G. riação do SNP, a sequência alvo inteira da sonda mole-
A Figura 10.10 mostra três sítios de restrição Ddel, cular está contida em um ú nico fragmento de restrição
de 1.350 pb (1,35 kb) (Figura 10.12 ). As pessoas que são
-
chamados 1, 2 e 3, no alelo P*. As três sequências de res
têm bandas de 1.150 pb (1,15 kb) e 200 pb (0,20 kb)
trição DdeI são clivadas, produzindo dois fragmentos de
detectadas pela sonda. Indivíduos que são P*p* têm uma
DNA de 1.150 pb e 200 pb para a regiã o do DNA exi - única faixa de 1.350 pb (1,35 kb) e os p* Ps produzem as
bida. O Southern blotting do DNA do alelo p* produz
duas bandas de DNA correspondentes aos tamanhos três bandas porque carregam os dois alelos. A Análise ge
né tica 10.2 vai orientá - lo na interpretação da análise de
de fragmento de 1.150 pb e 200 pb. A sequê ncia alvo- Southern blotting.
da sonda molecular é dividida entre dois fragmentos
de restrição pela clivagem do DNA no sítio DdeI 2 e a
sonda h í brida com os dois fragmentos de restrição de Observa çã o gen é tica A mudança de uma ú nica base
1.150 pb e 200 pb dos alelos p*. ( um SNP) na sequê ncia de DNA provoca a mutação do alelo
Por outro lado, na Figura 10.11, o alelo pç contém P* para alelo p4 e també m remove um sítio de restríçáo DdeI.
duas sequências de restrição DdeI, chamadas 1 e 3. A se- A substituição de base leva a uma variação RFLP que é detec-
quência de restrição do meio, marcada como 2 na ilustra - tada na aná lise de Southern blotting .
ção, está faltando no alelo ps em consequência da subs
tituição de pares de bases que produz o SNP. Apenas os
-
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 347

Sequê ncia do alelo 0* Figura 10.10 Digestão com enzima

Sítio Sitio Sitio de restrição Ddel e Southern blotting
OdeII Dde\ 2 Dde13 do gene da p - globina do tipo
i i i selvagem. A digestão com enzimas

P
5- J/ CTTAS
1.150 pb
s 200 pb
GFJG CTTAGIT ?
de restrição e aná lise de Southern
blotting da sequência de DNA do alelo
7 / 6 * ATC [ ® TD £ A A T C /f 5
*
3' *
P* identifica dois fragmentos de DNA
Sonda molecular hibridados peia sonda molecular. Um
A D(M reconhece
três sítios de
fragmento de restrição de 1.150 pb
Digest ão com enzima de restrição restrição CTNAG (1,15 kb) é produzido pela clivagem nos
sítios 1 e 2 e o fragmento de 200 pb é
produzido pela clivagem nos sítios 2 e 3.
i 1
-]
sI7 £
y ~ G A AT
TTAG C LJESõ C TTAG / f 3'
l GACH c GA A f
Sonda Sonda
molecular molecular
I I i
1.150 pb 200
A clivagem nos sítios 1,
Eletroforese, transferência 2 e 3 cria fragmentos
e hibridaçá o da sonda de DNA de 1.150 pbe

. I
200 pb
Transfer ência
de Southern
©
pb A hibridaçáo da sonda
1.150
200
-
-
com um DNA do aIdo
PA dentifca fragmentos
de 1.150 pbe 200 pb.

Sequénda do «Ido p Figura 10.11 Polimorfismo de

Sítio Sítio Sitio nudeotí deo único no alelo 0 *. A
Odel 1 Ddei 2 Ddel 3 substituição do par de bases inativa o
1 1.350 pb
1 J sitio Odel 2 e apenas os sítios 1 e 3 são
i clivados. A sonda molecular dctccta um
CTGHG CTTAG/ fy único fragmento de 1.350 pb (1,35 kb)
^ 3’7/ G A A T C aOBAG GAATÇ / f 5' na análise de Southern blotting.
Sonda molecular
A Ddel reconhece os sitos 1
e 3 que têm a sequência
Digestão com enzima CTNAG, mas não o segundo
de restrição s/tio qje sofreu mutação

I i 1
TTAG CTGHG C TTAG lf 3 f

rl/G ÃÃT c GACHC GAAT VC 5'

Sonda molecular

I 1.350 pb l

A clivagem nos sitos

Eletroforese, transferência 1 e 3 cria um
e hibridaçá o da sonda fragmento de DNA

Southern blotting

pb
! ©
de 1350 pb.

A hibrdaçào da sonda
1.350 com um DNA do alelo
35 identifica um
fragmento de 1350 pb

©
 343 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

F
1
?
L-L r L
tT DdeIt - 2
\ í
3
F
1
t
3 mobilidades eletroforé ticas dos transcritos de RNAm
desses dois alelos, pois os comprimentos de seus
RNAm são idê nticos. Uma análise de northem blot -
-
DdeI DdeI DdeI DdeI DdeI Dde\ Dde\
1 i I \ 1 I ting realizada no RNAm dos indivíduos com os três
0* F gcnótipos da P- globina dctccta a mesma faixa ú nica dc
! 2 3 1 2 3
RNAm para cada gen ót í po ( Figura 10.13 ). Consequen -
I temente, a análise de northem nào é ú til para detectar
a variação nesse caso.
Genótipo: FF FF Embora a diferença na sequê ncia entre esses dois
kb RNAm n ão seja detectá vel pela an álise de northem
U5
1,15
-- blotting, uma diferen ça na mobilidade eletroforé tica
~
de suas proteínas é detectá vel usando a análise de
0,20
western blotting, pois as prote í nas diferem quanto ao
conteúdo de aminoácidos. Lembre- se da Figura 10.9,
© em que os polipeptídeos produzidos pelos alelos (3* e
Tipo Portador de Anemia
selvagem anemia fak íforme
Ps diferem na sexta posição de aminoácido em suas
faldforme respectivas cadeias de aminoácidos de 146 membros.
Southern blotting A mudan ça no aminoá cido resulta em uma pequena
diferença de carga que produz mobilidades eletrofo-
F í g u ra 10.12 Resultados do RFLP para genótipos da
réticas caracter ísticas para as proteínas. Os western
P-globirva. blotting revelam bandas de proteí na hemoglobina
para os três genótipos essencialmente id ê nticas aos
An á lise de northern e western blotting do transcrito do padrões de faixa que Pauling detectou pela primeira
gene e da proteí na p-globina As sequê ncias de DNA
dos alelos P4 e p' sã o idê nticas, exceto pelo SNP que
.
vez ( Flcjura 10.14 ) Indivíduos com genótipos homozi
gotos e psP* produzem , cada um, uma ú nica faixa
-
as diferencia. Na transcrição, cada alelo produz uma de proteí na com mobilidade eletroforé tica diferente e
molécula de RNAm contendo 664 nucleot ídeos. A os indivíduos heterozigotos ( ( P*) tê m duas bandas de
substituição dc um ú nico nudeotídeo que diferencia ^
proteína , cada uma correspondendo ao produto poli -
os dois alelos nào altera o comprimento do transcrito pept í dico de um alelo diferente.
de RNAm. Considerando que o atributo molecular que
produz diferenças na mobilidade eletroforética entre
os RNAm é o comprimento total da molécula , n ão é
Observa çã o gen é tica A aná lise de northem blotting
de surpreender que, nesse caso, nào haja diferença nas produz resultados idê nticos para os genótipos p*p4 p*ps e.
P4 P\ pois os comprimentos dos transcritos de RNAm dos dois
alelos (p4 e P5) são idê nticos. Por outro lado, a aná lise de wes-
tern blotting produz diferenças detectá veis na mobilidade ele-
DNA F F
rroforêtka entre os produtos proteicos dos diferentes alelos.
Fita codificadora H IUC Jí IUL
Fita - molde 7Í
=.
n /c li
I
Transcrição
UZii
I
Transcrição
*
RNAm EU:
J L
n nu: Genótipo: fF FF
664 664
Sonda nucleot ídeos Sonda nucleot ídeos 0

Genótipo: FF FF i i FF
- ©
0
664 - Tipo Portador de Anemia
nucleot ídeos selvagem anemia faldforme
faldforme
Western blotting
0
Northern blotting
Figura 10.13 Aná lise de northern blotting do RNAm da Figura 10.14 An á lise de western blotting da proteí na
-
|3 globina humana. A transcrição produz um RNAm com P-globlna humana. Sáo observadas bandas simples de
664 nucleot ídeos de comprimento para ambos os alelos. proteí na na an á lise de western blotting dos homozigotos
Os resultados da aná lise de northem blotting, portanto, são P4p* e PJPS; duas bandas de proteí na são detectadas para os
idênticos para os três genótipos. heterozigotos.
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 349

AN Á LISE GENÉTICA
O segmento de DNA de 6 kb exibido contém o gene Bca . Sítios de restrição da EcoRI (E)
O local da hibrídaçáo de uma sonda molecular comple E E E E E
mentar à porção do gene é indicado. Os locais das cinco
sequências de restrição fcoRI também são indicados e 1 1
Gene Bca
1 i i
as distâncias (em quilobases) entre os locais de restrição
são fornecidas.
a. Se essa região de 6 kb for digerida com a £coRI, quan I 03 I
-
LO i
i— — —
3,0
Sonda
í
1 1.2 kb
tos fragmentos de DNA são gerados? Quantos pares
de bases de nudeotideos deve haver em cada um dos fragmentos de restrição resultantes?
.
b Quais fragmentos de restrição vão conter todo ou parte do gene Bca ?
c O DNA do segmento de 6 kb é digerido com a EcoRI e os fragmentos resultantes são separados
pela eletroforese em gel do DNA. Qual dos fragmentos resultantes estará ligado á sonda molecu-
lar e será observado nas bandas de Southern blotting? Quais fragmentos não serão detectados
por Southern blotting? Explique.

Estrat é gias de solu çã o Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por 1. Este problema diz respeito à digestão com enzima de restrição de um fragmento
este problema e explique a natureza de gene e à detecçào dos fragmentos de restrição com uma sonda molecular
da resposta solicitada . de uma parte do gene de interesse. A resposta exige a identificação do compri-
mento dos fragmentos de restrição que serã o ou não detectados pela sonda.

.
2 Identifique as informações críticas .
2 São fornecidas as localizações dos cinco sítios de restrição da EcoRI e as distâncias
fornecidas no problema. entre os sítios. 0 segmento do gene ligado pela sonda molecular é identificado.

Deduzir
.
3 Avalie a relação da sonda molecu- .
3 A sonda molecular se liga ao maior entre os dois fragmentos de restrição que
lar com o gene e avalie a escala em .
contém parte do gene Bca A soma dos pares de quilobases em todos os frag-
quilobases em relação aos sítios de mentos de restrição da EcoRI é igual a 6,0 kb.
restrição da fcoRI e os fragmentos
de restrição .
Solucionar Resposta a

.
4 Determine o número e o compri .
4 A digestão com a EcoRI produz quatro fragmentos de restrição com comprimen
mento (em pares de bases) dos frag- .
tos de 0,8 kb (800 pb), 1X1kb (1.000 pb), 3,0 kb ( 3.000 pb) e 1,2 kb (1.200 pb)
mentos de restrição.

Resposta b
.
5 Identifique os fragmentos de DNA .
5 Os fragmentos de restrição de 1,0 kb e 3,0 kb contém segmentos do gene Bca.
que contêm partes do gene Bca .
Resposta c
.
6 Identifique o fragmento de DNA que .
6 Apenas o fragmento de restrição de 3,0 kb contém a sequência hibridada pela
irá hibridar com a sonda molecular . .
sonda molecular Esse fragmento será observado no Southern blotting .
Dica: As sondas moleculares hibndam
com as teg órs- jlvc que contém sequências
de bases tompietrentares.

.
7 Explique por que um fragmento é .
7 A sequência de DNA complementar à sequência da sonda molecular está con-
hibridado pela sonda e outros frag - .
tida completamente no fragmento de restrição de 3.0 kb então esse fragmento
mentos, não . se liga à sonda. Nenhum dos outros très fragmentos de restrição contém uma
sequência complementar à sonda molecular, então, embora sejam separados
ArmftdMh : Evite contato lembrando que os
*
ragirentos de ONA que náo contém sequências
.
um do outro pela eletroforese em gel do DNA eles não são hibrldados pela
compfcmertares a uma sonda rrvoieculaf r\ o sonda e não são vistos no Southern blotting.
-
conseguem Nbndar com essa SO KU . *
Para pratkar mais, ver Problemas 15, 23 e 25 .
350 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
10.3 A anemia falciforme evoluiu por
causa da seleçã o natural nas
populações humanas
Dezenas de alelos variantes dos genes da hemo-
globina produzem uma forma ou outra de anemia he-
reditá ria. Segundo a Organização Mundial de Sa úde,
as anemias hereditá rias sã o as mais comuns de todas
as doenças genéticas humanas; elas ocorrem em uma
quantidade estimada de 250 milhões a 350 milhões de
pessoas em todo o mundo. A maioria das mutações do
gene globina que provocam anemia hereditária é rara,
mas algumas delas sã o encontradas em alta frequência
em certas populações. O alelo|3S ocorre em frequências
tão elevadas quanto 15% em vá rias populações nativas
da Á frica, Oriente M édio e subcontinente indiano. A
análise genética populacional c evolutiva verifica que
o alelo surgiu de modo independente em cada região e
evoluiu pelo mesmo processo evolutivo em cada loca
lidade. Exemplos de outros alelos da (3-globina encon
trados com alta frequência são o (3<:, principalmente em
populações da África Ocidental , e o
^ em populações
do Sudeste Asiá tico e das ilhas do Pacífico.
As altas frequências de Ps, e P* sào coerentes com
a conclusão de que a seleçã o natural está trabalhando
para aumentar a ocorrência desses alelos. Os estudos
populacionais ao longo dos últimos 50 anos estabele
ceram firmemente a malária como o agente de seleção
natural que leva a uma alta frequência desses alelos do
gene da P-globina em certas populações. Um ambiente
onde a malá ria é endémica favorece a sobrevivência e
a reprodução dos indivíduos heterozigotos para o
um dos alelos mutados sobre os outros genótipos. Em
outras palavras, os indivíduos que são p*|K p* pc ou
^
e de uma pequena quantidade de eritrócitos falciformes.
p p1 tém uma vantagem de sobrevivê ncia e reprodução
4
sobre os indivíduos homozigotos p* (V* (e, portanto, su
cumbem mais facilmente à malá ria ) e sobre os que sã o
homozigotos para os alelos mutados (e, portanto, so-
frem de anemia hereditá ria ).
Infecção por malária
A malá ria é uma doença infecciosa potencial
mente fatal, provocada por protozoá rios. Uma das for
mas mais comuns e graves da malá ria é causada pelo
Plasmodium falciparum. Esse protozoá rio é carregado
pelo mosquito vetor Anopheles gambeii, que transfere
o protozoá rio para os animais, incluindo os seres hu -
manos, quando os pica. Os sintomas da malá ria in -
cluem febre alta e outros problemas que podem causar
.
a morte se n ão forem tratados com eficácia Depois
de infectada com o P. falciparum, uma pessoa pode
sofrer recorrê ncias da malária por toda a vida. Como
consequê ncia , as vítimas dessa doença são menos sau
dáveis que suas contrapartes n âo infectadas e também
são suscetíveis a outras doen ças. No geral, as v ítimas
da mal á ria té m morbidade (doenças ) e mortalidade
(morte ) mais elevadas e geram menos filhos que o
resto da população.
O P. falciparum e o mosquito que o carrega pros -
peram em ambientes tropicais e, portanto, a malá ria é
endémica nos tró picos. Os embriões do P. falciparum
vivem em seus mosquitos hospedeiros, mas nâo come -
çam o desenvolvimento larval até serem transferidos
para o hospedeiro mam ífero. Uma vez dentro de um
hospedeiro mamífero, o plasmódio começa a amadure -
cer, primeiro em seu fígado, e mais tarde nos eritrócitos.
Vantagem heterozigótica
Um dos exemplos mais bem documentados da
seleção natural na evolu ção das populações humanas
tem sido a relação observada entre a malá ria e o alelo
P5. Muitos estudos antropológicos e epidemiológicos
registraram os efeitos da mal á ria na evolução do p* e
- SCD nas populações africanas e em outras populações
- no sul da Europa e da Ásia ( Figura 10.15). O achado
principal desses estudos é que os heterozigotos com o
genótipo p* ps sobrevivem e se reproduzem de forma
mais confiá vel que outros genó tipos em ambientes
onde a malária é comum.
As maiores sobrevivência e reprodução de hetero-
zigotos podem ser explicadas em um n ível celular pela
- vantagem seletiva que os heterozigotos derivam da ex -
pectativa de vida média menor de seus eritrócitos. A
expectativa de vida m édia dos eritrócitos nesses indiví-
duos é menor pela presença de uma certa quantidade de
proteí na P-globina mutadn e a consequente formação
A expectativa de vida menor dos eritrócitos interrompe
o ciclo evolutivo das larvas de Plasmodium, impedindo
que muitos parasitas cheguem à maturidade. Como re-
- sultado, os heterozigotos são menos suscetíveis à malá -
ria que os homozigotos p* PA e, quando contraem a do-
ença, ela é menos grave.
Em um n ível populacional, indivíduos com SCD
(homozigotos para o gene mutado) sobrevivem e se
reproduzem muito mal em razão de seu transtorno
- de hemoglobina. Indivíduos também tê m menos
- aptidão reprodutiva que os portadores heterozigotos
em decorrência da destruição causada pela malá ria. O
resultado é que a seleção natural favorece os portado-
res heterozigotos e faz que as populações desenvolvam
uma reserva genética que inclui grandes proporções de
ambos os alelos. Essa vantagem heterozigótica obser
vada nos indivíduos P*PS é compensada pela desvanta
--
gem dos portadores de SCD. A açâo dessas tendências
conflitantes produz um aumento global no alelo Ps até
ele atingir uma frequência de equil íbrio está vel , em
- que o ganho e a perda dos alelos pç sào iguais. O termo
polimorfismo balanceado é utilizado para descre-
ver situações como essa, na qual a perda de um alelo
 Cap ítulo 10 Integra ção das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme
Endem»cidade da malaria
Isenta de malá ria
d Epidéroica
L J Hipoendèmica
Mesoendémica
Hí pcrendémica
Holoencèmica
Figura 10.15 Distribuição da malária e da anemia faldforme. (a) As á reas coloridas indicam as regiões do mundo onde
a malá ria é uma doença endémica , ( b) Distribuição de frequência do alelo (3* em algumas populações humanas que ocupam o
cintur ão da malá ria (c) Distribuição do alelo p* no Sudeste Asiá tica
,
decorrente da seleção contra um de seus genótipos é
compensada pela seleçã o natural em favor do alelo
para outro fenótipo.
Na pesquisa pertinente à vantagem heterozigótica
na evolução do ps, três achados sào particular mente
importantes:
.
1 A frequência de portadores de SCD aumenta com a
idade avançada na população. Estudos de frequên
cia genot í pica nas popula ções afetadas pela malá ria
constatam que a frequência dos heterozigotos P^ PS
é menor em crianças que em adolescentes, e menor
em adolescentes do que em adultos. Em outras pa
pp
lavras, indivíduos com genótipos p*p* e * * estão
sendo perdidos nessas populações em idades infe
riores que os heterozigotos.
2. Mulheres heterozigotas geram uma quantidade
média maior de filhos que as mulheres p*p*. Isso
é uma indicação de que a sa ú de global dos hete -
rozigotos é melhor, levando-os a se reproduzir de
forma mais eficiente.
351
(c)
F requê ncias
de distribuição
do alelo da
hemoglobina E (%)
<2
2-10
>10
OP001 Uocmnan Pvtaihw» iro
3. No “cinturão da malária" a parte dos trópicos onde a
malária é comum, o alelo p5 se desenvolveu e evoluiu
de forma pelo menos três vezes mais independente
nas diferentes popula ções. Alguns biólogos acredi-
tam que a evidência genética apoia quatro eventos
distintos de mutação e evolução. Esses eventos evo -
lutivos independentes contribuem para a presença
- do p5 em alta frequência nas populações do Oriente
Médio, da região que circunda o Mar Mediterrâ -
neo, de partes do subcontinente indiano e de partes
da Á frica.
-
Observa çã o gen ética 0 alelo P' evoluiu pela seleção
- natural e atingiu uma alta frequência em vá rias populações
porque os portadores heterozigotos sobrevivem e se reprodu -
zem com mais eficiência que outros nas populações. Nessas
populações, a vantagem seletiva do alek> Ps no genõtipo he-
terozigoto é anulada pela perda dos alelos em decorrência da
SCD, produzindo um polimorfismo balanceado.
352 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Evoluçã o do pc e do pc (a ) (b)

Um suporte adicional ao papel da seleçào natural

Mokle p*
4 5 6~
7
Molde /Í*
24 25 26 __ 27
na evolução dos genes globina vem do estudo de dois DNA 7 fi ' *
1 [W c] C T C / jT
*•
~
J
^ è7/
i / áCU CTufr for
~
- itirfiG ¥ 5 SU
~ ~
‘
RN A
"

outros alelos do gene da P globina que estão presentes

em frequências elevadas nas outras populações no cin - Proteína j1CI3CI3 otuijç jillii '/ / /TGLYTGLYT \SS}I
tur ão da malária. Os alelos mutados p* e p' da P globina - Molde (P Molde 0*
evolu íram em razão da pressão seletiva natural da ma
lária de modo muito parecido com o que o pv evoluiu.
- 4 5 6 7 24 25 26 27
DNA É iTIlF.1 BTClcT C /r . W.1
11W1 iHHH! :
A mutação conhecida como pc provavelmente RNA ACU C C U 7, c
ocorreu milhares de anos atrás na costa ocidental da Proteí na j [_ITHRIPRO GLUX// GLY ^ GLY AIA
.
Á frica Essa muta çã o é uma substituiçã o de base de
um nudeotídeo imediatamenle adjacente ao sí tio
F igura 10. 6 Comparação das sequências do alelo
de mutação P' no sexto tripleto de DNA do gene da
pA (o tipo selvagem) e dos alelos mutados pc e P‘ da
-
P globina ( Figura 10.16a ). O efeito da mutação é mudar .
p-globina (a ) p5 e pc são mutados por substituição de base
o sexto aminoácido da proteína p-globina, de ácido que alteram a posição 6 do aminoácido trocando o ácido .
glutàmico para lisina. glutà mico (Glu ) pela lisirva (Lys) no pf. (b) O mutado por
Embora a mutação afete a mesma posição de ami
noácido alterada em pç, as complica ções da mutação
- substituição de base Pf troca o aminoácido 26, mudando de
ácido glutá mko (Glu ) para lisina (Lys).
não são tã o graves quanto as observadas na SCD. A
homozigosidade para a mutação Pr n ã o produz ane - contra a P* é compensada pela maior resLsté ncia à malá -
.
mia grave e raramente é fatal No entanto, assim como ria dos portadores heterozigotos do alelo.
nos portadores de SCD, os heterozigotos com o genó - Assim como a variante ps, que tem sido nosso foco
tipo P*pL são mais resistentes à malá ria que os homo - ao longo deste capítulo, as variantes p' e p* são dis-
zigotos p* p\ Essa situação leva à disseminação da mu
taçã o pc por um processo de seleção natural paralelo
- tribuídas por todo o cinturão da malá ria, que abrange
grande parte das regiões tropicais em volta do F.quador.
ao observado para o ps . Estudos cl ínicos e epidemiológicos confirmam que as
No outro lado do cinturão da malá ria , no Sudeste três variantes do gene da P- globina são vantajosas no
Asiá tico c nas ilhas do Pacífico adjacentes, outra muta - estado heterozigoto porque reduzem a incidência e a
çã o do gene da P-globina, a p', é prevalente. A Pf é uma intensidade da doença malá rica nos portadores. A in -
mutação por substituição de base que altera o aminoá - cidência de doença hereditária produzida pela homo-
cido 26 da proteína p-globina, mudando-o de ácido glu - zigosidade c compensada pelas maiores chances dc
tâ mico para lisina ( Figura 10.16b ). A anemia observada
nos homozigotos p£p£ é grave, mas a seleçào que exerce
sobrevivência e reprodu ção nos portadores dessas va
riantes do gene globina.
-
ESTUDO DE CASO

An á lise da transmissã o e da gen ética molecular da talassemia

As formas autnssómicas recessivas de uma anemia mutado nà o tê m proteína P-globina . Sua capacidade para
hereditária chamada talassemia resultam de mutações dos formar hemoglobina é muito reduzida, provocando ane -
genes globina que criam um desequilíbrio na proporção dc mia grave. Os heterozigotos també m t êm uma capacidade
- -
polipeptídeos a globina e p globina. O desequil íbrio reduz reduzida pru produzir hemoglobina e sofrem de anemia
a quantidade de hemoglobina que pode se formar e geia crónica. Uma vez que os heterozigotos tê m um alelo da p-
anemia. Pé las diferenças entre os alelos mutados. as talas - globina do tipo selvagem, sua anemia é menos grave que a
semia* exibem níveis variadas de gravidade, de branda a dos homozigotos.
fatal. Uma forma particular de talassemia é comum na ilha
mediterrâ nea da Sardenha.
-
Os alelos da p globina do tipo selvagem tê m dois sí
tios dc reconhecimento para a endonuclcasc dc restrição
-
A mutação da talassemia da Sardenha ( Omim 141900)
-
é uma substitui çã o dc base dc nuclcot ídco (G C > A - T)
no 39a códon ( correspondente ao 39° aminoácido) do gene
- .
da p giobina Figura 10.17a ) A mutação altera o 39“ códon
— Mae\ (sequê ncia de restrição 5'- CTAG - 3') na vizinhança
.
do gene ( Figura 10.17 b) A mutação por substitui çã o dc
base no tripleto 39 do DNA cria um novo sítio de res
trição MaeI, que n ão é encontrado na sequê ncia do tipo
-
- -
do transcrito dc 5' CÀG 3', que codifica o aminoácido
-
glutamina ( Gin ), para a sequência 5'- UAG 3\ que é um
selvagem . Enquanto o alelo do tipo selvagem conté m dois
sítios de restrição Mael separados por aproximadamente
códon de parada . Essa mudança resulta na terminação pre 1.500 pares de bases ( 1,5 kb ) , a sequê ncia do alelo mu -
-
matura da tradução da proteína P globina após os 38 pri - tado conté m um terceiro sítio de restriçã o Mael que cliva
.
meiros aminoácidos A prote ína truncada n ão é funcional. a região de 1,5 kb em dois fragmentos de DNA de 0,5
Conscqucntcmcntc, indivíduas homozigotos para o alelo kb c 1.0 kb. A an á lise dc Southern blotting do DNA da
 Cap ítulo 10 Integra ção das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 353

( a ) Variação na sequ ência de DNA dos alelos da 0-globina (c ) Análise de Southern blotting da
Trlpleto de DNA: 36 37 38 39 40
7/
Tipo selvagem (M) Rtacodificadora 5 CCT TGG ACC MAC AGG
'
41
TTC / ,r 3'
~~
variação dos alelos da
Mm Mm ^globina
7 DiO2
. n c^7/~
Rta-molde 3' / GSA ACC T 6 G MTC TCC A /TS fS *
I
I 1 ~
Mutado [ m ) Rta codificadora S 7/
' c c i i G U AC :: UA G \ si 3*
3
Rta-molde 3'7 G G A A C C T f a f i U i C I C C
/ AAG it* *
<
Novo sitio de
restrição Maei
5

—
0/
O
D
£ 1,5 -
(b) Digestão por enzima de restrição dos alelos da 0-globina
Sítio
Moei 1
Sítio
Mae12 I
% no -\
i 1,5 kb l o
Tipo selvagem (M) 5
*
7/ C T A CT AG 7 />
3* 7/ 6 A T C GA TC IT 5’
Sítio Novo sítio Sítio I
o

‘
7
Mutado (m ) 5 /TTrs ——
Moei 1
.I 03 kb

3 ' 7776 À TC
' "
MaHI
|
.f
CU Ã G
tf A 11'
1,0 kb

Sonda
Moei 2
I
Cf AG
GATC
/7 3'
7775'
F igura 10.17 Análise genética molecular da variaçã o no tripleto 39 do DNA do gene da (3-globí na na p- talassemia da
Sardenha, ( a ) Sequências de DNA dos alelos do tipo selvagem (M) e mutados ( m ) da {3-globina do tripleto 36 ao 41. (b) Mapas
de restrição dos alelos do tipo selvagem e mutados do tripleto 39 exibem um novo sítio de restrição Moei no alelo mutado.
O local de liga ção da sonda molecular identifica um fragmento de DNA de 1,5 kb para o alelo do tipo selvagem (M) e um
fragmento de 1,0 kb para o alelo mutado (m ). (c) Aná lise de Southern blotting de uma fam ília exibindo segregação de alelos do
tipo selvagem e mutado do tripleto 39. Os pais heterozigotos ( Mm ) produzem filhos com os três gervótipos. O genótipo de 11-4
é discutido a seguir.

p globina digerida pela Mael utiliza uma sonda molecular

- anemia grave t ê m o genótipo m m e produzem uma ú nica
que sc liga próximo a uma extremidade do gene da (J-glo-
bina. A sonda se liga a um fragmento de DNA de 1,5 kb
produzido pelo tratamento com Mael do alelo do tipo sel
vagem e a um fragmento de DNA de 1,0 kb produzido
- A Figura 10.17c mostra uma genealogia nuclear que
pelo tratamento com A/ael do alelo mutado. O fragmento
de 0,5 kb també m é produzido pela digestã o com Mael
do alelo mutado, mas esse fragmento não é detectado
na an álise dc Southern blotting porque n ão está ligado à
sonda molecular.
Em termos de presença ou ausê ncia do alelo mutado
da Sardenha , três gen ótipos são possíveis nesse lócus, cada
um tendo um padrão de bandas ú nico para o fragmento dc
restrição, detectável por Southern blotting. Os homozigotos
para o alelo do tipo selvagem ( M M ) produzem uma única
banda de Southern blotting de 13 kb. Os homo/.igolos com
banda de DNA de 1,0 kb. Os heterozigotos ( A/m ) produ -
zem as duas bandas, já que carregam os dois alelos,
é coerente com um padrão autossômico de herança da
talassemia. Os símbolos da genealogia para cada mem -
bro da fam ília est ão situados diretamente acima da pista
de Southern blotting contendo o DNA desse indivíduo.
O Southern blotting dctccta um padrã o diferente dc ban -
das de DNA para cada genótipo. A figura também ilustra
os resultados do Southern blotting para o DNA obtido de
um feto (o símbolo cm forma de diamante identificado
- -.
como II 4 ), que é carregado por 1 2 Essa análise é um
exame dc diagn óstico pré-natal para a talassemia da Sar-
denha que se baseia nas diferenças das bandas de Sou -
thern blotting entre os três possíveis genótipos.

RESUMO
10.1 Uma variante da hemoglobina herdada
provoca a anemia falciforme
A hemoglobina é uma prote í na abundante nos eritróci-
tos, transportando oxigénio por todo o corpo. Sua estru
tura é tetramérica , composta de dois polipept ídeos codi-
-
ficados pelo agrupamento gen ético da a globina e dois
polipept ídeos codificados pelo agrupamento gen ético da
p-globina.
I A mutação dos genes frequentemente leva à estrutura e
função anormais das proteí nas. As mutações dos genes da
- -
a-globina e da 0 globina costumam produzir anemia he -
reditá ria, a categoria mais comum de doença hereditá ria
conhecida nos seres humanos.
354 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

I A anemia fakiíorme (SCD) é uma anemia hereditária
comum nos seres humanos, provocada pela homozigosi-
dade para o alelo fis do gene da (Vglobina. Indivíduos com
SCD tém o genótlpo A proteína globina produzida
pelo ps difere do produto gènico normal da p-globina (P*)
quanto à substituição de um único aminoácido.
A hemoglobina em pessoas com SCD é instável e lineariza
na baixa concentração de oxigénio, distorcendo o eritró
cito e conferindo-lhe um formato falciforme. As células
distorcidas podem bloquear os capilares estreitos, produ-
zindo prfvaçáo de oxigénio nos tecidos, que leva ao dano
tecidua! e a outras complicações, A anemia falciforme leva
à morte prematura dos eritródtos.
I Portadores heterozigotos da mutação P5 (P^P5) têm uma
pequena porcentagem de eritródtos falciformes, mas não
sofrem os sintomas ou complicações da doença.
10.2 A variação genética pode ser detectada exa-
minando o DNA, o RNA e as proteí nas
A eletroforese em gel demonstra a base molecular da SCD
revelando que os produtos proteicos dos alelos p* e p* têm
mobilidades eletroforétícas diferentes. Os padrões carac-
terísticos das bandas eletroforétícas são detectados para
muitos genótipos do lócus da p globina.
A substituição de um único aminoácido causada pelo alelo
P5 é uma valina no lugar de uma glutamina na proteína P-
globina.
A aná lise do DNA identifica a mutação Ps como uma subs-
tituição de par de base no gene da p-globlna que produz
um polimorfismo de nucleotideo único (SNP) e elimina um
sítio de restrição Ddel.
A variação do RFLP distingue os alelos p* e P5.
O padrão de herança dos RFLPs se compara ao dos alelos
no gene da p-globina.
Os fragmentos de restrição do DNA são detectados trans-
ferindo fragmentos de DNA desnaturado dos géis eletrofo-
réticos para uma membrana permanente no processo de
Southern blotting .
Nos Southern blotting, sondas de ácido nucleico de fita
simples, marcadas com marcadores radioativos ou quími-
cos, hibridam com sequências alvo complementares nos
fragmentos de DNA .
A presença e a posição de um fragmento de DNA hibri-
dado por uma sonda molecular são reveladas pelo surgi-
mento de bandas na análise de Southern blotting.
0 northern blotting é similar à de Southern, mas examina o
RNAm em busca de diferenças de comprimento.
I 0 western blotting usa anticorpos com marcadores radio-
ativos ou químicos para detectar variação na mobilidade
eletroforética das proteí nas.
10.3 A anemia falciforme evoluiu por causa da
seleção natural nas popula ções humanas
O alelo Ps passou a ter uma alta frequência em muitas po-
pulações no cinturão da malária como consequência da
seleção natural, que favorece os heterozigotos p*Ps como
os mais adaptados no ambiente malárico.
A vantagem beterozigótica no caso dos alelos p4 e P' surge
da perturbação do ciclo de vida do parasita malárico re-
sultado da expectativa de vida média um pouco curta dos
.
eritródtos em heterozigotos .
As mutações do gene da P globina, incluindo Pc e p* pare .
cem ter evoluído em populações diferentes por processos
similares aos que o P* estabeleceu nas populações humanas.

TERMOS-CHAVE

Agarose (gel de agarose) (p. 336) .

Alelo p4 (p. 335)
Alelo ps (p. 335)
Análise da impressão digital peptidica
(p. 338)
Anemia falciforme (p. 333)
Brometo de etidio (EtBr) (p. 341 )
Cromatografia (p. 338)
Eletroforese em gel (p. 335)
Endonuclease de restrição (enzima de
restrição) (p. 340}
Extremidade cega (p. 340)
Extremidade coesiva (p. 340}
Faixa (na eletroforese em gel) (p. 337)
Frequência de equilíbrio (p 350} Polimorfismo balanceado (p. 356)
Gene da a-globina (agrupamento gené- Polimorfismo de nucleotideo único
tico da a-globina, cadeia da a-glo- .
(SNP) (p 338)
bina) (p.334) Polimorfismo do comprimento dos frag-
Gene da p globina (agrupamento ge .
mentos de restrição (RFLP) (p 340}
nético da P-globina, cadeia da P-glo- .
Quilobase (kb) (p 34 J)
bina) (p. 334) .
Sequência de restrição (p 340)
.
Hemoglobina (Hb) (p 333) .
Sonda molecular ( sonda) (p 341)
Hibrldaçáo (da sonda molecular) (p. 343) Southern blotting (p. 341 )
Mobilidade eletroforética (p. 337) Talassemia (p. 352)
.
Northern blotting (p 341 ) Vantagem heterozlgótica ip.350)
.
Origem òe migração (p 336) Western blotting (p. 347)
Poliacrilamidd (gel de poliacrilamida)
(p. 336)

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
.
I Defina os seguintes termos conforme descritos neste d. íntron
capítulo: e. Tetrâmero de hemoglobina
a. Agrupamento genético f. Anemia hereditá ria
b. Vantagem heterozlgótica g. Éxon
c Dominante h. Heterozigoto
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 355

L Recessivo 7. A substituição de uma única base cria o mutado Hb Cons -

.
j Doença molecular tant Spring (Hb^) do gene da a-gk>bina, cujo produto
k. Endonudease de restrição contém 172 aminoácidos. A proteína a-globina do tipo
L Homozigoto selvagem contém 141 aminoácidos. O RN Am do tipo sel-
.
m Eletroforese em gel vagem carrega o códon CGU para codificar a arginina
n. Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de ( Arg) como aminoácido final da cadeia, seguida pelo
restrição códon de parada UAA. O mutado Hba produz RNAm
.
o SNP com a sequência CGUCAA nessa região. Explique como
p. Mobilidade eletroforética a substituição de uma únka base do DNA no Hb pode °
.
q Southern blotting levar à produção de uma proteína que contém 31 amino-
.
r Sonda molecular ácidos a mais que o tipo selvagem.
.
s Northern blotting
8. A proteína P- globina do tipo selvagem é composta de
.
t Sonda de anticorpo
u. Western blotting
146 aminoácidos. O mutado do gene da p-globlna co -
nhecido como Hb Cranston contém 157 aminoácidos .
.
2 Usando a anemia falciforme como exemplo, descreva as Sáo exibidas sequências parciais do RNAm do P4 e do
semelhanças e diferenças entre os termos doença gené- .
Hb Cranston (pC/) Os números indicam as posições dos
tica e doença molecular . Em que as doenças moleculares aminoácidos. Identifique a mutação que causa o P e
e genéticas são diferentes das doenças causadas por um descreva como a mutação leva a uma cadeia de proteína
°
organismo infeccioso, como uma bactéria? p-globina maior que o normal .
3. Compare e diferencie as contribuições de Neel, Pauling e 144 146 Parada
143
Ingram para nossa compreensão da base genética e mo -
P* AAC CAC DAA CCU CCC UUU COTJ GCU GUC
UAU
lecular da anemia falciforme. CAA CUA UUA A
UUU
144 146 147
145 150
4. Por que as diferenças na mobilidade eletroforética das
P° AAG AGU AUC ACU AAG CUC GCU UUC UUG
proteínas costumam resultar de mudanças nas sequên-
155 156 157 Parada
cias de aminoácidos das proteínas? Como podem surgir CUG UCC AAU UUC UAU UAA
diferenças na mobilidade eletroforética entre os produ-
tos proteicos de diferentes alelos ? 9. Descreva por que a anemia falciforme é considerada um
.
5 A análise eletroforé tica da hemoglobina de uma pessoa transtorno genético recessivo .
com HbA normal e outra com anemia hereditária não 10. Qual parâmetro molecular faz que os fragmentos de DNA
revela diferença na mobilidade eletroforética. Como isso tenham mobilidade eletroforética diferente? Qual parâme-
pode ocorrer ? tro causa mobilidades diferentes no RNAm ? Quais parâ
metros causam mobilidades diferentes nas proteínas?
6. Muitos tipos de anemia hereditária resultam de substitui -
ções de um único amí noácido que afetam uma das ca- .
11 Como é produzida uma autorradiografia a partir do Sou-
deias de proteína hemoglobina. Por exemplo, o a leio do thern blotting?
tipo selvagem da p-globina tem a sequência molde do
DNA CTC no triplet 6, que codifica o aminoácido ácido 12. Os Southern e northem blotting podem revelar informa-
glutámico (Glu) na posição 6 da proteína [Vglobina (ver ções sobre os fragmentos de DNA ou moléculas de RNA
.
Figura 10.9) O a leio mutado que produz p' contém a se- que est ão sendo examinados, mas as posições das ban-
das de ácidos nuclekos em um tipo de transferência não
quência de DNA CAC e codifica valina (VaU na posição 6
.
da p globina e a mutação pc contém TTC no DNA e co podem ser comparadas diretamente com as do outro
tipo de transferência. Por quê?
difica lisina ( Lys) na posição 6. A tabela a seguir mostra
vários outros mutados do gene da p-globina que são o 13. A sequência-alvo de um fragmento de DNA é 3'- ATAT -
resultado das substituições de um único aminoácido.Use
as informações fornecidas e a Tabela 1.2 para determinar
.
CGCACGGACT - 5' Quais são a sequência e a polaridade
de uma sonda molecular de comprimento equivalente
a sequência-molde do DNA do tipo selvagem e a sequén usada para detectar essa sequência-alvo? Explique por
cia -molde de cada mutado . que a sonda molecular que você propô s irá detectar a se -
quência-alvo.
Forma da p-globina Posição Aminoácido
14. O aleio P1 ocorre em uma população do Oeste Africano
P 4
(tipo selvagem) 7 Glu
em uma frequência de 15%. O mesmo alelo ocorre em
Siriraj 7 Lys uma população da ponta sul da África em uma frequên -
San Jose 7 Gly cia de menos de 1%. Especule sobre a razão das diferentes
frequências do alelo nessas duas populações africanas.
P 4
(tipo selvagem) 58 Pro
Ziguínchor 58 Arg
P 4
(tipo selvagem) 145 Tyr
Bethesda 145 His
Fort Gordon 145 Asp
356 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Aplica ção e integração

15. A família representada na genealogia e no Southern blot-
ting a seguir foi avaliada quanto ã presença e distribuição
do alelo ps. Use as informações no Southern Wotting e a
explicação fornecida no capitulo para identificar o fenó-
tipo e determinar o genótipo de cada pessoa testada.
Smal é 5'CCCGGG 3' em cada fita Uma única ligação fos-.
fodiéster em cada fita é cortada no mesmo lugar na se-
.
quência em cada fita Explique como as enzimas de res-
trição são capazes de reconhecer a mesma sequência e
cortar sequência no mesmo lugar em cada fita de DNA.

.
21 Quatro alelos de um gene marcador de DNA variável pro-
i
to! duzem fragmentos de DNA de tamanhos diferentes: R' =
4 kb, = 13 kb, fl3 = 10 kb e = 7 kb.
a. Identifique os genótipos dos indivíduos retratados nas
II
OOT]' * pistas 1, 2 e 3 no gel exibido.
Pista: 1 2 3 4 5 6
r~i -
-
11 1-2 11- 1 -
H2 11-3 -
11 4 kb
r\ j i
0
kb © 13 -

--
1,35 10 -
1.15 7-
4 -
0,20 -
© b. Nas pistas 4, 5 e 6, desenhe os padrões de bandas pre
vistos para os indivíduos com, respectivamente os ge - .
.
16 Suponha que o casal (1-1 e I-2) exibido no Problema 15
nótipos ftW ftWeftW. .
esteja esperando um quinto filho . 22. Considere esta sequência de DNA:
a. é possível que seu bebê possa ter anemia falciforme? 5' TTCGAATTCGACTCAGGATCCTACA À GTTTCAT - 3'
Se for, qual é a probabilidade? Caso contrário, explique
por quê. -
3' AAGCTTAAGCTGAGTCCTAGGATGTTCAAACTA 5' -
b. O DNA fetal é coletado e analisado pelo Southern blot - Quais dos seguintes sítios de restrição estão presentes
ting. O feto tem uma única faixa de DNA com 1,35 kb nessa sequência? Desenhe um retângulo em volta de
de comprimento. Qual é a sua interpretação desse re- cada sequência de restrição.
sultado? Explique sua resposta. «
a. Eco (5'- GAATTC - 3 *)
.
17 O que são endonucleases de restrição e por que elas são -
b. flamHI (5' GGATCC - 30
úteis na identificação da variação da sequência de DNA ? -
C Hind\\\ ( 5' AAGCTT 3 ) - /

18. Apó s a digest ão com enzima de restrição, os fragmentos

23. Duas sondas, a sonda A e a sonda B, hibridam muito pró -
ximo uma da outra em uma regi ão do DNA que contém
de DNA produzidos pela digestão com certas enzimas
variação no comprimento do fragmento de DNA quando
têm ‘extremidades coesivas”, enquanto os fragmentos
digerida com a enzima de restrição HincMl Quatro mapas
produzidos pela digestão usando outras enzimas têm
mostram a localização e as dist âncias intervenientes em
.
‘extremidades cegas” Faça a distinção entre os significa - quilobases dos sítios de restrição Hind\\\ e dos locais de
dos desses dois termos.
ligação das sondas A e B. Os mapas correspondem aos
.
19 A sequência de DNA de fita dupla a seguir faz parte de alelos H' até H4.

Jr 2fi-r_ rT-3A—»
um fragmento de restrição que você deseja detectar por 4,0-
autorradiografia .
3' - ATTCATGACGGACTATTCGAGAGCTGATGCAT... 3 '
- -
.

r2M n 7.0- ^ 1
-.
3'- TAAGTACTGCCTGATAAGATCTCGACTACGTA ^ - 5
Identifique qual das seguintes sondas moleculares é a
#
H2
-5,0^ 3,0 4,0
1
1
melhor opçáo para alcançar a reação de hibridaçáo de-
8.0 4,0
sejada. Indique onde a fita superior ou Inferior da sonda
vai hibridar. H*
t t 1
a. 3'- TCATATCGTACCGAA - 5' Sonda Sonda
B A
b. 5'- TCCCTGATAAGATCT - 3'
C 3'- ACAGCCTAGTAAGAT 5-' a. Para o genótipo WH3, quais são as bandas de DNA pre -
d. 3'- ACTGCCTGATAAGCT - 5' vistas em uma autorradiografia usando a sonda A ? E
.
20 As enzimas de restrição reconhecem sequências de DNA usando a sonda B? E usando as duas sondas juntas?
de dupla fita específicas que têm a mesma sequênda b. Para o genótipo WH4, qual é o padrão de bandas pre
em ambas as fitas. Por exemplo, a sequência de restrição visto usando a sonda A ? E usando a sonda B? E usando
para BamH I é 5 ' GGATCC 3' em cada fita de DNA e para as duas sondas juntas ?
 Capítulo 10 Integração das abordagens genéticas: compreendendo a anemia faldforme 357

c. Suponha que uma mulher com o genótipo H' HS tenha mentos da progénie de portadoras altas são exibidos nas
um filho com um homem cujo genótipo seja hPH* . pistas 3 e 4 e o DNA das plantas anãs é exibido na pista 5.
Quais são os quatro genótlpos possíveis de um filho a. Qual mecanismo mutaciona! é o mais provavelmente
desse casal? responsável pela produção do comprimento anormal
d. Quais são os tamanhos das bandas produzidas por do fragmento de DNA correspondente a esse alelo
cada possível filho desse casal usando a sonda A ? E mutado? Explique.
usando a sonda B? b. Em comparação com o comprimento do RNAm do
24. As plantas de uma determinada espécie podem ter o fe alelo normal, o RNAm desse alelo mutado provavel-
nótipo dominante do tipo selvagem, alto, ou o fenótipo mente será maior, menor ou aproximadamente o
.
recessivo, chamado anão A análise genética identificou mesmo? Explique.
o gene da estatura e a análise do DNA das plantas altas 26. Durante a eletroforese em gel de moléculas de DNA linear,
produz um fragmento de DNA de 7,5 kb correspondente por que as moléculas maiores se movem mais lentamente
.
a uma parte do gene O mapa genético do tipo selvagem que as moléculas menores? O que determina a diferença
é ilustrado, com uma autorradiografia mostrando frag- na mobilidade eletroforética das moléculas de RNAm ?
mentos de restrição do DNA de uma planta progenitora
normal (T; pista 1); uma planta alta que carrega uma 27. Quais são as trés caracterí sticas mais importantes das
cópia do alelo mutado (T; pista 2); os dois padrões de proteínas na determinação de sua mobilidade eletro -
fragmento do DNA observados nas plantas altas da pro- forética? Com base em sua resposta, descreva como as
génie (T; pistas 3 e 4) e o padrão de fragmento do DNA substituições de um único aminoácido podem mudar a
observado nas plantas anãs (D; pista 5) . mobilidade eletroforética de uma proteína.
28. Em biologia molecular, as endonucleases de restrição
1.0
t 5.0
1-3'° Gene
7,5
isoladas das bactérias são usadas para clivar o DNA em
.
fragmentos Qual é o papel funcional exercido pelas en-
1 I 7 Sonda
donudeases de restrição nas bactérias das quais são deri-
vadas? { Dica: a endonuclease de restrição produzida por
Progenitores Progénie uma bactéria não consegue cortar o DNA dessa bactéria.)
i T
T T T T D 29. Um gene vegetal completo contendo quatro íntrons e
Pista: 1 2 3 4 5 cinco éxons é carregado em um fragmento de DNA de
© 6,0 kb. A análise do sequenciamento do DNA constata
kb que esse fragmento contém mil pares de bases que la-
deiam a região transcrita do gene e 5 mil pares de bases
7.5 - que são transcritos. Quatro íntrons contêm 3.500 pares
de bases e cinco éxons contêm 1.500 pares de bases. A
4 - análise de northern blotting é realizada no RNAm desse
© gene usando uma sonda que se liga a uma parte de um
dos éxons. O RNAm isolado do citoplasma das c élulas é
.
a Proponha dois eventos mutacionais que poderiam comparado com o RNAm isolado dos núcleos das célu-
causar o pequeno fragmento de DNA que representa o las no northern blotting. Você prevê que todos os RNAm
alelo mutado. terão um comprimento uniforme ou serão detectadas
b. Na análise de northern blotting do RNAm, quais dife- moléculas de RNAm de vários comprimentos no nor -
renças no RNAm você preveria para seus dois mecanis- them blotting?
mos de mutação propostos?
30. Dois cães de caça machos, identificados na figura como
25. Uma segunda cepa de plantas anãs tem uma mutaçáo di-
<? 1 e <£2, se perderam uma noite na Wet Noses Puppy
ferente do mesmo gene identificado no Problema 24 Na . Farm. Uma fêmea (Ç A na figura) ficou prenha e teve uma
segunda cepa, as plantas que carregam uma cópia do alelo .
ninhada de três filhotes (P1, P2 e P3) O proprietário da
mutado produzem um fragmento de restrição do DNA de Wet Noses está desesperado para saber qual dos machos
10,5 kb em vez de um fragmento de 7,5 kb Os fragmentos . é o pai e tem uma análise eletroforética de um marcador
de DNA produzidos pela digestão do DNA das plantas por genético de DNA variável (exibida na figura) para guiar
tadoras altas são exibidos a seguir nas pistas 1 e 2, os frag- - na identificação. O proprietário acha que é o pai dos
.
três filhotes O proprietário está certo ? Explique .
Progenltores Progénie
T 1
T T T T D 9A d1 cfl PI P2 P3
Pista: l 2 3 4 5 n n n n n r ©
rL *
ri J“"! kb
©
kb 10 -
10,5 - 8-
7,5 4 -
2 - ©
©
358 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

.
31 O mapa a seguir ilustra três alelos em um segmento ge- .
a Faça uma lista dos tamanhos (em quilobases } das ban -
.
nómko Os alelos diferem em número e localização das das de DNA detectadas pelo Southern blotting do DNA
.
sequências de restrição A digestão com enzima de res- digerido com enzima de restrição dos organismos com
trição e o Soutbern blotting com a sonda molecular cuja os genótipos D>D' e DW .
posição de hibridaçáo está indicada resultam na detec- .
b 0 DNA digerido com enzima de restrição dos dois
ção de uma única faixa de DNA para cada alelo. organismos é analisado pelo Southern blotting. São
observados fragmentos de restrição de 2,0 kb e 3,5 kb
Sítios de restrição (R)
no Southern blotting de um organismo e bandas de
R R R R
2.0 kb e 3,0 kb são observadas no outro. Quais sáo os
Dr
. 1 1 genótipos desses organismos?
'
c Os organismos com genótipo D1D sáo identifica
‘ r i dos pela dctecção de uma faixa de DNA de 2,0 kb
.
no Southern blotting Por que esse genótipo produz
uma única faixa detect á vel e por que os fragmentos
R R R
de restrição de 1,0 kb e 1,5 kb não são detectados no

D2
i 1 1 Soutbern blotting?

] V 1
R R R

O2
1 1 1
r i Sonda T
——
I 1.0 I 2,0 1 1,5 kb
Estrutura do cromossomo Capítulo

APRESENTA ÇÃO

11.1 Os cromossomos bacterlanos têm uma

organização simples
11.2 Os cromossomos eucarióticos são organizados
como cromatina
11.3 As regiões do cromossomo são diferenciadas
pelo padrão de bandamento cromossómico
11.4 A estrutura da cromatina influencia a
transcrição génica

O cromossomo da £ co / / esta situado no nudeoide da célula bacteriana.

O genoma de uma espécie é a quantidade total de informação

hereditária em um conjunto inteiro de seus cromossomos.
Os cromossomos consistem basicamente em DNA, cuja estrutura
PONTOS ESSENCIAIS
I As proteínas e o superenrolamento associa-
dos comprimem o cromossomo bacteriano
molecular do DNA e importância de sua sequência de nucleotideos em uma região chamada nudeoide dentro
.
são descritas no Capítulo 7 Mas a estrutura e a sequência do da célula.
DNA são uma descrição apenas parcial do genoma. Possivelmente I Os cromossomos eucariótkos contém gran-
des quantidades de proteína que organi-
ainda mais importante para a história do genoma é a maneira que zam e condensam os cromossomos,
o DNA é organizado nos cromossomos. I As bandas cromossómicas identificam uni-
Todo cromossomo carrega uma única molécula de DNA lon- camente cada cromossomo, mas variam
ga. O cromossomo pode ser único, como nas espécies bacterianas com o ní vel de condensação cromossômlca.
I Variações na organização e condensação
haploides; ele pode ser membro de um par de cromossomos ho - dentro dos cromossomos eucarióticos estão
mólogos, como observamos nas espécies diploides, ou pode ha- associadas com a transcrição.
ver vários conjuntos de cromossomos, como os encontrados nas
.
espécies de plantas poliploides Mas, seja qual for sua quantidade
e independentemente de pertencerem aos domínios Archaea,
Bactéria ou Eucarya, todos os cromossomos contém uma mistura
de DNA e proteínas.
A combinação da proteína com o DNA para produzir cro-
mossomos desempenha quatro funções essenciais Primeiro, .
360 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
ajuda a compactar o DNA de modo que ele venha a
se encaixar na célula ou núcleo. Segundo, estabili-
za o DNA e o protege de danos. Terceiro, promove a
condensação cromossômica necessária para a divisão
celular. Rnalmente, a combinação dos cromossomos
com as proteí nas ajuda a regular a replicação do DNA e
a transcrição gênica.
O assunto deste capí tulo é a associaçã o DNA- pro-
teína nos cromossomos e as maneiras em que as qua -
tro funções essenciais anteriormente identificadas são
realizadas. A maior parte do capítulo se concentra nos
cromossomos eucarió ticos, que têm um conjunto mui-
to mais complexo de proteínas associadas ao DNA que
o observado nos cromossomos bacterianos. No entan-
to, começamos com uma discussão sobre os cromosso
mos bacterianos.
11.1 Os cromossomos bacterianos
têm uma organização simples
Bactérias sào organismos haploides que possuem
cromossomos individuais, não pares homólogos. A des-
crição costumeira do genoma bacteriano consistindo
em um único cromossomo que quase sempre é circular
é válida para muitas das espécies bacterianas mais es-
tudadas, como a Escherichui coli e a Bacillus subtilis. O
genoma da £ coli consiste em um ú nico cromossomo
circular contendo aproximadamente 4,6 milh ões de
pares de bases ( Mb ) que codificam aproximadamente
4.200 genes. Todavia, certas espécies bacterianas pos-
suem cromossomos lineares e algumas carregam mais
de um cromossomo.
Cromossomos bacterianos e arqueais
Os genomas da maioria das espécies bacterianas e
arqueais consistem quase exclusivamente em um ú nico
cromossomo circular fechado covalentemente. No en
Tabela 11.1 Diversidade cromossômica entre os dom í nios Bactéria e Archaea
Espécie Tamanho do genoma ( tm Mb)
Mycoplosma genitalium 0,58
Borrelia burgdorferi 1.4
Methanococcus jannaschii 1.6
Haemopbiíus infí uenzoe 1.83
Thermotoga morítime 1 ,89
Vibrio choierae 4.0
Escherichia coli 4,2
Agrobocterium tumefaciens 5, 7
Sinorhizobium meliloti 6,7
tanto, o comprimento total do cromossomo e o n ú mero
de genes que ele conté m variam substancialmente entre
as espécies (Tabela 11.1). O cromossomo individual ou,
nas poucas espécies com mais de um cromossomo, o
maior cromossomo carrega genes essenciais, necessá -
rios para a reprodu çã o, a expressão gé nica e as ativida -
des metabólicas normais realizadas pelo organismo. As
bactérias também transportam rotineiramente vá rias
cópias de um ou mais tipos de plasmídeo, que sào molé-
culas de DNA extracromossòmico que nào fazem parte
.
—
do genoma bacteriano (ver Seção 6.1) Os plasmídeos
carregam genes n ão essenciais genes que não são ne
cessários para as bactérias realizarem seus processos e
tarefas normais.
-
A maioria dos genomas bacterianos e arqueais
conté m um ú nico cromossomo que carrega todos os
genes essenciais para o organismo. Entretanto, em
alguns genomas, os genes essenciais estão situados
em um cromossomo principal e em um ou dois cro-
mossomos adicionais. Por exemplo, o genoma da
Borrelia burgdorferi, o organismo bacteriano que
provoca a doença de Lyme, é composto de um único
cromossomo linear grande com 910 mil pb (0,91 Mb)
e um cromossomo circular menor com 530 mil pb
(0,53 Mb). A Agrobacterium tumefaciens , bactéria
causadora da galha -da -coroa em muitas espécies de
plantas, tem um cromossomo circular de 3,0 Mb, dois
cromossomos circulares muito menores e um cromos-
somo linear de 2,1 Mb. Até hoje, nã o foi encontrado
nenhum cromossomo linear nas espécies arqueais,
mas a archaebactéria Methanococcus jannaschii, á vida
por metano, possu í trés cromossomos circulares em
seu genoma — um grande cromossomo de 1,66 Mb e
dois cromossomos menores, de 58 kb e 16 kb.
Os cromossomos bacterianos e arqueais sào den
samente empacotados, formando uma pequena região
-
chamada nucleoide (ver imagem de abertura do ca -
pítulo) dentro da célula. A organização eficiente do
cromossomo em uma sé rie de alças apertadas toma
essa região notavelmente pequena. Por exemplo, se os
4,6 Mb do nucleoide da £ coli fossem desembrulha -
- dos c assentados ao longo de uma régua, eles mediriam
N ú mero de cromossomos Forma (s ) do( s ) cromossomo( s )
1 Circular
2 Um circular, um linear
3 Todos circulares
1 Circular
1 Circular
2 Ambos circulares
1 Circular
4 Três circulares e um linear
3 Todos circulares

aproximadamente 1.200 pm, um tamanho quase 1 mil
vezes maior que o da própria célula da f . coli. Para ter
uma noção dessa diferença de tamanho, imagine en -
cher uma cá psula gelatinosa como as que você toma
para alergia ou dor de cabeça com um fio de 19 metros!
Condensação do cromossomo bacteriano
Como a £ coli embrulha um cromossomo 1 mil
vezes maior que a própria célula e deixa espaço para as
atividades moleculares como replicaçào, transcrição e
tradução? A resposta é dupla. Primeiro, as proteínas aju
dam a organizar o cromossomo nas alças que embalam
eficientemente o nucleoide e, segundo, o DNA circular
do cromossomo é submetido a um superenrolamento.
O DNA bacteriano está associado a dois grandes
grupos de proteínas, as pequenas proteínas associa
das ao nucleoide e as prote í nas de manutençã o es-
trutural do cromossomo ( SMC ). Várias proteínas
diferentes pertencem ao grupo de pequenas proteí
nas associadas ao nucleoide e todas parecem participar
do encurvamento do DNA que contribui para a dobra
gem e a condensação do cromossomo. As pequenas
prote ínas associadas ao nucleoide, cujas funções são
mais bem caracterizadas, são a prote í na H - NS e a pro -
te í na HU. A Figura 11.1 ilustra uma organização geral
possível para a H - NS e a HU na manutenção das alças
de DNA cromossômico dentro do nucleoide. Ela tam
bém mostra o papel das proteínas SMC, que parecem
se prender diretamente ao pró prio DNA, mantendo- o
em espirais (ou talvez em configurações em forma de V)
que podem formar grandes complexos de nudeoprote-
ínas ( isto é, ácido nucleico e proteína ). Além das prote -
ínas HU, H- NS e SMC, outras proteínas interagem no
nucleoide para compactar o DNA. A identidade exata
e os papéis de cada uma dessas proteí nas ainda são as-
sunto de investigação ativa.
O segundo mecanismo facilitador da compactação
cromossô mica no nucleoide é o superenrolamento do
DNA, que ocorre no nível cromossô mico. Os cromos -
somos circulares fechados covalentemente existem em
As alças menores consistem
A alça média contém DNA
-
com 40 kb em DNA duplex condensado
petas proteí nas SMC
X Ç
,
v
\ como as fontes termais. Uma topoisomerase especia
Alças mantidas na base pelas
-
proteínas HU e H NS
Figura 11.1 Compacta çã o do cromossomo bacteriano.
Cap ítulo 11 Estrutura do cromossomo 361
vá rias formas enroladas; a menos enrolada é a forma
circular relaxada, e a mais enrolada é a forma altamente
superenrolada. O DNA circular relaxado tem a forma
de O , assemelhando-se a uma tira de borracha grande
e náo distorcida. Por outro lado, o DNA no estado al-
tamente superenrolado se parece mais com uma tira
de borracha muito retorcida , que sobrepõe a si pró -
pria e não vai ocupar um ú nico plano. O superenrola -
mento compacta o cromossomo circular de modo que
ele ocupa menos espaço e, assim, se encaixa mais facil-
mente no nucleoide.
- A Figura 11.2 ilustra a visualizaçã o do superenro-
lamento por eletromicroscopia e pela eletroforese em
gel. A micrografia eletrónica na Figura 11.2a mostra
dois cromossomos circulares da mesma espécie bac
teriana, um altamente superenrolado e outro em uma
-
- estrutura circular relaxada. A Figura 11.2b mostra os
resultados da eletroforese em gel para o DNA circular
relaxado, o DNA altamente superenrolado e o DNA em
- vá rios estados de superenrolamento. O DNA altamente
superenrolado bem embalado tem uma mobilidade ele
*
- troforética muito maior ( isto é, migra para mais longe
da origem ) que o DNA circular relaxado. O DNA su
perenrolado existe naturalmente nos cromossomos
-
circulares das bacté rias, mas pode se tomar excessiva -
mente enrolado — como acontece, por exemplo, du -
rante a replica çào do DNA. O enrolamento excessivo
- imprime um estresse de torção insustentável no DNA
e, se esse estresse nào for aliviado, o DNA vai se romper
aleatoriamente. O DNA superenrolado é parcialmente
desenrolado pelas enzimas girase bacterianas, tam
bém chamadas topoisomerases, que relaxam o DNA
-
superenrolado de maneira controlada (ver Capítulo 7,
para obter uma discussão sobre o DNA superenrolado
criado durante a replicaçào e o papel da topoisomerase
no desenrolamento da molécula ).
Duas formas de superenrolamento do DNA são
detectadas nos organismos. O superenrolamento
negativo ocorre pela tor çã o do DNA em volta de seu
eixo no sentido oposto ao da torção da dupla -h élice.
A fita dupla do DNA tem uma torção voltada para a
direita, então o superenrolamento negativo torce o
cromossomo para a esquerda . O DNA superenrolado
negativamente é a forma predominante na maioria dos
organismos. Algumas espécies arqueais, porém, tém
um cromossomo com superenrolamento positivo,
que é torcido no mesmo sentido de torção da dupla -
-
- hélice. Essas espécies são basicamente hipertermófi
las, um termo utilizado para identificar as formas que
vivem em temperaturas muito elevadas. Os hiperter
mófilos vivem em ambientes líquidos muito quentes,
-
-
lizada nessas espécies induz o superenrolamento posi
tivo. Acredita -se que o superenrolamento positivo do
-
cromossomo proporcione mais estabilidade contra os
efeitos da degradação pelo calor elevado que, de outro
modo, poderiam desnaturar a fita dupla ao desestabil í -
zar as pontes de hidrogé nio.
362 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Figura 11.2 DNAdrcular (a )
das bactérias em vá rias DNA superenrolado
formas, (a ) A micrografia
eletrónica mostra cromossomos
superenrolados e circulares
relaxados, ( b) O enrolamento
do DMA bacteriano circular
determina sua mobilidade
eletroforétlca. Na pista 1, o DNA
altamente superenrolado tem
uma mobilidade eietroforétka
muito maior que a do mesmo
DNA circular relaxado. Na pista
2, 5 minutos de tratamento com
topoisomerase para relaxar o
superenrolamento produzem
muitas formas enroladas
diferentes do cromossomo.
Na pista 3, 30 minutos de
tratamento com topoisomerase
convertem grande parte do DNA
para circular relaxado.
Observa çã o gen é tica Os cromossomos bacteriarvos
circulares sáo compactados para formar o nudeoide pelas
proteínas que produzem alças no DNA e pelo superenrola
mento negativo do cromossomo.
- —
11.2 Os cromossomos eucarióticos
são organizados como cromatina
Observamos repetidamente que as células eucarió
ticas são diferentes das células bacterianas de vá rias for
mas. Com relaçã o aos cromossomos, as diferenças mais
importantes são a presença de vários pares de cromos
somos no n úcleo eucariótico e a organização do DNA
eucariótico em cromatina . Assim como sua contraparte
bactéria na, cada cromossomo eucariótico contém uma
dupla - hélice longa de DNA; mas um conjunto diferente
e mais diverso de proteí nas está associado ao cromos
somo eucariótico, seja formando complexos direta
mente com o DNA, seja formando um suporte estru
tural para o cromossomo. As proteínas nucleares que
organizam o DNA eucariótico e produzem a estrutura
de cromatina sfto componentes essenciais da estrutura e
funçã o do genoma. Elas proporcionam um mecanismo
para a eficiente condensaçã o e segregaçã o cromos-
só mica durante a divisão celular e para a organização
cromossô mlca que é parte integrante da regulação da
transcrição génica.
Toda célula nucleada em seu corpo é beneficiá ria
de um feito notá vel da engenharia biomolecular atri
bu í vel à s prote í nas ligadas a seu DNA. Cada n úcleo
contém aproximadamente 6 bilhões de pares de bases
de DNA, divididos em 46 cromossomos. Se todos os
cromossomos fossem tirados do n ú cleo de apenas uma
de suas células e seu DNA fosse destituído das proteí
nas e desenrolado até um estado relaxado, as molécu
DNA circular ( b)
relaxado Pista:
Origem
DNA
circular
relaxado — &
5
gi
E
o
o
•
O
X)
5
c
Ji
DNA
altamente
superenrolado —
las de DNA assentadas de ponta a ponta ocupariam 1,8
metro quase 6 pés. Isso é mais do que 260 mil vezes
maior que o diâ metro do pró prio n ú cleo. O DNA de
seu menor cromossomo isoladamente seria quase 15
mil vezes maior que o diâ metro nuclear! Retomando
a analogia da cá psula medicinal mencionada anterior-
mente na conexào com o cromossomo da E. coli , uma
cá psula representando um n úcleo humano conteria
46 pedaços de fio, representando os 46 cromossomos
humanos, com um comprimento combinado de 190
- metros! Parece incr ível que esse nível de compactação
- possa ocorrer e ainda permita que o DNA seja repli --
cado e transcrito e que os cromossomos sejam efi
- cientemente separados durante a divisão celular. Mas
isso ocorre gra ças à cromatina , o complexo contendo
DNA e proteí nas que se combinam para formar os
cromossomos eucarióticos.
- Composiçã o da cromatina
-
- Quanto ao peso, cada cromossomo eucariótico tem
aproximadamente a metade do DNA c a metade das prote-
ínas. Cerca de metade do componente proteico da croma-
tina consiste de proteína histônicas. As histonas sào cinco
proteínas básicas pequenas, carregadas positivamente e
fortemente ligadas ao DNA carregado negativamente.
Igualmente abundante, porém mais diverso, há um con -
junto de centenas de outros tipos de proteínas de ligação
ao DNA chamados, por padrão, proteínas não histônicas.
Esse grande conjunto de proteínas desempenha uma série
- de tarefas no n úcleo, nem todas elas definidas.
Os cinco tipos de proteínas histônicas na cromatina
são designadas Hl , H 2A . H2B . H3 e H4 (Tabela 11.2).
A Hl é a maior e mais variá vel das proteínas hist ônicas,
contendo de 215 a 244 aminoácidos, dependendo da es-
- pécie. As outras quatro histonas sào consideravelmente
- menores e de tamanho mais uniforme, contendo entre 102

Tabela 11.2
Histona * Amino- Peso
CaraeterístJcas das proteí nas histônicas
Quantidade Localização
ácidos molecular de amino
bá sicos / ( D) á cidos
- a morfologia de “colar de contas" de cromatina. As "con
ácidos
Hl 5,4 23.000 224 DNA ligador
H 2A 1,4 13.960 129 Nucleossomo
H2 B 1,7 13.774 125 Nucleossomo
H3 1
* 15.273 135 Nucleossomo
H4 2,5 11.236 102 Nucleossomo
'
Prote í na* histônicas do timo bovino
e 129 aminoácidos. Entre os eucariotas, há uma conser-
vação muito forte da sequência de aminoácidos das pro-
te ínas histônicas, sugerindo uma pressã o evolutiva muito
grande para reter a estrutura e a função de cada uma delas.
Uma comparação das sequências de aminoácidos da H4
em vacas e em plantas de ervilha, que divergiram do an-
cestral comum das plantas terrestres e animais mais de
500 milhões de anos atrás, identifica diferenças em ape-
nas dois aminoácidos dentre os 102 que compõem a pro-
teína. A comparação nos diz que, desde a época em que
plantas e animais compartilharam pela última vez um an -
cestral comum, a pressão evolutiva extraordinariamente
forte manteve a identidade do DNA da H4 e a sequência
de aminoácidos entre os organismos. Esse exemplo radi
cal de conservação evolutiva fala sobre a importância das
hislonas na organização cromossômica eucariò tica.
As hLstonas são os agentes principais na embalagem
da cromatina. Duas moléculas de cada uma das quatro
— —
histonas H2A, H2B, H3 e H4 unem -se para formar
um nucleossomo octamé rico (oito membros) (Figura Bá-
sica 113). Os nucleossomos se montam após a transcrição
e a tradução dos genes histona que estão presentes em vá
rias cópias nos genomas eucariótkos. As proteí nas tradu
zidas em primeiro lugar se reú nem em dímeros contendo
duas histonas diferentes cada: os dímeros histona H2A
- H2B contêm uma molécula cada de histona 2A e 2B, e os
dímeros H3- H4 contêm uma molécula cada de histona 3
e 4. A evidência atual indica que os nucleossomos são for-
mados em etapas que começam com dois dímeros H3- H4
se juntando para formar um tetrâmero de histona. De-
pois da formação do tetrâmero, dois dímeros H2A-H2B
se associam para formar o nucleossomo octamérico final.
O nucleossomo totalmente montado é uma estrutura de
extremidade plana com aproximadamente 11 nm de diâ
metro por 5,7 nm de espessura ( ver Figura 113a). Um
trecho de DNA de aproximadamente 146 pb de compri-
mento dá 1 % de volta em tomo de cada partícula central
do nucleossomo. Essas voltas do DNA em tomo do nu
cleossomo são o primeiro nível de condensação do DNA,
condensando-o aproximadamente sete vezes.
Os 146 pb de DNA enrolados em volta de uma par
tícula central se chamam DNA centrai. As micrografias
eletrónicas das Fibras de cromatina em seu estado mais
Cap ítuloH Estrutura do cromossomo 363
condensado exibem uma série regular de estruturas cir -
culares encadeadas por filamentos de conexão (ver Fi
gura 11.3b). Essa forma de cromatina é identificada como
-
tas" são os nucleossomos, que têm pouco mais de 11 nm
-
de diâ metro, e o "colar" se chama DNA ligador . O com -
primento dos segmentos do DNA ligador varia bastante
entre os organismos, embora em cada espécie os nucle-
ossomos ocorram em intervalos regulares. Na levedura
Saccharomycês cerevisiae, o DNA ligador tem de 13 a
18 pb de comprimento. O DNA ligador tem aproxima-
damente 35 pb de comprimento na mosca -da-fruta, a
Drosophila. Nos seres humanos e em outros mamíferos,
DNA ligador é muito comprido
—
o DNA ligador tem de 40 a 50 pb; e nos ouriços- do- mar o
com aproximada
mente 110 pb. Vimos que o DNA central tem 146 bp de
comprimento e, quando adicionamos a ele o compri-
-
mento do DNA ligador, o número de pares de bases em
cada repetição do nucleossomo é de aproximadamente
160 a 260. O comprimento da repetição do nucleossomo
é uniforme dentro do genoma de uma determinada es-
pécie. Essa forma de contas em um colar da cromatina é
identificada como fibra de 10 nm, já que o di â metro dos
nucleossomos é de aproximadamente 10 nm.
A imagem por microscopia eletrónica criogénica
(crio-EM) tem produzido imagens detalhadas da estru-
tura do nucleossomo e tem revelado os prováveis pontos
de interação entre a partícula central do nucleossomo oc-
- tamérico e o DNA central. Timothy Richmond e colabora -
dores descreveram a estrutura cristalina do nucleossomo
.
observado na resolução de 2,8 À ( Figura 11.4) Os 146 pb
de DNA envolvem a partícula central em 1,65 volta. Ocor -
rem interações moleculares específicas entre as caudas
N-terminais das proteínas histônicas que formam o nu-
cleossomo e o DNA central. Em um capítulo posterior,
discutimos essas interações em detalhes e consideramos
- o papel que elas exercem na estrutura da cromatina e na
- regulação da expressão gênlca (ver Capítulo 15).
A fibra de 10 nm é um estado anormal da croma -
- tina . Para atingi- lo, a cromatina precisa ser tratada
quimicamente e mantida em condições não encontra-
das nas células. Em condições celulares normais, a cro -
matina forma a fibra de 30 nm , que é seis vezes mais
condensada que a fibra de 10 nm (ver Figura 11.3c). As
micrografias eletró nicas e a modelagem molecular nos
ajudam a visualizar como a fibra de 30 nm é montada.
Se considerarmos a fibra de 10 nm como um tipo de es -
trutura primária da cromatina, então a fibra de 30 nm
- é uma estrutura secundá ria. Ela é produzida pela coa -
lescência da fibra de 10 nm em um filamento cil í ndrico
dos nucleossomos enrolados, o que é frequentemente
chamado de estrutura solenoide. Cada volta do sole-
- noide conté m de seis a oito nucleossomos. O diâ metro
do solenoide é de aproximadamente 34 nm.
A proteína histônicas Hl desempenha um papel -
- chave na estabilização da fibra de 30 nni As longas ex-
tremidades N - terminais e C- terminais da proteína Hl se
prendem às partículas centrais do nucleossomo adjacente.
364 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

FIGURA B Á SICA 1 1.3

 CapítuloH Estrutura do cromossomo 365

AN Á LISE GENÉTICA
A espécie vegetal Arabtdopsis thaliana tem um genoma contervdo aproximadamente 100 milhões
de pb de DNA. Para este problema, suponha que a Arabidopsrs tenha um DNA central com 145 pb e
um DNA ligadorcom 55 pb.
a. Determine o número aproximado de nucleossomos em cada núcleo.
.
b Determine aproximadamente quantas moléculas de proteína histônica H4 são encontradas em cada núcleo.

Estrat é gias de solução Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema pergunta o número de nucleossomos por núcleo e a respeito
este problema e explique a natureza .
da composição de histona dos nudeossomos A resposta exige as quantidades
da resposta solicitada. aproximadas de nucleossomos e de moléculas de histona M4 por núcleo.
.
2 Identifique as informações criticas . .
2 O tamanho aproximado do genoma da A thaliana é fornecido em pares de
fornecidas no problema. bases, assim como os comprimentos de seu DNA central e llgador.

Deduzir
.
3 Descreva o número de pares de bases .
3 O envoltório de DNA central do nucleossomo tem 145 pb de comprimento. O
de DNA que envolvem cada núcleos- DNA ligador entre os nucleossomos tem aproximadamente 55 pb de compri-
somo e afirme o número aproximado mento. No total, existe apenas um nucleossomo para cada 200 pb de DNA.
no trecho entre os nucleossomos.
Dica: 0 nudeossomo é cnvcfctdopeto
DNA central e os trechos entre os nudeos-
scroos consistem em DNA IkjaOor.

.
4 Descreva a composição do nudeos .
4 Os nucleossomos são octâmeros de proteína histônica consistindo em duas
somo. moléculas cada de H2A, H2B, H3 e H4 .
Solucionar Resposta a

.
5 Calcule o número de nucleossomos .
5 Se estimarmos que um novo nucleossomo se associa com o DNA a cada 200 pb,
em cada núdeo de A. thaliana. aproximadamente, o número aproximado de nucleossomos por núcleo é
1 x 10* nudeotideos/núdeo
= 5 x 10* nuclcossomos/núdeo
2 x 101 nudeotideos/nudeossomo
Resposta b
.
6 Calcule o número de moléculas de .
6 Existem duas moléculas de H4 por nucleossomo, assim ( 2)(5 x 105) = 106, ou um
H4 nos nucleossomos de um núdeo milhão de moléculas de H4 por núdeo.
de Arabidopsis.

Para praticar mais, ver Problemas 4, 7 e 11 .

Vista de tr ês quartos H2B Vista lateral
Figura 11.4 Estrutura do nucleossomo Arte-final.
gerada em computador da estrutura cristalina em raios X
do nucleossomo na resolução de 2,8 À por microscopia
crioeletrônica. As oito moléculas de histona são visí veis em
um conjunto codificado por cores.
A proteína Hl puxa os nucleossomos para um conjunto
solenoide ordenado e reveste o interior da estrutura. A
análise experimental mostra que a cromatina da qual a
Hl foi removida pode formar fibras de 10 nm, mas nào fi-
bras de 30 nm. A cromatina existe em um estado de fibra
de 30 nm ou em um estado mais condensado durante a
-
interfase. A An á l í ie Gen ética 11.1 vai guiá lo durante a in
terpretação da organização da cromatina.
-
Observa çã o genética A unidade básica da cromatina
eucariótlca consiste no DNA central embrulhado em volta
das proteínas histômeas H2A, H2B, H3 e H4, que formam uma
partícula central de nucleossomo com oito membros que é
envolvida por 146 pb de DNA formando os nucleossomos. A
proteí na histônicas H1 se associa ao DNA ligador e participa
na condensação de ordem superior da cromatina.
366 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Estrutura de ordem superior da cromatina

Além do estágio de condensação de 30 nm, a compac -
taçáo da cromatina explica a estrutura dos cromossomos
da interfasc e o processo de condensação cromossômica
na fase M. As proteínas não histônicas desempenham
várias funções em ambas as fases. A estrutura cromossô-
jypt
«V -
mica na interfase resulta da formação de alças de croma - .t
•v

tina similares ao DNA bacteriano superenrolado ( ver Fi -

gura 11.3d ). As alças tém tamanho variável, contendo de •
• \ m
dezenas a centenas de pares de quilobases e consistindo V •!

em alças de DNA de fibra de 30 nm em uma categoria de

r-
*
<¥iS
proteínas n ào histônicas que sào a base da forma do cro-
mossomo. O diâmetro da alça de cromatina é de aproxi- ryv mm- *rv*
\ -3

madamente 300 nm, então a alça de cromatina se chama

fibra de 300 nm. Com o andamento da condensação, as
alças de cromatina formam as cromá tides irmãs. Na me
t áfase, a condensação cromossômica atinge seu apogeu,
-
resultando em cromossomos facilmente visualizados por
microscopia ( ver Figura 1 l.3e).
O suporte cTomossómico é um arcabouço fila -
mentoso de proteínas não histônicas que confere seu
formato aos cromossomos. Esse suporte é, de alguma
V í.V
forma, similar à superestrutura de aço que confere for
mato, resistência e apoio a um prédio. A Figura 11.5
- * *
f
-
v

mostra o suporte proteico de um cromossomo da metá -

fase após ser destitu ído do DNA. A forma do suporte é
claramente reminiscente da estrutura cromossômica da
metáfase, consistindo em cromá tides irmãs unidas no
centrômero, que é visível como uma constrição perto
do ponto médio do suporte.
As alças de cromatina contendo 20 mil a 100 mil pb
são ancoradas ao suporte cromossô mico por outras
proteínas não histônicas em locais chamados regiões
de associa ção à matriz ( MARs ); ver Figura 11.6. O
modelo de posicionamento radial dos cromossomos
prevê que as alças de cromatina se juntam em estrutu
ras tipo roseta e que sào ainda mais comprimidas pelas
proteínas não histônicas. A compactação total da cro
matina alcançada pela metáfase é aproximadamente
250 vezes maior que a da fibra de 300 nm já condensada .
A condensação cromossômica de ordem supe-
rior exerce um papel crítico em duas caracter ísticas
especiais da gen ética cucarió tica. Primeiro, o processo
geral de condensaçã o cromossômica compacta os cro - o gene A será encontrado bem longe de uma MAR, en
mossomos a um grau que lhes permite serem separa
dos eficientemente na anáfase. Segundo, as alças de
cromatina formadas durante a condensação exercem
um papel na regulação da expressão gé nica. A análise
recente da ligação do DNA ao suporte cromossômico
indica que certas sequências de DNA repetitivas sào
comuns nas MARs. Essas sequ ências, chamadas ATC,
2 pm
Fig ura 11.5 Suporte cromossômico de um cromossomo na
.
metáfase. Destitu ído de cromatina o suporte cromossômico
restante é composto de proteínas nào histônicas cuja forma
geral é reminiscente de um cromossomo da metáfase.
cularmente nos segmentos das alças que são distantes
das MARs. Desse modo, as alças maiores tendem a ter
- transcriçã o mais ativa que as al ças pequenas. O posicio -
namento das sequências ATC por todo o genoma pa -
rece desempenhar um papel nos padrões dependentes
- do tipo celular da formação das alças de cromatina de
um determinado cromossomo que podem levar à ex -
pressão de certos genes em um tipo de célula, mas n ão
em outra. Por exemplo, se o gene A for designado para
expressão em certo tipo de célula, mas o gene B nã o for,
-
quanto o gene B estará próximo de uma MAR . Os deta -
- lhes moleculares desse modelo sã o mais claros nos eu -
cariotos unicelulares que nos mamíferos, mas está claro
que a posição de um gene dentro do n úcleo é um fator
em sua transcrição, como discutimos em uma seção
posterior (ver també m o Capitulo 15).

--
são ricas em pares de bases A T e té m uma concentra
ção alta de C em uma fita. As sequê ncias ATC são en
contradas por todo o genoma. Consequentemente, elas
podem se associar às MARs em padrões diferentes em
tecidos diferentes. A evidência experimental indica que
a transcrição ativa ocorre nas alças de cromatina , parti-
Observa çã o gen é tica A condensação cromossòmka
progressiva durante a prófase resulta da compacta ção da
fibra de 30 nm em estruturas de ordem superior. As proteínas
de suporte formam a superestrutura cromossômica para a
condensação da cromatina que. no fim das contas, produz
a forma caracteristica dos cromossomos da metáfase.
 Cap ít u l o H Estrutura do cromossomo 367

Reinas de suporte formam alças de cromatina. Capítulo 7). No entanto, essa discussão não mencionou
a presença dos nucleossomos ou a necessidade de mo-
Proteínas de suporte ná o histònicas vê-los temporariamente para permitir a replicaçáo dos
Regi ão de
associação à
genomas eucariótícos. Também não mencionou o pro-
matriz ( MAR) cesso igualmente essencial de adicionar nucleossomos
-
ao DNA recém sintetizado após a passagem da forquilha
de replicaçáo ou a montagem de novas proteínas h ístô-
nicas que sâo necessárias em decorrência da duplicação
do DNA em consequ ê ncia da replicaçáo.
A presença dos nucleossomos levantou muitas ques
Al ças de tòes para os pesquisadores. Os nucleossomos antigos
cromatina são perdidos durante a replicaçáo? Novos nucleosso-
mos são sintetizados durante a replicaçáo? Os nucleosso-
mos antigos permanecem intactos, de modo que são com
postos inteiramente de proteínas histònicas antigas ou
-
inteiramente de proteínas novas? Independentemente de
os nucleossomos permanecerem intactos, como eles sâo
o As alças formam uma roseta. distribuídos para as cromátides irmãs? A evidência expe
rimental coletada por muitos pesquisadores constata que
as histonas antigas são retidas como dímeros, tetráme-
ros ou moléculas individuais, que a maioria dos nucleos-
Cromatina
interf ásica
somos presentes após a replicaçáo é pelo menos parcial -
mente montada a partir de componentes nudeossómicos
antigos e que a maioria dos nucleossomos contém alguns
dímeros de proteína histònica recém -sintetizados.
O modelo atual propõe que, à medida que a for-
-
põem em subconjuntos proteicos
—
quilha de replicaçáo passa, os nucleossomos se decom
especificamente,
tetrâ meros H3-H4 e d í meros H2 A -H 2B. Os tetr àmeros
H3-H4 se associam imediatamente, mais ou menos de
modo aleató rio, a um dos produtos de crom á tides irmàs
da replicaçáo. Por outro lado, muitos dímeros H2 A- H2 B
aparentemente se desmontam em proteínas histònicas
individuais e depois rapidamente se juntam em d ímeros
com parceiros proteicos, antigos ou recé m -sintetizados.
o As rosetas sào comprmidas em feooes
Ocorre uma nova síntese de todas as quatro proteí -
Proteínas de nas em quantidade suficiente para dobrar o numero de
suporte não nucleossomos. Nesse processo, novos dímeros H2A - H 2B
histònicas e tetrà meros H3- H4 sào formados. Alguns novos díme-
Cromossomo
metafá slco
-
ros H2A H2B se unem a tetrà meros H3- H 4 antigos já
no DNA, enquanto outros novos dímeros H2A - H2B se
unem a novos tetràmeros H3-H4 para formar nucleos-
somos. Desse modo, aproximadamente a metade dos
nucleossomos montados durante a replicaçáo é com-
-
posta de antigos tetrà meros H3 H4, distribu ídos aleato-
riamente para as cromátides irmãs e combinados com
dímeros H2A-H2B novos ou antigos. Os nucleossomos
Figura 11.6 Modelo de posicionamento radial da remanescentes contém novos H3-H4 e componentes
condensa ção da cromatina. A cromatina é presa às
regiões de associação à matriz (MARs ). 0 As proteínas não
H2A- H2B novos ou antigos ( Figura 11.7) .
histònicas organizam as alças de cromatina em rosetas. 0 As
rosetas são comprimidas nos cromossomos metafà sicos.
Remodelação da cromatina
A onipresença dos nucleossomos ao longo do DNA
Distribuição e síntese dos nucleossomos
ção da transcrição. Especificamente, quando as proteínas
-
eucariótico apresenta um desafio particular para a inicia
durante a replicaçáo
de ligação ao DNA buscam as sequências de consenso
Nossa discussão da replica çáo do DNA descreveu os do DNA nas quais iniciam a transcrição, sua ligação a
processos enzimá ticos necessá rios para sintetizar uma essas sequências pode ser atrapalliada pela presença dos
-
nova fita - filha do DNA em uma fita molde do DNA ( ver nucleossomos. Para permitir a liga ção das proteínas de
 368 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Nucleossomo compõe os nucleossomos. As modificações químicas, às

vezes chamadas marcas epigenéticas ou modificações
epigenéticas, consistem na adição e remoção de grupos
químicos como, por exemplo, os grupos metila (metilaçáo
e desmetilação), grupos acetila (acetilação e desacetilaçáo)
e grupos fosfato (fosforilação e desfosforilação) perto das
-
extremidades aminoterminais (N terminais) das pro -
teínas histônicas. O efeito dessas marcas epigenéticas é
alterar a firmeza com que o DNA e os nucleossomos se
ligam. Quanto mais firme a associação, menos provável
é a futura ocorrência da transcrição; e, inversamente, a
associação menos firme entre os nucleossomos e o DNA
aumenta a probabilidade de transcrição. Embora haja ex
ceções, muitas vezes é o caso de a metilação das caudas N
--
terminais dos nucleossomos levar à maior compactaçào
da croma tina que reduz a transcrição, enquanto a aceti -
laçào das caudas de histona afrouxa a cromatina e leva a
mais transcrição. A fosforilação é deiectada tanto na cro-
matina mais compacta quanto na cromatina mais frouxa.
As modificações epigenéticas alteram a força de associa-
Nucleossomo çã o entre os nucleossomos e o DNA, podendo levar ao
^
parental deslocamento dos nucleossomos ( isto é, à remodelação da
cromatina ) para tomar as sequências de DNA mais aces-
Sentido de síveis às proteínas de ligação ao DNA.
K replicaçáo do DNA
As modificações epigenéticas que remodelam a
cromatina são transmitidas durante a divisão celular ou
Maquiná riode reproduçã o. Repare que, apesar de alterarem a capaci -
t
replicaçáo do DNA
-
— “Antigo" telr á mero
dade das células para transcrever genes c regiões do ge
noma , elas nã o alteram a sequê ncia de DNA. A retenção
tâ H3-K4 “Antigas ’ proteínas das histonas antigas durante a replicaçá o do DNA pro-
1

H2A e H2 B porciona um mecanismo para a retenção da "mem ória"

Ci epigcn ética que pode ser transmitida para as células- fi-
lhas. Ao mesmo tempo, as modificações epigen éticas da
expressão genica são reversíveis, já que consistem em
Nova proteina um conjunto de grupos qu í micos ligados às proteí nas
H 2A histô nicas. O n ú mero e o padrão das modificações epi-
gené ticas nas caudas histona N- terminais sã o um com -
ponente complexo, mas cada vez mais bem compreen -
Nova proteína dido, da regulação da transcriçã o gênica nos eucariotos
H2 B ( para obter mais detalhes, ver Capítulo 15).
Novo &
tetrâ mero
H3-H4 Observa çã o gené tica Os nucleossomos se prervdem
Figura 111.7 Herança dos nucleossomos após a menos ao DNA durante a replicaçáo e são parcialmente des-
replicaçáo do DNA. Após a passagem da forquilha de montados, sendo reconstitu ídos posteriormente. As caudas N-
-
replicaçáo, os‘antigos" tetr â meros H 3 H 4 sâo atribu ídos terminais de cada proteina histônicas dos nucleossomos sâo
- - -
aleatoriamente à s fltas filhas e os tetrâ meros H3 H4 recém acetiladas para afrouxar a cromatina e gerar mais transcrição,
-sintetizados povoam as fitas não ligadas pelos tetrâ meros enquanto as caudas histona são metBadas para compactar a
antigos. Os d í meros H2 A H2 B antigos e novos se unem aos cromatina e reduzir a transcriçã o.
tetrâ meros para formar nucleossomos completos.

iniciação da transcrição, os nucleossomos precisam ser

deslocados para expor a sequê ncia promotora c outras
sequ ências de consenso do DNA. Esse processo de des-
locamento dos nucleossomos se chama remodelação da
cromatina, pois o grau de compactaçào da cromatina é
alterado pelas mudanças nos nucleossomos.
A remodelaçã o da cromatina é feita por meio de
modificações químicas em cada proteína histô nica que
11.3 As regiões do cromossomo sã o
diferenciadas pelo padrão de
bandamento cromossômico
A condensa ção cromossô mica, guiada pelo empa -
cotamento da cromatina, atinge o seu m áximo no final
da metáfase. Usando microscopia, os citogeneticistas
 Cap ítuloH Estrutura do cromossomo 369

conseguem distinguir cada cromossomo por seu tama

nho global e forma e pelos padrões de handas cromossó-
-
Metacêfitrico Submetacé ntrico Acrocèntrico Telocéntrico'
micas claras e escuras, ao longo do comprimento dos ômero
Tet
cromossomos, produzidas pelo seu tratamento com co-
rantes específicos. Braço
curto
Sat élite
(Sem o
Estruturas cromossômicas e padrões Centrômero braço p)
replicado
de bandamento
roço
O centrô mero divide cada cromossomo em seg
mentos conhecidos como bra ços cromossò micos,
- longo
(q )

que têm comprimentos desiguais. Quase invariavel

mente, um braço cromossômico, chamado braço curto
e també m conhecido como bra ço p, é mais curto que
o outro braço, conhecido como braço longo ou bra ço
q (Figura 11.8). A posição do centrômero determina os
comprimentos relativos dos braços curto e longo, le-
vando aos termos descritivos das formas dos cromos
somos metaf á sicos. Um cromossomo metacé ntrico
tem um centrômero localizado mais ou menos central
mente e braços cromossòmicos de tamanhos similares.
Os cromossomos submetacé ntricos têm um centrô
mero mais próximo de uma extremidade, produzindo
um braço caracteristicamente mais curto que o outro.
O centrômero dos cromossomos acrocéntricos é pra -
ticamente na extremidade do cromossomo. O “ braço
curtoM dos cromossomos acrocéntricos consiste fre-
quentemente em DNA altamente repetitivo (conhecido
como satélite). Os cromossomos telocêntricos tém um
centrô mero terminal e nenhum braço curto.
Uma exibiçã o fotográ fica organizada de um con -
junto completo de cromossomos para uma espécie se
chama cariótipo e apresenta os cromossomos agru -
pados em pares homólogos, em ordem decrescente
de tamanho global, dos autossomos. Os cromossomos
sexuais são identificados separadamente. Os cromos -
somos em um cariótipo podem ser corados com vá rios
corantes para produzir o padrão de bandamento ca
racteristico de cada tipo de cromossomo no conjunto.
Um cariótipo humano contendo 22 pares de autosso
mos ( numerados de 1 a 22) e um par de cromossomos
sexuais é apresentado na Figura 11.9.
Durante o final dos anos 1960 e o in ício dos anos
1970, foram desenvolvidas várias técnicas de banda -
mento cromossômico. principalmente por meio da
experimentação com cromossomos humanos e de ou
-
Figura 11.8 Forma do cromossomo. A posição do
centrômero e a proporção dos tamanhos do braço longo
( bra ço q) e do bra ço curto ( braço p) na met áfase determinam
a forma do cromossomo.
- Podem ser utilizados diferentes corantes nos cromos-
- somos para fazer que as faixas (bandas) apareçam. Certos
corantes requerem que os cromossomos sejam primeiro
- tratados com tripsina, uma enzima proteinase, para re-
mover algumas das proteínas que compõem a cromatina.
Após a lâmina de microscopia contendo os cromossomos
com faixas ter sido fotografada, a micrografia digital é ma -
nipulada para agrupar os homólogos. As imagens digitais
de quaisquer cromossomos curvados ou torcidos podem
ser manipuladas para endireitar essas imagens durante a
montagem do cariótipo. Nos anos anteriores ao advento
da fotografia digital, as micrografias eram capturadas
como imagens analógicas. Os cariótipos criados a partir
dessas imagens mais antigas eram criados cortando as fi -
guras de cada cromossomo e colando os homólogos em
seguida uns dos outros.
Os padrões de bandamento cromossômico produ -
zidos por diferentes corantes correlacionam se uns com-
os outros. Um simpósio internacional em Paris, França,
- foi convocado em 1971 para chegar a um acordo quanto
ao padrã o de bandamento de cada cromossomo hu -
-
1/ H it H H l í 1

tros mam íferos. O bandamento cromossômico permite

que os geneticistas identifiquem com precisão cada cro-
mossomo e segmento cromossômico em um cariótipo.
Vi W Vi U H » >
7 0 9 10 11 12

A geração de um cariótipo e o bandamento cromos-

sô mico são um processo de vá rias etapas. Primeiro, as I I II I t I I I I I I
11 14 18 1C 17 10
células são cultivadas e depois detidas na metáfase ou
ligeiramente antes, na fase M ( prometáfase ou final da
prófase), pela adição de certas substâncias químicas. A It ti * 4 1 4 (I
-
interrupção do ciclo celular maximiza o n ú mero de cé
10 20 21 22

lulas na cultura que podem conter cromossomos bem

Figura 11.9 Cariótipo humano normal. Compostos
condensados. Em seguida, cada célula da cultura celular
fluorescentes e cores melhoradas por computador tomam
detida é deixada em uma lâ mina de microscópio. Isso cada cromossomo caracteristico.
arrebenta a célula e rompe a membrana nuclear, permi
tindo que os cromossomos sejam derramados.
- 1 N . R .T.: em humanos não hi telocé ntrico.
370 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

mano e também quanto a uma nomenclatura padroni

zada para discutir os padrões. Esses padrões continuam
- cromossomo 5 indicada na Figura 11.10a. Um cariótipo
dos cromossomos metafásicos humanos contém aproxi -
em uso hoje. O padr ão para a nomenclatura do banda
mento cromossô mico humano se baseia em um padrã o
- madamente 300 bandas' G claras e escuras entre os 23
cromossomos ( 22 autossomos e o cromossomo X ),
de bandamento cromossô mico conhecido como ban - O bandamento cromossômico usando Giemsa c
damento G (Giemsa ) , que resulta quando o corante outras técnicas foi, em uma é poca , limitado aos cromos-
Giemsa é utilizado para criar faixas claras e escuras em somos na metáfase. No entanto, recentemente técnicas
um padrão diferente em cada tipo de cromossomo hu - avançadas permitiram que os citogeneticistas corassem os
mano. Esses padrões caracter ísticos e reproduzíveis são cromossomos mais cedo no ciclo celular. O bandamento
facilmente reconhecíveis pelos geneticistas. cromossômico no final da prófase e na prometáfase re-
sulta em até 2 mil faixas cromossô micas altamente repro-
A numeração das regiões de bandas maiores e me-
duzíveis. Cada faixa cromossômica , independentemente
nores começa em cada centrô mero cromossômico e se
de seu tamanho, contém muitas alças de cromatina e
move para fora ao longo de cada braço na direção do telô-
entre 1 milliào e 10 milhões de pares de bases de DNA.
.
mero ( Figura 11.10 ) As regiões maiores são subdivididas Quando um cariótipo tem um n ú mero de cromos -
para permitir uma designação para cada região de faixa somos anormal, os padrões facilmente reconhecidos
clara e escura de um cromossomo. Cada faixa recebe tornam a identificação dos cromossomos ausentes ou
uma designação que especifica o n ú mero do cromos- adicionais relativamente simples. De modo similar, as
somo, o braço cromossômico e a localização da faixa. Um reorganizações provocadas pela inserção, remoção ou
exemplo é 5q 2.3.1, que é a faixa escura no braço longo do outras alterações na estrutura de um cromossomo são
detectadas pelas alterações do bandamento cromo&só-
Padr ões normalizados de bandamento e designações de mico padrão. Além disso, as semelhanças nos padrões
referé nda dos cromossomos humanos 1 a 5. das bandas dos cromossomos que podem ser observadas
nas comparações dos cromossomos de espécies relacio -
: nadas possibilitam rastrear a evolução do n ú mero e da
.I
71
ii
estrutura dos cromossomos reconstruindo o provável ca-
ii 71 riótipo dos ancestrais comuns (ver Capítulo 13) .
1 4
J
2 r~3 ií
3X
2 2
2l 1 Heterocromatina e eucromatina
2

2
6
J
J I?
4i
« 2 A condensa ção da cromatina varia durante todo
I
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.11
.11
1 15I. 2
t J
4

.
U J » o ciclo celular , mas também varia de uma parte de um
cromossomo para outra. H á uma evidência clara de que
—.
n J
2
J
2
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1 52
i
1
J a última variação está diretamente relacionada com a
2 II
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4 4
1
transcrição gé nica. Durante a interfase, as regiões cro-
J 4
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1 —
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II mossô micas contendo os genes expressos ativamente
I
1 L»
í ; I
2
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“4 I 1 J 2 I 4 geralmente possuem um grau de condensaçã o da cro-

2* 1 i
matina menor que as regiões cromossômicas que não
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j I
74.3j
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J
f contêm genes expressos. Essas regiões de expressão
ativa são identificadas como eucromatina ou regiões
--
2
lis : eucromáticas. A maioria dos genes expressos está situa
4 n
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2
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3 l

a 2
1
4 da nas regiões eucromá ticas, onde a condensação é vari
ável durante o ciclo celular. As regiões cromossômicas
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-
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eucromá ticas são regiões de pouca coloração nos cro-
4 2
5 i li• il
• '1 li ?! 21 I
* mossomos com bandamento G. Inversamente, regiões
V 2
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2
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2
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.1 cromossômicas nas quais a cromatina é altamente con
densada contêm heterocromatina e se chamam regiões
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heterocromáticas. Estas contêm muito menos genes
expressos que as regiões eucromá ticas. A heterocroma -
L 4i
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1
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2
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L
9

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Li
4
hl 5
tina é identificada como uma região cromossômica de
coloração escura nos cromossomos com bandamento G.
Duas classes distintas de heterocromatina são de-
tectadas. A heterocromatina facultativa exibe n íveis
CAAAS
variá veis de condensaçã o. Às vezes, a heterocromatina
Flg ura 1 1 1 0 Padrões normalizados de bandamento facultativa é altamente condensada, enquanto outras
cromossômico humano. Cromossomos humanos 1 a 5 no vezes é menos condensada. A transcrição dos genes nas
final da prófase. As regiões heterocromáticas são exibidas
como faixas cinzentas e negras e as regiões eucromá ticas,
como faixas brancas. 2 N.R.T.: normaLmer.te é de 400 a 550 bandas cromossômicas.

regiões de heterocromatina facultativa normalmente
se correlaciona com períodos de menor compactação.
Por outro lado, a heterocromatina constitutiva ò um
estado heterocromá tico permanente e contém muito
poucos genes expressos, É composta predominante -
mente de sequências de DNA repetitivas. Ela é particu-
larmente proeminente nos teló meros cromossômicos e
nas regiões centromé ricas dos cromossomos.
Nem a heterocromatina constitutiva telomérica
nem a centromérica contê m genes expressos. (Ver Ca
pítulo 7 para obter uma descrição de como as repeti -
ções tclom éricas são sintetizadas pela telomerase.)
Estrutura do centrômero
As sequê ncias de DNA repetitivas nos centròmeros
facilitam a ligação das proteínas de cinetócoro especiali-
zadas e os microt ú bulos das fibras do fuso que atuam na
divisão dos cromossomos homólogos e das crom á tides
irmã s durante a divisão celular ( ver Figuras 3.4 e 3.6).
Essas sequ ê ncias repetitivas são organizadas em uma
forma não encontrada em nenhuma outra parte dos
cromossomos. No início dos anos 1980, John Carbon
e Louis Clarke descreveram o DNA centromé rico, ou
sequê ncias CEN, na levedura Saccbaromyces cerevisiae.
Carbon e Clarke analisaram as sequências de DNA
de 16 centròmeros de levedura e descobriram que cada
um tinha uma sequência CEN ligeiramente diferente, em
bora cada centrômero desempenhe a mesma função. As
sequências CEN abrangem de 112 a 120 pb e são divididas
em três dom ínios, designados elementos DNA centrom é-
ricos (CDE) I, II e III. A Figura 11.11a mostra quatro exem -
plos de sequências CEN de levedura que ilustram a seme
lhança global, mas também a variação sutil, das sequências
centroméricas. As sequências de consenso centroméri-
cas reveladas na análise de Carbon e Clarke são exibidas
na Figura 11.11 b. A da CDE I é uma sequência de 8 pb,
( a ) Regiões centroméricas de quatro cromossomos
r CDE I (8 pb)
CEN3 G T C A C A T
CDE II , CDE III (26 pb)
s 84 pb / j 93% A T T 6 T AT T T G A T T T C C G A A A GT T A A A A A
CEN4 6 T C À C A T G 78 pb / /Õ3% A T T 61T T À 16 A TT A C C 6 A A A t À T A A À A t
CENó ;
CEN 11 6 T C A C A T G 8 4 p b / / 4 % A T T G T T C A T G A T T T C C G A A C G T A T A A A A
^
( b) Sequê ncia de consenso
( c) Sítio de liga ção do microt ú bulo
R f C A C R I. (T7886 pb ncosem fflganmnrafl A
YAGTGYAC 7 8-8 6 p b r i c o s e n i A T T G T T T T T G - T T T C C G A A - - - AfrXÀT
f
Microtúbulo simples
Cap ítuloH Estrutura do cromossomo 371
RTCACRTG, onde R é qualquer uma das purinas: adenina
ou guanina. A da CDE UI contém 26 pb ricos em A T. -
Entre esses elementos encontra-sc a CDE II, variando de
78 a 86 pb de comprimento e tendo mais de 90% de sua
sequência composta de pares de bases A - T. Os microtú -
bulos se prendem aos cinetócoros para desempenhar seus
papéis na divisão celular (ver Capítulo 3) ( Figura 11.11c ) .
Após o trabalho de Carbon e Clarice, as sequên -
cias CEN foram caracterizadas na Schizosaccharomyces
- pombe e em outras espécies de levedura , além de muitos
outros eucariotos. As sequências CEN da S. pombe e ou -
tras espécies de levedura possuem tamanho similar, mas
diferem um pouco quanto à sequência em comparação
com a S. cerevisiae. Pesquisa posterior mostrou que as
sequências CEN dos eucariotos pluricelulares são muito
maiores que as encontradas na levedura e ocorrem den -
tro de uma grande extensão de heterocromatina cons-
titutiva que caracteristicamente se agrupa em volta dos
centròmeros dos cromossomos animais e vegetais. Essas
sequências CEN expandidas ligam vá rios microt ú bulos
em vez de apenas o microt úbulo ligado na levedura.
Heterocromatina centromérica
As sequências de DNA centromérico dos eucariotos
são altamente repetitivas e constitutivamente heterocro -
máticas. Uma forma especializada de proteína histònica
- H3, conhecida como proteína centromérica A (CENP A), -
liga se ao DNA centromérico. A CENP- A é similar à H3
desde sua extremidade C-terminal até grande parte de seu
comprimento, mas tem uma cauda N- terminal muito dife-
rente e muito maior que a encontrada em outras moléculas
- H3. A CENP- A age como a H3, formando cromatina, mas
-
as caudas N terminais estendidas das proteínas CENP- A
levam à ligação de proteínas de cinetócoro exclusivas que
.
se ligam apenas aos centròmeros Lembre-se de que as pro-
teínas de cinetócoro e as estruturas que elas formam são
Figura 11.11 Sequência de nudeotfdeos
.
, _°
conservad1 n «ntrô mero da levedura .
( Abreviações: R = purina, Y = pirimidina.)
AAAAA
372 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

os locais de ligação dos microtúbulos que movimentam os moleculares aumentou bastante a resolução da marca -
cromossomos e as cromátides durante a divisão celular. ção cromossômica, possibilitando a detecção precisa de
A importância da CENP-A na formação do cinetócoro é cada cromossomo marcado e a localização de genes es -
demonstrada pelos mutados nos quais as anomalias ou a pecíficos nos cromossomos. Hoje, a hibrida çà o in situ
pcrda da CENP-A interferem na criação dos tinetócoros. fluorescente ( FISH ) usa sondas moleculares marcadas
com compostos que emitem luz fluorescente quando
Observa ção gené tica 0 centrômero é uma região es- excitadas pela luz no espectro visível ou UV. Na FISH,
-
pecializada de heterocromatina constitutiva, ligada por proteí vários compostos que emitem luz fluorescente em di
ferentes comprimentos de onda podem ser usados si
--
nas de dnetócoro que facilitam a ligação do mkrotú bulo e o
movimento do cromossomo e das cromátides irmás para os multaneamente para marcar as sondas. Uma vantagem
polos da cé lula durante a divisão celular. dessa abordagem é que o comprimento de onda de cada
emissão produz uma cor diferente quando os cromos-
somos são visualizados no microscópio.
A Figura 11.12a ilustra o uso de sondas, uma pro-
Hibrida çà o insitu duzindo cor vermelha e a outra produzindo cor verde,
Discutimos anteriormente técnicas laboratoriais para identificar dois genes no mesmo cromossomo hu -
nas quais uma sonda molecular marcada hibrida com .
mano A Figura 11.12 b utiliza várias sondas para marcar
-
uma sequê ncia alvo de DNA ou RNA (ver Capí tulo 10). individualmente cada cromossomo humano. Nesse caso,
Esses procedimentos são utilizados para ajudar os pes
quisadores a detectarem fragmentos de DNA contendo
- (a )
uma sequência de interesse ou a detectarem um trans-
crito de RNAm específico. Os pró prios cromossomos
— ou , mais especifkamente, o DNA nos cromossomos
— também podem ser visados para hibridaçào pelas
sondas moleculares.
O DNA cromossómico não precisa estar fragmen -
tado para que uma sequência -alvo específica de um gene
ou cromossomo seja detectada por uma sonda molecular.
A técnica conhecida como hibridaçào in situ usa sondas
—
moleculares marcadas com radioatividade ou, mais re-
centemente, com compostos fluorescentes para detec-—
tar suas sequências-alvo. São utilizados muitos métodos
de hibridaçào in situ , mas as primeiras versões comuns
trabalhavam desnaturando o DNA de cromossomos in -
tactos e depois banhando-os em uma solução contendo
a sonda molecular marcada. A hibridaçào ocorre entre o
DNA cromossómico de fita simples e a sonda de fita dupla.
Os métodos de hibridaçào in situ de primeira ge -
ração usavam sondas de á cido nucleico radioativo que
produziam autorradiografias quando um pequeno
pedaço de película fotográfica era colocado em cima
de um cromossomo espalhado em uma lâ mina de mi - )i a xii
croscópio. O decaimento do marcador radioativo ttP
1 2 3 4 0

na sonda expunha a pel ícula fotográ fica que depois era

revelada da mesma maneira que a autorradiografia dc
uma eletroforese em gel. Nas autorradiografias cromos - > 1 ) l I ) II II 1 ) II
i y a t io ti 12

sômicas, as regiões escuras corresponderam às posições

II II ll Itl I»
cromossô micas de uma sequê ncia de DNA hibridada
pela sonda. Infelizmente, as autorradiografias produzi
das por esse método normalmente conté m várias man
chas escuras que nã o são sítios de hibridaçào, mas que
ocorrem em virtude da dificuldade de lavar a quanti-
dade de sonda molecular nâo hibridada.
-
-
II M
1 3

1 9
1 4

20
1 9

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1 7

Figura 1 1 . 1 2 Hibrida çà o in situ fluorescente ( FISH )

M
I
.
.
«0

Muitos avanços ocorreram ao longo das décadas,
particularmente com o desenvolvimento de uma nova
geração de marcadores fluorescentes, ou fluoróforos,
para serem usados como sondas moleculares. O de-
senvolvimento dos fluoróforos para marcar as sondas
(a ) Duas sondas com sequências-alvo em um cromossomo
humano sáo detectadas pelas emissões de cores diferentes.
( b) Usando fluoróforos diferentes paramarcar 24 sondas para
cromossomos espec íficos, esse cariôtipo masculino humano
normal exibe uma cor diferente para cada cromossomo.

cada sonda específica para cada cromossomo é marcada
com um fluoróforo diferente que emite uma cor de luz
fluorescente diferente. Existem 24 fluoróforos diferen
tes: um para cada autossomo, um para o cromossomo X
.
e um para o cromossomo Y Os dados de emissão de cada
sonda são coletados por um fotorreceptor e processados
por um software especializado para produzir o cariótipo
exibindo cada cromossomo em uma cor diferente.
A técnica de FISH tem muitas aplicações nas aná
lises cromossó micas em humanos e em outras espécies.
Um uso importante e prático desses métodos é a identi
ficação das reorganizações complexas dos cromossomos,
frequentemente encontradas nas células cancerosas, que
discutimos no Estudo de Caso que encerra o capítulo.
11.4 A estrutura da cromatina
influencia a transcriçã o g ênica
A presen ça da cromatina nos eucar íotos constitui
uma diferença importante entre os genomas eucarióticos
e bacterianos. A estrutura da cromatina é fundamental
no controle da expressão gênica eucarió tica. Diferenças
na estrutura da cromatina levam a diferentes níveis de
transcrição gê nica cm diferentes localizações cromossó-
micas. Nesta seção, exploramos essas variações na estru -
tura da cromatina c descrevemos como a localização de
—
um gene por exemplo, sua presença na heterocroma
tina versus oucrotnatina
— -
pode influenciar o fato de esse
gene ser transcrito ou não. Começamos com uma descri
ção dos cromossomos durante a interfase, um per íodo do
ciclo celular durante o qual os cromossomos não estão
bem condensados c, portanto, são difíceis de observar.
Território cromossómico durante a interfase
Um dos primeiros observadores dos cromossomos
no n úcleo foi Theodore Boverl, que também foi um dos
primeiros a propor a conexão entre genes e cromossomos.
Entre essas observações, Boveri reparou que os cromosso-
mos interfásicos não estão dispostos uniformemente den -
tro de um núdeo. Ele sugeriu que a varia ção poderia estar
relacionada com sua atividade na célula. A pesquisa re-
cente usando técnicas de hibridaçâo irt situ para estudar o
posicionamento dos cromossomos no n úcleo interfásico
indica que a sugestão de Boveri estava correta.
Os biólogos celulares Thomas Cremer e Christoph
Cremer usaram a pintura cromossômica para investi
gar a organizaçã o dos cromossomos no n úcleo durante
a interfase e constataram que os cromossomos são par
ticionados em seus próprios territórios cromossó micos
( Figura 11.13). Um território cromossómico é uma
pequena região do n úcleo que é o domínio de um único
cromossomo. Essa região nã o é delimitada por qualquer
tipo de membrana nem demarcada de qualquer maneira
característica. Os cromossomos não ocupam exatamente
o mesmo território em cada n úcleo (o n úcleo não tem
assemos reservados para cada cromossomo ), mas, depois
de confinado a um território, um cromossomo não se
Cap ít u l o H Estrutura do cromossomo 373
(a)
Territ ório
- cromossómico
Domí nio
intercromossómico
ucleo
- Replicante
precoce
- Replkante tardio
Figura 11.13 Territórioscromossômkoi no núcleo
eucariótko. ( a ) Os cromossomos ocupam territórios
distintos, separados por dom í nios intercromossômicos
durante a interfase do cklo celular (b) A marcação FISH dos
,
cromossomos no n úcleo de um embri ão de galinha revela a
ocupação de territórios distintos.
- afasta dele até o início da fase M do ciclo celular. No en-
tanto, os cromossomos são dinamicamente ativos dentro
de seus territórios durante a interfase e podem ser vistos
se deslocando, torcendo e virando durante a transcrição
e a replicação do DNA. ( )s cromossomos parecem estar
ancorados por seus centròmcros e talvez assumam posi-
ções que permitam, para cada cromossomo, padrões de
expressão gémea e outras atividades durante a interfase.
Os territórios cromossómicos adjacentes são sepa -
rados por um dom ínio intercromossómico que não
contém cromatina. Esses domínios são canais para a mo-
vimentação de proteínas, enzimas e moléculas de RNA
dentro do n úcleo e ao longo dos territórios cromossô-
micos. A distribuição dos territórios cromossómicos po-
siciona os cromossomos maiores e com mais genes na
direçã o do centro do n úcleo, enquanto os territórios dos
cromossomos menores, contendo menos genes, estão si -
- tuados na direção das bordas externas do n úcleo.
O posicionamento de um cromossomo dentro de seu
- território corresponde às atividades em que as partes do
cromossomo estão envolvidas em estágios particulares
da interfase. Por exemplo, as regiões cromossómicas que
replicam no início da fase S geralmente são encontradas
mais distantes da membrana nuclear. As regiões mais
próximas do centro do núcleo são os locais dos segmentos
cromossómicos replicantes precoces. Por outro lado, os
segmentos cromossómicos replicantes tardios, que são as
partes dos cromossomos que replicam no final da fase S,
são encontrados mais perto da membrana nuclear. Além
374 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Agrupamento de
centrómeros
A ção do DNA. Em uma ponta do espectro da condensa
/
i
/ outro lado, nas regiões cromossó micas eucromáticas, as
02010 Mftcrrtilan Pjtnabera LM •\
Figura 11.14 Modelo tridimensional dos cromossomos
no núcleo da levedura. Os centrómeros cromossòmicos
das leveduras sã o agrupados em uma extremidade do
n úcleo; os braços cromossòmicos irradiam a partir do
agrupamento centromérico.
disso, as regiões cromossó micas mais ativas em termos de
transcrição se encontram mais perto da fronteira entTe
um território cromossómico e um domínio interero
mossòmico, presumivelmente em razão (1) de um maior
acesso às proteínas e enzimas necessá rias para a trans
crição e (2) da dispersão mais rá pida dos transcritos de
RNA após o término da transcrição. Embora a transcrição
ocorra em cada território cromossômko inteiro, a evidên
cia experimental sugere que a transcrição é mais intensa
nas fronteiras com os domínios intercromossô micos.
Recentemente, C. Anthony Blau e vários colegas
ampliaram as descobertas dos Cremer desenvolvendo
um modelo tridimensional dos 16 cromossomos nos
n úcleos haploides das leveduras ( Figura 11.14 ). Empre
gando um método que identifica cada cromossomo de
maneira diferente, os pesquisadores conseguiram mapear
precisamente a localização de cada cromossomo dentro
do n úcleo. O mapa resultante do posicionamento tridi
mensional dos cromossomos revela que os centrómeros
cromossòmicos são agrupados e que os braços cromossô-
micos se projetam para fora desses agrupamentos. O co-
nhecimento do posicionamento dos cromossomos dentro
do n údeo possibilitará determinar como as sequências de
DNA influenciam o posicionamento dos cromossomos e,
por sua vez, como o posicionamento cromossómico in -
fluencia a transcrição e a replicaçáo das sequências.
Observa çã o gen é tica Os cromossomos ocupam terri-
tórios cromossòmicos distintos durante a interfase. A transcri-
ção génica depende em parte das posições dos cromossomos
dentro de seus territórios.
Estrutura dinâmica da cromatina
A estrutura da cromatina é dinâ mica; os segmentos
cromossò micos possivelmente existem em estados di -
ferentes de compactaçào e relaxamento durante o ciclo
celular. Em termas gerais, essas mudanças regulam o
acesso das proteí nas ao DNA, proteínas estas que exe -
cutam a replicaçáo, transcrição, recombinação e repara -
-
ção da cromatina est ão as regiões heterocrom á ticas dos
cromossomos, que são relativa mente inacessíveis para
as prote í nas transcricionais de modo temporá rio ( no
caso da heterocromatina facultativa) ou quase o tempo
todo ( no caso da heterocromatina constitutiva ). Por
proteínas e enzimas transcricionais têm mais facilidade
de ganhar acesso ao DNA.
Vá rias linhas de evidência experimental relacionam
a estrutura da cromatina com a expressão gé nica. A pri-
meira identiíicaçào dessa conexão veio da observação da
variegaçáo do efeito de posição (PEV) afetando a cor
dos olhos na Drosophila. Durante as décadas de 1920 e
1930, em testes do efeito dos raios X no desenvolvimento
da Drosophila, Hermann Muller identificou moscas-da -
-fruta expostas aos raios X com um padrão variegado
de cor dos olhos, no qual são observadas manchas ver
mcllias o brancas de tecido ocular colorido. As manchas
-
vermelhas resultam da expressão do alelo w' do tipo sel
vagem para a cor vermelha. As manchas brancas não tê m
-
- cor em consequência da ausê ncia de expressão do w\
Nos experimentos de variegaçáo mais importantes
de Muller, ele observou que os cromossomos X das mos-
- cas com cor das olhos variegada tinham uma estrutura
anormal. Esses cromossomos X foram rompidos pelos
efeitos nocivos dos raios X e os pedaços dos cromosso-
mos foram rejuntados, mas com um pedaço invertido
em 180 graus em relação à sua posição normal. Em con -
sequência da inversão do cromossomo X, o gene w se
- deslocou da sua posição normal perto do telômero do
cromossomo X, onde é expresso ativamente, para uma
nova posição mais perto do centrômero do cromos-
somo. A região centrom érica contém heterocromatina
- constitutiva que apenas relaxa brevemente para permitir
que as enzimas e estruturas de replicaçáo do DNA aces -
sem as sequências durante a replica çáo do DNA. A he-
terocromatina é restaurada rapidamente no centrômero
e a condensação heterocromá tica se espalha a partir da í.
O grau de disseminação da heterocromatina varia
de um cromossomo para o outro; basicamente nâ o há
genes expressos perto do centrômero, então um pouco
mais ou um pouco menos de disseminação heterocro -
má tica normalmente não traz consequê ncias genéticas.
Nas moscas-da-fruta com inversão do cromossomo X, o
ponto de parada da disseminação heterocrom á tica de-
termina se w é expresso ou n ão ( Figura 11.15 ). Se a dis-
semina çã o da heterocromatina nâo alcançar a nova po-
sição de w\ o gene estará em uma região eucromática
e pode ser transcrito ativamente, produzindo olhos de
cor vermelha. Por outro lado, as células nas quais a dis-
seminaçã o da heterocromatina centromérica abrange
a nova posição de w* não expressam o gene e carecem
da cor do pigmento. Neste exemplo, o gene w não sofre
muta ção por inversão. Pelo contr á rio, a oportunidade
para expressar o gene é alterada pela realocaçào do

(a ) Cor dos olhos do tipo selvagem
-— Telômero
Eucromatina Heterocromatina
w*
( b ) Cor dos olhos variegada
A oversão desloca o w*
A disseminação da
heterocromatina é variá vel
gene para uma nova posição situada dentro da região
cromossô mica heterocromá tica. Por isso, no “efeito de
posição", a expressão do gene depende de sua posição
com relação à heterocromatina centromérica.
Desde que Muller descreveu pela primeira vez a
variegaçáo do efeito de posição, os biólogos celulares
compreenderam que esse tipo de efeito de posição é
um fenó meno epigenético no qual a expressão gênica é
determinada pela estrutura da cromatina. O estado epi
genético dos genes do efeito de posição é transmissível
durante a divisão celular mitótica. Como consequência,
as células em que o w* está posicionado dentro da hete-
rocromatina centrom érica produziram células descen
dentes incapazes de produzir pigmento porque o gene
d silenciado. Consequentemente, aparecem manchas
brancas onde estão situadas as células descendentes
com w* inativado, produzindo um padrão variegado
de pigmentação da cor dos olhos no tecido ocular (ver
Figura 11.15b ). Não existem dois olhos de Drosophila
variegados com o mesmo padrão de variegaçáo. Até
mesmo os dois olhos da mesma mosca variegada t êm
padrões diferentes! A ocorrência da PEV indica que (1)
a expressão gê nica pode ser silenciada pela posição do
gene em um cromossomo e (2) o silenciamento é uma
característica da estrutura da cromatina que é transmis
sível de uma geração celular para a próxima.
Observa çã o gen é tica A estrutura da cromatina re-
gula a expressã o gê nica. Ha variegaçáo do efeito de posiçã o,
os genes transcritos ativamente que são transpostos para a
cromatina heterocromá tica perto do centrômero sofrem uma
forma de silenciamento epigenético.
Cap ít u l o H Estrutura do cromossomo 375
Figura 11.15 Variega çáo
1 do efeito de posição da
cor do olho na Drosophila .
O alelo w* é expresso nos
AJetoiv |
cromossomos X do tipo
expresso selvagem e nas Inversões
do cromossomo X em que
a heterocromatina náo se
espalha para cobrir o gene.
Se a heterocromatina cobrir
a nova posição do gene, o w*
.
é silenciado
— AJetokV
expresso
AJdowr
silenciado
Mutações da PEV
A an álise genética dos genomas eucarió ticos re
vela que a PEV é um fen ô meno comum, sugerindo
-
que os mecanismos que controlam a estrutura da
cromatina são importantes no controle da expressã o
gê nica. As muta ções que modificam a PEV levaram
à identificação de vá rios genes e prote í nas que de-
- sempenham um papel direto no estabelecimento e
na manuten ção das estruturas de cromatina associa -
das com a expressã o e o silenciamento gê nicos. Por
exemplo, as mutações conhecidas como E{ var ) , em
que E( var ) é uma abrevia çã o de potencializadores
- ( enhancers ) da variega çá o do efeito de posi çã o, au -
mentam ou potencializam o surgimento do fenótipo
mutado dos olhos brancos estimulando a dissemina -
ção da heterocromatina para alé m dos seus limites
normais. O efeito da mutaçã o E( var ) é a produ ção de
um n ú mero maior de células oculares sem pigmento
.
( Figura H.16) Por outro lado, as muta ções Su( var ) ,
em que Su( var ) é uma abrevia çã o de swpressores da
variegaçá o do efeito de posiçã o, restringem a disse-
mina ção da heterocromatina ou interferem em sua
forma ção. As mutações Su( var ) aumentam a extensão
- das regiões normalmente pigmentadas do olho, su
primindo o surgimento de manchas brancas.
-
Vá rias dezenas de mutações E( var ) e Su( var ) são
conhecidas no genoma da Drosophila e as mutações
Su( var) se mostraram particularmentc valiosas na
identificação dos genes e proteí nas que modulam a es-
trutura da cromatina. A análise gen ética das mutações
E( var ) e Su( var ) apoia a hipótese de que a estrutura da
cromatina é dinâ mica e está associada com a expres -
são gê nica. Na verdade, a estrutura da cromatina pa -
rece oscilar: às vezes ela está em um estado altamente
376 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
(Xho variegado Muta ções Su( var ) Mutações C ( var )
Sáo produzidas As mutações As mutações
manchas bloqueiam a aumentam a
vermelhas peias xxmaçao eficiente formação de
células em que o da heterocroma - heterocromatina
w* é transcrito e tina e deixam a e restringem a
manchas brancas maioria das céHjlas expressão do v/
nas células em
que ow* è
com transcrição
ativa do w*.
a pequenas
rranchas.
desativado pela
.
dlsserr nação da
heterocromatina
.
Figura 11.16 Muta ções E( var ) eSu( vor ) As mutações
dos genes cujos produtos proteicos participam na
remodelação da cromatina são detectadas pela intensificaçã o
ou supressão da variega çào do efeito de posição.
condensado, no qual a transcrição gênica é silenciada
( isto é, heterocromá tica ), e às vezes está em um estado
menos condensado que permite a transcriçã o ( isto é,
eucromá tica ), mas frequentemente ela existe em um
estado intermediá rio de condensa çã o.
Coletivamente, as an á lises experimentais dos su -
pressores e potencializadores da PEV identificam os
genes que criam as " marcas" epigen éticas nas proteí
nas histò nicas, causando conexão e desconex ão de
grupos metila , acetila e fosforila aos aminoácidos das
histonas. Essas marcas epigenéticas estão associadas
com a remodela çã o da cromatina , que leva à transcri -
ção gê nica ou ao silenciamento génico. Os padrões de
metila çã o e desmetila çâ o, acetila ção e desacet í laçâo
e fosforilação e desfosforilaçào são mantidos nas his
tonas e podem ser transmitidos através de gerações
sucessivas de células. Cinco aspectos importantes da
modificação epigen ética foram identificados pelos
pesquisadores: (1) as modificações epigen éticas alte-
ram a estrutura da cromatina; (2) são transmissíveis
durante a divisão celular; (3) são reversíveis; (4) estã o
associadas diretamente com a transcrição gênica e (5)
náo alteram a sequência de DNA. Em capítulo poste
rior, voltaremos a uma discussão sobre as modifica
ções epigenéticas da cromatina e seu importante papel
na regulação da expressão gê nica (Capítulo 15).
Proteínas de remodelaçã o da cromatina
Entre as questões que os biólogos celulares estuda -
ram através das an á lises mutacionais Su( var ) e E( var)
estão: “Quais genes e proteínas controlam a condensa
ção da cromatina ?" e "Como a remodelação da croma-
tina altera o acesso ao DNA das proteí nas do fator de
transcrição e da RNA polimerase?’. Em relação a essas
questões, os pesquisadores chegaram a duas conclusões
gené ricas. A primeira é que os padrões de modificação
das histonas se correlacionam com a formação da estru -
tura da cromatina. A segunda é que um grupo impor-
tante de mutações Su( var ) exemplifica como a detecçào
das proteínas defeituosas pode elucidar as funções nor-
mais. Algumas mutações Su( var) são provocadas pela
expressão defeituosa da prote í na heterocromatina 1
( HP-1), encontrada na associação com os centrômeros,
-
telò meros e outras posições cromossô micas hetero-
cromá ticas na Drosophila. A comparação dos mutados
Su( var ) com os tipos selvagens revela que a UP-1 é uma
proteí na de ligação a n ú cleos somos que visa aos amino-
ácidos Usina na posição 9 da histona H3, se forem por -
tadores de um grupo metila. A metilação da lisina 9 da
H3 é uma das modificações epigcnéticas mais comuns
das histonas nas regiões heterocromá ticas. A ausê ncia
da HP- 1 interfere na formação da heterocromatina e
suprime a variegaçào.
Um segundo grupo de mutações Su( var) afeta
os genes que codificam as histonas metiltransferases
(HMTs), enzimas responsá veis por catalisar a adição
de grupos metila aos aminoácidos das proteínas his-
t ô nicas. As histonas metiltransferases parecem visar
aos aminoácidos básicos específicos para a metilação
( por exemplo, arginina e lisina ) nos nucleossomos,
acoplando grupos metila a esses aminoácidos como
parte da marcação epigenética das histonas. Como foi
observado anteriormente, o resíduo de lisina na posi -
- ção 9 da proteí na histônica H3 é um alvo frequente da
metila ção. Na metilaçã o, essa posição é descrita como
H3K9me, que é uma abreviação de /fistona 3, lisina
( abreviação K de uma letra ), posiçã o 9 e metilaçã o. Se
as HMTs não estiverem funcionando adequadamente,
a metilação epigenética n ão é estabelecida e a forma
ção da heterocromatina é inibida.
-
- A identificação das funções desses dois grupos de
mutações Su( var ) levou ao modelo simples da função
da HP-1 e HMT, prevendo que as posições de histona
especificamente metiladas nos nucleossomos ( por
exemplo, H3K9me ) sã o metiladas pelas HMTs e agem
como sítios de ligação da HP -1 que ajudam a conden
sar a estrutura da cromatina para silenciar a expres
-
-
são genica ( Figura 11.17). De acordo com esse modelo,
- os mutados Su(var ) defeituosos em seu silenciamento
- do w' poderiam carregar uma muta ção do gene HMT
que leva à nã o metilação apropriada dos nucleossomos
ou poderiam carregar uma mutação do gene HP 1 e -
se tornarem incapazes de remodelar a cromatina para
uma forma altamente condensada. Discutimos a re -
modelação da cromatina e as modificações epigené-
tkas da cromatina em mais detalhes na conex ã o com
- os mecanismos que regulam a transcrição dos genes
eucarióticos ( ver Capítulo 15). A An á lise Gen é tica 11.2
vai guiá -lo por uma análise da estrutura da cromatina
em volta de um gene.

Heterocromatlna
CH
NucleossomcK
^
DMA
A HMT e a HP-1 se combinam para modificar
a cromadna e bloquear a transcrição.
Eucromatina
As mutações HMT ou HP-1 Impedem
a modificação da cromatina .
•
F i g u r a 11.17 A HMT a HP- 1 modificam a cromatína.
A aná lise de mutação Identifica as prote í nas HMT e HP 1
*
como controladoras da formação da heterocromatina .
As muta ções da HMT e da HP-1 impedem a modificação
da cromatina.
Inativa çã o dos cromossomos X femininos
em mamíferos
Os animais que se reproduzem sexualmentc en -
frentam um problema peculiar com relação aos dife
rentes n úmeros de cada cromossomo sexual carrega
dos pelos machos e fé meas da espécie. Discutimos esse
problema anteriormente e explicamos que as fémeas de
mam íferos sofrem inativação aleatória do X em cada
n úcleo no início do desenvolvimento gestaciona! (ver
Capítulo 3). Lembre-se de que a inativação aleatória
do X deixa um cromossomo X ativo, que é, em grande
parte, eucromático, e um cromossomo X inativo, que é
quase inteiramente heterocromá tico em cada n úcleo.
O cromossomo X heterocromá tico é quase completa -
mente silencioso com relação à expressão gênica. Esse
cromossomo X altamente heterocrom á tico forma o
corp úsculo de Barr no n úcleo. Todas as células descen -
dentes mantêm os mesmos cromossomos X ativos (eu
cromá ticos) e inativos (heterocromá ticos), levando ao
padrão em mosaico das células que é característico das
fé meas de mamíferos (ver Figura 3.26).
Estudos amplos da inativaçã o do X em camun
dongos e humanos detectaram cerca de uma dezena
de genes no cromossomo X heterocromá tico ( inativo)
que escapam do silenciamento. Um desses genes é cri-
ticamente importante para o estabelecimento e a ma
nutenção da inativaçã o do X. O gene, chamado frans
crito específico (specific ) de inativação do X (Xist), è
ativo no cromossomo X heterocrom á tico e inativo no
cromossomo eucromá tico. Ele está situado no centro
de inativaçã o do X, ou XIC, do cromossomo X ( Fi-
gura 11.18 ). O gene Xist é transcrito apenas no cro
C a p ít u l o H Estrutura do cromossomo 377
Cromossomo X heterocrom á tico
XIC (centro de inativação do X)
i j
Xist
(Transaito especifico para a inativação do X)
AtNaçâodoXfcre
transcrição do RNAXftr.
O RN A Prest ável
cobre ocromossomo X.
A cobertura de RNA Xist
leva ao silenciamento e à
condensação do
cromossomo X.
- As HMT» são atra ídas para a
- cobertura de RNA; as
historias H3 eH4 são
desacebladas e mediadas,
inativando o cromossoma
O cromossomo X condensado
e silenciado forma um
corpúsculo de Bar
Figura 11.18 Centro de Inativação do X ( XIC). O
XIC conté m Xist , que é transcrito para produzir um RNA
especializado que cobre o cromossomo X Esse mecanismo é
responsável pela inativação aleatória do X nos mam íferos.
- mossomo heterocromá tico, onde é ativo; não é trans-
crito no cromossomo X eucrom á tico, onde é inativo.
O transcrito génico é um transcrito de RNA especia -
lizado, chamado RNA Xist , que nunca sai do n úcleo
- e nunca é traduzido. Em vez disso, o RNA Xist cobre
exclusivamente o cromossomo X que o produz. O re -
vestimento de RNA Xist atrai as HMTs e histona desa
cetilases que metilam e desacetilam as proteínas histô-
-
-
-
nicas H3 e H4. Essas modificações epigenéticas estão
ligadas diretamente ao silenciamento transcricional
dos genes. O revestimento de RNA Xist , a metilaçâo
e a desacetilaçào subsequentes e outras modificações
controladas por proteína inativam um cromossomo
X e o condensam em um estado heterocromá tico em
- cada n úcleo de fé mea de mam ífero.
378 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
O gene Te2 da enzima do tecido do camundongo é expresso nas célu- Coração Timo Rim
las do coração (H), rim (K) e timo (T) em momentos diferentes durante E A E A E A
o desenvolvimento do camundongo. O DNA situado a montante dos rr n n- n ©
genes Te2 transcritos das c ópias transcricionalmente silenciosas do
Te2 é isolado dos tecidos embrioná rio (E) e adulto (A) Um marcador .
radioativo é preso a uma extremidade de cada fragmento de DNA
isolado. Os fragmentos com as extremidades marcadas sào trata -
dos com a enzima nudease microc ócica, que corta o DNA embalado
como eucromatina, mas não consegue cortar o DNA embalado como 5
.
heterocromatlna As amostras de DNA tratadas com enzima e com as
extremidades marcadas são submetidas à eletroforese em gel Os re- .
sultados da eletroforese são exibidos na figura.
a. Com base nos resultados exibidos no gel, há evidências de que a ©
compactaçáo e a remodelação da cromatina desempenham um
papel na expressão do 7fe2? Explique seu raciocínio.
.
b Em qual tecido e em que momento durante o desenvolvimento os resultados indicam que a ex-
pressão do Te2 é mais provável?

Estrat égias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por 1. Este problema lida com a análise da estrutura da cromatina perto de um gene
este problema e explique a natureza de camundongo que é expresso em diferentes tecidos e em momentos diferen-
da resposta solicitada. tes durante o desenvolvimento. A resposta exige a interpretação dos resultados
da eletroforese em gel do DNA exposto á enzima, situado a montante do gene.

.
2 Identifique as informações críticas .
2 São fornecidos os resultados da eletroforese do DNA a montante das cópias ina-
fornecidas no problema. tivas do Te2, ativas e inativas transcricionalmente.

Deduzir
.
3 Descreva a relação entre a atividade .
3 A heterocromatlna é aomatina densamente embalada e em grande parte ina-
transcricional e a estrutura da croma- cessivel para as proteínas transcricionais e contém poucos genes transcritos, se
tina de um gene. . .
tiver algum A eucromatina, por outro lado é uma cromatina mais relaxada, que
contém genes transcritos.

Solucionar Resposta a

.
4 Avalie os resultados da eletroforese
em gel de cada tecido dos camun
dongos embrionários e adultos.
V
Dica: A enzima clrva
0 ONA eucromitico, ma»
nèc o hetemcromático.
.
4 Dois padrões de faixas de DNA são observados. Um padrão contém faixas cujos
- .
comprimentos aumentam em uma sequência contínua Esse padrão de faixas
indica que são criados pela ação enzimática fragmentos de todos os compri-
mentos. O segundo padrão contém fragmentos menores e maiores, mas não de
tamanho intermediário. Esse padrào indica que os comprimentos de fragmen-
tos intermediá rios não são criados pelo tratamento com enzimas.

5. Use os resultados do gel para inter-
pretar os padrões de expressão do
Te2 do tecido embrionário e adulto
dos camundongos.
Dica : Lacunas no padráo dei frag -
mentos de DMA digeridos r»dica *n cue
parte da cromadna esta bem ligada e
que è bem resistente a digest ão enzimá-
tica. Porianta elas sáo um sinal de que a
Resposta b
5. Um padrão continuo de fragmentos de DNA é observado quando o DNA é eu-
cromático e tende a conter genes transcritos. Os resultados do gel são coeren-
tes com a expressão do gene Te2 no coração embrionário e no timo adulto e nos
rins tanto embrionários quanto adultos. Os resultados sugerem que o Te2 não é
.
transcrito no coração adulto ou no timo embrionário A estrutura compacta da
cromatina em volta do gene no coração adulto e no timo embrionário poderia
contribuir para o silenciamento observado da expressão gêmea nesses tecidos.

náo comim genes transcritos .

-
estrutura da aomatina heteroao nárica

Para praticar mais, ver Problemas 17 e 25 .

 C a p ít u l o H Estrutura do cromossomo 379

ESTUDO DE CASO
Busca de anomalias cromossôm í cas nas células cancerosas
As cé lulas cancerosas são altamente anormais c con
tê m caracleristicamente v á rias mutações que perturbam
muitas atividades celulares fundamentais, incluindo o con
trole normal do ciclo celular, as interações c a comunicação
entre as células, a taxa de divisã o celular e os processos de
.
reparação das mutações Alé m disso, os genomas c os cro-
mossomos das cé lulas cancerosas são instáveis e propensos
.
a mais alterações mutacionais As mutações cromossôuii-
cas nas células cancerosas normalmcnte são m ú ltiplas e, na
maioria das vezes, incluem a remoção ou a duplicação de
todos ou partes dos cromossomos» bem como as transloca
ções cm que parte dc um cromossomo é transferida c vincu
lada a uni cromossomo não homólogo.
Em um momento, as anomalias cromossô mí cas nas
cé lulas cancerosas foram identificadas pela inspeção dos
padrões de bandamento dos cromossomos quanto às alte
rações. Esse processo foi aprimorado nos últimos anos pelo
desenvolvimento da técnica FISH com sondas mullicolori-
das e pelo uso de sondas e fluoróforos diferentes para cada
cromossomo ( técnica SKY
—
xpectral karyotype ) A nova
metodologia permite a detecçáo e identificação mais preci
.
sas das anomalias cromossôm í cas. A Figura 11.19a mostra
o cariótipo de uma cé lula cancerosa na qual a FISH reve
lou que vários cromossomos contê m mais de uma cor. indi
cando que são realmcnte compostos de pedaços de dois ou
mais cromossomos n ão homólogos .
- Embora as cé lulas cancerosas tenham caractcristi-
camente cromossomos bastante instá veis e que tendem
- a produzir o tipo de cariótipo manifestamente anormal
observado na Figura 11.19a, certas células cancerosas sã o
incomuns pelo fato de conterem reorganizações cromos
sô micas específicas que sã o quase diagn ósticas dc um
-
determinado tipo dc câncer. É isso o que acontece na
.
leucemia mieloide crónica ( LMC ) em que uma translo
ca çã o recíproca específica entre os cromossomos 9 e 22
é observada em quase todos os casos. De modo similar,
- cm um câ ncer chamado linfoma de Burkitt , uma translo -
- cação recíproca diferente entre os cromossomos 8 c 14 é
observada com muita frequ ê ncia . A Figura 11.19b mos -
tra a transloca ção rec í proca entre os cromossomos 9 e 22
encontrada nas células cancerosas das pessoas com LMC.
- Do mesmo modo, a transloca ção entre os cromossomos 8
c 14 nas pessoas com linfoma dc BurkiU també m é reve-
lada pela FISH ( Figura 11.19c ). O uso de fluoróforos emi -
tindo comprimentos de onda diferentes facilita a iden -
-
tificação dos cromossomos envolvidos na mutação por
translocação e a indicação dos locais das translocaçôes
cromossôm í cas. Em um capítulo posterior , discutimos as
- perturbações biológicas criadas por essas translocaçôes C
como elas contribuem para o desenvolvimento do câ ncer
( Capítulo 13).
( b)

+-- -—
I
D
l
I Cromossomo
Ontrôcnêfo

Filad é lfia
I ??

9
Translocação
9/22

—
Figura 11.19 Detec çáo FISH da
P 1: reorganização cromossò mica nas células
TT -Q 0 Centr ômero cancerosas humanas, ( a ) A instabilidade
£ 1 » : cromossòmica geral leva à observação de
:I 2 8!
. BI

S
vá rias anomalias cromossôm ícas nas células
cancerosas, facilmente observadas usando o
q » i
método FISH (direita ), ( b ) Uma translocação
! s; 3
i i recíproca entre o cromossomo 9 e o

•
8
i
"V-lgV
Transloca çã o
a/14
Ç>
14
— igV
m c- myc
cromossomo 22 é multo comum na leucemia
mieloide crónica ( LMC). (c) A translocaçã o
entre o cromossomo 8 e o cromossomo 14
Translocação é frequentemente detectada nas células do
8/14 linfoma de Burkitt
380 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

RESUMO
11.1 Os cromossomos bacterianos têm uma
organização simples
Os genomas bacterianos sáo haplokles e costumam conter
.
um único cromossomo circular Os genomas de certas es-
pécies bacterianas contém mais de um cromossomo.
I Os cromossomos bacterianos sáo mil vezes maiores, ou
mais, que as células em que residem, e estão situados no
nudeoide.
As proteínas se associam com os cromossomos bacteria-
nos para ajudar na compactaçào.
O superenrolamento dos cromossomos bacterianos circu-
lares é o mecanismo principal de compactaçào do cromos-
somo nas células bacterianas.
11.2 Os cromossomos eucarióticos sá o organiza -
dos como cromatina
Os núcleos eucarióticos contêm vários cromossomos alta-
mente compactados.
Os cromossomos eucarióticos sáo compostos de croma-
tlna — uma mistura de DNA, proteínas histônicas, proteí
nas de suporte e outras proteí nas não histônicas.
- criçã o gênica
I Oito moléculas de proteína histônica formam os núcleos-
somos, em volta dos quais 146 pb de DNA se enrolam para
formar a fibra de 10 nm . .
I A fibra de 10 nm condensa e forma a fibra de 30 nm.
As proteínas nao histônicas formam o suporte cromos-
sómico, que confere estrutura às cromá tides e ajuda
a compactar mais o cromossomo durante a prófase do
ciclo celular .
As alças de cromatina se formam com a ajuda das proteí-
nas de suporte. Em cada tipo de c élula diferente, os genes
expressos estáo mais distantes dos pontos de ligaçáo ao
suporte que os genes não expressos.
113 As regiões do cromossomo sáo diferenciadas
pelo padrão de bandamento cromossómico
Os cromossomos são categorizados pela estrutura com
base na posição do centròmero e na proporção do com-
primento do braço longo (braço q) para o comprimento do
braço curto (braço p).
Cada cromossomo tem um padrão de bandas caracterfs-
tico, criadas quando são aplkados corantes.
O DNA heterocromá tico forma bandas de cor escura que
contém relativamente poucos genes expressos .
O DNA eucromátko forma bandas de cor clara que contêm
a maioria dos genes expressos.
O centròmero consiste em sequências de DNA especializa-
das que ligam proteínas de cinetócoro .
Sondas moleculares especializadas sáo utilizadas na hibri-
dação in situ para localizar genes espec íficos ou sequências
.
de DNA específicas do cromossomo Essas sondas frequen -
temente utilizam marcadores fluorescentes na detecçào.
11.4 A estrutura da cromatina influencia a trans-
Durante a Interfase, cada cromossomo habita um território
próprio no núcleo. O posicionamento cromossómico den-
tro do território está ligado à replicaçáo e à transcrição
Estudos da variegaçáo do efeito de posição (PEV ) determi
naram que a estrutura da cromatina que circunda um gene
influencia diretamente a transcrição .
A remodelação da cromatina consiste em modificações epi-
genéticas especificas das caudas N-terminais das proteínas
histônicas.
As mutações que potencializam [£( vor) ] ou suprimem
[Su(vor)] a variegaçáo do efeito de posição alteram os
genes responsáveis pela remodelação da cromatina .
A Inatlvaçào aleatória do X nas fémeas de mamíferos é pro-
vocada por um RNA especializado transcrito de um gene
ativo no cromossomo X inahvado.

TERMOS-CHAVE

Bandamento cromossómico (banda- Fibra de 10 nm (p. 363) Nudeossomo (p. 363)

mento Giemsa, bandamento G)
(p. 369, 370)
Braços aomossômicos [braço longo
(braço q), braço curto (braço pj] (p.369)
Carlótipo (p. 369)
Cromatina (p. 362)
Cromossomo acrocêntrico (p. 369)
Cromossomo metacéntrico (p. 369)
Cromossomo submetacèntrico (p. 369)
Cromossomo telocêntrico (p.369)
DNA central (p. 363 )
DNA ligador (p. 363)
Domínio Intercromossômko (p. 373)
Estrutura solenoide (p. 363)
Eucromatina (região eurromãtica) (p. 370)
Fibra de 30 nm (solenoide) (p. 363)
Fibra de 300 nm (p. 366)
Heterocromatina (região heterocro
mática) (p. 370)
Heterocromatina constitutiva (p. 371)
Heterocromatina facultativa [p. 370)
Hibridaçáo in iitu (p.372)
Hibridaçáo in iitu fluorescente (FISH)
(P- 372)
Marcas epigenéticas (modificações epi-
genétícas) (p. 368)
Modelo de posicionamento radial dos
cromossomos (p. 366)
Mutações E(var ) (p. 375)
Mutações Sufvar ) (p. 375)
Nucleoide (p. 360)
Pequenas proteínas associadas ao
nucleoide (p. 361 )
Proteínas de manutenção estrutural do
cromossomo (SMC) (p. 36 7)
Proteínas histônicas (Hl, H2A, H2B, H3 .
H4) (p. 362 )
Proteínas não histônicas (p. 362 )
Região de associação à matriz (MAR)
(p. 366)
Remodelação da cromatina (p. 368)
Superenrolamento negativo (p. 367)
Superenrolamento positivo (p. 367)
Suporte cromossómico (p.366)
Território cromossómico (p.373)
Variegaçáo do efeito de posição (PEV)
(p. 374)

PROBLEMAS
Conceitos do capí tulo
1. O que é um nudeoide bacteriano ? O que é um plasmí-
deo bacteriano? Quais as semelhanças entre esses obje-
tos e quais as diferenças ?
2. Os biólogos definem os genomas bacterianos como “ha -
ploides* mas alguns genomas bacterianos contêm mais
de um cromossomo portador do DNA genômico A des- . 9.
crição dos genomas bacterianos como "haploides* entra
em conflito com a ocorrência dos genomas bacterianos
com mais de um cromossomo? Explique.
3. O DNA bacteriano é compactado por dois mecanismos
principais. Identifique e descreva cada mecanismo.
4. O genoma humano contêm 2,9 x 10Q pares de bases
Quantos nucleossomos, aproximada mente, são necessá-
rios para organizar a estrutura de fibra de 10 nm do ge
noma humano ? Mostre os cákulos que você empregou
para determinar a resposta . .
5. Forneça descrições para os seguintes termos:a. Proteínas
histônicas; b.Nucleossomo; c. Sequéndas CEN; d. Bandas
.
G; e. Eucromatina; f Heterocromatina; g. Modificação epi-
genética; h. Território cromossômico;i. Nucleoide.
6, Descreva a importância das bandas G claras e escuras
que aparecem ao longo dos cromossomos.
7. No DNA eucariótko,
a. Qual é o lugar mais provável para encontrar a proteína
histônica H4?
.
b Qual é o lugar mais provável para encontrar a proteína
histônica Hl ?
.
c Ao longo de um segmento de DNA com 6 mil pb,
quantas moléculas de cada tipo de proteína histônica,
aproximadamente, você espera encontrar ? Explique.
Aplica ção e integra ção
16. Como seguimento da Análise Genética 11.1, na qual você
determinou o número aproximado de nucleossomos por
núcleo na Arabóopsis tbafí ana, responda a estas perguntas:
a. Se o número de nucleossomos fornecido na resposta
da parte o da Análise Genética corresponder ao nú-
,
cleo de uma célula na G , quantos nucleossomos você
prevê no núcleo após a conclusão da fase S? Explique.
b. Todos os outros nucleossomos presentes após a con-
clusão da fase S são compostos de proteínas histônicas
recém-slntetlzadas? Explique.
.
17 Um levantamento dos organismos que vivem nas pro-
fundezas oceânicas revela duas novas espécies cujo DNA
é isolado para análise. Amostras de DNA de ambas as es-
pécies são tratadas para remover proteínas não histônicas
Cada amostra é tratada com nudease mkrocódca que
corta o DNA não protegido pelas proteínas, mas não con-
segue cortar o DNA ligado ãs proteínas histônicas. Após
o tratamento com nudease mlcrocódca, as amostras são
submetidas à eletroforese em gel e os géis são corados
com brometo de etkJio para produzir todas as faixas de
CapítuloH Estrutura do cromossomo 381
Para obter as respostas dos probíemas pares,
ver o Apêndice: Respostas.
d. Qual é a diferença entre os papéis da Hl e da H3 na
formação da cromatina?
8. Descreva as diferenças relativas que você espera entre os
níveis de condensação cromossômica na interfase e na
metáfase.
Os cariótipos humanos do final da prófase possuem cerca
de 2 mil bandas G visíveis. O genoma humano contém
aproximadamente 22 mil genes. Considere a região 5p15.1
até o final do braço curto do cromossomo 5, identificada no
cromossomo profá sico final na Figura 11.10, e suponha que
a região inteira seja removida. Aproximadamente quantos
genes serão perdidos em consequência dessa remoção?
.
10. Quais são os dois ou três componentes mais essenciais
de uma sequência cromossômica bacteriana? E de uma
sequência cromossômica eucariótica? Pensando em um
contexto evolutivo Imagine um argumento para explicar
por que esses componentes estão presentes.
.
11 Quais são os componentes mais essenciais dos centrô-
meros da levedura?
.
12 Os cromossomos bacterianos possuem centrômeros? E te-
lòmeros? Responda a partir de uma perspectiva evolutiva.
.
13 Identifique duas maneiras em que os telômeros e os cen -
trômeros são similares .
.
14 Pensando na sequência de DNA, descreva como a sequên-
cia irá mudar com a distância do telômero.
15. De que maneira a variegação do efeito de posição (PEV)
da cor do olho da Drosophikj indica que a cxprcssáo gê
nica ocorre nas regiões eucromáticas dos cromossomos,
mas não nas regiões heteroeromáticas?
DNA no gel. Os padrões de coloração com brometo de etf-
dio do DNA de cada espécie são exibidos na figura. O nú-
mero de pares de bases ( pb) nos pequenos fragmentos de
DNA é exibido à esquerda do gel. Interprete os resultados
do gel em termos de organização da cromatina e de espa-
çamento dos nucleossomos na cromatina de cada espécie.
Espécie
A B
©
pb
800 - —
600
400
--
. 200 -
18. Um eucarioto com um número diploide de 2n 6 carrega
os cromossomos exibidos a seguir, numerados de 1 a 6.
382 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
a. Examine cuidadosamente e redesenhe os cromosso-
mos em qualquer alinhamento válido da metáfase I
Desenhe e indique a placa metafá sica e indique cada
cromossomo por seu número atribuído.
b. Explique como você determinou o alinhamento cor-
reto dos cromossomos homólogos nos lados opostos
.
da placa metaf ásica
.
19 O diagrama cromossômico exibido a seguir representa
um cromossomo eucariótico corado por bandamento G
(Giemsa). Indique as regiões heterocromática e eucromá-
tica do cromossomo e também as regiões centromérica
e telomérica . minutos, 1 hora e 4 horas e submetidas separadamente
Centrômero
a. Qual termo descreve melhor a forma desse cromossomo ?
b. Vocé espera que a região centromérica contenha hete-
rocromatina facultativa? Por què?
c Descreva as caracterí stlcas da composição da sequên-
cia geral e da ligação proteica que diferenciam a região
centromérica das outras regiões do cromossomo.
d. Por que os genes expressos não são encontrados na
região telomérica dos cromossomos?
e. Você tem mais chance de encontrar a sequência de
DNA que codifica a enzima digestiva amllase em uma
região heterocromática, eucromá tica, centromérica ou
telomérica? Explique sua resposta.
20. O genoma da bactéria Methanococcus jannaschil contém
um cromossomo principal circular e de fita dupla, com
posto de 1,6 x 10A pb. Um cálculo geométrico nos diz que
o diâmetro do cromossomo circular é aproximadamente
10 vezes o diâmetro da célula da M. jannaschil.
.
a Como esse cromossomo principal é empacotado den-
tro da célula?
b. Descreva como esse cromossomo é empacotado no
nudeoide bacteriano.
c Por que esse cromossomo é superenrolado?
.
21 A nuclease microcócica corta o DNA não associado di-
retamente com os nudeossomos. O tratamento do DNA
humano com nudease microcócica produz repetições de
nucleossomos com tamanhos de 185 a 200 pb. Por que
esse resultado indica que os nudeossomos são espaça-
dos uniformemente no DNA humano? Qual resultado
seria obtido se os nucleossomos fossem espaç ados alea-
toriamente ao longo do DNA ?
22. A proteína hlstònlca H4 isolada das plantas de ervilha e
do timo bovino contém 102 aminoácidos em ambos os
.
casos Um total de 100 desses aminoácidos é idêntico nas
duas espédes. Forneça uma explicação evolutiva para
essa forte identidade da sequência de aminoácidos com
base no que vocé conhece sobre as funções das histonas
e dos nucleossomos.
.
23 Estudos de modificações epí gené ticas das proteí nas
hist ônicas na levedura constatam um aumento apro-
ximado de 15% a 20% na transcrição dos genes se
houver acetklaçáo da H3 e H4 nos nucleossomos vlzi
nhos. Os estudos também detectam uma reduçã o no
nível de metilação dos nucleossomos ( hipometilaçã o)
na vizinhança dos genes ativamente transcritos. Espe -
cule sobre a import ância das observações epigenéti -
cas da transcrição génica .
24. A evidência experimental demonstra que os nudeosso-
mos presentes em uma célula apõs a conclusão da fase
S são compostos de alguns dimeros de histona "antigos"
e alguns recénvslntetizados. Descreva a concepção geral
. de um experimento que usa um marcador proteico como
,
o s5 para mostrar que os nucleossomos são frequente-
mente uma mistura de dimeros de histona antigos e
novos após a replicaçâo do DNA.
25. A nuclease microcóclca corta o DNA não protegido por
proteínas a ele ligadas, mas é incapaz de cortar o DNA
.
ligado a proteínas O DNA humano é isolado, destituí-
do de suas proteínas não histônicas e misturado com a
nuclease microcócica. Amostras são removidas após 30
.
à eletroforese em gel O gel resultante é corado com bro-
meto de etídio e os resultados são exibidos na figura. Os
tamanhos do fragmento de DNA em pares de bases (pb)
são estimados pela escala à esquerda do gel.
Tempo
30 min 1h 4h
n n©
pb
800 -
600
400 -
200 - ©
a. Examine os resultados do gel e especule por que o tra
tamento mais prolongado com a nuclease microcócica
produz resultados diferentes .
b. Tire uma conclusão a respeito da organização da cro-
matina no genoma humano a partir desse gel.
26. O DNA genômico do verme nematódeo Coenorhabditis eíe-
gans é organizado pelos nucleossomos da maneira típica
dos genomas eucarióticos, com 145 pb circundando cada
nudeossomo e aproximadamente 55 pb no DNA ligador.
Quando a cromatina da C etegans é cuidadosamente iso-
lada, destituída das proteínas não histônicas e colocada
em um tampão apropriado, a cromatina descorvdensa para
uma estrutura de fibra de 10 nm. Suponha que os pesqui-
sadores misturem uma amostra de cromatina de fibra de
10 nm com uma quantidade maior de enzima DNase I que
diva aleatoriamente o DNA nas regiões não protegidas por
proteínas ligadas. Em seguida eles removem os nudeosso -
mos, separam os fragmentos de DNA pela eletroforese em
gel e coram os fragmentos com brometo de etidio.
a. Aproximadamente, qual banda de tamanho dos frag-
mentos de DNA você espera encontrar no gel eletrofo-
rético corado ? Quantas bandas estarão visíveis no gel?
b. Explique a origem dos fragmentos de DNA observados
no gel.
c De que forma os resultados previstos apoiam o mo-
delo de cromatina de fibra de 10 nm ?
Mutação gênica, reparo do DNA Capítulo
e recombinação homóloga

APRESENTA ÇÃO

12.1 As mutações são raras e ocorrem de maneira

aleatória
12.2 As mutações gênicas modificam a sequência
do DNA
12.3 As mutações gênicas podem surgir de eventos
espontâneos
12.4 As mutações podem ser induzidas por
substâncias químicas ou radiação ionizante
12.5 Os sistemas de reparo corrigem alguns danos
ao DNA
12.6 As proteínas controlam a síntese do DNA
translesáo e o reparo das quebras na fita dupla
12.7 A recombinação meiótica é controlada por
quebras da fita dupla programadas
12.8 A conversão gênica é o reparo dirigido dos
erros de pareamento no DNA heteroduplex

Os pavões normalmente têm penas coloridas muito brilhantes,

mas esse pavão não tem cor nas penas em consequência de uma
mutaçã o gênica .
PONTOS ESSENCIAIS

M utação pode ser definida da forma mais simples como uma

alteração na sequência de DNA. Uma gama enorme de
alterações no DNA est á Incluída nessa definição. Em uma ponta
I As mutações gênicas sáo raras e aleatórias
I As mutações alteram a sequência de DNA, a
composição e a função dos polipeptídeos e
.

causam variação fenotípica.

do espectro estão as substituições simples de pares de bases de
DNA que poderiam ou não levar a uma alteração na composição
de aminoàcidos de um polipept ídeo. Na outra ponta do espectro
encontra- se a adição ou subtração de um ou mais conjuntos de
cromossomos do genoma.
Mutações derivam de danos impostos ao DNA por agentes
químicos, fí sicos ou biológicos ou de alterações espont âneas das
bases de nudeotideos do DNA. O dano pode ocorrer em qualquer
célula a qualquer momento e as mutações resultantes podem ser
passadas adiante pela divisão celular. Em organismos unicelula-
res, as mutações são transmitidas quando as células se dividem,
ao passo que, nas plantas e animais, as mutações nas células so-
má ticas são transmitidas por mitose para as células-fí lhas e as mu-
I As alterações nudeotfdicas espontâneas
podem levar à mutação.
I Os mutágenos químicos e a radiação danifi-
cam o DNA e produzem mutações.
I Os sistemas de reparo do DNA podem repa-
rar diretamente os danos ao DNA ou podem
remover e substituir segmentos danificados.
I Enzimas especializadas podem contornar o
bloqueio da replkaçâo do DNA em razão de
um dano não reparado .
I A recombinação meiótica ê um evento pro -
gramado realizado por processos relaciona-
dos ao reparo dos danos no DNA.
I A conversão gênica é uma sequência de
DNA direcionada e associada com a recom-

tações nas células germinativas sào transmitidas para a geração

binação homóloga .
seguinte através dos gametas.
384 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
O estudo dos danos ao DNA, do reparo do DNA e das
mutações é a pedra angular da an á lise genétka por mul-
tas razões. Por exemplo, (1 ) as muta ções são a fonte defini-
tiva da nova variação genética nas espécies e populações
e a evolução seria impossível sem a variação herdada que
elas geram; ( 2) os padrões de herança das variantes alé
licas são a base em que os princípios da hereditariedade
estão fundamentados; (3) o mapea mento das mutações é
uma primeira etapa rumo à construçã o dos mapas gené-
ticos dos cromossomos e dos genomas; (4) o exame das
anomalias que ocorrem nos organismos mutados leva à
descoberta da função do tipo selvagem dos genes; (5) o
estudo dos mecanismos de reparo dos danos ao DNA é
parte integrante da compreensã o dos processos biológi-
cos e moleculares que contribuem para a variaçã o here-
ditá ria; (6) o reparo das quebras do DNA de fita dupla é
subjacente ao processo de crossing -over dos cromosso-
mos homólogos na meiose e (7) o reparo do DNA defei-
tuoso é subjacente a vá rias doenças, com mais destaque
para o câ ncer. Este capítulo explora esses tópicos em sua
discussão da mutação gènica, reparo dos danos ao DNA e
mecanismo de recombinação homóloga.
12.1 As muta ções são raras e
ocorrem de maneira aleatória
As mutações têm estado no centro das atenções
desde o início da dé neia genética. Por exemplo, lembre-
-se de que a herança das sementes rugosas nas plantas
de ervilha estudadas por Mendel resulta da homozigosi
dade para um alelo mutado que não produz uma enzima
ramificadora de amido (ver Capítulo 2). Na ausência
dessa enzima , uma quantidade excessiva de moléculas
de açúcar livres está presente nos embriões em desen
volvimento, que acabam formando sementes rugosas
( ver Tabela 2.6). De modo similar, a baixa estatura da
planta de ervilha que Mendel observou ocorre nas plan -
tas homozigotas para um alelo mutado incapaz de pro
duzir um hormônio do crescimento. Do mesmo modo, a
descoberta de Morgan da base cromossómica da heredi-
tariedade surgiu de seu estudo do fenótipo dos olhos de
cor branca mutados na Drosophila (ver Capítulo 3).
Em cada um desses exemplos, um fenótipo mutado
resulta da mutação de um único gene transmitido du-
rante a reprodução. Mas, na realidade, todo organismo
carrega alelos mutados, independentemente de eles se
manifestarem ou não em fenótipos distintos. A presença
das mutações é abundante nos genomas e elas ocorrem
em toda geração. As estimativas atuais para o genoma
humano, baseadas nos dados de sequenciamento do ge-
noma, indicam que como indivíduos nós adquirimos de
uma a quatro novas mutações a cada geração.
Reconhecendo que a variação herdada era a fonte
da hereditariedade e da evolução nas populações, os
biólogos tiveram de responder a duas perguntas impor
tantes. A primeira , “Qual a frequência de mutações nos
-
diferentes genomas? w, e a segunda, “A variação entre
organismos é o resultado de mutações aleatórias, algu -
- mas delas adaptativas, ou uma mudança no ambiente
induz alterações genéticas?”. A resposta à primeira per -
gunta veio de muitos estudos de uma ampla gama de
organismos e a resposta à segunda pergunta veio prin -
cipalmente de um experimento realizado em 1943 por
Salvador Luria e Max Delbruck, o qual demonstrou a
natureza aleat ó ria das mutações.
Frequência das mutaçõ es
Com que frequência as mutações ocorrem? As
quantidades de mutações são iguais para cada gene ou
variam de acordo com o gene ou o organismo? Essas
são algumas questões que os geneticistas fazem sobre as
muta ções enquanto procuram descrever a frequência e
a distribuição das mutações nos genomas.
Em bactérias e outros microrganismos haploides,
a frequência das mutações pode ser medida pelo n ú -
mero de vezes que a mutação altera um determinado
gene. As mutações nesses organismos, que criam defi -
ciê ncias nutricionais auxotróficas que prejudicam a ca -
pacidade dos organismos para crescer em um meio de
cultura mínimo, são mais facilmente identificadas. Os
mutados auxotróficos requerem suplementa çào de um
meio de cultura mínimo para crescer.
A frequência das mutações é definida e investigada
de maneira diferente nos diploides que se reprodu -
zem sexualmente. Nesses organismos, a frequê ncia de
- mutação é o n úmero de eventos mutacionais em um
determinado gene em relaçã o a uma dada unidade de
tempo; e embora as mutações recessivas possam ser
identificadas, é mais comum identificar as dominan -
- tes, pois são mais fáceis de detectar. As frequências de
muta ção na maioria das vezes são medidas pelo ciclo
de replicação do DNA ou pela geração celular. Por
exemplo, se 100 mil grãos de pólen forem examinados
- quanto à varia ção na cor, a descoberta de dois grã os de
cor anormal seria relatada como uma taxa de mutação
de 2 X 10-5. De modo alternativo, estudos longitudi -
nais da reprodu ção em animais e plantas conseguem
identificar as taxas de mutação na prole. As mutações
dominantes são identificadas com mais facilidade por
essa abordagem pela simples razão de que uma ú nica
cópia de um alelo mutado dominante será observá vel
no fenótipo. A Tabela 12.1 apresenta as taxas de mu -
tação de genes selecionados em uma série de espécies
microbianas, vegetais e animais.
A partir de décadas de estudo das frequ ê ncias de
mutações genicas, três conclusões essenciais podem
ser extra ídas. Primeiro, as frequências de mutaçã o são
baixas em todos os genomas, significando que a es-
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recombina çáo homóloga 385

Tabela 12.1 Frequências de mutação espontânea de genes selecionados

Organismo ístka afetada

Caracter Gene Frequência
Bactérias
Escherichia coli Fermentação da lactose kic* - loc 2 x 10 *
"

*
Resistência ao fago TI TIs tTI r - - 2 x 10 •
Dependência de histidina -
htr thir 2 x 1o-6
Salmonella typbimurium Independência de triptofano trp -Krp * 5 x 1 0^
Dependência de histidina hir -> hisr 2 x 10-*
Dependência de treonina thr* -» thr 4 x 10“*
Algas
Chlamydomonas reinhordií Resistência à penicilina pen-s -» pen-r 1 x IO 7
"

Sensibilidade à estreptomicina str-r —* str-s 1 x 10 *

Fungos
Neurospora crassa Independência de adenina ode ~

-* ade' 4 x 10 *
Independência de inositol inor -* inos* 8 x 10 *
"

Plantas
Zea mays (milho) Cor do grão C* > c -
- 2 x 10-*
Composição do endosperma
Forma do grão
—
SlJ* > SlT
$h+ -> sh
2 x 1 0^
1 x 10-*
Insetos
Drosophlh melanogaster
(mosca-da- fruta)
Cor dos olhos —
w* > w 4 x 10-»
Cor do corpo y* -> y 1,2 x 10-*
Cor dos olhos bw -> bw 3 x 10 *
Cor do corpo e -» e
4
2 x 10 * *

Mamíferos
Mus musculus (rato) Cor do pelo -
64 > tr 8,5 x 10 * "

Padr ão de pigmentação 3 x 1fr »

Cor do pelo o * -MI 4 x 10-»
Cor dos olhos pf -> p- 8,5 x 10 * -
Homo sapiens (humano) Estatura (acondroplasia) -
A' * A - 5 x 10 *
Forma do olho (aniridia) AN* - AN ¥ ~
5 x 10“*
Coagulação (hemofilia) H* - H ~
2 x 10 * *

*
Doença de Huntington HUT* —> HUT 2 x 10-6
Síndrome unha-patela 5 x 10 6
"

Distrofia muscular de Duchenne DY -> DY 1 x 10 -*

Neurofibromatose NF 1*-> NF 1~ -
1 x 10 *

tabilidade genô mica é primordial e que as mutações
contribuem lentamente para a diversidade herdada.
Segundo, as frequê ncias de muta ções genicas diferem
consideravelmente entre os organismos, sugerindo
que os genomas podem ter níveis variá veis de tole
rà ncia para as muta ções e que a eficiê ncia do reparo
das mutações pode variar entre os organismos. Por
fim, as frequências de mutação entre diferentes genes
de uma ú nica espécie exibem varia ção, sugerindo que
existem variáveis intr ínsecas à sequência de DNA que
levam a taxas de muta çã o diferentes entre os genes em
um genoma.
CJada espécie tem uma frequência m édia de muta -
çáo gênica e as pesquisas indicam que as frequências
estão correlacionadas com o tamanho do genoma. Em
outras palavras, organismos com genomas maiores cos-
tumam ter uma frequência de mutação mais alta que
os organismos com genomas menores. As estimativas
386 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
atuais constatam que os vertebrados tém frequê ncias
de mutação pelo menos 100 vezes maiores por gera
ção que as bactérias. Alé m das diferenças nas frequê n-
cias de mutação entre os organismos, as frequências de
mutação para certos genes dentro de um dado genoma
podem ser substancialmente mais altas que a média da
espécie. No genoma humano, por exemplo, a frequên
cia de mutação média do gene médio é da ordem de 1
a 10 por milhã o de gametas. Mas em genes específicos,
como o DYS , que produz a distrofia muscular de Du -
chenne, um transtorno humano recessivo ligado ao X,
e o NF1, que produz a neurofibromatose autussômica
dominante, vemos frequ ê ncias de mutação elevadas.
Genes como esses sào identificados como hotspots de
mutação, genes individuais ou regiões dos genomas
onde as mutações ocorrem com muito mais frequência
que a m édia.
Os hotspots de mutaçã o derivam normalmente
de caracter ísticas específicas dos genes ou sequê n -
cias de DNA envolvidos. Uma razã o para as hotspots
de mutação é um gene de tamanho grande. É o caso do
DYS e do\T 1 , que sofrem mutações a uma taxa apro
ximadamente uma ordem de grandeza maior que a
taxa de mutação humana média (105 para o DYS e NF1
vénus a supracitada 10-* para o gene humano médio).
Esses genes também sào os dois maiores conhecidos no
genoma humano. O DYS , por exemplo, abrange apro-
ximadamente 2,5 milh ões de bp no cromossomo X.
Discutimos em seções posteriores outras circunstâ ncias
que criam hotspots de mutação.
Teste de flutuação
A natureza da muta ção foi tema de considerável
especulação até quase a metade do século XX. A espe-
cula ção praticamente acabou em 1943, quando Luria
e Delbr ú ck realizaram um experimento que testou a
.
natureza de uma mutação que protegia a E coli con
tra a lise após exposição ao bacteriófago. Embora no
experimento de Luria e Delbr ú ck a frequê ncia de bac
té rias resistentes ao fago fosse baixa, sua quantidade
pôde ser contada em razão do grande n ú mero de cé
lulas bacterianas em cada placa de cultura e da capaci
dade das bacté rias resistentes ao fago para crescerem
na presen ça do bacteriófago.
Luria e Delbr úck testaram duas teorias concor
rentes da natureza da muta çã o. Uma , a hipótese da
mutação aleató ria (que acabou sendo a hipó tese cor
reta ), propõe que as mutações ocorrem aleatoria
mente nos organismos e prevê que culturas bacteria -
nas distintas podem conter frequê ncias diferentes de
uma determinada muta çã o gênica. A hipótese alterna -
.
tiva conhecida como hipó tese da muta ção adaptativa
propõe que a mudan ça ambiental desencadeia uma
resposta mutacional adaptativa e prevê que diferen
tes culturas bacterianas expostas ao mesmo estresse
ambiental terão frequê ncias similares de uma deter
minada mutaçã o gê nica.
Luria e Delbriick conceberam o "teste de flutuação"
- para descobrir se as mutações ocorrem aleatoriamente
ou são induzidas por mudan ça ambiental. A mutação
que eles examinaram foi a aquisição de resist ência à in -
fccção por bacteriófago. A presença do bacteriófago nas
placas de cultura foi o fator ambiental que poderia ter
- desencadeado uma resposta adaptativa das bacté rias.
Luria e Delbr úck inocularam 20 culturas bacterianas de
pequeno volume com bactérias de uma cultura maior.
As 20 culturas pequenas e a grande cultura original
foram expandidas até a mesma concentração final de
bactérias e nunca encontraram um bacteriófago du -
rante a fase de crescimento. Depois de cultivadas, os
pesquisadores extraíram volumes iguais de cada uma
das 20 culturas pequenas e coletaram 20 amostras da
cultura grande, distribuindo cada amostra nas placas
de cultura contendo bacteriófago. Após aguardar o
crescimento das bactérias, eles contaram o n ú mero de
colónias resistentes a fago em cada placa de cultura.
A hipótese de muta ção adaptativa prevê que, como
as bacté rias em cada placa foram expostas ao mesmo
- tempo ao bacteriófago, cada placa deveria produzir
aproximadamente o mesmo n úmero de colónias re
sistentes a fago, caso esse fago no ambiente de cultura
-
estimulasse a mudança genética adaptativa. Por outro
lado, a hipótese de mutação aleató ria prevê que as célu -
las resistentes a fago se desenvolvem espontaneamente
em cada cultura; desse modo, suas quantidades totais
variam consideravelmente entre as diferentes culturas.
A Figura 12.1 ilustra que mais flutuação em volta da
quantidade média de coló nias resistentes é prevista pela
hipótese de mutação aleatória e é exatamente isso que
Luria e Delbriick detectaram. A partir desse trabalho,
eles conclu íram que as mutações ocorrem aleatoria -
mente e in ú meros experimentos em vá rios organismos
nos anos subsequentes apoiam essa conclusão.
- Observa çã o gen ética As mutações ocorrem aleato-
- riamente. Elas sào raras, mas t ém uma taxa variável entre as
diferentes espécies, de gene para gene dentro de uma espéde
-- e entre diferentes segmentos dos genomas.
12.2 As mutações genicas modificam
- a sequência do DNA
- Na maioria das vezes, as mutações gêmeas alteram
- a sequência de DNA substituindo, adicionando ou re-
movendo um ou mais pares de bases de DNA. Esses
tipos de mutações localizadas ocorrem em um ponto
específico ou identificá vel em um gene e se chamam
. mutações pontuais ou mutações de ponto. Nesta seção,
descrevemos vá rios tipos de mutações pontuais que têm
- consequências caracter ísticas dependendo do tipo de
alteraçã o na sequência e da localizaçã o da alteração na
- sequência em um gene. Essas mutações pontuais estão
resumidas na Tabela 12.2.
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 387

(a ) Hipótese de mutação adaptativa

Cultura A Cultura B Cultura C
Tempo 9 9 9
I 0 0 I 0 £ 0 0
. II
III
Adiciona
fago TI
-
Prevê que todas as populações carregam aproximada
mente a mesma propo'çá o de c élulas resistentes a fagos.

(b) Hipótese de mutaçã o aleatória

Cultura A Cultura B Cultura C
Tempo Q Q Q
•
~ ~ ~ ~ ~
§ I 9 9 9 9 9
' '
Aadon
fago TI
.Jj ÉàÉ&ÉàÈà I ív Ê&ÊàJÚlbÊè>
Prevê que o número de células resistentes a fagos flutua substancialmente
entre as popjlações em consequência do momento aleatório das mutações
Figura 12.1 Teste de flutuaçã o de Luria e Delbriick.

Muta ções por substituição de pares de bases
A substituiçã o de um par de bases de nucleotí
deos por outro é uma mutação por substituição de
pares de bases . Ocorrem dois tipos de substituição
de pares de bases: muta ções por transição, nas quais
uma purina substitui a outra ( isto é, A substitui G ou
-
vice versa ) ou uma pirimidina substitui outra ( isto é,
-
C substitui T ou vice versa ), e mutações por trans-
Mutaçã o silenciosa Uma substituição de pares de
- bases produzindo uma proteí na com a mesma sequê n
cia de aminoácidos da prote í na do tipo selvagem é
-
conhecida como mutação silenciosa , também cha -
mada mutaçã o sinónima. As Figuras 12.2a c 12 2 b ilus-
tram uma muta ção silenciosa na qual uma mutaçã o
por transição A T para G - C altera o códon leucina
- -
do tipo selvagem ( 5' UUA 3') para um códon mu
- -
tado ( 5# UUG 30 que també m codifica a leucina.
*

versão, nas quais uma purina é substituída por uma

As mutações silenciosas são possíveis porque o código
pirimidina ou vice versa. - gen ético é redundante, possuindo de 2 a 6 códons na
As mutações por substituição de pares de bases sã o
maioria dos aminoácidos ( ver Tabela 9.1 para obter
ainda classificadas no n ível molecular pela maneira que
alteram o conteú do informacional do gene. Três tipos uma Usta dos códons redundantes).
de mutações por substituição de pares de bases são fre- Mutação de sentido trocado Uma substituição de pares
quentemente reconhecidos: mutações silenciosas, mu
tações de sentido trocado e mutações sem sentido.
- de bases que resulta na mudança de um aminoácido
na proteína é uma mutação de sentido trocado. A

Tabela 12.2 Mutações pontuais

Tipo Consequência
Mutações de sequência codificadora
Silenciosa Nenhuma mudança na sequência de aminoá cidos
Sentido trocado Muda um aminoácido do polipeptídeo
Sem sentido Cria um códon de parada e termina prematuramente a tradução
Mudança de quadro de leitura Resulta na sequência de aminoácidos errada
Mutações regulatórias
Promotora Muda o momento e a quantidade de transcrição gênica
Poliadenilaçáo Altera a sequência de RNAm; pode afetar a estabilidade do RNAm
Sitio de spOóng Pode reter a sequência Intrônka ou excluir a sequência exônica do RNAm maduro
Mutação por replicação do DNA: Aumenta (ou raramente diminui) o número de repetições dos tripletos de DNA, pro-
Expansão da repetiçã o dos tripletos vocando instabilidade do RNAm ou o número incorreto de aminoácidos repetidos
em uma proteína
 388 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Figura 12.2c mostra a muta ção por transversâo de T - A

para A - T que altera o códon 5' - UGG - 3' do tipo sel-
vagem para 5' - A G G - 3 \ mudando o aminoácido de
triptofano para arginina. A função da proteína pode ser
alterada por uma mutação de sentido trocado. A natu
reza específica da mudan ça na proteína ( isto é, se ela re-
- Mutações por mudança da matriz de leitura
sulta na perda completa ou apenas parcial da função da
proteí na ) depende do tipo de alteração no aminoá cido e
em que ponto da cadeia polipeptídica a mudança ocorre.
A alta versus a baixa estatura nas plantas de ervilha
estudadas por Gregor Mendel usa um alelo dominante
( Lé) de um gene necessário para produzir o hormònio
do crescimento vegetal giberelina, que gera plantas altas.
Um alelo recessivo (le) desse gene produz uma enzima
com menos de 5% de atividade catal ítica da enzima do
tipo selvagem c produz plantas de baixa estatura ( ver
Tabela 2.6). O alelo mutado cont é m uma transição G - C
-
para A G que produz uma mutação de sentido trocado
que troca a alanina por treonina no produto gê nico.
Mutaçã o sem sentido Uma substituição de pares de
bases que cria um códon de parada no lugar de um
códon que especifica um aminoácido é uma mutação
sem sentido. A substituição do par de bases GC por
.
AT exibida na Figura 12.2d, que muda o códon UGG
(Trp) para um códon UGA ( parada ), é um exemplo de
mutação sem sentido.
A inserção ou remoção de um ou mais pares de
bases na sequência codificadora de um gene leva à adiçào
ou remoção de nudeot ídeos do RN Am. Isso pode alterar
a matriz de leitura da sequência do códon, começando
no ponto de mutação. O resultado seria uma mutação
por mudança da matriz de leitura , na qual o polipeptí
deo mutado contém uma sequênda de aminoácido alte-
rada do ponto de mutação até o final do polipeptídeo ( I •
gura 12.3). Além de produzir os aminoáddos errados em
uma parte do polipeptídeo, as mutações por mudan ça da
matriz de leitura frequentemente também geram códons
de parada prematuros que resultam em um polipeptídeo
truncado. Por essas razões, as mutações por mudança da
matriz de leitura costumam resultar na perda completa
da função proteica e, assim, produzem alelos nulos.
As vagens com sementes amarelas versus verdes
estudadas por Mendel nas plantas de ervilha são con -

(a ) Sequência do tipo selvagem

D N A S'7/ T T A T T T A G A t G G T G T // 3' Fita codificadora

"
(a ) Sequência do tipo selvagem
3'7/ AAT AAA K T A t C Á CA /f S' Fita -molde DNA 57/1 TA í T t A G A f 6ã 1 6 I jf 3' Fita codificadora
RNAm 5'7W , Y f M MUllTlllll £ 3' 37/ A A T A A A T C T A C C A C A / f 5' F i t a molde
Polipept ídeo N Leu Phe : Aiu I
'
I CVS 1//C
- ,
RNAm 57miIMmWXLWI -tWLVMl I*
Polipept ídeo N / f l Leu fPhc ~I Ara firo I Cvi TflC
( b ) Mutação silenciosa

,
DNA 5'7J TTET T t T AGA T G G T G T / r 3' Fita codificadora ( b) Mutação por mudanç a da matriz de leitura: inserção de um
7
3' JAAMIAAA t C T A C C AfTT/f 5’ Fita-molde único par dê bases
T
RNAm S'7 m G\ ITWW.OTJPI
*
Polipept ídeo N •1 Leu '/ C DNA 57f n i i nfj
t i É t m m i u 7 3'Fita codificadora
31n WJ A .Y.infMif .fHr.fiX 5'Fita-molde
(c) Mutação de sentido trocado RNAm 571 mu AUU U AG AUG GUG III, £ 3 *
Sequências
nudeotfcJtas
DNA S' 7 £ 3' Fita codificadora Polipept ídeo N Phm destacadas
3*7/ A A I AAA I C I T 5' Fita-molde
Sequência de aminoàcidos alterada
RNAm 5'7fiijraaiii»iiKiífji A [ rfHiiwifj 3'
Polipept ídeo N
JITL*UTPII« VkíSLíESU IVãI1 jc
* (c) Muta ção por mudança da matriz de leitura: remoção de um
ú nico par de bases
1
( d) Mutaçã o sem sentido

7/ ffr ã r í T AG A r liO T 6 T J ( ~ 3' Fita codificadora

DNA S* DNA57 I B I M l A
a X
G A T G G T G T ÍJ 3' Fita codificadora

*11.T.1F.T.TJl I«i1HM T If.W.ljX 5' Fita-molde 31rf.T.HFT. T ^ CTA CCA C AH£ -

5' Fita molde
, RNAm 57 , H l i r.W I i l A Sequê ncias
RNAm 5'7,miuiiiii' A nriifi £ 3 1
W
G A U G G U G U f 3’
nudeot ídeas
Polipept ídeo N I Gtt
^3c
; p h e ; AãJ
Polipept ídeo N

Seqcênda de amtaoá cidos alterada

destacadas

F i g u r a 12.2 Consequências das substituições de pares

de bases. F i g u r a 12.3 Mutação por mudança da matriz de leitura.
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 389

troladas pelo gene SGR (staygreen ) (ver Tabela 2.6). O (a ) Muta ções no promotor
produto proteico do alelo dominante participa da via Posição no promotor
de degradação da clorofila , mas a prote í na mutada tem -
Gene da (3- globlna 101 -88 - 30
muito pouca funçã o em virtude da muta ção que insere Tipo selvagem7 ' 1 C á C A IççaftÃõÃ AÇil
6 bp de DNA e adiciona dois am í noá cidos à proteí na. i u i u
Mutação 7inÊBulGuuR i sarf GUG cr;ac
(

Mutaçõ es regulatórias
(b ) Muta ções no íntron 1
Algumas mutações pontuais produzem o efeito de
reduzir ou aumentar a quantidade de transcritos gêni
cos do tipo selvagem e a quantidade de polipeptideos
- Éxon 1 [ í ntron 1
Quantidade de transcrito
com splicing normal

^
J GCCflfl G T iRilf l
’
Tipo selvagem 100%
do tipo selvagem sem afetar as sequências do transcrito
e do polipeptídeo. Essas mutações, classificadas como Mutação J ILEBAG QTTS 6 TA /Í . Nenhum
mutações regulatórias, ocorrem nas regiões nã o codi - 7/ SCC
'
U T T G G T A ,r
/ Nenhum
ficadoras dos genes, como as regiões promotoras, os ín- 7 G T T G H T A / ir Nenhum
trons e as regiões que codificam os segmentos 5' UTR - 7 / GCCFJH JtJTCiflOjC Reduzida
-
e 3' UTR do RNAm. Nenhuma dessas regiões codifica 1/ GCCHcf b I bUI JJC Reduzida
diretamente as proteínas, mas as mutações nessas re -
7 / GCCEE 6 T r áò HAlC
~

giões podem produzir RNAm anormais. Três tipos de
mutações regulatórias são frequentemente reconheci
dos: mutações promotoras, mutações de splicing e sítios
de splicing cr ípticos.
Muta ções promotoras As sequências de consenso pro
motoras reconhecidas pela RNA polimerase II e seus
fatores de transcrição associados controlam a inicia
ção eficiente da transcrição. As mutações que alteram
Reduzida
1 2 3 4 5 6 7J
- Posiçã o no íntron
Figura 12.4 Mutações regulatórias do gene da
- 0-globina humana, (a) Essas mutações por substituiçã o de
pares de bases no promotor reduzem a transcrição do gene.
(b) Essas substitui ções de pares de bases no íntron 1 reduzem
- ou eliminam o splicing normal do pré- RNAm.

os nucleot ídeos da sequência de consenso e interferem

na iniciação eficiente da transcrição são as mutações
promotoras. O gene da p-globina humana oferece vá -
rios exemplos de muta ções promotoras, com várias
consequências na transcrição. A Figura 12.4« apresenta
mutações em seis posições do promotor do gene da 0 -
globina humana, que resultam na redução de branda a
-
moderada na quantidade de proteína fl globina. Cada
uma dessas mutações promotoras reduz a transcrição,
mas nenhuma delas elimina inteiramente a transcrição.
Algumas mutações promotoras de outros genes resul
tam na eliminaçã o completa da transcrição.
Muta ções de splicing O d ínucleotideo GT do DNA, na
fita codificadora , ocorre invariavelmente no sítio de
splicing 5' do íntron para demarcar o limite entre a ex-
tremidade 5' do íntron e a extremidade 3' de um éxon
(o GT da fita codificadora do DNA corresponde ao di-
nucleot ídeo GU do RNAm; ver Figura 8.21 ). No gene da
p-globina humana, um dinucleotídeo AG ocorre na ex-
tremidade 3' do éxon 1. Cada um desses dinucleotídeos
faz parte da sequência de consenso em que se forma
o spliceossomo. Mutações de qualquer uma dessas
sequências de dinucleotídeos ou dos nucleotídeos vizi
nhos na sequência de consenso dentro do íntron podem
resultar em erros de splicing que removem sequ ências
intrônicas do pré- RNAm de maneira imprecisa .
O sítio de splicing 5' do tipo selvagem do gene da
p-globina humana contém um GT que é essencial para o
splicing normal, assim como sã o os vários nucleotídeos
seguintes no íntron >! Figura 12.4 b ). No íntron 1 do gene
da Pglobina, duas mutações diferentes que substituem
a guanina do dinucleotídeo GT abolem inteiramente o
splicing normal nas muta ções conhecidas como mu-
tações de splicing . Além disso, uma mutação por
substituição de pares de bases da posição 5 do íntron
1 també m impede a produção do RNAm com splicing
normal. A tradu çào dos transcritos que sofreram
splicing anormal não produz proteí na p-globina do tipo
selvagem. Outras mutações por substituiçã o de pares de
bases no íntron 1 resultam na produção de uma mistura
-
de transcritos com splicing normal e anormal e produ
zem alguma proteína f -globina do tipo selvagem.
-
Uma mutação resultante de muta ção por transição
de G - C para A - T altera a guanina e o sítio de splicing
5’ de um íntron no gene A que produz as llores roxas
vcrsus brancas estudadas por Mendel (ver Tabela 2.6).
Esse alelo dominante produz uma proteína ativadora da
transcrição que leva à produção do pigmento antocia -
nina da flor. A mutação do sítio de splicing no alelo mu*
tado leva ao splicing anormal, que retém oito nucleot í-
deos adicionais no RNAm maduro. A proteína mutada
não funciona na via da antocianina.
Sítios de splicing crí pticosCertas mutações por subs-
- tituição de pares de bases produzem novos sítios de
splicing que substituem ou competem com os sí tios au
tênticos durante o processamento do pré- RNAm. Esses
-
sítios recé m - formados são conhecidos como sí tios de
ípticos. O íntron 1 do gene da p-globina hu
splicing cr -
mana tem 130 nucleotídeos de comprimento. Uma mu -
taçã o por substituição de pares de bases que troca G por
A na posição 110 do í ntron 1 cria um dinucleotídeo AG
que é um sítio de splicing cr íptico ( Figura 12.5) () sítio .
390 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 12.5 Spilclng críptico. Sitio de sptking autêntico

A substitui ção do par de bases G C - Posição 100 110 120 130
-
por A T na posição 110 do íntron 1 do Tipo Sê|vagefY1
J 1É1 GcTs 7 r
gene da fi-globina humana cria um sítio l
t
de sptking 3'cr í ptico. Intron 1 Sitio de sptking 3' Éxon 2
i
1
Mutado 1/ HMMUfmr
, . «Í A G T C T A T T T T C C C A C C C T T A 6 G C T 6 /
l r
100 110 \ 120 130
Sítio de sptking criptico Sítio de sptking autêntico

de splicing cr íptico sofre splicing em aproximadamentc bases descritos anteriormente sào exemplos de processos
90% dos eventos de splicing 3' do í ntron 1. Esse splicing
aberrante deixa 19 nucleotídeos adicionais no RN Am
que criam mutação. As reversões podem ser provoca -
das por mecanismos similares. Em um tipo de reversão,
maduro; esses nucleotídeos foram removidos nos ou
tros 10% dos transcritos maduros, que sofrem splicing
- chamada reversão verdadeira , a sequê ncia de DNA do
tipo selvagem é restabelecida para codificar sua men -
no sítio 3' do íntron 1. Na Análise Genética 12.1, você sagem original por meio de uma segunda mutação no
pode praticar a identificação dos tipos de mutações mesmo local ou dentro do mesmo códon ( Figura 12.6a ).
pelas alterações que produzem nos polipeptídeos. De modo alternativo, a reversão pode ocorrer por meio

Muta çã o anterógrada e reversa (ou reversão)

A mutação anterógrada, muitas vezes identificada
apenas como "mutação", converte um alelo do tipo sel
vagem para um alelo mutado. Por outro lado, as muta -
ções identificadas como mutações reversas, ou, mais
frequentemente, como reversões, convertem uma mu
tação para um estado do tipo selvagem ou quase do tipo
selvagem. Os mecanismos de substituição de pares de
de uma segunda mutação em outra parte do gene. A Fi -
- —
gura 12.6b ilustra um exemplo desse tipo de reversão
uma reversão intragé nica . que ocorre por meio da
mutação em outra parte do mesmo gene. Aqui a muta-
ção inicial foi provocada pela remoção de dois pares de
bases e a reversão intragénica é uma inserção compen-
- satória de dois pares de bases perto do sítio de mutação
inicial, restabelecendo o alelo para uma forma quase do
tipo selvagem. A Figura 12.6c ilustra um exemplo de re-

—
(a) Reversão verdadeira ( c) Reversã o de segundo sítio

Tipo selvagem Mutação Revertente

Tipo selvagem Mutação Reversão
DNA
Fita codificadora S'
Fita-molde 3'
~
]j TTA / /
7 /~TÁ T /-»/ À AH / -»rE!À S
' ' '
TTM / — fflc íli
1( ~ 5'
Genótipo A' B* C
1
Pigmento
A r c
i
Pigmento
A~ B (T

Pigmento
azul azul azul
RNAm 5* 7/ UUA / «TITlClj / raj c i r y
Pollpept ídeo ( LOl Proteí na Prote ína Proteí na
de baixo de baixo de alto
\ transporte transporte transporte
A subsr tuiçáo de pares de A substituição de de pigmento de pigmento de pigmento
bases cria uma mutação pares oe bases revene
de sent do trocado. o códon alterado para Maior função Perda da função Perda da função
codticar o aminoã de transporte de transporte de transporte
odo (lej} do t po de pigmentol

(b) Reversão intragénica

selvagem.
Fenótlpo
#»
i
&

Fita
DNA Tipo selvagem

molde 3‘
~

AAT AAA
J
Fita codificadora 5' ] T T A T T T A G [A TGG TGT CCA
- 7/ T ACC ACA GGT

Muta çã o por
Ify
Ify
Dois pares de bases
a sL,
*
A

mudan ç a da
matriz de leitura
Tc são removidos. -
Flor azul escura -
Flor azul clara -
Flor azul escura

7/ TTA TTT ATS 6 TG TCC A //~~3'

5’
3 // A * í A A A * : L A I? GG f // 5'
"
A
Figura 12.6 Mutações por reversão, (a) Essa reversão
Mutação reversa AJQ. Dois pores de coses verdadeira restabelece a sequ ência de aminoácidos do tipo
por mudança da * 1 i
selvagem para o polipeptfdeo. (b) Essa reversão intragénica
matriz de leitura ^

-7 fTT Ã \ i i f U I l i A
reverte uma mutação por mudança da matriz de leitura
provocada por uma remoçã o de 2 bp e inser çã o de 2 bp em
l* um sítio próximo no gene. (c ) A reversão do segundo sitio
restabelece um fenótipo quase do tipo selvagem por meio de
A mutação adcional em um segundo local restabelece a matrtz de leitura.
uma mutação compensatória de um segundo gene.
 Capí tulo 12 Mutaçáo gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 391

AN Á LISE GENÉTICA
Um fragmento de um polipeptideo tem a seguinte sequência de aminoácidos do tipo selvagem:
Met-His- Ala-Trp- Asn-Gly-Glu-His- Arg
As sequências de aminoácidos dos três mutados são exibidas a seguir. Para cada mutado, identifi-
que o tipo de mutação que ocorre e especifique como a sequência de RNAm foi alterada.
Mutação 1: Met-His- Ala-Trp-Lys -Gly-Glu-His- Arg
Mutação 2: Met-His- Ala
-
Mutação 3: Met-Met -Leu-Gly-Met - Ala -Glu His- Arg

Estrat é gias de solução Etapas da solu ção

Avaliar
1. Identifique o tópko abordado por .
1 Este problema diz respeito à s mutações que afetam a sequência de aminoáci-
este problema e explique a natureza .
dos de um gene O tipo de mudança que gera cada mutação precisa ser identifi-
da resposta solicitada. cado e o efeito da mutaçáo no RNAm precisa ser descrito.

.
2 Identifique as informações críticas .
2 A sequência de aminoácidos do tipo selvagem e as partes correspondentes dos
fornecidas no problema. polipeptídeos mutados sáo fornecidas.

Deduzir
3) Determine a sequência de RNAm do (3.J A sequência de RNAm do tipo selvagem é
tipo selvagem.
/
J
5' AUG CA7C GCN UGG AAu/ GGN GAVC CA7C7CGN 3'
- = -
Dica: U w M w a postç So poder ser ocupada
; Dicê: Use 0 código qenetKo da Tabela IJ.
*-
pof qualquer nudeoriderx\ pan as purirws a
terrjçtvas e V, par» as pnlmdlw altemadwas

Solucionar
.
4 Compare cada sequência mutado .
4 As comparações sáo:
com o polipeptideo do tipo selva- Mutado 1: essa é uma mutação de sentido trocado em que o polipeptideo mu-
gem e identifique os prováveis tipos tado tem um aminoácido trocado de Asn para Lys.
de mutações. Mutado 2: essa é uma mutação sem sentido em que um códon Trp é trocado
por um códon de parada.
Mutado 3: esse mutado contém alterações de cinco aminoácidos consecutivos,
começando pelo segundo aminoácido (His por Met ). A sequência do tipo sei
vagem é restaurada, começando pelo sétimo aminoácido (Glu). Esse mutado
resulta de duas mutações compensatórias por mudança da matriz de leitura. A
primeira altera a matriz de leitura e a segunda a restabelece.

.
5 Determine a alteração no RNAm que .
5 0 códon do tipo selvagem (Asn) é AA:/C e o códon mutado (Lys) é AA7o Essa-
produz o mutado de sentido trocado. alteração resulta de uma mutação por transversâo .
.
6 Determine a alteração no RNAm que .
6 O códon do tipo selvagem Trp (UGG) é trocado por um códon de parada. A mu-
produz o mutado sem sentido. .
dança é UGG por UGA ou UGG por UAG Em qualquer um dos casos, essa é uma
mutaçáo por transiçã o .
.
7 Determine a alteração no RNAm que .
7 O surgimento do Met na posição 2 significa que o segundo c ódon do mutado
produz o mutado por mudança na .
por mudança da matriz de leitura é AUG Essa alteração exige a remoção da pri-
matriz de leitura. meira C da sequência do tipo selvagem e significa que U, e não Cr está presente
como o sexto nudeotídeo do tipo selvagem. Começando pek) Glu, a sequência
de aminoácido do tipo selvagem é restaurada. Isso exige a inserção de G ime-
diatamente apó s o códon Ala.

Para praticar mais, ver Problemas 4, 9 e 28 .

392 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
versão de segundo sítio, produzida pela mutação em
um gene diferente. Nesse caso, a mutação original ina
tiva o gene A e resulta na perda de função da proteí na
de alto transporte de pigmento em uma flor. Um gene de
baixo transporte de pigmento, R, permanece ativo, trans-
portando uma pequena quantidade de pigmento azul do
gene G A mutação inicial produz uma flor azul-clara. A
reversão do segundo sítio é uma mutação do gene B que
aumenta a transcrição gênica e, assim , aumenta a produ -
ção da proteína transportadora de pigmento. A mutação
do gene B compensa a mutação do gene A e restabelece o
-
fenótipo da flor azul escura do tipo selvagem. Uma mu
tação de segundo sítio desse tipo também pode ser iden-
tificada como uma mutação supressora.
Observa çã o gen ética As mutações pontuais são provo-
.
cadas por substituições Inserções ou remoções de bases simples
nos segmentos codificadores dos genes e podem gerar proteí
nas anormais. As mutações regulat órias alteram a quantidade
de proteí na do tipo selvagem produzida. As reversões anulam
a consequência fenotípka das mutações anterógradas e restau-
ram plena ou substancialmente o fenótipo do tipo selvagem.
12.3 As muta ções gênicas podem
surgir de eventos espont âneos
Na muta ção espontâ nea , as mutações de ocor
rência natural surgem nas células sem ser induzidas
pela exposição do DNA a um agente físico, químico ou
biológico capaz de gerar danos ao DNA. As mutações
espontâneas surgem basicamente por meio de erros du-
rante a replicação do DNA e por meio de mudan ças es-
pontâ neas na estrutura química das bases nudeotídicas.
Erros de replicação do DNA
A replicação do DNA tem uma fidelidade extraor
dinariamente alta. Os erros de replicação que resultam
na combinaçã o malsucedida dos pares de bases entre
uma fita- molde c uma fita recém-sintetizada do DNA
ocorrem em uma taxa aproximada de 1 X 10 9 na Esche
richia coli do tipo selvagem, e uma taxa de acurácia si-
milar é encontrada na replicação do DNA eucariótico.
A eficiê ncia global da replicação do DNA é atribuível à
capacidade de correção de erros das DNA polimerases
-
e à operação dos sistemas de reparo reparo de erros de
combinação nos pares de bases do DNA (Seção 12.5).
Uma exceção à acurácia geral da replicação, poré m,
é observada nas regiões gcnó micas contendo sequê ncias
repetidas. Os erros de replicação nessas regiões mudam
o n ú mero de pares de bases nas sequê ncias repetidas
e são outra fonte de hotspots de mutação. As sequên -
cias de DNA repetidas frequentemente são repetições
curtas de ponta a ponta. Por exemplo, trechos consis
tindo em muitas repetições de ponta a ponta dos mes
mos dois nucleot ídeos ( repetições dinucleotídicas ), dos
mesmos trés nucleotídeos ( repetições trinucleotidicas)
- ou de unidades de repetição maiores são suscetíveis a
erros de replicação que surtem o efeito de aumentar ou
diminuir o n úmero de repetições.
Mutações que alteram o n úmero de repetições do
DNA ocorrem por um processo chamado deslizamento
da fita. Em meados dos anos 1960, George Streisinger e
colaboradores descreveram o primeiro exemplo conhe -
cido de deslizamento da fita, que gerou mutações por mu -
dança da matriz de leitura em um gene do bacteriófago
T4. Streisinger propôs que o deslizamento de fita ocorre
- quando a DNA polimerase do replissomo se dissocia tem -
porariamente da fita- molde enquanto se desloca por uma
região da sequência de DNA repetida ( Figura 12.7). Du -
rante a dissociação, uma parte do DNA recém - replicado
forma uma estrutura em hairpin temporária de fita dupla,
induzida pelo pareamento de bases complementares dos
nucleotídeos na alça. A reassociação da DNA polimerase
e a retomada da replicação levam a uma nova replicação
de uma parte da região repetida, aumentando o compri -
mento da região repetida na fita-filha. As sequências de
DNA repetidas frequentemente são hotspots de muta ção
em razão do deslizamento da fita.
Nas últimas duas décadas, uma categoria especial
de mutações foi identificada como uma causa de doen ça
hereditá ria em humanos e em outros organismos. As do-
enças hoje são classificadas como doen ças de repetição
de trinucleotídeos (Tabela 12*3). Os alelos do tipo sel -
- vagem dos genes em questão normalmente contêm
uma quantidade variável de repetições trinucleotidicas
de DNA. Em raras ocasiões, esses genes sofrem muta-
ção pelos eventos de deslizamento da fita que causam o
aumento do n ú mero de repetições de trinucleot ídeos.
Em cada um desses exemplos, a expansão do nú mero de
repetições de trinucleot ídeos além da faixa do tipo sel-
vagem resulta em uma doença hereditá ria que bloqueia
a produção do RNAm do tipo selvagem e reduz ou eli-
mina a produ çã o de proteínas do tipo selvagem.
-
Mudanças espontâneas das
bases nudeotídicas
- As bases nudeotídicas do DNA são estruturas quími-
cas orgânicas que às vezes podem ser convertidas, no que
são conhecidas como mudanças tautoméricas, em estru-
turas alternativas conhecidas como tautòmeros. Estes são
estruturas que tèm a mesma composição e organização
geral, mas uma ligeira diferença na ligação e colocação de
um hidrogénio. A geração de um tautômero muda a es-
trutura tridimensional da base nudeotídíca de uma forma
comum, mais estável, para uma forma rara , menos está-
vel. Mudanças tautoméricas que afetam as bases nitro-
genadas podem levar a uma combinação malsucedida de
pares de bases entre um tautômero raro em uma fita do
DNA e a forma comum na fita complementar.
- O pareamento equivocado dos nucleotídeos do DNA
- em razão da presen ça dos tautòmeros é a forma mais
comum de erro de replicação do DNA. A Figura 12.8a
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 393

O 1 2 3 4 5 6 Figura 12.7 Deslizamento da fita

1 1 1 i i
ir ir ír ir O segmente durante a replicar ã o do DNA.
5‘ 7/ T A A CAG CAG CA6 CAG CAG CAG TC jf 3' deQNA
yijATT GTC GTC GTC &TC GTC 6 TC k jT 5'
^ contendo seis
repetições do

Separaçao da fita
tripleto CAG .
o
TC 6 TC GTC GTC GTC 6 TC A 6 // 5'
I
Inicio da replkaçáo

o i

^^ if^/15
~ ~ ' Flta-molde
5' 7/ T A A C A S C A S CTITTA 6 CA 6 Fita- filha em
crescimento

Dissociação da fita e reassociação da fita

durante a síntese da fita-filha
O
~
i O ceslizamerto
3* 7/ A T T GTC GTC GTC GTC GTC
da fita-filha
G CAG CAG CAG forma uma alça
Pares de bases < em hairpin.
complementares
Replkaçáo parcial da
Par de bases fita-molde, produzindo
que não combinam 11 repetições CAG

Próximo ciclo de replkaçáo

i
o 1
I
1 r
2
I
ir
3
I
4
I
i r
5
ir
6
I
ir
7
I
ir
8
I
i r
9
ir
1 0
i r
1 1
I

7
5* C*
7
J'

Conclusão; o deslizamento da fita nas reg óes de sequência de DNA repetidas leva a uma
alfpraçào no número de elementos repetidos

mostra o paramento de bases padrão envolvendo for
mas tautoméricas comuns das bases nucleot ídicas. Em
comparação, as combinações malsucedidas que ocorrem
entre um nucleotídeo tautomérico raro e um nucleotídeo
normal são exibidas na figur» 12, 8b. Repare que, em cada
caso de combinação malsucedida, o pareamento purina
-pírimklina é mantido, mas o tautòmero raro forma o n ú
- mero errado de pontes de hidrogénio, levando ao parea-
mento equivocado.
Mudanças tautoméricas podem levar a mutações
.
por substituição de pares de bases Na igura 12.9, a rara
forma en ólica da timina é pareada incorretamente com
- a guanina durante a replicação do DNA Três pontes de.
- hidrogénio está veis se formam entre esses nucleotídeos

Tabala 12.3 Doenças humanas de repetição de trlnucleotídeos

Número Sequência
Doença Omim repetida Faixa de repetição Fenótipo da doença principal
Normal Doença
Síndrome do X frágil 309550 CGG 6-50 200- 2000 Deficiência intelectual
Ataxia de Friedrelch 229300 GAA 6- 29 200-900 Perda òe coordenação
Doença de Huntí ngton 143100 CAG 10 34 40 200 Movimento descontrolado
Sí ndrome de Jacobsen 147791 CGG 11 100 1000 Retardo do crescimento
Distrofia miotònka (tipo I) 160900 CTG 5-37 80- 1000 Fraqueza muscular
Atrofia muscular espinhal e bulbar 313200 CAG 14- 32 40-55 Perda muscular
Ataxia esplnocerebelar ( várias formas) 271245 CAG 4 - 44 45- 140 Perda de coordenaçã o
394 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

(a ) Pareamento de bases padrão

ídeos padrão e
Nucleot
pdfcdrrxaito de bd 3
*

a
*
( b) Pareamento de bases envolvendo tautômeros raros Mudança tautoménca da
forma T (eetônica) comum
HjC para a forma T (erólica) rara

o ,o
| Replicarão |
H
- N

Taut Ômero H
O tautômero T
(enólico) pareia
equivocada*
mentecom
G (cetônico).

Mudança
tautomérica de
T (enólCa) para
T (cetôníca) CL | Replicaçáo |

Mutação por
transição.
-
A T - -
G C

Mutado Tipo selvagem

Figura 12.9 Mutação por transição oriunda de uma
mudanç a tautomérica da forma cetònica comum da
timina para a forma enólka rara.
TautÔmero raro

pareados incorretamente. Uma mudança tautomérica

Figura 12.8 Pareamento de bases de tautômeros
nucleot ídicos. (a ) Pareamento de bases padrão de
tautômeros nucleotídicos comuns, (b) Equívocos no
pareamento de bases resultantes do pareamento de um
tautômero nudeotí dico comum e um incomum.
da timina de volta para sua forma comum, seguida pela
replicaçã o do pareamento equivocado e não corrigido
dos pares de bases, produz uma cromá tide com um par
de bases T - A do tipo selvagem e a cromá tide irmã com
uma mutação por substituição do par de bases C - G.
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 395

( a ) Despurina çá o Desamina çà o, a perda de um grupo amina ( NH2)

Quebra da ligação de uma base nucleotídica, é uma segunda forma de mo-
dificação química espontâ nea que pode levar â muta -
o; o ção. Cada uma das bases nucleotídicas do DNA contém
3 um grupo amina. A desaminaçào da citosina frequen -
/
0 Sítio apirinico temente é uma fonte de mutação. Quando a citosina é
desaminada , o grupo amina normalmente é substitu ído
por um átomo de oxigénio, formando a base nucleoti -
.
dica uracila { Figura 12.11a ) O reparo do pareamento
equivocado do DNA reconhece prontamente a uracila
como unta base nucleotídica de RNA e a remove do
Despurina çáo^0
Sitio apurfnico DNA. A uracila excisada é substitu ída pela citosina e a
sequência do tipo selvagem é restaurada.
7/
5' TTA HCG " 3' // 5' 7 £ 3' No entanto, tem -se um cenário diferente quando a
7/
3' AAT tSC 5' /f 3'7 / AAT CGClf 5' desaminaçào ocorre em uma citosina que foi metilada
Sequência do tipo selvagem

(b) Cido 1 de replicaçâo do DNA

— em outras palavras, uma citosina na qual um á tomo
de hidrogénio no carbono n ú mero 5 foi substitu ído por
A adenina é incorporada com
um grupo CH, ( metila ). A desaminaçào da 5- metilcito-
mais frequência levando a sina ( 5meC) cria timina e gera um pareamento errado
Sítio apurínico uma mutação por transição entre a recé m-formada timina em uma fita e a guanina
Q anterí ormente complementar em outra fita (Figura
amimei
3- 7 C 5' ->
S'
3'
7
7
C 3’
Cr
12.11b). Se as enzimas de reparo do pareamento equi
vocado corrigirem esse pareamento antes do próximo
-
Dú plex filha mutado ciclo de replica çâo do DNA, dois resultados sâo possí-
veis: (1) O reparo vai restaurar o par de bases G - C do
s LuÁ AtèlCy
^7/
3' AAT CGC
Duplex filha do
ir 5'
tipo selvagem ou (2) o reparo vai gerar uma substituição
por transição do par de bases A T (Figura 12.11c). De
*

modo alternativo, se o reparo do pareamento equivo-

tipo selvagem
Figura 12.10 Despurinaçáo. (a) Quebra da ligação de
carbono 1' libera uma purina e cria um s ítio apurí nico.
(b) A adenina é utilizada com mais frequência para preencher
.
os sítios apurfnicos durante a replicaçâo do DNA provocando
-
uma mutação, neste caso, de G C para A T -.
Lesões nucleotídicas no DNA
Dois tipos de danos espontâneos em cada nucleotí
deo estão associados com uma mutação subsequente. A
- como CpG (o p significa a ú nica liga çã o fosfato da li -
despurinaçáo é a perda de uma das purinas, adenina ou
guanina , de um nuclcotídco pela quebra da ligação cova-
lente no carbono 1’ da desoxirribose que liga o açúcar à
base nucleot ídica ( Figura 12.10 ). As células vivas perdem
milhares de purinas por dia, tomando a despurinaçáo uma
das mais frequentes mudanças químicas espontâneas que
afetam o DNA. Felizmente, quase todas as purinas perdi
das sâo substitu ídas antes do próximo ciclo de replicaçâo
-
do DNA (o mecanismo de reparo é discutido mais tarde
neste capítulo), mas algumas nào são. Uma lesào não cor-
rida desse tipo se chama sítio apurínico, significando um
nudeotídeo que não possui uma base purina. Durante a
replicaçâo, o sítio apurínico não contém uma base- molde
e a DNA polimerase normalmente compensa colocando
uma adenina ( mas, às vezes, uma guanina ) oposta ao
local. Durante o próximo dclo de replicaçâo do DNA, o
sítio apurínico mais uma vez atrai uma adenina para a fita
recém - sintetizada. Nesse meio tempo, a fita complemen -
tar com a adenina incorporada controla a síntese de uma
d ú plex filha que contém uma mutação por substituição
de pares de bases se a purina perdida for a G.
cado não ocorrer antes da replicaçâ o, a fita contendo
guanina será utilizada para produzir uma duplex filha
com a sequê ncia do tipo selvagem ( G - C), enquanto a
fita contendo timina será utilizada para sintetizar uma
duplex filha contendo uma substituição de par de bases
G - C por A - T (Figura 12.11d ).
As citosi nas que estã o lado a lado com as guani -
nas em uma fita de DNA são unidas por uma ligação
fosfodiéster. Esses dinucleotídeos são identificados
gação fosfodiéster ). As citosinas dos dinucleot ídeos
CpG são alvos frequentes da metilação nos promo -
tores mamíferos, onde a metilaçã o ajuda a regular a
transcriçã o. A evid ê ncia experimental mostra que os
dinucleot ídeos CpG sã o hot& pots de mutação em con
sequê ncia da desaminaçào da citosina metilada e da
-
produção de timina.
Observa çã o gen é tica Os nudeotideos sofrem mudan -
ças qu ímicas espontâ neas, como, por exemplo, as mudanças
tautoméricas, a despurinaçáo e a desaminaçào. que podem
levar ã mutação.
12.4 As mutações podem ser induzidas
por substâncias químicas ou
radiação ionizante
Mutações induzidas são produzidas pela intera
ção entre o DNA e um agente f ísico, qu í mico ou bio
-
-
396 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

•
( ) ( b)

Dcsaminaçá o DesamlrvaçAo

Otosina (C) Uradla ( U) 5- metikitosina Timina (T)

-
(5 meC)

(O
~
ljf ~ 3’
Reparo usando a fwa T como molde. S'
3*
ji C Tp
7/ ^
fiAH í
GAT
lTTjf 5 '
Muta ção po' transição (C G- -
T A)

*'1 Cl'
*1 C 5'
Par de bases equivocado Reparo usando a fita G como molde. 5' 7 C 3' -
Par de bases C G do tipo
CTA A / í- 5'
t
selvagem restaurado

(d )

5'
3 -7J £ 5-
Replicação do CNA sem
reparo do erro de pareamenta
o/
*1 si GAT
CTA
V Ê*
»// 5'
" Muta ção po' ransição (C G -
— -
T A)

rReplicação do CNA sem Sequ ência do tipo selvagem.

Par de bases equivocado
rpparo do erro de pareamento 3r 7/ SAC CTA Aff 5 *

Figura 12.11 Desaminaçáo. (a ) A crtosina não metilada é desaminada para formar uracila. ( b ) A desaminaçáo da 5- metilcitosina
forma timina pareada equlvocadamente com a guanina . (c ) O reparo do pareamento equivocado pode criar uma mutação por
-
transiçã o de G - C para A T ou pode remover a timina para restaurar a sequê ncia do tipo selvagem (d ) Os erros de pareamento
,

não corrigidos são replicados e produzem uma cromátide do tipo selvagem e uma cromátide de mutação por transição.

lógico que gera danos que resultam em mutação. Os Mutagénicos químicos

agentes que geram danos ao DNA indutores de mu -
taçã o se chamam mutágenos. Conforme discutimos
nesta seção, os mutágenos quí micos e físicos intera -
gem com o DNA de maneiras espec í ficas para criar de
terminados tipos de mudanças na sequência. Os mutá
genos biológicos são basicamente elementos genéticos
transpon íveis ( ver discussão no Capítulo 13) . Os mu -
tágenos às vezes são exóticos e raros, mas muitas vezes
est&O rotineira mente presentes na vida di á ria de um
organismo. Por essa ra2ào, o estudo da mutagénese
é tào importante para a sa úde pú blica e a segurança
quanto para aumentar nossa compreensão da base
biol ógica da mutação e do reparo. Começamos a dis-
cussão dos mutá genos examinando as reações quí mi -
cas que provocam mutações; passamos para o exame
detalhado da ação da radiação ultravioleta ( UV ), um
mutágeno físico ao qual os seres humanos e outros
organismos são expostos diariamente , e conclu í mos a
seção com uma discussão sobre o teste de Ames , um
procedimento biológico para avaliar o potencial muta
gènico dos compostos químicos.
Os compostos químicos que induzem mutações o
fazem por meio de interações específicas e caracterís-
ticas com as bases nucleot ídicas do DNA . Consequen -
- temente, eles podem ser classificados por seu modo de
- ação sobre o DNA . Fies podem agir como ( 1 ) aná logos
das bases nucleotídicas, (2) agentes desaminantes, ( 3)
agentes alquilantes, (4) agentes oxidantes, ( 5) agentes
hidroxilantes ou (6) agentes intercalantes. Os compos -
tos em cada uma dessas categorias e os tipos de muta-
ções que causam são apresentados na Tabela 12.4. Em
suma, cada mutágeno reage de uma maneira especí fica
com o DNA e, como resultado dessa reação, produz um
tipo coerente de mutação.
Aná logos das bases nucleot ídicas Um aná logo de
base é um composto qu í mico que tem uma estrutura
similar à dos nucleotídeos do DNA e, portanto, pode
penetrar no DNA , onde forma par com um nucleo-
t ídeo. As DNA polimerases sã o incapazes de distin -
- guir os análogos de base dos nucleotídeos normais em
raz ão de sua semelhança em tamanho e forma mo-
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 397

Tabela 12.4 Exemplos de agentes mutagènkos e suas consequências

Mutá geno Tipo de agente Evento mutag énko (com exemplo )
2- Amlnopurlna Aná logo de base - - T-A
Mutação por transição ( C G 4 )

5 Bromodesoxiundina Aná logo de base Mutação por transição (G C- - A - T)

4

Metanossulfonato de etila Agente alquilante Mutação por transição G - - A - T

( C 4 )

Hidroxilamina Agente hidroxilante Mutação por transição (C - G - T - A

4 )

Óxido nitroso Agente desaminante Mutação por transição ( C - G - T - A

4 )

Radicais oxigenados Agente oxidatlvo Mutação por transversào ( G C - -4 A - T)

Laranja de acrldina Agente Intercalante Mutação por mudança de matriz de leitura
Proflavlna Agente Intercala nte Muta ção por mudança de matriz de leitura

lecular. Consequentemente, os análogos de base são
incorporados nas fitas de DNA durante a replicação.
Como os análogos de base se assemelham a nucleo -
tídeos end ógenos ( isto é, os nucleot ídeos produzidos
pelo corpo), as muta ções que eles induzem são tran
sições. Por exemplo, o composto 5- bromodesoxiuri-
dina ( BrdU ) é um derivado da uracila muito similar
à timina quanto ao tamanho e à forma. Nas células,
ele age como um análogo da timina . Após a incor -
pora çã o do BrdU durante a replica çã o do DNA , ele
forma par com a adenina ( Figura 12.12 ). A replica ção
da fita - molde contendo a adenina equivocadamente
pareada resulta em uma mutação por transversào de
C - G para A - T no exemplo exibido na figura . O BrdU
sofre tautomerização com muito mais facilidade que
seu an álogo, a timina. Em sua forma tautom é rica , o
BrdU pode levar a muta ções também nos ciclos de
replicação posteriores. Outros análogos de base pro-
duzem diferentes mutações por substituiçã o de pares
de bases. Por exemplo, o composto 2- aminopurina ( 2-
- AP) é um análogo de base da adenina que pareia com
a timina e pode levar a qualquer um dos tipos de mu
taçã o por transição.
Agentes desaminantes O ácido nitroso ( HN 02) é um
agente desaminante, ou seja , um agente que remove
um grupo amina ( NH2 ). Ele é capaz de remover grupos
amina de qualquer nucleot ídeo. Na maioria dos casos,
a desaminação n ão produz nenhum efeito mutagé nico;
-
mas a desaminação da 5 metilcitosina (exibida na Fi -
gura 12.11) é uma exceção, levando a uma substituição
- - -
de pares de bases G C por A T. Alé m disso, quando
o ácido nitroso desamina a adenina , o produto é a hi -
poxantina , um nucleot ídeo modificado que pode pa -
rear equivocadamente com a citosina e levar a uma
mutação por substituição de pares de bases C G por -
T - A (Figura 12.13a ) .
Agentes alquilantes Os agentes alquilantes adicio-
nam grupos laterais volumosos, como os grupos me
—
*
tila (CHj) c etila (CHf CHa), às bases de nucleotídeos.
Esses grupos adicionados são conhecidos como adutos
volumosos. O metanossulfonato de etila ( EMS) é um
poderoso agente alquilante que adiciona um grupo etila
à timina , produzindo 4-etiltimina, ou um grupo etila à
guanina, criando O^ -etilguanina (Figura 12.13b). Esse
e outros adutos volumosos interferem no pareamento
normal das bases de DNA e podem distorcer a dupla -
- -hélice do DNA.
Agentes hidroxilantesA hidroxilação é a adição de
um grupo hidroxila (OH ) a um composto receptor
por um doador chamado agente hidroxilante. A hidro-
xilamina é um agente hidroxilante que adiciona um

Replicado do DMA 7/ CTC

5' T /Ç 3'
£ 5'
Replicação do DMA
3- 7
5' /JLI.C.S W -H Ç y
jgzrcqA ?£ 5
^
Incorporação do BrdU e pareamerto
- Replicação do DNA —• *>
Mutado

equivocado com a adenira.

Pareamento equivocado
Sequência do ~ do análogo de base
tipo selvagem Replicação do DMA
3’ 7/ 6 A G CG Á A // 5' T\po selvagem produzido
pela replicação do DNA
5*
Tipo selvagem
Figura 12.12 Mutação por incorporação do análogo de base nudeotídica 5-bromouridína ( BrdU).
398 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Mecanismo mutaclonal
Novo nucleotfdeo Par de bases Par
Base normal Mutá geno Base modificada parceiro original modificado Muta çã o

—
Acido nitroso Mutação por
( HNO ) , C transição

— c ( AI GC)
Agente desammante
remove grupos
Adenlna amlna.

(b)
Metanossutfonato
"T"W°

H
/
N

Guanlna
-H —
deetlla
(EMS)

Agente alquiã me
adiciona
grupos etia.
CT- Etilguanlnal
A
T
—
Mutação por
trarsição
(G-C A T)-

(0 H
/

—
H
Hldroxilamina Mutação por
(NH ,OH) C (NH,OH) c* T
- H • N N III III II transição
-
(C G T-A)
Agente hadroxiante
— adiciona gnjpos
nidroxila.
H >= N
\ G A A

Citosina Hidroorilaminocitosina Adenina

Figura 12.13 Exemplos da ação dos mutágenos químicos. Em (a), H é a hipoxantina. Em ( b) e (c). os asteriscos (*)
representam nucleot ídeos modificados.

grupo hidroxila à citosina deslocando um H3, criando
assim hidroxilaminodtosina ( Figura 12.13c) A hidro
xilaminocitosina costuma parear com a guanina mas
frequentemente pareia equivocadamente com a ade
nina , levando a mutações por transiçã o de pares de
- — -
bases C G > T A.
Reações oxidativas Oxidação é um processo químico
de transferência de elétrons pela adição de um átomo de
oxigé nio ou pela remoção de um á tomo de hidrogénio.
As reações oxidativas que levam à mutação resultam
quando os compostos que contém formas reativas do
oxigé nio ( muitas vezes identificadas como radicais oxi
genados) reagem com as bases de DNA. Um exemplo de
mutação originária da ação de um composto oxidativo
é a produção de 8-oxi-7,8-di - hidro-deoxiguanosina a
partir da guanina pela adição de um átomo de oxigénio
ao carbono 7 e a transferência de um átomo de hidro-
génio do carbono 8 para o carbono 7 do anel de purina .
A forma oxidada da guanina costuma parear equivoca
damente com a adenina, levando a uma mutação por
-
transversão ( G C para T A ). - mutágenos leva a substituições de pares de bases; o dano
Agentes intercalantes do DNA Uma série de pequenos
compostos moleculares , chamados agentes intercalan
tes, consegue se espremer entre os pares de bases dc
. - DNA. Os compostos intercalantes do DNA , como a
. profiavina , o benzo(a ) pireno ( um composto da fuma ça
- do cigarro) e a aflatoxina ( uma toxina encontrada em
amendoins contaminados com mofo), são grandes com -
postos que podem se infiltrar entre os pares de bases
.
e distorcer a fita dupla ( Figura 12.14 ) Esses compostos
também podem se associar a bases nucleot ídicas, for-
mando adutos volumosos que contribuem para a dis-
torção do DNA. Essas distorções helicoidais levam a
um corte da fita de DNA que nã o é reparado eficiente
mente . No próximo ciclo de replicação, as fitas cortadas
-
- podem ganhar ou perder um ou mais nudeotídeos. Em
consequ ência, os agentes intercalantes causam muta-
ções por mudança da matriz de leitura.
Observa çã o gen é tica Mutágenos qu ímicos interagem
com o DNA por meio de mecanismos diversos, mas cada mu-
- tágeno em particular modifica o DNA de modo sistemá tico
para criar danos caracteristieos a ele. 0 dano criado por alguns
criado por outros mutágenos leva a muta ções por mudança
damatnz de leitura .
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga
Proflavina
Benzoíajpireno P]
Figura 12.14 Agentes intercalantes do DNA A . anterior na nova fita. A formação de pontes de hidrogé-
-
proflavina e o benzo< a) pireno se intercalam na dupla hélice e
distorcem sua forma, levando a mutações.
Danos ao DNA induzidos por radia ção
A energia eletromagné tica é convertida em ondas,
ou raios, e categorizada por seu comprimento de onda,
que é a distância entre os pontos equivalentes em suas
cavas ou picos repetidos. A radiação de energia mais
alta tem comprimentos de onda mais curtos que a ener-
gia dc radiação mais baixa. Uma categoria dc energia
eletromagnética é a luz visível, que tem comprimentos
de onda entre aproximadamente 750 mm e 380 nm.
I odas as formas de energia radiante com comprimen -
tos de onda menores que 380 nm, ou seja, toda a energia
eletromagné tica acima do espectro visível, podem pro-
vocar danos ao DNA e são mutagénicas. Essas formas
de radiaçã o que danificam o DNA sã o radiações ultra
violeta, raios X , raios gama e raios cósmicos. A radiaçã o
ultravioleta ( UV), produzida como um componente da
luz solar , é o mutágeno ao qual nós e outros organismos
somos mais frequentemente expostos.
Assim como os efeitos dos mut ágenos químicos, a
mutagenicidade deriva da radiação UV das lesões es -
pecíficas que ela cria no DNA. A radiação UV altera os
nucleotídeos do DNA, incitando a formação de outras
pontes que formam estruturas aberrantes cltamadas fo-
toprodutos. Um tipo de fotoproduto, chamado d ímero
de pirimidina , é produzido pela formação de uma ou
duas outras ligações covalentes entre dinucleot ídeos pi
rimidina adjacentes em uma fita de DNA. Existem dois
tipos proeminentes dc d ímeros de pirimidina ( Figura
12.15 ). Um deles é um d í mero de timina , que possui
duas ligações covalentes unindo os carbonos 5 e 6 das
timinas adjacentes na mesma fita de DNA. O segundo,
chamado fotoproduto 6- 4, també m une timinas adja
399
centes pela formação de uma ligação entre o carbono
6 de uma timina e o carbono 4 de outra. Qualquer um
desses dois complexos diméricos també m pode envol -
ver a outra pirimidina, a citosina , embora esta seja in-
cluída com menos frequência que a timina. A forma ção
desses dímeros distorce o DNA, empurrando as bases
nucleot ídicas dimerizadas para mais perto umas das ou -
tras e perturbando a forma çã o das pontes de hidrogénio
com seus nucleotídeos complementares na fita oposta.
Os organismos, das bactérias aos seres humanos,
possuem sistemas de reparo do DNA que identificam e
corrigem a maioria dos dímeros de pirimidina, mas al -
guns escapam do reparo e, quando o fazem, a replicaçào
do DNA pode ser perturbada. Considere o problema
apresentado durante a replicaçào quando os dímeros
de pirimidina são encontrados pela DNA polimerase
durante suas atividades de síntese e reparo de erros
(ver Seção 7.4). A DNA polimerase acrescenta novos
nucleotídeos às fitas de DNA nascentes, identificando
o nucleotídeo complementar à fita - molde e depois ca-
talisando a formação de ligações fosfodiéster entre o 5'
trifosfato do novo nucleotídeo e o 3* OH do nucleot ídeo
nio entre os nucleotídeos complementares na fita antiga
e na recém -sintetizada orienta o 3*OH do nucleot ídeo
adicionado anteriormente de modo a estar na posição
correta para reagir com o 5’trifosfato do nucleotídeo que
está chegando. Uma base equivocada em uma fita de
DNA nascente não vai conseguir formar pontes de hidro -
gé nio com o nucleotídeo na fita molde, deixando o 3'OH
fora de posição à medida que a DNA polimerase tenta
catalisar a próxima ligação fosfodiéster. Essa ocorrência
ativa a função de reparo de erros da DNA polimerase.
Mais especificamente, quando encontra timinas
em um d ímero na fita - molde, a DNA polimerase tenta
adicionar adeninas complementares à fita de DNA
nascente. Mas a primeira adenina n ã o consegue for-
mar as pontes de hidrogénio necessá rias, pois o posi-
cionamento de sua parceira complementar é distor -
- cido. Na tentativa de adicionar a segunda adenina, a
DNA polimerase identifica o 3'OH mal posicionado da
primeira adenina e inicia a atividade de reparo de erros
do d í mero de timina
—
de 5' para 3’ e depois tenta retomar a síntese na região
mas com o mesmo resultado
negativo. A repetição contínua dessas tentativas mal
sucedidas de replicar através do d í mero de timina faz
-
que a replicaçào pare nesse ponto.
Como o processo de replicaçào supera o bloqueio
provocado pela presença de dímeros de pirimidina ? Ela
contorna o problema de duas maneiras. Primeiro, o blo-
queio da replicaçào pelos d ímeros de pirimidina induz
- a reiniciaçào da síntese do DNA em um sítio adjacente
de prí nter de RNA. A reinicia çào da replicaçào possivel-
mente deixa lacunas que abrangem de dezenas a cente-
nas de nucleotídeos nas fitas de DNA recém -sintet íza -
das, mas as lacunas são preenchidas subsequentemente
pela sí ntese de DNA translesào, que é executada por
- DNA polimerases especializadas ( uma nas bacté rias e
400 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

-
Fotoproduto 6 4
H

Figura 12.15 Fotoprodutos UV. A radiaçã o UV forma fotoprodutos a partir das pirimid í nas adjacentes, distorcendo a dupla *

-hélice e possivelmente bloqueando a replicaçáo.

vá rias nos eucariotos ) que conseguem replicar através
das lacunas. Essas DNA polimerases especializadas sáo
mais propensas a erros de replicaçáo, pois não têm ca
pacidade de correção de erros. Na verdade, é a ausência
da atividade de correção de erros que permite à s poli
merases realizarem a replicaçáo através dos d ímeros de
pirimidina. Desse modo, a replicaçáo pode avançar , mas
.
com o risco de introduzir mutações Discutimos mais o
processo na Seção 12.6.
A radiaçã o com energia mais alta que ondas UV ,
raios X e materiais radioativos, por exemplo , pode
causar danos ao DNA de vá rias formas, a mais grave
delas sendo a indu ção de quebras na fita simples ou
dupla do DNA. Essas quebras bloqueiam potencial-
mente a replica çáo do DNA e , assim , representam
uma ameaça importante para a integridade e a so-
brevivência das células afetadas. Esse tipo de dano ao
DNA é enfrentado com mecanismos de reparo espe
cializados na quebra de fitas, os quais discutimos mais
adiante neste capítulo.
Observa çã o gen é tica A energia de radiação nos com-
primentos de onda menores que 380 nm é mutagénica. A
- radiação ultravioleta é um mutá geno frequentemente encon -
trado que uia d í meros de pirimidina no DNA e que pode levar
- a mutações por substituição. A radiação de energia mais alta
pode induzir quebras na fita de DNA.
Teste de Ames
Em nossas vidas diárias, encontramos dezenas de
produtos qu ímicos naturais e sinté ticos nos alimentos
que ingerimos, no ar que respiramos, nos carros que di -
rigimos e até mesmo nos livros que lemos. A cada ano,
centenas de novos compostos qu ímicos sáo introduzi -
dos como parte de vá rios processos comerciais e indus-
triais. De que forma determinamos se esses produtos
- químicos representam um perigo para a nossa sa úde ao
aumentarem as frequências de mutação dos genes? Às
vezes, o potencial mutagé nico ou carcinogè nico de um
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 401

composto é tào grande que a evidê ncia de seu perigo Experimento dt exemplo Resultados de exemplo
é relativamente fácil de identificar. No entanto, com
muito mais frequê ncia a mutagenicidade de um com -
posto é mais sutil, sendo necessá ria uma an álise cuida -
-
dosa dos dados experimentais para averiguá la.
Durante 40 anos, milhares de compostos naturais e
Extrato S9
sintéticos foram testados quanto ao potencial mutagénico Testar o produto
por um simples teste biológico desenvolvido por Bruce qu ímico adktonado
ao disco de filtro Resultado
Ames. Esse procedimento, chamado teste de Ames, positivo
Cultura
expõe bactérias aos compostos experimentais na presença
de uma mistura de enzimas purificadas produzidas pelo
experimental
com cepa 1 h /r
i Incuba çã o
(substituição
f gado de mam íferos. Nos animais, os produtos químicos
í de base) Mistura colocada ( reversão
ingeridos são enviados para o í f gado, onde são decompos- em placa contendo Importante)
Mutado por melo de cultura
tos por enzimas desintoxicantes. Usando um subconjunto substituição sem histidina
crítico de enzimas hepáticas desintoxicantes, chamado de base da
cepa 1 his'

extrato S9, o teste de Ames imita os processos de defesa

biológica que ocorrem no í f gado dos animais expostos
aos compostos químicos. Durante a decomposição enzi -
má tica no íf gado, vários produtos intermediários podem Testar o produto
qu í mico adicionado
ser produzidos, alguns deles podendo ser mutagé nicos, ao disco de filtro Resultado
mesmo se o composto original n ão for. O propósito do negativo
Cultura
* Incuba çã o
teste de Ames é detectar se o composto original ou qual- experimental
com cepa 2 hHr
quer um dos produtos da decomposição é um mutágeno. ( mudança
Mistura colocada ( pouca
O teste de Ames utiliza mais frequentemente cepas de matriz
de leitura ) Mutado de em placa com reversão)
da bact éria Salmonella typhimurium que carrega muta - meio de cultura
matriz de sem histidina
ções que afetam sua capacidade para sintetizar o ami- leitura da
noácido histidina. Essas bacté rias são designadas his ,
' cepa 2 hir Nenhum produto qu í mico
para indicar que sua muta ção impede a síntese da histi - de teste adicionado Resultado
dina. Elas nâo vão crescer, a menos que contem com um
meio de cultura suplementado com histidina. O teste de Cultura de
controle
O
T do controle
Incuba çã o
Ames é concebido para identificar a taxa de mutações
Mistura colocada ( pouca
por reversão ( his para his* ) que restabelecem a capaci-
~
em placa com reversão)
dade das bactérias para sintetizar sua própria histidina, Cepa 1 hir meio de cultura
sem histidina
eliminando, assim, a necessidade de suplementa ção de
histidina no meio de cultura. Nenhum produto químico
de teste adicionado
O teste de Ames usa vá rias cepas hisr da 5. ty - Resultado
phimurium , cada uma carregando tipos diferentes de
mutações de genes sintetizadores de histidina . Algumas
Segunda
cuftura de
T Incuba ção
docontrole

cepas de teste carregam mutações por substituição de controle

Mistura colocada ( pouca
pares de bases (transição e transversào); outras carre- em placa com reversão)
Cepa 2 hisr meio de cultura
gam mutações por mudança da matriz de leitura. O uso ( para estimar a sem histidina
dessas cepas mutadas diferentes permite a detecçâo dos taxa de reversão
espontânea}
compostos que induzem mutações por substituição de
pares de bases, bem como os que induzem muta ções Figura 12.16 Teste de Ames para a mutagenicidade dos
por mudança da matriz de leitura, comparando as taxas compostos qu ímicos .
de reversão nas culturas bacterianas experimentais ex-
postas a possíveis mutágenos com as taxas de reversão controle contendo bactérias his e S9 são colocadas em
'

espontâ neas nas culturas de controle.
Em cada cultura experimental , o extrato S9 é adi-
cionado às cepas mutadas da S. typhimurium com mu-
tações por substituição de pares de bases ou mutações
por mudança de matriz de leitura , e cada mistura é
colocada separadamente em placas contendo um meio
de cultura sem histidina ( Figura 12.16 ). O composto de
teste, em diferentes concentrações, é adicionado a um
disco de papel de filtro no centro de cada placa de teste
e as placas são incubadas. Para determinar a frequê n -
cia de reversão espontâ nea de his para his\ culturas de
placas contendo meio de cultura sem histidina e as pla -
cas sâo incubadas. As bacté rias nas placas de controle
não são expostas ao composto de teste.
Os resultados do teste de Ames são interpretados
pela contagem do n úmero de colónias em crescimento
em cada placa e comparando os n úmeros uns com os
outros e com as placas de controle. Esses dados são usa -
dos para determinar se um composto de teste é mutagé-
nico e para desenvolver uma curva de resposta ao cresci-
mento, descrevendo como a concentração do composto
de teste afeta sua mutagenicidade. Um resultado posi -
 402 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
2.000 n
100
Cepa /ris de
'
S. typhtmurivm,
1.500 -
com substituições
2-
n
de pares de bases
5 seu DNA reparando a maioria das lesões que ocorrem
3m i .ooo -
a manter um equilíbrio delicado entre mutação e reparo.
>
.2
3 Por outro lado, um n ú mero muito pequeno de muta
500 - Cepa fos~ de
í um, com
5. typhimur
mutações por mudança
da matriz de leitura
TA 1538
0 identificam e reparam. Em termos gerais, esses proces
20 40 60 80 100
Dose de aflatoxina B , ( ng )
120
Figura 12.17 Mutagenkklade da aflatoxina B,,
determinada pelo teste de Ames. A aflatoxina B1 induz uma
alta taxa de reversão nas bactérias for com mutações por
substituição de pares de bases (cepa TA 100), mas não induz
mutados por mudança da matriz de leitura (cepa TA 1538).
tivo, indicando que o composto de teste é mutagénico, é
indicado por um aumento significativo na taxa de rever
são nas células bacterianas que sofrem um tipo de mu
tação em relação às que sofrem outro tipo de mutação e
em relação à taxa de reversão espontâ nea . DNA erró neo e sintetiza novamente a sequê ncia. Dois
Na Figura 12.17, a curva dose- resposta revela o forte
potencial mutagénico da aflatoxina Bj toxina produzida
(
pelo fungo Aspergillus que cresce em nozes e no milho.
Esse poderoso mutágeno induz grandes quantidades de
mutações por substituição de pares de bases na cepa
his ~ designada TA 100, que conté m uma substituição
de par de bases e é altamente sensível à aflatoxina B,.
F.m todas as doses testadas, a taxa de reversão da aflato-
xina B 1 nas cepas hitr com substituição de par de bases
é elevada acima da cepa TA 1538 da his\ que conté m
uma mutação por mudança da matriz de leitura. Esse
resultado indica que a aflatoxina Bj induz a reversão dos
mutados por substituição de par de bases, mas não dos
mutados por mudança da matriz de leitura. A Analise
Genética 12 J. vai guiá - lo por uma an á lise do teste de
Ames dc possíveis mutágenos.
Observa çã o gen é tica 0 teste de Ames identifica se
um composto produz mutação por substituição de par de
bases ou por mudança da matriz de leitura quantificando a
taxa de reversão de um genótipo for para um genótipo /rir
nas bactérias sujeitas aos compostos de teste.
12.5 Os sistemas de reparo corrigem
alguns danos ao DNA
A integridade estrutural e informacional do DNA
está sob ataque contí nuo de alterações qu ímicas es-
pontâneas c de vá rios mutágenos. Apesar desse desafio
permanente, os organismos preservam a fidelidade de
e deixando muito poucas mutações se acumularem. No
entanto, a sobrevivê ncia de uma espécie depende de
Um n úmero excessivo de mutações pode arruinar um
organismo e acabar afetando a sobrevivência da espécie.
-
ções vai limitar a gama de variabilidade genética e pode
dificultar a evolução da espécie.
Os organismos desenvolveram vários mecanismos
de reparo e muitas vezes esses mecanismos sã o parcial
mente redundantes no que diz respeito às lesões que
-
-
sos de reparo de danos caem em duas categorias: (1) os
140 que reparam diretamente os danos ao DNA e restabe -
lecem seu estado natural ( tipo selvagem ) e (2) os que
permitem que o organismo contorne problemas, como
o bloqueio da replicaçào do DNA, que podem ocorrer
quando o dano n ão é corrigido.
Reparo direto de danos ao DNA
A maneira mais direta de reparar lesões ao DNA é
identificar e depois reverter o dano ao DNA. Relembre
-- que um desses mecanismos diretos, a correçã o de erros
pela DNA polimerase (ver Capí tulo 7), que identifica um
pareamento de bases equivocado, remove o segmento de
sistemas de reparo adicionais que realizam o reparo de
danos ao DNA são identificados aqui.
Reparo da foto produtos induzidos por UV Os d í meros
de pirimidina , fotoprodutos comuns do dano ao DNA
induzido por UV, podem ser reparados diretamente
pelo reparo fotorreativo , um mecanismo de reparo do
DNA encontrado em bactérias, eucariotos unicelulares,
plantas e alguns animais ( por exemplo, Drosophihi ),
mas nã o nos seres humanos. A fotorreativaçâo utiliza a
enzima fotoliase para quebrar as ligações formadas du -
rante a dimerizaçâo da pirimidina. Na Figura 12.18, um
d ímero de t í mina produzido pela radiação UV é ligado
pela fotoliase. A energia da luz visível é absorvida pela
fotoliase e redirecionada para quebrar as ligações que
formam o d ímero. A fotoliase é o produto do gene phr
( reparo fotorreativo ) da £ coli . As mutações do gene
phr resultam em um aumento substancial nas mutações
induzidas por UV nas bacté rias.
Reparo de danos gerados por agentes alquilantes
O dano ao DNA gerado por agentes alquilantes , como
o EMS, que adiciona grupos etila , ou a guanidina ni -
trosa , que adiciona grupos metila às bases nucleot ídi -
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 403

AN Á LISE GENÉTICA
Três compostos potencialmente nocivos, A, B e C, sáo submetidos ao teste de Ames. Duas cepas
de bactérias hbr (1 e 2) sáo utilizadas. A auxotrofia na cepa 1 é provocada por uma mutação por
mudança da matriz de leitura e na cepa 2 por uma substituição de par de bases, resultando em
.
uma mutação sem sentido Cada cepa é tratada com compostos diferentes Uma fração de S9 (so- -
brenadante de enemas hepá ticas de rato soiubilizadas) foi adicionada a cada mistura de bactérias
auxotróficas, além de um dos compostos .
Após o tratamento, as células foram colocadas em placas contendo meio de cultura mínimo. As
placas de controle contém cada uma das duas cepas tratadas com S9 isoladamente, sem a presença
.
de A, B ou C A tabela a seguir mostra o número de colónias prototróficas observadas nas placas:

Composto testado Cepa 1 Cepa 2

A 904 6
B 5 4
C 3 680
Controle (nenhum composto) 6 3
.
a Avalie os resultados de crescimento e determine se cada composto é mutagènko ou não.
.
b Determine o tipo de mutação mais provavelmente induzido por quaisquer mutágenos.

Estrat é gias de solução Etapas da solu ção

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema diz respeito à interpretação dos resultados de um teste de Ames
este problema e explique a natureza de trés compostos.Identifique qual dos compostos é mutagènico, se houver um
da resposta solicitada. composto mutagènico, e descreva a natureza da mutagenicidade.

.
2 Identifique as informações críticas . .
2 O número de colónias revertentes é fornecido para cada composto Um resul-
fornecidas no problema. tado de controle também é fornecido. A causa da auxotrofia em cada cepa mu-
tado é identificada.

Deduzir
.
3 Descreva o significado dos resultados . .
3 As placas de controle não tiveram adição de nenhum composto de teste As co-
de crescimento na placa de controle. lònias cultivadas nessas placas são revertentes espontâneos para cada uma das
cepas-teste auxotróficas.

.
4 Deduza o significado dos resultados .
4 O composto A produz muitos revertentes da cepa 1, mas nenhuma reversão em
de crescimento em cada uma das relação aos níveis espontâneos na cepa 2.0 composto C gera muitos reverten -
placas experimentais . tes da cepa 2, mas não produz revertentes em uma taxa maior que o controle na
cepa 1.0 composto B não aumenta a taxa de reversão acima do nível espontâ -
neo em qualquer uma das cepas.

Solucionar
.
5 Identifique os compostos mutagèni- . .
5 Os compostos A e C sáo mutagênicos, mas o composto B não é As grandes
cos e justifique sua resposta. quantidades de colónias revertentes no teste da cepa 1 do composto A e o nú-
mero de revertentes no teste da cepa 2 do composto C identificam esses com-
postos como mutágenos. O composto B não exibe uma taxa maior de reversão
em relação aos números básicos nas placas de controle.

.
6 Descreva a natureza da mutagenicj: .
6 O composto A provoca mutações por mudança da matriz de leitura indu-
. zindo uma alta taxa de reversão dos auxótrofos da cepa 1 H‘n~. O composto C
dade de cada composto
K
Dica: Oi mutigencn por wtntttuição dr pjr òc
provoca uma alta taxa de reversão dos auxótrofos da cepa 2 induzindo rever-
baie» getalrrentr revertem o» JL ò'.tokn por
sões por substituição de par de bases.
*
vut»llluk o de par de bavev e o& niuiiyercn
^
por mcdança da nrutrtz de leitura revertem os
aunxrofos por mudada da matriz de leitura.

Para praticar mais, ver Problemas 26, 28 e 33 .

404 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

movem um ou niais nudeotídeos de uma fita danificada

S' 7/ C 6 A C 6 T TAC 6 jf 3' Luz e usam o pareamento de bases complementares para
3’ 1 í 6 CT GC Ã Á T G C //
"

5' UV substituir os nucleot ídeos excisados.

I Reparo com UV O dano ao DNA induzido por UV pode

ser reparado pelo uso do reparo com UV ( Figura 12.19)
— excisáo de uma região curta da fita contendo o foto-
7 3'
S
^/ CÓA 6/ kxma-se o dímero de timina.
produto, seguida pela síntese do novo DNA para subs-
tituir a região excisada. Na £. coli , o reparo com UV é

3
5'
37 '
/13'
/:*•
« PI Afotoiaseseligaao
dimerodelimira.
executado pelos produtos proteicos de quatro genes de
- -
reparo com UV, chamados uvr A, uvr B, uvr C e uvr D
.
(Figura 12.20) Duas moléculas de prote í na UVR A e
uma molécula de proteí na UVR- B se ligam a uma fita

DNA danificado por UV

-
-
-

Luz
vis í vel

A luz visível energia a

I
5
3'
-17£ GÇ
t- 3’
fòtdiase.
Á Complexo
UVR--AB
em frente ao
d ímero de
timina.
Afotoiase é
iberada deixando
o DMA corrigKJo

5' J £ 3' DNA corrigido ? um

Deslocamento 5* do Corte 3
' corte
3'
complexo UVR -BC
Figura 12.18 Reparo fotorreativo. 1
°s*r
cas, é corrigido pelas enzimas que removem o grupo
qu í mico adicionado e restabelecem a forma normal
dos nucleot ídeos. Por exemplo, a 06- metilguanina
criada quando a guanid í na nitrosa metila a guanina , é
convertida novamente para guanina pela enzima de
-
(
Corte 5' Corte 3'
UVR -D
corte 5'

O AUVR-O *
^
reparo O metilguanina metiltransferase. A enzima
tem um ú nico sítio ativo que puxa o grupo metila para
fora do nucleotídeo, convertendo a enzima para uma
forma permanentemente inativa. Cada enzima de re-
Segmento de
fita danificado
r< #)
DNA
polimerase
liga e ajuda a
liberar a fita
simples
danificada;
DNA a DNA
paro remove apenas um ú nico grupo metila. Conse- polimerase _ polimerase
quentemente , a exposição a uma alta dose de guani - preenche a
lacuna de
dina nitrosa pode resultar em um nível de metilação fita simples.
que pode oprimir a capacidade de uma célula para
corrigir o dano. Os recursos de reparo celular limita
dos fornecem uma explicação para a observação de
- Síntese de
DNA 5 3* -
que alguns compostos produzem mutações apenas
quando a exposiçã o é alta.
DNA
polimerase
Excisão e substituiçã o de nucleotídeos O A DMA iigase
restaura a
sequência
Se um nucleotídeo modificado não puder ser re- original
parado diretamente, a estrutura de dupla fita do DNA Intacta.
pode ser explorada pelo uso da fita intacta como molde, Figura 12.19 Reparo por exdsão de nucleotídeo.
em uma abordagem diferente para o reparo do DNA. As proteí nas UVR removem o dano induzido por UV das fitas
Vários sistemas de reparo em bacté rias e eucariotos re- de DNA.
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recombinação homóloga 405

DNA contendo um nucleot ídeo modificado do DNA oposta ao sitio do fotoproduto. As duas mo -
-
léculas de UVR A se dissociam da fita e uma molécula
-
de UVR C se une à UVR- B para formar um complexo
UVR- BC. Cada molécula do complexo UVR-BC cliva
um par dc ligações fosfodiéstcr na fita contendo o foto-
produto. A UVR- B diva uma ligação de quatro a cinco
nucleotídeos até o lado 3’ do fotoproduto e a UVR-C
corta uma ligação de aproximadamente sete ou oito
DNA glicosilase nucleotídeos até o lado 5' da lesão. O fragmento de fita
simples de aproximadamente 12 nucleotídeos contendo
Q Nucleot ídeo modificado o fotoproduto é liberado. A UVR-D, que é uma helicase,
se liga com a DNA pol I ao 3’OH exposto. A UVR- D
31*
5'
desenrola o DNA e a pol I usa a fita complementar para
Sítio AP
o Aremove
DNA glicosilase
o sintetizar um substituto para o segmento que está fal-
nucleotídeo tando. Na etapa final do processo de reparo por excisão,
modificada a DNA ligase se liga à região para vedar a espinha dorsal
deixando um
sítio AP. de açúcar-fosfato.
Reparo por excisã o da basa nudaotídica Um processo
Endonudease AP de reparo em vá rias etapas, chamado reparo por ex -
cisã o de nucleot ídeos, é iniciado quando as enzimas
Desoxirribose AP exdsada conhecidas como DNA glicosilase reconhecem e re-
Sítio AP movem uma base nudeotídica purina modificada para
produzir sí tios apur í nicos ( AP ) ( Figura 12.20). Entã o,
a nuclease AP remove o restante do nucleotídeo apu -
rinico, após o que a atividade da DNA polimerase e da
O Endonudease AP DNA ligase preenche a lacuna nudeot ídica e veda a
excisa a
desoxirribose AP . espinha dorsal de açúcar- fosfato da fita reparada.

Reparo por recombinação do DNA

polimerase
+ dNTPs
•
—
^>
O dano ao DNA gerado em grande escala por
um alto n ível de exposiçã o a um mutá geno pode so-
brepujar a capacidade dos mecanismos de reparo
para corrigir todas as lesões resultantes. Por exem
plo, a £. coli exposta a uma alta dose de radiação UV
-
S
3* 1 5' pode adquirir tantos fotoprodutos que muitos deles
O Apolimerase
DNA permanecem quando a replica çã o do DNA começa.
Então a replicaçã o pode contornar os segmentos de
sintetiza o novo
DNA a partir do DNA contendo fotoprodutos na fita - molde, pois as
s ítio 3*OH usando pontes de hidrogé nio n à o conseguem se formar entre
a fita inferior um nucleotídeo - molde e um recé m -adicionado à fita
y como molde.
sintetizada se o nucleotídeo- molde fizer parte de um
DNA ligase
fotoproduto. A replicaçã o vai reiniciar no local de
um primer de RNA adjacente, mas as lacunas de fita
simples que abrangem dezenas de nucleotídeos vão
continuar. O reparo por recombina çã o consegue
preencher essas lacunas de fita simples controlando a
O A DNA ligase recombina çã o do segmento de fita simples com a fita
veda a lacuna de complementar usando a cromá tide irmã como molde
fita simples e
reforma um de reparo (Figura 12.21).
duplex intacto Na £. coli , a enzima de recombinação RecA é o
com a sequência principal agente de reparo por recombinação. A RecA
3' original.
se liga à regi ão da lacuna de fita simples e forma um
Figura 12.20 Reparo por excisão de bases de filamento de nucleoproteína ativa. A fita - molde não
nucleotídeos. A DNA glicosilase e a endonudease replicada invade a fita dupla recém -sintetizada no
AP ( apur ínica ) removem do DNA os nucleot ídeos outro lado da forquilha de replicação. Após a inva -
modificados quimicamente. são, a fita é totalmente complementar à fita molde -
406 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

oposta e a RecA induz a clivagem e transferê ncia da Observa çã o gen é tica Os processos de reparo do
fita - molde oposta para preencher a lacuna de fita sim - DNA corrigem os danos ao DNA reparando direta mente a
ples na fita - molde não replicada . Essa ação preenche a lesão, removendo ou substituindo um segmento de uma fita
lacuna de fita simples deixada pela replica çã o ininter- danificada ou preenchendo lacunas deixadas após a replica-
rupta do DNA. çã o incompleta.
O reparo por recombinaçâ o n ào corrige a lesão ao
DNA original. Em vez disso, sobrepõe a interrupção da
replicação do DNA provocada pela presença dos foto - Sistemas de sinalização de danos ao DNA
produtos do DNA nas í f tas- molde e permite a conclu - Os mecanismos bioquímicos capazes de reconhecer
são da replicação. Mecanismos semelhantes de reparo
por recombina çâo atuam nos genomas eucarióticos. a presen ça de danos ao DNA e montar uma resposta de
correçã o aos danos são cruciais para a sa úde e a sobrevi -
.
vência de um organismo Eles consistem em processos
genéticos rigidamente regulados, envolvendo muitos
genes e proteínas. Nos seres humanas e em outros ma -
míferos, um complexo multiproteico age como sentinela
O O dano Induzido por UV Dano induzido
por UV genômica para identificar danos. Esse processo atua
bloqueia a replicação
.
do DNA deixando uma y 7
durante todo o ciclo da célula , sendo especialmente im -
grande lacuna de portante na regula ção da transição de G para S do ciclo
(

ftta simples.
0 A proteína RecA se liga
â lacuna de fita simples.
O Invasão da fita do
duplex inferior
pda fita supenor .
Q A recombinaçâ o da
-
fita molde inferior
na lacuna de fita
simples deixa uma
nova lacuna no
d ú plex inferior que
é preenchida pela
DNA pollmerase. DNA
pollmerase
G A DNA ligase veda o
DNA recém-
Lacuna celular, impedindo que esse ciclo entre na fase S até a cé-
lula corrigir quaisquer mutações de maneira adequada.
5' Uma proteína importante nesse processo é a
3'
BRCA 1, o primeiro gene implicado na suscetibilidade
familiar aos câ nceres mamário e ovariano. Uma segunda
Proteína RecA proteí na, chamada ATM, desempenha um papel funda -
mental na comunicação do dano ao DNA pela transdu-
ção de sinal. O dano ao DNA adquirido pela exposição
qu ímica ou radiação é detectado usando a ATM como
uma molécula de transdução de sinal para ativar a trans-
crição do gene /?53 que produz a proteína p53. Por meio
desse mecanismo, a ATM ativa a “ via de reparo da p53",
que controla a resposta celular à mutação decidindo (1)
pausar o ciclo celular na transição de G, para S, dando
tempo para o reparo da mutação, ou (2) direcionar a
célula para a via apoptótica, na qual ela sofre a morte ce-
lular programada ( Figura 12.22 ).
Nas células saudá veis, o n í vel de p53 é baixo, mas a
ATM aumenta seu n ível em resposta ao dano empreen -
dido ao DNA. Agindo como um fator de transcrição, a
Dano Induzido p53 inicia a parada da Gt do ciclo celular pela indução
por UV
da síntese da proteína p21, que Inibe a formação dos
-
complexos Cdk ciclina. A pausa induzida pela p53 no
5"
— 3’
Replica ção
ciclo celular dá tempo para o reparo dos danos ao DNA.
A conclusão do reparo ao DNA esgota a p53 e o ciclo
5' celular para a fase S.
Lacuna 3' Ao mesmo tempo que inativa a parada do ciclo
-
celular na transição G ( S, a p53 também ativa a trans-
crição do gene BAX . A proteína BAX é um inibidor de
i ação lenta da proteína BCL 2 que reprime a via apop-
tótica. Nas células saudáveis, em que o nível de p53 é
baixo, a transcrição do BAX n ão é iniciada. Em conse-
J

-sintetizado: a lesão ?JO0OC quência , a proteína BCL2 permanece não inibida e re-
UV permanece e
pode ser corrigida
.
^ y
prime a apoptose. No entanto, nas células danificadas, a
inibição BAX do BCL2 leva à ativação da via apopt ótica.
subsequentemente DNA ligase
^^ Se a pausa induzida pela p53 no ciclo celular demorar
demais, a ria detecta que há uma grande quantidade de
danos ao DNA que nã o podem ser reparados rapida -
mente. A pausa longa permite que a via apoptótica
Figura 12.21 Reparo por recombinaçâo. avance e a célula sofre morte celular programada.
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 407

DNA danificado ) 0000000000( Transtornos de reparo de danos ao DNA

|Ativa Os transtornos de reparo de danos ao DNAr resul
tantes de mutações nos genes que participam do reparo
-
ou da sinalização ou iniciação desse reparo, fazem que um
j Ativa organismo seja altamente sensível aos mutágenos qu ími -
cos e à radiação. Esses transtornos aumentam bastante
Cinase do ponto de verificaçã o a suscetibilidade do organismo aos cânceres provocados
pela exposição a mutágenos. Voltamos a esse tema no Es -

-
tudo de Caso que conclui este capítulo, onde discutimos
ATP ADP

0 v y .a
uma conexão entre as mutações do pS3 e a ocorrência
de câncer e o papel da transmissão da mutação do pS3
» na síndrome do câncer familiar humano, conhecida como
"' Degrada çã o \ -
sí ndromc dc Li Fraumeni (Omim 151623). A Tabela 12.5
apresenta alguns transtornas humanos de reparo de mu -
tação que estão associados a níveis significativamente ele -
P p
P5 3
^ "
P5 3
P
P
vados de tipos específicos de câncer.

Observa çã o gen é tica Os complexos proteicos que

®1 varrem o genoma em busca de danos ao DNA e os processos
1® simultâ neos que reparam ou contornam os danos são parte
<g21^ (InibkJordeCDK) integrante da sobrevivência celular e do bem-estar dos orga -
nismos. Os defeitos nos sistemas de detec çáo ou reparo de
Jjnlbe Inibe danos podem ser adquiridos por mutação ou ãs vezes podem
ser transmitidos como mutações, transtornos específicos

Não consegue fosforllar

0
Náo consegue
podem resultar de mutações dos genes que contribuem para
a detecçáo e reparo dos danos.

a proteína Rb inibir a apoptose 12.6 As proteínas controlam a síntese

I I do DNA translesão e o reparo
Parada do Apoptose
( morte celular )
das quebras na fita dupla
ddo celular
Os mecanismos de reparo descritos até aqui são ca-
pazes de reparar danos ao DNA ou superar seus efeitos
Figura 12.22 Via de reparo dos danos ao DNA pe\ap53. sem introduzir outros erros. No entanto, nem todos os

Tabela 12.5 Transtornos humanos selecionados de reparo de mutações

Transtorno e n ú mero Omim Descrição
Ataxia telangiectasia Mutação do gene ATM e ausência da proteí na ATM . Má coordenação (ataxia ), marcas
( 208900) vermelhas na face (telangiectasia ), maior sensibilidade aos raios X e outra radiação, alto
risco de câ ncer.
Câ ncer mamá rio ovariano Mutação do BRCA 1. Reparo defeituoso do DNA e maior suscetibilidade aos câ nceres
( 604370) mamá rio e ovariano.
Síndrome de l i-Fraumeni Mutação do gene p53 e via da proteí na p53 defeituosa . Alto risco de câ ncer.
(151623)
Câ ncer de cólon náo polipoide Reparo defeituoso da combina çã o malsucedida dos pares de bases provocada pela mu-
(120435) ta çã o de qualquer um de sete genes diferentes. Alto risco de c â ncer de cólon.
Tr ícotiodistrofia Mutações de qualquer uma de cinco mutações gê meas que provocam maior sensibilida -
( 601675) de aos danos oxidativos. Deficiência intelectual, nanismo, anomalias da pele e cabelos e
maior risco de câ ncer.
Xeroòerma pigmentoso Reparo por excisã o defeituosa, resultando da mutaçã o de qualquer um de sete genes de
(278700) reparo de danos por UV. Extrema sensibilidade ao dano induzido por UV e alto risco de
câ ncer de pele.
408 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
mecanismos de reparo de danos são perfeitos e alguns
são uma importante fonte de alterações no DNA, alte
rações essas que podem levar à mutação. Pode não ser
imediatamente óbvia a razão de os mecanismos de re
paro, propensos a introduzirem mais erros, terem conse
—
guido evoluir. Afinal, a finalidade dos sistemas de reparo
do DNA é apenas esta reparar danos para manter a
integridade do genoma. Esse enigma é solucionado pelo
fato de que os mecanismos de reparo propensos a erro
são ativados somente nos casos de dano disseminado no
DNA que, de outro modo, impediriam a realização da
replicaçâo do DNA e poderiam causar morte celular . lesão do DNA e depois é substituída pela pol 111, que re-
Síntese do DNA translesão
A seção anterior descreve o reparo de recombina -
çâo como uma resposta da E coli ao dano disseminado
do DNA. Existe um segundo mecanismo de reparo que
pode ser ativado na £ coli em resposta ao dano maciço
no DNA. Esse sistema de reparo, chamado reparo SOS,
é conhecido há décadas, mas apenas recentemente foi
compreendido em n ível molecular. O sistema tem seu
nome emprestado da frase marítima nave ourshtp, usada
quando o naufrágio era iminente. No passado, o reparo
SOS era descrito como um derradeiro esforço da parte
da célula bacteriana gravemente danificada para repli
car seu DNA e se dividir antes de sucumbir ao dano. A
pesquisa recente demonstra que o reparo SOS é feito
pela ativação de DNA polimerases especializadas em
um processo conhecido como síntese do DNA translc-
são. Esse processo de vida curta permite a replicaçâo do
DNA por polimerases alternativas por meio de lesões
que bloqueiam a ação da DNA polimerase 111 ( pol 111), a
principal DNA polimerase de replicaçâo na £ coli .
A síntese do DNA translesão é realizada pelas DNA
polimerases translesã o, também chamadas polimera -
ses de desvio (bypass ). As polimerases de desvio ope-
ram de modo diferente da pol III em vá rios aspectos.
Primeiro, são capazes de replicar através das lesões de
DNA que param a pol UI. Essa capacidade se explica
pela segunda diferença que distingue as polimerases de
desvio, que é a ausência de correção de erros. Em outras
palavras, as polimerases de desvio não possuem capa
cidade de exonuclease de 3' para 5' e são incapazes de
remover os nucleot ídeos recém -adicionados que nã o
formam ponte de hidrogé nio com os nucleotídeos da fi
ta - molde. Em decorrência de sua falta de capacidade de
correção de erros, a terceira caracter ística diferencia
dora das polimerases de desvio é que elas são propensas
a produzir erros de replicaçâo. Finalmente, as polime-
rases de desvio sintetizam apenas segmentos curtos de
DNA; elas caem da fita - molde após sintetizarem uma
pequena quantidade de nucleotídeos. A partir dessas
caracter ísticas diferenciadoras, os biólogos molecula
res concluem que as polimerases de desvio são utiliza
das para realizar a replicaçâo que, de outro modo, seria
bloqueada. No entanto, isso tem um preço, que é o de
possivelmente introduzir novas mutações.
O sistema SOS na £ coli opera por uma polimerase
- de desvio especializada, identificada como polimerase V,
ou pol V. Quando a pol III para no DNA danificado, a
- proteína RecA cobre a fita - molde à frente da lesão que já
- está ligada a uma proteína de ligação de fita simples (SSB).
Lembre-se de que a SSB cobre as fitas simples de DNA
separadas à frente da forquilha de replicaçâo (ver Figura
7.21). A proteína RecA no complexo DNA -RecA -SSB é
uma forma ativa que també m aciona a transcrição de vá -
rios genes, incluindo a pol V. Esta desloca a polimerase
III, sintetiza uma pequena parte da fita-filha através da
toma sua atividade normal de replicaçâo.
Os genomas eucarióticos utilizam um mecanismo
similar na síntese do DNA translesão. No entanto, nos
eucariotos as polimerases de desvio estão sempre pre-
sentes nas células, então o sistema que regula seu acesso
ao DNA é bem diferente. O mecanismo regulat ório que
guia sua escolha da polimerase decide qual delas se liga
ao PCNA, o sliding clamp eucariótico. Quando a re-
plicaçáo eucariótica para em uma lesão do DNA, uma
proteí na chamada Rad6, que está sempre presente na
forquilha de replicaçâo, adiciona um grupo ubiquitina
( Ub) ao PCNA. Esse processo, chamado ubiquitinaçâ o,
costuma procurar uma célula visando à sua destruição.
- No entanto, no PCNA a ubiquitinaçâo causa apenas
uma alteração de conformação, conferindo à polimerase
de desvio uma grande afinidade com o PCNA ubiquiti -
nado. Nesse processo, a polimerase de desvio desaloja
a polimerase normal e executa a sí ntese translesão do
DNA. Assim como no sistema SOS, o uso das polimera -
ses de desvio nas células eucarióticas é propenso a erros
porque a enzima não possui capacidade de correção.
Observa çã o gen ética A sí ntese do DNA translesão é
um sistema propenso a erros que utiliza polimerases de des-
vio para replicar segmentos curtos das fitas-filhas cuja replt-
cação normal ê bloqueada pelas lesões na fita-molde do DNA.
Reparo de quebras na fita dupla
-
Uma característica comum dos mecanismos de re -
paro do DNA que examinamos é o uso da DNA poli
-
-
- merase e uma fita molde de DNA para guiar o reparo, a
substituição ou a síntese do DNA. Esses sistemas de re -
- paro são eficazes, contanto que uma fita do DNA esteja
intacta e possa servir como molde. Mas, o que acontece
se ambas as fitas do DNA estiverem danificadas de uma
maneira que não seja possível ter um molde para o re-
paro da fita? Esse dano é uma consequência frequente da
exposição aos raios X e a certos tipos de radicais oxige-
- nados. O dano causado por esses agentes quebra ambas
- as fitas do DNA , deixando lesões que são conhecidas
como quebras da fita dupla. Como podem provocar ins-
tabilidade cromossômica e replicaçâo incompleta do ge-
noma, as quebras de fita dupla são potencialmente letais
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga
para as células e elevam o risco de câncer e a chance de
mutações na estrutura dos cromossomos.
Para proteger os organismos das consequ ências
desagradá veis das quebras de fita dupla, dois meca -
nismos evolu íram para realizar o reparo da quebra
da fita dupla . O primeiro deles é um processo de re
paro propenso a erros, conhecido como ligação das
extremidades nã o homólogas ( NHEJ ), que corrige as
quebras da fita dupla antes da replica ção do DNA. O
segundo é um processo sem erros, chamado anela -
mento da fita dependente de síntese , que corrige as
quebras da fita dupla que ocorrem após a conclusã o
da replica çã o do DNA . rente da degradação das extremidades desprotegidas. No
Ligação das extremidades náo homólogas Se uma que-
bra da fita dupla danificar um cromossomo cucariótico
durante a G , do ciclo celular, a replicação do cromos -
somo danificado é bloqueada. Considerando que as
DNA polimerases, e até mesmo as polimerases de des -
vio, exigem uma fita- molde para controlar a sí ntese de
uma fita filha, está claro que uma quebra da fita dupla é
incompatível com a execu çã o da replicação. Uma alter-
nativa de reparo que permite que as células readquiram
sua capaddade para replicar seu genoma plenamente é a
ligação das extremidades não homólogas ( NHEJ ), em
bora seu processo de quatro etapas para reparar quebras
da fita dupla leve à mutação (Figura 12.23).
Na primeira etapa, as quebras da fita dupla são re-
conhecidas pelas proteínas Ku 70 e Ku80, que formam
heterod ímeros e se associam às extremidades quebradas
da fita dupla do DNA. Os heterod í meros estabilizam
as extremidades quebradas contra a degradação pelas
nucleases. Em seguida, as nucleases aparam ( ressec
cionam ) as extremidades livres de cada fita quebrada.
O 0 dano provocado por
raios X ou o dano
oxidatrvo produzem
quebra da fita dupla
Ku80
I Ku 70
do DNA.
O 0 complexo proteico
^
Ku80- Ku 70 liga as
áJCáJ
'
(s xiooec
* extremidades do DNA
O As extremidades são
àfl pej); «
Txxxf A aparadas, resultando
em uma perda de
nucleotídeos.
I O A DNA ligase IV liga as
extremidades cegas
para reformar uma fita
dupla intacta.
Figura 12.23 Ugaçãodas extremidades nã o homólogas.
A NHEJ é um sistema propenso a erros que junta novamente
as fitas do DNA após uma quebra da fita dupla.
409
A ressecção deixa extremidades cegas em cada lado da
quebra. Finalmente, essas extremidades sã o ligadas por
uma ligase especializada, chamada ligase IV.
A realização da NHEJ produz uma fita dupla de DNA
intacta c permite a replicação através da região reparada
- no próximo eido de replicação, mas o reparo costuma
ser imperfeito porque a ressecção remove nucleotídeos
que não podem ser substituídos. Por essa razão, a NHEJ
é propensa a erros. Contudo, por mais que esse processo
seja potencialmente danoso, seu resultado é superior ao
das alternativas sofridas pelas células incapazes de reparar
quebras de fita dupla e impede a perda mais ampla decor -
entanto, podem ser geradas mutações quando os nudeo-
tídeos são perdidos pelos genes transcritos.
Anelamento da fita dependente da sí ntese Nos euca
riotos, depois da conclusão da replicação do DNA, cada
-
cromossomo consiste em duas cromátides irmãs idênti
cas. Vimos anteriormente que o reparo por recombina
--
ção tira proveito da presença das crom átides irmãs para
preencher as lacunas de fita simples deixadas quando
a replicação é bloqueada por danos na fita - molde in-
duzidos por UV. As quebras de fita dupla apresentam
- um tipo diferente de desafio para as células após a re -
plicaçào, mas a presença de cromá tides irmãs idênticas
pode ser explorada em um processo de reparo isento
de erros, conhecido como anelamento da fita depen -
dente da síntese (SDSA ).
Como mostra a Figura 12.24, uma quebra da fita
dupla ( DSB) afeta uma cromá tide irmã; a outra está
intacta. A SDSA começa com a aparagem de uma das
- fitas quebradas. Isso é seguido pela ligação da prote ína
Rad51, um homólogo da proteína bacteriana RecA, na
região quebrada , para formar um filamento de nucleo-
proteína. Em um processo reminiscente da ação da RecA
na facilitaçào do reparo por recombinação, a Rad51
se liga às fitas e facilita a invasão da cromá tide intacta
pela extremidade resseccionada e uma fita da cromá tide
irmã. Esse processo de invasão da fita desloca uma fita
do duplex e cria uma alça de deslocamento ( D). A re-
plicação do DNA dentro da alça D sintetiza novas fitas
de DNA das fitas- molde intactas. As crom á tides irmãs
são reformadas pela dissociação e pelo anelamento da
fita nascente no outro lado da quebra. Fazendo a remo-
ção do DNA na vizinhança imediata de uma quebra de
fita dupla e a substituição do DNA excisado por uma fita
dupla idêntica à da cromátide irmã, a SDSA executa o
reparo perfeito das quebras da fita dupla.
Observa çã o gen é tica A ligação das extremidades n ão
homólogas é um sistema propenso a erros para o reparo das
quebras da fita dupla do DNA que ocorrem antes da fase S. 0
anelamento da fita dependente da síntese ocorre após a con-
clusão da fase S e utiliza a cromá tide irmã idêntica como fonte
da sequê ncia da fita- molde para sintetizar uma fita dupla de
substituição de modo isento de erros.
410 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

3' O Uma crom á tide

sofre quebra da fita
muitos pesquisadores tentaram construir prováveis mo -
delos de recombinação homóloga. Em mais de 60 anos
dupla ( DSB ).
desde que o trabalho começou a descrever formalmente
Centr òmero o mecanismo molecular da recombinação homó loga,
muitos modelos foram propostos e a modificação dos
modelos tem sido continua. Os biólogos moleculares
continuam a ajustar os modelos de recombinação para
O As nudeases corresponder às observações, mas dois pontos salientes
digerem uma agora estão claros. Primeiro, a recombinação meiótica é
! parte das fitas
quebradas. um processo geneticamente controlado, iniciado pelas
enzimas que produzem quebras na fita dupla do DNA; e,
segundo, o mecanismo molecular da recombinação ho-
G A invasão da fita móloga está infimamente relacionado com os processos
da cromá tide irmã que corrigem as quebras da fita dupla do DNA.
cria uma alça D.
Uma forquilha dc
replkaçà o é Modelo de Holliday
montada na alça D.
O primeiro modelo molecular viável da recombina -
ção meiótica foi proposto por Robin Holliday em 1964.
O A síntese da r>ova Conhecido como modelo de Holliday, ele ofereceu um
fita ocorre usando esquema plausível para a recombinação meiótica ao
fitas intactas
dispon íveis como
moldes.
teorizar que as quebras de fita simples geradas espon
taneamente em uma crom á tide levam à invasão de uma
-
Excisáo parcial
da fita cromá tide não irmã do cromossomo homólogo. O es-
quema de Holliday para quebrar e juntar novamente as
fitas do DNA sugeriu que alguns encontros entre cro-
G Ocorre a excisáo mossomos homólogos produziriam cromossomos de
parcial da fita: as fitas
duplas são crossing over, enquanto outros n ão o fariam .
-
reformadas e as fitas O modelo original de Holliday acabou se provando
são ligadas.
simplista demais e foi substitu ído por modelos mais pre-
Figura 12.24 Anelamento da fita dependente da
síntese (SDSA ) .
cisos da recombinação meiótica . Os modelos mais recen -
tes se baseiam em algumas das caracter ísticas do modelo
de Holliday, mas incorporam novos conhecimentos e
12.7 A recombinação meiótica é etapas. Talvez as características mais importantes que
distinguem o modelo atual da recombinação meiótica do
controlada por quebras da fita modelo original de Holliday sejam, primeiro, que hoje se
dupla programadas sabe que a recombinação meiótica é iniciada pelas que
bras da fita dupla do DNA e , segundo, que as quebras
-
A muta ção é a fonte definitiva da nova variação da fita dupla que iniciam a recombinação meiótica são
herdada nas espécies, mas, por necessidade, é um pro- geradas de maneira programada pela atividade de uma
cesso que apenas lentamente acumula variação. Nos enzima especializada.
organismos que se reproduzem assexuadamente, existe
outra fonte muito mais potente de variação herdada
a recombinação meiótica gera novas combinações de
alelos que já existem em um organismo (ver Figura 6.5).
— Modelo de recombinação meiótica da
quebra da fita dupla
Essa diversidade adicional aumenta as oportunidades A evid ência experimental incoerente com os mo-
de sobrevivência da prole.
A recombinação meiótica é um processo homólogo
delos anteriores de recombinação homóloga ou a iden -
tificação de eventos não previstos por esses modelos
que ocorre no início da prófase 1 da meiose. Biólogos e foram as forças motrizes que moldaram a evolução da
geneticistas interpretaram e compreenderam as conse - compreensão da recombinação hom óloga. A descrição
quências genéticas da recombinação mais de um século do modelo atual foi proposta em 1983 por Jack Szostak,
atrás, mas uma compreensão da recombinação meiótica Terry Orr - Weavcr, Rodney Rothstcin e Franklin Stahl
no nível molecular tem sido mais ambígua. Embora ini- Seu modelo foi o primeiro a prever que as quebras da
cialmente descoberta no início do século XX pelo tra - fita dupla eram a base da recombinação homóloga. A
balho de Thomas Hunt Morgan e colaboradores, que
detectaram cromossomos recombinantes nos gamelas,
evidência experimental acumulada confirmou essa opi
nião e a pesquisa acrescentou novos detalhes importan -
-
a recombinação homóloga não pôde ser estudada em tes à proposta original feita por Szostak c colaboradores.
um nível molecular até os anos 1950. Na década após No modelo atual, a recombinação homóloga é ini-
a determinação da estrutura de dupla - hélice do DNA, ciada pela proteína Spoll (“Spo onze”), que foi desco-
 Cap í tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recombinação homóloga
berta na levedura e hoje se sabe que ela existe na forma
homóloga em todos os eucariotos [figura Básica 12.25, 0).
A Spoll é uma proteína dimérica que gera cortes na fita
dupla, ligeiramente assimétricos, em uma cromá t í de. As
proteínas Mrx e Exol se associam com a Spol 1 c, após a
.
degradação da Spol 1, a Mrx resseta as fitas simples 0 Duas
proteínas homólogas à RecA, Rad5 e Dmcl , se unem na
região cortada O. Hsse complexo proteico ajuda a formar
um conjunto de intercâmbio de fitas, facilitando a invasão
.
da fita e a formação de uma alça D O, 0 A fita invadida
pareia com a fita complementar na alça D. Fora da alça
D, as duas fitas que parecem cruzar uma sobre a outra
formam uma junção de Hotliday. uma estrutura tem
porária proposta no modelo original de Holliday. Repare
que também há uma região heterod ú plex contendo duas
fitas complementares de DNA que se originaram em ho-
mólogos diferentes. Também identificadas como DNA
heterod ú plex , essas regiões são uma assinatura molecu -
lar da recombinação homóloga. Como as duas fitas do
DNA heterod ú plex se originam em homólogos diferen -
tes, pode liavcr pares de bases incompatíveis entre essas
fitas. Em outras palavras, se a heterozigosidade estiver
presente nas sequências de DNA que formam uma região
heterodú plex, um ou mais pares de bases serão incompa
t íveis no DNA heterodú plex. Discutimos as implicações
dessa situação na seção a seguir.
A extensão da fita invasora e a sí ntese do DNA
dentro da fita quebrada sáo guiadas pelas fitas - molde
intactas O, O. Nesse ponto, formou - se uma segunda
região heterod ú plex. A extremidade 3’ da fita invasora
conecta-se em seguida com a extremidade 5' de um seg
mento de fita que inicialmente fazia parte da fita invasora
O, formando uma segunda junção de Holliday. Agora as
cromá tides não irmãs dos cromossomos recombinantes
estão intcrconectadas uma à outra pela presença de jun
ções de Holliday duplas ( DHJs): os cromossomos re
combinantes contêm DHJs e duas regiões heterod ú plex.
Resolução das junçõ es de Holliday
As etapas recombinatórias recém -descritas ocor
rem na prófase I da meiose e quaisquer correções entre
os cromossomos hom ólogos precisam ser resolvidas na
prófase, bem antes de os homólogos se prenderem às fi -
bras do fuso na metá fase. O corte e a reconex ào das fitas
simples dos cromossomos homólogos interconectados
- .
resolvem o crossing over
Dois padrões de resolução, a resolução de mesmo
sentido e a resolução de sentido oposto (O e 0 na Fi
gura 12.25), completam o crossing-over e desligam os
homólogos para que possam ser separados na aná fase.
A resoluçã o de mesmo sentido envolve dois cortes de
resolução norte - sul (NS) ou dois cortes dc resolução
leste - oeste ( EW ) das fitas do DNA para separar os ho-
mólogos ( ver Figura Básica 12.25). Quando a conexão
entre os homólogos é resolvida pelos dois cortes NS ou
EW, os marcadores laterais ( As e Bt e A2 e BJ não re-
.
combinam Consequentemente, a recombinação desses
411
genes não é produzida, embora as regiões heterod ú plex
estejam presentes. Essa resolução ocorre apenas rara -
mente. Bem mais comum é a resolução em que uma
região da junção de Holliday é resolvida por um corte
NS e a outra, por um corte EW. Os cromossomos resul -
tantes sã o recombinantes e carregam A r e B , ou A2 e B , .
Essas recombinações são detectiveis entre a progénie,
onde são contadas como recombinantes entre os genes.
Observa çã o gen é tica A recombinação homóloga é um
processo geneticamente programado, inkiado pela proteina
Spol 1, que gera quebras na fita dupla do DNA. A recombina -
- çào dos homólogos forma DHJs e adquire DNA heterod ú plex
por meio de sua interação. A resolução das conexões DHJ pode
ou nao resultar em evidência genétka de recombmaçáo.
12.8 A conversã o gênica é o
reparo dirigido dos erros
de pareamento no DNA
heterodúplex
- Nosso tópico final neste capítulo é a conversão
gênica , um processo de alteraçã o direcionada na
sequência dc DNA que ocorre pelo reparo dos erros de
pareamento das bases dentro do DNA heterod ú plex.
Esses erros podem ocorrer quando a sequê ncia de DNA
é heterozigota em uma região heterod ú plex criada du -
rante a recombinação meiótica. Na conversão gênica , a
- alteração “direcionada " é o reparo dos erros de parea -
mento das bases que mudam a sequê ncia nucleoddica
de um alelo para a de outro alelo que já está presente
porque o organismo é heterozigoto na parte do genoma
- onde se forma o DNA heterod ú plex. Ao contrário da
- mutação, que pode transformar um alelo em qualquer
outro alelo, a conversão gênica consegue apenas mudar
um alelo para outro já presente em um gen ót í po hetero-
zigoto do outro alelo na regiã o heterozigótica.
- A conversão gê nica é mais facilmente detectada
nos fungos que formam um asco, um saco de esporos
haploides que são produtos da divisão meiótica. Por
exemplo, identificamos que, nos fungos com o genótipo
a * a , a proporção desses alelos nos esporos em um asco
de oito células deve ser igual (4:4) (ver Figura 5.23). A
conversão gê nica muda essa proporção, passando um
ou mais alelos de uma forma para outra: a* para a ou
- .
a para a* O resultado é uma proporção aberrante de
esporos em um asco de oito células, normal mente 5:3
ou 6:2 em vez de 4:4. Como a conversão gênica está ri -
gorosamente limitada às conversões de um alelo para a
forma alternativa em um genótipo heterozigoto ela é .
diferente da mutação, na qual um alelo pode ser alte -
rado para uma variedade de formas quase infinita. De
modo similar, nos organismos que produzem um asco
de quatro células, prevê -se uma proporção 2:2 para um
heterozigoto e qualquer outra proporção é aberrante.
412 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

FIGURA B Á SICA 12.25

Modelo molecular de recombinaçáo meiótica

B, A ,
Recombmação meiótica
B A , diagramada entre essas
Bi Aã cromátides nào irmãs de
cromossomos homólogos
Bi AI

O A Spoi 1 cria quebra de fita dupla em um dúpiex de DNA. O A digestão enzimática 5' —
3' pela Mrx
cria segmentos de fita simples.
Spo 11 + Mrx + Exo 1
B, A, BJ A,
^1 3’ 5':
y\
3'

5*
5*
Bi AI BI Ai

O A invasão da fita cria uma alça D e a primeira região O A extensão da fita pela DMA polimerase desloca o DNA
heterodúplex. da alça D, que pareia com o DNA de fita simples
complementar e forma a segunda região heterodúplex .
Junção de Holiiday Região heterodúplex
B A Br A

s
5' Alça D 5'
3'
mi
Bi I AI BI AI
T Síntese do DNA
Região heterodúplex

B, A,
Recombinaçáo meiótica
B, A, diagramada entre essas
Bi AI cromátides não irmãs dos
cromossomos homólogos
BI AI

O Resoluçáo de mesmo sentido

Corte leste- oeste Região heterodúplex
B? I Ar
5'
3'

BI Corte leste oeste AJ BI l AI

T
Região
heterodúplex
A resolução de mesmo sentido produz regiões heterodúplex
deslocadas,mas nenhuma recombinaçáo dos genes laterais.
Essa forma de resolução raramente ocorre.
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçáo homóloga 413

0 nucleoproteicos
A Dmcl e a Rad51 montam filamentos Q Os filamentos de intercâmbio de fitas promovem a
de intercâmbio de fitas. invasão da fita.

B} A/ Aj

0 A extensão e a ligação da fita preenchem a lacuna de fita O As junções duplas de Holliday se formam após a incisão estar
simples na fita pareada com o DNA da alça D. vedada; as cromátides contêm heteroduplexes deslocados.
Extensão e ligação Junção de
da fita Região heterodúplex Holliday
0 1 A, 0, I Ar

0, A; 0;
F
Junção de Região
Holliday heterodúplex
A,
5*

0, A,
Recombinaçáo meiótrca
0, A, diag ramada entre essas
BÀ A, cromátides não irmãs dos
cromossomos homólogos.
0 j Aj

Q Resolução em sentido oposto

Corte norte sul Reglào heterodúplex
0, 1
A 0, r i Aj
' 3*

m
5'

mi 3'
3'
5'
Aj 0, A,
Corte leste oeste \ I i
T
Região
heterodúplex

A resolução em sentido oposto é muito comum,

gerando recombnaçáo dos genes laterais e
criando regiões heteroduolex deslocadas.
414 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

No in ício do processo de constrição dos modelos Opçã o de correção 1

de conversão gênica e dos modelos de recombinaçào AT ÇCG
Asco 3:1
meió tica , os biólogos perceberam que a conversã o OH* Correção
gé nica só poderia ocorrer se houvesse forma çã o de
DNA hctcrod ú plcx durante o crossing-over. Desse
rrclfr
LE&. Correção
G -T ATC AG
TAG C
AI
A;
modo, um objetivo no desenvolvimento dos modelos
contemporâ neos de recombinaçào meiótica foi levar
em conta a formação do DNA heterod ú plex, seguido
rrtfBs c A - ATC G
IMI» Aí
pela conversão gé nica nos ascos de quatro células e
nos de oito células. A Figura 12.26 ilustra a formaçã o ífxtf! A correção dos dois erros de pareamento
de DNA heterod ú plex para os alelos A , e A Ã que dife- para A, (par de bases A -T) cria asco 3:1
rem pela substituiçã o de um par de bases. O alelo A ,
carrega um par de bases C - G na posição diferente e Opção de correção 2
o A2 carrega um par de bases A - T. Os erros de parea -
mento entre G e A e entre C e T estã o destacados nas Asco 3:1
lM Correção
regiões heterod ú plex. * A|
ÃTíflir A c ATCEHB
Em um asco de quatro células, a correção dos
TÃ GGC A,
erros de pareamento de bases no DNA heterod ú plex Correção
resulta em três proporções aberrantes ou padrões de A
.
esporos ( Figura 12.27) Na opção de correção 1, ambos Ií3fl£ ItXW * Aí
os erros são corrigidos pela conversão da sequê ncia A"C A 6
para a do alelo A .. Inversamente, na opção de correção T AG TC A correção dos dois erros de pareamento
2, ambos os erros são corrigidos para produzir Ar Em
cada caso , ocorreu a conversão gé nica, e os ascos re - -
para A , ( par de bases C Q cia asco 3:1.

Opção de correção 3
ATCCG Asco 22
aberrante
T A GGC
Correção
AIC.A.S Ai
•
( ) 3* ATC G
TAG C
Corredio
TA'6 C Aí
Asco 22 ATCCG A
TAG C
.
ã vm 3'
A,
A
A ’C A G
Aí
ATC G 5' A,
TÃ 6 1 C A coneção de erros ce pareamento de bases em
ATC G Aí
sentidos opostos rescrta em um asco 22 aberrante.
TAG C Aj
Figura 12.27 Exemplo de correção de erro no
TAG C pareamento de bases e padrões de conversão génka em
ATC G um asco de quatro células.

sultantes contêm uma proporção aberrante de 3:1 dos

(b) 3' À TC 77G 5'
alelos. Na opção de correçã o 3, o padrã o de correção
TAG C 3'
do erro de pareamento produz um asco com uma pro-
TX@ 3' por ção aberrante 2:2, no qual At e A . estão em ordem
n&çj ziy Reg ôes heterod ú plex
alternada em vez de como nos alelos lado a lado, como
normalmente esperado.
comerTosde
ÃT
pareamento das bases O padrão de correção de erros de pareamento
f ZZ
TZÇô y també m determina as proporções aberrantes no asco
de oito células pela conversã o génica . A Figura 12.28
r ÀG C 3' mostra três opções para a correção dos erros de parea -
ATC G 5' mento de bases. Na opção 1, as duas correções de erro
favorecem um ú nico alelo (Anesse caso) e produzem
Figura 12.26 DNA heterodúplex. (a) Um segmento do um asco contendo uma proporção aberrante 6:2. Uma
-
alelo A , contém um par de bases C G, enquanto o alelo A;
proporção aberrante 6:2 similar, que produz um asco
-
contém um par de bases A T no mesmo local. A segregação
produz um asco 2:2. (b) O crossing -ovtr dos cromossomos
contendo 6 gametas A 2 e 2 gametas A „ ocorre se os dois
hom ólogos gera DNA heterod ú plex contendo erros de erros forem corrigidos em favor de A2 em vez de Ar Na
- -
pareamento G A e C T (em vermelho) entre as fitas que, de
outro modo, seriam complementares.
opção de correção 2, apenas um cm vez de dois erros de
pareamento de bases é corrigido antes do ciclo de repli -
 Capí tulo 12 Mutação génica, reparo do DNA e recomblnaçáo homóloga 415

Opção de correção 1 Melose Mitose Asco 6:2 Figura 12.28 Correção de erros de pareamento e
conversão génica em um asco de oito células.
A
A
3b
< Nenhum erro
de pareamento
A,
,
X1
Correção At
— 3
A

3b
X^
A
Aí
<
Correção A

Nenhum erro
—
de pareamento
, A
*
A>

*4
A7
/

Opção de correção 2

A,
Meiose Mitose
—
A correçã o dos dois erros de
pareamento de Aj Ar aia asco 62

Asco 5:3

A,
Opção de correção 3 Meiose Mitose
Asco 4:4
aberrante
A,
A
< Nenhum erro
de pareamento
A,
A
A < Nenhum erro
de pareamento
A;
A,
-A
A0 </Nenhuma correção

3b ^ lorreçá o At +

*A X-1
3b
'

</NNenhuma correção
*
A,
*
A;

X^
^ Nenhuma correçã o
Aí XJ Aí
A
A < Nenhum erro
de pareamento
Ay
Aí
A
A
< Nenhum erro
de pareamento
Av
Aí

A correção dc um erro e a nãu correção A não correção dos erros de pareamento das bases na
do outro criam uma proporção 53. região heterod ú plex cria uma proporção aberrante 4:4.

ca ção do DNA, resultando em um asco contendo uma

proporção aberrante 5:3. Duas proporções aberrantes
5:3 diferentes, 5 A ,:3 A , e 5 A 3 A { , sào possíveis, de
^
pendendo do alelo favorecido na única correção de erro
de pareamento. Na opção de correção 3, n ão ocorre ne
nhuma correção de erro. Os esporos estão dispostos em
um padrão 3:1:1:3, uma distribuição chamada propor
ção aberrante 4:4.
Observaçã o gené tica A conversão génica é um pro-
- cesso dirigido de correção de erros no pareamento de bases
no DNA heterodúplex que converte um alelo para a forma
- alternativa em um organismo heterozigoto. As proporções
aberrantes dos esporos haploides nos ascos de quatro ou oito
- células são o resultado da conversão génica.

ESTUDO DE CASO

A sí ndrome de U-Fraumeni é causada pela herança das mutações dop53

Vários estudos sobre os cânceres humanos identificam
o p53 como o gene que mais sofre mutações nas células
cancerosas. A partir do papel fundamental que o p53 e seus
produtos proteicos desempenham nas células, é fá cil perce
ber por que as cé lulas que não possuem a função dop53 são
.
anormais Na ausê ncia da proteína p53 funcional , o dano ao
DNA nâ o é detectado e as células passam pela G , do ciclo
celular, entrando na fase S com o dano ao DNA presente.
De modo similar , a inativaçáo homozigótica do p53 inter
fere no início da apoptose nos casos em que as células têm
altos níveis dc dano. Por si só, a mutação homozigótica do
p53 nào provoca câncer. Outras mutações precisam estar
presentes para provocar a rá pida proliferação celular e ou -
tras anomalias que caracterizam o câncer. Ainda assim, a
- mutação homozigótica do p53 pode desempenhar um papel
crucial no acú mulo dc outras mutações que levam ao de -
senvolvimento do câ ncer.
Em 1969, Frederick Li e Joseph Ffaumeni encontra
ram uma fam ília cm que o câncer atingiu todas as gerações
-
- -
( Figura 12.29 ). Essa família destacou se por seu padrão de
câncer, coerente com um modo de transmissão autossômica
dominante, c porque muitos dos casos ocorreram décadas
416 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
I DTO
TO 3 >
É[0 O
IV
V
ÉÒÓÓ O
|
Câ ncer de mama Outras neoplasias malignas,
Sarcoma
indulndo o câ ncer cerebral
e a leucemia
F > gura 12.29 Sindromede U - Fraumeni. As muta ções
herdadas do p53 aumentam bastante a suscetibilidade a
sarcoma, câ ncer de mama, câ ncer do cérebro, leucemia e
outros câ nceres .
antes do que seria t í pico para esses tipos de câncer na po-
pulação geral ( isto é, os cânceres de mama apareceram na
faixa etá ria dos 30 anos nos membros da família afetados, ao
contrá rio da faixa dos 60 anos nos membros da população
.
geral ) Essas duas caractcrísticas são marcas registradas das
famílias propensas ao câncer, nas quais a mutação germina-
tiva herdada aumenta a suscetibilidade individual ao câncer.
Curiosamente, poré m , ao contr á rio da maioria das fam ílias
propensas ao câncer, nas quais um ou dois tipos de câ ncer
predominam, essa família estudada por Li e Fraumeni tinha
muitos tipos dc câ ncer, incluindo sarcomas de tecido mole,
câncer de mama. câncer no cérebro, osleossarcoma, câ ncer
adrenocortical e leucemia . Após a descrição de Li e Frau
meni , outras fam ílias com padrões similares de câ nceres
mistos foram identificadas Essa condição herdada de pro
RESUMO
12.1 As mutações sà o raras e ocorrem de manei-
ra aleatória
A mutação é uma alteração herdada na sequência do DNA.
I As muta ções resultam de danos empreendidos ao DNA.
I As frequências das mutações são baixas em todos os orga-
nismos.
Os hotspots de muta ção são genes ou regiões nos quais
as mutações ocorrem com muito mais frequ ência que a
média.
O teste de flutua ção realizado por Luria e Delbr úck de-
monstrou que as mutações ocorrem aleatoriamente.
12.2 As mutações gênicas modificam a sequên-
cia do DNA
As mutações por substituição de pares de bases podem ser
transições ou transversões.
pensão ao câncer foi designada stndrome de U -Fraumeni 1
(LFS 1; Oinim 151623). O estudo da LFS1 despertou investi -
gações revolucioná rias da biologia e gené tica do câncer, que
identificaram vá rios genes que sofriam mutações frequentes
nas células cancerosas, bem como investigações da heran ça
das mutações que aumenta a suscetibilidade ao câncer.
Em 1997, a primeira evidê ncia do defeito molecular
na LFS 1 surgiu com a identificação das anomalias do gene
p53 em aproximadamente 70% dos membros da família
FRS1 com câ ncer. As mutações foram descobertas cm cé -
lulas germinativas, significando que um progenitor passou
uma cópia mutada do p53 no espermatozóide ou no óvulo.
Na concepção, os óvulos fertilizados eram heterozigotos e .
à medida que se desenvolveram , todas as células carrega -
vam um gene com mutação e uma cópia do tipo selvagem
do p53. Cada cé lula dos portadores dc mutação se tomou
homozigota para a mutação do p53 pela ocorrê ncia de uma
mutação somá tica que altera o alclo do tipo selvagem. As
células mutadas homozigotas resultantes não produzem
prote ína p53 normal c são incapazes dc regular adequada -
mente o ciclo celular ou a entrada na apoptose. Os câ nceres
se desenvolvera nos indivíduos sem p53 funcional pelo acú -
mulo de mutações somá ticas dos genes. Os tipos de câncer
específicos que se desenvolvem dependem de quais genes
sofrem mutações e dos tecidos ou tipos dc células nos quais
as mutações ocorrem.
Após a identificação do papel das mutações germinati-
vas do p53 na LFS1, as mutações herdadas de outros genes
de reparo do DNA foram identificadas como capazes de
aumentar a suscetibilidade a certos câ nceres nas fam ílias.
Pdr exemplo, as mutações do BRCAI c do BRCA2 que in -
teragem com o p53 podem aumentar a suscetibilidade ao
câncer de mama ou de ovário. Outras mutações herdadas
- dos genes de reparo do DNA que aumentam a suscetibili
dade aos câ nceres incluem os transtornos apresentados na
-
- Tabela 12.5.
I As substituições de pares de bases podem mudar um ami
noácido do polipept ídeo, podem criar um novo códon de
-
parada ou podem deixar o polipeptideo intocado.
I As mutações por mudança da matriz de leitura resultam
da inserção ou deleçâ o de um ou mats pares de bases que
deslocam a matriz de leitura do RNAm durante a tradução.
I As mutações regulatórias alteram a transcrição gé nica ou o
splicing do pré-RNAm.
A mutação anterógrada altera um alelo do tipo selvagem para
a forma mutada e a reversão muda um mutado de volta para a
forma do tipo selvagem ou quase do tipo selvagem.
12.3 As mutações gênicas podem surgir de even-
tos espontâneos
Os erros de replicaçáo do DNA podem substituir os pares
de bases e o deslizamento da fita pode modificar o n ú -
mero de repetições de uma sequê ncia de DNA
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recombinação homóloga 417

I Os deslocamentos tautoméricos da estrutura das bases
nucleotídicas podem induzir mutações espontâneas por
substituição de pares de bases.
I Várias mudanças espontâneas na estrutura nucleotídica
podem resultar na mutação da sequência do DNA pelos
erros de pareamento das bases.
12.6 As proteínas controlam a síntese do DNA
translesão e o reparo das quebras na fita
dupla
I O reparo SOS, controlado pela proteína RecA, é um pro-
cesso especializado, ativado durante a replicação nas bac-
térias em resposta ao dano disseminado no DNA.

12.4 As mutações podem ser induzidas por subs-
tâncias quí micas ou radiação ionizante
Os produtos químicos mutagênicos interagem nas reações
características com os nucleotideos do DNA e geram mu-
tações específicas.
Os compostos químicos podem criar mutações agindo
como análogos das bases nucleotídicas, adicionando ou
removendo grupos laterais dos nudeotideos ou interca-
lando no DNA.
A energia na faixa ultravioleta e superior (comprimento
.
de onda mais curto) é mutagènica A radiação ultravioleta
induz a formação de fotoprodutos que levam a mutações
por substituição de pares de bases.
O teste de Ames identifica compostos químicos mutagêni
cos testando o aumento nas taxas de reversão nas bacté-
rias auxotróficas expostas a um composto de teste na pre-
sença de enzimas deslntoxkantes do fígado eucariótlco .
125 Os sistemas de reparo corrigem alguns
danos ao DNA
O reparo direto das lesões ao DNA remove os nucleotideos
e impede a mutação . não recombinantes.
Os nucleotideos de DNA com erros de pareamento, os fo-
toprodutos induzidos por radiação UV e as cadeias laterais
nucleotídicas modificadas são removidos pelo reparo direto.
I O reparo por excisao, o reparo por UV e os mecanismos de
reparo controlados por metila removem segmentos das
fitas simples do DNA que contém nucleotideos danificados
e dirigem a nova síntese para preencher a lacuna de fita
simples resultante .
Os sistemas geneticamente controlados monitoram o ge-
noma e regulam o reparo do DNA .
A síntese do DNA translesão usa polimerases de desvio
para concluir a replicação quando o dano está presente.
A ligação das extremidades não homólogas corrige as
quebras da fita dupla do DNA que ocorrem antes de sua
replicação.
I 0 anelamento da fita dependente da síntese corrige as
quebras da fita dupla que ocorrem apó s a conclusão da
replicação.
12.7 A recombinação meió tica é controlada por
quebras da fita dupla programadas
A recombinação meiótica é um processo programado e
iniciado por uma enzima que gera quebras na fita dupla.
- I A invasão da fita e a síntese do novo DNA formam o DNA
heterodúplex nos dois participantes da recombinação.
O DNA heterodúplex contém erros no pareamento de
bases se as sequências de DNA forem heterazigotas.
As fitas de DNA que formam as junções duplas de Holli-
day são cortadas e rejuntadas para separar os homólogos
antes de sua separação na meiose.
I A resolução das junçóes duplas de Holliday gera DNA hete-
rodúplex e pode produzir cromossomos recombinantes ou
12.8 A conversã o gênica é o reparo dirigido dos
erros de pareamento no DNA heterodúplex
A conversão gênica ocorre pelo reparo dos erros de parea
mento de bases no DNA heterodúplex .
1 A conversão gênica em um asco de quatro ou oito células
gera proporções aberrantes de esporos que diferem das
proporções 2:2 ou 4:4 previstas.

T E R M O S- C H A V E

Aduto volumoso (p. 397)
Alça de deslocamento (alça D) (p. 409)
Análogo de base (p. 396)
Anelamento da fita dependente da
síntese (SDSA) (p. 409)
Conversão gênica (p. 411 )
Desamínação (p. 395 )
Deslizamento da fita (p. 392 )
.
Despurinação (p 395)
Dimero de pirimidina (dimero de timina)
(p. 399)
DNA heterodúplex (região heterodúplex )
Doença de repetição de trinucleotídeos
(p. 392)
Fotoproduto (p. 399)
Fotoproduto 6-4 (p.399)
Frequência das mutações (p. 384 )
Hotipot de mutação (p. 386 )
Invasão da fita (p. 409)
Junção de Holliday (p. 41 f )
Junção de Holliday dupla (DHJ) [p. 411)
Ligação das extremidades não homólo-
gas (NHEJ) (p. 409)
Modelo de Holliday (p. 410)
Mutação anterògrada (mutação) (p. 390)
Muta ção de sentido trocado Ip. 387)
Muta ção de iplicing (p. 389 )
Mutação espontânea (p. 392)
Mutação pontual (p. 386)
Mutação por mudança da matriz de lei-
tura (p. 388)
Mutação por substituição de pares de
bases (p. 387 )
Mutação por transição (p. 387 )
Muta ção por transversão (p.387 )
Mutação promotora (p. 389)
Muta ção regulatória (p. 389)
Mutação sem sentido (p. 388)
418 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

.
Mutação silenciosa (p 38 / ) Reparo de quebra da fita dupla (p.409 ) Reversáo de segundo sitio (p.392)
Mutaçáo supressora (p 392!) . Reparo fotorreatlvo (p. 402 ) Reversáo Intragênlca (p. 390)
Mutações induzidas (p. 395) Reparo por exclsão de nudeotideos Reversão verdadeira {p. 590)
.
Mutágeno (p 396) ip. 405) Sintese de DNA translesào (p. 599)
Polimerase de desvio (DMA polimerase Reparo por recombinação (p.40$ ) Sitio apuriníco (p. 595)
translesào] (p. 408 ) -
Resolução leste oeste (EW) ip. 411 ) Sitio de splicing críptico (p. 589)
Propor çáo aberrante (p. 411 ) Resolução norte- sul (NS) (p. 41 J ) Teste de Ames (p. 40 /)
Reparo com UV (p. 404 ) Reversão (mutaçáo reversa ) (p. 390)

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas .

Conceitos do capítulo
1. Identifique dois modos gerais em que os mutágenos quí- 9 . As duas sequências de DNA e polipeptídicas exibidas são
micos conseguem alterar o DNA. Forneça exemplos des- de alelos em um local hipotético que produzem pollpeptí -
ses dois mecanismos. deos diferentes, ambos com cinco aminoácidos de compri
mento. Em cada caso, a fita de DNA inferior é a frta-molde:
2. O ácido nitroso e o 5-BrdU alteram o DNA por mecanis-
mos diferentes. Identifique cada mecanismo e descreva
.
5' ..ATGCATGTAAGTGCATGA. 3' ..
como cada composto cria mutação.
Alelo Af : ...TACGTACATTCACGTACT. .5'
3' .
3. Usando o par de bases adenina-timina nesta sequência
- - - - - -
Polipeptideo A , N Het Hia Vai Ser Ala C
5\..ATGCAAGTAAGTGCATGA...3'
de DNA Alelo A; 3'...TACGTTCATTCACGTACT. .5' .
••• GCTC •• -
Polipeptideo A3 N - M e t - G i n V a i - S e r - A l a C
.* • CGAG ... Com base apenas nas sequências de DNA e polipeptidkas,
a. Forneç a a sequência após a mutaçáo por transição. há algum modo de determinar qual é o alelo dominante e
.
b Forneça a sequência após a mutaçáo por transversão . qual é o recessivo? Explique.

4. A sequência pardal de aminoácidos de uma proteí na do
tipo selvagem é
.. Arg-Met-Tyr-Thr-Leu-Cys-Ser ...
A mesma parte da proteína a partir de um mutado tem a
sequência:
... - - -
Arg Met Leu Tyr- Ala-Leu-Phe - haploide de levedura. A primeira impede a síntese da
a. Identifique o tipo de mutaçáo.
b. Forneça a sequência da fita -molde do DNA do tipo sel-
vagem. Use V6 se o nucleotídeo puder ser uma purlna,
T
/c se puder ser uma pirimidina, N se qualquer nucleo-
tídeo puder ocorrer em qualquer lugar ou os nudeoti-
deos alternativos se uma purina e uma pirimidina
forem possíveis.
5. A timina normalmente é a forma cetÔnica normal, mas,
se ocorrer um deslocamento tautomérico logo antes da
replicaçáo do DNA, faça um diagrama do par de bases
que resultaria . c Supondo que não ocorram outras mutações no ge-
6. A radiação ultravioleta (UV) é mutagénka.
a. Que tipo de lesão do DNA a energia UV provoca?
b. De que modo as lesões do DNA Induzidas por UV
levam à mutação?
c Identifique e descreva dois mecanismos de reparo do
DNA que removem as lesões do DNA induzidas por UV.
7. Pesquisadores interessados em estudar a mutação e o re-
paro da mutaçáo costumam induzir mutações com vários
agentes. Que tipos de mutações são induzidas por
a. Mutágenos quimicos? Forneça dois exemplos.
b. Energia radiante ? Forneça dois exemplos.
8. O efeito das mutações por substituição de par de bases
sobre a função da proteína varia amplamente, de ne-
nhum efeito detectável á perda completa da função da
proteína ( alelo nulo). Por que as consequências funcio -
nais das substituições de pares de bases variam tanto?
10. Em muitos estudos populacionais sobre mutaçáo espon-
tânea, duas observações são feitas sistematicamente: (1) a
maioria das mutações é recessiva e (2) a mutaçáo anteró-
grada é mais frequente que a reversão Em sua opinião, quais
são as prováveis explicações para essas duas observações?
11 . Duas mutações diferentes são identificadas em uma cepa
adenina por meio de uma mutação sem sentido do gene
ade- 1. Nessa mutação, uma substituição de par de bases
muda um códon triptofano(UGG)para um códon de pa-
rada(UGA). A segunda afeta um dos vários genes de RNAt
duplicados. Essa mutação por substituição de par de bases
muda a sequência de anticódon de um RNAt passando
- - - -
de 3' ACC 5'para 3' ACU 5' . ^
a. Você considera a primeira mutação anterógrada ou
uma reversáo? Por quê?
b. Você considera a segunda mutaçáo anterógrada ou
uma reversáo? Por quê?
noma, essa cepa de levedura mutada dupla será capaz
de crescer em um meio de cultura médio? Se o cres-
cimento vai ocorrer, caracterize a natureza do cresci-
mento relativa ao tipo selvagem.
12. Muitos genes humanos sáo conhecidos por terem ho
mólogos no genoma do camundongo. Uma abordagem
para a investigação da doença heredit ária humana é
produzir mutações dos homólogos no camundongo dos
genes humanos por métodos que podem visar precisa-
mente a determinados nudeotideos para mutação.
a. Muitos estudos de mutações dos homólogos no ca-
mundongo dos genes humanos produziram informa-
ções valiosas sobre como as mutações gênicas influen-
dam o processo de doença humana. Em termos gerais,
descreva como e por que a criação de mutações dos ho-
mólogos no camundongo pode fornecer informações
sobre os processos de doenças hereditárias humanas.
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recombinação homóloga
b. Apesar das homologias que existem entre os genes
humanos e os dos camundongos, algumas tentativas
para estudar os processos de doenças hereditárias
humanas induzindo mutações nos genes dos camun-
dongos indicam que há pouco a ser aprendido sobre a
doença humana dessa maneira. Em termos gerais, des
creva como e por que o estudo das mutações génicas
nos camundongos poderia não produzir informações
úteis sobre os processos de doença humana.
13. Responda às seguintes perguntas a respeito da acurácia
da DNA polímerase durante a replicaçào . .
a. Qual é o mecanismo geral que as DNA polimerases uti-
lizam para verificar a acurácia da replicaçào do DNA e
identificar os erros durante a replicaçào?
b. Se for detectado um erro de replicaçào do DNA pela
DNA polimerase, como ele é corrigido?
c. Se um erro de replicaçào escapar è detecçáo e corre-
ção, que tipo de anomalia tem mais chance de existir
no sí tio do erro de replicaçào?
d. Identifique dois mecanismos que conseguem corrigir
o tipo de anomalia resultante das circunstâ ncias iden-
tificadas na parte (c).
e. Se o tipo de anomalia Identificada na parte (c) náo
for corrigido antes do próximo ciclo de replicaçào do
DNA, que tipo de mutação ocorre?
í. A correção dos erros de pareamento do DNA pode dis - Qual é a base molecular da propriedade ausente?
tinguir com precisão entre a fita-molde e a fita recém-
-replicada de um duplex de DNA. Qual caracteristica
das fitas de DNA é utilizada para fazer essa distinção?
14. A síndrome de Apert é uma condição autossômica domi
nante humana que afeta o desenvolvimento de cabeça,
.
mãos e pés Em uma pesquisa de 322.182 nascimentos
consecutivos na Irlanda, dois novos casos de síndrome
.
de Apert foram identificados Qual é a taxa de mutação
desse gene por gameta?
15. A polidactilia é uma condição autossômica dominante hu-
mana que produz dedos extras nas mãos e nos pés. Estu-
dos de centenas de famílias com polidactilia determinaram
que a penetrânda do alelo dominante é de 70%. Levanta-
mentos de nativos baseados em hospitais constatam que
1 em 40 mH bebés tem um novo caso de polidactilia. Use
essa informação para estimar a taxa de mutação do gene.
16. A tabela a seguir mostra as taxas aproximadas de novas
mutações para tr ês doenças humanas autossômicas
dominantes.
Mutação por
Traço 106 gametas
Retinoblastoma (tumor da retina ) 20
Acondroplasia (nanismo estatural) 80
Neurofibromatose (tumor do tecido nervoso) 220
Aplica ção e integra ção
25. Apó s o derramamento de uma mistura de produtos quí-
micos em um pequeno lago, as bactérias do lago foram
testadas e exibiram uma taxa de mutação incomumente
elevada. Uma série de culturas mutadas é realizada a partir
das colónias mutadas e tratadas com mutágenos conheci-
.
dos para estudar a taxa de reversão A maioria das culturas
mutadas exibe uma taxa de reversão significativamente
419
a. Em uma série de 50 mil nativivos consecutivos regis -
trados em uma grande área metropolitana, quantos
novos casos de cada doença devem ocorrer ?
.
b Identifique duas razões moleculares para que a taxa de
novas mutações que causam neurofibromatose seja
mais de 10 vezes superior à taxa de mutação que causa
o retinoblastoma.
17. Uma amostra de 1 ml da bactéria £ coli é exposta à luz
ultravioleta. A amostra é usada para inocular um frasco
de 500 ml de meio de cultura completo, que permite o
crescimento de todas as células bacterianas A cultura
de 500 ml é realizada na bancada e duas amostras de
mesmo tamanho são removidas e colocadas em pla-
.
cas possuindo meios de cultura completos A placa 1
é embrulhada imediatamente em pano escuro, mas
.
a placa 2 náo é coberta As duas placas são deixadas
em temperatura ambiente por 36 horas e depois são
.
examinadas Observa-se que a placa 2 contém muito
mais colónias do que a placa 1. Pensando a respeito
dos processos de reparo do DNA, como você explica
essa observação?
18. Uma cepa de £ coti è identificada como portadora de
uma mutação nula do gene RecA. Qual propriedade bio-
lógica você espera que esteja ausente na cepa mutada?
19. Defina conversão génica e compare-a com mutação gènica.
20. Alguns eventos de recombinação homóloga produzem
.
conversão gênica A recombinação homóloga é um
evento mutacional? Explique .
21. O que é DNA heterodúplex e por que ele se forma ? Qual
é a relação entre DNA heterodúplex e conversão génica ?
22. O DNA heterodúplex resulta sempre da recombinação
homóloga? Explique.
23. Uma cepa de levedura produzindo um asco de quatro cé -
-
lulas é heterozigota para o alelo A/o 8 do tipo selvagem e
para o alelo mutado alob. O alelo do tipo selvagem car -
rega um par de bases A - T e o alelo mutado, um par
-
de bases G C em um sítio que faz parte de uma região
heterodúplex. Identifique os eventos que produzem os
seguintes tipos de ascos .
a. 3 Ala B: 1 alob
b. 3 ola-b: 1 AJa-B
c 2 o h b: 2 A J a B
.
24 A conversão gènica é relativamente fácil de detectar nos
ascos fúngicos de quatro e oito células, onde proporções
como 3A:1a ou 5a:3 A Indicam que a conversão génica
.
ocorreu Por que a conversão gènica é mais difícil de de -
tectar nos eucariotos multicelulares ?
mais alta quando exposta aos análogos de base como a
proflavlna e a 2-aminopurina. O que isso sugere a respeito
da natureza dos produtos químicos no derramamento?
.
26 Um geneticista em busca de mutações usa as endonu-
cleases de restrição Smai e PvuW para procurar mutações
que eliminem sítios de restrição. A Sma\ não vai clivar o
420 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

DNA com à metilaçã o CpG. Ela cliva o DNA na sequência a. Use as informações dispon í veis para caracterizar cada
de digestão por enzima de restrição mutado.
i b. Determine a sequência do RN Am do tipo selvagem.
5 ' - CCC GGG - 3' c. Identifique a mutação que produz cada polipeptideo
3' * GGG CCC - 5' mutado.
T 29. Experimentos realizados por Charles Yanofsky nos anos
A /Vuil não é sensí vel à metilaçáo CpG. Ela diva o DNA na 1950 e 1960 ajudaram a caracterizar a natureza da sín-
sequência de restrição tese do triptofano na £. coli. Em um dos experimentos
i de Yanofsky, ele identificou a glicina (gly) como o ami-
5 ' - CAG CTG - 3' noácido do tipo selvagem na posição 211 da triptofano
3' - GTC GAC - 5' sintetase, o produto do gene trpA. Ele identificou dois
t mutados independentes de sentido trocado com trip-
a. Qual é a caractenstica comum a Smol e Pvi/ll que seria tofano sintetase defeituosa nessas posições e que resul-
útil para um pesquisador em busca de mutações que taram de substituições de pares de bases. Um mutado
perturbem a digestào com enzima de restrição ? codificou a arginina (arg) e o outro codificou o ácido
b. Que processo o pesquisador está pretendendo detec- glutâ míco ( glu). Na posiçã o 235, a triptofano sintetase
tar com o uso das enzimas de restrição ? do tipo selvagem contém serina (ser), mas um mutado
27. Uma cultura do tipo selvagem de leveduras haploides é por substituição de par de bases codifica a leucina (leu).
exposta ao metanossulfonato de etila (EMS ). As células Na posição 243, o polipeptideo do tipo selvagem con-
da levedura sâo colocadas em placas com um meio de tém glutamina e um mutado por substituição de par de
cultura completo, e seis colónias (numeradas de 1 a 6) bases codifica um códon de parada. Identifique os có-
são transferidas para uma nova placa com meio de cul- dons do tipo selvagem mais prováveis para as posições
tura completo para mais estudos. Quatro placas iguais 211, 235 e 243. Justifique sua resposta em cada caso.
são produzidas, da placa com meio de cultura completo
30. A levedura do padeiro ( Saccharomyces cerevisiae ) nor -
até placas contendo apenas o meio de cultura mínimo ou
malmente é cultivada a 37° C, mas vai crescer produti-
um meio de cultura mínimo acrescido de um aminoácido
vamente em temperaturas baixas de até 20° C, aproxi-
(placas numeradas de 1 a 4 ) com os seguintes resultados:
madamente. Uma cultura haploide da levedura do tipo
Melo selvagem é mutagen í zada com EMS. As células da cul-
completo
tura mutagenizada são espalhadas em uma placa con-
tendo meio de cultura completo e cultivadas a 25* C.
Seis colónias ( 1 a 6) são selecionadas na placa original
I contendo o meio completo e transferidas para duas
Placa réplica placas novas contendo meio de cultura completo. As
novas placas completas (exibidas a seguir ) são cultiva -
f 1 das a 25° C e 37* C. Quatro placas- réplica s â o criadas
Placa 1 Placa 4 em meio de cultura mínimo ou acrescido de adenina a
partir da placa com meio de cultura completo a 25 ° C.
As novas placas sâo cultivadas a 25® C ou 37° C, con
Mínimo Minimo Mí nimo Minimo forme Indicado a seguir.
hlstidlna + arginina leucina
a. Identifique as colónias prototróficas (tipo selvagem).
Qual informação sobre o crescimento o(a ) levou a dar Meio
essa resposta ? completo
b. Identifique as colónias auxotróficas (mutadas). Qual
informação sobre o crescimento o(a) levou a dar essa
resposta ?
c Identifique quaisquer colónias His , Arg , Leu .
d. Para as seguintes colónias, preencha *+# para a síntese
do tipo selvagem e *-* para a síntese mutada da histi-
dina e leucina nas colónias 1, 3 e 5. Mínimo Minimo Mínimo Minimo
e. Existem colónias para as quais a informação genotípica adenina
4 adenina
4

não possa ser determinada ? 5e existirem, quais são elas? 25*C 37°C
28. Um fragmento de polipeptideo do tipo selvagem é se- a. Quais colónias são prototróficas e quais são auxotrófi
quenclado para sete amlnoácidos. A mesma regiã o poli- cas? Qual informação de cultura é utilizada para fazer
peptidica é sequenciada em quatro mutados. essas determinações?
Polipeptideo N.JThr-His-Ser- Gly-Leu -Lys- Ala...C b. Classifique a natureza das mutações nas colónias 1, 2 e 5.
do tipo selvagem c O que vocé pode dizer a respeito da colónia 4?
Mutado 1 N. Thr-Hi$-Ser-VaW_eu-Lys-Ala...C
» 31. Os dois géis ilustrados a seguir contém informações de
Mutado 2 NJRir-His- Ser-C sequenciamento do DNA pelo método didesoxi (ver Ca-
Mutado 3 N._Thr-Thr-Leu- Asp-C pítulo 7, pá ginas 250- 254) para um segmento de DNA do
Mutado 4 N.JThr-Gln-l_eu-Trp-lle-Glu-Gly...C tipo selvagem e mutado correspondentes á extremidade
 Capí tulo 12 Mutação gênka, reparo do DNA e recomblnaçào homóloga 421

N-terminal da proteína. O códon de início e os cinco có- a. Usando A para representar o alelo do tipo selvagem e
dons seguintes são sequenciados . a para o alelo mutado, identifique o genótipo de cada

A T
_
Tipo selvagem
C G AT
Mutado
CG
9 .
.
membro da família Identifique qualquer membro da
família que seja alcaptonúrico.
b Em uma figura separada, desenhe os padrões autorra-
diográficos de todos os genótipos que poderiam ser
encontrados nos filhos deste casal .
.
c Explique como a alteração na sequência de DNA resulta
em uma mutação de sentido trocado Ser para Thr .
33. Duas cepas haploides de fungo se fundem e formam um
.
diploide que produz ascos de oito c élulas A cepa fúngica
.
A tem o genótipo +ade 1 hts2 e a cepa B é <J++ Os três
genes estão ligados e ocorrem na ordem fornecida.
a. Os alelos no lócus do gene A são determinados em um
asco e a ordem é oaao+++^. Escreva o genótipo dos três
genes que você espera encontrar com mais frequência.
b. Um asco do diploide é do seguinte tipo:
f adel hii2
4- adelhis2
4 adel his2
9
4 adel his2
a. Escreva a sequência de DNA dos alelos, incluindo a po - a adel +
laridade da fita. a+ +
b. Identifique as fitas molde e não molde do DNA. a+ +
c Escreva as sequências de RNAm codificadas por cada o+ +
fita-molde e sublinhe os códons de início.
Explique os eventos que produziram esse asco.
d. Determine as sequências de aminoácldos traduzidas
desses RNAm. c Um asco do diploide é do seguinte tipo:
e. Qual é a causa da mutação? a 4- +
32. A alcaptonúria é um transtorno autossòmico recessivo o + +
humano, provocado pela mutação do gene HAO, que co- a -f his2
difica a enzima ãcido homogentlsico oxidase. 0 mapea- a 4- his2
mento de restrição da região do gene HAO revela quatro 4 adel his2
sítios de restrição SamHI (BI a B4) no alelo do tipo selva - 4- ade 1 his2
gem e três sítios de restrição ftamHI no alelo mutado. A 4 adel his2
fiomHI utiliza a sequência de restrição 5' - GGATCC - 3' . 4 adel hii2
A sequência de restrição da BamH\ identificada como Explique os eventos que produziram esse asco.
- -
B3 é alterada para 5' GGAACC 3' no alelo mutado. A
mutação resulta em uma mutação de sentido trocado Ser 34. Dois fungos haploides são cruzados e examinados em
.
para Thr Os mapas de restrição dos dois alelos são exibi- busca de evidências de recombmação e conversão gê-
dos a seguir e os sítios de ligação das duas sondas mole - nica em uma região de três genes ligados. A cepa A tem
culares (sonda A e sonda B) são Identificados. o genótipo ah' brp' cty e a cepa B tem o genótipo ala
brp- cty . A maioria dos esporos nos ascos de oito células
Kb 3,0 2.5 4,0
i i
dessa espécie é encontrada em uma proporção 4:4 de
BI B2 B3 B4 ala* brp* cty : akr brp - cty . No entanto, um asco contém
Fipo selvagem —I 1
i I
1
I + os seguintes esporos:
Sonda mutada f [
i i
+ fI + I + ala brp cty
LJ ala brp cty
A B
ala brp- cty
Amostras de DNA extraídas de uma mãe (M), um pai (F) akr brp’ cty
e dois filhos (Cl e C 2) são analisadas pela Southern blot- ola* brp* cty
ting do DNA digerido por ftomHI. A autorradiografia re- ala* brp* cty
sultante é ilustrada a seguir. ola' brp * cty*
ala* brp* cty
Kb
M „ F „ Cl „ a a. O que é Incomum nos esporos desse asco?
6r 5 b. O que os esporos sugerem a respeito da localização da
4,0
recombinação e do processo de conversão gênica?
3.0
c Explique como os esporos produzem uma proporção
23
6:2 nos alelos do gene brp e proporções 4:4 em ala e cty.
 Capítulo Aberrações e transposição

13
APRESENTA ÇÃO
cromossômicas

13.1 A não disjunção leva a mudanças no número

de cromossomos
13.2 Mudanças na euploidia resultam em vários
tipos de poliploidia
133 A quebra cromossômica provoca mutação por
perda,ganho e reorganização dos cromossomos
13.4 A quebra cromossômica leva á inversão e
translocação dos cromossomos
13.5 Elementos genéticos transponí veis se movem
por todo o genoma
13.6 A transposição modifica os genomas bacterianos
13.7 A transposição modifica os genomas eucarióticos

Transloca ções cromossômicas são mutações que reorganizam a

PONTOS ESSENCIAIS
I A não disjunção causa mudanças no nú
mero de cromossomos e pode resultar em
-
gametas contendo o número errado de
cromossomos.
I As mudanças no número de conjuntos
de cromossomos alteram os fenótipos e
podem conferir vantagens evolutivas.
I A quebra do cromossomo pode alterar sua
estrutura e levar à perda ou duplicação
de genes .
I A quebra do cromossomo pode levar às in-
versões e translocações cromossômicas.
I Os elementos genéticos transponíveis se
movem por todo o genoma e modificam
genes, cromossomos e genomas.
I Os elementos genéticos bacterianos trans-
poní veis facilitam a transferência de DNA.
I A transposição é uma fonte de mutação e
expansão dos genomas eucarióticos.
.
estrutura cromossômica Esta micrografia eletrónica mostra dois
pares de cromossomos homólogos que possuem segmentos troca -
dos e precisam formar uma estrutura tetravalente envolvendo os
quatro cromossomos para formar sinapses em suas regióes homó -
.
logas durante a prófase I
A Igo interessante está acontecendo aos camundongos em
Madeira, uma minúscula ilha na costa ocidental de Portugal:
eles estão passando por um processo de diferenciação em duas
espécies! A Ilha da Madeira, com cerca de 32.186 quilómetros de
comprimento e 12.874 quilómetros de largura, tem montanhas
vulcânicas íngremes correndo pelo meio que formam uma barrei-
ra para a fácil migração dos camundongos. O camundongo do-
méstico comum ( Mus musculus ) foi introduzido na Ilha da Madeira
pelos marinheiros nos anos 1400. Hoje, a Ilha da Madeira possui
duas populações distintas de camundongos. Uma em cada lado
da cadeia montanhosa central.
No entanto, há mais de uma cadeia de montanhas separando
essas duas populações. As duas populações se submeteram a vá-
rias fusões cromossômicas que reduziram seu número diploide. O
número normal de cromossomos do Mus musculus é de 20 pares
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômicas 423

.
( 2n = 40) No entanto, na Ilha da Madeira uma popu-
lação tem 2 n = 22 e a outra tem 2 n = 24. Como cada
população tem um número cromossômico diferente,
.
os híbridos entre as populações sào estéreis Esses hí-
bridos carregam 23 cromossomos (11 de um progeni - complexidade do organismo (Tabela 13.1 ). O n ú mero de
tor e 12 de outro) e, portanto, não conseguem formar
gametas viáveis. Esse exemplo de especiaçáo, baseado
principalmente nas diferenças na estrutura cromossô-
mica e no número de cromossomos, ocorreu ao longo
de menos de 600 anos.
A variação e a evolução no número de cromosso-
—
mos têm escopo genômico ou seja, potencialmente
alteram o conteúdo do genoma, mudando as intera-
ções entre os cromossomos homólogos na meiose
e limitando a possibilidade de reprodução entre os
organismos com diferenç as cromossômkas. Este ca-
pítulo aborda duas categorias distintas de mudança
cromossòmica. A primeira compreende um grupo de
alterações do número de cromossomos e da estrutura
cromossòmica, conhecidas coletivamente como aber -
rações cromossômicas. Por um lado, as aberrações
cromossômicas são eventos mutacionais que podem
alterar gravemente os fenótipos normais ou que po-
dem ser fatais para seus portadores. Por outro lado,
fazem parte do processo mutacional que cria diversi-
dade genética dentro da espécie, proporcionando um
mecanismo para a diversificação e a especiaçáo, como
exibido pelos camundongos da Ilha da Madeira. A se-
Euploidia e aneuploidia
O n ú mero de cromossomos contidos em um n úcleo
e o tamanho e forma relativos de cada cromossomo são
características que dependem da espécie, mas nenhum
dos dois parâ metros est á diretamente associado com a
cromossomos varia amplamente entre as espécies, em -
bora as espécies intimamente relacionadas tendam a ter
n ú meros semelhantes.
Com muito poucas exceções, o n ú mero de cro
mossomos é o mesmo nos machos e fê meas de uma
-
espécie e o n ú mero de cromossomos nos n úcleos das
células normais é um m ú ltiplo do n ú mero haploide
( w ), o n ú mero em um ú nico conjunto de cromosso-
mos. Independentemente de o n ú mero total de cro -
mossomos ser 2n ( diploide ), 3« ( triploide ) ou um
m últiplo maior de n, ele é descrito como um n ú mero
.
cromossô mico euploide Se as células contiverem
um n ú mero de cromossomos que nã o seja euploide,
o n ú mero cromossômico é aneuploide. A aneuploi-
dia ocorre quando um ou mais cromossomos sã o per -
didos ou adquiridos em relaçã o ao n úmero euploide
normal. A não disjun ção cromossòmica é uma causa
principal de aneuploidia .
Não disjunção cromossòmica
O termo não disjunção cromossòmica, ou simples -
mente não disjunção, se aplica a uma incapacidade
de separação dos cromossomos hom ólogos ou das
cromá tides irmãs como fariam normalmente durante
a divisão celular. A n ão disjun ção pode ocorrer com
resultados similares nas células somá ticas ou nas cé -
.
lulas germinativas Se um ú nico par de cromossomos

gunda categoria de mudança cromossòmica é a trans-

posição, o movimento de elementos do DNA dentro Tabela 13.1 Número de cromossomos em espécies
animais selecionadas
dos genomas dos organismos. A transposição é uma
fonte de mutação e também uma fonte adicional de Espécie Número cromossômico
diploide (2/i)
sequência de DNA que pode aumentar o tamanho dos
Carpa {Cyprinus carpio ) 104
genomas. Tanto as aberrações cromossômicas quanto
Gato ( Feiis cotas ) 38
a transposição cromossòmica contribuem para a evo-
Galinha (Go/ lus domesticus ) 78
lução e a especiaçáo, reorganizando e remodelando o
Chimpanzé ( Pan troglodytes ) 48
conteúdo dos genomas.
Vaca ( fios tourus ) 60
13.1 A não disjunção leva a mudanças Cão ( Canis familiaris ) 78
no número de cromossomos R ã ( Rana pipiens ) 26
Mosca- da-fruta 8
Anteriormente, discutimos a conexã o entre as (iOrosophih melonogaster )
duas leis da hereditariedade de Mendel e a disjunção
Cavalo { Equus cabalius ) 64
dos cromossomos homólogos e das cromá tides irmãs
.
durante a meiose (ver Capítulo 3) Na discussão que se Homem { Homo saptens ) 46
-
segue, concentramo nos na não disjunção como um Camundongo { Mus muscu /us ) 40
processo fracassado de disjunção cromossòmica e da Rato {Rattus non/ egicus ) 42
-
cromá tide irmã que pode resultar em anomalias no n ú
Macaco rhesus ( Mococa mulato ) 42
mero de cromossomos.
424 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
homólogos não fizer adequadamente a disjunção em
uma célula somá tica durante a divisão celular mitó-
-
tica , uma das células filhas resultante carrega um cro-
mossomo adicional ( 2n + 1) e na outra vai faltar um
cromossomo ( 2w - 1 ) ( Figura 13.1 ).
As células mitóticas dos animais que contê m o
n úmero errado de cromossomos podem sofrer viabili
dade reduzida em compara ção com suas contrapartes
possuidoras de um n ú mero cromossómico diploide. A
m á sobrevivê ncia dessas células costuma limitar sua
quantidade nos organismos, embora as células com
n ú meros anormais de cromossomos sejam comuns
no câncer, em que outras alterações genéticas, alé m
das alterações do n úmero de cromossomos, desempe
nham um papel central na sobreviv ê ncia e proliferação
da célula cancerosa.
Ao contrá rio das circunstâ ncias limitadas para as
mudanças no n úmero de cromossomos nas células ani
mais, muitas vezes as plantas té m uma tolerâ ncia subs-
tancialmente maior quanto ao n ú mero de cromosso-
mos e não é incomum encontrar cepas de plantas com
mais de duas cópias de cada cromossomo. Descrevemos
essa situação, chamada pvliploidia , em mais detalhes
em uma seção posterior.
A não disjunção nas células germinativas produz
gametas aneuploides e pode levar à produção de zigo -
tos aneuploides. A n ão disjunção meiótica pode ocor
rer tanto na meiosc I como na II e na maioria das vezes
afeta apenas um ú nico par homólogo ou um ú nico par
de cromá tides irm ãs. A não disjunção na meiose I é a
não separação dos cromossomos homólogos. Ela resulta
no deslocamento dos dois homólogos para um ú nico
polo. Um gametócito secundá rio contém os dois cro-
mossomos e o outro não contém nenhum . Esses game
tócitos contém n ú meros cromossômicos aneuploides
iguais aM + l e n - 1 ( isso presume que apenas um par
de cromossomos é afetado). Normalmente a meiose II
Figura 13.1 Não disjunção Meiose I
.
na meiose I Os cromossomos
homólogos nào fazem a disjunção
na meiose I e todos os gametas
resultantes são aneuploides. A
fertilização por um gameta haploide
normal produz zigotos trissômicos
(2n -f 1) ou monossômicos (2n - 1 ).
a a
A Nâo dsjunçâo
Gametócito
primá rio ( 2n )
prossegue, mesmo quando a meiose I é aberrante e
sua conclusão envia as cromá tides irmãs para game-
tas diferentes. Os quatro gametas resultantes contêm,
cada um, um n ú mero aneuploide de cromossomos. A
união dc um gameta aneuploide com um gameta ha -
ploide normal na figura resulta em um ovo fertilizado
- com um n ú mero aneuploide de cromossomos que será
t ris vó mico (2n + 1), possuindo três cópias de um dos
cromossomos em vez de um par homólogo, ou monos-
-
só mico ( 2n 1), possuindo uma única cópia de um dos
cromossomos em vez de um par homólogo.
Se ocorrer a n ão disjunção na meiose 11, normal -
mente ela vem depois de uma meiose I normal. Em
- consequência, os dois gametas secundá rios cont ê m o
n ú mero haploide de cromossomos ( Figura 13.2). Uma
vez que são células diferentes, elas se dividem inde-
pendentemente durante a meiose II; desse modo, se
- ocorrer a não disjunção, apenas um dos gametas se-
.
cund á rios será afetado Entre os quatro gametas re-
sultantes, dois são normais, pois a disjunção normal
ocorre durante cada divisão meiótica. Os outros dois
gametas sã o aneuploides, contendo n + 1 ou n 1 cro - -
mossomos. Os zigotos trissô micos ou monossô micos
são produzidos quando um desses gametas aneuploi -
des se une a um gameta normal na fertilização. Os
zigotos diploides normais resultam da fertilização de
qualquer um dos dois gametas haploides.
-
Alteração da dosagem gênica
Em 1913, aproximadamente ao mesmo tempo que
Calvin Bridges estava publicando sua demonstração da
teoria cromossòmica da hereditariedade, Albcrt Fran -
cís Blakeslee e John Belling estudaram as consequ ê n -
- cias fenotipicas da aneuploidia no estramônio ( Datura
itramonium) diploide (2w 24), no qual 12 pares de
cromossomos são identificados como A a L. Blakeslee e
Belling identificaram 12 linhas fenotipicamente distin -
Gametócitos Fertilização (com
secund á rios Gametas um gameta normal ) Zigotos
V(n + 1)
+
a
V(n + 1)
tn)
Trissòmico (2n + 1 )
a
a
(n - 1) +
(n)
(n - 1) Monossômico (2n - 1 )
(n - 1 )
 Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossóm í cas 425

Maios II Gametócitos Fertilização ( com Figura 13.2 Nio disjunção na

* secund á rios Gametas um gameta normal) maios II. A disjunção da cromátide
*
irmã falha na meiose II. A fertilização

A (Y) A
\\ 1)
•
normal dos gametas resultantes gera
zigotos tnssòmicos, monossómicos
ou diploides normais.

Não disjunção TrissÔmico ( 2/J f 1)

0
(n)
+

(n)
-
Monossômico ( 2/1 1)

a a
Cn)
Diploide normal (2n )
(n )

(n)

Diploide normal (2n )

tas de Datura trissòmico, uma para cada um dos pares
de cromossomos (Figura 13.3).
Esse resultado sugere que o número de cromosso
mos é um fator no fenó tipo e, nos anos que se seguiram
ao relatório de Blakeslee e Belling, outros estudos de -
monstraram que a ancuploidia provoca consequ ê ncias
fenotí picas graves em quase todas as espécies de animais
e que afeta o fenó tipo de muitas espécies de plantas. As
anomalias resultam de alterações na dosagem génica ,
o n ú mero de cópias de um gene. A aneuploidia muda
a dosagem de todos os genes no cromossomo afetado.
Em um diploide onde duas có pias de um gene, em um
par homólogo de cromossomos, geram 100% da dosa
gem génica, um mutado monossômico tem apenas uma
cópia do gene c apenas 50% da dosagem génica normal
para cada gene no cromossomo. Por outro lado, um
mutado trissòmico tem três cópias e 150% da dosagem
génica normal para cada um dos genes no cromossomo.
As alterações na dosagem gé nica levam a um de -
sequilíbrio dos produtos gênicos de cada cromossomo
afetado em relação aos nã o afetados e esse desequil íbrio
está no â mago das alterações do desenvolvimento nor-
mal e da produçào de fenótipos anormais. A maioria dos
animais é altamente sensível às mudanças na dosagem
génica, e sua biologia evolutiva, especialmente dentro
do sistema nervoso, não progride normalmente na pre -
sença de desequilíbrio na dosagem génica Ao contrário .
do potencial para perturbações evolutivas decorrentes
da aneuploidia nos animais, as mudanças na dosagem
génica sào mais pronlamente toleradas em muitas espé -
cies de plantas como consequência de seus programas
evolutivos distintos.
Aneuploidia nos seres humanos
- Profissionais médicos e outros especialistas em
biologia humana forneceram abundantes informações
sobre a aneuploidia humana, a maior parte delas se ori -
ginando na não disjun ção germinativa e na produçã o de
gametas aneuploides. Os seres humanos sào tremenda -
mente sensíveis às mudanças na dosagem génica pro-
vocadas pela aneuploidia , e a maioria das aneuploidias
humanas é incompatível com a vida. Teoricamente,
existem possivelmente 24 tipos diferentes de trissomia
—
nos seres humanos uma para cada autossomo e uma
para cada um dos cromossomos X e Y e um n úmero —

f aa #
Trissómkos igual de possíveis monossomias. Contudo, somente as
trissomias dos cromossomos 13, 18 e 21, e nenhuma
monossomia autossômica , são observadas com qual
quer frequência mensurável em recém nascidos huma
--
nos. Vá rias formas de trissomia do cromossomo sexual
também são detectadas com alguma frequê ncia no nas -
selvagem Enrolado Brilhoso Fmpenado Alongado cimento, com um tipo de monossomia do cromossomo
2n 2n + A 2n + B 2/i + C 2n + D sexual (Tabala 13.2). Uma ampla variedade de outras
F 1 gura 13.3 Surgimanto da tr
í ssômicos salacionad os no anomalias cromossô micas também ocorre nos recém -
estramònio ( Datura stramonium ) . nascidos. Cada uma das condições de aneuploidia
426 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
identificadas na Tabela 13.2, junto com outras anoma
lias cromossòmicas que ocorrem, resulta em anomalias
fenotípicas importantes nos neonatos.
Biólogos sabem que as trissomias e monossomias
diferentes das apresentadas na tabela ocorrem na con -
cepção, mas os zigotos resultantes quase nunca sobrevi -
vem para nascerem vivos. A explicação para essa situa
ção é que as anomalias do desenvolvimento produzidas
por essas outras trissomias e monossomias são tão gra
ves que quase sempre levam ao aborto espontâ neo no
in ício da gravidez. Os melhores dados dispon íveis sobre
a ocorrência de aneuploidia humana e sobrevivência
são provenientes de estudos que monitoram as mulhe-
res quanto a pequenas alterações hormonais associadas
à concepção e ao inicio da gravidez. Esses estudos fazem
duas observações surpreendentes. A primeira é que, no
primeiro trimestre da gravidez, cerca de metade dessas
concepções humanas evolui para um aborto espontâ
neo e a segunda é que mais da metade dessas gestações
humanas terminadas espontaneamente carregam ano-
malias do n úmero cromossò mico ou da estrutura cro
mossô mica. Essas observações apontam para uma fre-
quência surpreendentemente alta, de 15% a 25%, de n âo
disjunção meiótica nos seres humanos. Outros erros
que produzem gametas com cromossomos anormais
também podem ocorrer.
Para apurar a base biológica da alta taxa de não
——
disjunção meiótica nos seres humanos, a trissomia do
21 (síndrome de Down) a trissomia autossó mica mais
comum no nascimento tem sido foco de estudos in
Ta bela 13.2 Aneuploidias humanas e frequ ê ncias ao nascimento
Aneuploidia Sí ndrome Frequ ência ao nascimento
Aneuploidia autonômica
Trissomia do 13 Síndrome de Patau 1 em 15.000
Trissomia do 18 Síndrome de Edward 1 em 8.000
Trissomia do 21 Síndrome de Down 1 em 1.500
Aneuploidia do cromossomo sexual
47, XXY Sí ndrome de Klinefelter 1 em 1.000 ( homens )
.
47 XYY Síndrome de Jacob 1 em 1.000 ( homens)
47, XXX Síndrome do triplo X 1 em 1.000 ( mulheres)
.
45 X Síndrome deTumer 1 em 5.000 ( mulheres)
- tensos. Estudos epidemiológicos realizados ao longo de
várias décadas ligaram o risco de uma criança ter trisso-
mia do 21 com a idade da mã e na concepção. A Tabela
13.3 ilustra a conexã o entre a idade materna e o risco
.
de trissomia do 21 As an álises moleculares e gen òmicas
da síndrome de Down determinaram que um pequeno
- n ú mero de genes no cromossomo 21 é responsá vel pela
deficiência intelectual e por anomalias card íacas, que
- .
são os principais sintomas da síndrome A parte critica
do cromossomo 21 para a síndrome de Down, conhe-
cida como região crítica da síndrome de Down ( DSCR,
do inglês Down syndrome criticai region ), foi identi-
ficada pelo estudo de pessoas com trissomia parcial
do cromossomo 21. Esses indivíduos carregam duas
cópias completas do cromossomo 21 e um pequeno
segmento adicional do cromossomo 21 em outro cro -
- mossomo. Esses estudos identificam a região 21q 22.2
como a DSCR. Em outras palavras, os indivíduos com
síndrome de Down carregam invariavelmente a 21q 22.2
em três cópias. As pessoas que carregam três có pias de
um segmento diferente do 21q22.2 nã o exibem os prin -
cipais sintomas da síndrome de Down. Dentre um pu -
nhado de genes candidatos, o DYRK, um homólogo de
um gene no camundongo e na Drosophila que produz
defeitos de aprendizagem sensíveis à dosagem, faz uma
contribuiçã o pequena para a sí ndrome de Down. Nos
-
camundongos, a maior dosagem do homólogo DYRK
reduz o tamanho do cérebro. O DSCAM é um segundo
gene cuja maior dosagem está ligada à síndrome de
Caracter ísticas da sí ndrome
Deficiência intelectual e atraso no desenvolvi-
mento, possí vel surdez, anomalias orgâ nicas
importantes, morte precoce
Deficiência intelectual e atraso no desenvol -
vimento, anomal ias cranianas e faciais, morte
precoce
Deficiência intelectual c atraso no desenvolvi
mento, anomalias faciais caracter ísticas, baixa
-
estatura, expectativa de vida variá vel
Caracteristka sexual secundá ria variável,
glnecomastia frequente; pouco ou nenhum
impacto na capacidade mental
Alta estatura é comum; poss í vel redução, mas
nenhuma perda, na fertilidade; nenhum impac-
to na capacidade mental
Alta estatura é comum; possível redução da
fertilidade; irregularidade menstrual; nenhum
impacto na capacidade mental
Nenhuma caracteristica sexual secundá ria;
infertilidade, baixa estatura; pescoço alado é
comum; pouco ou nenhum impacto na capaci-
dade mental
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômí cas 427

Tabela 13.3 Risco de sindrome de Down (trissomia do 21) pela Idade materna *
Faixa etá ria materna Total de natrvivos estudados Nascimentos com trissomia do 21 Taxa por 1.000 nascimentos
15 19 30.272 18 0,49
20- 24 117.593 87 0,73
25 29 108.746 96 0,90
30- 34 49.487 72 1,56
35-39 19.522 73 4,19
40-44 4.880 73 18,02
45-49 304 19 55,02
'Diaao .
* adaptado* dr E. 6. Hook e A. linckjo, Down syrdromr In llvp blrtht by tlngk* ycar m rrrmaJ age Interval In a Swcdbh ttudy: Compatlvon w*rh rrsult* frcvn a New
. *-
York State study. Am J. Hum Genet, n 30t p. 1 27, 1978.

Down. Esse gene também tem homólogos no camun - (a ) Estrutura trivalente (b) Fstruturas bivalente
dongo e na Drosophila, onde seu produto proteico par
ticipa na formação do coraçã o e dos componentes do
- Metáíase I
e trivalente
Metáfase I
sistema nervoso em desenvolvimento.
Um tipo de mudança diferente na dosagem genica III Bivalente
é observado nos seres humanos com sindrome de Tur-
ner, uma monossomia do cromossomo X na qual há um
cromossomo X, mas não h á um segundo cromossomo
sexual (ver Tabela 13.2). Apesar da ocorrência da inati
vaçáo do X nos embriões femininos humanos, são ne
cessários dois cromossomos sexuais para o início de de-
-- III
«- Unlvalente

senvolvimento normal. Nos embriões femininos que são Anáfase I Anáfase I

X (sindrome de Tumer ), a ú nica cópia do gene SHOX , I
localizada na regiã o pseudoautossò mica no braço curto
do cromossomo X e do cromossomo Y, é insuficiente I
para controlar certos aspectos do desenvolvimento nor
mal. A haploinsuficiência do SHOX parece desempenhar
- II III

um papel central na produção da sindrome de Turner.

/ ÍU1 \ Segregação
Observa çã o gené tica Normalmente a aneuploidia
resulta da não disjunçã o cromossômica e produz anomalias
pelas mudanças na dosagem de genes críticos.
cromossomo
i
Meiose II Meiose II
\ I
Diminuição da fertilidade na aneuploidia i i i

O tipo e o grau das anomalias de desenvolvimento

em um organismo aneuploide são uma consequência das
mudanças na dosagem dos genes afetados, mas as pertur -
bações nos padrões de segregaçã o cromossômica durante
a meiose também conseguem produzir outro problema: a
redu çã o no n ú mero de gametas haploides também pode
prejudicar a fertilidade. No caso de uma trissomia, a se-
gregação cromossô mica na meiose é perturbada porque
trés cromossomos homólogos, em vez de dois, estão ali
nhados na sinapse e segregando na anáfase 1.
Em uma trissomia, dois padrões de cromossomos
homólogos são possíveis entre os três cromossomos na
metá fase I (Figura 13.4 ) —
uma estrutura sin ó ptica tri
valcntc ou um arranjo bivalente e univalente mas
II II
lll lll lll lll
Em quakjuer um dos casos, dos gametas são
normais e carregam um cromossomo, e das gametas
sáo aneuploides e carregam dois cromossomos.
- Figura 13.4 Dois padrões meióticos de segregação nos
trissômkos. (a ) Tr és cromossomos formam uma estrutura
trivalente na sinapse e produzem apenas dois gametas
haploides normais entre os quatro gametas. (b) Um arranjo
- bivalente e um arranjo univalente dos três cromossomos
— também levam a apenas dois gametas haploides normais.
428 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

náo existe um mecanismo para dividir igualmente três

cromossomos na anáfase I. Assim, dois cromossomos 46, XX
zigoto
se deslocam para um polo e um cromossomo se desloca
para o polo oposto durante a anáfase. Após a conclu
são da meiose, a metade dos gametas é haploide para
- Mitose
o cromossomo, mas os gametas restantes contém duas
có pias. Isso reduz efetivamente o n ú mero de gametas
viáveis em aproximadamente a metade, pois os game - 46, XX 46, XX
tas com um cromossomo extra vão produzir progénie
trissò mica com pouca probabilidade de sobrevivência.
Uma proporção 1:1 de gametas haploides ( normais) para i I
diploides (anormais) foi observada em vários organis
mos experimentais. Essa circunstância resulta em uma
- Continuação normal
da mitose
Náo disjunção
mitótica do cromossomo X

—
forma de semiesterilidade, uma redução mas não a
eliminação completa da fertilidade. Estudos de casos
de reprodução esporádicos de pessoas com síndrome de
Down identificam a menor fertilidade e a geração fre
quente de filhos com síndrome de Down em consequê n
cia da alta taxa de produção de gametas com uma cópia
adicional do cromossomo 21 decorrente da alta propor
ção de gametas com duas cópias do cromossomo 21 .
Mosaicismo
Nossa discussão sobre a inativaçâo aleató ria do X
das fé meas de mamíferos identificou o fenómeno como
um exemplo de mosaicismo que ocorre naturalmente,
no qual diferentes células do organismo contêm cro-
mossomos X com funcionamento diferente ( ver Ca
pítulo 3). O mosaicismo também pode se desenvolver
pela n ão disjunção mitótica no in ício da embriogê nese e
é um dos muitos tipos de anomalias cromossómicas que
-
ocorrem nos recém - nascidos. Por exemplo, 25 30% dos
casos de sí ndrome de Turner , a monossomia do cro-
mossomo X (45,X ), ocorrem em mulheres com algumas
células que são 45, X e outras que são 46,XX. Alguns
indivíduos com síndrome de Turner tipo mosaico tam
bém carregam células 47,XXX. Esse tipo de mosaicismo
normalmente é derivado da náo disjun ção mitótica em
.
um zigoto 46, XX ( Figura 13.5 )
Nas moscas-da -fruta, borboletas e traças, o mosai
cismo do cromossomo sexual produz um determinado
fenótipo sexualmente ambíguo, chamado ginandro-
morfismo. A morfologia sexual do ginandromorfismo
é a fémea Cgin ** ), com a metade do corpo e o macho
.
("andro") com a outra metade ( Figura 13.6) O ginan -
dromorflsmo se desenvolve em consequência da não
disjunção mitótica no início do desenvolvimento.
Dissomia uniparental
Uma anomalia rara do conteúdo cromossòmico,
.
chamada dissomia uniparental foi identificada no
homem. A dissomia uniparental ocorre quando ambas
as cópias de um par de cromossomos hom ólogos ori -
ginam -se de um ú nico progenitor. Ela foi identificada
pela primeira vez vinculada a duas condições cromossó-
micas, a síndrome de Angelman ( AS; Omim 105830) e
- 46, XX 47, XXX
-
-
Cariótipo tipo mosaico
-
As mulheres com síndrome deTumer npo mosaico contém células
46, XX e 45, X e também podem ter células com 47, XXX
Figura 13.5 Mosaicismocromossòmico. 0 mosaicismo
começa normalmente com um zigoto diploide normal. A não
disjunção mitótica produz uma ou mais linhagens celulares
aneuploldes que persistem e são encontradas no recém-nasddo.
- -
a síndrome de Prader Willi (PWS; Omim 176270), que
normalmente resultam de uma deleçã o parcial da parte
15ql 1.12 do cromossomo 15.
A dissomla uniparental tem dois mecanismos de ori -
- gem. O mecanismo mais raro requer a não disjunção do
mesmo cromossomo no espermatozóide e no ovo Por .
exemplo, a dissomla uniparental para o cromossomo 15 é
produzida quando um gameta contribui com duas cópias
do cromossomo e o outro não contribui com uma cópia.
O segundo mecanismo é mais comum. Ele envolve a náo
disjunção cm um progenitor que resulta em um gameta
aneuploide fornecendo duas cópias do cromossomo 15.
O outro gameta é normal e contribui com uma única
cópia desse cromossomo. A união dos gametas resulta em
trissomia do 15 no ovo fertilizado, uma condição invaria -
velmente incompatível com a sobrevivência. Por meio de
um processo conhecido como resgate trissómico, uma
das cópias adicionais do cromossomo 15 c ejetada alea -
toriamente em uma das primeiras divisões mitóticas após
a fertilização. Um resultado do resgate trissómico pode
ser uma célula com um cromossomo de cada progenitor.
Os zigotos com esse resultado t êm conteú do cromossò-
 Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 429

Macho com olhos Fémea com olhos (a ) Fertiliza ção por m ú ltiplos grá os de pólen
brancos e asas em
miniatura ( X )
vermelhos e asas do
tipo selvagem ( XX) n + n + n

°*°
I
Pólen
— 3n
Zlgoto

n t n + n n 4n
Ovo Pólen Zigoto

( b) Aumento do n úmero de cromossomos pela ná o

disjunção mí tótica
Fertilização por
gameta haplode
Não disjunçã o
m í tótica Meíose
2n 4n 2n + n 3n
Célula - tronco Gameta Gameta Zigoto
sexual triploide
Fertilização por
gameta diplõde
N ão disjunção
m í tótica Meiose
2n 4n 2n + 2n -» 4n

Célula-tronco Gameta Gameta Gameta Zigoto

sexual tetraploide
Figura 13.6 Ginandromorfismo na Drosophila. Os olhos
brancos e as asas em miniatura são traços recessivos ligados ao (c ) Aumento do n ú mero de cromossomos pela náo
X, presentes na metade hemizigótica masculina ( X) da mosca. disjunção meiótlca
Os genótlpos heterozigotos de ambos os genes estã o presentes Fertilização por
na metade feminina do tipo selvagem ( XX ) da mosca. gameta haplode
Não disjunção
meiótica
2n 2n + n 3n
mico normal. De modo alternativo, o resgate trissòmico
poderia resultar em um zigoto que contém duas cópias -
Célula tronco
sexual
Gameta Gameta Zigoto
triploide
do cromossomo 15 provenientes do mesmo progenitor
( isto é, dissomia uniparental ) . Fert lização pa
gameta dfjJode
-
A dissomia uniparental produz 10% 20% dos casos Não disjunçã o
de AS e PWS. Quando a dissomia uniparental provoca
.
AS as duas cópias do cromossomo 15 são do pai e não
há cópia materna do cromossomo 15. Mos casos de dis -
2n
meiótlca

somia uniparental da PWS, as duas cópias do cromos -
somo 15 são da mãe e não há cópia do cromossomo 15
paterno. A descoberta das formas de dissomia unipa
-
rcntal da AS e da PWS origina se de um processo de re
gulação da expressão gé nica nos mam íferos, conhecido
como iniprintinggenômico ( ver Capítulo 15) .
Observa çã o gen é tica Os organismos tipo mosaico
contêm duas ou mais linhagens celulares distintas que pos-
suem cromossomos diferentes, resultantes da não disjun ção
m ítótica. A dissomia uniparental é uma consequência rara da
não disjunção, na qual as células resultantes possuem duas có-
pias de um cromossomo provenientes de um ú nico progenitor.
13.2 Mudanças na euploidia resultam
em vários tipos de poliploidia
Poliploidia é a presença de três ou mais conjuntos de
cromossomos no n úcleo de um organismo. A poliploidia
na natureza pode resultar da duplicação de conjuntos de
cromossomos euploides de uma única espécie ou da com
binação de conjuntos de cromossomos de diferentes es-
Célula - tronco
sexual
2n
Gameta
+ 2fl
Gameta
— 4n
Zigoto
tetraploide
Figura 13.7 Mecanismos que criam zigotos triploides e
tetraploides nas plantas.
-
-
pécies. Muitos tipos de poliploidia são possíveis triploi-
des (3/f ), tetraploides (4/f ), pentaploides (5/f ), hexaploides
—
(6/f ), octaploides (8w) etc. Os poliploides cujo cariótipo
consiste em cromossomos derivados de uma única espé-
cie são designados autopoliploides e os poliploides com
conjuntos dc cromossomos derivados de duas ou mais
espécies se chamam alopoliploides ( aio - "diferente").
Termos como autotetraploide (cromossomos 4/f que
derivam de uma única espécie) e aloexaploide (6/f com
cromossomos derivados de duas ou mais espécies ) são
usados para descrever o conteúdo genômico de um orga-
nismo poliploide. A poliploidia é comum em espécies de
plantas, mas é extremamente rara nos animais.
Autopoliploidia e alopoliploidia
Três mecanismos levam à poliploidia ( Figura 13.7) .
1 . Fertilizações m últiplas. A fertilização de um ovo
- por mais de um grão de pólen haploide resulta em
um zigoto triploide (3/f ) ou superior Geralmente .
430 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

isso é um evento raro, pois a maioria das plantas (a )

com reprodução sexuada possui mecanismos ela - Espécie 1 Espécie 2
borados para evitar a fertilização de um ovo por 2n * 10 2n 14
mais de um ú nico grão de pólen.
.
2 N ã o disjun ção mit ótica. A n ão disjunção mitótica I
nas células- tronco sexuais pode resultar em dupli - Meiose
i
cação cromossòmica. Essas células se dividem por
mitose antes de entrarem na meíose e a n ão disjun - n, = 5 Gametas n, «= 7
çã o mitótica duplica o n ú mero de cromossomos
de 2n para 4n. Os gametas resultantes da divisão
-
meiótica das células tronco sexuais 4/i são 2n. Se
União dos gametas
um gameta 2n se unir a um gameta haploide, a pro-
gé nie resultante é 3w; e se dois gametas 2w se uni - i
rem, o resultado é um zigoto 4n . , - , = 12 O h íbrido interespecífico é inf értil pea
3. N ão disjunção meiótica. A nào disjunção meiótica Hibrido 0 40
não hornology dos cromossomos
interespecí fico
pode produzir um gameta diploide em vez de um
haploide. Isso é similar em termos funcionais ao
( b)
mecanismo de não disjunção mitótica, exceto que
a quebra na disjun ção afeta os produtos de uma
ú nica meiosc. A união de um gameta 2w c um ga - , - , = 12
0 4 0

meta haploide produz um zigoto 3« e a união de

dois gametas diploides produz zigotos 4n. I
Duplicação
Os alopoliploides carregam conjuntos de cromosso- cromossòmica
mos que se originaram de espécies diferentes. A união i
de um conjunto de cromossomos haploides da espécie
1 ( n ) e um gameta haploide da espécie 2 ( n ) produz 2n, + 2n, = 24
Pareamento e disjunção de
um organismo híbrido que pode ter um n úmero par cromossomos homólogos.
ou impar de cromossomos, já que a espécie relacionada
.
pode ter n úmeros diploides diferentes iFigura 13.8a ) Por I
Meiose
exemplo, se a espécie 1 tiver 2w = 10 e a espécie 2 tiver l
2rt = 14, o h íbrido « , + n terá 12 cromossomos. Os h í-
bridos interespécies desse tipo são inférteis, pois os dois
conjuntos de cromossomos nã o sã o homólogos e não
pareiam durante a meiose. A fertilidade desses híbridos
Gametas o, + o, = 12 + , , = 12
o +n
— ,
2o, 2o * 24

interespécies pode ser resgatada se ocorrer a duplicação 0 hibrdo interespédes é fértil e

cromossòmica pela não disjunção nas células que ori-
ginam as células sexuais. A duplicação cromossòmica
em nosso hipotético híbrido interespécies resulta em
24 cromossomos nas células sexuais [ 2n / + 2wJ e cada
cromossomo tem um parceiro hom ólogo para o parea -
.
mento meiótico adequado [ Figura 13.8b ) O término da
meiose produz gametas contendo w# #i2 12 cromos-
somos. Esses gametas conseguem se unir com gametas
parecidos para reproduzir o híbrido interespecífico e
manter o n ú mero de cromossomos 2n , + 2n2 = 24.
Consequências da polí ploidia
Os alopoliploides ocorrem na natureza e também
são produzidos pela manipulação humana. Quando
usada para fins comerciais, a pol í ploidia gera trés conse-
quências principais. Primeiro, o tamanho da fruta e da
flor é maior. Os n úcleos e células das cepas poliploides
são maiores que os das cepas diploides e muitas varie
dades comuns de frutas e legumes se beneficiam desse
- plantas cultivadas com polí ploidia ímpar. Certos frutos e
efeito. As maçãs (3w = 51), as bananas (3n = 33), os mo-
rangos (8w = 56), o amendoim ( 4n = 40) e as batatas ( 4n
= 48) são apenas alguns exemplos.
pode se reproduzir
Figura 13.8 Produçãodt alopollploldla . ( a ) Auni à ode
dois gametas haploides, o , = 5 e = 7, de espécies diploides,
produz um h íbrido interespécies com 12 cromossomos.
( b ) A duplicação cromossòmica produz um alopoliploide
fértil com 24 cromossomos que produz gametas com 12
pares de cromossomos homólogos.
O maior tamanho da fruta e da flor nas plantas po-
liploides ocorre à custa de um segundo efeito
tilidade. O problema é particularmente agudo para os
a fer- —
poliploides de n ú mero ímpar (3w, Sn etc), nos quais o n ú-
mero ímpar de cromossomos nào pode ser dividido igual-
mente na primeira divisão meiótica. O resultado é uma
distribuição desigual dos cromossomos que toma quase
todos os gametas resultantes inviáveis. Essa desvantagem
reprodutiva é transformada em vantagem comercial nas
legumes "sem sementes" no corredor de produtos horti-
frú ti do seu supermercado local são poliploides ímpares.
tica de importância comercial
—
Os alopoliploides exibem uma terceira caracterís-
aumento na heterozi -
 Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 431

gosidade em relação aos diploides que ocorre quando
as linhagens puras (endogá micas) são cruzadas, sendo
a base do maior vigor de crescimento. Esse fenó meno
é conhecido como vigor híbrido e consiste no cresci-
mento mais rá pido, na maior produção de frutos e flo-
res e na maior resistência à doença entre a progénie he -
terozigota ( h íbrida ) das linhagens puras.
Homozigosidade recessiva reduzida
O padrào de herança de um ú nico gene nos poli-
ploides é diferente do padrà o nos diploides no que diz
respeito às proporções dos fenótipos dominante e re -
cessivo de certos cruzamentos. Essa diferença está li
gada diretamente ao n úmero adicional de cópias gené
ticas nos genomas poliploides. Um fenótipo dominante
é produzido por qualquer gen ótipo contendo uma ou
mais cópias do alelo dominante e o recessivo é produ -
zido apenas pelo gen ótipo recessivo homozigoto. No
caso de um fenótipo decidido por um ú nico gene com
um alelo dominante e um recessivo, a probabilidade de
produzir o fenótipo recessivo em uma cepa tetraploide
é menor em comparação com a probabilidade de pro -
duzi- lo em uma cepa diploide.
Pegando como exemplo um autotetraploide com o
genótipo AAaa , vamos determinar a probabilidade de a
progénie produzida pela autofertilizaçáo ter o genótipo
.
aaaa Vamos usar as designações A , A „ a.t e a 4 para os
{
liploide pelas diferenças cromossõ micas que tornam
improvável a hibridação entre a nova espécie. Segundo,
a poliploidia produz duplica ção gémea que relaxa as
restrições da seleção natural sobre as cópias duplicadas
dos genes. ( Discutimos essas ideias no Capítulo 22.)
Nenhuma espécie de planta comum incorpora o
impacto evolutivo da poliploidia de maneira mais ra -
dical que o Triticum aestivum, o trigo comum do pão.
O Triticum aestivum é um aloexaploide natural (6n )
que se desenvolveu pela união de genomas diploides de
três espécies ancestrais em dois eventos de hibrida ção
( Figura 13.9 ). Os membros modernos do gênero Triti -
cum possuem 14 ( 2w ), 28 (4« ) e 42 (6rt ) cromossomos.
- A história evolutiva do trigo moderno começa com a
- hibridação de duas espécies diploides que contê m 14
cromossomos cada. O trigo einkorn ( T. monococcum ) é
uma variedade cultivada que ainda pode ser encontrada
em todo o mundo. Representada pela fórmula gen ô-
mica AA , o T. monococcum hibridado com uma grama
selvagem , T. searsiii ( fórmula genó mica BB ), forma uma
variedade alotetraploide chamada trigo emmer ( 7. tur *
-
.
gidum ) O trigo emmer (fó rmula genó mica AABB ) era
cultivado aproximadamente 10 mil anos atrás, quando
sofreu um segundo evento de hibridação com outra es -
pécie diploide de grama selvagem, T. tauschii (fórmula
.
genómica DD ) , formando o T aestivum ( fórmula genô-

alelos do gene. A proporção entre alelos dominantes e re- Trigo einkorn

{T. monococcum )
Grama selvagem
cessivos é 2:2 no tetraploide e são produzidos seis genóti
pos de gametas diploides pela disjunção homóloga: Aftj
- 14 cromossomos
(conjuntos AA)
{ T. seonii )
14 cromossomos
(conjuntos BB )
A /it A / i 4 e a /tr Dentre esses gametas, apenas
um ( um sexto do total ) contém dois alelos recessivos. A
probabilidade de união de dois gametas totalmente re- I
cessivos é, portanto, ( l /6)( l /6) = 1/36, muito menos que Duplica ção cromossôrrca
% de probabilidade de produzir uma prole homozigota 5110.000 - 12.000 anos atrás
recessiva a partir de diploides heterozigotos com o genó I
tipo Aa. A An á lise Genética 13.1 vai guiá - lo pela aná lise Trigo emmer Grama selvagem
de um cruzamento genético envolvendo poliploides. .
( T turgidum ) .
(T tauschii )
28 cromossomos 14 cromossomos
(conjuntos AABB) x (conjuntos OD )
Poliploidia e evolução
As desvantagens no crescimento e reprodução vi -
vendados pelos organismos poliploides podem ser
compensadas pelas vantagens evolutivas da poliploidia. i
Trigo h íbrido
Mais da metade de todas as espécies contemporâ neas 21 cromossomos
de plantas floríferas deriva de ancestrais que evolu íram (conjuntos ABO )
por poliploidia.
A evolução por poliploidia é um evento repentino
I
Duplicação cromossómlca
e radical, que pode levar ao desenvolvimento de uma * 8000 anos atrás
nova espécie em um período de apenas uma ou duas
gera çóes. As espécies que tiveram uma histó ria gené - Trigo de pão
tica quicsccntc podem sofrer uma explosão repentina (Ti aestivum )
de mudan ça evolutiva através do desenvolvimento da 42 cromossomos
(conjuntos AABBDD )
poliploidia por meio de dois mecanismos. Primeiro, a
alopoliploidia pode resultar na evolução de uma nova
-
espécie, pelo fato de que a progénie recé m poliploide
é isolada reprodutivamente de sua progenitora não po - Figura 13.9 Evolução do trigo moderno [ Triticum aestivum ) .
432 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
A cor da flor em uma planta autotetraploide é a caracterí stica de um único gene com dois alelos, R ,
e no lócus gênico. O alelo Rt produz cor, mas o Rt não produz. Consequentemente, a intensidade
da cor da flor é determinada pelo número de alelos Rt no genótipo. A correspondência genótipo-
-fenótipo é
Genótipo Fenótipo
Vermelho- escuro
Vermelho- claro
Rosa
Rosa-claro
WA Branco
Uma planta de flor rosa é autofertilizada. Quais são os fenó tipos previstos para a cor da flor e em
que propor ções eles devem ocorrer ?

Estrat égias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por
este problema e explique a natureza
.
1 Este problema diz respeito è autofertilização de um autotetraploide. A resposta
requer a determinação dos fenótipos da progénie e da frequência prevista para
da resposta solicitada. cada fenótipo.

2- Identifique as informações criticas (X A planta é identificada como autotetraploide e as relações especificas entre ge-
fornecidas no problema. nótipo e fenótipo são fornecidas.

Dica: Os a*jtou»*.ràptc«dM sáo An e carre-

gam quatro cromossomos homólogos dal-
vados de uma Omaepédt

Deduzir
3. Identifique o genótipo da planta au - . ,
3 0 genótipo da planta de flor rosa é R R :RjRr Os gametas serão diploides. Seis
tofertilizada e os possíveis gametas combinações aleatórias de cromossomos podem se formar durante a ga -
que eia produz . .
metogénese O primeiro cromossomo R , pode ocorrer em um gameta com o
Dica: Os gametas dr um autotetraploide tio
segundo Rt ou com qualquer um dos cromossomos R , formando três dos ga-
dipodev Cada gameta contém dois das cro- metas. 0 segundo íf , pode ocorrer com qualquer um dos cromossomos Rr for-
mossomos no genótipo tetraploníe- mando mais dois gametas, ou os dois cromossomos R . podem formar um ga-
meta, perfazendo a sexta combinação.

.
4 Determine o genótipo e a frequência 4. Cada combinação de cromossomos nos gametas vai se formar com a mesma
prevista para cada possível gameta. frequência, significando que a frequência prevista para cada gameta é 1/6. Uma
V combinação contém os dois cromossomos R , e a outra contém os dois cromos -
Dk : /Adicione as frequências previstas para os
*
qairww e certifique se de gue sua soma é 1JQ. ] somos R . Os gametas restantes são combinações diferentes com o genótipo
Rfl2 para uma frequência combinada de 4/6.
Solucionar
.
5 Descreva as possíveis uniões de ga- .
5 Os resultados da união desses trê s genótipos de gameta são:
metas e a produção de progénie por R ,R > RA RA
< > < >
fertilização.
Dica: Use um quadrado de Punnett
para mostrar as uriòes dcs uameLsv
RA RtRiRrRi
* <í>
R r RiR rRj RARA
*
< > 4> ( 4) 4
*
( ( )

RA RrR ,RA R,R ,RJRí ,

R RJRA
<í ) ( ) 4 (ú) ( ) 4

RA RARA RMA RJRíRA

(i) ( ) 4 ( )4 ( 4»

ANÁLISE GENÉTICA
6. Resuma os genótipos, fenótipos e frequên- 6. A autofertiliza çào de uma planta rosa com o genótipo
cias previstas a partir desse cruzamento. duzir o seguinte resultado:
Ok «: AdWo'* * frequtndas previsUs
pare » certificarde que a soma é 1jD
Para pratkar mais, ver Problemas 1.2 e 11 .
mica AABBDD ) , a espécie aloexaploide moderna. O úl
timo evento pode ter resultado da intervenção humana
durante o processo de domesticação do trigo . de cromossomos intactos. Por outro lado, como parte
Observa çã o gen é tica A poliploidia aumenta o tama-
nho do fruto e da flor, provoca mudanças na fertilidade e al-
tera o vigor de crescimento. Apesar de ter poss í veis desvanta-
gens de crescimento e reprodução, a poliploidia oferece vá rias
vantagens evolutivas.
13.3 A quebra cromossômica
provoca mutação por perda,
ganho e reorganização dos
cromossomos
Vimos que o equil íbrio adequado da dosagem gê -
nica é importante para promover o crescimento e o de
senvolvimento normais e que mudanças na dosagem gê
nica podem ter consequê ncias fenotí picas substanciais.
Por essa razão, as mutações que resultam em perda ou
ganho de segmentos cromossômicos també m têm po
tencial para produzir anomalias graves. Essas mudan ças
podem ser suficientemente grandes para serem detec
tadas por microscopia e podem afetar amplas regiões
dos cromossomos possivelmente contendo de deze -
nas a centenas de genes. Por outro lado, as mudan ças
podem ser tão pequenas que sua detecçào é visualmente
impossível pela microscopia convencional Essas alte -
rações cromossómicas às vezes podem ser detectadas
com métodos moleculares. Nesta seçã o, examinamos
as alterações na estrutura cromossô mica pela quebra
cromossô mica e outros eventos que levam a perda ou
ganho de segmentos cromossô micos.
Deleção cromossômica parcial
Quando um cromossomo se quebra, as duas fitas
do DNA são cortadas em um local chamado ponto de
quebra cromossômica. As extremidades do cromos
somo quebrado em um ponto de quebra retém sua es -
Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossómicas 433
continuação
deve pro-
Genótipo Fenótipo Frequência
Vermelho escuro 1 /36
R .R ,RtRj Vermelho-claro 8/36
Rosa 18/36
Rosa-daro 8/36
VM Branco 1 /36
- trutura de cromatina e podem aderir a outras extremi
dades de um cromossomo quebrado ou às extremidades
-
do cromossomo quebrado é acéntrica (sem um centrô-
mero), ela pode ser perdida durante a divisão celular.
A quebra cromossômica pode resultar em dclcçáo
cromossô mica parcial , pela perda de parte de um cro-
mossomo. O tamanho da dcleção e os genes específicos
deletados são fatores importantes no grau da subsequente
anomalia fcnotípica. Pequenas deleções, conhecidas como
microdeleções, afetam um ou alguns genes e são pe-
quenas demais para serem vistas pela microscopia con-
vencional. As microdeleçôes podem se comportar como
mutações recessivas se as cópias simples dos genes rema-
nescentes nos cromossomos hom ólogos não quebrados
forem haplossuficientes. Se um ou mais dos genes detec-
tados forem sensíveis à dosagem, a mutação vai agir como
uma mutação dominante e pode ter consequências graves.
- As deleções cromossómicas maiores são detecta -
das por microscopia pela observação de alterações nos
- padrões de banda cromossômicos. Nessas deleções
maiores, mais genes são afetados, e a probabilidade de
consequências fenotípicas substanciais é muito alta.
- Uma quebra cromossômica que desprende um braço
- do cromossomo leva a uma deleção terminal ( Figura
.
13.10a ) O fragmento cromossò mico quebrado na dele-
çào terminal contém uma das extremidades cromossô-
micas que consistem em um telòmero e mais material
genético. Sem um centrômero, o fragmento acêntrico
n âo possui cinet ócoro, sendo incapaz de prender fibras
do fuso e de migrar para um polo da célula durante a
divisão. Os fragmentos cromossômicos acéntr ícos são
perdidos durante a divisão celular. Os organismos que
carregam um cromossomo do tipo selvagem e um ho-
mólogo com uma deleção terminal chamam -se hetero-
zigotos por deleção parcial . Uma condição humana
conhecida como síndrome do miado de gato (Omim
123450) é um exemplo de síndrome cromossômica pro-
-
vocada pela deleção terminal do 5pl 5.2 5pl 5.3 ( Figura
.
13.10b) A síndrome foi batizada com esse nome em
- razã o do som parecido com o miado de um gato emi
tido pelos bebés portadores da condição.
-
434 An á lise gen ética: uma abordagem integrada

( a ) Perda do fragmento (b) Deleçá o terminal na síndrome A

terminal do miado de gato
Tel ômero

Deleçáo
terminal
Tel ô mero

P I 14
tu
\H
ti

li .
I M
Deleção
Ponto de
quebra

STCJ Centrómero
p
1
4
3

Lfi
J
L,i

mi- m:!I _ T_
U ^egiàode
deleçáo
comum

tu
'12U T
_
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9
I 11 «
Quebra
14
1
14
3- iA Deleçòes intersticiais
cromossômica IS IS 1 A

/ parciajDeleçá o 21
72
- —- 21
77 q 4
A
A
1

>

ÍLi
21 * 7) 2.

Cromossomo
do tipo
—-
S )S
it
a
--
J II
11
selvagem Cromossomol * 14
^ Telômero
Cromossomo Cromossomo 5
O fragmento acéntrico 5 normal na deleçáo
é perdido na dMsáO terminal
celular subsequente
Figura 13.10 Deleçáo cromossômica terminal.
(a ) A quebra da dupla fita do DNA em um ponto de quebra
cromossômica na região H leva à deleçáo terminal do
fragmento acéntrico. (b) A deleçáo terminal do cromossomo
5 na sí ndrome do miado de gato.
Ao contrário de uma deleção terminal, que resulta
de uma quebra simples em uma extremidade de cro-
mossomo, uma deleçáo intersticial é a perda de um
segmento interno de cromossomo que resulta de duas
quebras cromossômicas. As deleçòes intersticiais podem
ser vistas em muitos organismos, incluindo os seres hu
manos. A síndrome de WAGR, uma condição de deleção
intersticial observada nos seres humanos, na realidade é
uma série de condições causadas pela deleçáo de vá rios
genes contíguos na vizinhança do llpl.3 (Figura 13.11 ).
As iniciais WAGR significam tumor de Wilms ( um tipo
de câncer renal hereditário) , aniridia (ausência de íris no
olho), anomalias genituriná rias e retardo mental. Os pa
cientes com as maiores deleçòes do 1lpl.3 têm as quatro
condições, enquanto os pacientes com deleçòes menores
podem ter apenas uma ou duas dessas condições.
Cruzamento desigual
O processo de recombina çáo recíproca realiza a re-
combinação dos alelos nos cromossomos homólogos
sem causar ganho ou perda de material cromossómico
que resultaria em mutaçào (ver Capítulos 5 e 12). Nem
todo evento de recombinaçáo entre homólogos é recí-
proco e às vezes ocorre um cruzamento desigual entre
os homólogos. Isso pode resultar em duplicação parcial
e em deleção parcial do material genético nos cromos
somos recombinantes resultantes. Um organismo que
carrega um homólogo com material duplicado é um
heterozigoto por duplica ção parcial , enquanto um or-
ganismo com material deletado de um cromossomo é
um heterozigoto por deleção parcial. Introduzimos o
A banda 11p13
contém genes que
3
produzem ò
síndrome de WAGR
11
Figura 13.11 Deleçòes intersticiais do cromossomo
11p1.3 na síndrome de WAGR. As deleçòes de 1 a 7
resultam na WAGR, mas as deleçòes 8 e 9, náo. A menor
região de deleçáo comum é a banda 11 p1.3 .
crossing-over desigual em um capítulo anterior para ex -
plicar a mutação mais comum que causa o daltonismo
recessivo ligado ao X (ver Estudo de Caso no Capítulo 4).
-
O crossing over desigual é raro e ocorre com mais
frequência quando regiões repetidas dos cromossomos
hom ólogos estão mal alinhadas. A condição humana
conhecida como síndrome de Williams- Beuren ( WBS;
- Omim 194050) é encontrada com frequência nos hete-
rozigotos por deleçáo parcial para um segmento do cro-
mossomo 7. No cromossomo 7 do tipo selvagem, essa
região conté m có pias duplicadas do gene PMS , desig -
nadas PMSA e PMSb, que estão situadas próximas umas
das outras e possuem 17 genes situados entre cias (Fi-
gura 13.12a ). O desalinhamento dos cromossomos ho-
- mólogos resulta em erros de pareamento do PMSA em
um cromossomo com o PMSB no cromossomo homó -
logo. Uma cópia do PMS em cada cromossomo forma
uma alça em cada hom ólogo durante o desalinhamento
(Figura 13.12b). O crossing -over desigual nos cromosso-
mos desalinhados resulta em um cromossomo recom
binantc que possui um cromossomo 7 por deleçáo par-
-
cial que resulta em WBS. Esse cromossomo cont ém um
-
gene h íbrido não funcional PMSA PMSX que ná o existe
nos genes PMS K e PMS . intactos, bem como 17 genes
encontrados normalmente entre o PMSt e o PMSa (Fi-
gura 13.12c). O cromossomo por duplicação parcial
( contendo cópias duplicadas do gene híbrido PMSA ~
- PMSB e os 17 genes interv enientes) não provoca anoma
lias fenot í picas imediatamente identificáveis.
-
Detecçã o da duplicaçã o e deleção
Grandes deleçòes ou duplicações dos segmentos
cromossómicos podem ser detectadas pelo exame mi -
 Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 435

Estrutura normal do cromossomo 7

(a )
Centrômero
.
Cópias duplicadas ( a ) Cromossomo do tipo selvagem

*JL
PMS Á PMSn do PMS ePM
^
com 17 genes entre
as cópias Sondas FISH
Marcador T Marcador
lateral 17 genes lateral (b ) Deleçáo m íaointersticial
( b ) Desalinhamento dos cromossomos homólogos e
crossing -ovtr desig uai
PM 5A Alça de DNA Os homólogos desalnham e uma
cópia do PMS em cada cromos- Nenhuma fluorescência
1 2 somo forma uma alça.Crossinç- dPterraria a partir da sonda B.
PMSt ( c) Mlcroduplkação
over desgual dos homólogos Os
dísticos 1, 2 3 e 4 são marcadores
3 PMS Â 4 laterais para referência.
A B C
Duas manchas fluorescentes
PMSd «nt
í cam que o alvo da sonda B
está dupíkado.

(c) Cromossomos recomblnantes por deleçá o e duplica ção Figura 13.13 Detecçáo da microdeleçáo e
.. microduplica ção cromossó mica pela FISH. (a ) Très sondas
3 PM5 /PMS,i 2
*
Osrecombinantessão.
FISH Identificam os genes A, BeC, (b) A mkrodeleção de um
Um cromossomo de defeção segmento cromossô mko contendo B Impede a hlbrldaçâo da
Gene h í brido parcial com um gene híbrido, mas
Sfndrome de WBS no qual faltam os 17 genes entre sonda , (c) A microduplicação resulta na hibrida ção da sonda
os PMS,é duplicado .. B para genes duplicados.
1 PMSA PMSi/ PMS* PMSy ^ primento do par homólogo, ocorre o pareamento sin á p
Nenhuma Gene hibrido tico normal. Mas, nas regiões de diferença estrutural, o
L
anomalia material adicional presente em um cromossomo protrai
fcnotfpka 17 genes 17 genes
para fora visando a permitir o pareamento sin á ptico em
-duplica
eum cromossomo de
ção parcial com P¥ St ,
qualquer um dos lados. O material na alça consiste em
PMS$ eum gene híbrido e material gené tico normal se um cromossomo carregar
duplicação dos 17 genes uma deleçáo e em material gen ético duplicado se um
Figura 13.12 Crosslng -over desigual na criação da homólogo carregar uma duplicação.
sí ndrome de Williams-Beuren.
Observa çã o gen é tica A defeção e a duplicação par -
croscópico que revela alterações no padrão de banda - dais criam anomalias ao afetarem os genes sensíveis à dosa -
mento cromossô mico resultantes da mudança estru
tural no cromossomo. Essas deleções e duplicações
- gem. As deleçóes e duplicações maiores alteram os padrões
de bandamento cromossô mico e afetam a sinapse entre os
geralmente são bem grandes. Nos cromossomos hu - homólogos, enquanto as mkrodeleções e microduplicaçóes
são detectadas pela aná lise molecular.
manos, as duplicações e deleções de aproximadamente
100 mil a 200 mil pares de bases estão no limite infe-
rior da visualização do bandamento cromossômico. As
microdeleçòes e microduplica çôes são consideravel -
mente menores e em geral não são facilmente detec
tadas pela análise do bandamento cromossô mico. Em
- Alça rvào pareada
i i
vez disso, as t écnicas moleculares como a FISH ( hi -
bridação in situ fluorescente ) podem ser usadas para
detectar a ausê ncia ou duplica ção de um determinado
gene ou sequê ncia cromossó mica ( Figura 13.13; ver
també m Capítulo 11).
Uma observação microscópica alternativa indicando
Homólogo com
duplicação parcial
1 2 3

1 2 3 4
4 5
M
6

5 6 7
1

8
9

9
10 11

10 11
12

deleçáo ou duplicação cromossó mica parcial pode ser
feita na sinapse dos cromossomos hom ólogos da prófase
I durante a meiose. Os pares hom ólogos com erros de
pareamento porque um deles contém uma grande dupli -
cação ou deleçáo vão formar uma alça nâo pareada na
sinapse ( Figura 13.14)« Ao longo da maior parte do com-
12
Hom ólogo normal
Figura 13.14 Alça não pareada na sinapse.
O bomozigoto por duplicação parcial exibido aqui tem
rnaterial genético duplicado nas faixas 6 a 9.0 material extra
forma uma alça não pareada na sinapse para permitir que as
regiões homólogas se alinhem correta mente.
436 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Mapeamento das deleções
Pseudodomináncia é um fenô meno genético
que ocorre quando um alelo normalmente recessivo é
"desmascarado" e expresso no fenótipo porque o alelo
dominante no cromossomo hom ólogo foi deletado. A
pseudodominá ncia é utilizada para mapcar os genes nas
regiões cromossô micas deletadas por um método co-
nhecido como mapeamento das deleções.
A Figura 13.15 mostra o mapeamento das dele
ções usando pseudodomináncia para mapear o gene
- A quebra cromossô mica envolve quebras na dupla
Notch ( rt ) na Drosophila. O gene Notch reside no cro-
mossomo X e sua localizaçã o é revelada pela correlação
da pseudodominá ncia nas cepas de delcçào pardal do
cromossomo X. A pseudodominá ncia aparece nas fé-
meas heterozigotas para a deleçào parcial, carregam o
alelo recessivo no cromossomo X intacto e perderam
o alelo dominante pela deleçào parcial do cromossomo
X. Na figura, os segmentos dnzentos representam os
segmentos cromossômicos presentes, e a cor identi-
fica os que foram deletados. As duas primeiras deleçòes
-
parciais ( rjl e 258 42) nào levam à pseudodominá ncia
(em outras palavras, o fenótipo dominante do tipo sei
vagem é observado), indicando que as regiões deletadas
não conté m o gene Notch. As outras duas deleções par
ciais, 62dl8 e N71a, resultam em pseudodomináncia,
- é que, contanto que nenhum gene crítico ou região re-
indicando que o lócus do gene Notch contendo o alelo
dominante está na região 3C5 a 3C9. Por conterem a
localização do gene Notch, as deleções parciais pro-
gressivamente menores sào utilizadas para identificar
o menor segmento de deleçào comum a todas as dele
ções que resultam em pseudodomináncia. Nesse caso,
- complicações durante a meiose podem afetar a eficiê n
e usando outros dados nào exibidos, a menor deleçào
parcial comum para os genomas que expressam pseu -
dodominància para o Notch é a regiã o 307, sendo onde
o gene reside. A An á lise Genética 13.2 vai guiá -lo por
uma an álise do mapa de deleções.
13.4 A quebra cromossômica leva
à inversã o e transloca ção dos
cromossomos
fita do DNA que cortam um cromossomo. A quebra
que não é seguida pela religação do segmento quebrado
leva à deleçào cromossômica parcial; poré m , o que
acontece se o cromossomo quebrado for remontado,
mas o segmento quebrado for religado na orientação
errada, ou se o segmento quebrado for religado a um
cromossomo n ão homólogo ? As respostas são que a re-
liga çào na orientação errada produz uma inversão cro-
mossòmica, enquanto a religação a um cromossomo
não homólogo resulta em translocação cromossô mica .
Discutimos dois tipos de eventos de inversão cromossò-
mica e dois tipos de translocação cromossômica nesta
seção. Um tema repetido que vai surgir nessa discussão
gulató ria sofram mutações pela quebra cromossô mica e
contanto que os genes sensíveis à dosagem sejam man -
tidos em seu equilíbrio adequado, os portadores hete-
rozigotos de inversã o ou translocação cromossô mica
podem nào sofrer anomalias fenotipicas. No entanto,
cia da segregação cromossômica e a fertilidade pode ser
-
afetada nesses indivíduos .

z w rst n dm

1
M
* í
\

Fenótipo mutado
Unias 112 ? 1 2 3
2D 2E 2 r
56 112 3 A 5 6 7 el9 »C 1 ? 3 4 112 3 4 5 6 7 R 9 E l i
3A 38 3C
I 23
3D
5 6
u M l|l
3c
? 56 78 M3j*lM7lgj9 «12
3F 4A
por deleçào parcial

rJ1 Dominante
258 42 Dominante
62d 18 Pseudodominante
N71a Pseudodominante

.
Figura 13.15 Mapeamento de deleções do gene Notch (n) da Drosophila 0 grau de cada deleçào parcial do cromossomo
X da Drosophila é exibido pelas barras coloridas para quatro mutados por deleçào parcial. A retenção do traço dominante ou
o surgimento do notch por pseudodomin á ncia sào Indicados. O menor segmento do cromossomo X que falta em todos os
mutados pseudodominantes é a regiã o 3C-7, indicando essa como a localização do gene.
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômí cas 437

AN Á LISE GENÉTICA
Na DrosopMa, os traços mutados recessivos ligados ao X de cer-
Cromossomo X
das chamuscadas, olhos lozenge e asas cortadas são codificados Unidades de 2 4 6 8 101214161820
nos genes ligados. Cinco cepas de Drosophila produzidas pelo cru- mapeamento
zamento de moscas de linhagem pura do tipo selvagem e moscas Cepa 1
mutadas de linhagem pura ( SLC/SLC x slc/ slc ) devem ter o genótlpo chamuscada
triibrido SLC/ slc e expressar os fenótipos do tipo selvagem. As fémeas Cepa 2
de cada cepa exibem pseudodominância para um ou mais traços em chamuscada, cortada
razão da deleção pardal do cromossomo X. Cepa 3
Os mapas cromossômkos comparativos mostrando o grau das dete- lozenge
ções em cada cepa pseudodomlnante (indicadas pelas linhas traceja- Cepa 4
das) são fornecidos na figura junto com os fenótipos pseudodominan- chamuscada, cortada
tes encontrados em cada cepa. Use essas informações para localizar Cepa 5
cada gene com a maior precisão possível ao longo do cromossomo X. cortada

Estrat é gias de solu ção Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema aborda o mapeamento das deleções usando pseudodominância
este problema e explique a natureza para localizar a posição de cada gene. A resposta requer a construção de um
da resposta solicitada. mapa de localização dos genes.

2. Identifique as informações criticas .

2 As regiões de deleção nos cromossomos e os fenótipos pseudodominantes cor-
fornecidas no problema. respondentes são fornecidos.

Deduzir
.
3 Faça uma revisão do significado de .
3 Pseudodominância é o aparecimento de um traço recessivo em um organismo
pseudodominância e da conexão presumidamente beterozigoto em razão da deleção de um segmento cromos-
entre a deleção cromossômica e a sômico que carrega o alelo dominante. No mapeamento das deleções usando
pseudodominância . pseudodominância, a localização de um gene é mapeada para a menor região
de deleção comum compartilhada por todos os organismos que expressam o
traço pseudodominante .
Solucionar
.
4 Interprete o significado do fenótipo .
4 Falta material cromossômico na cepa 1, da 81 até a 14* unidade de mapeamento .
pseudodominante na cepa 1 . O aparecimento do fenótipo pseudodominante chamuscado indica que o gene
chamuscado mapeia para esse intervalo .
.
5 Compare a cepa 2 com a cepa 1 e in- .
5 A cepa 2 tem uma deleção das unidades de mapeamento 4 a 13, que inclui os
terprete o significado do novo fenó- fenótipos chamuscado e cortado.
tipo cortado pseudodominante. Isso restringe a localização do fenótipo cortado para o intervalo entre as uni-
dades de mapeamento 8 e 13. A localização do fenótipo cortado é entre a 4* e
Dica: Compare o mutjòm por dck\io qur tom-
* a 8J unidade de mapeamento, com base em seu aparecimento com a deleção
pjrtilhdm fcnó:ipoi de ourudodominãntu ver
onde a ddevòtfj e sobrepõem. desse intervalo.
*
.
6 Avalie a pseudodominância da cepa 3 . .
6 A ocorrência simultânea da deleção entre as unidades de mapeamento 16 e 20
e o aparecimento do fenótipo lozenge pseudodominante mapeiam o gene lo-
zenge para essa posição.

7.) Avalie as cepas 4 e 5 e, onde for pos- .

sí vel, refine ainda mais as localiza
A ções dos genes.
.
Dica: Mais uma vn compare os mutaòos por de-
leçAo que compartilham fenótipos de pseudodomi-
nâncta para ver onde as deteçfes se sobrepõem.
7 A cepa 4 contém uma deleção entre as unidades de mapeamento 4 e 12 e con-
- fina a localização do fenótipo chamuscado para o Intervalo entre 8 e 12 Essa .
cepa não fornece mais informações sobre a localização do fenótipo cortado.
A deleçã o entre as unidades de mapeamento 3 e 6 na cepa 5 inclui o fenó-
tipo cortado e refina sua localização para o ponto entre as unidades de ma -
peamento 4 e 6.

8. Identifique as localizações genicas 8. Com base nos dados de pseudodominância nessas cinco cepas, o fenótipo cor -
com base na análise do mapeamento tado reside no intervalo entre as unidades 4 e 6, chamuscado se situa entre 8 e
das deleções. 12 e lozenge, entre 16 e 20.

Para praticar mais, ver Problemas 4, 10 e 26 .

438 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Inversão cromossômlca No entanto, a inversão cromossòmica provoca uma

As inversões cromossô micas ocorrem em conse
quência de quebras cromossômicas seguidas pela re
ligação do segmento livre na orientação inversa. Dois
tipos de inversão cromossòmica sã o observados, depen
dendo do fato de o centrô mero fazer parte ou não do
.
segmento invertido ( Figura 13.16 ) A inversão paracé n -
trica resulta da inversão de um segmento cromossô
mico em um único braço e não envolve o centrômero,
enquanto a inversão pericêntrica reorienta um seg
mento cromossòmico que inclui o centrômero.
A inversão, na maioria das vezes, afeta apenas um
membro de um par hom ólogo e esses organismos são
heterozigotos para inversão paracê ntrica ou pericên
trica, nos quais um cromossomo tem estrutura normal
e o homólogo contém uma inversão. Os heterozigotos
para inversão podem n ão sofrer quaisquer anomalias
genéticas ou fenotípicas, contanto que nenhum gene
crítico ou sequência de DNA regulat ória seja rompido
pelas quebras nos cromossomos. Em tais casos, a reo-
rientaçào de 180 graus dos segmentos invertidos nã o
muda o conteúdo gen ético ou a expressã o genica do
cromossomo afetado.
(a ) Inversão paracêntrica
diferença na ordem linear dos genes entre os homólogos;
-- portanto, para conseguir o alinhamento siná ptico dos
homólogos de um heterozigoto para inversão durante a
meiosc, é necessá ria a formaçã o de uma alça de inversão
- incomum na sinapse. Porém, repare que um organismo
homozigoto para uma inversão carrega a mesma ordem
de genes e as regiões cromossômicas dos hom ólogos e,
- portanto, vai sofrer sinapse cromossòmica normal sem a
necessidade de formação da alça de inversão.
- Nos heterozigotos para inversão, a formação da alça
de inversão ocorre imediatamente e não afeta a segregação
cromossòmica subsequente. O cruzamento ocorre nos
homólogos; mas, enquanto o cruzamento que ocorre
- fora da região abrangida pela alça de inversão transcorre
de maneira normal, o cruzamento dentro da região da
alça de inversão resulta em duplicações e dcleções entre
os cromossomos recombinantes. A Figura 13.17 ilustra o
cruzamento dentro da alça de inversão entre as regiões
cromossômicas B e C em um heterozigoto para inversão
paracêntrica. Após o cruzamento, um cromossomo em
- --
ordem normal (1 ABCDEFGHI 1*) e um cromossomo
em ordem inversa (3 ADCBSFGHI 30 mantém-se inal-
terados pela recombinação (o ponto representa o centrô-
mero). Entretanto, os cromossomos recombinantes são
anormais: um deles é um cromossomo dic é ntrico com

Quebra
i
K
o ni dois centròmeros (2 ABCDA - 4) e o outro é um fragmento
acêntrico que não possui centrômero (2'- IHGFEDCBE -
- -
FGHI 40 Na anáfasc I, quando os centròmeros nos cro-
mossomos homólogos migram normalmente para polos
Segmento opostos, forma se uma ponte dicéntrica à medida que o
Quebra
invertido cromossomo dicéntrico é puxado para os polos da célula.
No fim das contas, a ponte se encaixa sob tensão em um
ponto de quebra aleatório. Ambos os produtos da quebra
possuem um centrômero, mas ambos também têm mate-
rial genético faltando. Por outro lado, o fragmento acén-
trico, que nâo possui centrômero, não possui mecanismo
pelo qual migrar para um polo da célula e será perdido du-
Quebra Rotação livre Inversã o Heterozigoto rante a meiose. A conclusão da meiose desse heterozigoto
cromossòmica do segmento paracêntrica para inversão para inversão paracêntrica resulta em dois gametas viáveis,
paracêntrica
um com o cromossomo em ordem normal (1 ABCDE - -
( b) Inversã o pericê ntrica
-
FGHI 10 e um com o cromossomo em ordem inversa
(3* ADCBEFGHI - 3 ) e dois gametas inviáveis com cro
/
-
mossomos de deleção parcial.
O cruzamento na alça de inversão em um hetero-
Quebra
WWV zigoto para inversã o pericêntrica produz dois gametas
viá veis e dois inviáveis. Um gamcta vi á vel cont ém o
Segmento cromossomo em ordem normal (1 ABCDE FGHI 1') 4
-
invertido e um contendo o cromossomo de ordem inversa (3 AB -
-
CHGF * EDI 3'). O cruzamento também resulta em
dois gametas inviáveis, cada um possuindo uma com -
Quebra
binação de deleçôes e duplicações (2 ABC DE FGH
CBA - 4) e (4'- IDE • FGHI - 20 ( Figura 13.18).
4
-
Quebra Rotação Irvre Inversão Heterozigoto Três observações sobre recombinação nos he-
cromossòmica do segmento pericêntrica para inversão terozigotos para inversã o têm implica ções gen éticas
pericêntrica importantes:
Fí g ura 13.16 Inversão cromossòmica paracêntrica .
1 A probabilidade de cruzamento dentro da alça de
e pericêntrica. inversão está ligada ao tamanho da alça de inversão.
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômí cas 439

Pequenas inversões produzem pequenas alças de

iCromossomo
normal
inversão que tèm uma baixa frequência de cruza -
í Cromossomo
invertido
.
mento Por outro lado, inversões maiores produ
zem alças que abrangem mais de um cromossomo
-
i e se correlacionam com uma maior probabilidade
Smapse rva prófase I
de cruzamento.
2. A inversão suprime a produção de cromossomos
Cruzamento . Alça de recombinantes. Os gametas viáveis produzidos
inversão
pelos heterozígotos para inversão contêm o cro-
mossomo em ordem normal ou o cromossomo
r em ordem inversa , mas nenhum cromossomo re-
combinante é viável em razão das duplicações e
4’ deleções dos segmentos cromossómicos. A ausên -
cia de cromossomos recombinantes na progé nie é
\
\ identificada como supressão do cruzamento. Na
Cruzamento entre \
v realidade, os cruzamentos ocorrem entre os cro-
*xxnólogo5 \
\
V mossomos homólogos carregados pelos heterozi-
Migração gotos para inversão, mas, como os cromossomos
N
na anáfase I \
N
\
recombinantes contêm duplicações e deleções, h á
pouca possibilidade de viabilidade de qualquer pro-
ir
2' génie formada a partir de gametas que os contêm.
UU
^n -
4’.
~ T
é 3'
C )s geneticistas tiram proveito da supressão do cru
zamento para marcar os cromossomos hom ólogos
-
Cromossomo
dk êntnco
Cromossomo
acêntrlco
com alelos dominantes que ajudam na interpreta -
Migração ção dos cruzamentos genéticos. A Observação
na anáfase I
Experimental 13.1 descreve a pesquisa realizada
Separação dos por Hermann Muller, que utilizou o conhecido cro-
homólogos na anáfase i mossomo C1B para identificar e posteriormente in -
Ponte
dkéntrfca i i Perdido
vestigar as mutações letais ligadas ao X induzidas
na Drosophila pela exposição aos raios X.
1'
F2 r 3. A fertilidade pode ser alterada se um hetero-
Quebra aleatória zigoto para inversão carregar uma inversão
muito grande. Quando uma inversã o abrange todo
4' ou quase todo o comprimento de um cromossomo,
O fragmento acêntrko é perdido em razão pelo menos um cruzamento vai ocorrer. Como a
da falta de um centrôrren o fragmento
dicêntrico se quebra aleatoriamente em * meíose produz dois gametas viáveis e dois inviá-
4
razão da migração do centrômera veis, aproximadamente a metade dos gametas será
3 perdida . Não se espera esse tipo de perda de fertili-
I dade nos organismos com pequenas inversões.

Condusáo da meiose II Observação gené tica As inversões reorganizam a

I estrutura cromossômica por uma rotação de 180 graus dos
1 V Cromossomo segmentos cromossómicos. Os heterozigotos para inversã o
normal sofrem supressão do cruzamento peia não viabilidade de
( viá vel)
quaisquer gametas portadores de cromossomos resultantes
2
4 }Produtos da deleçào
(inviáveis)
do cruzamento dentro da alça de inversão.

3 3' Cromossomo
de inversão
( viável)
0 cruzamento na alça de inversão resulta em dois gameis
wiávets e dois inviáveis
Figura 13.17 Consequências do cruzamento na alça de
inversão nos heterozigotos para inversão paracéntrica.
Transloca ção cromossômica
A translocação cromossômica ocorre após a quebra
cromossômica e a religaçào de um segmento quebrado
com um cromossomo não homólogo. Se nenhum gene
crítico for cortado ou tiver sua regulação perturbada pelos
eventos de quebra ou translocação, os heterozigotos para
translocação, com um cromossomo normal e um cro -
mossomo alterado em cada par homólogo, tèm um fenó-
 440 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Transloca çã o n ào balanceada
Cromossomo
normal Cromossomo / Cromossomo
Normak deietado / translocado
Cromossomo
invertido Quebra z Normal
I ycromossômica
Sinapse na prótese I Translocação
nâo balanceada
!
Alça de
inversáo À Cruzamento

i r I II III IV I II III IV
2 2' Fipo selvagem Heterozigoto
para translocaçáo
3 náo balanceada
4
(b) Translocação balanceada recíproca
I Cromossomos
Cruzamento entre
homólogos Norm. translocados
Normal
Migra ção na
anáfase I Translocação
balanceada

II
Quebra reciproca

4
Quebra

I II III IV I II III IV
Migra çao na Tipo selvagem Heterozigoto
an áfase I para translocaçáo
balanceada
Conclusão da meiose II
(c) Transloca çáo robertsonlana (fusão cromossômica )
l Cromossomo
1 1 # Cromossomo Normak fundido
normal
( viável )

2
4* ' f} 4
Cromossomos
com duplicação/
Translocaçáo
robertsonlana
ec Bra ço P
Centrômero
Normalmente
deleçào perdido
(inviá veis)

II
Normal
í 3' Cromossomo
com inversáo
( viável)

0 cruzamento na aiça de inversáo resUta em dos gametas viá veis e

em dois gametas inviáveis Diploide normal

Figura 13.18 Consequências do cruzamento na alça de

inversão nos heterozigotos para inversão pericêntrica.
tipo externo normal e um padrão de expressão génica nor-
mal No entanto, mesmo se forem detectadas anomalias
.
fcnotípicas certos heterozigoto® para translocação podem
sofrer semiesterilidade em consequência de anomalias na
segregação cromossômica, como descrevemos a seguir.
Os três tipos principais de translocação são obser-
vados. A translocação não balanceada surge de uma
quebra cromossô mica e da subsequente religa çà o a um
cromossomo não homólogo em um evento umdirecio-
.
nal; ou seja um pedaço de um cromossomo é translo
cado para um cromossomo n ão hom ólogo e nã o há um
evento recí proco ( Figura 13.19a ). A translocaçáo balan -
ceada rec í proca é produzida quando ocorrem quebras
Heterozigoto
para translocação
robertsoniana
Figura 13.19 Translocações cromossômicas não
balanceada, balanceada recíproca e robertsoniana.
em dois cromossomos homólogos e os fragmentos re -
sultantes trocam de lugar quando são religados (Figura
13.19b). A translocaçã o robertsoniana , também co-
nhecida como fusão cromossômica , envolve a fusão de
dois cromossomos nâo homólogos ( Figura 13.19c ). Uma
consequência da translocação robertsoniana é a redu -
ção do n ú mero cromossómko. Nossa discussão nesta
seção se concentra nas translocações balanceadas recí
procas e nas translocações robertsonianas.
-
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômí cas 441

Observa çã o Experimental 13.1

Hermann Muller e o método do cromossomo C/B da Drosophila

Hermann Muller, um aluno de Thomas Hunt Morgan, fez Cruzamento I:
multas contribuições Importantes para a genética. Entre as 9 C/B/+ <3 Tipo selvagem

r
realizações de Muller estavam sua descoberta de que os raios (exposto aos raios X )

li
X Induzem mutações por quebra cromossômica e seu desen Raios X
volvimento de um método genético para identificar mutações
letais ligadas aos raios X no cromossomo X da Drosophila. C/B x m{7)
Para Identificar essas mutações, Muller crtou um cromos-
somo X chamado cromossomo C/B: C relativo à supressão do Olho em barra
cruzamento. / relativo à presença de uma mutação recessiva
letal e B relativo à mutação dominante produzindo um olho
anormal em forma de barra . A supressão do cruzamento resulta
da presença de várias inversões que impedem o surgimento de
1 Fêmeas
! I Machos 1
recombinantes entre cromossomos X invertidos e do tipo selva-
gem nas fémeas. O olho em barra é um fenótipo mutado domi-
nante que marca permanentemente ocromossomo invertido, )á C/B m{7) e + m{7)
que não pode ser reformado pela recombina çáo. As mutações
recessivas potencialmente letais (m?) são geradas nos cromos- Olho cm barra Tipo selvagem Tipo selvagem Morrem
l l
somos X masculinos peia exposição aos ralos X.
Os machos de Drosophita hemizigotos para C/B (C/B/Y)
morrem em consequência da mutação letal (/) no cromossomo Cruzamento II:
X. As fémeas portadoras do C/B (OB / +) sobrevivem e preser-
vam o cromossomo. Muller começou sua busca pelas mutações 9 C/B / mi ? ) cf Tipo selvagem
letais Induzidas por ralos X expondo machos de mosca-da-fruta
aos raios X a fim de induzir mutações nas células germinati-
x
vas. Os machos expostos aos raios X foram cruzados com uma
fémea portadora de olhos em barra (C/B / +), no Cruzamento
I. Em seguida, a progénie da mosca com olhos em barra do
Cruzamento I foi acasalada individualmente com machos do
tipo selvagem, no Cruzamento II. Este deveria produzir uma
I
Se nenhuma mutação letal for mduzida per
proporção de 2:1 de fêmeas para machos se a exposição aos
raios X nóo Induzisse uma mutação letal no cromossomo X.
.
raios X uma proporção 2:1 de 9 : (3 é prevista.

Nesse caso, apenas os machos que herdassem o cromossomo Fêmeas Machos

||.. * j[. j° . ji
C/B morreriam. Se, por outro lado, uma mutação letal fosse In-
duzida, seria produzida uma progénie apenas com fémeas pelo
Cruzamento IL Os machos que herdassem o cromossomo C/B
morreriam, mas isso também aconteceria com os machos que
C/B « »
herdassem o cromossomo X com a mutação letal induzida . Olho em barra Tipo selvagem Tipo selvagem Morrem
A Identificação das mutações letais induzidas por raios X
usando o método C/B é altamente precisa: ela requer apenas que
se determine se os machos são produzidos pelo Cruzamento II.
Por outro lado sea mutação letal for induzida, será
Muller reconheceu que. quando a exposição aos raios X induzia produnda uma progénie apenas com fémeas
uma mutação letal, ele podia estudá-la através das fémeas do
Cruzamento II com olhos normais, que são portadoras heterozi- Fêmeas Machos

jj. . jj. * jf . „ j°
gotas da mutação letal induzida. Muller usou o método C/B para
demonstrar que a exposição aos raios X induz mutações em uma
taxa mais de 150 vezes maior que a taxa de mutação espontânea
na Drosophila. Sou trabalho levou à caracterização de vánas mu-
C/B «
tações e à identificação da relação linear entre o nível de exposi-
Olho em barra Tipo selvagem Morrem Morrem
ção aos raios X e a frequência de mutações letais induzidas. (portador de
mutação)
Método C/B de Muller Machos expostos aos raios X são
cruzados com fêmeas portadoras de olhos em barra que car- Ma»s estudos e possível
regam o cromossomo C/B no Cruzamento I. As fémeas com • cara erização da
^
olhos em barra da progénie que possivelmente carregam mutação letal induzida.
uma mutação letal ligada ao X [m(?)3 são cruzadas com ma-
chos do tipo selvagem no Cruzamento II. A ausência de pro-
génie masculina do Cruzamento II identifica a ocorrência de
uma mutação letal induzida.
 442 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Translocaçáo balanceada reciproca Na translocaçáo
balanceada recíproca, um membro de cada par homó-
logo é alterado pela translocaçáo e nenhum dos quatro
cromossomos tem um parceiro plenamente homólogo.
Pelo contrário, os segmentos cromossomos transloca-
dos hom ólogos ao membro normal de cada par sâo dis
tribuídos em dois outros cromossomos. A ausência de
homologia completa entre os pares de cromossomos
requer a formaçào de uma estrutura siná ptica tetrava
lente incomum, uma configuração cruciforme composta
de quatro cromossomos relacionados pela transloca çáo,
habilitando as regiões hom ólogas a formarem sinapses
durante a metáfase I , como mostra a F i g u r a 13.20, Os
cromossomos na figura são indicados como 1, 11, 111 e IV,
de modo a podermos acompanhar com mais facilidade
sua progressão na meiose e os resultados meióticos.
Dois padrões de segregação cromossómica surgem
das estruturas tctravalcntcs encontradas nos hetero-
- zigotos para translocaçáo. A segregação alternada e a
-
segregação adjacente 1 ocorrem, cada uma, em aproxi-
madamente 50% das divisões meióticas, embora as pro -
- porções reais variem um pouco entre diferentes espécies.
Na anáfase I na segregação alternada, os cromossomos
I e IV se deslocam para um polo da célula e os cromosso-
mos II e III se deslocam para o polo oposto. Na conclusão
da meiose, todos os gametas sâo viá veis porque cada um

Complexo tetravalente

Metáfase I

Seg ^egeçào Segregação

-
alternada í 50%)
I I
adjacente-2 ( muto ra^a)
IV I III I
f +

e e
•f

II

Gametas
1 Meiose II
III II
I Meiose II
IV III

K A B C D EF-6J K A 6 C D E f 6j I IABCO E F 6J
7 T!1
IV III II

i ( A B C D. Tcrrza I I (ABC 0 JE FG
7T
IV III II

II I K A B C D .; E S R J
III IV IV

II III
III IV IV

A segregação alternada separa os A segregação adjacente- 1 separa os A segregação ad

| acente-2 é muito rara
centrômeros homólogos e produz centrômenos homólogos e produz porque não separa os certrômeros
gametas rormak gametas inviáveis com dup rações homóbqos, os gametas são inviáveis em
edeéçóes , virtude de dupicaçôes e deleções.

Condusà oc acenas a segregação alternada produz gametas viáveis e progénie. Esse padrão de segregação ocorreem
apxiximactarrente metade das rreioses e contrtbu » para a semiesteriSdade dos heteroziçotos para translocaçáo,

Figura 1 3.20 Estrutura sináptica tetravalente e a segregaçã o cromossómica alternada e adjacente nos heterozigotos
para translocaçáo balanceada recíproca.
 Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 443

deles contém um conjunto completo de informação ge - somos distintos. A Figura 13.21 ilustra esse padrão de
nética para os dois cromossomos. A fertilização de um translocaçâo robertsoniana nos seres humanos, em uma
gameta contendo os cromossomos 1 e IV vai produzir condição chamada síndrome de Down familiar, que
um zigoto normal, enquanto a fertilização de um gameta é a causa de 5%-10% dos casos de síndrome de Down
contendo os cromossomos II c III vai produzir um zigoto ( trissomia do 21 ). A sí ndrome de Down familiar ocorre
com heterozigosidade para translocaçâo balanceada recí
proca, como o progenitor ilustrado na figura.
- quando um progenitor é portador de uma translocaçâo
robertsoniana do cromossomo 21 para outro autos-
-
Na anáfase 1 da segregação adjacente 1, os cro- somo acrocéntrico, na maioria das vezes o cromossomo
mossomos I e III são deslocados para um polo da célula 14. O progenitor heterozigoto para translocaçâo tem
e os cromossomos II e IV vão para o polo oposto. Ne- um genótipo diploide normal, produzido por uma cópia
nhum dos gametas formados por esse padrão de segre- completa do cromossomo 14, uma cópia completa do
gação é viá vel em razão das duplicações e deleçòes da 21 e um cromossomo fundido 14/ 21. O cromossomo
informação gené tica. Os gametas contendo os cromos- fundido perdeu os braços curtos do cromossomo 14 e
somos I e 111 têm uma duplicação das regiões F e G, com
a deleção das regiões R e S. De modo contrá rio, os ga --
do cromossomo 21; mas esses braços não contêm infor
mações genéticas cr íticas e, portanto, os portadores de
-
metas contendo os cromossomos II e IV tém uma dupli transloca çâo robertsoniana têm um fenótipo normal.
cação das regiões R e S e uma deleção das regiões F e G. Trés padrões de segregação possíveis dos três cromos -
Às vezes, ocorre um padrão de segrega ção inco- somos são igualmente prová veis após a formação do
mum, conhecido como segregação adjacente-2. Ele é
raro porque requer que os cromossomos I e II, que com -
partilham centrômeros homólogos, se desloquem para
Sinapse da translocaçâo Progenitor
o mesmo polo da célula na anáfase I. Analogamente, robertsoniana (14/21) normal
os cromossomos III e IV, que também compartilham
14 14/21
centrômeros hom ólogos, também se deslocam para I f| Cromossomo
o mesmo polo da célula ( cromossomos opostos I e II ). fundido
Isso é at í pico do padrão usual na anáfase 1, na qual os
cromossomos hom ólogos (que carregam centrômeros
homólogos) são separados na divisão por redução. Ne -
nhum dos gametas ou nenhum membro da progénie re
sultante da segregação adjacente- 2 é viável.
- Complexo trivalente
Gametas
I
Gametas
Em suma, os biólogos celulares conclu í ram que, ;
nos heterozigotos para translocaçâo balanceada, ape - 21
nas a segrega ção alternada produz gametas e progé nie 14 Resultado
viáveis. Esse padrão contribui para apenas a metade dos
.
eventos meióticos nesses indiv íduos; desse modo a se- 21
o21 21 Cariótipo normal
miesterilidade dos heterozigotos para translocaçâ o se 14 14 14 (fenótipo normal )
deve à redução pela metade no n úmero de gametas viá
veis que podem ser produzidos.
- O
21
Portador de
translocaçâo
14/21 14/21 14 (fenótipo normal )
Translocaçâo robertsonlana Nos organismos com uma
translocaçâo robertsoniana, também conhecida como 14/21 14/21
fusão cromossô mica, dois cromossomos não homólo - 21 Trissomia do 21
21 21 14 (s í ndrome de Down )
gos se fundem e formam um ú nico cromossomo maior,
resultando em uma redução no n ú mero cromossômico. o
Se dois pares de cromossomos se fundirem através da 14 14 dl 21 Monossomia do 21
translocaçâo robertsoniana , o n úmero de cromossomos O 14 (inviá vel)
-
em um genoma é reduzido para 2n 2. Isso é um me - O14/ 21
canismo observado frequentemente, por meio do qual o 14 /21
número cromossômico se expande nos organismos re - 21 Trissomia do 14
lacionados. Esse mecanismo contribui para a diferença 14 14 14 (inviá vel)
no n ú mero cromossômico entre o homem ( 2n 46) e- 21 21 21 Monossomia do 14
o chimpanzé (2n = 48), conforme discutido no Estudo O 14 (inviá vel)
de Caso. Se vá rios cromossomos sofrerem translocaçâo
Figura 13.21 Síndrome de Down familiar decorrente
robertsoniana , como foi o caso dos camundongos na da translocaçâo robertsoniana. Para a reprodução entre
Ilha da Madeira , ocorrem reduções maiores no n úmero um portador de translocaçâo robertsoniana 14/ 21 e um
cromossô mico. indiv íduo com cariótipo normal, são possí veis três zigotos
Os portadores de uma ú nica translocaçâo robert - invi á veis (categorias 4.5 e 6) e tr ês zigotos viá veis (1, 2 e 3).
soniana têm uma fusão cromossômica. Os homólogos Aproximadamente um terço das crianças com essas uniões
dos cromossomos fundidos continuam a ser cromos- (categoria 3) tem trissomia do 21 (sí ndrome de Down) .
444 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

complexo trivalente. Seis possíveis gametas produzidos A descoberta da transposição

por esses padrões são exibidos na coluna da esquerda
na figura. Quando unidos com um gameta normal, três
dos seis tipos de gameta possíveis resultam em zigotos
inviáveis (categorias 4, 5 e 6 na figura ). Os outros três
tipos de gameta produzem zigotos viá veis ( categorias 1,
2 e 3). Dois tém fenótipo normal e um , da categoria 3,
tem síndrome de Down. Essa forma de heterozí gosidade
para translocação robertsoniana leva a uma chance de
aproximadamente 1 em 3 de produzir um filho com
trissomia do 21, e esse alto risco está presente cada vez
que um filho é concebido.
Observa çã o gen é tica A translocação cromossô-
mica transfere todo ou parte de um cromossomo para um
cromossomo não homólogo. Nos portadores de transloca -
çã o, as estruturas slná pticas anormais precisam se formar
e os erros de segregação cromossômica mei ótica produ
zem semiesterilidade.
Barbara McClintock descobriu a transposiçã o em
uma sé rie de estudos de um fenótipo mutado da cor
da semente no milho ( Zea mays). O gene C da cor da
semente está situado no cromossomo 9, onde um alelo
dominante do tipo selvagem C produz sementes roxas c
um alelo ci produz sementes incolores. Um gene ligado
ao C produz sementes gordas (Sh) ou encolhidas (s/t ) e
um segundo gene produz sementes brilhantes ( Wx) ou
ceráceas ( wx ) (Figura 13.22 a ). Em experimentos com vá -
rias cepas triíbridas do milho com o gen ó tipo C Sh Wx/
ct sh wx, McClintock encontrou algumas sementes in -
comuns que eram praticamcntc roxas, mas que tinham
setores incolores que variavam entre diferentes semen -
tes. Invariavelmente, por ém , as regiões roxas eram gor -
das e brilhantes, mas os setores incolores eram encolhi
dos e ceráceos.
-

(a) Fenótipo triibrido do tipo selvagem

13.5 Elementos genéticos
transponíveis se movem por
wxsh c.
todo o genoma DsWxSh C
Roxo,
Elementos genéticos transpon íveis são sequê n - ( b) Fenótipo mutado por deleçáo parcial
gordo,
cias de DNA de vários comprimentos e composição de
sequência que ampliaram a capacidade para se deslocar
wxsh c . brilhante

dentro do genoma por um processo impulsionado por Incolor,

enzima conhecido como transposição. Os elementos encolhido,
Quebra O fragmento
transpon íveis existem em dezenas de formas, com ta - cromowómica cromossômico cer áceo
manhos variando de 50 pb a mais de 10 kb. Elas variam em Ds ativada é perdido
quanto ao n ú mero de cópias, de poucas até centenas de por Ac.
milhares. Os elementos transponíveis conseguem criar
mutações, normalmente por sua inser ção em alelos do ( c ) Mutado incolor instável
tipo selvagem. Um exemplo é a mutação do gene SBE1
da planta de ervilha que gera ervilhas rugosas estudadas
.
wx sh c

por Mendel ( ver Tabela 2.6). O gene SBE1 sofre mutação

por transposição nas plantas de ervilha, o alelo recessivo
é gerado pela inserção de aproximadamente 800 pb de
DNA transponível no que antes foi o alelo do tipo selva-
gem. Isso inativa o alelo mutado e bloqueia a produção
da enzima de ramificação do amido. Esse processo muta - ( d) Reversão do fenótipo mutado
inst á vel, manchas roxas
cional é conhecido como inarivação por inserção.
Os elementos transponíveis em termos evolutivos wxshci
podem aumentar o tamanho do genoma . Muitos ele-
mentos transponíveis parecem ter a fun ção ú nica de Wx Sh, Cx
aumentar teu próprio n úmero de cópias. Consequen -
temente, os organismos que carregam certos elemen - C
tos transponíveis não se beneficiam de sua presença,
for outro lado, alguns elementos transponíveis con
té m genes expressos que podem beneficiar o orga
-- Excisáo do Ds
aevada por Ac
Os

.
nismo Nesta e nas duas próximas seções, discutimos F igura 13.22 Mutação de setores incolores e reversão
os elementos transpon íveis nos genomas bacteriano e da mutação incolor está vel no milho pelos elementos
eucariótico e suas relações evolutivas . genéticos transponíveis Ds e Ac .

Examinando o cromossomo 9 nos n úcleos das cé
lulas dos setores incolores das sementes, McCUntock
observou uma deleção terminal de um homólogo do
cromossomo 9. Por outro lado, ambos os homólogos do
cromossomo 9 estavam intactus nas células dos setores
roxos. McCUntock concluiu que o surgimento simultâ
neo de sementes incolores, encolhidas e ceráceas era o re
sultado da pseudodominância decorrente da deleção dos
alelos dominantes de um homólogo (Figura 13.22 b). A di
visão mitótica de uma célula original contendo a deleção
cromossómica produzia os setores anormais. A frequên -
cia das sementes setorizadas era frequente demais para
ser o resultado da mutação cromossómica espontânea
.
e, ainda mais importante McCUntock observou que os
pontos de quebra do cromossomo 9 ocorriam no mesmo
lugar em todas as sementes afetadas de uma determinada
cepa. Com base nessas observações, ela concluiu que um
elemento genético, mais tarde batizado como elemento
de dissociação ( Ds ) , estava situado no sítio de quebra
cromossómica. No entanto, o que intrigava McCUntock
era por que o Ds gerava quebra cromossómica em algu -
mas células, mas não em outras. Para explicar isso, ela su-
geriu que o Ds isoladamente não conseguia gerar quebra
cromossómica. Em vez disso, a quebra cromossómica no
Ds era ativada por um elemento genético desvinculado,
ao qual ela chamou elemento ativador { Ac ).
A proposta Ds/ Ac de McCUntock provou -se capaz de
expUcar outra observação altamente incomum que ela fez
no milho. Ela encontrou mutados de milho incolores oca
sionais que tinham fenótipo mutado instável. Esses mu
tados instáveis tinham sementes praticamente incolores,
mas também tinham manchas roxas. Os padrões de man
chas roxas diferiam de semente para semente na mesma
espiga de milho, indicando que se desenvolveram por
algum tipo de reversão nas células somáticas que era per-
petuada pela divisã o mitótica subsequente ( Figura 13.22c).
A investigação de McCUntock a levou a concluir que os
alelos mutados instáveis eram produzidos pela inserção
.
do Ds no alelo C para formar o alelo cf* Esse alelo sofre
mutação pelo processo insercional de inativação e, con -
sequentemente, nâo produz cor na semente. O alelo cj*
é revertido pela ação do Ac , que ativa a excisáo do Ds em
cada célula somá tica das sementes em desenvolvimento.
A reversão do cf* para C nessas e nas células descendentes
leva à produção de pigmento e às manchas roxas.
A hipótese do elemento genético transponível de
McCUntock era que o fenótipo mutado instá vel era re -
sultado de um elemento gen ético transpon ível ( Ds ) que
criava uma mutação quando inserido em C e levava à re-
versã o quando a expressão de Ac levava à sua remoção
( Figura 13.22d ). A hipótese de McCUntock surgiu em
um momento da história da Biologia em que a estrutura
molecular do DNA e os genes foram descritos pela pri
meira vez. Para muitos biólogos, foi dif ícil compreen -
der como os elementos gen éticos podiam ser móveis,
e então a hipótese da transposiçã o foi muito debatida
durante anos. No entanto, no fim das contas surgiram
mais exemplos de transposição no milho, em outras es -
Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 445
- pécies de plantas, nos animais e nas bactérias. Desde a
descoberta da transposição no milho por McClintock, o
processo tem sido identificado em praticamente todos
os organismos. Pela descoberta da transposição, Mc-
Clintock foi agraciada com o Pré mio Nobel de 1983 em
- Fisiologia ou Medicina.
-
Características dos elementos genéticos
- transponí veis
A transposase é a enzima responsável por excisar ou
copiar elementos genéticos transpon í veis dos cromosso -
mos e por reinseri - los em novos locais. Um gene trans-
posase é carregado por alguns elementos transpon íveis,
.
mas nâo por todos Além disso, alguns elementos trans -
pon íveis carregam um ou mais genes que traasmitem
caracter ísticas específicas para as células ou organismos
que os contém. Por outro lado, alguns elementos trans -
pon íveis nâo codificam quaisquer genes específicos e são
compostos basicamente de sequência repetitiva .
Essas c outras diferen ças no conteúdo gen ético ex-
plicam dois tipos de elementos transponíveis. Os ele -
mentos transpon íveis autó nomos carregam o gene
transposase e possuem sequências de DNA que lhes per-
mitem mobilizar sua pró pria transposição sem a ajuda
.
de outros genes ou elementos transponíveis De modo
oposto, os elementos transponíveis não autónomos
-
não carregam o gene transposase e podem não ter ou
tras sequê ncias de DNA necessárias; essa condição os
-
- deixa incapacitados para se deslocar, a menos que um
elemento autó nomo esteja presente em outro lugar do
- genoma. O elemento Ac descrito por McClintock é um
exemplo de elemento transponível autónomo que codi
fica a transposase e pode conduzir sua própria transpo-
-
sição e a do elemento transpon ível autó nomo Ds.
13.6 A transposiçã o modifica os
genomas bacterianos
Os genomas bacterianos contém duas categorias de
elementos transponíveis. Os elementos de sequência de
inser ção ( IS) são elementos transpon íveis simples que
contêm apenas as sequências e genes necessários para
a transposição aut ónoma. Em um capítulo anterior, in -
troduzimos as sequências de inserção com a integra ção
dos plasm ídeos F nos cromossomos bacterianos para
formar cromossomos Hfr ( ver Capítulo 6). A segunda
categoria contém dois tipos de transposons que car-
regam, cada um, vá rios genes e conferem novos traços
nas bactérias que os contém. Os dois tipos de elemento
transponível podem produzir mutações se forem inseri -
dos em um gene do tipo selvagem , como acontece com
- o alelo d* ou nas ervilhas de Mendel.
Sequências de inserçã o
Muitas sequê ncias de inserção foram identifica
das no DNA bacteriano e plasmidial (Tabela 13.4 ). Os
-
 446 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Tabela 13.4 Caractedstkas dos elementos de sequência de inser çáo na £ coll .

Elemento Comprimento (pb) Comprimento da Comprimento da Número na E. coli Sequéncia-alvo
repetlçáo Invertida (pb) repetição direta (pb) da integração’
IS1 768 23 9 58 Aleatória
IS2 1.327 41 5 5 Hotspots
IS4 1.428 18 11 1- 2 .
AAAN JTT
IS5 1.195 16 4 Variável Hotspots
151OR 1.329 23 9 Variável NGCTNAGCN
IS50R 1.531 9 9 Variá vel Hotspots
IS903 1.057 18 9 Variável Aleatória
‘ N indica qualquer mxJeotideo.

elementos de IS variam um pouco quanto ao compri-

mento, mas todos contêm aproximadamente mil pb
de DNA. Cada elemento de IS contém uma cópia do
gene transposase demarcado por uma curta sequência Sitio original de inserçáo de IS Novo sítio-alvo
repetida invertida ( IR). Diferentes sequências de in
serção té m diferentes sequê ncias IR. As sequências IR
- Gene transposase
j i_ J
encontradas em cada extremidade de um determinado GGCTTAATC SAGCTGAGCTG
-
elemento de IS possuem a sequê ncia 5’ para -3' idêntica
1
CTAATT A ’: i CCGAATTAG, CTCGACTCGAC
ou quase id ê ntica nas fitas opostas do DNA. A Figura I
13.23 fornece exemplos de sequê ncias repetidas inverti - Clivagem da transposase Clivagem da transposase
das para dois elementos de IS . I I
As repetições invertidas são parte integrante da Gene transposase
transposição mediada pela transposase, que começa
com a clivagem nas extremidades dos elementos de IS 1 rh I
.
(Figura 3.24) A transposase també m reconhece uma
GATTAAGCC MÊ GGCTTAATC -. G ASCTGA 6CTG
’
sequ ência específica no novo sítio de integração no
CTAATCGGl
‘
ICCGAATTAGr CTC 6ACTCGA I
DNA bacteriano e alt catalisa uma clivagem escalonada
da dupla fita. A liga ção da IS no novo sítio junta primeiro Ligação
uma extremidade de cada fita da IS no DNA bacteriano. Gene transposase
Depois a replicaçào do DNA preenche as lacunas cur
tas de fita simples em cada extremidade da IS integrada,
- Lacuna de fita simples
rhGGCTTAATC AGCTGAGCT6
I l GATTAAGCC

* I
CTCGACTCGA Ç TAATTCGG CCGAATTAG

( a ) /5903 Lacuna de fita simples

Replicaçào para preencher as lacunas

18 pb
1.057 pb
Gene transposase 18 pb
i
Repetição direta Gene transposase Repetlçáo direta
r i T I í rnj r i

Repetições invertidas terminais

( b) tSI
768 pb Figura 13.24 Transposição de um elemento dt IS.
23 pb Gene transposase 23 pb O elemento de IS é removido de seu sítio de inserçáo
original pela clivagem da transposase na extremidade de
.
cada repetição invertida O novo sítio-alvo sofre clivagem
w.wf.w«tnra^.w /.i escalonada da fita dupla pela transposase. A ligaçáo une
o elemento de IS ao novo sltio- alvo em uma extremidade
Repetições invertidas terminais .
de cada fita As lacunas de fita simples remanescentes são
preenchidas pela replicaçào do DNA para criar repetições
Figura 13.23 Scquéndas de inserção IS903 e IS1 da £ coti . . diretas que ladeiam os elementos de IS .
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômí cas 447

AN Á LISE GENÉTICA
As seguintes sequências de DNA ocorrem na mesma fita e são separadas por uma grande quantidade
de núcleotideos. Quais dessas sequências poderiam ser encontradas ladeando uma sequência de in
serção? Explique sua resposta e identifique as partes relevantes das suas sequências selecionadas.
a. 5 '- TTAGCAC . .. CAGGATT - 3'
.
b 5'- GCCCAAT ... ATTGGCC - 3'
C. 5'- CCGACCGTA ... CCGACCGTA - 3'
.
d 5'- AGTATACCGC * • GCGGTATGGC - 3'

Estrat égias de solu ção Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema requer que você reconheça as sequências de DNA que poderiam
este problema e explique a natureza ladear uma sequência de inserção bacteriana. Você precisa identificar uma ou
da resposta solicitada. mais das sequências fornecidas como candidata.

.
2 Identifique as informações críticas .
2 Foram-nos fornecidas sequências de fita simples provenientes da mesma fita de
fornecidas no problema. DNA em lados opostos das possí veis sequências de inserção.

Deduzir
3. Determine as sequências de fita .
3 As sequências de fita dupla são
dupla para cada uma das sequências
de fita simples apresentadas.
a. 5'- TTAGCAC . .. CAGGATT - 3'
3'- AATCGTG ... GTCCTAA - 5'
b. 5'- GGCCAAT 4 ATTGGCC - 3'
m m

-
3' CCGGTT À ... - ' TAACCGG 5
C -
5' CCGACCGTA • • -
CCGACCGTA 3'
-
3' GGCTGGCAT • * -
GGCTGGCAT 5'
-
d. 5' AGTATACCGC ... --
GCGGTATGGC 3'
-
3' TCATATGGCG 4 . 4 CGCCATACCG 5'

.
4 Faça uma revisão de seus conheci- .
4 As sequências que ladeiam os elementos de inserção são sequências repetidas
mentos sobre as sequências que la - invertidas.
deiam os elementos de Inserção.

Solucionar
.
5 Identifique qualquer sequência que
poderia ser encontrada ladeando
uma sequência de inser ção.
.
5 As sequências b e d na etapa 3 são as com maior probabilidade de serem en-
contradas ladeando as sequências de inserção, pois cada sequência forma uma
sequência repetida invertida no DNA de fita dupla.

Para pratkar mais, ver Problemas 30 e 32 .

formando um par de sequências duplicadas chamadas
repetições diretas. Após a conclusão da transposição
de uma IS, a IS integrada contém o gene transposase
ladeado por repetições invertidas e diretas. Esse resul-
tado é conhecido como duplicação do sítio-alvo, sendo
uma ocorrência praticamente universal na transposição
bacteriana e eucariótica, sugerindo que os mecanismos
básicos da transposição são compartilhados.
-
A duplicação do sítio alvo e as repetições dire
tas são sinais de transposição que podem ser lidos na
sequência de DNA. Assim, a busca pelas repetições di-
retas pode levar os pesquisadores aos elementos trans-
poníveis e pode facilitar a identifica ção de mutações
criadas pela transposição. As buscas desse tipo tém sido
fundamentais na detecção de muitas mutações nulas
criadas na £ coli pela inativaçào insercional de um gene
do tipo selvagem. A Analise Genética 13.3 vai guiá -lo por
uma avaliação das possíveis sequências de IR.
Observaçã o gen ética As sequências de inserção são
elementos genétkos bacterianos transponiveis que carregam
- o gene transposase que conduz a transposição e é ladeado
por sequências repetidas invertidas. A transposição é um
evento mutackmal que pode Inatlvar ou alterar a expressã o
gênka normal.
448 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Transposon (a ) Estrutura geral

Unidade IS (esquerda ) Região central Unidade IS (direita )
Assim como as sequências de inserção, os trans- I
posons ( Tn ) sã o elementos que podem ser transpos - Gene Gene
tos para outras partes do genoma bacteriano. São transposase Gene marcador transposase
encontrados dois tipos de transposons: composto e í r
simples; eles são diferenciados pelos genes que con -
té m e pelas sequê ncias que ladeiam o transposon. Os
genes resistentes a antibióticos são os mais comuns
transportados pelos transposons e a transposição é Repetições
um mecanismo proeminente da disseminação da re - Invertidas do invertidas do
sist ê ncia antibiótica nas populações bacterianas (Ta- elemento de IS elemento de IS
bela 13.5 ). Outros genes dos transposons incluem os
que resistem à s consequ ências tóxicas da exposição
a metais pesados. Alé m disso , podem carregar genes
que conferem vantagens de crescimento em ambien
tes estressantes ou extremos.
Os transposons compostos têm uma região cen
-
-
—
( b ) Estrutura do TnIO
1.329 pb
Gene
transposase
I
6.600 pb 1-329 pb
Gene
transposase
—-
tral que consiste em vários milhares de pares de bases I I
que normalmente conté m um ou mais genes funcionais, T T
IStOL Gene de tSIOR
como os que conferem resistência antibió tica. A região Repetições resistência Repetições
central que contém os genes é ladeada por elementos de invertidas do à tetraciclina invertidas do
IS completos que possuem orientações opostas e, assim , elemento de IS (Tc(*) elemento de IS
I
formam repetições invertidas. Pelo menos um dos ele - Elementos de IS invertidos
mentos de IS de um transposon composto, e às vezes os F igura 13.25 Estrutura da um transposon composto.
dois elementos de IS, contêm uma có pia do gene trans -
posase. Outros genes estã o contidos no elemento cen -
tral dos transposons compostos. ximadamente 9.300 pb. O transposon TnIO insere-se
O transposon composto TnIO tem uma estrutura prontamente no DNA plasmidial, permitindo a rá pida
tí pica de muitos transposons. Ele tem uma cópia do disseminação da resistê ncia à tetraciclina entre as cepas
IS10R no lado direito ( R ) e uma cópia do IS10L no lado bacterianas que carregam o plasmídeo.
esquerdo ( L) de um grande segmento de DNA central Os transposons simples são ladeados por sequ ê n -
contendo o gene de resistência à tetraciclina ( Tet* ) ( Fi - cias de IR muito curtas com menos de 50 pb. As se-
.
gura 13.25 ) Cada elemento de IS codifica a transposase. quê ncias de IR não codificam a transposase. Em vez
disso, o gene transposase é carregado pelo próprio
Cada cópia do IS10 tem 1.329 pb e o segmento central
contendo o Tet" tem aproximadamente 6.600 pb, confe- transposon simples, com outros genes no elemento cen
tral do transposon. Por exemplo, o transposon simples
-
rindo a esse transposon um comprimento total de apro-
Tn3 contém um elemento central de 4.957 pb que codi
fica três genes: transposase ( TnpA ) e resolvase ( TnpB),
-
Tabela 13.5 Caracter
ísticas dos transposons ambos necessá rios para a transposição, e p-lactamase
bacterianos ( bla ) , que proporciona resistência à ampicilina e penici-
lina. O elemento central é ladeado por duas sequ ê ncias
Diferen ça de repetidas invertidas de 38 pb.
sequ ê ncia Compri-
entre os mento do
Sequ éndas elementos transposon Gene Mecanismos da transposição
Transposon de inserção de IS (pb) marcador’ A duplicação do sítio- alvo e a criação de repetições
Tn5 IS50L Diferença 5.700 Kan* diretas das sequências de DNA que ladeiam os sítios de
de 1 pb transposição são um resultado comum da transposição
ISS0R bacteriana e eucariótica. Dois mecanismos de transpo-
Jn9 IS 1 Nenhuma 2.500 Com* siçã o que levam à duplicação do sítio-alvo também são
compartilhados. A transposição conservadora é um
TnIO /5 ) 01 Diferença 9.300 Tet*
mecanismo de exdsflo de um elemento transponível de
de 2,5%
um local e sua inserção em um novo local, por um pro-
ISWR
cesso conduzido pela transposase. A transposição con -
Tn 903 IS 903 Nenhuma 3.100 Kan* servadora é similar ao tipo de processo de cortar e colar
' Com * doran íenlcol - -
Kan caoamkln*. Jet tetraciclirMi. que você pode usar ao alterar um arquivo de texto. O ele -
 Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 449

mento transponivel é cortado do seu local original e sub - 13.7 A transposiçã o modifica os
sequentemente colado em um novo local. Esse processo
movimenta os elementos transponíveis pelo genoma, genomas eucarióticos
mas não aumenta o n ú mero de elementos transpon íveis.
A transposição replicativa. como seu nome im -
Os elementos genéticos transponíveis são abun -
dantes e altamente variados nos genomas eucarióticos;
plica, envolve a replica çâ o dos elementos transpon íveis e os mecanismos básicos que realizam a transposição
que leva a aumentos no n ú mero de elementos transponí
veis em um genoma. A Figura 13.26 ilustra a transposição
- nos eucariotos e os possíveis resultados mutacionais são
similares aos descritos anteriormente para as bactérias.
replicativa entre dois plasmídeos. Após a iniciação da re- Os elementos transponíveis eucarió ticos são divididos
plicação do elemento transponivel, a transposase facilita em dois grupos; transposons de DNA , que são trans-
a formação de um cointegrado entre os dois plasmídeos. postos através dos genomas eucarióticos pela transpo-
O cointegrado é uma fusão temporá ria dos plasmídeos, sição conservadora ou replicativa, e retrotransposons ,
resolvida por um processo similar à recombinaçâo que que usam a enzima transcriptase reversa para sintetizar
corta e religa as fitas do DNA para separar os plasmídeos. DNA de fita dupla a partir de um transcrito de RNA de
O resultado da transposição replicativa é que os dois
plasmídeos contém uma có pia do elemento transponivel.
fita simples. Os elementos transponíveis Ds e Ac descri-
tos pela primeira vez por McClintock são transposons
de DNA e muitos outros exemplos são encontrados nos
genomas eucarióticos. Os transposons de DNA na Dro -
O Um plasmídeo doador sophila foram totalmente caracterizados com a identi-
pares
carregando Tn3 Tn3 fica ção e análise dos elementos Pf e começamos nossa
com um plasm ídeo
receptor carregando Plasm ídeo discussã o com essa análise.
uma sequénria-alvo. doador
Plasm ídeo
receptor ~
_
4 Sequência
-alvo
/
*

Elemento P da Drosophila
O genoma da Drosophila melanogaster carrega vá -
rias dezenas de cópias de um elemento genético trans-
pon ível, chamado elemento P . Esses transposons de
DNA não faziam parte do genoma da D. melanogaster
O A transposase corta as coletado na natureza antes de 1960. No entanto, hoje
fitas simples do DNA toda D. melanogaster coletada na natureza carrega ele -
adjacente ao Tn3 e na mentos P em seu genoma, sugerindo que esses elemen-
-
sequência alvo; as
tos P foram introduzidos na D. melanogaster por volta
fitas se cruzam.
de 1960, talvez pela transferência entre espécies de uma
espécie com rela ção distante. Desde sua introdução no
genoma , os elementos P proliferaram rapidamente. O
ciclo de vida da Drosophila consegue produzir de 20 a
25 gerações por ano; assim, os elementos P vém evo-
O Um cointegrado se luindo há mais ou menos mil gerações na D. melanogas
ter, desde que foram introduzidos em seu genoma.
-
forma após a sí ntese
do novo DNA para
preencher as lacunas
Os elementos P existem em várias formas. Os ele -
mentos P de tamanho total codificam a transposase e
de fita simples.
Cointegrado -
Novo são capazes de realizar transposição autónoma. Esses
DNA elementos P tém aproximadamente 2.900 pb de com -
primento e possuem uma região central contendo um
gene para a transposase que é codificado em quatro
éxons e três íntrons ladeados por repetições invertidas
de 31 pb. A transcrição e a tradu ção do gene transpo-
O A resolução do
separa
sasc nos elementos P de tamanho total produzem uma
cointegrado enzima transposase de 87 kD que ativa a transposição
os plasm ídeos; o Plasm ídeo f Tn3
plasm ídeo doador doador do elemento P nas células germinativas. Vários tipos de
retém o Tn3 e o Plasm ídeo elementos P nã o funcionais também são encontrados
plasm ídeo receptor receptor \ + no genoma da D. melanogaster , nenhum deles produz
modificado ganha modificado
uma cópia replicada transposase funcional e todos são menores que 2.900 pb.
do Tn3 . Tn3 Os elementos P foram descobertos na D. melano
gaster porque produzem dUgenesia hí brida , um fenô -
meno no qual ocorre esterilidade na progénie FL de um
cruzamento específico de moscas cruzadas em laborató-
Figura 13.26 Transposição replicativa. rio. A disgenesia híbrida ocorre quando os híbridos da
450 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
F, são formados pelo acasalamento de uma mosca fémea
de laboratório do citótipo M (Aí refere -se a " materno")
com uma mosca - macho do tipo selvagem conhecido
como citótipo P (" paterno"). O macho com citótipo P
tem de 3 a 4 dezenas de elementos P dispersos pelo seu
genoma e també m possui um repressor para bloquear a
transposiçã o no genoma. A fémea de citótipo M vem de
um estoque que nào possui elementos P e nào produz o
repressor da transposição. A progénie desse cruzamento
entre moscas de laborat ório e selvagens consiste em hí
bridos com uma aparência externa normal, mas são es-
téreis porque seus gametas nào se desenvolvem .
O modelo atual de disgenesia híbrida explica por
que o fenótipo ocorre apenas quando os machos têm o
citótipo P e as fêmeas, o citótipo M ( Figura 13.27). Nos
machos de dtótipo P, o espermatozóide, que contém
apenas os cromossomos e praticamente nenhum mate-
rial citoplasmá tico, não possui uma proteína repressora
da transposição que é encontrada no citoplasma. Os ovos
das fêmeas com citótipo M contém material citoplasmá -
tico abundante, mas nào carregam a proteí na repressora
da transposição, pois o citótipo M não possui elementos
P. Na fertilização, o espermatozóide adiciona cromos-
somos carregados com elemento P em um ovo que não
possui prote í na de repressão da transposição. Ocorre a
ampla transposição, criando várias mutações pela inser
ção de elementos P nos genes funcionais ou induzindo
quebras cromossômicas similares à s observadas por Mc
Clintock no genoma do milho. Após o desenvolvimento
embrioná rio, a consequência dessa ampla atividade de
transposição é a ampla mutação pela inativação insercio -
nal, que resulta na disgenesia híbrida. Por outro lado, a
disgenesia h íbrida nào ocorre no cruzamento recí proco
entre as fé meas com citótipo P e os machos com citótipo
M ou P. Nesses cruzamentos, o citoplasma dos ovos con
tém a proteína repressora da transposição, que bloqueia
a transposição do elemento P, e a linhagem germinativa
da progénie híbrida Ft resultante permanece está veL
Os elementos P da Drosophila são facilmente mani -
pulados e se tornaram uma ferramenta importante para
a manipulação genética do genoma da Drosophila (ver
Capítulo 17).
Retrotransposons
Os retrovírus são vírus que infectam as células eucarió-
ticas e possuem um genoma que consiste em RNA de fita
simples. Na Infecçâo, o RNA é transcrito para o DNA de
fita dupla pela transcriptase reversa, passando a integrar
um cromossomo da célula animal ou vegetal infectada. O
DNA retroviral integrado codifica três genes, chamados
gag, env e pol. O gag e o env codificam proteínas que for-
mam a partícula retroviral. Novas partículas retrovirais são
produzidas dentro das células infectadas e perpetuam a in
fecção invadindo novas células. O gene pol codifica a en -
zima transcriptase reversa, que controla a síntese do DNA
de fita dupla a partir do RNA de fita simples.
Os retrotransposons são elementos transpon íveis
relacionados aos retrovírus. Todos os retrotransposons
(a ) ( b)
Citótipo P Citótipo M Citótipo Citótipo P
PCKJ M
Geração
parental
-
H íbridos F.
Tipo selvagem esté ril Fertilidade normal
i I
Pouca ou nenhuma
Progénie Fa progénie em razflo
da esterilidade da F,
pravocaca pela
disgenesia hlbf da
Prole do tipo selvagem
F igura 13.27 Disgenesia h íbrida na Drosophila .
( a ) Macho de Drosophila com citótipo P cruzado com fêmeas
de citótipo M produz progénie F , praticamente Infé rtil em
- razão das mutações resultantes da transposição do elemento P .
( b) Cruzamentos de fêmeas com citótipo P e machos com
citótipo P ou M produzem progénie F , com fertilidade normal.
-
carregam o pol e alguns deles o gag , mas nenhum car-
rega o env. Consequentemente, os retrotransposons são
capazes de sintetizar DNA de fita dupla a partir de RN À
de fita simples e conseguem transpor o DNA por todo
-
o genoma , mas não té m capacidade para produzir partí
culas de proteína.
-
A Figura 13.28 ilustra as estruturas comparativas de
um retrovíru5 e de três retrotransposons. Duas carac-
terísticas constantes dos retrotransposons podem ser
observadas. A primeira é que todos os retrotransposons
codificam a transcriptase reversa para catalisar a trans-
posição. A segunda é que o gene ( ou genes ) carregado
pelos retrotransposons é ladeado por repetições termi
nais longas ( LTfts ) que podem ter até vá rias centenas
-
de pares de bases de comprimento.
Vá rios tipos de retrotransposons foram identifica -
dos nos genomas eucarió ticos, incluindo os elementos
Ty na levedura , os elementos copia na Drosophila e os
elementos LI wo homem. Os vários retrotransposons
foram identificados em grande parte pela análise de mu
tações remontadas at é a inserção do retrotransposon.
-
Elementos Ty da levedura Muitas formas diferentes de
retrotransposons Ty da levedura são encontradas, todas
- compartilhando as características comuns dos retro-
transposons. Nos elementos Ty , o elemento central tem
aproximadamente 6 kb, ladeado por I.TRs com aproxi -
madamente 330 pb de comprimento. Ambas as LTRs
contê m promotores que controlam a transcrição de
diferentes genes na região central. Aproximadamente

(a ) Retrovirus
10.000-20.000 pb
! substancialmente influenciada pelos elementos genéticos
çog põf
( b ) Retrotransposons
5.000 pb
1 copia (Drosophila) 1 ções genicas humanas espontâneas.
gog põT
LTR LTR
5.900 pb
I Ty (levedura) 1 elementos LI de comprimento total codificam uma
gog poi
ITR ITR
6.500-8.000 pb
I Ll (homem)
orfT cri2 (ooi)
LTR
«COO? MnovMan Pttmtoe* Ud
Figura 13.28 Estrutura do retrovirus e retrotransposons
•ucarfóticos selecionados.
50 a 100 có pias dos elementos Ty estão presentes no
genoma da Saccharomyces cerevisiae tí pica . Os elemen
tos Ty causam mutação nos genomas da levedura por
inserção .
Elementos copia da Drosophila Várias formas de copia
do retrotransposon são encontradas no genoma da
Drosophila. Os elementos copia possuem um elemento
central de 5 a 8,5 kb que contém os genes pol e gag e é
ladeado por LTRs de 250 a 600 pb cada . A palavra copia
é proveniente do latim “abundâ ncia” e, adequando essa
designa ção, mais de 5% do genoma da Drosophila é
composto de retrotransposons copia Essa abundância . -
leva a muitas mutações por todo o genoma, que nor
malmente são o resultado da inserção da copia em um
gene do tipo selvagem . os elementos Alu sã o adições relativamente recentes
Elementos UNE e SINE nos seres humanos Mais de 45%
do genoma humano é composto de sequências de DNA
repetitivas, muitas delas derivadas de ex elementos gené-
ticos transpon íveis que não são mais transpostos dentro
E S T U D O DE C A S O
Evolu çã o do cromossomo humano
Os pesquisadores conseguem rastrear a evolução dos
cromossomos humanos comparando a estrutura cromossò-
mica e a composição gené tica dos seres humanos com as
de outras espécies que compartilham um ancestral comum.
Descrevemos duas dessas abordagens comparativas aqui:
uma delas compara os grupos sintê nicos de genes ( genes no
mesmo cromossomo) cm espécies pouco relacionadas c a
outra compara os padrões dc bandamento dos cromosso-
mos nas espécies intimamente relacionadas
Capítulo 13 Aberrações e transposição cromossôm í cas 451
do genoma. Porém, a presença dessas sequências sugere
que a evolução genòmica dos mamíferos e do homem foi
transponíveis. Entre os elementos genéticos transpon í-
veis funcionais restantes no genoma humano, as famílias
de elementos LINE (elementos intercalantes longos) e
SINE (elementos intercalantes curtos) se destacam por sua
abundância relativa e sua capacidade para provocar muta-
Os elementos Ll humanos são retrotransposons
e membros particularmente comuns da fam ília LINE
no genoma humano. O comprimento dos elementos
LI varia de aproximadamente 6.500 pb a 8.000 pb. Os
proteína com função nuclease e transcriptase reversa,
podendo codificar també m uma segunda proteína
de ligação ao RNA, mas o encurtamento do elemento
I afeta sua capacidade para transpor. O genoma humano
LTR
contém aproximadamente 600 mil cópias de Ll , cons-
tituindo mais de 17% do genoma total. A evidê ncia de
que os elementos Ll transpõem ativamente no genoma
humano é extraida em parte dos estudos de mutação
espontâ nea remontados até a transposição do Ll . Por
exemplo, as mutações do gene F8, um gene ligado ao X
- cuja mutação causa uma versão recessiva ligada ao X do
transtorno de coagulaçã o sanguínea chamado hcmofi-
lia , são rastreadas até a inser ção do Ll no gene.
Os elementos SINE também são comuns no ge-
noma humano. Uma forma, o elemento Alu, é a mais
comum dos elementos SINE. O tamanho dos elementos
Alu varia de 100 a 300 pb, e eles são ladeados por repe -
tições diretas de 7 a 20 pb. Recebem esse nome porque
cada elemento pode ser clivado em dois segmentos pela
endonuclease de restrição Alu\ ( Al- LOQ-um) que reco-
nhece a sequência - alvo de 4 pb da enzima de restrição
5 * AGCT - 3 * . O genoma humano conté m aproxi-
- madamente 1,2 milhão de elementos Alu , constituindo
quase 11% do seu totaL A análise genòmica indica que
ao genoma humano. Eles estão presentes nos genomas
- —
dos nossos parentes primatas mais próximos o chim-
panzé, o gorila e o orangotango
mas de outros mam íferos.
— mas não nos geno-
A Figura 13*29 compara os grupos sint ênicos dc genes
em 20 cromossomos (19 autossomos e o cromossomo X )
no genoma do camundongo e sua relação com as mesmas
sequ ê ncias nos 23 cromossomos ( 22 autossomos c o cro-
mossomo X ) em seres humanos. Publicado em 2002 por um
grande grupo de pesquisas conhecido como Consó rcio de
Scqucnciamcnto do Genoma do Camundongo, esse estudo
compara 342 segmentos cromossõmiooa sintênicos. O ta-
. manho médio dos segmentos sintênicos é um pouco menor
452 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
= II
o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X
iSii
u li
Cromossomos humanos
?
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 1213141516171819 2021 22 X
Figura 13.29 Conservação evolutiva da sintenia
cromossò mica entra os cromossomos do camundongo e
do homem. Cada um dos 23 cromossomos humanos recebe
uma cor exclusiva e seus segmentos são superpostos aos de
20 cromossomos de camundongo .
que 10 milhões de pares de bases Os grupos sintê nicos de
genes encontrados no genoma humano estão dispersos por
vá rios cromossomos no genoma do camundongo. Curiosa -
mcntc, os cromossomos humanos 17 c 20 correspondem ,
.
cada um inteiramente a uma parte dos cromossomos 11
c 2 do camundongo, rcspcctivamente. F.m ambos os casos,
o cromossomo humano corresponde a um agrupamento
maior de grupos sint ênicos contíguos no cromovsomo do
camundongo rcspcctivo. A comparação dos cromossomos
X do homem c do camundongo revela uma semelhança
muito forte de sequência e genética.
Essa comparação leva a duas conclusões evolutivas
importantes. A primeira é que O camundongo c o homem
compartilham agrupamentos sintê nicos similares porque
seu ancestral comum carregava esses agrupamentos. Os
cromossomos do homem e do camundongo divergiram dos
de seu ancestral comum em muitos arranjos, incluindo a
translocaçáo cromossòmica, a fusão e a inversão cromos-
sômica, que mudaram muitos atributos da estrutura do
cromossomo: mas eles també m mantém grandes segmen -
tos de genes e sequências como agrupamentos sintênicos.
A segunda é que, especificamente nos genes ligados ao Xr
a forte relação sintê nica foi mantida pela seleção natural,
conduzida pelos requisitos do desenvolvimento embrion á -
rio e pela necessidade de manter um equilíbrio na dosagem
dos genes ligados ao X pela inativação aleat ória do X.
A Figura 13.30 ilustra os padrões de bandamento dos
cromossomos 1, 2 e 3 do homem ( H ), chimpanzé ( C) gorila.
(G ) e orangotango (O). Essas quatro espécies de primatas
intimamente relacionadas compartilharam um ancestral
comum entre 30 e 35 milh ões dc anos atrás. Em cada um
desses três cromossomos, a forte semelhança dos padrões
RESUMO
13.1 A não disjunçã o leva a mudanç as no núme-
ro de cromossomos
Nos n úcleos euploides, o n ú mero de cromossomos é igual a
um m últiplo do n ú mero haploide (n ), enquanto os n úcleos
aneuploides têm cromossomos adicionais ou ausentes.
H C G O H C G O H C G O
!
T
r
.2
o
'-i
t
1
ç[
-í 2
,8
O
s
1 2 3
Figura 13.30 Evolução dos cromossomos humanos
.
edos grandes símios Os cromossomos 1, 2 e 3 do
homem (H), chimpanzé (O, gorila (G) e orangotango (O)
são comparados para determinar os eventos que levam a
diferentes n ú meros e estruturas cromossòmécos.
de bandamento reflete diretamente a grande semelhança
.
gcnctica entre as cspccics As diferen ças estruturais c nu -
mé ricas entre os cromossomos permitem a reconstrução
dos eventos evolutivos que moldaram os cromossomos
contemporâneos dc cada espécie. Olhando os eventos pela
perspectiva dos cromossomos humanos, podemos recons
truir a evolução de cada cromossomo da seguinte forma.
-
O cromossomo 1 é muito similar nas quatro espécies de
primatas, com a exceção de uma inversão pericêntrica
e da adição dc um pequeno segmento perto do centrô
mero do cromossomo humano ( lql.2 a lq 2.1).
-
O cromossomo 2 abriga a explicação para a diferença
no n úmero diploide entre os humanos (2n 46 ) e nos- =
sos parentes próximos (2/i 48). A redução no n ú mero
=
diploide humano resulta dc uma transJocação robertso-
niana que funde dois cromossomos acrocêntricos que
pertencem a pares dc cromossomos distintos no chim
panzé, no gorila e no orangotango.
-
O cromossomo 3 exibe forte semelhança dc padrão de
bandamento nas quatro espécies, com a exceção do cro -
mossomo do orangotango, que sofreu uma inversão peri -
cê ntrica que mudou os comprimentos relativos dos bra -
ços e alterou a posição do centrômero em comparação
com os cromossomos dc outros primatas .
A nã o disjunçã o cromossò mica é a incapacidade dos
cromossomos hom ólogos ou das cromá tldes Irm ã s para
se separarem, sendo uma causa comum de gametas
aneuploides.
A aneuploidia altera o fenótipo de um organismo mu
dando o equil í brio da dosagem gènica dos genes críticos.
-
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossòmí cas 453

I A aneuploidia humana se manifesta como trissomia de de -
terminados autossomos e como trissomia ou monossomia
dos cromossomos sexuais.
I Mosaicos cromossòmicos são organismos contendo célu-
las com dois ou mais cariótipos distintos.
I A dissomia uniparental ocorre quando as duas cópias ho-
mólogas de um cromossomo se originam em um único
progenitor.
132 Mudanças na euploidia resultam em vários
tipos de poliploidí a
Os poliploides carregam três ou mais conjuntos haploides
de cromossomos.
Os alopoliploides carregam conjuntos de cromossomos de
espécies diferentes, enquanto os autopoliploides possuem
vários conjuntos de cromossomos de uma única espécie . 13.5 Elementos genéticos transponíveis se
A poliploidia é comum nas espécies de plantas, nas quais o
aumento no tamanho das frutas e das flores altera a fertili -
dade e pode produzir vigor híbrido.
I Os poliploides têm uma menor frequência de homozigosi
dade recessiva em comparação com as espécies diploides.
13.3 A quebra cromossòmica provoca mutação
por perda, ganho e reorganização dos
cromossomos
A quebra cromossòmka pode resultar na deleçáo terminal
ou intersticial e pode alterar os padrões de bandamento
cromossòmica
A heterozigosidade para deteção ou duplicação parcial
produz anomalias fervotípicas por meio de perturbações
do equilíbrio da dosagem gènka.
A sinapse dos cromossomos homólogos envolvendo um
cromossomo com deleção ou duplicação parcial produz
uma alça não pareada caracteristica.
I Microdeleções e microduplkações pequenas demais para
serem vistas pelas alterações de bandamento são detecta-
das por métodos moleculares.
A detecçáo da pseudodominânda fornece importantes
indicadores posicionais para o mapeamento das deleções
dos genes.
As inversões paracêntricas possuem dois pontos de que-
bra em apenas um braço e a inversão não inclui a região
centromérka. As inversões paracêntricas possuem pontos
de quebra em cada braço e a região centromérlca está In-
duida na região invertida.
A inversão cromossòmica é um mecanismo de supressão
do cruzamento.
Uma estrutura sináptica tetravalente contendo cromosso-
mos envolvidos na translocaçào recíproca leva a dois pa
drões de segregação cromossòmica na rrveiose .
A redução no número de gametas viáveis produzidos pelos
heterozigotos para translocaçào balanceada reciproca re-
sulta em semlestefilidade.
A translocaçào robertsoniana ocorre pela fusão dos cro-
mossomos não homólogos acrocéntrícos.
movem por todo o genoma
I Transposição é o processo que movimenta os elementos ge-
- néticos transponíveis nos genomas e fòidescoberto no milho.
Transposase é a enzima responsável pela transposição, sendo
codificada por muitos elementos genéticos transponíveis.
1 A transposição produz mutações por meio da inativação
InsevclonaL
Os elementos transponíveis autónomos codificam a trans-
posase para impulsionar seu movimento, mas os elemen-
tos não autónomos precisam contar com os elementos
transponivels para produzir transposase.
13.6 A transposição modifica os genomas
bacterianos
I As sequências de Inserção bacterlanas codificam a trans -
posase e são ladeadas por sequências repetidas invertidas
exclusivas de cada sequência de inserção.
Os transposons bacterianos conservadores e simples car-
regam o gene da transposase e talvez os genes de resistên-
da antibiótica ou de resistènda a metais pesados.
A transposição conservadora ocorre pela excisão e reinser-
çáo de um elemento transponível, enquanto a transposição
replicatlva produz novas cópias do elemento transponível .

13.4 A quebra cromossòmica leva à inversão e 13.7 A transposição modifica os genomas

translocaçào dos cromossomos
A quebra cromossòmica pode levar à inversão ou translo-
caçâo dos segmentos cromossòmicos.
Os heterozigotos para Inversão cromossòmica possuem
um cromossomo com ordem normal, mas têm uma Inver-
são no homólogo. Os homólogos nesses organismos for-
mam uma alça de inversão na sinapse.
eucarióticos
I Os elementos P da Droiophila são comuns, transpõem
ativamente e causam disgenesia híbrida em certos cruza-
mentos.
Os retrotransposons são transcritos em RNA e depois so-
frem transcrição reversa em DNA de fita dupla, e a nova
cópia do DNA é transposta para um novo local .

T E R M O S- C H A V E

Aberração cromossòmica (p.423)
Alça de inversão (p. 438)
Alça não pareada (p. 435 )
.
Aneuplolde (p 423 )
Cointegrado (p. 449)
Cruzamento desigual (p. 434 )
Deleção (Intersticial, microdeleção, dele-
ção parcial, heterozigoto por deleçáo
parcial, terminal) (p. 433, 434)
Deleção cromossòmica parcial (p. 433 )
Disgenesia híbrida (p. 449 )
Dissomia uniparental (p. 428)
Dosagem gémea (p. 425 )
Duplicação (duplicação parcial, heterozi-
goto por duplkaçào parcial) (p. 434 )
454 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Elemento ativador (Ac ) (p. 445)
Elemento de dissociação (Ds) (p. 445)
Elemento P (p. 449)
Elemento transponrvel autónomo (p. 445)
Elemento transponrvel não autónomo
(p. 445)
Estrutura sínáptica tnvalente (p. 427)
Euplolde (p. 423 )
Fenótipo mutado Instável (p. 445 )
Fragmento acéntrico (cromossomo
acêntrlco) (p. 433)
Ginandromorflsmo (p. 428 )
Heterozlgoto para translocação (p. 439)
.
Inativação por inserçáo (p 444 )
Inversão (heterozigoto para inversão)
cromossômica (paracéntrlca, peri-
cêntríca) (p. 436, 438)
Mapeamento das deleçôes (p. 436)
.
Monossomla (p 424 )
Poiiploidia ( aloploidia, autopoliploidia )
.
(p 429 )
Ponte dicéntrica (cromossomo dicên
trico) (p. 438)
Ponto de quebra cromossômica (p 433 )
Pseudodominância (p 436 ) . .
Repetição direta (p 447 ).
Repetições terminais longas (LTRs) (p. 450)
Resgate trissòmico ( p. 428)
Ret/ otransposon (p. 449)
Segregaçáo adjacente 1 (p. 443 )
Segregação alternada {p 442) . Trissomia (p. 424 )
Semiesterilidade (p. 428)
Sequência repetida invertida (IR) (p 446 )
Supressão do cruzamento (p. 439)
.
Transposição conservadora (p 448 )
Translocaçào cromossômica (p. 436)
Translocação reciproca (balanceada,
não balanceada) (p. 440 )
Transposição repllcatlva (p. 449)
. Translocação robertsoniana (fusão cro-
mossômica) (p 440 )
Transposição (elemento genético trans-
.
ponível) (p 444 )
Transposon (composto e simples)
(p. 445, 448 )
Transposon de DNA (p. 449 )
.
Vigor híbrido (p 431 )
.

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capitulo
1. Considere a sinapse na prófase I da meiose de duas espé-
cies de planta que carregam, cada uma, 36 cromossomos.
.
A espécie A é diploide e a espécie B é triploíde Quais ca-
racter ísticas da sinapse dos cromossomos homólogos
podem ser usadas para diferenciar essas duas espécies?
2. Em um conjunto de cromossomos carregado por uma es-
pécie de planta triploíde, suponha que o par de cromos-
somos seja bivalente entre os cromossomos Cl e C2 e
univalente com o cromossomo C3. Mostre os gametas re-
sultantes desse padrão sináptico e identifique a frequên
cia e o conteúdo dos gametas geneticamente diferentes
produzidos pela espécie.Na sua resposta, use as designa
ções C,,C; e C, para identificar cada cromossomo.
3. Se o número diploide de uma espécie de planta for 4,
quantos cromossomos são encontrados em um membro
da espécie que tenha uma das seguintes características?
Explique sua lógica em cada caso.
a. Diploide
b. Pentaploide
c Octaploide
d. Trissòmico
e. Triploíde
f. Monossômico
g. Tetraploide
h. Hexaploide
Na lista acima, quais plantas tendem a ser inférteis ou a
ter uma fertilidade reduzida ?
.
f Translocação balanceada recíproca
g. Inversão paracêntrica
h. Monossomla
.
i Poiiploidia
5. O acasalamento entre um burro macho (2n = 62) e uma
égua (2n = 64) produz mulas estéreis. No entanto, recen-
temente ocorreu um evento muito raro —
uma mula
fémea gerou uma prole ao acasalar com um cavalo.
a. Determine quantos cromossomos estão no cariótipo
da mula e explique por que as mulas geralmente são
estéreis.
- b. Quantos cromossomos são portados pela prole da
mula- cavalo ?
c. Por que é muito improvável que a prole venha a ter
caraterí sticas genéticas totalmente parecidas com as
do cavalo?
6. Estudos da disgenesia híbrida na Drosopbiia indicam que
a proteína repressora da transposição produzida pelos ele-
mentos P faz parte de um processo que limita o número
de elementos P presentes em um genoma- Por que é van-
tajoso limitar o número de elementos P em um genoma?
7. Qual evidência sugere que os elementos copia das mos-
cas- da-fruta e os elementos Ty da levedura estão relacio -
nados com os vírus portadores de RNA ?
8. O que podemos concluir sobre um evento mutacional
que toma o tS1 incapaz de transpor ?

4. A partir da seguinte lista, identifique os tipos de altera 9. Em termos do conteúdo cromossòmico dos núcleos, o
que significa o termo mosaico ?
ções cromossômicas que devem exibir consequências
fenotipkas. 10. Na Drosopbila, um aleio recessivo ligado ao X produz
a. Inversão pericéntrica .
corpo amarelo O cruzamento de uma fémea amarela e
b. Deleçáo intersticial um macho com corpo da cor do tipo selvagem costuma
c Duplicação produzir fêmeas do tipo selvagem e machos amarelos .
d. Deleçáo terminal No entanto, às vezes é produzida uma fêmea amarela Ex- .
e. Trissomia plique como é produzida a fémea normal.
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossômí cas 455

Aplica ção e integra ção

.
11 As plantas neste problema são as mesmas descritas na c Identifique os gametas produzidos pela segregação
Análise Genética 13.1, em que a cor da flor no autotetra- .
adjacente- 1 Quais desses gametas são viáveis?
ploide é a caracterlstíca de um único gene determinada d. Identifique os gametas produzidos pela segregação
pelos alelos Rt e fl, que têm uma relação aditiva. A corres- adjacente-2. Quais desses gametas são viáveis?
pondência genótlpo- fenótipo é: e. Entre os tr ês padrões de segregação, qual deles tem a
menor probabilidade de ocorrer ? Por quê?
Genótipo Fenótipo
Vermelho-escuro
15. O Dr. Ara B. Dopsis tem uma ideia que ele acha que será
uma bênção para a agricultura. Ele quer criar a'bamate",
Vermelho-daro um híbrido entre um tomate (Lycopersicon esculentum),
Rosa que possui 12 cromossomos, e uma batata (Solanum
tuberosum ), que possui 48 cromossomos. O Dr. Dopsis
Rosa-daro
espera que a nova bamate tenha um crescimento de
¥M Branco tubérculo como o da batata e a produção de frutos do
tomate. Ele une um gameta haploide de cada espécie
a. Preveja os fenótipos e as frequências da progénie gerada
para formar um híbrido e depois induz a duplicação do
pela autofértilizaçáo de uma planta vermelho-daro.
número cromossómico.
b. Uma planta rosa- daro e uma planta vermelho-daro
são cruzadas. Preveja as frequências dos fenótipos a. Quantos cromossomos terá o híbrido antes da duplica-
entre a progénie. ção cromossômica?
b. Esse híbrido será infértil?
12. Um cromossomo normal e seu homólogo, portadores de
.
uma inversão paracêntríca, são fornecidos O ponto ( •)
c Quantos cromossomos o poliploide ter á após a dupli -
cação cromossômica?
representa o centrômero. d. O Dr. Dopsis pode ter certeza de que o poliploide terá
as características que ele deseja? Justifique.
Normal ABC • DEFGHIJK
Inversão abc * djihgfek 16. Suponha que a reação em cadeia da polimerase (PCR)
seja usada para amplificar um único marcador de DNA
a. Diagrame o alinhamento dos cromossomos durante a no cromossomo 21 humano. Suponha também que um
.
prófase I casal que tenha um filho com síndrome de Down (tris-
b. Suponha a ocorrência de um cruzamento na região somia do 21) seja examinado para esse marcador. A mãe
entre F e G. Identifique os gametas formados após esse tem alelos marcadores de 310 e 380 pb. Seu parceiro tem
cruzamento e Indique quais deles são viáveis. alelos marcadores de 290 e 340 pb. Quais faixas de PCR
c. Suponha a ocorrência de um cruzamento na região estão presentes nos seus filhos com síndrome de Down
entre A e B. Identifique os gametas formados por esse se a não disjunção ocorreu
evento de cruzamento e indique quais deles são viáveis.
a. na meiose I materna?
13. Um par de cromossomos homólogos na Drosophih tem b. na meiose II materna?
o seguinte conteúdo (cada letra representa um gene): c. na meiose I paterna?
d. na meiose II paterna ?
Cromossomo 1 RNMDHBGKWU
Cromossomo 2 RNMDHBDHBGXWU .
17 O cromossomo IV na Drosophlla é um cromossomo
muito pequeno e carrega uma quantidade minúscula de
a. Qual termo melhor descreve essa situação? material genética As moscas-da-fruta trissômicas para o
b. Diagrame o pareamento desses cromossomos homó- cromossomo IV não têm anomalias fenotípicas aparentes
logos na pr ófase I. e continuam férteis. Entre os genes no cromossomo IV,
c. Qual termo melhor descreve a estrutura normal que se existe um para o qual um alelo recessivo ey produz o fe-
forma durante o pareamento desses cromossomos? nótipo "sem olhos". Um macho trissõmico para o cromos-
d. Em que o pareamento diagramado na parte (b) difere somo IV e que tem o genótipo -f +ey é cruzado com uma
do pareamento dos cromossomos em um heterozi- fémea diplolde sem olhos com o genótipo eyey.
goto para inversão? a. Supondo que a segregação aleatória dos cromosso-
14. Um animal heterozigoto para uma translocaçáo balan- mos ocorra durante a espermatogénese e que todos
ceada recíproca tem os seguintes cromossomos: os espermatozóides sejam viáveis, quais genótipos dos
espermatozóides são previstos e em que proporções?
KN • OPQRST b. Se esses espermatozóides se unirem a ovos de fêmea
MN * OPQRjkl sem olhos, qual é a razão prevista de moscas sem olhos
para moscas com olhos normais entre a progénie?
cdef • ghijkl
cdef * ghiST 18. Um casal saudável com uma história de três abortos es-
pontâneos acabou de ter um filho com síndrome do
a. Diagrame o pareamento desses cromossomos na pró- miado do gato, um transtorno causado por uma deleção
.
fase I terminal do cromossomo 5. Seu médico prescreve a aná -
b. Identifique os gametas produzidos pela segregação al- lise do carió tipo dos dois pais e do filho. Os resultados do
ternada. Quais desses gametas são viáveis? cariótipo para os cromossomos 5 e 12 são exibidos aqui .
456 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

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1X2
tu

12 5 5 12 12 5 5 12 12
Pai Filho

a. Os cromossomos no filho sâo coerentes com os previstos H C G O

em um caso de sindrome do miado do gato? Explique.
b. Qual dos pais tem um cariótipo anormal ? Com base em
que você afirma isso? Qual é a natureza da anomalia ?
J
c Por que esse progenitor tem um fenótipo normal ?
d. Diagrame o pareamento dos cromossomos anormais.
1

2
y J

e. Qual padrão de segrega ção ocorreu para produzir Zi

o gameta envolvido na fertilização do filho com sin - I
'
•
drome do miado do gato?
f. Qual é a probabilidade aproximada de o próximo filho 1 i
desse casal vir a ter a sindrome do miado do gato ? 4
g. Os cariót í pos dos pais ajudam a explicar a ocorrência 5
dos três abortos espontâ neos? Explique.
19. Um menino com sindrome de Down (trissomla do 21 )
tem 46 cromossomos. Seus pais e suas duas irmãs mais
velhas têm um fen ótipo normal, mas cada um tem 45
2
3 » 2
1
-1
=r i
I
cromossomos.
.i
a. Explique como Isso é possível. 3 *2
1
b. Quantos cromossomos você espera ver nos cariótipos 4

dos pais?
c Qual termo descreve melhor esse tipo de anomalia
cromossômica?
d. Qual é a probabilidade de o próximo filho desse casal
vir a ter um fen ótipo normal e possuir 46 cromosso-
mos? Explique.
20. O cromossomo 5 humano e os cromossomos correspon
dentes do chimpanzé, gorila e orangotango são exibidos
ao lado. Descreva quaisquer diferenças estruturais que
você observar nos cromossomos do outro primata em
relação ao cromossomo humano e proponha um meca
nismo para explicar cada diferença.
5 2
i
.
21 Uma pequena popula ção de cervos que vive em uma
ilha isolada é separada durante muitas gerações de
uma popula ção de cervos do continente. As popula ções
mantém o mesmo n ú mero de cromossomos e são infér-
- .
teis mas esse cromossomo tem um padrão de banda -
mento diferente.
a. Descreva como o padrão de bandamento do cromos-
somo da população da ilha isolada evoluiu a partir do cro-
- mossomo continental. Qual termo ou termos descrevem
melhor a diferen ça entre esses cromossomos?
b. Desenhe a sinapse desses homólogos durante a pró -
fase I nos h í bridos produzidos a partir do cruzamento
do cervo continental com o insular .
c No cervo hibrido continental insular, a recombinação
ocorre na banda q1 dos cromossomos homólogos.
 Capí tulo 13 Aberrações e transposição cromossòmí cas 457

Continente Ilha cromossomo. Essa região do cromossomo contém genes

que expressam sete fenótipos mutados recessivos, iden-
p2-2 P3 tificados na seguinte tabela como a a g. Um pesquisador
p2 deseja determinar a localização e a ordem dos genes no
p2J
Pi cromossomo, então ele configura uma série de cruza-
Pi mentos nos quais as moscas homozigotas para um alelo
Centrômero — — Centrômero mutado são cruzadas com moscas homozigotas para uma
ql ql deleçào parcial. A progénie é classificada para determinar
se possui o fenótipo mutado ("m* na tabela) ou o fenótipo
q2 q2.1
q3.1 q22
.
do tipo selvagem (Vna tabela) Use o mapa de deleçào
parcial e a tabela dos fenótipos da progénie para determi-
q3.2 q2.3 nar a ordem dos genes no cromossomo.
q4.1 q2.4
25. Duas variedades experimentais de morango são produ -
q4.2 q 3, 5 zidas pelo cruzamento de uma linhagem hexaploide que
contém 48 cromossomos e uma linhagem tetraploide
que contém 32. A variedade experimental 1 contém 40
cromossomos e a variedade experimental 2 contém 56.
d. Suponha que 40% de todas as meioses nos híbndos con-
tinentais-insulares envolvam a recombinaçáo em alguma a. Vocé prevê que as duas linhagens experimentais sejam
parte na região cromossômka entre q2.1 e p2. Qual é a férteis ? Por quê ?
proporção de gametas viáveis do cervo híbrido? Qual é b. Quantos cromossomos da linhagem hexaploide são
a causa da menor proporção de gametas viáveis nos hí- fornecidos para a variedade experimental 1? E para a
bridos em relação às populações parentais? variedade experimental 2?

.
22 Nos seres humanos mosaicos XX/X,o fenótipo é altamente
.
c Quantos cromossomos das linhagens tetraploides são
fornecidos para a variedade experimental 1? E para a
variável, variando de mulheres com sintomas de síndrome variedade experimental 2?
de Turner até mulheres basicamente normais. Do mesmo
26. No tomate,Solanum esculentum, a planta de estatura ele-
modo, os mosaicos XY/X têm fenótipos que variam de mu-
_
vada (D ) é dominante em relação à planta de baixa esta -
lheres com síndrome de Turner até homens basicamente
.
normais Como pode ser explicada a ampla gama de fenó-
_
tura (dd), o fruto liso (P ) é dominante em relação ao fruto
tipos desses mosaicos do cromossomo sexual? "com pelos” (como o pêssego, por exemplo) (pp) e o fruto
redondo (O ) é dominante em relação ao fruto alongado
.
23 Um criador de plantas gostaria de desenvolver uma va- .
(oo) Esses três genes estão ligados no cromossomo I do
riedade de pepino sem sementes a partir de duas linha- tomate na ordem baixa estatura- pêssego-alongado. Exis-
.
gens existentes A linhagem A é tetraploide e a linhagem tem 12 unidades de mapeamento entre baixa estatura
B é diploide. Descreva a estratégia de procriação que vai e pêssego e 17 unidades de mapeamento entre pêssego e
produzir uma linhagem sem sementes e sustente sua es- alongado. Uma planta triíbrida (DPO/ dpo) é submetida a
tratégia descrevendo os resultados dos cruzamentos. um cruzamento-teste com uma planta homozigota re-
cessiva nos três lócus ( dpo/dpo ). As plantas da progénie
.
24 Na Drosophifa, sete deleções parciais (1 a 7) exibidas como
são cultivadas com os resultados exibidos a seguir.
lacunas no diagrama a seguir foram mapeadas em um
Fenótipo da progénie Número
Cromossomo .
Alta lisa, redonda 473
Deleçào Baixa, pêssego, alongada 476
1
Alta, lisa, alongada 12
2
3 Baixa, fruto com pelos, redonda 8
4 Alta, pêssego, alongada 17
5 Baixa, lisa, redonda 13
6
Alta, pêssego, redonda 0
7
Baixa, lisa, alongada 1
Mutação 1.000
Deleçào a b c d e í 9 Identifique o mecanismo responsável pelos dados resul-
1 + m + m + + + tantes que não est ão de acordo com o mapa genético
2 m + + + m + estabelecido.
3 m +
+
+
+
+
m
+ +
m
m
m
.
27 Na Drosophlla, a cor do olho do tipo selvagem é produ-
4 m + zida pelo alelo w* ligado ao X. Os mutados para a cor
5 + m + m m dos olhos costumam não ter capacidade para depositar
6 m m m m + m m pigmento no olho e, portanto, t ém olhos brancos. Para
7 m + + + + + + a finalidade deste problema, suponha que, na aná lise
458 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
.
da Southern blot uma sonda molecular hibride com um
fragmento de DNA de 5,0 kb do lócus da cor do olho. A
sonda se liga aos fragmentos de DNA contendo sequên-
cia do tipo selvagem ou mutado.
a. Se um macho de Drosopbila tiver olhos brancos como
consequência da inativação do w' pelo movimento de
um elemento P de 3 kb para o alelo do tipo selvagem,
diagrame o padráo previsto para a Southern blot dos
fragmentos de DNA dos machos do tipo selvagem e
das fêmeas e machos de olhos brancos que carregam
o alelo mutado. Explique sua lógica.
b. Vários integrantes masculinos da progénie de uma
fêmea portadora de alelo mutado têm setores verme
lhos em seus olhos. O número e tamanho dos setores
variam entre os machos. Explique a origem desses se-
tores vermelhos e leve em conta a variação no número
e tamanho.
c Se a Southern blot for utilizada para comparar o DNA
isolado de um setor branco e de um setor vermelho do
mesmo olho, há previsão para uma diferença no tama-
nho do fragmento de DNA ? Explique.
.
28 Um elemento P da Drosophila tem 2,5 kb de compri-
mento e é modificado pela adição de uma sequência
.
Intrônica de 1,0 kb a um dos seus éxons Um elemento
copia de 6,0 kb é modificado pela adição do mesmo irv
tron de 1,0 kb á sua regiáo central.
.
a Um genoma de Drosophiia carregando os dois elemen
tos transponíveí s é induzido a sofrer transposição. Qual
é o comprimento do elemento P recém-transposto?
b. Qual é o comprimento do elemento copia reeém-
-transposto?
c Explique os resultados de cada caso de transposição.
29. Um biólogo que estuda mecanismos de voo nos insetos
deseja introduzir um alelo mutado dominante que pro-
duza asas de tamanho exagerado, chamadas íf apper, no
genoma da Drosophiia. O biólogo escolhe uma cepa de
mosca-da-fruta homozigota para um mutado recessivo
que produz asas em miniatura. Como o biólogo vai con
ceber o experimento usando um elemento P para forne-
cer o alelo mutado para o genoma?
.
30 Uma parte de uma sequência repetida invertida mar-
cando o sítio de Integração de um transposon é forne
.
cida A região centrai do transposon tem 868 pb de com-
primento. A transposase cria um corte escalonado no
DNA, quebrando as fitas no local indicado pelas linhas.
Transposon
I
5‘
3’ 5*
T
a. Escreva a nova sequência que circunda o tTansposon
recém-inserido.
b. Descreva o mecanismo que cria a sequência que cir-
cunda o sítio de inserção do transposon.
.
31 Duas enzimas de restrição Nofl clivam o DNA em lados
opostos do gene Dbm em uma espécie de levedura. Uma
sonda molecular para o Dbm detecta um fragmento de
restrição do DNA de 8,5 kb nos organismos do tipo sel-
vagem em Dbm. Em uma cepa de levedura, um elemento
genético transponlvel Tyl provoca mutação dbm. O Tyl
tem 5,6 kb de comprimento.
a. Na levedura haploide com essa mutação dbm, qual é
o comprimento do fragmento de restrição detectado
pela sonda após a digestão com Nofl?
b. Quais são os tamanhos de fragmento de DNA detec-
tados em uma cepa de levedura diploide heterozigota
para alelos do tipo selvagem e mutados no dbm?
c A inser ção do Tyl no dbm causa mutação por perda de
função. Explique por que isso acontece.
32. Nos cruzamentos a seguir,determine com a maior precisão
possível os genótipos de cada progenitor, em qual desses
progenitores ocorre a não disjunção e se a não disjunção
ocorre na primeira ou na segunda divisão meiótica. O dal-
tonismo e a hemofilia, um transtorno de coagulação, são
.
traços recessivos ligados ao X Em cada caso, suponha que
os pais tenham cariótipos normais (ver Tabela 13.2).
a. Um homem e uma mulher que tenham fenótipos do
tipo selvagem geram um filho com síndrome de Kline-
.
felter ( XXY) que tem hemofilia
b. Um homem daltónico e uma mulher do tipo selvagem
geram um filho com síndrome de Jacob (XYY) que tem
hemofilia.
- c Um homem daltónico e uma mulher do tipo selvagem
geram uma filha com síndrome de Turner ( X) que tem
visão e coagulação normais.
d. Um homem daltónico e portador de hemofilia e uma
mulher do tipo selvagem geram uma filha com síndrome
- do triplo X (XXX) que tem hemofilia e visão normal.
Regulação da expressão gênica Capítulo
nas bactérias e bacteriófagos

APRESENTA ÇÃO
14
14.1 O controle transcriclonal da expressão gênica
exige a interação DNA-proteina
14.2 O óperon loc é um sistema óperon induzível
sob o controle negativo e positivo
143 A análise das mutações decifra a regulação
genética do óperon loc
14.4 A transcrição a partir do óperon do triptofano
é repressivel e atenuada
14.5 As bactérias regulam a transcrição dos genes
de resposta ao estresse e também regulam a
tradução
14.6 Os antitermínadores e repressores controlam a
infecçáo por fago lambda da £ coli

Jacques Monod { direita ), André Lwoff ( centro) e François Jacob ( es-

querda ) em 14 de outubro de 1965, após o anúncio do Prémio Nobel
em Fisiologia ou Medicina por seu trabalho descrevendo o óperon
.
lactose (Ave) na £ coli

I A expressão gênica nas bactérias é con -

P are um momento para pensar sobre o ambiente em constante
mutação suportado pelos bilhões de bactérias Escherichia coli
que povoam seu trato intestinal. Essas bactérias desenvolveram
mecanismos de controle genéticos que alteram rapidamente os
padr ões- chave da expressão gênica, habilitando as bactérias a se
ajustarem a fatores ambientais diversos e em constante mutação
e a condições nutricionais, além de competirem com as muitas
trolada principalmente pela regulação da
transcrição, frequentemente por mek» da re-
gulação dos grupos de genes conhecidos
como óperons.
I A transcrição dos óperons lactose [ loc ) é In-
duzida pela lactose, sendo reprimida na au-
sência de lactose.
I A transcrição do óperon triptofano ( trp)

outras espécies bacterianas no seu intestino. Nos intestinos, e

em uma ampla gama de nichos ambientais em que as bactérias
habitam na natureza, a norma consiste em condições variá veis e
até mesmo extremas. Em todos esses ambientes, a sobrevivência
bacteriana depende da capacidade de regular a expressão gênica
a fim de acomodar as necessidades imediatas da célula. Além dis-
so, esses mecanismos contribuem para a capacidade de as células
bacterianas serem quase inteiramente autossuficientes quando se
trata de produzir as proteí nas e enzimas necessárias para gerar os
compostos que as mantêm vivas.
ajusta o nível de triptofano disponí vel.
I Processos regulatórios especializados con-
trolam a resposta transcricional ao estresse
ambiental e regulam a tradução.
I 0 bacteriófago usa a regulação transcricio -
nal para expressar os genes responsáveis
por infectar seus hospedeiros.
I A competição entre as proteínas regulat ó-
rias determina o curso da infecçáo por bac
teriófago lambda nas bactérias .
-
460 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Vá rios dos mecanismos e processos que executam a
regulação transcrlck> nal da expressã o gê nica nas bacté-
rias e nos ví rus bacterianos ( bacteriófagos) são o assunto
deste capítulo. A partir de cada uma dessas discussòes,
—
surge um motivo operacional central a transcrição é
regulada pelas intera ções entre as prote í nas regulató-
rias de ligação ao DNA e as sequ ências de DNA regula
tó rias específicas. Esse motivo é comum entre todos os
organismos e o veremos repetido nas discussões de re-
gulação da expressão gè nica nos genomas eucarióticos
(Capítulo 15).
Neste capítulo, os sistemas regulatórios que dis - 14). A Figura 14.1 fornece uma visão global dos meca
cutimos se encontram principal mente na E. coli, a bac-
téria mais utilizada como modelo. Começamos com
uma introdução geral à expressã o gé nica regulada e
ao mecanismo mais comum de interação entre as pro-
teínas regulatórias dc ligaçã o ao DNA e as sequ ê ncias
de DNA que regulam a transcriçã o. Em seguida, explo-
ramos a organiza ção, função e regulaçã o do sistema
óperon lactose (lac ) da £. coli, cuja transcrição gé nica é
induzida (ativada ) pela presen ça do a çú car lactose no
meio de cultura. Depois disso, vem uma discussã o so-
bre a aná lise mutacional e a explica ção molecular do
controle transcricional dos genes do ó peron lac. Depois
voltamos nossa atenção para a estrutura gen ética e o
controle molecular da transcrição do óperon triptofano
( frp), que conté m os genes necessá rios para sintetizar o
aminoácido triptofano; por fim, após uma discussão da
regulação pós-transcrição dos genes bacterianos, exa-
minamos os processos controlados geneticamente que
controlam a infecçáo das células bacterianas pelo bacte
riófago X ( lambda ).
das interações entre as proteí nas de ligação ao DNA e as
sequências regulatórias específicas do DNA. O primeiro
n ível de controle regula o início da transcrição, deter -
minando se um determinado gene ou grupo de genes
é ou nào transcrito. O segundo nível de controle trans-
cricional determina o volume de transcrição, regulando
a duração da transcrição ou o volume de transcrito de
RN Am produzido a partir do gene.
A maior parte da regulação da expressão gènica nos
genomas bacterianos ocorre pela regulação transcricio-
nal , que é o foco principal deste capítulo. Os mecanis-
mos regulatórios pós- transcricionais também sào im -
portantes para controlar o n ível e tradução do RNAm
ou a atividade das proteínas e enzimas (ver Capítulo
-
nismos regulató rios bacterianos.
Controle negativo e positivo da transcrição
Os mecanismos de controle da transcrição sào des -
critos como negativos ou positivos. O controle nega -
tivo da transcrição envolve a ligação de uma proteí na
repressora com uma sequê ncia de DNA rcgulató ria,
com a consequência de impedir a transcrição de um
gene ou grupo de genes. Por outro lado, o controle po-
sitivo da transcriçã o envolve a ligação de uma proteí na
ativadora ao DNA regulatório, com o resultado de ini
ciar a transcrição gênica.
-
As prote í nas repressoras são uma ampla cate-
goria de prote í nas regulatórias que exercem controle
negativo sobre a transcrição. Em sua forma ativa, as
proteínas repressoras se ligam a sequências de DNA
regulatórias, incluindo as conhecidas como opera -
dores , conforme descrevemos para o óperon lactose. A
A B C D
Gene
DNA

14.1 O controle transcricional da

Transcrição

RNAm

Tradu ção
i L f—
.. Controle da
expressão gênica exige a
intera ção DNA-proteína Enzima A Enzima B ^ transcrição
nenhuma
sí ntese

—
Certos genes bacterianos especificamenle aque - tradução
nenhuma —
Controle da de RNAm

para realizar tarefas de rotina

—
les cujos produtos são permanentemente necessá rios
sofrem transcrição
constitutiva, um termo que identifica os genes que
estão sendo transcritos continuamente sem qualquer
Substrato O /

Nenhuma
Produto

regula ção
atividade — -
sí ntese
enzimá tica

atividade enzimá tica

nenhum produto —
Controle pós traduçáo da

controle regulat ório. Por outro lado, a necessidade de
respostas á geis e calibradas às condições ambientais
mutá veis requer a transcrição regulada de muitos
genes bacterianos.
A regulação da transcrição dos genes bacterianos
ocorre em dois níveis e ambos controlam o resultado
enzimá tica total
Constitutiva
Figura 14.1 Visã o global da expressão génica nas
.
bactérias A expressão não regulada ( constitutiva ) e trés
padrões de expressão gènica regulada ocorrem nas bacté rias.
 Capítulo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos 461

ligação da proteína repressora bloqueia a iniciação da ( a ) Efeito do indutor

transcrição, ocupando o espaço na sequência de DNA Proteína repressora Proteí na repressora
Indutor

i
regulatória onde a polimerase se ligaria ou impedindo Dom ínio Dom í nio alostérico
a formaçã o do complexo promotor aberto necessá rio de ligação Sem RNA polimerase
para a iniciaçã o da transcrição. As proteínas repres - ao DNA transcriçã o / Transcrição
soras podem ser ativadas ou inativadas por interações \
com outros compostos. Promotor 'Operador Gene
Normalmente, as prote í nas repressoras contêm A ligação da proteína repressora A ligação da mdéoia
dois sítios ativos por meio dos quais seu papel funcional bloqueia a transcrição por meio irdutora ã proteí na repressora
da regulação negativa permite a transcrição.
é exercido. O domínio de ligação ao DNA é responsá -
vel por localizar e ligar a sequência de DNA operadora
ou outras sequências- alvo regulatórias. O domínio (b) Efeito da repressora simultâ nea
alostérico se liga a uma molécula ou proteína e, ao fa - Proteína Prote í na repressora
zê- lo, provoca uma mudança na conformação do sítio
de ligação ao DNA. A propriedade pertencente a algu
mas enzimas de mudar a conformação no sítio ativo em
consequê ncia da ligação de uma substância em um sítio
-
repressora

t Repressora simultâ nea

«
Sem
transcrição
f RNA polimerase
l
-Transcriçi

diferente é conhecida como aloster í a. Promotor Operador Gene

Os dom í nios alosté ricos operam em dois modus. A ligação do complexo Com a repressora simultâ nea
Certas proteínas repressoras sofrem inativaçâo de seu repressora repressora simultânea ausente, a repressora não se
domínio de ligação ao DNA em virtude de mudanças
bloqueia a transcrição por meio
ca regulação regat vai
.
liga permitindo a transcrição

alostéricas acarretadas por um composto indutor que

se liga ao sitio alostérico (Figura 14.2a). Se o indutor for Figura 14.2 Mecanismos da controla negativo da
removido do sítio alosté rico, a conformação do repres - transcrição.
sor é modificada, o sítio de ligação ao DNA é reativado
e a proteína consegue reprimir a transcrição. Por outro
lado, algumas proteínas repressoras requerem a ligação ( a ) Efeito do composto efetor alostérico
de uma molécula repressora simultânea no sítio alosté
rico para ativar o sitio de ligação ao DNA (Figura 14.2b).
- Prote í na ativadora
Efetor
Nesse caso, a repressão da transcrição é revertida quando Sem RNA polimerase
i
a repressora simultâ nea é removida do sí tio alostérico. transcrição Transcrk ã
O controle positivo da transcrição é obtido pelas Promotor me
prote í nas ativadoras que se ligam à s sequê ncias de
DNA regulat órias chamadas sí tios de ligação das A ausência do efetor impede a A ligação do efetor á proteí na
liga ção da proteína ativadora e ativadora fadfita a transcrição
ativadoras. A ligação da proteína ativadora facilita a a transcrição. por meio da regulação positiva.
ligaçã o da RNA polimerase nos promotores e ajuda a
iniciar a transcriçã o. As prote í nas ativadoras têm um (b) Efeito do composto Inibidor alostérico
domínio de ligaçã o ao DNA que liga o sitio de ligação Proteína ativadora
das ativadoras no DNA. Em um modo de ação das pro -
te í nas ativadoras, o dom í nio de ligação ao DNA per -
manece inativo at é o dom ínio alosté rico ser ligado por
um composto efetor alostérico. A mudança alostérica
Inibidor 0 Sem
transcriçã o
RNA polimerase
l
Transcrk ã

induzida leva à formaçã o de um dom ínio funcional de Promotor ie

ligação ao DNA, permitindo que a proteína ativadora A ligação do inibidor á protefrva A ausência de urn inibidor
ativadora impede a ligação í to permite a liga ção da proteína
se ligue ao DNA (Figura 14.3a). Por outro lado, certas ativadore a transcrição ativadora e a transcrição por
proteí nas ativadoras possuem um domínio funcional meio da regula ção positrva
de ligação ao DNA que é convertido para uma confor-
F igura 14.3 Mecanismos de controle positivo da
ma ção inativa ligando um composto inibidor no dom í - transcrição.
nio de ligaçã o alosté rico ( Figura 14.3b).

Observa çã o gen é tica 0 controle negativo bloqueia

a transcrição por meio de uma proteí na repressora com uma
sequência de DNA regulatória. 0 controle positivo ativa a
transcrição por meio da ligação da proteína ativadora a uma
sequ ência de DNA regulatória.
Proteínas regulatórias de ligação ao DNA
A maioria das proteínas de ligação ao DNA, que
exerce controle regulató rio, se liga ao DNA em sequ -
ências específicas que desempenham sua fun ção regu -
latória. Essas interações ocorrem pela associação de ca-
462 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
deias laterais de aminoácidos das proteínas com bases
nucleotídicas específicas e com a espinha dorsal de
açúcar-fosfato do DNA. As proteí nas entram em con -
tato com pares de bases específicos localizados no sulco
maior e no sulco menor da hélice do DNA usando um
padrão exclusivo de á tomos de hidrogé nio, nitrogénio e
oxigénio que caracteriza cada par de bases.
-
Para obter a especificidade proteína DNA nessas
interações, a proteína precisa entrar em contato si
multaneamente com vários nucleotídeos. Um motivo
comum nas estruturas das proteínas regulatórias de li-
gação ao DNA é a formação de estruturas proteicas se-
cund á rias, na maioria das vezes hélices a, que contém
aminoácidos que entram em contato com nucleotídeos
regulatórios. Frequentemente, dois segmentos protei
cos entram em contato com a sequência -alvo de DNA.
As regiões de ligação ao DNA pareado de uma proteína
regulatória se formam de duas maneiras. Em um tipo de
interação, um ú nico polipept ídeo se dobra e forma dois
dom í nios que se ligam a sequências de DNA específicas.
No outro tipo, a proteína regulató ria consiste em dois
ou mais polipeptideos unidos, formando um complexo
multimérico de dois (dimérico) , três ( trimérico) ou
quatro (tetramérico) polipeptideos. Quando polipeptí
deos idênticos se unem, utiliza -se o prefixo homo-. Um
"homod í mero" contém dois polipeptideos idê nticos na
proteína funcional. Quando polipeptideos diferentes se
unem, o complexo é identificado pelo prefixo hetero- ,
como em “ heterod í mero*1.
Estudos sistemá ticos das proteínas reguladoras da
transcrição nas bactérias identificaram as característi
cas estruturais típicas das prote í nas regulat ó rias de li -
gação ao DNA e da sequência de DNA à qual se ligam.
As sequ ências de DNA regulat órias bacterianas costu -
mam conter repetições invertidas ou diretas. Nos dois
tipos de interação, cada polipeptídeo de uma prote í na
regulatória homodimérica , ou cada uma das regiões de
ligação a um peptídeo dobrado, interage com um dos
segmentos repetidos invertidos. Disparadamente, o
motivo estrutural mais comum visto nessas proteí nas
nas bactérias é o motivo hélice- volta - héiice (HTH, do
.
inglês helix- turn- helix ) ( Figura 14.4 ) No motivo HTH,
duas regiões alfa - helicoidais em cada um dos polipep-
tideos em um homodímero interagem com sequências
regulatórias repetidas invertidas no DNA. Em cada um
dos polipeptideos, uma região alfa - helicoidal forma a
hélice de reconhecimento, que está conectada a uma
cadeia curta de aminoá cidos formando a "volta", que é
conectada a uma segunda região alfa - helicoidal como
h élice estabilizadora que atua para manter os dois po-
lipeptideos juntos. Centenas de diferentes proteínas re
gulatórias de ligação ao DNA com o motivo HTH foram
identificadas nas bactérias. Veremos alguns exemplos
em seções posteriores deste capí tulo e em discussões
sobre HTH e outros motivos de proteínas regulató rias
nos eucariotos (Capítulo 15).
0 dlrrero da proteína regulatória
Hélice estabilizadora -
tem contatos atfe helicoidais que
sf forrrwn as hélices estabiBAKlords.
7
As alfa-hélices formam
hélices de reccnhec mpnto
Hélice de que se encaixam nos
reconhecimento s jkos menor e maior para
entrar em contato com as
sequências regulatórias.
-
/ Repetição invertida
- s1MB £
- -
3'3 n f.W.H Hf.T.H.WHl Hnií lIf.H
- 1
Repetição invertida
u
3'
F igura 14.4 Mothro da proteína regulatória hélice
-volta-h élke. Um polipeptídeo formando duas alfa
-hélices separadas por uma “volta'' de aminoácidos se junta
a um polipept í deo idéntko para formar uma proteína
- regulatória homodimérica com hélices estabilizadora e de
reconhecimento que se ligam a repetições invertidas do DNA.
14.2 O óperon lac é um sistema
óperon induz í vel sob controle
negativo e positivo
-
Na comparaçã o dos genomas das diferentes formas
de vida , uma conclusão é que a evolução trabalhou para
restringir o tamanho total dos genomas bactcrianos
em comparação com a maioria dos outros e també m
para limitar sua porcentagem de DNA repetido ( n ão
codificador). Essas limitações são impostas por vários
fatores, incluindo a depend ência das bacté rias de suas
capacidades para se reproduzir rapidamente e respon -
der prontamente às mudan ças ambientais. A posse de
um genoma relativamente pequeno e de uma pequena
porcentagem de DNA que não codifica polipeptideos
acelera o processo de replicação do DNA e encurta o
tempo de reprodução. A necessidade de capacidade de
resposta rá pida à mudança ambiental e de um menor
tamanho do genoma dita outra adapta ção evolutiva nas
bactérias: o agrupamento e a regulação transcr ícional
coordenada dos genes envolvidos nos mesmos proces-
sos metabólicos.
Os grupos de genes submetidos à regulação trans-
- cricional coordenada por meio de uma região regulató
ria comum se chamam óperons. Estes são comuns nos
-
genomas bacté ria nos, e os genes que fazem parte de
um determinado ó peron quase sempre participam da
mesma via metabólica ou biossintética. Além dc ter um
ú nico promotor, compartilhado pelos genes do ó peron ,
 Ca pitu lo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos
os óperons contém outras sequências de DNA regulató
rias que interagem com os promotores para comparti
lhar o controle da transcriçã o.
Nesta discussão, concentramo-nos no óperon lac-
tose ( lac ) da £ coli . Esse óperon é responsá vel pela pro-
dução de três polipeptfdeos que permitem que a £ coli
utilize o açúcar lactose como fonte de carbono para
crescer e produzir energia metabólica. Nesta seção, ex
plicamos como o óperon lac funciona, descrevemos as
circunstâncias sob as quais seus genes são transcritos e
identificamos os mecanismos regulatórios que contro -
lam a transcrição gênica do óperon. Na próxima seção,
voltamos nossa atenção para as aná lises mutacionais e
moleculares do óperon lac para compreendermos a fun -
çã o dos genes do óperon e explorarmos as intera çóes
moleculares que regulam a transcrição gênica do óperon.
Metabolismo da lactose
O açúcar lactose é a fonte de energia preferida
da £ coli , assim como a das suas células. É metaboli
zado por uma via bioquímica chamada glicólise, uma
sequ ência de reações bioquímicas que oxida a glicose
para produzir piruvato e ATP ( trifosfato de adenosina ,
o composto utilizado universalmente pelas células para
armazenar e produzir energia ). A glicólise ocorre em
praticamente todas as células como parte integrante da
fermentaçã o e da respira ção celular e a £ coli vai con
sumir toda a glicose dispon ível antes da ativação de um
interruptor que altera sua via metabólica para uma que
utilize um açúcar alternativo. A lactose é um dos mui
tos açúcares que podem servir como fonte de carbono
alternativa para as bactérias. O interruptor genético
para a utilização da lactose requer que ela esteja pre-
sente na célula, mas isso só ocorre depois que a glicose
tiver sido esgotada. A utilização da lactose é controlada
pelos genes e as sequê ncias regulató rias que formam o
óperon lac, que é um sistema de óperon induzívcl
ou seja, em circunstâ ncias especificas nas quais a lac-
— com várias partes c uma região gênica estrutural con
tose está presente no meio de cultura e a glicose está
ausente, a transcrição dos genes do óperon é ativada
ou induzida. A natureza induzível do óperon lac e de
outros ó perons induzíveis significa que a expressão dos
genes do óperon é limitada à circunstâ ncia em que o
.
composto indutor está disponível Outros requisitos
nutricionais também podem ter de ser cumpridos para
a ocorrência da indução da transcrição.
A lactose é um dlssacar ídeo que consiste em dois
monossacarideos, a glicose e a galactose, unidos por
uma ligação covalente betagalactosídica ( Figura 14.5).
As bactérias que possuem um fen ó tipo lac* {“ lac
mais”) conseguem crescer em um meio contendo lac
tose como ú nico açúcar. As cepas lac* obtê m seu cres -
cimento produzindo um canal seletivo na membrana
celular que permite a entrada da lactose na célula e
produz a enzima betagalactosidase, que quebra a liga -
ção betagalactosídica para liberar a glicose e a galac
463
- f Betagalactos ídica
,
- CHjOH CH OH
O OH
- DUW LHJOH
Figura 14.5 Metabolismo da lactose. A enzima
betagalactosidase cliva a ligação betagalactosídica do
dlssacar ídeo lactose e produz os monossacarideos glicose
e galactose.
tose. A glicose produzida pela quebra da lactose pode
- entrar imediatamente na glicólise. A molécula da ga -
lactose pode ser ainda mais processada para produzir
glicose. Além de produzir glicose e galactose, a quebra
da lactose produz uma pequena quantidade de alolac
.
tose uma forma modificada de lactose. A alolactose
-
desempenha um papel cr ítico na regulação da trans -
crição dos genes do óperon lac , agindo como com -
- posto indutor. As bacté rias que não conseguem cres
cer em um meio contendo lactose são identificadas
-
como portadoras do fen ótipo lac {“ lac menos"). F.ssas
- cepas n ão conseguem importar lactose para a célula ou
n ã o conseguem decompó- la depois que está na célula,
ou as duas coisas.
Estrutura do óperon lac
O óperon lac consiste em uma região regulatória
.
tendo três genes ( Figura 14.6a ) A região regulatória
-
contém três sequências regulatórias de ligação à proteí-
na. Uma delas é o promotor que se liga à RNA polime-
rase, a segunda é a sequência do operador { lacO ) que se
liga à proteína repressora lac e a terceira é a região do
-
complexo CAP cAMP. Essas três regiões se sobrepõem
parcialmente e estão imediatamente a montante do ini
cio da transcrição dos genes do óperon lac.
-
Os três genes estruturais do ó peron lac são iden -
tificados como lacZ , um gene que codifica a enzima
betagalactosidase; lacY , que codifica a enzima per-
mease; e lacA, que codifica a transacetilase. Esses três
genes são transcritos como RNAm policistrô nico,
- uma molécula de RNAm que é o transcrito de todos
os genes no ó peron. Cada transcrito gênico integrante
de um RNAm policistrônico contém uma sequê ncia de
códon de início e de parada . A tradução de um RNAm
policistrônico gera um polipeptideo diferente para
- cada gene. A betagalactosidase produzida pelo gene
 464 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

<•)
ôperon lactose
1
Região
Repressora regulatória Região gè nica estrutural
i i
r T T 1

Comprimento do Lu
1.040 ptó
w
f - 3.072 pb 1.251 pb 609 pb

—
gene ( pb) I
Promotor fad y
,' Sitio LOperador
/ de ligação
/
/ da CAP
/
/
y Promotor do
/
y lod ó pcron lac hcZ lacY lacA
y
y
y
y
(b ) y
y

/
/ Região promotora
/ i
/
Sítio de ligaçã o da CAP Sequência promotora Operador

j i -«0 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

r
+1
RNAm
+10 + 20 + 30
Ui 1 !
! 1
I I I I I I I I I I
5' iéi/ W ftlflii ATTGT 3'
3' .
fTir WT ? 7ril7»
Í f.TÍ+J4 M1 iM
'
5'
I
J Sequência 35 - Sequência 10 -
Regi ão de liga ção CAP-cAMP
L 1 1 1 j
T T
Repressora Promotor Operador HocZ )
( tod)
. .
Figura 14.6 Ôperon lactose { lac ) da E coU ( a ) A proteína repressora ( toc/) é codificada por um segmento de 1.040 pb
submetido a uma regulação transcricional distinta. A região regulató ria da transcri ção consiste em um sítio de ligação da CAP,
uma região de sequê ncia de consenso promotora, e uma sequ ência operadora. Os três genes estruturais do ô peron lac codificam
as enzimas betagalactosidase {lacZ ), permease UacY ) e transacetilase [ lacA ). ( b ) A sequência de DNA da região regulatória do
ôperon lac incluindo as sequências de consenso -10 e -35, o operador e o sítio de ligação da CAP.

lacZ é responsá vel por clivar a ligaçã o betagalactosí- A Figura 14.6b mostra a composição da sequê ncia
dica da lactose a Fim de liberar moléculas de glicose de DNA do promotor do ôperon lac, lacP, e do operador
e galactose. A enzima també m converte uma pequena lac, lacO , que abrange apenas 80 pares de bases, apro-
quantidade de lactose em alolactose, que tem uma es
trutura química muito similar à da lactose. A enzima
- ximadamente. Repare que as sequências promotora e
operadora se sobrepõem e que a sequência operadora se
permease do lacY age na membrana celular para fa - sobrepõe ao nucleot ídeo +1 que inicia a transcrição. A
cilitar a entrada da lactose na célula . A transacetilase, lacP conté m os sítios de sequência de consenso -10 e
o produto do lacA , n ào é essencial para a utilizaçã o -35, críticos para a ligação da RNA polimerase (veja o
da lactose, embora nas bactérias ela proteja contra Capítulo 8 para uma revisão). A lacO, que sc liga à pro-
subprodutos potencialmente danosos, resultantes do teína repressora produzida pela lacl , se sobrepõe à lacP
metabolismo da lactose. Nossa discussão se concentra perto do inicio da transcrição. Repare també m que o
apenas na transcrição do lacZ e do lacY , e na ação da
betagalactosidase e da permease, já que a transaceti -
sitio de ligação à CAP é próximo das regiões 35 e 10
do promotor. Discutimos essa relação na próxima seção.
- -
lase n ão é essencial para a utilização da lactose.
Adjacente ao ôperon lac, mas nã o fazendo parte Funçã o do ôperon lac
dele, encontra -se o gene regulató rio, lacl , que produ 2
a proteí na repressora lac. O gene lacl tem seu próprio O ôperon lac é silencioso na transcriçã o quando a
promotor, que nào é regulado e conduz a transcrição lactose não está disponível ou quando a glicose está dis-
constitutiva. A proteína repressora lac é um homotetrâ
mero que possui dois domínios funcionais. O primeiro
- ponível para a célula ( Figura 14.7a ). Na ausência de pro-
dução de betagalactosidase, nào h á alolactose na célula
é o domínio de ligação ao DNA que se liga às regiões e a prote ína repressora lac produzida constitutivamente
operadoras e o segundo é um dom ínio alostérico que se se liga à lacO, usando seu dom ínio de liga ção ao DNA.
liga à substâ ncia indutora alolactose. Por sua presença no operador , a repressora lac impede
 Ca pitu lo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 465

—
( a ) Lactose indispon ível (glicose dispon ível ) gerar cópias suficientes do RNAm policistró nico para
Gene Não há acionar o metabolismo ativo da lactose. Um segundo
repressor Promotor Operador i transcrição processo regulat ório que apresenta controle positivo
da transcriçã o é necessá rio para ativar totalmente a
\ transcrição genica do óperon lac. O controle positivo
RNAm da transcrição do óperon lac reside em uma intera çã o
i A proteína reoressora lac se -
DNA proteí na que ocorre no sí tio de ligação à CAP
m Prote ína
repressora
liga à sequência operadora
(tocO) e inibe a transcrição.
do promotor do ó peron lac. Esse sítio está situado
-
aproximadamente a 60 da lacP (ver Figura 14.6b ). O
s ítio de ligaçã o à CAP é a sequê ncia que atrai o com -
plexo CAP -cAMP, um pequeno complexo molecular
( b) Lactose dispon ível (gltcose indisponível) composto de uma proteína conhecida como prote í-
RNA polimerase na ativadora por catabólito ( CAP) e do nucleot ídeo
Gene adenosina monofosfato cíclica (cAMP). A ligaçào do
repressor Transcrição
locO -
complexo CAP cAMP ao seu sítio de ligação faz que o
DNA se dobre em torno do complexo e isso aumenta
l 1 a capacidade de a RNA polimerase transcrever os
RNAm RNAm genes do óperon lac ( Figura 14.8), Esse efeito regula -
I i tó rio positivo leva a um alto n ível de transcrição dos

W
¥'
Proteí na
repressora
Transacetilase
Permease
Betagalactosidase
genes do ó peron lac que permitem que a célula meta -
bolize a lactose c cresça em um meio de cultura con
tendo lactose .
-
Alolactose O processo regulató rio positivo é, em si, regulado
m Com a onxeína repressora inatvada
pela ligação da atoiactose, a RNA
polimerase executa a transcrição.
indiretamente pelo nível de glicose, que modula a dis
ponibilidade de cAMP ( AMP cíclico). O AMP é sinteti -
-
Complexo indutor -repressor zado a partir do ATP (adenosina trifosfato) pela enzima
adenilato cíclase. Durante a glirólise, a disponibilidade
Figura 14.7 Regulação da transcrição do óperon /0c. de adenilato ciclase é limitada e a síntese da cAMP é re-
(a ) Quando a glicose está dispon ível e a lactose n ã o est á, os duzida. Desse modo, quando a glicose está disponível,
genes do óperon toe não são transcritos, (b) A disponibilidade a cAMP tem uma concentração muito baixa, quase ne-
da lactose na ausênda da glicose Induz a transcrição gêmea -
nhuma CAP cAMP consegue se formar e a transcrição
do óperon. génica do óperon lac é altamente ineficiente. Esse efeito
da glicose em bloquear a transcrição genica do óperon
que a RNA polimerase se ligue à lacP e impede também lac é conhecido como repressão por catabólito, du -
a iniciação da transcrição. Essa interação regulatória rante a qual a presença do catabólito preferido (glicose)
transcricional é um exemplo de controle negativo da reprime a transcrição dos genes para um catabólito al-
transcrição que é alcançado pela ligação da proteína re-
ternativo ( lactose, neste caso) .
pressora à sequência operadora que regula a transcrição.
Por outro lado, a disponibilidade de lactose no
Promotor toc
meio de cultura e a indisponibilidade da glicose levam
à indução da transcrição dos genes estruturais do ó pe
ron lac ( Figura 14.7 b ), Com base nisso, o óperon lac é
- -35
identificado como um óperon induz ível. Com a síntese DNA ,0 \ h -10
V
da betagalactosidase ocorre a produção da alolactose. Li - V
7
gando-se ao domínio alost érico da proteína repressora, a
alolactose forma o complexo indutor-repressor A for
mação desse complexo induz uma mudança alosté rica
.
- \
Genes estruturais
que altera a conformação do domínio de ligaçào ao DNA do óperon lac
da proteína repressora para uma forma que nâ o reco-
o
nhece ou se liga ao operador. O operador aberto permite
que a DNA polimerase acosse o promotor. A transcrição
dos genes do óperon lac é induzida por esse evento. A Complexo
CAP-cAMP
sí ntese do RNAm policistrónico se segue e a tradução
produz betagalactosidase, permease e transacetilase.
Apenas a transcrição conduzida pela RNA poli
merase que ganha acesso ao promotor lac pelo meca
-
-
Figura 14.8 Complexo CAP-cAMP se ligando ao sítio de
ligação da CAP. O DNA se dobra em um â ngulo aproximado
-
nismo do complexo indutor repressor n ã o basta para de 90" em volta do complexo CAP cAMP.
466 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Observa çã o gen é tica 0 óperon lac é um óperon irvdu-
zivel que codifica três genes cuja transcrição é induzida pela
alolactose, um derivado da lactose. Quando a lactose está pre-
sente e a glicose est á ausente, o complexo CAP -cAMP exerce
regulação positiva da transcrição, ajudando a RNA polimerase
.
a se ligar com eficiência no promotor
Com sua compreensã o incipiente da transcrição
enigma do tipo o ovo e a galinha
—
génica do óperon lac , talvez a seguinte pergunta um
tenha lhe ocorrido.
A lactose precisa entrar na célula para que a alolactose
— gene e regiào regulatória e à descrição funcional do
possa ser produzida para agir como indutor. A lactose
não consegue entrar na célula sem a ajuda da permease,
que ajuda a trazer a lactose para a célula. Mas, como o
gene lacY que produz a permease faz parte do óperon
lac e a transcrição não é induzida até a lactose estar
presente dentro da célula , como a lactose entra na cé
lula primeiro? A resposta está na reversibilidade da in -
teração entre a proteína repressora e o operador lac. Na
presença da glicose e na ausência da lactose, a proteína
repressora quase sempre se liga à sequência operadora .
Entretanto, às vezes, e de maneira espontâ nea, a proteí-
na repressora perde contato com a sequê ncia operadora.
Embora de vida curta, essa liberação espontânea é ape
nas suficiente para permitir a transcrição momentânea
do óperon e a produção de algumas moléculas de be-
tagalactosidase e permease. Essa pequena quantidade
de permease e betagalactosidase, somando nào ma is do
que algumas moléculas por célula, é suficiente para
fazer que as primeiras moléculas de lactose atravessem
a membrana celular e gerem alolactose. Esse filete de
lactose induz rapidamente mais transcrição, disparando
uma cascata de transcrição que logo faz que a célula
mude seu metabolismo para utilizar a lactose.
Tabela 14.1 Genes e sequ ências regulat órias do óperon lac
Gene/sequ énda Tipo de produto/ sequénda
Genes produtores de proteí na
lad Proteí na repressora
lacZ Betagalactosidase
lacY Permease
lacA
Sequências reguiat ôrias
Transacetilase
lacO Operador
lacP Promotor
14.3 A análise das mutações decifra a
regulação genética do óperon lac
A identificação e descrição do óperon lac sào atri-
bu ídas a uma série de publicações no in ício dos anos
1960 por Fran çois Jacob, Jacques Manod , André Lwoflf
e vá rios outros colegas. Sua análise genética dos vá rios
imitados do óperon lac levou à identificação de cada
óperon que fizemos na seção anterior. Jacob, Monod e
Lwoff foram agraciados com o Pré mio Nobel em Fisio
logia ou Medicina em 1965 por seu trabalho (ver foto
-
de abertura do capítulo). Seu trabalho també m assen -
tou as bases da descrição da regulação da transcrição do
óperon lac no nível da sequência de DNA. Discutimos
nesta seção vá rias análises dos mutados do óperon lac
e os elementos da análise molecular da regulação trans-
- cricional do óperon lac. À medida que vocé ler essa dis -
cussão, consulte a Tabela 14.1 e a Tabela 14.2 para obter
uma lista dos genes do óperon lac e das sequências re-
gulatórias, bem como um exemplo dos genótipos e fe -
nótipos associados às mutações que discutirmos.
Análise das muta ções g ênicas estruturais
- A análise genética do óperon lac realizada por
Jacob, Monod e colegas foi viabilizada pela indução
das mutações do óperon. Vá rias dezenas de mutados
lac foram geradas pelo tratamento da £ coli com
mutágenos. Primeiro os mutados foram submetidos a
experimentos de complementaçáo genética para de-
terminar se os fenótipos lac de mutados diferentes
'
resultavam da muta ção do mesmo gene ou de muta -
ções de genes diferentes. As investigações mostraram
que os mutados lac formavam dois grupos de comple-
Função Mutados importantes
Contêm dois sítios de ligação, um I —
incapaz de se ligar ao
para o operador e um para a lacto-
se, o indutor
Cliva a lactose em dois monossaca -
——
operador
P incapaz de se ligar ao indu -
tor (alolactose)
Z nenhuma betagalactosi -
rídeos (glicose e galactose) dase funcional
Facilita o transporte da lactose
através da membrana celular
—
Y ~ nenhuma permease
funcional
Protege contra subprodutos dano
sos do metabolismo da lactose
- A~
— nenhuma transacetilase
Liga-se à proteí na repressora para
bloquear a transcrição dos genes
do óperon
O
—n ão se liga à proteína
repressora
Liga -se à RNA polimerase P~ —
não se liga à RNA poli-
merase ou o faz com pouca
intensidade
 Ca pitu lo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos
Tabela 14.2 Síntese da betagalactosidase e da permease pelos haploldes e dlploldes parciais com mutações
gê nicas estruturais
Genótipo Betagalactosidase
Lactose Nenhuma lactose
.
1 /* P O
* 4
rr + +
2.rrcrz-r
3. rp - crrr
. -
A I' P 0' Z' Y / t' P' O Z r +
' Os simDoios e - Irdfccam a produ ção e a n*> procuçío das enzimas f jndonals. respecttvamente.
mentaçáo, indicando que dois genes sào responsá veis
pelo fenótipo lac . Hoje se sabe que os dois grupos de
complementaçào correspondem a lacZ ( betagalactosi
dase) e lacY ( permease ) . tica entre certas cepas lac e também identificou dois genes
A análise da complementaçào foi executada usando
cepas bactenanas diploides parciais que foram pro-
duzidas pela conjugaçào entre bactérias F ( lac ) e F .
Lcmbrc-se de que as exconjugantcs produzidas pela
conjugação F' X F possuem duas cópias de uma parte
4
do genoma e, portanto, são parcialmente diploides. No
caso do óperon lac, a informaçã o reside no cromos
somo bacteriano receptor e a segunda có pia do óperon
é adquirida no plasmídeo F (ver Capítulo 6). O gen ó -
tipo dos diploides parciais é escrito com o segmento
F' à esquerda e o cromossomo receptor, à direita. Os
cromossomos hom ólogos sào separados por uma barra
( /). Por exemplo, o genó tipo de um diploide parcial de-
monstrando complementaçào das muta ções do gene
lac pode ser escrito da seguinte forma:
F /* P O Z iM /74 P* O Z F A*
4 4 4 4 4 4
Analisadas como gen ótipos haploides, cada parte
do genótipo diploide parcial acima produziria o fenó-
tipo lac. O haploide F não tem capacidade para produ -
zir permease ( lacY ) c o haploide bacteriano é incapaz
de produzir betagalactosidase ( lacZ ). A complementa -
ção genética ocorre nesse haploide parcial e o fenótipo
resultante é lac’ (ver Tabela 14.2). A base molecular da
complementaçà o genética nesse caso é que a parte F'
do diploide parcial fornece betagalactosidase por meio
de seu gene lacZ e a parte receptora do diploide par
4
dal fornece permease por meio de seu gene lacY' . Com
base na an á lise das mutações gé nicas estruturais, Jacob,
Monod e colegas concluíram que existem dois genes
produtores de proteína necessá rios para o comporta
mento de crescimento do lac e que os alelos do tipo
4
selvagem do lacZ e lacY geralmente sà o dominantes em
relaçã o aos alelos mutados. A an á lise do mapeamento
da recombinaçào revelou uma estreita ligaçào gené tica
dos trés genes estruturais do óperon lac, mas a ordem
desses genes estruturais ( lacZ lacY lacA ) foi determi
nada , no fim das contas, pela análise mutacional.
467
*
Permease * Descriçã o
Lactose Nenhuma lactose
Tipo selvagem ( tor )
+ Nenhuma betagalactosidase
funcional ( toe )
Nenhuma permease funcional
(t
oe )
+ Resposta do tipo selvagem
através da complementa çào
(toe )
4
Observa çã o gen é tica A aná lise genética dos diploides
parciais do óperon lac identificou a complementa çào gené -
-
estruturais, lacZ ( betagalactosidase ) e lacY ( permease), como
essenciais para o metabolismo da lactose. A ordem dos genes
" estruturais é lacZ- locY- lacA.
Mutações regulatórias do óperon lac
- As mutações dos componentes regulatórios do
ó peron lac alteram a resposta induzível do óperon para
a presen ça de lactose e alolactose na célula. Certas mu -
tações do óperon lac levam a mutados constitutivos,
que nào sào responsivos à presença ou ausência de lac-
tose no meio de cultura. Esses mutados transcrevem
continuamente os genes do óperon, em vez de transcre -
verem os genes de maneira induzível. Outras mutações
regulatórias bloqueiam toda a resposta à lactose e trans-
formam a célula em lac. O mapeamento genético das
mutações constitutivas identificou dois sítios distintos
de mutações constitutivas do óperon lac. lacO e lacl. As
mutações constitutivas do lacO tornam irreconhecível a
sequência de DNA do operador para a parte de liga çào
ao DNA do tipo selvagem da prote ína repressora. Por
outro lado, as mutações constitutivas do lacl resultam
da produção de uma proteína repressora com uma re-
gi ão de ligação ao DNA modificada ( por mutação), que
é incapaz de reconhecer e se ligar à sequência opera -
dora do tipo selvagem. As duas mutações impedem a
- regulação negativa da transcrição do óperon lac.
A descoberta de que existem dois sítios de mu -
tações constitutivas do ó peron lac sugeriu a jacob e
- Monod que um sistema regulatório negativo com dois
componentes exerce controle transcricional dos genes
estruturais. Eles postularam que um sítio de muta ção
constitutiva é o gene que produz uma proteína regu -
-
lató ria e o segundo é um sítio alvo de ligaçào ao DNA
para a ligação da proteína regulatória.
- Mutações do operador A evidência genética indicando
que o operador é a sequência de DNA que se liga à
468 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

proteí na repressora vem da constatação de que as mu

tações do operador lac ( lacO ) são exclusivamente de
- la) / * (tipo seh/agem)
ação cis; ou seja , influenciam a transcrição dos genes
apenas no mesmo cromossomo. No organismo do tipo l A repressora se bga ao
operador quando o indutor
selvagem , o lacl* produz proteína repressora com do-

a?
está ausente e forma um
m ínio de liga ção alostérico (alolactose) e um dom í nio -
complexo indutor repressor
de ligação funcional ao operador. A proteína repressora quando o Indutor está
Proteína repressora presente
usa seu domínio de ligação ao operador para se ligar à lac Alolactose
sequê ncia regulatória e bloquear a transcrição ( Figura
14.9a ). As bactérias com mutações do operador são
constitutivas para a transcrição dos genes do óperon lac ( b) & (mutação constitutiva do operador)
e possuem o genótipo /* P* Cf Z* Y~ ( Figura 14.9b ) A . 7Õ&T
designação Cf do alelo significa uma "mutação consti - i 1 A mutação do sítio do
tutiva do operador! Nos mutados Cf , a sequência nu -
y y operador impede que a
1

ídica da região operadora é alterada e não mais

cleot proteína rep*essora se ligue e
leva à sintese constitutiva do
reconhecida pela proteína repressora do tipo selvagem. óperon fac.
Na ausência da proteí na repressora ligada à sequência Proteína repressora lac
operadora , ocorre a transcrição constitutiva dos genes
do ó peron, sendo produzidas continuamente a betaga -
lactosidase e a permease. ( c) t (mutação da repressora)

Os experimentos cruciais para revelar a natureza lãcõ

de ação cis do lacO foram realizados com diploides par - i T A mutação da proteína
ciais. Primeiro demonstrou se que a criação dos diploi
des parciais pela conjugação de uma cepa lac * consti
-- repressora impede sua
Sgaçào ao operador e prcxAiz
tutiva (/’ P* O Z* Y" ) com uma cepa lac produzindo
' a síntese constitutiva do
óperon lac.
betagalactosidase defeituosa ( I* P* O Z K4 ) n ão altera
4 "
Proteína
a transcrição constitutiva da betagalactosidase. Repare mutada
que o lacO no diploide parcial parece ser dominante
em relação ao lacO \ A dominâ ncia pelo lacO surge (d) / s (mutação super repressora )
porque a transcrição do alelo lacZ * do tipo selvagem
é exclusivamente controlada pela mutação do lacO , já
i
- ,V
A muta ção da proteína
que esses dois alelos estão no mesmo cromossomo. O repressora impede a ligação ao
operador do tipo selvagem não surte efeito sobre o alelo
lacZ porque o DNA do operador é um elemento de
4

ação cis, nào um elemento de ação trans.

j indutor, evitando a formação do
-
complexo indutor repressora
A proteína repressora minada
se liga ao ope ador, impedindo
Mutante super-
-
*

Em um segundo experimento, os alelos lacZ esta repressora

vam em cromossomos diferentes e o genótipo do di
ploide parcial F' /’ P Cf Z Y* / 1' P* O 4 Z 4 Y foi pro
duzido usando duas cepas lac . Neste caso, a cepa F' é
constitutiva para a produção da permease, mas não
produz betagalactosidase funcional devido à mutaçã o
do lacZ. A cepa receptora bacteriana produz betagalac-
tosidase pelo mecanismo induzível do tipo selvagem ,
mas nào produz permease funcional devido à mutação
.
do lacY O diploide parcial produz permease constitu
tivamente, mas a betagalactosidase é produzida apenas
quando a transcrição é induzida pela lactose. Esse resul
tado poderia ocorrer apenas se o operador for um ele-
mento de a ção cis. Nesse caso, o alelo do operador em
cis para Z* é do tipo selvagem , então a produção da be-
tagalactosidase fica sob o controle induzível da sequên
cia operadora do tipo selvagem. Repare que, nesse di
ploide parcial, o operador do tipo selvagem parece ser
dominante em relação ao mutado Cf . selvagem estiverem em cromossomos diferentes, como
A aparente diferença na relação de dominâ ncia dos
alelos O* e Cf é compreensível se o operador lac for
um elemento de ação cis que controla apenas a trans-
crição dos genes na mesma molécula de DNA. Reuni
• a transcrição.
-- F igura 14.9 Mutações regulatórias do lacl e lacO .
(a) Lacl e lacO do tipo selvagem, (b) Mutação constitutiva do
operador ( lacCf ) . (c) Mutação do lacl . (d) Mutação do lacl5
(super-repressora ) do domínio de ligaçã o alostérico.
dos, os dois experimentos revelam que o operador lac
é cis- dominante. O principio da cis- dominâ ncia reflete
- a capacidade do operador para influenciar apenas a
transcriçã o dos genes a jusante. No óperon lac , o alelo
- operador "dominante" pode ser diferente, dependendo
dos alelos carregados pelos genes estruturais em cada
cromossomo. Se ambos os genes estruturais do tipo sel -
vagem estiverem em cis para lacO , o operador mutado
- é dominante porque ele transcreve constitutivamente
- ambos os genes. Ê isso que acontece no primeiro expe-
rimento. Por outro lado, se os genes estruturais do tipo
acontece no segundo experimento, ent ão o alelo lacO' é
dominante porque exerce controle transcricional indu -
zível em um dos dois genes necessários para o metabo -
- lismo da lactose (Tabela 143).
 Capítulo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos
Tabela 14.3 Síntese da betagalactosidase e da permease pelos haplokles e dlploldes parciais com
muta ções regulat órias
Gen ótipo Betagalactosidase
Lactose Nenhuma lactose
1.rro - z- r + +
+ +
4. rp- o*
zr
* Nenhuma transcri ção efetiva,
Mutações constitutivas da proteína repressora A evi
dê ncia experimental que apoia a hipótese de que o gene
repressor produz uma proteína regulatória é prove -
niente da análise dos mutados que transcrevem consti-
tutivamente os genes do óperon lac, em que o alelo mu -
tado é recessivo em relação ao alelo do tipo selvagem.
Para constatar a rela ção de dominâ ncia desses ale
los, primeiro vamos considerar uma célula haploide
com o genótipo I P* O* Z' Y * do óperon lac. Essa célula
transcreve constitutivamente e produz betagalactosi -
.
dase e permease ( Figura 14.9c ) De modo similar , uma
cepa haploide com o genótipo P P* CP Z* Y ~ produz be -
tagalactosidase constitutivamente, mas nenhuma per-
mease é produzida e as bactérias com o genótipo I P*
O* Z‘ Y * produzem constitutivamente a permease, mas
não produzem betagalactosidase.
Por outro lado, um diploide parcial com o gen ó -
"
-
tipo F' P P* O’ Z r / I P* O* Z’ Y expressa as duas
enzimas em sua maneira induzível normal. O alelo P
/
pode estar no plasm ídeo F ou no cromossomo receptor
e surtir o mesmo efeito, inevitavelmente resultando na
dominância de P sobre 7\ Esse resultado indica que o
lacJ produz uma proteína regulatória com ação trans.
Nesse contexto, trans se refere a uma proteí na capaz de
se difundir através da célula e se ligar a uma sequê ncia -
-alvo de açã o cis.
A explicação molecular da capacidade de ação trans
da proteí na repressora lac é que o mutado lad altera
o domínio de ligação ao DNA da proteína, tornando- a
incapaz de se ligar à sequência operadora. Na ausência
do controle negativo, a transcrição é constitutiva. En
tretanto, nos diploides parciais que são P /l , a proteína
repressora como um dom ínio de ligação ao DNA fun -
cional está presente na célula e responde normalmentc
à adiçã o ou remoção da lactose da célula.
-
Muta ções da proteí na super repressora Um segundo
conjunto de mutações da proteí na repressora produz
uma consequência diferente da transcrição do óperon
.
lac Esses mutados produzem proteína repressora mu
tada com um domínio alostérico alterado. As proteínas
mutadas são incapazes de se ligar à alolactose e não são
responsivas à adição ou remoção de lactose das célu
469
Permease Descriçã o
Lactose Nenhuma lactose
+ Transcrição constitutiva devido
à mutação do lact .
+ + Transcriçã o constitutiva devido
à mutação do tacO\
A transcrição não é induzível,
devido à muta ção lad*.
devido à muta ção lacF .
- las. O domínio de ligação ao DNA não é afetado pela
mutação do domínio alostérico; mas, em consequência
do dom ínio alosté rico n ão funcional, as proteínas re-
pressoras mutadas n ão conseguem liberar o operador,
mesmo na prpsença da alolactose.
Os haploidcs e diploidcs parciais com mutações do
- dom í nio alostérico da proteína repressora são identifi -
cados como mutados F e são designados super repres- *
sores. Esses mutados são n ão induzí veis, significando
que a transcrição genica do ó peron não pode ser indu -
zida ( Figura 14.9d e Tabela 143). Haploides com o ge-
nótipo F P~ CP Z* Y* produzem uma proteí na repressora
que se liga normalmentc à sequência operadora; mas,
sem um dom í nio alosté rico funcional, a proteí na não é
removida do operador pela lactose na célula. Esses mu -
tados são lac e n ão podem ser induzidos a metaboli
zar lactose. Culturas de bactérias diploides parciais com
-
o genó tipo F' F P* O* Z* Y* / P P* O* Z* Y* podem ter,
inicialmente, alguma resposta induzível à lactose, mas
essa capacidade é perdida à medida que a proteína re-
pressora mutada se liga às sequências operadoras. Esse
diploide parcial revela a dominância de F sobre 7\
Mutações da sequ ência promotora As mutações das
sequências de consenso promotoras reduzem bas -
tante a transcrição ou podem eliminá -la inteiramente
(ver Figura 8.11). Para conhecer o efeito específico de
uma mutaçã o da sequ ência promotora , geralmente é
necessá rio o teste direto da transcrição no organismo
mutado. As sequ ências promotoras, como as operado-
ras, sáo sequências regulatórias de ação cis e a maioria
- das mutações do lacP reduz sí gnificativamente, e pode
eliminar por completo, a transcrição dos genes lacZ e
.
lacY , que estão situados em cis Isso reduz a produção
de betagalactosidase e permease a um ponto tão baixo
que as bacté rias haploides com o genótipo F P~ O Z * *
Y* são lac .
A Tabela 14.4 resume as condições da transcrição
genica do óperon lac , considerando a presença ou au -
- sência de glicose e lactose. A transcrição ativa dos genes
do ó peron ocorre apenas quando a glicose está esgotada
na célula e a lactose está presente. Nessas condições,
- ocorrem os seguintes eventos:
470 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Tabela 14.4 Condições da transcrição do óperon lac
Glicose Lactose cAMP Alolactose
Presente Ausente Ausente Ausente
Presente Presente Ausente Presente
Ausente Ausente Presente Ausente
Ausente Presente Presente Presente
1. O n ível de AMP cíclico sobe em consequência da
disponibilidade de adenilciclase.
2. O complexo CAP-cAMP se forma e se liga ao sítio
CAP do promotor lac.
3. A alolactose é produzida por uma reação colateral
do metabolismo da lactose pela betagalactosidase.
4. A conformação da proteína repressora é modificada
pela interação com a alolactose, fazendo que a pro-
te í na se libere a partir da sequê ncia operadora , per -
mitindo assim a transcrição gènica do óperon.
Para testar sua compreensão do óperon lac , ver a
An á lise Genética 14.1, que vai guii- lo pela análise de al
guns mutados do óperon lac.
Observa çã o gen é tica Os mutados do operador lac,
incapazes .
de se ligar à proteína repressora exibem transcri -
ção constitutiva pela atividade ds. A aná lise das mutações da
proteí na repressora revela dois dom ínios funcionais na proteí-
na de ação trans. As mutações do promotor loc impedem de
modo eficaz a transcriçã o pela ação crs.
Análise molecular do óperon lac
Nos 50 anos desde que Jacob, Monod e colegas des
creveram sua análise genética do óperon lac, a análise
molecular identificou as sequências de DNA de seus com-
ponentes ( ver Figura 14.6b). Essa e outras informações
moleculares acumuladas criam um quadro praticamente
completo da regulação da transcrição do ó peron lac , reve-
lando que ele é um pouco mais complexo, mas totalmente
coerente com a descrição apresentada anteriormente.
A Observaçã o Experimental 14.1 discute duas par-
tes importantes da evidência molecular experimental deri-
vada das análises de proteção da impressão digital do DNA
que dizem respeito à regulação tianscricional do óperon
lac. A primeira observação é que a posição de ligação da
proteína repressora no operador lac se sobrepõe à posição
de ligação promotora da RNA polimerase. Essa observa
ção apoia a hipótese de que a ligação da proteí na repres-
sora bloqueia a ligação da RNA polimerase e a iniciação da
transcrição e, pelo contrá rio, quando a proteína repressora
nâo se liga à sequência operadora, a RNA polimerase con-
Transcri çáo do Explicaçã o
óperon lac
Basal A glicose está presente para fornecer energia.
Basal A glicose está presente para fornecer energia; a
ausência de cAMP impede a regulação positiva
da transcrição.
Basal Forma se o complexo CAP cAMP, mas nenhum
indutor está presente para bloquear a ligação da
proteí na repressora na sequê ncia operadora.
Alta Indutor e CAP-cAMP dispon íveis para induzir e
regular positivamente a transcri ção.
segue acessar e iniciar a transcrição na sequ ê ncia promo-
tora. A segunda observação identifica três segmentos dis-
tintos de sequência de DNA operadora. Esses segmentos
operadores, designados O ., 02 e Oy interagem de forma
diferente com a proteína repressora e o resultado das inte -
rações proporciona um mecanismo pelo qual a ligação da
proteína repressora consegue bloquear o acesso da RNA
polimerase à sequência promotora.
A análise molecular suplementar revela que a pro-
teína repressora é uma proteí na homotetramérica for
mada pela união de quatro polipeptideos idênticos com
-
.
360 aminoácidos ( Figura 14.10 ) Os quatro polipeptideos
- -
são unidos em suas extremidades C terminais e dispos -
.
tos como dois feixes idênticos Uma extremidade de cada
feixe forma um domínio de ligação à sequ ência operadora
de DNA e a outra extremidade forma o dom í nio alosté -
rico. Os três segmentos da sequência operadora de DNA
que são alvos da ligação da proteína repressora compar
tilham uma sequência repetida invertida conservada de
-
.
21 pb Em cada sequência, um par de bases central G C -
Dom í nios de liga ção à sequê ncia operadora de DNA
-
- Dom ínios alostéricos
Figura 14.10 Estrutura homotetramérka da proteí na
repressora lac . Os dom í nios de ligação à sequência
operadora e os dom í nios alostéricos se formam em lados
opostos da proteína.
 Ca pitulo 14 Regulação da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 471

AN Á LISE GENÉTICA
Avalie os seguintes diploides parciais do óperon fac . Indique se a produçáo da betagalactosidase
funcional do lacZ e da permease do facY é 'induzível", "constitutiva ’ ou "não induzível” para cada
1

diploide parcial.
«. tr&rr/rrcrrr
b. r r o r r / r F O r Y' -

c rroz - r /p r o r r
Estrat égias de solução Etapas da solu çã o
Avaliar
.
1 Identifique o tópko abordado por .
1 Este problema diz respeito a uma análise dos padrões de regulação da transcri-
este problema e explique a natureza ção e à produção de betagalactosidase funcional e permease pelos genòtipos
da resposta solicitada . do óperon. A resposta exige uma determinação da forma de produção das enzi-
mas: induzí vel, constitutiva ou de modo algum .
.
2 Identifique as informações críticas .
2 Os genòtipos do óperon lac de très diplokies parciais são fornecidos,
fornecidas no problema.
Deduzir
3. Descreva as consequências de quais- 3. A mutação t produz uma proteí na repressora Incapaz de se ligar à sequência
quer mutações no genótipo a. .
operadora A mutação Zr não vai produzir betagalactosidase funcional e a mu -
.
-JL
tação Y não vai produzir permease funcional
r
Olc : PrtmMroiraikaimutaçôrsrpgubft óriai;
*
dcpo»v conuòcrr as consequências da transcri
.
ç &o do gene cstrutuf il.

.
4 Descreva as consequências de quais- .
4 A mutação O altera a sequência operadora e impede a ligação e a repressão
quer mutações no genótipo b. transcricional pela proteína repressora. As mutações Z~ e Y bloqueiam a produ-
ção de betagalactosidase funcional e permease.

.
5 Descreva as consequências de quais-
quer mutações no genótipo c
.
5 A mutação P produz uma proteína super-repressora que possui um domínio
. alostérico alterado e que não vai interagir com a alolactose. (7 e Z alteram a
'

função conforme descrito anteriocmente .

Solucionar Resposta a

.
6 Determine o padrão de expressão .
6 A proteína repressora do tipo selvagem tem atividade trans e se liga à sequência
das enzimas fundonals para o di- .
operadora do tipo selvagem Essa sequência operadora de ação ds bloqueia a
ploide parcial a . transcrição de Z* e quando a lactose não está na célula, mas permite a trans-
.
crição quando a lactose está presente Portanto, as duas enzimas são produzi
das por indução .
Resposta b
.
7 Determine o padrão de expressão .
7 O* tem atividade cis sobre Z\ resultando em transcrição constitutiva. Y* está sob
das enzimas fundonais para o di- o controle transcricional de atividade ds de O . Portanto, a betagalactosidase é
ploide parcial 6. produzida constitutivamente e a permease é produzida por indução.

Resposta c
.
8 Determine o padrão de expressão .
8 A sequência de O' não é reconhedda pela proteína repressora do tipo selvagem
das enzimas fundonais para o di- ou pela super -repressora. Ambas as repressoras têm sequências de ligação ao
ploide parcial e . DNA do tipo selvagem. A sequência de O0 com atividade cis transcreve consti-
tutí vamente Y\ A super repressora se liga a O* e sua atividade ds torna Z' e Y*
.
não induzívers Portanto, a betagalactosidase é não induzível e a produçáo de
permease é constitutiva.

Para praticar mais, ver Problemas 5.16, 17 e 18 .

472 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Observa çã o Experimental 14.1

As proteínas regulatórias se ligam à s sequências regulatórias do óperon lac

A análise de proteção da impressão digital do DNA contra
DNase I do tipo descrito na Técnica de Pesquisa 8.1 (ver página
271) tem sido utilizada para identificar precisamente os locais de
ligação da proteína repressora lac relativos ao local de ligação da
RNA polimerase na região regulatóna do óperon lac. Recorde,
na descrição anterior dessa técnica, que o controle idêntico e os
fragmentos de DNA experimentais contendo sequências regu
latórias são marcados nas extremidades com "P. Os fragmentos
experimentais são expostos a proteinas de ligação ao DNA, mas
os fragmentos de controle, não. Todos os fragnrventos são ex -
postos à DNase I que digere aleatoriamente os segmentos não
protegidos pelas proteínas ligadas. Os fragmentos de DNA di
geridos pela DNase I resultantes são separados pela eletroforese
em gel para revelar a 'impressão digital' da proteção proteica.
A figura aqui mostra os resultados da análise da impressão
digital de um segmento de 123 pb da região regulatóna do ópe-
ron lac da posição 4- 39 até -84.0 DNA de controle na primeira
faixa O não está protegido por proteína. O gel mostra que as
regiões promotoras protegidas pela O RNA polimerase e pela
O proteína repressora lac se sobrepõem parcialmente uma à
outra. As posições relativas dessas regiões protegidas por pro-
teí na são coerentes com o modelo de que a ligação da proteina
repressora consegue interferir na ligação da RNA polimerase.
A análise separada da impressão digital por DNase I da
região operadora lac detecta tr ês segmentos de sequência de
DNA que sáo protegidos pela proteína repressora lac O Oy,
Or A faixa do gel exibida é o DNA de controle não ligado à
proteína e, portanto, é um DNA desprotegido. A análise ex-
perimental identifica um segmento protegido, designado Of ,
como a sequência operadora principal. As outras duas regiões
da sequência de DNA operadora protegida por proteína são
- designadas 02 e Or As faixas d até g do gel de proteção da
impressão digital do DNA são protegidas por proteína repres-
sora e exibem lacunas na impressão digital, correspondentes
a esses elementos da sequência operadora.
As faixas do gel também identificam duas regiões, desig-
- nadas Cr e Cy protegidas da digestão da DNase I pelo com-
.
plexo CAP-cAMP Esse segmento contém as sequências de
consenso do sítio de ligação à CAP que se sobrepõem par -
cialmente às regiões operadoras O, e Or As posições relativas
desses sítios de ligação à proteína indicam dois tipos de in-
terações entre as proteínas que se ligam à promotora lac e à
operadora. Primeiro, quando o CAP-cAMP está ligado ao sítio
de ligação da CAP, a RNA polimerase ganha um maior acesso
à sequência promotora, estabelecendo as condições para
a transcrição eficiente dos genes do óperon lac. Segundo, a
sobreposição da região de ligação à CAP com O, sugere que,
quando a proteína repressora está ligada ao DNA, o complexo
CAP-cAMP não consegue se ligar, impedindo com isso a regu -
lação positiva da transcrição.

o n on on
n ab cd e fg
84

O DNA na faixa \ é digital Sequência

totalmente digerido, operadora
já que foi adicionada secundária
uma proteina que
não se l»ga ao DNA

-»-1
I Sequência
operadora
primária
+10 %
Os espaç os em nranco na
bka 2 ir dicam proteção da
RNA polimerase centra a
I
digestão dos nucleotideos
peia DNase L

Na faixa 3, a proteína + 20
repressora protege os Sequência
nudeotíceos operadora
secundária

+39

Impressão digitai da RNA polimerase

, _ 3'
5
3' ^-84l

+39 5'
Região -35 Região -10
Análise de proteção da impressão digital pela DNAase I Impressão digital da proteína repressora lac a
das regiões e do modelo do lacP e lacO. ligação ao DNA.
 Ca pitu lo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 473

(a)

Alça de
Proteí na DNA
repressora
0> 0
ou

Proteí na
repressora
-
5' AATTTCACACA 3 *
hd ... : .íacZ ..
AACAI
rÍCI AT IGt I AAA Ô tGlGI 5
'

-10 +1 Par de bases + 20 (b )

L
central G C -
Regi ã o de 21 pb

O ,
TRepet »ções Invertidas J
Figura 14.11 A região O, do facO cont ém uma sequência
repetida invertida. O par de bases central G-C é o ponto de
articulação dessa regi ão de simetria nudeot ídica dupla de
uma sequência repetida Invertida.

encontrasse no ponto médio de um eixo de simetria duplo

.
( Figura 14.11) Em ambos os lados do par de bases central Repressora lac Repressora lac
G-C estão sequências repetidas invertidas de 10 pb cada
que são o local de ligação especifico dos polipeptídeos
em cada metade da proteína repressora. Mitchdl Lewis e
colegas examinaram a estrutura cristalina da proteína re -
pressora ligada ao DNA em um estudo de 1996 e determi -
naram que a prote í na repressora tetramérica se liga a 0{ e
0? e induz a formação da aiça de DNA que aproxima as Figura 14.12 Ligaçã o da proteína repressora fac.
.
regiões O , e 03 ( F igura 14.12) A estrutura da alça de DNA repressora às regiões 0, e 0í do
( a ) A liga ção da prote ína
contém parte do promotor lac e impede a transcrição blo- locO forma uma alça de DNA que Inibe a ligação da RNA
queando o acesso da RNA polimcrasc. polimerase ao lacP. (b) O modelo de estrutura cristalina da
Experimentos paralelos examinando sequências de ligação da repressora em locO.
DNA operadoras que sofreram mutação revelam como as
mutações constitutivas da sequência operadoras são pro-
vocadas por alterações da sequência de DNA na região
Or A Figura 14.13 mostra várias substituições de pares de
bases que provocam mutações constitutivas da sequênda
operadora. Cada uma dessas alterações provoca perturba -
ções na simetria dupla de Ot , impedindo que a sequênda Proteí na
seja reconhedda pela proteína repressora. Uma vez que repressora
,
O é o alvo principal de ligação da proteína repressora, e O ,
precisa estar ligada antes da ocorrência da ligação de 03, a
mutação de Ol também atrapalha a ligação a Or A inca
pacidade da proteína repressora para se ligar à sequênda
- -10
0|C do tipo
s' Íá rt ( í GiG6
j 3'
operadora mutada significa que a alça de DNA repressora 5 LWMCACACCTTAACACTCG CTATTGTTAAAGTGTGt 5’
selvagem
da transcrição não consegue se formar. Por sua vez, isso I 11111 1 1
deixa a sequênda promotora incapaz de se ligar à RNA 5'
polimera.se e abre a porta para a transcrição cont Comutados
ínua e
^ a g
para a expressão constitutiva dos genes do óperon lac.
Figura 14.13 Mutações constitutivas da sequência
Regulação positiva e negativa do óperon operadora (O*). Oito mutações por substituição de pares
de bases na região O, do lacO produzindo mutações
da arabinose
constitutivas da sequência operadora. Cada mutação
Como uma última ilustraçã o do papel das proteí nas perturba a simetria dupla das sequ ê ncias repetidas invertidas
regulatórias no controle positivo e negativo da transcri- da operadora e impede a liga ção da prote ína repressora lac.
474 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) ponsáveis pelo metabolismo da arabinose. A transcrição

Sequência promotora desses genes é controlada de modo induzível e o óperon
Transcrição *—
para araC
- Transcrição ara é um sistema óperon induz ível.
araC Pc A arabinose é metabolizada pelos produtos pro-
r H i teicos de três genes do óperon ara , araB, araA e araD,
y.1 Esses genes produzem um RN Am policistrónico que tem
FTFJM C
DNA
RNAm I Transcrição
RNAm I um mecanismo único de controle transcricional ( Figura
14.14). A transcrição dos genes do óperon ara é contro-
lada por uma sequência promotora (P ) e também por
policistrónico
^ ^
três sítios operadores: arai, araO } e araOr A proteína re -
[ Tradução
* - Domínio de ligação 1 1 <12 gulató ria do óperon ara é a araC, o produto do gene araC,

*
à arabinose dentro da qual está situada a sequência operadora araOr
proteína
Ugador
£2 O gene araC tem a sua própria sequência promotora (Pr ),
araC Proteí nas: araB araA araD
Domínio de ligação que se sobrepõe à sequência operadora araOr O gene
ao DNA araC é adjacente ao óperon ara , com um sítio de ligação à
CAP separando Pc de arai e resto do óperon ara.
( b) Em 1989, Robert Schleif e colegas propuseram um
araA araB araD modelo de alça de DNA para explicar a regulação do
i
.
Arabinose -1*- - Rlbulose - i- Ribulose -I • o-xllose - GUcóllse .
óperon ara O modelo de Schleif propõe uma estrutura
5-fosfato 5-fosfato que é reminiscente das alças de DNA formadas quando
Figura 14.14 Óperon arabinose [ ara ) e metabolismo da a proteína reprcssora se liga ao operador lac (ver Figura
arabinose. (a ) A proteína regulatória araC é codificada pelo 14.12a ). Uma característica especial do modelo de Schleif
gene araC sob o controle da sequência promotora Pc A araC é a proposição do duplo papel que a proteína araC de-
se liga a três regiões regulatórias: araOx , ora02 e arai. Os três sempenha no controle positivo e negativo da transcrição.
genes do óperon, araB , araA e araD, são transcritos como um Na ausê ncia de arabinose, o modelo de alça de DNA de
RNAm policistrónico a partir da sequê ncia promotora Pm. ( b) Schleif prevê que a proteína araC vai se ligar às sequên -
As proteí nas araA. araB e araD catalisam etapas diferentes do cias operadoras arai, araO } e ara02 ( Figura 14.15a ). Um
metabolismo da arabinose . homod ímero da proteína araC se liga em ara01 e mo-
n ômeros da araC se ligam a arai e araOr As proteínas
ção, voltamo- nos para o sistema óperon de arabinose araC ligadas em arai e araO , ligam -se uma à outra, in-
( ara ) , em que uma ú nica proteína regulató ria executa duzindo a formação de uma alça de DNA. Esta impede
tanto a regula ção transcricional positiva quanto a nega - a ligação da RNA polimerase a P , bloqueando assim a
^
transcrição dos genes do óperon ara. Além de bloquear
tiva. A arabinose é outro dos açúcares alternativos que
as bactérias usam como fonte de carbono quando a gli
cose está esgotada e o óperon ara contém os genes res
-- a transcrição gênica do óperon, o dímero araC ligado a
araOl ocupa o sítio de ligação à RNA polimerase de Pc
( a ) Arabinose ausente Figura 14.15 Regula ção transcricional
Nenhuma negativa e positiva do ó peron ara pela
Pç -» transcri ção proteí na araC. ( a ) Nenhuma arabinose.
oraO, araO, ( b ) Arabinose presente.
Monômero araC
Alça de
DNA Nenhuma

CAP site arai

-
i transcriçã o

.
O araC se liga ao araQ e ao arai para promover a formação de uma
^
.
al a de DNA e hibir a transcrição dos genes do óperon Um dímero
araC se liga ao oruO para inibir avida mais a transar ão do araC

( b ) A/ abinose presente
Arabinose

^
cAMF NA polimerase
\ CAP \r
— Transcrição

Nenhuma transcriçã o —* PQ
A arabinose se liga à proteína araC e quebra a alça de DNA entre oroO .
e arai. Uma molécula addonal de proteína araC se Sga ao oral O
complexo CAP-cAMP se liga ao CAP site e a RNA polirrerase
transcreve os geres do óperon.
 Capítulo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos
e impede a continuação da transcrição de araC. Quando
a arabinose está ausente do meio de cultura, a araC age
como uma proteína de controle negativo que suprime a
transcrição genica. A combinação da alça de DNA su
pressora da transcrição e da repressão do araC significa
que, na ausência da arabinose, o óperon ara é desligado
pelo controle transcricíonal negativo da proteína araC.
Quando a arabinose está presente, ela se liga às pro-
teínas araC em todos os trés sítios operadores ( Figura
14.15b), Isso rompe a conexão entre as proteínas araC
em arai e ara02 e destrói a alça de DNA que suprime a
transcrição do óperon ara. Após o rompimento da alça
de DNA, um segundo complexo formado pela proteína
araC e pela arabinose se liga em arai, produzindo díme -
ros araC-arabinose em arai e araOt que ladeiam o sítio
de ligação à CAP. Assim como na ativação transcricional
do óperon lac , a CAP precisa formar um complexo com
a cAMP e se ligar ao sítio de ligação à CAP para ativar a
transcrição gènica do óperon ara. A formação do com
-
plexo CAP cAMP ocorre quando a glicose está ausente.
O grande complexo formado por dímeros de araC-
- arabinose predsa se ligar em arai e araOjt e o complexo
CAP-cAMP precisa se ligar no sítio de ligação da CAP,
para que a RNA polimerase se ligue de modo eficiente e
inicie a transcrição em Com esses complexos esta -
belecidos, o óperon ara é transcrito e as proteínas B, A e
D, necessá rias para metabolizar a arabinose, são produ -
zidas. Nesse caso, a araC exerce controle transcricional
.
positivo sobre a transcrição do gene ara Na presença da
arabinose e na ausê ncia da glicose no meio de cultura, a
-
araC opera em conjunto com o CAP cAMP para trans
crever araB, araA e araD no óperon ara.
14.4 A transcrição a partir do
óperon do triptofano é
repressível e atenuada
Os óperons lac e ara são exemplos de óperons in
duzíveis que produzem proteí nas responsáveis pela
quebra dos açúcares que são fontes alternativas de
energia quando nào há glicose. Os óperons como o lac
e o ara que estão envolvidos no catabolismo das fon
tes alternativas de energia são tipicamente induzíveis,
já que são convocados quando a glicose está esgotada
e o açúcar alternativo está dispon ível. Por outro lado,
os óperons envolvidos nas vias anabólicas ( vias que sin
tetizam os compostos necessá rios para a célula ) podem
ser regulados por mecanismos de feedback negativo que
operam por meio da atividade do produto final da via
para bloquear a transcrição gènica do ó peron . Os ó pe-
rons desse tipo sã o óperons repressíveis.
Além do mecanismo de feedback negativo, certos
óperons repressíveis têm uma segunda capacidade regu
latória, conhecida como atenuação, que consegue fazer
o ajuste fino da transcrição para se adequar aos requisi
tos momentâneos da célula, alcançando um estado mais
ou menos constante de disponibilidade de compostos. A
475
diferença entre atenuação e capacidade de indução pode
ser esclarecida por uma analogia. Os óperons induzíveis,
como o lac ou o ara, são semelhantes a um interruptor
- de luz que fornece iluminação em uma configuração
(“ligado") e nenhuma iluminação na configuração alter-
nativa (“desligado"). Os ó perons induzíveis são ligados
e desligados por interruptores moleculares controla -
dos por proteínas de ligação ao DNA. A atenuação, por
outro lado, funciona mais como um interruptor do tipo
dimmer que permite o ajuste incremental da ilumina-
ção. Para vários óperons de aminoácidos, a regulação da
expressã o gè nica evoluiu para manter n íveis estáveis de
aminoácidos nas células. Nesses sistemas, a inibição por
feedback desliga a transcrição gènica do óperon quando
o aminoácido está imediatamente disponível e a atenua -
ção faz o ajuste fino do nível de aminoácido para manter
uma concentração constante.
- Inibição por feedback da síntese
do triptofano
O óperon triptofano ( Irp) no genoma da £ coli con-
tém cinco genes estruturais que compartilham uma região
regulatória contendo uma sequência promotora ( trpP ),
uma sequência operadora ( trpO ) e uma região líder
( trpL ) que contém a região atenuadora ( Figura 14,16). A
região regulatória abrange 312 pares de bases e os cinco
genes estruturais abrangem aproximadamente 6.800
pares de bases. Os cinco genes estruturais transcritos no
óperon são trpE, trpD, í rpC, trpB e trpA, nessa ordem.
- Juntos, os produtos proteicos desses genes são responsá -
veis pela síntese do aminoácido triptofano. Fora do ópe-
ron, um sexto gene, trpR , codifica a proteína repressora
que não é ativada até formar par com o triptofano.
A transcrição dos genes do ó peron trp é regulada
por um sistema de inibição por feedback que responde
ao triptofano livre na célula. Nesse sistema , o triptofano
age como um correpressor ligando-se e ativando a pro-
- teí na repressora trp que nã o é ativa sem seu correpressor
ligado. A inibição por feedback ó o principal mecanismo
que liga e desliga a transcrição gènica do óperon trp ( Fi
gura 14.17), Na ausência do triptofano, a proteína re-
-
- pressora inativa é incapaz de se ligar ao trpO , ocorrendo
a transcrição gènica do óperon. No entanto, quando o
triptofano está presente, ele se liga à prote í na repressora
para ativá- la e o complexo repressora-correpressor se
- liga à sequência operadora para bloquear a transcriçã o.
Com base nessa descrição, e conhecendo a inibição
por feedback da transcrição gènica , pode-se prever que
as bactérias trpR , que são mutadas para a proteína re -
pressora, exibam transcrição constitutiva dos genes do
ó peron , independentemente da presença do triptofano.
-
No entanto, surpreendentemente não é isso que acon
tece. Nas bactérias do tipo selvagem { trpR' ), a síntese
-
do triptofano é muito baixa quando ele está presente na
- célula; mas, embora a síntese do triptofano pelas cepas
trpR seja mais alta nas mesmas condições, ela não
ocorre em 100% da capacidade (Tabela 14.5). As duas
476 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 14.16 Ôperon Sitio de terminação

triptofano ( trp). A transcrição 0 Pb. 162 pb , /da transcrição
é iniciada a partir da sequência |^ 6.800 pb

promotora e passa peia O trpO trpB

região líder do triptofano i
( frpí ) para transcrever os cinco Promotor i
Operador Região Transcriçã o
genes do óperon [ trpE até trpA ) atenuadora
em um RNAm polkistrõnico. Região l í der
Os produtos proteicos dos
genes do óperon catalisam RNAm
etapas sucessivas da síntese polidstrônico Líder
do triptofano. Tradução
PoWpeptfdeos
I
Antranilato
I
Antranilato PRA Isomerasc Triptofano
I
Triptofano
sintase sintase InGP sintetase sintetase 3 sintetase a
componente I componente II i
(PRA sintetase)

T
Complexos enzimáticos

Reações
catalisadas
Corismato
+ Glutamlna
AntranHato
+ PRPP
PRA — — ^—1
CdRP InGP
+ Serlna
Triptofano

PRPP - fosfombosil pirofosfato

PRA fosforribosil antranilato
CdRP = 1 -(o-carboxlfenllamí r>o)-l-desoxlrrlbose 5-fosfato
InGP = indo»- 3-glkerol fosfato

cepas, trpR' e trpR , sintetizam o triptofano em 100% da Atenuaçã o do óperon trp

capacidade quando ele está ausente. Isso sugere que um
segundo mecanismo regulatório também está afetando O segundo mecanismo que regula a transcrição
a transcrição dos genes do óperon trp. gênica do óperon trp é a atenuação, que é controlada
pelo dobramento alternativo empreendido pelo RNAm
sintetizado a partir da região trpL de 162 pb. A RN A po-
li merase se liga ao trpP e inicia a transcrição da trpL. A
( a ) Triptofano ausente região trpL contém quatro sequências de DNA repeti
das e o transcrito de RNAm contém repetições comple-
-
Transcrição
trpE tfPC trpA mentares, assim como sequências de códon de início e
parada para um polipeptídeo curto de 14 aminoácidos
RNAm cuja tradução desempenha um papel central na atenua -
polidstrônico
ção (Figura 14.18a). Duas característ í cas da regiã o trpL
são cr íticas para sua função de atenuação. A primeira

Repressora
-
A refxessora riath a não se liga ao
trpO, ocorrendo a transcrição dos
genes do óperon.
são as quatro sequê ncias repetidas, designadas 1, 2, 3 e
4, que conseguem formar estruturas de haste em al ça
(inativa) diferentes (Figura 14.18b). ( As estruturas de haste em

(b ) Triptofano presente
alça sã o discutidas no Capitulo 8 vinculadas à termina -
ção intrí nseca da transcrição nas bact é rias; ver Figura
j- X * Nenhuma transcrição
~
8.7). A segunda delas é que, entre os códons dos 14 ami -
tn 3 trpC trpA noácidos codificados pelo trpL RNAm, existem dois có-
Repressora dons triptofano um após o outro ( UGG ), que agem na
t' ativa detecção da disponibilidade de triptofano.

W'S +
Repressora
A repressora é ativada pelo tnptnfano
correpressor e se Hga ao trpO para bbquear
a transcrição do gene do óperon.
Tabela 14.5 Porcentagem de expressão plena do
triptofano para as cepas trpR* e trpR ‘

Ç) Triptofano (correpressor ) Triptofano presente Triptofano ausente

Figura 14.17 Regulação da transcrição do óperon trpR' 8% 100%
trp pela proteína repressora. (a ) Triptofano ausente ,

(b) Triptofano presente. trpR 33% 100%

 Ca pitu lo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 477

(a ) Regiã o atenuadora trpL

Termina ção da
Pausa transcrição
1
r i r í
Região 1 2 3 4
RNAm do operon trp 5' J IKíIRf U6 A, m*
Códon de Iníck) CÓdon5 Códon de Antiterminaçào Códon de
trp parada da transcrição in ício do frpf
T
Regtáo l íder codificadora de pept ídeo

Possíveis estruturas de
© ©
haste em alça do RNAm 1 2 2 3

Pausa Antiterminaçà o Terminação

( b) TrpL RNAm
Fim da sequência
codificadora trpL
* Parada
fé
Ser K
Thr -
J
Região 1
Arg -
Trp Sequência de terminação
rica em U
rrp - (apenas a haste em alça 3 4) *

5* N giHJ
Lys Met Gin Thr
1 L 1 1
10 Leu ir
Met
20
ZÀ 150 C A A A Ç A i 3'
I62
\
Inicio da sequência
Inido da sequência 30 40 codificadora trpE
codificadora trpL
Figura 14.18 Região atenuadora trpL e o RNAm. (a ) A trpL atenuadora conté m quatro sequências repetidas invertidas
que codificam as regióes 1 a 4 no trpL RNAm. Três hastes em alça alternativas podem se formar no RNAm. ( b ) A sequência
de atenua ção trpL RNAm conté m 162 nudeotideos. O poss ível pareamento de bases entre as regióes atenuadoras e a
sequência de codificação do polipept ídeo da trp l íder são exibidos.

A formação das hastes em alça do trpL RNAm está
ligada diretamente à continuação ou terminação da
transcrição dos cinco genes do óperon trp. No RNAm da
região trpL , a regiã o 1 é complementar à 2, a região 2 é
complementar à 3 e a região 3 é complementar à 4. Duas
dessas estruturas de haste em alça, a haste em alça 3 4 e
a haste em alça 2- 3, são fundamentais para a atenuação.
O terceiro tipo de haste em alça, a haste em alça 1 2 , de
sempenha um papel pouco importante na atenuação.
-
A haste em alça 3 4 do RNAm, que é a haste em
al ça de terminação, sinaliza a terminação da transcri -
ção. Isso é identificado como sítio de terminação da
transcrição na Figura 14.16a. A forma ção da haste em
alça 3-4 interrompe o avanço da RNA polimerasc ao
longo do DNA, terminando a transcrição na região l íder
antes de chegar aos genes estruturais do óperon ( Figura
14.19a ) .
Repare que a região 4 é seguida imediatamente
por uma sequência poli - uracila ( uma cauda poli- U) .
—
Essa configura çã o uma haste em al ça de RNAm se-
—
guida por uma cadeia de uracilas é a mesma descrita
- na conexão com a termina ção intr ínseca da transcrição
nas bactérias (ver Capítulo 8). A formação da haste em
- - -
alça 3 4 pode ser precedida pela formação de uma haste
-
em alça 1 2 que consegue induzir uma pausa no pro -
cesso de atenuação. A formação da haste em alça 1 2 -
deixa apenas a região 4 para formar par com a regiã o 3.
Por outro lado, uma haste em alça 2-3 do RNAm, que
é a haste em alça de antitermina çào, se forma quando
a região 1 está indisponível para pareamento imediato
com a região 2; a formação dessa haste em al ça impede
478 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Figura 14.19 Formação (a) Abundâ ncia de triptofano: terminação

da haste em alça de RNAm
da trpL . (a ) Na abundância
de triptofano, a haste em £
alç a 3-4 (terminação) B
<
termina a transcrição apó s
.
a cadeia poli-U (b) Na falta l Ribossomo ê
.
de triptofano a haste em
alça 2 - 3 (antiterminação)
c‘" “ \ IA
leva à síntese do RNAm
policlstrônico.

-A
GÂ
/
JGGUGGCGCACUUCR; AÀCGGGCAGUCUÀUUCACCAUG -JC*
Regi ã o 1 U

Códons: Trp Trp Arg Thr SerParadd

C yUUUUUUU trpE
10 11 12 13 14 C C
A 6
Região poli| G G
de 14 aminoáodos Região 3 CHG Regi ão 4
C C
0 ribossomo completa a tradução da sequência C- G
cxxl ócadoratrpie ocupa asregiões 1 e 2 As G A
regiões 3 e 4 pareiam e a transcrição termina. C U

Q
( b ) Falta de triptofano: ant í termina ção

Ribossomo
AcU CAu
U C
A C
U-A
C-G
U C
Região Q Q Regiã o

^ Região 1
2
C G
5 ç
AC
_
—
Regi ão 4
3

UGGUGGCGCACUUCt íSTAACGG - C UAÀAUAUAGCGGGAUUUUUUUU trpE

Códons: Trp Trp Arg Thr SerParadd
10 11 12 13 14 O ribossomo para na região 1 e as regiões
2 e 3 pareiam A transcnçáo continua nos
Regiào ( MiBSpt
KJ ica genes do óperon
dc 14 aminoáodos

a formação da haste em alça 3-4 ( Figura 14.19b ). A haste
em alça de antíterminação permite que a RNA poli-
merase continue a transcrição através da regiã o l íder e
nos genes estruturais do ôperon trp , começando com
a transcrição do trpE. Se a transcrição passar da região
4, é produzido um RNAm policistrònico abrangendo
cinco genes do trp , A tradução das cinco enzimas ne-
cessá rias para a síntese do triptofano se segue.
Cada RNAm transcrito a partir do óperon trpL
acaba formando uma haste em alça 2-3 ou 3-4; mas o
que determina o tipo de haste em alça de RNAm que vai
se formar? A ligação da transcrição e da tradução, que
é uma caracter ística proeminente da expressão gé nica
bacteriana, desempenha um papel crítico na decisão
desse resultado. A transcrição da região trpL começa no
nucleotídeo + 1 após a RNA polimerase iniciar a trans -
crição. A transcrição através das regiões repetidas 1 e
2 pode levar à formação de uma haste em alça 1 2 que
para temporariamente o avanço da RNA polimerase
- .
A pausa é apenas momentâ nea; entretanto, ela dura o
tempo suficiente para um ribossomo se ligar no códon
de início da trpL e começar a tradução do polipeptídeo
de 14 aminoácidos, começando pelo códon AUG identi -
ficado na Figura 14.18. A iniciação da tradução rompe a
-
haste em alça 2 3, a RNA polimerase retoma a transcri
ção e o ribossomo e a RNA polimerase começam junta
--
mente sua progressão .
Observe três caracter ísticas do RNAm l íder retra -
tadas na Figura 14.19b: (1) A sequência codificadora dc
polipeptídeo se sobrepõe inteiramente à região l íder 1 e
 Capítulo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos
o códon de parada é imediatamente adjacente à região
2; ( 2) os códons 10 e 11 do RNAm especificam o tripto -
fano, tomando a realização da tradução dependente da
disponibilidade de triptofano; e (3) a regiã o 4 é seguida
imcdiatamcntc por uma cadeia poli- U, uma caractcrís-
tica associada à terminação intr ínseca da transcrição. À
medida que a transcrição e a tradução conjuntas avan
çam, as posições relativas da RNA polimerase e do ri
bossomo são determinadas pelo grau de eficiência com
que o ribossomo avança pelo RNAm. Esse processo, por
sua vez, está ligado diretamente à disponibilidade de
triptofano e à rapidez com a qual o triptofano é inserido
na cadeia polipept ídica nascente. Quando a célula tem
um suprimento adequado de triptofano, o ribossomo
avança continuamente ao longo do trpL RNAm , che
gando ao códon de parada, onde parcialmente sobrepõe
a região 1 e a região 2. Simultaneamente, a RNA polime -
rase está transcrevendo a regiã o 3, seguida pela regiã o 4.
Com uma parte da região 2 ocupada pelo ribossomo e
indispon í vel para o pareamento em uma haste em alça,
a região 3 forma uma haste em alça com a região 4, o
ú nico segmento de RNAm complementar dispon ível.
A haste em alça 3- 4, sendo seguida imediatamente por
-
uma cadeia poli U, faz que a transcrição termine espon
taneamente no fim da região 4 pelo processo intrí nseco.
A formação da haste em alça 3- 4 (a haste em alça de
terminaçã o) interrompe a transcriçã o do óperon trp na
sequência líder antes que a RNA polimerase alcance o
início do gene trpE. Desse modo, a transcrição cessa
apenas quando o sistema detecta que não há mais ne
cessidade de triptofano para abastecer a tradução.
Quando a célula é privada de triptofano, o supri
mento de RNAtti> carregado é baixo. O ribossomo é
obrigado a pausar momentaneamente nos códons 10 e
11 e esperar a chegada de um RNAt de triptofano car-
regado que vai incorporar o triptofano no polipept ídeo
nascente. Quando o ribossomo pausa , sua massa cobre
-
a região 1. Nesse meio tempo, a RNA polimerase con
.
tinua a transcrever o trpL À medida que a RNA poli
merase transcreve a região 3, essa região encontra uma
parceira complementar na regiã o 2, levando à formaçã o
da haste em alça 2-3. A região 3 não é seguida por uma
-
cadeia poli U, impossibilitando a terminação intr ínseca.
A transcrição continua pela região 4 e na região gé
nica estrutural do óperon para produzir o transcrito de
RNAm policistrònico do óperon. A formação da haste
em alça 2-3 ( a haste em alça antiterminação) permite
assim a transcriçã o e a tradu çã o das enzimas necessá
rias para sintetizar o triptofano quando o sistema de-
tecta que o suprimento de triptofano dispon ível é insu -
ficiente para dar suporte à tradução.
Cada trpL RNAm toma uma “decisã o” baseada em
molécula quanto a formar uma haste em alça 3-4 ou
-
2 3, dependendo da disponibilidade de RNAtti> carre -
gado no momento em que o RNAtwp é exigido pelos ri
bossomos. É provável que cm qualquer dado momento
uma ú nica célula bacteriana contenha uma mistura de
trpL RNAm com hastes em alça 2- 3 e trpL RNAm com
479
-
hastes em alça 3 4. O equilíbrio pende para mais hastes
em alça 3-4 e menos hastes em alça 2-3 nos níveis mais
altos de concentração do triptofano e pende para o sen -
——
tido oposto mais hastes em alça 2-3 e menos hastes
em alça 3-4 quando a concentração do triptofano cai.
O ajuste fino resultante permite que cada célula man -
- tenha uma concentração relativamente constante de
- triptofano aumentando ou diminuindo sua síntese para
satisfazer as necessidades da célula.
Observaçã o genética Atenuação é o mecanismo que
ajusta a taxa de transcrição dos genes do óperon para satisfazer
as necessidades de uma célula. A atenuação do óperon trp é con-
trolada pelo tipo de haste em alça do trpL RNAm que se forma na
- resposta direta à disponibilidade de triptofano na célula.
Mutações de atenuação
O modelo de atenuação é suportado pelos experi -
mentos de mutagènese. Por exemplo, os experimentos
em que um dos dois códons de triptofano adjacentes
( nas posições 10 e 11 do trpL RNAm ) foi alterado por
- mutação de sentido trocado para especificar outro ami-
noácido forneceram evidências da importâ ncia dos có
dons de triptofano sucessivos no transcrito da trpL A .
-
mutação de um códon UGG de triptofano afeta a capa -
cidade de resposta da atenuadora ao triptofano. Se os
dois códons de triptofano forem alterados por muta-
- ções de sentido trocado, a atenuadora não detecta mais
a concentração de triptofano e, cm vez disso, detecta a
- disponibilidade do aminoácido codificado pelos códons
que sofreram mutação. Os experimentos de mutagènese
também visaram às regiões 3 e 4 da sequê ncia líder ( Fi-
gura 14.20). As substituições de bases que reduzem a
porcentagem de pares de bases complementares que se
ligam a essas duas regiões desestabilizam a haste em alça
- de terminação e reduzem a eficiência do sistema óperon
- mutado na repressão da transcrição génica estrutural.
Restante do
trpL RNAm
- Posiçã o de nudeotídeo 110 - A
C
Cadeia poli U -
’ 1401
c ,/T) U U U U Ú U
- __| GRCG - .
—
Região 3 < 5<*- U Região 4
—
y G
A CHG A C
A G C
U Jc í G Muiações que reduzem
/ \j \ a complementaridade
125
- Figura 14.20 Muta ções do trpL. As análises mutaclonais
identificam várias substituições de base na trpL que
diminuem a eficiência da regulação transcricional na região
atenuadora atrapalhando a formação da haste em alça 3-4.
 480 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Ô peron htí:
úBpI
Ô peron (eu:
Leu Leu LíUWWBIÍ 37/
ôperon pheA:
ôperon tfir.
W5)lTO®(|F
Pbe Ptie Phe Phe PheMTí phe
^ii^Wr ThrThrThr t ^ Thr 'I^ThrThrWW'I
)
-
' Jj
Figura 14.21 Quatro óperons de aminoácidos bacterianos
.
com controle atenuador da transcrição O amiooárido
regulatório de cada ôperon é exibido em negrito.
Atenuaçã o em outros sistemas ôperon
de aminoácidos
A atenuação reprime a transcrição dos genes estru
turais em vá rios sistemas ôperon de aminoácidos nas
bactérias, como a £ coli e a Salmonella typhimurium.
Assim como o ôperon trp , esses outros óperons de ami
noácidos também contêm vários códons para o aminoá -
.
cido-alvo em seus transcritos lideres ( Figura 14.21 ) Por
exemplo, o polipept ídeo líder do ôperon histidina da £
coli contém uma série de sete resíduos de histidina con -
secutivos na regiã o atenuadora. De modo similar, o poli -
peptídeo líder fenilalanina conté m sete resíduos de feni-
lalanina em um intervalo de nove aminoácidos na região
atenuadora. Assim como o ô peron trp, esses óperons
usam a atenuação para formar hastes em alça de termina
ção para regular a transcriçã o génica do ôperon. A Aná lise
Genética 14.2 examina as mutações do ôperon trp.
14.5 As bactérias regulam a
transcriçã o dos genes de
resposta ao estresse e também
regulam a tradução
A necessidade de as bactérias responderem rapi
damente às mudanças nas condiçòes ambientais sugere
que a regulação da transcrição precisa acomodar tanto
as circunstâncias comuns quanto as raras, e també m
que a regulação da tradução deve estar disponível sob
certas circunstâ ncias. Esta seção apresenta exemplos de
regulação transcr ícional nas bactérias em condiçòes ra -
ramente encontradas e conclui com exemplos de como
as bactérias regulam a tradução.
Fatores sigma alternativos e resposta
ao estresse
Os mecanismos de ôperon descritos até este ponto
sã o exemplos de estratégias regulatórias empregadas pelas
células bacterianas em condiçòes que elas encontram ro-
tineiramente. No entanto, em resposta a circunstâ ncias
ambientais raras ou incomuns, as bactérias mudam os pa-
drões de transcrição génica para usar genes que normal-
mente não são expressos. A resposta da £ coli ao estresse
térmico ilustra como a expressão de um fator sigma (a)
alternativo altera a transcrição genica ativando a transcri-
ção de genes especializados em resposta ao estresse.
A Escherichia coli cresce vigorosamente a 37° C e
consegue tolerar apenas uma estreita variaçã o de tem -
sacelera
—
peratura. Em baixas temperaturas, seu crescimento de-
uma razão importante para a refrigeração
ser utilizada para preservar os alimentos. No outro ex-
tremo, as altas temperaturas matam as bacté rias. Essa
é a razão para o cozimento ser tão eficiente na redução
da contaminação bacteriana do alimento. Nas tempe-
raturas menos radicalmente elevadas de 45° C, a £ coli
muda seu padrão de transcrição ativando a expressão
dos genes que fazem parte da resposta ao choque té r-
mico pela célula. A resposta ao choque térmico protege
as células da £ coli contra certos tipos de danos induzi -
dos por calor. Mecanismos semelhantes são comuns em
- - -
outros microrganismos e també m nas moscas da fruta ,
plantas e animais, incluindo o homem .
A resposta ao choque té rmico nas bactérias envolve
- a expressão de um fator sigma (o) alternativo, que
muda a capacidade de reconhecimento do promotor
pela porção central da enzima RNA polimerase. Recorde
que a porção central da enzima RNA polimerase se liga a
um fator sigma para formar a holoenzima ( ver Capítulo
8). Em condiçòes de crescimento normais, a holoenzima
RNA polimerase reconhece as sequê ncias promotoras
bacterianas contendo a caixa de Pribnow rica em AT no
sítio -10. O fator sigma comum, identificado como or70,
- forma essa holoenzima que transcreve uma ampla gama
de genes bacterianos em condiçòes fisiológicas normais.
As bactérias cultivadas a 45u C sofrem várias mu-
danças, incluindo a iniciação da expressão das proteí -
nas de choque térmico, que são expressas apenas em
alta temperatura , e as proteínas chaperonas, uma classe
de proteínas que dobram novamente ou degradam ou -
tras proteínas danificadas por alta temperatura. Nessas
temperaturas mais altas, tr 3 é instá vel e a RNA poli-
merase que o contém funciona muito mal. Para expli -
- car a transcrição das proteínas do choque térmico na
presença da RNA polimerase contendo a70 e com mau
funcionamento, os pesquisadores rapidamente propu
seram e encontraram evidências gen éticas apontando
-
para um fator o alternativo de alta temperatura.
A evidência proveio de estudos da £ coli mutada e
sensível à temperatura que cresce normalmente a 37° C,
mas não consegue se desenvolver a 45u C. Essa sensibi-
lidade à temperatura é uma mutação condicional letal
que afeta um gene chamado rpoH , que codifica um fator
sigma alternativo conhecido como o32. Quando o o32 se
liga a uma porção central da enzima RNA polimerase, a
holoenzima reconhece sequências promotoras diferentes
das reconhecidas pelas holoenzimas contendo o73 ( Figura
14.22 ). Ao contrário do alto teor de AT que caracteriza a
sequ ê ncia da caixa de Pribnow das promotoras bacteria -
-
nas, a região 10 das promotoras reconhecidas pela RNA
polimerase que contém o33 é rica em pares de base G - C.
A sequ ência promotora para rpoH é reconhecida
pela RNA polimerase contendo o70 quando a tempera -
 Ca pitu lo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 481

(a )
Sequê ncias promotoras
nas proteínas chaperonas. Nas temperaturas de cresci
mento normais, várias prote ínas chaperonas se ligam à
-
-35 -10
pequena quantidade de cr13 presente na célula para ini -
Reconhecidas por:
i ’ .
. . •
••
•

-16-18 Ptx-
( b) Em temperatura elevada
Porçã o central da enzima RNA
rpoH RNAm ]
. conhecem as sequências promotoras exclusivas e transcre-
Transcreve os geres
do choque térmsco
Figura 14.22 Fatores sigma alternativos para os genes
do choque térmico, (a ) Sequências promotoras reconhecidas
por oJV e aÀJ contendo RNA polimerase. (b) Em temperatura
elevada, o"e o* transcrevem o rpoH, que codifica o on
.
que, por sua vez se junta à porção central da enzima RNA
polimerase para transcrever os genes do choque térmica
tura está alta. O pol í pept ídeo traduzido a partir do rpoH
RNAm é muito ativo na estimulação da transcrição dos
genes do choque térmico. Alé m disso, a transcrição de
um terceiro fator sigma , conhecido como o34, que nor
malmente está presente nas células da £ coli em um
nível muito baixo, é bastante elevada. A holoenzima
RNA polimerase contendo or34 també m reconhece a
sequência promotora do rpoH e transcreve o gene em
temperaturas elevadas que inativam o a70
Uma segunda mudança transcricional que ocorre
em consequência da alta temperatura é uma alteração
l.ll.f.1 bir sua capacidade para formar holoenzima. Em tem -
peraturas elevadas, as prote ínas chaperonas liberam
cru, deixando-o livre para se unir à porção central da
enzima RNA polimerase e formar uma holoenzima. As
proteínas chaperonas livres são redirecionadas para se
ligar às proteínas celulares danificadas pelo calor. Nesse
papel, as proteí nas chaperonas degradam as proteí nas
ás quais se ligam ou ajudam a redobrá las - .
Foram descritos vários outros exemplos do uso de
fatores sigma alternativos nas bactérias. Por exemplo, o
Bacillus subtilis é uma bactéria que normalmente se pro-
paga pelo crescimento vegetativo, mas as más condições
de crescimento mudam o modo de crescimento para es-
porulaçào, ativando a expressão de fatores sigma alterna -
tivos. A evidência da transcrição gènica mostra que, com
a deterioração das condições de crescimento, a transcrição
do fator sigma comum é substituída pela transcrição de
dois fatores sigma alternativos. Os novos fatores sigma re-
vem os genes usados na esporulação. Uma ampla gama de
evidência mostra que a mudança da transcrição do fator
sigma normal para os fatores sigma alternativos induz a
uma mudança no padrão de expressão de todo o genoma
que silencia os genes anteriormente ativos e inicia a trans-
crição de genes especializados que são utilizados apenas
em condições de crescimento restritivas ou extremas A .
Tabela 14.6 compara e diferencia os mecanismos da regu-
lação génica nos sistemas bacterianos.
Observa çã o gen ética Os fatores sigma alternativos
causam mudanças na expressão génica de todo o genoma ao
permitirem a transcrição dos genes cujos produtos são neces-
sá rios apenas em circunstâ ncias extraordiná rias.
-
Regulação da tradução nas bactérias
A regulaçã o da transcrição é disparadamente o
modo predominante de controle da expressão gé nica
. nas bactérias, mas elas també m sã o capazes de regular
a traduçã o. A regulaçã o da tradução ocorre por meio
de dois mecanismos, um que liga uma proteína a um

Tabela 14.6 Mecanismos de regulação transcricional nas bactérias

Mecanismo Ações e resultados
1. Controle específico do óperon Substâ ncias indutoras, como a lactose, e mecanismos de feeàback negativo, como a
disponibilidade de triptofano, regulam a transcri ção gênlca nos óperons controlados
coordenadamente.
2. Controle CAP-cAMP O complexo CAP-cAMP é utilizado como um regulador positivo da transcrição dos genes
em vá rios óperons diferentes, incluindo os óperons lac e ara.
3. Fatores sigma alternativos Condições de crescimento extremas, como o estresse térmico e a inaniçáo, induzem
a transcriçã o de fatores sigma alternativos que transcrevem exclusivamente os genes
induzindo uma mudança global na transcrição, afetando o genoma Inteiro.
482 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
Descreva os efeitos sobre a atenuação e a síntese do triptofano das seguintes mutações dos còdons
de triptofano ( UGG) na regtáo atenuadora do óperon.
a. Os códons de triptofano são alterados para UAGUGG .
b. Os códons de triptofano são alterados para UUGUUG.

Estratégias de solu çã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 identifique o tópico abordado por .
1 Fste problema diz respeito à s consequências das mutações para os códons UGG
este problema e explique a natureza ( triptofano) na região atenuadora do óperon trp. A resposta exige uma descri*
da resposta solicitada. ção das consequê ncias mutacionais sobre a regulação e a sí ntese do triptofano.
2. identifique as informações cr íticas 2. As sequências de códons mutados sã o fornecidas,
fornecidas no problema.
Deduzir
3. Examine a natureza da mutação na 3. A substituição de bases no mutado (a ) cria um códon de parada no lugar do
parte (a ). primeiro códon de triptofano.

4. Examine a natureza da mutação na 4. Duas substituições de bases são vistas no mutado (b). Cada uma delas cria um
parte (b ). códon de leucina em vez de um códon de triptofano.
Solucionar
s) Descreva a consequ ência da muta - .
5 UAG é um códon de parada que para a tradução do polipeptideo. A localizaçã o
ção na parte (a ). desse códon de parada vai impedir que o ribossomo cubra a região repetida 2 .
Mci: Compare d tMnvur çio do óperon do A haste em alça 2 3 é a ú nica configuração regulatória que consegue se formar
*

tipo setoçem com à de&se òp*ron mutado e vai levar á síntese constitutiva do triptofano.
.
(ver Figuras 14.18 é 1420)

6. Descreva a consequ ência da muta
ção na parte ( b).
- 6. Os dois códons mutados neste caso codificam a leudna. Essas altera ções muta-
dona ís vão Impedir a atenuação do óperon trp em resposta ao n ível de tripto-
fano. Em vez disso, a sí ntese do triptofano vai atenuar em resposta ao n ível de
leucina , já que a disponibilidade de leucina a ser acrescentada ao polipeptideo
vai determinar qual haste em alça vai se formar.

Para praticar mais, ver Problemas 7, 15 e 25.

RNAm para impedir sua tradu çã o e outro que pareia de
modo complementar o R\rA antissentido com o RNAm
para bloquear sua tradução.
As proteínas repressoras da tradução regulam
-
a tradução ligando se ao RNAm nas vizinhanças da se
quência de Shine-Dalgamo. A ligação da prote ína nesse
local interfere no reconhecimento da sequência de Shine
- Dalgamo pelo 16S RNAr na pequena subunidade ribos-
sômica e, assim, impede a iniciação da tradução. Um dos
exemplos mais claros desse tipo de interação entre prote-
ína regulatória e RNAm é visto na regulação da tradução
.
das proteínas ribossómicas na £ coli As proteínas ribos
sòmicas são codificadas em uma série de óperons que
produzem RNAm policistrô nicos. Esses óperons estão
sujeitos a um certo grau de regulação transcricional, mas
o controle mais proeminente da tradução das proteínas
ribossómicas ocorre no nível da tradução. Um dos pro-
dutos proteicos de cada óperon de proteína ribossó mica
consegue se ligar ao RNAm policistrônico desse óperon,
perto da sequência de Shine- Dalgarno mais para 5’, im
pedindo, assim, a ligação da pequena unidade ribossó-
mica com o RNAm policistrônico e inibindo a síntese das
proteínas codificadas pelo óperon.
A tradução bacteriana també m pode ser inibida pela
- atividade do RN A antissentido, uma molécula de RN A
complementar a uma parte de um RNAm específico. A
- ligação de um RNAm por um RNA antissentido impede
a ligação do ribossomo ao RNAm e bloqueia a tradução.
Foram descritos vá rios exemplos de regulação da tradu -
ção bacteriana pelo RNA antissentido. Um dos primei
ros mecanismos de controle antissentido da tradução
-
- prové m da regulação da produção de transposase pela
sequência de inserção bacteriana IS10. A transposase é
uma enzima que conduz o movimento dos elementos
genéticos transponíveis nos genomas ( ver Capí tulo 13) .
A transposase corta o DNA para remoção ou inserção
do elemento transponível. Um baixo nível de transposi
ção pode ser tolerado pelos genomas bacterianos e pode
-
até mesmo ser vantajoso ( ver Capítulo 12). No entanto,
- a expressão excessiva de transposase leva à transposi ção
 Capítulo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos
RNAm da transposase
nalSW
5' 1
Hri iini
5' 3 í>
3* < 5'
Pour
Região codificadora
de transposase
na /SJO RNA antissentido.^"
ndISIO
RNAm da
s
transposase
5' [W.m.T.1ir»r.f.117;AUCAG /L'»rTT«r.T.TrAJ &.TI
na IS 10
RNA 3'
^2Z 53
antissentido
na l$ 10
Figura 14.23 Controla da expressão da transposase 1510
pelo RNA antissentido.
igualmente excessiva, que pode provocar mutações letais
em virtude da inserção do transposon em genes críticos.
A sequê ncia de inserção ISJO contém duas regiões
promotoras. Uma, chamada PL f é relativamente fraca
% deira em um processo chamado ciclo lítico ( ver Figura
e controla a transcrição da fita de DNA que codifica a
transposase ativa. A segunda sequ ência promotora ,
é muito mais forte. Essa promotora está embutida no
gene transposase e dirige a transcrição da fita nào codi
ficadora do gene, produzindo um RNA antissentido que
é complementar à extremidade 5' do RNAm da transpo-
sase e cobre a sequência de Shine- Dalgamo do RNAm,
evitando, assim, seu reconhecimento pela pequena su -
bun í dade ribossómica ( Figura 14.23 ). Como consequên -
cia da promotora POUT mais forte, o RNA antissentido
na IS10 é mais abundante que o RNAm da transposase.
A consequência disso é que a maior parte do RNAm da
transposase se liga ao RNA antissentido e impede efe-
tivamente a traduçã o de quase todo o RNAm da trans-
posase. Contudo, às vezes um RNAm da transposase es-
capa da ligação antissentido e sofre tradução. Isso gera
um baixo nível de transposase que inicia o evento raro
de transposição da IS 10 dentro do genoma bacteriano.
Observa çá o gen é tica As proteínas represso ras da tra- -
du ção e os RNA antissentido regulam a tradu ção nas bactérias
visando a transcritos específicos para a inibição regulatória.
14.6 Os antiterminadores e
repressores controlam a infecçáo
por fago lambda da E. coli
Bacteriófagos (ou fagos, para abreviar) sào vírus que
infectam as células bacterianas. Assim como todos os
vírus, eles precisam infectar as células hospedeiras para
se reproduzirem. Seus genomas min úsculos nào con
tê m todos os genes necessá rios para replicação, trans -
crição e tradução, então os fagos são parasitas obrigató -
rios que usam um conjunto engenhoso de truques para
483
realizar esses três processos moleculares. O segredo de
seu sucesso reprodutivo reside em sua capacidade de
recrutar proteínas e enzimas bacterianas para expressa -
rem preferencialmente os genes do fago em detrimento
dos genes bacterianos.
Dado o conteúdo limitado de genomas de fago,
alguns dos genes mais importantes para a reprodu ção
dos fagos são os que redirecionam a atividade dos genes
hospedeiros bacterianos para atender à s exigê ncias dos
fagos. A infccçáo fagocítica bem - sucedida requer (1)
que os interruptores gen éticos regulatórios sejam con -
*
*
trolados por meio da expressã o gê mea do fago para
redirecionar a ação dos genes hospedeiros e (2 ) que a
expressão genica do fago inicie uma sequência de even-
tos que levam a bactéria a participar na expressão da
informação gen ética do fago. Em nenhum bacteriófago
existe um quadro claro dos processos que controlam a
comutação genética regulat ória no fago lambda ( X ).
Recorde que todos os bacteriófagos são capazes de
infectar e se reproduzir dentro da célula bacteriana hos-
pedeira. A infecção termina com a lise da célula hospe-
6.16). Porém, certos bacteriófagos conhecidos como
fagos temperados, dos quais o fago X é um exemplo,
também são capazes de passar por um ciclo lisogènico,
- -
ou lisogenia. O ciclo lisogènico é caracterizado pela inte
gração do fago no cromossomo hospedeiro, convertendo
o hospedeiro em um lisógeno. A integração iisogênica é
específica ao sítio, significando que ela ocorre em uma
sequência compartilhada pelo fago e o hospedeiro bac
teriano ( ver Figura 6.20). A enzima de fago integrase é
-
responsável pela integração iisogênica. Nesta seção, dis-
cutimos os dois ciclos de vida do fago X, examinando as
prote í nas regulatórias que controlam qual ciclo de vida
uma determinada infccçáo vai empreender, bem como
as ações das proteínas que controlam cada ciclo de vida.
Genoma do fago lambda
O genoma do fago lambda é composto de aproxi-
madamente 48 kb de DNA linear de fita dupla que co-
difica aproximadamente 60 genes ( Figura 14.24 ). Sua
injeção em uma célula bacteriana hospedeira leva a uma
circularizaçào imediata dentro da célula hospedeira , ob-
tida pela união de duas extremidades coesivas (cos) de
fita simples, com 12 nucleotídeos de comprimento cada
uma. Uma DNA ligase do hospedeiro veda as lacunas
deixadas quando as extremidades coesivas se unem e
produzem um fago X circularizado que está pronto para
começar a expressão génica.
O genoma do fago X é organizado como uma série
de óperons. Os genes em cada óperon são expressos em
uma sequência bem definida. A expressão dos genes
em certos óperons começa imediatamente após a cir-
- cularizaçáo. A ordem específica da expressão gé nica é
fundamental para a capacidade do fago X para realizar
a infecção bem -sucedida de seu hospedeiro bacteriano.
Consequentemente, certos genes precoces sào expres -
484 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

(a) Regulador da
Regulador expressão génka
do gene d
Regulador dos
.
deA c/ efní
Proteínas de
replicaçã o do DNA
dofago

Proteínas de Regulador dos

recomblnação genes tardios
do fago
< ,,
O P 0* P* Origem Proteínas
Exctslonase replícaçáo dellse
(para excisâo do
cromossomo) xti
P, Corte do DNA
Integrase
(para integração
int - Nu ; no sitio cos para
Fago lambda empacotamento
no cromossomo) A Termmase
com 48.502
nucleotWeos

Genes para as
proteínas da
cabeça e montagem

Genes para as
proteínas da cauda
e montagem
(b)
Extremidade coesiva
5' A S G T C G C C G C C C 1
T C C A G C G G C G 6 6 5’

II
AGGTCGCCSCCC
Extremidade coesiva
Figura 14.24 Mapa genômico do fago X (lambda )
(a) 0 genoma do fago A é organizado em óperons que
funcionam em momentos definidos durante a infecçâo de
.

uma célula hospedeira, (b) O sítio coesivo (cos) é a região que

permite que o cromossomo do fago linear se torne circular
quando entra na célula baeteriana hospedeira.

sos logo depois da circularização, enquanto os genes
tardios são expressos mais adiante no ciclo infeccioso.
Os segmentos reguladores da transcrição dos óperons
também são organizados em regiões precoces e tardias.
Imediatamente após a circularização do cromossomo
do fago X, as sequências promotoras c operadoras pre
coces controlam a transcrição dos genes cujos produ -
tos proteicos interagem para determinar se o fago passa
pelo ciclo lítico ou pelo dclo lisogênico ( ver Capítulo 6).
O dclo lítico resulta em uma infecçâo de rá pida progres
são que leva à lise ( ruptura ) da célula hospedeira e à libe
ração de uma progénie com dezenas de fagos. No eido de
vida lisogènico, por outro lado, o cromossomo do fogo se
integra no cromossomo hospedeiro, como foi observado
anteriormente. A expressão dos genes no cromossomo
do fogo integrado (o prófago) é mínima; apenas os genes
necessá rios para manter a lisogenia são expressos. A re-
plicação do cromossomo bacteriano produz células filhas
que carregam uma cópia do prófogo. A lisogenia continua
até o fogo exdsar a si próprio em seu sítio de integração,
rcativando a expressão genica do fago e o ciclo lítico.
Transcrição genica precoce
Na circularização do cromossomo do fago, os pro-
- dutos proteicos dos genes precoces do fago X se envol -
vem em um cabo de guerra molecular pelo controle de
um interruptor genético que determina se a infecçâo vai
resultar em um ciclo l ítico ou em um ciclo lisogènico.
-
- No começo de cada infecçâo, a transcrição começa em
duas regiões promotoras precoces do fogo A. A promo-
tora precoce Pg controla a transcrição para a direita dos
genes precoces, começando pelo gene cro (que significa
controle da repressora e outras) que produz a proteína
cro (Figura Bá sica 14.25, O). A promotora precoce P ,
controla a transcrição para a esquerda, começando pelo
gene N , que produz uma proteína antiterminadora que
- desempenha um papel fundamental no estabelecimento
da lisogenia O.
 Ca pitulo 14 Regulação da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 485

FIGURA B ÁSICA 14.25

Regulação da entrada do bacteriófago no ciclo lítico ou lisogênico

A proteína N é produzida pela transcrição de PL . O A transcrição de Pu produz cro

P, cWft 0< Oyj Orj P/i cro t », Pm cN O
71

RNAm
I RNAm “
i
© A proteína N age como
um antiterminador para i i © 0 acúmulo da
estender a transcrição
Q proteína cro leva
além das sequências de
terminação f e t
* *
. Proteína N Proteína cro
1 ao ciclo lítico

Desenvolvimento do ciclo lítico

0 0 O,,
O
Proteína cro
* *
RNAm 1 RNAm
1
Q
Proteína clll Proteína dl
O A proteí na cro se liga a Ot e 0 e inicia a transcrição
da proteína Q; a cro bloqueia *a transcrição de cl . A
transcrição dos genes para a esquerda de Ot leva à
© 0 acúmulo do/
complexo cll dll
.
montagem da partícula do fago e a transcrição dos
genes para a direita de O leva à expressão dos
leva ao ciclo lisogênko . genes tardios . *
Desenvolvimento do eido lisogênico

It
Proteína cll/dll

I 1
PidHU vi«eu
771
O A ligação do complexo Q A ligação do complexo
cll/dll a Pt leva à cll/dll à Pv leva à expressã o
de cl, a proteí na repressora
expressão da integrase,
que estimula a
integração do prófago
.
Á bloqueando a síntese de
cro e permitindo sua
própria síntese.
486 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O interruptor genético que dispara a via Lisogénica (a )

começa com a ligação da proteína N antiterminação a d 4*04 cro
três sequ ências de DNA de termina ção da transcrição:
tL, tgl e í (ver Figura 14.25, O). Quando nã o está li-
tt
gada à proteí na N, a sequê ncia de terminação t . age no Pm P,
bloqueio da transcrição para a esquerda alé m de M No
outro sentido, tgl e tiP > impedem a transcrição para a di- Ogj Ou Oj

—
reita além de cro ou alé m dos trés outros genes precoces
dl , O e P. Entretanto, quando a proteína N se liga a
tL, tg , e vários genes à esquerda de tL e à direita de tg
e são transcritos. Uma das proteínas produzidas pela
1
çl
Transcrito

( b)
17 pb 17 pb 17 pb
cro
Transcrito

transcrição para a esquerda é a integrase (o produto do

RNA polimerasc
gene int ) , que é necessá ria para a integração do prófago
no cromossomo bacteriano. No outro sentido, a trans- d Ou Ocj O» , cro
crição para a direita produz a proteí na cil , que forma
um complexo com a proteína cIII, um dos produtos da
j Transcrito
cro

transcrição para a esquerda. ) untos, o complexo cll/clll Pm P

(O
se liga à sequência promotora P . ( RE significa consti-
^
tuição da repressora, do inglês repressor establishment) RNA polimerase
O. Essa sequência promotora inicia a transcrição do d Ou Ou Oui cro
gene cl para a esquerda , produzindo a proteína cl, que
també m é conhecida como proteí na repressora X ( Fi - " J
gura 14.25, O e O). O complexo cll /clll també m se liga
Transcrito ^
a PL para ativar mais sí ntese da integrase. Pm Po
Figura 14.26 Transcri ção dos genes cro e d do fago
Proteína cro e ciclo lít í co .
X (a ) As sequências promotoras Pn e P LI se sobrepõem a
A entrada no ciclo lítico requer a transcrição dos
genes tardios regulados pelas sequê ncias promotoras e
— —
[

três sítios operadores O 0„ e 0„, que são ligados

operadoras tardias. Esses genes estão à direita de Pg e
estã o envolvidos na síntese das proteí nas da cabeça e da
cauda, bem como os produtos que lisam a célula hospe
deira. O interruptor genético que determina se o fago X
entra no ciclo lítico ou no ciclo lisogénico depende da
ligação da proteína cro e da proteína repressora X, res
pectivamente 0. Tanto a prote í na cro quanto a proteína
repressora X t êm afinidade pelas sequências operadoras
Ofl , Ok , e O , situadas entre Pg e PA M, mas possuem afi-
í
^ ção e efeitos de transcrição opostos (ver
nidades de liga
Figura 14.25 O). Essas três sequências operadoras pos
suem cada uma um alvo de 17 pb para a ligação da pro
te ína cro ou da proteína repressora X. A sequência Og , se
situa totalmente dentro de Pg e a sequê ncia se situa
totalmente dentro de P Ow é dividida entre as duas
^
sequências promotoras ( Figura 14.26).
O produto da proteína cro é um monômero de 66
aminoácidos que forma uma estrutura globular. A pro-
teína cro funcional é um homodímero que abrange pre
cisamente os 17 pb de DNA que são sua sequé ncia alvo -
de ligação nas operadoras. A proteí na cro dimerizada
tem afinidade de ligação muito forte e igual por Ota e
.
0#/, mas afinidade menor por Ogl No entanto, à me-
dida que a concentração de proteí na cro aumenta, ela se
liga a 0 gf e Og ) , nessa ordem .
A presenç a da proteína cro nas sequências opera
doras bloqueia o acesso da RNA polimerase à região
PgKi , exercendo controle negativo da transcrição do
gene cl e evitando a produção da proteína repressora X.
competitivamente a proteí nas regulatórias. ( b ) O gene cro
é transcrito a partir de e leva à via lltica se sua Influ ê ncia
predominar, (c) O gene d è transcrito a partir de PRW e leva à
via lisogénica se prevalecer.
-
Ao mesmo tempo, a ligação da proteína cro exerce con
trole positivo sobre P levando à transcrição reforçada
-
- de cro e de outros genes ^ que estão à direita de Pg Entre.
esses genes à direita , está Q, um gene que produz a pro-
teí na Q, que é uma reguladora positiva da transcriçã o
dos genes tardios que estão à direita da promotora tar -
- dia Pg. Esses genes tardios incluem os genes que codifi-
-
cam as proteínas da cabeça e cauda do fago e també m
os genes necessá rios para a lise da célula hospedeira.
Proteína repressora À e lisogenia
A proteí na repressora X é o produto do gene cl. Essa
proteí na é um polipeptídeo de 236 aminoá cidos con -
tendo 92 aminoácidos no domínio C - terminal (amino-
ácidos 1- 92), 105 aminoácidos no domínio N - terminal
(aminoácidos 132-236) e os 39 aminoá cidos restantes
-
(93 131) ligando os dois domí nios. A prote í na repres -
sora X funcional é dirncrica e os monô meros estã o li-
gados em suas extremidades C - terminais. Os d ímeros
resultantes té m uma dimensão que abrange 17 pb de
- DNA, precisamente o tamanho de cada sequê ncia ope-
radora ( Figura 14.27a ) .
A estrutura da proteína repressora X é similar à
da proteína cro e as duas proteínas visam aos mesmos
 Capítulo 14 Regulaçã o da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos 487

segmentos operadores, mas com padrões opostos de (*)

Monómero Dí mero de
.
afinidade A afinidade de ligação da proteína repres - de repressora repressora
sora X é maior por 0R! e Or e menor para O.j. Por
1 - (
Aminoácidos inativo
) ( ativo)
tanto, a ligação da proteína repressora X com os ope- -

A
132 236
radores ocorre na ordem Or í , Ofi , e Okr A ligação a 0R , 93- 131
e exerce controle negativo sobre PR, bloqueando o
1 -92
acesso da RNA polimerase a cro , Q e aos outros genes
à direita de Pg . Essa regulação negativa bloqueia a
transcrição necessá ria para iniciar o ciclo iítico. A li- 17 pb
gaçã o da proteí na repressora às sequê ncias operadoras
inicia o controle positivo da transcrição em PRM e leva ( b)
RecA RecA
DMA
à transcriçã o cont í nua de cl que mant ém a repressã o. Cativa danificado ativada^
Ela também ativa a a çã o da integrase, provocando a
inserção do cromossomo do fago no cromossomo
P
hospedeiro, ponto em que o genoma do fago X é re
lativamente quiescente. A regulação positiva contínua
-
da expressão do gene cl pela repressora X serve para
manter o estado lisogé nico e é a ú nica atividade gen é- (0
RNA polimerase
tica no prófago. o
^
Indução lisogênica
A lisogenia é um estado semi per manente que pode
ser mantido por um longo per íodo pela ligação per
manente da proteí na repressora X com Ogl , Og , e Ogr
-
° L cl PHM Ofu Õ fcWl
— cr
° pfft c{l O
Transcri ção do ao

Figura 14.27 Manutenção e terminação da lisogenia

PAQ PfiSRRZ

.
A persistê ncia do estado lisogénico por per íodos pro - ( a ) A proteí na repressora X homodim érlca se liga às
longados levanta duas questões. Primeiro, o que faz a sequências operadoras de 17 pb para regular sua própria
lisogenia chegar ao fim ? Segundo, de que modo o fago transcrição e manter a lisogenia. ( b ) A luz UV e outros agentes
retoma o ciclo I ítico e produz uma progénie de fagos? nocivos ao DNA ativam a RecA que cliva os monômeros
A indução é o processo que leva a lisogenia ao fim c de repressora X para inativar a proteína repressora . (c) A
reinicia o ciclo I ítico. Você poderia comparar a indução lisogenia termina com a remoção da proteina repressora X
com a ativação de um interruptor, disparado pelo dano das sequências operadoras e a iniciação da transcri ção do
gene cro.
ao DNA provocado por forças extracelulares. A força
principal que provoca lesão no DNA é a luz ultravioleta,
cujos efeitos sobre o DNA ativam sua reparação. Entre Em resumo, o fago X oferece um exemplo elegante
as muitas proteínas ativadas na cascata de reparação do de sistema regulató rio que controla de que maneira
DNA está a proteí na RecA , cujo papel na reparação da
mutaçã o é ativar a recombina çào.
um interruptor genético é acionado. A interação cru
cial é entre os produtos proteicos dos genes precoces
-
No entanto, quando o DNA baderiano é danificado cro e cl que competem pela liga çã o com as sequ ências
pela luz LTV, a atividade de protease (destruição de pro- operadoras 0 Ry Ow e 0 Ry Se a proteí na cro prevalecer
teínas) da proteína RecA também é ativada. A atividade pela liga ção bem -sucedida com Ow e 0Rt , a expres -
de protease visa ao segmento de aminoácido dos monô - são de cl é expressa e a síntese dos genes tardios que
meros de repressora X que se unem às regiões N e C-ter - leva à conclusão do ciclo I ítico está assegurada. Por
minais de cada proteína ( Figura 14.27b ). A terminação C outro lado, se a proteina repressora X prevalecer , sua
é cortada de cada mon ó mero, literalmente quebrando ocupação precoce de 0 R , e Ou impede a transcrição
os d í meros da repressora e fazendo que as extremidades dos genes tardios, assegurando que o ciclo lisogé nico
N- terminais caiam do DNA. Com a repressora X desli - vai prosseguir.
gada do DNA, as sequências 0Â / OgJ e Ow são expostas,
f

a regulação positiva da transcrição de cl e a regulação

negativa da transcrição de cro terminam, permitindo a
Observa çã o gen é tica No bacteriófago X uma série .
ordenada de sequências promotoras e terminadoras controla
produção da proteína cro < Figura 14.27c). A proteína cro a expressão dos genes necessá rios no inicio e no fim do ddo
se liga às operadoras que n ã o estã o mais ocupadas pela I ítico. A intera ção competitiva entre a proteina repressora X e a
proteí na repressora. Isso leva à expressão de Xis , que proteína cro pelos mesmos sítios de liga ção ao DNA decide se
produz a enzima excisionase, que remove o lisógeno de uma célula entra no ciclo Iítico ou no ddo lisogénico.
sua localização integrada. Esse evento desencadeia a re -
tomada do ciclo Iítico e acaba resultando na lise da cé
lula hospedeira e na liberação de uma progé nie de fagos.
-
483 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
ESTUDO DE CASO
Vibrião colérico — A resposta ao estresse leva à infecçã o grave
A cólera é uma doença gravemente debilitante e po
lencialmcnle faial, provocada pela infecção com a bact é-
ria intestinal Vibrio choierae. A bactéria é transmitida de
pessoa para pessoa através do contato com material fecal
infectado. A ingestão de água contaminada por fe /es é a
maneira mais comum de contrair a doença . A maioria das
bact é rias ingeridas é morta pelo ambiente altamente ácido
do estômago, mas as que sobrevivem sofrem um chavea-
mento rá pido na regula ção genica que desativa a expres
sã o dos genes rotineiramente ativos c ativa a expressão
dos genes de resposta ao estresse. Esses mecanismos de
chavcamcnto gené tico permitem que as bacté rias sobre
vivam no ambiente hostil do estômago. Infclizmcntc para
os seres humanos infectados, a resposta ao estresse da V
choierae produz toxinas que podem levar rapidamente à
degradação das células mucosas que revestem os intestinos
e ao vazamento excessivo de água das células danificadas.
O vazamento perturba o equil íbrio osraótico das células;
para compensar, cias lecretam água, iniciando um ciclo
repetido de vazamento de ferro e liberação de água que
produz diarreia c desidratação grave. A menos que o trata -
mento imediato com antibiótico e a terapia de reidrataçâo
sejam iniciados, a morte pode ocorrer em horas . letais e como os prestadores de cuidados de sa úde pode
. —
No V choierae, três genes ToxS , ToxR c ToxT
exercem controle positivo sobre a transcrição dos genes que
RESUMO
14.1 0 controle transcrlcional da expressão geni-
ca exige a interação DNA-proteína
Os genes regulados estão sujeitos ao controle transcrlck)
nal, enquanto os genes constitutivos não são regulados . O controle negativo da transcrição gênka do óperon loc è
No controle negativo da transcriçã o, as prote í nas regula-
tórias ligadas ao DNA reduzem ou eliminam a transcrição.
As proteí nas regulatórias, também chamadas repressoras,
possuem um domínk) de ligação ao DNA para se ligarem
às sequências de DNA regulatórias e um dom ínio alosté-
rico para se ligarem à molécula regulatória.
Uma molécula indutora se liga à molécula repressora em
um sítio alostérico para Inibir sua a ção.
No controle regulatório positivo, as proteí nas ativadoras se
ligam a sequências de DNA promotoras e a outras sequên-
cias regulatórias e iniciam a transcriçã o ou aumentam sua
eficiência.
14.2 O óperon lac é um sistema óperon induzí vel
sob o controle negativo e positivo
I Os óperons bactenanos transcrevem dois ou mais genes
sob o controle regulatório coordenado das sequências
promotoras, operadoras e outros elementos regulatório*
compartilhados.
I
—
0 óperon lactose (toc) é um sistema óperon Induz ível que
produz três prote í nas betagalactosidase (tocZ), permea-
- produzem virulê ncia ( crescimento bacteriano ativo
que provoca a doença ). A expressão dos genes ToxS e
TuxR é estimulada pelas pistas ambientais encontradas
pelo V. choierae no ambiente hostil do estômago. Um com -
plexo proteico formado pelos produtos desses genes ativa
.
a transcrição do ToxT O produto polipeptldico de ToxT
é uma proteína ativadora da transcrição que se liga à se -
quência promotora P t < que controla a transcrição de dois
- genes, CtxA e CtxB ( abreviações para “ toxina A da cólera ”
e “toxina B da cólera ” ), que fazem parte de um óperon . Os
produtos polipeptídicos de CtxA e CtxB são as toxinas da
- cólera que iniciam uma série dc ações que levam aos sinto-
mas da cólera.
. Prevenir a cólera é uma prioridade de sa úde pú blica,
podendo salvar milhares dc vidas por ano. Igualmcnte
importante é adquirir uma compreensão de como o com -
-
plexo ToxS ToxR e o ToxT operam no reconhecimento da
sequê ncia promotora c na identificação dc outros genes
que eles regulam. De modo similar, reunir informações
sobre a resposta ao estresse e os genes da virul ência no V .
choierae vai ajudar profissionais dc medicina c microbiólo -
gos a compreenderem como a bactéria produz seus efeitos
-
— riam intervir precoccmentc no processo infcccioso para evi
tar as consequê ncias mais graves da infecção.
-
se ( tocV) e transacetilase ( lacA ) — necessá rias para metabo-
lizar a lactose e seus subprodutos. Seu centro de controle
regulatório contém uma sequência promotora e uma se-
- quência operadora (tocO).
exercido por uma proteí na repressora ( toc/) que se liga à re-
gião lacO para bloquear a transcrição. A alolactose inativa
a prote í na repressora mudando sua conformação e impe-
dindo - a de se ligar á sequ ência operadora .
0 controle positivo da transcrição dos genes do óperon loc é
exercido pelo complexo CAP-cAMP que se forma na ausência
de glicose e se liga aosítio CAP da sequência promotora toe.
14.3 A aná lise das mutações decifra a regula ção
gené tica do óperon lac
Os estudos de mutação determinaram que a ordem dos
genes do óperon loc é lacZ- lacY-facA.
A aná lise de haploides e diploides pardais mutados nas
bactérias identificou a proteí na repressora de atividade
trans que se liga à sequência operadora.
A aná lise de mutação da sequê ncia operadora toc indica
que a operadora é um elemento de ação cis que controla
a transcrição dos genes imediatamente adjacentes no cro-
mossomo.
O sítio de ligação da repressora toe se sobrepõe ao sitio de
ligação da RNA polimerase na sequência promotora toc.
 Capítulo 14 Regulação da expressão gênlca nas bactérias e bacteriófagos 489

I A ligação da proteína repressora lac induz a formação de
uma alça de DNA que impede a ligação da RNA polimerase
na sequência promotora.
O complexo CAP-cAMP se liga ao sítio de ligação è CAP da
sequência promotora lac e facilita a ligação da RNA poli
merase.
I A transcrição dos genes do óperon arabinose { ara ) é re-
gulada pela proteína araC que exerce controle positivo e
negativo.
14.5 As bact érias regulam a transcrição dos
genes de resposta ao estresse e também
regulam a tradução
- I Fatores sigma alternativos são usados para gerar RNA poli-
merases que reconhecem sequências promotoras de genes
não transcritos pela RNA polimerase bacteriana comum .
I Os genes transcritos usando fatores sigma alternativos são
necessários apenas em circunstâncias especiais, como na
resposta ao choque térmico.

14.4 A transcrição a partir do óperon do triptofa -
no é repressí vel e atenuada
O óperon triptofano (frp) é um óperon repressível que produz
cinco polipeptideos que participam da síntese do triptofano.
II A transcrição do óperon frp é inibida por um mecanismo de
feedback envolvendo o triptofano como um correpressor
A expressão do gene do óperon frp é atenuada para man-
ter a concentração celular do triptofano em estado perma-
nente. Vários óperons de aminoáddos são regulados por
um mecanismo de atenuação.
A região trpL (líder) contém uma sequência atenuadora de
quatro repetições de DNA que formam uma das duas has-
tes em alça de RNAm alternativas . I A integração e manutenção do lisógeno requer a expres-
A haste em alça 2- 3 (antitenminação) formada pelo RNAm
permite a transcrição de cinco genes estruturais do óperon
frp em um RNAm policistrònko.
A haste em alça 3-4 (terminação) do RNAm termina a trans
crição antes que a RNA polimerase se ligue aos genes es-
truturais do óperon .
T E R M O S- C H A V E
I A tradução do RNAm bactériano pode ser impedida pelas
proteí nas repressoras da tradução ligadas ao RNA ou pek>
RNA antissentido que se liga ao RNAm de genes específicos .
14.6 Os antiterminadores e repressores contro-
lam a infecção por fago lambda da E. coli
.
Os genes precoces do genoma do bacteriófago X produ-
zem proteí nas que competem para se ligar á mesma região
.
regulatória A proteína que prevalece determina se a infec-
ção por fago vai seguir o ciclo litico ou o ciclo lisogénico.
A passagem pelo ciclo lírico requerem a expressão dos
genes tardios do fago X.
são permanente da proteína repressora X, que regula sua
própria transcrição .
A integração do lisógeno é revertida pelas mudanças am-
- bientais que levam à indução e retomada do ciclo litico .

.
Ação ds (p 468 ) Gene lacA (gene tacY , gene tocZ) (p 463) . óperon repressível (p. 475)
Ação trans (p 469) . Genes precoces ( sequências operadoras Proteína atrvadora (p. 461 )
Alça de DNA (p 473 ) . precoces, sequências promotoras .
Proteína repressora (p 460)
Alolactose (p. 463 ) precoces) (p. 483, 484) Proteína repressora da tradução (p. 482 )
Atenuação ( região atenuadora) (p. 475) Genes tardios (sequências operadoras Região líder { trpL ) (p. 475)
-
Cis dominante (p. 468) tardias, sequências promotoras tar-
dias) (p. 484, 486)
Repressão por catabólito (p. 465 )
Complexo indutor repressor (p. 465) Repressora simultânea (p. 46 J )
Composto efetor alost érico (p. 461) Haste em alça [3 -4 (terminação), 2-3 (an - RNA antissentido (p. 482 )
Controle negativo (da transcrição)
titerminação}) (p 477). RNAm policrstrônico (p. 463 )
(p. 460) Indução (p. 487)
Sítio de ligação à CAP (complexo CAP-
Controle positivo ( da transcrição) Indutor (p. 46 F ) cAMP) (p. 465 )
.
(p 460) Inibidor (p.461) Sítio de ligação da ativadora (p. 467 )
.
Domínio alostérico (alosteria) ( p 461 ) -
Motivo hélke volta- hélice (HTH) (p. 462 ) Transcrição constitutiva (mutados cons
.
Domínio de ligação ao DNA [ p 461 ) Não induzível (p. 469) titutrvos) (p. 460, 467 )
.
Extremidades coesivas ( cos) (p 483) Operadores (p. 460) Transcrição regulada (p. 460)
Fator sigma (o) alternativo (p. 480) óperon [lactose ( lac ), triptofano ( frp),
Fenótipo lac* (p. 463 ) arabinose (ara )) (p. 462.463, 475)
Fenótlpo lac (p. 463) óperon induzível (p 463) .

PROBLEMAS
Para obter as respostas dos problemas pares .
ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Frequentemente, os genomas bacterianos contém gru - Identifique os componentes regulatórios que você es-
pos de genes organizados em óperons. Qual é a van pera encontrar em um óperon. Como os genes expressos
tagem biológica dos óperons em relação à s bactérias ? de um óperon costumam estar dispostos?
490 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

2. A regulação transcricional da expressão genica do ópe-
ron envolve a interação das moléculas umas com as
outras e das moléculas regulatórias com segmentos de
.
DNA Nesse contexto, defina e forneça um exemplo de
cada um dos seguintes itens:
.
a Sequência operadora
.
b Sequência repressora
c. Indutor
.
d Correpressor
.
e Sequência promotora
f. Regulação positiva
g. Aiosteria
.
h Regulação negativa
.
i Atenuação
3. Por que é essencial que as células bacterianas se>am ca-
pazes de regular a expressão de seus genes? Quais são as
vantagens energéticas e evolutivas da expressão genica
regulada? A expressáo de todos os genes bacterlanos está
sujeita à expressão regulada? Compare e diferencie a ex-
pressão gê mea regulada e a expressão gênica constitutiva.
4. Identlflque as semelhanças e diferenças entre um óperon
induzivel e um óperon repressivel em termos
.
a das sequências de DNA reguladoras da transcrição
tx da presença e ação das moléculas regulatórias alostérícas
c da organização dos genes estruturais do óperon
5. A transcrição da betagalactosidase e da permease é in-
duzível nas bactérias lac* com um óperon lac do tipo sel-
vagem. Explique o mecanismo pelo qual a lactose ganha
.
acesso à célula para induzir a transcrição dos genes
6. A atenuação é o produto de um efeito alostérico? A ate-
nuação é o resultado de uma atividade de transcrição ou
de tradução? Explique suas respostas.
7. A região trpL contém quatro sequências de DNA repeti-
das que levam à formação de estruturas haste em alça no
RNAm. Quais são essas estruturas haste em alça e como elas
afetam a transcrição dos genes estruturais do óperon frp?
8. O sítio de ligação à CAP no promotor loc é o local de
regulação positiva da expressáo génica para o óperon.
Identifique o que se liga a esse sitio para produzir regu-
lação positiva, em que circunstâncias a ligação ocorre e
como a ligação exerce um efeito positivo.
9. Qual papel a cAMP desempenha na transcrição dos
genes do óperon locl Qual papel a CAP desempenha na
transcrição dos genes do óperon lacl
10. Como uma mutação cap que produz uma proteí na CAP
inativa afetaria o controle transcricional do óperon locl
11. Explique as circunstâncias em que a atenuação da ex -
pressão gênica do óperon é vantajosa para um orga-
nismo bacteriano. Você preveria que a atenuação fosse
encontrada em um euearloto unicelular? E em um euca-
ríoto pluricelular ?
12. Descreva como a proteína araC age como reguladora po-
sitiva e como reguladora negativa da transcrição do ópe-
ron ara (arabinose).
13. Descreva os ciclos de vida lítico e lisogénico do bacte-
riófaqo X. Quais papéis a repressora X e a proteína cro
desempenham no controle da transcrição de Pxe PMe
como esses papéis estão ligados à lise e á lisogenia ?
14. Defina RNA antissentido e descreva como ele afeta a tra -
.
dução de um RNAm complementar Por que é mais van-
tajoso para o organismo parar a iniciação da tradução
em vez de inativar ou destruir o produto gènico após ele
ser produzido?

Aplicação e integração
15. A atenuação da transcrição do óperon np é controlada c. Mutação do gene locl que afeta o sitio alostérico da
pela formação de estruturas haste em alça no RNAm. A proteína
função de atenuação pode ser perturbada por mutações d. Mutação do gene locl que afeta o sí tio de ligação ao
que alteram a sequência das regiões de DNA repetidas 1 DNA da proteína
e 4 e impedem a formação das haste em alça de RNAm. e. Mutação do sítio de ligação à CAP da promotora loc
Descreva os prováveis efeitos sobre a atenuação de cada 17. Identifique quais dos seguintes genótipos haploides do
uma das seguintes mutações nas condições especificadas. óperon lac transcrevem genes do óperon de modo indu-
zfvel e quais transcrevem genes de modo constitutivo,
Região alterada (por mutação) Nível de triptofano indique se a cepa é /oc* ( capaz de crescer em um meio
a. Região 1 Baixo contendo apenas lactose) ou lac (não consegue crescer
b. Região 1 Alto em um meio contendo lactose),
c. Região 2 Baixo a rro z r -
b. r r a z- r
d. Região 2 Alto
e. Região 3 Baixo
.
c r P* o* r r
d.rp crrY*
f. Região 3 Alto -
e. r p o z- r
g. Região 4 Baixo .
f rraz Y- -
h. Região 4 Alto g. r p a z r-
18. Complete a tabela a seguir, indicando se a betagalactosi-
16. No óperon lac, quais são os prováveis efeitos sobre a dase e a permease funcionalmente ativas são produzidas
transcrição gênica do óperon exercidos pelas mutações .
na presença ou ausência de glicose Use V para indicar a
identificadas a seguir? presença de uma enzima funcional e "-" para indicar sua
a. Mutação da sequência de consenso promotora lac. ausência. Indique se a cepa diploide parcial é lac (capaz
b. Mutação do sítio de ligação á repressora na sequência de crescer em um meio contendo apenas lactose) ou lac
operadora (não consegue crescer em um meio contendo lactose).
 Ca pitulo 14 Regulação da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 491

Genótipo Betagalactosidase Permease Fenótipo

Lactose Nenhuma lactose Lactose Nenhuma lactose
Exemplo: /T O* Z* Y * + + lar
a. /TO* ZT//TO* ZT
b. /TO* 2T//TOTT
c /TO* ZT /?TO* ZT
d. r p& r w r r & r r
e.
.
f / * P O* Z r /15 F 0T Y
g. r r c r z r /r r & z - Y

19. Faça uma lista dos possíveis genótipos de óperon l a c que Cruzamento Transcrição e crescimento
possuem as seguintes caracter ísticas fenotipicas:
AxB lar , induzível
a. Os genes do óperon são transcritos constitutiva-
mente, mas a cepa é incapaz de crescer em um meio A xC lar, induzível
.
contendo lactose Apresente dois genótipos possíveis A xD lac , constitutiva
para esse fenótipo.
.
b Os genes do óperon nunca sào transcritos acima de BxC lar , induzível
um nível basal e a cepa é incapaz de crescer em um BxD lac*, constitutiva
meio contendo lactose. Apresente dois genótipos pos
CxD lar , induzível
síveis para esse fenótipo.
.
c Os genes do óperon sào transcritos de modo induzí-
Use essas informações para identificar qual gene do
vel, mas a cepa é incapaz de crescer em um melo con - óperon lac sofre mutação em cada cepa.
tendo lactose. Apresente um genótipo possível para
esse fenótipo. 22. Suponha que o diploide parcial de óperon lac cap~ t P
d. Os genes do óperon são transcritos constitutivamente O* Z YWcap t F O Z' Y seja cultivado.
e a cepa cresce em um meio contendo lactose. Apre-
a. Essa cepa diploide parcial vai crescer em um melo con-
sente dois genótipos possíveis para esse fenótipo.
tendo lactose?
20. Suponha que cada um dos genótipos que você apresen- b. A transcrição da betagalactosidase e da permease é in-
tou nas partes (a) e (b) no Problema 19 sejam colocados duzível, constitutiva ou não induzível?
em um genótipo diplokJe parcial com um cromossomo c. Explique como a complementação genética contribui
que tenha um óperon l a c do tipo selvagem. para o h ábito de crescimento dessa cepa.
.
a A transcrição dos genes do óperon em cada diploide 23. Um óperon bacteriano induzível, similar ao óperon lac,
parcial ser á induzível ou constitutiva ?
b. Quais diploides parciais conseguirão crescer em um
contém três genes —R, T e S —
que est ão envolvidos
na regulação coordenada da transcrição. Um desses
meio contendo lactose? genes é uma região operadora, um é uma proteína re-
21. Quatro mutados l a r independentes (mutados A a 0} são gulat ória e o terceiro produz uma enzima estrutural.
.
isolados em cepas diploides de £ coti As cepas têm as se- Na tabela a seguir, *+" indica que a enzima estrutural é
guintes características fenotípicas: sintetizada e indica que ela não é produzida. Use
as informações fornecidas para determinar qual gene
O mutado A é lac , mas a transcrição dos genes do é o operador, qual produz a proteína regulatòria e qual
óperon é induzida por lactose . produz a enzima.
O mutado B é lac e tem transcrição induzível dos genes
do óperon . Genótipo Síntese da enzima com ...
O mutado C é lar e tem transcrição constitutiva dos Indutor presente Indutor ausente
genes do óperon.
*?• ST +
0 mutado D é lac’ e tem transcrição constitutiva dos ff ST
genes do óperon.
ff *ST +
Um microbiólogo desenvolve variedades doadoras e re-
ff* ST f
ceptoras de cada cepa mutada e realiza seu cruzamento,
.
obtendo os resultados a seguir A tabela indica se ocorre ff - s- r/ff* s- r + +
transcrição induzível, constitutiva ou não induzível, com ff *Sf /ff - ST + f
o hábito de crescimento de lac 4 e lac de cada diploide
parcial. Suponha que cada cepa tenha uma única muta- ff* S4 T~ /R~ S T
"
+
ção.
492 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

.
24. Um sistema óperon repressfvel como o óperon trp, con- 28. De que modo as mutações que inativam cada um dos
tém très genes, G, Ze IV Os genes do óperon são sinteti- seguintes genes afetam a determinação do ciclo de vida
zados quando o produto final da via de síntese do ópe- lítko ou lisogénico nas cepas mutadas de fago X ? Justifi-
ron está ausente, mas náo há síntese quando o produto que suas respostas.
.
final está presente Um desses genes é uma sequência a. cl
operadora, um é uma proteína reguladora e o outro é .
b dl
uma enzima estrutural envolvida na síntese do produto c cro
.
final Na tabela a seguir, *V indica que a enzima é sinte- d.íní
tizada pelo óperon e significa que náo ocorre síntese .
e cll e cro
.
enzimátíca Use essas informações para determinar qual .
f N
gene corresponde a cada função do óperon . .
29 A sequência de inserção bacteriana tSIO usa RNA antis-
sentido para regular a tradução do RNAm que produz a
Genótipo t ca
Síntese enzimáí
enzima transposase, necessária para a transposição da
Com o produto Com o produto .
sequência de inserção A transcrição do gene RNA an-
final presente final ausente tissentido é controlada por P que é mais de 10 vezes
^
mais eficiente na transcrição do que a região promotora
G’ Z' IV* +
G' Z* IV* + + Pn que controla a transcrição do gene transposase.
a. Se uma mutação reduzir a eficiência transcricional de
G* Z W* de modo a igualá -la à de P qual é o provável
^
G+ Z* W + f efeito sobre a transposição da IS Í01
b. Se uma mutação de Pw eliminar sua capacidade de
G Z* IV7G* Z W
'
•f
funcionar na transcrição, qual é o provável efeito sobre
G* Z~ W* tG~ Z* IV "
+ a transposição da 15 / 0?
G Z IV7G* Z* IV •f 30. A análise de northern blotting é realizada em RNAm ce-
G* Z* W7G Zr VV*
' lular isolado da E. coll . A sonda utilizada na análise de
northern blotting hibrida com uma parte da sequência
25. Qual é o provável efeito das seguintes mutações da re- .
lacY A seguir vemos um exemplo de autorradiografia da
gião trpL sobre o controle da atenuação da transcrição análise de northern blotting de uma cepa bacteriana toc *
génica do óperon trpl Explique sua lógica. .
do tipo selvagem Nesse gel, a linha 1 é de bactérias cul-
tivadas em um meio de cultura contendo glicose (meio
a. A região 3 é deletada.
b. A região 4 é deletada.
.
mínimo) A linha 2 é de bactérias em um meio de cultura
contendo apenas lactose. Seguindo o estilo desse dia-
c A região trpL inteira é deletada.
d. O códon de início (AUG) do polipeptídeo trpL é dele- .
grama desenhe o aspecto da autorradiografia para os
tado.
northern blotting das bactérias apresentadas a seguir .
Em cada caso, a linha 1 é de RNAm isolado após o cres -
e. Dois nudeotídeos são inseridos na região trpL imedia-
cimento em um meio de cultura contendo glicose (mí-
tamente após o códon de parada do polipeptídeo.
nimo) e a linha 2 é de RNAm isolado após o crescimento
f. Vinte nudeotídeos são inseridos na região trpL imedia-
em um meio contendo apenas lactose.
tamente após o códon de parada do polipeptídeo.
g. Dez nudeot ídeos são inseridos entre as regiões 2 e 3 Pista
da trpL,
1 2
h. Dois nudeotídeos são inseridos imediatamente após o
códon de início do polipeptídeo.
í. A sequência codificadora inteira do polipeptídeo da
trpL é deletada.
j. Os oito nudeotídeos uracila imediatamente após a re-
gião 4 sáo deletados.
26. Se as mutações de cada região apresentada a seguir im-
pedem a ligação da proteina araC, de que modo será afe- Autorradiografia
tada a regulação transcricional do óperon arai do northern
a. arai blotting
b. araO,
c. araO , a. Bactérias laC com genótipo t* P* & Z* Y*
d. araO , e araO) b. Bactérias lac com genótipo !' P* O* ZY*
. .
27 Duas mutações diferentes afetam Pu 0 mutado 1 dimi- c Bactérias lac com genótipo I’ P CFZ* Y'
d. Bactérias lac* com genótipo t P* CF Z* Y*
nui a transcrição da região promotora para 10% do nor - e. Bactérias lac com genótipo f P 0‘ Z Y\ que é uma
mal. O mutado 2 aumenta a transcrição da região pro-
motora para dez vezes mais que o tipo selvagem. De que mutação polar que afeta o gene lacZ
modo cada mutação vai afetar a determinação do ciclo f Bactérias lac com genótipo 1' P* O ZrY -
.
de vida litico ou lisogénico nas cepas mutadas de fago X? g. Bactérias lac com genótipo V P* 0' Z* Y* e uma muta-
Justifique suas respostas. ção que impede a ligaçào do complexo CAP- cAMP ao
sítio CAP
 Ca pitulo 14 Regulação da expressão gênlca nas bactéf ias e bacteriófagos 493

31. O gel eletroforético exibido a seguir na parte (a) é da aná-
lise da impressão digital por DNase I da região de con-
trole de transcrição de um óperon. A análise da sequên-
cia de DNA de uma região de 35 pb é exibida na parte (b)
A região de controle, chamada l 2 P em uma extíemidade,
é exibida em um mapa na parte (c). Amostras diferentes
do DNA da região de controle são expostas ã DNAse I e o
DNA resultante digerido pela DNase I é colocado em pis-
tas diferentes do gel eletroforético. 0 DNA desprotegido
est á na linha 1, o DNA protegido pela proteína repressora
na linha 2 e o DNA protegido por RNA polimerase na
.
pista 3 Os números ao longo do gel eletroforético cor -
respondem à sequência de 35 pb rotulada no mapa na
.
parte (c) Use as informações fornecidas para soluek>nar
os problemas a seguir.
a. Determine a sequência de DNA da região de 35 pb
examinada.
b. Localize as regiões da sequência protegida pela proteí-
na repressora e pela RNA polimerase.
(a) Tratamento fase I (b) Sequenciamento do DNA
32. Para os diploides parciais de óperon lac a seguir, deter -
mine se a sintese do RNAm UscZ é 'constitutiva", "induzí-
vel" ou "não induzrvel" e indique se o merodiploide é lac*
. ou lar ( capaz ou não de utilizar a lactose).
Genótipo Sintese do Fenótipo lac
RNAm lacZ
a. I P* 0' Z* Y' / r F O* ? Y*
b. t P & Z+ Y+l t F & Z Y*
--
c r p- o+ r r / i p c t r r
d. r P' 0' Z- r / r r c r z' Y'
e. r r c r r r / r r c r z t Y -
.
33 Os seguintes genótipos hipotéticos têm os genes A, B e C
.
correspondentes a locl, lacO e ktcZ mas não necessária
mente nessa ordem. Os dados na tabela indicam se a be-
tagalactosidase é produzida na presença ou na ausência
do indutor de cada genótipo. Use esses dados para iden-
tificar a correspondência entre A, e C e os genes tad,
lacO e lacZ. Explique sua lógica cuidadosamente para
identificar cada gene.

G A T C Genótipo Produção de betagalactosidase

r»
Indutor presente Indutor ausente
1. A P C + +
30 - 2. A B' C-
3. A P O/A T C +
4 . A * rc-/A* s« e +

20

10 -
5 -
1-
(c)

1 35
 Capítulo Regulação da expressão gênica
nos eucariotos

APRESENTAÇÃO
15.1 As sequências cls-regulatórias ligam as proteínas
trans-regulatórias para controlar a transcrição
eucariótica
15.2 A remodelação da cromatina regula a transcrição
eucariótica
15.3 Mecanismos mediados pelo RNA controlam a
expressão gênica

Flores de petúnia do tipo selvagem possuem cor sólida em virtude da

.
expressão de um gene pigmentar cromossòmico As petúnias trans-
génicas com uma cópia extra do gene pigmentar possuem regiões
incolores (brancas) em razão de um processo chamado cossupressào,
PONTOS ESSENCIAIS provocado pelos RNAs regulatórios que inatlvam a cópia cromossô -

I As sequências de DNA regulatórias se

.
mica e a c ópia transgénica do gene pigmentar

ligam a proteínas regulatórias para contro-

lar a iniciação ou o silendamento da trans -
crição em eucariotos.
I A remodelação da cromatina regula a
transcrição gênica por meio de modifica-
ções que afetam os nudeossomos.
I A estrutura da cromatina varia entre os
diferentes tipos de células e estabelece o
programa de expressão gênica de tipos de
células distintos.
I Os mecanismos mediados por RNA regu
lam a expressão gênica eucariótica por
meio de interações pós- transcrição com o
RNAm maduro.
S e os 46 cromossomos em um único núcleo de qualquer célula
em seu corpo fossem despidos de suas proteínas associadas
e assentados de ponta a ponta, eles abrangeriam quase 2 metros.
Contudo, em seu estado compactado normal, esses cromosso-
mos cabem dentro de um núcleo com aproximadamente 5 mi-
crons (5 milionésimos de um metro) de diâmetro e ainda deixam
espaço para a replicação do DNA, transcrição, processamento do
- pré-RNAm e muitas outras atividades que lá ocorrem. Esse acon-
dicionamento eficiente e o acesso ao DNA são possibilitados pela
estrutura de cromatina de seu genoma e pelas mudanças dinâ-
micas das quais a cromatina é capaz durante todo o ciclo celular.
Os genomas dos organismos eucarióticos — Incluindo o seu
são, em média, consideravelmente maiores que os das espécies
bacterianas e arqueais, e também são acondicionados de modo
muito diferente. Uma diferença importante no acondicionamen-
to é a localização dos cromossomos em um núcleo nas células
 Cap ítulo 15 Regulado da expressão g ênica nos eucariotos
eucarióticas. A localização nuclear sequestra os cromos-
somos e encapsula a repllcação do DNA. a transcrição e
as vá rias atividades de processamento do RNA. Uma se-
gunda diferença é a incorporação do DNA em cromatina.
O processo de condensação da cromatina começa
com a prófase e culmina em cromossomos totalmente
condensados na metáfase. Essa etapa é uma predecesso-
ra essencial da separação eficiente dos cromossomos na
anáfase. A condensação da cromatina também desempe-
nha um papel fundamental, permitindo ou impedindo a
transcrição. Nenhuma célula em seu corpo expressa to-
dos os 22 mil genes do genoma humano. Em vez disso, a
maioria dos tipos celulares humanos expressa apenas al-
guns milhares de genes, enquanto os outros são silencio-
sos na transcrição. Nas últimas décadas, os biólogos ce-
lulares que estudam a ligação íntima entre as mudanças
estruturais na cromatina e a transcrição dos genes euca-
rióticos tiveram êxito em revelar muitos detalhes cruciais.
Os processos que regulam a expressão génica
nos eucariotos ( ver Capítulos 8 e 9) são mais variados
e multifacetados que os que governam a expressão
gênica nos genomas bacterianos (Figura is.l ). Neste
capítulo, concentramo-nos em cinco outros elementos
centrais para a regulação da transcrição e da expressão
gênica nos eucariotos: ( 1) sequências regulatórias,
diferentes das sequências promotoras, que contribuem
para a regulação da transcrição; ( 2) mecanismos que
remodelam a cromatina ou reconfiguram a associa ção
entre nucleossomos e DNA para regular a transcrição;
( 3) mecanismos epigenéticos que exercem controle
regulatórlo transcrlclonal nas linhagens celulares em
longo prazo; (4 ) a transmissão dos estados epigenéticos
de uma geração de células para outra a fim de exercitar
o controle em longo prazo da expressão gênica diferen-
cial e (5) mecanismos baseados em RNA que atuam após
a transcrição para regular a disponibilidade de RNAm
maduro para a tradução e, portanto, a capacidade para
produzir polipeptídeos.
15.1 As sequências cis-regulatórias
ligam as proteínas trans-
-regulatórias para controlar a
transcrição eucariótica
Apesar das consideráveis diferenças entre eucariotos
e bactérias, os mecanismos básicos que controlam a trans-
crição são similares, em um sentido amplo, em ambos os
grupos de organismos. As interações DNA - proteína nos
495
eucariotos seguem um esquema familiar ao dos processos
bacterianos. As proteínas ativadoras se ligam a sequên
cias regulatórias para estimular a transcrição ( regulação
-
positiva da transcrição) e as proteínas repressoras se ligam
a outras sequências para impedir a transcrição ( regula -
.
ção negativa da transcrição) No entanto, ao contrário de
suas contrapartes bacterianas, as sequ ências ativadoras e
repressoras da transcrição eucariótica se encontram em
grandes complexos compostos de centenas de proteínas
regulatórias diferentes que se ligam a uma ampla e diversa
gama de sequências regulatórias. Essas proteínas se jun
tam em combí naçóes diversas, que ativam ou reprimem a
-
transcrição de diferentes padrões de genes em diferentes
tecidos e em diferentes momentos do cicio de vida.
Motivos estruturais das proteínas de
ligação ao DNA
Centenas de proteínas de ligação ao DNA regulató-
rias foram identificadas nos eucariotos. Essas proteínas
são as fontes primárias de expressão gênica regulada
nos eucariotos. Essas proteínas são categorizadas com
base em sua estrutura , chamada motivo ( motif ) estrutu
ral da proteí na, e existem muitos motivos estruturais
-
.
diferentes Os elementos mais comuns dos motivos es -
truturais sã o as alfa - hélices e outras estruturas protei-
cas secundá rias, que formam os domí nios funcionais
das proteínas regulató rias. Certos dom ínios funcionais
permitem que as proteínas identifiquem e se liguem a
sequências de DNA regulatórias específicas no sulco
maior ou no sulco menor do DNA. Esses dom í nios de
ligação ao DNA geralmente consistem em algumas
dezenas de am í noácídos, dentre os quais vá rios fazem
contato direto ou interagem com pares de bases nucleo -
tídicas nas sequ ências regulat órias. Os aminoácidos nos
domí nios funcionais das proteínas regulatórias também
são capazes de reconhecer sequências de DNA especí -
ficas por meio de interações com conjuntos únicos de
á tomos de nitrogénio, oxigénio e hidrogénio que se
estendem de cada par de bases. As interações dos dois
motivos estruturais comuns com o DNA regulalório
.
são exibidas na Figura 15.2 As características desses e
de outros motivos comuns são descritas na Tabela 15.1 .
Interações regulatórias transcricionals
Três conjuntos de sequências de DNA regulatórias
estão normalmente envolvidos na regulação da transcri -
ção eucariótica de genes específicos. O primeiro conjunto
de sequências regulatórias é a região promotora central,
contendo a TATA box e outras sequências; ela é imedia -
tamente adjacente ao início da transcrição e é a sequência
á qual a RNA polimerase II e seus fatores de transcrição
.
associados se ligam (Figura 153) A montante da sequência
promotora central há vá rias elementos prwdmais, que são
o segundo conjunto de sequências regulatórias. Essas se-
quências se ligam às proteínas regulat órias e são essenciais
para o reconhecimento da sequência promotora e eventual
 496 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Q Regula ção da transcrição O Processamento do RNAm

Núcleo
.
a As proteínas regulatôrias e os .
a Capeamento da extremidade 5,'
fatores de transcrição se ligam
à s sequências de consenso de
DNA jooooooocy : poliadenilaçáo da extremidade 3'e
spJiáng intrônko modificam o
DNA (regiões promotoras) para
.
facilitar a transcrição
-
pré RNAm .
Pré- b Capeamento alternativo e sítios de
.
b Outras sequências de DNA RNAm v/V/Y/V/ poliadenilaçáo podem ser utilizados
regulatôrias (enhoocers e ^ em diferentes tipos de células.
silenciadoras) se ligam a proteínas
regulatôrias para facilitar a Cap Cauda poli(A) c. O iplicí ng alternativo produz
transcrição de genes específicos I moléculas de RNAm maduro
é diferentes de alguns tipos de células.
em cada tipo de célula. maduro y
^ AAA
c.Estrutura de cromatina aberta
favorável á transcrição formada
pela ação proteica.
_ d. A edição do RNA modifica as
sequências de bases do RNAm.

d. Sequências promotoras Citoplasma O Regulaçã o do RNAm maduro

alternativas utilizadas em
a. Proteínas regulatôrias da tradução
diferentes tipos de células para \/\/^AAA se ligam ao RNAm maduro para
produzir diferentes moléculas
de pr é-RNAm. atrasar a iniciação da tradução.

e. A metilaçáo do DNA inibe a b O silenciamento do RNA pela

transcrição. interferência do RNA bloqueia a
tradução do RNAm maduro.
Polipeptídeo
Pós-traduçlo c.O transporte do RNAm maduro
a.Os pollpeptídeos são processados para o citoplasma ê regulado.
e modificados no corpúsculo de d. Regulação da estabilidade do RNAm.
Gdgi antes de serem
transportados para fora da célula.
b. Moléculas de DNA regulatôrias
Proteína
funcional
"
o Tradução
se ligam a um polipeptídeo para O disfarce do RNAm atrasa ou
alterar sua função. impede a traduçáa

c. Regulação da estabilidade da
proteína

Figura 15.1 Visão global dos mecanismos de regulação gènka em eucariotos.

Figura 15.2 Motivos estruturais (a ) Motivo ziper de leudna (b) Motivo hélice -torção-hélice
e ligação ao DNA. (a ) As alfa-
-hélices das proteí nas ziper de
leucina dimérica se ligam ao DNA
regulatório. (b) As proteínas hélice-
Hélice
-torçâo-hélice usam uma alfa -hélice
de cada polipeptídeo para se ligar
ao DNA regulatório.
- Resíduos de leudna
(vermelho) unem Alça
as alfa-hélices. Hélke

Alfa - hélices dimétricas

se ligam ao sulco
maior do DNA
»

i
Sulco maior Sulco maior
 Cap ítulo 15 Regulado da expressão g énica nos eucariotos 497

Tabela 15.1 Motivos estruturais comuns das proteínas reguiatórias de ligação ao DNA eucariótico

Motivo estrutural Caracterfsticas

H élice -torçáo-hélice Duas alfa -hélices separadas por uma alça em cada polipept ídeo. Dois polipept ídeos se unem e formam
uma proteína dim é rica de ligação ao DNA. Uma alfa - hélice de cada dimero se liga à sequ ê ncia de DNA

Z í per de leucina .
Duas alfa-hélices, uma contendo vá rios aminoácidos leucina em cada polipept ídeo. Dois polí peptideos
formam uma proteína dimé rica funcional. As alfa -hé lices contendo leucina estão de frente uma para a
-
outra e se penetram, formando o *zfper* e a outra alfa hélice de cada polipept ídeo se liga ao DNA.
Homeodom ínio Trés alfa-hélices se formam em polipept ídeos funcionais individuais e a hé lice mais longa interage com
as sequências de DNA reguiatórias.
Dedo de zinco Alças projetadas ou “dedos* contendo cerca de 24 aminoá cidos cada uma contém uma molécula
central de zinco ligada a dois aminoá cidos cisteina e dois aminoácidos histidina. Dois ou trés dedos de
zinco se formam em cada polipeptídeo e cada dedo interage com o DNA regulatório.

transcrição. Em distâncias maiores da sequência promo-
tora central encontram-se as sequências enhancers , o ter-
ceiro conjunto de sequências reguiatórias, que se ligam às
proteínas reguiatórias e interagem com as proteínas liga
das a outros segmentos promotores. Ao contrário dos ele-
mentos de sequência promotora centrais e proximais, que
invariavelmente estão situados a montante e próximos dos
genes que regulam, as sequências enhancers podem estar a
montante ou a jusante, algumas vezes sendo encontradas
dentro dos genes. Além disso, embora algumas sequências
enhancers estejam perto dos genes que regulam, outras
-
estão bem distantes de seus genes alvo; algumas estão a
uma distância de milhares a dezenas de milhares de nudeo-
tídeos dos genes que regulam.
Todas as três regiões reguiatórias contêm sequências
.
reguiatórias de açâo ds significando que elas regulam a
transcrição de genes situados no mesmo cromossomo em
que se situam as sequências. Os elementos reguiatórias de
ação cís sào capazes de regular apenas a transcrição dos
genes no mesmo cromossomo e n ão influendam a trans-
crição dos genes nos outros cromossomos.
Proteí nas
reguiatórias
JSdaítiotranscri
de inicio
ção
enhancer / \Elemento TATA
próximaI box
\ 8.12). As alças de DNA podem ser pequenas ou grandes,
Promotora
central
Figura 15.3 Interações reguiatórias na transcrição
eucariótica. A proteína de ligação á TATA (TBP), outros
fatores de transcrição gerais (GTFs) e a RNA polimerase II ( Pol
-
II ) ligam se à sequência promotora central. Outras proteí nas
reguiatórias ligam-se è sequê ncia promotora proximal e à s
regiões enhancers, interagindo com os nudeossomos para
ativar a transcrição.
A RNA polimerase II ( Pol II ) e vários fatores de
transcrição gerais (GTFs) são atraídos para a sequê n -
cia promotora central e a ela se ligam (ver .Seçã o 8.3).
- As prote ínas ativadoras da transcrição ou as proteínas
repressoras da transcrição se ligam aos elementos pro -
motores e enhancers proximais. Todas essas prote ínas
sã o proteínas reguiat órias de a çã o trans: elas conse-
guem identificar e se ligar a sequ ências- alvo reguiató-
.
rias em qualquer cromossomo A RNA polimerase II,
por exemplo, consegue se ligar a qualquer região pro -
motora central se os fatores de transcrição geral corre -
tos também estiverem presentes. De modo similar, as
proteínas ativadoras e repressoras da transcrição con -
-
seguem se ligar a qualquer sequência alvo regulatória
e podem influenciar a transcriçã o com igual eficiê ncia,
independentemente de onde a sequência ocorrer.
Além das proteínas reguiat órias que se ligam às
sequéndas de DNA reguiat órias, muitas outras proteí-
nas també m se associam com regiões reguiatórias do
-
DNA por meio de interações proteí na prote í na que for-
mam complexos maiores. Nas sequências promotoras,
por exemplo, a agregação de várias proteínas, algumas
sequéndas enhancers de ligação e as outras se ligando
a outras proteí nas formam um complexo proteico
grande, conhecido como acentuassomo. Os acentuas -
somos controlam o dobramento do DNA em alças que
colocam o acentuassomo em contato com a RNA poli
merase e os fatores de transcrição ligados na sequê ncia
-
promotora central ou com os complexos proteicos li-
gados aos elementos promotores proximais ( ver Figura
-
observando se que os acentuassomos podem estar pró -
ximos ou bem distantes dos genes que regulam.
Em um sentido amplo, a atividade enhancer controla
o momento e a localiza ção da transcrição gênica eucarió-
tica para ajudar a garantir a função e o desenvolvimento
adequados dos organismos ( por exemplo, disponibili
zando polipeptídeos específicos em momentos cruciais).
-
Muitas vezes, os genes cuja transcrição é controlada de
modo dependente do tempo produzem polipeptídeos
necessários para determinados processos metabólicos ou
processos de desenvolvimento. As sequê ncias enhancers
também controlam a expressão dos genes em tecidos ou
498 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

tipos celulares específicos, produzindo padrões de pro
dução de polipeptídeos específicos para o tecido.
Observa çã o gen é tica As proteí nas regulatórias de
açáo trans sc ligam a sequências regulatórias de açáo os para
controlar a transcrição eucartótica .
Conservação da sequência enhancer
Apesar da diversidade das combinações por meio das
quais as sequências e proteínas regulatórias controlam
a transcrição nos eucariotos, os cientistas identificaram
muitas informações ú teis sobre esses componentes regu
latórios. Por exemplo, estudos da composição das sequên
cias enhancers no vírus eucariótico SV40 (vírus símio 40)
revelaram sequências modulares que desde então foram
constatadas como similares às das sequências enhancers
de outros eucariotos. A sequência enhancer do SV40 con-
siste em regiões adjacentes de sequências conservadas, si
tuadas a aproximadamente 200 pb a montante do ponto
de início da transcrição dos genes regulados. Cada um dos
sete segmentos da sequência conservada se liga a proteí
nas regulatórias específicas ( Figura 15.4a ).
Comparações entre as espécies revelam a conser
- a an álise identifica as possíveis sequências enhancers.
Depois, são identificadas as sequências conservadas
que se ligam a proteínas regulat órias. Curiosamente,
as compara ções das sequências conservadas em termos
evolutivos nos genomas do camundongo e do homem
constatam que menos da metade das sequências
conservadas se liga a proteí nas. Sugere -se que essas
sequências conservadas que nã o se ligam a proteí nas
possam ter sua diversifica ção restrita pela necessidade
de serem reconhecidas de modo eficiente pelas proteí
nas regulatórias. Partindo dessa perspectiva , a evolução
-
da sequência enhancer poderia ser desacelerada pela
necessidade de que as sequê ncias sejam reconhecidas
- pelas proteínas regulató rias.
- Sequências ativadoras a montante
em leveduras
A regulação da transcrição pelas sequências enhan -
- cers é bem compreendida na levedura Saccharomyce.s
cerevisiae, na qual a transcrição dos genes envolvidos
na via de utilização da galactose, entre outras, é cui --
- dadosamente regulada por sequ ê ncias similares às en
.
hancers Quando o monossacar ídeo galactose é o único
- açúcar no meio de cultura, as cepas gal da levedura *

vação da sequência de DNA nas promotoras. Isso im-
plica que a seleção natural trabalha para reter a função
enhancer, ou seja, reter a capacidade de se ligar a proteí
nas regulatórias específicas conservando a composição da
sequência. A Figura 15.4b mostra as sequ ências enhancers
do gene betainterferon em vários mamíferos; as abre-
viações representam as proteínas de ligação à enhancer,
ligaçào essa que se baseia em certas sequências. As espé
cies apresentadas na figura compartilham um ancestral
comum a partir do qual as diferentes linhagens divergi-
ram aproximadamente 100 milhões de anos atrás.
A an á lise da sequência genômica aponta para a
probabilidade de forte restrição evolutiva na diversifi
cação da sequência enhancer. Nesses estudos, primeiro
vào induzir a transcrição de quatro genes produtores
de enzima , GAL1, GAL2, GAL7 e GAL10, que, juntos,
- importam a galactose extracelular ( GAL 2) e depois,
através de uma curta série de reações bioquímicas, de-
compõem a galactose intercelular em glicose-1- fosfato
para a glicólise [ GAL1 , GAL7 e GAL10; Figura 15.5).
Cada um dos quatro genes tem sua própria sequê ncia
- promotora , mas a transcrição dos genes é regulada por
outro gene, GAL4, que produz uma proteí na regulat ó-
ria. A prote í na Gal4 é uma proteí na ativadora da trans-
crição que se liga a um elemento similar à sequê ncia
enhancer, chamado sequê ncia ativadora a montante
- ( UAS) ( neste caso, designada UASJ, situada a mon -
tante de cada um dos quatro genes GAL . A proteína

(a)
1 2 3 4 5 6 7
3 ' TTfiGT [ 5'
5‘ AACCAGCTGTGGAA GTC AGTTAG66 TCTGGA A A £TCCCCAfifiCTCCCCA 66CAGG f. A r 3
ÀÇ T A T £ £ AAA ÇÇ AT Q f A T Ç. T. A A T T A Ç T C. Afc Ç AA Ç .

-
GT II GT- I
TC-II
TC I - SpW-ll SpH-l P
Proteí na ligada

( b)

Proteí na ligada ATF Jun IRF IRF IRF IRF -

NF KB
Homem A A A T G T A A A T G A C A T A G G A A A A C T G A A A G6 G A G A A G T G A A A G T G G G A A A T T C C T C T G A A T
Camundongo AAATGACATAGGAAAACTGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGGAAATTCCTCTGA ..
Rato AAATGACGTAGGAAAAGTGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGGAAATTCCTCTGA . .
Su í no
.
A A A T G A C A T A6 G A A A A C T 6 A A A G 6 G A G A A C T G A A A G T G G G A A A T T C C T C T G A A .
Equino AATGTAAATGACATAGGAAAACAGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGGAAATTCCTCTGAA.
Bovino 2 TAAATGACATAGGAAAACTGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGGAAATCTCTCC . * * .
Bovino T A A A T 6 A C A T A 6 G A A A A A T 6 A A A G C G A G A A C T G A A A G T G6 G A A A T T C C T C T

F i g u r a 15.4 Sequências enhancers e as proteínas regulatórias que a elas se ligam, ( a) A sequência enhancer do SV40
contém sete segmentos de sequência curtos, visados por proteínas regulatórias especificas, (b) A sequência enhancer do
betainterferon contém vá rias sequências (caixas coloridas ) conservadas entre as espécies mam íferas. As sequências destacadas
sáo cruciais para a liga ção de proteínas regulatórias espec íficas.
 Cap ítulo 15 Regulado da expressão g ênica nos eucariotos 499

UASc UASC UASc UASc

GAL2 GALJ GALIQ GAL7
Cromossomo 12 Cromossomo 2
Permease Epimerase Transferase Galactoquinase

Galactose
extracelular
Galactose
intracelular
Galactose
fosfato
UDP-
-galactose
UDP-
-q li cose
Figura 15.5 Utiliza çã o da galactose na S. cerevisiae. A utilização da galactose exige a ação dos produtos de cada um dos
Glicose-1
-fosfato
*

— Glicólise

quatro genes de utiliza ção da galactose [ GAL ) .

regulatória GaI4 está sempre disponível nas células da Regiões controladoras de lócus
levedura e interage com a Gal80, o produto do gene
GALRO. Quando a prote í na GalftO se liga à proteí na O gene da betaglobina humana foi o foco da atenção
Gal 4, ela inativa a Gal4 e bloqueia sua capacidade para em um capítulo anterior (ver Capítulo 10). Lembre-se de
ativar a transcrição. que esse gene produz o polipeptídeo betaglobina, duas
As sequ ências UASC são elementos regulatórios de cópias do qual se unem a dois polipeptídeos alfaglobina
ação cis e a proteína Gal4 é uma proteína regulató ria de produzidos pelo gene alfaglobina para formar a molécula
ação trans. Cada elemento UASG contém duas sequên - heterotetramé rica de hemoglobina. No entanto, o gene
cias repetidas de 17 pb que são os sítios de ligação da pro- betaglobina é apenas um dos seis genes globina intima-
teína Gal4. Fm sua forma ativa de ligação ao DNA, a Gal4 mente relacionados que formam o complexo betaglobina
é uma proteína homodimérica, composta de dois poli- no cromossomo 11 humano ( Figura 15.7a ). Situada perto
peptídeos idênticos, que formam dois domí nios ativos. do complexo betaglobina há uma região regulatória co-
O domínio de ligação ao DNA, em uma extremidade do nhecida como região controladora de lócus (LCR ). As
dí mero Gal4, visa às repetições de 17 pb da UASG. O do- LCRs são elementos potenciadores altamente especializa
dos que regulam a transcrição de muitos genes acondicio-
-
mínio de ativação, na extremidade oposta , é um alvo para
a ligação da proteína Gal80. Como a Gal4 e a Gal80 são nados em complexos de genes intimamente relacionados.
produzidas constitutivamente, normalmente se ligam A LCR que regula a transcrição dos genes no complexo
uma à outra no dom ínio de ativaçã o da Gal 4. Nessa con - betaglobina contém quatro sequências regulatórias de
figuração, o domí nio de ligação ao DNA da Gal4 é inativo ação cis diferentes, designadas HS1 a HS4. Juntos, esses
e o dímero não consegue se ligar a UAS . . Sem a ligação elementos orquestram a expressão sequencial do desen -
da GaJ4 à UASC, a transcrição dos genes GAL é impedida (a ) Galactose ausente
( Figura 15.6a ). De modo oposto, quando a galactose está
Gal80
presente, tanto ela quanto a Gal3, o produto proteico de Dom ínio de
outro gene GAL , se ligam à Gal80. A ligação do complexo ativa çã o A Gal4 se liça à GalBO e rvão
Homodlmero consegue se ligar à UA$t>
galacto$e-Gal3 altera a Gal80 e faz que ela libere Gal4. O V
*14 V
d í mero Gal4 livre, então, se liga à UASr e ativa a transcri - í Genes GAL
ção do gene GAL ( Figura 15.6 b ).
No sistema gênico GAL , a Gal4 age como uma Nenhuma transcrição
UASc
proteí na ativadora por seu efeito de inicia ção da trans -
(b) Galactose presente
crição. Sua sequência -alvo de DNA é a UASG, que age
como uma sequência enhancer e é separada das sequ ên - Ga13 A GaBO se liga d Gal3; a
cias promotoras do gene GAL por uma grande quanti- GaM se liga à UAfv eariva
GalSO a transcrição
dade de nudeotídeos. A liga ção da Gal4 leva à forma -
ção de um complexo multiproteico conheddo como
Mediador , que é um acentuassomo que se forma após Homod í mero Dom ínio de ligação ao DNA
a prote í na ativadora Gal 4 se ligar à UAStí. Durante a in - Gal4 Genes GAL
dução da formação de uma alça de DNA, o Mediador
entra em contato com o dispositivo de transcriçã o geral Transcrição

— incluindo o TFIID ( fator de transcrição II D) e a RNA

—
poli mera.se II (Pol II ) em uma sequência promotora
do gene GAL ( ver Figura 8.12). Desse modo, a transcri
ção dos genes GAL pela RNA polimerase II depende da
ativação da transcrição pela Gal4 se ligando aos elemen
tos UASG e provocando a forma ção do Mediador As
sequências enhancers e silenciadoras distantes usam o
mesmo mecanismo de formaçã o da alça de DNA para
regular a transcrição dos genes-alvo.
UASC
Figura 15.6 Regulação da transcrição do gene GAL.
UASCi (a ) Quando a galactose está ausente, a prote í na Gal80
- se liga ao dom ínio de ativação para inativar a proteí na Gal 4 e
bloquear a transcrição do gene GAL. ( b) Quando a galactose
- está presente, a proteína Gal3 se liga à proteína Gal80 para
. impedir que ela se ligue á proteína Gal4. A proteí na Gal4,
por sua vez, usa seu dom í nio de ligação ao DNA para se ligar
a dois segmentos de 17 pb da UASG para ajudar a inkiar a
transcrição do gene GAL.
500 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
( a ) Complexo do gene betaglobina
0 10 20 30 40 50 60 70 kb
i i i i i i
HS4 HS3 HS2 HS1
6
LCR
(b) Expressã o do desenvolvimento dos genes do
complexo betaglobina
100 Gy + Ay
3 «
3
2J 80 -
H ^-
£ 40
3* 20- r£ 6
f Ay
0 -
6 12 18 24 30 36 6 12 18 24 30 36 42 48
Semanas de gesta ção Nascimento Semanas de idade
F i gura 15.7 Controle do lócus e expressão do
desenvolvimento dos genes do complexo betaglobina
humano, (a ) A região de controle de lócus (LCR) do complexo
betaglobina humano contém quatro segmentos regulatórios
( HS1 a HS4). ( b ) A LCR regula a expressão de cinco genes
( 4$ é um pseudogene não expresso) em um padrão de
desenvolvimento compatí vel com a idade gestadonal.
vdvimento dos genes do complexo betaglobina à medida
que um feto se desenvolve durante a gestação. A LCR e
os seis genes que ela regula ocupam pouco mais de 70 kb.
Cada gene do complexo betaglobina produz um po-
li peptídeo globina diferente que confere à hemoglobina
uma capacidade de transporte de oxigénio diferente. Du
rante a gestação, as necessidades de oxigénio do feto em
desenvolvimento mudam à medida que ele cresce e seus
órgãos se desenvolvem. Com o avan ço da gestação, a
transcrição dos genes do complexo betaglobina muda de
um para outro a fim de produzir moléculas de hemoglo-
bina que tenham a capacidade de transporte de oxigénio
exigida pelo feto em desenvolvimento. A ordem de ex-
pressão dos genes do complexo betaglobina corresponde
à ordem em que eles ocorrem no cromossomo. A igura
15.7 b mostra o perfil de expressão desses genes durante
o desenvolvimento. Os componentes HS1 a HS4 da LCR
do complexo betaglobina ligam -se a proteínas regula
tórias que controlam a formação de pequenas alças de
DNA , que servem como uma ponte para as sequências
promotoras dos genes do complexo betaglobina ( Figura
15.8). A composição dos acentuassomos ligados à LCR
varia durante o desenvolvimento para variar também as
alças resultantes e, assim, produzir o padr ão regulado no
desenvolvimento da expressão génica do complexo be-
taglobina. Uma LCR similar conduz a transcrição de um
n ú mero menor de genes no complexo alfaglobí na.
Observa çã o gen é tica As sequências promotoras são
sequê ncias regulatórias de ação cis que se ligam a complexos
contendo proteí nas regulatórias; por sua vez, elas interagem
com sequências promotoras gén ícas específicas para contro
lar a transcrição.
Mecanismo de ativação transcricional pela LCR
Proteínas RNA polimerase
ativadoras
Sequência
promotora
6 £ ** J Transcrição
/
Gene betaglobina
Fatores de •
transcrição
F igura 15.8 Regiã o de controle de lócus do complexo
betaglobina. Combinada com as proteínas regulatórias, que
variam de acordo com o est á gio de desenvolvimento, a LCR
forma alças de DNA que també m variam com o estágio de
desenvolvimento, permitindo que ela ative a transcrição de
genes específicos do complexo.
Proteínas repressoras e
sequências silenciadoras
- Um modo comum pelo qual as proteínas repres-
soras inibem a transcrição nas bactérias é se ligar às se
quências operadoras que se sobrepõem às sequências
promotoras, bloqueando a ligação da RNA polimerase
( ver Capítulo 14). Nos eucariotos, esse mecanismo de ini-
bição da transcrição não é observado. Em vez disso, as
sequências repressoras eucarióticas inibem a transcrição
por meio de outros mecanismos. Um desses mecanismos
é a ligaçã o das sequências repressoras eucarióticas às se-
quências silenciadoras, que são sequências regulatórias
de ação cis que bloqueiam a transcrição evitando direta -
mente a transcrição mediada pela sequência enhancer.
- Os genes de utilização da galactose na levedura ofe-
recem um exemplo desse mecanismo direto de repres
são da transcrição. Quando a glicose está presente no
-
meio de cultura da levedura, a prote í na Migl é produ -
zida. A Migl se liga a uma sequ ência silenciadora loca -
lizada entre a UASG e a sequê ncia promotora do GAL1
( Figura 15.9). Por sua vez, a Migl atrai a prote í na Tupi e,
Repressão da
Tupi transcrição
UASr,
Migl
_ w Nenhuma
transcrição
GALt
F igu ra 15.9 Repressã o da transcrição do gene GAL1
.
da levedura As prote í nas Migl e T u p i ligam se ao sítio
da Migl para reprimir a transcrição quando a glicose est á
dispon ível no meio de cultura.

juntas, essas proteínas formam um complexo repressor
que impede a UASy de controlar a iniciação da transcri -
ção. Outros mecanismos de repressão da transcrição são
discutidos em outras partes do capítulo.
Regula ção da transcrição pelas sequências
enhancers e silenciadoras
As sequências enhancers e silenciadoras que con
trolam a transcrição de um gene podem estar próximas
ou distantes do gene que regulam , embora a formação
da alça de DNA possa trazer para perto até mesmo as
sequências mais distantes. Algumas evidências suge-
rem que às vezes a mesma sequ ência de DNA pode
agir como enhancer ou silenciadora , dependendo das
prote ínas regulatórias que se ligam à sequê ncia. Na le-
vedura , as enhancers e silenciadoras estão situadas re
lativamente perto dos genes que regulam. A LCR do
complexo betaglobina nos seres humanos também
está muito próxima dos genes que regula. No entanto,
muitas vezes a distâ ncia entre uma sequê ncia enhancer
ou silenciadora e os genes que ela regula é grande. Um
exemplo é fornecido pelo gene SHH { Sonic hedgehog ) ,
que nos seres humanos e em outros mam íferos controla
o desenvolvimento dos membros e, em sua forma do
tipo selvagem, produz cinco dedos ( de m ãos e pés) em
cada apêndice. O SHH é expresso de um modo especí
fico para o tecido nos membros, sob o controle de uma
sequê ncia enhancer com 1 milhão de pares de bases (1
megabase) de distâ ncia do gene. A an á lise do sequen -
ciamento genômico revela que, na realidade, a enhancer
do SHH está situada em um íntron de um gene vizinho.
Um modelo geral para a regulação da transcrição
eucariótica precisa retratar a ação caracteristica das se-
quências enhancers e silenciadoras, levando em conta,
ao mesmo tempo, a variabilidade dos locais e seus pa -
drões de regulação específicos para o tecido. O modelo
retratado na Figura 15.10, para o SHH , mostra duas
sequências enhancers que controlam a transcrição do
mesmo gene de um modo específico para o tecido. Nesse
exemplo, o gene SHH aparece expresso no cérebro e nos
membros. A transcrição nesses tecidos é controlada por
diferentes proteínas regulatórias e fatores de transcrição
produzidos em cada tipo de célula. Uma combinação de
proteínas regulató rias se liga a uma sequência enhancer
nas células cerebrais, mas uma combina çã o diferente de
proteínas regulató rias se liga a uma sequência enhancer
alternativa nas células dos membros. As diferentes pro-
teínas regulatórias presentes nos diferentes tipos de
células levam a padrões de expressã o do gene-alvo, es-
pecíficos para o tecido, produzindo um polipeptídeo
diferente em cada caso. Modelos similares retratando a
ligação das proteínas repressoras às sequê ncias silencia -
doras descrevem como as sequê ncias silenciadoras dis
tantes conseguem inibir a transcrição dos genes visados.
Esse modelo ilustra um aspecto importante da regu
lação da transcrição eucariótica. Somente quando todos
os fatores de transcrição e proteínas regulatórias necessá -
rias estão presentes em uma célula, pode ocorrer a mon -
tagem dos complexos proteicos necessários para o padrão
Cap ítulo 15 Regulado da expressão g énica nos eucariotos 501
(a ) Células cerebrais
Fatores de transcrição
específicos para o cérebro
Sequência
enhancer Gene SHH
cerebral
0
-
r'
Sequência
enhancer
do membro v
( b ) Células do membro
Fatores de tTanscrição
espec í ficos para o membro
ir? '
-
1 Gene SHH
Sequência Sequénda
enhancer cerebral enhancer
do membro
Figura 15.10 Açã o enhancer específica para o tecido.
( a ) A sequência enhancer espec ífica parao cérebro se liga
a fatores de transcrição específicos para o cé rebro e ativa a
transcrição do SHH nas células cerebrais, ( b ) Uma sequ ê ncia
- enhancer diferente especifica para o membro se liga a fatores
de transcrição diferentes espec íficos para o membro a fim de
expressar o SHH de modo diferente nas células dos membros .
de transcrição específico para o tecido ou para o estágio de
desenvolvimento. Os complexos proteicos montados nas
sequências regulatórias controlam determinados padrões
de expressão ativando a transcrição de certos genes, ao
mesmo tempo bloqueando a transcrição de outros genes.
Os polipeptídeos que acabam sendo produzidos em cada
célula ou em cada estágio do desenvolvimento conduzem
os processos que tomam as células características e levam
às mudanças de desenvolvimento observadas.
Sequências isolantes
-
Considerando se que as sequências enhancers podem
estar situadas bem longe dos genes que regulam, quais
mecanismos controlam a açào enhancer para o gene pre-
tendido e longe dos genes mais próximos que não são re
gulados pela mesma sequência enhancer? A resposta se
-
encontra nas sequências isolantes, que são sequências de
ação cis situadas entre as sequências enhancers e promoto -
ras dos genes que devem ser Isolados dos efeitos da sequ-
ência enhancer. As sequências isolantes são sequências de
ligação à proteína que direcionam as sequências enhancers
a interagirem com a sequência promotora pretendida e que
- bloqueiam a comunicação entre as sequências enhancers e
outras sequências promotoras ( Figura 15.11). O mecanismo
- dessa atividade pode consistir em permitir a formação de
alças de DNA contendo sequências enhancers e suas pro-
motoras-alvo, impedindo ao mesmo tempo a formação das
alças de DNA contendo uma sequência enhancer e uma
promotora que não são seu alvo.
 502 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Mutações das enhancers

Tanscriçáo
do gene A Nossas discussões anteriores sobre mutações des-
r A atividade
enhancer ajuda a creveram muitas maneiras em que as mudanças no DNA
Enhancer Promotora Gene A iriciar a transer çáo. podem resultar em polipeptídeos anormais ou em níveis
ATIVADO anormais de produçào desses polipept ídeos. Aqui, toma-
mos um tempo para considerar exemplos de mutações
Isolante das sequências enhancers que são a causa de transtornos
A sequência
hereditários nos seres humanos.
isolantebtoQjeiaa O termo talassemia é usado para descrever certas
açáo da enhancer anemias hereditá rias nas quais a mutaçáo leva a um dese-
Enhancer Promotora Gene A ePoGe quilíbrio de produção dos polipeptídeos alfa e betaglobina.
DESATIVADO Esse desequilíbrio reduz a quantidade de hemoglobina
funcional, já que cada molécula precisa de uma quanti-
(0 Isolante dade igual dos dois polipeptídeos. Muitos tipos diferentes

- /® _
de talas&emia resultam de mutações diferentes dos genes
.enhoncer
..rec econara
'
para
alfa e betaglobina. No entanto, em alguns pacientes de
outro gene.
talassemia nenhuma mutação de qualquer um dos genes
Gene 8
ATTVADCA
\Enhancer Promotora Gene A
DESATIVADO
globina foi detectada. Além disso, as sequências promo-
Promotora toras de ambos os genes eram do tipo selvagem, então a
busca pela origem das mutações nesse grupo de pacientes
(d)
Isotante Uma determinada teve de ser ampliada. F.m vá rios casos, as mutações perti-
enhancer ativa um nentes à talassemia devem -se a mudanças por deleçào ou
gene prefe^enclal-

Enhancer
J4£
Promotora Gene A
, menteem
detfmenco de um
gene vtz nho cu>a
reorganização cromossômica que alteram a LCR de um
dos complexos gênicos de globina. Essas deleções resul-
tam em mutações da sequência enhancer que alteram o
ATIVADO ação está
boqueada
nível de transcrição dos genes afetados e levam a um de -
sequilíbrio na produçào de polipept ídeos.
As mutações por substituição de bases nas enhancers
(e )
Gene B sào outra fonte de disfunção das sequências enhancers. A
DESATIVADO sequência enhancer do SHH , localizada a 1 megabase do
As isolantes pedem gene SHH que ela regula, sofre mutação em certos casos
controlaras
Promotora 1 informações das de uma condição chamada polidactilia, na qual dedos ex-
Enhancer Promotora 2 alças de DNA que tras nas mãos e pés podem se formar durante o desenvol -
daTATA box da TATA box contém enhancer e
vimento. Os dedos extras resultam da expressão anormal
os genes que
ativam. do gene SHH. Em estudos de certas famílias humanas
Gene A com polidactilia, foram identificadas substituições de uma
ATIVADO Isolante única base na sequê ncia enhancer do gene SHH. Além
disso, estudos em camundongos nos quais uma deleçào
Figura 1 5.1 Interações entre as sequências isolante e
enhancer .
da sequê ncia enhancer do SHH ocorreu revelaram ano-
malias importantes no desenvolvimento dos membros.
Certas sequências isolantes tê m uma função dife-
rente, ou seja, parar a disseminação da heterocroma - Observa çã o gen é tica As sequências silenciadoras e
isolantes direcionam a ação das sequências enhancers para
tina. Por exemplo, a variega çào do efeito de posiçã o
( PEV) nas moscas-da - fruta é observada nas inversões certas sequências promotoras e para longe de outras. As mu-
do cromossomo X que levam o gene hranco para mais tações das sequências enhancers podem alterar os padrões
perto do centrô mero ( ver Figura 11.16) A dissemina . - normais de expressão gênica.
ção da heterocromatina centromé rica que impede a
transcrição gê nica é controlada pelas sequê ncias iso-
lantes. Nesse caso, sua fun ção é evitar a disseminação 15.2 A remodela ção da cromatina
descontrolada da heterocromatina após a replicaçào, regula a transcriçã o eucariótica
impedindo, assim, que a expressão dos genes críticos
seja bloqueada. Até este ponto no capítulo, descrevemos a regula-
No fim das contas, o que importa a respeito das se - ção da transcrição em termos das interações entre as
quências enhancers , silenciadoras e outras sequências proteínas regulató rias e as sequ ências regulatórias. Em
regulatórias é o seu efeito na transcrição. As enhancers um sentido, esse padrã o de regulação é análogo, embora
e silenciadoras contêm sequências que atraem determi
nadas proteínas e que podem controlar a transcrição dos
- mais complexo, aos processos descritos para regular a
transcrição nas bactérias ( ver Capítulo 14). Entretanto,
genes em determinados tecidos ou em momentos espe- a característica definidora do DNA eucariótico é o
cíficos durante o desenvolvimento ( ver Capítulo 20) . acondicionamento em cromatina . Como, então, os fato-
 Cap ítulo 15 Regulado da expressão g énica nos eucariotos
-
res de transcrição ativadores e repressores ligam se ao
DNA regulató río acondicionado em cromatina ? Exis
tem trés mecanismos básicos pelos quais as proteínas
- associação dos nucleossomos com sequência de DNA re
de ação trans acessam sequências de DNA regulatórias
específicas nos cromossomos eucarió ticos. Primeiro, al-
gumas sequê ncias regulatórias não se ligam fortemente
às histonas, que, com isso, permitem a entrada mais ou
menos direta para o DNA regulatóí r o. F.ssas sequê ncias
incluem as sequê ncias “ ligadoras" entre os nudeosso -
mos e as sequências com características específicas que
impedem as histonas de se ligarem eficientemente.
Segundo, proteínas chamadas remodeladoras de
cromatina podem mudar enzimaticamente a distribui
ção ou a composição dos octâ meros de histona ( nucleos -
somos). Essas enzimas remodeladoras possuem três
modos de opera çã o. Um tipo de enzima rcmodeladora
da cromatina reorganiza os nucleossomos induzindo sua
movimentação. Essas enzimas normalmente reprimem
a transcrição movimentando os nucleossomos. Um se-
gundo tipo de enzima remodeladora da cromatina muda
a organização dos nucleossomos deslizando- os ao longo
-
do cromossomo ou movendo os do DNA. Essas enzi
mas costumam funcionar descobrindo as sequências
- a jusante, da NDR. O nucleossomo a montante, identifi
enhancers ou promotoras e, assim, estão associadas com
a ativação do gene. O terceiro tipo de enzima remodela
dora da cromatina muda a composição dos octâ meros
de histona, substituindo determinadas proteínas histona
por proteínas de versões diferentes. Essas mudanças
estã o associadas com a ativação gé nica. As enzimas re-
modeladoras da cromatina são recrutadas para sítios es-
pecíficos na cromatina pelos fatores de ação trans que se
ligam a sequências de DNA específicas.
Finalmente, proteínas chamadas modificadoras de
cromatina podem modificar enzimaticamente as histo
nas adicionando ou removendo grupos meti la ou ace-
tila em resíduos de aminoácidos específicos, com mais
frequência as Usinas, das proteínas histona. A adição
dos grupos acetila está associada com a ativação génica,
-
encontrando se caracteristicamente na eucromatina.
Por outro lado, a remoção dos grupos acetila e a adição
dos grupos metila a resíduos de lisina específicos estão
associadas com a repressão génica, sendo caracteristi
camcnte encontradas na hctcrocromatina. Assim como
as enzimas remodeladoras da cromatina, as enzimas
modificadoras da cromatina são recrutadas para sítios
específicos na cromatina por fatores de ação trans que
se Ugam a determinadas sequências de DNA.
Essa combinação de atividades determina o acesso
relativo dos fatores de transcrição de ação trans às se-
quências de DNA de ação eis em determinadas células,
em momentos diferentes do desenvolvimento do orga
nismo e em certas condições fisiológicas. Assim, as re
modeladoras e modificadoras da cromatina medeiam a
transição reversível do DNA heterocrom á tico inativo
para o DNA eucromá tico ativo.
Promotores abertos e cobertos
Dois estados contrastantes de associação dos nudeos-
somos com sequências promotoras, conhecidos como
promotores abertos e promotores cobertos, encontram -se
503
em extremidades opostas de um conjunto continuo de
gulat ór ía. A maioria dos promotores cai em algum ponto
-
entre esses extremos no que diz respeito à sua associação
com os nucleossomos, mas um exame dos promotores
abertos e dos cobertos pode nos ajudar a compreender
como a estrutura de cromatina contribui para a regulação
da transcrição.
Os promotores abertos fazem que os genes sejam
transcritos constitutivamente. Esses promotores têm
uma região sem nucleossomos ( NDR ), que é uma região
de 150 a 100 pb contendo poucos nucleossomos situados
- imediatamente a montante do início da transcrição. Esses
promotores geralmente não contém uma TATA box. Em
vez disso, uma região rica em adenina c timina, conhe-
cida como trato poli A/T, está situada na NDR, perto
.
do sítio de inicio da transcrição ( Figura 15.12a ) O trato
poli A/T contém sequências de ligação ( BS) que atraem
as ativadoras da transcrição ( ACT). Essa região de liga -
ção normal mente é ladeada por sequências que ajudam a
posicionar dois nucleossomos, um a montante e o outro
cado como o nucleossomo *1, é posicionado no sítio de
-
início da transcriçã o. Esse nucleossomo + 1 contém uma
-
( a ) Promotor aberto
- -
Nucleossomo 2 Nucleossomo 1 Nucleossomo +1 Nucleossomo +2
da transcrição
Trato poli A/T
(sem TATA box)
-
(b) Promotor coberto
O Ligação da attvadora
Nucleossomo +1 Nucleossomo +2
- A
\
TATAbax Deslocamento
do nucleossomo
O Remodelação da cromatina
e ligação adicional
- X
- «009 MAcrmmo LM
Figura 15.12 Transcrição dos promotores abertos e
cobertos, (a ) Os promotores abertos possuem uma região
sem nucleossomos ( NDR) e nenhuma TATA box. As proteí nas
ativadoras (ACT) são atra ídas para as sequências de ligaçã o
( BS ) para recrutarem a RN A polimerase II para transcrição.
(b) Com os promotores cobertos, a transcrição é ativada
pela ligação da proteí na ativadora e pelo deslocamento dos
nucleossomos.
504 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
versão da proteí na histona 2A, conhecida como H2AZ,
que é facilmente modificada para a remoção do sítio de
início da transcrição durante a iniciação dessa trans-
crição, permitindo que a RNA polimerase II se ligue e
acesse a sequência de início da transcrição.
Por outro lado, os promotores cobertos caracteri -
7.am os genes cuja transcrição é regulada . A transcrição
desses genes é bloqueada até os nucleossomos serem
deslocados ou removidos do promotor para permitir
que as ativadoras da transcri ção se liguem às sequências
necessá rias , um evento que leva à ligação da RNA po-
limerase 11 e à iniciação da transcrição ( Figur » 15.12 b ).
Geralmente esses promotores contêm TATA boxes
e outras sequências de ligação ao fator de transcrição.
Nos promotores cobertos, há uma competi ção ativa
entre os nucleossomos e os fatores ativadores da trans - somo. Segundo, os remodeladores de cromatina podem
crição pela ligação. Em consequência, são necessá rios
mecanismos regulat órios que remodelam a cromatina
para conceder às proteínas ativadoras o acesso às sequ-
ências de ligação a fim de iniciar a transcrição.
Remodelação da cromatina pela
modificação de nucleossomos
A remodelação da cromatina se refere às modifica -
ções da cromatina que reposicionam os nucleossomos de
modo a abrir ou fechar os promotores e outras sequências
regulatórias. Mover os cromossomos para fora das sequên-
cias regulatórias melhora o acesso a elas pelas proteínas re-
gulatórias ativadoras da transcri ção. A cromatina aberta é
aquela em que a associação do DNA com os nucleossomos
é relaxada nas regiões que contêm sequências regulatórias,
permitindo o acesso das proteínas regulatórias. As modi -
ficações que fazem que o DNA regulatório seja coberto
por nucleossomos, restringindo com isso o acesso das pro-
teínas regulatórias às sequências, produzem cromatina
fechada. Nela, as sequências regulatórias não podem ser
acessadas de modo eficiente pelas proteí nas regulat órias e
os genes sào silenciosos na transcrição.
Os biólogos moleculares conseguem determinar
experimentalmente se uma região do DNA contém
cromatina fechada ou aberta avaliando a sensibilidade
da região à enzima de digestão do DNA , a DNase I .
Essa enzima corta o DNA aleatoriamente nas regiões
de cromatina aberta , mas não é capaz de fazê- lo onde
a cromatina é fechada . As regiões de cromatina aberta,
sensíveis à digestão pela DNase I , são conhecidas como
sí tios hipersens íveis à DNase I . Onde a hipersensibi -
lidade à DNase I é detectada , os genes possivelmente
podem ser transcritos. A aná lise experimental do DNA
quanto à hipersensibilidade à DNase I se parece com a
análise de proteção da impressão digital do DNA, des-
crita na Técnica de Pesquisa 8.1 ( página 271). Os frag -
mentos de DNA criados pela exposição à DNase I são
separados e analisados pela eletroforese em gel.
A hipersensibilidade à DNase I ocorre na vizinhança
imediata dos genes transcritos e também podem surgir mil
pares de bases ou mais a montante ou às vezes a jusante
dos genes transcritos. As regiões hipersensíveis circundam
as sequências promotoras, enhancers e outras sequências
regulatórias da transcrição. Os complexos de cromatina
aberta detectados pela hipersensibilidade à DNase I são os
sítios de ligação das proteínas ativadoras da transcrição e
para a própria transcrição ( Figura 15.13). A Análise Gené-
tica 15.1 vai guiá- lo por uma análise da presença de hiper-
sensibilidade à DNase I em uma região do DNA.
Os remodeladores de cromatina são os comple -
xos proteicos que executam a remodelação da croma -
tina movimentando os nucleossomos de duas maneiras
principais (Figura 15.14), Primeiro, os remodeladores
de cromatina podem fazer que os nucleossomos desli -
zem ao longo do DNA . Nesse processo, o DNA se en -
rola no nucleossomo até as sequências promotoras ou
enhancers se livrarem de sua ligação com o nucleos-
fazer que os nucleossomos sejam realocados de uma
molécula de DNA para outra .
Uma série de remodeladores de cromatina diferen -
tes é conhecida. Três das categorias mais compreendi -
das, classificadas por suas funções principais, são o com-
plexo SWI / SNF, que desliza e realoca os nucleossomos; o
complexo 1SWI , que ajuda a direcionar o posicionamento
dos nucleossomos; e o complexo SWRI , que substitui a
versão de proteí na histona 112AZ nos nucleossomos, no
lugar da proteína H2A mais comum.
(a ) Cromatina fechada
Insensível à DNase I e silenciosa na transcrição.
Nucleossomo Sequência promotora Gene
L- Sítio de inicio
Sequência da transcrição
enhancer
( b ) Cromatina aberta
Os nucleossomos são deslocados e a ativadora se liga
Ligação da ativadora
z
— '
T .~
A RNA pol lie os fatores
de transcrição se ligam
A hipersensibilidade
à DNase I é detectada
apõs o deslocamento
à sequência promotora. do nucleossomo
A pol II
Hipersensibilidade
per -\ ‘.tente à DNase I
A transcrição é iniciada.
-
RNAm 5'
r L*
Figura 15.13 Estrutura de cromatina aberta e
fechada, (a) A cromatina aberta é inacessível para as
proteí nas transcriclonais e Insensível à digestão pela DNase I.
(b ) A cromatina aberta se liga às proteínas transcricionais e é
hipersensível à DNase I.
 Capitulo 15 Regulado da expressão génica nos eucariotos 505

AN Á LISE GENÉTICA
A enzima tecidual TE2 é expressa em vá rios tecidos de camundongo
em momentos diferentes durante o ciclo de vida . Fragmentos de DNA
idênticos foram isolados de uma região imediatamente a montante de
Regiã o a montante
TE2 e analisados quanto à hlpersensibilldade à DNase I. O DNA foi co - de TE?
lhido do coração (W), rim (K) e timo (T) de camundongos embrionários
(E) e adultos (A). Na análise, um marcador radioativo foi vinculado a uma
DNA a montante deTE2 GQ)OGt
extremidade de cada fragmento de DNA e as amostras de cada tecido
foram expostas à DNase I para determinar se as regiões a montante de Marcador ^
radioativo Tratamento
TE2 eram hipersensíveis à DNase I. O DNA de cada amostra foi separado com DNase I
pela eletroforese em gel e os resultados são os exibidos a seguir. I
.
a Com base nos resultados do gel, há evidência de que a remodelação
da cromatina desempenha um papel na expressão da TE21 Explique IT TTimoT TRim1
seu raciocínio . E
çã
Cora o
A E A E A
.
b Em qual (ou quais) teddo(s) e em que momentos durante o desenvol- ri
0
vimento os resultados indicam maior probabilidade de ocorrência da
expressão da TE21
5
5

©
Gel de eletroforese

Estrat égias de solução Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema diz respeito a uma análise experimental de hipersensibilídade á
este problema e explique a natureza DNase I na região a montante (isto é, região promotora} de TE2 As respostas .
da resposta solicitada. exigem a interpretação dos resultados experimentais com relação à estrutura
de cromatina e â expressão gènica .
.
2 Identifique as informações críticas .
2 Os resultados da eletroforese em gel são fornecidos para fragmentos de DNA
fornecidas no problema. idênticos, provenientes de coração, timo e rim, embrionários e adultos. Todos os
fragmentos de DNA foram expostos à DNase I.
DICA: A NpefsmsJbdidxte DNase lé terectadiquardo a estrutura
*
de cromatlrw e aberta e possivelmente acesstoe As proteínas atlvadc-
Deduzír * 4 trarvKrKâa A cromatina fechada nèo e hlpetsenstae DNase I
** * *
® Compare e diferencie o significado 3. Uma série contínua de faixas digeridas pela DNase I indica hipersensibilídade
de uma série continua de faixas em a essa enzima. A hipersensibilídade está correlacionada com cromatina aberta
algumas pistas do gel versus as pistas .
que é acessível para a transcrição As lacunas entre as faixas de gel indicam que
em que são observadas lacunas nas certos comprimentos do fragmento de DNA náo são criados pelo tratamento
.
faixas .
com DNase I Esse resultado sinaliza a ausência de hipersensibilídade à DNase I
nessas regiões e sugere uma estrutura de cromatina fechada e sem transcrição .
.
4 Avalie o gel e descreva os padròes .
4 Os padrões de faixas descontínuas são observados no DNA do coração humano
das faixas com digestão pela DNase I adulto e do timo embrionário. Essa ausência de hipersensibil í dade à DNase I su-
em cada amostra. gere estrutura de cromatina fechada. Cada uma das outras amostras de DNA
indica hipersensibilí dade à DNase I.

Solucionar Resposta a
.
5 Determine se os dados do gel indi- .
5 Os resultados da hipersensibilídade à DNase I indicam padrões diferenciais de
cam modificação da cromatina perto expressão de TE2 em diferentes tecidos e em diferentes momentos do desenvol -
de TE2 . .
vimento em razão das modificações da cromatina A hipersensibilídade à DNase I
resultante da cromatina aberta aparece no DNA do rim embrionário e adulto, do
coração embrionário e do timo adulto. A hipersensibilídade não é observada no
DNA do coração adulto ou do timo embrionário, indicando cromatina fechada .
Resposta b
6. Mencione os tecidos em que TE2 è 6 A expressão de TE? tende a ocorrer nos estágios embrionário e adulto do rim,
expresso e descreva o tempo de de- .
no coração embrionário e no timo adulto A expressão de TE? náo tende a ocor-
senvolvimento. rer no coração adulto ou no timo embrionário.

Para pratkar mais, ver Problemas 3, 17 e 18 .

506 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
(a ) Deslizamento do nucleossomo
Sequência enhancer
Sequê ncia promotora Sj
*.
( b) Reposlclonamento do nucleossomo
1ÍDNA 1
Figura 15.14 Deslocamento do nucleossomo para expor
sequências regulatórias. (a ) O nucleossomo pode ser
deslocado por deslizamento ou ( b) pode ser reposicionaòo
em outras regiões do DNA.
Complexo SWI /SNF
1
tegoria de remodeladores da cromatina foi descrita pela
-
Pronunciado “ switch sniff , essa ca
primeira vez na levedura e hoje se sabe que ela atua em
todos os eucariotos. Ela foi descoberta pela análise das
mutações que afetam duas atividades da levedura que
nào guardam conexào uma com a outra. Um conjunto
de mutados da levedura foi incapaz de mudar o tipo de
acasalamento (SW1), um processo ligado à capacidade
das cepas de levedura haploides para se fundirem e for -
marem cepas diploides. As mutações SWI resultam de
alterações de qualquer um dos três genes, designados
SWI1, SW12 e SW13. Um segundo conjunto de muta -
dos consiste nos n ã o fermentadores e sucrose (SNF). Os
mutados SNF perdem a capacidade para crescer em um
meio contendo o açúcar sucrose em decorrência da mu-
tação de qualquer um dos três genes, designados SNF2,
SNFS e SNF6. A descoberta de que o SWI2 e o SNF2 são
o mesmo gene indicou que a atividade bloqueada nos
mutados SWI e SNF era mais do que apenas mudar o tipo
- Desmetilaçào
de acasalamento ou a capacidade para iniciar a transcri
ção dos genes necessá rios para a fermentação da sucrose.
A pesquisa revela que o complexo SWI / SNF é
composto de 8 a 12 proteí nas. As proteínas específicas
e outros detalhes da composição do SWI /SNF variam
um pouco entre as espécies eucarióticas, mas em cada
espécie o complexo age na abertura da estrutura de
cromatina e no deslocamento ou ejeção dos nucleos - SWI/SNF, provoca a abertura da cromatina.
somos. Essas ações expõem as sequências promotoras
e outras sequ ências regulató rias para permitir a ligação
dos fatores de transcrição ou das ativadoras que ajudam
a iniciar a transcrição ( Figura 15.15 ). A desmetilaçào e
a acetilação de certos aminoácidos dos nucleossomos
também podem ocorrer durante a ativação da transcri -
ção, como discutiremos em breve.
Complexo ISWI Os remodeladores de cromatina do
complexo ISWI agem basicamente no controle do po-
sicionamento dos nucleossomos em um arranjo que
torna a região silenciosa na transcrição. Essas proteí nas
têm capacidade para " medir ” o comprimento do DNA
ligador entre os nucleossomos ligados para dispor os
nucleossomos em intervalos regulares, nos quais irão
cobrir os promotores, impedindo assim que as proteí
nas regulatórias tenham acesso à TATA box e a outras
-
sequências regulatórias. Existem algumas evidê ncias de
que certas modificações dos nucleossomos podem blo-
quear a atividade ISWI, por um processo que poderia
estar relacionado à abertura da sequência promotora e
da estrutura de cromatina ( Figura 15.16).
Complexo SWR 1 Esse complexo é responsável por
substituir a proteína hislona comum 2A dos nucleosso-
mos por uma versão conhecida como H2AZ, que difere
da forma mais comum pelas diferenças dos aminoácidos
internos e diferenças na cauda proteica aminoterminal
( N- terminal ). As diferenças encontradas na H 2AZ alte-
ram seu pareamento com outras proteínas H 2A e suas
interações com os tetrâ meros H3/ H4 no nucleossomo.
A H2AZ é encontrada principalmente no nucleos-
somo +1, que está associado com o início da transcrição.
Essas sequências promotoras contém frequentemente
NDRs e tendem a ser transcritas constitutivamente. Em al-
gumas espécies, a H2AZ é encontrada em outros nucleos-
somos que circundam o início da transcrição. As an álises
hincionais em vá rias espécies sugerem que o papel da
H2AZ é exercido na criação de nucleossomos instá veis
que poderiam então ser deslocados, ejetados do DNA ou
modificados para regular a transcrição ( ver Figura 15.16).
(a ) Cromatina fachada
Nudeossomo Sequê ncia promotora Gene
—
I sítio de inicio
da transcri ção
.
Sequestrada pela cromatina a sequência promotora não é
fadimente acessível então o nrvel de transcrição é babeo.
( b ) Cromatina aberta
tt
Promotora
AC AÇ
hipersensí vel
á DNase I
±r.
«vvi®jO
<
r -Cfc
.
A acetilação c desmetilaçào das proteí nas hislona
com o reposioonamento dos nudeossemos pelo
(c ) Iniciaçã o da transcrição
RNApolll
^r
Os fatores de transcrição e a BNA polimerase ganham
acesso às sequências promotoras ra cromatina
I
aberta paraWt íar a transcr çâo.
Figura 1 5 . 1 5 Função do complexo proteico SWI /SNF.
 Cap ítulo 15 Regulado da expressão g énica nos eucariotos 507

Ativadora da
transcrição Deslocamento
© SWI
Fam ília do nixleossomo
TATA
box
Montagem e
organiza çã o do
ACT -9 /SNI
nudeossomo Ejeçã o do

o o SWR nudeossomo

02009 Macmdan LM
^ Complexo
remodelador
da cromatina
-i 1

Inserção da
historia H2 AZ
Figura 15.16 Ações dos complexos remodeladores de cromatina. O OISWI monta e organiza os nucleossomos em um
padrão regular e contribui piara a repressão da transcrição. O A fam ília SWI /SNF abre a estrutura de cromatina e ajuda a iniciar a
transcrição realocando os nucleossomos para longe das sequê ncias regulatórlas ou ejetando os nudeossomos. O O SWR 1 insere
a proteína histona modificada H 2 AZ nos nucleossomos para ajudar a facilitar o deslocamento.

micas nos nudeossomos ocorrem por meio da adi ção e

Observa çã o gen é tica Os remodeladores de cromatina
são complexos proteicos que alteram a arquitetura de cro-
matina nas sequé ndas promotoras para regular o acesso das
proteínas alivadoras da transcrição às sequências regulatórias.
Modificações químicas da cromatina
As proteínas chamadas modificadoras da croma
tina modificam quimicamente as proteínas histona nos
nucleossomos adicionando ou removendo grupos quí
micos específicos. Essas modificações alteram a força de
associação entre os nucleossomos e o DNA. As mudanças
podem provocar o relaxamento da estrutura de croma
tina , levando a promotores abertos e à ativação da trans-
crição, ou podem levar a estruturas promotoras fechadas
que inibem a transcrição. As principais modificações quí-
Q Nenhuma transcrição A proteína repressora recruta
Repressora e
recrutamento'*. Comple>
.
s a HDAC historias desacetila -
'
das Não ocorre transcrição.
daHDAC KHDAC ;
remoção de grupos acetíla e metila em aminoá cidos es-
-
pecíficos na região N terminal (aminoterminal ) das histo-
nas. Com menos frequência, a adição ou remoção de gru -
-
pos fosfato modifica o domínio N terminal das histonas.
A modificação química mais comum associada à
abertura da estrutura do cromossomo é a adição de grupos
acetila (COCH,) pelas histonas acetiltransfera.se (HATs) .
As HATs são enzimas modificadoras de cromatina que
- adicionam grupos acetila a aminoácidos específicos carre-
-
gados positivamente nas caudas N terminais das histonas.
- Em sua forma não acetilada, esses aminoácidos carregados
positivamente promovem a adesão do nudeossomo ao
DNA carregado negativamente. A acetilaçá o neutraliza a
- carga positiva e relaxa a grande preensão que os nudeos-
somos têm no DNA. O aminoáddo lisina é comum nas
caudas N- terminais, sendo um alvo frequente das HATs.
( )s grupos acetila na lisina e em outros aminoáddos N
terminais são removidos pelas histonas desacetilases
-
(HDACs), uma modificação associada com o fechamento
da estrutura de cromatina (Figura 15.17) .

0 Recrutamento da
e ativadora
HAT A ligação da pioteina
atroadora recruta o complexo
Cromatina fechada
insensível à DNase I — Ativadora
Complexo
HAT
HAT; histonas aretiladas

t. -
0 Transcrição ativada
Ativadora
Cromatina aberta
—
hipersensí vel à DNase I

jrrT
r
RNAm 5* . — -
A ligação da PNA pol II
Inicia a transcrição
Figura 15.17 Acetilaçá o e desacetila çá o na estrutura de cromatina aberta e fechada. As proteí nas histona desacetilases
( HDACs) desacetilam os aminoá cidos nas caudas N-terminais de proteí nas histona e fecham a estrutura de cromatina As histonas .
acetiltransferases ( HATs) acetilam os aminoácidos N terminais e ajudam a abrir a estrutura de cromatina para ativar a transcrição.
508 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Uma segunda modificação química comum dos ami

nnácidos nas caudas N-terminais das proteínas histona é a
-
H 2AN C
metilaçâo, a adição de grupos metila (CH3 ) pelas histonas 5 KK
niutil transicrases ( HMTs) modificadoras da croma tina. 1 4 5
A lisina é visada frequentemente para metilaçâo, mas a ar -
gí nina também é um alvo. A metilaçâo exerce um papel h h rh
na conversão da cromatina aberta para cromatina fe
chada com a dcsacctilaçào. De modo oposto, a dcsmctila-
- H2BN
K K S K
ção, com a acetilação, forma cromatina aberta. A desmeti
laçâo é executada pelas histonas desmetilases ( HDMTs).
- 5 12 1415

Às vezes, a fosforilação e a desfosforilaçáo, a adição e re

moção de grupos fosfato, respectivamente, também estão
- H3 N
*
rí h:r h h Tr * C
TK K S T K R K K K S K
associadas com a modificação da estrutura de cromatina. 3 4 9 101114 1718 23 27 28 36

Observa çã o gen é tica Os modificadores de cromatina

alteram a estrutura de cromatina adicionando ou removendo
grupos qu í micos das caudas N-terminais das proteí nas his-
tona, influenciando, assim, a transcrição.
A lisina (abreviada como K) é o aminoácido N -termi
nal mais visado para acetilação e também pode ser visado
.
para metilaçâo Figura 15.18) A arginina (abreviada como
R ) é um alvo comum para metilaçâo e os aminoácidos treo-
nina (T) e serina (S) sáo alvos da fosforilação. Na maioria
dos casos, esses aminoácidos são alvos de um único tipo de
alteração, mas certos resíduos de lisina são objeto de com
petição entre as HATs e as HMTs. Por exemplo, na H3
( proteína histona 3), os aminoácidos lisina (K) nas posições
4, 9 e 27 podem ser acetilados ou metilados. A acetilação
desses resíduos de lisina ocorre na cromatina aberta, en
quanto a metilaçâo ocorre na cromatina fechada.
Várias modificações químicas dos aminoácidos
N- terminais são necessá rias para remodelar a croma-
tina da estrutura fechada para a aberta e vice versa. Ne
nhum evento isolado de acetilaçã o ou metilaçâo deter-
- -
mina a estrutura da cromatina. Em vez disso, mais de
150 modificações químicas identificadas que tornam a
estrutura da cromatina dinâ mica estão ligadas à ativi
dade transcricional ou ao sllendamento dos genes.
Como diferentes padrões de modificações das cau -
das histona levam a maiores ou menores quantidades
de transcrição ao contribuírem para a abertura e o fe-
chamento das estruturas de cromatina, os biólogos mo-
leculares Thomas Jenuwein e C. Davis Aliis sugeriram
que existe um “código histona". Esse código especulativo
consistiria em diferentes combinações de modificações
químicas nas caudas histona N - terminais, resultando em
mudanças diferentes na estrutura de cromatina. Mais re-
H4 N
h h h ^ C
S RK K K K K
1 35 8 12 16 20
-
Figura 15.18 Aminoáddos alvo da acetila ção, metila çâo
e fosforilação nas caudas histona N-terminais. Os
- numeros sáo as posições dos amlnoácidos em cada histona.
alvos concorridos para acetila ção e metila çâo.
-
Trés posições do am í noácldo lisina na H3 K4, K9 e K27 - sáo
ccntemente, dois estudos examinando diferentes aspectos
- da complexidade da cromatina em dois eucariotos distan -
tes evolutivamente sugerem que existe cromatina em ape-
nas uma quantidade limitada de estados diferentes (Ta-
bela 15.2 ). Examinando a complexidade combinatória das
- modificações da cromatina nas células da Drosophila em
2010, Guíllaume Filion e colegas identificaram cinco tipos
principais de cromatina , cada um designado por uma cor
(a palavra grega chroma significa “cor"). Um estudo simi-
lar da cromatina na Arabidopsis, realizado por François
Roudier e colegas em 2011, examinou as modificações
na histona e a metilaçâo do DNA para identificar quatro
estados proeminentes da cromatina (CS) que correspon-
- dem aproximadamente aos da Drosophila Esses estudos
refinaram nossa opinião anterior sobre a heterocromatina
.
e a eucromatina ao definir características moleculares es-
pecíficas dos diferentes estados da cromatina.
Um exemplo de regulação da transcrição
na 5. cerevisae
Para ilustrar o papel das modificações da croma
tina na iniciação da transcrição, passamos para a re-
-
gulação da transcrição do gene PH05 na espécie de

Tabela 15.2 Principais estados da cromatina na Drosophila e na Arabidopsis

Drosophila Arabidopsis Funçã o do estado da cromatina
Amarelo CS1 Transcrição gènica ativa (eucromatina )
Vermelho CS1 Transcrição génica ativa (eucromatina )
Azul CS2 Genes Polycomb reprimidos ( heterocromatina facultativa )
Verde CS3 Sequê ncias repetidas reprimidas ( heterocromatina constitutiva )
Preto CS4 Transcrição reprimida (diferente de outra heterocromatina )
. ..
Dados de: flLLION. G. J. et al, 2010 e ROUDIER F et aU 2011.

levedura S. cerevisiae. Nossa discussão desse exemplo
particular se baseia em vários estudos que pintam cole
tivamente um quadro abrangente das ações associadas
com a modificação da cromatina na iniciação e regula -
ção da transcrição do PHOS . sob o controle da NuA4. O complexo Pho4- Pho2 inicia
O PHOS é um gene repressfvel que codifica uma en
zima fosfatase ácida que remove os grupos fosfato das
outras prote í nas. Na levedura , a transcrição do PHOS é
ativada pela necessidade premente de fosfato, mas é re
primida quando o nível de fosfato é alto. No estado re-
primido, o acesso dos fatores de transcrição e da RNA
polimera.se II à TATA box da sequência promotora é
bloqueado por um nucleossomo, chamado -1 na Figura
15.19a. De modo similar, o acesso das proteínas ativado
ras da transcrição ao elemento UAS, chamado UASp2, é
bloqueado por um nucleossomo chamado 2. No estado
reprimido, a proteína ativadora da transcrição Pho2 e a
proteína acetilase NuA 4 estão presentes a montante da
sequência promotora em um elemento UAS chamado
UASpl. A montante desses elementos, encontramos os
nucleossomos chamados -3 e -4. Há um nível baixo de
- -
acetilaçào dos nucleossomos 1 a 4 no estado repri
mido. Em conjunto, a presença dos nucleossomos la
-4 bloqueia o acesso da proteína ativadora e dos fatores
de transcrição às sequê ncias regulató rias do PHOS.
(a ) Alta concentração de fosfato
CBO09 MacmUar Pufaiat «rs LM
N ú mero do
nucleossomo
(b ) Baixa concentração de fosfato
JrxH ^£ r*
/ tos tipos diferentes de células ( hepá ticas, musculares,
UASpl UASp2 TATA
- - -
5 4 3 -2 -1
Ejeção do nudeossomo,
ligação do SWVSNFe
atvaçâo da transclçãa
V ftuA4l
-
'
li Í /W f i
R
-5
UASpl UASp2
“ I
TATA
4
“ )
Figura 15.19 Controle da transcrição do gene PH 05 na
Saccharomyces cerevisiae . ( a ) A transcrição é reprimida
nas condições de alto teor de fosfato (b) Nas condições de
,
baixo teor de fosfato, a Pho4 se une à Pho 2 no UASpl e a
NuA 4 controla a acetilaçào dos nucleossomos próximos.
0 complexo SW1/SNF se liga, levando à ejeção dos
-
nucleossomos 1 a -4. A RNA polimerase II e os fatores de
transcrição gerais inkiam a transcriçã o do PHOS .
Cap ítulo 15 Regulado da expressão g ênica nos eucariotos 509
A transcrição do PHOS ocorre quando o nível de
- fosfato cai. A proteína Pho4 se liga à Pho2, formando um
complexo proteico que começa a ativação da transcrição.
Ocorre a acetilaçào adicional dos nucleossomos -1 a -4
- então a modificação da cromatina, deslocando o nucleos -
somo -2 ( Figura 15.19b ), d ísponibilizando o UASp2 para
que se ligue à proteína Pho4.0 complexo proteico SWI/
- SNF é reunido, e a modificação adicional da cromatina
-
desloca os cromossomos 1 (que antes cobria a TATA
box ), -3 e -4. Com a cromatina aberta pelo desloca-
mento do nucleossomo, a proteína geral da transcrição e
a RNA polimerase II conseguem se ligar à sequência pro-
motora e iniciar a transcrição do gene PHOS .
- Herdabilí dade epigenética
A transcrição dos genes eucarió ticos é um processo
intricado, no qual vá rias sequências regulatórias inte-
ragem para controlar a expressão gênica de dois níveis
diferentes. Um nível consiste nas interações necessá rias
para transcrever cada gene. O segundo nível consiste
-
- em interações que regulam os padrões de desenvolvi-
mento da expressão gênica criando e mantendo estados
de cromatina específicos para certos genes.
A ativação da transcrição de um determinado gene
requer a confluê ncia das proteínas regulatórias que re-
-
modelam ou modificam a cromatina para proporcionar
o acesso da sequência enhancer e da sequência promo -
tora aos fatores de transcrição que iniciam e executam
a síntese do transcrito, como vimos na descrição deta-
lhada da transcrição do gene PHOS. Os mecanismos
TATA
que controlam a formação diferencial do estado da cro-
-1 +1
matina e sua manuten ção produzem padrões de expres-
são gênica nos diferentes tipos de células que são ne-
cessá rios para o crescimento e o desenvolvimento dos
organismos complexos. Em um sentido amplo, esses
processos regulatórios são a razão para que um único
ovo fertilizado consiga se desenvolver e produzir mui-
cerebrais etc.) que têm aparências e ações diferentes,
+1
embora carreguem a mesma informação genética.
Entre os trilhões de células somáticas no seu corpo,
encontram -se dezenas de diferentes tipos celulares e, no
entanto, todas essas células contêm a mesma informa -
ção genética. As diferenças na morfologia e função entre
V
^ SWI/5NF os tipos celulares são controladas geneticamente, con -
forme evidenciado pelo fato de que as células- filhas têm
PtfOS as mesmas estruturas c funções das células parentais;
1
mas a variabilidade da sequ ência de DNA não é a razão
para essas diferenças. Em vez disso, as diferenças entre
-
as células somá ticas são epigenéticas, resultando de di
ferentes estados da cromatina que afetam a transcrição
gê nica em tipos de células específicos.
Certos padrões epigenéticos são herdáveis de uma
geração de células para a outra, fazendo que as células-
-filhas tenham os mesmos padrões de expressão gênica de
suas células progenitoras e irmãs. Também há evidências
de que as diferenças epigenéticas são herdáveis durante a
510 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
reprodução, ou seja, de uma geração do organismo para
a próxima. Por outro lado, algumas mudanças epigenéti
cas ocorrem no curso do crescimento e desenvolvimento
normais, resultando em alguns casos das condições fisio-
lógicas diferentes. Essas mudanças sao potenualmente
reversíveis e variá veis durante o eido de vida de um or-
ganismo, período em que a transcrição de certos genes é
-
ativada e mais tarde desativada novamente e vice versa.
As mudanças deste último tipo não dependem da passa -
gem pela meiose.
Anteriormente encontramos exemplos de variação
hereditá ria da expressão genica com uma base epige-
nética. Por exemplo, a variega çà o do efeito de posição
( PEV) na Drosophila resulta do movimento do alelo w*
ativo na transcrição para a região centromérica do cro
mossomo X da mosca -da -fruta (ver Figura 11.16). A se
quência de DNA do gene não é alterada. Em vez disso,
a disseminação da heterocromatina fecha a estrutura
de cromatina e bloqueia a transcrição genica por meio de
um mecanismo epigenético. O estado transcricional re-
primido é mantido nas células- filhas por meio da divisão
mitótica. O resultado sã o fragmentos de células descen
dentes das células progenitoras originais que compar
tilham o mesmo padrão de inativaçào da expressão do
w\ Essas células formam manchas brancas no olho da
mosca. Nos vertebrados e nas plantas, a dcsacetilaçào e
a metilação das caudas N-terminais das histonas levam
à formação de heterocromatina que fecha a estrutura de
cromatina , enquanto a desmetilação e a acetilação levam
à estrutura de cromatina aberta e estão associadas com
as regiões eucromá ticas dos genomas.
Como esse controle epigenético é mantido nas célu -
las? Em geral, quaisquer grupos acetila e metila presentes
nas histonas antes da replicaçào do DNA são mantidos nos
mesmos padrões após a replicaçào do DNA. A mecânica
molecular específica desse processo não está totalmente
clara, mas a desmontagem parcial e a subsequente remon
tagem dos nucleossomos são um componente essencial
(ver Figura 11.8). Lembre-se de que a estrutura de cro-
matina é decomposta durante a passagem da forquilha de
replicaçào (ver Capítulo 11 ). Os nucleossomos são separa -
dos das fitas de DNA parentais para que mais tarde sirvam
como moldes para a síntese das fitas filhas Os nucleosso-
»
mos se separam parcial mente e os segmentos antigos de
nucleossomos, com os segmentos recém -sintetizados, são
remontados em ambos os duplex novos.
Após a replicaçào do DNA, os nucleossomos re-
cém - formados carregam apenas parte da informaçã o
epigcnética anterior. O estado epigenético original pre-
cisa ser restabelecido rapidamente pela marca ção epi
genética das histonas recé m - sintetizadas. As histonas
antigas são capazes de modificar as novas histonas para
que tenham o mesmo padrão de marcas epigenéticas.
Esse processo ocorre entre os nucleossomos adjacen
tes, preservando, assim, o controle epigenético local da
transcrição genica. A interaçã o também precisa ocorrer
ao longo de distâ ncias grandes, como as que caracteri
zam os cromossomos X inatívados.
- Observa çã o gen ética A herança epègenética ocorre
por meio de modificações hereditá rias da cromatina que con-
trolam a transcriçã o sem alterar a sequência de DNA. Os esta-
dos epigenéticos podem ser mantidos pela divisão celular ou
podem variar durante o eido de vida.
Impressão genômica
Temos diferentes rcgiòes dos genomas eucarióti-
cos caracterizadas por estados de cromatina específicos
que mantêm a ativação e o silenriamento transcricional
epigeneticamente controlados por meio de divisões ce-
lulares mitóticas sucessivas. A manutenção da estrutura
- de cromatina aberta e fechada é essencial para o cresci-
- mento e desenvolvimento normais, que requerem pa-
drões característicos de expressão génica nos diferentes
tipos de células. Embora os padrões específicos de ex -
pressão gé nica epigeneticamente controlados possam ser
passados ao longo da mitose, os padrões de expressão de
certos genes podem precisar ser restaurados na meiose.
-
- Um exemplo especializado desse tipo de restauração dos
padrões epigenéticos na meiose ocorre em certos genes
mamíferos, em um mecanismo conhecido como im -
pressão genômica. Para o pequeno n ú mero de genes
mamíferos sujeitos à impressão genô mica, as duas có pias
do gene são funcionais, mas apenas uma delas é expressa.
Provavelmente você se acostumou, neste ponto dos
nossos estudos de genética, à ideia de que, nos mamíferos,
duas cópias de cada gene autossómico são herdadas e ex -
—
pressas uma cópia no cromossomo é herdada da m ãe e
a outra cópia é proveniente do pai. Uma razão para saber-
mos que a expressão das duas cópias do gene geralmente é
necessária para o desenvolvimento e fenótipo normais nos
mamíferos é que a deleção ou inativação de uma cópia de
um gene geralmente provoca o surgimento de anomalias.
- No entanto, para um pequeno n úmero de genes cuja ex -
pressão está sujeita à impressão genômica ( imprinting ),
esse padrão não vale. Em vez disso, uma cópia do gene é
expressa ativamente, enquanto a outra cópia é silenciosa.
A cópia do gene expressa sempre é herdada de um deter -
minado progenitor (em alguns genes, é herdada da mãe;
em outros, é herdada do pai) e a cópia silenciosa é aquela
herdada do outro progenitor.
Os exemplos mais estudados de impressão genômica
são dos genes humanos codificados muito perto um do
outro no cromossomo 15.0 gene do fator de crescimento
2 semelhante à insulina ( IGF2 ) na cópia derivada do cro-
mossomo do pai é expresso, enquanto o gene 1GF2 no
- cromossomo derivado da mãe é silencioso. O caso oposto
é o do gene H19, que é expresso a partir do cromossomo
15 derivado da mãe, mas é silencioso na cópia paterna.
Esses dois genes estão em uma região do cromossomo 15
- contendo vários outros genes que também são impressos.
Eles estão entre algumas dezenas de genes humanos cuja
transcrição é controlada pela impressão genômica.
- Duas sequências regulató rias são responsáveis por
dois exemplos de impressão genô mica. Um deles é uma
 C a p i t u l o 1 5 Regulação da expressão g ênica nos eucariotos 511

sequê ncia enhancer a jusante do Hl 9; o outro é uma se - ta ) Desenvolvimento normal

quência isolante, chamada regiã o de controle de im- Macho Fémea
printing (ICR), situada entre o H 19 e o IGF2 (Figura KiF2 H 19 IGF2 H 19
15.20 ). No cromossomo materno, as proteí nas ativado-
ras sc ligam à sequência enhancer c controlam a trans - Inativo Ativo Inativo Ativo
crição do H 19 interagindo com os fatores de transcrição
fGF2 expresso nocromossomo paterno mas nãono
e a RNA polimerase II na sequência promotora. A ICR
no cromossomo materno se liga a uma proteína isolante
que impede a sequê ncia promotora de afetar o IGF2. No
.
cromossomo materno, e H 19 expresso no cromossomo
marpmo mas não no cromossomo patprna

( b) Apagamento e restabelecimento da impressão germinativa

cromossomo paterno, por outro lado, a metila ção ampla
Os padrões de impressão são apagados nas células germinativas.
da ICR e do Hl 9 impede a proteí na isolante de se ligar e
bloqueia a ligação da proteína transcricional na sequên - /GF2 H /9 IGF2 H 19
cia promotora do Hl 9. Na ausência da proteína isolante,
a sequência enhancer estimula a transcrição do 1GF2.
A impressã o genómica silencia a expressã o do H 19
Células
germinativas
*
^
Os padrões de expressão são restabelecidos;o HJ 9 ó desligado
paterno e do IGF2 materno e controla a transcrição do nos machos; o X r2 é desligado nas fêmeas
*
1GF2 paterno e do Hl 9 materno em todas as células so - fGF2 H/9 IGF2 H /9
má ticas. Esse padr ão é essencial para o desenvolvimento Células
gaméticas
normal e qualquer outro padrã o produz anomalias pro-
fundas. Uma condição genética chamada síndrome de
Prader- Willi (Omim 176270) resulta, na maioria das
/GF2
Espermatozóide

“"gaméticas
. Ovo
H /9

vezes, da deleção parcial de parte da cópia paterna do

cromossomo 15 contendo o H 19 e o 1GF2. A condição
també m pode ocorrer se o cromossomo 15 paterno não Ativo
IGF2 . Fertilização e desenvolvimento
H/9
Inativo
for impresso adequadamente. Uma condição diferente, Inativo
I
Ativo
chamada síndrome de Angclman (Omim 105830), é
produzida com mais frequência pela deleção parcial da Figura 15.21 Herança da Impressão genómica. Os padrões
mesma parte do cromossomo 15 materno. A síndrome de impressão genómica no cromossomo 15 são apagados e
restabelecidos em formas especificas para o sexo no in ício da
de Angelman també m ocorre se o cromossomo ma -
gametogênese para garantir o sucesso reprodutivo.
terno não for impresso adequadamente.
Dada a importância da impressão de certos genes, e
considerando os diferentes padrões de impressão da ex - movida da ICR no cromossomo materno. Depois, ambos
pressão gênica nos cromossomos derivados da mã e e do os cromossomos são reimpressos com o padrão feminino
pai, como ocorre a herança dos cromossomos impressos espedfico. Na Unha germinativa masculina, ambos os
corretamente? A resposta é que, nas células germinativas cromossomos têm sua impressão apagada e depois resta
belecida no padrão masculino específico. Esses processos
-
primordiais, os padrões de impressão herdados sã o apa -
gados primeiro e depois restabelecidos no padrão espe - garantem que cada progenitor passe um cromossomo
cífico para o sexo da linhagem germinativa no início da adequadamente impresso durante a reprodução.
gametogênese ( Figura 15.21 ). Na linhagem germinativa
feminina, a metilação do cromossomo paterno é rever- Silenciamento por metilação de
tida pela atividade desmetilase, e a proteína isolante é re- nudeotídeos
O padrão de metilação identificado na impressão
Proteína isolante Proteí na No cromossomo genómica da ICR e do gene H19 é um tipo limitado de
atrvadora materno uma
sequência enhancer
metilação, que pode silenciar a expressão gênica em
conduz a expressão muitos vertebrados, particularmente nos mam íferos,
IGF2 OFF
do W 9 euma que difere da metila ção dos am í noácidos nas caudas
ína isolante
Cromossomo Enhancer prote
bloqueia a de proteína hislona N- terminais. Nesse caso, os gru-
materno expressão do tGF2. pos meti la (CHS) são acoplados a nucleotideos de DNA
específicos, não a aminoácidos nas caudas de proteína
No cromossomo histona, para silenciar os genes. A metilação dos n úcleo -
pa:ç rrcvameti:açào tídeos é realizada por DNA metiltransferases especiali -
IGF2r^-OU inativa a ICR e
bloqueia a
zadas que adicionam grupos metila, principalmente, às
expressão do Hl 9, a citosinas localizadas nos dinudeotídeos CpG, lado a
Cromossomo ICR Hl 9 Enhancer enhancer conduz a
paterno lado com os nudeot ídeos citosina e guanina na mesma
expressão do IGF2. fita de DNA. O p no CpG representa o ú nico grupo fos-
fato na ligação fosfodiéster que conecta os nucleotideos.
Figura 15.20 Impressão genómica diferencial do
cromossomo 15 em seres humanos.
As fitas de DNA complementares contendo dinucleoti
deos CpG possuem, cada uma, 5' CG 3'. - - -
512 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

A maioria das citosinas nos dinucleot ídeos CpG dos (a ) Estrutura de cromatina nas ilhas CpG
genomas dos vertebrados é metilada, mas o padrão não Ilha CpG
é aleatório. Em vez disso, as sequê ncias ricas em CpG , Ilhas CpG não
chamadas ilhas CpG, sào visadas para metilaçáo. Nos metiladas possuem
genomas dos mamíferos, as ilhas CpG são agrupadas nas estrutura de
cromatina aberta
sequências promotoras. Quando as ilhas CpG não sào
metiladas, a cromatina na região promotora é aberta ,
A metfoçáo das
concedendo acesso aos fatores de transcrição e à RNA ilhas CpG fecha a
polimerase. Assim , a transcrição ativa está ligada aos bai - estrutura de
xos níveis de metilaçáo das ilhas CpG { Figura 15.22a ). Por cromatna.
outro lado, se as ilhas CpG forem metiladas, as regiões
promotoras sáo fechadas e a transcrição é reprimida. (b ) Detecçáo do status de metila çáo das ilhas CpG
No laboratório, a detecçá o das ilhas CpG metila - I 800 pb lf 400 pb-j
das versus não metiladas é realizada isolando o DNA
OH ,
-
e tratando o com certas enzimas de restrição que tém
sequências de restrição ricas em CG (Figura 15.22 b) As . Ilha
CpG C C G G Ct 6 G CCG 6
enzimas de restrição Mspl e Hpall possuem, cada uma,
- -
a sequência de restrição 5' CCGG 3'. A enzima HpaW , 1200 pb I
no entanto, é "sensível à metila", significando que, se sua Digest ào Nenhuma digestão
sequência de restrição for metilada ( 5' - CC**GC 30, - M
Hpall Sonda
A metilaçáo da
CpG impede a
a sequência não será digerida. Por outro lado, a Mspl digestão pela
não é sensível à metila çáo e digere sua sequência de res
trição, independentemente da metilaçáo. No exemplo
- Digestào
pela
(- 400 pbj Hipai mas náo a
digestão pela Msp \
ilustrado na figura, fragmentos de restrição de tama - Mspl Sonda
nhos diferentes são produzidos pela digestão com Hpall
e Mspl da mesma região da ilha CpG, dependendo se a Southern bk>t
região for metilada. A Análise Genética 15.2 demonstra pb ® Aete^ofereseemgdeaaná lise
uma análise da metilaçáo da ilha CpG. 1.200 - da Southern btotting usando a
sonda indicada detectam a
diferença entre a digestão por
Observa çã o gen ética A metilaçáo dos nudeot ídeos . 400 •*Ípallcapoí //spl.
principalmente da dtosina, fecha a estrutura de cromatina
nas ilhas CpG para silenciar a transcrição e também age na im - Mspl Hpall
pressão genômlca . Figura 15.22 Metilaçáo dos nudeotideos dtosina
nas ilhas CpG dos mamíferos, (a) A metilaçáo fecha a
cromatina, enquanto a desmetilação abre a cromatina.
( b ) A digest ão comparativa pelas enzimas de restrição Mspt
15.3 Mecanismos mediados pelo RNA e Hpall sens ível à metila resulta na digestã o diferencial
por enzima de restriçã o, caso uma sequ ê ncia de restri ção
controlam a expressão gênica esteja metilada . ( c) A aná lise de Southern blotting detecta
Nos últimos anos, o RNA surgiu como componente- metila çáo da ilha CpG.
-chave no controle regulatório da expressão gênica euca-
ríótica. Em grande parte desconhecidos antes de meados eram quase inteiramente brancas. Os pesquisadores cha-
dos anos 1990, os mecanismos regulatórios mediados maram esse fenômeno de cossupressáo, pois a expressão
pelo RNA se tornaram rapidamente o foco da pesquisa do gene pigmentado introduz.ido e do gene produtor do
em plantas e animais. Essa área importante de investi
gação surgiu inesperadamente a partir de experimentos
- pigmento natural da petú nia foi suprimida.
Em 1995, fenô menos de silenciamento gé nico si -
concebidos para produzir uma petú nia mais colorida. milares foram documentados em muitas espécies de
No início dos anos 1990, Richard Jorgensen e seus
colegas estavam tentando intensificar a cor das petú nias
plantas, no fungo Neurospora crassa, no verme nema
tódeo Caenorhabditis elegans e na mosca -da -fhita Dro-
-
introduzindo em seu genorna um gene produtor de pig- .
sophila O mecanismo fundamental subjacente a essa
mento controlado por uma sequência promotora ativa. forma de regula ção foi identificado em 1998 por uma
Os pesquisadores esperavam que a transcrição ativa equipe de pesquisa liderada por Andrew Fire c Craig
desse gene recombinante intensificasse radicalmente a Mello. Fire e Mello descobriram que as moléculas do
cor da flor. No entanto, para surpresa de Jorgensen, em RNA de fita dupla (RNAds) estavam fazendo parte de
vez de exibir uma coloração global mais intensa, muitas um mecanismo regulatório pós- transcriçào hoje conhe-
das flores resultantes eram variegadas ( ver a foto de aber - cido universalmente como RNA interferente ( RNAi).
tura do capítulo ). Algumas flores tinham faixas de pig- Fire e Mello receberam o Prémio Noel em Fisiologia ou
mento intenso e faixas sem pigmento, e algumas flores Medicina em 2006 por seu trabalho.
 Capítulo 15 Regulação da expressão gênica nos eucarlotos 513

AN Á LISE GENÉTICA
.
M Ethyl Layton, um biólogo que estuda os efeitos da metilaçáo Número de Porcentagem relativa
da ilha CpG sobre a expressáo gênica nos eucariotos, constr ói CpGs metiladas de transcrição do lacZ
dois sistemas genéticos recombinantes. Ambos os sistemas
cont ém o gene lacZ bacteriano. Um dos recombinantes une o Homem 0 100
lacZ a um segmento de 4 0 kb de uma regiào promotora hu-
f
9 50
mana contendo vários dinudeotideos CpG. 0 segundo recom- 20 25
binante une o lacZ a um segmento de 4,0 kb de uma região 35 2
promotora do gene da Drosopbila que também contém vários
Drosophila 0 100
CpGs. A tabela apresenta o número de dinudeotideos CpG me-
7 99
tilados e a porcentagem relativa da expressáo do lacZ no sis -
tema génico recombinante . 14 97
.
a Que conclusão genérica você pode tirar a respeito do papel 26 95
da metilaçáo como um mecanismo de silenciamento génico
nos seres humanos?
b . Com base nesses dados, o que você conclui a respeito do papel da metilaçáo na transcrição nos
seres humanos em comparação com a Drosopbilos ?

Estrat é gias de solução Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópko abordado por .
1 Este problema trata da influência da metilaçáo dos dinudeotideos CpG sobre
este problema e explique a natureza a transcrição do gene ktcZ em um sistema recombinante no qual a transcrição
da resposta solicitada . é induzida por uma sequência promotora humana ou por uma sequência pro-
motora da mosca-da-fruta. A resposta exige a interpretação dos resultados ex-
perimentais e uma determinação do efeito da metilaçáo sobre as sequências
promotoras humanas e da Drosopbila .
.
2 Identifique as informações críticas .
2 As duas moléculas de DNA recombinantes são descritas como combinações do
fornecidas no problema. gene lacZ bacteriano com uma sequénda promotora humana ou uma sequèn-
da promotora da Drosopbila contendo, cada uma, vários nudeotídeos CpG São .
fornecidos dados sobre os níveis de transcrição do lacZ associados com diferen
tes números de CpGs metilados em cada recombinante.

Deduzir
.
3 Descreva qualquer correlação entre
o número de dinudeotideos CpG
metilados e a expressão do lacZ.
.
4 Compare as diferenças entre os recom-
binantes em termos de sua expecta-
tiva baseada na leitura do capítulo
.
3 A transcrição do gene lacZ diminui à medida que o número de dinudeotideos CpG
metilados na sequência promotora gênica humana aumenta, mas a transcrição do
lacZ permanece basicamente inalterada peíos números crescentes de CpGs meti-
lados na sequência promotora gênica da Drosophila.
.
4 Quando não há metilaçáo, ocorre 100% da transcrição em ambos os recombi-
nantes. A transcrição induzida pela sequência promotora da Drosopbila não é
. reduzida pela metilaçáo, mas a transcrição induzida pela sequência promotora
humana diminui gradualmente à medida que o número de nudeotídeos me-
tilados aumenta e cai pratkamente para zero no maior número de eventos de
.
metilaçáo A leitura do capitulo indica que a metilaçáo das ilhas CpG reduz a
transcrição nos genomas dos mamíferos.

Solucionar Resposta a

5. Descreva o significado dos resulta .

5 A metilaçáo das ilhas CpG reduz a transcrição a partir das sequências promoto
dos experimentais para a expressão ras humanas,
gênica humana.

Resposta b
.
6 Descreva como a metilaçáo dos CpGs .
6 A porcentagem de transcrição diminui gradualmente com o aumento da meti-
afeta a expressáo gênica humana ver - laçáo dos CpGs nas sequências promotoras humanas, mas nenhum nível de me -
su5 a expressáo gênica na Drosopbila . tilaçào reduz a transcrição induzida pelas sequências promotoras da Drosopbila .
Para praticar mais, ver Problemas 5 e 16 .
514 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Silendamento gênico pelo RNA de fita dupla RNAsi

Membrana celular
O RNA interferente silencia a expressão genica blo-
queando a transcrição dos genes visados ou bloqueando
a expressão gênica pós- transcrição. O silendamento pós-
-transcriçào ocorre após a ligação de pequenas RNA* re- Citoplasma
gulatórios aos alvos de RNAm por meio do pareamento
de bases complementares. A ligação desses RN As regu - xxnooooooc
latórios pode levar à destruição dos RNAm - alvo ou pode -
Pré- RNAmi e pré RNAsl
impedir sua tradução. Por outro lado, alguns RN As regu
latórios entram no n údeo, onde se ligam ao DNA para
- A Dicer corta o RNA
(do RNA do n ú cleo)

bloquear a transcrição dos genes visados. Qualquer um em 21 a 25 pb

desses processos regulatórios exige, em primeiro lugar,
que pequenas moléculas de RNA regulatório usem o pa-
reamento de bases complementares para se ligarem a seus
alvos. Os RN As regulatórios no RNAi são derivados de
várias fontes que produzem RN As de fita dupla por do * RNAsi ou
xxxxxxx
1
bramento. Uma enzima conhecida como Dicer ( Figura RNAmi
15.23) corta o RNA de fita dupla em fragmentos de 21 a
25 pb. Esses fragmentos são ligados a um complexo pro- RISC
í Liga-se ao RISC

teico chamado complexo silenciador induzido por RNA

( RISC:), que desnatura os RN As de fita dupla em RNAs de
gOQCXXX
Rta passageira
fita simples, com 21 a 25 nucleotídeos. As fitas simples
de RNA produzidas pelo RISC sã o identificadas como
fita -guia, que é biologicamente ativa, e a fita passageira ,
O RISC desnatura
o RNA

£v\/\/
r \/\/\/\
( )
degradada
Vá rios genes e
que normalmente é degradada. A fita -guia permanece Qhi Fita - guia sequências
liga-se ao transcrevendo
ligada ao RISC e o complexo controla um dos processos O Silendamento pré RNAmi
RNAm pelo
de silendamento gênico ( n úmeros 1 a 3 na figura ): O O pareamento da transcrição e pré-RNAsi
complexo usa o pareamento de bases complementares de bases dos genes-alvo
para prender a fita- guia ao RNAm e o RNAm é destruído; complementares
-
0 o RN A guia do RISC se liga a RNAm complementa
res e impede sua tradução ou O o complexo direciona as
-
enzimas modificadoras da cromatina para o n údeo, onde
silenciam a transcrição de genes selecionados.
Qual é a origem do RNAds? Ele pode ser produzido Q RNAm destru ído
ou
a partir de genes endógenos, da transcrição de outras Q tradução bloqueada
N úcleo
sequências endógenas, ou pode ser proveniente de fon -
tes exógenas. Em muitos eucariotos, os genes codificam Figura 1 5.23 Silencia mento génico pelo RNAi .
precursores de RNAds que são processados em RNA
micro ( RNAmi) de 21 a 24 nt em um complexo Dicer.
- A Dicer corta o RNAds em segmentos de RNAsi ou RNAmi,
com 21 a 25 pbr que são desnaturados pelo RISC. Os
A maioria dos genes que codifica os RNAmi é transcrita complexos RlSC fita guia conseguem degradar os RNAm
* *

pela RNA polimerase II e o transcrito resultante se dobra
novamente em um RNAds. Os alvos dos RNAmi são os
RNAm que sào destruídos ou têm sua tradução bloquea-
da de modo subsequente à atividade mediada pelo RISC.
Ao contrário dos RNAmi, os pequenos RNAs in -
terferentes ( RNAsi ) normalmente não são derivados
de genes, mas são RNAs complementares provenien -
tes de fontes exógenas ou de outra transcrição endógena.
Por exemplo, se as duas fitas de uma região genómica
forem transcritas, podem se formar RNAds. A trans-
crição de fitas opostas de elementos repetitivos, como
os transposons, também podem levar à produção de
RNAds. No último caso, as duas fitas não precisam ser
derivadas da mesma posição genómica. Alguns euca -
riotos possuem RNA polimerases dependentes do RNA
que podem produzir RNAds usando RNA de fita simples
como molde. As fontes exógenas de RNAds podem con-
trolar o silendamento pós-transcrição pela destruição
visados, Impedir a tradução destes ou entrar no n úcleo para
modificar a cromatina .
dos RNAm -alvo ou via silendamento transcricional dos
genes -alvo, que ocorre por meio dos processos modifi-
cadores da cromatina. Finalmente, as fontes exógenas de
RNAds, como as produzidas por alguns vírus de RNA,
podem disparar silendamento gênico induzido por vírus.
Clivando o RNAds A atividade Dicer cliva as moléculas
de RNAds em fragmentos de 21 a 25 pb. O mecanismo de
ação geral da divagem do RNAds foi identificado em
2006, quando Jennifer Doudna e colegas determinaram
a estrutura cristalina da Dicer no parasita intestinal Gwr -
dia intestinalis. O grupo de pesquisa de Doudna usou a
estrutura cristalina para determinar que o sítio de ligação
do RNAds na Dicer, chamado PAZ, é separado por 65 À
dos sítios dos dois domínios RNasc que cortam o RNA.
O espaço de 65 À entre o PAZ e os dom í nios RNase cor-
 Capitulo 15 Regulação da expressão g énica
responde a um comprimento de RNAds de 24 pb Figura
15.24 ). A Dicer repete essa ação, agindo a cada vez. como
uma régua molecular que mede RNAds precisamente
dimensionados. O espaçamento entre o sítio PAZ e os
domínios RNase varia entre as espécies e aparentemente
está correlacionado com a diferença nos comprimentos
dos RNAsi produzidos pelo processamento RISC subse-
quente dos RNAds em cada espécie.
A criação do RNAmi é similar à criação dos RNAsi.
Os transcritos precursores dos RNAmi são sintetizados
no n úcleo de uma célula e são processados em RNAmi
pela atividade Dicer. O transcrito que vai formar o
RNAmi se chama RNAmicro prim ário (pri-RNAmi ).
O pri- RNAmi se dobra e forma um tronco de fita dupla
normalmente contendo de 65 a 70 nucleotídeos e pos -
suindo extremidades livres em um lado e uma alça de fita
.
simples no outro lado (Figura 15.25 ) Nos animais, o com
plexo enzí má tico Drosha corta o pri- RNAmi perto do
meio do tronco e produz dois segmentos, um dos quais,
hoje chamado RNAmicro precursor ( pre- RNAmi).
contém o restante do tronco superior, que tem aproxi
madamente 21 a 25 pb, e a alça terminal. C ) pré-RNAmi
é transportado para o citoplasma, onde a Dicer remove a
alça terminal, deixando um RNAds de aproximadamente
21 a 25 pb. Depois, o complexo RISC se liga ao RNAds
e separa as fitas, criando RNAmi. Ao contrá rio dos ani
mais, as plantas usam uma única enzima Dicer para rea -
lizar todas as atividades de processamento do RNAmi.
RISC e Argonauta Após a produção, o RNAsi e o
RNAmi se ligam ao RISC, um complexo multiprotcico
dentro do qual uma proteína da fam ília do gene Argo -
nauta desempenha um papel central no modo como o
- -
complexo RISC fita guia silencia a expressão génica.
—
Muitas espécies codificam vá rias prote í nas Argonauta
os seres humanos codificam oito, por exemplo e
— ficientemente alta, essa ligação forma uma estrutura que
^
j RNAds
S —
Dom í nio RNase
Dom í nio RNase
sc
lV i
65Â -
( 24 pares de bases)
> Sítio PAZ
Figura 15.24 Estrutura da Dlcar e interação com o
RNAds. A distâ ncia entre o sitio de ligação PAZ e a posição
das RNases determina o comprimento do RNAsi.
nos eucariotos 515
Clivagem pela Clivagem pela
Tronco inferior Tronco superior Alça terminal
Ml pbl -
( 22 pb)
, Clivagem do tronco inferior pela Drosha
Tronco inferior Tronco superior Alça terminal
(degradado)
Pré-RNAmi
- O Clivagem da alça terminal peia Dicer
- Tronco superior
-
( 22 pb)
Alça terminal
(degradada )
© Processamento RISC para produzir RNAmi
RNAmi ‘ ‘ -
Figura 15.25 Processamento passo a passo do
- pri-RNAmi pela Drosha para produzir RNAmi.
cada uma parece controlar uma atividade um pouco di -
ferente por meio do complexo RISC fita-guia . -
O mecanismo de silenciamento gênico pelo RISC-
fita- guia mais bem compreendido envolve a ligação
complementar da fita -guia a um RNAm-alvo. Se a por-
centagem de complementaçào de pares de bases for su -
permite a um domínio RNase da Argonauta cortar a fita
-alvo do RN Am perto do meio do d ú plex fita -guia - RNAm,
-
provocando assim a clivagem do RNAm. Quando o pare-
amento de bases fita -guia-RNAm é menos bem adaptado
— ou seja , quando apenas um n úcleo dos pares de bases
complementares está presente no d ú plex fita - guia- RNAm
o domínio RNase da Argonauta é incapaz de cortar o
d ú plex. Em vez disso, o d ú plex retém sua forma de fita
dupla, provocando o bloqueio da tradução.
Modificação da cromatina pelo RNAi
O terceiro mecanismo pelo qual o complexo RISC -
-fita-guia silencia a expressão génica é por meio da
modificação da cromatina, sendo mais bem estudado
na levedura { Schizosaccharomyces pombe ) A primeira .
evid ência de um papel para o RNAi na modificação da
cromatina veio do estudo da heterocromatina centro-
mérica na S. pombe. Os centròmeros da S. pombe, como
os de outros eucariotos complexos, contém um ele-
mento central circundado por sequê ncias repetidas (ver
Figura 11.12). As histonas na região centromérica tém
um baixo nível de acetilaçà o c a lisina 9 da cauda N- ter-
minal da H3 (ou seja, H3K 9) é metilada . Os dois tipos
de modificação são coerentes com a formação de uma
516 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

estrutura de cromatina fechada e com a disseminação O Transcrição do

da heterocromatina para silenciar os genes vizinhos.
A Schizosaccharomyces pombe possui genes ú nicos
para a Dicer e a Argonauta, e a mutação de qualquer
f $ 1“ f DNA centroménco
.
produz .

um dos genes atrapalha a atividade do RNAi na célula. i

No entanto, a descoberta surpreendente foi que a S.
pombe com mutações na Dicer e na Argonauta també m
RNAds )OOOO0OOG0O < O -processado
RNAds, qu« í
pela Dicer

\h
não tem metilação da H3K9 nem silenciamento gé nico em RNAsi
Dicer
em volta do centrómero. A explicação para essas defi -
ciências adicionais é que, na S. pombe, as duas fitas das
sequ ê ncias repetidas centrom éricas são transcritas pela RNAsi TOQG O A Argonauta se une à
RNA polimerase II. Os RNAm resultantes são com - RITS
sooc Chpl e ò outras
proteí nas para formar
plementares e formam RNAs de fita dupla que a Dicer
Chpl
o complexo RITS, que..
corta. Os fragmentos produzidos por esse processo sáo
RNA 51
separados em fitas simples que se ligam à Argonauta ,
ArgonnautiK
que depois se une a uma proteína conhecida como
Chpl e a outras proteí nas, formando um complexo tipo RNAm —
i:Í\ £ £ £ £
RISC chamado complexo de silenciamento transcri -
cional induzido por RNA ( RITS) ( Figura 15.26 ), que
carrega o RNAsi no n údeo. O complexo RNAsi -RITS é
atraído para o centró mero, onde o RNAsi parece usar o
pareamento de bases complementares para formar um
O - leva o RNAsi para o
n údeo, onde se liga
aos transcritos de RNA
duplex com transcritos das sequências repetidas cen nascentes da regláo
troméricas. Esse pareamento atrai outras proteínas que centromé rka.
promovem a desacetilaçâo das histonas e a metilação do
H3K9 para fechar a estrutura de cromatina c disseminar
a heterocromatina para fora do centrómero.
Swi6

A evolu ção do RNAi
O RNAi é disperso nos eucariotos e acredita -se
que o mecanismo de silenciamento transcricional na S.
pombe esteja relacionado ao silenciamento transcricio-
nal mediado pelo RNAi em outras espécies eucarióticas.
Mas como o RNAi evoluiu? A resposta ainda está sob
investigaçã o, mas a hipótese operacional é que o RNAi
evoluiu ajudando os organismos a protegerem seus ge-
nomas contra os efeitos mutacionais dos elementos ge-
néticos transponíveis (descritos no Capítulo 13).
()s elementos transpon íveis sào diversos, mas per
- Figura 15.26 Silenciamento transcricional induzido por
fazem grandes porcentagens dos genomas dos eucario -
tos complexos. Por exemplo, quase metade do genoma
humano é composta de elementos transponíveis. No
genoma humano e em outros genomas eucarióticos, a
maioria desses transposons está situada na heterocroma -
tina e é silenciosa. Os pesquisadores descobriram que as
mutações no maquiná rio RNAi de um organismo podem
reativar os transposons normalmente quiescentes, rever -
tendo o silenciamento transcricional. Isso pode levar ao
movimento de alguns elementos transpon íveis em tomo
do genoma e potencialmente à produção de novas mu -
tações. A evid ência sugere que o RNAi desempenha um
papel no silenciamento da transcrição dos transposons.
O RNAi também desempenha um papel protetor na
resposta â infecção virai Nas plantas, a infecção de uma
folha por um vírus pode gerar uma resposta do RNAi que
bloqueia a replicação virai e impede a infecção de se es-
palhar pela planta. Apoiando essa observa çã o, as plantas
com mutações nos genes Dicer ou Argonauta são muito
Clr4 ^C>
G O complexo RfTS-ftNAU
atrai as metilases e
desacetilases (Swi6 e
Or4), que fecham a
cromatina e espalham a
heterocromatina.
RNA ( RITS) na levedura.
mais suscetíveis à disseminação de infecções virais que as
plantas sem mutações no Dicer ou Argonauta. Essas des-
cobertas são coerentes com a ideia de que o RNAi evo
luiu como um mecanismo de proteçã o gen ômica contra
-
os elementos genéticos transponíveis e a infecção viraL
Voltando brevemente às pet ú nias de Jorgensen e à sua
cossupressão, hoje os biólogos sabem que o RNAi é res
ponsá vel por impedir a expressão do gene cromossómico
-
produtor de pigmento e também da cópia induzida do
gene produtor de pigmento.
Tanto o genoma das plantas quanto o dos animais
codifica RNAmi, mas o modo de açã o dos RNAmi di -
fere ligeiramente entre os dois táxons. Nas plantas,
os RNAmi exibem complementaridade de sequê ncia
quase completa com seus alvos de RNAm e normal -
mente clivam o alvo e, com menos frequência , repri-
mem a tradução. Por outro lado, os RNAmi nos animais
 Cap ítulo 15 Regulação da expressão gênica nos eucariotos
geralmente são apenas complementares a seus alvos em
uma extremidade do RNAmi e normalmente reprimem
a tradu ção em vez de clivarem o alvo. Essas diferen ças
sugerem que os RNAmi podem ter evolu ído de modo
independente nas duas linhagens.
O estudo do RNAi está emergindo como uma po-
derosa ferramenta de pesquisa que pode ser utilizada
de muitas maneiras. Uma aplicação frequente do RNAi
na pesquisa é o uso dos RN As interferentes para “ no -
cautear" a expressão de genes selecionados. Essa é uma
maneira de descobrir o efeito do gene sobre o fenótipo
examinando como esse fenótipo ê alterado na ausência
de expressão do gene. Uma segunda abordagem ao uso
do RNAi é na medicina, em que os pesquisadores bio-
médicos estã o explorando os possíveis usos do RNAi
para controlar a expressão dos genes que produzem
transcrito em excesso ou transcritos anormais na do -
ença. Em certos câ nceres, por exemplo, o processo da
doença é induzido em parte pela superexpressáo de cer-
tos genes. A terapia com RNAi envolveria a concepção e
construção dc pequenas moléculas de RNA que sc ligam
especificamente e impedem a tradução dos transcritos
dos genes causadores de doença, ao mesmo tempo sem
afetar os transcritos de outros genes. ( Discutimos ou
tras aplicações experimentais do RNAi no Capítulo 16.)
- A inativação do X é reversível nas células germi-
Inativação do X e RNA regulatório
Por fim, tomemos um tipo diferente de mecanismo
de silcnciamento gênico mediado por RNA esse me- — processo dc reversão.
ESTUDO DE CASO
Epigenética ambiental
Temos aqui uma pergunta simples: como os traços são
passados dc uma geração para outra ? A primeira resposta
que veio à sua mente, provavelmente (e acertadamcnte ),
foi que os traços são passados pela transmissão dos genes
dos pais para a prole. Entretanto, mais ou menos na última
década, a resposta a essa pergunta foi ampliada cm uma di-
reção imprevista. Novas evidências sugerem que, em certos
casos, a nutrição e a dieta parentais podem levar a modifi
cações da expressão genica controladas cpigcncticamcntc c
que, em alguns casos selecionados, os genes afetados podem
ser transmitidos para a prole em sua forma modificada epi
gcncticamcntc. Ainda mais surpreendente, os dados tam
bé m indicam que o estado modificado cpigcncticamcntc
pode persistir nas gerações futuras. Em outras palavras,
pode ser possível que a experiê ncia nutricional dos avós
afete a expressão gê nica dos netos.
Três linhas de evidência sugerem um papel da nutri-
ção e da história alimentar na modificação epigené tica da
expressão gê nica. A primeira é proveniente dc estudos
cm abelhas, nos quais se demonstrou que as larvas geneti-
camente idênticas conseguem se desenvolver em rainhas
f é rteis ou oper á rias esté reis após a alimentaçã o diferencial
-
com gcleia real, composto fornecido às larvas que sc tor
nam rainhas. A an álise experimental, liderada por Ryszard
517
canismo ocorre exclusivamente nas fêmeas de mamífe -
ros para equilibrar a dosagem dos genes ligados ao X.
Para atingir o equil íbrio correto da expressão génica
ligada ao X entre machos e fê meas de mamíferos, o me-
canismo de compensação da dosagem conhecido como
inativação do X inativa aleatoriamente um dos cromos -
somos X no n úcleo de cada célula em uma fêmea ( ver
Figura 11.18). O centro de inativaçã o do X ( XIC) é a
fonte do transcrito de RNA específico para a inativaçã o
do X ( Xist ) , que se espalha ao longo do comprimento
do cromossomo X inativo para silenciar praticamente
todos os genes (ver Capítulo 11). A inativação do X é
um fenô meno epigenético no qual o RNA Xist induz
a formaçã o de uma estrutura de cromatina fechada
atraindo as proteínas desacetilases e metilases que de-
sacetilam e metilam os aminoácidos nas caudas N ter - -
minais das proteínas histona. Esses eventos fazem que
o cromossomo X inativado inteiro forme heterocroma -
tina , que aparece no n úcleo como um corpo de Barr. A
evid ê ncia dispon ível indica que a transcriçã o e disse-
minação do RNA Xist são essenciais para estabelecer a
inativação do X. Outros eventos mantê m as modifica -
ções epigenéticas.
nativas femininas mamíferas. Os eventos de reversão
remodelam a cromatina fechada para uma forma mais
aberta que restaura as regiões eucromá ticas no cromos-
somo. A desmetilaçâ o e a acetilação acompanham esse
.
Maleska. em 2008 revela que o silenciamento da expressão
da DNA mctiltransfcrasc Dnmt3 pelo nocautc da traduçã o
do transcrito de Dnmú pelo RNA interferente leva ao de-
.
senvolvimento de rainhas férteis Em outras palavras, o blo
queio de uma ria importante de metilaçâo de histona levou
-
á expressão dos genes que normalmcntc são expressos
apenas quando uma larva é alimentada com geleia- real. A
- implicação é que a metila çâo é um mecanismo epigenético
importante para reprimir a expressão gênica e controlar o
desenvolvimento das abelhas operá rias. A metilaçâo c a re-
- sultante repressão da transcri ção são subvertidas pela ali -
- - .
mentação com gclcia rcal para produzir o desenvolvimento
dc abelhas rainhas férteis
A segunda linha de evidê ncia é proveniente de vários
estudos da conexão entre a metilaçâo dos genes gerada am -
bientalmentc c a variação na expressão genica dos ratos c
camundongos. Em um estudo, camundongos geneticamente
idênticos carregam um gene agouti modificado que produz
pelo amarelo e obesidade extrema, enquanto o pelo marrom
e o peso corporal normal são produzidos se o gene modificado
nào for expresso. A cor do pdo e o peso corporal dos filhotes
de camundongo geneticamente idênticos que carregam esse
- gene modificado são determinados pela dieta da mãe nas se -
manas antes da impregnação e durante a gravidez e lactação
518 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Em experimentos controlados, as mães que vão trans-
mitir a seus filhotes o gene agouti modificado são alimen -
tadas com uma dieta enriquecida com três compostos, que
—
agem , cada um, como doadores de grupos metila ao DNA
ácido fólico ( vitamina B13), cloreto de colina e betaína
—
anidra , ou com uma dieta sem esses compostos. O pe-
ríodo alimentar controlado começa duas semanas antes do
acasalamento e continua durante toda a gravidez e lacta
ção. Os filhotes gerados são geneticamente idê nticos e, apõs
serem desmamados, são alimentados com a mesma dieta.
No entanto, com três semanas dc idade, a aparência dos fi
lhotes é radicalmente diferente. Os camundongos gerados
pelas mães alimentadas com dieta enriquecida possuem
pelo marrom e peso corporal normal , enquanto os camun -
dongos gerados por m ães n ão alimentadas com dieta enri -
.
quecida possuem pelo amarelo e são obesos A diferença
indica que o gene agouti modificado é expresso quando é
transmitido das mães que n âo receberam dieta enriquecida
com doadores de metila . No entanto, se o gene modificado
for transmitido das m ães que receberam alimentação enri-
quecida, o gene agouti é metilado e silenciado.
A terceira linha dc evidê ncia é proveniente dc um
evento infeliz que ocorreu na Segunda Guerra Mundial.
Uma grande fome atingiu a Holanda ocupada pela Alema
nha , entre novembro dc 1944 c maio dc 1945. A fome redu -
-
ziu a ingestão calõrica diá ria para 500 800 calorias por dia,
muito menos que as necessidades do corpo para suprir suas
atividades metabólicas normais. Estudos de longo prazo
foram realizados em holandeses concebidos ou nascidos du
.
rante a fome e em seus descendentes Os estudos dos efeitos
da fome constataram que os chamados filhos da fome costu-
RESUMO
15.1 As sequências cis-regulat órias ligam as
proteínas trans-regulatórias para controlar
a transcrição eucariótica
Proteínas regulatórias nos eucariotos ligam-se a nucleotf-
deos espec íficos expostos nos sulcos maior e menor do DNA
As promotoras, os elementos proximais e as enhancers são
sequências de DNA de ação cis que se ligam a prote ínas
regulatórias de a ção trans para regular a transcrição.
As sequ ências enhancers são fortemente conservadas, in -
dicando que desempenham fun ções essenciais.
As sequ ê ncias ativadoras a montante ( UAS) na levedura
são elementos parecidos com enhancers que regulam a
expressão dos genes, como os que estão envolvidos na uti-
lização da galactose.
As regiões de controle de lòcus ( LCRs) são sequências
enhancers especializadas que controlam a expressão se
quencial de conjuntos de genes, como os pertencentes
- grupos acetila, metila e fosfato em aminoácidos espec ífi -
ao complexo do gene betaglobina humano, regulados no
desenvolvimento.
As sequências silenciadoras ligam-se á s proteínas repres-
soras para impedir a transcrição de determinados genes.
I As isolantes bloqueiam a influência da sequê ncia promo-
tora sobre certos genes e direcionam a influência para ou-
tros genes.
mavam nascer gravemente abaixo do peso. À medida que os
-
filhos da fome cresciam, tomavam se adultos c envelheciam ,
eles sofriam maior risco de doença cardiovascular, diabetes
c obesidade, cm comparação com os pares que n ão tinham
sido afetados pela fome, A explicação proposta é que as
condições nutricionais restritas no feto provocaram altera
ções da expressão gênica que produziram um metabolismo
-
- energeticamente “frugal? No entanto, ainda mais surpreen -
dente foi que, entre os filhos dos filhos da fome, també m há
um risco elevado de doenças cardiovasculares, entre outras .
- A explicação oferecida para esse efeito na segunda geração
é a modificação cpigenética da expressã o gê nica que é trans-
mitida através de vá rias gerações.
Um estudo realizado cm 2008 por Bastiaan Hcijmans,
sobre o padr ão de metilação do gene ÍGF2 no cromossomo
15, confirma o mecanismo de controle epigenético que dis -
cutimos anteriormente na conexão com a impressão genô
-
mica, a sí ndrome de Prader Willi e a síndrome de Angel -
man. Heijmans e colegas descobriram que o IGF2 em certos
filhos da fome (hoje na casa dos 60 anos de idade ) ainda
carregam as marcas da fome. Os genes IGF2 das pessoas ex -
postas à fome durante as primeiras dez semanas dc gestação
- são marcados por um n ú mero significativamente menor dc
grupos metila que os genes dos seus irmãos do mesmo sexo
não expostos a condições dc fome. Esses resultados apoiam
-
a ideia de que as condições pré natais podem conferir pa
drões epigenéticos específicos aos genes e que os fatores
-
- ambientais que contribuem para os padrões epigenéticos
podem desempenhar um papel importante na modificação
da expressão gê nica ao longo de muitas gerações.
15.2 A remodelação da cromatina regula a trans-
criçã o eucariótica
I As sequ ências promotoras abertas são transcritas constitu-
tlvamente, enquanto a transcrição das sequências promo
toras cobertas é regulada .
I Nas regiões de estrutura de cromatina fechada, o DNA se
enrola de modo demasiadamente apertado em volta dos
nudeossomos. Essas regiões são silenciosas na transcrição.
I Nas regiões de estrutura de cromatina aberta, a associação
do DNA com os nudeossomos é mais relaxada, permitindo
que os genes sejam expressos.
Os complexos remodeladores da cromatina deslocam os
nudeossomos para permitir a iniciação da transcrição pela
RN A pol II e pelos fatores gerais de transcrição.
A modificação da cromatina pela adição ou remoção de
-
cos nas caudas N terminais das proteínas histona abre e
fecha a cromatina.
I Os estados epigenéticos da cromatina sá o herdáveis nas célu-
las somá ticas, que se dividem por mitose, e podem ser restau-
rados nas células germinativas, que se dividem por meiose.
I A impressão genômka nos genomas dos mam íferos en-
volve a metila çã o de dinudeotideos e a ação das sequên -
cias enhancers e isolantes.
 Capitulo 15 Regulado da expressão génica nos eucariotos 519

I A metilaçáo das bases nucleotídrcas de citosina que fazem Os pequenos RNAs interferentes (RNAsi) e os RNAmicro
parte dos dinucleotideos CpG nas Ilhas Cpg é um meca- (RNAmi) são as principais moléculas de RNA regulatórias .
nismo destacado para silenciar as sequências promotoras O complexo proteico Dicer processa os RNAds em sua
nos mamíferos. forma rçgulatória.
O complexo RISC leva os RNAs regulatòrios até os RNAs vi-
153 Mecanismos mediados peio RNA controlam sados para destruição ou bloqueio da tradução .
a expressã o gênica Uma forma específica de RNA regulatório controla a inati -
vaçào do X nos mamíferos .
I O RNA interferente (RNAi) é um mecanismo mediado por
RNA para regular a expressão génica nos eucariotos.

T E R M O S- C H A V E

Acentuassomo fp 497). Fita-gula (p. 514 ) Região controladora de lócus (LCR)

.
Argonauta ( p S 15 )
.
Complexo ISWI (p 506 )
Complexo silenciador induzido por RNA
mC) (p. 514)
Complexo de silencíamento transcricio
.
nal induzido por RNA (RITS) (p 516 )
Complexo SWI/SNF (p. 506)
Complexo SWR 1 (p. 506 )
Cossupressão (p. 512)
Cromatina aberta (p 504).
Cromatina fechada (p 504) . Promotor coberto (p. 504)
.
Dicer (p 514)
.
Dinucleotideo CpG (ilha CpG) (p 511 )
Domínio funcional (p 495) . .
Epigenética (p. 509)
Histona acetiltransferase (HAT) (p. 507)
Histona desacetilase (HDAQ ( p. 507)
Histona desmetilase (HDMT) (p. 508)
Histona metiltransferase (HMT) (p. 508 )
- Impressão genômica (p. 510)
Mediador (p. 499)
Modificador da aomatina (p. 507)
Motivo estrutural (p. 495 )
Pequeno RNA interferente (RNAsi) (p. 514)
Promotor aberto (p. 503 )
Proteína regulatória de ação trans (p.497 )
Região de controle de imprinting
OCR) (p 511)
.
(p 499)
Região sem nucleossomos (NOR) (p. 503)
Remodelação da cromatina (p. 504 )
Remodelador de cromatina (SWI/SNF,
ISWI, SWR1) (p. 504, 506)
RNA interferente (RNAi) (p. 512)
RNAmicro (RNAmi) (p. 514 )
Sequência ativadora a montante (UAS)
(p. 498)
Sequência enhancer (p. 497)
Sequência isolante ( p. 501 )
Sequência regulatória de ação cis (p. 497)
Sequência silenciadora (p. 500)
Sítio hipersensivel ã DNase I ( p. 504)

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.
Conceitos do capitulo
1. Dedicando algumas sequências para cada uma, descreva motivos comuns permitem que as proteínas localizem
as seguintes estruturas e seus efeitos na expressão gê- sequências de consenso de DNA especificas ?
nica eucariótica:
a. Sequência promotora
7. Uma ilha CpG é uma região que contém muitos dinucleo-
tídeos CpG. As ilhas CpG costumam ser encontradas
b. Sequência enhancer
.
c Sequência silenciadora perto das extremidades 5' das sequências promotoras
nos genomas dos mamíferos. Especule sobre o provável
d. RISC
.
e Dicer papel das ilhas CpG nesses locais.
2. Descreva e forneça um exemplo (real ou hipotético) de 8. A maioria dos biólogos argumenta que a regulação da
cada um dos seguintes elementos: expressão génica é consideravelmente mais complexa
.
a Sequência ativadora a montante (UAS) nos eucariotos do que nas bactérias. Mencione e des-
b. A ção da sequência isolante .
creva os quatro fatores que em sua opinião, dão a maior
.
c A ção da sequência silenciadora contribuição para essa percepção.
d. A ção do acentuassomo
9. Compare e diferencie a regulação transcricional dos
.
e RNA interferente
genes GAL na levedura com a dos genes lac nas bactérias.
3. O que significa o termo remodelação da cromatina? Des-
creva a importância desse processo para a transcrição . 10. O termo heterocromatina se refere à s reglóes multo con -
densadas dos cromossomos, que são, em grande parte,
4. Qual é o papel geral desempenhado pela acetilação dos desprovidas de genes. Uma vez que existem poucos
aminoácidos de proteí na histona durante a transcrição genes nas regiòes heterocromáticas, eles quase nunca
dos genes eucarióticos? descondensam para a transcrição. Em que ponto du --
5. Qual é o papel desempenhado pela metilaçáo durante a rante o ciclo celular vocé esperaria observar a descon
transcrição? Compare e diferencie a importância relativa densaçáo das regiões heterocromáticas? Por qué?
da metilaçáo para a transcrição em um camundongo e
no verme nematódeo C. elegons.
.
11 Compare e diferencie as sequências promotoras e
enhancers quanto à sua localização (montante versas ju-
6. Por que as proteínas de ligação ao DNA compartilham sante), orientação e distância (em pares de bases) relativa
três motivos dimensionais comuns? De que modo esses a um gene que regulam .
520 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Aplicação e integração
.
12 As consequências de quatro deleções na regiã o a mon-
tante do gene DBM 1 da levedura são estudadas para
determinar o efeito sobre a transcriçáo. A taxa normal
de transcrição, determinada a partir do estudo da trans-
criçáo dos genes que náo tém deleções a montante, é
definida como 100%. A localização de cada deleção e
os efeitos das deleções sobre a transcriçáo DBM 1 são
exibidos a seguir.
Inicio da
transcriçáo
é isolada. Vários segmentos da sequência a montante se
fundem com o gene lacZ e cada fusão é examinada para
determinar o grau de eficiência com que o gene é trans-
crito. No diagrama deste problema, as barras escuras in-
dicam os segmentos a montante que estão presentes em
cada um dos seis diferentes genes fundidos. A eficiência
transcriciona! de cada fusão é medida em relação à fusão
de controle, isto é, o segmento completo a montante,
fundido com o gene lacZ.
Região completa

r
Região a jusante
a montante
]Gene DBM ) Gene
fundido
LacZ
i li i l ll l
Regiões A B C 0 Fusão Segmento fundido Transcriçáo (%)
dc deleção Controle
Deleção Transcrição (%) (comprimento total) 100
Nenhuma A 6
100 B 0
(controle)
C 8
A 7
B 155 D 0
C 51 E 55
D F 88
<1
a. Identifique a região a montante que contém a sequên-
a. Qual(is) mutaçáo(ões) afeta(m) uma sequência
cia enhoncer.
enhancerl Justifique.
b. Qual(is) mutaçáof ôes) afeta(m) uma sequência silen-
b. Identifique a região a montante que contém a sequên -
cia promotora.
ciadora? Justifique.
c Especule sobre a razão para as diferentes taxas de
c Oual(is) mutaçào{òes) afetafm) a sequência promo- transcrição detectadas nas fusões E e F.
tora ? Justifique.
15. Uma doença hereditá ria é herdada como um traço au-
.
13 O gene UG4 é expresso nos tecidos do caule e da folha da tossõmico recessivo. O alek> do tipo selvagem do gene
planta Arabdopsis thaliana. Para estudar os mecanismos da doença produz um RNAm maduro com 1.250 nucleo-
que regulam a expressão do UG4, sáo feitas seis pequenas
tídeos (nt) de comprimento. A análise molecular mos-
deleções da sequência de DNA a montante da sequên- tra que o RNAm maduro consiste em quatro éxons que
cia codificadora do gene. As posições das deleções e seu
medem 400 nt (éxon 1), 320 nt (éxon 2), 230 nt (éxon 3) e
efeito na expressão do UG4 são exibidos a seguir.
.
300 nt (éxon 4) Uma mãe e um pai com dois filhos saudá-
Inicio da veis e dois portadores de doença são submetidos á anã
Região transcriçáo lise de northern blotting em um laboratório de genética
Região a montante promotora | * médica. Os resultados para cada membro da família sáo
GCM exibidos a seguir.
I II II II I I II I
Regiões E D A C B F
de deleção
Transcrição (%)
Deleção Caule Folha

Nenhuma (controle)
A
B
100
100
100
100
II
èb i b
<1 92
C 100 100 -
11 1-2
H
-
11 1 11-2 11-3 11-4
D 100 163
E 1.250
98 <1 Northern
F 100 100 nt blotting
1.020

a. Explique os efeitos diferenciais das deleções B e F na
expressão nos dois tecidos.
b. Por que a deleção D aumenta a expressão do VGA no
tecido da folha, mas náo no tecido do caule?
c Por que a deleção E reduz a expressão do VGA no te-
cido da folha, mas não no tecido do caule?
.
14 Um gene expresso no músculo longo do camundongo é
identificado e a região regulatória a montante do gene
a. Identifique o genótipo de cada membro da famí -
lia usando os tamanhos dos RNAm para indicar cada
alelo. (Por exemplo, uma pessoa homozigota do tipo
selvagem é indicada como "1.250/1.250".)
b. Com base na sua aná lise, qual é a mais provável ano
malía molecular causadora do alelo da doença?
16. A região do DNA humano ilustrada no diagrama a seguir
contém três sequências de restrição ( 5' - CCGG - 30 para
 Capitulo 15 Regulação da expressão gênica nos eucariotos 521

.
as enzimas de restrição Hpoll e Mspl (Lembre - se de que a
.
Hpoll é sensível à metilaçâo, mas a Msp\ não é ) A ilustra-
ção identifica a distância entre as sequências de restrição
e indica a posição de ligação de uma sonda molecular
I 1,7 kb li 2.3 kb
5* HM
i ! CCGG CCGG
3' G G C C GGÇÇ GGCC
Sonda molecular
a. Se a metilaçâo ocorrer em qualquer uma das sequên
cias de restrição, qual é o nudeotideo mais propenso a
adquirir um grupo metila ? Por quê?
b. Desenhe dois experimentos de Southern blotting,
cada um deles contendo uma pista com DNA digerido
por Hpoll e uma segunda pista com DNA digerido por
Mspl. No experimento A, não ocorreu metilaçâo das
sequéndas de restrição. No experimento B, a sequên-
cia de restrição do meio é metilada, mas as duas outras
sequéndas não são.
17. Uma proteína muscular no camundongo é produzida
através do uso de sequências promotoras alternativas
nos músculos cardíaco e esquelética Um diagrama da
região gênica é exibido a seguir. O gene contém um total
de seis éxons e existem três sítios de restrição reconhe-
cidos pela enzima de restrição Hind\\\ na vizinhança do
18. Uma enzima muscular chamada MEl é produzida pela
transcrição e tradução do gene ME 1 em vários múscu-
los durante o desenvolvimento do camundongo, in -
. cluindo o músculo cardíaco, de modo altamente regu -
lado. A produção da ME1 parece ser ligada e desligada
em momentos diferentes durante o desenvolvimento.
3' Para testar o possível papel das sequências enhoncers e
S silenciadoras na transcrição de ME 1, um biólogo cria um
sistema genético recomblnante que funde a sequên
cia promotora de ME 1, com o DNA a montante dessa
-
promotora, com o gene lacZ bacteriano (betagalactosi-
- dase). O gene lacZ é escolhido pela facilidade e simpli-
cidade para examinar a produção da enzima codificada.
O diagrama mostra a estrutura do recombinante, bem
como as barras que indicam o alcance das deleçòes que
o biólogo faz na sequência promotora de ME 1 e nas se-
quências a montante. A tabela exibe a porcentagem de
atividade betagalactosidase em cada mutado por de-
leçào em comparação com o sistema gènico recombi-
nante sem quaisquer deleçòes.
Região a montante Promotora
de MÍ 1 àtMEl Gene LacZ
.s C
B

gene. No diagrama, as localizações das sequéndas pro- D

motoras cardí aca (P e esquelética (Pv) estão indicadas, E
^
assim com a localização das duas sondas moleculares. A
sonda a híbrida com o éxon 2 e a sonda b hí brida com o
F

.
éxon 4 A transcrição do gene nos músculos cardíaco e Atividade de
esquelético termina apó s o éxon 6. A proteína produzida Deleçâo LacZ (%)
pelo gene é reconhecida nas amostras cardíacas e mus- Nenhuma (controle) 100
culares pelo mesmo anticorpo. A 100
B 100
Hindlll H/odlll H/odlll C 4

I> *>
D
E
<1
170

Éxon
ícncin
1 2 3 4 5 6
F 5

Sonda a b a. Essas informações indicam a presença de sequências

Faça um diagrama dos resultados previstos para a di-
gestão do DNA pela H/ndlll, seguida pelo uso das sondas
o e b n o Southern blottíng. O RNA mensageiro e as son-
das a e b são usados no northern blotting. A proteína é
sondada com o anticorpo no western blotting.
a. Aná lise do Southern blotting do músculo cardíaco e
do músculo esquelético.
b. Análise do northem blotting do RNAm maduro extraído
do músculo cardíaco e do músculo esquelético.
c. Aná lise do western blotting da proteína do músculo
cardíaco e do músculo esquelético.
enhoncers e/ ou silenciadoras na sequência a montante de
Me11 Se indicarem, onde estão situadas as sequências?
b. Por que a deleçáo D elimina efetivamente a transcrição
do lacZl
c. Dadas as informações disponíveis a partir da aná lise da
deleçáo, você consegue fornecer uma explicação mo-
lecular para a observação de que a expressão do ME 1
parece ser ligada e desligada em vários momentos du-
rante o desenvolvimento normal do camundongo?
 Capítulo Genética prospectiva e tecnologia
de DNA recombinante

APRESENTAÇÃO
16.1 As triagens genéticas prospectivas identificam
os genes por seus fenôtipos mutados
16.2 As sequências de DNA especificas são
reconhecidas usando tecnologia de DNA
recombinante
16.3 As tecnologias de sequenciamento do DNA
revolucionaram a biologia
16.4 As coleções de fragmentos de DNA donados
chamam-se bibliotecas
16.5 Genes especí ficos são clonados usando a
tecnologia de DNA recombinante

A "sala das moscas” deThomas Hunt Morgan ( na última fila, à direita)

PONTOS ESSENCIAIS
I As triagens de genética prospectiva induzem
mutações para identificar os genes envolvi-
dos em um processo biológico; a donagem
subsequente esclarece sua função molecular .
I O DNA pode ser amplificado pela donagem
molecular ou pela reação em cadeia da po-
limerase.
I Na donagem molecular, os fragmentos de
DNA são ligados em um vetor de donagem,
que, por sua vez, é replicado em um hospe -
deiro viva
I Bibliotecas são coleções de dones de frag-
mentos de DNA,derivados do DNA ou RNAm
isolado de células ou de um organismo.
I A sequência precisa do DNA pode ser deter-
minada em um processo automatizado.
I As sequências de DNA de genes específicos
podem ser descobertas usando tecnologia
de DNA recombinante . geneticistas puderam, pela primeira vez, obter as sequências de
.
foi o local da mutagènese original As primeiras triagens se basea -
ram em mutados espontâneos, mas com a descoberta por Hermann
Muiler ( segundo, da direita para a esquerda, na última fila ) de que
os raios X são mutagênicos, as triagens genéticas se tornaram ferra -
.
mentas rotineiras e poderosas para descobrir a função do gene Tam-
bém se podem ver nesta foto Calvin Bridges (terceiro, da esquerda
para a direita, na última fila ), que utilizou a não disjunção para pro-
var a teoria cromossômica da hereditariedade, e Alfred Sturtevant
( primeira fila,no melo), que construiu o primeiro mapa genético .
U m objetivo central da biologia é compreender as bases mo-
leculares e genéticas da fisiologia e do desenvolvimento. Co-
meçando com Mendel e continuando na pnmeira parte do século
XX, os geneticistas tentaram dissecar as regras de hereditariedade
conectando fenôtipos aos lócus genéticos. A descoberta do DNA
como material hereditário indicou que os genes são sequências
de DNA específicas e que as diferenças alélicas refletem diferenças
nessas sequências. Nos anos 1970, descobertas surgidas do estu-
do das bactérias e seus fagos levaram ao desenvolvimento de fer-
ramentas para manipular o DNA in vitro. Com essas ferramentas,
chamadas coletivamente de tecnologia de DNA recombinante, os
DNA precisas de genes e alelos espec íficos, identificando assim a
base molecular das diferenças fenotipicas.
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recombinante
Neste capítulo, ilustramos como a existênda de um
gene pode ser inferida a partir dos fenótipos mutados e
como as sequências de DNA e as funções de determina-
dos genes podem ser reveladas usando técnicas da tec-
nologia de DNA recombinante. Essas discussões são uma
base para os Capítulos 17 e 18, nos quais exploramos apli-
cações da tecnologia de DNA recombinante ao dissecar-
mos a funçào gênica e o sequenciamento dos genomas.
A exploração de como os genes controlam os proces-
sos fisiológicos e evolutivos é abordada de duas maneiras
que atacam o problema a partir de direções diametral-
mente opostas. Essas abordagens opostas são conheci-
das como análise genética prospectiva e análise genético
reversa . Os objetivos das análises prospectiva e reversa
são os mesmos: identificar os genes responsáveis pela
variação hereditária, determinar a estrutura e função dos
alelos do tipo selvagem que controlam os traços e descre-
ver como os alelos mutados geram fenótipos anormais.
No entanto, as duas estratégias começam em diferentes
extremidades do processo de identificação gènica.
A análise genética prospectiva começa com uma
triagem genética que identifica anomalias fenotí picas
específicas em uma população de organismos que fo-
ram mutados. 0 fenótipo anormal é estudado para iden-
tificar a natureza da anomalia hereditária e, por infer ên-
cia, as funções normais de um gene associado. No final
das contas, a sequência do gene responsável pela ano-
malia é determinada e pode sugerir a função molecular
do produto gênico correspondente figura 16.1a). Neste
capítulo, discutimos as triagens genéticas prospectivas
e como a tecnologia de DNA recombinante é utilizada
para identificar a sequência de DNA de determinados
genes. Ao contrário da análise genética prospectiva, a
análise genética reversa começa com a sequência de
um gene de funçào conhecida que depois é conectado
a um fenótipo mutado (Figura 16.1b). Essa estratégia é
explorada com mais profundidade no Capitulo 17.
16.1 As triagens genéticas
prospectivas identificam os genes
por seus fenótipos mutados
Com a descoberta feita por Hermann Muller de que
a radiação ionizante induz mutações (ver Seção 123), os
geneticistas perceberam que os organismos mutados po-
diam ser gerados à vontade e triados sistematicamente
em busca dos fenótipos de interesse. Os fen ótipos muta
dos fornecem informações sobre a função do alelo do tipo
- pectivas é que elas nào são tendenciosas; nào é necessá
523
selvagem e conhecimentos sobre os processos biológicos.
Em um dos primeiros exemplos, em 1908, Archibald Gar-
rod vinculou uma condição hereditária, a alcapton úria, à
falta de uma atividade bioquímica específica, o metabo-
lismo dos anéis de benzeno no ácido homogentísico. Ele
sugeriu que a versão do tipo selvagem do gene codifica a
enzima responsá vel por essa atividade bioquímica. Com a
capacidade para gerar mutações à vontade, os geneticistas
começaram a empregar triagens genéticas sistemá ticas
para dissecar outros processos biológicos, e as bases gené-
ticas de vias bioquímicas inteiras foram elucidadas.
A concepção das triagens genéticas para identificar os
genes envolvidos em determinados processos biológicos é
limitada apenas pela imaginação do geneticista. Um exem -
plo é a pesquisa realizada por Seymour Benzer que levou
ao campo da genética comportamental nos anos 1970.
Benzer acreditava que podiam ser identificadas as muta-
ções que afetavam espeáficamente os processos compor-
tamentais, como o que você está usando agora, o processo
de aprendizagem e memória. Na época, muitos acredita-
vam que o comportamento era complexo demais para ser
dissecado geneticamente. No entanto, Chip Quinn, um
aluno de pós-graduaçâo no laboratório de Benzer, apro-
veitou as ideias anteriores e concebeu uma triagem enge-
nhosa para identificar os mutados deficientes em apren -
dizagem e memória na Drosophila. As moscas do tipo
selvagem podiam ser ensinadas que um pulso de odor seria
seguido por um choque: mais tarde, quando sentissem o
odor, elas adotariam uma ação evasiva. Quando Quinn e
Benzer sujeitaram uma população mutada de Drosophila a
essa triagem genética , eles identificaram cepas mutadas de
moscas que podiam perceber o odor, mas pareciam inca -
-
pazes de associá lo com o estímulo; ou elas não aprende -
ram ou não conseguiam se lembrar.
Mais tarde, foi demonstrado que dois genes muta -
dos identificados no estudo, dunce e rutabaga , codifi -
cavam prote í nas envolvidas na produção ou degrada ção
da pequena molécula de sinalização adenosina mono-
fosfato cíclico ( cAMP). Na é poca, sabia-se que a sina -
lização por uma via cAMP era necessá ria para a apren -
dizagem na lebre- do- mar, Aplysia. Como os mutados
da Drosophila eram defeituosos na fisiologia do cAMP,
outros genes que codificavam proteínas envolvidas na
sinalização e resposta cAMP também foram investiga
dos quanto aos seus papéis na aprendizagem. No final
-
das contas, um fator de transcrição chamado creb (ele -
mento de resposta, proteína de ligação ao cAMP, do
-
inglês cAMP response element òinding protein ), que
ativa ou reprime os genes em resposta à sinaliza ção
cAMP, demonstrou -se cr ítico para armazenar as me-
m órias nas moscas. Notavelmente, o creb é amplamente
conservado nas espécies animais, e os mutados de ca -
mundongo que n ã o possuem atividade creb também
nào conseguem se lembrar. Um gene similar também é
encontrado no nosso genoma.
Um grande ponto forte das triagens genéticas pros-
rio nenhum conhecimento prévio da funçào molecular
-
 524 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
( a ) Gen ética prospectiva
: i Promovei muta ções O Identificar a
em moscas e fazer sequê ncia uitrabithorax
triagem de genica .
fenótipos
aberrantes.
Tipo selvagem Mutado u /frobrf õorax
( b)Genética reversa
Tipo selvagem Mutado Hox 10
Lombar
Sacra!
O identificar
o fenótipo
mutado.
Figura 16.1 Estratégias gerais da genética prospectiva e reversa.
do produto génico codificado. De certo modo, ao realizar
a mutagênese, o geneticista está permitindo que o orga -
nismo revele como seus processos biológicos funcionam.
Uma vez que os genes em determinados processos fisio-
lógicos ou evolutivos foram identificados por mutação,
podem ser obtidas as pistas para a função molecular do
produto génico usando tecnologia de DNA recombinante.
Projetando uma triagem genética
As triagens genéticas prospectivas começam com
uma mutagênese: Um organismo é tratado com um
mutágeno para criar mutações aleatoriamente por todo
o genoma. Um objetivo tí pico é induzir mutações em
cada gene em uma população de indivíduos mutados
por meio de uma abordagem chamada mutagênese por
saturação. A população mutada passa por uma triagem
de defeitos fenotí picos, seja qual for o processo bioló-
gico que esteja sendo estudado, e os mutados são cole-
tados e propagados para an á lise posterior. As estrat égias
para a mutagênese dependem dos processos biológicos
de interesse, o que dita o organismo experimental a ser
utilizado, a escolha do mutágeno e o procedimento de
triagem para identificar as mutações.
Escolha de um organismo Os atributos que fazem de um
organismo um bom modelo genético também o tornam
uma boa opção para um experimento de mutagênese
( ver páginas finais): Um organismo precisa ser capaz de
passar por todo o seu eido de vida no laboratório, ter um
tempo de geração curto (o tempo necessá rio para pro-
duzir uma progénie sexualmente madura e completar
o eido de vida sexual), produzir uma progénie com um
n úmero razoável de integrantes e ser passível de cruza -
mento. Os organismos diploides precisam ter um ge
ATG AAC T Ç Q TAC
mnai
~
Q Analisar a
TCC GGC TTT T ÃT 7/ -
"
funçào
molecular.
TTA SAT CAG TAG
Hox 10
níwwwvzn
— lso ,í r 9^^ do
O camundongo
* °
GCG GGG GAA GCG
GAC ATG &CT TAG
í
O alelo
Gerar
GCG GGG GAA GCG
IBMBgmia£ *
GAC ATG GCT TAG
— similar ao gene
Ultmbithorax
da Drosophíb.
mutado.
—
n ótipo de partida que seja inato em outras palavras,
homozigoto em todos os lócus. Esse genótipo permite
que as mutações recém- induzidas sejam imediatamente
identificadas , sem interferência dos efeitos perturbado
res dos polimorfismos. Final mente, é vantajoso usar o
organismo mais simples possível para o processo bioló-
gico em estudo. Como a Saccharomyces cerevisiae tem
um ciclo de vida rápido e é facilmente manipulada em la -
boratório, ela é frequentemente utilizada para investigar
os processos comuns a todos os eucariotos. Os princípios
elucidados na S. cerevisiae muitas vezes podem ser esten -
didos a outros eucariotos, incluindo as seres humanos.
Escolha de um mutágeno A escolha de um mutágeno
é ditada pelo organismo e pelo tipo de alelos mutados
desejados; diferentes mutágenos têm diferentes vanta
gens e desvantagens (Tabela 16.1 ). Os mutágenos que
-
induzem diferentes tipos de mudanças nas sequências
de DNA foram descritos na Seçã o 12.4. O tratamento
com mut ágenos químicos pode induzir centenas de
mutações em um único indivíduo, permitindo que seja
alcançada a saturação com apenas alguns milhares de
indivíduos mutagenizados. No entanto, a clonagem
de genes identificada pela mutagênese qu í mica pode ser
trabalhosa. Por outro lado, os mutágenos que resultam
especificamente em inserções de DNA , como os trans-
posons, resultam em muito menos mutações por indi -
v íduo, dificultando a saturação. Mas esses mutágenos
têm a vantagem de ser capazes de proporcionar uma
“etiqueta" de DNA que facilita encontrar e clonar os
genes que sofreram mutação. Em todas as mutagé neses,
deve-se ter cuidado para cruzar os mutados de interesse
com a cepa progenitora do tipo selvagem, garantindo
- assim que as linhagens do mutado coletado tenham
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 525

Ta beia 16.1 Mut ágenos comuns utilizados na mutag énese

Mutãgeno Espectro de muta ção Taxa de muta ção por lócus Espectro alé lico
Químico

EMS -
Conversã o GC AT
Códons de parada criados: TGG TAG
Alta
- Nulo, hipomorfo, hipermorfo

Sítios de splicing destru ídos: AG -* AA

Radiação
Nèutrons r á pidos Reorganizações (deleçòes, inversões
translocaçòes)
. Moderada Normalmente perda de função
(frequentemente nulo), mas
pode ser de ganho de função
Raios X
Raios gama
Initrclonal
DNA de tra nsferência Inserções Baixa Normal mente perda de função
(frequentemente nulo)
Transposons

apenas a mutação de interesse e não as outras que tam -
bém foram induzidas durante a mutagénese.
Estratégia para identificar mutações dominantes e recessi
vas O objetivo global da mutagénese é identificar vários
alelos mutados independentes de cada gene envolvido no
processo biol ógico de interesse. Consideremos a iden
tificação das mutações dominantes e recessivas em um
as Drosophilas são tratadas com um mutágeno por —
-
exemplo, alimentando os machos com metanossulfonato
de etila (EMS) (ver labela 16.1) somente as mutações
—
induzidas nas células germinativas são herdáveis e serão
passadas para a progénie das moscas mutadas.
- As mutações dominantes recé m - induzidas podem
ser identificadas na gera ção F produzida pelo cruza -
-
(

exemplo animal tí pico. A Drosophila , como a maioria dos
animais, passa a maior parte do seu ciclo de vida no estado
diploide. Suas células germinativas são extra ídas no início
do desenvolvimento e não contribuem para o desenvol
vimento somático do resto do corpo do animai. Quando
mento dos machos mutados com fémeas do tipo selva
gem ( Figura 16.2a ). No entanto, apenas uma pequena
fraçã o da progénie F , exibirá um íenótipo mutado, pois
- as mutações dominantes são raras. Essa raridade se
deve à baixa probabilidade de que qualquer altera ção

,
(a ) A triagem da F identifica ,
( b) A triagem da F identifica mutações ,
(c) A triagem da F identifica mutações
mutações dominantes recessivas nos animais. recessivas nas plantas.
O Promover O Promover
mutações mutações O Promover muta ções
nas células nas células nos progenitores
t espermá tlcas . espermáticas. germi nativos.
4441 I 4 f7H I O Acasalar com a 0 Acasalar com F, 4 * l I [í ’r' I ( ) Permitir que as
I x 1 +++' ! plantas da F,
P9 p
fé mea do tipo f émea do tipo 1 +++
selvagem. selvagem. autofertillzem.
,F ( 1 O Identificar muta ções
m- n i HM
Fi I 1 O Isolar a progénie
+1714 +4+ Q Identificar as F, e acasalar F , 1 indiv
recessivas nos
+4+ 4+4 mutações indlvldualmente íduos da F . 2
fn » » ro»
dominantes com o tipo
4m+
444
+4+
44
nos indivíduos selvagem para
4/n+ +4 *--
da F produzir famílias +m4 4+4
* distintas na F2.
-
4
4+4
As mutações dominantes _[ 444

1
1 x mi O
segregam em uma proporção 1:1 +4+ I 41774 | |4ff )4 I Entrecruzar os

^ í 1
indiv íduos da F2
para produzir a
progénie F*
0 Identificar
Os mutados homozigoros ncxmalmente
não vão segregar na proporção 3:1 na
geração F POts as piantas da F são
quimeras *com algumas células do tipo
secagem e algumas células rrutadas
,
F# 4ffi + » mr
-
44 4
mutações
recessivas nos
heterozígotas .
4m+ -
44 4 indiv íduos da Fj
44 4- 4+ 4

Os mjtados homoagotos não segregam em uma

,.
proporção 3:1 ra F já que os odviduos em alguns
acasalamentos não carregam a neva mutação.
Figura 16.2 Estratégias de mutagénese nos animais e plantas.
526 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

na sequê ncia de DNA de um gene venha a produzir um pare que, embora as mutações sejam induzidas por todo
ganho de função para o produto génico codificado, seja o genoma, apenas as mutações no homólogo do cromos -
qualitativamente seja quantitativamente. somo balanceador são analisadas. Os membros machos
As mutações que resultam em uma perda de função da progénie Ft que herdaram um cromossomo mutado
são mais comuns, mas as muta ções de perda de função do pai e o cromossomo balanceador da mie são selecio-
geral mente são recessivas e n ão resultam em um fenó- nados. Em seguida , os machos selecionados são cruzados
tipo observável na geração F,. Portanto, devem ser reali - com fémeas do estoque de portadoras do cromossomo
zados mais cruzamentos para produzir mutados homo- balanceador , produzindo a progénie Fr A geração F, con -
zigotos de perda de função. Na Drosophila , as mutações siste em machos e fémeas heterozigotos para a mutação
recessivas são identificadas em uma triagem da F, ( Fi - induzida e podem ser cruzados para produzir a progénie
.
gura 16.2 b) Nessa triagem , os indivíduos da F( deriva - Fr Na geração Fy 25% devem ser homozigotos para a mu-
dos do acasalamento de machos mutados com fémeas tação induzida e não vão carregar o alelo dominante do
do tipo selvagem são cruzados com fê meas do tipo sel - cromossomo balanceador; 50% serão heterozigotos para
a mutação recém - induzida e também carregam o alelo
vagem, produzindo uma geração ¥ r Os irmãos da F 2 sã o
cruzados, produzindo uma população F 3 segregando dominante; e os 25% restantes morrerão em virtude da
os indivíduos homozigotos para a mutação induzida. homozigosidade para o cromossomo balanceador. A pro-
O cruzamento da F: para produzir o mutado homozi- génie homozigota não portadora do alelo dominante do
goto da F3 é ineficiente, já que apenas a metade da F2 cromossomo balanceador pode passar por uma triagem
é hctcrozigota para a mutação induzida. Todavia , essas de fenótipo aberrante.
estratégias de mutagènese são empregadas em muitas
espécies, como os camundongos e o peixe paulistinha.
A identificação das muta ções recessivas é um O Promover muta ções nas
Cromossomo células espermá ticas.
pouco mais simples nos organismos que autofertilizam, balanceador i
como a Caenorhabditis elegans e muitas plantas ( por V X
l
Q Acasalar com uma mosca
f êmea carregando um
exemplo, Arabidopsis e milho). Nesses organismos, cromossomo balanceador.
os indivíduos da F são autofertilizados para produzir
C)Oé um cromos -
somo balanceador. A mutaçãocom vcmdhâ o dc cnábno
uma geração F2 a partir da qual as mutações recessivas AmjtaçáoCyé ícn) é mclu da para ajudar a acompanhar
dominarvTe, o balanceador e nutar oscromossomos
podem ser identificadas. Um exemplo de triagem da F} resultando em asas
é exibido na Figura 16.2c. Em uma triagem da F 2 ou da onòjladave é letal O Selecionar os ,membros
da progénie F com asas
Fy as mutações que resultam na letalidade homozigó - quando bomoagoQ
onduladas, carregando a
tica podem ser mantidas nos irmãos heterozigotos. F, cn+m+
cn
muta çã o CyO, e acasalar
com uma mosca
.-
Uso dos cromossomos balanceadores para rastrear mu- portadora do cromos
tações A ineficiência de uma triagem da F1 pode ser
somo balanceador
: } Selecionar os membros
contornada usando cromossomos marcados de modo a cn da progénie F2 com asas
serem seguidos através das gerações. Os cromossomos Fj y onduladas e olhos

balanceadores desenvolvidos na Drosophila permitem cn+m + * cn - - -

*
±t±m±4 ç/Ryr?+
cn
/ vermelhão de ciná brlo,
portadores do CyO
que cromossomos espec íficos sejam transmitidos in- dominante e homozigo-
tactos e acompanhados através de v árias gerações. Os cn tttt
cn
tos para o alelo cn
recessivo. (Fsses
cromossomos balanceadores têm três características membros herdaram o
gerais: (1) um ou mais segmentos cromossòmicos in - cromossomo original
vertidos, dentro dos quais os recombinantes meióticos mutado e um cromos
somo balanceador ).
-
não são transmitidos ( ver uma análise na Seção 13.5); (2)
um alelo recessivo que resulta em letalidade, de modo
que um indivíduo não pode ser homozigoto para o cro- Homozigotos para
a mutação m.
i
mossomo balanceador; e (3) uma “ marca" na forma de CHCyO
F, rn » m < rn » m «
mutação dominante conferindo um fenótipo não letal
cn
visível, de modo que a segregaçã o do cromossomo pode
ser acompanhada através de gerações. Um exemplo de
--
cm m f A
*** TH**,olho* Asas onduladas,

cromossomo balanceador é o cromossomo CIf í , utili- Heterozigotos para

venmelhiode
cinibno de cinã brto
-
olhos verrif i í :>

zado por Hermann Muller para demonstrar que os raios a mutação m. cn+ mt
cn
X induzem mutações (Observação Experimental 13.1) . cn Asa* ondulada *,
Os cromossomos balanceadores estão disponíveis para olhos verme hio
todos os cromossomos da Drosophila . de cirtAbrio

As mutações em cromossomos específicos podem ser Se náo houver moscas de

identificadas na Drosophila usando cromossomos balan -
.
ceadores Figura 163) As moscas macho são alimentadas
com EMS para induzir mutações e depois são acasaladas
com fêmeas contendo um cromossomo balanceador. Re-
asas retas na progénie F>
a nova mutação é fetal .
Figura 16.3 Identificando mutações recessivas na
Drosophila usando um cromossomo balanceador.
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 527

O que acontece se a nova mutação resultar em letali

dade quando for homozigota? Nesse caso, todos os indi
-- por todos os eucariotos. A levedura mutada foi cultivada
em uma temperatura permissiva para permitir a propa -
víduos sobreviventes da F. serão portadores do alelo do- gação e depois as linhagens mutados foram expostas a
minante, situado no cromossomo balanceador. Quando uma temperatura restritiva, provocando uma parada no
uma mutação letal for identificada dessa maneira , o alelo crescimento dc algumas cepas mutados ( Figura 16.4a ) .
mutado pode ser propagado a partir dos irmãos heterozi
gotos para a propagação. Essa estratégia de mutagênese
- Supreendentemente, em algumas linhagens mutados,
o crescimento foi interrompido em estágios específicos
foi utilizada por Eric Wieschaus, Christiane Nusslein - do ciclo celular, em vez de aleatoriamente ao longo do
-Volhard e colegas em uma triagem para identificar as
mutações da Drosophila que perturbam a formação do
espectro contínuo do crescimento (este último seria pre
visto se a mutação tivesse perturbado uma via metabó-
-
padr ão durante a embriogênese. A pesquisa é descrita em lica ). Esses mutados de levedura ca íram em categorias
detalhes na Seção 20.2. fenotípicas discretas, definidas pelo estágio do eido ce-
Triagem dos a idos condicionais nos organismos haploi- lular em que foram retidos. Uma explicação possível foi
des Uma vantagem de usar organismos haploides em a existência de pontos de checagem específicos no ciclo
celular ( Figura 16.4 b ) e, na realidade, foi constatado que
uma triagem genética prospectiva é que tanto as muta -
ções recessivas de perda de função quanto as mutações alguns dos genes identificados por essas mutações regu -
dominantes podem ser diretamente identificadas. Com lam a progressão da célula por meio de vários estágios
organismos unicelulares, uma população de células mito -
ticamente ativas pode ser mutada e os mutados com um (a )
fenótipo alterado podem ser selecionados diretamente nas Tratar com mutágeno Mutados sensí veis à
colónias derivadas das células mutadas. Uma desvantagem temperatura
é que as mutações que perturbam os processos essenciais /
ao crescimento e à fisiologia frequentemente são letais, in -
terferindo na propagação dos alelos e, assim, complicando Placa Placa
-
a triagem genética. Felizmente, muitas vezes é viável con levedura haploide Colónias de
réplica
Colónias de
ceber uma triagem para identificar os alelos mutados con - cresce a 23 *C levedura a 23 *C levedura a 36 °C
dicionais dos genes essenciais. Nos mutados condicionais, Mutados sensíveis à
o produto génico codificado é funcional ou não é necessá - temperatura crescem a

—
rio em uma condição ambiental a condição permissiva
—— mas é necessário e inativo ou ausente em outra condi-
.
23 X mas não a 36 X.

ção a condição restritiva ( ver Seção 4.1). ( b) Ciclo celular da levedura

Com algumas mutações letais, o fenótipo mutado
pode ser resgatado pela adição de uma substancia ne-
cessária para o meio de cultura (ou crescimento). Por
exemplo, os mutados auxotróficos para histidina con -
seguem crescer apenas quando a histidina está presente G1 S Final de S/G 2/M -
Pos
-anáfase
no meio de cultura. Em uma triagem para mutados con -

— —
dicionais desse tipo, a população mutada inicialmente é Retenção do
cultivada em condições permissivas nesse caso, em fenótipo
um meio contendo histidina de modo que o mutado N ú mero dc cdc2B
genes ede
cdc6, 7, 8, 16
17.20,23
. cdcIS
e o tipo selvagem vão crescer. Essa população mutada é
replicada e depois passa por triagem quanto aos defeitos 0$ fenótipos dos mutados doeido dedivisão
fenotípicos ( por exemplo, letalidade) quando cresce em celular iede ) se parecem com a levedura do too
selvagem em estágios específicos do ddo celular
uma condição restritiva ( por exemplo, falta de histidina ).
Essas triagens genéticas foram realizadas por Beadlc e
Tatum para identificar os auxótrofos no Neurospora na ( c)
Processos biokjç cos celulares espec íficos bloqueados
pesquisa que estabeleceu a gen tica bioquímica produ
é e
ziu a teoria de um gene- uma enzima ( ver Seção 4.3) .
- nas Snhagens mutados ak sugerem funções
especificas do ddo celular para os genes mutados.
Se uma substancia ausente não puder ser fornecida Duplicação Iniciação Sí ntese Ponto de Divisão
para o meio de cultura, outros tipos de condições am - do corpo da s í ntese doDNA checagem nudear
bientais podem ser alterados em seu lugar. Nos mutados polar do fuso doDNA da síntese ( mtose)
doDNA f
sensíveis à temperatura, a estabilidade do produto poli -
peptídico mutado de um alelo varia com a temperatura
( ver Seção 4.1), muitas vezes como resultado de uma
Fator alfa i
cdc28 cdc7 cekó, 8, 17 cdcl ó, 20.23 cdcIS
mutação de sentido trocado. Esse tipo de alelo letal con - Pós-
dicional nas leveduras S. cerevisiae e Schizosaccharomy - G1 S Final de S/G 2/M
-anáfase
ces pombe leva a uma compreensão genética molecular
do ciclo celular, um processo biológico compartilhado Figura 16.4 Identificação e análise dos alelos condicionais.
528 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
.
do ciclo celular ( Figura 16.4c) Os estudos na levedura
forneceram a base para compreender o papel da regula
ção do ciclo celular no câ ncer ( ver Seção 3.1).
Análise da mutagênese
Vá rias perguntas importantes precisam ser res
pondidas na an á lise dos mutados obtidos pela mutagè-
nese: (1) Os alelos mutados são dominantes ou recessi-
vos com relação ao alelo do tipo selvagem ? (2) Quantos
genes diferentes foram identificados na mutagênese?
(3) Quantos alelos mutados diferentes de cada gene
foram identificados?
Determinação da dominá nda ou recessivklade A resposta
para a primeira pergunta fornece informações sobre a pro-
babilidade de o aldo mutado representar uma perda ou
um ganho de função ( ver nas Seções 4.1 e 12.2 as descri-
ções dessas categorias). A dominâ ncia ou a recessividade
sao determinadas usando a mesma abordagem empregada
por Mendel. ()s indivíduos homozigotos para as novas
mutações são cruzados com a cepa do tipo selvagem em
que a mutagênese não foi realizada. O fenótipo na progé-
nie Fj derivada do cruzamento permite que o aldo mutado
seja designado como dominante ou recessivo.
Determinação da quantidade de genes identificados
resposta para a segunda pergunta fornece pistas sobre
quantos genes estão envolvidos nos processos biológicos de
interesse. O método mais direto para determinar o n ú mero
de genes representados por uma nova coleção de muta
dos que produzem fenótipos mutados similares é a reali
zação de testes de complementaçáo entre diferentes pares
de linhagens mutados. Se a progénie produzida pelo cru
zamento de duas linhagens mutados recessivas exibir um
fenótipo mutado, então as duas mutações são no mesmo
gene, ao passo que, se a progénie exibir um fenótipo do tipo
selvagem, então as duas mutações são em genes diferentes
( ver Capitulo 4). Na prá tica , podemos limitar o n úmero de
cruzamentos reconhecendo que a complementaçáo é co-
municativa; ou seja, se a mutação A for alélica para a mu
tação B e a mutação B for alélica para a mutação C, então
as mutações A e C são alélicas. Em alguns casos especiais,
como acontece com as mutações dominantes ou game-
tolkamente letais (letais em um estágio haploide do eido
celular, por exemplo, no pólen), os experimentos de com
plementaçáo não podem ser realizados facilmente e outros
métodos para averiguar o alelismo, como o mapeamento
(ver Seção 5.2), podem ser empregados.
Determinação do número de alelos mutados identificados
para um gene A resposta para a terceira pergunta deve
t
provir da análise de complementaçáo. ú til obter vá rios
alelos mutados de cada gene por dois motivos. Comparar
os fenótipos mutados de vá rios alelos permite uma ava
liação da gama de variação fenotí pica que pode ser ob-
tida pela mutação do gene em questão ( ver Seção 4.1). A
recuperação de vários alelos para cada gene também for -
nece informações sobre a saturação da triagem genética;
em outras palavras, ela sugere a porcentagem dos genes
que podem ser identificados, que na verdade foram iden -
tificados. Quando um experimento de mutagênese de -
- monstra ter produzido várias mutações independentes
em cada gene identificado, a maioria dos genes no pro -
cesso de interesse provavelmente sofreu mutação.
Observa çã o gen ética As triagens genéticas prospec-
- tlvas sào uma abordagem imparcial para Identificar os genes
envolvidos em um processo biológico específico; nã o é neces
sá rio nenhum conhecimento prévio da função molecular dos
genes. Os testes de complementaçáo revelam o n ú mero de
genes e alelos identificados nas triagens genéticas.
As triagens genéticas prospectivas costumam exigir
a mutagênese de milhares de indivíduos e a seleção de
grandes quantidades de integrantes de sua progénie por
tadores de fenótipos mutados. Cada progénie pode conter
-
várias mutações, mas apenas uma pequena fração da pro-
génie terá um fenótipo mutado de interesse. Por exem -
plo, em suas triagens para identificar auxótrofos, Beadle,
Tatum e colegas selecionaram muitos milhares de linha -
gens mutadas individuais para descobrir alguns auxótro-
fos para arginina que foram produzidos. F.mbora algumas
triagens necessitem de inspeção visual de toda a progénie,
outras são concebidas especifica mente para realçar certos
A mutados de interesse contra o pano de fundo composto
por todos os demais mutados. A concepção dessas tria-
gens é uma arte. Talvez a triagem mais radical seja aquela
- em que a aplicação de uma técnica de seleção simples per -
mite que os mutados de interesse sobrevivam, enquanto
- os que não são de interesse morrem. Entre os exemplos,
temos o isolamento das bactérias resistentes a antibióti-
- cos, os insetos resistentes a inseticidas e as plantas resis -
tentes a herbicidas. De modo similar , o isolamento dos
mutados resistentes aos análogos dos compostos quími -
cos celulares ou aos altos níveis de hormónios naturais se
provou útil nas triagens genéticas. Frequentemente nes
ses casos, as mutações identificam genes codificadores de
-
proteínas envolvidas no metabolismo ou nas vias de sina -
- lização dos compostos químicos respectivos.
Mesmo quando não podem ser aplicados fortes
critérios de seleção, o conhecimento dos processos bio-
lógicos de interesse pode influenciar na concepção da
triagem. Por exemplo, quando Wieschaus e N ússlein -
- -Volhard realizaram sua triagem de mutados da em-
briogênese na Drosophila , eles supuseram que todas as
mutações de interesse provavelmente eram letais para
a larva (ver Seção 20.2). Assim, eles podiam limitar sua
análise intensiva às linhagens mutadas em que a letali-
dade larval era evidente. A Aná lise Genética 16.1 vai de -
safiá -lo a conceber uma triagem que identifique os genes
envolvidos em um determinado processo biológico.
-
Identificação da interação e da
redundância gênica
Geralmente, os fenótipos mutados refletem a res -
posta do organismo à perda , ou alteraçã o, de um deter -
minado produto génico. No entanto, os genes não agem
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 529

AN Á LISE GENÉTICA
Em todos os organismos eucarióticos, as proteí nas a serem secretadas pela célula ou incorpora
das à membrana plasmática são traduzidas no ret ículo endoplasmático e seguem pelo aparelho
de Golgi até alcanç ar a membrana plasmática. Descreva uma triagem genética para identificar os
genes envolvidos na secreção proteica.

Estrat égias de solução Etapas da solu ção

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema diz respeito à concepção de uma triagem genética,
este problema e explique a natureza
da resposta solicitada.
.
2 Identifique as informações críticas .
2 O objetivo é identificar mutações nos genes que funcionam na secreção pro-
fornecidas no problema. teica, um processo universal entre os eucariotos .
Deduzir
.
3 Considere qualquer informação dls- .
3 Como não recebemos qualquer tipo de informação sobre os genes erwofvídos
ponibilizada sobre os genes envolvi- na secreção proteica, uma triagem genética prospectiva seria uma boa aborda-
dos no processo seaetórlo. gem porque suas mutagéneses nâo são influenciadas pelos preconceitos sobre
as funções bioquímicas ou as sequências génicas .
.
4 Escolha um organismo para a abor- .
4 Uma vez que os sistemas secretórios em todos os eucariotos são similares, pro-
dagem genética prospectiva. vavelmente eles são homólogos, ou seja, herdados de um ancestral comum.
Assim, podemos escolher qualquer eucarioto apto a análise genética. A Sac-
charomyces cerevisiae seria uma boa escolha, pois já existem muitas ferramentas
genéticas para esse organismo genético modelo.

.
5 Considere a consequência fenotípica .
5 Como a perda de um sistema secretório funcional tende a ser letal para qual-
de uma perda de secreção proteica . quer organismo, devemos usar uma estratégia para identificar os alelos muta-
dos condicionais.

Solucionar
6. Projete uma abordagem para a tria-
gem genética baseada nos passos 3
a 5 da solução.
.
7 Descreva como vocé identificaria
as mutações que afetam especifica-
mente a secreção.
6. Um bom projeto seria similar ao procedimento utilizado para identificar os ale -
los mutados sensí veis á temperatura nos genes do ciclo celular da S. cerevisiae.
A mutagênese das células haploides poderia ser realizada em uma temperatura
permissiva (por exemplo, 25 - 30 *0, seguida pela triagem de fenótipos mutados
em uma temperatura restritiva (por exemplo, 39 °C).
7. é necessário um método para monitorar a secreção. Uma abordagem seria
acompanhar o destino de uma proteína reconhecidamente secretada no meio
de cultura e procurar mutados em que a proteína não foi detectada.

Para pratkar mais, ver Problemas 21, 22, 23, 27, 28 e 29.
isoladamente. A atividade dos outros genes pode modifi -
car, potencializando ou suprimindo, os defeitos fenotipi-
cos provocados pela perda de um produto gênico. Uma
abordagem para descobrir as interações genéticas é rea
lizar uma triagem modificadora genética para ver se as
mutações em um segundo gene conseguem potencializar
ou suprimir o fenótipo da primeira mutação. Em uma
variação de uma triagem modificadora, chamada tria -
gem potenciadora, as muta ções em um segundo sítio
potencializam o fenótipo do mutado inicial. Um tipo
complementar de triagem gen ética , chamado triagem
supressora , procura identificar mutações de segundo
sítio que suprimem o fenótipo do genótipo inicial. Re
pare que os dois tipos de triagem podem ser realizados
simultaneamente. As estrat égias de triagem potencia -
doras-supressoras sáo quase ilimitadas em quantidade e
sofisticação, além de terem o potencial para identificar
- os genes que funcionam nas vias genéticas interagentes.
As triagens modificadoras conseguem identificar
mutados duplos que exibem um fenótipo imprevisto,
um que n ã o seja simplesmente uma combina ção dos
fen ótipos dos dois mutados simples. Na que seja tal-
vez a forma mais radical de potencializaçã o, chamada
letalidade sinté tica , os dois mutados simples sã o viá -
veis, mas o mutado duplo é inviá vel. A letalidade sin -
-
tética foi observada pela primeira vez pelos geneticis
tas de Drosophila que observaram a inviabilidade de
-
algumas combinações de pares de alelos mutados. Por
 530 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

exemplo, quando Alfred Sturtevant cruzou fé meas
mutados prune { pn no cromossomo X ) com machos
de uma reserva separada, chamada S/ E S, ele notou
que a progénie consistia somente em fê meas pn* e ne-
nhum macho viá vel ( Figura 16.5 a ), Sturtevant deter-
minou que os machos S/ E-S portavam uma muta çã o
autossô mica dominante, que ele chamou de Prune
- -
kUler ( K pn ) , que combinada com a pn resulta em
letalidade; mas ele notou que as moscas homozigotas
-
para a muta ção K pn isolada não tinham um fenó-
tipo aberrante. Em seu cruzamento, todos os machos
da progé nie herdaram um alelo pn de sua mâe e um
-
alelo K pn de seu pai e, portanto, essa progé nie mor
reu. Por outro lado, a progé nie feminina era viá vel ,
pois, apesar de herdar um alelo K pn do seu pai, ela
(a) Cruzamento de Sturtevant identificando letalidade sintética
— ±+
çv pn X
-
K pn
F, 9
pn Kpn
^
també m herdou um alelo pn* de seu pai. Nesse exem -
plo, os mutados pn e K - pn são viá veis, mas o mutado
- duplo pn, K pn resulta em letalidade.
-
A Figura 16.5b mostra dois possíveis mecanismos
para explicar a letalidade sintética ou potcncializaçào.
Em um dos mecanismos, os dois genes em questão
- agem em vias complementares paralelas. Neste cenário,
as mutações que resultam na perda de qualquer uma
das vias podem ser compensadas pela atividade da via
restante. Entretanto, quando ambas as vias são rompi -
das, observa -se uma potencializaçã o radical no fen ótipo
mutado. Um mecanismo alternativo é possível quando
- os dois genes estão agindo na mesma via: uma redução
na função de um componente da via resulta em um fe-
- nótipo brando, mas, quando os dois componentes são
rompidos, a via não consegue mais funcionar de modo
eficaz. Repare que no último cenário os alelos hipomór -
ficos podem resultar na potencializaçã o sintética, mas
0 afeio dominante,
não os alelos nulos.
O primeiro cená rio, em que os dois genes agem em
-
Prune kí Mcf (K-pn), em paralelo, é um exemplo de redundância genética , na
combinaçãocoma
perda da função
qual a perda de fun ção de qualquer um dos genes iso -
ladamente é compensada pela atividade do outro gene

— Todos morrem prune (pr), resulta em

* = Cromossomo Y
( b) Possíveis mecanismos para potencializa ção sintética
Interações entre as vias
Via A
letalidade. não mutado. Somente quando os dois genes são muta
dos seria evidente um fenótipo mutado ostensivo. Nesse
-
caso, pode-sc prever uma razão de segrega ção de 15:1
na F , de um cruzamento entre os dois mutados reces-
sivos simples ( ver Seção 4.2). No caso mais óbvio de
redundâ ncia genética , dois genes codificam proteí nas
ViaB muito similares que podem funcionar alternadamente.

CD CD Em muitos casos, as atividades dos dois genes n ão com -

pensam plenamente uma á outra, de modo que as mu -
\ / tações simples em qualquer um dos genes isoladamente
Função biológka resultam em um fenótipo brando, enquanto um fenó-
essencial tipo grave é observado quando os dois genes são mu -
tados. A redund â ncia genética provocada pela presen ça
Se duas vias realizam uma função essencial, a mutação de qualquer
uma delas isoJadamente pode não trazer conseojèncas, mas a
mutação de ambas res jlta em uma perca ca função essencial
de genes duplicados pode surgir por meio de duplica
ções de pequena escala ou de duplicações do genoma
-
inteiro. Conforme exploramos em detalhes no Cap ítulo
Interações dentro da via 18, as sequê ncias genô micas de eucariotos mostram que
Tipo selvagem Cf Mutado cf Tipo selvagem Cf Mutadocf
essas duplicações sã o bastante comuns.
Tipo selvagem C2 Tipo selvagem C? Mutado c2 Mutado c2 A redundâ ncia genética também pode surgir da
açâo compensatória dos genes com pouca ou nenhuma
© © © 0 semelhança de sequência, mas que codificam atividades
I . bioquímicas diferentes. Com esse tipo de redundâ ncia
genética, é dif ícil prever a redundância desses genes
© Atividade
©; Atividade 0i Atividade 0Atividade com base em sua sequê ncia de DNA, mas ela pode ser

i total
da via
! reduzida
f
da via
! reduzida
da via
Insufioente
da via
revelada pelas triagens potenciadoras-supressoras. As
triagens potenciadoras-supressoras tê m sido realiza -
Função das em muitos organismos, incluindo Drosophila , C
essencial
eleganz, Arabidopsis e camundongos ( ver Seção 18.3),
Tipo selvagem Viável Viá vel letal sendo extremamente bem -sucedidas na identificação
das vias genéticas interagentes (ver Seção 20.3) .
Mutações por perda de função parcial no Cf ou C? isoladamente
reduzem as funções, mas os organismos ainda são viáveis No
entanto se os dois componentes sofrerem mutação a va pode se
tomar não funcional.
Observa çã o gen é tica As triagens potenciadoras-su -
pressoras podem revelar que dois genes estão agindo em vias
00007 Macnvlan Pubk*r*n LM genéticas interagentes.
Figura 16.5 Potencializaçã o sintética .
 Capítulo 16 Genética pfospectiva e tecnologia de DMA recombinante
16.2 As sequências de DNA específicas
sã o reconhecidas usando
tecnologia de DNA recombinante
Vimos que o uso de triagens genéticas concebidas
de forma inteligente habilita os pesquisadores a isola
rem os mutados que afetam quase qualquer processo
biológico. Porém, para descobrir a base molecular dos
fenótipos resultantes, os pesquisadores também preci
sam ser capazes de clonar os genes que identificaram.
A tecnologia do DNA recombinante fornece ferramen
tas para passar do fenótipo mutado para a sequência de
DNA, de modo que as diferenças alélicas possam ser
examinadas no nível molecular.
A tecnologia de DNA recombinante é o conjunto
de técnicas desenvolvidas para amplificar, manter e ma
nipular sequê ncias de DNA específicas itt vitro e també m
.
in vivo Essa tecnologia, que se baseia nos avanços da mi -
crobiologia — particularmente na compreensão dos ci
clos de vida das bacté rias e seus vírus, os bacteriófagos
— , revolucionou o estudo da genética. Com o objetivo
final de estudar determinados genes e suas funções, os
biólogos usam as técnicas de DNA recombinante para
( 1 ) fragmentar o DNA em pedaços de fácil manipulação e
depois separar e purificar esses fragmentos; (2) criar mui -
tas cópias das moléculas de DNA com sequências idênti-
cas; (3) combinar os fragmentos de DNA para construir
moléculas de DNA quiméricas ou recombinantes; (4)
determinar a sequência exata de moléculas de DNA es-
pecíficas; (5) identificar os fragmentos de DNA contendo
sequências complementares; (6) introduzir moléculas de
DNA específicas nos organismos vivos; e (7) analisar os
efeitos fenot í picos do DNA introduzido.
Os principais desafios da tecnologia de DNA re
combinante são a identificação de sequê ncias de DNA
específicas e sua manipulação in vitro. Para ver esses
desafios em perspectiva , considere que cada uma das
suas células conté m duas cópias de cada um dos 22 au
tossomos e 2 cromossomos sexuais. Coletivamente, um
conjunto haploide de 23 cromossomos conté m 3 bi
lh ões de pares de bases e carrega mais ou menos 25 mil
genes. Um gene tí pico codifica um transcrito de RNAm
consistindo em alguns milhares de bases, embora o
RNAm possa ser transcrito a partir de uma região que
abrange milhões de pares de bases. A análise molecular
dos genes e a variação alélica são possíveis apenas dis -
tinguindo um gene de interesse dos demais no genoma .
A tecnologia de DNA recombinante permite que os
pesquisadores dividam o genoma em segmentos meno-
res que depois podem ser analisados e remontados para
proporcionar uma visualização molecular dos genes e
do genoma . Nas próximas seções, descrevemos o desen -
volvimento das ferramentas tecnológicas de DNA re-
combinante e sua aplicação para identificar sequências
de DNA específicas, culminando nas abordagens para
identificar os genes originalmente identificados apenas
por um fenó tipo mutado.
531
Enzimas de restrição
As enzimas de restrição cortam o DNA em sequên
.
cias específicas (ver Capítulo 10) Cada enzima de restri-
-
ção reconhece uma sequência de restrição específica na
qual ela corta as duas fitas da espinha dorsal de açúcar -
- - fosfato do DNA, clivando a sequê ncia de restrição da
mesma maneira toda vez que for encontrada. As enzimas
de restrição foram originalmente descobertas nas células
- bacterianas, onde protegem as bacté rias das invasões dos
ácidos nucleicos, como os genomas injetados dos bacte-
- riófagos, digerindo o DNA estranho. Elas receberam o
nome de enzimas de restrição porque restringem o cresci -
mento dos bacteriófagos. As células bacterianas também
contêm sistemas de modificação da restrição que mo -
dificam as sequências de reconhecimento da enzima de
- restrição no DNA bacteriano pela adição de grupos metila
e, assim, protegem o DNA da própria bacté ria contra a
digestão pelas enzimas de restrição endógenas. A Obser -
- vação Experimental 16.1 explica como os sistemas de
modificação da restrição foram identificados e como se
tomaram parte indispensável da biologia molecular.
As enzimas de restrição são comuns nas bactérias. Os
nomes dados a essas enzimas geralmente são derivados da
primeira letra do género bacteriano e das duas primeiras
letras da alcunha da espéde, seguidas por um algarismo
romano. Por exemplo, a EcoRI deriva da Escherichia coli;
a letra R indica a cepa da qual a enzima foi obtida ( RY13)
e o numeral (I) indica que foi a primeira enzima identifi-
cada. A EcoRI reconhece a sequência palindrômica:
-
5' GAATTC - 3'
-
3' CTTAAG - 5'
Lembre-se de que um pal índromo tem a mesma
sequência de bases em suas duas fitas de DNA antipa-
- ralelas. A maioria das enzimas de restrição reconhece
sequências palindrómicas. Por exemplo, o EcoRI corta
a ligação de açúcar -fosfato entre o G e os resíduos A ad-
jacentes nas duas fitas, e o corte escalonado resulta em
- dois produtos, cada um deles terminando com uma se-
qu ência de quatro bases em fita simples:
- -
5' G AATTC 3' -
3' - CTTAA G 5' -
Os segmentos de fita simples nas extremidades de
cada fragmento EcoRI são chamados extremidades coe-
sivas porque conseguem “aderir " a uma sequência de
1
pares de bases complementares pela ligação de hidrogé-
nio. A produção de extremidades coesivas facilita a com
binação dos fragmentos de DNA gerados com as enzimas
-
de restrição e o pareamento de bases complementares
desempenha um papel em quase todas as técnicas de
DNA recombinante. O princí pio é que, se duas molécu -
las de DNA produzidas pela digestão com enzima de res-
trição tiverem extremidades coesivas complementares,
elas podem ser combinadas pelo pareamento de bases
complementares. O próprio genoma da E coli é prote-
gido contra a digestão pela endonuclease EcoRI pela en -
zima EcoRI metilase, que adiciona um grupo metila ao A
532 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Observa çã o Experimental 16.1

Do bacterió fago à s enzimas de restriçã o: a pesquisa bá sica gerou uma revolução biológica
A pesquisa biológica bá sica visa descobrir e compreen-
der fenómenos de todas as partes do espectro da vida. Mi-
lhares de biólogos participam dessa pesquisa diariamente e
a maioria possui especialidades que podem parecer obscuras
ou triviais para os que não são cientistas. Contudo, suas des-
cobertas podem não só revolucionar a pesquisa, mas também
contribuir para mudar a forma como enxergamos o mundo.
Em meados dos anos 1960, Werner Arber estava estudando
um fenômeno bacteriano chamado restrição e modificação con-
troladas pelo hospedeiro, que age como um sistema imune sim-
pies nas bactérias invadidas por bacteriófago , Ele mostrou que
*
a £ coli produz duas enzimas que afetam as mesmas sequências
.
de DMA palindrômkas curtas Uma enzima, chamada endo-
nudease de restrição, diva o DNA como um par de tesouras mo-
leculares. A segunda enzima, chamada enzima de modificação,
adiciona grupos metila (CH1) ao DNA, impedindo assim que as
endonudeases de restrição se liguem ao DNA.
Em 1970, Hamilton Smlth ampliou o trabalho de Arber
ao estudar uma endonuclease de restrição do Haemophitus
irifluenzae. Smith isolou o Hind\\ e determinou que ele diva
na sequência
5' GTPyPuAC 3'
3'- CAPuPyTG - 5'
- 5' GTPy PuAC 3'
3'- CAPu PyTG - 5'
- recombinante em 1975.
O HindW gera extremidades cegas clivando sua sequência-
<
alvo entre a purina central (Pu = A ou G)e a pirimidina Py =
T ou C). O trabalho de Smith no HindW identificou algumas ca-
racteristicas importantes das enzimas de restrição. Primeiro, o
HindW cliva o DNA estranho em fragmentos grandes, mas não
afeta o DNA do H. infhtenzae. Isso confirmou a ideia de Arber
de que o DNA bacteriano está protegido contra a ação das
enzimas de restrição da pr ópria bactéria. Segundo, cada frag-
mento de DNA resultante tem os mesmos três pares de bases
em suas extremidades, indicando que a clivagem ocorre ape-
nas na sequência-alvo. Smith também descobriu que as enzi-
mas de restrição divam cada cópia de sua sequência-alvo que
encontram.
Em 1971, Daniel Nathans foi o pioneiro no uso das en-
donucleases de restrição para tratar de questões genéticas e
genômicas. Nathans usou o Hind\\ para digerir o pequeno ge-
noma do virus SV40 dos simios e constatou que se formaram
11 fragmentos de DNA. Em 1973, Nathans digeriu o SV40 com
duas endonudeases de restrição recém-descobertas. Depois
ele usou os três conjuntos de fragmentos de restrição para
criar o primeiro mapa de restrição do genoma do SV40, deter -
minando o número e a ordem dos sítios de restrição de cada
enzima e reunindo tudo em um mapa.
Quando Nathans concluiu seu mapa do genoma do
SV40, os biólogos já estavam examinando outras enzimas de
restrição. Em cinco anos, mais de 100 enzimas de restrição
foram descobertas. Muitas formavam extremidades coesivas
no DNA digerido e Paul Berg percebeu que os fragmentos
de DNA provenientes de diferentes organismos podiam ser
unidos se tivessem extremidades coesivas complementares.
Essa constatação o levou a criar a primeira molécula de DNA
Arber, Smith e Nathans dividiram o Prémio Nobel em Fi-
siologia ou Medicina de 1978 por seu trabalho sobre enzimas
de restrição e Berg ganhou o prémio em 1980 pek) desenvol -
vimento do DNA recombinante. Desde então, as enzimas de
restrição se tornaram uma ferramenta onlpresente na pes -
.
quisa genética e genómica O estudo inicial de Arber sobre
um evento obscuro nas bactérias desencadeou uma revolu-
ção tão importante quanto a descrição da estrutura do DNA
feita por Watson e Crick ou a descrição das leis da hereditarie-
dade de Mendel.

adjacente ao T em ambas as fitas de DNA. Essa é a “ mo-
dificação" no sistema de modificação da restrição EcoRI.
Centenas de enzimas de restrição foram isoladas
das bactérias e estã o dispon íveis comercialmente (ver
Tabela 10.1). Embora muitas enzimas de restrição pro
duzam extremidades coesivas, seja com ressaltos em 5’
( como na EcoRI ) ou com ressaltos em 3’, algumas delas
deixam extremidades cegas que não possuem um
segmento de fita simples. As moléculas de DNA com
extremidades cegas també m podem ser recombinadas.
Algumas enzimas de restrição reconhecem sequên
cias de 4 pb, outras reconhecem sequências de 5, 6 ou 8
pb. O tamanho da sequência de reconhecimento influen
cia a frequência com que uma determinada enzima vai
cortar o DNA. Se o DNA de um organismo consistisse em
25% A, 25% T, 25% G e 25% C e as bases fossem distribuí-
das aleatoriamente, então uma enzima de restrição que
tivesse uma sequência de reconhecimento de 4 pb deveria
cortar o DNA uma vez a cada 256 p b ( % x % x % x % a
.
1/256) Do mesmo modo, uma enzima de restrição que
reconhecesse uma sequência de 6 pb cortaria o DNA uma
vez a cada 4.096 pb ( l /4ft ) em média, e uma enzima de res-
trição que reconhecesse uma sequência de 8 pb cortaria o
DNA uma vez a cada 65.536 pb (1/ 48) em média. Na rea-
lidade, o genoma da maioria dos organismos não consiste
em quantidades iguais de quatro bases. Por exemplo, a
- maioria dos genomas dos eucariotos pluricelulares é rica
em AT (ou seja, seus genomas têm um conteúdo maior de
A e T do que de G e C ) e então as enzimas de restrição que
reconhecem uma sequência rica em GC cortaria o DNA
com menos frequência, em média, que as enzimas que re-
conhecem uma sequência rica em AT .
- Os cientistas usam dados dos experimentos de res-
-
trição, incluindo o n úmero de sítios de restrição e o nu
mero de pares de bases entre os sítios, para criar mapas
-
de sequê ncias de DNA específicas. Esses mapas de res-
trição fornecem uma base para a manipulação poste-
rior dos fragmentos de DNA clonados
—
por exemplo,
sugerindo onde subdividir ainda mais os fragmentos
clonados para clonar fragmentos ainda menores, em
um processo conhecido como subclonagem .
Utilizemos o genoma do fago lambda da E coli em .
um exemplo de processo de mapeamento de restrição.
O DNA do genoma do fago pode ser isolado purificando
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 533

o fago e removendo seu revestimento proteico. Se isso
for feito delicadamente, o ácido nucleico isolado será o
cromossomo inteiro do fago lambda, que consiste em
uma molécula linear com 48.502 pb de comprimento.
A eletroforese do cromossomo em gel de agarose, in -
cluindo um corante fluorescente para o DNA (ver Ca
pítulo 10), revelaria uma única faixa fluorescente de
48,5 kb (primeira pista na Figura 16.6). Se o cromossomo
lambda purificado for digerido primeiro com Apal , dois
fragmentos, um medindo 10,1 kb e o outro 38,4 kb, são
gerados, indicando que a Apa\ precisa cortar o genoma
uma vez. Isso nos permite começar a desenhar o mapa
de restrição conforme mostrado se segue.
Apal
A[ ][
Se digerirmos o cromossomo lambda purificado
com Xhol , dois fragmentos, um de 33,5 kb e um de
15 kb, são gerados, indicando que a Xhol também pre
cisa cortar o genoma uma vez:
Xhol
A[
l grandes, os pesquisadores precisam fragmentar os ge
No entanto, duas orientações sào possíveis para o
mapa de restrição da Xhol em relaçã o ao mapa de res -
trição da Apal desenhado anteriormente. Ele também
poderia ser desenhado conforme segue:
Xhol
i agarose, os fragmentos que perfazem o “esfregaço” re -
A[
Para determinar qual é a ordem correta, precisamos
realizar uma digestão dupla, na qual as duas enzimas são
usadas simultaneamente para cortar o genoma do lambda.
Esse experimento gera três pedaços: 10,1 kb, 15 kb e
23,4 kb. Uma vez que o fragmento de Xhol de 15 kb per-
- maneceu intacto, mas o fragmento de Xhol de 33,5 kb
foi cortado em dois fragmentos (10,1 kb e 23,4 kb) pela
Apal , concluímos que o mapa deve ser
AM Xhol
l
A[
O outro possível mapa pode ser considerado incor-
reto e eliminado, já que geraria fragmentos de 4,9 kb,
10,1 kb e 33,5 kb:
Apal Xhol
A[
- A Analise Gen é tica 16.2 proporciona mais prá tica
adicional para a construção de um mapa de restrição.
Para analisar o DNA dos organismos com genomas
-
nomas em peda ços mais manuseáveis. Por exemplo, o
genoma da Physcomitrella patens consiste em 400 mi -
lhões de pares de bases e quando é digerido com uma
enzima de restrição como a £coRI que corta o DNA, em
média, a cada 4.096 pb, são produzidos aproximada -
mente 100 mil fragmentos de DNA diferentes. Quando
esse DNA digerido passa pela eletroforese em gel de
sultante variam de 20+ kb até pedaços menores que
.
100 pb ( Figura 16.7) O resultado é um esfregaço por-

HMH Híndlll Hr/idlll HindUl Hindlll

(23130) ( 25157) (27479) ( 36895) (37459)
Apa\ XÒíJl
<
100901 ( 24508! Xhol
(33498)
írtdlll
( 44141)
/ Digestão do DNA genõmico
da Physcomitrella patens,

,
I 1 I 1i I
4 x 10" pb

As faixas em destaque sáo

Pista: DNA de doroplasto (123 kb)
presentes em centenas a
kb milhares de cópias por célula
48,5
- 23,1
Sequências de reconhecimento
Nofl 5’ GC »£ GCCGC 3’

- 9,4 SomHI 5'

~
G * GA T CC 3J

Qgfll S‘ I 3‘
- 6,7
- 4.4 EcoRl 5' G VAA T C
'
3'

=a HindUl 5'
Alu\ 5'
A*
A Q*C T
“

3'
3’

- 0,5 Figura 16.7 Digestão do DNA genõmico com enzima de

Fiq ura 16.6 Mapeamento de restriçã o do fago lambda. restri ção.
 534 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

AN Á LISE GENÉTICA
Você isola um plasmideo da £ coli e quer começar sua análise O O O
deste criando um mapa de restrição. Usando tr ês enzimas de
restrição, O BamHI, O EcoRI e O Norl, você realiza seis digestões
o o o ó ó ó
diferentes: digestões simples usando cada enzima isoladamente kb
i nr
- 23
9A
ou digestões duplas usando cada uma das combinações de duas
enzimas. A eletroforese em gel de agarose dos fragmentos resul- li:
si
-- 4J
.
tantes produz os resultados exibidos aqui Desenhe um mapa de 40
30
restrição do plasmideo . u 2J
20
1.3
- 20

10
a«
oA
a4
- os
02

Estratégias de soluçã o Etapas da solução

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema pede para que você construa um mapa de restrição de um
este problema e explique a natureza plasmideo .
da resposta solicitada.

.
2 Identifique as informações críticas 2. Os resultados da eletroforese de três digestões simples e três possíveis combi -
fornecidas no problema . nações de digestão dupla são fornecidos .
Deduzir
.
3 Identifique os tamanhos de cada um .
3 SomHI — um único fragmento de 7 kb. Como os plasmídeos são circulares, o
dos fragmentos das digestões sim - BomHI precisa cortar o plasmideo apenas uma vez.
ples e determine quantas vezes cada
enzima corta o plasmideo.
—
EcoRI um único fragmento de 7 kb Um sítio no plasmideo.
—
Norl dois fragmentos, 3 kb e 4 kb. A Not\ precisa cortar o plasmideo em dois sítios.

4. Identifique os tamanhos de cada um .

4 Not\ + BamHI —três fragmentos: 3 kb, 2 3 kb e 1,7 kb
*
.
dos fragmentos das digestões duplas. Nofl + EcoRI — dois fragmentos: 4 kb e 3 kb.
fiomHI + EcoRI — dois fragmentos: 5,3 kb e 1,7 kb .
(S) Compare os resultados das digest ões 5. Nort A- Bomfil —
três fragmentos, com o fragmento 3 kb da Nofl Intacto, suge
rindo que o sítio BamHI está dentro do fragmento Not\ de 4 kb.
-
/f simples e duplas e descubra as se-
/1 melhanças e diferenças.
MM: AO analisar as digestões do -
\
Armadilha Se dos sítios
—
Nort + EcoRI dois fragmentos, com os dois fragmentos de 4 kb e 3 kb da Not\
intactos, sugerindo que o sitio EcoRI é adjacente a um dos sítios Nort .
pias, è oos çáo relativa dos sJlrcs
de restrição pode ser determinada
esflverem muito pcõwmos
urr do OUDO, haverá menos
—
BomHI + EcoRI dois fragmentos, indicando que os dois sítios estão separados
fragmentos qce o previsto por 1,7 kb ou 53 kb no caminho mais longo do plasmideo .
observando quas fragmentos ( )
permaneceu mtacxos e quais sao na digestão dupla,
cortados em fragmentos menor
**.
Solucionar
6. (b) 3 kb (c) 3 kb
(a) Desenhe um mapa de restrição
com os sítios A/ort. Nort
(b) Adicione o sítio flomHI. 7 kb EcoRI 7 kb
7 kb 23 ,7 kb 23
.
mmmj
(c ) Adicione o sítio EcoRI *
imHI imHI

Dki: 0 desenhe do mapa de restrito rio exige 4 4

que as irfs enzimas sejam examiradas em qual- A digestão com a fiamHI O sítio EcoRI deve ser adja -
quer ordem particular corta o fragmento Not\ de cente a um dos sítios Not\ e
4 kb em fragmentos de está a 1,7 kb do sítio BamH \ A.
2,3 kbe 1,7 kb ordem relativa do sítio EcoRI
e dos sítios Noti adjacentes
não pode ser determinada, já
que a resoluçã o da eletrofo-
rese em gel não é suficiente
Para praticar mais, ver Problemas 14, 16, 17 e 19 .
 Capítulo 16 Genética prospect í va e tecnologia de DMA recombinante 535

que, embora a enzima corte o DNA a cada 4.096 pb em

média, as distâncias entre os sítios da £coRI vão mudar
em virtude da variação na sequência genô mica e a po-
t ência de resolução da eletroforese em gel de agarose
nâo é suficiente para separar todos os fragmentos di-
ferentes em faixas discretas Essa falta de resolução é
*
rir o DNA da fonte doadora e o DNA do vetor de clona
gem com a mesma enzima de restrição. Os fragmentos
-
lineares resultantes das duas fontes de DNA podem
ser hibridados em suas extremidades coesivas comple-
mentares. A Figura 16.8 ilustra a digestã o pela enzima

agravada nos genomas maiores, como o nosso, no qual

—
de restrição EcoRI do DNA do vetor
—
um plasm ídeo,
nesse caso e do DNA do genoma humano. A mistura
a digestão com a EcoRI produz aproximadamente 730 dos dois DNAs em um tubo de ensaio permite que as
mil pedaços (3.000.000.000/ 4.096). extremidades coesivas hibridem uma com a outra pelo
pareamento de bases complementares, após o que os
Observa çã o gen é tica As enzimas de restrição cortam cortes de fita simples restantes são vedados com DNA
o DNA de fita dupla em sequências de reconhecimento es- ligase (ver Capítulo 7), resultando em uma molécula de
pecificas e são utilizadas para fragmentar o DNA em pedaços DNA recombinante. Nesse caso, um plasm ídeo recom -
pequenos. Os mapas de restrição do DNA permitem que frag- binante contendo DNA humano é formado.
mentos específicos sejam identificados para manipulações ex- Embora seja comum cortar o DNA da fonte e do
perimentais posteriores. vetor com a mesma enzima , frequentemente são em -
pregadas variações desse tema. Por exemplo, às vezes
sã o utilizadas duas enzimas de restrição diferentes
que criam extremidades coesivas complementares.
Clonagem molecular Quando sã o utilizadas enzimas de restriçã o diferentes
Após um genoma em estudo ter sido reduzido para digerir o DNA vetor e doador, as extremidades
para peda ços menores pelas enzimas de restrição, coesivas complementares se chamam extremidades
cada peda ço precisa ser reproduzido em grande quan -
tidade
pela PCR
—— geralmente, pela clonagem molecular ou
para que cada um deles possa ser anali -
sado em mais detalhes. A clonagem molecular surgiu Vetores plasmídeos DNA humano
das descobertas na enzimologia bacteriana e utiliza
Ecofil fcofil EcoRI
bactérias e seus plasm ídeos ou fagos para ampliar e 1- t Í t
propagar fragmentos de DNA espec íficos. Ecofll EcoRI
£coRI
Na clonagem molecular, fragmentos de DNA isola -
dos são inseridos em um vetor , um fragmento portador
Digestão
de DNA com atributos que irão permitir a ampliação com
( replicaçào) em um sistema biológico. Depois, a mol é
cula de DNA recombinante é introduzida em um sis -
- Digestão com EcoRI . EcoRI.

tema biológico que amplia o DNA, criando muitas có-

pias idê nticas, chamadas dones de DNA. A clonagem
molecular produz uma grande quantidade de moléculas Extremidades \
de DNA idênticas que podem ser analisadas por uma coesivas
-
=—
série de técnicas, incluindo a an álise com enzimas de \ complementares, "
Id ênticas '
>
restrição e o sequenciamento do DNA. Í 3' 5' A AT TC
:CTT A A S* 3'£
5 A À TTC G 3' \
A donagem molecular consiste em três etapas gerais: 3' TT C T T A A 5’

1. A união do vetor de donagem e de um fragmento de

DNA doador para produzir um done recombinante.
Combinação
2. Escolha dos organismos contendo có pias do seg - dos fragmentos
mento de DNA clonado desejado.
3. Amplificação do clone recombinante em um sis
tema biológico.
- Plasmídeos
recombinantes
Vetor não
recombinante

Nesta seção, descrevemos como os fragmentos de

DNA são combinados in vilro, os atributos dc alguns
vetores de clonagem comuns e os meios para sua am -
plificação. Essas discussões são acompanhadas na Seção
16.4, com uma descrição de como as bibliotecas de
DNA, coleções de fragmentos de DNA clonados nor -
malmente derivados de ácidos nucleicos de uma única A DNA hgase catalisa a formação da ligação
fonte, são constru ídas. fosfodiéster entre os grupos 5 fosfato e 3’ hdroxila
'

Cria ção de mol éculas de DNA recombinantes Um mé-

todo comum para produzir DNA recombinante é dige - Figura 16.8 Criando mol éculas de DNA recombinante .
536 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

compatíveis coesivas. Por exemplo, a BamHI reco - Cóar extremidades coesrvas ráo
compementarps e diferentes
nhece a sequência de 6 pb (doragem direcional).
-
5' GGATCC - 3' DNA vetor Fragmento de DNA inserido
-
3' CCTAGG - 5' EcoRI Bam Hl EcoRI BamHl
e deixa as extremidades coesivas f

-
5' G GATCC 3' -
-
3' CCTAG G 5' - Digerir com
EcoRI e BamHl . Digerir com
EcoRI
A Sau3 A reconhece a sequência de 4 pb Remover o fragmento
^• Extremidades e ôomHI.
-
5' GATC - 3' coesivas
-
3' CTAG - 5' diferentes e
e deixa uma extremidade coesivas
-
5' N -
GATCN 3'
complementares
/ às extremidades
do DNA — r
,

-
3' NCTAG -
N 5' 3'
*v Inserida

5’ S A> T t C
/
yA ÀTrCafbE 3’ '\
(onde N representa qualquer nucleotídeo). Como as TT7TÍ 5’
extremidades coesivas criadas pelas duas enzimas são
iguais ( 5' - GATC - 3'), as extremidades de um fragmento
BamHl c Sau3A podem se combinar c criar moléculas de Combinar os fragmentos
DNA recombinantes. No entanto, nesse caso, nos produ
tos ligados resultantes sempre faltará um sítio BamHl in
-- Vetor recombinante Vetor não ligado

tacto, já que os Ns 5' do sítio Sau3 A podem não ser Gs.

Normalmente, o objetivo desse processo é criar mo-
léculas de DNA recombinante nas quais um único pedaço
do DNA fonte é combinado com uma única molécula do
vetor de dofttgem. Entretanto, como os DNAs digeridas
de ambas as fontes são misturados em um tubo de ensaio,
pode surgir uma série de moléculas recombinantes. Por
exemplo, alguns recombinantes podem ter um único frag-
mento de DNA doador, enquanto outros recombinantes
podem ter dois ou mais fragmentos de DNA doador que
se unem e depois se inserem no vetor. Além disso, as extre-
midades coesivas dos vetores podem se juntar novamente
uma com a outra, em vez de incorporarem um fragmento
doador, produzindo um vetor não recombinante. Como
nem os vetores recombinantes nem os dones com vários
fragmentos inseridos são desejados na clonagem, foram
desenvolvidas técnicas para favorecer a produção dc dones
com uma única inserção. Por exemplo, a ocorrênda dos
dones recombinantes pode ser reduzida pela remoção dos
5’ fosfatos no DNA do vetor, de modo que esse DNA não
consegue se ligar para produzir dones não recombinantes.
Uma caracter ística dos experimentos que usam uma
única enzima de restrição ou que usam duas enzimas com
extremidades compat íveis coesivas é que o fragmento
de DNA inserido pode ser ligado no vetor em qualquer
orientação. Uma maneira de garantir que o fragmento
de DNA inserido seja clonado em um vetor respeitando
uma orientação específica é utilizar duas enzimas de res-
trição com extremidades compatíveis diferentes, um pro - berâ ncias 3' podem ser transformadas em cegas por uma
cesso chamado clonagem direcional Figura 16.9). A clo -
nagem direcional possui três características desejáveis. A
primeira é que apenas os fragmentos de DNA inseridos
que possuem duas extremidades compatíveis diferentes
serão clonados eficientemente no vetor. A segunda é que
os fragmentos de DNA inseridos são ligados em uma de-
terminada orientação, ditada pelas extremidades compa-
tíveis coesivas. E a terceira é que, em razão da incompa-
tibilidade das duas extremidades do DNA vetor digerido,
0 fragmento de DNA i nsertdo 0 vetor isoladamente
pode ser ligado nc vetor em não pode ser religada
apenas uma orientação
Figura 16.9 Clonagem direcional das moléculas de DNA .
este vetor não consegue se religar, minimizando assim a
criação de vetores não recombinantes.
Embora estejam dispon íveis comercialmente cen -
tenas de enzimas de restrição, as extremidades com
patíveis coesivas nem sempre são possíveis de produzir
-
nas posições necessá rias para construir certas molécu -
las de DNA recombinante. Uma abordagem para a cria-
ção de extremidades compatíveis nesse caso é gerar ex
tremidades cegas, sem qualquer protuberância, e ligar
-
as moléculas com essas extremidades.
Algumas enzimas de restrição criam naturalmente
as extremidades cegas, mas qualquer sítio de enzima
de restrição pode ser convertido em uma extremidade
cega ( Figura 16.10 ). Por exemplo, a DNA polimerase (ver
Capítulo 7) pode usar a protuberância 5’ como molde e
adicionar dNTPs na extremidade 3’ rebaixada até pro -
duzir uma extremidade cega . Por outro lado, as protu -
DNA exonuclease ( ver Capítulo 7), que degrada apenas
o DNA de fita simples e “ mastiga" a protuberância 3’.
Em alguns procedimentos, a força de cisalhamento, em
vez das enzimas de restrição, é utilizada para produzir
fragmentos de DNA aleatórios (como acontece quando
o DNA é passado por uma agulha fina) e as extremi -
dades do DNA fragmentado podem ser transformadas
em cegas pelo tratamento com uma DNA polimerase
e com exonuclease. De modo oposto, as extremidades
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recombinante 537

Criar extremidades cegas preenchendo ou aparando da £ coli (ver Capítulo 6) é um plasmideo. Os plasmi -
Vetor plasmideo Fragmento de DNA deos utilizados como vetor de clonagem se replicam de
modo independente do cromossomo bactcriano e, ao
Kpn\ Kpn\ contrário do fator F, que consegue recombinar no cro-
mossomo da £ coli , sempre permanecem separados dele.
Os plasmídeos utilizados como vetores de clonagem
foram modificados em laboratório para possuir várias
Digerir com Digerir com características que facilitam a produção de moléculas de
fcoRI. BM DNA recombinante Figura 16.11 ). Por exemplo, os plas -
m ídeos são equipados com uma origem de replicaçào que
induz a replicaçào eficiente do plasmideo dentro do hos
pedeiro bacteriano. Eles também contê m um gene que
-
s
confere um traço que permite às bactérias abrigarem o
plasmideo para que cresça seletivamente. Os genes que
/ 5* conferem resistência aos antibióticos frequentemente
3' [W
são utilizados como marcadores selecionáveis.
Dois tipos de plasmídeos, identificados como plas-
Preencher a Remover a
extremidade 5’ protuber ância m ídeos baseados em pUC e plasm ídeos baseados em
com DNA 3' com pBR, são utilizados com mais frequência na construção
polimerase exonuclease
de plasm ídeos recombinantes capazes de transformar
bactérias competentes. Ambos os tipos possuem mui -
.3’
L 5*
5'
3*
5' £
=**=£ 3’ tas formas diferentes, desenvolvidas por meio de ampla
engenharia gen ética realizada em laboratório. Nesses
vetores, o gene betalactamase, que confere resistê ncia
á ampicilina, é utilizado com frequê ncia como marca -
Combinar os fragmentos dor sclccion á vcl. A origem de replicaçào (ori ) derivou de
um plasmideo de £ coli de ocorrência natural chamado
Vetor recombinante plasmideo ColEl. A ori do CoIEl permite que esses
plasmídeos sejam mantidos em um n ú mero elevado de
cópias, de 100 a 200 plasmídeos por célula.
Os plasm ídeos pUC e pBR também contêm um
sítio de clonagem m últipla ( MCS) que possui vários
sítios de enzima de restrição diferentes nos quais o
DNA pode ser clonado. Esses sítios de enzima de res-
trição ocorrem apenas dentro do MCS e em nenhum
outro lugar no plasmideo. Nos vetores de clonagem de
Figura 16.10 Clonagem de extremidade cega das plasmideo baseado em pUC, o MCS está incorporado
moléculas de DNA . no gene lacZ, que codifica a betagalactosidase, uma
organização que proporciona uma análise calorimé-
cegas podem ser convertidas em extremidades coesivas trica para determinar quais bactérias abrigam vetores
pela ligação de oligonucleotídeos curtos nas moléculas com uma inserção de DNA no MCS (ver Figura 16.11).
de DNA com essas extremidades cegas. Os oligonu - Embora o substrato normal da betagalactosidase seja
cleotídeos podem ser sintetizados para ter sequências a lactose, a enzima também consegue clivar análogos da
destinadas a qualquer enzima de restrição desejada, adi
cionando assim qualquer sítio de restrição específico à
- lactose, como o X -gal. Quando o substrato incolor X -gal
é adicionado ao meio de cultura, as bactérias com um
extremidade de qualquer molécula de DNA. Os oligonu - gene lacZ funcional que produzem betagalactosidase
-
cleotí deos desse tipo chamam se ligadores . vão converter o X -gal em um produto azul. Quando um
fragmento de DNA é inserido no MCS, o gene lacZ é
Observa çã o gen é tica A ligação dos fragmentos de afetado c se torna não funcional. Então, as bactérias vão
DNA derivados de diferentes fontes cria moléculas de DNA aparecer como coló nias brancas, enquanto as bactérias
recombinante. Com o uso de várias ferramentas combinadas, que abrigam um vetor de clonagem que não contém um
pratkamente quaisquer duas moléculas de DNA podem ser fragmento do DNA inserido no MCS são azuis. Essa di
ferença permite a rá pida identificação das coló nias que
-
ligadas e produzir uma molécula recombinante .
abrigam vetores com inserções no MCS. Desse modo,
a seleção baseada na resistê ncia a antibióticos permite a
Plasm ídeos como vetores de donagem Os plasm ídeos identificação das bacté rias que foram transformadas, e
sâo moléculas de DNA circulares que se replicam de a triagem de azul versus branco permite a identifica ção
modo autó nomo nas bactérias e normalmente carregam das bactérias que abrigam vetores plasmídeos com uma
genes não essenciais. O fator F envolvido na conjugação inser ção de DNA recombinante.
538 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Figura 16.11 Vetor de (a )

clonagem plasmideo . Sí tios de restrição MCS para clonagem
1
Primer Ml 3 de
sequenciamento Psfl Som Hl Pr/mer M13 de
anterógrado HincU Smai 5ocl sequenciamento
Hmd\\\ PaeI Sal\ / Accó5l reverso

5' CP
\ \ Xbai Kpn\ EcoRI
jAsaGmcnr , 3'

MCS

kTcZ

O gene marcador seíeconáveí A origem de repllcaçáo

betalactamase, bfo [ Amp* ), bh PUC 18 onr permite a repiicaçác do
2 686 pb
confere resistência à ampicrlin* DMA nas bacténas.

( b)

Ascoiôr as brancas
Emum meio contendo X-gal as . identificam as bactérias em
colónias azuis identificam as < je o gene bcZ foi afetado
bactérias com gcnc tocZ fundonal c*assim, contém moléculas
.
de DMA recombinante

Amplifica ção das moléculas de ONA recombinante
moléculas de DNA recombinante são introduzidas na £
coli por transformação, o mesmo processo descrito por
GrifFiths e por Avery, MacLeod e McCarty em suas pri -
meiras investigações da funçã o hereditá ria do DNA ( Fi
gura 16.12; ver Capítulo 6). Para amplificar as moléculas
de DNA recombinante nos laboratórios modernos, o
DNA é misturado com a £ coli em um tubo de ensaio.
As bactérias são tratadas quimicamente com cátions bi
valentes (como o Ca2 * ) ou com um choque elétrico para
abrir poros em suas membranas, tornando, assim, as
bactérias competentes para capturar DNA exógeno por
transformação. As cepas bacterianas utilizadas nos ex-
perimentos de DNA recombinante são escolhidas pelas
caracter ísticas que n ão permitem que sobrevivam fora
do laboratório.
As concentraçóes de DNA utilizadas para transfor -
mar as bactérias competentes são determinadas empi
ricamente e escolhidas para que cada célula bacteriana
seja propensa a capturar mais de uma molécula de DNA.
Após a transformação, aguarda se a recuperação das bac
*
As sistência a um antibiótico, codificado no vetor de DNA .
Quando as bactérias transformadas são colocadas em
placas com um meio contendo o antibió tico, apenas as
bactérias que abrigam o DNA do vetor vã o sobreviver.
- As moléculas de DNA recombinante introduzidas
nas células microbianas sào amplificadas por ciclos re -
petidos de replicação do DNA. Uma vez que o vetor
recombinante tem uma origem de replicação, ele será
- amplificado pela replicação autónoma usando enzimas
.
bacterianas Depois, quando a bactéria se dividir, cada
membro de sua progénie receberá cópias da molécula
de DNA recombinante. Como uma ú nica bactéria com
uma molécula de DNA recombinante consegue crescer
em uma colónia consistindo em aproximadamente 10*
bactérias, cada uma com várias cópias da molécula de
DNA recombinante, são criados bilhões de cópias idê n -
ticas das moléculas de DNA.
- Observa çã o gen é tica Os plasmideos são utilizados
como vetores para amplificar as moléculas de DNA Sào utili-

térias por um curto período e depois elas sà o colocadas

- zados sistemas biológicos para executar a amplificação. A re-
sistê ncia a antibióticos produzida pela expressão de um gene
em placas com meio de cultura que seleciona as células no vetor é utilizada para identificar as bactérias transformadas.
contendo o gene marcador selecion ável, conferindo re-
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recombinante 539

Plasmídeos recombí nantes cada gene costuma ser maior que 20 kb e, portanto, não
pode ser clonado em um único plasmídeo. Para contor-
nar essas limitações dos plasmídeos, foram desenvolvi-
dos vetores capazes de lidar com clones maiores (Tabela
16.2). Têm sido empregadas duas abordagens gerais para
propagar os fragmentos de DNA maiores. Em uma delas,

Transformação dentro da £ coii e —

seeção no melo contendo
ampícilina . Os plasm ídeos só
Genoma entram err aproxima da mente 1 em
bacteriano 1.000 células, então a probablidade
de uma célula ter dois plasm ídeos
Célula da E. coii independentes é IO 6.-
vetores baseados no ciclo de vida dos bacteriófagos em
particular , o bacteriófago lambda acomodam fragmen -
—
tos maiores de DNA. A segunda abordagem aproveita as
origens de replicaçã o de uma ú nica cópia para propagar
efidentemenle até mesmo as moléculas maiores de DNA
recombinante, tanto nas bactérias quanto nas leveduras.
Vetores bacteriófagos O bacteriófago lambda é capaz de
passar por um ciclo Utico e um eido iisogénico (ver Seção

' k © &è è 14.6). A propagação do fago através do dclo de vida liso-

gé nico requer a presença de todos os genes do genoma
do lambda , mas os genes que estão envolvidos especifi
camente no ciclo de vida Iisogénico são dispensáveis para
-
Mas bactéria os plasm ídeos são amplificados pela replicação do DNA o ciclo de vida l ítico. Se os genes necessá rios para a liso-
^
e transmitidos para a progénie por ruvisão celiiar
genia forem removidos, eles podem ser substituídos por
i até 23 kb de DNA provenientes de outra fonte, e o fago
Replica çã o do DNA recombinante pode então ser propagado através de um
l .
ciclo de vida l ítico ( Figura 16.13a ) Nos vetores baseados

mt ® é 6 ®ó%°
Divisão celular
em bacteriófago, é a replicação do fago dentro da bactéria
que amplifica a molécula de DNA recombinante.
O tamanho do fragmento de DNA inserido que pode
ser acomodado é ainda mais aumentado aproveitando
outra caracteristica do sistema bacteriófago lambda: a re-
plicação por círculos rolantes (ver Capítulo 6). Durante o
ciclo de vida lítico, o DNA lambda replicado pela replica -
i çáo por círculos rolantes resulta na concatenação suces-
b siva dos genomas de 50 kb em moléculas de DNA longas.
@ © © Uma nuclease codificada pelo lambda reconhece uma
M sequê ncia específica dentro do genoma lambda e cliva os
genomas concatenadas em unidades genó micas simples.

$èè £ ©
Subsequentemente, sequências específicas, chamadas

<0© sítios de sequê ncia de extremidade coesiva ou cos, no

Cada colónia
consiste em 106 - 1 (f a cos derivadas do lambda, o DNA ligado pode ser encap
bactérias genetica -
mente idênticas,
cescendentesde
uma ú nica bactéria
transformada
Figura 16.12 Amplifica ção das mol éculas de DNA
recombinante nas bact érias.
O uso de vetores plasmídeos para clonar grandes
fragmentos de DNA é limitado, principalmente porque
os plasmídeos grandes ( mais de 20 kb) não são manti
dos eficientemente em um alto n ú mero de cópias. Essa
limitação restringe a utilidade dos plasmídeos na clona
gem do DNA genô mieo eucariótico, na qual os genomas
podem ser grandes (o genoma humano tem 3 x 109 pb) e
genoma lambda vão interagir com as proteí nas de reves-
timento do fago lambda para "encapsular" cada genoma
lambda em part ículas de fago discretas in vitro. Os sítios
cos são as únicas sequências lambda necessárias para que
o DNA seja encapsulado, então, quando o DNA prove-
niente de outra fonte for concatenado com as sequ ências
sulado em partículas de fago. Nesse caso, nem os genes
da lise nem os genes da lisogenia estã o nas partículas do
fago; desse modo, após a infecçào de uma bactéria hos-
pedeira, o DNA injetado nào entra no ciclo de rida do
lambda. Se uma origem de replicação e um marcador se-
lecioná vel forem incluídos no vetor, o DNA pode ser re-
plicado como um plasmideo na bactéria (Figura 16.13b ).
Os vetores com essas características são conhecidos como
vetores cosmídeos. Como o fago lambda consegue abri -
gar até 50 kb, os vetores cosm ídeos podem transportar até
- 45 kb de sequência de inserção com 5 kb de cos , origem de
replicação e sequência de marcador selecionável.
-
Cromossomos artificiais Embora os vetores de lambda e
cosmídeo sejam historicamente importantes, os vetores
540 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Tabela 16.2 Vetores de donagem

Vetor Forma do DNA Hospedeiro Capacidade Usos
Plasm ídeo Qrcular £ coti < 15 kb Subdonagem e bibliotecas de DNAc
Lambda Cromossomo de fago linear E. coti < 23 kb DNAc e bibliotecas genòmicas
Cosmideo Qrcular E. coti 30-45 kb Bibliotecas genòmicas
BAC Cromossomo bacteriano £ coti 100 200 kb Bibliotecas genòmicas
YAC Cromossomo de levedura S. cerevisioe -
250 2,000 kb Bibliotecas genòmicas

chamados cromossomos artificiais, que têm capacidade A reação em cadeia da polimerase

para transportar até mesmo fragmentos de DNA maio-
res , hoje são utilizados com mais frequência. Eles foram Como vimos, uma faceta importante da donagem
desenvolvidos com o conhecimento acumulado sobre molecular do DNA é que não é necessário qualquer conhe
como os cromossomos se propagam nos procariotos e cimento prévio sobre a sequência de DNA a ser clonada.
eucariotos e sobre as funções das diferentes regiões cro-
Um segundo método de amplificação do DNA, a reação
mossô micas na replicação. em cadeia da polimerase ( PCR ), é um método enzimá tico
rá pido e barato para amplificar sequências de DNA especí-
Os cromossomos artificiais da levedura (YACs)
foram os primeiros cromossomos artificiais desenvol- ficas a partir de uma mistura complexa original de sequên-
cias de DNA; entretanto, em muitas aplicações, a amplifi -
vidos e sào utilizados como vetores de donagem na &
.
cerevisioe Um vetor YAC contém sequências corres- cação baseada em PCR requer algum conhecimento prévio
da sequê ncia de DNA que está sendo amplificada.
pondentes a um centrò mero ( ver Seção 11.3), telò meros,
um marcador selecionável e um sítio de donagem, po- Lembre-se de que, em uma amplificação baseada em
dendo aceitar um fragmento de inserção de 200 kb até .
PCR duas sequêndas primar curtas ladeiam uma sequén-
da-alvo a ser amplificada; uma sequéndaprimer é comple-
2 megabases (Mb). Os YACs que transportam um frag -
mentar a uma fita da sequência-alvo e a segunda sequên-
mento de inserção menor que 200 kb frequentemente
cia primer é complementar a outra fita da sequência - alvo
são instáveis e não segregam adequadamente na mitose.
(ver Figura 7.24). Os eidos reiterativos de desnaturação,
Os cromossomos artificiais bacterianos ( BACs)
hibridação e síntese do DNA levam à amplificação expo-
foram desenvolvidos logo após os YACs. Embora os BACs
nencial da sequência -alvo entre as duas sequências-/?ri-
tenham uma capacidade menor para acomodar inserções
( 100-500 kb) que os YACs, eles sào o vetor de donagem
mer, levando também à produção de bilhões de cópias da
sequênda -alvo a partir de uma ú nica cópia original.
cromossòmico artificial preferido, em grande parte em
razão da facilidade de usar a £ coli em vez da levedura Os métodos de PCR e baseados na PCR revolucio-
naram muitos aspectos da tecnologia do DNA recombi-
como hospedeiro. Como os pla&mídeos, os vetores BAC
nante e, conforme descrevemos na próxima seção, têm
contém uma origem de replicação, um marcador seledo-
nável e um MCS. No entanto, a origem de replicação nos
sido fundamentais para o desenvolvimento de novas ge -
vetores BAC é derivada do plasmídeo de fator F. Ao con - rações de tecnologias de sequenciamento de DNA. A ex -
trema sensibilidade da PCR facilitou o estudo dos genes
trário da replicação via origem ColEl, a replicação via ori-
de organismos que não podem ser propagados nas cultu-
gem fator F é rigidamente controlada, produzindo apenas
ras puras em laboratório e, portanto, seu DNA é escasso.
uma ou duas cópias do fator F por célula. Essa diferença
Por exemplo, a PCR permitiu o estudo da evolução das
permite que os plasm ídeos grandes sejam mantidos, con -
sequências virais durante a infecçáo de um organismo
tornando o problema encontrado com os plasm ídeos que
hospedeiro isolado, facilitou o estudo da ancestralidade
possuem altos n úmeros de cópias.
A utilidade dos vetores de donagem BAC se toma
humana e permite o monitoramento do tráfico de espé -
cies em risco de extinção. Outras aplicações da PCR, in-
aparente quando consideramos os tamanhos típicos dos
cluindo seu uso forense e na genotipagem dos alelos de
genes eucarióticos. Por exemplo, embora genes globina
doenças humanas, são discutidas no Capítulo 7.
individuais no lócus da betaglobina tenham aproxima
damente 1,4 kb de comprimento, as sequências regula
tórias que controlam o grupo de genes globina abrangem
- 16.3 As tecnologias de
aproximadamente 70 kb de DNA genòmico. O lócus sequenciamento do DNA
inteiro da betaglobina pode estar contido em um único revolucionaram a biologia
BAC, mas não estaria contido em um único clone de
plasm ídeo ou cosmideo. No entanto, alguns genes euca - A descrição definitiva de qualquer molécula de DNA
rióticos, como o gene responsá vel pela distrofia muscu - é sua sequénda precisa de bases. Os princí pios do se-
lar de Duchenne nos seres humanos, abrangem mais do quenciamento de Sanger, também conheddos como
que uma megabase e provavelmente não caberiam em sequenciamento didesoxi, consistem em um método
um ú nico clone BAC ou YAC. de sequendamento desenvolvido nos anos 1970 ( ver
 Capítulo 16 Genética prospectí va e tecnologia de DMA recomblnante 541

(a ) Clonagem em um vetor de fago lambda (b) Clonagem em um vetor cosmideo de fago lambda
Genoma do lambda Genoma do lambda
I
r 1 r i
Repkaçào Llsogêmco Lítlco Cauda Cabeç a Repkaçào llsogênèco Utico Cauda Cabeça
1 I t 4 4
flomHI fiomHI cos cos flomHI BamH I cos
J
I
V Y
Inser ção apenas de uma sequência
cos no vetor cosmideo
Digestão com
cos
Gene de resistência
isolamento dos DNA genômico humano Amp* e a origem
braços esquerdo flomfll
de repliração (pr
í)
cos e direito cos derivados de um
4 f vetor plasmfdeo. Vetor cosmideo
5-10 Kb
Sítios 5ou3 A
Amp”
o/ i

Digestão com
Digest ão pardal Digestão parcial Somlll.
com $oi/ 3 A, com Sou3A, BomHlcos BamH \
para - 20- 25 kb -
para 35-45 kb

I 1 1 1 1 I I .1

Ligação e concatamerização

it ( cos
t
I cos
t
cos
t t t l

I Prcteinas do fago devam os

concatámeros e encapsulam os
pedaços em partículas dp fago in vtfro.

0 cosmideo circulariza
e se comporta como
um plasmideo
Infecção da E. coí i e Infecção da f. co/r.
colocação cm placa

Placas em substrato de £. coli

Colocação em placa
e seleção das
bactérias Amp9

Figura 16.13 Clonagem em vetores bacteriófagos.

542 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Capítulo 7). No sequenciamento didesoxi, aproximada - (a) Sequenciamento por primer walking

—
mente 800 a 1.000 bases consecutivas sâo determinadas
em cada reação uma leitura sequencial, mas a maioria
das regiões do DNA de interesse é maior que isso. Como
são sequenciados os fragmentos de DNA maiores?
O Os primers( (cinza)), baseados Inicialmente nas sequências
do vetor laranja , permitem que as extremidades do
done sejam sequendadas a partir dos dois lados.

I 3 kb

Sequenciamentos de moléculas de
DNA longas
O Novos primers sâo
Existem duas estratégias básicas para o sequencia
mento de grandes moléculas de DNA. A primeira técnica,
- concebidos com
base na sequência Q o procedimento é reiterado
o primer walking ( caminhada do primer ) ( Figura 16.14a ), recém obtida até a sequência dos dois
(vermelho). lados se sobrepor.
se baseia na síntese sucessiva de primers baseados na ob -
tenção progressiva de informações sobre a sequência. A (b) Sequenciamento shotgun
informação sobre a sequência de DNA obtida na primeira .100 kb
reação de sequenciamento didesoxi fornece uma base para DNA
a concepção de um segundo primer. Se o segundo primer
O Fragmentação em) tamanhos
-
estiver a 600 800 bases do primeiro, a segunda reação de
sequenciamento didesoxi pode estender a sequência co - Biblioteca de dones
-
menores ( 2-3 kb e donagem
usando vetores plasmideos.
nhecida para até 1.800 bases a partir do primeiro primer. ( roxo) do DNA
t
As reiterações desse processo permitem que os técnicos
“caminhem” ao longo de uma molécula de DNA, conce -
bendo novos primers a cada 600-800 bases. A velocidade
com que uma molécula é sequenciada por esse método é
limitada pela sua natureza reiteratíva.
Um segundo método para sequenciar grandes molé
culas de DNA é o sequenciamento shotgun, uma abor-
-
dagem que se baseia no sequenciamento redundante do
DNA -alvo fragmentado na esperança de que todas as
regiões venham a ser sequenciadas pelo menos algumas
vezes. Nessa técnica, uma grande molécula de DNA ( por
exemplo, um clone BAC de 100 kb) é fragmentada em
pedaços menores e os fragmentos são ligados em vetores O Extremidades das sequências Cada porção do DNA deve
.
de donagem ( Figura 16.14b) Os fragmentos podem ser dos dones (vermeibo) .
-
ser sequenciada em 10
gerados pela digestão parcial com enzima de restrição ou 0 Montagem das sequências dones independentes para
faclitar a montagem
cisalhando o DNA. O principal aqui é que a fragmentação por computador em
sequê ncias cont íguas
é feita de tal forma que produz pedaços aleatórios e, por- ( verde).
tanto, sobrepostos. As extremidades desses dones podem
Contig
ser sequenciadas usando um primer baseado na sequência
do vetor. Os dones desses fragmentos podem ser con - Primers z
Produto da PCR
z
siderados uma biblioteca de sequências da molécula de Sequência
DNA maior. A estratégia é sequenciar dones suficientes
para conseguir montar uma sequénda contígua completa O Utilização da PCR (com os primers)
baseados nas sequências laterais para
com base nas sobreposições das sequências. Existem al- fechar as lacunas restantes.
goritmos informatizados para realizar grande parte dessa
tarefa, permitindo que os dados de milhões de reações de Figura 16.14 Primer walking vtnus sequenciamento
shotgun.
sequenciamento sejam montados rapidamente ( ver Seção
18.1). Desse modo, no sequenciamento shotgun, o se
quenciamento de muitos fragmentos diferentes ocorre de
- base é adicionada a cada etapa. Após a fragmentação,
forma simultânea “em paralelo", permitindo que grandes cada molécula de DNA é desnaturada e são capturadas
moléculas de DNA sejam sequendadas rapidamente. e imobilizadas moléculas de fita simples em esferas. As
esferas, com cada uma abrigando uma única molécula
Novas tecnologias de sequenciamento: de DNA, são colocadas em cavidades. Os ligadores são
próxima geração e terceira geração adicionados aos fragmentos de DNA, permitindo a am
plificação pela PCR usando primers complementares
-
Novas gerações de tecnologias de sequenciamento
.
estão sendo desenvolvidas continuamente A tecno -
aos ligadores. Os fragmentos amplificados são sequen
cíados lavando as cavidades sequencialmente com so-
-
logia de sequenciamento de DNA conhecida como luções contendo as quatro bases, A, G, C e T. A luz só
última geração certifica a sequê ncia de uma ú nica fita é produzida quando a solução contiver o nucleotídeo
sintetizando a fita complementar e detectando qual complementar da primeira base não pareada do molde.
 Capítulo 16 Genética pfospectiva e tecnologia de DMA recomblnante
A luz é detectada por um sensor e a ordem das bases
é revelada pela sequência de soluções que produzem
sinais. Assim, as tecnologias de sequenciamento de úl
tima geração se baseiam no sequenciamento “ pela sí n -
—
tese" em vez de se basearem na terminação da cadeia,
como é o caso do sequenciamento didesoxi.
Um avan ço importante das tecnologias de sequen -
ciamento de ú ltima geração é que milhares a milhões
de reações de sequenciamento são executados simul-
taneamente, produzindo muito mais sequências que
o método didesoxi; desse modo, elas també m são cha
madas tecnologias maciçamente paralelas ou de alto
rendimento. Outro avanço importante das tecnologias
de sequenciamento de última geração em relação ao
sequenciamento didesoxi é que o DNA a ser sequen
ciado não precisa ser clonado primeiro, mas, em vez
disso, precisa ser amplificado diretamente pela PCR e
os produtos da PCR resultantes são sequenciados. Por
essa razão, essas técnicas são conhecidas como tecno -
logias de sequenciamento direto. A eliminação da etapa
de clonagem inicial tem duas vantagens importantes. A
primeira é que cia facilita o sequenciamento das amos-
tras de DNA encontradas apenas em quantidades- traço
—
( residuais ) por exemplo, as pequenas amostras de
DNA obtidas de organismos extintos, como as dos ossos
do homem de Neandertal ou dos mamutes preservados
na camada de terra congelada ( permafrost ) da Sibé ria.
Na verdade, o sequenciamento direto é tão poderoso
que permitiu a identificação das sequê ncias que repre
sentam a contaminação ambiental do DNA do mamute,
fornecendo, assim, informações sobre organismos que
coexistiram com o mamute ( por exemplo, espécies de
grama ). A análise do genoma do homem de Neandertal
é discutida em mais detalhes na Seção 18.2. Segundo,
certos tipos de DNA que são dif íceis de clonar, como a
heterocromatina altamente repetitiva, agora podem ser
sequenciados. Por outro lado, esses métodos tém a des-
vantagem de produzir leituras sequenciais mais curtas
( 20-500 bases ) que as sequências de 800 a 1.000 bases
obtidas com o sequenciamento didesoxi de Sanger.
Agora estão sendo desenvolvidas as tecnologias de
sequenciamento de terceira geração, nas quais milhões de
moléculas de DNA simples são sequenciadas diretamente
e em paralelo, sem a necessidade de clonagem ou amplifi
cação por PCR. Vale observar que, embora as tecnologias
de sequenciamento tenham mudado, o processo de deter
minação da sequência de DNA sempre se baseia na quí
mica precisa do pareamento de bases complementares.
Com o advento das novas tecnologias, o preço do se-
quenciamento caiu, tornando possíveis novas aplicações.
O custo do sequenciamento de um milhão de pares de
bases pela tecnologia didesoxi era de US$ 10.000 em 2001.
F.m 2005, o preço caiu para US$ 1.000, relativo ao pí rosse-
quendamento, e para apenas US$ 1,00 usando a tecnolo-
gia de sequenciamento de terceira geração dispon ível em
2010. O custo mais baixo resultou em uma explosão de
sequências disponíveis nos bancos de dados públicos; seu
n úmero passou de menos de 10 bilhões de pares de bases
543
em 2000 para quase 300 bilhões em 2010. L'm objetivo
declarado é produzir a sequência genômica de qualquer
- pessoa por menos de US$ 1.000, o chamado genoma de
mil dólares, dentro da próxima década. Quando isso for
viável, pode ser rotineiro que sua sequência gen ômica faça
parte de seu prontuá rio médico. Hoje o sequenciamento
de última geração está sendo empregado para determinar
se os pais podem ser portadores de mutações nos genes
subjacentes a 448 doenças recessivas da inf ância.
Essas novas possibilidades levantam algumas ques -
- tões sociais sem precedentes. Desde os primeiros dias
no desenvolvimento das tecnologias de DNA recom -
binante, os possíveis problemas éticos e os possíveis
riscos ambientais, entre outros, tê m sido assunto de
- intenso debate. F.m 1975, após uma moratória inicial
autoimposta, os cientistas se reuniram em Asrlomar
para tra çar um conjunto de diretrizes abordando muitas
questões de segurança. Possíveis problemas éticos sus-
citados pelo sequenciamento dos genomas individuais,
incluindo questões pertinentes à confidencialidade, pre -
cisarão ser abordados por debates pú blicos similares.
Observa çã o gen é tica Sobreposições nas sequências
decorrentes de m ú ltiplas reações de sequenciamento perml
tem que sequê ncias cont íguas de milhões de pares de bases
sejam montadas. Por meio das tecnologias de sequencia -
mento maciçamente paralelas, genomas inteiros são sequen -
ciados a um custo baixo.
-
16.4 As coleções de fragmentos
de DNA donados chamam- se
bibliotecas
Uma biblioteca dc DNA é uma coleção de fragmen -
tos de DNA clonados, normalmente derivada de ácidos
nudeicos provenientes de uma única fonte (lembre se
do nosso uso da biblioteca na discussão anterior sobre
.
sequenciamento shotgun ) As bibliotecas de DNA estão
disponíveis em duas variedades; as bibliotecas derivadas
do DNA gen ômico de um organismo chamam -se biblio-
tecas gen ó micas e as derivadas do RNAm chamam -se
- bibliotecas de DNA complementar ( DNAc). Como a
fonte dos ácidos nudeicos dc cada tipo dc biblioteca é
- diferente, os tipos de sequências representadas em cada
- tipo e biblioteca também sào diferentes.
Teoricamente, as bibliotecas genómicas devem con -
ter todas as sequências encontradas no genoma do orga
nismo de origem (fonte ). Por exemplo, uma biblioteca ge-
-
n ômica humana conteria todos os 3 x 10" pb na sequê ncia
genômica haploide. Isso incluiria os éxons e íntrons dos
genes, as sequências regulatórias que controlam a expres-
são genica, as sequências intergênicas (sequências não
codificadoras entre os genes) e as sequências repetidas
(ccnlrómcros, telômeros, DNA ribossômico, transposons,
retroelementos etc.). Por outro lado, as bibliotecas de
DNAc são derivadas do RNAm e, assim, representam as
 544 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

sequências de DNA transcritas no tecido do qual o RNAm
é derivado. Como apenas uma fração dos genes presentes
no genoma tende a ser expressa em qualquer tecido em
particular, e mesmo estes sào expressos em níveis dife-
rentes, apenas uma fração dos genes é representada, e em
diferentes quantidades, em qualquer biblioteca de DNAc.
Desse modo, o n úmero de veies que uma sequê ncia es-
pecífica é representada em uma biblioteca difere bastante
entre as bibliotecas genômicas e de DNAc.
Construçào de bibliotecas genômicas
As bibliotecas genômicas são coleções de clones in
dividuais derivados do DNA gen ômico de um organismo.
Para construir uma biblioteca genòmica, normalmente a
-
partir de um único indivíduo, isola se um fragmento em
pedaços menores que depois sào ligados em vetores de clo
nagem Figura 16.15 ). ( >s vetores recombinantes são trans
formados em bactérias (no caso dos vetores plasmídeos
e BAQ ou utilizados para infectar bactérias (no caso dos
vetores de fago ) que crescem em colónias ou placas que
contêm coletivamente clones representando o genoma in-
teiro. Uma biblioteca genòmica contém cada sequê ncia no
genoma aproximadamente cm frequências iguais. Desse
modo, as sequ ências que representam os éxons e íntrons
dos genes, as sequências regulatórias que controlam sua
expressão e as sequências repetitivas e intergênicas são
todas representadas com frequência aproximadamente
igual na biblioteca genòmica. Porém, na prática, algumas
sequências não são mantidas o suficiente nas células hos-
pedeiras e serão sub- representadas, de modo que o ge-
- noma inteiro nâo é totalmente representado em qualquer
biblioteca genômka tí pica. Por exemplo, o DNA repetitivo
-
tende a ser sub representado em decorrência de sua pro -
pensão para sofrer recombinação intragénica, resultando
- na deleção das sequências de DNA dentro dos clones.
- Três atributos desejá veis para a biblioteca gen ò-
mica são: (1) os clones genô micos são amplamente re-

DNA genômico

Fragmentação no tamanho adequado

por digestão parcial ou cisalhamento

-
20 25 kb -
40 45 kb
100- 200 kb 250 2.000 kb

Ligação
ao vetor
Liga çã o
ao vetor I Ligação
ao vetor
Liga ção
ao vetor
Origem da levedura

Cosmideo
Marcador selecioná vel

Origem bactertana (ori) ( YAC

Telõmero
y^
entrómero
ci it
Manrador selecioná vel
levedura Telõmero
Infecçáo Infecçáo Transformação Transformação
da £. coti da L coti na £. coti na levedura

Placas em substrato de £. coJi Seleção das colónias bacterianas Seleção das colónias bacterianas Seleção das colónias de levedura
Cada paca ou colónia é um clone independente. Todas as sequènoas origmaimente
presentes no DNA genômico devem ser rep,esentadasda mesma forma na biblioteca

Figura 16.15 Construção de bibliotecas genô micas.

 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante
presentativos do DNA do genoma inteiro, (2) os clones
genômicos sào suficientemente grandes para o sequen
ciamento e a subclonagem e (3) os clones genômicos
t êm tamanhos aproximadamente iguais. Vamos exami -
nar como esses atributos sào obtidos.
Para garantir que uma biblioteca genô mica seja am
plamente representativa, deve- se ter cuidado para frag
mentá -la em pedaços aleatórios de tamanho adequado
para a clonagem em um vetor. A fragmentação aleatória
é obtida por dois métodos diferentes. Em uma das téc
nicas, o DNA é digerido parcialmente com uma enzima
que corta com muita frequ ência ( por exemplo, uma en-
zima de restrição com sequência de reconhecimento de
4 pb). O termo digestão parcial se refere ao uso de menos
enzimas de restrição do que seria necessá rio para cortar
o DNA em todas as sequências de restrição reconheci
das pela enzima, resultando em cortes em algumas das
sequ ências de restrição, mas não em todas elas. Como
uma sequência de reconhecimento de 4 pb deve ocorrer
a cada 256 pares de bases, em m édia , a digestão parcial
do DNA na qual, em média, apenas uma em cada 400 se-
quências de reconhecimento é cortada deve resultar em
fragmentos de DNA de aproximadamente 100 kb. Assim,
a digestão parcial com uma enzima que, de outro modo,
corta frequentemente vai gerar fragmentos grandes e ale-
atórios de DNA gcnômico com extremidades coesivas,
como é desejado. A segunda t écnica para obter a frag-
mentação aleatória do DNA é o corte aleatório do DNA
genômico com tratamento enzimá tico subsequente para
criar extremidades cegas. Teoricamente, qualquer uma
das técnicas deve proporcionar uma representação alea
tória do DNA genômico do genoma inteiro.
O tamanho dos clones de DNA nas bibliotecas ge-
nômicas resulta de escolhas técnicas que buscam um
equil íbrio entre, por um lado, a dificuldade de isolar ,
clonar e propagar moléculas de DNA grandes e, por
outro, o maior n úmero de fragmentos menores que te - para promover a expressão gènica eficiente no organismo
riam de ser clonados a fim de abranger o genoma in
teiro. Como discutimos no Capítulo 18, um conjunto
- hospedeiro. Uma biblioteca de DNAc construída com
de bibliotecas gen ômicas possuindo, cada uma, uma se -
qu ência de inserção de tamanho diferente pode ser ú til
para determinar a sequê ncia de um genoma inteiro.
Construção de bibliotecas de DNAc
A matéria- prima para uma biblioteca de DNAc é o
RNAm, frequentemente derivado de um tecido ou tipo de
célula especifico. O RNA mensageiro não pode ser donado
diretamente, pois é de fita simples e, naturalmente, é RNA,
não DNA. A clonagem das sequências de RNAm pode ser
obtida pela sintetização de uma cópia DNAc de fita dupla
do RNAm e depois ligando o DNAc em um vetor. As bi-
bliotecas de DNAc sào especialmente ú teis para trabalhar
com os organismos eucarióticos, cujas sequências gênicas
são interrompidas por íntrons muito longos.
O conceito e o desenvolvimento das bibliotecas de
DNAc exigiram avanços na compreensão do ciclo de vida
dos retrovírus e do movimento dos retrotransposons ( ver
Seção 13.7). A disponibilidade da enzima transcriptase
545
reversa, encontrada nos vírus portadores de RNA, e dos
- retrotransposons, que usam o RNA de fita simples como
um molde para produzir uma fita complementar de DNA,
toma possível a clonagem do RN Am. A transcriptase re-
versa cria DNAc, primeiro transcrevendo uma molécula
- de DNA de fita simples complementar ao RNAm que age
- como um molde. A cauda poli-A adicionada aos transcri -
tos de RNA polimerase U dos eucariotos facilita a cons
trução das bibliotecas de DNAc a partir desse RNAm, já
-
- que a primeira fita do DNAc pode ser sintetizada usando
um primer oligo dT ( Figura 16.16), O molde de RNAm
é removido enzimaticamente e a segunda fita do DNA é
sintetizada pela DNA polimerase, usando a primeira fita
do DNAc como molde.
A composição de uma biblioteca de DNAc reflete
- o nível de expressão dos diferentes genes ativos no te -
cido, a partir dos quais o RNAm foi extraído. Os genes
altamente expressos são representados no RNAm em
uma frequência mais alta que os genes expressos em um
n ível inferior, e os genes não expressos no tecido de ori-
gem náo sào representados. Ao contrário das bibliotecas
genô micas, que representam todos os genes aproxima
damente na mesma frequência, a frequência com que
-
qualquer gene em particular será representado em uma
biblioteca de DNAc é dif ícil de estimar, já que depende
do nível dc expressão do gene na populaçã o de RNAm
original ( Figura 16.17 ),
Uma vez que as bibliotecas de DNAc normalmente
sào feitas de RNAm citoplasmá tico maduro, as ú nicas
sequências incluidas nos clones de DNAc são a 5' UTR,
- -
os éxons e a 3' UTR; os clones não terão as sequê ncias
intrònicas e intergênicas. Como o código genético é uni -
versal, os clones de DNAc derivados de um organismo
podem ser expressos em qualquer outro organismo, con-
tanto que os sinais de transcrição ( por exemplo, sequên -
cia promotora ) e tradução adequados sejam inseridos
essas características chama -se biblioteca de expressão.
Um exemplo é descrito na Seção 16.5.
Seleção nas bibliotecas
Depois de produzida uma biblioteca ou outra cole-
ção de clones, como os biólogos identificam os dones
que contêm determinadas sequências de DNA ? Como
rimos com a PCR e com a análise dos ácidos nucleicos
por Southern e northern blotting (Técnica de Pesquisa
10.2 na página 344), todas as técnicas para identificar
fragmentos contendo sequ ências de ácidos nucleicos es-
pecíficas tiram proveito da excelente especificidade do
pareamento de bases complementares entre as sondas
moleculares de fita simples e as regiões da sequêncta -alvo
de fita simples do DNA ou RNA. l ^mbre-se de que, no
Southern blotting, o DNA de fita simples preso a uma
membrana sólida de apoio é sondado com um DNA de
fita simples marcado (a sonda molecular). A sonda mar -
cada vai hibridar com os fragmentos de DNA na mem -
brana que contém a sequência complementar. Quando o
546 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

DNA gen ômico

j

Gene 1 Gene 3
(expresso (expresso (expresso
nos olhos) nas asas e na nos olhos e na
Fonte de RNAm ( neste caso, reticulócltos) embriogé nese) embriogénese )

5'
i Isolar o RNAm.

3*
(b)
Biblioteca genòmica Biblioteca de Biblioteca de
DNAc embriog ènka DNAc do olho
1
Adicionar primers oligo dT.
1 (2 )

S'
3' TTTTTT S' 2
(2 ) 3
3
= 22
2

Sintetizar a primeira fita de DNAc 3

usando transcriptase reversa. Todas as sequências —
génicas e intergénicas —
TT 5' são representadas de modo
5 _ 3' -
aprc» nadamente igual
Osdonesde Os docesde
DNAc repin- DNAcnecreserv

3
i Degradar parciaknente o RNAm
usando a RN aseH.
É AA É É[ 5’
taram apenas os
genes 2 e a
tam apenas os
genes le 3.

.3' As frequêrcias refletem os níveis de

expressão gênlca e Induem aceras
Sintetizar a segunda hta de DNAc as sequências encontradas no
usando DNA pol í merase e RNAm maduro (nenhum íntron ou
mantendo os fragmentos de sequência intergêcica).
RNAm como primers.
Figura 16.17 Conteúdo das bibliotecas genô micas
ií mnrs' versus bibliotecas de DNAc
A A A A A A 3'

3’
Extremidades cegas
da S1 nuclease.
I Proteger os sítios fcoRI no DNAc da
digestão usando fcoRI metilase
T T T T T T 5*
. das bactérias em cada colónia grudam na membrana. As
bactérias remanescentes na placa de Petri servem como
5' ajam 3' recurso para uma etapa posterior no procedimento. As
bactérias ligadas à membrana sofrem lise e seu DNA é
i Anexar os llgadores contendo
sítios fcoRI .
TTTTTT
desnaturado. Então a membrana pode ser sondada com
um ácido nudeico marcado de fita simples e tratada con-
forme descrito no Southern blotting. O DNA, que hibrida
rf.mii com a sonda , é detectado ( por exemplo, por autorradio-
fcoRI fcoRI grafia) e as colónias de onde ele veio são identificadas por
i Digerir com fcoRI e dorvar no vetor.
sua posição na placa de Petri original . O mesmo proto -
colo é seguido para o fago, que forma placas em substra-
Os dones dos genes tos de bacté rias espalhadas nas placas de Petri, e para a
expressos em altos levedura, que forma colónias similares às das bactérias.
Rl RI nNeis nos reticulócitos
váo aparecer em maior
frequência nessa
biblioteca de DNAc
Observa çã o gen é tica As sequências de DNA genômi-
que os dones cios cas sáo igualmente representadas em uma biblioteca genó-
Amp* ori çenes expressos em mica, enquanto as sequê ncias transcritas sá o representadas
um mvel baixo em uma biblioteca de DNAc de acordo com sua abundância
na população de RNAm correspondente.
Figura 16.16 Construção das bibliotecas de DNAc.

excesso da sonda for lavado da membrana, os fragmentos

de DNA que hibridararn com a sonda serão dctectados.
O mesmo conceito se aplica quando uma sonda
marcada é misturada com fragmentos de DNA clona
dos de uma biblioteca (Figura 16.18) Uma membrana
é assentada em cima das colónias bacterianas que cres-
cem em uma placa de Petri. Cada colónia contém clo-
nes de um fragmento diferente da biblioteca, e algumas
16.5 Genes específicos são clonados
usando a tecnologia de DNA
recombinante
.
Para isolar um gene específico, deve ser empregada
uma sonda adequada; mas de onde vem uma sonda
específica para o gene? A resposta é parecida com a
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 547

Clonagem de genes altamente expressos

Nrtrocelulose ou filtro
de ná ilon colocado Situações em que genes específicos são expressos em
em cima da placa altos níveis podem ser exploradas para identificar esses
genes. Considere uma biblioteca de DNAc composta de
RNAm isolado de precursores dos eritródtos humanos
Biblioteca genômica
de clones lambda
.
(retkulócito ) Até 60% da proteína total nos eritródtos
*
consiste em hemoglobina, entào os genes alfa e betaglo-
Sonda
Marcar o DNA bina tendem a ser os genes mais altamente expressos
( por exemplo,
usando a PCR). 0 filtro é removido \
nos reticulócitos. Se isolarmos o RNAm dos reticulóci
tos, sintetizarmos e marcarmos o DNAc, podemos usar
-
Adicionar os
-
após 1 2 minutos;
alguns fagos de cada
)
o DNAc marcado como uma sonda em uma biblioteca de
primen, a DNA placa aderem ao filtro. DNAc composta de eritródtos ( Figura 16.19), Segue-se
polimerase, o
dNTP marcado." que o DNAc marcado representando os genes alfa c beta-
globina estará entre os mais abundantes das moléculas de
DNAc marcadas. A mistura de DNAc marcados é entào
O filtro é tratado para liberar
hibridada com clones da biblioteca de DNAc. Como a
o DNA do fago, desnatur á-lo reação de hibrida ção é bimolecular. os clones de DNAc
e fixá-lo permanentemente ,
ao filtro. / Biblioteca a ser sondada
Desnaturar
para fitas
simples

Biblioteca de DNAc
constru ída com
A sonda hibrida o Um ácido nucleko marcado RNAm isolado dos
DNA do fago ( por exemplo, radioativo) é usado reticulócitos
complementar/ como uma sonda e deixado

\:
hibridar com o DNA no filtro.
*
•
Sí ntese
O excesso da sonda é da sonda
Conjunto de filtTos
lavado; o filme de representando a
raios X é exposto ao filtro oco biblioteca de DNAc
cc
O filme de raios X é comparado com as placas
originais e o done desejado é escolhido
I RNAm isolado
dos reticulócitos.
AAAAA
•m
Adicionar oligo
'm
dT, transcriptase
» <*» reversa, dNTP
* marcado *

Filme de raios X Biblioteca genômica TTTTT

AAAAA
de clones lambda
Desnaturar para fitas
Figura 16.18 Triagem de bibliotecas em busca de simples. Usar DNAc de
sequências especificas. fita simples marcado Hibridar a sonda,
como sonda. lavar e expor o
filme.
história do ovo e da galinha, pois um pesquisador precisa
}á ter acesso a uma sequ ência similar para identificar um
Candidatos a
done específico em uma biblioteca. Felizmente, existem dones de DNAc
várias maneiras de produzir sondas para procurar sequên
cias de DNA específicas ou genes específicos dentro de
- de betaglobina

uma biblioteca genômica ou de DNAc. Na discussão a se-

guir, vamos considerar primeiro as abordagens que tiram
proveito dos atributos biológicos exclusivos de certos
tipos de células para clonar determinados genes. Depois,
enfrentamos o desafio de donar os genes para os quais
apenas um fenótipo mutado é conhecido, como os genes
identificados nas triagens genéticas prospectivas.
Todos os dones ce ONA no fitoo vão hibridar até certo ponto,
mas os dones representados em um nrvel mais alto na sonda
de DNAc marcada vão aparecer de forma mais Intensa.
Figura 16,19 Clonagem dt um gene altamente expresso.
A expressão da betaglobina nos reticulócitos é usada como
exemplo.
 543 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

na biblioteca que representam os genes mais altamente
expressos ( por exemplo, betaglobina ) vão hibridar mais
rapidamente e exibirão um sinal mais forte que os menos
bem representados na sonda de DNAc marcado.
Em nosso exemplo, podemos prever dois genes di
ferentes representados por deões de forte hibridação,
os genes betaglobina e alfaglobina. Como as sequências
de proteína betaglobina e alfaglobina são conhecidas, o
exame das sequências de DNA dos clones de forte hibri
dação poderia identificar rapidamente os genes. Porém,
essa é uma situação especial e a maioria dos genes não
pode ser identificada tão facilmente. Por exemplo, em
um experimento com a S. cerevisiae , determinou -se que
as células podem conter 15 mil moléculas de RN Am de-
rivadas de aproximadamente 2 mil genes diferentes e que
os genes expressos com mais frequência são representa -
dos por 1% a 2% da população de RNAm total.
Clonagem de genes homólogos
Os clones de uma sequénda de DNA conhecida
podem ser usados para isolar outros clones de DNA
com sequência similar. Por exemplo, o clone de DNAc
da betaglobina humana da discussão anterior poderia
ser utilizado para isolar o clone de DNA gen òmico que
representa o gene da betaglobina humana. Ao contrário
do clone de DNAc, o clone genòmico pode conter não
só éxons, mas os introns do gene betaglobina e algumas
sequências a montante (5*) e a jusante (3*) da parte trans
crita. Se o clone genòmico não contiver o gene betaglo-
bina inteiro, podemos usar um processo reiterativo com
as extremidades do clone genòmico para sondar mais
uma vez a biblioteca gen ômica. Essas sondas devem
identificar o mesmo clone genòmico de antes, além de
alguns clones genómicos sobrepostos cujas sequências
se estendem para além de 5'e 3' da regiào codificadora
- do gene betaglobina. Voltaremos a esse processo reite-
ra tivo de isolar clones genómicos sobrepostos quando
considerarmos a técnica de donagem posicionai.
També m podemos usar o gene da betaglobina hu -
- mana para clonar outros genes homólogos. Se o grau
de semelhança da sequência for suficiente a ponto de
permitir que as sequê ncias hom ólogas façam uma hi -
brida çâo cruzada, o gene da betaglobina humana pode
ser empregado para sondar bibliotecas de DNAc com -
postas de RN Am de reticulócitos provenientes de ou -
tras espécies. Entretanto, quando a distâ ncia filogené -
tica entre as espécies é grande, essas sequências podem
não ser suficientemente similares para permitir a hi -
brida çá o cruzada, já que são necessá rios trechos com
aproximadamente 20 bases conservadas consecutivas.
Porém, uma abordagem tipo PCR baseada na tradução
reversa das sequências de aminoácidos consegue, na
maioria das vezes, contornar esses problemas de espe-
cificidade. Se sequências curtas, como 6 ou 7 aminoáci -
dos, estiverem conservadas nas proteínas de interesse,
primers degenerados podem ser designados usando a
tradução reversa de duas regiões conservadas diferen -
tes em uma proteína e o DNA interveniente pode ser
amplificado pela PCR usando o DNAc como substrato.
- Suponha que você queira clonar um gene betaglo-
bina de um wombaU um marsupial australiano, e que
tenhamos os dados da sequência proteica exibidos na
Figura 16.20a. Em três regiões, as sequê ncias de pelo

( a ) Sequências de ammoácidos
1 10 20 30 40 50 60
Aves, tartaruga, peixes:
Gallus gaí ius
I
MVHWTAE E KQL ITGLWGKVNVA ECGA EA LAR L l I VY PWTQR F FASFGNLSSATAI IGNPMVRAHGK
Taenhpyg ía guttata MVQWTAEEKQLITGLWGKVNVAECGGEALARLLIVtPWTQRFFASFGNLSSPTALLGNPKVQAHGK
Geochelone carbonário M V H W S C E E K Q F I T S L W A K V N V E E V G G E A L A R L l I V Y P W T O R F P S S F G N L S S P N A I L H N A K V L A H G K
Danto rerio MVEWTDAERTAIIGLWGKtNIDEIGPQALSRClIVYPWTQRYFATFGNLSSPAAIMGNPKVAAHGR
Salmo safar M V O W T D A E K S T I S A V W G K V O I N E V G P L A L A R V L I V Y P W T Q R Y F G S F G D V S T P A A I M GN P K V A A H G K
Mam íferos:
Homosapiens MVHLTPEE KSAVTALWGKVNVDE VGGEALGRLL VVYPWTQR FFESFGDLS TPDAVMGKPKVKAHGK
Pon trogfodytes MVHLTPE EKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRL LWYPWTQRFF E SFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGK
Aotus azarai MVHLTGFFKAAVTAlWGKVNVOFVGGFAl GRL lVVYPWTQRFFOSFGDl S S POAVMNK PKV KAHGK
Canis famitiaris MVHLTAEEKSLVSGLWGKVNVDEVGGEALGRLL IVY PWTQR FFDSFGDLSTPDAVMSNAKVKAHGK
Rattus norvegicus MVHL TDAE KAAVNGLWGKVNPDDVGGEALGR LL VVY PWTQRY F 0S FGDLSSASA IMGNPKVKAHGK
Ochotona cvrzonioe MVHLSGEEKSAVLSlWG KVNVDEVGGE T LGRLL VVF PWTOR P F0 S FGDL S SP 0AVMGNSKVKAHGK
Mocropus eugeníi MVHLTSEEKNCITTI WSKVQVDQTGGEAlGRMl VVYPWTTRFFG$ FGDLSSPGAVMSNSKVQAHGA
Didelphis virginiana M V H I S G S E K T A V T N L W G H V N V N E L G G E A L G R L L W Y P W T Q R F F E S F G DlS S A D A V M G N A K V K A H G A
Tochygfossus oculeatus M V H L T A E E K N A I T S L W G K V A I E Q T G C E A L G R L L I V Y P W T 5 R F F 0HFGDL S N A K A V M S N P K V L A H GA
/ \
v
Conservadas em todos os vertebrados
O Conservadas em todos os mamíferos /
* \

( b ) Tradução reversa da sequência proteica ; G I G I EI AI LI GTR ~1 Três regiões altamente conservadas podem se'
5' GGã GGã GãAGCATTã GGACGã 3* identificadas nas sequências dos rramfleros
Em razão da redundância do código genético, a G 6 G GC G GA G
identidade dos nucieot ídeos em algumas posições c c C C C C
pode ser representada por mais de um nudeotíoeo
T T T T T T
Figura 16.20 Usando a traduçã o reversa e a PCR para clonar genes homólogos .
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 549

menos sete aminoácidos estão conservadas em todos os
genes betaglobina dos mamíferos:
GGEALGR
LSELHCDKLHVDPSNF
ALAHKYH
Essas sequências podem sofrer tradução reversa (Fi-
gura 16.20b) Os .primem devem ter pelo menos 20 nu
cleotideos de comprimento para serem suficientemente
específicos para uso em uma mistura complexa de áci-
dos nucleicos, como o DNA gen ô mico ou o DNAc. Os
primem podem ser usados para amplificar o DNAc, em
um processo chamado transcrição reversa PCR ( rtPCR )
que começa com o RNAm, que sofre transcrição re-
versa para DNAc, que depois é utilizado como molde
para uma reação PCR . Com o DNAc como molde, qual
quer um de dois primem específicos para o gene pode
ser utilizado ou, de forma alternativa, pode ser em -
pregado um primer específico para o gene combinado
com um primer oligo dT. As técnicas baseadas na PCR
podem ser aplicadas para amplificar qualquer gene que
compartilhe similaridade de sequência suficiente com
um gene homólogo conhecido. Como a maioria dos
genes pertence a uma família de genes relacionados,
essa abordagem revolucionou o estudo dos genes ho -
mólogos dentro de uma espécie e entre as espécies.
Clonagem de genes por complementaçáo
Outra abordagem para identificar genes específicos
é detectar a complementaçá o genética de um fenótipo
mutado por meio de um gene do tipo selvagem introdu-
zido. Essa abordagem é restrita aos casos em que organis-
mos transgênicos podem ser gerados. Considere os mu -
tados do ciclo celular da levedura sensíveis à temperatura
descritos na Seção 16.1. Se os clones de uma biblioteca
de expressão do DNAc da levedura forem transformados
em um mutado do ciclo celular da levedura , quaisquer
clones que complementem o fenótipo mutado de modo
que as células cresçam normalmente devem conter ale-
- los do tipo selvagem do gene que sofreu mutação ( F i g u r a
.
16.21 ) Nesse caso, a cepa de levedura primeiro seria
transformada e cultivada na temperatura permissiva. As
colónias de levedura resultantes seriam então transferi -
das para um ambiente mantido na temperatura restritiva.
Apenas as colónias de levedura que recebem um done
que codifica uma versão do tipo selvagem do gene mu -
tado em questão seriam capazes de continuar a crescer
na temperatura restritiva; nessas colónias, o fenótipo
mutado teria sido complementado pelo gene adicionado.
Os experimentos de complementaçáo também
podem ser empregados para identificar genes ortólogos
de outras espécies, se houver conservação suficiente da
fun çã o proteica. Por exemplo, a pesquisa em que um
mutado do ciclo celular da levedura foi transformado
usando uma biblioteca de expressão do DNAc humano
(uma em que os clones de DNAc humanos primeiro
foram fundidos com sequê ncias que permitem sua
transcrição e tradução na levedura ) levou à identifica -
ção dos genes humanos ort ólogos aos genes da levedura
que sofreram mutação. O fato de que os genes humanos
e das plantas podem complementar esses mutados da
levedura demonstra a universalidade do maquln á rio do
ciclo celular c indica que tais proteínas estavam presen-
tes no ancestral comum dos eucariotos.

70 80 90 100 110 120 130 140

KVLSSFGEAVKNLONI KKSFAQLSKLHCDKLHVDPENFRLLGDI L I I VLASHFSKDFTPASQAAWQKVVRVVAHALAHEYH

I I I
K V L T S F G E A V K N L D S I K N T F S Q L S E L H C D K L H V D P E N F R L I G D I lV V V L A A H F G K 0 F T P D C Q A A W Q K L V R V V A H A L A R K Y H
KVITSFGEAVKNIDNIKKTFAQISEIHCEKLHVDPENFKIIGNI L I IVLATHFPKEFT PA $QAAWTKlVNAVAHA LAlGYH
T V M G G L F R A I K N M D N V K N T Y A A l S V M H S F K l H V D P D N F R l I A D C I S I V I A T N F 6 P A F M P S V Q S TWQK L l S V V V A A L T S P Y F
VVCGALDKAVKNMGNILATYKSLSETHANKLFVDPDNFRVLADVLTIVIAAKFGASFTPEIQATWQKFMKVVVAAMGSRYF

KVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCOKLHVOPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAVQXVVAGVANALAHKYH
KVlGAFSDGlAHlDNLKGTFATLSElHCDKLHVOPENFRLLGNVlVCVlAHHfGKlFIPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH
KVLGAFSDGIAHIDNLKGTFAQISEIHCDKIHVDPENFRILGNVIVCVIAMHFGKEFTPQVQAAYQKVVAGVANAIAHKYH
KVLNSFSDGLKNLDNLKGTFAKLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPQVQAAYQKVVAGVANALAHKYH
KVINAFNDGLKHLDNLKGTFAHL 5 ELHCDKLHVDPENFRLLGNMIVIVLGHHLGKEFTPCAQAAFQKVVAGVASAIAHKYH
KVMNAFSEGIHHIDSLKGTFAKISELHCDKLHVDPENFXllGNVLVVVtSHHFGAfFTPQMQAAWQKVVSGVANAlAHKYH
KVLTSFGEAVKMIDNIKGTYAKISELHCDKIHVDPENFSMLGNIIVIClAEHFGKDFTPECQVAWQKLVAGVAHÀ lAHKYW
KVLTSFGDALKNLDNLKGTFAKISELHCDKLHVDPENFNRLGNVIVVVLARHFSKEFTPE AQA AWQKLVSGVSHALAHKYH
KVLVAFGDAI KNIDNLKGTPAKLSELHCDKLHVDPENF KLLGNI IVICLAEHFGKEFTI DAQVAWQK LVAGVANAlAHKYH
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CGAGG G CG T T T G CG T G T G G T T
3* 5' KOI/MWMVM
G CG G T G T T
'Zr
C C C c c c c c c
T T T T T T T T T
550 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Mutacos cdc2 sensíveis muitas vezes os transposons ocorrem em grandes quanti -

à temperatura, da dades de cópias no genoma, são necessárias técnicas para
Schwasoccbarornyces distinguir a cópia do transposon no gene-alvo de todas
pombe.
as outras cópias no genoma. A situação ideal é começar
com um genótipo que abrigue apenas uma ú nica cópia ou
uma quantidade pequena de cópias de um transposon de
sequência conhecida e depois mobilizá - lo para criar uma
coleção de mutados, que depois passa por uma triagem
O Transformar com biblioteca de
DNAc da . pombe
5 constru í
da de fenótipos. Outra consideração é que, como os trans -
no vetor de expressão. posons são móveis, um transposon que tenha sido inse -
O Plasmideo contendo CDC2
-
rido em um gene alvo pode saltar para fora novamente.
Para contornar esse problema, o transposon utilizado
como marcador frequentemente é separado em dois
O o Cada célu a daicontx
recebe um done de componentes
— a transposase e as repetições invertidas
o oO DNAC cierente ca
bibioteca de expressão
cuja sequência a transposase reconhece ( ver Seção 13.5).
As repetições invertidas formam a parte funcional de um
oo elemento não autónomo que não consegue se mover por
conta própria , mas que pode ser mobilizado se a transpo-
|O Colocarem placa a 23 ”C. sase for fornecida em trans. Em condições ideais, a ativi -
dade transposase é produzida a partir de um transposon
mutado que nã o é capaz de se mover porque não possui
as repetições invertidas. As novas inserções do transpo-
son não autónomo podem ser estabilizadas pela remoção
|O Placa réplica e cultura a 36 C * da fonte de transposase por meio da exogamia.
Um protocolo geral para usar um transposon para
marcar um gene em um eucarioto diploide é exibido na
Figura 16.22. Duas linhagens são cruzadas inicialmente,

Apenas as cdôcias que abrigam um done de

uma das quais é homozigota para um alelo mutado está
vel do gene-alvo e a segunda é portadora de um sistema
-
DNAc que consegue complementar o mutado
cck? vãocrescer na temperatura restritiva.
transposon ativo e homozigota para o alelo do tipo selva -
gem no gene-alvo. A F desse cruzamento é heterozigota
Figura 16.21 Clonagem por complementar ão. para o alelo mutado do gene-alvo em um fundo genômico
com um transposon ativo. .Se o transposon se mover para
Utilização de transposons para donar genes o gene de interesse, criando assim um segundo alelo mu-
Os transposons podem ser utilizados como etiqueta
tado, cada membro da F, vai exibir o fenótipo mutado re -
cessivo. Normalmente é exigida a triagem de uma grande
de identificação para clonar genes específicos, uma téc
nica chamada marcação com transposons. Lembre -se
- quantidade de indivíduos da F, para encontrar qualquer
membro com mutações no gene-alvo, pois o movimento
de que os transposons são elementos genéticos móveis do transposon para um gene específico é um evento raro.
que podem se integrar ao genoma com pouca especifi - A marcação com transposons é limitada aos orga-
cidade da sequ ência -alvo (ver Capítulo 13). Se a sequ ê n - nismos que abrigam transposons ativos ou nos quais foi
cia de um transposon for conhecida , pode ser usada introduzido um transposon ativo proveniente de outra
como uma biblioteca genòmica constru ída a partir do espécie. Entretanto, essa limitação nào costuma ser um
DNA de uma cepa em que o mesmo transposon foi in
serido em um gene-alvo. As sequências adjacentes ao
- problema , pois, por exemplo, o sistema transposon Ac /
Ds do milho (ver Seção 13.5), quando introduzido em um
transposon devem pertencer a um gene alvo. - transgene, é ativo em outras espécies de plantas, como a
Para usar a sequê ncia do transposon como uma
sonda, essa sequência precisa ser conhecida — um pro-
blema do ovo e da galinha similar a outros que encontra -
Arabidopsis e o tomate, e ainda é ativo no peixe- zebra.

Observa çã o gen é tica A biologia dos transposons

mos quando consideramos sondas. Uma solução neste
pode ser explorada para "etiquetados genes, permitindo que
caso particular é “aprisionar ” o transposon em um gene
fragmentos contendo os genes possam ser identificados para
cuja sequência já é conhecida. A instabilidade alélica é ca - donagem molecular.
racterística da inserção do transposon (ver Capítulo 13) .
Se os pesquisadores identificarem primeiro os aielos mu -

— —
tados instáveis de um gene clonado aielos propensos a
conter um transposon eles podem usar uma sonda para
Clonagem posicionai
o gene clonado para isolar a sequência do transposon. Os genes identificados nas triagens genéticas pros -
Para que a marcação com transposons possa ter êxito pectivas são conhecidos apenas por seu fenótipo mutado
na prá tica, a biologia deles precisa ser considerada. Como e, portanto, nenhuma das abordagens para clonagem
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante 551

(a)Induzir e identificar os alelos marcados com transposon. cromossômica, já que consiste em “caminhar" ao longo
Alek> mutado está vel O Cruzar uma linhagem homozigota do cromossomo em etapas sequenciais, de um marcador
Linhagem para um alelo mutado est á vel ( m) para o outro, unindo os clones de DNA sobrepostos.
' causadora de muta çã o com uma linhagem portadora de A clonagem posicionai é feita em três etapas. A pri -
x
transposons ativos. meira é construir um mapa genético mostrando a lo-
m + calização do gene de interesse relativa aos marcadores
| de DNA mapcados. A segunda é identificar os clones de
m
O Fazer a triagem de um fenótipo
F, segundo
DNA que abrangem os marcadores que ladeiam o gene
mutado na . O
£
alelo
mutado deve ser derivado do
de interesse. A terceira etapa é identificar o gene de in-
estoque causador de muta ção e teresse dentro do DNA que o abrange e determinar sua
m* poderia ser provocado por uma sequência nucleotídica.
Alelo mutado induzido inserçã o de transposon .
Etapa 1: Construir um mapa genético usando marcado-
por transposon.
res de DNA Em 1980, um artigo de David Botstein e
colegas propôs uma ideia para criar um mapa genético
(b) Identificar o transposon que c ireça . baseado em marcadores de DNA com a finalidade de
O Cruzamento - Tipo selvagem executar a clonagem posicionai dos genes humanos.
retr ógrado para Nas décadas que se seguiram, a clonagem de muitos

construir uma
população com um
alelo induzido por
segregação do
transposon com o
novo alelo.
O a sequência do transposon m» m
m
como uma sonda em um
Southern blotting do DNA
genômico isolado dos indivíduos
de uma população retrocruzada
Avaliar a cossegregação dessa
população em m* com o
transposon.
-
“genes de doença ” humanos foi obtida usando esse
protocolo. Mesmo hoje que o genoma humano foi $c-
E .
quenciado um protocolo de mapeamento similar con
tinua a ser empregado na identificação de genes nos
-
seres humanos, e a abordagem geral para a clonagem
posicionai, conforme descrita aqui, pode ser aplicada a
*
qualquer organismo.
A chave para a clonagem posicionai é identificar
. os marcadores moleculares que ladeiam o gene que
você deseja clonar. Os marcadores de DNA definem
as duas extremidades da sequência de DNA na qual o

transposon ( seta ; que

estejam presentes nas
— — £ £& ¥£££«Ff £
Linhagens parentais
O Procura r i nserçôes de , I ,
}
gene de interesse é codificado. Qualquer sequência de
DNA que varie entre os indivíduos pode ser um mar-
cador de DNA , incluindo os polimorfismos de nucleo-

-
plantas m /m , mas
* tídeo único (SNPs), os polimorfismos de comprimento
não nas plantas m/ +.
éS S ou deleções e diversas variantes da sequência de DNA
Figura 1 6 . 2 2 Uso dos transposons para marcar genes.
de genes que discutimos até agora é aplicável. Como os
biólogos encontram a sequência de DNA de um gene
quando apenas um fenótipo mutado é conhecido? Eles
o fazem combinando um mapa genético composto de
frequências de recombinação (Capítulo 5) com um
mapa f ísico do genoma baseado em clones de DNA ou,
quando estiver disponí vel, na sequência gen òmica , para
encontrar a sequência de DNA em uma posição espe
cífica do mapa. A Figura 16.23 fornece uma visão geral
das relações entre os mapas genéticos baseados na se
gregação dos lócus, os mapas í f sicos baseados em con -
juntos de clones genômicos sobrepostos, os genes e a se-
quência de DNA do genoma. Se forem identificados dois
marcadores ladeando o gene de interesse, este gene deve
residir no DNA interveniente. O DNA do gene, no fim
das contas, pode ser identificado isolando um conjunto
de clones de DNA que abrange coletivamente a região
entre os marcadores que o ladeiam. Essa abordagem é
classificada como clonagem posicionai ou caminhada
do fragmento de restriçáo ( RFLPs), pequenas inserções
repetida (ver Capítulo 10). Depois de identificado um
conjunto de marcadores de DNA polimórficos, a detec-
ção da segregação desses marcadores em uma “ popula-
ção de mapeamento" vai permitir o posicionamento de
cada marcador em um determinado local no genoma. A
construção do mapa com marcadores moleculares segue
o mesmo procedimento dos marcadores fenotí picos (ver
Capítulo 5); os diferentes marcadores de DNA que cos -
segregam estão ligados fisicamente, com uma frequência
de recombinação proporcional à distâ ncia entre eles em
unidades de mapeamento.
Para examinar como funciona o mapeamento, to-
- memos como exemplo a Arabidopsis, na qual um gene
é mapeado cm uma populaçã o F2 ( Figura 16.24 ). A pri -
- meira etapa na construção de um mapa genético é iden -
tificar duas cepas com sequências de DNA diferentes,
neste caso, a Landsberg ( L) e a Columbia (C). Cada cepa
é altamente homozigota em razão da endogamia (endo-
cruzamento), embora difiram uma da outra nos lócus
polimó rficos por todo o genoma. A população de ma
peamento é gerada pelo cruzamento de duas linhagens
-
homozigotas a fim de produzir uma geração hetero-
zigota em todos os lócus que diferem entre as duas li -
nhagens endocruzadas. Esses indivíduos da F , sã o inter-
552 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Q Mapa genético baseado © Mapa genético baseado em

em marcadores marcadores moleculares
© dones
Mapa f ísico dos
BAC
Q Genes © Sequ ê ncia
de DMA
fenot ípkos
Cromossomo 5 Cromossomo 5 **

0 -- fy 447 4* 0 **
217 4.1
5.9 tt 7
-
11 2 v / hys 224 11.1
-- XCHS 2
<tt4)
14.6

235
253 - j
25.7 /
-... -- cnx
. ,
r
pl
291 -- 273 \
\

' msl i
31.5 ttg i
35.4 -- ga 3 i
38.2 su y
i

-
4 5 3 .. c h5
y
i

^
2
Vrlr 247 57.7
\
\
y
\
56.1
61.2
-- g!3
tt3
422
423 3 - 62.6
y
\
í
i
sAt2105 712 y
\
y
\
225 79.4 i
\
\
82.4 -- tz
s
85.6 -- cer3 268'' < 905 ~ ; 59 *
i
\
\

- ->^
\
904
92.6 :: KL ^ 435 ^ . ^ 98.7
233 100.7
1043 /) X
N 105.3 005
035 i
y t
'
'
"

100.3 aba 558 \

y
cM Genes identificados \
y
por muta ç &es 555
211
-
118 2.0
121.3
7
U /U
\
i
y
Marcadores cM
moleculares *
\
sy
\ 2
i
sy \
\
s
Ui
y
W
-- V
\
\
\
\
i
Figura 16.23 Correlacionando os mapas genéticos e os mapas f ísicos da Arabldopsls para localizar as sequências de
DNA dos genes.

cruzados ou autofertilizam. Em cada lócus no genoma , direta do genótipo. Por outro lado, apenas os indivíduos
os indivíduos na população F2 resultante podem ser ho - da F2 homozigotos para uma mutação recessiva no gene
mozigotos para os alelos de uma ou da outra linhagem de interesse podem ser genotipados com precisão e o ge -
endocruzada original, ou podem ser heterozigotos. Os nótipo dos indivíduos da F2 fenotipicamente do tipo sel-
alelos do gene de interesse, neste caso o AP2, també m vagem tem de ser determinado na F3 ou por meio de um
estão segregando na população já que um dos pais cruzamento- teste. Embora esse exemplo use um sistema
( l.) é homozigoto para um alelo mutado recessivo ap2t genético modelo, o mapeamento genético nos seres hu -
enquanto o outro progenitor (C) era homozigoto para o manos com marcadores moleculares segue um protocolo
alelo AP2 do tipo selvagem. similar ( modificações descritas no Capítulo 5).
Os genótipos de cada membro da F2 são determina Como o n úmero de diferenças na sequência de
dos para os marcadores de DNA e o gene de interesse.
Os marcadores de DNA que cossegregam com a muta -
DNA entre as duas cepas tende a ser maior que o n ú
mero total de genes no organismo, os mapas genéticos
-
ção estão ligados ao gene de interesse, no qual a distância baseados em marcadores de DNA costumam ser sufi-
em relação ao gene é proporcional à frequência de re- dentemente densos para que os marcadores intima -
combinaçào; os marcadores de DNA não ligados devem mente ligados ao gene de interesse sejam identificados.
segregar de modo independente da mutação. Na maioria Depois que os marcadores de DNA sã o encontrados
dos casos, os alelos dos marcadores de DNA são codomi-
nantes, então o exame do DNA permite a determinação
ladeando o gene de interesse, a próxima etapa da iden
tificação do DNA entre os marcadores pode prosseguir.
-
 Capítulo 16 Genética prospectí va e tecnologia de DMA recombinante 553

DNA genômico digerido

pela fcotil
Marcador 1 Marcador 2
P

x C-
L-

AP2 ap2
AP2 ap2 O Identificar os marcadores polirrvórficos.
F,

AP2
ap2
\
Autocruzamento ou cruzamento
dos Indivíduos da Ft .
O Sondar população de mapeamento com os marcadores 1 e 2 e analisar pela eletroforese em gel para
encontrar recombinantes. Os Indivíduos da Fa que são homozigotos para o alelo Columbia
(C, sombreado vermelho) ou para o alelo Landsberg (L sombreado azul) ou heterozigotos (H) em cada
um dos dois marcadores (sombreado dnza ) são marcados como não recombinantes. Qualquer indiví duo
em que o genótipo difere entre os marcadores 1 e 2 é um recombinante { sombreado amarelo}.

Indivíduo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 O Como os indivíduos da

Marcador 1 da F2 £_ i
Fi autofertlllzaram, a
meiose ocorreu nos
L C H L H L H H H H C L L H H C L L gametas masculinos e
femininos; desse modo,
os 18 indiví duos da Fa
2 3 5 7 12 13 representam 36 meioses.
Indivíduo: 1 4 6 8 9 10 11 14 15 16 17 18
l
Marcador 2 da F, C — Os marcadores 1 e 2
estão ligados um ao outro
L H L H C H H H H H C L H L L C H L
9 recombinantes
=2 5c M
36 por meiose
O Mapear os dados do gel recombinante para os marcadores 1 e 2.
Indivíduo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
F,

Marcador 1 - L C H L HiL H H H L Os cromossomos são

representados em cores

-m
para mostrar os portos
hipotéticos de
Marcador 2 - "L H L H c H H H L recombinação em cada
um dos indivíduos .
O genótipo AP2 è ap2 ap2 qp2 ap2 AP2 ap2 op2 ap2 ap2 ap2 AP2 op2 ap2 ap2 ap2 AP2 ap2 ap2
determinado
examinando as pianas
O ap2/op2 é determi-
. ap2 AP2 ap2 AP2 AP2 AP2 AP2 ÀP2 AP2 AP2 AP2 op2 AP2 ap2 AP2 AP2 AP2 ap2
= H =L = H =C «H

© O genótipo no lóeus AP2 é

H «L =H =H
— © Como o genótipo do AP2 no único
nado na geração F Marcador 1 e op2r
AP2/AP2 eAP2/ap2*são comparado aos genótipos nos indivíduo recombinante entre o marcador
determinados na
geração F3, apóso
marcadores 1 e 2: 8 recombinantes
36 por meiose
22 cM- 2 e o AP2 (15) corresponde ao do
marcador 1, o AP2 pode ser posicionado
autocaj amentodas
^ AP2/AP2 = C Marcador 2 e ap2: no mapa entre os marcadores 1 e 2.
plantas da F,
fenotipicamente do
ap2/ AP2 H
ap2/ap2 = L
- 1 recombinante
36 por meiose
= 2,8 cM
aproximadamente nesta posição: 1 /9 da
distância entre os marcadores 1 e 2.
tipo selvagem.

Figura 16.24 Mapeamento dos genes usando marcadores moleculares .

554 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

a b c GOI d e
Observa çã o gen é tica Os polimorfismos da sequên- O identificar os *=* i
(Gene de
i i
marcadores
cia dc DNA entre os indiv íduos sáo utilizados para construir
mapas genéticos. Os marcadores de DNA agem, então, como
-
moleculares (a e) interesse)

pontos de correspond ê ncia conectando os mapas genéticos

que ladeiam o
gene de interesse.
a b c GOI
1 d e
(com base na frequência de recombinação) com os mapas f ísi-
cos (a sequência de DNA dos cromossomos) de uma espécie. O Usando os
marcadores para *=* i
i I
l
i

sondar a biblioteca
genômlca, Identificar
Etapa 2: Construção da sequ ências contíguas de DNA os ciocies genômicos
( vermelho) que
Antes do advento dos projetos de sequenciamento do
hibridam com os
genoma, os pesquisadores eram obrigados a montar o marcadores.
DNA abrangendo dois marcadores por meio da constru - a b c GOI d e
ção dc sequências contíguas (contigs), a partir dc con-
Ousaras
extremidades dos
i
*==* i i
i
i
juntos de dones genômicos sobrepostos ( Figura 16.25) . dones genômicos
Os marcadores de DNA que ladeiam o gene de interesse para isolar os
O podem ser usados como sondas em uma biblioteca dones sobrepostos
(laranja ).
genómica para identificar clones genômicos que con -
têm os marcadores de DNA 0. As extremidades desses
clones genô micos podem ser usadas para sondar nova - a d e
O Mapear as =: » I • * *
mente a biblioteca genómica a fim de identificar os do- extremidades dos
•

nes que se sobrepõem aos dones iniciais O. A reiteração

desse processo vai identificar mais dones genômicos
clones genômicos
recém-isolados
(violeta ) para
^
r i

-
sobrepostos (contigs) estendendo se em ambas as dire
ções a partir dos dois marcadores de DNA iniciais. A ex -
- determinara direção
da caminhada.
tensão em uma direção revela sequências mais próximas I
c GOI
do gene de interesse e a extensão na outra direção revela
sequ ências mais distantes.
O Reiterar a triagem . 4
i f
da biblioteca até
Como o direcionamento de uma contig é determi-
nado? O mapeamento genético das sequè ndas de DNA
os clones
sobrepostos
abrangerem a
^
r =i !
i 1 t I
polimó rficas nos dones gen ô micos recé m isolados - regiào entre os i
i
d ==
pode resolver o direcionamento dos dones genô micos marcadores I
.
sobrepostos O Se a extremidade do clone genòmico originais (azuis). l

mapear mais perto do gene de interesse que do mar -

cador dc DNA inicial, o direcionamento é para o gcnc-
-alvo. De modo oposto, se a extremidade do clone genô-
mico mapear para mais longe do gene de interesse que
do marcador de DNA inidal, o direcionamento é para
-
longe do gene alvo. Depois de averiguado o direciona
mento, a sondagem reiterativa das bibliotecas genò-
micas com as sequências nas extremidades dos clones
genô micos recé m -isolados na direçã o do gene permite
a construçã o de contigs ainda maiores que, no fim das
contas, devem abranger a sequência de DNA inteira
entre os dois marcadores de DNA que a ladeiam 0.
A disponibilidade das sequências genômicos para
muitos organismos genéticos modelo simplificou a clo
nagem posicionai . Com essas espécies, a construção
de uma contig não é necessária, pois, como o gene de
interesse foi mapeado, o pesquisador pode proceder
diretamente à identificação dos genes candidatos na
sequ ência gen ó mica abrangendo o intervalo mapeado,
conforme descrevemos a seguir.
Etapa 3: Contig do gene Unia contig abrangendo dois
marcadores que ladeiam um gene de interesse precisa ,
por definição, incluir o gene alvo, mas como encontra
mos o gene de interesse entre os outros genes na contig
O? A resposta depende em grande parte do organismo
O identificar e avaliar os
c GCM d
genes candidatos usando
padrões de expressão do
- RNAm, polimorfismos de
DNA e complementação.
Figura 16.25 Clonagem posicionai.
em estudo. Se a sequência genómica for conhecida, o
n ú mero e a identidade dos genes candidatos ou seja,
as sequê ncias que poderiam codificar o gene de inte-
—
resse são basicamente conhecidos. Por outro lado, se
- a sequência genó mica não for conhecida , sáo necessá -
rias abordagens experimentais para identificar os genes
candidatos dentro do trecho de DNA .
Nos organismos aptos à transformação, o " padrão
ouro” da identificação genica para a clonagem posicio-
nai é complementar o fenótipo mutado introduzindo
uma cópia do alelo do tipo selvagem no substrato mu -
tado. Essa abordagem é similar ã clonagem por comple-
mentação descrita anteriormente, exceto que o n ú mero
- de genes candidatos é reduzido em relação ao conjunto
inteiro de genes no genoma para apenas os genes que
mapeiam entre os marcadores que ladeiam. Os expe-
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante
rimentos de transformação são rotineiros em muitos
organismos genéticos modelo e são descritos em mais
detalhes no Capítulo 17 .
Nos organismos inaptos à transformação ( por
exemplo, os seres humanos), outras abordagens podem
ser empregadas para identificar e caracterizar os genes
candidatos. Primeiro, o sequenciamento direto dos
genes candidatos e a comparação das sequências nos
indivíduos do tipo selvagem e mutados podem revelar
o gene de interesse. As mutações de sentido trocado ou
sem sentido podem ser previstas em cada um dos ale-
los mutados, com relação ao alelo do tipo selvagem No .
entanto, como as mutações fora da região codificadora
podem ser responsá veis pela expressão gênica alterada,
as sequê ncias não codificadoras também podem ter de
ser pesquisadas. Repare que, nas espécies n ão endocru - Nos anos 1980 e 1990, muitos genes na Drosophila, C.
zadas, se houver apenas um ú nico alelo mutado a ser
examinado, pode ser dif ícil dizer se as diferen ças nas se-
qu ências de DNA dos genes candidatos são a causa do
fenótipo mutado ou simplesmente polimorfismos exis-
tentes na população.
Em uma segunda abordagem para identificar o ge
ne alvo, a natureza do defeito fenotí pico conferida pelo
- da inviabilidade de realizar cruzamentos controlados e
alelo mutado pode fornecer pistas para os prováveis pa - O Estudo de Caso descreve o gene responsável pela do
drões de expressão gênica e os genes candidatos podem
ESTUDO DE CASO
Clonagem posicionai em humanos: o gene da doen ça de Huntington
.
A doença de Huntington um transtorno neurodege
nerativo de in ício tardio e inevitavelmente fatal, tem esse
nome em homenagem a Gcorge Huntington , o médico que
publicou a descri ção clássica da doença e de sua herança em
1872. Sua descrição especificou os sintomas do transtorno
de movimento, alteração de personalidade e declínio cog-
nitivo e, notavelmente, descreveu o padrão autossômico do
minante de heran ça, uma característica desconsiderada até
a redescoberta do trabalho de Mendel em 1900. Hunting
ton reconheceu o padrão de heran ça graças à experiência
coletiva de seu pai e seu avô, ambos médicos també m, que
tiveram a oportunidade ú nica de observar vá rias gerações
da doença cm uma fam ília local. Ele não encontrou a forma
de início juvenil da doença , que apresenta outros sintomas,
como rigidez c convulsões Em uma forma dc herança cha
mada antecipação, a doença dc Huntington com início na
juventude é herdada por um alelo paterna
Mapeamento do gene HD Os pesquisadores compila -
ram genealogias amplas retratando a transmissão da do-
ença de Huntington em uma grande fam ília da Venezuela.
As genealogias abrangem 10 gerações e incluem quase
20 mil indivíduos, trê s quartos dos quais est ão vivos. No
início dos anos 1980, James Gusella e Susan Wexler e co
.
legas estudando essa fam ília venezuelana e també m uma
grande fam ília de Ohio, mapearam o gene HD no braço
curto do cromossomo 4 ( ver Estudo de Caso no Capí
tulo 5). Outros marcadores polim órficos ligados aos ale
los mutados dominantes do gene HD o restringem ainda
555
ser avaliados quanto a esses padrões de expressã o em
células e tecidos específicos. Também pode ser possível
detectar mudan ças nos padrões de expressão do RNA,
como, por exemplo, as muta ções que resultam em pa -
drões alterados de splicing ou as que resultam em um
RNAm menos está vel que o RNAm do tipo selvagem.
Os genes também podem ser avaliados com base no
tipo de proteína que devem codificar. Se for poss í vel
-
prever a função bioquímica do gene alvo, alguns genes
candidatos podem ter características que os fazem pa -
recer mais propensos que outros a conseguirem desem -
penhar essa função. Entretanto, em muitos casos, esse
conhecimento não existirá.
Essa abordagem geral para a clonagem posicionai
tem sido aplicada a vários sistemas genéticos modelo.
elegans e Arabidopsis foram identificados por protoco-
los de clonagem posicionai , bem antes de os genomas
terem sido sequenciados. As estratégias de clonagem
posicionai têm sido especial mente ú teis na identifica -
ção dos genes associados com doenças humanas, apesar
experimentos de complementaçào nos seres humanos.
-
ença de Huntington.
- mais a uma regi ão de 2,2 Mb no cromossomo 4 ( Figura
16.26 ). Os alelos mutados do HD foram conhecidos a
partir de um grande n ú mero de fam ílias n ão relacionadas
com diversas origens gen éticas, sugerindo que os alelos
mutados dominantes do HD surgiram v á rias vezes de
maneira independente. Os dados de mapeamento de 75
- famílias identificaram um haplótipo compartilhado por
aproximadamente um ter ço delas, sugerindo que o gene
- HD estava localizado provavelmente dentro dos 500 kb
do haplótipo compartilhado ( ver no Capítulo 5 uma dis
cussã o sobre os hapló tipos ).
-
Identifica ção do gene candidato Antes dc 2001, ano
em que foi publicado um esboço da sequ ê ncia gen õmica
humana , a identifica çã o dos genes em grandes trechos da
- sequ ê ncia gen õ mica humana cra uma tarefa á rdua. No
caso da clonagem do gene HD no in ício dos anos 1990,
ela exigiu a reconstruçã o de um contig de cosm ídco e
clones YAC abrangendo o l ócus do HD , usando as té cni -
cas descritas em todo este capítulo para isolar os clones
gen õmicos sobrepostos. Para identificar as sequê ncias
transcritas na regiã o gen õmica de 500 kb, foi utilizada
uma abordagem de aprisionamento exônico desconhe-
- cida. Fragmentos dc DNA gen ô mico foram clonados em
um vetor, onde eram flanqueados por dois é xons conti -
dos na sequ ê ncia do vetor . Quando avaliados em uma
- cultura dc células humanas, se o DNA gen ômico n ão
- contivesse um é xon , os dois é xons do vetor sofreriam
-
splicing no processamento pós transcrição, gerando um
556 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

O O gene HD foi mapeado em uma região de 500 kb do cromossomo 4, na qual foram detectados quatro genes transcritos.
500 kb
Marcadores D D D D D D
moleculares 4 4 4 4 4 4
s s s s s s
1 ; r 9 ; 9
0 8 2 5 8 8
0 7 2
I I I I
HH R R R R R R R
MM M M M |M M M M M MM M M M M
i i l i i I
N NN N N N N NN N N NN NN N N
Mapa de restrição:
Nort (N),
MkA (M) e J
Nrul (R) Centrômero i Telômero
GUS72-2130 , ~ i
=y
i
Oones LI 9 91Fl
genômicos L11386 L83D3 L181010 L118F6
BJ66
LI 3489 L22886
L40010
LTC2
LE9F 7 BJ65W Ai 2
LT4208
Genes identificados a

/
/ ms rm moa ADDA
/
/

O Um gene O A variação nas repetições CAG cossegrega precisamente com o

candidata fenótipo HD nas famílias afetadas.

°siram
/775,exibiu
polimorfismos
no tamanho de
uma repetição
nudeotidka 12 3 4 6 7 8 9 10
(CAG) entre
indivíduos
normais e
portadores
de HD, como AJelosdos
pode ser visto cromossomos Repetições
nesse gel de
sequenoamento .
HD - 48

Alelos dos AN1 -

cromossomos AN2 -
normais AN3 - 18

Análise KR do comprimento da repetição CAG nos

individuos de uma família venezuelana portadora de HD

©19 3 a»
* *** -
Figura 16.26 Localizando o gene da doenç a de Huntington .
 Capítulo 16 Genética prospectiva e tecnologia de DMA recomblnante
transento de tamanho definido. No entanto, se o DNA
gen ômico clonado contivesse um é xon, ele sofreria spli
cing em dois éxons flanqueadores, criando um transcrito
de tamanho maior. Essa t écnica revelou a presen ça de
quatro genes transcritos na região.
Foram empreendidas duas abordagens para avaliar os
genes candidatoeL Primeiro, foram analisados os padrões
de expressão do RNAm dos genes Porém, nenhuma dife
rença nos padrões ou níveis dc expressão para qualquer um
dos quatro genes foi detectada entre os indivíduos normais
c portadores dc HD. Segundo, os genes candidatos foram
examinados quanto aos polimorfismos do DNA. Um dos
genes candidatos era polimórCco entre os indivíduos. Foi
observada uma diferença impressionante nos comprimen
tos de uma sequência trinucleotídica repetida nesse gene;
os indivíduos normais tinham 17 a 34 cópias de uma repe
ti ção CAG c os indivíduos portadores dc HD tinham dc 42
a mais de 66 cópias. A mesma correlação foi observada em
todas as 75 famílias, sugerindo fortemente que se tratava de
um gene HD. Como uma evidê ncia adicional , o tamanho
das repetições nos indivíduos com IID também se correla-
cionava com a idade de início dos sintomas da doença.
O gene HD abrange 210 kb, codificando um RN Am
de mais de 10 kb, e tem uma matriz de leitura aberta de
9.432 bases que codificam uma proteína de 3.144 amino-
ácidos. Nesse caso, há pouca coisa na sequê ncia proteica
para fornecer uma pista para a função ( e possivelmente o
RESUMO
16.1 As triagens genéticas prospectivas identifi-
cam os genes por seus fenótipos mutados
As triagens genéticas prospectivas são concebidas para
identificar os genes pela criação de um fenótipo mutado,
frequentemente permitindo aos pesquisadores inferirem a
função biológica de um gene.
I Os testes de complementação são utilizados para desco-
brir o número de alelos e o número de genes afetados em
uma triagem genética prospectiva.
I As mutações que resultam em letalIdade podem ser Identi -
.
ficadas nas triagens genéticas de alelos condicionais
As triagens genéticas das sequências poterveiadoras e su-
pressoras identificam genes que agem em vias relaciona-
das ou redundantes.
16.2 As sequências de DNA específicas são reco-
nhecidas usando tecnologia de DNA recom-
binante
I As enzimas de restrição, que cortam sequências de DNA
específicas, são utilizadas para fragmentar grandes molé-
culas de DNA em pedaços menores definidos.
I Um mapa de restrição de uma molécula de DNA pode ser
construído analisando os padrões dos fragmentos de DNA
após a digestão com enzima de restrição.
I Os fragmentos de DNA podem ser ligados para criar mo-
léculas de DNA recombinantes, normalmente compos-
557
tratamento ). No entanto, o conhecimento da sequê ncia de
- DNA proporcionou uma maneira dc testar a presen ça do
alclo da doença nas famílias cm que está segregando. Essa
informação pode ser utilizada no diagn óstico pré natal -
para eliminar o alelo da próxima geraçã o, caso o aborto te
rapê utico seja uma opção, o que é legalmente possível em
-
alguns pa íses, mas n ão no Brasil. Embora esse teste possa
- parecer uma dádiva , ele introduz muitos dilemas éticos.
-
Deve se testar uma criança quanto a uma doença de ma
nifestação na vida adulta na qual não há perspectiva de
-
tratamento ou cura no momento? O teste em um adulto
jovem poderia inadvertidamente fornecer informações
.
sobre outro indivíduo, como um dos pais que n ão deseja
conhecer seu status gené tico?
- A an álise da repetição CAG polimórfica també m for
neceu informações sobre o fenômeno da antecipação. Os
-
alclos CAG cujo tamanho sc aproxima da extremidade mais
alta do intervalo normal [( CAG)r.,J são instá veis durante
a transmissã o e mudam de tamanho de uma geração para
outra. A instabilidade ocorre tanto na herança materna
quanto na paterna, mas grandes expansões tê m sido obser-
vadas apenas durante a transmissão masculina; isso explica
por que os pacientes juvenis quase sempre herdam o alclo
mutado do pai . Embora a base molecular dessa tend ê ncia
dc gê nero tenha se tornado aparente, a base do mecanismo
ainda é desconhecida.
tos de um vetor que pode ser amplificado em um sis -
tema biológico e um trecho -alvo de inserção de DNA a
ser amplificado.
I Embora as extremidades compatíveis coesivas fadlitem
a criação de moléculas de DNA recombí nante, quaisquer
dois fragmentos de DNA podem ser ligados se suas extre-
midades forem transformadas em cegas .
I 0 uso de duas enzimas de restrição diferentes facilita a clo-
nagem direcional das moléculas de DNA
I A amplificação das moléculas de DNA recombínante em um
sistema biológico permite a produção de dones de DNA.
I Os cromossomos artificiais de bacteriófago, bacterianos e
de levedura permitem a donagem de grandes moléculas
de DNA.
I A reação em cadeia da polimerase é um método enzimá-
tico de amplificação do DNA, que depois pode ser clonado
em um vetor ou diretamente sequenciado.
16.3 As tecnologias de sequendamento do DNA
revolucionaram a biologia
I Moléculas de DNA longas podem ser sequenciadas usando
métodos de caminhada do primer { primer walking ) ou pelo
sequendamento shotgun e remontagem via algoritmos in -
formatizados.
As tecnologias de sequenciamento maciçamente paralelo
permitem que o DNA seja sequenciado sem antes donar o
DNA em um vetor.
558 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

16.4 As coleções de fragmentos de DNA clonados
chamam-se bibliotecas
As bibliotecas genômicas são coleções de fragmentos de
DNA clonados que representam o genoma inteiro de um
organismo.
As bibliotecas de DNAc são coleções de fragmentos de
DNA donados que representam a população de RN Am de
um organismo ou tecido.
A hibridação do DNA, que depende do pareamento de
bases complementares, é um meio de identificar sequên-
cias similares em uma mistura de sequências de DNA.
16.5 Genes especí ficos são clonados usando a
tecnologia de DNA recombinante
conservadas para conceber primers de PCR de modo a am-
plificar as sequências relacionadas.
Alguns genes podem ser clonados pela complementação
de um fenòtipo mutado.
Os transposons e outros elementos integrantes podem ser
utilizados para marcar (etiquetar) os genes, facilitando sua
clonagem subsequente .
A clonagem posicionai, ou caminhada cromossòmlca, pro-
porciona um meio para identificar genes donados conhe-
cidos apenas a partir de um fenòtipo mutado.
Nas abordagens de clonagem posicionai, primeiro as mu-
tações são mapeadas e depois os contigs do DNA sáo isola
.
dos, abrangendo o gene-alvo O gene-alvo pode ser iden-
tificado pelas aná lises de expressão, análises da sequência
de DNA ou experimentos de complementação.

Genes homólogos podem ser identificados usando sequên-

cias de DNA similares como sondas ou usando sequências

T E R M O S-C H A V E

Análise genética prospectiva (genétka
prospectiva ) (p. 523)
Análise genética reversa ( genética re -
.
versa) (p 523)
Biblioteca de DNA (p. 543)
Biblioteca de DNA complementar
(DNAc) (p. 543)
Biblioteca genòmka (p 543) . Letalidade sintética (p.529)
Clonagem direcional (p 536) . .
Clonagem posicionai (caminhada CTO-
mossômica) (p 557 ).
Clone de DNA (p. 535)
Clone recombinante (p. 535)
Condição permissiva (p. 527)
.
Condição restritiva (p 527)
Cromossomo artificial bacteriano (BAQ
(p. 540 )
Cromossomo artificial da levedura (YAC)
(p. 540 )
Cromossomo balanceador (p. 526)
Extremidades cegas (p. 532 )
Extremidades coesivas (p 531).
Extremidades compatíveis coesivas
<
p. 536 )
Ligador (p 537)
.
Mapa de restrição (p 532)
Marcação com transposon (p 550 ) . Triagem modificadora (p. 529)
.
Mutagênese (p 524 )
Mutagênese por saturação (p 524 ) .
Primer walkinq (p. 542)
Redundância genética (p. 530 )
Sequência contígua (contig) (p 554 )
Sequenciamento shotgun (p. 542)
Sistemas de modificação da restrição
(p- 537)
Sitio de clonagem múltipla (MCS) (p. 537)
Sí tios de sequência de extremidade coe-
siva (cos) (p. 539)
Subclonagem (p. 532)
Tecnologia de DNA recombinante (p. 537)
Tradução reversa (p. 548 )
Transcriptase reversa (p. 545)
.
Triagem genética (p 523)
Triagem potenciadora (p. 529)
Triagem supressora (p. 529)
Vetor (p. 535)
Vetor cosmídeo (p. 539)
. Vetor não recombinante (p.536)

Paro obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas .

Conceitos do capítulo
1. A que finalidade se prestam os genes da betalactamase e
locZ no vetor plasmideo pUC!8?
2. O genoma humano tem 3 x 10 pb de comprimento.
’ .
.
a Quantos fragmentos devem resultar da digestão com-
pleta do genoma humano com as seguintes enzimas:
- -
Sou3A ( GATC), BamH\ (GKSATCC), EcoRI (G AATTC) e
-
Nort (GC GGCCGC) ?
b. Em que a sua resposta Inicial mudaria se você sou-
besse que o conteúdo médio de GC do genoma hu-
mano fosse 40%?
3. A ligase catalisa uma reação entre o 5’-fosfato e o 3'-hi-
droxila nas extremidades das moléculas de DNA A en- .
zima fosfatase intestinal de vitelo catalisa a remoção do
5’-fosfato das moléculas de DNA. Qual seria a consequên-
cia de tratar o vetor, antes da ligação, com a fosfatase in-
testinal de vitelo?
4 Você construiu quatro bibliotecas diferentes: uma biblio -
teca genômica composta de DNA isolado de tecido cere -
bral humano, uma composta de DNA isolado de tecido
muscular humano, uma biblioteca de DNAc cerebral hu-
mano e uma biblioteca de DNAc muscular humano.
a. Quais dessas bibliotecas teriam a maior diversidade de
sequências?
b. As sequéndas contidas em cada biblioteca devem se
sobrepor completamente, parcialmente ou não devem
se sobrepor ?
 Capítulo 16 Genética prospectí va e tecnologia de DMA recomblnante
5. Você deseja tlonar o gene humano que codifica a mios - 9. Muitas vezes é desejável donar DNAc em um vetor de tal
tatina, que é expressa apenas nas células musculares.
a. Supondo que o genoma humano tenha 3 x 10* pb e
que o tamanho médio do fragmento de inserção nas bi-
bliotecas genômicas seja de 100 kb,com que frequência
um done representando a miostatina será encontrado
na biblioteca genômica feita de tecido muscular ?
b. Com que frequência um done representando a mios
tatina será encontrado na biblioteca genômica feita de
tecido cerebral?
c Com que frequência um clone representando a miosta-
tina será encontrado na biblioteca de DNAc muscular ?
d. Com que frequência um done representando a miosta
tina será encontrado na biblioteca de DNAc cerebral ?
6. O genoma humano tem 3 x 109 pb. Você deseja conce -
ber um primer para amplificar um gene específico no ge-
noma. Fm geral, qual comprimento de oligonucleotideo
seria suficiente para amplificar uma única sequência ?
Para simplificar seu cálculo, suponha que todas as bases
ocorram com a mesma frequência.
7. Com base nas sequências da Figura 16.20, como você
donaria o gene da betaglobirra a partir da salamandra da
Califórnia?
8. Os mapas genéticos e os mapas físicos são representa-
ções de um genoma.
a. Quais são as semelhanças e diferenças entre os modos
de criação dos mapas genéticos e fisicos?
b. Se os mapas genéticos de um determinado organismo
forem construídos de modo independente em dois
laboratórios diferentes, eles ser ão idênticos? E dois
mapas físicos construídos de modo independente?
c Como a informação que consta nos mapas genéticos e
físicos pode ser combinada?
Aplica ção e integra ção
14. O genoma do bacteriófago lambda pode existir na forma
linear ou circular ( ver Figuras 16.6 e 16.13). A forma circu-
lar ocorre quando os sítios cos de 20 pb (extremidades
coesivas) hibridam em seus pares de bases complemen-
tares e são ligados.
a. Quantos fragmentos ser ão formados pela digestão
com enzima de restrição Xhoi, Xba\ e com Xhoi e Xbal
simultaneamente nas formas linear e circular do ge-
noma lambda ?
b. Diagrame os fragmentos resultantes como aparece-
riam em um gel de agarose após a eletroforese.
15 . As enzimas de restrição Xhoi e Sali cortam suas sequên-
cias específicas conforme mostrado a seguir
Xhoi -
5' C -
TCGAG 3'
3'- GAGCT C - 5'
5ail 5'- G TCGAC - 3'
-
3' CÀGCT -
G 5'
As extremidades coesivas criadas pelos sí tios Xhoi e So/I
podem ser ligadas? Se puderem, as sequências resul-
tantes podem ser clivadas pela Xho\ ou pela Sal1?
16. O bacteriófago $X 174 tem um genoma com DNA de fita
.
simples composto de 5.386 bases Durante a replicação
do DNA, são geradas as formas de dupla fita do genoma . £coRI f Hinà lW
559
modo que todos os dones de DNAc venham a ter sua ex-
tremidade 3' em uma orientação no plasmideo e sua extre-
midade 5' na outra orientação. Isso é chamado clonagem
.
direcional Descreva como vocé donaria direcionalmente
uma biblioteca de DNAc no vetor plasmideo pUC18.
10. Você sequencia seu DNA genômico usando o sequencia-
mento de Sanger e uma tecnologia de sequenclamento
.
maciçamente paralela Haver á diferenças entre os tipos
de sequências representados nos dois conjuntos de
dados? Se houver, que tipos de diferenças?
.
11 Usando os dados do final do livro, calcule o número
médio de pares de quilobase (kb) por centimorgans nos
quatro organismos eucariótícos pluricelulares. Como
essa informação influencia as estratégias para donar po-
sidonalmente os genes nesses organismos?
12. Um importante avanço nos anos 1980 foi o desenvolvi-
mento da tecnologia para sintetizar ohgonucleotídeos
curtos. Esse trabalho facilitou o sequenciamento do DNA
e levou ao advento do desenvolvimento da PCR. Recen-
temente, ocorreram avanços rápidos na tecnologia para
sintetizar o DNA quimicamente e hoje são produzidas se -
quências de até 10 kb com facilidade. À medida que esse
processo se torna mais económico, como isso ir á afetar
as abordagens de clonagem genica descritas neste capí-
tulo? Em outras palavras, que tipos de técnicas essa nova
tecnologia tem potencial para suplantar e quais técnicas
não serào afetadas por ela?
13. Supondo que as tecnologias de sequenciamento vão
continuar a avanç ar e que qualquer pessoa em breve
terá seu próprio genoma sequenciado como parte de um
procedimento médico padrão, discuta algumas das rami
ficações éticas do conhecimento gerado .
-
Em um esforço para criar um mapa de restrição do $X 174,
você digere a forma de dupla fita do genoma com várias
enzimas de restrição e obtém os resultados mostrados na
página 560. Desenhe um mapa do genoma do 0X 174.
Pst\ 5386 Pst\ + Pii \ 3078, 2308
PSí1 5386 PstUDrai 331, 1079, 3976
Orai 4307, 1079 Rsrl + Dral 898, 1079, 3409
.
17 Você identificou um clone de DNAc de 0,80 kb que con-
tém a sequência codificadora inteira do gene CRABS
CLAW da Arabidopsis. Na construção da biblioteca de
DNAc, foram adicionados ligadores com sítios fcoRI a
cada extremidade do DNAc e este foi clonado no sítio
.
EcoRI do MCS do vetor exibido a seguir Você realiza di -
gestões no clone de DNAc do CRABS CLAW com enzimas
de restrição e obtém os resultados a seguir. Você con -
segue determinar a orientação do clone de DNAc com
relação aos sítios de enzima de restrição no vetor ? As
enzimas apresentadas na região verde são encontradas
apenas no MCS do vetor .
fcoRI 0,8, 3,0
H/ndUI 0,3, 3,5
0,3, 0,5, 3,0
560 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

orl

Amtf lacZ
T7
MCS
2.961 pb
-T3

Primer de sequenciamento T7
5’ 6 ,A À AAC bAC 6&1 C 4G !&A AH
3' C AU HG LtB ÇÇjS á tC AÇI IAA tAI CCCI SCI TM

Not\ Xbct\ BamH \ Smal £o>RI Hinó\\\ Sa /\ Xho\

1 Vf
" HCUSLJ .
<5Ç Cfif cct ÇTÇ TAf, AAf. TA$ TCG ATÇ CCC C&w CCT GC r,f,A ATT ÇGA TAT CAA ÇCT TA, i &V* i*. tÇT ÇÇA ÇC i l u*
* GÇÇ U u JAÇ CCA
- » .
íT ATC TTi MC KC TM Mf« CttCOT CCT TM «T ATA «TT C4A ATA «T 4Ti KA «T Wtd «C CCC CM 9CC MT

t- SL SÇT TGG LtiT AAT ÇA “ G6 t CAI ABL T â t t !C ç te 3'

btb CSX A.CC 6CA MA U CCA GIA RS AC A AA 6 bAC S*

Primer de sequenciamentoT3

18. Vocè isolou um clone genômico com um fragmento a. Qual sequência representa a extremidade 5' do gene?
fcoRl de 11 kb que abrange o gene CRABS CLAW {ver Pro- Qual sequência representa a extremidade 3' do gene?
.
blema 17) Você digere o clone genômico com Hind\\ \ e b. O trecho longo dos resíduos T na sequência T3 vão
nota que o fragmento £coRl de 11 kb é dividido em très existir na sequência genômica do gene?
fragmentos òe 9 kbr 1,5 kb e 0,5 kb . c. Vocè consegue identificar quais sequências são deriva-
.
a Isso lhe diz alguma coisa sobre onde está situado o das do vetor ( especificamente o MCS) e quais são deri-
gene CRABS CLAW dentro do done genômico de 11 kb? vadas do clone de DNAc?
b. Multas vezes os sítios de enzima de restrição dentro d. Você consegue identificar o início da região codifica-
de um clone de DNAc também estão na sequência dora na extremidade 5' do gene ? O que representa a
genômica. Você consegue imaginar um motivo para sequência que precede o códon de início?
que isso às vezes não aconteça? Os sítios de enzima de
restrição em um done genômico estão sempre em um Sequência produzda
comopwnefT7
done de DNAc do mesmo gene?
ACTAfiTM ATCCCCC 6G6:T KAtG A»TTCS6CAt4 A 6 TTCAA6 A &C 46TTT7CAATtCAT
.
19 Para analisar mais o gene CRABS CLAW (ver Problema 130
18), você cria um mapa do done genômico. O fragmento
fcofil de 11 kb é donado no sitio £coRI do MCS do vetor
exibido r>o Problema 17 .
Você digere a forma de dupla fita do genoma com várias
enzimas de restrição e obtém os resultados mostrados a rCBCTAAA« ACCA -« AACCTA6 * »fi ífiAA <CAACCAI8 »C 66 «1TCAA 66« mCCC TC A
130 140
seguir. Desenhe, dentro do possível, um mapa do clone
genômico do CRABS CLAW .
fcoRI 11,0, 3,0
fcoRI + Xba\ 4,5,6,5.3,0 Xba( 4,5,9,5
EcoR\ + Xho\ 10,2, 3,0, 0.8 Xho\ 13,2, 0,8
t \
fcoRI + San 6,0, 5,0, 3J0 San 6.0, 8.0 Sequência produzda
fcoRI + Hiodlll 9,0, 3,0, 1,5, 0,5 Híndlll 12,0, 1,5, 0,5 com oprimerT3 1
CCOCCC TCI* TTTTImT TT T TTTTTTTTA A40 AAT AC6C- ATAT AAAATTTM AT AM ATT A
Qual digestão com enzima de restrição ajudaria a re- 40 *
50 60 70 80 90 100
solver qualquer ambiguidade no mapa?
20. Você isolou outro done de DNAc do gene CRABS CLAW
n
de uma biblioteca de DNAc construída no vetor exibido
.
no Problema 17 O DNAc foi donado direcionalmente
*GACAA*TAAA6 ACCAfiAí:ATAAA£eT:CAA /.&i6 «CATA
IMJ
*C .* i 6 <«TTACTTTCAAIITCT
4
â *

usando os sítios fcoRI e Xho\. Você sequencla o plasml-

deo recombinante usando primers complementares aos
sítios promotores T7 e T3 que ladeiam o MCS. As primei-
ras 30 a 60 bases da sequência normalmente são descar
tadas,pois elas tendem a conter erros .
 Capítulo 16 Genética prospectí va e tecnologia de DMA recomblnante
21. Em nossa triagem na Análise Genética 16.1, concebida
.
para identificar mutados condicionais da S cerevisiae nos
quais o sistema secretório era defeituoso, conseguimos
identificar 12 mutados.
a. Descreva os cruzamentos que você faria para determi
nar o número de genes diferentes representados pelas
12 mutações.
b. Com base em seu conhecimento das ferramentas gené
ticas para estudar a levedura do padeiro, como você clo-
naria os genes que sofrem mutação em suas cepas de le
vedura respectlvas? Quais são as duas abordagens para
donar os ortólogos humanos dos genes da levedura?
22. Como você projetaria uma triagem genética para a tria
gem de genes envolvidos na meiose?
23. Os olhos da Drosophila se desenvolvem a partir de discos
imagéticos, grupos de células retirados no embrião da
mosca que se diferenciam nas estruturas adultas durante
o estágio de formação da pupa. Apesar de sua importân-
cia na natureza, os olhos são dispensáveis para a mosca
-da-fruta no laboratório.
a. Conceba uma triagem genética para identificar os genes
que controlam o desenvolvimento dos olhos da mosca.
b. Quais complicações poderiam surgir das triagens ge-
néticas visando a um órgão que se diferencia no final
do desenvolvimento?
24. Dado o seu conhecimento das ferramentas genéticas
para estudar a Drosophila, descreva dois métodos pelos
quais você poderia donar os genes dunce e rutabaga
identificados pelo laboratório de Seymour Benzer na tria-
gem genética descrita no inicio deste capitulo . no qual os ritmos circadianos estabelecidos estão fora
25. As mutações no gene CFTf í resultam em fibrose cística nos
seres humanos, uma condição na qual estão presentes se-
creções anormais nos pulmões, pâncreas e glândulas su-
doríparas. No esforço para donar posicionalmente o gene
CFTf í , esse gene foi mapeado para uma região de 500 kb
no cromossomo 7, contendo três genes candidatos.
a . Usando seu conhecimento dos sintomas da doença,
como você distinguiria entre os genes candidatos
para deddir qual deles é mais propenso a codificar o
gene CFTf í?
b. Como você provaria que o candidato escolhido por
você é o gene CFTR1
26. Você donou o DNAc do gene CFTf í (ver Problema 25) e
usou o DNAc que tem 4,5 kb de comprimento, para Iden
561
tificar um done BAC de 250 kb em uma biblioteca genô
mka que contém totalmente o gene CFTf í.
-
a. Descreva as estratégias que você utilizaria para se-
quenciar cada um desses dones.
- b. Você presume que a ampla maioria das mutações cau-
sadoras de doença nesse gene está dentro dos éxons
ou nos limites íntron-éxon. Como você espera identi-
ficar as mutações nos pacientes com uma quantidade
mínima de sequenciamento?
- 27. Como você concebe uma triagem para Identificar mu -
tações recessivas na Drosophila que resultam em letali-
dade do embrião? Como você propaga os alelos muta-
- dos recessivos?
28. Nas plantas terrestres, há uma alternâ ncia de gerações
entre uma geração de gametofítica haploide e uma es-
porofftica diploide. As duas gerações são caracteristica-
.
mente pluricelulares e podem ser de vida livre Os game -
tófitos masculinos (pólen) e femininos (saco embrionário)
sáo a geração haploide das plantas com flor.
a. Como você concebe uma triagem para identificar os
genes necessários para o desenvolvimento dos game-
tófitos femininos na Arabidopsis?
b. Como você concebe uma triagem para identificar os
genes necessários para o desenvolvimento dos game-
t ófitos masculinos?
29. A maioria dos organismos exibe um ritmo drcadlano no
qual os processos biológicos são sincronizados com a du-
ração do dia (por exemplo, nos seres humanos, o movi -
mento r ápido entre os fusos horários resulta em jet lag,
de sincronismo com as horas do dia). Na Drosophila, as
pupas eclodem de madrugada.
a. Usando esse conhecimento, como vocé faria a triagem
dos mutados da Drosophila que têm um ritmo circa -
diano prejudicado ?
b. Na maioria das plantas, como a Arabidopsis , os genes
cujos produtos codificados têm papéis relacionados à
fotossíntese possuem padrões de expressão que va-
riam de modo circadiano. Usando esse conhecimento,
como você faz a triagem dos mutados da A/ obidopsis
que têm um ritmo circadiano prejudicado?
c Em cada caso, como vocé donaria os genes que identi-
ficou por mutação?
-
 Capítulo Aplicações da tecnologia de DNA
recombinante e genética reversa

APRESENTAÇÃO

17.1 A introdução de genes estranhos nos genomas

cria organismos transgénicos
17.2 Os rransgenes proporcionam um meio de
dissecar a função do çene
173 A genética reversa investiga a ação do gene
progredindo da identificação do gene ate o
fenótipo
ph/fosna
Phytofltfeh
*
17.4 A terapia gémea usa tecnologia de DNA

-
recombinante

Ç Corotene
17.5 A clooagem de plantas e animais produz
indivíduos geneticamente idênticos

ffeurosporMl

I Os organismos transgénicos sòo criados
pelo aproveitamento dos vetores biológicos
para introduzir genes nos organismos.
I Os fenotipos dos organismos transgénicos
podem fornecer informa ções sobre a fun
çáo génica.
I As técnicas de genética reversa começam
•
com uma sequência genica depois passam
para a identificação de um fenótipo mutada
I A tecnologia dc DNA recombinante nos
seres humanos é uma via para o desenvolvi-
mento da terapia gémea
I A donagem de plantas e animais produz tn
divtduos geneticamente idênticos.
ê. coli transgemea expressando os genes da via biossintétka caro-
tenoide derivada das plantas. Os pigmentos carotenoides, respon-
savei pelascores vermelha e alaranjada de tomates, pimentas e la
^ um tampão para absorver o excesso de
*‘*t *m*durante
eTeuomTraafcafs produzidos a fotossintese.
0 advento da tecnologia de DNA recombinante abriu cami-
nho para o estudo da funçáo génica no nível molecular.
Apôs introduzir as estratégias bá sicas para a manipulação in vitro
do DNA e para a identificação da sequência de qualquer gene (ver
Capitulo 16), uma etapa próxima e óbvia é a manipulação precisa
da ação génica nos organismos vivos. Um dos desenvolvimentos
principais que impeliram esse avanço e a capacidade para criar
organismos transgénicos. que são receptores dos genes inseridos
em seus genomas. A criação dos organismos transgénicos é uma
ferramenta poderosa para manipular a atividade de genes especí-
ficos. observar os fenótipos resultantes e, dessa maneira, adquirir
novas percepções dos processos biológicos. Além disso, os orga-
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombinante e genética reversa
nlsmos transgênicos podem ser moldados para fins mé-
dicos, agrícolas ou industriais específicos.
A produção de organismos transgênicos é rotinei-
ra na análise genética hoje e pode ser adaptada a um
número quase ilimitado de abordagens experimentais.
Entretanto, um dos usos mais significativos da tecno-
logia de DNA recombinante é no pioneirismo das téc -
nicas de gené rica reversa. Enquanto as abordagens de
genética prospectiva começam a investiga ção gené-
tica com um fenótipo mutado e seguem para a iden-
tifica ção de uma sequência gênica, as abordagens de
genética reversa começ am com uma sequência g ênica
e procuram identificar o fenótipo mutado correspon-
dente. Por exemplo, um experimento de gené tica re-
versa poderia gerar alelos de perda de função de genes
específicos inserindo transgenes em um organismo e
depois observando as diferenças entre os fenótipos
transgênicos e o tipo selvagem. A análise genética
reversa ganhou proeminência em consequência da
enorme quantidade de dados de sequência de DNA
disponibilizados desde o final dos anos 1990.
A análise transgênica também é utilizada para ex-
plorar a regulação gênica. As sequências regulatórias
podem ser dissecadas por experimentos transgênicos
que fundem todas ou parte das sequências regulatórias
para um gene com o segmento expresso de outro gene
cujo produto é facilmente visualizado. As sequências
regulatórias de genes diferentes podem ser misturadas
e compatibilizadas para alterar o momento, o lugar e a
quantidade de expressão gênica, proporcionando no-
vas perspectivas para o estudo da função gênica e a
produção de produtos gênicos específicos.
Neste capítulo, discutimos essas aplicações da tec-
nologia de DNA recombinante, concentrando-nos nos
métodos utilizados para criar organismos transgênicos
e manipular a atividade gênica.
17.1 A introdução de genes
estranhos nos genomas cria
organismos transgênicos
A introdução de um gene de um organismo no ge
noma de outro organismo cria um organismo transgé
nico. O gene introduzido é conhecido como transgene;
se o gene introduzido vier de uma espécie diferente, ele é
um transgene heterólogo. Os dois principais desafios na
criação de um organismo transgé nico são (1) a necessi
dade de introduzir DNA em uma célula de tal modo que
563
esse DNA se integre ao genoma e (2) a necessidade de
fornecer as sequências regulatórias adequadas para que
o transgene venha a ser expresso convenientemente.
Como as células dos diferentes organismos têm
capacidades diferentes para importar DNA de seu am
biente e também têm propensões diferentes para re
--
combinar DNA exógeno em seus genomas, os proto-
colos para introduzir os transgenes variam de acordo
com o organismo. Contudo, a produção de organismos
transgênicos é surpreendentemente objetiva , talvez
porque os organismos de ocorrência natural tenham
evolu ído na maioria das linhagens da vida visando à
capta ção ou ao fornecimento de DNA. Muitos organis-
mos ou células vão absorver DNA de seu ambiente e,
depois que esse DNA estiver dentro da célula , um dos
seus possíveis destinos é a recombinaçáo no genoma.
Recorde nossa discussã o sobre certas versões de ocor-
rência natural desse processo, incluindo a transferência
gênica pelos doadores Hfr nas bacté rias receptoras, a
transdução dos genes de um doador para um receptor
bacteriano e a transferê ncia gê nica entre e dentro das
espécies por meio da transformação ( ver Capítulo 6).
A concepção dos transgenes utiliza técnicas de tec -
nologia de DNA recombinante (ver Capítulo 16). A ex
pressão dos transgenes é igual à expressão de qualquer
-
gene; primeiro, a sequência gênica precisa ser transcrita
em RNAm e depois traduzida em um polipeptídeo. A
universalidade do código genético permite a expressão
-
das sequências codificadoras, mesmo quando transfe
ridas entre organismos muito pouco relacionados
mesmo quando um deles é procarioto e o outro é eu
carioto. Entretanto, as sequências regulatórias e suas
—-
interações moleculares com o maquinário de transcri
ção e tradução variam bastante entre os organismos, não
-
sendo intercambiávcis entre os organismos muito pouco
relacionados. Desse modo, para que os transgenes sejam
expressos eficientemente, eles precisam ser combinados
com as sequê ncias regulató rias do hospedeiro.
Transgenes na Escherichia coli
A transformação bacteriana por um plasmfdeo re-
combinante é o método prim á rio para gerar bactérias
transgênicas. Conforme descrevemos na Seção 17.2, DNA
estranho pode ser introduzido nas bactérias, como a £
coli , usando um vetor plasmídeo contendo sequências ne-
cessárias para a replicação do DNA e possuindo também
um marcador selecionável, como a resistência a antibióti-
cos, para facilitar a identificação dos transformantes.
Os vetores de expressão são vetores que foram for-
-
necidos com sequê ncias capazes de controlar a transcri -
ção eficiente e a tradução dos transgenes ( Figura 17.1 ).
Para que os transgenes sejam expressos adequadamente
na £ coli , as sequê ncias regulató rias compatíveis com o
maquiná rio de transcriçã o e tradução na £ coli precisam
estar presentes no vetor. Os vetores de expressão para
- uso na £ coli são constru ídos a partir de plasmídeos
que foram equipados com sequências promotoras que
564 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a ) Vetor de expressão £. coli ( b) Vetor de expressão eucari ótico

Sítio de muitldonagem Sítio de muitldonagem
( MCS) (MCS)
Sequê ncia Sequências de
- 10 terminadora da
transcrição
TATA box terminação
da transcrição
-35 Sinal de
vC N
Seq uência de Shine * poliademlaçào
\ -Dalgarno para tradução
Sequência eficiente nas bactérias
promotora

Sequências regulatórias para conrmbr

a transcr çâo do gene inserido na £ coú
(sequências regulatórias do óperon
toc), bem como nos eucariotos
Origem (pocenciadores eucarióteos).
bacterlana Ori
da replkação bacteriana

Marcador Marcador
selecioná vel seledonável
bacteriano bacteriano

Figura 17. i Vetores de expressão pare £. coli nos eucarlotos.

se ligam à RNA polimerase a montante do sí tio de mul - sinónimos não são utilizados com a mesma frequência.
ticlonagem ( MCS) do plasm ídeo. Lembre-se de que o Por exemplo, a glicina é codificada pelo GGN, com N re -
MCS é um grupo de sítios de restrição ú nicos nos quais presentando qualquer nucleot ídeo, mas o GGA e o GGG
o gene a ser expresso é inserido em dones recombinan - raramente são utilizados no E colit ao passo que esses
tes (ver Capítulo 16). A tradução eficiente do RN Am na códons são comumente usados nos outros organismos
£ coli também exige a presença de uma sequência de apresentados na Tabela 17.1. Os RNAt correspondentes
-
Shine Dalgarno na região 5' não traduzida do RNAm , aos códons frequentemente utilizados são expressos em
outra característica embutida nos vetores de expressão n íveis mais altos que os RNAt para os códons raramente
da E coli. Além disso, como o maquiná rio de splicing do utilizados. Esse uso preferencial dos códons se chama
RNAm não existe nos procariotos, os transgenes euca - viés de códon. Desse modo, para a produção eficiente
rióticos precisam ser isentos de íntrons para que sejam das proteínas heterólogas na E coli, o uso de códons den -
traduzidos adequadamente nos procariotos. Esse requi- tro das sequ ências gé nicas heterólogas pode precisar ser
sito implica o uso de DNAc como transgenes eucarióti - alterado para aproximar a polarização do códon na E
cos nos sistemas de expressão da E coli . coli. Repare que essas mudan ças não alteram a sequência
A expressão do gene heterólogo transportado por de aminoácidos da proteína codificada: elas alteram ape-
um vetor de expressão pode ser constitutiva ("ativa" o
nas a eficiência com que ocorre a tradução na E coli. A
tempo inteiro ) ou regulada pela adição ou remoção de
polarização do códon pode afetar a expressão dos trans-
compostos indutores. Um exemplo da ú ltima aborda - genes heterólogos em qualquer caso em que os genes
gem é o uso do aparelho rcgulató rio do ó peron lac da E
sejam transferidos entre espédes pouco relacionadas.
coli para induzir a expressão dos transgenes: a fusão da
Uma segunda obstruçã o possível à produção de
sequência operadora lac e dos sítios de ligação ao CAP
proteí nas heterólogas funcionais na £. coli é apresen -
do óperon lac com o sitio de ligação da RNA polime - tada pelas modificações pós- tradução à qual muitas
rase permite que o transgene seja controlado da mesma
maneira induzível que os genes do óperon lac (o óperon proteí nas precisam se sujeitar para funcionar. As mo -
lac é descrito no Capítulo 14).
Dois tipos de variação nos mecanismos genéticos dos Tabela 17.1 Preferência em diferentes organismos por
organismos vivos podem dificultar a produção eficiente códons g&dna específicos
de produtos transgénicos funcionais. A primeira com
plicação afeta a eficiência da tradução. Embora na reali
-- Códon £ coli S. cerevisiae H. sapiem A. thaliana
dade o código genético universal permita a expressão dos GOA 0 23% 23% 37%
transgenes heterólogos, os organismos variam quanto ao GGG 2% 12% 26% 15%
grau em que utilizam códons específicos quando o có- GGC 38% 20% 33% 14%
digo genético contém mais de um para um determinado
GGT 59% 45% 18% 34%
aminoácido ou sinal. Na maioria das espédes, os códons
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombinante e genética reversa
-
dificaçòes pós traduçáo das proteínas são diferentes de
acordo com a espécie, em particular entre os eucariotos
e as bactérias. Por exemplo, os grupos de carboidratos e
lipídios são adicionados a muitos tipos de proteínas eu
ca rióticas. Além disso, as fun ções das proteí nas podem
ser modificadas pela fosforilaçâo, acetilação ou metila
çào dos resíduos de aminoácidos; outro processamento
-
polipept ídico pós traduçâo; e atividades específicas de
dobramento proteico. Muitos desses processos simples
mente n ão ocorrem ou o fazem com diferenças impor
tantes nas células bacterianas. Em tais casos, as células
eucarióticas, como a levedura ou as células na cultura de
tecido, e os vetores de expressão eucarióticos precisam
ser utilizados. Os vetores de expressão eucarióticos
possuem caracteristicas eucarióticas an á logas às encon -
tradas nos vetores de expressão bactcrianos, incluindo
as sequ ências para a regula ção da transcrição (como a
TATA box para a ligação com a RN A polimerase II ),
sequ ências potenciadoras para o controle quantitativo
e qualitativo da transcrição e poiiadenilaçào e sinais de
terminação da transcrição (ver Figura 17.1).
Observa çã o gen ética A universalidade do código gené-
tico permite a expressão dos genes heterótogos controlada por
sequências regulatórias específicas para o organismo hospedeiro.
Produção de insulina humana na £. coli
Um gene que codifica insulina foi um dos primeiros
genes humanos a ser expressos na £ coli e a insulina
humana foi a primeira proteína produzida a partir da
tecnologia de DNA recombinante para uso terapêutico
em seres humanos. A insulina, um hormònio proteico,
regula o metabolismo do açúcar nos animais estimu
lando as células hepá ticas e musculares a absorverem
glicose e as células adiposas a absorverem lipídios do
sangue. Os indivíduos incapazes de produzir insulina,
ou cujas células não respondem a ela, sào portadores de
diabetes, uma doença frequentemente debilitante que
afeta milhões de pessoas no mundo inteiro.
A insulina é produzida ciclicamente no pâncreas por
células especializadas nas ilhotas de Langerhans, sendo
liberada na circulação sanguínea em resposta à ingestão
de carboidratos contendo açúcar. As células pancreá
ticas inicialmente sintetizam uma proteína precursora
com 110 aminoácidos, chamada pré- pro-insulina, que
não é secreta d a e não possui função hormonal até ser
——
processada proteoliticamente. Os aminoácidos “ pré”
os 24 aminoácidos terminais da pré- pro-insulina
clivados da precursora para produzir proinsulina, um
sào
— chamados segmento “ pro"
—
evento seguido pela clivagem de mais 35 aminoácidos
do meio da proteí na.
A clivagem posterior gera duas cadeias de aminoácidos,
chamadas cadeia A e cadeia B, que consistem respecti
vamente em 21 e 30 aminoácidos de comprimento. A
cadeia A se une à cadeia B por pontes bissulfeto entre os
resíduos de cisteína para produzir insulina.
565
-,
A sequência de aminoácidos da insulina foi determi
nada por Fred Sanger no inicio dos anos 1950 (Figura 17.2
O), mas o gene humano que codifica a insulina não foi
- identificado até o final dos anos 1970. Entretanto, mesmo
antes de o gene da insulina humana ter sido clonado, os
- biólogos moleculares começaram experimentos concebi -
dos para produzir insulina humana na £ coli construindo
plasm ídeos recombinantes contendo DNA quimicamente
sintetizado que codifica a insulina humana. Uma estraté-
- gia experimental, chamada método das duas cadeias, uti-
lizou dois genes sintéticos, um codificando a cadeia A c
o outro codificando a cadeia B. Cada gene sintético foi
construído a partir de oligonudeotideos cuja sequência se
baseava na tradução reversa das sequ ências de aminoáci-
dos das cadeias gê nicas da insulina humana 0.
Os genes sintéticos foram clonados em vetores plas-
mideos diferentes. Em cada caso a cadeia foi fundida , na
mesma matriz de leitura , à termina ção 3’ do gene lacZ
que codifica a betagalactosidase O. Construtos genéti -
cos como esse, consistindo em dois ou mais genes ou
segmentos gènicos unidos para formar um novo gene
artificial, chamam -se genes de fusão. A transcrição e
a tradução de um gene de fusão produzem uma pro-
teína de fusão, que em cada um desses casos conti
nha o polipeptídeo da cadeia de insulina fundido com
-
a terminaçã o carboxila da betagalactosidase (o produto
.
proteico do gene lacZ ) No plasm ídeo recombinante a
transcrição é controlada pelas sequências regulatórias
do operador lac. A transcrição gènica é induzida pela
lactose na ausê ncia de glicose, conforme descrito em 0
e O ( ver també m o Capítulo 14). Em condições de cres-
cimento adequadas, até 20% da proteí na total produzida
pelas cepas recombinantes de £ coli é proteína de fusão.
Para separar os peptídeos de insulina dos peptídeos
- de betagalactosidase, e para formar moléculas de insulina
funcionais, foi elaborado um resíduode metionina na pro-
teína de fusão, na junção entre a extremidade N -terminal
dos peptideos de insulina e a extremidade C- terminal dos
peptídeos de betagalactosidase para servir como um sitio
de clivagem pept ídica O. O tratamento das proteínas com
brometo de cianogênio (CNBr ) cliva as pontes peptídi-
cas na extremidade carboxila dos resíduos de metionina
O. Não há outros resíduos de metionina na proteína de
fusão, então o tratamento com CNBr libera cada uma das
- cadeias de insulina das peptideos da betagalactosidase.
Quando as cadeias A e B são purificadas de suas cepas
hospedeiras recombinantes e misturadas em condições
oxidantes, pontes bissulfeto se formam e ligam as cadeias
A e B, produzindo moléculas de insulina ativas 0.
As moléculas originais de insulina humana recom
binante, produzidas por esse m étodo, foram idênticas
-
-
à insulina humana de ocorrência naturaL No entanto,
desde a implementação desse processo sintético nos
anos 1980, tê m sido desenvolvidos métodos mais efi -
cientes para produzir insulina humana recombinante.
Alguns desses métodos introduziram alterações nos
aminoácidos na insulina humana recombinante para
criar proteínas que possuem diferentes efeitos dese-
566 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Q A sequénda de aminoéridos da cadeia B de insulina humana é determinada pelo sequenciamento peptfclico.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

l
© A sequência de nudeotídeos foi criadaappela tradução reversa da sequência de aminoácidos. Dois códons de
parada sucessivos foram adicionados ós a matriz de leitura aberta .
Molde 3'
^ .^ .
Codificadora 5' Élí f«f r»f . ^ .
t4'UÉf í Értf»fK4í irym4iÉÉí
^^ f f TOi . ^ÉÉ^^í^mi^Éif4T«iy.W1^4«lf.T.T^TiiiTAArA 3 35' *

l
© Dm códon metionina foi inserido no inicio da sequência codificadora B da insulina para facilitar o subsequente
isolamento da proteí na B insulina.
5' 3*
^7 7
3' TACr.yTrr i r?WrT ? T.T#T»ri7JT;yTmrrTrrirJTilIflftTT.T.W.ãiW.lXfJJXftf
^ âfX ifrT»TT«r T.TTrf.T.Trf.
lfrj
* ^ fti frflA ~ 77
^ 5'

l
O Sítios £co«I e BamHI foram adicionados às extremidades do DNA para facilitar a donagem em um vetor.
5' G A>iT MaMMaiittâttfjcammflaiT AA r A C GA T C q3'
y CTTÃÃG 5m^»n^t/.Hf ^iicI:TJJ.!^^-LI-Ít- 'L!J4tl ^ ^^ m^X^^
LI c >?
^^ ^ ^ .^^
miII HÍcr » ícrMTTATCCTAGCl25'
ií|

© O fragmento de DNA inteiro foi sintetizado quimicamente. 1

(; A cadeia B de Insulina (azul) foi G A A 1 T C A I bUMiflLll I3'
donada no vetor de clonagom (direita)
como contí nuaçáo da matriz de leitura
3 ^ "«ItiMIC T r GT A crxiw.»
r nrH #mífdfTirin
lf j
ynvp riry£ j
AA
pnij
, 5*
do focZ (laranja), criando uma proteína
NHj
^ ri COOH
de fusão; a expressão do gene de Gene para a Gene para
x
fusão é induzida pela lactose. ^ vbetagalactosidase
•
V
a cadeia
4

Vetor de expressão da £ cofc a

transcrição é controlada pelas
sequências operadora (O) e
promotora (P) do óperon /53c.

© A proteína produzida na £.coíi foi purificada e

a cadeia B da insulina humana foi separada da Clivagem In vílro com
bctagalactosidaso pela clivagem in vitro com brometo de clanogênio
brometo de cianogènkx
í
C A cadeia A da insulina foi produzida usando
uma estratégia similar. A insulina ativa foi
Fragmentos de
betagalactosídase — .
rghTT u i TA» Tr ,
—1'
^ *

produzida após a mistura de duas cadeias Cadeia B de Insulina

purificadas em uma atmosfera oxidante para
induzir pontes bissulfeto entre os resíduos de
cístelna das duas cadeias .
Figura 17.2 Produçã o de insulina humana na £. coll . Essa estrat égia foi utilizada no final dos anos 1970 pelo City Hope
National Medica! Center e pela empresa de biotecnologia Genentech para produzir insulina humana na £ coli.

jados na absorção da glicose pelas células-alvo. Essas
vá rias formas de insulina humana recombinante sào
utilizadas por milh ões de diabéticos dependentes de in-
sulina em todo o mundo, diariamente.
A facilidade e a economia de trabalhar com bac
térias em comparação com eucariotos tornou prá tico
produzir muitas proteínas eucarióticas nas bactérias
para aplicações médicas e industriais. Além da insulina
humana , proteínas como o hormõnio do crescimento
humano (hGH ) c a eritropoietina (que induz a formação
de eritrócitos) são produzidas em sistemas procarióti
cos. Os sistemas recombinantes utilizados para produzir
esses e muitos outros agentes farmacêuticos e indus-
triais sào fontes seguras e eficazes de material que, de
outro modo, seria escasso. Por exemplo, antes da produ -
- ção da insulina humana pela tecnologia de DNA recom
binante, a insulina era extraída dos pâncreas de porcos e
-
vacas, sendo coletada como um subproduto da ind ústria
de carne. A insulina suína e a bovina são muito pareci-
das com a insulina humana, mas não idênticas; conse-
quentemente, as reações alérgicas comprometeram seu
- uso pelos diabéticos. As extrações de insulina de animais
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 567

também trazem o risco de contaminação proveniente

dos tecidos de origem. Do mesmo modo, o hGH ex - tiposclvagcm ' ULMALK JA HISL 3'
^
tra ído das hipófises de cadá veres humanos traz o risco
de transmissão de doen ças neurológicas ( por exemplo, 1
doença de Creutzfeldt-Jacob), pela possível presença de
prote ínas contaminantes. Tanto a insulina humana re - Oligonucleotfdeos
n iTtTficcy/ y
combinante quanto o hGH recombinante se provaram con mutação sítio
seguros e eficazes ao longo de décadas de uso .
Muitas proteínas utilizadas nos processos industriais
dirigda
nTT. WíTTT A «Mí M.Tf.W ITj£ 5 -
e também nos produtos dom ésticos diários são produzi -
das em bactérias. Por exemplo, as proteases sâo enzimas
que degradam proteína , adicionadas aos detergentes de
roupas para ajudar a remover manchas. O Isolamento dos Sequèndas GATC
metiadas ( m)
genes que codificam as proteases nas bactérias psicrofí-
licas, ou amantes do frio, permitiu a produção industrial
das proteases que atuam na água fria, levando a econo -
mias substanciais nos custos de energia oriundos do uso
Plasmídeo a ser modificado
doméstico da á gua quente. A engenharia genética da £
I
coli e de outros micróbios, para produzir proteínas ou Desnaturar o plasrr deo pa^a
compostos usados na ind ústria, agricultura e serviços de permur que os prtmen se 'iguem ao
sa úde, é um campo ativo que vai florescer nos próximos DMA, de fita s mpí es do plasm ídeo.
anos à medida que mais sistemas microbianos forem in -
vestigados nos níveis genòmico e fisiológico. Um exem
plo de transferência de uma via bioquímica inteira para a
-
£ coli a fim de produzir um composto importante para
a medicina é descrito na Observação Experimental 17.1 . I
Usar os olgonudeotídeos como primcn (vermelho)
Observa çã o gené tica Os genes eucariótkos que codi- e usar o plasmídeococtendo a sequência a ser
modificada ( verde) como um molde para a PCR
ficam proteínas para fins farmacêuticos e industriais podem
ser expressos por bactérias transgénicas.

Modificação da sequência das moléculas

de DNA Repetir 6-10 vo2es
Às vezes a versão do tipo selvagem de um gene é
aquela que os geneticistas desejam expressar como um
transgene. Mas vimos que, em alguns casos, é desejável
expressar uma versão modificada, na qual determinados
nuclcotídeos foram modificados. Uma razão para que às
vezes seja desejável alterar a sequ ência de uma proteí na
codificada é tomar essa proteína mais ou menos ativa.
Por exemplo, as mudanças nas identidades de aminoá
cidos específicos às vezes podem fazer que uma enzima
-
seja constitutivamente ativa ou mais estável nas tempe - A maioria das moléculas vai ter uma sepjê noa melado
em amhas as fitas. Destruir as pouras que rão possuem
raturas altas ou baixas. Uma segunda razão para mudar essa sequência usando a digestãocom Qfhl (setasX
a sequência de nucleot ídeos de um gene é melhorar
sua expressã o em uma espécie com uma polarização de
códon diferente da encontrada na espécie da qual o gene
i
foi derivado (ver “Transgenes na Escherichia colT ).
Transformar dentro da f. coftTj
Mudanças específicas nos nucleotídeos podem ser Figura 17.3 Mutagénese sítio dirigida.
feitas por meio de uma técnica chamada mutagénese
sítio dirigida, descrita na Figura 17.3. A chave para a procedimento da PCR, a sequência génica a ser modifi -
mutagénese sítio dirigida é conceber primem de oligo- cada é clonada em primeiro lugar em um vetor plasmídeo,
nudeotídeos contendo a mudança nucleot ídica desejada após o que o plasmídeo é desnaturado em fitas simples
no meio da sequê ncia do primer. Depois, os primem são ao ser aquecido a 95 UC c depois resfriado rapidamente.
utilizados em uma reação em cadeia da poiimerase ( PCR ) Em seguida, a adição dos primem (contendo a mutação)
para amplificar a sequência génica a ser modificada. No de unta DNA poiimerase e de um suprimento de dNTPs
 568 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Observa çã o Experimental 17.1

Medicamentos antimaláricos derivados de plantas e produzidos na E. coli

A produção de amorfadieno na £ coli exemplifica o uso
da engenharia genética para produzir um pcoduto farmacêu-
tico de alto valor. O amorfadieno é o precursor imediato da
artemisina, um medicamento antimalárico potente. A artemi
sina tem sido promovida como a pr óxima gera ção de medica-
mentos antimaláricos, já que é eficaz no tratamento de vá rios
estágios da infecçáo malárica e náo exibe resistência cruzada
com os medicamentos antimaláricos existentes, como a doro-
quina e a quinina. Estas vêm sendo utilizadas para combater
a infecçáo malárica há vá rias décadas, mas sua eficácia está
diminuindo em decorrência da evolução de cepas resistentes
do Plasmodium , o parasita malárico.
Assim como muitos medicamentos modernos, a artemi-
sina foi originalmente descoberta em extratos vegetais. Atual-
mente, o fármaco é extraído e purificado a partir da artemi
.
sia Artemí sia annua , A logí stica de cultivar a artemísia é um
fator limitador e o custo de produzir grandes quantidades de
artemisina a partir de sua fonte natural também é proibitivo.
A produçã o da artemisina em um sistema biológico fermentá-
vel como d £ coli poderia aumentar o suprimento do fármaco,
conservar as fontes naturais e reduzir radkalmente os custos
de produção.
A artemisina é uma molécula de terpeno complexa pro-
duzida em várias etapas biossintéticas. Todas as plantas pro-
duzem os precursores da via do terpeno, o pirofosfato de
í sopentenila (IPP) e o pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), mas
os terpenos especí ficos produzidos a partir deles por cada es-
pécie de planta variam. As duas etapas finais na biossíntese da
artemisina, de pirofosfato de farnesila (FPP) para artemisina,
são catalisadas por enzimas codificadas por genes espedficos
para a artemísia. Embora a £ coli produza IPP e DMAPP natu-
ralmente, a via está sujeita à Inibição do feedback , impedindo
o acúmulo de grandes quantidades dessas moléculas.
Esse obstáculo á produçã o de grandes quantidades de
amorfadieno na £ coli è contornado pelo uso de uma combi-
nação de oito genes da Soccharomyces eerevisiae e da £ coli
para recriar a via biossintética que leva à produção de FPP. O
Uma cepa mutado da £ coli é utilizada, sendo que esta náo
possui a inibição normal do feedback da via biossintética do
FPP. O A expressão dos oito genes da S. eerevisiae é coorde-
nada pela distribuição dos genes em dois óperons diferentes
— um contendo três genes e um contendo cinco — controla-
dos pelas sequências regulatór í as do óperon lac (ver no Capi-
tulo 14 uma revisão do sistema óperon lac ). Dessa maneira, a
expressão gémea é induzida na presença de lactose ou do in
dutor sintético isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (1PTG).
A etapa O é donar o gene da amorfadieno sintetase ( ADS ) da
artemí sia e coloc á- lo sob o controle das sequências regulató-
rias do óperon loc .
Os primeiros experimentos com esse sistema foram de
cepcionantes, já que apenas baixos ní veis de proteína ADS
foram produzidos na £ coli . Descobriu-se que a razão eram
as diferenças na polarização do códon entre a artemí sia e a £
coli . Quando os códons preferidos pela artemí sia eram substi-
tuídos por códons sinónimos preferidos pela £ coli , a produ-
ção da proteína ADS na £ coli se tornava muito mais eficiente.
O Hoje as bactérias produzem uma grande quantidade de
amorfadieno, que poderia ser convertido em artemisina por
meio de síntese química ou In vivo pela introduçã o do gene
da artemisina sintetase da artemísia.

O A via biossintética FPP da £ coli, sujeita à

regulação do feedback, foi inativada
por uma mutação no gene í spC.
ispC
0 A fermentação da cepa de E.
coli resultante produz
amorfadieno, que é secretado
Via biossintética endógena da £ coli no meio e que pode ser

*
convertido para artemisina por
G3P um processo químico in vitro.
^ DXP -» MEP CDP-ME - CDP-ME2P ME-2,4cPP HMB4 PP -J-» IPP -» pMAPP
Plruvato ** *

Via biossintética projetada

FPP
A-CoA 7* AA-CoA -* HMG-CoA 7* Mevalonato-» Mev-P -+ Mev-PP - » IPPDMAPP- A^XÀ/NÂ/Xv 7* * Amorfadieno Artemisina
atoB
f t
HMGS
*
tHMGR ERG 12
j
ERG8 MVDI Idl ^
IspA
*
^

ADS

f>* Óperon 1 P»r Óperon 7 Pvr

0 0 gene da artemísia (verde)
que codifica a ADS, a qual
0 Uma via biossint( ética)FPP composta de uma mistura de genes da 5. eerevisiae
sequ
(laranja) e converte o FPP para
genes da £ coli cinza foi Introduzida em dois óperons controlados pelas ências amorfadieno, foi colocado em
reguiatórias do óperon P * (azul- escuro). outro vetor de expressão,
*
também controlado pelas
sequências reguiatórias do
óperon lac (azul- escuro). 0
gene foi modificado para
corresponder à polarização de
códon da £ coli.
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombí nante e genética reversa
leva a uma síntese do DNA in vibro a partir do nucleotí -
deo 3' hidroxila dos primers. O resultado é uma mistura
de plasmídeos de fita dupla, alguns deles contendo a mu -
tação de interesse e outros contendo a sequência original.
Após a conclusão da PCR , os plasm ídeos nào mu -
tados podem ser degradados seletivamentc usando en
zimas de restrição sensíveis à metilaçâo. Para isso, pri
meiro o plasmideo original precisa ter sido cultivado em
uma cepa de E coli na qual o DNA seja metilado no resí
duo de adenina na sequê ncia GATC, que ocorre natural
mente na reparação de DNA controlada por metila (ver
Capítulo 12). A sequência GATC metilada é clivada pela
enzima de restrição Dpnl , enquanto o DNA sintetizado
in vitro pela PCR nào é metilado e é resistente à clivagem
mediada pela Dpnl. Desse modo, durante a transforma
ção apenas o plasmideo mutado é introduzido na E coli.
Do mesmo modo que no sequenciamento do DNA,
a tecnologia para sintetizar quimicamente as moléculas
de DNA foi bem aperfeiçoada nos últimos anos, tanto
em termos de precisã o quanto de custo. Considere o
exemplo dos genes da insulina humana. No final dos
anos 1970, a construção do gene da cadeia B a partir de
18 oligonucleotídeos quimicamente sintetizados, com 10
a 12 nucleotideos de comprimento, e do gene da cadeia
A a partir de 12 oligonucleotídeos, com 10 a 15 nucleo-
t ídeos de comprimento, foi uma tarefa monumental. No
entanto, hoje os oligonucleot ídeos com dezenas a cente-
nas de bases de comprimento são baratos para construir
e constituem uma das ferramentas mais utilizadas para
manipulação das moléculas de DNA in vitro ( por exem
plo, na PCR e nas reações de sequenciamento).
Mais recentemente, a síntese química das molé -
culas de DNA com até 50 mil bases de comprimento
tornou -se viá vel. Os geneticistas conseguem projetar
uma molécula de DNA do zero e sintetizá-la para uso
subsequente nos organismos vivos. Essa capacidade
é ú til quando muitas mudanças na molécula de DNA
antes de sua introdu ção em um organismo transgê nico
são necessá rias. Do mesmo modo que nas tecnologias
de sequenciamento, os avanços na síntese química das
grandes moléculas de DNA têm potencial para trans-
formar a biotecnologia e a pesquisa biológica. Em 2008,
o genoma inteiro de 582.970 pb do Mycoplasma geni
Uilium foi sintetizado quimicamente in vitro , clonado
em um vetor YAC e propagado na Saccharomyces cere -
visiae. Depois, o genoma sintético foi transplantado
para um citoplasma receptor do Mycoplasma , gerando
uma célula que usaria a informaçã o gen ética contida no
cromossomo sintético. Essa capacidade para sintetizar
moléculas de ácido nucleico do tamanho de um genoma
poderia revolucionar a biologia experimental.
Geraçã o de fungos transgênicos
Os transgenes podem ser introduzidos nas células
f úngicas de modo similar ao das bactérias usando um
sistema plasmideo desenvolvido para o fungo Saccha
romyces cerevisiae ( levedura do padeiro ). Alé m disso, o
569
DNA pode ser facilmente integrado no genoma de mui -
tos fungos por meio de recombinação homóloga , viabi
lizando a manipulação direta do genoma f ú ngico.
-
Plasmí deos de levedura Algumas cepas de 5L cerevisiae
abrigam um plasmideo circular de 6,3 kb que, em decor-
- rência de seu diâmetro aproximado de 2 pm, é conhecido
- como plasmideo 2-mícron. Esse plasmideo pode ser trans -
formado em um plasmideo recombinante pela inserção
- de transgenes. Uma origem de replicação da E coli,além de
- marcadores selecionáveis, também pode ser introduzida
-
no plasmideo 2 mícron, que já contém a origem de replica -
çào da 5. cerevisiae Figura 17.4). Com essas adições, o plas-
mídeo se toma um vetor de transporte, ou seja, um vetor
- que consegue se replicar em duas espécies —
nesse caso,
—
a E coli e a £ cerevisiae e, portanto, pode ser utilizado
para transportar sequências de DNA entre elas . Com um
vetor de transporte, as sequências de DNA podem ser ma -
nipuladas na E coli, onde a manipulação é mais fácil, após
o que os plasmídeos modificados podem ser transportados
para a levedura visando à expressão proteica heteróloga .
.
Integração do DNA no genoma da S cerevisiae Se o DNA
que é introduzido em um organismo não tiver origem de
replicação, ele se submete a um entre dois destinos: degra -
dação enzimática ou integração no genoma hospedeiro. A
degradação enzimática , realizada pelas nucleases comuns
nas células, vai eliminar o DNA introduzido. A integração
do DNA no genoma hospedeiro, por outro lado, permite
que o ácido nucleico introduzido persista na célula hos-
- pedeira. A integração é feita por meio de um entre dois
mecanismos de recombinação distintos: recombinaçáo
ilegítima ou recombinaçáo homóloga.
A recombina çáo ilegí tima integra o DNA intro -
duzido em uma localização aleatória e não homóloga.
Essa forma de recombinaçáo nào exige qualquer homo-
logia entre o DNA introduzido e o DNA gen ô mico no
qual o primeiro é integrado. Por outro lado, o segundo
mecanismo para integraçã o do DNA introduzido, a re-
combinaçâ o homóloga entre esse DNA introduzido e
a sequência gen ômica do hospedeiro, exige um tama -
MCS
-
Marcador
Marcador selecioná vel
selecioná vel da levedura
bacteríano
Orl
Oh da levedura
bacteriana
- .
Fig ura 17.4 Vetor de transporte para a E coli e a
Saccharomyces cerevisiae .
570 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

nho significativo da sequência de DNA comum entre as
duas moléculas recombinantes. As frequências relati
vas com que esses mecanismos ocorrem dependem da
espécie na qual o DNA é introduzido. Na maioria das
espécies dc plantas c animais, a recombinaçâ o ilegí tima
é o destino mais comum, embora existam t écnicas para
selecionar os indivíduos nos quais ocorreu recombina
ção hom óloga (conforme descrito mais adiante neste
capitulo). Nas espécies de bactérias e fungos, o DNA
introduzido frequentemente é recombinado no genoma
de uma maneira homóloga.
Os segmentos de DNA introduzidos na S. cerevi
siae tê m uma propensão a sofrer recombinaçâ o ho-
móloga. Uma molécula de DNA circular introduzida
pode recombinar por meio de um cruzamento simples
.
ou duplo ( Figura i 7.$a ) Em um cruzamento simples, a
molécula inteira do DNA circular introduzida é inte
grada no genoma da levedura sem nenhuma perda de
DNA genô mico. Se a recombinaçâ o de uma molécula
circular ocorre por meio de cruzamento duplo, apenas
o DNA entre as sequê ncias fianqueadoras homólogas é
integrado no genoma receptor e a integração é acom
panhada por uma perda concomitante do genoma do
DNA entre as sequências homólogas. Desse modo, a
recombinaçâo com dois cruzamentos resulta na subs-
tituição do DNA genô mico pelo DNA introduzido flan -
- queado pelas sequências homólogas.
A introdução de uma molécula de DNA linear em
vez de circular favorece a recuperação dos recombinantes
produzidos pelo cruzamento duplo, pois um cruzamento
simples vai provocar um evento de deleção que resulta
- em moléculas recombinantes sem uma grande parte do
cromossomo original e, portanto, propensas a serem le -
tais [Figura 17.5 b). As moléculas de DNA linearizadas re -
combinam em uma frequência maior que as circulares,
tornando a introdução de moléculas lineares o método
- preferido nos experimentos de recombinaçâo homóloga.
Tirando proveito dessa tendência de ocorrê ncia da
recombinaçâo homóloga na levedura, geneticistas es-
pecializados nesse organismo criam leveduras recombi
nantes pela inserção e substituição de genes. Os alelos
-
- de perda de função são criados pela substituição do ge-
ne-alvo com DNA heterólogo, frequentemente um gene
marcador selecionável, eliminando assim a produção
da proteína funcional do tipo selvagem pelo gene-alvo.
.
As inserções génicas que resultam na deleçào de toda
- a região codificadora do gene, criam alelos nulos que
não geram produtos proteicos. Esses alelos de inserção
frequentemente são chamados nocautes gé nicos ( ina -
tivaçáo génica ) , pois a inser ção "nocauteia" a função do

(a ) Recombina çâ o homóloga com molécula de DNA circular (b) Recombina çâo homóloga com molécula de DNA linear

Homologia coi
-
Plasm ídeo o gene alvo
2
Gene- ah/o
1 Cruzamento simples em Marcador selecion á vel
Marcador selecionável Plasm ídeo linearizado
1 / 2
Cruzamento simples em 1
X
Cromossomo da levedura Gene-alvo* Cromossomo da levedura
Parte do cromossomo
Plasm ídeo integrado 1 1 é perdida.
Plasm ídeo integrado
1
1 2 11 1 2
Gene alvo Gene alvo' Gene-alvo
O cruzamento simples resulta na integração do O cruzamento simples resulta na integração do DNA ntroduzido
-
DNA introduzido sem substituição do gene alvo. e na pe^da dos cromossomos distais ao sitio de Integração

Plasm í deo Gene-ah/o '

Cruzamento duplo em 1 e 2
Cromossomo da levedura
1 Cruzamento duplo em
2 I e 2
Plasm ídeo linearizado
X X
Gene alvo" Cromossomo da levedura Gene alvo'

1 1 , 1 1 ,
Gene alvo’ Gene alvo '

O cruzamento duplo na substituição do gene-aKio 0 cruzamento duplo resulta na substftulçáo do gene-alvo.

Figura 17.5 Recombinaçâo homóloga na levedura: cruzamentos simples versus duplos.
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa
gene, criando um alelo recessivo de perda de função. Por
outro lado, a inserção de um gene funcional, criando
frequentemente um alelo de ganho de fun ção, chama se - em uma posição aleatória nesse genoma Figura 17.6b )
ativação genica.
A facilidade com que os recombinantes hom ólogos
.
são gerados na S cerevisiae permitiu a produ ção de um
grande n ú mero de cepas de levedura para análise gené-
tica dos processos biológicos nesse organismo. Como
descrito em mais detalhes na Seção 17.4, os alelos de
perda de função de todo gene no genoma da S. cerevi
siae foram gerados e podem ser encomendados em um
.
estoque central. Esses estoques facilitaram bastante a
pesquisa genética ao livrarem os cientistas da necessi-
dade de produzir mutações nos genes de interesse no
início de cada experimento gené tico novo.
Observa çã o gen é tica A levedura do padeiro, 5. cerevi -
-
siae, exibe um alto n ível de recombinaçáo homóloga, permi
tindo que os pesquisadores criem nocautes génicos e outros
alelos sob medida.
Transformação do genoma das plantas
pela Agrobacterium
Nosso alimento é derivado principalmente das
plantas e os seres humanos vêm modificando geneti
camente as plantas desde o início da agricultura , apro-
ximadamente h á 10 mil anos. Na maior parte dessa
histó ria, o aprimora mento genético limitou -se aos cru -
zamentos entre espécies selvagens e domesticadas para
selecionar traços já presentes na natureza . As técnicas
recentemente desenvolvidas para introduzir nas plan
tas um DNA proveniente de muitas fontes acrescentou
uma nova dimensão à modificação genética das plantas
para fins agr ícolas. Por esses novos meios, a variação
gené tica disponível nas plantas tem sido ampliada para
incluir não só os genes de outra espécie de planta, mas
també m genes derivados de animais, fungos e bactérias.
O método mais utilizado para gerar plantas trans -
génicas aproveita o sistema de transformação natural
das plantas que evoluiu na bactéria do solo, a Agrobac
terium tumefaciens. Na natureza, essa bactéria é a causa
da doença galha - da - coroa , uma divisão celular descon -
trolada nas células vegetais. A doen ça resulta em tumo-
res {galL$ ), tipicamente na coroa ( crown , a base perto do
solo) da planta . Cepas selvagens da A. tumefaciens abri -
gam um grande plasmídeo (200 kb) chamado plasmídeo
indutor tumoral ou plasmídeo Ti ( Figura 17.6a ). Uma
parte do plasm ídeo Ti, uma regiã o chamada DNA de
-
transferência (T DNA ), é transferida da bactéria para o
-
n úcleo de uma célula vegetal. Mary Dell Chilton e cole
gas demonstraram de modo conclusivo a natureza dessa
notável transferência de DNA entre reinos no final dos
anos 1970, demonstrando que o DNA do plasmídeo Ti
da Agrobacterium pode ser detectado dentro das célu
las vegetais. Uma vez dentro da célula vegetal, o T- DNA
571
pode se recombí nar ilegitimamente com o genoma nu -
clear da planta , resultando em uma inserção do T-DNÀ
.
Partindo da perspectiva bacteríana, o resultado desse
evento de transformação natural é a expressão dos genes
-
no T DNA que codificam proteínas cujo efeito é fazer
-
que as células vegetais (1) dividam se de uma maneira
descontrolada e (2) produzam aminoácidos que somente
a bactéria consegue utilizar como fonte de energia. Ba -
- sicamente, as bactérias reprogramam as células vegetais
para se transformarem em fá bricas de alimento para as
bactérias. Os genes bacterianos que codificam enzimas
de biossíntese dos hormó nios vegetais fazem que as célu -
las vegetais transformadas produzam altos níveis de dois
hormó nios vegetais, auxina e citocinina, que por sua vez
provocam a divisão descontrolada das células vegetais,
-
.
resultando na formação de tumor ( Figura 17.6c) Os ou
tros genes no T DNA codificam enzimas de biossí ntese
-
da opina. As opinas, como a nopalina e a octopina , são
aminoácidos que não ocorrem naturalmente nas plantas;
portanto, as plantas não produzem quaisquer enzimas
capazes de metabolizar as opinas. Porém, a Agrobacte -
rium possui essas enzimas; consequentemente, as opinas
produzidas pelas células vegetais podem ser usadas como
fontes de carbono e nitrogénio pelas bactérias. Outros
genes no plasm ídeo Ti, mas não situados dentro da re-
gião do T- DNA, codificam enzimas necessárias para a
- transferência do T- DNA para a célula vegetal.
A análise de sequência revelou que os genes envolvi-
-
dos na transferência do T DNA estão relacionados evolu -
tivamente aos genes envolvidos na transferência do fator
F na £ coli ( ver Capítulo 6). Assim, a Agrobacterium de-
senvolveu um mecanismo para transferir o DNA para as
- células vegetais adaptando os genes normalmente envol -
vidos na conjugaçã o bacteriana. Um aspecto formidável
dessa transferência gênica entre reinos é que os genes no
T-DNA evoluíram para serem transcritos e traduzidos
eficientemente nas células vegetais, em vez das células
bacterianas. Na natureza , a Agrobacterium normalmente
transforma apenas as plantas; mas, em laboratório, a
bactéria tem capacidade para transferir DNA para quase
qualquer célula eucariótica, incluindo as humanas.
- Criação da plantas transg ã nkas Os cientistas podem
usar a Agrobacterium para transferir qualquer gene
desejado para as plantas removendo os genes produto-
res de opina e tumores , normalmente encontrados no
-
T DNA , e substituindo- os por DNA que codifica o gene
-
desejado. Depois, o T DNA transfere o gene desejado
para a célula vegetal, onde ele passa a se integrar ao
DNA genô mico da planta.
A Figura 17.7a retrata a maneira que o plasm ídeo
Ti é modificado para os procedimentos de transforma -
- ção. Primeiro, os genes indutores tumorais e os genes de
opina são delctados do plasm ídeo Ti, produzindo o que
.
se chama um plasm ídeo Ti “desarmado* Depois, o gene
de interesse é inserido entre as duas extremidades da re-
- gião do T- DNA, denominadas bordas esquerda e direita.
Essas regiões fronteiriças contém as sequências necessá *
 572 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(« )
Genes
de interesse inserido entre as duas sequências das bor -
, Borda direita das também será transferido. Assim como em qualquer
oncogén co
/ .>^
Produção
\
Produ
f ção de
dtocinina
C
Síntese do T-DNA
de opina (repetições
outro protocolo para construir organismos transgênicos,
um marcador selecioná vel é incluído (entre as bordas
de auxina I iimperfeitas
de 25 pb) esquerda e direita ), além do gene de interesse, para per -
Borda
esquerda Genes para mitir a seleção eficiente das plantas transformadas. Nos
do T - DNA \
Região T
transferência
experimentos com plantas, genes que conferem resistên -
(repetições conjugativa
imperfeitas cia a antibióticos ( inibindo a traduçã o no cloroplasto) ou
de 25 pb; herbicidas podem ser empregados como marcadores se-
lecionáveis. Os genes marcadores selecioná veis normal-
Plasm ídeo indutor tumoral ( TI ) mente sáo expressos usando uma sequência promotora
que confere expressão constitutiva, de modo que as plan -
Genes para tas transgènicas possam ser selecionadas em qualquer es-
catabolismo da opina
(necessários para a A
tágio de seu desenvolvimento.
utilização dos
aminoácidos)
y
/
Como o plasniídeo Ti é grande demais para ser ma -
nipulado com facilidade, a maioria dos protocolos experi-
Região de virulência mentais que utilizam a Agrobacterium constrói uma cepa
( genes necessários
para a transfer ência que abriga dois plasmídeos: um deles é um plasmídeo Ti
Ori
eficiente do DNA} desarmado e o segundo é um plasmídeo que contém as se-
0 DNA de transferènca ( T-DNA) contém genes bèossintéticos de quências das bordas esquerda e direita ladeando o DNA de
auxina e dtocinina e genes para a biossíntese dos aminoácidos. interesse Figura 17.7b ). Essa estratégia, separando os ele-
mentos funcionais do plasmídeo Ti em dois plasmídeos, é
(b) Agrobocterium tumefaciens Célula vegetal denominada abordagem biná ria. FJa resulta na transferên -
-
( 1 2 mferons de largura ) -
(5 50 mfcrons de largura) cia eficiente do DNA dc interesse para a célula vegetal c
Plasm ídeo TI em sua subsequente Integração no genoma da planta.
T- DNA
Diferentes das bactérias e leveduras, que sào orga-
nismos unicelulares, as células vegetais transformadas
precisam ser regeneradas em uma planta inteira a fim de
revelar os efeitos dos transgenes no fenótipo da planta.
Tradicionalmente, os dentistas tiram proveito de uma
característica exclusiva do desenvolvimento vegetal, a
totipoté neia da maioria das células vegetais: sujeita às
Proteínas condições ambientais e hormonais adequadas, uma planta
de virulência
normal inteira pode ser regenerada a partir de uma única
célula vegetal isolada. Desse modo, após a infecçào das
-
Um T DNA de fita simpées é transfehdo para a cêiu a
vegetal e » ntegrado ao genoma nuclear da planta
'
células vegetais com a cepa de Agrobacterium modificada
e a seleção das células transformadas com base no gene
marcador selecionável, as plantas da progénie podem ser
regeneradas a partir de células transformadas individuais
A expressão dos genps ( Figura 17.7c ). F.$sa técnica tem sido aplicada com êxito
biossintéticos da auxina e da
citodnina leva à dfcrisão celUar a uma ampla gama de espécies dc plantas com flores, in-
descontrolada e à fòrrra çáo cluindo espécies cultivá veis como arroz, milho e tomates.
do tumor, ascélulas tumcrais
produzem os arr moác dos
Os pesquisadores dc plantas que usam a Arabidop -
corr jns que a Agrcòaaernjm sis como um sistema modelo para estudar os processos
usa como fonte de carbono biológicos básicos procuraram um método de trans-
e ntrogênkx formação mais fácil, que n ão exigisse a regeneração a
partir de uma única célula transformada. Após tenta
rem várias técnicas diferentes, eles descobriram que
-
a técnica simples de imergir flores da Arabidopsis em

Figura 17.6 Doença galha -da -coroa provocada pela

Agrobacterium via transformação da planta.
rias para a transferência eficiente. Proteínas codificadas
pelos genes do plasm ídeo Ti fora do T- DNA reconhecem
sequências específicas nas bordas esquerda e direita e ca
talisam a transferência de uma fita simples do T DNA da
bacté ria para a célula vegetal; quando isso ocorre, o gene
uma cultura de Agrobacterium funciona surpreenden -
temente bem. Essa técnica permite que o T- DNA seja
transferido diretamente da Agrobacterium para o ovó-
cito do gamet ófito feminino. Nesse protocolo, as plan -
tas transgè nicas sã o selecionadas a partir de sementes
produzidas pela planta exposta à Agrobacterium .
- Muitas espécies de plantas sào suscet íveis à trans-
- formação mediada pela Agrobacterium. Se não forem, o
DNA pode ser introduzido diretamente em suas células.
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombí nante e genética reversa 573

(a ) Produção Síntese
decltocinina de opina
Produção
de auxlna Borda direita do T-DNA

Borda esquerda Genes para

Região T
do T- DNA transferência
,conjugatlva
Plasmideo indutor
tumoral (TI)

Região de
Genes para
virulência
catabolismo
de opina
^

Ori
i
A reengenharia do plasmideo Ti separa as sequências
responsáveis por transferir o T-DNA do próprio T-DNA.

/
Genes para a
transferência conjugativa
Marcador selecioná vel vegetal

Sequência promotora
Sequência termlnadora 3'

(por exemplo, resist ência a herblcldas)J

MCS (gene de
Interesse inserido)
Borda direita do T- DNA
constitutiva / /
Borda esquerda Região T
Regiã o de do T-DNA 7W /
virulências Kan"
(marcador
Plasmideo (Ti)
selecionável Vetor de
desarmado
(região T removida)
I bacteriano) transformação

' r - (Amp
'
”
marcador
selecioná vel
bacteriano)
Ori

O plasmideo'dpsarmado* contêm os genes necpssários Ori

para a virulência e a transferência conjugativa; sem a região O vetor de transformação contém a região T laceada
- -
T, ele não ê mais capaz de induzr a doença gaha da coroa. pelas sequências das bordas esquerda e direita

(b) O plasmideo desarmado e o vetor são transferidos para uma Agrobocteriom.

Agrobacterium Célula vegetal

Plasmideo
^
Ti desarmado *
Células de Crescimento Planta
cultura das plântulas transgénica

As células vegetais infectadas são cultivadas nomeo de cutura

selecionável contpndo herbicida e,depois da seleção,regenera-
das em plantas transgênicas.
Vetor de transformação

Os genes no plasmideo desarmado produzem proteínas conjugadvas

e de virulência que agem em trans nas sequências de borda do T-DNA
do vetor de transformação para efetuar a transferência do T-DNA, que
contém o gene de interesse inserido paia a céiu a vegetal

Figura 17.7 Reengenharia do plasmideo Ti para criar plantas transgènicas.

574 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Primeiro, as paredes celulares das células vegetais isola
das sào removidas enzimaticamente, após o que as célu-
las sào misturadas com DNA heterólogo e recebem calor
ou um choque elétrico para despolarizar a membrana e
facilitar a entrada do DNA. Uma vez dentro da célula, o
DNA tem o mesmo destino do DNA transferido para os
fungos, conforme descrito anteriormente. Nas plantas, a
recombinaçào homóloga é rara em relação à recombi -
naçào ilegítima, então o resultado mais comum é a in -
serção do DNA heterólogo em uma posição aleatória no
genoma. Em outra técnica, o DNA é introduzido nas cé-
lulas vegetais pelo bombardeamento de partículas, que é
o uso de alta pressão para disparar partículas microscó
picas revestidas com DNA nas células vegetais. As partí-
culas sào impelidas com força suficiente para penetrar a
parede celular e a membrana plasmática. Essas duas téc
nicas podem ser aplicadas a qualquer espécie de planta.
Observa çã o gen ética A transferência natural entre
reinos do DNA entre a Agrobacterium e as plantas pode ser
aproveitada para criar plantas transgênicas que expressam
genes heterõlogos.
Plantas transgê nicas na agricultura Os dois traços mais
comuns projetados nas safras transgênicas cultivadas
—-
hoje em dia são a resistência a herbicidas e a resistência
a insetos. Com as safras resistentes a herbicidas por
exemplo, as variedades vendidas como Roundup Ready
( transgcnica )
—os agricultores conseguem aplicar her
bicida a um campo para limpar as ervas aninhas do solo
e outras plantas que n ã o fazem parte da cultura sem
danificar a própria cultura. Isso reduz a necessidade de
arar as ervas daninhas no começo da estação. Menos
aragem resulta em menos perda de solo e também em
economia de consumo de combustíveis fósseis.
As culturas de algod ão e milho resistentes a inse
tos herbívoros são duas das culturas transgênicas mais
utilizadas. A resistência a insetos normalmente é con
ferida pela expressão de genes derivados da bactéria
Bacillus thuringiensis. Os genes que codificam aproxi-
madamente 100 toxinas de insetos, conhecidas como
toxinas Bt, foram identificados em diferentes cepas da
B. thuringiensis. As toxinas atuam perfurando os intes-
tinos de diferentes espécies de insetos e as vá rias toxi
nas possuem especificidades diferentes para o “ hospe-
deiro". As plantas transgê nicas que expressam os genes
que codificam as toxinas Bt sào menos palatá veis para
os insetos e exibem menos insetos herbívoros. Conse
quentemente, as plantas transgênicas que expressam os
genes da toxina Bt exigem muito menos aplicação de
inseticidas que as plantas não transgênicas, reduzindo,
assim, a carga de inseticida no ambiente.
Embora as toxinas Bt claramente diminuam a quan -
tidade de insetos, outros herbívoros, como os seres huma
nos, sào impermeá veis aos compostos. As propriedades
das toxinas Bt têm sido avaliadas há algum tempo. Os agri-
cultores orgânicos aspergem rotineiramente a B. thuringi
*Nota do editor: o Brasil é o segundo maior produtor de tramgénicok, produzindo milho, algudáo e soja , fic ando apenas atrás do» Estados
. .
Unidos. Fonte: < agncultura.ruirdbcjcom br>
- ensis diretamente em suas culturas para que atuem como
um inseticida "natural". Milhões de acres de milho, algo-
dão c batatas transgênicas expressando os genes Bt e de
soja resistente a herbicidas estão sendo cultivados atual-
mente nos Estadas Unidos* c em vários outros países.
Arroz dourado Embora muitas culturas transgênicas
utilizadas até agora tenham beneficiado principalmente
os agricultores no Primeiro Mundo, o potencial huma -
nitário da modificação das culturas para auxiliar os agri -
cultores de subsistê ncia nos países em desenvolvimento
é exemplificado pelo arroz dourado. O arroz ( Oryza
saliva ) é o principal alimento de primeira necessidade
- em grande parte do mundo. Como o óleo tende a ficar
rançoso, especificamente nos climas tropicais, o arroz é
- frequentemente moído até sua camada externa rica em
óleo ter sido removida. Infelizmente, o grão comestível
restante, o endosperma , carece de vários nutrientes, in -
cluindo a provitamina A. A vitamina A pode ser obtida
direta mente pelo consumo de produtos de origem animal
ou indiretamente das plantas que produzem carotenoi -
des, que são convertidos para vitamina A após a ingestão
e, portanto, são chamados provitamina A. A deficiência
de vitamina A resulta em cegueira e maior suscetibili-
dade a doenças, contribuindo assim para a mortalidade
infantil cm muitos países subdesenvolvidos. Estima-se
que a deficiência de vitamina A afete entre 140 milhões
e 250 milhões de crianças em idade pré-escolar, levando
a um n ú mero entre 250 mil e 500 mil casos de cegueira
anualmente. Como nenhum cultivar de arroz selvagem
ou domesticado produz provitamina A no endosperma,
as tecnologias recombinantes, em vez do programa de
cruzamento convencional, sào necessárias para produzir
arroz com endosperma contendo provitamina A .
Os cientistas sabiam que o endosperma do arroz sin -
tetiza geranilgeranil difosfato ( GGPP), um precursor na
- sí ntese dos carotenoides. O estudo da via biossintética do
carotenoide nas plantas sugeriu que cinco enzimas deri-
- vadas de plantas sào necessárias para converter o GGPP
para betacaroteno. No entanto, a descoberta de que uma
única enzima bacteriana (CRTI) poderia substituir três
das enzimas vegetais ( PDS, ZDS, CRTISO) simplificou
a estratégia de engenharia genética ( Figura 17.8a ) Então,.
em 2000, lngo Potrykus, Peter Beyer e colegas relataram
- que a adição de apenas dois genes, um gene derivado
do narciso chamado PSY e o gene bacteriano chamado
CRTI , resultava na produção de betacaroteno no endos-
.
perma do arroz ( Figura 17.8b) Esse resultado foi surpre-
- endente porque se previa que um gene chamado LCY
também seria necessá rio, mas aparentemente o gene
LCY endógeno do arroz já é expresso no endosperma.
Subsequentemente, o trabalho se concentrou em
adaptar o processo para que (1) o transgene fosse ex
presso apenas durante a formação do endosperma e
-
- somente no endosperma , ( 2) a síntese do betacaroteno
pudesse ser incrementada usando diferentes versões
dos genes, (3) o marcador selecioná vel pudesse ser re-
- movido das linhagens transgê nicas e (4) os transgenes
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 575

( a ) Sí ntese do GGPP necessá ria de provitamina A a partir de uma porção de

Nas bactérias Nas plantas
arroz dourado { Figura 17.8c) .
A pesquisa para produzir o arroz dourado teve fi-
Geranilgeranil difosfato (GGPP) nanciamento p úblico, em parte da Rockefeller Founda
tion, mas as patentes de muitas técnicas e ferramentas
-
PP utilizadas para gerar o arroz transgé nico são de proprie-
dade das empresas de biotecnologia. Felizmente, essas
1 PSY 1 | PSY empresas concordaram em permitir aos inventores do
2 |PDS arroz dourado fornecer tecnologia gratuitamente para
2 CRTI 3 |ZDS uso humanitário em países subdesenvolvidos. O arroz
4 |CRT1SO dourado é um exemplo de como as culturas personali-
Licopeno Licopeno zadas podem ser desenvolvidas para atender às necessi
dades nutricionais específicas e abordar os problemas de
-
J
3 {JLCY 5|aLCY, PLCY sa úde pública provocados pelas deficiências alimentares.
4
J p-HYD 6 j a -HYD, (J - HYD As plantas transgênicas têm sido amplamente acei
tas em algumas partes do mundo, mas foram levantadas
-
Betacaroteno OH muitas preocupações a respeito de sua introdução. Al
guns críticos temem que os transgènicos possam afetar a
-
HO
—
sa úde humana por exemplo, as pessoas poderiam ter
reações alérgicas ao produto proteico de um transgene.
Outra preocupação é que os transgenes possam “esca-
(b) Plasmideos recombinantes par" para o ambiente se as plantas da cultura transgênica
Sequência regulatória Gtl cruzarem com espécies relacionadas que crescem em
PSY do narciso CRTI bacterlano seu entorno. A probabilidade dessa ocorrência pode ser
Sequência T- DNA direito reduzida não cultivando plantas transgênicas em am -
regulatória Gtl y
-
bientes que abriguem espécies relacionadas com poten -
T ONA esquerdo / /
Região T .
cial para cruzamento As culturas transgê nicas devem
Plasmídeo GRI
ser testadas para amainar essas preocupações, mas pre
cisamos reconhecer que, embora as preocupações com
-
Primeira geração do arroz dourado (GRI): a fhoeno sjntetase as culturas agr ícolas transgênicas sejam válidas, elas são
(PSY) do narciso e o gene bacteriano (CRTI ) da fiwi igualmente aplicáveis ao cultivo de safras desenvolvidas
ureckyxya são conduzidos com as sequências regulatórias
do endosperma glute na- l (Gtl ). pelos m étodos de cruzamento tradicionais.
*
CRTI bacteriano PSY do milbo
Marcador Observaçã o gen é tica A construção das plantas trans
selecion á vel genicas introduz modificações genéticas precisas para satisfa -
T-ONA esquerdo -
T ONA direito zer determinadas necessidades agrícolas.
Regi ão T
Plasmideo GRII

Segunda geração do arroz docrado (GRft urr. gene PSY do Animais transg ènicos
milho foi trocado peio gene PSY do naicsa reforçando a
produção de betacaroteno Os protocolos para geração de animais transgé -
nicos sà o similares aos descritos para os fungos, mas,
(c) Aparência do arroz do tipo selvagem e transgé nico assim como nas plantas, a recombinação homóloga
ocorre com muito menos frequê ncia que a recombi
naçáo ilegítima ( isto é, recombinação não baseada em
-
homologia de sequência ). A Caenorhabditis elegans , a
Betacaroteno Drosophita e o Mus musculus ( camundongos) sào três
«r
produzido nõ dos animais modelos genéticos mais utilizados e pro-
endosperma
porcionam exemplos da variedade de mé todos disponí -
veis para a criação de animais transgènicos. A totipo-
-Tipo selvagem téneia não é característica da maioria das células; desse
( sem
betacaroteno) modo, os m étodos para produzir animais transgènicos
se baseiam na injeçã o de DNA em ovos, embriões ou
Figura 17.8 Geração do arroz dourado. células que irão originar os gametas, na esperança de
que o DNA injetado venha a se integrar ao genoma por
pudessem ser introduzidos nos cultivares de arroz uti- recombinação homóloga ou ilegítima.
lizados tipicamente pelos agricultores de subsistência Onde a injeçã o diretamente nos gametas não for
no sudeste e no centro- sul asiá tico e africano. Esses viável, o DNA pode ser injetado em células isoladas que,
aperfeiçoamentos levaram a linhagens transgênicas que subsequentemente, são transplantadas para um em -
forneceriam uma fraçã o substancial da ingesta diá ria brião. Então o embrião desenvolve uma quimera gen é-
576 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

tica, um organismo no qual algumas células té m um ge
n ótipo diferente das demais e vão transmitir transgenes
para a progénie apenas se as células germinativas em
brioná rias carregarem uma cópia do transgene. Assim
como os protocolos utilizados cm fungos c plantas, os
métodos para a produção de animais transgènicos va
riam de acordo com as características biológicas especí
ficas para cada tipo de organismo.
C elegans No verme nematódeo C. elegans , um pro
tocolo para a criação de animais transgènicos é injetar
DNA diretamente nas gò nadas dos hermafroditas du
rante o desenvolvimento do ovócito ( Figura 17.9 ). As
gò nadas são sinciciais, significando que as células go-
nadais conté m muitos n úcleos cada uma e uma grande
quantidade de citoplasma . No fim das contas, cada n ú-
cleo origina uma célula germinativa. Se o DNA injetado
estiver integrado ao genoma de uma célula germinativa ,
o mecanismo de integração quase sempre é a recombi
nação ilegítima. Muitas vezes, mas nem sempre, o DNA
- portamentaL em vez de se moverem em um padrão sinuoso,
os mutados tendem a rolar em círculos apertados. Os ani -
- mais com várias cópias desse alelo mutado dominante não
sobrevivem, então ele serve como um " marcador" que se -
leciona os concatâmeros entre os transgenes.
- Drosophila Nos anos 1980, Gerald Rubin e Allan Spra -
- dling demonstraram que os elementos P transpon íveis,
uma dasse de transposons, ofereciam um meio efi-
- ciente para criar Drosophila transgénica, na maioria dos
casos a simples inserção de uma cópia do DNA sendo
- transferido (ver Capítulo 15 para obter uma descrição
dos elementos P ). Sua ideia era utilizar a atividade en -
dógena dos elementos P para transpor os transgenes
para o genoma (Figura 17.10).
Com base em seu conhecimento da transposição do
elemento P, Rubin e Spradling argumentaram que po -
diam substituir grande parte do DNA do elemento P por
- DNA exógeno, contanto que (1) a transposase, a enzima

é inserido como um concatâ mero, isto é, como vá rias

0 elemento P usado como vetor contém o gene de interesse e
cópias em tandem do DNA inserido. Os concatâ meros .
também o gene rosy que confere a cor dos olhos do tpo
4

sào indesejá veis porque resultam em n íveis anormais de selvagem, mas não possu transposase funcional. Um segundo
expressão gênica , seja porque as cópias adicionais pro - óeo fornece a atMdade transposase em trans.
plasmt
duzem excesso de produtos génicos ou em decorrência Vetor plasmí deo Segundo pJasmfdeo
dos efeitos do silenciamento gênico mediado por RNA Gene de Interesse
e desencadeados pelas repetições no concat âmero (dis - Transposase do
3' Sequência elemento P
cutido no Capítulo 15). Por outro lado, o DNA injetado v, terminadora
pode existir como conjuntos extracromossòmicos que U Sequências
nào estão integrados ao genoma e que podem não ser * '
finais repetidas
3' invertidas do
Gene
rosy 4

segregados adequadamente durante a mitose. \ \ elemento P

Assim como acontece com outros sistemas para Arryf
transferência génica, um marcador selecioná vel é em
butido no DNA injetado para facilitar a identificação das
- Ampa
Ori
3*
Õri
Plasmideos injetados
células que foram transformadas. No C elegans , um alelo simultaneamente nos
-
mutado dominante do gene roller 6 ( especificamente o
Aov/ eOrfsàcpa aa - embriões rosy
-
rol 6( sul006) ] pode ser utilizado, fazendo que os animais propaça çàodos rosy Irosy '

portadores desse alelo mutado exibam um defeito com - plasmideos nas bactéras
A atividade transposase
O DNA é Injetado na gónada. insere o elemento P.

rosy rosy
Ocorrem eventos de feminino masculino
integração em algumas
células orglnando x
gameias, o que leva a
uma parte ca p énie
0 DNA injetado no sincício da gônada pode ser
incorporado aos ovócitos após a celulariza çâa
como gene rosy * eo ^ Acasalamentodas
gene de nteresse. fémeas injetadas com
t A J t machos rosy / rosy\
Lí

rosy ~ rosy rosy 4

rosy 4
rosy ~
Espermatozóide Ovócitos
O OlA pode ser integrado, muitas vezes como um concatâmero,
v m #1 n J
no genoma njcèar dos precursores germinativos
A progé nie com olhos vermelhos deve ter herdado um transgene
rosy de complementaçâo e também o gene de interesse.
4

DNA genômico Concatâmero

dos transgenes
Figura 17.10 Transformação mediada pek) elemento P
Figura 17.9 C. elegans transg è nico. na Drosophila .
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 577

que controla o movimento do elemento P, fosse forne- Gene end ógeno do hormônlo do crescimento do
cida; e (2) as extremidades do elemento P fossem manti - salmão vermelho
das, já que eram necessárias para o reconhecimento pela Os elementos potenciadores do
transposase. Duas moléculas de DNA , uma consistindo gene do hormôrio do Gene do
crescimento do sal mio vermelho hormônlo do
cm um elemento P modificado e a outra , uma molécula são responslvos à luz e advos crescimento do
de DNA codificadora da transposase, mas sem as sequên - apenas na primavera e no verão
1A Í A 5'
salmão vermelha
cias necessárias para a transposição, são injetadas simul - box UTR
taneamente em um embrião de Drosophila. Os elementos
P modificados são induzidos a se inserirem no genoma Combinação dos
fragmentos génicos
em posições aleatórias pela ação da transposase. Nor- in vitro usando
malmente, somente um único elemento P é inserido, evi - Gene projetado do salmão vermelho tecnologia de DNA
recomblnante.
tando os problemas associados aos conjuntos concatemé-
Os elementos pctenciddofes Gene do
ricos observados no C elegans transgênico. Essa estratégia
lembra o uso da Agrobacterium para transformar plantas,
-
do gere metaioOoneina beta
do salmão vermelho ativam a
hormônio co
crescimento do
já que também utiliza um sistema biológico que evoluiu expressão gênèca oano Inteiro. salmão vermelha
TATA 5*
para recombinar o DNA no genoma de um hospedeiro. , box UTR .
Como os elementos P transpõem apenas nas célu-
las germinativas da Drosophila , a injeção é feita em um DNA Injetado
embrião em estágio inicial, visando às células que vão no óvulo do
salmão coho
originar a linhagem germinativa. Os embriões em está -
gio inicial da Drosophila são sinciciais e os núcleos na
extremidade posterior do sincício são mais propensos a
O DNA se
originar células germinativas. A mosca derivada do em - integra ao /1
brião injetado é, portanto, uma quimera em que a maior genoma i

parte do soma e alguns gametas são do tipo selvagem ,
mas alguns soma e gametas são transgénicos. Quando
a mosca injetada é acasalada com uma mosca injetada e
alguma cepa , os gametas em cujos genomas foi inserido
um elemento P vão produzir progénie transgénica.
Um marcador selecionável frequentemente utili -
zado na Drosophila é o gene rosy (17). No procedimento
que está sendo discutido, os embriões a ser injetados
são ry / ry e possuem olhos rosados, em vez dos olhos
vermelhos do tipo selvagem. Uma cópia do tipo selva -
gem , ry* , do gene é inclu ída no elemento P modificado,
al ém do DNA a ser transformado na mosca. Enquanto
as moscas derivadas dos embriões injetados terão olhos
rosados, alguns dos membros da progénie derivada de
gametas transgénicos da mosca terão olhos vermelhos
em decorrência da ação do alelo ry* no elemento P in -
serido. Como é característico dos transposons, os ele -
mentos P se inserem no genorna em posições aleatórias.
Vertebrados Uma abordagem geral para criar verte -
brados transgénicos é injetar DNA diretamente no nú-
cleo de um óvulo fertilizado, de modo similar ao que foi
descrito anteriormente para o C. elegans e a Drosophila .
O DNA injetado pode se integrar ao genoma em po-
sições aleatórias por meio da recombinação ilegítima .
Como o DNA se integra aleatoriamente ao genoma , o
transgene se torna inserido em locais diferentes nos ge -
nomas de cada animal. Em organismos como o salmão,
cada óvulo injetado tem potencial para se desenvolver
em um indiv íduo transgênico ( Figura 17.11 ).
Duas características desse método levam à variabi -
lidade na expressão do transgene . A primeira é que, em
virtude da integração dos transgenes como concatàmeros
multicópia, os níveis de expressão genica podem ser afe-
tados conforme descrito para o C elegans . A segunda é
—
nuclear /
S a l m ão c o h o Os óvulos
do tipo injetados se
selvagem
Salmão desenvolvem
em um salmão
adulto
Figura 17.11 Criação de salmã o transgênico pela
injeção de DNA nos ó vulos.
que a expressão do transgene pode ser anormal em razão
do ambiente cromossômico no qual ele está localizado.
Por exemplo, se o transgene for inserido na heterocro-
matina , a expressão gènica pode ser alterada conforme
descrito na variegação do efeito de posição na Drosophila
(ver Capítulo 15 ). Repare que o problema dos efeitos da
posição do transgene é compartilhado por todos os orga-
nismos transgénicos em que o transgene é integrado no
genoma por meio da recombinação ilegí tima. Embora os
efeitos da posição possam representar problemas na Dro-
sophila , no C elegans e nas plantas, eles são exacerbados
nos camundongos pelo maior tamanho médio dos genes
dos vertebrados e pela maior quantidade de heterocro-
matina nos genomas dos vertebrados. Para superar essa
variabilidade, foram desenvolvidos métodos para inserir
os transgenes com mais precisão nos camundongos.
Mus muscukis Os camundongos sã o modelos genéti -
cos importantes para as doenças e a fisiologia humana;
desse modo, a capacidade para criar camundongos
transgénicos habilita os cientistas a dissecarem não só
a base genética e molecular do desenvolvimento e da
fisiologia dos camundongos, mas também, consequen-
temente, muitos aspectos do desenvolvi mento e fisiolo-
gia humanos. Existem dois métodos para criar camun -
dongos transgénicos: uma abordagem direcionada e
uma não direcionada . Na abordagem não direcionada ,
578 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
o transgene é inserido aleatoriamente no genoma atra
vés da recombinação ilegítima; na abordagem direcio-
nada, o transgene é inserido em um l ócus específico
no genoma por recombinação homóloga . Este último
mé todo transformou o estudo da biologia dos camun
dongos, já que permite a criação de camundongos com
alelos específicos de perda de função (ou nocaute ) e de
ganho de função. Em 2007, Má rio Capecchi , Martin
Evans e Oiiver Smithies dividiram o Prémio Nobcl em
Medicina ou Fisiologia por seu trabalho que levou ao
desenvolvimento dos camundongos nocaute.
Problemas associados com as posições genòmicas
variá veis e com a expressão dos transgencs levaram os
geneticistas a explorarem a possibilidade de usar a re
combinaçào homóloga para a integração dos transgencs.
A recombinação homóloga fornece cepas de camundon
gos transgénicos mais coerentes e também facilita a cria -
ção de mutações em genes específicos do camundongo,
o que seria extremamente ú til para estudar a biologia
dos mamíferos. Assim, foram desenvolvidos métodos
para identificar os camundongos em que o DNA exó-
geno havia sido inserido no genoma por meio da re
combinação homóloga , ao contrá rio da recombinação
ilegítima, que é muito mais frequente [ Figura 17.12a ). A
identificação é obtida pela seleção do recombinante ho-
mólogo e, ao mesmo tempo, pela eliminação seletiva dos
transformantes resultantes da recombinação ilegítima.
A estratégia geral é similar à que foi descrita para a
recombinação homóloga na levedura. O vetor de trans-
formaçã o contém duas regiões de DNA homólogas ao
lócus-alvo que ladeiam um marcador selecion ável po-
sitivo. Um exemplo de marcador selecioná vel positivo
é o gene da Neomicina ( Neo ), cujo produto metaboliza
a droga G418, que bloqueia a tradu ção e é letal para as
células dos mam íferos. Um vetor contendo esses ele-
mentos é capaz de ser integrado no genoma por meio
de recombinação homóloga , porém, mais de 99% das
integrações vão ocorrer por meio de recombinação ilegí
tima. Para selecionar contra os eventos de recombinação
não homóloga , adiciona-se um marcador selecionável
negativo ao vetor fora de uma das regiões de homologia
com o gene-alvo. Um marcador selecioná vel negativo
utilizado com frequência é o gene da timidina cinase
( tk ), derivado de um vírus do herpes simples. A timi
dina cinase catalisa a adição de um fosfato à desoxitimi
dina, formando desoxitimidina monofosfato, que acaba
sendo convertido em desoxitimidina trifosf à to, um dos
substratos da síntese do DNA. Ao contrário da timidina
cinase dos mamíferos, a timidina cinase do vírus do her
pes simples também pode catalisar a adição do fosfato
aos análogos da timidina que provocam a terminação da
cadeia quando incorporados ao DNA. Como a timidina
cinase endógena dos mam íferos não reconhece os análo-
gos da timidina como substratos, apenas as células que
expressam o gene tk do vírus do herpes simples são sen-
síveis aos análogos da timidina. Desse modo, as células
que abrigam o gene tk virai serão selecionadas quando
colocadas em placas em um meio de cultura contendo
- o análogo da timidina chamado ganciclovir . Esses an á
logos da timidina também são utilizados como potentes
-
medicamentos antivirais, pois somente as células que
abrigam o vírus são sensíveis ao an álogo.
- Para que as células transformadas do camundongo
sobrevivam, elas precisam adquirir o marcador positivo
e perder o negativo. A ocorrência de um evento de re-
combina çã o hom óloga entre os marcadores negativo e
positivo é uma das maneiras possíveis para que o DNA
introduzido possa ser integrado a fim de produzir uma
célula que possua o marcador positivo e não o nega -
tivo. A seleção desse tipo de transformação se chama
seleção positiva- negativa. Um protocolo correlato, a
- - -
seleção negativa positiva negativa, em que os marcado
res selecionáveis negativos estão posicionados em cada
-
- extremidade do DNA introduzido, tem sido utilizado
com êxito para identificar os eventos de recombinação
homóloga nas plantas, como o arroz, e deve ser aplicado
genericamente a qualquer espécie.
Que tipos de células dos mamíferos são caracteristi -
camente visados para a transferência genica? O embrião
- mamífero no estágio de blastocisto consiste em uma
espera externa de células e em uma pequena reserva de
.
células dentro da esfera. No estágio de blastocisto as cé-
lulas internas, conhecidas como células- tronco embrio-
nárias (E$), sào totipotentes. A produçào de um camun-
dongo transgê nico começa com o isolamento das células
ES da cepa de camundongo a ser transformada ( Figura
17.12 b ). As células ES são cultivadas e o DNA é introdu
zido nelas, muitas vezes despolarizando transientemente
-
suas membranas para que as células se tomem permeá -
veis ao DNA. Depois as células sã o transferidas para um
meio contendo os agentes da seleção positiva e negativa
e as células transformadas nas quais ocorreu recombina -
ção homóloga são selecionadas.
As células ES transformadas selecionadas sào rein -
troduzidas em um blastocisto de um camundongo com
- um genótipo diferente do das células transformadas,
permitindo que a progé nie derivada das células ES
transformadas seja detectada. Por exemplo, os alelos
que conferem as diferenças na cor da pelagem são uti-
lizados com frequê ncia. O blastocisto, agora transpor
tando as células ES transformadas, é implantado em
-
- uma fé mea de camundongo substituta. Como apenas
- algumas das células ES no blastocisto hospedeiro são
transgé nicas, o camundongo que se desenvolve a par -
tir do embrião em que as células transformadas foram
introduzidas é uma quimera gen ética na qual alguns
- tecidos são derivados das células ES transformadas e
outros tecidos são derivados das células ES do hospe-
deiro. Os animais quimé ricos podem ser rapidamente
identificados por sua cor de pelagem variegada. Espera-
-se que pelo menos parte dos gametas da prole quimé-
rica do camundongo hospedeiro venha a ser derivada
de células ES transformadas, de modo que alguns ca -
mundongos na geração subsequente venham a ser he-
terozigotos para a mutação provocada pelo evento de
recombinação homóloga. Se dois membros heterozigo-
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 579

(a ) Criar o a leio nocaute pela recombinaçáo homóloga nas (b) Gerar camundongos nocaute a partir das células ES .
células-tronco embrionárias .
Homologia com o gene CFTR

—
Vetor linearizado / Resistência \ Tlmldina
Isolar os Wastoostos
é injetado nas
células ES
/à neomicina
1 1
\dnase
BBCFTRVcftr
|
Marcador Marcador CFTfr / CFTfr\ Injetar as células ES
Construir umclone bb \
heterozigotas nos
contendo o gene selecionável selecionável \
\
positivo negativo Wastocistos hospedeiros,
CFTR do camundongo criando blastocistos que
e substituir a regiào sào qu meras genéticas
central por um gere
Trés destinos possíveis conterdo células do tipo
marcador seecionável seVageme células
positivo, rompendo o do DNA njetado. Quando sào utilizados os mutados hewozigotâs
gene 07??. mutados da cor da pelagerx
a prole quimérica é
mediatamente identificada
O Recombinaçáo O Recombinaçáo O Nenhuma 8_ * marrom; bb - preto
homóloga ilegítma recombnação Injetar bastocistos no
útero.
X
1
.
Resistente à neomlclna Resistente à neomlclna, Sensível à neomlclna,
resistente ao gancidovir sensivel ao gancidovir resistente ao gancidovir
Os camundongos da
progénie sào
quiméricos
Após a transformação e apiicaçáo da seleção
postNa e negativa, apenas as células que adquiriram Acasala'os camundon-
.
o marcador positivo {peoR) mas não o marcador
negativo { xirrvána anose do M9A vão sobreviver
gos quiméricos com os
do tipo selvagem. Se o
Camundongo trarsgene estiver
nocaute presente nascélulas
homozigoto germinativas,ele será
herdada
Selecionar as ,
células ES resistentes
à neomicina e ao
gancidovir

.
« r» «
CFTJr /CFnr
bb
cmr /cftr
Bb
•
cmr /cftr
Bb
Parreda progéreserá
heteraõgota para os
alelo5 nocaute e os
outros camundongos
serão liP sehagem.
°
I | Acasalar os heteroõgotos.
1

CFTR* /CFTR* CFTK /dtr cftr /cftr

Gerar camundongos
nocaute homozigotos.
Os recombinantes
homólogos serã o
heterozigotos.
Figura 17.12 Recombinaçáo homóloga em camundongos criando um alelo de perda de função no CFTR (regulador da
condut ânda transmembrana da flbrose cí stica ). As mutações no ortólogo humano são a causa da fibrose cística.

tos da progénie forem cruzados, podem ser produzidos
camundongos homozigotos para a mutação. As tecno
logias para a construção de outros mamíferos transgê
nicos, incluindo ovelhas, gatos, vacas, cavalos, macacos
e ratos, seguem um protocolo similar.
Observa çã o genética Os mamíferos transgênkos
podem ser criados pela seleção dos eventos de recombinaçáo
homóloga nas células-tronco embrionárias. Depois as células
podem ser reintroduzidas em um embrião a partir do qual se
desenvolve um animal geneticamente quimérico.
Recombinaçáo sítio- específica
- -
- Em alguns casos é desejá vel manipular os transge
nes após terem sido introduzidos em um organismo.
Por exemplo, a capacidade para remover o gene mar -
cador selecionável positivo após a seleção dos transfor -
mantcs mitiga uma das preocupações levantadas pelos
críticos das plantas transgénicas. Além disso, a manipu -
lação in vivo dos transgenes facilita a produção de aldos
condicionais dos genes cujo alelo nulo é letal. A capaci
dade para recombinar especificamente as moléculas de
-
DNA viabiliza a manipula ção dos transgenes in vivo .
580 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

V ários bacteriófagos usam sistemas de recombina - (a )

-
çà o sí tio específica durante seu ciclo de vida , .seja para LoxP LoxP LoxP LoxP
recombinação intramolecular dentro do genoma bac -
teriófago, seja para recombinação intermolecular nos
.
genomas hospedeiros Esses sistemas de recombinação
l
podem ser aproveitados para produzir moléculas de
DNA recombinante in vitro e para recombí nar moléculas
.
de DNA in vivo Os sistemas de recombinação sítio -es - Recombinase
pecíficos dos bacteriófagos possuem dois componentes: Cre
(1) as sequências de DNA no genoma bacteriófago idê n
ticas às sequ ências no genoma bacteriano alvo e (2) uma
- Recombinase
Cre
enzima , frequentemente chamada recombinase ou inte
grase, que sc liga às sequências de DNA idênticas e ca
-
-
+
DNA interveniente é excisado. DNA interveniente tem
talisa sua recombinação. Dois sistemas de recombinação a sua orientação invertida .
dos bacteriófagos, um no bacteriófago lambda e o outro
(b)
no bacteriófago Pl, se mostraram particularmente valio - Recombinação Intermolecular
sos no desenvolvimento da recombinação sítio-específica
para uso em experimentos de biologia molecular. DNA do fago lambda (forma circular)
-
Um sistema de recombinação sítio específico de -
rivado do bacteriófago PI utiliza a recombinase Cre, , P attP
uma proteína codificada por bacteriófago que age na re - GCTT"rTT~ ATACTA À
C rjkAXA TtÀTT
combinação do DNA contendo sequências loxP ( Figura
17.13a ). Os sítios loxP são sequ ê ncias de 34 pb que con - DNA da £ coti X
sistem em duas repetições invertidas de 13 pb separadas
por um espaçador de 8 pb que proporciona assimetria B ittB B'
e são reconhecidos especificamente pela recombinase |Integrase
Cre. Esta se liga aos dois sítios loxP e catalisa um evento Pr ófago integrado DNA do fago lambda
de recombinação entre eles. Se os dois sítios loxP forem
repetições diretas, o DNA interveniente é deletado, ao
— CCT ÕCTTnTATACTAA
TAT6ATT
KiniininfTiíuu
^
B B'
passo que, se os dois sítios loxP forem invertidos entre
si, a sequência interveniente é invertida. Recombina çã o intramolecular
-
O sistema de recombinação Cre lax foi adaptado Prófago integrado
para recombinar o DNA in vivo nos organismos trans-
gênicos. Por exemplo, os sítios loxP são adicionados às
extremidades do DNA a ser deletado ou invertidos e in
troduzidos como um transgene em um organismo. Um
- P B'
.na «tf.fTjr.m
segundo gene que codifica a recombinase Cre també m
é introduzido no mesmo organismo. Nas células onde a X
4 >t 4«aaitaM f.Timni '
*
recombinase Cre é expressa, o DNA ladeado pelos sítios
B P1

loxP será deletado ou invertido. Integrase e excisionase

Uma razão pela qual um geneticista poderia querer
deletar um transgene após té-lo introduzido no genoma
Fago lambda excisado
é avaliar a funçã o do gene em determinados momentos P attP P*
e em determinados tecidos durante o desenvolvimento.
Por exemplo, se um alelo nulo de perda de função resul-
tar em letalidade embrionária, o papel do gene nos está
gios finais do desenvolvimento é dif ícil de avaliar. Uma
- DNA da E.coli
aaatfirwriiHil^J

abordagem para determinar a função pós-embrion ária B attB B’

de tais genes é complementar um mutado de perda de
função com uma cópia funcional do gene ladeado pelos
sí tios loxP. Nas células em que a recombinase Cre é
ativa, o transgene será adicionado, fazendo que as cé-
lulas e suas descendentes tenham um genótipo mutado.
Se a recombinase Cre for conduzida por uma sequ ência
promotora que confira uma expressão induzivel ou que
seja temporal ou espacial mente restrita, pode ser criada
uma quimera gen ética, permitindo uma avaliação da
função gênica em determinados tecidos.
Uma segunda aplicação é a remoção dos marcadores
selecioná veis nos organismos transgênicos. Uma objeção
Figura 17.13 Sistemas de recombinação sítio-específicos
dos bacteriófagos.
ao uso desses organismos na agricultura é que algumas
cepas transgênicas contêm um marcador selecioná vcl que
confere resistência a antibióticos, a qual poderia se espa -
lhar na população natural. Os genes marcadores selecio-
ná veis de resistência a antibióticos foram utilizados para
selecionar o organismo transgé nico, mas não são mais
necessários, já que o organismo transgénico foi identifi -
cado. Uma estratégia para eliminar o marcador selecio-
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombinante e genética reversa
nável é ladear o transgene indesejado com sítios loxP em
uma orientação repetida direta. Uma planta contendo o
transgene é cruzada com outra planta Lransgénica expres-
sando a recombinase Cre, e o transgene indesejado é de-
letado na Fr Depois é possível segregar o transgene que
codifica a recombinase Cre para longe do transgene dese
lado em operações subsequentes.
Além da recombí naçào in vivo das moléculas de
DNA, os sistemas de recombinação sitio específica
podem ser utilizados para manipular o DNA in vitro.
Um sistema de recombínaçào do bacteriófago lambda foi
adaptado para essa tarefa. Lembre-se de que, durante o
ciclo de vida lisogônico, o genoma do bacteriófago lambda
é integrado ao genoma da £ coli hospedeira (ver Capítulo
6). A integração é mediada pela proteína integrase codifi -
cada pelo bacteriófago lambda, que reconhece sequências
de DNA praticamente idênticas no genoma do bacterió-
fago lambda ( onde a sequência é identificada como fogo
de acoplamento ou attP) e no genoma da £ coli ( onde a
sequência se chama bactéria de acoplamento ou attB). A
integrase medeia a recombí naçào sítio-específica entre
.
as sequ ências (Figura 17.13b) As sequências attP e attB
compartilham 15 n úcleotídeos idênticos, mas diferem
quanto aos três nucleotídeos flanqueadores em ambos os
lados, dependendo de a sequência ser attP ou attB. Desse
modo, após a recombínaçào entre os sítios attP e attB, for-
ma -se um sítio híbrido ( parte superior da Figura 17.13b).
Uma proteína adicional codificada pelo bacteriófago
lambda, a excisionase, é necessária para agir com a inte
grase na recombinação reversa que excisa o bacteriófago
lambda do genoma da £ coli. A capacidade para inserir e
excisar do genoma bacteriano permite que o bacteriófago
lambda passe por um ciclo de vida lisogênico ou lítico (ver
Capítulo 14). Uma vez que o sistema de recombinação
sítio-específica requer apenas proteínas codificadas pelo
bacteriófago lambda e sequê ncias de DNA curtas, o sis-
tema pode ser adaptado para recombinar quaisquer mo
léculas de DNA . A recombinação é obtida adicionando
sequências attB ou attP específicas às extremidades das
moléculas de DNA a serem recombinadas e fornecendo a
enzima integrase purificada.
A Análise Genética 17.1 pede que você aplique algu
mas dessas ideias concebendo um modelo de uma do -
ença humana em um camundongo.
Observa çã o gen é tica Quando as sequénrias-alvo da
recombí naçào pelas enzimas dos bacterlófagos são incorpo-
radas aos transgenes, estes podem ser manipulados in vivo.
17.2 Os transgenes proporcionam
um meio de dissecar a função
do gene
A maioria dos transgenes descritos até agora neste
capítulo consiste em genes heterólogos transferidos
com a Finalidade de produzir um produto proteico ou
conferir um traço agronómico favorá vel. No entanto,
581
també m vimos que outro uso importante dos transge -
nes é para o estudo da função génica criando alelos de
perda e de ganho de fun ção, bem como para monitorar
os padrões de expressão gé nica. Esta seção descreve em
mais detalhes as maneiras que os transgenes podem re -
- velar a função genética.
Embora um conjunto quase ilimitado de transgenes
possa ser construído visando à análise genética, muitos
deles caem em duas categorias. Uma categoria consiste
em genes repórteres para investigar a regulação génica.
A fusão das sequências regulat órias de um gene com um
gene repórter fornece informações sobre onde, quando
e quanto um gene é expresso. Alguns genes repó rteres
facilitam a geração de imagens e a monitoraçào ao vivo
da expressão génica em tempo real. A segunda catego -
ria consiste em alelos de ganho de funçã o gerados pela
colocação de regiões codificadoras de um gene sob o
controle de sequências regulató rias derivadas de outro
gene. Um alelo constru ído dessa maneira pode ser ex
presso ectopicamente, significando às vezes ou nos lu
--
gares onde o gene n ão é expresso normalmente. O uso
de um ou ambos os tipos de transgenes pode comple -
mentar as análises dos alelos de perda de função forne -
cendo informações sobre como os genes normalmente
são expressos e as consequências fenotí picas de mudar
seu padrão de expressão normal.
- Monitora çào da expressão génica com
genes repórteres
Um gene pode agir como repó rter se o seu produto
puder ser detectado diretamente ou se for uma enzima
que produz um produto detectá vel. As sequências regu -
latórias do gene dc interesse sã o utilizadas para induzir
a expressão do gene repórter. Dois tipos de fusões de
- gene repó rter podem ser construídos: por traduçã o ou
por transcrição (Figura 17.14).
Em uma fiísào por transcrição, as sequências regula-
tórias que controlam a transcrição do gene de interesse
são fundidas diretamente com as sequências codifica-
- doras do gene repórter. Nesse caso, o gene repórter será
transcrito no padrão induzido pelas sequências regu-
latórias às quais é fundido. Na fusão por tradução, não
só as sequências regulatórias, mas também a sequência
codificadora do gene de interesse são fiindidas com o
gene repórter, de tal modo que a matriz de leitura para
a traduçã o é mantida entre o gene de interesse e o gene
repórter. Em consequência, a proteína repórter é fundida
por traduçã o com a proteína de interesse e a localização
da proteína repórter fornece informações não só sobre o
padr ã o de expressão espacial e temporal da transcrição,
mas também sobre a localização subcelular da proteína
de fusão. Nas fusões por tradução é preciso ter cuidado
para saber se a proteína de fusão ainda é funcional, já que
a adição da proteína repórter poderia interferir no dobra-
mento adequado ou na atividade da proteína dc interesse.
Alguns genes repórteres utilizados com frequência
estão representados na Figura 17.15. A escolha do gene
582 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Figura 17.14 Fusóes Gene no genoma eucariótko

genicas por transcrição Sequências Sí tio de início da
vtnus por traduçã o. regulatórtas 5' transcríçáo on
a montante ^
, ^ on 2 Éxon 3
Sequências 3'
a jusante
5‘ 1/TR tá \
Intron 1 íntron 2
Fusão por transcrição
Sequências Sítio de início
regulatórias 5 da transcrição Sequências 3'
a montante a jusante
amara I 3 UTR 1

Fusão por tradução

Sequências Sítio de início da
regulatórias 5' transcrição Sequências 3’
txon 3
a montante LU ^ , ^on 2
i
1
| a jusante
5 UTR PAAMM 3’UTR
T \
Intron 1 Intron 2

(a ) Sequências regulatórias (b) Sequências regulatórias PHABULOSA (c) Sequências regulatórias CaMV
Lin-3 controlando o gene controlando o gene repórter 35 S controlando o gene
repórter lacZ no C. elegans betagtkuronldase na Arofodopsls repórter ludferase no tabaco

(d) Sequências regulatórias RHODOPSiN contro- ( e) Neurònios doMus muscufvs expressando tr ês genes repórteres
lando o gene repórter GFP no Mus musculus fluorescentes diferentes, derivados da modificação do GFP

Figura 17.15 Genes repórteres.

 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombinante e genética reversa 583

AN Á LISE GENÉTICA
Modelos de camundongo para Investigação de doenças humanas são ferramentas de pesquisa va
liosas que podem ser empregadas para testar terapias e fármacos. Como vocé fana um modelo de
camundongo da doença de Huntlngton, que normalmente é provocada por uma mutação autossò-
mka dominante que consiste em uma sequência expandida de repetições trlnucleotídicas?

Estrat égias de solução Etapas da solu ção

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Este problema pergunta como construir uma cepa específica de camundongo
este problema e explique a natureza transgénico.
da resposta solicitada.
.
2 Identifique as informações críticas .
2 O modelo de doença desejado é o da doença de Huntington (HD), descrita
fornecidas no problema. como uma mutação autossômica dominante que consiste em uma sequência
expandida de repetições trlnucleotídicas .
Deduzir
.
3 Identifique o padrão de herança do .
3 Como a HD é dominante, um fenótipo deve ser evidente se um alelo mutado for
fenótipo da HD . introduzido no gonoma.
.
4 Avalie as maneiras em que o alelo HD .
4 Os camundongos transgénicos podem ser gerados pela integração aleatória de
pode ser transferido para os camun- um transgene our por outro lado, pela recombinaçáo homóloga que substitui o
dongos. gene endógeno por uma versão mutado.
.
f Escolha um método para gerar um
camundongo transgénico.
ArmadUha: Os transgmrs Integradas de modo alcató
5 Como queremos que o transgene seja expresso no mesmo padrão do gene HD
do camundongo do tipo selvagem, a recombinaçáo homóloga é a melhor abor -
dagem, pois o gene HD mutado estará no mesmo contexto genômico e será
-
rio podem ter yyiaçio nos pjdròrs dc ciprcs vki g ricA
^ expresso no mesmo padrão do gene do tipo selvagem.

Solucionar
.
6 Crie uma estratégia para substituir
o gene HD do camundongo do tipo
selvagem por uma versão mutado
do oeneHD humano.
Armadilh : Como um aldo funconal é
* sequências regulatórías do HD do camundongo {5' e 3 ’ do gene HD]
desejado o rtidftuJof selec orwivd positivo
^ b. O gene marcador selecionável positivo pode ser colocado a jusante do gene
rdodeveiotertMir rn funçãodoflcne HO
.
6 A abordagem de seleção positiva-negativa descrita na Figura 17.12 para produzir
um camundongo transgénico por recombinaçáo homóloga resulta em um alelo
.
de perda de função Essa abordagem precisa ser modificada para criar um alelo de
ganho dc função.
.
a Construa um vetor no qual um gene HD mutado humano seja ladeado pelas
.
.
HD, em uma posição improvável para interferir na expressão gênica do HD, ou
-
poderia ser removido usando a abordagem Cre tox descrita na Figura 17.13 .
c Outro camundongo transgénico expressando o gene humano do tipo sel
vagem controlado pelas mesmas sequências regulatórías proporcionaria um
-
controle útil para comparar os efeitos fenotipicos especí ficos induzidos pela
expressão do alelo mutado.

Para praticar mais, ver Problemas 3, 4, 10, 16 e 22 .

repó rter depende da questão biológica que está sendo
tratada. Com alguns genes repórteres, o teste para mo
nitorar a expressão gênica requer o sacrif ício do orga
nismo, enquanto a expressã o de outros genes repórteres
pode ser rastreada em um organismo vivo. Os genes re-
pó rteres normal mente exigem substratos que precisam
penetrar nos tecidos ou células onde esses genes estão
situados. Além disso, os genes repórteres variam quanto
à sua sensibilidade.
Um dos primeiros genes repórteres a ser desenvolvi
dos surgiu da pesquisa sobre o óperon lac na E. coii (ver
Capítulo 14). Para purificar e estudar a atividade da be-
tagalactosidase, codificada pelo gene lacZ , uma série de
bctagalactosidases foi sintetizada e testada em substrato.
- -
Duas betagalactosidases, abreviadas como X gal e ONPG,
- foram consideradas úteis. A betagalactosidase cliva o subs
trato incolor, ONPG, em um produto amarelo. Esse ensaio
-
é normalmente utilizado na medição in vitrv da atividade
da betagalactosidase. Por outro lado, o X -gal, também in -
color, é clivado pela betagalactosidase em produto azuL O
ensaio pode ser utilizado nas bacté rias in vivo, já que as cé-
-
lulas bacterianas podem absorver o substrato de X gal sem
- uma redução na viabilidade (ver Capitulo 16).
O gene lacZ pode ser utilizado em conjunto com o
substrato de X -gal como um gene repórter nos sistemas
animais (Figura 17.15a ). Entretanto, como as plantas têm
584 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
uma atividade endógena de betagalactosidase, o lacZ não
é adequado para estudar sistemas vegetais. Um sistema
alternativo é o gene uidA da £ coli que codifica a beta
glicuronidase, que cliva enzimaticamente um precursor
. .
incolor X -glic em um produto azul ( Figura 17.15b). De
modo oposto, como os animais possuem atividade endó-
gena de betagalactosidase, o gene uidA não pode ser uti-
lizado como repórter nos animais. Uma limitação desses
dois genes repórteres nos organismos diferentes das bac
térias é que, para o substrato ser absorvido efetivamente
nos tecidos internos, o tecido a ser corado precisa ser ba -
nhado em uma solução que mata as células.
A pesquisa sobre as reações que causam a emissão
natural de luz em alguns animais levou ao desenvolvi-
mento de genes repórteres que fazem a luz ser produ
zida em células vivas. Por exemplo, a luciferase, enzima
responsável pelo brilho dos vagalumes, catalisa uma rea -
çã o entre o substrato de luciferina e o ATP que resulta
na emissão de luz. As plantas transgé nicas que expres-
sam o gene da luciferase vã o emitir um brilho amarelo
esverdeado se receberem o substrato (Figura 17.15c). No
entanto, a luciferina não é fornecida a todas as células da
planta em igual medida, o que em muitos casos limita a
sua utilização como gene repórter.
O desenvolvimento da proteí na fluorescente
verde (GFP ) levou a um grande progresso na gen ética
e na biologia celular ao proporcionar um meio náo in -
vasivo de visualizar os padrões de expressão génica e
proteica nos organismos vivos ( Figura 17.15d ). O gene
GFP, derivado da água - viva Aequoria viciaria , é a fonte
de bioluminescéncia natural dessa espécie. Seu produto
proteico do tipo selvagem, que consiste em 238 amino-
á cidos, emite fluorescência verde ( um comprimento de
onda de 509 nm ) quando iluminado com luz UV ( um
comprimento de onda de 395 nm ), que nesse caso é o
*substrato", fornecido pelo laser.
Como a luz UV, com esse comprimento de onda
curto, pode ser nociva para os organismos ( por exemplo,
fazendo que os dímeros de timidina se formem no DNA,
conforme desento no Capítulo 12), o gene GFP do tipo sel-
vagem foi alterado para produzir variantes que respondam
aos comprimentos de onda de energia mais baixa. Um
aperfeiçoamento importante foi uma mutação que mudou
o comprimento de onda da excitação para 488 nm, cor
respondendo à luz azul e minimizando o dano potencial
às células iluminadas. A subsequente modificação da se
quência da proteína GFP lev ou à produção de versões que
emitem outras cores ( por exemplo, amarelo, dano, azul ).
Os genes que codificam proteínas repórteres fluorescentes
também foram isolados de corais marinhos e outras águas-
vivas. A disponibilidade de vários genes repórteres fluo-
rescentes possibilita a visualização da expressão de vários
genes simultaneamente em um único organismo (Figura
17.15e). Osamu Shimomura, Martin Chalfie e Roger Y.
Tsíen receberam o Prémio Nobel em Química de 2008 por
sua descoberta e desenvolvimento da GFP.
Os genes repórteres podem ser utilizados para dis-
secar as sequências de DNA regulatórias e identificar
sequê ncias específicas necessárias para determinados
aspectos da regulação génica. A abordagem geral é co-
- meçar com um clone em que estejam presentes todas as
sequências regulatórias necessárias para a expressão gê-
nica adequada e depois avaliar os efeitos da deleçâo e al-
teração de partes específicas do clone. Um exemplo desse
tipo de análise do gene even- skipped { eve ) da Drosophila ,
que é expresso em sete faixas no padrão de segmentação
- .
do embrião, é exibido na :igura 17.16 As deleções sobre-
postas abrangendo grandes regiões são analisadas antes,
com as regiões identificadas como importantes para a
manipulação gé nica dissecadas usando deleções meno-
res. O conceito é similar ao descrito anteriormente para
o mapeamento das deleções (ver Capítulo 7). Quando se-
- quências específicas necessárias para a expressão genica
são deletadas, a expressão do gene repórter será alterada
de modo correspondente. Se a sequência gen ô mica esti-
ver disponível em duas ou mais espécies relacionadas, os
elementos regulatórios podem ser previstos buscando as
sequê ncias que estão conservadas entre as espécies rela -
cionadas, usando um método conhecido como impressão
digital filogenctica (discutida no Capítulo 19). Essas aná-
lises da sequê ncia genômica iniciais podem direcionar os
testes experimentais subsequentes que usam genes re-
pó rteres para analisar os organismos transgénicos.
Observa çã o gen é tica Os genes repórteres sáo utiliza
dos para dissecar as sequências regulatórias e monitorar os
padr òes de expressão gênka nos organismos vivos.
Investiga ção da função génica com
genes quiméricos
Com as fusões génicas quiméricas, os cientistas
podem fazer que qualquer gene de interesse seja con -
trolado por sequências regulatórias ativas no organismo
que está sendo utilizado como hospedeiro. A Figura
17.17 mostra uma das maneiras para os experimenta
dores aproveitarem esse potencial de obtenção de infor
-
-
mações sobre a função génica. As mutações recessivas
de perda de função no gene eye/ess da Drosophila resul -
- tam no não desenvolvimento dos olhos. O gene eyeless
normalmente é expresso apenas nos discos imaginais
- do olho durante o desenvolvimento da Drosophila Os .
discos imaginais são grupos de células precursoras aban -
donadas durante o desenvolvimento embrionário. Elas
crescem por proliferação mitótica durante a vida larval
e mais tarde se diferenciam em tecidos corporais adultos
durante a metamorfose. Se o gene eyeless for expresso
ectopicamente em outros discos imaginais, como os que
normalmcnte originariam antenas ou patas, os discos
imaginais vão se diferenciar como tecido ocular. Esse re-
sultado indica que as células em qualquer disco imaginai
são capazes de se diferenciar nos olhos e que o produto
gênico eyeless pode promover o desenvolvimento dos
olhos a partir de qualquer disco imaginaL Desse modo,
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 585

Mapa de restriçã o do DNA genòmico do eve Smal Eli Pstl

1,65 1,5 0,05
Mlul Saci Ndel Asull EcoRV Kpnl BamHI Xhol Hindi Xlvol Hll XI Stil
Sítio de inicio da transcrição
7.3 6.5 6.3 5,9 5.45 4.65 3.8 2.9 2.6 1.75 1,15 0.6 0.3
I I i

Regi ão codificadora
Urra série de fusões transcriõonais com um gene do IQCZ
repórter kxJ.é criada usando enemas de restrição
para remover partes da sequência regulatória e
Construtos de deleçáo
analisada quanto ã expressão nas fatxas 2 e 3.
Construto Expressão na
de fusão faixa 2 faixa 3
5'A 4 4
5‘F + 4
5‘G 4 +
5'H 4
5*1
AB 4 4
AC 4
AD 1
4 4
AE 4 4
AF 4
AG 4 4

m
I 1
AI 4 4
AJ i i
i
i i
l t
A análise de deleçáo localiza módulos potenc adores para sequêndasde DNA especificas
i
2,9 1*7
r T— Sítio de in ício da transcrição
Módulos potenciadores do DNA genòmico do eve 3 8 1.0

Faixa 3 Faixa 2 Região

codificadora
dotocZ
Para testar os resultados da anái se dedeleçáo
uma fusão transcncional do módulo potenoackx
da *aixa 2 é analisado com o gene repórter lar?
Módulo Região
potenciador codificadora
da faixa 2 do lacZ

A Dotenõadora isolada da faixa 2

induz a expressão apenas na faixa 2.

Figura 17.16 Uso do gene repórter na análise da

sequência promotora do gene even -skipped ( eve).

quando o alelo eyeless é expresso ectopicamente como

mw
Faixa: 1 2 3 4 5 6 7

embriogénese leva à letalidade embrionária, um fenó -

uma mutação de ganho de função nos discos imaginais tipo que não é harmonizado facilmente com o de perda
inadequados, o fen ótipo resultante é o inverso do fenó- de função. Portanto, quando se consideram os alelos de

cos em vez de ausência de olhos.

—
tipo do alelo eyeless de perda de função olhos ectópi -
Nos casos em que os fen ótipos de ganho e perda de
função são complementares, a interpretação dos efeitos
da expressão ectópica é direta. Desse modo, no exemplo
anterior, o eyeless se revelou o gene e controle principal
na diferenciação dos olhos na Drosophila . No entanto, a
expressão ectópica dos genes também pode levar a fenó-
tipos enigmá ticos, que sâo mais difíceis de interpretar.
Por exemplo, a expressão ect ópica do eyeless durante a
ganho de função gerados pela expressã o ectópica, pre-
cisamos lembrar que os fenótipos representam o que o
gene é capaz de fazer quando expresso em determinados
contextos e não pode refletir a função normal do gene.
Observa çã o gen ética A construção de genes quiméricos
por meio da fusão das sequências promotoras heterólogas com
as regiòes codificadoras derivadas de outros genes pode criar ale
los de ganho de função que podem esclarecer a função gênica .
586 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Figura 17.17 Mutados de ganho de função gerados pela expressão ectópica .
17.3 A genética reversa investiga
a ação do gene progredindo
da identificação do gene até
o fenótipo
As tecnologias gen éticas que introduzem DNA nos
organismos também viabilizam um método de análise
genética conhecido como gené tica reversa. A gené
tica reversa busca , no fim das contas, identificar uma
sequência gênica começando com um fen ótipo mu
tado e investigando a fisiologia ou o desenvolvimento
anormal do fen ótipo como um indicador do gene ou
dos genes envolvidos na anomalia ( ver Capítulo 16). A
genética reversa funciona no sentido oposto, come
çando com uma sequê ncia gênica e procurando Iden
tificar um fenótipo mutado associado ( ver Figura 16.1).
parte do século XX —
Durante um longo tempo, a genética prospectiva
foi a abordagem primá ria e a ú nica, durante a maior
— a revelar a função gê nica. O de-
senvolvimento dos m étodos moleculares para a identifi -
cação gênica e os avanços nas tecnologias de sequencia -
mento hoje estã o tomando as abordagens de gen ética
reversa cada vez mais valiosas e comuns. São duas as
Murados de ganho
oe furção eyeíeu ,
nos quais o gene
-
gyfltes é exp esso
ecopicamente nos
a»scos imaginais
errados,
oesenvolvem onos
ectóprcos em
antenas, pataseasas
AOosqp/wtadofcpo
sekagem tem oihos
vermelhos.
Os olhos ectcpcos
sáo anatomicamente
normais, apesarde
suas locahzaçôes
ectópicas.
Os mutados de perda
de função eyeiess são
totalmente
desprovidos de olhos.
razões para essa mudan ça na ê nfase. A primeira é que
a enorme quantidade de sequências gen òmicas dispo-
n íveis aumentou em vá rias ordens de grandeza a quan -
tidade de sequências génicas conhecidas e apenas uma
fraçào delas recebeu uma funçào por parte da genética
prospectiva. Por exemplo, quando o genoma da E coli
foi totalmente sequenciado, 4.288 genes codificadores
de proteína foram identificados, mas apenas 1.853 des-
- ses genes haviam sido identificados anteriormente por
meio das triagens gené ticas prospectivas. A segunda
- razã o é que o sequenciamento genòm íco e as triagens
genéticas reversas também revelaram um grau de du-
plicação gê nica antes insuspeitado. As duplicações de
genes costumam resultar em redundância genética. Nas
- triagens gené ticas prospectivas, esses genes duplicados
- n ão seriam identificados, pois a mutação de apenas um
dos genes normalmente não resultaria em um fenótipo
mutado ostensivo. No entanto, as abordagens de ge-
nética reversa, nas quais as funções das duplicatas sáo
perturbadas, são particularmente convenientes nessas
situações para fornecer evidências da função gê nica.
A genética reversa começa com a criação de um
alelo mutado para um gene que é identificado apenas por
sua sequê ncia. A escolha das ferramentas mutadonais
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 587

depende bastante da biologia do organismo experimen
taL Nos organismos em que a recombinação homóloga
ocorre de imediato, as mudanças na sequência visada,
como as deleções, são o método preferido. Nos organiS
mos aptos à transformação, mas em que a recombinação
é rara, duas abordagens são utilizadas com frequência. A
primeira é gerar um grande conjunto de mutações por
inserção aleatória e depois fazer a triagem desses conjun
tos em busca de mutações no gene de interesse usando
técnicas baseadas na PCR. A segunda abordagem é apro
veitar um fenómeno de silenciamento génico conhecido
como RNA interferente ( RNAi ), induzido pelas molécu-
las de RNA de fita dupla. Nas espécies inaptas aos expe-
rimentos de transformação em larga escala , os métodos
não transgènicos de mutagénese podem ser utilizados.
Três técnicas básicas de genética reversa sáo descritas no
restante desta seção. (Os aspectos genómicos da gen ética
reversa são discutidos no Capítulo 18.)
Uso de mutados por inser ção na
genética reversa
As abordagens de genética reversa para a maioria
dos organismos genéticos modelo frequentemente uti
lizados empregam bibliotecas de nocaute , conjuntos
de mutados em que a maioria dos genes, ou todos eles,
sofreram mutação pela inativaçào (ou “nocaute") de sua
expressão. A maioria dos mutados nocaute é produ
zida pela inserção de pedaços exógenos de DNA no ge-
noma para gerar alelos de perda de função; desse modo,
a maioria dos alelos nas bibliotecas consiste em alelos
nulos. Por exemplo, os genetidstas da Saccharomyces
cerevisiae e da £ coii têm gerado sistematicamente alelos
de perda de função de todos os genes conhecidos da S.
cerevisiae e da £ coli por meio de recombinação homó-
loga. Nesses conjuntos de bibliotecas de nocaute, cada
cepa tem uma mutação simples em um gene diferente.
Em muitos organismos genéticos modelo, não é tec-
nicamente simples ou economicamente viá vel gerar mu -
tados de perda de funçã o para todos os genes de forma
sistemá tica. No entanto, se um organismo for fácil de
transformar, podem ser geradas populações de mutados
aleatórios por meio de inserções de transposons ou de
T-DNA ( no caso das plantas) (Tabela 17.2). Essas popu -
lações podem ser selecionadas quanto às mutações em
genes específicos. A triagem é feita usando técnicas ba -
- seadas na PCR com um primer específico para o gene
de interesse e um para o mutágeno insercional utilizado.
Para modelar sistemas genéticos como a Drosophila , na
' qual os elementos P foram utilizados como mutágeno
insercional, grandes populações de mutados gerados por
inserções foram caracterizadas a tal ponto que as muta -
ções em determinados genes podem ser encomendadas
- diretamente de um estoque central. Bibliotecas de no-
-
caute similares, baseadas em T DNA e inserções de
transposons, estão disponíveis para a Arabidopsis Essas .
bibliotecas de nocaute são um recurso inestimável para
os experimentos de gen ética reversa em larga escala que
visam elucidar a função de cada gene nos organismos
genéticos modelo (ver Capítulo 18). Um exemplo de
aplicação da genética reversa para determinar a fun ção
dos genes intimamente relacionados na Arabidopsis é
descrito no Estudo de Caso no final deste capítulo.
Observa ção gené tica A genética reversa Investiga a
função gêmea começando com uma sequência gêmea e pas
.
sando para a descoberta de um fenódpo mutado As bibliote-
cas de nocaute facilitam a triagem genética reversa fornecendo
alelos nulos para todos ou a maioria dos genes em um genoma.
-
Interfer ênda do RNA na atividade do gene
- No final dos anos 1980, pesquisadores introduziram
na petúnia um transgene da calcona sintetase na tenta -
tiva de aumentar a quantidade de pigmento floral. Para
sua surpresa, algumas linhagens transgênicas exibiram
perda completa de produção do pigmento (Capítulo 15).
Não só o transgene da calcona sintetase não foi expresso
adequadamente nessas linhagens, mas também o gene
endógeno da calcona sintetase foi silenciado, um fenô -
meno que eles classificaram como cossupressão. Subse -
quentemente, um fenô meno semelhante foi observado
nos sistemas f ú ngicos e animais. Esse m étodo de silen -
ciamento dos genes foi inicialmente chamado supressão
no Neurospora e nos animais com RNA interferente
( RNAi ). Hoje o fen ômeno é conhecido universalmente
como RNAi. Nos anos 1990, Andréw Flre e Craig Mello,
que receberam o Prémio Nobel em Fisiologia ou Medi
cina de 2006 por seu trabalho sobre o RNAi, emprega
--
ram uma abordagem genética para dissecar e elucidar o
mecanismo bioqu ímico do RNAi no C. elegans.

Tabela 17 *2 Abordagens de genética reversa em organismos genéticos modelo

Espécie Ferramentas de genética reversa
Escherichia coíi Nocautes por recombinação homóloga
Saccharomyces cerevisiae Nocautes por recombina ção homóloga
Arabidopsis thaliana Inser ções aleatórias de T DNA e transposons; T1LUNG; RNAi
Drosophila mekinogoster Linhas de inserção aleatórias do elemento P, RNAi
Coenorhobditis elegans Alelos de perda de função do RNAi
Mus musculus Nocautes por recombina ção homóloga; RNAI
588 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
O RNA de fita dupla (RNAds) pode agir como um
gatilho para a degradação não só do próprio RNA de fita
dupla, mas também de quaisquer moléculas de RNA que
sejam complementares ao RNA de fita dupla (ver Capí-
tulo 15). Um papel básico desse sistema dc silendamcnto
génlco é silenciar o DNA repetitivo. A transcrição de vá
rias cópias diferentes de elementos repetitivos frequente
mente gera moléculas de RNA de fita dupla, já que cole
tivamente as duas fitas de DNA repetitivo costumam ser
transcritas. Além disso, o RNAi protege as células contra
os vírus de RNA de fita dupla. Desse modo, o silencia-
mento génico mediado por RNAds age como um sistema
imune gen òmico no silenciamento das sequências de
DNA repetitivas e na invasão dos ácidos nucleicos.
Para tirar proveito da atividade endógena de RNAi
como uma maneira de silenciar os genes, os cientistas in -
troduzem RNA de fita dupla complementar em termos de
.
sequência ao gene-alvo ( Figura 17.18 ) O RNAm do gene-
-alvo será degradado por meio da ação das enzimas Dicer
e Argonauta (descritas no Capítulo 15), provocando um
fenótipo de perda de funçáo do gene- alvo. A eficiência do
silenciamento pode se aproximar à do alelo nulo, embora
muitas vezes os fenótipos induzidos representem uma
gama de fenótipos de perda pardal de função.
O RNA de fita dupla pode ser introduzido direta -
mente nas células ou organismos, pda injeçã o de RNA
de fita dupla, ou ind í retamente, pela infecçâ o com um
vírus de RNA de fita dupla. De forma alternativa, pode
ser criado um transgene que resulte na produção de
RNA de fita dupla, um método que traz a vantagem
adicional de ser hereditá rio. Nos animais, a introdução
temporária do RNA de fita dupla nas culturas celulares
tem sido bem-sucedida. Um dos m étodos para introdu -
O RNA de fita dupla pode ser introduzido por
\ 0 Transfecção
ou Injeção
1 direta do
RNAds 0 Introdu ção do
RNAds mediada
por virus
0 Transgene com
V repeti ção invertida
Transcrição
0 transcrito
RNAds
poce formar
0 Clivagem do
RNAds em RNAsi
.
V
urna estrutura
hairpin.
com 21 a 24
bases de
\ Argonauta O Os RNAm alvo
comprimento complementares
pela enzima Dicer
alvo
-
RNAm aos RNAsi são
clivados pela
Clivagem atividade s /Zcerda
enzima Argonauta
Figura 17.18 Genética reversa usando RNAi.
zir o RNA de fita dupla no C elegans é surpreendente -
mente simples. Normalmente, o C elegans se alimenta
da £ coli e quando a £ coli está produzindo RNA de fita
dupla, o mesmo será absorvido pelo C elegans e irá si
lenciar os genes em muitos órgãos de seu corpo. Embora
-
- nesse caso o fenótipo do RNAi não seja indefinidamente
- hereditá rio, os efeitos fenotí picos podem ser observados
- em várias gerações subsequentes, produzidas pela auto-
fertilização do verme que se alimenta da £ coli.
As vantagens da abordagem do RNAi para a genética
reversa incluem a facilidade e a rapidez de aplicação do
método. Ele permite que triagens genéticas em larga es-
cala sejam realizadas em culturas celulares ou em organis-
mos inteiros sem a trabalhosa tarefa preparatória de criar
populações mutagenizadas. Além disso, o silenciamento
génico mediado por RNAi transiente oferece um meio al -
ternativo de aplicar a genética reversa nas espécies para as
quais não existem protocolos de transformação estáveis.
Em uma abordagem relacionada, foram criados
RNAmicro sintéticos para direcionar a degradação de
RNAm específicos. Assim como o silenciamento gê-
nico mediado por RNAi, o silenciamento génico me-
diado por RNAmicro sintético aproveita o maquinário
de silenciamento génico endógeno ( ver Capítulo 15). Os
RNAmicro sintéticos são concebidos de acordo com os
princí pios derivados dos RNAmicro conhecidos, mas
são adaptados para coordenar a repressão da tradução
ou a clivagem do RNAm do gene de interesse.
Genética reversa porTILLING
A genética reversa também pode ser realizada nas
espécies que não podem ser facilmente transformadas,
contanto que a espécie seja passível de se submeter à aná
lise genética padrão. Uma abordagem para a genética re -
-
versa que pode ser aplicada a qualquer genoma é a lesão
local induzida e direcionada nos genomas (T1LL1NG,
.
do inglês targeted induced local lesions in genomes ) Em
um protocolo T1LLING, uma população de organismos
de uma cepa endogámica é mutagenizada aleatoriamente
.
no genoma inteiro ( Figura 17.19) São produzidas linha -
gens independentes em quantidade suficiente para levar
o nível da mutagénese próximo à saturação, na qual, em
condições ideais, cada gene é representado por vários
alelos mutados na população mutagenizada. Frequente -
mente, o mutágeno empregado no desenvolvimento das
linhas mutagenizadas é um composto químico como o
metanossulfonato de etila ( EMS), um potente mutágeno
que gera um espectro de alelos (Capitulo 16). O DNA das
linhagens mutagenizadas é selecionado sistematicamente
I
usando métodos baseados na PCR para procurar muta -
ções em um determinado gene de interesse.
Para cada indivíduo da população mutagenizada são
colhidos a progénie e o DNA. A geração derivada da po-
pula ção mutagenizada é frequentemente chamada gera -
.
ção M , (Figura 17.19a ) O DNA é isolado dos indivíduos
,
da M, ou das famílias de organismos da M2. Qualquer
mutação induzida na mutagénese será heterozigota (se o
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 589

(a ) As sementes são modificadas para produzir a gera çã o M „ ( b) As mutações em genes espec íficos são identificadas analisando
Cada membro da M , é heterozigoto para as muta ções em .
o DNA Isolado de cada fam ília da M 2 Por exemplo, uma fam ília
diferentes genes (coces ). representativa da M3 com um mutado segregado ( vermelho) .
Indiv íduos da M ,
¥ ¥ ¥ ¥ ¥

i1 à\
^ /
/
I
/
ik
Cada Indiv íduo da M, é propagado para produzir uma fam ília M,
l \
.
O DNA é coletado e selecionado quanto ãs mutações
no gene alvo pela amplificação baseada na PCR.
Famílias da M 2

r
t 1
t •2
r
\ • - •- <
Gene-alvo

t
^ »
T
*
r -
t
r
^
»
Produtos da PCR:
r* Alelodotipo G
I Alelo A
selvagem
Alelo do tipo
5 Indivíduos +/+
G
mutado
Alelo
do tipo
I
G
Indiv íduos / -
Cada faml a da M, segrega para as mutações em diferentes genes selvagem ç c
selvagem
.
(mutados homozlgotos em ccres) O estoque de sementes e as
amostras de DNA são coletados para cada família da . Os Alelo A
estoques de sementes representam um repositório demutados . mutado
[ Indivíduos -/-
Alelo A
Figura 17.19 Genética reversa por TILLING. mutado j

|Calor, hibridaçã o
DNA homod ú plex G DNA heterod ú plex
DNA for derivado de um indivíduo da M ) ou segregada , G
(se o DNA for derivado de uma fam ília da M2). Uma re - C T A
gião do gene -alvo é escolhida para amplificação baseada A
em PCR. Os produtos da PCR gerados na análise devem T C
conter a sequência do tipo selvagem e a sequência mu - A endonudease (Cell ) cliva
tado. Os que consistem somente no alelo do tipo selva- uma fita simples nos erros
gem podem ser distinguidos dos que consistem em uma no DNA heterod ú plex.
mistura do alelo do tipo selvagem e um alelo mutado. G G
Primeiro, os produtos da PCR sào desnaturados e c T A
deixados hibridar novamente, criando algum DNA ho - A
mod ú plex no qual as fitas são totalmente complemen - T C
tares se forem derivadas do mesmo alelo e algum DNA
heterod ú plex iFigura 17.19b). O DNA heterod ú plex é
composto de fitas em grande parte complementares, mas Fam ília da 1 2
I
3
Desnaturação por eletroforese

4 5
que contém um ou mais pares de bases que não combi - DNA não cortado
A maioria cas
fam’ as da Mj
nam, indicando que as fitas derivam de DNA contendo possui apenas
alelos diferentes. O DNA heterod ú plex pode ser diferen - DNA nâo cortado
(lipo selvagem).
ciado do homodú plex por uma diferença na migração DNA cortado
dos produtos durante a eletroforese ou pela suscetibili - Uma família
dade diferencial a uma endonuclease que cliva o DNA (veimdho) possu*
heterod ú plex nos pares de bases incompatíveis. O DNA DNA cortado
indicando uma
heterod ú plex se forma apenas nas amostras de DNA em DNA cortado mutação no gene
-
que uma mutação no gene alvo está presente. A triagem de interesse
da progénie a partir de vários milhares de indivíduos mu
tagenizados frequentemente permite a identificação de
-
vá rios alelos mutados do gene-alvo. Os indivíduos homo- TILLING costuma ser ú til para dissecar a fun ção génica,
zigotos ou heterozigotos para o alelo mutado podem ser mesmo nos organismos em que os nocautes génicos
identificados na fam ília adequada da Mr estão dispon íveis. Embora o TILLING tenha sido de-
Quando a mutagé nese química é utilizada para senvolvido para estudos em espécies genéticas modelo,
produzir alelos TILLING, ela resulta em alelos nulos e ele é adequado para qualquer organismo que possa ser
alelos de perda parcial de função. O espectro dos alelos mutagenizado e analisado geneticamente. Atualmente
de diferentes fenótipos produzidos pelas abordagens de ele está sendo aplicado a vá rias plantas cultivadas.
590 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

(a) DNA da armadilha da sequência potenciadora

Observa çã o gené tica 0 RNAi pode ser aproveitado
para criar rapidamente alelos de perda de função temporá - ATATA box é Gene Marcador
rios ou está veis por meio do silenciamento gé nico. 0 TllLING utilizada como uma repórter selecíonável
é uma abordagem da genética reversa para gerar e analisar sequência promotora ( betagaf )
quimicamente as mutações induzidas em todo um genoma. m ínima para recrutar Insere aleatoriamente a armadilha
o maquin á río basal da sequência potenciadora no
de transcrição. genoma via vetor de transposons
Elemento ou deT DNA -
Aprisionamento da sequência potenciadora regulatór í o
endógeno Gene X endógeno
O aprisionamento da sequência potenciadora
utiliza uma variação de uma biblioteca insercional para RNA endógeno
identificar os genes com base nos padrões de expres -
são. Essa abordagem combina a geração de uma grande
quantidade de mutados aleatórios por inserção com a
expressão de um gene repó rter ( Figura 17.20) Em sua .
aplicação mais simples, uma população de organismos
Se a sequência promotora estoer
transgè nicos é gerada pela inserção aleató ria de um integrada perto dos elementos
-
transposon (ou T DNA) contendo a sequência codifica
dora de um gene repórter fundido com uma sequência
- regula*órios endógenos, o gene
repórter será expresso cm urr .-
padrão induzido pelas sequên
promotora mí nima para a transcrição da RN A polime - cias reguatór as adjacentes.
rase IL Se a inser ção ocorrer perto das sequências regu
latórias potenciadora e silenciadora que podem agir em
- DNA
conjunto com a sequê ncia promotora mí nima do gene 1 l
repó rter, esse gene pode ser expresso em um padrão que RNA
reflita a capacidade regulat ória das sequê ncias de DNA 1 1
genô micas vizinhas. A sequência potenciadora ( ou as
Proteí nas
sequências silenciadoras) do DNA genômico adjacente
são cooptadas ou “aprisionadas" pela inserção para in - Expressão do betagai no Marcador
duzir a expressão do gene repórter. Embora a expres- padrão induzido pelo elemento selec íoná vel
são do gene repórter possa não refletir precisamente a regulatór ío endógeno
expressão do gene adjacente, a expressão do repó rter Se a amnadilha da sequência potenciadora perturbar a região
reflete pelo menos parcialmente o padrão normal de codificadora do gene. cria-se um aleto de penda de função No
entanto a nserção do vetor pode ocorrer em 5'ou 3’ até um gene
expressão gênica do gene adjacente. As técnicas de apri
sionamento da sequê ncia potenciadora foram aplicadas
- e 3irvda 'aprisionadas sequènoas potenctedcxas sem provocar
mutação de perda de função
pela primeira vez na Drosophila e hoje foram adaptadas
(b) Três padrões oe
a outros sistemas. Como elas identificam os genes pelos expressão gênica nos
padrões de expressã o gênica , as técnicas de aprisiona
mento da sequência potenciadora complementam as
- embr ôes da Ofosoptoa
observados rias linhas dc
armac ha da sequência
triagens genéticas prospectivas. polenuadora usando
A An* lis# Genetka 172 testa sua compreensão das téc - betagalactosidase como
gere repórter.
nicas analíticas de genética reversa discutidas nesta seção.

17.4 A terapia gênica usa tecnologia

de DNA recombinante
A capacidade para manipular a expressão gênica
pela introdução de um transgene levanta a possibili
dade de que as doen ças gen éticas humanas poderiam
ser tratadas pela introdução de uma cópia funcional do
gene mutado. O uso de genes como agentes terapêuti -
cos para curar ou aliviar sintomas de doença chama -se
terapia gênica. De uma perspectiva genética, a terapia
gênica é similar a um experimento de complementaçáo
gen ética no qual o gene introduzido pela terapia gênica
compensa uma anomalia gen ética na célula alterada.
Dois tipos de terapia gênica, classificados como terapia
gênica somá tica e terapia gênica terminal, são viáveis.
-
Figura 17.20 Aprisionamento da sequência
potenciadora para revelar os padr óes de expressão de
genes endógenos, (a) Estratégia para geração das linhas de
armadilha da sequência potenciadora. (b) Exemplos de linhas
de armadilha da sequência potenciadora na Drosophila .
A terapia gênica somá tica visa às células somáticas,
cujos descendentes não vão originar células germinativas.
Quaisquer alterações gen éticas induzidas nas células-alvo
serão passadas para as células-filhas por mitose, mas a
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 591

AN Á LISE GENÉTICA
Na busca do genoma do camundongo, vocé Identifica as sequências de tr ês genes octólogos ao
gene hedgehog simples da Drosophila: Sonic hedgehog, Indian hedgehog e Desert hedgehog. Des
creva a técnica de pesquisa que vocé utilizaria para aprender a função de cada um dos genes e se
essa função gênica é única ou redundante no camundongo.

Estrat é gias de solução Etapas da soluçã o

Avaliar
.
1 Identifique o tópico abordado por .
1 Esta quest ão pede a identificação da função dos genes conhecidos apenas pela
este problema e explique a natureza sequência .
da resposta solicitada.

.
2 Identifique as informações críticas .
2 Embora exista apenas um gene hedgehog na Drosophila, existem três genes
fornecidas no problema. hedgehog no camundongo, levantando a questão de saber se os três genes têm
funções diferentes ou se há algum compartilhamento de funções .
Deduzir
.
3 Considere as possíveis abordagens .
3 As funções dos genes conhecidos apenas pela sequência podem ser determina -
para descobrir as funções dos genes das pelas abordagens de genética reversa.
conhecidos apenas pela sequência.
.
4 Considere as possíveis abordagens .
4 As abordagens de recombinaçào homóloga podem ser empregadas para produzir
para a genética reversa disponíveis .
mutações de peida de função nos camundongos Assim como outras possibilida-
nos camundongos. des, os a leios de ganho de função podem ser construídos com genes quiméncos e
os padrões de expressão gênica podem ser deduzidos com genes repórteres.

Solucionar
5. Descreva como vocé criaria alelos .
5 A abordagem de seleção positiva-negativa descrita na Figura 17.12 pode ser
nocaute de perda de função de cada utilizada com um vetor de recombinaçào homóloga no qual a sequência codi-
um dos três genes por melo da re- ficadora dos genes hedgehog é substituída pela de um gene marcador seledo-
combinaçào homóloga. nável positivo.

.
6 Descreva uma abordagem genética .
6 As linhagens mutados homozígotas podem ser cruzadas e os fenótípos de cada
para determinar se os genes possuem .
um dos três nocautes simples podem ser examinados O cruzamento das linha -
funções únicas ou redundantes. gens mutados simples vai levar à criação de cepas em que combinações de dois
ou mais genes são inativas. A comparação dos fenótipos dos mutados simples
com os dos mutados múltiplos permite a avaliação dos genes quanto à exibição
de funções únicas ou redundantes .
.
7 Descreva como os experimentos . 7 A informação sobre a função gênica também pode ser obtida sabendo-se onde
usando genes quiméricos e genes e quando um gene é expresso, a localização subcelular do produto génlco co -
repórteres poderiam apoiar as con- .
dificado e os efeitos fenotípicos da expressão ectópica Como as sequências re -
clusões a que você chegou com base gulatórias gênicas eucarióticas podem se situar nos íntrons ou em grandes dis -
.
nos alelos nocaute tâncias a montante (5') ou a jusante (3') das sequências codificadoras, a melhor
abordagem é fundir o gene repórter na matriz com o gene endógeno usando
recombinaçào homóloga. As comparações dos padrões de expressão dos três
ArmacMKa: A npmúa dos grnes repórteres poder á ruo genes também podem guiar os ensaios para avaliar os fenótipos mutados.
refletir « expressóo normal do gene determinada«penmeo- As sequências codificadoras dos três genes hedgehog podem ser fundidas
tjinenee (por exemplo,por hibddaçAo com o flNAm intinA
corn sequências regulatórias derrvddds de outro gene que seja expresso em
um padrão diferente ou em níveis mais altos que a expressão do gene hedgehog
endógeno, com o fenótipo sendo avaliado. Os fenótipos complementares de
ganho e perda de função fornecem uma evidência poderosa da função gênica .
Para praticar mais, ver Problemas 11,12, 16 e 18 .
alteração não será herdada pela progénie do indivíduo lado, nas doenças do sangue, células de várias linhagens
submetido à terapia gênica somática. As células somá ti - hemopoicticas são as células-alvo; elas podem ser re-
cas específicas visadas dependem da doença em quest ão. movidas da medula óssea, tratadas e devolvidas para o
Por exemplo, nos indivíduos com íibrose cística , as cé- mesmo indivíduo. A terapia gênica somá tica transforma
lulas epiteliais dos pulmões representam um alvo lógico, o indivíduo tratado em uma quimera genética que tem o
já que os pulmões são gravemente afetados. Por outro transgene presente nas células- alvo, mas não em outras
592 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
células somá ticas ou nas células germinativas. A terapia
gênica som á tica tem potencial para ser utilizada no trata -
mento de várias doenças genéticas cujo fenótipo se toma
aparente no inicio da infâ ncia.
A estratégia alternativa para a terapia gé nica, a te-
rapia genica germinal, visa às células germinativas, que
originam os gametas. Como a terapia gênica germinal
altera as células germinativas, o transgene terapêutico
é transmitido para a progénie do indivíduo tratado. Os
-
dois tipos de terapia génica tém sido bem sucedidos nos
sistemas animais, mas por razões éticas apenas a terapia
génica somá tica tem sido tentada nos seres humanos.
Nesta seção, discutimos a terapia gé nica somá tica nos
seres humanos e descrevemos as modifica ções desses
protocolos , sugeridas pelos experimentos bem -sucedi-
dos da terapia gênica somá tica nos camundongos.
Terapia gênica humana
As principais dificuldades na terapia gê nica somá -
tica humana dizem respeito ao fornecimento dos trans-
genes para as células somá ticas de interesse e à expres -
são adequada do transgene nas células-alvo. O DNA
que codifica o gene precisa ser fornecido para as células
adequadas, passar pela membrana celular e entrar no
n úcleo e, uma vez l á dentro, ser expresso em um n ível
suficiente para proporcionar a fun ção gê nica normal.
— —
Em alguns casos por exemplo, nas doen ças hemopoi
éticas as células a ser tratadas podem simplesmente
- promotora da LTR retroviral não foi capaz de causar a
ser extraídas do corpo, tratadas in vitro e depois injeta -
—
das de volta. No entanto, em outros casos por exem -
plo, na fibrose cística, em que as células epiteliais pul-
—
monares sào visadas as células precisam ser tratadas
in situ , pois não podem ser removidas do paciente.
A escolha do vetor para levar o DNA às células é
fundamental. Os métodos de terapia gê nica costumam
aproveitar os vírus que desenvolveram mecanismos
para acessar tipos específicos de células. Basicamente,
os vírus são aproveitados para traduzir o transgene nas
células - alvo da mesma maneira que ocorre a tradução
do DNA entre as bacté rias, realizada pelos bacteriófa -
gos (ver Capítulo 7). Os ví rus podem ser “desarmados"
para que não tenham mais capacidade para provocar a
doença associada com seus parentes do tipo selvagem.
Tém sido utilizados vá rios tipos de vetores virais, in
cluindo os retrovírus gama , lentivirus e adenoví rus (Ta-
- foram discutidos cm relação à transduçâo bacteriana
bela 173). Cada um tem suas vantagens e desvantagens
para os protocolos de terapia gênica.
Muitos vetores virais levam os transgenes se inte-
grando ao genoma da célula - alvo. A integração propor-
Tabela 17.3 Ví rus utilizados como vetores na terapia génica
Tipo de vírus Integração no genoma
Retrovírus Integra se; mutágeno insercional
Lentivirus Integra- se; mutágeno insercional
Adenovírus Não se integra
Vírus adeno- assodado Epissomal, mas pode se integrar
ciona um mecanismo para a transferê ncia génica está -
vel e, assim, para a correçã o permanente do defeito A .
integração do vetor no genoma não ocorre sem riscos;
a inserção pode provocar uma mutação prejudicial,
um problema que tem atormentado a maioria dos ex -
perimentos de terapia génica humana até hoje. O tra -
tamento de uma doença grave no sistema imune, cha -
mada sindrome da imunodeficiê ncia combinada grave
(SC1 DS), é um exemplo. Os pacientes com SCIDS nào
tém capacidade para produzir uma categoria de células
sangu íneas, as chamadas células T, que são fundamen -
tais para a defesa do corpo contra infecções. Uma forma
de SCIDS se deve a mutações no gene que codifica a su -
bunidade gama (cadeia y ) do receptor da interleucina-2
e é ligado ao X. Em meados dos anos 1990, foi concebida
uma abordagem de terapia gé nica usando um vetor re-
troviral portador do DNAc da cadeia y conduzido por
sequências regulató rias virais. O retrovírus portador do
DNAc se ligou a repetições terminais longas ( LTRs; ver
Capítulo 12). Em um estudo, 9 de 10 pacientes foram
tratados com sucesso, exibindo sistemas imunes adapta
tivos e funcionais após a terapia gênica. No entanto, em
-
três pacientes um aumento descontrolado das células T
maduras, chamado leucemia linfoblástica T aguda, se
desenvolveu nos anos imedialamente subsequentes ao
tratamento. Em cada um desses indivíduos, o retrovírus
se inseriu no gene LM02 de tal modo que a sequê ncia
expressão desregulada do LM 02. Sabe-se que esse gene
é necessário para a diferenciação das células hemopoié -
ticas. Sua superexpressão, segundo o que se acredita, é o
que leva esses pacientes a desenvolver a leucemia.
Uma das preocupações levantadas com o uso dos re-
troví rus como vetores de terapia gênica é que eles podem
agir como mutágenos. Uma vez que essa possibilidade
foi reconhecida, os ensaios de terapia gênica da SCIDS
-
recém descritos foram suspensos. No entanto, a alta
proporçã o de indivíduos tratados cujos defeitos imunes
foram corrigidos no estudo sugere que a terapia génica
pode ser uma abordagem viável para tratar essas doenças.
Além das preocupações com a segurança e a eficá -
cia, o uso dos vetores virais apresenta desafios técnicos
oriundos da quantidade limitada de DNA que pode ser
acondicionada em um capsídeo virai (limites similares
no Capítulo 7). Na maioria dos casos, a quantidade de
DNA que pode ser acondicionada por um vírus é muito
menor que o tamanho de um gene humano tí pico. Por
exemplo, a região transcrita do gene CFTR abrange
aproximadamente 170 mil pb e resulta em um RN Am
Alvo Capacidade
Infecta as células que se dividem 8 kb
Infecta as células que não se dividem 8 kb
Infecta as células que não se dividem 7,5 kb
Infecta as células que nâo se dividem 4,5 kb
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa
processado de 6.132 pb codificando uma proteína de
1.480 aminoácidos. Uma vez que os vetores virais só con
seguem aceitar 5 a 10 kb de DNA, apenas um DNAc do
gene CFTR sem todos os elementos regulatórios da ex
pressão génica endógena pode ser acomodado em um
vetor virai. Na ausência dessas sequê ncias regulató rias
endógenas, a expressão da sequência que codifica o CFTR
é induzida pelas sequências regulatórias virais, que pode
riam não regular os transgenes de uma maneira adequada
para a função génica conveniente nas células-alvo.
A terapia gé nica baseada em vírus continua a ser
empregada em casos experimentais selecionados, ape -
sar dos fracassos passados e das permanentes preocu
pações com a segurança dos procedimentos. O sucesso
do tratamento dos pacientes com fibrose cística, SCIDS
e muitas outras condições hereditá rias humanas oferece
uma esperan ça de que a pesquisa permanente vai iden
tificar vetores eficazes para fornecer um tratamento que
seja sustentado, direcionado e seguro.
Curando a anemia falciforme
em camundongos
A terapia genica somá tica ideal seria uma que corri -
gisse a mutação específica que causa a doença genética, em
vez de apenas compensar o alelo mutado. O aumento da
compreensã o da biologia das células- tronco embrionárias
( ES) trouxe novas formas de terapia génica somá tica que
podem se aproximar do ideal no caso de algumas doen
ças genéticas. As células- tronco embrionárias são totipo-
tentes, significando que tém potencial para se diferenciar
em qualquer tipo de célula no corpo. Além disso, como foi
discutido na Seção 17.1, o genoma de uma célula-tronco
embrioná ria pode scr manipulado pela recombinação ho-
móloga. Desse modo, se as células- tronco embrionárias
pudessem ser isoladas de um indivíduo, as mutações gê
nicas dentro das células talvez pudessem ser corrigidas e
as células poderiam entáo ser induzidas a se diferenciar no
tipo de célula conveniente para tratar a doença genética.
Conforme ilustrado no experimento com camundongo
descrito a seguir, a capacidade para criar e manipular célu-
las- tronco embrionárias proporciona um meio de isolar as
células de um indivíduo, corrigindo as mutações nas célu
las e reintroduzindo as células “corrigidas" no corpo.
Em muitos casos, o diagnóstico de uma doença ge
nética só é feito no início da infância , quando o corpo
-
não possui mais quaisquer células tronco embrion á rias,
já que elas se formam apenas no início da embriogénese
(ver Seção 17.1). Como as células- tronco embrioná rias
podem ser obtidas de uma pessoa que não possui ne
nhuma? A resposta é criar células - tronco embrionárias
a partir de outras células do corpo.
Em 2006 e 2007, uma série de experimentos demons-
trou que os fibroblastos, um tipo de célula que ocorre no
tecido conjuntivo de camundongos ou do homem, po
diam ser reprogramados in vitro para se comportarem
-
como células tronco. Essas células reprogramadas foram
chamadas células- tronco pluripotentes induzidas ou iPS.
593
(A palavra pluripotente é utilizada porque os cientistas
- ainda não sabem se as células iPS são totipotentes. ) Essa
reprogramação das células diferenciadas foi obtida pela
- expressão de uma combinação de três a quatro fatores de
transcrição, incluindo Oct4, Sox2, c-Myc e KIf4. Os fato-
res de transcrição que foram utilizados normalmente são
expressos nas células- tronco embrioná rias e parecem ser
suficientes para induzir a reprogramação das redes trans-
cricionais de células somá ticas diferenciadas em redes ca-
racterístícas de células- tronco embrioná rias. Esses avan -
ços estabeleceram o cenário para a utilização das células
-
iPS na terapia génica. A prova de princí pio ( uma frase uti
- lizada pelos cientistas significando a prova de que a ideia
geral é válida ) foi fornecida usando um modelo de camun
dongo para anemia falciforme ( Figura 17.21). A estratégia
-
básica testada consistia em (1) colher células adultas, (2)
- reprogramar as células adultas em células iPS, (3) corrigir
o defeito genético por meio da recombinação homóloga,
(4) diferenciar as células iPS em precursoras hemopoiéti-
cas in vitro e (5) transplantar as células corrigidas para a
medula óssea do camundongo afetado.
O ponto de partida para esse teste da terapia génica
somá tica foi a criação de um modelo de camundongo
“ humanizado" para anemia falciforme, substituindo os
genes da alfaglobina humana pelos genes da alfaglobina
endógenos do camundongo e substituindo os genes da
-
f35 globina (falciformes) humana pelos genes da p-glo-
bina do camundongo. Os camundongos homozigotos
- -
para o alelo ps globina ( hf&/hfP) exibiram sintomas tí
picos da doença, incluindo anemia grave e deformação
-
dos eritrócitos. Os fibroblastos isolados da cauda do ca -
mundongo HfP/hfF foram infectados com retrovírus co-
dificadores dos fatores de transcrição Oct4, Sox2 e Klf4
e com um lentivírus codificador do fator de transcrição
-
c Myc. A expressão desses quatro fatores de transcri
ção resultou na reprogramação das células fibroblásti
-
-
cas em células iPS. Em ambos os lados do gene c-Myc
no lentivírus, foram colocados os sítios lox para permitir
que o gene fosse cxcisado do genoma quando as células
foram infectadas com um adenoví rus codificador da re-
combinasc Cre. Isso foi importante porque a expressão
-
-
permanente do c Myc predispóe as células a se torna
rem cancerosas. Embora os outros três transgenes não
-
tenham sido removidos nesse experimento, sua remoção
- por um mecanismo similar também é recomendada.
-
Para corrigir um alelo pA globina, um vetor de
transformação codificando o alelo [ - globina foi in
^ -
troduzido nas células iPS e foram criados recombinan -
tes hom ólogos resistentes a higromicina e ganciclovir
- usando o procedimento descrito na Seção 17.1. As célu -
las i PS corrigidas agora eram heterozigotas no lócus da
^ .
p-globina ( hf /hf }5) As células iPS hfP /hfF foram dife-
renciadas em progenitoras hemopoiéticas ( HPs, células
com potencial para se diferenciar em qualquer linha-
- gem hemopoié tica ) pela Infecçâ o com outro retrov írus
codificador do gene HoxB4 , que induz a diferenciação
das células- tronco embrionárias em HPs quando incu
badas com citocinas secretadas das células da medula
-
594 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Modelo de camundongo humanizado

com anemia falciíorme
(HbVWó5)

O O transplante comgiu as
•• O Coletar os. fibroblastos
células
hematopoi éticas nos da cauda
camundongos Irradiados, Cultivar os
curando os assim da fibroblastos.
anemia falcíforme. é possível acompanhar
as células HP com GFP Fibroblastos

Células HP
Htf / Hb* O De-diferenciar os fibroblastos
nas células-tronco
í potentes induzidas (Í PS);
plur
O Infectar com retrovírus infectar com três retrovlrus
Moloney expressando Moloney expressando os
HoxM GFP para genes Oct4, Sox2 e Klf4 e um
promovera Células iPS lentiv í rus expressando o
diferenciação das células Células iPS Htf / Hb* gene c-Myc (o gene c-Myc é
IPS nas células HP. Htr / HbA Células iPS
flanqueado pelos s ítios loxP).

Infectar com adenoví rus expressando

a recombinase CRE para remover o
S* G Substituir Hb* por Hb 4
via c -MYC das células iPS.
recombinação homóloga
y
* (abaixo) .
' iS

^
ay2 h0 h1 ph 2 Ph 3
J L|
* /£ Wb' DNA gen ômko do camundongo
/ Hó5 \ / DMA do camundongo
V f “] DfJA humano
O marcador se*eciorȇvei
PGKHygo pode sef removido
pea recombinase Ge. t
/ /
X •>
i Vetor-alvo da recombina ção
TK
Braço de Hb*
>
loxP
PGKHygro
loxP
> |
— ço
Bra de
h o mó l o g a

homologia 5* homologia 3'

do camundongo ( 1,7 kb) do camundongo (7 kb)
ay: M 0h 1 ph 2 0h3 ay PA „
n
I I I I

Figura 17.21 Terapia gen ética para camundongos com anemia faldforme.
^>
Hb* loxP
PGXHygro
^
loxP
AleloHÓ4 corrigido

óssea . As HPs hpA /hp* foram transplantadas de volta
nos camundongos /r/3Vfy3' nos quais as células endó-
genas hpVhp' da medula óssea haviam sido eliminadas
por radiaçã o, de modo que agora as HPs hpA/hp5 consti-
tu íam a fonte primá ria de células hemopoiétí cas. Nesse
experimento em particular, a sequência codificadora do
HoxB4 foi fundida por tradução com a da proteína fluo
rescente verde (GFP ), de modo que a atividade das HPs
hpA / hps podia ser monitorada pela presen ça das células
GFP* no sangue. Subsequentemente, por meio de todos
os testes fisiológicos, os camundongos que receberam
as HPs hpA/hpà foram curados da anemia falciíorme.
Esses experimentos nos camundongos proporcio-
nam uma prova de princí pio para o potencial terapê u -
tico da utiliza ção das células - tronco embnoná rias ou
das células iPS na terapia gé nica para corrigir defeitos
genéticos, mas pelo menos duas facetas da terapia gê-
nica continuam a causar preocupação. Problemas as-
sociados com o uso de retrovírus e oncogenes para
reprogramação precisam ser resolvidos antes de imple
mentar um protocolo de terapia génica em seres hu
manos. Alé m disso, a memó ria genética de sua origem
ainda não foi determinada. Como as pró prias células
de um indivíduo são utilizadas como fonte para a mo-
dificação genética, n ão h á impedimento decorrente de
incompatibilidade do sistema imune. No entanto, essa
abordagem se limita a doenças (como os transtornos
- sanguíneos) em que as células podem ser isoladas, gene -
ticamente corrigidas e reintroduzidas no corpo .
Observa çã o gen é tica A terapia génica somática é con -
cebida para corrigir defeitos genéticos nas células somátkas.
17.5 A clonagem de plantas e
animais produz indivíduos
geneticamente idênticos
Muitas plantas têm capacidade para a propagação
-- vegetativa ( assexual ), além da propaga çã o sexual. Por
exemplo, os bosques de álamo e aspen ( Populus sp.)
 Cap í tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 595

muitas vezes consistem em clones propagados vegetati

vamente, todos geneticamente idê nticos. Estima - se que
- Ovelha a ser donada
( Finn Dorset)
Mà e de aluguel
(Scottish Blackface )
alguns desses bosques clonais tenham pelo menos 10
*
mil anos de idade. Os seres humanos, tirando proveito
da capacidade das plantas para se reproduzirem vege -
tativamente, vêm propagando há séculos as plantas por
clonagem por meio das prá ticas agr ícolas. Nesses proto-
colos, os genótipos heterozigotos dos espécimes dese -
já veis para a agricultura são propagados intactos, sem a
Remover as células
das glâ ndulas 1 oRemover
óvulo.
mamárias.
segrega ção dos alelos que ocorre durante a reprodução
n
sexual. Os genótipos hetero2igotos costumam exibir
um vigor h íbrido, resultando em um alto rendimento
comparado às variedades endogâmicas.
Talvez o exemplo mais claro da propagação vege -
tativa agrícola seja o cultivo de uvas ( Vitus vinifera ), que Remover
foram domesticadas de 6 mil a 7 mil anos atrás. A maio - Célula
mamá ria
o núcleo.
ria dos cultivares de uva é altamente heterozigota, isto é, em
cultura. n úcleo.
possui dois alelos diferentes em muitos lócus genômicos.
Desse modo, quando são autofertilizadas ou cruzadas
com outros cultivares, observa -se a ampla segregação dos
genótipos e fenótipos na progénie. Como isso apresenta Injetar o n úcleo.
um obstáculo para controlar as propriedades das videiras
por meio do cruzamento, os cultivares que possuem fenó-
Eletrochoque para
tipos favoráveis são propagados por corte (ou seja, outras induzir a divisão
plantas são cultivadas a partir de pedaços das plantas ori - celular e aguardar
.
ginais) Na maioria dos vinhedos as videiras sào quimé- o desenvolvimen-
to até o está gio
ricas: os ramos sào geneticamente idênticos e escolhidos de blastocisto.
com base no fenótipo de seu fruto e as raízes, também
idênticas entre si, têm um genótipo diferente que é esco -
lhido para ser bem adaptado às condições de solo locais.
Vários cultivares de uvas para vinho remontam à
Idade Média e alguns provavelmente são ainda mais an -
tigos. Por exemplo, o tipo pinot foi descrito pela primeira
vez na Roma Antiga e acredita -se que tenha pelo menos
Implantar o blastocisto no
2 mil anos de idade. Embora a propagação clonal permita ú tero da máe de aluguel.
a manutenção de genótipos específicos, as mutações so-
—
má ticas decorrentes, por exemplo, de erros na replica -
çào do DNA e da atividade do elemento transpon ível —
podem se acumular ao longo do tempo e levar à variação
fenotípica. Assim, uma mutação em um gene necessá rio
para a síntese do pigmento levou à formação da variedade
pinot blanc, um cultivar de baga branca, a partir da varie
dade pinot noir, o cultivar ancestral de baga escura.
- Nasce'Dolly' uma
ovelhinha da raça
Ao contrário das plantas, a maioria dos animais Finn Dorset.

—
na natureza não se propaga facilmente por clonagem
mas há exceções. Por exemplo, algumas espécies de
ídeos se submetem a várias gerações partenogenéticas
af
(clonais ) na primavera e no verão, seguidas pela repro-
Dolly com sua màe de aluguel.

.
du ção sexual no outono Como a maioria das células
animais não é totipotente, com as células- tronco em
bríonárias sendo uma exceção, os animais n ão se rege-
neram imediatamente a partir de células simples. Desse
modo, as técnicas para clonagem de animais, especial-
mente de mamíferos, são consideravelmente mais com -
plicadas que as destinadas à clonagem de plantas.
Dolly, uma ovelha, foi o primeiro mam ífero clo-
.
nado No protocolo empregado para produzir Dolly,
um n úcleo diploide é isolado de uma célula diferenciada
Fig ura 17.22 Clonagem de animais por implantação
*
nuclear.
do animal a ser clonado ( Figura 17.22 ). Esse n úcleo, con -
tendo toda a informação genética nuclear do animal de
onde foi tirado, é injetado em um óvulo que teve seu
próprio n úcleo removido. O óvulo pode ser derivado do
animal a ser clonado (se possuir óvulos) ou de um indi -
víduo diferente. Se o transplante nuclear for bem -suce-
596 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

dido, o genoma do n úcleo doador vai controlar o desen
volvimento do embrião derivado do óvulo. O uso de um
n úcleo doador diploide significa que a fertilização com
um espermatozóide n ão é necessá ria para produzir um
n úcleo diploide no embrião; assim, a constituição gené-
tica do embrião será idêntica à do doador. No entanto,
tenha em mente que, embora o genoma nuclear seja ge
neticamente idêntico ao do doador, o genoma mitocon
drial é derivado do óvulo de aluguel. O óvulo diploide é
induzido então a começar a embriogénese e posterior-
mente implantado em uma mãe de aluguel. Se tudo cor-
rer bem, ele vai se desenvolver em um embrião normal
e vai ocorrer o nascimento de uma progénie normal.
Na maioria dos mamíferos, a frequência de sucesso
.
com esse protocolo tem sido muito baixa O óvulo de
Dolly foi o único entre 270 óvulos implantados que re
sultou no nascimento de uma ovelha. As células doa
—
doras têm sido derivadas de animais adultos a célula
doadora de Dolly foi uma célula da glâ ndula mamá ria
e, portanto, são células somá ticas altamente diferencia -
das em vez de células- tronco embrioná rias totipotentes.
- Nas células somá ticas diferenciadas, como as da glân -
dula mamá ria, os padrões de heterocromatina faculta -
tiva (ver Capítulo 15) são amplamente diferentes dos
padrões das células-tronco embrioná rias. Em outras
palavras, embora as sequências de nucleotídeos nos ge-
nomas das células- tronco diferenciadas e embrioná rias
- sejam idênticas, as modificações epigenéticas das histo-
- nas e dos padrões de metilação do DNA são diferentes.
A baixa frequência de sucesso nas tentativas iniciais de
clonar mam íferos provavelmente se deveu a deficiê n -
cias na reprogramação do material genético do n ú cleo
injetado para imitar as modificações epigenéticas ca -
racter ísticas de uma célula - tronco embrioná ria. Entre-
.
tanto os avanços no conhecimento da biologia celular
-
das células tronco embrion á rias e em sua aplicação na
- criação de células iPS a partir de células diferenciadas
- sugerem que a clonagem de mamíferos vai aumentar
com o passar do tempo. Apesar das dificuldades, muitos
— mam íferos diferentes além da ovelha têm sido clonados
com êxito, incluindo camundongos, vacas, cavalos, bur-
ros, gatos e cães.

ESTUDO DE CASO

Genética reversa e redundância genética no desenvolvimento das flores

.
Neste estudo de caso apresentamos um exemplo de
como a gené tica prospectiva c a gen é tica reversa trabalham
juntas para proporcionar uma visão mais ampla da função
gê nica c da evolução. Começamos com a gené tica prospec-
tiva — o isolamento de um mutado que altera o desenvol -
vimento da flor e a subsequente identificação da sequê ncia
genica mutado usando tecnologia c DNA rccombinantc.
Usando o gene clonado como sonda, os genes de sequên-
cia similar também sã o clonados. Finalmcnte, as abordagens
dc gen é tica revena são aplicadas para identificar os alelos
mutados dos genes relacionados e sua função biológica é
inferida com base nos fen ótipos mutados.
Nas plantas com fior, a idenlidade dos órgãos florais é
determinada pela expressão de um conjunto de fatores de
transcri ção. ( Para uma descrição mais completa dessa ati-
vidade, consulte o Capítulo 20.) A identidade dos órgãos
reprodutivos da Arabidopsis (estames e carpelos ) é deter
minada em parte pela atividade do gene AGAMOUS. Os
alelos agamons recessivos nulos de perda de função levam
ao desenvolvimento de pé talas nas posições normalmente
ocupadas pelos estames dc outra flor na posição normal-
.
mente ocupada pelos carpelos Os homozigotos são esté
reis e nã o produzem gametas (da í o nome AGAMOUS )
Nas triagens de genética prospectiva voltada para a iden -
tificação dos genes envolvidos no desenvolvimento floral
.
da Arabidopsis os alelos mutados agamoui induzidos por
EMS ou T-DNA são isolados ( Figura 17.23 O; ver també m
no Capítulo 16 uma revisão das triagens genéticas ).
O a leio induzido por T- DNA sc mostrou uma ferra -
menta ú til para clonar o gene AGAMOUS, pois o T DNA -
“marcou” o gene O ( ver també m no Capítulo 16 uma re
visão sobre como os transposons ou o T- DNA podem ser
utilizados para clonar genes ). Primeiro, uma biblioteca ge-
nõmica é construída a partir do DNA isolado dos mutados
açamous ( ver no Capítulo 16 a construção c triagem das bi-
bliotecas genômicas ). Depois, a biblioteca genômica é trí ada
-
com uma sonda que consiste na sequê ncia dc T DNA. A
sonda identifica os clones genòmicos na biblioteca que pos-
- -
suem a sequência de T DNA. Como o T DNA foi inserido
no gene AGAMOUS, o DNA da Arabidopsis adjacente às
sequê ncias de T- DNA codifica o gene AGAMOUS.
O clone genômico que codifica o AGAMOUS pode
ser utilizado para identificar um clone de DNAc do AGA -
MOUS a partir de uma biblioteca construída com RNAm
dc flores do tipo selvagem O ( ver lambem no Capítulo 16
uma revisão das bibliotecas de DNAc ). O sequenciamento
dos clones dc DNAc do AGAMOUS revela que a proteína
codificada tem uma semelhança com os fatores dc transcri-
ção eucarióticos conhecidos. Essa conclusão se baseia na se-
- melhança entre um domínio de 60 atninoácidos da proteína
AGAMOUS e os dom ínios de ligação ao DNA nos fatores
de transcrição da levedura e dos mamíferos.
Quando o DNAc do AGAMOUS é utilizado para
sondar um Southern blotting do DNA genômico da Ara -
- bidupsis digerido por enzima de restrição, as sequências
. relacionadas à sequência do gene AGAMOUS podem
scr identificadas O ( ver DO Capítulo 10 uma revisão dc
Southern blotting ). O mesmo DNAc do AGAMOUS pode
scr utilizado como uma sonda na biblioteca dc DNAc dc
flores para identificar os clones de genes relacionados ( ver
no Capítulo 16 uma revisão da identificação dos genes ho-
mólogos). Os genes relacionados ao AGAMOUS foram
-
denominados AGAMOUS LIKE ou AGL. Esses genes re-
- lacionados possuem o mesmo domínio de ligação ao DNA
altamente conservado, mas diferem quanto ao resto dc suas
.
sequências proteicas Para determinar como os genes AGL
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 597

Genética prospectiva
Tipo selvagem

agamous
0 Gerar mutado
agamous pela
mutagènese
do T-DNA
0 Usar o ONA isolado do
mutado do T-DNA do
agamous para construir
uma biblioteca genômica. i
Inserçã o do T-DNA

DNA ger>ômico Q Q
^^^
mmna
O Identificar sequências similares
em outras especies de plantas,
fungos e animais. 10 20 30 40 50
AGiArabidopsis ) RGKIEIKRIENTTNROVTFCKRRNGLLOtAYELSVLCCAEVALIVFSSRGRLYEYS
DCFfAntí rrblnum ) RGKIOIKRIENQTNRQVTYSKRRNGLFKKAHELSVLCDAKVSIIHISSTOKLHEYI
SRFlHomosopí ens ) RVKIKMEFIDN<IRRYTTFSKRKTGIM<KAYELSTLTGTQVILLVASETGHVYTFA
.
MCM 1 (S cerevkiae ) RRKIEIKFIEHKTRRHVYFFKRKHGIMKKAFELSVLTGTQVILLVVSETGLVYTFS

Genética reversa A sequência de aminoácidos conservada codifica

a caixa VAD5,um dorríniode ligação ao DNA
O Usar a sequência de DNA da caixa
MADS do AGAMOUS como uma
sonda no DNA genômico da v >

Arabidopsis .
AGAMOUS

!S As sequências relaoonadas
sofrem hibridaçáo cruzada,
como mostra esse
Southern blotting.

0 Clorar
da
as sequências que codificam os genes relacionados
Arabidopsis;
caixa MADS na construir rvore
aá
filogenética com base nas sequências da caixa MADS.
SEP 1
SEP2
SEPS _
AGL3

Gene
FUL
AGLJ 3
CAI
AP 1
AGL79
! O Identificar as mutações nos genes relacionados SEP 1, SEP2 e
ancestral SHP1 SEP3 usando abordagens de genética reversa (por exemplo,
SHP2 triagem das bibliotecas de nocaute das linhagens mutados
AGAMOUS de transposon e T- DNA ).
AGL 11
AGLJ 2 0 Combinar as mutações nulas em cada um dos três genespara
pelo
cruzamento dos mutados e das linhagens homozigotas
mutações em todos os très genes. Analisar o fenótipo do
sep 1 sep2 sepi mutado triplo nulo.
Figura 1 7.23 Aplicação da genétka prospectiva e reversa para determinar a função génica.
598 An á lise gené tica: uma abordagem integrada
estão relacionados com o AGAMOUS c entre si, pode ser
construída uma á rvore f ílogenética O ( ver no Capítulo 1
uma revisão das árvores filogenéticas ).
Uma vez que os genes relacionados são conhecidos
apenas pela sequê ncia pê nica , pode ser empreendida uma
abordagem genética reversa para determinar a função
genica. Os alelos mutados induzidos por transposon ou
-
T DNA de muitos genes AGL 11a Arabulopsis podem ser
identificados nas bibliotecas de nocautc dispon íveis O ( ver
Seção 17.3). Os pesquisadores inidalmente ficaram surpre
sos com o fato de as plantas homozigotas para alelos dc
perda de função dc muitos genes individuais n ão exibirem
um fenótipo aberrante. Na hipótese de que. quanto mais
intimamente relacionados forem os genes, mais similares
serão as suas funções, os pesquisadores combinaram os ale-
los de perda de função dos genes intimamente relacionados
0. Os alelos dc perda dc função sc deveram a inserções dc
-
T DNA ou de transposons nos genes c aos alelos mutados
identificados pela genolipagem baseada na PCR. Por exem
pio, os mutados sepl possuindo mutações do gene SE
PALLATA1 —
foram cruzados com mutados sep2 , após
RESUMO
17.1 A introdução de genes estranhos nos geno-
mas cria organismos transgênicos
Os genes introduzidos em um organismo se chamam
.
transgenes Os genes introduzidos a partir de outras espé-
cies se chamam transgenes heteròlogos.
Os transgenes podem ser introduzidos na levedura em
.
plasmídeos ou de modo alternativo, por recombinação
homóloga no cromossomo da levedura.
A Agrobacterium e seu tumor indutor tumoral podem ser
aproveitados para criar plantas transgênicas nas quais o
DNA de transferência carrega o transgene desejado.
As Drosophibs transgênicas são criadas pela injeção no
embrião de um transposon de elemento P carregando o
transgene.
Os transgenes são introduzidos nos camundongos peta
injeção direta do DNA em células isoladas. A detecçáo dos
eventos de recombinação homóloga é facilitada pela sele-
ção negativa-positiva das células -tronco embrionárias. Os
camundongos transgênicos são criados pela injeção de cé-
lulas-tronco embrionãrias transgênicas em um embrião que
é subsequentemente implantado em uma mãe de aluguel e
a progénie resultante é quimérica. Depois, os camundongos
não quiméricos são selecionados na geração seguinte.
17.2 Os transgenes proporcionam um meio de
dissecar a função do gene
Os genes repórteres são utilizados piara monitorar os pa-
drões de expressão gênica nos organismos transgênicos e
.
na dissecação das sequências regulatórias Alguns genes
repórteres, como os da proteina fluorescente verde, podem
ser visualizados em tempo real nos organismos vivos.
Os genes quiméricos representam alelos desconhecidos
que fornecem pistas para a função gênica.
o que os mutados duplos sepl sep2 foram identificados na
geraçã o Fr Lamentavelmente, os mutados duplos sepl sep2
não diferiram muito das plantas do tipo selvagem. No en-
tanto, as plantas mutados triplas sepl sep2 sep3 exibiram
flores consistindo apenas em sé palas, o que indica que esses
genes tê m uma função relacionada à especificação do órg ão
floral , mas distinta do papel do AGAMOUS.
A redundâ ncia genética decorrente de duplicações
é prevalente na maioria dos genomas eucariótieos ( ver
- Capítulo 18). Imcdiatamcntc após uma ocorrê ncia dc du -
plicação gênica. frequentemente os genes duplicados tê m
sequê ncias de DNA e padrões de duplicação idê nticos e,
portanto, são geneticamente redundantes Entretanto, ao
longo do tempo, as funções dos dois genes podem divergir
devido ao acú mulo dc mutações que levam a mudanças na
sequê ncia dc prote ínas e no padrão dc expressão. Contudo,
como os genes estão relacionados evolutivamente, muitas
vezes eles funcionam cm processos biológicos similares. As
- abordagens de genética reversa podem facilitar a an á lise
dos genes redundantes intimamente relacionados.
0 sistema de recombinação bacteriófago pode ser uti-
lizado para manipular as sequências de DNA in vitro e os
transgenes ín vivo.
17.3 A genética reversa investiga a açã o do gene
progredindo da identificaçã o do gene at é o
fen ótipo
As abordagens de genética reversa, nas quais a determina
çáo da função biológica vai da sequência gênica até o fenó-
tipo mutado, utilizam conjuntos que consistem em mata-
dos defeituosos, cada um em um gene definido diferente.
Conjuntos de alelos de inserção, o processo TILLING e o si-
lenciamento gênico mediado por RNAi contribuem para a
anãlise genética reversa de organismos modelo.
17.4 A terapia gênica usa tecnologia de DNA re-
combinante
Terapia gênica é a aplicação da tecnologia de DNA recom-
binante e da transgénese para tratar doenças humanas.
Na terapia gênica somática, os transgenes são direciona
dos para as células somá ticas e náo são herdados. Na te-
rapia gênica terminal, os transgenes são direcionados para
as células germinativas e,portanto, sáo herdados.
17.5 A donagem de plantas e animais produz in-
divíduos geneticamente idênticos
Muitas plantas se reproduzem por clonagem na natureza,
enquanto a reprodução donal nos animais é rara.
I A reprodução donal nos mamíferos requer a reprograma-
ção das células somáticas diferenciadas em células-tronco
plurip>otentes.
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recombínante e genética reversa 599

T E R M O S- C H A V E

Aprisionamento da sequência potência
dora (p. 590)
Biblioteca de nocaute fp. 587)
DNA de transfer ência (T-DNA) (p. 571 )
Elemento P (p. 576)
Gene de fusào (p. 565)
Gene repórter (p. 581 )
Genética reversa (p. 586)
Lesào local Induzida e direcionada nos
genomas (T1LLING) (p. 588)
Mutagênese sitio dirigida (p. 567)
Nocaute génico (p. 570)
Organismo transgénico (p. 563 )
Plasmídeo TI (p. 571 )
.
Proteína de fusão (p 565 )
Proteína fluorescente verde (GFP) (p 584) .
Recombinação homóloga (p 569) . Vetor de expressão (p. 563)
Recombinação ilegítima ( p. 569)
Recombinação sítio-específica (p 580) .
RNA interferente (RNAi) (p. 587)
Seleção positiva negativa (p.578)
Terapia génica (p. 590 )
Terapia génica germinal (p. 592)
Terapia génica somática (p. 590)
Totipotênda (p. 572 )
Transgene (p. 563 )
Vetor de transporte (p. 569)
Vetores de expressão eucarióticos (p. 565)
Viés de códon (p. 564)
Quimera genética (p. 575 )

Para obter as respostas dos problemas pares,

PROBLEMAS ver o Apêndice: Respostas.

Conceitos do capítulo
1. Quais são as vantagens e desvantagens de usar o GFP
versus o ktcl como gene repórter nos camundongos, no
C elegans e na Drosophllal
2. Uma fusào transcricional das sequências regulatórias de
um determinado gene com um gene repórter resulta na
expressão relativamente uniforme do gene em todas as
células de um organismo, ao passo que uma fusão por
tradução com o mesmo gene exibe expressão do gene
repórter apenas no núcleo de um tipo de célula especí-
fico. Discuta algumas causas biológicas para a diferença
nos padrões de expressão dos dois transgenes.
3. 0 uso de modelos animais das doenças humanas pode
levar a percepçôes sobre a base celular e genética das
doenç as. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a
consequência de um alelo recessivo ligado ao X . 8. Compare e diferencie os métodos para criar plantas
a. Como você alaria um modelo de camundongo da DMD?
b. Como você aiaria um modelo de Drosophila da DMD?
4. Compare os métodos para construir camundongos e le-
veduras transgènicos por meio de recombinantes ho-
mólogos.
5. Os produtos da fusão de genes quiméricos podem ser
utilizados para fins médicos ou industriais. Uma ideia é
produzir terapêuticos biológicos para uso médico hu
mano em animais dos quais os produtos possam ser
colhidos facilmente — no leite da ovelha ou gado, por
exemplo. Descreva em detalhes como você produziria in-
sulina humana no leite da ovelha.
6. Por que as doenças do sangue são alvos mais prováveis
para o tratamento pela terapia génica do que muitas ou -
tras doenças genéticas?
7. A injeção do RNA de fita dupla pode levar ao silencia-
mento gènko pela degradação das moléculas de RNA
complementares a qualquer uma das fitas do RNAds. O
RNAI poderia ser utilizado na terapia génica para um de-
feito provocado por um alelo recessivo? E por um alelo
dominante? Se puder, qual poderia ser o principal obstá-
culo ao uso do RNAi como agente terapêutico?
transgènkas e a Drosophila transgènka.
9. Quais são as vantagens e desvantagens de usar alelos de
inserção versus alelos gerados por produtos químkos (via
T1LLING) nos estudos de genética reversa?
10. Você clonou o ortólogo de camundongo do gene asso-
ciado com a doença de Huntington humana (HD} e quer
examinar sua expressão nos camundongos. Descreva as
- abordagens que você poderia adotar para examinar o
padrão de expressão temporal e espacial no nívei celular.

Aplica ção e integra ção

11. Os genes CBF da Arabtdopsu são induzidos pela exposi-
ção das plantas à baixa temperatura.
a. Como você examinaria os padrões temporais e espaciais
da expressão após a indução pela baixa temperatura?
.
b Você consegue conceber um método que indicasse
essas mudanças na expressão génica de maneira que
um agricultor pudesse reconhecê-las observando as
plantas crescendo no campo ?
12. Você Identifkou cinco genes na S. cerevisiae que são
induzidos quando a levedura é cultivada em um meio
contendo alto teor de sal (NaCI). Para estudar os possí-
veis papéis desses genes na adimatação para crescer em
melo contendo alto teor salino, você deseja examinar os
fenótipos dos alelos de perda e ganho de função de cada
um desses genes .
a. Como vocè fará isso?
b. Em que a sua resposta seria diferente se voc ê estivesse
trabalhando com tomateiros em vez de leveduras?
13 . Você gerou três linhagens transgénicas de milho que
são resistentes à broca de milho europeia, uma praga
Importante em muitas regiões do mundo. As linhagens
transgènkas foram criadas usando a transformação me -
diada por Agrobocterium com um T-DNA possuindo dois
genes, o primeiro sendo um gene que confere reslstén-
600 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
cia à broca do milho e o segundo, um gene que confere
resistência a um herbicida que você utilizou como mar-
cador selecionável a fim de obter suas plantas transgéni-
cas. Você cruzou cada uma das linhagens com um milho
do tipo selvagem e também gerou uma população T,
por autofertiliza ção das plantas T,. Foram observados os
seguintes resultados de segregação (resistência a herbi-
cida/ sensibilidade a herbicida ):
Cruzamento Linhagem 1 Linhagem 2 Linhagem 3
Transgênico (T, ) x 1:1 3:1 5:1
tipo selvagem
Autofertilização (T2) 3:1 15:1 35:1
Explique essas razões de segrega ção.
14. A espécie bacteriana Pseudomonos frequentemente
possui plasmídeos que codificam genes envolvidos no
catabolismo dos compostos orgânicos. Você descobriu
uma cepa que consegue metabolizar petróleo cru e de-
seja identificar o(s) gene(s) responsável(eí s). Descreva
um protocolo experimental para descobrir o gene ou os
genes necessários para o metabolismo do petr óleo cru.
15. Duas queixas a respeito de algumas plantas transgénlcas
atualmente em uso comercial sã o que (1) o gene da to-
xina Bt é expresso constitutivamente nessas plantas, le-
vando a receios de que as pressões seletivas venham a
fazer que insetos desenvolvam resistência à toxina e ( 2) o
gene marcador selecioná vel que confere resistência á ca-
namicina permaneça na planta, levando a preocupações
com a maior resistência a antibióticos nos organismos na
natureza. De que modo você geraria plantas transgénlcas
que produzam a Bt apenas em resposta à alimentação
por insetos e sem o marcador selecionável ?
16. Na Drosophikj , as mutações de perda de função do Ul-
trabithorax resultam nos segmentos toráckos posterk)
res se diferenciando com uma identidade encontrada
normalmente no segmento tor ácico anterior. Quando o
gene Ultrabttborox foi donado, ficou claro que ele codi-
fica um fator de transcrição e é expresso apenas na re-
gião posterior do tórax. Desse modo, o Ultrabtthorax age
na especificação da identidade dos segmentos torádcos
posteriores. Genes similares logo foram descobertos em
outros animais, incluindo camundongos e o homem.
Você descobriu que os camundongos possuem dois
genes intimamente relacionados. Hoxa7 e Hoxb7, que
são ortólogos ao Uttrabithorax . Você quer saber se os dois
genes do camundongo agem na especificação da identi-
dade dos segmentos corporais nos camundongos.
a. Como você vai determinar onde e quando os genes do
camundongo são expressos?
b. Como você vai criar alelos de perda de função dos
genes do camundongo ?
c. Como você vai determinar se os genes do camun-
dongo possuem funções redundantes?
17. Você identificou uma linha de armadilhas da sequência
potenciadora gerada pela transposição do elemento P
na Drosophlla, na qual o gene marcador da armadilha da
sequência potenciadora é expresso especificamente no
disco imaginai da asa.
a. Como você pode identificar o gene adjacente ao sí tio
de inser ção da armadilha da sequência potenciadora ?
b. Como você mostraria que o padrão de expressão
da linha de armadilha da sequência potenciadora
reflete o padrão de expressão gênica endógena do
gene adjacente?
18. Quando o genoma da S. cerevrswe foi sequenciado,
apenas cerca de 40% dos genes previstos haviam sido
identificados anteriormente nas triagens genéticas pros-
pectrvas. Isso deixou aproximadamente 60% dos genes
previstos sem nenhuma função conhecida, levando al
guns a dublar os genes fun (de função desconhecida ).
a. Como uma abordagem para compreender a função de
um certo gene fun, você deseja criar um alelo de perda
de função. Como você faria isso ?
b. Você quer conhecer a localiza ção fisica do produto
proteico codificado. Como você vai verificar essa in
formação?
19. As fusões por tradução entre uma proteí na de interesse
e uma proteina repórter são utilizadas para determinar a
localizaçã o subcelular das proteínas in vivo. No entanto,
uma complicação é que às vezes a fusão com uma proteí-
na repórter torna a proteína de interesse não funcional,
pois a adição da proteina repórter interfere no dobra-
mento correto da proteína, na atividade enzimática ou
nas interações proteína- proteína. Você construiu uma
fusão entre sua proteina de interesse e um gene repórter.
Como você demonstraria que a proteína de fusão retém
sua função biológica normal?
20. A sequência destacada a seguir é a que foi usada original-
mente para produzir a cadeia 8 da insulina humana na E
coii . A sequência do gene humano que codifica a cadeia
B da insulina foi determinada posteriormente a partir do
DNAc isolado de uma biblioteca de ONAc pancreático
humano e é exibida a seguir em preto. Explique as dife-
renças entre as duas sequências.
ATGTTCGTCAATCAGCACCTTTGTGGTTCTCACCTCGTTGAAGC
TTTGTACCTTGTTTGCGGTGAACGTGGTTTCTTCTACACTCCT
AAGAC7TÀA
GCCTTTGTGAACCAAC ÀCCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGC
TCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCC
AAGACCCGC
21. Em experimentos de aprisionamento da sequência po-
tenciadora, uma sequência promotora mínima e um
gene repórter foram colocados adjacentes á extremi-
dade de um transposon, de modo que as sequências
potenciadoras genómicas adjacentes ao sítio de inserção
possam induzir a expressão do gene repórter. Em uma
modificação dessa abordagem, uma série de sequên-
cias potenciadoras e promotoras pode ser colocada na
extremidade de um transposon em um DNA genómico
adjacente. Quais tipos de mutações você acha que serão
Induzidos por um transposon como esse em um experi -
mento de mutagênese?
22. O gene RAS codifica uma proteína de sinalização que hi-
drolisa o GTP em GOP. Quando ligada ao GDP, a proteína
RAS é inativa, ao passo que, quando ligada ao GTP, ativa
uma proteína-alvo, resultando na estimulação das célu-
las para crescerem e se dividirem ativamente. A mutação
de um único par de bases resulta em uma proteína mu-
tado que é constitutivamente ativa, levando à promoção
contínua da proliferação celular. Essas mutações desem -
 Capí tulo 17 Aplicações da tecnologia de DNA recomWnante e genética reversa 601

penham um papel na formação do câncer. Você clonou a seus construtos do gene repórter e os sinais + e - à direita
versão do tipo selvagem do gene RAS do camundongo indicam se o gene de fusão eveiacZ correspondente con-
e deseja criar uma forma mutado para estudar sua ativi- trola a expressão da faixa 2 nos embriões de Drosophita
dade biológica In vitro e em camundongos transgênlcos. transformados, mediados pelo elemento P. Como você In-
Descreva como você procederia. terpretaria os resultados — isto é, onde residem as sequên-
cias regulatórias responsá veis pela expressão da faixa 2?
Gly Ala Gly Gly Vai Gly
.
DNA RAS do tipo selvagem: 5' . GGC GCC GGC GGT GTG GGC , 3' .. +1 eve
r*
i
DNA RAS mutado: GTC
Vol
23. Vitamina E é o nome para um conjunto de tocofer óis qui-
micamente relacionados, que são compostos lipossolú-
veis com propriedades antioxidantes. Esses antioxidantes
protegem as células contra os efeitos dos radicais livres
criados como subprodutos do metabolismo energético
-1,7 -1,55 -1.1 -0,4 -0,04 Regiã o codificadora do taci

na mitocôndria. Diferentes tocoferóis têm atividades

biológicas distintas em razão das diferenças em sua re-
tenção, ligando-se às proteínas intestinais durante a di-
+
gestão. O tocoferol retido no nível mais alto é o a-toco- +
ferol, embora o y-tocoferol seja retido em menos de 10% +
dessa eficiência. Na Arabidopiis , o a- tocoferol é o tocofe - O •f

rol mais abundante nas folhas, enquanto o y- tocoferol é f

o mais abundante nas sementes. Uma enzima codificada I

pelo gene VTE4 pode converter y- tocoferol em a- tocofe*
rol. Como você criaria uma Arabidopvs que produz altos
niveis de a- tocoferol nas sementes?
24. O gene even-dupped ( eve ) da Drosophfb é expresso em
sete faixas no padrão de segmentação do embrião. O seg-
mento de sequênda de 8 kb de 5' até o sitio de inicio da
transcrição (exibido como +1 na figura ) é necessário para
induzir a expressão de um gene repórter ( lacZ) no mesmo
padrão do gene eve endógeno. Notavelmente, a expressão
de cada uma das sete faixas parece ser especificada de ma-
neira independente, com a expressão da faixa 2 controlada
pelas sequências regulatórias na região 1 de 1,7 kt de 5'
*
até o sítio de início da transcrição. Para examinar melhor
as sequências regulatórias da faixa 2, você cria uma série
de construtos, cada um contendo fragmentos diferentes da
região de 1,7 kb da sequência 5' Na figura, as barras á es-
querda representam as sequências de DNA incluí das em
LZ]
n
o +/-
/-
25. Você clonou um gene para uma enzima que degrada lipí-
deos em uma bactéria que normalmente vive em baixas
temperaturas. Vocé quer usar esse gene na E. coli para
produzir quantidades industriais da en2ima utilizada em
sabão de lavar roupa.
a. Como vocé conseguiria Isso ?
b. Você conseguiu produzir E. co/r transgénica expres-
sando RNAm de seu gene, mas somente um baixo
ní vel de proteína é produzido. O que poderia ser isso?
Como você poderia contornar esse problema?
 Capítulo Genômica: a genética do ponto
de vista do genoma inteiro

APRESENTAÇÃO
18.1 A genômica estrutural fornece um catálogo
dos genes contidos em um genoma
18.2 A genômica evolutiva reconstitui a história dos
genomas
18.3 A genômica funcionaI ajuda a elucidar a função
gênica

Sequências de genomas inteiros de muitas espécies do "banco ema-

IS
I O objetivo de sequenclar o genoma humano
estimulou os avanços tecnológicos que via-
.
bilizaram sua realização Além do genoma
humano, os pesquisadores sequenciaram
os genomas de centenas de bactérias e Ar-
chaea e dezenas de eucariotos .
I A história evolutiva de uma espécie está es-
crita em seu genoma e pode ser lida tanto
a partir de seu conteúdo génko quando de
sua arquitetura cromossômica.
I As análises da expressão genica no nivel do
genoma, as interações entre proteínas, as
interações proteí nas DNA e as interações
genéticas fornecem percepções quanto às
funçóes biológicas dos genes .
ranhado" de Charles Darwin esclareceram as relações evolutivas da
vida na Terra e proporcionaram mapas genéticos dos genes que defi-
nem os organismos, embora as funções exatas da maioria dos genes
náo sejam conhecidas atualmente .
A genômica, que é o estudo científico dos processos biológicos
pelo ponto de vista de todo o genoma, originou se no Pro
jeto Genoma Humano (HGP). Esse projeto audacioso foi iniciado
nos anos 1980 para sequencí ar e analisar o genoma humano. Na
época, não existiam nem as tecnologias para gerar grandes quan-
tidades de sequências de DNA nem o poder computacional para
analisar esse grande volume de dados.
Embora um objetivo primário do HGP tenha sido sequenciar
o genoma humano, vá rios organismos genéticos modelo também
foram sequenciados sob seus auspícios, incluindo os que aparece-
ram com mals frequência nas páginas deste livro: Escher í chiú coli ,
Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans
, , Drosopbiia mela -
nogaster , Arabidopsis thaltana e Mus musculus. As sequências genô-
micas desses organismos modelo contribuí ram para a nossa com-
preensão dos próprios organismos e também para a interpretação
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
da estrutura, funçã o e evolu ção do genoma humano.
Desde então, os genomas de centenas de outros proca -
riotos e dezenas de outros eucariotos também foram se-
quenciados. Em virtude dos custos sempre decrescentes
e das tecnologias cada vez mais aprimoradas, o sequen-
ciamento do genoma est á se tornando cada vez mais
viá vel em termos de custo e rotina . Ele está se mostrando
tã o ú til que, no futuro, as espécies poderã o ser definidas
pelas caracteristkas de sua sequência gen ômica.
Nas aná lises iniciais dos genomas de organismos
modelo, duas constata ções se destacam. A primeira é
que, mesmo nos organismos bem estudados, apenas
uma fraçã o dos genes identificados pelo sequenciamen -
to gen ô mico havia sido previamente identificada pelas
aná lises genéticas prospectivas; Isso levanta a quest ão
quanto à funçã o desses genes antes desconhecidos. A
segunda é que as an á lises genô m ícas também revela
ram a natureza altamente dinâ mica dos genomas, pro
porcionando percepções quanto ao grau das diferen ças
entre as espécies, entre indiv íduos de uma espécie e os
ritmos de evolu çã o das sequ ências de DNA.
Este capítulo fornece uma visã o geral da genômi-
ca descrevendo três de suas principais subdivisões. A
genômica estrutural se concentra no sequenciamento
dos genomas inteiros e na catalogaçã o, ou anotação,
das sequ ê ncias dentro de um determinado genoma. Ela
fornece uma lista de componentes do kit de ferramen
tas gen éticas de um organismo. A genômica evolutiva
é a compara çã o dos genomas, tanto dentro quanto
entre as espécies. Ela ilumina as bases genéticas das se
melhan ças e diferenças entre indivíduos ou espécies. A
genômica funcional utiliza as sequências gen ômicas
para compreender a fun ção gênica em um organismo.
Juntas, essas três abordagens contribuem para o objeti-
vo final de compreender o papel de cada gene contido
em um determinado genoma .
18.1 A genômica estrutural fornece
um catálogo dos genes contidos
em um genoma
Os genomas variam tremendamente quanto ao seu
tamanho, de várias centenas de quilobases em algumas
espécies bacteríanas até vá rios milhares de megabases
em algumas espécies de vertebrados e plantas (Tabela
18.1 ). Os genomas podem consistir em uma ú nica mo -
lécula de DNA, como em muitas espécies bacter íanas
e arqueais, ou em centenas de cromossomos, como em
603
algumas espécies eucarióticas. A partir de uma perspec -
tiva ampla , o n úmero de genes geralmente aumenta com
a complexidade do organismo. No entanto, os genomas
também variam em suas proporções de sequê ncias de
DNA codificadoras versus não codificadoras; e nos eu
cariotos multicelulares, o tamanho do genoma pode au
--
mentar muito mais que o n ú mero de genes em razão de
um aumento desproporcional no DNA não codificador.
Essas diferenças à parte, até mesmo os menores ge -
nomas bacterianos são milhares de vezes maiores que
os 600 a 900 pb que podem ser sequenciados em uma
ú nica reação tradicional de sequenciamento didesoxi
.
(ver Capítulo 7) Está claro que, para sequenciar intei -
ramente qualquer genoma, seriam necessá rias muitas
reações. Por exemplo, o genoma humano, com seus
3 x IO'4 pb, exigiria pelo menos 5 x 10* reações. Se os téc-
nicos fossem executar essas reações sequencialmente,
concebendo um novo primer para cada reação com
base na sequê ncia obtida a partir da sequência anterior,
levaria décadas para sequenciar o genoma inteiro.
- Então, qual seria uma maneira eficiente para se-
- quenciar as moléculas de DNA ( isto é, cromossomos )
com milhões de bases de comprimento? A resposta
é decompô-las em fragmentos menores e sequenciar
todos esses fragmentos em paralelo. Depois disso, al-
goritmos computadorizados montam as sequências dos
fragmentos em uma ú nica sequ ência cont ínua. Duas
abordagens básicas para esse modo de ataque geral dife-
rem apenas quanto ao DNA inicial a ser fragmentado e
sequendado. Em uma das abordagens, frequentemente
chamada sequenciamento de clones ordenados, cada
cromossomo é decomposto em clones sobrepostos que
depois são dispostos em ordem linear para produzir um
mapa f ísico do genoma. Cada clone no mapa é sequen -
ciado separadamente. Na segunda abordagem, chamada
sequenciamento sfiotgun do genoma inteiro (WGS),
o DNA representativo do genoma inteiro é fragmen -
- tado em pedaços menores e um grande n ú mero de frag-
mentos é escolhido aleatoriamente e scqucnuado.
A escolha da abordagem é ditada pelo genoma a
.
ser sequendado A abordagem de clones ordenados se
baseia na disponibilidade de recursos gen éticos especí-
ficos e, portanto, só é aplicá vel a alguns organismos mo-
delo. Por outro lado, a abordagem shotgun do genoma
inteiro é aplicá vel a qualquer genoma, sendo a mais
utilizada hoje em dia. Descrevemos as duas abordagens
aqui porque ambas desempenharam um papel no se-
quenciamento do genoma humano.
A abordagem de sequenciamento de
clones ordenados
A abordagem de clones ordenados começa com a
construção de um mapa í f sico. Os mapas genéticos fa
cilitam a construção de um mapa í .
f sico Por essa razão
o sequenciamento de clones ordenados normalmente é
aplicado apenas às espécies que têm uma história de aná
lise genética e, portanto, para as quais já existem ferra
--
604 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Tabela 18.1 Exemplos de genomas sequenciados

Tamanho do N ú mero de Genes
Organismo Descri çã o genoma ( Mb)* genes prevista previstos/ Mb
Escherichia coli Eubactéria unicelular 4,64 -
4 200 905
í um tvmefociens
Agrobacter Eubacté ria unicelular 5,67 5.419 956
Rkkettsia prowazekii Eubactéria parasitica UI 834 751
Aeropyrum perníx Archaebacteria unicelular 1,67 2.694 1.631
Arabidopsis thaliana Planta pluricelular com flor 130 28.775 238
Oryza sativa Planta pluricelular com flor (arroz) 450 37.544 83
Saccharomyces cerevisiae Fungo unicelular ( levedura do padeiro) 12 6.294 521
Neurospofa crassa Fungo pluricelular ( bolor do pâo) 43 10.580 246
Caenorhabditis elegans Verme nematódeo pluricelular 100 19.100 91
Drosophih melanogaster -
Inseto pluricelular ( mosca-da fruta) 180 14.100 78
Takifugu rubripes Peixe pluricelular ( baiacu ) 380 31.000 (est.) 82
Ornithorhynchus anatinus Monotremado pluricelular (ormtorrlnco) 437 18.500 41
Mus musculus Mam ífero pluricelular [camundongo) 3.000 24.502 8
Pan troglodytes Mam ífero pluricelular (chimpanzé ) 3.200 20.947 7
Homo sapiens Mam ífero pluricelular [ homem ) 3.200 22.763 7
* Os tamanhos de genoma fornecidos para a maioria dos eu cariot os piur celulares s o estimativas, pois as sequ ências das regiões beterocromátrcas dos gerorras
*
$»o desconhecidas.
' As estimativas do nú mero de genes se baseiam nas anotações aluais e podem mudar com novas evidências experimentais.

mentas como os mapas genéticos. O mapa í f sico de um
genoma é um conjunto de clones genô micos sobrepostos
reunidos em contigs que, depois de montados, cobrem
o genoma inteiro (ver uma descrição de contigs no Ca
pitulo 16). Então, a sequência genômica é determinada
pelo sequenciamento shotgun de cada um dos clones (ver
Figura 16.14), após o que as sequências dos clones são
combinadas em sequências contíguas maiores, baseadas
no mapa í f sico. A integridade do sequenciamento genô-
mico resultante depende da qualidade e da integridade
dos conjuntos de clones sobrepostos.
A comparação do mapa genético com o mapa í f -
sico pode fornecer informações que ajudem a alinhar o
mapa í f sico com os cromossomos do organismo conhe
cidos. O sequenciamento do genoma da S. cerevisiae, C
elegans , A. thaliana e, até certo ponto, dos seres huma -
nos contou com esse uso dos mapas í f sicos. Para essas
espécies, foi extra ída uma correspondência direta entre
a sequência gcnòmica e os cromossomos , com cada
uma dessas correspondências representada por uma
sequência contígua simples ou um pequeno n ú mero
de sequê ncias contíguas com intervalos nos centrôme-
ros e em outras sequências altamente repetitivas.
fragmentos e sequenciado, com as sequências montadas
em contigs baseados nas sobreposições dessas sequências
.
(Figura 18.1 ) Para produzir sobreposição suficiente das
- sequências com esse propósito, normalmente os técnicos
geram a sequência totalizando aproximadamente 10 a 12
vezes o tamanho real do genoma (o grau de sobreposi-
ção se chama cobertura 10- 12 x ); desse modo, qualquer
sequência está contida em vá rias leituras para minimizar
a chance de erros de sequenciamento. A facilidade com
que as sequências são montadas em contigs depende dos
comprimentos de leitura do sequenciamento, que variam
de acordo com a tecnologia aplicada (ver Capítulo 16) .
-
O DNA repetitivo representa um obstáculo impor
.
tante no sequenciamento WGS As sequências de DNA
-
Cromossomo
I Fragmentar o genoma e
aplicar o sequenciamento
l shotgun
[fj
.
O Reunir as sequências
em contigs.

Sequenciamento shotgun do genoma inteiro is ws

A abordagem shotgun do genoma inteiro (WGS)
faz o sequenciamento do DNA genômko pelo método O Determinar a ordem e a
shotgun sem a constru ção prévia de um mapa í f sico. orienta ção dos contigs.
Por essa razão, o WGS pode ser aplicado a qualquer ge-
noma. A matéria- prima para o sequenciamento shotgun
é o DNA do genoma inteiro. O DNA é decomposto em
Sequê ncias
genômicas
Figu ra 18.
— Sequenciamento shotgun do genoma inteiro .
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 605

repetitivas dispersas ( por exemplo, transposons e retro - sequências em particular são ligadas fisicamente e a dis -
transposons) interferem na montagem do genoma , con - tância aproximada entre elas. Mesmo que ocorra DNA
forme está explicado na Figura 18.2, já que podem ser repetitivo entre as sequências com extremidades parea -
mapeadas para vários locais dentro do genoma. Conse- das, elas ainda podem ser ligadas em um scaffold.O DNA
quentemente, a sequê ncia montada precisa permanecer repetitivo disperso no genoma frequentemente consiste
decomposta nas sequências repetitivas. Uma maneira em repetições simples e curtas ( microssatélites ou minis-
de contornar esse problema é usar dados de sequências satélites) de sequências de elementos transponíveis (até
com extremidades pareadas para preencher as lacu - 10 mil pb). A maioria das sequências repetidas é flanque-
nas na montagem decorrentes das sequências de DNA ada por uma sequência com extremidades pareadas de
repetitivas. No sequenciamcnto com extremidades pelo menos uma das diferentes bibliotecas. No entanto,
pareadas, a sequ ência é gerada a partir de ambas as as sequências repetitivas maiores que os maiores dones
extremidades de um fragmento de DNA gen ô m íco de disponíveis ( por exemplo, sequências repetidas centro-
tamanho conhecido. Se as sequê ncias com extremida - méricas ) nâ o podem ser transpostas usando essa aborda -
des pareadas flanquearem um elemento repetitivo, elas gem e, assim, provocam lacunas entre os contigs.
permitem a montagem de um scaffold , um conjunto
de contigs que estão fisicamente ligados por sequên - I 80 kb I
Sequências:
cias com extremidades pareadas, contendo o elemento
Ú nica Repetida Ú nica Repetida Ú nica
repetitivo. As orientações relativas das sequências com
extremidades pareadas e sua distâ ncia umas das outras
A 8
JL —II *
podem ser incorporadas nos algoritmos de montagem.
Examinemos como isso funciona. Tipicamente, são
O sequ
Gerar leituras de
ência com
O Construir três
bibliotecas de tamanhos
geradas três bibliotecas genômicas, cada uma contendo extremidades pareadas. diferentes.
fragmentos de DNA clonados com um tamanho diferente 20-30 kb \
— uma com clones de 2 a 3 kb, uma segunda com clones
de 6 a 8 kb e uma terceira com dones maiores (20-30 ou s
X

.
mais quilobases ) ( Figura 18.3) A sequ ência com extremi - =
dades pareadas gerada a partir dos clones nas diferentes i
6-8 kb i
bibliotecas vai fornecer informações revelando se as duas “ •I X

Sequências:
Única Repetida Ú nica Repetida Ú nica Repetida
B ii 2 C
A 11
^ 3
2-3 kb
O Fragmentar o DNA e
sequenciar pelo
método shotgon.

-- - - - •••••••
• '

G Identificaras sequências
sobrepostas e montar
em contigs.
A i I
I I I i
B
Repetida rnandÊ i i
j O Montar os contigs.
c 2 i
l
i
I l i

!
Uma vez que as seqjéncias são idênticas, elas não Contig 1 ontig 2 Contig 3
podem ser atribuídas a uma Icxalizaçáo genômica ' ' i
Os condgs podem ser ordenados e orientados usardo lerturas com
única; assim, as localizações relativas e as orientações
dos contigs K B e C nâo podem ser determinadas. extremidades pareadas dos dones X e Y maiores; assim, os três
contigs formam um scaffold simples.
Algumas montagens possíveis: i
r
A

D
B
B
C
A
i
i
i
A -
II® Montar o scaffold.
i

A 8
B C
a c
Fi gura 18.2 Problema do DNA repetitivo
Tamanho Cobertura em
C da inserção n ú mero de vezes
A 2-3 8x
6-8 2x
A 20-30 0.5x
Figura 18.3 Estratégia de sequenciamento shotgun
. com extremidades pareadas.
606 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

Sequendamento WGS de um genome bact ériano
ter uma ideia de como a abordagem WGS funciona
na prá tica , consideremos dois exemplos: um pequeno
genoma bacteriano com pouco DNA repetitivo e um
grande genoma eucariótico contendo uma proporção
significativa de DNA repetitivo.
O primeiro genoma a ser sequenciado por uma abor
dagem WGS com extremidades pareadas ( no Instituto
de Pesquisa Genómica, ou TIGR, em 1995) foi o da Hae
mophilus influenzae, uma bactéria Gram - negativa cujo
hospedeiro natural é o homem ( Figura 18.4) O genoma
da H. influenzae tem 1,8 x 10* pb e relativa mente poucos
elementos repetitivos dispersos. A sequência com extre
midades pareadas foi gerada a partir de três bibliotecas
genòmicas. Os dados dessa sequê ncia foram montados
em 140 contigs cujas ordens relativas e orientações eram
desconhecidas. O genoma da H. influenzae é um cromos-
somo circular simples, então a sequência montada tinha
140 lacunas em que faltavam informações da sequ ência.
(a) Estratégia empregada no sequenciamento shotgun
do genoma inteiro da H. influenzae.
Genoma da
.
H influenzae
I,8 x 10a nt
Para No entanto, com as informações sobre a ligação í f sica das
leituras de extremidades pareadas, as lacunas puderam
ser divididas em duas categorias: 98 eram lacunas de se-
quência dentro de um scaffòld , significando lacunas para
as quais havia um donc disponível para sequenciamento
posterior que podia fechar a lacuna, e 42 eram lacunas
- f sicas entre scaffòlds, significando lacunas para as quais
í
não havia clone para fornecer a sequência.
- As lacunas de sequência foram fechadas pelo se-
quenciamento dos clones transpostos identificados por
. meio do sequenciamento com extremidades pareadas.
Foram utilizadas duas abordagens para fechar as lacunas
- f sicas. Primeiro, as bibliotecas genòmicas lambda foram
í
sondadas com sequências derivadas das extremidades
dos scaffolds: se um clone genòmico simples hibridasse
com as extremidades de dois scaffolds, o clone podia
transpor a lacuna entre esses dois scaffolds. Segundo,
usando primers específicos para as sequências nas extre
midades dos scaffolds, foi empregada a metodologia de
-
.
(b) Mapa do genoma da H Influenzae
Sobrepor os clones X Sítios de enzima
para verificar e confirmar de restrição
a montagem
Pares de bases

O Construir dois tipos de bibliotecas genòmicas.

Uma biblioteca de Duas bibliotecas
plasm ideo de 1JS- 2,0 kb de 1S-20 lambda
©
Gerar sequência
com extremidades
© Gerar sequência
com extremidades
pareadas de 6x pareadas de lx
Sequê ncia de 11,6 x 10* pb

© Montar em
contigs.

140 contigs ( 140 lacunas)

O em
Montar os contigs
scaffolds .

42 scaffolds

Cada linha no circulo externo representa um gene com a cor

42 lacunas f ísicas 98 lacunas de sequê ncia indicando a função biológica prevista .
Scaffoki
Scaffòldl > Biossí ntese de aminoáckJos
' Scaffòld 2
X * -= Biossfntese dos cofatores, grupos prostéticos, portadores
Envoltório celular
i i Metabolismo Intermediá rio central
Metabolismo energético
© abrange
Identificar o clone X que Contig 1 Contig 2
O Purina, pirimidinas, nucleosideos, nucleot ídeos
a lacuna f ísica
usando as sequências da © Fechar a lacuna da Funções patogênicas
extremidade do scaffòld sequê ncia usando esse D Replkaçáo
como sondas na biblioteca clone como molde para o Proteí nas de transporte
genómica . Depois sequenciamento posterior. Tradução
sequendar o done X para
Transcrição
fechar a lacuna.
Outras categorias
I I Hipotéticas
I I Desconhecidas
Figura 18.4 Sequenciamento shotgun do genoma inteiro da Haemophilus influenzae.
 Capitulo 18 Genômica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 607

reação em cadeia da polimerase ( PCR) para amplificar a Genoma da Drosophilo melanogaster

sequência transposta. Com essa combinação de aborda -
gens, a sequência inteira de 1.830.137 pb do genoma da
H. influenzae foi montada em um ú nico contig .
Mb
Mb
C
— ílT
23.0
5,
21.4 24.4
,0 a!?(h
28.0
)
21,8 20,0
c
wè
x ai
Y
1.2
3,1

Sequenciamento WGS de um genoma eucariótico O ge - Cromossomo 2L 2R 3L 3R 40,9 4

XeY
noma da Drosophila foi o primeiro grande genoma eu -
cariótico contendo uma fração de DNA repetitivo a ser
Heterocromatina Eucromatina de 120 Mb -
Eucromatina Heterocromatina de -97 Mb
sequenciado usando a abordagem WGS. O genoma da o Centrômero / \
Drosophila tem aproximadamente 180 Mb, dos quais 0 Construir três bibliotecas.
120 Mb são considerados eucromá ticos e os 60 Mb res
tantes são heterocrom á ticos. Como o DNA heterocro-
-
Biblioteca de
I
Biblioteca de
\
Biblioteca BAC
mático centromérico não é clonado de modo eficiente, plasmídeo de 2 kb plasmfdeode 10 kb de !30 kb
devendo isso à sua natureza altamente repetitiva, ape- o* * *
v sequénciacom
Gerar
sequência com
Gerar
sequência com
nas a parte eucromá tica do genoma foi sequenciada . (Sequência
extremidades extremidades extremidades
total
O sequenciamento com extremidades pareadas foi pareadas de 7,3x. pareadas de S,4x. pareadas de 0,/x.
de 12.8 X)
realizado usando três bibliotecas genômicas de 2 kb, O Montar contig s e scaffolds .
10 kb e 130 kb ( Figura 18.5). Os clones de 10 kb eram su -
ficientemente grandes para abranger a maior parte dos I
elementos repetitivos dispersos ( como os transposons e O Ma pear os scaffolds no genoma usando o mapa
genético da Drosophila melanogaster .
os retrotransposons) encontrados no genoma da Dro-
sophila , enquanto os clones de 130 kb forneceram in - 1636 contigs em 50 scaffolds grandes (1143 Mb) e
84 scaffoids pequenos (1 ,4 Mb) mapeados para as
formações de liga ção de longo alcance para a inferência regiões eucromáticas do genoma (cobrindo
da estrutura global na montagem da sequ ência. A maior apraoõmadamente 97% tias regiões eucromáticas).
parte da sequência com cobertura 12 x gerada podia ser
montada em 50 scaffolds representando quase 115 Mb dc X CS
da parte eucrom á tica do genoma. A sequ ê ncia restante 2L 2R 31 3R Y 4
foi montada em quase 800 outros scaffolds represen - 704 scaffolds pequenos { 3.8 Mb) náo mapeados
tando aproximadamente 5 Mb; desse modo, a sequência para sítios especí ficos no genoma
genòmica montada da Drosophila tinha várias centenas
de lacunas f ísicas. Os mapas genéticos e f ísicos da Dro- Figura 18.5 Sequenciamento shotgun do genoma
sophila foram utilizados para atribuir 50 grandes scaf - Inteiro da Drosophila melanogaster .
folds e mais 84 scaffolds a regiões específicas dos quatro
cromossomos , correspondendo à maioria das regiões
eucromá ticas dos braços cromossó micos. tecnologias de genética prospectiva e reversa ( ver Ca -
O sequenciamento WGS do genoma da Drosophila pítulos 16 e 17), viabiliza o desenvolvimento de quase
se beneficiou dos recursos genéticos que os geneticistas qualquer organismo na forma de um modelo genético
da Drosophila constru íram durante todo o século XX, para o qual haja uma questã o biológica interessante.
como os mapas genéticos dos marcadores morfológicos
e moleculares. Essas ferramentas viabilizaram a atribui- Observaçã o gené tica 0 sequenciamento shotgun do
ção das sequências a posições cromossòmicas específi - genoma inteiro ( WGS) pode ser utilizado para obter a sequên-
cas. Elas também proporcionaram um modelo para ava- cia completa dos genomas pequenos e a cobertura razoá vel
liar a integridade da sequência montada: dos 2.783 genes do DNA eucromático de genomas complexos.
previamente conhecidos da Drosophila, 2.778 podiam
ser encontrados nos scaffolds, contribuindo assim para
um percentual estimado de 97,5% de DNA eucromá tico.
Genoma humano
Futuro Os rá pidos avanços tecnológicos estão mu - O Projeto Genoma Humano dos Estados Unidos
dando continuamente a forma de sequenciamento dos
genomas. Quase todos os projetos genó micos atuais (HGP) começou oficialmente em 1990 com um crono-
empregam tecnologias de sequenciamento paralelo ma - grama projetado de 15 anos c um orçamento de US$ 3
ciço ( ver Capítulo 16) para obter mais detalhes sobre a .
bilhões Esse projeto financiado pelo governo adotou
técnica WGS. Para a maioria dos organismos cujos ge - uma abordagem clone a clone para sequenciar o ge
nomas estão sendo sequenciados, os pesquisadores não noma humano; portanto, o projeto começou pelo de -
possuem mapas genéticos extensos, coleções de muta - senvolvimento de ferramentas para a constru ção de um
dos ou outros recursos gen éticos. Assim, a integridade mapa íf sico. No entanto, em 1998, a recém -fundada Cc-
das sequências genômicas nâo é fácil de avaliar como lera Corporation anunciou que forneceria uma sequ ên -
foi para a Drosophila , e a atribuição das sequências a cia do genoma humano em apenas três anos utilizando
cromossomos específicos também nã o é direta. No uma abordagem de sequenciamento WGS A concor . -
entanto , a facilidade com que os genomas podem ser rência com essa empresa privada aumentou o ritmo
sequenciados hoje em dia, associada aos avanços nas do projeto financiado com recursos pú blicos, de modo
608 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
que o sequenciamento do genoma foi concluído quatro
anos antes do previsto no cronograma.
Em 2000, o entã o presidente Bill Clinton, em uma
coletiva de imprensa com J. Craig Venter ( presidente da
Celcra ) e Francis Collins (diretor do Consórcio dc Se-
quenciamento do Genoma Humano ) , anunciou a con
deles fornecido pela abordagem de clones ordenados
do HGP e o outro pela abordagem WGS da Celera e
——
clusão de um “esboço" da sequê ncia genô mica humana.
Na verdade, havia dois esboços de sequência um
ambos tinham muitas lacunas. Nos anos subsequentes,
uma sequência "completa " do genoma humano foi ge-
rada pelo sequenciamento direcionado de regióes es
pecíficas do genoma para conectar contigs adjacentes e
garantir que a taxa de erro fosse menor que 1/ 10.000. As
lacunas entre scaffolds e contigs foram fechadas usando
as mesmas abordagens descritas anteriormente para os
genomas da H. influenzae e da Drosophila, resultando
em uma sequê ncia genômica consistindo em aproxima -
damente um contig para cada braço cromossôm í co.
Metagenòmica
F.m seu n ú mero de organismos individuais e em
massa total , as populações microbianas constituem a
maioria da vida na Terra. Entretanto, ao contrário dos
organismos genéticos modelo, que são convenientes
para os cientistas estudarem, apenas uma pequena fra
ção dos micróbios pode ser cultivada em laborató rio.
Como podemos começar a compreender a diversidade
microbiana sem conseguirmos cultivar a gama necessá -
ria de microrganismos no laboratório? Uma abordagem
possível é aplicar o sequenciamento WGS ao DNA iso-
lado de comunidades naturais inteiras consistindo em
uma gama de organismos. Os dados derivados desses
projetos de sequenciamento se chamam metagenoma .
Um dos primeiros projetos metagenômicos serve
de exemplo. Foi um sequenciamento shotgun genômico
ambiental do DNA isolado de microrganismos originá-
rios do Mar dos Sargaços, uma região do oceano delimi-
tada pela Corrente do Golfo na costa sudoeste dos Es
tados Unidos. Nesse estudo, aproximadamente 265 Mb
de sequência foram gerados e montados em um grande
n úmero de contigs, representando uma quantidade esti -
mada de 1.800 genomas diferentes. No entanto, nenhum
dos 1.800 genomas estimados era completo, e muitos
eram representados por apenas um ou poucos contigs.
Essa situação destaca uma complicação que surge nos es-
tudos metagenô micos: as espécies em qualquer amostra
ambiental específica n ão são representadas igualmente e,
portanto, os dados das espécies comuns são superestima -
dos em relação aos das mais raras. Consequentemente,
quaisquer sequências gcnô micas complexas que sejam
produzidas tendem a pertencer a espécies muito comuns,
enquanto os genomas das raras sáo representados por
apenas um n úmero pequeno e incompleto de contigs.
Apesar dessas limitações, as an álises metagenômicas
fornecem informações sobre a diversidade das espécies
e os níveis populacionais relativos em um contexto am
biental e também contribuem para a identifica ção das
sequê ncias genicas dos organismos que habitam um de-
terminado ambiente. Essas análises têm sido aplicadas a
comunidades ecológicas que vivem em resíduos ácidos
das minas, águas subterrâneas contaminadas e sistemas
- de água potá vel , além de ecossistemas mais " naturais"
(menos afetados pelo homem ), como solos, oceanos e
fontes termais. Além disso, as análises metagenô micas de
vários biomas microbianos dos seres humanos, incluindo
intestino, boca e pele, revelaram que, coletivamente, nos-
sos biomas microbianos possuem mais genes que o nosso
próprio genoma. A mesma estratégia de sequenciamento
- pode ser aplicada a qualquer sistema biológico do qual o
DNA purificado pertencente a uma ú nica espécie é difícil
de obter. Uma aplicação da metagenòmica é apresentada
no Estudo de Caso no final deste capitulo.
Observa çã o gen é tica A metagenòmica fornece infor-
mações sobre a composição de comunidades microbianas in -
.
teiras que tendem a consistir basicamente em espécies antes
desconhecidas e que nào podem ser cultivadas facilmente.
Anotaçã o para descrever genes
A sequência genô mica pode ser considerada o
mapa í f sico de escala mais precisa do genoma e nela
- estào codificados todos os genes do organismo. Mas
os cientistas precisam empregar uma série de métodos
para pesquisar a sequê ncia e encontrar os genes. Ano-
tação é o processo de associar funções biológicas às se-
quências de DNA. A anota ção gen ômica é o processo
dc identificar a localização dos genes e outras sequê n -
cias funcionais dentro da sequ ência genô mica e a ano-
tação génica define a fun ção bioquímica , celular e bio-
lógica de cada produto génico que o genoma codifica.
Até ser anotada, uma sequência gen ômica não é nada
além de uma cadeia muito longa de As, Ts, Cs e Gs. O
objetivo da anotaçã o é identificar genes conhecidos, se-
- quê ncias regulató rias e outros, bem como identificar as
sequências que provavelmente sã o genes —
mas cuja
função, se forem genes , ainda é desconhecida. As anota -
ções podem se basear em evidências experimentais, no
padrão ouro ou na análise computacional, que depois
precisam ser confirmadas experimentalmente.
Abordagens experimentais para a anotação As aborda -
gens experimentais para identificar sequências transcri -
tas em um genoma utilizam o DNAc. As sequências dos
clones de DNAc são comparadas com as sequências ge-
nômicas para identificar as partes do genoma que sofrem
transcrição, levando à produção de moléculas de RNA
(ver Capítulo 16 para fazer uma revisão do DNAc e das
.
bibliotecas genômicas) Teoricamente, um conjunto com-
pleto de dones de DNAc representando todos os genes de
um organismo permitiria a anotação completa das regiões
transcritas de seu genoma. Na prática , porém, os conjun -
tos completos de DNAc não estão disponíveis. Todavia,
- para muitos organismos, grandes quantidades de clones
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
de DNAc foram total ou parcialmente sequenciadas. As
leituras parciais da sequência de DNAc são chamadas eti
quetas de sequências expressas (ESTs). A compara ção das
sequêndas de DNAc com a sequência gen ômica permite
a anotação precisa dos éxons c íntrons gémeos c também
fornece pistas para o spiicirtg alternativo ( Figura 18.6 ).
Abordagens computacionais para a anota ção Os ge
nomas dos eucariotos multicelulares frequentemente
contém dezenas de milhares de genes, dos quais foi co
letado pouco ou nenhum dado. Na ausência de dados
experimentais pertinentes à existê ncia ou função de um
gene, as abordagens computacionais são empregadas
para identificar possíveis genes dentro das sequências
gen ômicas. O uso de abordagens computacionais para
decifrar informações da sequência de DNA é classifi-
cado como bioinformática.
Os algoritmos de anotação da bioinformática pre
veem a estrutura gê nica pela identifica ção das matrizes
de leitura abertas (ORFs), sequências que têm poten -
cial para codificar polipeptídeos. A maioria desses al-
goritmos inicialmente busca as ORFs maiores que um
tamanho mínimo, como 50 aminoácidos, por exemplo,
pois as ORFs desse tamanho têm menor probabilidade
de ocorrer aleatoriamente. Os dados derivados das se
qu ências de DNAc conhecidas do organismo em aná
lise
——
códon
por exemplo, informações sobre polarizações de
podem ser utilizados para fazer o ajuste fino
dos algoritmos empregados na anota ção gênica . Mesmo
assim, as previsões não sào infal íveis, especialmente
nos grandes genomas eucarióticos, nos quais os éxons
frequentemente são pequenos em relação aos íntrons e
dispersos ao longo de grandes distâncias.
Em comparação com os dados experimentais, os al
goritmos de bioinform ática geralmente são apenas 50%
a 90% bem -sucedidos em prever corretamente os éxons,
mas podem fornecer informações suficientes para auxi-
DNA
genômko
O Comparar a EST e as sequências
completas de DNAc com as
sequências genômicas.
5‘ EST [ I~-P I | 3' EST
DNAc completo .j — ÉB— I
hIntron
' Exon Intron
1
Éxon 1 i 1 ! 2 ! 2 I' Éxon 3 !
Gene LR > **. i
anotado u
5' UTR 3' LfTR
u bioquímicas e celulares possam ser previstas, a determi -
Códon de inicio Sequências Códon de parada
para a extremidade de consenso do
5' do gene sítio de ipticinç
O Examinar a sequência para os códons de in ício e parada
nos éxons e as sequências de consenso do s ítio de spliáng
nas extremidades dos í ntrons . rem famílias de genes, que são grupos de genes rela
Figura 18.6 Pistas para a anota ção gênica adquiridas
experímentalmente.
609
liar na concepção de abordagens experimentais para es -
- clarecer a função dos genes. Em contraste com os genes
codificadores de proteína, os genes que codificam molé -
culas de RNA não são fáceis de prever computacional
mente, já que a maior parte dos métodos computacio
--
nais começa com uma busca pelas ORFs. Desse modo,
- as abordagens genômicas experimentais ou comparati-
vas normalmente sào necessárias para anotar os genes
cujos produtos são o RNA n ã o codificador. O processo
- pelo qual os genes sao previstos é explorado em mais
detalhes na Técnica de Pesquisa 18.1 .
Outro método de bioinformá tica da anotação gé-
nica é comparar as sequ ências genômicas de espécies
relacionadas. Como discutiremos em uma seção poste-
rior, essa e outras formas de aná lise genômica compa -
rativa estã o se tornando cada vez mais poderosas com
- a disponibiliza ção das sequ ê ncias gen ômicas de uma
quantidade maior de espécies. Após os genes serem
previstos por meios computacionais, seja por meio de
algoritmos, seja por meio de comparações filogenéticas,
eles precisam ser confirmados experimentalmente.
Anotação para descrever funções biológicas
- -
- Além de apontar os genes e seus componentes es
truturais, a anotação gênica também descreve a função
bioquímica e biológica. Consideremos o gene lací , que
-
codifica a prote í na repressora da £. coli. A função bio
química da proteína codificada é se ligar ao DNA e à
alolactose, e sua função celular é regular a transcrição
do ó peron lac ( ver Capítulo 14). A função biológica do
gene lacl é a regulação da expressão gênica em resposta
à disponibilidade de açúcar no ambiente. Nesse exemplo
- em particular, a anotação que fazemos pode ser bem de-
talhada , já que conhecemos bem a função do gene lacl.
Os genes com sequências similares presumidamente
codificam produtos gênicos com funções bioquímicas si-
milares. Os genes com sequência similar à do gene lacl,
por exemplo, tendem a codificar fatores de transcrição
que regulam a expressão gênica; mas a natureza dos
genes que regulam pode ser dificil de prever. A anotação
inicial dos genomas eucarióticos representados na Figura
18.7 categorizou os genes por sua função bioquímica ou
celular presumida . Muitos genes possuem fun ções bio-
químicas ou celulares conhecidas, aprendidas a partir de
evidências experimentais prévias; e um n ú mero de genes
aproximadamente igual possui função bioquímica pre-
sumida, baseada na semelhança de sua sequência com
a das proteínas conhecidas. Embora às vezes as funções
nação das funções biológicas dos genes exige análise dos
fenótipos mutados ( ver Capítulos 16 e 17 para obter des-
crições das abordagens de análise dos mutados ).
O exame e a comparação das sequências gen òmi
cas inteiras permitiram aos pesquisadores reconhece
-
-
-
cionados evolutivamente. Algumas fam ílias de genes
são proeminentes em certas espécies, enquanto outras
610 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

TÉ CNICA DE PESQUISA 18.1

Bioinformática
Finalidade O que os algoritmos de computador 'procu
ram* em uma sequência de DNA durante a anotação do
genoma bacteriano, arqueai ou eucariótico? Muitas vezes
a primeira etapa na anotação é a identificação de matrizes
de leitura abertas (ORFs). Nas bactérias e archaea, todas
as ORFs traduzidas em proteína ter ão um códon de ini-
cio ( ATG) e um códon de parada (TAA, TAG ou TGA ) com
uma matriz de leitura aberta ininterrupta entre eles. No
entanto, nos eucariotos, onde os genes podem estar sepa-
rados em vários éxons, apenas o éxon aminoterminal pos-
sui um códon de início e apenas o último éxon codificador
possui um códon de parada; mas todos os éxons internos
possuem as sequências que garantem o splicing adequado,
assim como a extremidade 3' do primeiro éxon e a extremi-
dade 5 ’ do último.
Procedimento Vamos praticar examinando uma sequência
núcleotidica para verificar se podemos identificar as sequências
que poderiam codificar informações biológicas- Entretanto,
como este exemplo ilustra, a identificação das ORFs se trans-
forma rapidamente em um problema computacional maí s
adequado para os computadores que para o lápis e o papei.
Para simplificar a análise, vamos supor que estejamos procu-
rando uma sequência de DNA de uma bactéria, então precisa-
mos considerar os requisitos de corte e spbclng éxon-íntron.
Na busca pelas possíveis ORFs, sempre precisam ser
consideradas seis matrizes de leitura, já que as proteínas
podem ser codificadas em qualquer uma das fitas duplas
da molécula de DNA. Existem trés matrizes de leitura na fita
complementar, no sentido Inverso. Considere os primeiros
21 nudeotideos da sequência a seguir.

5' J

M : 7. C - ? M : vv *
'

*
-
. •
. .
L

O Identificar as três matrizes de leitura no sentido progressivo e na fita complementar .

As trés matrizes de leitura no sentido progressivo As tr é s matrizes de leitura na fita complementar

r f l 5'7 / T T G C À G T Á T G 6 6 C T A G A C C À À 7C 3’
~ ~
r f4 3*7fTITC 6 T C A T A C C C G À T C T G G T T // 5'
rf 2 5'7/T~ t S C A f i f ATfe feG Ó T A á À C C A â/ /~ 3 7f t A CfcV C Á Y ktt C á A TCY
r f S 3* ~
17/15'
r f3 S GC A G T À T S G G t t A G A t CA hjf 3‘ r f6 3‘7/ * A C 6 T t A T A C C C G A T t T G G T T/f S'
0, Destacar todos os possíveis códoos OATfl); repare que eles podem ocorrer em qualquer uma das seis matrizes de leitura.
Q Destacar quaisquer códons de parada l í É fA í iXtr . líefJl que estejam na mesma matriz de leitura dos quatro códons de
inicio identificados.
Sentido progressivo
rf 2-1 rf2 rf2 rf2-2
5' T T B C A G THIBT A 6HMHHlfIf.MMrriiT.WT A GEfrm.TMMM
.
HfHIMIlí TT.miiÍ IfI
i!r A 6
.
. Éí liaí HIlITTWIff U I M i ll i JéH
L 3’
** . .. - T A AÍ MCIMl A AfrjS
rf2 r f2
rf2 rf2- 3 r f2

Sequénda complementar Inversa

rf4 rf4 rf4
.. . . <
S' *’i Éf Tlf H4I H4 mi tí tl1í HMf M4W4 . «i4f.lf.l'liT A GWJ Mr A AFMéifJlilUir A GEMtTXW'
rf4 rf4 rf4- 1
rWT A Glir.U4.T.HCéHMÉÉi11(*iT A C(4i
* 4.U.tl
> í14.T.[ 3*
rf4 rf4
Constatamos que os possíveis códons de início rf2-1,rf2-B e rf4-l sâo seguidos
quase imediatamente por códons de parada dentro da matriz, imped ndo que
as rratrizes de eitura abertas codifiquem mars de 2 3 ou 5 aminoáridos.

G Identificar as matrizes de leitura abertas e as sequências de aminoácidos correspondentes.

O códon de Início rf2- 2 é seguido por uma matriz de leitura aberta de 93 nudeotideos que poderia codificar uma proteína de
31 aminoácidos:
5 *:ii-MXdVl . IRTil A Gr.WW.mTTMWÉW.ll. AG ffmitH.Uf<I4<f.UUÉI4M4i
d T M o u r i r r. i

4f l+t àittttmrXt+mààiíài+i.XIX+ líMXIXW A A[iT«LTrT4T AAFW

C T U I [ v/ ; r T A L i Y i l T V C T G Til fi T fi f l E l y l T l P l K • . i l
. . . . . . .
, í<tíWrifHdT e Alf WIélHfléWHIH
T A Grl . ..
flÉ f Y ’[ 3*

Para praticar maí s os conceitos de bioinformática, ver os Problemas 4, 5, 6 e 15.

 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 611

(a ) Arabidopsis thaliana
Transcrição Crescimento celular, divisã o celular
e síntese do DNA
Metabolismo
/ Resgate celular, defesa,

^ /
/ morte celular, envelhecimento

Comunicação celular/
transduçào de sinal

N áo c l a s s i f i c a d o
É Destina ção da proteí na

Transporte intracelular

Blogê nese celular

Facilltaçào do transporte
Energia

Sí ntese proteka
Momeostase tónica

(b) Homosapiens
Adesão celular ( 577, 1,9%) v Chaperone toteína estrutural dtoesquéletica (876, 2,8%)
(159, 0,5%) Matriz extracelular (437, 1.4%)
Dl versos (1318, 4,3%)
Imunoglobulina ( 264, 0,9%)
Proteína virai (100, 03) f
Canaliônko (406, 13%)
Proteí na de transferê ncia (203, 0,7%) / Motor (376, 1,2%)
Fator de transcrição (1850, 6,0%) \
Enzi ma de á cido nucleico (2308, 7,5%) „ A
Henbum
v A
^
/ Prote ína estrutural do m úsculo (296.1,0%)
Proto oncogcnc (902, 2,9%)
Selecionar proteí na de liga ção aocá lcio (34, 0,1%)
Molécula de sinalização (376, 1,2%) ^ jM ^ Transportador Intracelular ( 350, 1.1%)
Receptor (1543, 5,0%)
^ ^ Transportador (533, 1,7%)
Quinase (868.23%) Obfl- *

Selecionar molécula reguladora (988, 3,2%K -tfcj- Categorias Panther ( Análise Proteica

Transferase (610, 2,0%)

Slntase e slntetase (313, 1,0%)
—
- fjjt
^ '
Através das Rtlaçóes Evolutivas)

Oxidorredutase (656, 2,1 %) Categorias GO ( ontologia génka )

Uase (117.0,4%) /
Ligase (56.03%) /
lsomerase {163, 0,5%)
^ '| Função molecular desconhecida (12809, 41,7%)
Hidrolase (1227, 4,0%) íg VnnbK InnUu»
CAAAÃU , C Tt

Figura 18.7 Anotação génica da funçã o biológica prevista.

podem ser inteiramente ausentes. Os 23 mil genes do
genoma humano podem ser colocados em aproxima
damente 10 mil famílias de genes. Embora a maioria
dos animais compartilhe esse conjunto de fam ílias de
genes, apenas 3 mil a 4 mil dessas fam ílias de genes são
encontradas nos eucariotos. Outras linhagens, como os
fungos e plantas, possuem seus próprios conjuntos de
fam ílias de genes de linhagens específicas.
A expansão e retenção de determinadas famílias de
genes dependem da importância de suas fun ções bio
lógicas para o organismo. Por exemplo, nos mam íferos
ros
a fam ília de genes que codifica os receptores olfatóí
frequentemente é a maior do genoma, consistindo, na
maioria das vezes, em mais de mil membros. No entanto,
a fam ília de genes dos receptores olfatórios é muito
- maior nos organismos que se baseiam fortemente nesse
sentido ( um camundongo tem mais de 900 desses genes)
que nas espécies em que o sentido do olfato é reduzido
(os seres humanos tém apenas 339). Em seres humanos,
a maior fam ília de genes codifica as proteínas que atuam
no sistema imune, mas essa fam ília de genes nào existe
na Arabidopsis e na Saccharomyces , em que as maiores
famílias de genes codificam proteínas quinases.
- A conservação não se estende necessariamente pelos
genes inteiros e as relações evolutivas entre os genes tam -
bém podem ser reconhecidas pelos dom ínios proteicos
conservados. Muitas proteínas eucariót ícas sâo modula -
res, consistindo em domínios proteicos distintos reuni-
612 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

dos ( Figura 18.8). Como muitos domínios proteicos estão (a)

correlacionados com a estrutura de éxons nos genes
ou seja, um ou mais éxons codificam precisamente um
— Uma proteína ancestral
tipo E(PO adquiriu defc
.
Nos arenaís as proteínas
correspondentes têm domínios
—
determinado dom ínio proteico foi adiantada uma hi-
pótese de que os genes compostos (genes que codificam
domínosPHD. .
adkdonais (Br Znf, BMB).

vá rios dom í nios proteicos conservados) sâo gerados pela

mistura de éxons ( ver Capítulo 18), por meio de duplica Éplfp
* É p2
-
*

Verme (lir> 49)

ções, translocações e inversões dos segmentos cromossô-
Levedura, Levedura
micos. A estrutura modular das proteínas significa que o mosca, (YPR031 w)
n úmero de genes é muito maior que o n úmero de domí - homem
[tipo F{Pc)l
Mosca ( peregrin )
nios proteicos funcionais únicos. A mistura de éxons cria
novos genes com arrays inéditos dos domínios proteicos
que podem ser adequados para atender a novos papéis Homem (peregrin)
biológicos. Os dados disponíveis indicam que os reper -
( b)
tórios proteicos dos eucariotos pluricelulares geralmente
são mais complexos, tendo em média mais domínios di - 2000 Proteí na:
O Transmembrana
ferentes por proteína que os dos eucariotos unicelulares.
O conhecimento dos dom ínios proteicos conservados
fornece informações sobre as possíveis atividades bioquí-
1500 - Extracelular
Intracelular

micas das proteí nas, porém, mais uma vez, a compreen -
são da função biológica requer a análise dos mutados.
Observa çã o gen é tica A anotação gen ômica é o pro-
cesso de associar informações bioíógkas à s sequências de
DNA. A anotação é facilitada pelos algoritmos que buscam se
quências potencialmente significativas, mas que precisam ser
- Levedura Mosca Verme Homem
confirmadas por evidências experimentais.
Variação na organização do genoma entre
as espécies
Tendo obtido e comparado as sequências genômi-
cas de centenas de bacté rias e archaea e de dezenas de
eucariotos (ver Tabela 18.1), os biólogos conseguem
tirar vá rias conclusões gerais sobre a organização do ge
noma ( Figura 18.9). Primeiro, as bactérias e archaea tém
menos genes e uma densidade gênica muito maior que
os eucariotos. Essa densidade génica elevada é atribuí-
1000
0 número de arquiteturas
putecas diferentes é rraicx
nos animais que na levedura.
500 -
0
F i g ura 1 8.8 Modularidade dos domí nios proteicos.
(a ) Frequentemente as proteínas são modulares, compostas de
domí nios discretos ( por exemplo, Epl , Ep2, PHD, Br, BMB, Znf ).
As prote í nas complexas podem se desenvolver pela mistura e
compat íbillzaçáo dos dom ínios proteicos, normalmente por
um processo conhecido como mistura de éxons (ver Capitulo
18). (b ) Os eucariotos multicelulares têm arquiteturas proteicas
mais complexas que os eucariotos unicelulares.
vel à falta de íntrons, ao tamanho mais compacto das se
quências regulatórias e às estruturas geralmente menos
-
- complexas da maioria das proteí nas codificadas nas bac -
térias e archaea. Segundo, os eucariotos diferem ampla -
mente quanto ao n ú mero de genes e à densidade gé nica,
e os genomas dos eucariotos unicelulares tendem a co-

Figura 18.9 Compara ção da Genes/ íntrons/

-ao
organização dos ganes e do 100 kb gene
genoma. Nos genomas eucarióticos
retratados, as linhas grossas OpA trpti trpC trpO ma u
«PK
\ 1 »
i m
20 kb
100
representam éxons, as linhas finas Peptídeo
representam íntrons e as caixas em Escherichk) coh Óperon l íder
branco representam regiões não
traduzidas ( UTRs).
Saccharomyces cerevwae (cromossomo 2) *
M
Sentido da transcrição
O B
'
Sentido da transcrição
.
AIJ'9°100—
S 8 M-
kb
50 0,05

20 4
Arabidopsis thaliana (cromossomo 1)

7 3,2
100
Drosopbila melanogaster ( cromossomo X)

1 9
1 Mb
Homo sapiens (cromossomo 1)
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 613

dificar menos genes que os dos eucariotos pluricelula
res. Terceiro, as espécies que evoluíram para parasitas
obrigatórios sofrem contração genô mica. À medida que
os parasitas se tomam dependentes de seus hospedeiros
para obter nutrientes, eles perdem os genes dos quais
não necessitam mais. Esse traço é refletido no tamanho
reduzido do genoma em comparação com as outras
eubacté rias da Rickettsia prowazekii , a eubacté ria res
ponsável pelo tifo nos seres humanos ( ver Tabela 18.1).
Assim como o n úmero e a densidade dos genes va
riam entre os eucariotos, a proporção de DNA repetitivo
no genoma também varia. O genoma humano consiste
em mais de 50% de DNA repetitivo: aproximadamente
45% consiste em elementos transponíveis ( transposons,
retrotransposons e retroelementos); mais 3% consiste em
sequências microssatélites; e aproximadamente 5% con
tém duplicações gênicas recentes. Mais DNA repetitivo
está presente nas sequências centroméricas e teloméri -
cas. O DNA repetitivo que não é centromérico ou telo-
mérico costuma ser chamado DNA repetitivo disperso,
já que é distribuído por todo o genoma. A proporção de
- DNA repetitivo em um genoma é um fator significativo
que influencia a densidade gènica. Algumas característi-
cas da organização do genoma podem ser observadas no
cromossomo humano 21, exibido na Figura 18.10 .
As sequências gen òmicas anotadas dos organis-
mos gené ticos modelo podem ser visualizadas em web-
sites ( ver flnal do livro). O website do genoma humano
- ( http:// genome.ucsc.edu/ ) també m serve como portal
para os genomas anotados de vá rias outras espécies.
-
Tr ês informações extraídas das
sequências genòmicas
As an á lises das sequências genòmicas de uma gama
de bact é rias, archaea e eucariotos produziram muitas
- informações sobre a natureza dos genomas, das quais
três são particularmente importantes. Primeiro, as
comparações genòmicas demonstram que os genomas
de todos os organismos são dinâmicos por natureza. Os
elementos transponíveis (ver Capítulo 13) são apenas um
dos fatores que induzem a evolução genômica; duplica -

Padrão de Elementos Nomes Sentido da Localiza ção

faixas G repetitivos Genes dos genes transcri çã o do gene Produto ou função
•» I T
—
I—
I
l TIAM ) » 21q22.11 Invasão por liníomas de célula T e metástase 1
I
21 pi 3

—
i
i
LOC 150051 * 21 q 22.ll LOC150051 hipotético

21 p!2 FBXW 11 P 1 * 21q 22.11 Dom í nio repetido F-box e WD contendo 11 pseudogenes 1
soo; i 21 q 22.11 Sú peróxido dismutase 1, solú vel
:
í «? (esderose lateral amiotrófica 1 [adulta])

21 pl 1.2
i: - :
- -
SFRS 15
HMG 14P I
21 q 22.11 Fator de spíicing, alto teor de arginina/serina 15
21 q 22.11 Grupo de alta mobilidade (cromossômico não histona),
pseudogene de proteína 14

21 pl 1.1 *i l.
&
‘

1
*
— LOC 100131268 * 21 q 22.11 LCX 100131268 hipotético
21q11.1 !§:
:x
21 q 11.2 - 4 r *

1
— HUNK 21 q 22.11 Quinase Neu -associada suprarregulada via hormônio

i:* =
Azul éxon
21q 21.1 S3 Vermelho = íntron

m
<

í»
21q 21.2

-
- jSih * 3 •
!i
21q 21.3
m hJ
»f »
r
1* HI *

21q22.11
—{^ H-
:i
|
t
21 q 22.12
—|
—|
21 q 22.13
M \-
r s-LOC
^
C2 orf45
)

100128198
-
21 q 22 11 Matriz de leitura aberta 45 do cromossomo 2
21 q 22.11 Proteína hipotética 10000128198
21q 22.2
— - s
MRAP

SHORA80
21 q 22.11 Proteína acessória do receptor da melanocortina 2

.
21 q 22.11 Pequeno RNA nudeolar caixa H/ACA 80
*
— JH
*

Is
(•

h:.
~ C21orf 119 21 q 22.11 Matriz de leitura aberta 119 do cromossomo 21
21q 22.3 * ^
C21orf63 21 q 22.11 Matriz de leitura aberta 63 do cromossomo 21
í *
t
LJ
Figura 18.10 Anota ção genômica do cromossomo humano 21 .
614 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
ções cromossó micas de grande e pequena escala, bem
como deteções e outras reorganiza ções, també m con
tribuem. Observa-se uma variação genética substancial
mesmo dentro de uma espécie, fornecendo, assim , maté
ria - prima para a seleção natural e levando à evolução de
novas espécies. Segundo, o sequenciamenlo genômico
de organismos modelo revela as limitações das triagens
genéticas prospectívas. Mesmo nas espécies intensamente
.
estudadas, como a £ coli e a S cerevisiae, as triagens ge-
n éticas prospectívas (ver Capítulo 17) identificaram ape-
nas uma fração ( 1/3 a 1 / 2) dos genes identificados pelo
sequenciamento genômico. Quais são as funções de todos
esses genes antes desconhecidos?
A terceira informação obtida da análise dos genomas
é a descoberta de que o n úmero de genes no genoma hu
mano é comparável ao de vários outros eucariotos multi-
celulares. Ao longo dos últimos 25 a 30 anos, as estimati-
vas do n úmero de genes no genoma humano diminuíram
constantemente. Uma vez tendo estimado que o nosso
genoma contém de 80 mil a 120 mil genes, podemos achar
humilhante descobrir que nós e outros animais temos
menos genes que as plantas. O n ú mero de genes estimado
em 20 mil a 25 mil no genoma humano é característico
dos vertebrados e não é muito mais alto que os 14 mil,
mais ou menos, estimados para a Drosophila. Se alguns de
nós sofrermos “ansiedade quanto ao n ú mero de genes”,
isso pode ser aliviado reconhecendo que o n ú mero de
genes não se traduz dirctamcntc em n úmero de proteínas
ou em complexidade do organismo. Tanto a mistura de
éxons quanto o splicing alternativo aumentam a comple-
xidade das proteínas nos eucariotos e esses processos são
muito mais prevalentes nos animais que nos fungos ou
plantas. Nas páginas restantes deste capítulo, abordamos
essas informações importantes em mais detalhes.
18.2 A genòmica evolutiva reconstitui
a história dos genomas
A genòmica evolutiva , às vezes chamada filogenò
mica ou genòmica comparativa , é o estudo comparativo
dos genomas. As comparações interespec íficas dos
—- —
genomas comparações entre espécies identificam
sequ ências conservadas ao longo do tempo de evolução
e, assim, facilitam a anota ção dos genomas e fornecem
informações sobre a evolução dos genes e a diversidade
dos organismos. Por outro lado, as comparações in
traespecíficas identificam polimorfismos de sequência
que sào responsá veis pelas diferenças genéticas dentro
.
das populações de uma ú nica espécie Essas diferenças
são a maté ria - prima da evoluçã o e formam a base da ge-
nética populacional e da evolução das espécies.
A histó ria evolutiva de cada organismo pode ser
reconstituída em seu genoma e na composição de seus
cromossomos. A genò mica evolutiva revelou o fato im -
pressionante de que uma grande quantidade de genes é
compartilhada por espédes filogeneticamente distantes,
reafirmando que toda a vida na Terra está relacionada.
As espécies mais intimamente relacionadas entre si
compartilham quantidade de genes maior que as espé
cies que guardam relações mais distantes. Nas espécies
- intimamente relacionadas, as semelhanças na sequ ê ncia
-
vão alé m dos genes compartilhados, chegando aos seg
mentos cromossô micos conservados. A genòmica evo
-
-
lutiva também trouxe à tona informações importantes
pertinentes à natureza altamente din â mica do genoma.
Podem ser observadas mudan ças na forma das muta -
ções, mesmo na escala de tempo de uma ú nica geração.
Árvore da vida
A grande quantidade de informações sobre sequê n -
cias de DNA disponí veis hoje em dia revolucionou o
modo como os biólogos percebem a á rvore da vida ,
- a á rvore filogenética que retrata as relaçòes evolutivas
entre os organismos. Os tra ços morfológicos e fisioló-
gicos já foram a base principal da classificação das es
pécies, mas as comparações das sequ ê ncias de DNA
esclareceram questões que os m étodos de estudo mais
antigos eram incapazes de solucionar.
As comparações das sequências de DNA do mesmo
gene em diferentes espécies são particularmente ú teis
para avaliar as relações filogenéticas. Em razão de sua
onipresença e alto grau de conservação, os genes que co-
dificam os RNAs ribossómicos fornecem uma sequência
universal para tais comparações. Ao comparar as sequên -
cias de RN A ribossômico, Cari Woese e colegas reve -
laram, por meio de estudos pioneiros no final dos anos
1970, que todas as formas de vida na Terra caem em um
ou outro dos três dom í nios distintos: Bacté rias, Archaea
e Eukarya. Desde então, as relações dentro de muitos
grupos eucarióticos têm sido esclarecidas usando compa -
rações das sequê ncias de DNA, permitindo a determina -
ção da arquitetura básica da á rvore da vida ( Figura 18.11 ).
Algumas relações surpreendentes surgiram. Por exem -
plo, descobriu -se que os fungos e metazoá rios, que antes
eram considerados “ reinos” diferentes da vida, eram rela
tivamente bem relacionados e hoje são agrupados com os
-
Ameboides em uma clade chamada Unikonta. Uma vez
- que os animais e plantas são as formas de vida mais cons-
pícuas pelo ponto de vista humano, a árvore apresentada
na Figura 18.11 é polarizada para um foco nas inter- rela -
ções desses dois grupos. Se todos os seus ramos pudes
sem ser apresentados com o mesmo n ível de detalhe, a
-
árvore lembraria mais um arbusto muito denso.
A árvore da vida na Figura 18.11 foi construída uti -
- lizando informações das sequências de DNA ( ver Capí -
tulo 1) e a compara çã o do alinhamento dos nudeotideos
homólogos para apurar as relações filogenéticas. Os nu-
cleotídeos homólogos são os que descendem do mesmo
nucleotídeo no ancestral comum de duas espédes que
estáo sendo comparadas. As sequências de DNA codifi-
cadoras de proteína altamente conservadas são analisa -
das para identificar os pontos de ramificação evolutiva ou
nós. Algumas sequências codificadoras de proteína têm
sido conservadas em escalas de tempo de mais de um
bilhão de anos. Por outro lado, as sequências não codifi-
cadoras são comparadas para esclarecer os nós recentes
na evolução da espécie. As sequências de íntrons c in -
- tergênicas, nas quais pode haver pouca pressão seletiva
 Cap í tulo 18 Genô mlca: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 615

Proteotoacteria Escherichia coli

Cyanobacteria
I Deinococcales
.
I / High-GC Gram positive
1
/ /^ y Thermotogales
Aquificaies Bactéria
„ Spiroctiaetes
-Chlamydiales
Planctomycetales
Mitoc ò nd rias -
• Low GC Gram positive
Metazoá rios
Thermococcales
Methanococcales Archaea
' Archaeoglobales
Thermoplasmatales
Methanosarcinaies
Halobacteriales | Artró podes
Esponjas Equi nodermas Moluscos /
Sacchoromyces
cereviiioe e
Neurofpora
eras:
j
Excavata
"" Rhlzaria
\

''•Chromalveolata
Sulfolobales
x Desuifurococcales Cnid á rios
1
^ yCaencrhobMis
^
Drosophih metanogcnter elegans

Vertebrados
1

Larvd plants
, Fungl

Eukarya
Amoebozoa
^ Metazoans
Algae j Choarvoflagellates (anjmaiS pluricelulares)
n
r\ —j 's
Linhagens de peixes
n
Anfí bios
'' Danioreno
nm
R épteis
e pássaros
Plantas

Mamíferos

%
Linhagens de algas" Chkjmydomonas reinhardtii

Plantas com semente

Mam íferos placentá rios
Mus musculus

1
J
nfflTlA
^
Marsupiais
Monotremados

* Primatas
1

Plantas com flor Gimnospermas Lémures Loriformes Macacos Macacos do Primatas

;rs thotiana Zea mays do Novo Velho Mundo sem
Mundo cauda
Homo sapiens
Figura 18.11 Árvore da vida, destacando as relações filogenéticas dos organismos modelo discutidos neste livro.

para manter uma sequência especifica, podem acumular
mutações e mudar rapidamente ao longo do tempo. Uma
estratégia desenvolvida para pesquisar sequências homó
logas é descrita na Técnka de Pesquisa 18.2.
Compara ções genômicas interespecíficas:
conteúdo gênico
O scquenciarncnto genômico indica que certos genes
sâo encontrados em todos os organismos, sejam bactérias,
archaea ou eucariotos, e sugere que esses genes devem
ter surgido no início da evoluçã o da vida na Terra. Esses
—
genes altamente conservados por exemplo, os que co-
dificam as proteínas necessárias para a síntese do DNA
estão envolvidos em processos biológicos comuns a todas
as espécies. Outros genes têm uma origem mais recente
e definem clades de espêdes específicas. Por exemplo, os
genes que codificam a tubulina se encontram em todos
- os eucariotos, implicando que o gene da tubulina evoluiu
antes da diversificaçã o dos eucariotos. Outros genes ainda
sâo compartilhados entre clades mais restritas de orga -
nismos e alguns estão confinados apenas às espécies infi -
mamente relacionadas. Dessa maneira, a distribuição filo-
gené tica das famílias de genes fornece informações sobre
quando genes específicos estão envolvidos. Além disso, o
conjunto de genes compartilhados entre qualquer grupo
de organismos pode ser considerado representativo do
conteúdo genômico mínimo do ancestral comum desse
—
grupo de organismos, fornecendo, assim, informações
sobre a evolução dos genomas e organismos.
Como os primeiros genomas a ser sequenciados
eram de organismos filogeneticamente diversos, muitos
616 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

T É CNICA DE PESQUISA 18.2

Ferramenta bá sica de alinhamento local de sequências

Finalidade Os genes homólogos sáo derivados de um
gene ancestral comum e frequentemente tém funções
semelhantes. Um programa de computador chamado fer-
ramenta bá sica de alinhamento local de sequências
(BLAST) foi desenvolvido em 1990 por Stephen Altschul,
Oavid Lipman e colegas para pesquisar sequências homólo-
gas. O BLAST, talvez a ferramenta mais empregada e impor-
tante nos esforç os de bioínformática, permite que os cien-
tistas pesquisem nos bancos de dados sequências similares
a qualquer sequência fornecida.
O programa BLAST, no National Center for Biotechno-
logy Information do National Institutes of Health (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), permite buscas de seme-
lhança da sequência de DNA ou de semelhança proteica.
Vários tipos de buscas podem ser realizados. Aqui temos os
três tipos mais comuns .
I blast de nucleotí deo ( blastn): uma sequência de con-
sulta de nucleotídeo é comparada com as sequências de
nucleotídeos no banco de dados.
I tblastn: uma sequência de consulta de proteína é com-
parada com os bancos de dados de nucleotídeos, tra-
duzidos hipoteticamente nas seis possíveis matrizes de
leitura hipotéticas.
I tblastx: uma sequência de consulta de nucleotídeo é
traduzida nas seis possíveis matrizes de leitura e com-
parada com as sequências de nucleotídeos no banco de
dados que também foram traduzidas para as seis possí-
veis matrizes de leitura.
Procedimento Um dos primeiros experimentos que os
pesquisadores realizam depois de determinarem a sequên-
cia de um gene é fazer um 'BLAST* em sua sequência contra
o banco de dados GenBank. Para fazer uma busca, o usuário
fornece uma sequência de nudeotídeo ou proteína de 'en-
trada', digitando-a em uma janela, e o programa BLAST faz
uma busca de sequências similares nos bancos de dados es-
colhidos. As sequências recebem uma pontuação baseada
no grau de semelhança e em relação à probabilidade de que
.
essas sequêndas possam ser similares pelo acaso
.
Para praticar mais ver Problemas 14 e 15 .
genes pareciam especí ficos de um determinado grupo
taxonômico. No entanto, à medida que mais sequências
genòmicas foram determinadas, descobriu-se que genes
antes considerados exclusivos encontravam contrapar -
tes nos genomas das espécies relacionadas. Na reali
dade, duas espécies intimamente relacionadas podem
- se formam os novos genes.
Conclusão Que Informação pode ser derivada desse ex
perimento? Primeiro, os resultados da busca BLAST podem
fornecer pistas para a função biológica e bioquímica do
.
gene utilizado como consulta Como os genes homólogos
descendem de um ancestral comum, provavelmente eles
compartilham atividade bioquímica se não compartilharem
um contexto biológico. Segundo, o conhecimento da distri-
buição filogenética dos genes homólogos permite infer ên-
cias sobre quando o gene evoluiu. Por exemplo, se a con -
sulta for relativa a um gene humano e se forem detectados
genes homólogos em todos os eucariotos, provavelmente
a proteí na desempenha uma função conservada em todos
os eucariotos. Por outro lado, se apenas os mamíferos tive-
rem genes homólogos, o gene tende a desempenhar uma
função espedfica para os mam íferos.
Uma vez que as espécies relacionadas possuem se-
quências de aminoácidos conservadas, mas, em virtude
da redundância do código genético, possuem sequências
nudeotídicas diferentes, uma busca tblastn (ou tblastx)
frequentemente é mais sensível que uma blastn na identi-
ficação das sequências homólogas de espécies com relacio-
namento distante. As sequências de betaglobina na Figura
16.23 foram compiladas usando a sequência da proteína
betaglobina humana como consulta em uma busca tblastn
no banco de dados GenBank, onde a maioria das sequên-
cias de DNA determinadas em qualquer parte do mundo
está depositada. Quando um pesquisador não tem conhe
cimento prévio da sequência de DNA que está sendo utili-
zada como consulta, as buscas tblastx são particularmente
úteis porque elas Identificam as sequências de DNA com
potencial para codificar proteínas similares.
E se uma busca BLAST não conseguir encontrar quais-
quer outras sequências no banco de dados similares à
sequência que está sendo consultada? Se já soubermos que
a sequência codifica uma proteína, o resultado sugere que o
gene para a proteína provavelmente não está conservado
.
em um amplo sentido filogenético Como alternativa, se a
sequência for de DNA nâo codificador, não seria surpresa a
falta de semelhança com outras sequências de DNA.
espécie foi detectado, com uma média de um gene ex-
clusivo para cada 0,5 milhão de anos de distância evolu-
tiva. Ainda nâo está claro se essa taxa é característica de
outros organismos. Mas isso levanta a questão de como

compartilhar quase todo o conteúdo de seu genoma; as
diferenças genòmicas entre grupos taxonômicos irmãos
definem as diferenças entre as duas espécies. Por exem-
plo, o conteúdo genómico é muito similar em quatro es-
pécies de Saccharomyces intimamente relacionadas (S.
cerevisiae, S. paradoxus , SL mikatae e 51 bayanus ) , todas
separadas por 5 milhões a 20 milhões de anos (Figura
.
18.12) Por todos os genomas das espécies de Saccharo
myces, apenas um punhado de genes especí ficos de cada
Observa çã o genética A arquitetura da árvore da vida
pode ser verificada comparando as sequências de DNA dos
mesmos genes encontrados em diferentes espécies. As dife-
rentes taxas de evolução da sequência de DNA nas sequências
funcionais e não funcionais podem ser exploradas para resol-
ver as relações evolutivas dos organismos que divergiram em
tempos antigos e recentes.
-
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
Espécies de
Saccharomyces
5. cerevisiae
5. paradoxos
S. mikatae
5. bayanos
50 kb
Nascimento e morte dos genes Na reconstituição da
histó ria evolutiva dos genes pela comparação das se-
quências genômicas, os geneticistas obtê m pistas para
os mecanismos por meio dos quais surgem novos genes
.
(Figura 18.13) Esses mecanismos incluem:
1 . Duplicação genica por meio da duplicação do
DNA genómico. A duplicação do material gené
tico pode duplicar uma parte de um gene, um ú nico
gene, um cromossomo ou um segmento cromossô -
mico, ou o genoma inteiro ( ver Capítulo 13).
2. Duplicação génica por meio do cruzamento
desigual. Em um caso especial de duplicação gê
nica, um ou mais genes podem ser duplicados pelo
cruzamento desigual em razão do mau alinhamento
dos cromossomos homólogos na sinapse durante a
prófase I da meiose. A duplicação génica pelo cruza-
mento desigual é indicada pela detecção de repetições
em tandem, ou cópias sucessivas, de material genético
(ver Capítulo 13 e Estudo de Caso do Capítulo 3).
3. Mistura de éxons. Durante um evento de mistura
de éxons, os éxons de dois ou mais genes são com -
binados em um novo contexto genómico (ver Figura
18.8a ). A reorganização poderia ocorrer por meio de
eventos de recombinaçào ilegítima ou, de modo al
ternativo, por meio de eventos de retrotransposição.
4. Transcrição reversa. A transcrição reversa dos
RNAs celulares, usando transcriptase reversa co
dificada por retrotransposon e sua inserção no ge -
noma , costuma levar à formação dc pseudogenes ,
sequências reconhecíveis como sequ ências géni-
cas alteradas ( por muta ção), mas também podem
produzir novos genes . Mais de 10 mil pseudogenes
foram reconhecidos no genoma humano e mui-
tos foram derivados da transcrição reversa. Além
disso, a inserçã o de um retrotransposon em uma
nova posição genò mica pode alterar o padrão de
expressão dos genes adjacentes , levando potencial-
mente a novas funções gênicas .
5. Derivação de éxons dos transposons. Os trans
posons possuem sequ ê ncias que codificam uma
proteína de ligação ao DNA chamada transposase,
que é necessá ria para o movimento do transposon.
As sequências da transposase podem ser feitas para
desempenhar uma nova função, se fundidas com
outros éxons derivados do genoma. Por exemplo,
os genes RAGI e RAG2 dos vertebrados com man
617
.
Figura 1 B 12 Comparação
de quatro genomas de
Saecharomyces . As matrizes de
leitura abertas (ORFs) previstas são
retratadas como setas apontando
no sentido da transcriçã o. As ORFs
ortólogas são conectadas por
linhas pontilhadas. As ORFs com
uma correspondê ncia de um para
um são exibidas em azul; as ORFs
com uma correspondência um
para dois estão em vermelho (a S .
paradoxui tem dois genes no lugar
do gene 7 da S. cerevisioe); as ORFs
sem correspondência (gene 24 na
S. cerevTuae ) est ão em branco. As
lacunas de sequência sã o indicadas
por linhas cheias verticais.
díbulas, cujos produtos proteicos estão envolvidos
- na reorganização das sequê ncias de DNA durante
a maturação do sistema imune, foram derivados de
sequências que codificam a transposase.
6. Transferência génica lateral (horizontal ). O movi
mento dos genes de uma espécie para o genoma de
-
- outra espécie é chamado transferência génica late-
ral. Esses eventos são comuns nos procariotos, que
podem trocar genes até mesmo com organismos dis -
tantemente relacionados ( ver Capítulo 6). As endos
simbioses levam a eventos de transferência génica
lateral de larga escala , como é o caso da mitocòn
dria e do cloroplasto. Embora menos comum entre
-
os eucariotos, a transferência génica lateral tem sido
documentada em alguns protistas e plantas.
7. Fusão génica e fissão génica. Dois genes conse -
guem se fundir em um único gene pela deleção do
códon de parada e pelos sinais de termina ção da
- transcrição que normalmente separam os genes.
De modo alternativo, um ú nico gene pode ser divi-
dido em dois genes, cada um com as suas próprias
- sequências regulatórias.
8. Derivação de novo . Os éxons podem ser deriva-
dos de novo a partir das sequências intrônicas ou
intergènicas que estão incorporadas nos éxons dos
genes adjacentes.
As comparações entre os genomas de vá rias es-
pécies de Drosophila relacionadas forneceram infor-
mações sobre as origens de novos genes em um euca -
rioto pluricelular. A principal fonte de novos genes,
um pouco menos que 80% das vezes, foi a duplica ção
génica, na qual as duplicações estavam arranjadas em
- tandem ou dispersas em localizações cromossómicas
distantes. Outros 10% dos novos genes derivaram de
eventos de retrotransposição; e, surpreendentemente,
aproximadamente 12% deles surgiram de novo, a partir
——
de sequências não codificadoras.
Dois mecanismos duplicação génica e transfe -
rência génica lateral se destacam como principais
- mecanismos responsáveis pela geração de genes nos eu -
618 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

O Duplkaçáo gênica -\ —r T
|Duplicação
.
nômica evolutiva A maioria dos genomas contém um
mosaico de famílias de genes derivadas de eventos de
duplicação antigos e mais recentes, indicando que os ge -
|Diverg ência nomas sào dinâ micos e mudam continuamcntc com o
\ l \ L tempo. Um estudo no ano 2000, realizado por Michael
Lynch e John Concry, contou os genes duplicados em
nove espécies eucarióticas e estimou a taxa de duplica -
O Duplicação géníca 1 I ção: aproximadamcnte 0,01 gene por milhão de anos.
pelo cruzamento
desigual

I
1
i—r
.I 1 l Desse modo, para um genoma eucariótico médio com 10
mil a 30 mil genes, essa pesquisa sugere que um gene du-
plica e é mantido no genoma a cada 3 mil a 10 mil anos.
mr O destino dos genes duplicados depende da base
molecular da duplicação. Se o gene inteiro, incluindo as
sequê ncias regulató rias, for duplicado, as duas cópias
0 Mistura de éxons czt serão capazes de produzir um produto proteico funcio-
nal na quantidade, tempo e lugar corretos. Nesse caso, os

ri fi —i genes duplicados são geneticamente redundantes e livres

para desenvolver novas funções, contanto que as funções
compostas dos dois genes duplicados retenham a fun ção
do gene originaL Os genes totalmente redundantes não
O Transcrição são mantidos por longos per íodos, normal mente porque
reversa
|Transcrição os genes duplicados se submetem a um entre três desti-
nos prová veis ( Figura 18.14), Primeiro, a ampla maioria
dos novos genes degenera em decorrência da falta de
ção reversa
i Transcri
e inser ção seleção positiva, sem o que os mutados vã o se acumular
E lentamente e tomar os genes não funcionais. Os pseudo -
genes correspondem a uma fraçã o significativa dos ge-
nomas de alguns organismos. Segundo, as mutações em
O Deriva çã o dos cada uma das duas cópias podem resultar nos dois genes
éxons a partir
dos transposons tendo atividades complementares, tal que sua atividade
combinada é igual à atividade do gene antes da duplica -
H r j
Novos sítios de spfidnç
ção, um processo chamado subfiincionalizaçã o. Ter
ceiro, em um processo chamado neofuncionalizaçâo,
-
i evoluem dentro da TE uma mutação em uma das cópias poderia prover uma
função não desempenhada pelo gene original. Em casos
| Outras sequências raros, em que a nova função proporciona uma vantagem
1 TE degeneram
fr-ÊTT- seletiva, o gene pode ser mantido e se tomar fixo na po-
pulação. Nos dois últimos casos, as duas cópias permane
cem funcionais, ao passo que, no primeiro caso, apenas
-
O Transfer ê ncia
gênica lateral
i Organismo A
uma ú nica cópia retém a atividade.
j Transfere
i I Organismo B
Os eventos e duplicação repetidos produzem fa
mílias de genes relacionados. Por meio das duplicações
-
mr
j Diverge
Organismo B lações entre esses genes costumam ser complexas. Três
-
gênicas, das perdas gênícas e de eventos especiais, as re

termos descrevem as diferentes relações entre genes

Q Fissã o/fusã o gênica ] relacionados evolutivamente. O termo mais geral é ho -
Fusão i t Fissão mologia , que é definida como a descendê ncia de um
T ancestral comum. Desse modo, os genes hom ólogos
descenderam de um gene ancestral comum e diz - se
O Derivação de novo a cu que constituem uma família de genes ( Figura 18.15 ). Os
partir da sequência I outros dois termos definem relações específicas entre
não codificadora r mr genes homólogos. Os genes pará logos são aqueles cuja
origem reside em um evento de duplicação. Nenhuma
Figura 18.13 Nascimento dos genes. indicação da idade do evento de duplicação que levou
aos parálogos está implícita. Geralmente, os par álogos
desempenham funções biológicas distintas, porém bio-
cariotos e procariotos, respectivamente. Consideremos
quimicamente relacionadas. Os genes ortólogos são
cada um desses mecanismos em mais detalhes. aqueles cuja origem reside cm um evento de especiaçào.
Duplkaçáo gênica A alta frequência de duplicação gé - São genes em diferentes espécies que derivaram de um
nica é uma descoberta surpreendente decorrente da ge - único gene ancestral no último ancestral comum das
 Capitulo 18 Genômica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
ab HGeneZF
Gene 2^
^- FunçãoB
Duplicação gènica
ab 4 GeneZ,!^
ab 4 Função A
Gene 4 '
-,
^ 1
f 1
O Pseudogene 0 SubfunoonaJlzação
4 Gene 4 Função 4
ab
ab
/
a
* ~
Xb 1 4 IZ Gene Z, Função B
Muta ções de
inativaçào As funções compostas
dosgenesZ, e 4 sào
equ valentes ãs do
abU 4 n gene 7
- z* XI
GeneZ,
^ Função B
duas espécies. Na maioria das vezes, mas nem sempre, os
ortólogos têm funções equivalentes nos dois organismos
que estão sendo comparados. Os genes globina na Figura
18.15 ilustram essas relações evolutivas.
A duplicação gênica tem sido um mecanismo fun
damental na geração de novos genes que, ao longo do
tempo, viabilizam a evolução dos organismos complexos.
Durante a evolução do gene globina, a duplicação génica
permitiu a especialização, que, por sua vez, permitiu uma
maior complexidade fisiológica . Tanto a subfunrionaliza -
çào quanto a neofunc íonalizaçào podem ser observadas
dentro da fam ília do gene globina. A neofundonalização
pode ser observada no evento de duplicação gêmea que
produziu os genes hemoglobina e mioglobina, em que a
hemoglobina atua no transporte de oxigé nio no sangue
e a mioglobina atua na ligação do oxigénio nos m úscu
los. A subfuncionalizaçáo també m ocorreu nos genes
globina, se presumirmos que a -globina ancestral era
^
ativa durante todo o ddo de vida do organismo. Se for,
a subfundonalizaçào agora é evidente entre os parálogos
de c-globina e (5- globina, em que a £ - globina é ativa no
embrião e a Pglobina é ativa no adulto. Outros exemplos
incluem duplicações de um gene ancestral que levam a
uma fam ília de genes que permitem a visão tricrômica
em algumas espécies de primatas, incluindo o homem
( ver Capítulo 3), e na criação de outra fam ília de genes
que especifica a identidade ao longo do eixo anterior
- posterior dos animais (ver Capítulo 20).
Transferènda génica lateral A transferência génica lateral,
também conhecida como transferência génica horizontal,
é a transferência de material genético entre duas espécies.
A transferénria gênica lateral pode ter sido ampla no inírio
da evolução da vida, mas, à medida que os mecanismos ge-
néticos espedalizados evolu íram para controlar a expres-
são gênica , a transferência gênica lateral se tornou menos
frequente dentro da linhagem eucariótica. Um evento de
transferência gènica lateral comum ocorre pelo compar
619
« Funçào A Figura 18.14 Destinos dos
genes duplicados.
Funçào A
- Função 8 ,
Os geres Z e 4
Inicia hr>ente são
idênticos ao gere7
FunçàoB
0 Neofuncionalizaçáo
„ Funçào A
ab 4 GeneZ, '- Funçào B
c 4 Gene Z2 —
Funçào C
0 gene 4 ret ém a funçào
original do gene 4
enquanto o gene 4
adquire uma nova funçáa
tilhamento dos plasmídeos entre as espécies bacterianas
(ver Capítulo 6), mas outros eventos de transferência gê-
nica lateral entre espécies bacterianas e entre espécies de
bactérias e archaea também foram documentados. Com
- base na comparação dos genomas bacterianos e arqueais
sequenciados, estima-se que 1,5% a 14,5% dos genes em
qualquer genoma resultam da transferência génica lateral.
Provavelmente esse percentual está subestimado, já que os
eventos de transferência ancestrais podem não ser detec-
táveis. Em um exemplo extremo de transferência gé nica
lateral, as espécies bacterianas hipertermófilas ( bactérias
capazes de viver em ambientes extremamente quentes)
adquiriram genes de espécies arqueais. Quase um quarto
dos genes na bactéria Thermotoga marí tima são mais pa
recidos com os genes arqueais, indicando uma origem ar-
-
- queai. Um gene arqueai adquirido codifica uma girase re -
versa, uma topoisomerase que induz superenrolamentos
positivos no DNA e que é necessária para a adaptação à
vida nas altas temperaturas.
Embora os genes que codificam proteínas com fun
ções metabólicas pareçam ter sido doados em eventos
-
de transferê ncia génica lateral, os que codificam proteí -
nas para o processamento de informações ( por exem
plo, replicaçào, transcrição e tradu ção) normalmente
-
não são transferidos. Uma explicação possível para essa
-
tendência é que as prote í nas com funções de processa -
mento de informações agem frequentemente nos gran
des complexos e não são facilmente incorporadas aos
-
complexos existentes em outras espécies.
Embora a transferência génica lateral seja relativa
mente comum entre as bactérias e archaea, a transferência
-
entre bactérias ou archaea e eucariotos, ou entre eucario -
tos, é rara. Isso se deve em parte aos diferentes mecanis-
mos de controle da transcrição e tradu ção nos eucariotos,
por um lado, e às bactérias e archaea por outro. Apesar
de a bactéria Agrohacterium tumefaciens transferir genes
para células vegetais (ver Capítulo 17), existem poucas
620 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Homosapitns
Agrupamento de genes (5 globina
1* 1 lYoí
O agrupamento de genes 3-ç bbma no nosso
geronna e o do genoma oo chimpanzé tém o
mesmo complemento gêrvca Os genes da (3 çlobna-
hixnana e do ch impanzé estão relacionados por im
-
cvcr to de especiação e os dois genes são ortólogos
Cí
t J
L 260 mya
300 mya
Gene a-globina ancestral
V /
450- 500 mya
O termo homokjgia pode se aplicar à
relação entre os genes derivados
através de um evento de especiação
(ortólogos) ou á relação entre os genes Gene hemoglobina ancestral
derivados através de urr evento de
duplicação gênica (parálogos).
Figura 18.15 Ortologia e paralogia , eventos de especiação e
duplicações gênlcas: exemplos da família de genes globina.
evidências de que esses genes entraram na linha germi
nativa das plantas transformadas. Por outro lado, nâo há
evidência da transferência de genes das plantas transgéni
cas para as bactérias do solo. No entanto, há uma exceção
importante a essa generalização: a transferência de mate
rial gen ético dos endossimbiontes para seus hospedeiros.
Os exemplos mais claros são as transferências de genes
em larga escala das mitocôndrias e cloroplastos para os
n úcleos nas células eucariòticas (exploradas em mais de
talhes no Capítulo 19). Finalmente, a transferência gênica
lateral entre os eucariotos não é considerada comum; mas
tem sido documentada, por exemplo, entre plantas para-
sitárias com flores e suas plantas hospedeiras com flores e
também entre fungos e afídeos.
Observa çã o gen é tica 0 nascimento de novos genes
pode ocorrer por uma sé rie de mecanismos. Embora a maioria
dos novos genes decaia rapidamente em razào de um acú-
mulo de mutações danosas, os novos genes também podem
começar a desempenhar novas funções, induzindo assim a
evolução de novas espécies.
Comparações genômicas interespec íficas:
anotação genômica
Comparando as sequências genô micas de espécies
intimamente relacionadas, os pesquisadores muitas
vezes são capazes de refinar suas anotações dos genes
Í
l l 101
‘
—
Ortólogos
Pan trogbdytei ITT
Agrupamento de
TM m m
Parálogos genes 0-globina Pará logos
Como os genes dentro de cada agrupamento derivaram
de eventos de duplicação génea dentrode um genoma .
os membros dentro de um agrupamento são genes
pará logos (isto é, os genes humanosda 6-globina e
0 gftubna são parálogos! Os genes da 6- ylubina
. -
humana e da 3 gtabina do chimpanzé também são
pará logos já que podem remontar a um evento de
duplica ção gê nlca dentro de um genoma ,
.
|o I 1LL IVcl 161 IP lMnl
50 mya 50 mya
80 mya
120 mya
170 mya
Gene (Tglobina ancestral
Duplicação gér ica 450-500
milhões de anos atrás
Gene mioglobina ancestral
l
- 600 800 mya
Gene globina ancestral
Como todos os genes g õbína são derivados de
um único gene globina ancestral , todos os genes
-
miogobina, a- e p glcbirva são homóogos
- previstos cuja existê ncia não foi experimental mente
confirmada. Se o gene previsto funcionar mesmo como
- um gene, provavelmente os genes ortólogos existem nas
espécies relacionadas.
- Sequências codificadoras conservadas As análises ge -
nômicas comparativas podem facilitar a descoberta de
genes anteriormente não anotados. As sequê ncias con -
servadas nos genomas de duas ou mais espécies são
- mais propensas a ser funcionais ( por exemplo, a codifi -
car genes) que as sequências nào conservadas. Em vir-
tude da redundâ ncia do código gen ético, frequentemente
as sequências de aminoácidos das proteínas sáo mais
conservadas que as sequências de nudeotideos que as
codificam. Desse modo, durante as buscas por sequén -
das codificadoras conservadas, as sequências de nude -
otídeos de cada um dos genomas sáo traduzidas antes
em todas as seis possíveis matrizes de leitura e depois as
sequéndas de aminoácidos hipotéticas sáo comparadas
(ver tblastx na Técnica de Pesquisa 18.2). As sequências
conservadas podem ser utilizadas então para controlar o
exame experimental dos genes previstos, levando ao refi -
namento da anotação gcnòmica.
A anotação gênica pode ser dificultada por uma
falta de homologia com genes conhecidos, e os genes ou
éxons de tamanho pequeno ( por exemplo, codificando
proteí nas de menos de 100 aminoácidos ) sáo particu -
larmente difíceis de prever. Considere que os códons
de parada ocorrem, em média, uma vez em 21 códons
(3/64) em uma sequê ncia aleatória. Assim , as ORFs
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
aleatórias de 63 aminoácidos ocorrem com frequência
( aproximadamente 5% do tempo em qualquer sequên -
cia aleatória de 189 pb) . Além disso, nos eucariotos plu -
ricelulares, as sequências codificadoras dos genes são
fragmentadas cm pequenos éxons ( frequentemente co-
dificando menos de 100 aminoácidos) dispersos sobre
grandes distâncias, tomando, assim, um desafio sua
identificação inequí voca. A anotação desses genes é vi á -
vel apenas com evidências experimentais ou evidências
de sequências similares em outros genomas .
No caso das espécies de Saccharomyces ( ver Figura
18.12), as comparações entre os quatro genomas leva -
ram à previsão de mais de 40 genes previa mente nã o
anotados que codificam proteí nas entre 50 e 100 ami -
noácidos de comprimento. As comparações do genoma
humano com os de outros vertebrados ajudaram na
identificação dos éxons e refinaram significativamente
a anota ção do genoma humano. Fsse é um aspecto em >
que o sequenciamento genômico de organismos genéti -
cos modelo aumentou bastante o conhecimento sobre
nosso próprio genoma.
Sequências nã o codificadoras conservadas Além de
ajudar a identificar matrizes de leitura abertas, as com -
parações genómicas também detectaram a presença de
sequências náo codificadoras conservadas (CNSs).
•
( ) Espécie A
E x o n I n t r o n Exon
Espécie 6 1 6
Porcentagem 100
da identidade 50 -
de sequência
Tempo
evolutivo
Um evento evolutivo provoca a separação
cas espéces B e A Inidalmeme. os genes
nas espécies A e B são idênticos
( b) Gene SHH
(éxons em azul )
100% r~
Conserva ção
da sequ ê ncia
entre o
homem e
o camundongo
50%
100%
Conserva ção
da sequência
entre o
homem e Uma CNS localizada em um intron Co gene LM 8FJ controla a expressão do
oFugu gene SHH , ooe está situado a 1 megabase de distâ ncia da CNS. As mutações
50% da CNS pstâo associadas com poí dartilia nos camundongos e sems humanos
Figura 18.16 Impressáodigitalfilogenética. (a ) Evolução
de uma sequência náo codificadora conservada (CNS). ( b ) Uma
CNS associada com o gene SHH age como uma sequência
promotora que controla a expressão do gene SHH no broto
do membro em desenvolvimento .
621
O DNA não codificador já foi chamado “DNA inútil" ( um
termo originalmente cunhado por Sydney Brenner), pois
uma coisa in útil, ao contrário do lixo, é algo que tende-
mos a manter mesmo sem uma finalidade identificável.
No entanto, hoje sabemos que pelo menos parte desse
DNA náo codificador é funcional; ele contém sequências
regulat órias, centroméricas e teloméricas e genes que
produzem RNAs não codificadores funcionais, como os
genes de RNAmicro.
Existem dois métodos para identificar sequências
não codificadoras conservadas e eles abordam a tarefa
partindo de sentidos opostos. Na impressão digital filo-
gené tica , as sequências conservadas são identificadas
buscando sequências similares em espécies separadas
por grandes distâncias evolutivas ( Figura 18.16 ). De modo
oposto , na cópia filogenética as sequências conserva -
das são identificadas eliminando primeiro as sequências
nâo conservadas nas espécies intí mamente relacionadas.
_
As análises de sequência comparativas complementam
os experimentos de análise das sequências promotoras
(conforme descrito no Capítulo 17) e hoje são, frequen-
temente, a primeira etapa na previsão das sequências re-
gulatórias, que depois são testadas por experimentação.
As sequências regulatórias que controlam a expres -
são dos genes na maioria dos eucariotos pluricelulares
^É xon * intron
1
Ê :« ~ n
A
Exon Intron xon
8 T
100 - CMS
50
0
-
evolutivo
»
0
n^A /i
Ao tango do tempo, a porcentagem ce identidade de sequenda diminui nas
regiões não submetidas a uma forte seeçáa deixando picos de conserva ção
nos éxons e algumas sequências nâo codificadoras conservadas (CNS).
Gene RNF32 Gene LMBR 1
(éxons em verde ) (éxons em lilás)
1 Mb
Camundongo Homem
622 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

consistem em módulos potenciadores que abrangem O = Sequ ência NAO conservada entre as espécies
centenas e possivelmente dezenas de milhares de pares
.
de bases (ver Capítulo 15) Um grande n úmero de CNSs Homem
que correspondem a sequê ncias regulatórias foi identifi-
i i i
i i i
cado pela impressão digital filogenética usando compa
rações dos genomas de mamíferos e outros vertebrados
- Kl +
I +
Babu íno

=
i i i
.
( Figura 18.16a ) As comparações entre mamíferos e pei - U n {] | j [] Macaco Rhesus
xes mostraram que os módulos potenciadores podem ser i i i
conservados ao longo de grandes distâncias evolutivas (as
linhagens que levam aos peixes e seres humanos se sepa - Í - 1L — Ú
i i i
Colobo

raram aproximadamente 400 milhões de anos atrás) As . i i

Titi escuro
sequências nào codificadoras conservadas muitas vezes i
estão agrupadas no genoma e frequentemente sã o adja - i i i

centes aos genes conservados evolutivamente envolvidos fii mnnízft 1 I [] Macaco-aranha

nos processos básicos do desenvolvimento. Por exem
plo, as comparações entre os genomas do homem, ca-
- i
i
i
i i
Macaco-coruja
mundongo e fugu ( peixe- balão) identificaram uma CNS i i i
correspondente a um m ódulo potendador aproximada -
mente a 1 megabase de distância do gene Sonic hedge - n i i n ~
i Sagui
i
hog ( SHH ) ( Figura 18.16 b ). Quando essa CNS foi testada i i

quanto à atividade regulató ria, ela induziu a expressão de I

um gene repórter no camundongo de uma maneira remi-
niscente do padrão de expressão endógeno do SHH nos
brotos dos membros era desenvolvimento. Essa CNS é
funcionalmente importante, pois as mutações nesse mó-
dulo potendador estão associadas com a polidactilia nos
camundongos e em seres humanos.
A cópia filogenética identifica sequências conservadas
via comparação de várias espédes intimamente relariona -
das. Nessa abordagem, as sequências não conservadas em
pelo menos uma das espédes não são mais consideradas,
enquanto as sequências que são conservadas em todas as
espédes são consideradas possív eis sequências funcionais.
A cópia filogenética das sequências de primatas identi-
ficou sequências funcionais no genoma humano exami-
nando as sequências que não mudaram em qualquer uma
das várias espédes de primatas ( Figura 18.17 ) . .
Observa çã o gen ética As aná lises genômicas compa
rativas refinam a anotação gen ômica descobrindo sequências
de DNA conservadas. As sequéndas nào codificadoras conser -
vadas de diferentes idades evolutivas podem ser identificadas
peia impressão digital filogenética e pela cópia filogenética.
Comparações genômicas interespecíficas:
ordem dos genes
Assim como a história evolutiva dos organismos e
genes pode ser reconstitu ída pelas comparações dos ge-
nomas, o mesmo ocorre com as histórias evolutivas dos
cromossomos. Por exemplo, os seres humanos possuem
2n = 46 cromossomos, mas nossos parentes mais pró-
ximos (chimpanzés, gorilas, orangotangos ) têm um par
adicional de cromossomos, 2n = 48 (ver Figura 13.29).
A compara ção dos cromossomos dos seres humanos e
desses outros primatas quanto à sintenia a ordem
conservada dos genes consecutivos ao longo do compri-
— Outra característica impressionante da maioria dos
mento de um cromossomo ou segmento cromossòmico
t 1
Sequências conservadas entre todas as espécies
08004 Mocmflan PuCWm LW
Figura 18.17 Cópia filogenética das espécies de primatas.
— mostra que um par de cromossomos em nosso an -
cestral comum se fundiu e formou um único cromos
somo, o cromossomo 2, nos seres humanos. Outras di-
ferenças menores entre os cromossomos dos primatas
podem ser consideradas por um pequeno n ú mero de
eventos de translocaçáo e inversão. A sintenia també m
pode ser observada nos mamíferos com relações mais
distantes, como entre as linhagens de camundongos e
seres humanos que divergiram cerca de 100 milhões de
anos atrás ( Figura 18.18) A informação da sequência
genô mica pode fornecer visões detalhadas da sintenia
entre organismos até mesmo com relações mais distan
tes. Por exemplo, essa informaçã o revelou as relações
-
entre os cromossomos de pássaros e mamíferos.
Mesmo se a sintenia cromossômica nào estiver con-
servada, às vezes a sintenia no nível de apenas alguns
genes, chamada microssintenia, pode ser detectada. De
modo oposto, estudos comparativos revelaram grandes
quantidades de pequenas reorganizações entre as espé-
cies intimamente relacionadas. Em certo sentido, isso
pode ser considerado uma perda de microssintenia. A
presença de várias reorganizações pequenas sugere que
a estrutura cromossômica é dinâ mica em uma escala
local. Um exemplo de perda de microssintenia pode ser
observado na perda de colinearidade estrita entre os cro-
mossomos de camundongos e seres humanos, exibida na
Figura 18.18. Conforme discutiremos mais adiante neste
capítulo, as pequenas reorganizações também são encon -
tradas dentro dos indivíduos de uma ú nica espécie.
genomas cucarióticos examinados até hoje é a evidência
de duplicações pregressas do genoma inteiro e também
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 623

Exemplo de sintenia humano-camundongo de duplicações menores envolvendo apenas segmentos

de cromossomos. A evidência das duplicações do genoma
STCH Stcb inteiro e das duplicações menores dos segmentos cromos-
sòmkros pode ser encontrada no genoma da Arabidopsis
na Figura 18.19. As duplicações do genoma inteiro ( por
Cromossomo Cromossomo 16
exemplo, poliploidia ) são particularmente abundantes nas
21 humano do camundongo plantas (ver Capítulo 13), embora nào se limitem a elas. A
evidência de duplicações genômicas pregressas é encon
.
-
trada nos genomas dos fungos (por exemplo, S cerevisiae )
e também nos genomas dos vertebrados ( por exemplo,
Danio rerió). As duplicações segmentares menores são
comuns em todos os genomas. Tanto a duplicação do ge-
NCAM2 noma inteiro quanto a duplicação segmentar resultam em
duplicações em escala maciça e, assim, contribuem signi-
ficativamente para a evolução génica e genômka.

Comparações genômicas interespecí ficas

Gabpa É conveniente falar do “sequenciamento do genoma
Ncam2 de uma espécie" como se um genoma representasse
GABPA App todos os membros dessa espécie, mas a lógica nos diz
APP
Grikl que n ào é bem assim. As diferen ças alélicas, definidas
GRíKI pelos polimorfismos nas sequê ncias de DNA, são a causa
TIAM 1 SodJ
S001 tniOrb
definitiva das diferen ças fenotfpicas entre os indivíduos
H fOPB Tioml de uma espécie. £ essa diversidade genética, a matéria -
IFNAR 1
IFHAR2
Runxl
Gart
-prima sobre a qual a seleção natural consegue agir , é
observada nas comparações intraespecificas dos geno-
GART Ifnar
SON Son mas de dois indivíduos quaisquer que não sejam clones.
RUNX 1 tfngr2 O estudo das distribuições alélicas é a base da gené-
CBR 1 Cbf tica populacional (assunto do Capítulo 22). Assim como
CBR3
OiAflB
Cbf 3
Chaflb
a história evolutiva da vida em geral está escrita nos ge-
S/MJ Sim2 nomas das espécies, a história evolutiva de uma espécie
H L CS Hlcs é refletida na distribuição dos alelos polimórficos entre
na Ttc3 as populações. Embora a genética populacional seja um
DYRK 1A Oyrkla
KCNJ6
campo estabelecido há muitas décadas, estamos apenas
Kcnjó
KCNJ 15 Kcnj ) 5 começando a examinar a diversidade genética sob uma
ERG Btt perspectiva genô mica.
ETS2 Ets2 As sequ ências que representam os genomas de or-
HMG / 4 Hmg 14
PCP4 ganismos modelo derivaram de cepas haploides indivi-
DSCAM
MX2
Pcp4
Dscam
Mx2
duais ou de uma cepa laboratorial endogâ mica ( homozi
gota na maioria ou em todos os lócus) de um organismo
-
MX 1 Mxl diploide e, assim, sem polimorfismos. A sequência de
TFF3 T f f3 Cromossomo 17
CBS Cbs do camundongo DNA do indivíduo ou dos indivíduos utilizados para
CRYAA rCryal construir a sequência genômica completa inicial se
CSTB Cstb chama sequ ê ncia genômica de referência. Os polimor-
02 / S20S6E Nnpl fismos nessas espécies podem ser identificados compa-
TMFMI UbeJg2
PFKL pfkl rando as sequências genô micas de diferentes cepas co-
C210RF2 Smt3h 1 letadas de diferentes populações derivadas da natureza
UBE2G2 ttgb2 com a sequência genô mica de referência. Esta pode ser
SMT4H 1
ÍTGBJ
Tmeml
DJ 0Jhul 3e Cromossomo
usada para apressar a reunião dos dados do sequencia -
ADARB 1 Co/ IBal
10 do mento shotgun do genoma inteiro (WGS) de cada novo
COL 19A1 camundongo indivíduo. Pelo uso das tecnologias de sequenciamento
Co/ 16a 1
SLC19A 1 CoMt
í de última geração, esse "resscquenciamcnto" dos geno-
COL6A 1 Lss
COL6A2
mas é barato e está se tornando cada vez mais comum.
SlOOb
LSS Hrmtlll Duas questões intrigantes surgem no curso do es-
S 100B Adorb 1 tudo da diversidade gené tica dos seres humanos pelas
HRMT1L 1 Slc19a 1 análises genô micas: (1) Até que ponto a sequê ncia ge -
Figura 18.18 Sintenia entre os cromossomos humanos e nô mica varia de uma pessoa para outra? (2) O que signi -
os do camundongo . fica ser humano no sentido genômico?
624 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
N ú mero do cromossomo
OKXX) PUUU*# I» LM
Figura 18.19 Duplica ções segmentares no genoma
.
da Arabidopsis As faixas coloridas conectam os
segmentos duplicados. As faixas torcidas conectam
os segmentos duplicados com orientações invertidas. Muitas
duplicações de segmentos são, frequentemente, rel íquias de
uma duplicação pregressa do genoma Inteiro.
Diversidade genética humana
Os dois primeiros projetos de sequenciamento do
genoma humano identificaram um conjunto limitado
de polimorfismos desse genoma. O DNA sequenciado
no projeto genoma humano, financiado com recursos
pú blicos, foi isolado de espermatozóides de uma série
de doadores anónimos e de leucócitos de doadoras anó-
nimas. Desse modo, vá rios alelos para um determinado
sítio foram revelados nos dados desse projeto. Por outro
lado, como o DNA sequenciado pela Celcra foi isolado
de um ú nico indivíduo, o fundador da empresa J. Craig
Venter , só põde ser detectado um máximo de dois ale
los em cada gene autossô mico.
- para o alcance global das diferenças genéticas entre os in-
No final de 2010, sequências genòmicas inteiras
de centenas de indivíduos estavam disponíveis, repre-
sentando grande parte da diversidade humana. Essas
sequê ncias incluíram o genoma de !Gubi, caçador-cole-
tor na Namíbia e membro da comunidade khoisan, uma
das mais antigas e diversificadas populações humanas;
-
do arcebispo Desmond Tutu, sul africano de ascendê n -
cia Bantu e grande defensor dos direitos civis; e de um
inuíte, um paleoesquimó da Groenlândia representado
por um cabelo de 4 mil anos de idade preservado na
terra congelada. Alé m disso, com o Projeto de Diversi -
dade do Genoma Humano, o sequenciamento do DNA
genómico de um amplo espectro de seres humanos pro
veniente de todos os continentes habitados identificou
milhões de polimorfismos que distinguem os indivíduos
e as populações, proporcionando assim uma visão sem
precedentes da diversidade genética humana.
SNPs e iodeis Uma amostra da variação do polimos
fismo de nucleotídeo simples (SNP) entre dois seres hu-
manos escolhidos aleatoriamente revela diferenças em
aproximadamente 1 em mil bases na sequência de DNA ,
ou aproximadamente 3 milhões de pares de bases nos
3 x 10* do genoma. A variação é maior nos genomas afri-
canos, coerente com o fato de a África ser o lugar onde
a nossa espécie surgiu. Estudos que produzem sequên -
cias genòmicas de pais e filhos indicam que a variação
do SNP se acumula em decorrência da mutação em um
ritmo de aproximadamente 30 novos SNPs em cada cé-
lula germinativa do indivíduo em cada geração.
Além dos SNPs, as análises dos genomas de vá rios
indivíduos revelaram uma alta frequência de inserção
ou deleçâo ( indel ) e pequenas versões de inversão no
genoma humano. Essas indels e inversões chamadas
—
coletivamente variações estruturais eram desconheci-
das porque são pequenas demais para serem detectadas
pela an álise do cariótipo. Um tipo específico de variação
estrutural, chamada variação no n úmero de cópias
(CNVs ), se deve a indels maiores que 1 kb de compri
mento. Embora muitas CNVs sejam pequenas, algumas
-
têm centenas de quilobases de comprimento, abrangem
vários genes c resultam cm alterações da dosagem gê-
nica. As maiores deleções est ão frequentemente nas re -
giões cromossõmicas presentes em mais de uma cópia
em razão de duplicações prévias, sugerindo que os genes
nos segmentos deletados teriam sido redundantes.
As comparações dos genomas de quatro doadores de
ascendência africana, dois doadores do Sudeste Asiá tico
e dois doadores caucasianos revelaram 1.565 varia ções
estruturais (CNVs ou pequenas inversões) e indicaram
que cada genoma humano pode diferir em centenas até
milhares de variações estruturais. Esse n ú mero provavel
mente é subestimado, pois esse estudo não solucionou as
-
CNVs menores que 5 kb de comprimento. Assim como
na variação SNP, os genomas dos doadores africanos
possu íam uma diversidade muito maior que os genomas
dos doadores não africanos. Como há dados limitados
sobre as CNVs, ainda não se sabe como elas contribuem
divíduos ou com que frequência as variações surgem.
História humana A distribuição dos alelos polimórfi -
cos entre as populações forneceu informações sobre a
história evolutiva dos seres humanos como espécie ( Fl
.
gura 18.20 ) Por exemplo, a diversidade humana é maior
nas populações africanas que nas não africanas, indi -
cando que são as populações humanas mais antigas e
que todas as populações humanas modernas derivam
de uma popula çã o africana ancestral . A maior parte da
diversidade alélica é compartilhada por muitas , ou até
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
mesmo a maioria, das populações humanas; mas tam
bém existem ‘'alelos privados" ( alelos restritos a uma
única população) para todas as populações.
A ampla maioria das SNPs e indels é neutra com
relação à seleção natural , mas uma pequena fração delas
determina diferen ças fenotipicas entre os indivíduos e
algumas são conhecidas como alelos vantajosos seleti
vamente, associados com a dieta e a adaptaçã o às con
dições ambientais. Por exemplo, a persistência da lac
tase, a capacidade para digerir leite in natura na idade
adulta, se deve a mutações de ganho de funçã o nas
sequências regulat ó nas do gene da lactose ( LCT ). Tais
mutações surgiram e foram selecionadas independente
mente nas populações do norte da Europa e da África
que adotaram o estilo de vida pastoril lácteo. Outro
exemplo claro diz respeito aos alelos em lócus que de
terminam a cor da pele: alelos que conferem cor de
pele escura ocorrem em ambientes com altos n íveis de
radiação UV e são ancestrais. A seleção dos alelos que
conferem cor de pele mais clara ocorre nos ambientes
com baixa radiação UV (em virtude da necessidade da
radia ção UV para a fotossí ntese da vitamina D3). Algu
mas vezes, migrações humanas recentes resultaram na
transferê ncia de certos alelos, como no caso das pessoas
de ascendê ncia norte europeia que vivem no ambiente
com elevada radiação UV em Queensland , Austrália , e
consequentemente exibem as maiores taxas de câ ncer
de pele no mundo.
Estudos indicam que o nível de diversidade gené-
tica entre os seres humanos é relativamente baixo com
parado com muitas outras espécies. Isso é interpretado
com o significado de que o Homo sapietts é uma espécie
comparativamente jovem e que as populações não ti
veram muito tempo para divergir umas das outras. Por
exemplo, em comparação com a variação da SNP hu
mana de aproximadamente 1 em l .(XX) bases, dois chim
panzés vão diferir em cerca de 1 em 500 bases e duas
linhagens endogàmicas de milho frequentemente vão
diferir em mais de 1 em 100 bases de DNA. É impor
tante enfatizar que a extensão das diferenças fenotipicas
entre dois organismos nã o está necessariamente correla -
cionada ao grau das diferenças genéticas. Por exemplo,
os cães podem exibir diferenças fenotipicas acentuadas
entre os indivíduos em razão da seleção feita pelos seres
humanos, apesar de terem uma variação de sequê ncia
mínima de apenas 1 em 670, aproximadamente.
Observa çã o gen é tica Os polimorfismos identificados
pelo sequenõamento genômico sào utilizados para estudar a
varia ção al élica nas populações. A variação genétka humana
é limitada em compara ção com murtas espécies e consiste em
.
SNPs indels e variações no nú mero de cópias.
O qut significa str humano Embora as comparações
entre genomas humanos diferentes forneçam informa
ções sobre o que nos faz indivíduos, precisamos exami -
nar nossos parentes primatas mais próximos para com -
625
- .
preender o que nos faz humanos Os seres humanos e
os chimpanzés divergiram aproximadamente 6 milhões
de anos atrás. As comparações entre seus genomas
ajudaram a definir atributos exclusivos do genoma hu -
mano que podem contribuir para as diferenças que dis-
tinguem as duas espécies.
- Aproximadamente 4,0% a 4,5% da sequência eu-
-- cromática em cada espécie é especifica da linhagem. As
substituições de nudeotideos simples que diferenciam
os dois genomas somam aproximadamente 30 milhões
( uma frequência de aproximadamente 1%, ou 10 vezes o
n ú mero entre dois seres humanos quaisquer). A ampla
- maioria das SNPs consiste em DNA não codificador, uma
vez que as proteínas ortólogas nos seres humanos e nos
chimpanzés são muito parecidas; 29% das proteínas têm
- sequê ncias idênticas e um par médio de proteínas ortólo-
gas difere em apenas dois aminoácidos. As indels somam
aproximadamente 5 milhões, mas contribuem para apro-
ximadamente 3% da diferença na sequência eucromá tica
entre os genomas humano e do chimpanzé. Os dois ge-
nomas também sofreram muitas mudanças em termos de
- ganho e perda de genes, já que divergiram de um ancestral
comum; os genomas do chimpanzé e do homem diferem
quanto à composição em centenas de genes.
Muitas das diferenças indel entre as duas espécies de-
vem -se à atividade especifica da linhagem realizada pelos
elementos transpon íveis, resultando na amplificação do
n ú mero de elementos. Por exemplo, elementos curtos
entremeados (SINEs; ver a descrição no Capítulo 13)
- são mais ativos no homem que nos chimpanzés. Existem
aproximadamente 7 mil inserções específicas da linhagem
no genoma humano, em comparação com aproximada -
- mente 2.300 no genoma do chimpanzé. De modo oposto,
o genoma do chimpanzé cont ém dois elementos retrovi-
- rais que são diferentes de quaisquer outros elementos re-
- trovirais em qualquer genoma e que devem ter sido intro-
duzidos por infecção da linha germinativa do chimpanzé
após sua divergê ncia da linhagem que leva ao homem.
- Como podemos determinar quais mudanças foram
funcionalmente importantes na evolução do ser hu -
mano? Uma primeira etapa é determinar se as mudan -
ças ocorreram na linhagem que leva aos chimpanzés ou
na linhagem que leva ao homem. Conhecer a sequ ê ncia
genòmica de uma terceira espécie mais distantemente
relacionada, como o Gorila , permite que os pesquisa
dores separem os alelos humanos e os do chimpanzé
-
naqueles que são ancestrais e nos que são derivados
( Figura 18.21 ). Os alelos humanos sã o considerados an-
cestrais se forem compartilhados pelo homem e pelo
gorila, mas diferentes no chimpanzé. De modo oposto,
considera - sc que os alelos humanos são derivados se
forem diferentes dos alelos compartilhados pelos chim
panzés e gorilas. Presume-se que a maioria das altera -
-
ções genéticas que fazem do homem uma criatura ú nica
consista em alelos derivados que surgiram na linhagem
- humana antes de sua separação dos chimpanzés.
( )s neandertats são descendentes de uma linhagem
que se separou dos seres humanos cerca de 400 mil anos
626 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

1
3 - índia A diversidade genética entre
europeus, asiáticos e australianos

4ê
é um subconjunto da diversxiade
encontrada na África, coerente
}
• Asia central como fato de essas populações
terem derrvaco de uma
população africana ancestral.
Europa - Asia oriental

-
-
D- ta<

H— } Américas

£ «Mui
J
J

As distâncias genéticas estão

-
cc Telactorvadas posltlvamente
com a geografia e a
linguagem, tanto gloòatmerue
«MM quanto dentro da África.

- África oriental

m
T

TM>Wl

- Afnca ocidental/central

—^
As populações africanas exibem

É a maior varação aenética,

coerente com o rato de a África
ser o berço de todos os seres
humanos modernos
IMK T 4»

} - Sul da À frka/pigmeus

•cr OAAAS/ Sarati A TlsMof

Figura 18.20 Cladograma mostrando as distâncias genéticas entre populações humanas. Á rvore filogenética baseada
em 1.327 marcadores poiimórficos: 848 microssatéiites, 476 indels, 3 SNPs.
 Capitulo 18 Genó mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
O de
A compara ção das sequências Gorila
espécies extintas permite a
GATCGAGCTT
inferência da sequência
presente no ancestral comum .
I I
Ancestral Ancestral
Chimpanzé
GATCAAG TT
J GATCAAG1 T T
I I
Alelos Ancestral Derivado
ancestrais O As sequências que
mudaram desde a
divergência do ancestral
comum se chamam
© As sequências presentes
\ alelos derivados.
no ancestral comum
são alelos ancestrais. Homem
GGTCAAGCTT
I I
Derivado Ancestral
Figura 18.21 Alelos ancestrais versus derivados .
atrás, saiu da África e viveu na Eurásia até 30 mil anos atrás.
O homem moderno saiu da Á frica um pouco mais tarde,
cerca de 65 mil anos atrás, e coexistiu com os neander
tais na Eurásia. Em meados de 2010, foi determinada
a sequência genómica de um neandertal , e as compa -
rações dos genomas dos neandertais, do homem e do
chimpanzé esclareceram o tempo de aquisição dos ale-
los no homem que sào derivados em relaçào aos chim -
panzés. ( >s neandertais compartilham com os humanos
a maior parte dos alelos derivados, indicando que essas
mudanças na evolução humana datam da época entre a
divergência homem chimpanzé e a divergê ncia homem
-neandertais. No entanto, no que diz respeito a alguns
genes, os neandertais possuem alelos ancestrais, apon -
tando assim para mudanças na linhagem humana após a
divergê ncia dos neandertais.
Como o homem moderno e os neandertais coabita
ram a Eurásia por milénios, persistem questões sobre a
ocorrência ou não de miscigenação entre essas linhagens.
As comparações entre o genoma dos neandertais e uma
série de genomas humanos sugerem que uma pequena
quantidade de fluxo génico ( i %-4%) pode ter ocorrido
dos neandertais para os ancestrais dos não africanos, mas
não dos africanos. À medida que mais genomas humanos
e de nossos parentes próximos, tanto existentes quanto
extintos, forem sequenciados, seremos capazes de obter
uma visão sem precedentes da nossa história evolutiva
recente. (Os métodos para analisar e interpretar esse tipo
de dado sào discutidos no Capítulo 22.)
18.3 A genómica funcional ajuda a
elucidar a função gênica
Embora a sequência genó mica forneça um catá
logo dos genes de um organismo, ela n ão proporciona
diretamente uma compreensão de como os genes con -
trolam o desenvolvimento e a fisiologia do organismo.
Para isso, precisamos saber quando e onde os genes
são expressos, os fenótipos dos alelos de perda e ganho
de função, que outros genes agem nas mesmas vias ou
627
em vias redundantes e com quais proteínas cada pro -
duto gé nico interage. A genómica funcional é o estudo
da função gênica pela perspectiva do genoma inteiro.
Tecnologias de alto rendimento, nas quais um grande
n úmero de genes é analisado simultaneamente, permi
tiram o exame dos padrões de expressão do RNA e das
-
proteínas, as interações gen éticas e as interações proteí
na - DNA e proteína - proteí na no nível do genoma. Além
-
disso, as tecnologias de alto rendimento facilitaram a
criação de alelos mutados de todos os genes no genoma
de algumas espécies genéticas modelo. Nesta seção,
descrevemos algumas tecnologias de alto rendimento
da genó mica funcional e consideramos o que aprende-
mos aplicando -as a organismos modelo.
Transcriptômica
Uma pista importante para a função de um gene
é quando e onde esse gene é expresso. O estudo da ex
pressão gênica pela perspectiva genómica se chama
-
- transcriptômica, e o conjunto de transcritos presentes
em uma célula ou organismo se chama transcriptoma.
O northern blotting é utilizado para analisar a expres -
são gênica ( ver Capitulo 10). No entanto, a análise de
northern não é propícia ao projeto de alto rendimento .
Duas técnicas de alto rendimento utilizadas para analisar
-
o transcriptoma são os micro arrays ( arrays ) de DNA e o
sequenciamento de alto rendimento do DNAc. Os arrays
de DNA são amplamente utilizados hoje em dia , mas o
sequenciamento de alto rendimento provavelmente vai
- se tornar o método dominante nos próximos anos.
Arrays de expressão e titing arrays Os micro-arrays de
DNA consistem em coleções de fragmentos de DNA sin -
tetizados, presos a um suporte sólido e representando as
- sequências presentes em um genoma ( Figura 18.22 ). Os
fragmentos de DNA tê m tamanho fixo, geralmente 25 a
70 bases. As sequências de DNA específicas sào sinteti-
—
zadas quimicamente em um substrato de sil ício, chamado
chip, em alta densidade de dezenas de milhares a mi
lhões de sequências de oligonucleotideos por array, com
cada sequência localizada em um ponto diferente. Após a
-
hibridaçào com uma sonda fluorescente representando o
DNAc, a intensidade do sinal de cada um dos pontos re -
flete a concentração da sequência complementar à sonda.
Para os genomas sequenciados , foram produzidos dois
-
tipos de micro arrays: arrays de expressão e titing arrays.
Um array dc expressão carrega sequências úni
cas de cada gene anotado do genoma. A hibridaçào de
-
um array de expressão com sondas de DNAc marcadas
produz informações quantitativas sobre os n íveis de
expressão relativos dos genes representados no array.
- O poder para examinar os padrões de expressão gé-
nica por meio do uso de arrays de expressão é limitado
apenas pelo grau em que o RNAm pode ser extra í do de
determinadas células e tecidos e convertido para DNAc
antes da marcação.
Um exemplo do brotamento da levedura S cere- .
visiae ilustra como os dados do micro -array podem
628 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

menos, sete. Genes com padrões de expressão simila -

Amostra experimental
res aos dos genes conhecidos poderiam ter, hipotetica
mente, papéis biológicos similares aos dos genes conhe-
-
Oligooudeo
y\/\/\/\/x
i cidos. Por exemplo, sabe-se que alguns genes “Precoce
1“ (ver Figura 18.23) atuam na sinapse dos cromossomos
t ídeo
RNA homólogos. Por extrapolação, outros genes Precoce 1
\ '
fp
5
«p p <p
© r® í®
/

\ cujas funções são desconhecidas també m podem ter pa

~
<' 0 S& /52? DNAc sintetizado com
p t? /15> ít) marcador fluorescente.
/ / h
-
V cro array com digonudeotideos
presos a um suporte sóiòo.
DNAc
I I
Hibridar a amostra experimental com
-
os oíigonucleotideos no micro array.
A Intensdade reiat va da fluorescência
Indica o nfvé de expressão relativo.
Figura 18.22 Análise do transcr
í ptoma usando arrays
de oligonudeotideos.
fornecer informações sobre a função dos genes não
identificadas previamente pelas abordagens gen éticas
prospectivas. As células da levedura diploide S. cere-
visiae produzem células haploidcs pelo processo de
desenvolvimento por esporulaçã o, que consiste em
meiose e morfogénese dos esporos. A partir dos estudos
de genética prospectiva, descobriu -se que aproximada
mente 150 genes estão envolvidos na esporulação e eles
poderiam ser classificados em quatro grupos definidos
pelos padrões de expressão e pelos fenótipos mutados.
Para examinar os padrões de expressão no nível do
genoma durante a esporulação, as células de levedura di
ploides foram induzidas a esporular, amostras de RNA
foram extraídas em sete momentos dentro de um inter
valo de 11 horas e seus níveis de expressão foram compa -
rados para identificar os genes cuja expressão foi induzida
.
ou reprimida ( Figura 18.23 ) Mais de mil genes exibiram
alterações significativas em algum momento durante o
processo de esporulação: em aproximadamente metade
desses casos os genes foram induzidos e na outra me
tade os genes foram reprimidos. Em outras palavras, uma
quantidade mais de seis vezes maior de genes em relação
aos que foram identificados previamente tendia a desem-
penhar algum papel durante a esporulação.
Os pesquisadores categorizaram os genes induzidos
de acordo com seus padrões de expressão, expandindo
os quatro padrões descritos anteriormente para, pelo
péis na sinapse dos cromossomos, sugerindo áreas de es
--
tudo experimentais para apoiar ou refutar os papéis pre-
vistos. De modo similar, as comparações das sequências
a montante dos genes regulados de modo coordenado
podem fornecer informações sobre a regulação genica.
Por exemplo, mais de 40% dos genes Precoce 1 possuem
uma sequência de consenso URS1 à qual se liga o fator
de transcrição UME6, sugerindo que esse conjunto de
genes é regulado de modo coordenado pelo mesmo fator
de transcrição. Os padrões de expressão gênica tempo-
rais durante a esporulação fornecem pistas para as fun -
ções de centenas de genes previamente não caracteriza -
dos, alguns com homólogos nos seres humanos.
A tecnologia dos micro-arrays está sendo aplicada
atualmente no estudo de câ nceres humanos, permitindo
a caracterização precisa da expressão gênica em cânce-
res semelhantes, mas diferentes em termos moleculares.
O segundo tipo de array, o tiling array de genoma
completo, contém todas as sequências do genoma ou de
um intervalo genômico, incluindo os íntrons, é xons, re-
giões nâo traduzidas ( UTRs ) e regiões intergênicas. Uma
das muitas aplicações de um tiling array de genoma
completo é o mapeamento preciso dos padrões de trans-
crição na sequência do DNA genômico ( Figura 18.24 ) .
O DNAc marcado é utilizado para .sondar tiling arrays
a fim de identificar as sequê ncias que estão sendo trans-
critas em RNAm ou outros tipos de RNA. Tais experi-
mentos facilitam a anotação gênica fornecendo dados
sobre a delimitação dos éxons e o comprimento das
UTRs, além de identificar transcritos inéditos. Os genes
- que ainda não foram anotados usando abordagens com
putacionais às vezes podem ser identificados pelo uso de
-
dados de expressão provenientes de um experimento de
tiling array gen ômico.
Outra aplicação dos tiling arrays de genoma com-
- pleto é a identificação dos sítios de ligação do fator de
transcrição. Isso é feito isolando os fatores de transcri
- çào e a cromatina ligada ao DNA genômico e utilizando
o DNA isolado como uma sonda nos micro-arrays. Os
fatores de transcrição, com a cromatina e o DNA asso-
ciados, são isolados das células vivas pelo cruzamento
químico das proteínas e do DNA juntos e depois por
um processo chamado imunoprecí pitaçáo da cromatina
- (Q\1P), usando um anticorpo especifico para a proteína
regulatória transcricional para precipitar a cromatina de
interesse. O DNA da cromatina isolada é liberado pela re-
versão do cruzamento. Os ligantes podem ser ligados nas
extremidades do DNA isolado, que depois é amplificado
pela PCR, c pode ser feita uma sonda a partir do produto
amplificado. Os pontos no micro-array que hibridam com
a sonda correspondem às sequências com as quais o fator
 Capitulo 18 Genômica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro

Sequências
potenciadoras
Horas
S
/
/
0 V 2 5 7 911
* ^^
/3 ^

:i
i
i
i
z
/
r
/
/
i
l <v
i 8
/ 8
£
i
i
/
Horas após a indução /
da esporulaçâo i
# •f
i
0 V 5 7 9 11 8
Asinhas verdes
*2 /
/
/
8
£
r
representam a repressão r
da expressão gônica r
r
relativa ao terr poO r
t
i
t
t
/
%
9
CL
9
3
5

Os genes podem ser

colocados em classes
baseadas nos padrões
de expressão qêr ca .
Asinhas verrreihas
representam a ativação
da expressão gênica
relativa ao tempo 0.

o
I
5

\
s
\
\
X 4»
\
\
5
s 2
X O

\1

I
\
X
X
\ -i

3T?

Figura 18.23 Análise dos padr ões de transcHçáo da levedura usando micro- arrays.
630 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada
Tiling array AnáJise dos três genes previstos
II AI1QT 2110
III AI 1 g 10^70
Fig ura 18 24 Usando tiling arrays para identificar a transcrição.
de constrição se ligou na célula. Essa técnica proporciona
uma visão genômica das interações proteína DNA e é co
nhecida coloquialmente como ChiP no chip.
Os tiling arrays gen ômicos também podem ser
utilizados para descobrir e analisar polimorfismos. Os
-
micro arrays são muito sensíveis, detectando diferenças
de sequência de um ú nico par de bases por meio de uma
redu ção na intensidade do sinal relativo à sonda que
tem 100% de complementaridade com seu alvo. Como
os micro - arrays utilizam uma sequência genômica de
referência, as diferen ças alélicas com relação a essa se-
quência são detectadas como uma redu ção na intensi -
dade da hibridaçào, onde reside a diferença alélica.
Aná lise do transcr
í ptoma pelo sequendamento de alto
rendimento As técnicas de sequenciamento de DNA
de alto rendimento (ver Capítulo 16) proporcionam
outra maneira de analisar o transcr í ptoma . Nessa
abordagem, o RNA é isolado das células de interesse e
convertido em DNAc, que depois é fragmentado e se
quenciado usando o sequenciamento de DNA de alto
rendimento. A sequência resultante é comparada com
a sequê ncia genômica de referência para identificar as
sequê ncias presentes na populaçã o de DNAc. A abor-
dagem de sequendamento tem duas vantagens sobre
as que utilizam micro-arrays. A primeira é que a abor-
dagem de sequenciamento tem potencial para ser mais
sensível. Uma vez que milhões de fragmentos de DNAc
podem ser sequenciados, os dados quantitativos preci
sos sobre os níveis de expressão gènica podem ser obti
dos. A segunda é que as abordagens de sequenciamento
conseguem distinguir mais facilmente entre os trans-
critos com sequências similares, como as variações de
splicing alternativo e as SNPs, que às vezes são dif íceis
de distinguir com as técnicas de hibridaçào.
A primeira aplicação do sequenciamento de alto ren
dimento à análise do transcrí ptoma do genoma da leve
dura foi publicada em 2008. Ela forneceu descrições pre
cisas das extremidades 5 e 3' dos transcritos e esclareceu
*
as anota ções gê nicas. Fm virtude do custo decrescente do
sequendamento de alto rendimento, esses métodos estão
Garram* Genes previstos
COMA
TFT ^experimentalmente
RNA detectado
A presença de barras vermelhas em um local
oode não se acredita que os genes ocorram
ÍV A|lgl 0630 - pode identificar regiões transcritas, não
previstas na anotação genômica original.
* Fonte de DNAc ( RNAm ):
. 1 Vi» Verde flores
Verrrdho = sementes com 3 dias
devida CAAAS
se tornando a escolha preferida para as an álises do trans-
criptoma e para a descoberta de polimorfismo.
Observa çã o gené tica Os mlcro-arrays e o sequencia-
mento de alto rendimento fornecem Informações sobre os
padr ões de expressão gêmea, melhoram a anotação gênka e
facilitam a descoberta dos polimorfismos.
Outros "ornas" e "ômicas"
Pela mesma lógica que produziu os termos genômica
as proteínas
teoma
— —
e transcriptômica, a proteò mica é o estudo de todas
conhecidas coletivamente como pro-
expressas em uma célula, tecido ou indivíduo.
Enquanto a bioqu ímica dos áddos nucleicos é previsível
— qualquer ácido nucleico pode formar par de bases com
qualquer outro ácido nucleico, dadas as sequ ê ncias com-
- —
plementares , a bioquímica do proteoma é complicada
pela gama muito maior de estruturas e funções proteicas.
O estudo das proteínas requer, assim, técnicas adaptadas
aos subconjuntos espedficos de proteínas. Várias tec-
nologias de alto rendimento foram desenvolvidas para
as análises proteômicas, incluindo técnicas para estudar
a expressão proteica, a modificação proteica e as intera-
-
-
-
teí na proteína
— —
ções proteína - proteína. Os exemplos das interações pro-
técnicas que revelam se e como proteí
nas diferentes interagem fornecem informações sobre
o funcionamento dos sistemas biológicos, identificando,
-
por exemplo, conjuntos de proteínas que formam um
complexo. Aqui, discutimos uma técnica para identificar
proteínas interagentes.
O sistema de duplo- híbrido é um mé todo de alto
rendimento para descobrir se duas proteinas interagem.
- Esse sistema se baseia na natureza modular do fator de
- transcrição GAL4 da levedura que se liga à sequê ncia
- de ativação GAL4 a montante (ou UAS J, que é um
^ ção dos
elemento potenciador, para ativar a transcri
genes envolvidos no metabolismo da galactose (ver Ca -
pítulo 15). Um domínio da proteína GAL4, o dom ínio
 Capitulo 18 Genômica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 631

( a ) O fator de transcrição Gal4 é modular . (b) Dez proteínas de levedura testadas em um

experimento reciproco de dois híbridos.
O domínio de 0 domino de ativação CAD)
ligaçãoao DNA (BD) interage com a RNA pol II
se liga à sequência para estfmular a transcrição.
-
GaW UAS
í AL?
Oo»r«rk> WRN;
Bait:
VMA6
A
f pdimerase
Transo VM.M;/
KWUAS jStquIntXpnimcm YPR 1QSC
YAL034W-A

- -.
OGaW 6D e o Gal4 AD podem estar
separados Cada urr deles pocie ser fundido
com uma proferia diferente, o GaW-BO com a
-
proteína Balt e o GaW AD com a proteíra Prey,
para testar se essas duas proteínas interagem. Aajséncade 0 crescimento signfica
crescimento que as duas proteí nas
significa que as estão interagindo
Se a Bait e a Prey não duas proteínas não
-
irte aqirem, a transcrição não esiáo interagindo.
.
pode ser ateada e portanto,
não ocorre transcrição.
Apartrdosdadosce
intera ção de dois
Gê W D hbridos, jma rede de
^ Sem transcrição proteínas interagentes

^
j pode ser inferida.

Se a Bait e a Prey Interagirem,

o GaW-BO e o Gal4-AD sáu
Í YOL08 zH' -

Pt« y
GdM AD , conectados indiretamente e
a transcrição ocorre.
>OR3 3 >
S C »R120C) ~<APG13> (APG1)
YPR 105 C) A YGRl 20C age como um
.
'entrorcamer lo'coneaando
6JII4 fiO
Transcrição .
as cx tras pritenas.

02000 MKirMan Putetnom LM

Figura 18.25 Identificação das redes de interação proteína-proteí na, (a) O sistema de duplo-híbrido identifica as
proteí nas Interagentes. (b) A aplicaçã o do sistema de duplo híbrido identifica redes de proteínas interagentes.

de ligação ao DNA, liga - se à sequência UASGAIA , ; um .

segundo domínio, o domínio de ativação, ativa a trans
crição interagindo com a RNA polimerase II e também
com outros fatores da cromatina ( Figura 18.25 a|. Os
dois dom í nios podem estar separados fisicamente.
Para testar se duas prote ínas interagem , uma das
proteínas a ser testada é fundida por tradução (ver Capí
tulo 17) com o domínio de ligação ao DNA da GAL4 ( BD)
- Duas abordagens de dois h íbridos têm sido aplica
e a outra proteína a ser testada é fundida por tradução
ao dom ínio de ativação da GAL4 ( AD). Esses dois genes
quiméricos são transformados em uma ú nica cepa de le-
vedura. Se as duas proteínas interagirem, o GAI /t-BD e o
GAL4- AD serão reunidos e os genes ativados pela GAL4
serão transcritos. De modo oposto, se as duas prote í nas
não interagirem, não será observada qualquer transcrição
do gene repórter ativado pela GAL4. Para facilitar esse
processo de triagem, frequentemente é utilizada uma
cepa auxotrófica da levedura na qual a UASGAL4 induz a
expressão de um gene que vai complementar o defeito
auxotrófico. Por exemplo, um auxótrofo para histidina
por GAL4 esteja ativa ( Figura 18.25 b ) No entanto, certas
- interações não podem ser detectadas com o sistema pa -
drão de dois híbridos, incluindo aquelas em que as pro-
teínas interagentes não são transportadas eficientemente
para o n úcleo e aquelas em que as proteínas exigem uma
terceira parceira para a interação.
das com sucesso a muitos sistemas modelo, fornecendo
-
informações sobre suas redes de interação de proteínas .
Na S. cerevisiae, todas as combinações de pares de mais
de 6 mil proteínas codificadas no genoma foram testa -
das, proporcionando uma visão global das redes de inte-
ração de proteínas na célula da levedura viva (ver Figura
18.25b ). A soma de todas as interações proteí na proteí
na em um organismo é conhecida como interatoma.
- -
Abordagens genômicas para a
genética reversa
Um resultado surpreendente do sequendamento

-
com um transgene UASr AiA :HIS não vai crescer em um gcnômico foi a grande quantidade de genes identifica -
meio sem histidina, a menos que a transcrição mediada dos pela aná lise de sequê ncia , mas que previamente não
632 An á lise gen é tica: uma abordagem integrada

foram identificados pelas triagens genéticas prospecti

vas. Mesmo em um organismo intensamente estudado,
como a S. cerevisiae , apenas mil dos mais de 6 mil genes
no genoma foram identificados pelas triagens gen éti-
cas prospect í vas. Entre os 5 mil genes restantes, mais
ou menos, cerca de metade tinha alguma semelhança
de sequê ncia com os genes com uma função conhe
cida ou provável, enquanto a outra metade não exibiu
homologia com quaisquer outros genes conhecidos em
outros sistemas modelo. As análises de outros genomas
eucarióticos pluricelulares obtiveram resultados simila -
res. As técnicas de alto rendimento discutidas anterior-
mente podem fornecer informações sobre os padrões de
expressão gènica e as interações proteína- proteína, mas,
para compreender totalmente a fun ção gè nica, precisa
mos conseguir analisar os alelos de perda e ganho de
função. As abordagens gen éticas reversas (ver Capí tulo
17) proporcionam uma via experimental para explorar
esses alelos e, por meio deles, a função dos genes previa -
mente n ão identificados.
Uma ferramenta essencial para a análise genòmica
usando a genética reversa é uma coleção de alelos muta
dos para cada gene no genoma. No caso da S. cerevisiae ,
uma biblioteca de nocaute, contendo alelos de perda
de função por deleção de cada gene, encontra-se dispo-
n ível. Nas cepas mutados, o gene-alvo inteiro é substi-
tu ído por um gene marcador que confere resistê ncia ao
.
antibiótico canamicina ( Figura 18.26) Alé m disso, em
cada cepa de deleção, o gene da canamicina é flanquea
do por duas sequê ncias de 20 pb, chamadas códigos de
barras; um conjunto diferente de códigos de barra é
utilizado para cada cepa de deleção. Os códigos de bar -
ras permitem quantificação independente de cada cepa
mutada abundante quando cultivada em uma popula -
ção mista consistindo em vá rias cepas. Cepas mutadas
específicas podem ser verificadas e quantificadas pela
amplificação seletiva das sequências de códigos de bar
ras usando estratégias baseadas na PCR.
Uso de mutados de levedura para
categorizar os genes
Um desafio para o futuro é determinar com mais
precisão os papéis molecular e biológico de todos os
genes a fim de esclarecer por que eles são mantidos
no genoma . Como uma etapa inicial nessa direção, as
cepas de deleção da levedura foram analisadas para
categorizar os genes da S, cerevisiae como essenciais
ou dispensá veis para a vida. As cepas de deleção sã o
constru ídas na levedura diploide. A cepa de dele
ção diploide heterozigota é induzida a se submeter à
meiose, permitindo que os fenó tipos dos alelos de de
.
leçã o sejam analisados na progénie haploide Quando
as mutações em cada um dos 6.300 genes da S. cerevi
siae foram analisadas, os alelos de deleção dos 1.102
genes nã o foram recuperá veis na progé nie haploide
( Figura 18.27 ). Esses genes, aproximadamente 20% do
genoma da levedura, definem o conjunto gé nico es
- (a ) Construção dos mutados por deleção da levedura com
código de barras
UP kan* DN
ORF
i
- UP W DN
As regiões codificadoras de cada gene foram substituídas por um
gene marcador selecioná vei (por exemplo, resistência à
canarTKína) e os códigos de barras exdusvos de cada gene foram
adicionados a montante (UP) e a jusante (DN ) do gere marcador.
(b) Crescimento competitivo de conjuntos de cepas mutadas
por deleção
-
íiá
As cepas mutadas com códigos de barras podem ser cubadas em
concorrência com o tipo sebagem ou entre si. Neste exemplo, a
cepa “azul * não cresce tão bem quanto as ourras três cepas.O DN A é
- isolado antes e apóso crescimento, e cada gene pode ser aralisado
usanao primen de código de barras marcados com fluorescência.
Antes do Após o
crescimento crescimento
Amplificação por PCR dos códigos de
barras e marcação com fluorescência
-
I
I Hbndaçáo dos códigos de barras marcados
com um micro array de DNA
- A proporção relativa do crescimento decada cepa pode ser
examinada htoridando os produtos derivados de um micro-array
de DNA
09037 Mnr.mBan Pufcfaih** LM
F igura 18.26 Bibliotecas de nocaute com códigos de
barras para a análise fenotipica dos mutados.
sencial da S. cerevisiae , significando que são necessá -
rios para a sobrevivê ncia do organismo. Alé m disso,
186 dos mutados por deleção tinham um fen ótipo de
crescimento reduzido como heterozigotos antes da
indução da meiose, indicando, com isso, a haploinsu -
- ficiéncia desses genes. ( Lembre-se de que a haploin -
- suficiê ncia é um fenó tipo dominante nos organismos
diploides heterozigotos para um alelo de perda de
- função.) Para os 5 mil genes restantes, foram obti -
dos tanto os mutados haploides por deleção quanto
os mutados diploides homozigotos. Entretanto, 891
dessas cepas mutadas exibiram um defeito de cresci -
- mento lento em meio rico sob condições ideais, indi -
 Capitulo 18 Genô mica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro
-6.000 cepas de deleçào
O crescimento reduzido
dos diplokfes heterozigotos
identificou 186 genes Os mutados
haploides insuficientes. haploides letais
identificaram 1.102
genes essenciais.
- 5.000 mutados viáveis por deleçào
O crescimento reduzido
dos mutados homozigotos
identificou 891 genes
necessá rios em
.
condições ideais
-4.000 genes‘dispensáveis *
Genes testados em
1.144 condições de
crescimento diferentes
-
Para 3.800 genes, os
homozigotos exibem 205‘genes* podem
um defeito de crescimento ser question á veis.
em pelo menos
uma condição.
Figura 18.27 Análise global dos mutados por deleçào
da levedura.
cando que os genes sã o necessá rios para os processos
biol ógicos vitais em condições de crescimento ideais.
Isso deixa aproximadamente 4 mil genes para os quais
nenhum fen ótipo mutado óbvio é detectado em condi
ções de crescimento ideais. Esses genes são classifica
dos como dispensáveis, mas a classificação depende do
ambiente; em outras palavras, os genes são dispensá
veis (ou não essenciais ) em condições de cultura ideais
no laboratório.
Uma explicaçã o possível para a falta de fen ótipos
mutados evidentes associados com 4 mil genes dispen
sá veis da 5. cerevisiae é que os genes sáo necessá rios
apenas em condições de crescimento especificas. Para
testar essa hipó tese, cada cepa mutada foi cultivada em
uma série de condições ambientais, incluindo varia
ções na temperatura , composiçã o do meio e presença
de compostos antif ú ngicos, sais e outros produtos
qu í micos que reconhecidamente perturbam determi
nados processos biológicos. Como resultado, os gene -
ticistas de levedura descobriram defeitos mensurá veis
do crescimento em pelo menos uma condição ambien
tal para quase todos os 4 mil genes previamente iden -
tificados como dispensá veis. Desse modo, esses genes
são necessá rios para o crescimento eficiente em pelo
menos uma condição ambiental testada; eles n ão são
real mente “ dispensá veis" do ponto de vista evolutivo,
já que sua presença tende a proporcionar uma vanta
gem seletiva. Os defeitos de crescimento n ão foram
encontrados em apenas 200 dcleçòes, sugerindo que
(1) esses genes são autenticamente dispensá veis, ( 2) as
633
condições para testar sua importâ ncia n ã o foram satis -
feitas ou (3) sua anota çã o como genes est á incorreta.
Para analisar ma is os genes essenciais, são neces-
sá rios alelos condicionais. Trad ícionalmente , os alelos
sensíveis à temperatura isolados nas triagens gen éticas
tém sido utilizados para estudar as fun ções dos genes
essenciais. As bibliotecas de alelos condicionais pro-
jetados dos genes essenciais da S. cerevisiae també m
foram construídas para essa finalidade. Em uma abor
dagem, cada gene essencial é colocado sob o controle
-
de uma sequê ncia promotora repressível por tetraci
clina. Na ausê ncia da tetraciclina, o gene é expresso;
-
mas, ao ser adicionada a tetraciclina, a expressão gé -
nica é reprimida, criando um fenótipo de perda de
função. Em outra abordagem , uma etiqueta pept í dica
curta que confere degradação proteica induzida por
calor é adicionada às regiões codificadoras dos genes
essenciais. Sob a temperatura de crescimento normal
de 30 °C, a prote í na é estável; mas, a 37 *C, as prote í
nas etiquetadas sã o degradadas e perdem sua capaci
-
-
dade para funcionar.
Outros tipos de bibliotecas que foram construídos
proporcionam outras ferramentas para identificar fun -
ções gênicas potenciais na S. cerevisiae. Por exemplo,
uma biblioteca em que todos os genes são o resultado
de uma fusão por tradução com a proteína fluorescente
verde (GFP) permite a determinação visual da localiza
ção subcelular das proteínas.
-
A Observa ção Experimental 18.1 descreve o resul
tado de algumas tentativas para identificar o conjunto de
-
genes essenciais e o genoma m í nimo em certas bactérias.
- Observa çã o gen ética As bibliotecas de nocaute das
- mutações de peida de função permitem a detecçào de genes
essenciais e genes dispensá veis nas condições de crescimento
- padráo. Essas bibliotecas podem ajudar a definir as condições
de crescimento em que os genes, que de outro modo seriam
dispensáveis, demonstram funções essenciais.
-
Redes genéticas
A identifica ção das interações genéticas pode for -
- necer pistas para a função genica revelando se dois
genes interagem na mesma via ou em vias redundantes
( ver Capítulo 16). Os dados derivados dos mutados du -
- plos identificam conjuntos de genes interagentes que
definem redes genéticas.
Um exemplo extremo de interação genética é a /e -
- talidade sintética , em que a mutação de qualquer gene
isolado não é letal, mas a muta ção simultânea de ambos
.
os genes resulta em letalidade (ver Figura 16.5) Uma es-
timativa do n ú mero de interações sintéticas letais na S.
cerwisiae foi obtida usando mutados que representam
132 genes e analisando suas interações genéticas. Para
- os genes cujo fenótipo mutado simples é a inviabilidade,
foram utilizados alelos condicionais; para os genes dis -
pensáveis, foram utilizados alelos nulos. Cada um dos
132 mutados foi cruzado com 4.700 mutados viáveis por
634 An á lise gené tica: uma abordagem integrada

Observa çã o Experimental 18.1

Dicas filogenômicas procarióticas no genoma mínimo da vida

A $ análises genômicas de centenas de espécies bacteria- parte dos aminoácidos e vitaminas necessários para a vida .
nas produziram informações abundantes sobre a fisiologia e então as condições eram bastante benignas em comparação
a patogénese bacterianas. Como os genomas das bactérias com seus ambientes normais de crescimento.
variam tremendamente em tamanho, uma questão oriunda A maioria dos genes essenciais codifica as proteínas ne -
da genòmica comparativa é: quais componentes essenciais cessárias para atividades bioquímicas fundamentais, como o
constituem o genoma mínimo de um organismo de vida livre? metabolismo do DNA, RNA e proteína; a síntese do envoltó-
A definiçáo do genoma mínimo tem sido abordada a rio celular (lipídeos e parede celular ); divisão celular e funções
partir de duas direções. Uma abordagem compara os geno- energéticas celulares.
mas de bact érias distantemente relacionadas para identificar
os genes compartilhados, supondo que o conjunto de genes Genes essenciais na BacJIlus subtilis
compartilhados deve refletir os que são essenciais para as fun- Função Número
ções biológicas. A primeira comparação desse tipo, entre os
genomas da Haemophltus influenzoe e da Mycoplasmo genita-
Metabolismo do DNA 27
lium, identificou 256 genes compartilhados. As comparações Metabolismo do RNA 14
subsequentes entre outras espécies bacterianas e arqueais Síntese proteica 95
identificaram aproximadamente o mesmo número de genes.
Envoltório celular 44
Esses estudos assentam a base para estabelecer o genoma
mínimo, mas os números que eles fornecem tendem a ser Forma e divisão celular 10
subestimados em razão da incapacidade desse método para Glicólise 8
identificar os genes que divergem quanto á sequência, mas
Vias respiratórias 22
codificam proteínas com funções similares.
A segunda abordagem é descobrir quais genes sâo es- Síntese de nucleotídeos 10
senciais monitorando os efeitos das mutações em cada gene Cofatores enzimáticos 15
de um genoma. Isso pode ser feito pela mutagènese aleatória.
Outras 15
Os genes cujo fenótipo mutado é a letalidade são conside-
rados essenciais. Um estudo da Bociltus subttlis rompeu cada Desconhecidas 11
um dos seus aproximadamente 4.100 genes pela recombi- Total 271
naçáo homóloga. Nesses experimentos, apenas 271 genes se
mostraram essenciais. Esse número tende a ser uma subes- Mais da metade dos genes essenciais possui homólogos
timativa, já que os genes só foram ligeiramente inativados e nos eucariotos ou archaea, atestando a importância funda-
a redundância genética iria obscurecer a identificação de al mental dos produtos génicos para a manutenção da vida. Ou-
guns genes essenciais. Além disso, repare que a descrição dos tros genes essenciais, como os da síntese da parede celular,
genes como essenciais ou dispensáveis é relativa ao grau em eram mais restritos em termos filogenétkos, já que perten
que a classificação depende das condições de crescimento. ciam a processos fisiológicos consideravelmente diferentes
As bactérias foram cultivadas em meio rico contendo a maior em cada organismo.

deleçào e os fenótipos mutados duplos foram exami-
nados. Aproximadamente 4 mil interações letais sinté
ticas diferentes foram identificadas, envolvendo cerca de
mil genes diferentes. O n ú mero de interações por gene
variou de 1 a 146, com uma média de 34. Uma carac
terística impressionante desse estudo de intera ção ge-
nética é que os genes essenciais exibiram cerca de cinco
vezes mais interações que os genes ' dispensáveis'’. Esses
resultados sugerem que as redes genéticas consistem
em um pequeno n úmero de genes essenciais que parti
cipam de muitas interações e em um n úmero maior de
genes dispensáveis que participam de menos interações
(Figura 18.28).
Se o mesmo n ível de letalidade sinté tica existir
para os genes restantes no genoma da levedura, es-
tima- se que 200 mil interações sintéticas letais dife-
rentes vão ocorrer entre todos os genes da levedura
e que 1% de todos os mutados duplos vai resultar em
letalidade sinté tica. Desse modo, embora apenas mil
genes sejam essenciais nas condições de cultura labo -
ratorial ideais, conforme definido pelos fenótipos de
- mutados simples, outros genes se tornam essenciais
quando os organismos sã o comprometidos por uma
mutação em outro gene. Uma explicação para os ní -
- veis de letalidade sintética observados é que, onde
existem vá rias vias genéticas, algumas dessas vias
amortecem uma à outra , criando sistemas gen é ticos
está veis que sâ o mais capazes de suportar perturba -
ções ambientais e gené ticas.
- As redes genéticas definidas pelas interações gené -
ticas frequentemente identificam grupos de genes com
funções moleculares similares, como tradução, meta -
bolismo de lipídios ou repara ção do DNA ( ver Figura
18.28). Se um gene com função desconhecida pertencer
a uma rede genética na qual muitos genes possuem pa -
— —
péis conhecidos por exemplo, no metabolismo dos
lipídeos , experimentos para identificar a função mo
lecular do gene desconhecido poderiam começar pela
investigação do gene em questão e descobrir se também
-
exerce um papel no metabolismo dos lipídeos.
 Capitulo 18 Genômica: a genética do ponto de vista do genoma inteiro 635

Os genes com funções celulares

simldres tendem a formar redes Ç GID3
de genes nteragentes q
c fm* s CPP6 C O *' !1 VTFP!

Alguns genes, frequentemente ©

*
\\RPL [ 6* P FPM
SOS3 ©
YLR23SC c WY05
MON ro ’ CAPI
essenr ^is agem romo um C ^N YDL063C
CL&4 ; -:: CAP2 ARcTs
'entroncamento'e interagem PACIO B9CJ
com murtos outros genes , N8P2 - ( MAS ,

SUMI
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