ETI-EBV-M reverse

(P001605)
 TESTE IMUNOENZIMÁTICO
PARA IgM ANTI-ANTIGÉNIO DO CAPSÍDEO
DO VÍRUS DE EPSTEIN-BARR
Procedimento para a determinação quantitativa/qualitativa
dos anticorpos IgM dirigidos contra
o antigénio do capsídeo do vírus de Epstein-Barr
em amostras de soro ou plasma humano
Só para uso in vitro

1. INTRODUÇÃO
O vírus de Epstein-Barr (EBV) é o agente patogénico responsável pela mononucleose in-
fecciosa (MI) e está envolvido no linfoma africano de Burkitt (LB), no carcinoma nasofa-
ríngeo (CNF) e na síndroma linfo-proliferativa ligada ao cromossoma X (LPX). O vírus
EBV é um dos sete herpesvírus patogénicos para o homem. Como a sua difusão é ubiq-
uitária, infecta com aproximação 95% dos indivíduos durante sua vida em todo o mundo.
O ADN do EBV é composto por uma cadeia dupla com cerca de 172 kbases de compri-
mento.
O EBV transmite-se principalmente por via oral. O vírus EBV efectua sua replicação no
epitélio orofaríngeo e é liberado na saliva pelos linfócitos B infectados. Durante a infân-
cia, a infecção primária por EBV em geral é assintomática. Durante a adolescência ou a
idade adulta, contrai-se, em geral, uma mononucleose infecciosa sintomática. Após a in-
fecção primária, o vírus fica latente durante toda a vida.
O diagnóstico da mononucleose infecciosa baseia-se nos sintomas (caracterizados por
dor de garganta, febre, linfadenite mal-estar geral), associados a manifestações hema-
tológicas (linfocitose) e serológicas (presença de anticorpos heterófilos circulantes e/ou
anticorpos dirigidos contra as proteínas específicas do EBV).
Vários agentes patogénicos de doenças infecciosas podem provocar sintomatologia se-
melhante a da mononucleose infecciosa como, por exemplo, citomegalovírus, Toxo-
plasma gondii, vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência humana (HIV) e outros. Em-
prega-se, em geral, o termo síndroma de mononucleose enquanto não for identificado o
agente etiológico específico. Em geral, o diagnóstico de mononucleose infecciosa aguda
por EBV é confirmado com um teste para anticorpos heterófilos (aglutinação de hemá-
cias ovinas ou equinas pelo soro do doente). Todavia, é possível que seja difícil estabe-
lecer um diagnóstico, quando o teste para anticorpos heterófilos for negativo ou a sin-
tomatologia é atípica.
A mononucleose infecciosa negativa ao teste para anticorpos heterófilos é verificada em
10-20% dos adultos e, em percentagem ainda mais elevada, em crianças com mononu-
cleose infecciosa aguda. Pode-se confirmar o diagnóstico de mononucleose infecciosa
nesses doentes, detectando-se os anticorpos dirigidos contra proteínas específicas de
EBV, como o antigénio do capsídeo vírico (viral capsid antigen, VCA) e o antigénio pre-
coce difuso [early antigen-diffuse, EA(D)]. A presença de anticorpos da classe IgM anti-
VCA é essencial para estabelecer um diagnóstico de mononucleose infecciosa aguda.
Recomenda-se, entretanto, uma verificação da presença de anticorpos confirmadores –
tais como IgG anti-EA(D), ou IgG ou IgM anti-EBNA-1 predominantes – e uma verifi-
cação com informações clínicas suplementares. A presença de IgM anti-VCA e de níveis
transitórios de IgG anti-EA(D) em amostras negativas para anticorpos heterófilos é con-
siderada suficiente para formular um diagnóstico de mononucleose infecciosa aguda.
Os testes serológicos para as infecções por EBV permitem detectar respostas imunitá-
rias características em função do tempo. Sob o ponto de vista serológico, há uma in-
fecção primária por EBV quando se tem um aparecimento precoce de IgM anti-VCA
circu-lante e, a seguir, uma diminuição até níveis não detectáveis. Quase ao mesmo
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tempo, observa-se uma elevação dos níveis de IgG anti-VCA. A maior parte (> 80%) dos
doentes sintomáticos afectados pela mononucleose infecciosa apresenta níveis muito el-
eva-dos de IgG e de IgM anti-VCA no primeiro teste. A IgM anti-VCA desaparece da
circulação no decorrer de dois ou três meses após o início da doença, ao passo que a
IgG permanece de maneira indefinida nos indivíduos normais. A maioria dos doentes
desenvolve anticorpos anti-EA(D) de maneira transitória, mas a IgG anti-antigénio nucle-
ar do vírus de Epstein-Barr (Epstein-Barr nuclear antigen, EBNA) aparece na circulação
várias semanas ou até vários meses após o ínicio da doença e persiste durante anos, ou
mesmo por toda a vida. Nos doentes sintomáticos afectados pela mononucleose infecci-
osa, a detecção da IgG anti-EBNA, em combinação com a da IgM e IgG anti-VCA é útil
para diferenciar o estágio precoce da convalescença da fase aguda da doença. Uma el-
evação dos níveis da IgG anti-EBNA pode indicar uma passagem da mononucleose
infecciosa de convalescença precoce a avançada. Uma elevação dos níveis de IgG anti-
VCA indica a fase aguda da infecção, assim como uma elevação dos níveis de IgM anti-
VCA pode indicar a passagem da fase de incubação à fase aguda da doença. De igual
maneira, uma diminuição dos níveis de IgM anti-VCA pode indicar a passagem da fase
aguda da infecção à fase de remissão. Nos indivíduos adultos sadios, a presença de IgG
anti-EBNA indica que foram expostos ao EBV; a presença de IgG anti-VCA indica que
foram expostos ao EBV, tanto sob forma duma infecção primária subclínica, como duma
infecção sintomática.
Em virtude das relações complexas que existem entre a reacção do hospedeiro ao vírus
EBV e a sintomatologia, o acompanhamento da evolução dos níveis de anticorpos anti-
EBV pode ser útil para o diagnóstico de infecção por EBV. Os respectivos níveis dos an-
ticorpos específicos não são forçosamente os marcadores da doença, mas podem ter um
significado diagnóstico quando monitoram-se os perfís das respostas imunitárias. Os
perfís das respostas imunitárias para os vários antigénios de EBV demostram uma ev-
olução característica para a infecção primária subclínica, para a infecção latente persis-
tente e para cada uma das infecções associadas ao EBV.
O dispositivo utiliza o péptido sintético p18, um componente principal específico do com-
plexo antigénico do capsídeo vírico, identificado e caracterizado recentemente. O pép-
tido é composto de 56 resíduos de aminoácidos codificados pelo registo de leitura (open
reading frame, ORF) BFRF 3 e contém epítopos da proteína p18 seleccionados entre os
imunodominantes, capazes de detectar o VCA com alta sensibilidade e especificidade. A
expressão do antigénio VCA está associada à fase de revestimento do genoma vírico
com as glicoproteínas do capsídeo, que ligam os vírus aos receptores celulares. Estas
glicoproteínas são fortemente antigénicas e estimulam a síntese de anticorpos neutrali-
zantes dirigidos contra o vírus.
O teste serve para diagnosticar as infecções por EBV primárias ou reactivadas. A avalia-
ção da IgM anti-VCA nas amostras recolhidas em sequência permite determinar o está-
gio da infecção primária por EBV.

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2. PRINCÍPIO DO ENSAIO
O método imunoenzimático para a determinação quantitativa/qualitativa de IgM específi-
ca anti-antigénio do capsídeo do vírus de Epstein-Barr (péptido sintético p18) é um teste
imunométrico de captura de anticorpos, baseado na técnica de ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay), cujo esquema é ilustrado na Fig. 1.
1

incubação
(1 hora a 37°C)
+ lavagem

+ incubação
(1 hora a 37°C)
4
lavagem

incubação
(30 min à T.A.)
cromogénio/substrato solução de paragem

leitura no fotómetro a 450/630 nm e 405/630 nm.

Fig. 1

➀ Poço revestido com IgG (monoclonal de ratinho) anti-IgM humana.

➁ Amostra ou calibrador: IgM anti-p18.
➂ Péptido sintético p18 do VCA.
➃ Conjugado enzimático: IgG (monoclonal de rato) anti-p18 conjugada com peroxidase
de rábano (HRP).
A presença de IgM específica anti-p18 permite que o conjugado ligue-se à fase sólida at-
ravés da presença do péptido sintético p18 do VCA. A actividade enzimática é, portanto,
proporcional à concentração de IgM anti-p18 presente nas amostras ou nos calibra-
dores.
A actividade enzimática é medida pela adição duma solução incolor de cromogénio/sub-
estrato. A acção da enzima no cromogénio/substrato produz uma coloração que é med-
ida por um fotómetro.

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3. REAGENTES E ACESSÓRIOS

3.1. Reagentes fornecidos no dispositivo

Tiras sensibilizadas 12 tiras x 8 poços separáveis
Conjugado enzimático 1 frasco, 0,6 mL
Calibradores 4 frascos, 2,5 mL
Diluente do conjugado 4 frascos, liofilizado
Solução de reconstituição 1 frasco, 25 mL
Diluente das amostras 2 frascos, 50 mL
Tampão de lavagem 1 frasco, 40 mL
Cromogénio/substrato 1 frasco, 16 mL
Solução de paragem 1 frasco, 30 mL
Número de testes 96

ARMAZENAGEM: Depois da recepção, armazene todos os reagentes a 2-8°C, ao abrigo

da luz. Não congele. Após a abertura, os reagentes deste dispositivo permanecem es-
táveis durante 12 semanas, se mantidos de modo adequado, salvo indicação em contrá-
rio. O dispositivo é estável durante uma semana útil se utilizado oito horas por dia à tem-
peratura ambiente e conservado durante a noite a 2-8°C.
Não utilize reagentes expirados. O prazo de validade do dispositivo está descrito na et-
iqueta externa. O prazo de validade de cada reagente está descrito na etiqueta de cada
frasco.
Não misture reagentes específicos (veja §4.a) de lotes diferentes. Reagentes comuns
(veja §4.b) podem ser trocados entre os diferentes lotes.
3.2. Materiais fornecidos com o dispositivo
– 2 adesivos autocolantes pré-cortados para tiras
– 2 adesivos autocolantes inteiros para 12 tiras (uma placa)
– selador da embalagem das tiras.
3.3. Equipamentos e material necessários, mas não fornecidos
– Fotómetro de leitura vertical (como o leitor ETI-SYSTEM ou equivalente) com as seg-
uintes especificações:
comprimento de onda: comprimento de onda triplo, 405, 450 nm e 620-630 nm
largura de banda: ≤ 10 nm
faixa de absorvância: de 0 a ≥ 2 unidades de absorvância
repetibilidade: melhor ou igual a 0,005 unidades de absorvância, ou 1%, depende de
qual opção é maior
linearidade ou exactidão: melhor ou igual a 0,010 unidades de absorvância, ou 2%,
depende de qual opção é maior
fluctuação: menos de 0,005 unidades de absorvância por hora.
– Câmara húmida com termóstato (estufa) com as seguintes especificações:
temperatura: 37°C ± 1°C.
– Lavador manual ou automático dos poços (como o lavador ETI-SYSTEM ou equiva-
lente) com as seguintes especificações:
volume distribuído: 300-370 µL
número de ciclos de lavagem: 5
tempo de espera: 30 segundos
aspire a última alíquota de líquido distribuído: sim.
– Micropipetas com pontas descartáveis de 10 µL (exactidão ± 3%, precisão 2%) e 100,
200, 1000 µL (exactidão ± 2%, precisão 1%).
– Agitador Vortex.
– Tubos descartáveis de plástico.
– Suporte para tubos.
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– Material de vidro.
– Água destilada.
Os equipamentos ETI-STAR, ETI-LAB, ETI-MAX 3000 ou OMNI SYSTEM podem ser us-
ados para o processamento automático dos testes.

4. COMPOSIÇÃO E PREPARAÇÃO DOS REAGENTES

Todas as unidades de soro e plasma utilizadas para produzir os componentes deste dis-
positivo foram testadas para a presença de HBsAg, anti-HCV e anti-HIV-1/2 e os resulta-
dos encontrados foram não reactivos. Contudo, como nenhum método pode oferecer
segurança absoluta de que agentes patogénicos estejam ausentes, todas as amostras
de origem humana devem ser consideradas potencialmente infecciosas e manuseadas
com cuidado.

a) REAGENTES ESPECÍFICOS DO DISPOSITIVO

4.1. Tiras sensibilizadas

Os poços separáveis são revestidos com IgG (monoclonal de ratinho) anti-IgM humana
(específica para as cadeias µ). Os poços estão prontos a usar e devem ser armazena-
dos a 2-8°C.
Deixe os poços à temperatura ambiente antes de abrir a embalagem para evitar conden-
sação de água. Coloque os poços não utilizados na embalagem, feche hermeticamente
e mantenha a 2-8°C por oito semanas.
4.2. Conjugado enzimático (50x)
O frasco contém 0,6 mL duma solução de IgG (monoclonal de rato) anti-péptido sintético
p18 do VCA conjugada com peroxidase de rábano (HRP), tampão MES, albumina sérica
bovina, estabilizantes e conservantes.
Antes de usar, dilua a solução a 1:50 com o diluente do conjugado reconstituído (4.4)
(ex. 100 µL de conjugado + 4,9 mL de diluente do conjugado). Prepare apenas a quanti-
dade de conjugado necessária para o ensaio e mantenha o conjugado enzimático con-
centrado a 2-8°C. Não utilize a solução se esta estiver turva.
O conjugado enzimático diluído não pode ser armazenado e deve ser utilizado 10 min
após a preparação.
4.3. Calibradores
Cada frasco contém 2,5 mL duma solução de soro humano contendo IgM anti-péptido
sintético p18 do VCA, diluído em tampão PBS, albumina sérica bovina, estabilizantes e
conservantes. As concentrações dos calibradores são as seguintes: 5 - 20 - 80 - 140
UA/mL, onde UA é um valor arbitrário definido em relação a uma preparação de anticor-
po de referência. O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2-8°C. Não
utilize as soluções se estas estiverem turvas.
4.4. Diluente do conjugado
Cada frasco contém o péptido sintético p18 do VCA liofilizado, tampão MES, albumina
sérica bovina, IgG de rato, estabilizantes e conservantes.
Antes de usar, reconstitua o conteúdo de cada frasco com 5 mL de solução de reconsti-
tuição (4.5), deixe descansar por 10 min à temperatura ambiente e agite devagarinho
evitando a formação de espuma. A solução resultante é usada para diluir o conjugado
enzimático (4.2). Após a reconstituição, o reagente pode ser conservado durante quatro
semanas a 2-8°C. Não utilize a solução se esta estiver turva.

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4.5. Solução de reconstituição
O frasco contém 25 mL de água desmineralizada e conservantes. O reagente está pron-
to a usar e deve ser armazenado a 2-8°C. A solução é utilizada para reconstituir o con-
teúdo do frasco de diluente do conjugado (4.4).

b) REAGENTES COMUNS AOS DISPOSITIVOS EBV

4.6. Diluente das amostras

Cada frasco contém 50 mL duma solução de tampão PBS, albumina sérica bovina, Triton
X-705, Tween ® 20, estabilizantes, conservantes e um corante vermelho inerte. O rea-
gente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2-8°C. A solução é usada para diluir
as amostras.
4.7. Tampão de lavagem (25x)
O frasco contém 40 mL duma solução de tampão PBS, Tween ® 20 e conservantes.
Antes de usar, dilua o conteúdo do frasco num litro de água destilada. O tampão de lav-
agem de uso é estável durante uma semana a 2-8°C e é utilizado para lavar os poços.
Não utilize a solução se esta estiver turva.
Quando a solução concentrada de tampão de lavagem é armazenada a 2-8°C, como no
dispositivo ainda fechado, pode ocorrer cristalização; neste caso, aqueça o tampão a
37°C e misture bem antes de diluir.
4.8. Cromogénio/substrato
O frasco contém 16 mL dum sistema formado por tetrametilbenzidina e peróxido de hid-
rogénio. O reagente está pronto a usar e deve ser armazenado a 2-8°C, ao abrigo da
luz.
A solução deve ser incolor ou ter um tom levemente azulado. Se a mistura cromogénio/
substrato adquirir um tom de azul mais intenso, pode ter sido contaminada e deve ser
eliminada.
4.9. Solução de paragem
O frasco contém 30 mL duma solução de ácido sulfúrico 0,4 N. O reagente está pronto
a usar e deve ser armazenado a 2-8°C.
A solução de paragem está definida como irritante na lei norte-americana (29 CFR
1910.1200, Ap. A). Não é uma substância tóxica ou nociva em conformidade com a Di-
rectiva do Conselho 99/45/CE.

5. COLHEITA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

Pode-se utilizar tanto soro como plasma humano para o teste. Os anticoagulantes citrato
de sódio, EDTA e heparina foram testados e podem ser utilizados neste teste. O sangue
deve ser colhido assepticamente por punção venosa, deixado coagular e o soro deve ser
separado do coágulo tão cedo quanto possível. As amostras que contêm partículas sól-
idas, turvas, lipémicas ou com fragmentos de eritrócitos podem necessitar de
clarificação por filtragem ou centrifugação antes de serem testadas. As amostras muito
hemolisadas ou lipémicas, bem como as amostras que contêm partículas sólidas ou que
exibem evidente contaminação bacteriana, não devem ser utilizadas. Se o ensaio for re-
alizado dentro de 48 horas após a colheita das amostras, estas podem ser conservadas
a 2-8°C. Em caso contrário, estas devem ser subdivididas em alíquotas e congeladas
a –20°C ou a temperatura inferior. Se as amostras estiverem congeladas, deixe-as
descongelar e misture bem antes de utilizar. Evite ciclos repetidos de congelação e
descongelação.

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Diluição das amostras
As amostras devem ser diluídas a 1:101 com o diluente das amostras (4.6) antes do
teste. Distribua 10 µL de amostra e 1 mL de diluente das amostras nos respectivos tubos
para obter uma diluição a 1:101 e utilize um agitador Vortex para garantir uma mistura
homogénea.
Os calibradores estão prontos a usar e não devem ser diluídos.

6. PROCEDIMENTO PARA O TESTE QUANTITATIVO

Deixe todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25°C) antes do teste.
Execute todas as etapas do teste na ordem apresentada, sem muita demora entre cada
etapa.
Numere poços suficientes para efectuar o teste em duplicado dos calibradores e sim-
ples das amostras. Os calibradores devem ser testados em cada placa de amostras de
doentes. Os calibradores e as amostras devem ser submetidos ao mesmo processo e
tempo de incubação.
Prepare um poço livre para a determinação do valor do branco do substrato devido ao
reagente cromogénio/substrato.
Utilize uma ponta descartável para dispensar cada calibrador e amostra.
Identifique os poços dos calibradores e das amostras numa folha de dados. Distribua os
calibradores e as amostras segundo o esquema abaixo:

Legenda: O = poço CAL = calibradores

BLK = branco S = amostras.
Ajuste a temperatura da estufa a 37° ± 1°C.
1. Distribua 100 µL de calibradores e amostras diluídas nos respectivos poços, ex-
cepto no branco.
2. Aplique o adesivo autocolante para evitar evaporação. Bata devagarinho nos poços
de reacção para eliminar qualquer bolha de ar no líquido.
3. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.

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4. Prepare a solução de conjugado enzimático diluído (4.2 + 4.4) no final da primeira
incubação.
5. Quando completar a incubação, remova e elimine o adesivo autocolante e lave as ti-
ras com um equipamento automático ou semi-automático adequado: aspire o líquido
e lave os poços cinco vezes com um volume de tampão de lavagem variável entre
0,30 e 0,37 mL. Evite trasbordamentos dos poços de reacção. Independentemente
da utilização dum lavador automático ou semi-automático, o tempo de espera entre
cada ciclo de lavagem deve ser de 30 segundos.
Após a lavagem, inverta as tiras sobre um papel absorvente e bata devagarinho para
remover o excesso de líquido dos poços. Deixe as tiras invertidas sobre o papel até
ter lavado todas para evitar evaporação.
6. Distribua 100 µL de conjugado enzimático diluído em todos os poços, excepto no
branco. Repita a etapa 2.
7. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.
8. Repita a etapa 5.
9. Distribua 100 µL de cromogénio/substrato em todos os poços.
10. Incube durante 30 ± 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da luz intensa.
11. Distribua 200 µL de solução de paragem em todos os poços na mesma ordem us-
ada para dispensar o cromogénio/substrato e com os mesmos intervalos de tempo.
12. Meça a absorvância da solução contida em cada poço a 450/630 nm e 405/630 nm
dentro de uma hora após a adição da solução de paragem.
Os equipamentos ETI-STAR, ETI-LAB, ETI-MAX 3000 ou OMNI SYSTEM podem ser us-
ados para o processamento automático dos testes.

7. CÁLCULO DOS RESULTADOS PARA O TESTE QUANTITATIVO

Quando são utilizados os equipamentos adequados, os valores de absorvância são for-
necidos em automático ao seleccionar o protocolo correcto. Quando um fotómetro de
leitura vertical diferente é utilizado, calibre o instrumento com o poço do branco, leia as
absorvâncias do conteúdo dos poços com os comprimentos de onda de 450/630 nm e
405/630 nm e subtraia o valor de absorvância a 630 nm dos calibradores e das amostras
dos valores de absorvância a 450 nm e 405 nm.
Os valores de absorvância a 450 nm que são superiores à capacidade de leitura linear
do fotómetro devem ser normalizados a valores de absorvância equivalente a 450 nm. O
valor de absorvância equivalente a 450 nm para uma amostra é obtido multiplicando o
valor de absorvância a 405 nm daquela amostra por 3,2.
Exemplo de cálculo
Os seguintes dados devem ser considerados apenas como exemplo e não devem ser us-
ados no lugar dos dados obtidos pelo utilizador.
Absorvância Absorvância
Descrição
a 450/630 nm a 405/630 nm
Calibrador 1 (5 UA/mL) 0,065 0,020
Calibrador 2 (20 UA/mL) 0,451 0,141
Calibrador 3 (80 UA/mL) 1,728 0,540
Calibrador 4 (140 UA/mL) 3,037 0,949
Amostra 1 2,036 0,636
Amostra 2 2,650 0,828

90
7.1. Critérios de validação do ensaio
As instruções abaixo devem ser usadas para validar o ensaio. Calcule e avalie sempre
as absorvâncias médias dos calibradores de cada placa, mesmo que estas pertençam ao
mesmo lote.
O valor de absorvância do poço do branco deve estar entre 0,000 e 0,150:
0,000 ≤ BLK ≤ 0,150.
A absorvância média do calibrador 1 deve ser menor que 0,150:
Cal 1 x < 0,150.
A razão entre a absorvância média do calibrador 4 e a absorvância média do calibrador
2 deve ser maior ou igual a 4:
Cal 4 x / Cal 2 x ≥ 4.
Caso contrário, o teste é inválido e deve ser repetido.
7.2. Interpolação dos resultados
Valide sempre o ensaio quando avaliar os resultados (veja par. 7.1, Critérios de vali-
dação do ensaio).
Quando um fotómetro de leitura vertical é utilizado, coloque as coordenadas em papel
linear-linear e faça a curva utilizando a ordenada (eixo dos y) para o valor médio de ab-
sorvância de cada calibrador em função da concentração de IgM anti-VCA expressa em
UA/mL na abscissa (eixo dos x).
Desta forma, obtém-se uma curva de calibração. Directamente da curva de calibração,
leia as concentrações de anticorpo expressas em UA/mL. Um valor em UA/mL maior ou
igual ao do calibrador 2 indica a presença de IgM anti-VCA. Um valor em UA/mL menor
que o do calibrador 2 indica níveis não detectáveis de IgM anti-VCA.
Pela interpolação da curva de calibração, as amostras resultan conter 94 UA/mL y 122
UA/mL de IgM anti-VCA e são, portanto, consideradas positivas.
As amostras com concentrações de IgM anti-VCA dentro da faixa de ± 10% do valor lim-
ite devem ser retestadas para confirmar o resultado inicial. As amostras repetidamente
reactivas devem ser consideradas positivas. As amostras não reactivas no segundo
teste devem ser consideradas negativas. Se o resultado sucessivo à repetição do teste
for confirmado como duvidoso, é necessário recolher uma amostra nova depois duas ou
três semanas e repetir o teste.

8. PROCEDIMENTO PARA O TESTE QUALITATIVO

Deixe todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25°C) antes do teste.
Execute todas as etapas do teste na ordem apresentada, sem muita demora entre cada
etapa.
Numere poços suficientes para efectuar o teste simples dos calibradores 1 e 4, em
triplicado do calibrador 2 e simples das amostras. Os calibradores devem ser testa-
dos em cada placa de amostras de doentes. Os calibradores e as amostras devem ser
submetidos ao mesmo processo e tempo de incubação.
Prepare um poço livre para a determinação do valor do branco do substrato devido ao
reagente cromogénio/substrato.
Utilize uma ponta descartável para dispensar cada calibrador e amostra.
Identifique os poços dos calibradores e das amostras numa folha de dados. Distribua os
calibradores e as amostras segundo o esquema abaixo:

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Legenda: O = poço CAL = calibradores
BLK = branco S = amostras.
Ajuste a temperatura da estufa a 37 ° ± 1 °C.
1. Distribua 100 µL de calibradores e amostras diluídas nos respectivos poços, ex-
cepto no branco.
2. Aplique o adesivo autocolante para evitar evaporação. Bata devagarinho nos poços
de reacção para eliminar qualquer bolha de ar no líquido.
3. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.
4. Prepare a solução de conjugado enzimático diluído (4.2 + 4.4) no final da primeira
incubação.
5. Quando completar a incubação, remova e elimine o adesivo autocolante e lave as ti-
ras com um equipamento automático ou semi-automático adequado: aspire o líquido
e lave os poços cinco vezes com um volume de tampão de lavagem variável entre
0,30 e 0,37 mL. Evite trasbordamentos dos poços de reacção. Independentemente
da utilização dum lavador automático ou semi-automático, o tempo de espera entre
cada ciclo de lavagem deve ser de 30 segundos.
Após a lavagem, inverta as tiras sobre um papel absorvente e bata devagarinho para
remover o excesso de líquido dos poços. Deixe as tiras invertidas sobre o papel até
ter lavado todas para evitar evaporação.
6. Distribua 100 µL de conjugado enzimático diluído em todos os poços, excepto no
branco. Repita a etapa 2.
7. Incube durante uma hora ± 5 min a 37° ± 1°C.
8. Repita a etapa 5.
9. Distribua 100 µL de cromogénio/substrato em todos os poços.
10. Incube durante 30 ± 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da luz intensa.
11. Distribua 200 µL de solução de paragem em todos os poços na mesma ordem us-
ada para dispensar o cromogénio/substrato e com os mesmos intervalos de tempo.
12. Meça a absorvância da solução contida em cada poço a 450/630 nm e 405/630 nm
dentro de uma hora após a adição da solução de paragem.

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Os equipamentos ETI-STAR, ETI-LAB, ETI-MAX 3000 ou OMNI SYSTEM podem ser us-
ados para o processamento automático dos testes.

9. CÁLCULO DOS RESULTADOS PARA O TESTE QUALITATIVO

Quando são utilizados os equipamentos adequados, os valores de absorvância são for-
necidos em automático ao seleccionar o protocolo correcto. Quando um fotómetro de
leitura vertical diferente é utilizado, calibre o instrumento com o poço do branco, leia as
absorvâncias do conteúdo dos poços com os comprimentos de onda de 450/630 nm e
405/630 nm e subtraia o valor de absorvância a 630 nm dos calibradores e das amostras
dos valores de absorvância a 450 nm e 405 nm.
Os valores de absorvância a 450 nm que são superiores à capacidade de leitura linear
do fotómetro devem ser normalizados a valores de absorvância equivalente a 450 nm. O
valor de absorvância equivalente a 450 nm para uma amostra é obtido multiplicando o
valor de absorvância a 405 nm daquela amostra por 3,2.
Exemplo de cálculo
Os seguintes dados devem ser considerados apenas como exemplo e não devem ser us-
ados no lugar dos dados obtidos pelo utilizador.
Absorvância Absorvância
Descrição
a 450/630 nm a 405/630 nm
Calibrador 1 (5 UA/mL) 0,062 0,019
Calibrador 2 (20 UA/mL) 0,464 0,145
Calibrador 4 (140 UA/mL) 3,051 1,097
Amostra 1 2,065 0,645
Amostra 2 2,714 0,848

9.1. Critérios de validação do ensaio

As instruções abaixo devem ser usadas para validar o ensaio. Calcule e avalie sempre
as absorvâncias médias dos calibradores de cada placa, mesmo que estas pertençam ao
mesmo lote.
O valor de absorvância do poço do branco deve estar entre 0,000 e 0,150:
0,000 ≤ BLK ≤ 0,150.
A absorvância do calibrador 1 deve ser menor que 0,150:
Cal 1 < 0,150.
O valor de absorvância de cada calibrador 2 deve estar entre ± 25% da absorvância mé-
dia do calibrador 2 (valor limite). Se um valor de absorvância do calibrador 2 não
preencher este critério, este deve ser eliminado e a média recalculada entre os dois val-
ores restantes:
0,75 Cal 2 x ≤ Cal 2 ≤ 1,25 Cal 2 x .
A razão entre a absorvância do calibrador 4 e a absorvância média do calibrador 2 deve
ser maior ou igual a 4:
Cal 4 / Cal 2 x ≥ 4.
Caso contrário, o teste é inválido e deve ser repetido.

93
9.2. Interpretação dos resultados
Valide sempre o ensaio quando avaliar os resultados (veja par. 9.1, Critérios de vali-
dação do ensaio).
O teste pode tornar-se qualitativo utilizando só o calibrador 2 com a função de calibrador
de cut-off. A presença ou a ausência de IgM anti-VCA pode ser determinada pela com-
paração do valor de absorvância das amostras com o índice de absorvância, que é dado
pela razão entre a absorvância da amostra e a absorvância média dos três calibradores
de cut-off (valor limite).
As amostras com índice de absorvância maior ou igual a 1,0 devem ser consideradas re-
activas para IgM anti-VCA. As amostras com índice de absorvância inferior a 1,0 devem
ser consideradas não reactivas.
No exemplo fornecido, as amostras são reactivas para IgM anti-VCA.
As amostras com concentrações de IgM anti-VCA dentro da faixa de ± 10% do valor lim-
ite devem ser retestadas para confirmar o resultado inicial. As amostras repetidamente
reactivas devem ser consideradas positivas. As amostras não reactivas no segundo
teste devem ser consideradas negativas. Se o resultado sucessivo à repetição do teste
for confirmado como duvidoso, é necessário recolher uma amostra nova depois duas ou
três semanas e repetir o teste.

10. CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPENHO

10.1. Especificidade analítica

A especificidade analítica pode ser definida como a capacidade do teste de detectar com
cuidado o analito específico na presença de factores potencialmente interferentes na
matriz da amostra (ex. anticoagulantes, hemólise, efeitos de tratamentos da amostra) ou
de reacções cruzadas com anticorpos potencialmente interferentes.
Estudos controlados de substâncias ou condições potencialmente interferentes demos-
traram que o desempenho do ensaio não é afectado por anticoagulantes (citrato de
sódio, EDTA, heparina), hemólise (até a 2,5 g/L de hemoglobina), lipemia (até a 10 g/L
de triglicéridos ou 10 g/L de colesterol), bilirrubinemia (até a 0,3 g/L de bilirrubina) ou um
ciclo de congelação e descongelação das amostras. Normalmente, a presença de anti-
corpos potencialmente interferentes (anticorpos heterófilos e anticorpos dirigidos contra
outros agentes patogénicos) não interfere de modo significativo no ensaio.
10.2. Precisão
Diferentes grupos de amostras, que contêm diferentes títulos de analito específico, fo-
ram testados para determinar a repetibilidade e a reprodutibilidade do teste (isto é, a va-
riabilidade intra e inter-ensaio).
Repetibilidade Grupo A Grupo B Grupo C
Número de determinações 10 10 10
Média (UA/mL) 3,89 35,48 127,28
Desvio padrão 0,65 1,48 4,37
Coeficiente de variação (%) 16,61 4,17 3,44

Reprodutibilidade Grupo D Grupo E Grupo F

Número de determinações 10 10 10
Média (UA/mL) 4,11 23,28 57,50
Desvio padrão 0,60 1,85 2,59
Coeficiente de variação (%) 14,61 7,94 4,51

94
10.3. Exactidão
A exactidão do teste foi controlada pelo teste de diluição.
Teste de diluição. Foram testadas diluições em série de dois soros que contêm uma
concentração elevada de IgM anti-VCA efectuadas com o diluente das amostras.
Concentração Concentração
Diluição esperada, medida, % Recuperação
UA/mL UA/mL
puro – 162,26 –
1:2 81,13 81,52 100,5
1:4 40,56 40,53 99,9
1:8 20,28 20,88 103,0
1:16 10,14 10,49 103,5
puro – 158,63 –
1:2 79,31 79,17 99,8
1:4 39,66 40,70 102,6
1:8 19,83 19,87 100,2
1:16 9,91 9,71 98,0

10.4. Especificidade diagnóstica

A especificidade diagnóstica é definida como a probabilidade do teste ser negativo na
ausência do analito específico.
A especificidade diagnóstica foi determinada ao testar 250 amostras seleccionadas
duma população presumivelmente negativa para IgM anti-VCA (dadores de sangue).
Cinco resultados positivos foram observados na população estudada (especificidade di-
agnóstica: 98,0%; intervalo de confiança a 95%: 93,40-99,35%).
A análise da distribuição dos valores, expressos em UA/mL, observados no meio duma
população negativa para IgM anti-VCA (n = 368), indica que 95% da população exami-
nada apresenta uma concentração aparente de IgM anti-VCA inferior a 13,3 UA/mL.
10.5. Sensibilidade diagnóstica
A sensibilidade diagnóstica é definida como a probabilidade do teste ser positivo na
presença do analito específico.
A sensibilidade diagnóstica foi determinada ao testar 100 amostras seleccionadas duma
população presumivelmente positiva para IgM anti-VCA (doentes com mononucleose in-
fecciosa em curso). Quatro resultados negativos foram observados na população estu-
dada (sensibilidade diagnóstica: 96,0%; intervalo de confiança a 95%: 90,07-98,90%).
A análise da distribuição dos valores, expressos em UA/mL, observados no meio duma
população positiva para IgM anti-VCA (n = 158), indica que a população examinada ap-
resenta uma concentração aparente de IgM anti-VCA superior a 20 UA/mL.

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11. VALORES ESPERADOS
Um resultado positivo (≥ 20 UA/mL) indica infecção recente (até no máximo três meses
antes do teste). Um resultado negativo (< 20 UA/mL), porém, não exclui com certeza
uma infecção aguda. Em caso de suspeita exposição ao vírus de Epstein-Barr, apesar
do resultado negativo do teste da IgM anti-VCA, é necessario recolher uma segunda
amostra ao menos uma semana mais tarde e testá-la para observar um aumento signifi-
cativo dos níveis de IgM ou IgG anti-VCA, que indica infecção primária em curso.
Os anticorpos da classe IgM anti-VCA podem, em geral, ser detectados nos doentes
com infecção primária recente por EBV, mas podem-se também encontrar nos doentes
imunocomprometidos sujeitos a reactivação da infecção por EBV. Nos doentes assin-
tomáticos, é possível observar títulos baixos de IgM anti-VCA, que indicam infecção cró-
nica activa por EBV.
A interpretação do resultado analítico depende da aplicação clínica específica do teste:
portanto, cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores clinicamente relevan-
tes para a população considerada. A prevalência pode variar de acordo com área geo-
gráfica, idade, condições socioeconómicas, raça, tipo de teste utilizado, modalidade de
colheita e preparação das amostras, dados clínicos e epidemiológicos dos doentes.
Esquema de reactividade em ELISA
Estágio de infecção por
IgG IgM IgG IgG EBV
anti-EA(D) anti-VCA anti-VCA anti-EBNA
– – – – Negativo para EBV
– – + + Infecção passada por EBV
– + – – Infecção primária por EBV
+ + + – (fase aguda)
– + + –
+ + + +* Infecção primária por EBV
– – + –* (fase de transição)
– – + + Infecção primária por EBV
+ – + +* (fase de convalescença)
+ – + +* Reactivação da infecção
+ + + +* por EBV
* É necessário recolher e testar uma segunda amostra.

12. LIMITAÇÕES DO TESTE

Contaminações bacterianas das amostras, ciclos repetidos de congelação e desconge-
lação ou inactivação pelo calor podem afectar os valores de absorvância das amostras
com consequente alteração dos níveis de anticorpos anti-EBV.
O diagnóstico duma doença infecciosa não deve basear-se no resultado dum único
teste, mas é necessário ter em consideração a anamnese e a sintomatologia do doente,
assim como os dados serológicos. Todavia, é importante lembrar que os resultados dos
testes serológicos devem ser interpretados com cautela nos doentes imunocomprome-
tidos.

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13. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Para obter resultados fiáveis, é necessário seguir correctamente as instruções de uso e
possuir uma adequada formação técnica. Em especial, é essencial uma boa precisão na
preparação e distribuição dos reagentes, na aspiração e na lavagem.
Resultados não reprodutíveis podem ser devidos a erros de execução, tais como:
– troca das tampas dos frascos
– uso da mesma ponta para dispensar soluções ou amostras diferentes
– exposição dos reagentes ou das amostras ao calor intenso ou a fontes de contami-
nação bacteriana
– lavagem inadequada dos poços
– contaminação dos rebordos dos poços com o conjugado ou com as amostras
– troca de reagentes específicos de diferentes lotes.
São indispensáveis as seguintes precauções adicionais:
– para evitar contaminação, utilize um dispensador limpo e exclusivo para o conjugado
enzimático
– o tampão de lavagem deve ser armazenado em recipiente limpo para prevenir con-
taminação com substâncias que inactivem a actividade enzimática.

14. REGRAS DE SEGURANÇA

– Manuseie com cuidado o cromogénio/substrato e a solução de paragem. Evite o con-
tacto dessas substâncias com agentes oxidantes ou com superfícies metálicas.
– Não coma, beba, fume ou aplique cosméticos durante a execução do teste.
– Não pipete as soluções com a boca.
– Evite o contacto directo com todos os materiais potencialmente infecciosos usando
equipamentos de protecção como luvas descartáveis, óculos e aventais. Lave bem as
mãos no final de cada teste.
– Evite salpicos ou formação de aerossóis. Qualquer reagente derramado deve ser la-
vado com uma solução de hipoclorito de sódio a 5% e tratado como material residual
potencialmente infeccioso.
– Todas as amostras, os reagentes biológicos e os materiais utilizados nos testes de-
vem ser considerados potencialmente capazes de transmitir agentes infecciosos. Por
isso, os resíduos devem ser eliminados conforme as regras emitidas pelos órgãos au-
torizados que administram o laboratório e conforme o regulamento específico de cada
país. O material descartável deve ser incinerado, os resíduos líquidos devem ser
descontaminados com uma solução de hipoclorito de sódio a 5% no mínimo durante
meia hora. Líquidos que contêm ácido deverão ser neutralizados antes do tratamento.
Qualquer material reutilizado deve ser autoclavado usando a abordagem de sobrede-
struição (overkill) (USP 24, 2000, p. 2143). Em geral, uma hora a 121°C é
considerado um tempo de esterilização adequado, mas os utilizadores devem verificar
a eficiência do seu sistema de descontaminação através de validação e utilização roti-
neira de indicadores biológicos.

97
 ESQUEMA DO TESTE

1 - DILUA AS AMOSTRAS A 1:101 COM O DILUENTE DAS AMOSTRAS.

2 - DISTRIBUA OS REAGENTES NOS POÇOS RESPECTIVOS DE ACORDO COM O

ESQUEMA ABAIXO, DEIXANDO UM POÇO VAZIO PARA O BRANCO:

REAGENTES N° DE REPLICATAS VOLUME

CALIBRADORES 1-3* 100 µL
AMOSTRAS DILUÍDAS 1 100 µL
* Variável depende se o teste é quantitativo ou qualitativo .

3 - INCUBE DURANTE UMA HORA A 37°C.

4 - ASPIRE O LÍQUIDO E LAVE MAIS VEZES COM TAMPÃO DE LAVAGEM.

5 - DISTRIBUA 100 µL DE CONJUGADO ENZIMÁTICO DILUÍDO EM TODOS OS

POÇOS, EXCEPTO NO BRANCO.

6 - INCUBE DURANTE UMA HORA A 37°C.

7 - ASPIRE O LÍQUIDO E LAVE MAIS VEZES COM TAMPÃO DE LAVAGEM.

8 - DISTRIBUA 100 µL DE CROMOGÉNIO/SUBSTRATO EM TODOS OS POÇOS.

9 - INCUBE DURANTE 30 MIN À TEMPERATURA AMBIENTE, AO ABRIGO DA LUZ.

10 - DISTRIBUA 200 µL DE SOLUÇÃO DE PARAGEM EM TODOS OS POÇOS.

11 - LEIA AS ABSORVÂNCIAS NO FOTÓMETRO A 450/630 nm E 405/630 nm.

Distribuído no Brasil por:

DiaSorin Ltda - CNPJ 01.896.764/0001-70
Av. Ermano Marchetti, 1435 B - Lapa - São Paulo SP
S.A.C 0800 7716216 e-mail: diasorin@diasorin.com.br

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ETI-EBV-M reverse / JUNE 2008 200/007-620
Rev. I

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