LÍPIDO E CAROTENÓIDE SIMULTÂNEO PRODUÇÃO POR BATERIA ALIMENTAR

STEPWISE CULTIVAÇÃO DE Rhodotorula mucilaginosa COM GLICEROL BRUTO

INTRODUÇÃO

Os lipídios têm amplas aplicações potenciais em vários setores industriais e

pode ser usado em alimentos, suplementação alimentar, oleoquímicos e
biocombustível produção, incluindo biodiesel. O crescente biodiesel a produção
depende essencialmente de óleos vegetais, o que levou a muitas discussões sobre a
competição com a produção de alimentos para animais (Koizumi,2015; Koutinas et al.,
2014). Nesse contexto, matérias-primas alternativas foram investigadas, com vários
estudos sobre a produção de lipídios microbianos (Angerbauer et al., 2008; Béligon et
al.al., 2015; Chang et al., 2013; Chen et al., 2013; Zhao et al., 2008). As leveduras
oleaginosas destacam-se entre as microrganismos produtores de lipídios devido à sua
alta taxa de crescimento e capacidade de assimilar uma grande variedade de fontes de
carbono (Moliné et al., 2012), como petróleo glicerol da produção de biodiesel. O
glicerol é o principal subproduto do biodiesel produção e aproximadamente 10% do
peso de o biodiesel é gerado no glicerol (Quispe et al., 2013). Com a crescente
demanda por biodiesel, esse subproduto é cada vez mais fácil de obter, reduzindo sua
capacidade comercial valor. De acordo com o relatório da UFOP para 2017/2018,
produção mundial de biodiesel totalizou 34,08 milhões toneladas em 2016. O mais
importante produtor de biodiesel era a União Europeia (12,61 milhões de toneladas),
seguido pelos Estados Unidos (6,21 milhões de toneladas) e Brasil (3,30 milhões de
toneladas). Portanto, soluções são necessários em relação ao uso do glicerol bruto
gerado nesta produção. Diferentes leveduras oleaginosas demonstraram uma
capacidade de sintetizar lipídios usando o glicerol bruto derivados da produção de
biodiesel como fonte de carbono (Liang et al., 2010; Saenge et al., 2011; Thiru et al.,
2011; Duarte et al., 2013). O uso deste subproduto para obter óleo microbiano pode
ser uma alternativa promissora, pois pode agregar valor à cadeia produtiva do
biodiesel, tornando-o mais competitivo (Silva et al., 2009). Contudo, os óleos
microbianos (principalmente de leveduras) não são uma alternativa viável para a
produção de biodiesel e outros processos de substituição de óleos vegetais,
principalmente devido aos custos de cultivo (por exemplo, aeração, agitação e
esterilização) (Koutinas et al., 2014; Tchakouteu et al., 2017). A levedura Rhodotorula
mucilaginosa mostrou um grande potencial de produção de lipídios e, como levedura
vermelha, tem a capacidade de sintetizar carotenóides, um bioproduto de alto valor
agregado que, se produzido simultaneamente, pode tornar o processo
economicamente viável. Carotenóides são pigmentos naturais amplamente utilizados
nos alimentos, indústrias farmacêutica, cosmética e de ração animal devido a suas
propriedades biológicas, como atividade antioxidante (Valduga et al., 2009). Maior
consumidor consciência em relação à saúde e alimentos funcionais desencadeou um
aumento na demanda por carotenóides, destacando a produção biotecnológica devido
à atividade biológica comprovada dessas biomoléculas. Assim, as condições que
favorecem o crescimento celular e lipídico acúmulo de carotenóides devem ser
investigados, incluindo o modo de cultivo. No processo passo a passo, a alimentação é
intermitente e permite a regulação da alimentação do substrato, impedindo uma
atividade inibitória no crescimento de biomassa e lipídios acumulação (Shuler e Kargi,
2012). Além disso, alguns autores encontraram aumento da produção lipídica em
processo de lote alimentado em comparação com o processo em lote (Fei et al., 2016;
Saenge et al., 2011). Esse cultivo estratégia pode ser uma alternativa promissora,
atraindo a atenção de vários pesquisadores quanto à produção de óleos microbianos
por esse processo (Anschau et al., 2014; Béligon et al., 2015; Cescut et al., 2014; Chang
et al., 2013; Fei et al., 2016; Pirozzi et al., 2014; Raimondi et al., 2014; Rakicka et al.,
2015). Entretanto, estudos que envolvem lipídios simultâneos e produção de
carotenóides por processos em lotes alimentados permanecem escassos. Portanto, o
principal objetivo deste estudo foi avaliar diferentes culturas graduais em lotes
alimentados estratégias para a levedura R. mucilaginosa CCT 7688 em meio bruto à
base de glicerol e os efeitos na concentração de biomassa, produção de lipídios e
produção de carotenóides.

MATERIAL E MÉTODOS

Cepa de levedura

A levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT 7688 Fundação André Tosello,

Campinas, Brasil) foi previamente isolada e identificada por nossa pesquisa grupo, e
caracterizada pela impressão digital por PCR, ou seja, a técnica de PCR com mini /
microssatélites (MSPPCR), de acordo com Libkind et al. (2003). A cepa foi reativada
transferindo-a para Inclinações do ágar de malte de levedura (YM), composto por (g L-
1): 10 glicose, 5 peptona, 3 extrato de malte, 3 extrato de levedura e Ágar 20. Os tubos
foram incubados a 25 ° C por 48 h.

Glicerol bruto

O glicerol bruto foi adquirido da BS Bios Indústria e Comércio de Biodiesel Sul

Brasil S / A, localizado em Passo Fundo (Brasil), obtido da produção de biodiesel de
óleo de soja degomado pela via metanólica. O glicerol bruto continha (%): 81,92
glicerol (monografias oficiais USP XXI, 1985), 11,29 umidade (AOCS, 2004), 5,38 cinzas
(Oficial monografias USP XXI, 1985) e 1,41 não glicerídicos matéria orgânica (por
diferença), pH 5,39. Pré-inóculo e preparação do inóculo para preparar o pré-inóculo,
dois tubos da cultura microbiana reativada foi raspada com 10 mL de diluente de
peptona a 0,1% em cada tubo para remoção das células de microrganismos e
transferidos para um Balão Erlenmeyer contendo 180 mL de caldo YM. O meio de
cultura foi preparado de forma concentrada para atingir a composição desejada após a
inoculação (10 g L-1 de glicose, 5 g L-1 de peptona, 3 g L-1 de malte extrato e 3 g L-1 de
extrato de levedura) e incubados em agitador rotativo (Tecnal TE-424, Brasil) a 25 ° C e
180 rpm (Spier et al., 2015). Após 48 h, 20 mL do pré-inoculo foram transferidos para o
meio do inóculo (180 mL) com a mesma composição e incubados sob a mesma
temperatura e condições de agitação. Após 72 h, o número de células foi contado em
um Câmara de Neubauer (108 células mL-1).

Cultivo em lote

O cultivo em lote foi realizado em 500 mL Balões Erlenmeyer com volume inicial
de 200 mL, agitador rotativo (Tecnal TE-424, Brasil) a 180 rpm e 25 ° C. O inóculo
correspondeu a 10% do volume inicial e o tempo total de cultivo foi 168 h. A
composição do meio (YMG) foi adaptado do caldo YM, substituindo a glicose com
glicerol bruto, mantendo o mesmo C / N razão (7,63). As concentrações dos
componentes foram estabelecidos usando o software Excel (ferramenta Solver)
(Microsoft Inc., EUA), considerando esta relação C / N e a composição dos
componentes em termos de carbono e nitrogênio, determinados em um CHNS / O
Analisador Elementar (Modelo 2400 Série II, Perkin Elmer, EUA), usando acetanilida
como referência (Tabela 1) A composição do meio foi (g L-1): 10,4 em bruto glicerol,
4,3 peptona, 2,6 extrato de malte e 3,4 leveduras extrato, sem ajuste de pH.

Cultivo em lotes alimentados por etapas

Primeiro, as condições de cultivo e o meio composição eram as mesmas no

modo lote e a curva de crescimento microbiano foi usada como base para
estabelecimento das estratégias de cultivo em lote alimentado. As duas primeiras
estratégias (YMG24 e YMG96) consistiram de alimentar 20 mL de solução aquosa (10%
de volume), contendo apenas glicerol bruto (104 g L-1), em diferentes tempos de
alimentação: um pulso no exponencial fase (24 h) ou fase estacionária (96 h). Novo
estratégias foram então propostas (Tabela 2), aumentando o número de alimentações
(YMG1, YMG2 e YMG3). Cultivos com a adição de 3 g L-1 de magnésio ajuste de sulfato
e / ou pH do meio de cultura a 4,5 também foram realizados (YMG4, YMG5 e YMG6).

Métodos analíticos

Durante o cultivo, foram coletadas amostras em intervalos regulares para

determinar a biomassa concentração, concentração de glicerol e pH. O lipídios e
carotenóides na biomassa recuperada foram determinados no final do processo.

Biomassa

As amostras foram centrifugadas (Eppendorf 5804 R, Alemanha) a 10414 × g

por 15 min, e as células (granulado) foram lavados com água destilada, centrifugados
novamente e ressuspenso. A densidade óptica foi então medida em um
espectrofotômetro (Bioespectro SP 220, China) a 600 nm. Usando previamente
estabelecido uma curva padrão para o microrganismo, a biomassa foi determinada a
concentração no peso seco das células (g L-1) para cada amostra (Choi e Park, 2003).

pH

O pH do sobrenadante foi medido com um pH medidor, conforme AOAC

(2000).

Glicerol

O glicerol no sobrenadante foi determinado pelo método descrito por Bondioli

e Bella (2005), com base na reação com periodato de sódio, com leitura de absorvância
a 410 nm. Os valores de absorvância foram convertidos para a concentração de glicerol
(g L-1) usando uma curva padrão predeterminada (Equação 1).

Tabela 1. Teor de carbono, nitrogênio e hidrogênio do componentes do meio de

cultura.

Tabela 2. Estratégias para cultivos em lotes alimentados por etapas.

Teor lipídico

O conteúdo lipídico, expresso em porcentagem de peso seco de células (%

CDW), foi determinado na biomassa (300-500 mg) usando o método de Bligh e Dyer
(1959), adaptado por Manirakiza et al. (2001) o a biomassa seca foi obtida através da
centrifugação (10414 × g por 15 min) do meio restante em final do cultivo, lavagem
com água destilada, centrifugação novamente, secando a 35 ° C (Michelon et al., 2012)
até peso constante e trituração em pó em um almofariz e pilão. A produção lipídica
total (g L-1) foi calculada multiplicando a concentração de biomassa pelo conteúdo
lipídico (Spier et al., 2015). Lipídico a produtividade (g L-1 h-1) foi calculada dividindo-
se o total de produção de lipídios pelo tempo.

Perfil de ácidos graxos

Para determinar o perfil de ácidos graxos, o lipídio fração foi esterificada para
obtenção de ácidos graxos ésteres (Metcalfe et al., 1966). As amostras foram depois
analisadas usando um cromatógrafo a gás (Shimadzu 2010 Plus, Japão), equipados com
um split / splitless injetor, uma coluna capilar Rtx®-1 (30 m × 0,25 mm de diâmetro
interno × 0,25 μm de diâmetro de partícula) e um detector de ionização de chama.
Hidrogênio foi usado como gás portador a uma taxa de fluxo de 1,25 mL min-1, e as
temperaturas do injetor e do detector foram de 260 ° C.

A temperatura inicial da coluna era de 50 ° C, aumentando a 200 ° C a uma taxa

de 6 ° C min-1, permanecendo 4 minutos nessa temperatura. Isto foi seguido por mais
aumento de 2 ° C min-1, até a temperatura atingir 240 ° C, no qual permaneceu por 10
min. Os padrões SigmaAldrich foram utilizados para identificar a gordura ácidos,
quantificados por normalização da área.

Concentração de carotenóides

Os carotenóides totais (CT) foram determinados de acordo com a metodologia

de Fonseca et al. (2011), modificado por Cipolatti et al. (2015). Por esta finalidade, 2
mL de dimetilsulfóxido (55 ° C) foram misturado com 0,05 g de biomassa seca (35 ° C
por 48 h), moído, peneirado (Tyler 115) e congelado (-18 ° C por 48h) A suspensão foi
agitada por 1 min a 15 min intervalos, totalizando 1 h. Posteriormente, 6 mL de
acetona foram adicionado e a amostra foi centrifugada (1745 x g para 10 min) para
remover o solvente. O procedimento foi repetido até as células ficarem incolores.
Segue 10 mL de NaCl a 20% p / v e 10 mL de petróleo foi adicionado éter ao extrato
solvente. Depois de agitar e separação de fases, o excesso de água foi removido com
sulfato de sódio (Michelon et al., 2012). A absorbância foi então medida em um
espectrofotômetro 448 nm (Machado e Burkert, 2015) e o total carotenóides foram
calculados usando a Equação 2, como relatado por Davies (1976).

Análise estatística

As experiências foram conduzidas em triplicado, utilizando ANOVA seguida pelo

teste de Tukey para verificar significante diferenças entre as condições de cultivo em
um nível de confiança de 95% (p ≤ 0,05), usando o Statistica 5.0 software (Stat Soft
Inc., EUA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Cultivo em lotes alimentados por etapas com Meio YMG Conforme mostrado
na Tabela 3, nenhum lipídio significativo foi observado acúmulo na CCT de R.
mucilaginosa 7688 para o cultivo descontínuo (teor lipídico de 8,5 % CDW e produção
lipídica total de 0,57 g L-1), provavelmente devido à relação C / N utilizada (7,63), sem
limitação de nitrogênio. A limitação de nitrogênio é geralmente o tipo mais eficiente
de regulação para induzir lipídios acumulação, uma vez que o carbono é distribuído
entre os diferentes grupos macromoleculares (carboidratos, lipídios, ácidos nucléicos e
proteínas) durante o processo microbiano fase de crescimento, e o nitrogênio é
essencial para a síntese de ácidos nucleicos e proteínas, necessários para a
crescimento celular. Com limitação de nitrogênio, o crescimento taxa diminui
rapidamente, enquanto a assimilação de carbono taxa diminui mais gradualmente.
Assim, o fluxo de carbono é canalizado para a síntese lipídica, permitindo acúmulo de
triacilgliceróis (Beopoulos et al., 2009). Angerbauer et al. (2008) estudaram o fermento
Lipomyces starkeyi usando glicose como fonte de carbono e observou um aumento no
conteúdo lipídico de 34% CDW a 68% CDW e produção lipídica total de 4,1 a 6,4 g L-1
quando a relação C / N mudou de 15 a 150.
 Com base na curva de crescimento de R. mucilaginosa CCT 7688 no cultivo em
lotes (Figura 1), estratégias YMG24 e YMG96 foram estabelecidos (Tabela 2), isto é,
glicerol bruto alimentado dentro de 24 horas ou 96 horas, respectivamente. É
importante notar que todas as etapas os cultivos em batelada começaram com o
mesmo meio utilizado no cultivo em lotes, a fim de fornecer inicialmente uma relação
C / N que promove o crescimento microbiano, seguida por alimentação bruta de
glicerol em intervalos de tempo específicos que fornecem um excesso de carbono e
um aumento na relação C / N que promove o acúmulo de lipídios, porque uma alta
produção total de lipídios depende da biomassa e conteúdo lipídico. Portanto, essa
estratégia de cultivo procura conciliar o alto teor de biomassa e lipídios para melhorar
a produção lipídica.

De acordo com a Tabela 3, um aumento na biomassa foi observada na concentração

(de 6,77 a 14,47 e 13,22 g L-1, respectivamente), provavelmente devido à maior
disponibilidade da fonte de carbono e presença de nitrogênio. No entanto, não houve
alteração nos lipídios. Contudo, sem diferenças significativas entre essas duas
estratégias.

Por outro lado, quando mais de uma alimentação com alimentos brutos foi
utilizado glicerol (YMG1, YMG2 e YMG3), a capacidade de síntese lipídica também
aumentou, provavelmente devido quantidade significativa de carbono introduzido no
meio, resultando em um aumento na relação C / N, favorecendo o acúmulo de lipídios
nas células. Uma das diferenças entre as estratégias YMG1, YMG2, e YMG3 foi o tempo
de alimentação (Tabela 2). Além disso, YMG2 e YMG3 exibiram mais uma alimentação
comparado ao YMG1 (Tabela 2). Esse carbono mais alto disponibilidade, juntamente
com o tempo de alimentação, permitiu maior acúmulo de lipídios em YMG2.
Comparado com o processo descontínuo, a produção total de lipídios aumentou em
mais de 400% nessa condição. Saenge et al. (2011) comparou os resultados dos
processos em lotes e lotes alimentados levedura R. glutinis TISTR 5159, e relatou que o
lote alimentado levou a um aumento de aproximadamente 41% na produção lipídica
total (de 4,33 g L-1 a 6,10 g L-1). Assim, a produtividade lipídica também aumentou de
0,058 g L-1 h-1 a 0,085 g L-1 h-1. Fei et al. (2016) compararam os processos por lote e
por lote alimentado e observou que o este último proporcionou um aumento de
produtividade de 0,28 g L-1 h-1 a 0,40 g L-1 h-1.

Não foram observadas diferenças significativas na concentração de biomassa

quando YMG24 e YMG96 são comparados com YMG1 e YMG2 (Tabela 3), apesar da
adição de quantidades crescentes de glicerol. Durante a fase de crescimento, o
metabolismo da levedura resulta em distribuição equilibrada de carbono entre as
quatros principais macromoléculas (carboidratos, lipídios, ácido e proteína). Em
condições de limitação de nitrogênio (aumento da relação C / N), causada por um
excesso de alimentação de glicerol, síntese de ácidos nucléicos e proteínas reprimidas
e a taxa de crescimento diminui (Beopoulos et al., 2009).
 Os diferentes tempos de cultivo para as diferentes estratégias também são
mostradas na Tabela 3. Os respectivos tempos foram estabelecidos de acordo com a
fase estacionária realização, onde a acumulação lipídica aumenta. Este fato está
associado às diferentes estratégias utilizadas porque a alimentação com glicerol leva a
um substrato de mais alta disponibilidade que afeta o crescimento celular e estende a
fase exponencial. As leveduras oleaginosas tendem a acumular lipídios na fase
estacionária, quando o nitrogênio presente no meio já está esgotado, canalizando o
fluxo de carbono para a síntese lipídica ao invés do crescimento, permitindo o acúmulo
de triacilgliceróis. Comparando o YMG1 e o YMG2 estratégias, um aumento no tempo
(de 168 para 240 horas, respectivamente), uma vez que a estratégia YMG2 apresenta
três mamadas em vez de duas, aumentando a quantidade de glicerol no meio, o que
proporcionou uma extensão no consumo dessa fonte de carbono.

O mesmo ocorreu para os ensaios YMG4, YMG5 e YMG6, que apresentou maior
tempo de cultivo quando comparado com as estratégias com um ou dois feeds.

Efeito do ajuste inicial do pH

Durante o primeiro cultivo sem ajuste de pH, foi observado aumento expressivo
do pH, atingindo pH 8 (dados não mostrados). Esses valores estavam acima daqueles
recomendados na literatura para crescimento microbiano, uma vez que os valores de
pH mais frequentemente relatados de 3 e 6 (Ageitos et al., 2011). Esse comportamento
indicou a necessidade de avaliar a influência do pH inicial do desempenho do
microrganismo. Portanto, um ensaio com ajuste do pH inicial a 4,5 foi proposto
(YMG4). O cultivo YMG4 levou a um aumento de lipídios conteúdo de 21,4% CDW a
44,3% CDW e total lipídios de 3,04 g L-1 a 7,81 g L-1 em comparação com o YMG2
submetido à mesma alimentação, sem ajuste do pH inicial. O pH final do o cultivo
YMG4 foi de 4,32. Comportamento semelhante foi observado por outros autores.
Karatay e Dönmez (2010) encontraram um aumento no conteúdo lipídico de 31,5%
CDW para 59,9% CDW para Candida lipolytica com um aumento no pH do meio de 4 a
5. Angerbauer et al. (2008) avaliaram o efeito do pH no cultivo de Lipomyces starkeyi e
encontrou um conteúdo lipídico de aproximadamente 7% CDW a pH 7,0 e
aproximadamente 56% CDW a pH 5.

Efeito da adição de magnésio

Conforme relatado por Taha et al. (2013), a adição de magnésio para o meio
favorece o lipídio acumulação no microorganismo. Baseado em estudos anteriores
(dados não mostrados), foram realizados ensaios proposto com a adição de sulfato de
magnésio ao meio de cultura inicial (YMG5, YMG6, com e sem ajuste de pH,
respectivamente). YMG5 resultou em conteúdo lipídico de 51,0% de CDW, biomassa
concentração de 21,00 g L-1, produção lipídica total de 10,72 g L-1 e produtividade
lipídica de 0,037 g L-1 h-1, com diferenças significativas em relação às outras condições
testados em relação à produção lipídica total e lipídios produtividade (Tabela 3).
Comparado com o lote processo (Tabela 3), essa estratégia representou um aumento
no acúmulo de lipídios e produção de biomassa de aproximadamente 500% e 200%,
respectivamente, e um aumento da produtividade lipídica e produção lipídica de
aproximadamente 12 e 19 vezes, respectivamente.

O perfil cinético de ambos os cultivos é mostrado em Figura 2. No cultivo em

lote, o pH permaneceu próximo a 8,0, valor considerado acima do recomendado na
literatura para o crescimento de microrganismos. Para Cultivo YMG5, após um
aumento para 8, os valores de pH diminuiu para 6 devido à alimentação gradual que
favoreceu acumulação lipídica. Espera-se uma diminuição no pH porque o acúmulo de
lipídios é seguido pelo ácido cítrico produção, levando a uma redução do pH
(Beopoulos et al., 2009). Em relação ao consumo de glicerol em a estratégia YMG, após
cada hora de alimentação, glicerol concentração quase dobrou em relação à
quantidade presente no meio de cultura e foi rapidamente consumido pela levedura,
enquanto que na estratégia de batelada, quase todo o glicerol foi consumido.

Quando comparado, YMG2 e YMG5, que diferem apenas no que diz respeito à
adição de magnésio, um aumento do conteúdo lipídico e produção lipídica observados,
com valores variando de 21,4% CDW a 51,0% de CDW e 3,04 g L-1 a 10,72 g L-1,
respectivamente.

Esse maior acúmulo de lipídios na presença de sulfato de magnésio pode ser

devido à ação do Mg2 + sobre o metabolismo celular durante a biossíntese lipídica.
Segundo Beopoulos et al. (2009), o A síntese de triacilglicerol ocorre a partir da via e
monoacilglicerol, em que o glicerol-3- o fosfato é acilado em ácido lisofosfatídico (LPA)
pela enzima glicerol-3-fosfato aciltransferase (SCT1), que gera ácido fosfatídico (PA)
após acilação pela enzima lisofosfatídica aciltransferase ácida (SLC1). Sofre
desfosforilação pela enzima ácido fosfatídico fosfo-hidrolase (PAP), tornando-se
diacilglicerol (DAG), que leva à formação de triacilglicerol (TAG) após a reação acil-CoA,
catalisada pela enzimas DGAT1 e DGAT2. De acordo com Taha et al. (2013), o
magnésio pode influenciar esse processo em duas etapas, a seguir: no PAP1
(dependente de Mg2 +), porque esta enzima requer Mg2 + como cofator para a
atividade catalítica, resultando em maior atividade e, consequentemente, maior
conversão para DAG; e no enzimas DAGT1 e DAGT2, que podem ter sua atividades
catalíticas favorecidas pela concentração de magnésio disponível, resultando em uma
maior conversão para TAG (Yen et al., 2008). Comportamento semelhante foi
observado por outros autores com outros microorganismos. Singh et al. (2016)
estudaram o comportamento da microalga Aurantiochytrium sp. na presença de
magnésio no meio de cultura (5 g L-1), e observou um aumento no conteúdo lipídico

de aproximadamente 17% CDW em comparação com o cultivo sem magnésio. No que

diz respeito ao fermento Trichosporon cutaneum, maior acúmulo lipídico e
concentração de biomassa foram observadas com o adição de 0,3 g L-1 de sulfato de
magnésio ao meio de cultura contendo hidrolisado de sabugo de milho (Chen et al.,
2013). Para Lipomyces starkeyi, um aumento na conteúdo lipídico de 41,6% CDW a
56,1% CDW foi observado em comparação com a adição de 0,5 e 1,0 g L-1 de MgSO4 .
7H2O para o meio de cultura (Zhao et al. 2008). Assim, pode-se afirmar que a adição
de magnésio para o meio de cultura estimula lipídios produção pelo microorganismo.

Perfil de ácidos graxos

Conforme mostrado na Tabela 4, o ácido linoléico foi o principal ácido graxo

encontrado no óleo produzido por R. mucilaginosa CCT 7688. É comum em milho,
girassol e óleo de soja, que são importantes óleos vegetais usados na produção de
biodiesel (Ma e Hanna, 1999). Kot et al. (2017) estudou a levedura Rhodotorula glutinis
CCT 7688 cultivado em meio de cultura contendo glicerol com pH entre 4 e 7, e
encontraram um aumento na síntese de ácido linoléico em detrimento do ácido oleico,
também encontrado em óleos microbianos, provavelmente devido ao aumento da
atividade das enzimas que convertem o ácido oleico em ácido linoleico. Liang et al.
(2010) estudaram Cryptococcus curvatus ATCC 20509 usando glicerol bruto como
substrato, e oleico encontrado (39,6%), palmítico (23%), esteárico (16,7%) e ácidos
linoléico (15,2%) como os principais ácidos graxos, enquanto Duarte et al. (2013)
encontraram linoleico (54,9%), oleico (25,5%), palmítico (9,8%), esteárico (13,5%) e
ácidos palmitoléico (0,4%) na biomassa de Candida sp. Embora os principais ácidos
graxos sejam os mesmos, em O presente estudo R. mucilaginosa CCT 7688 apresentou
proporções diferentes em comparação com os achados desses autores, com maior
teor de ácido linoleico (76,8%) e proporção expressiva de doenças palmitoléicas ácido
(13,5%) que geralmente é encontrado em pequenas quantidades. Além disso, um
pequeno conteúdo de ácidos graxos saturados foi observado, por exemplo, ácido
palmítico, em relação à outros microorganismos.

Além disso, é importante enfatizar a presença de ácidos graxos essenciais como

araquidônico, γ-linolênico, e ácidos α-linolênico no óleo de R. mucilaginosa CCT 7688,
embora em pequenas quantidades. Os seres humanos não podem sintetizar o ácido α-
linolênico, precursor de dois outros ácidos graxos poliinsaturados importantes,
incluindo ácido eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico ácido (DHA). Portanto,
deve ser ingerido na dieta (Nelson e Cox, 2013).

Carotenóides

R. mucilaginosa CCT 7688 foi capaz de sintetizar carotenóides associados ao

acúmulo de lipídios. No estudo, a estratégia de cultivo YMG5 correspondeu a melhor
condição para a produção de lipídios, resultando em produção volumétrica de
carotenóides de 2843,2 μg L-1, que representa cerca de duas vezes mais carotenoides
o processo em lote (Tabela 5). Sem diferenças significativas foram observadas entre as
demais estratégias, exceto para YMG2. No entanto, a produtividade carotenóide foi
9,87 μg L-1 h-1, que é menor do que o observado para YMG24 e YMG1. Saenge et al.
(2011) produziram lipídios e carotenóides da levedura Rhodotorula glutinis, usando
glicerol bruto como substrato. Isso resultou em um aumento de apenas 5% do total de
carotenóides quando passando do cultivo em batelada para o processo de batelada
gradual, enquanto o conteúdo lipídico aumentou aproximadamente 40%. Este
resultado pode ser devido à produção concomitante de carotenóides e lipídios, eles
podem competir entre si, pois tanto a produção vias requerem Acetyl Co-A como
precursor comum (Schneider et al., 2013). No entanto, no presente estudo, YMG5
resultou em um aumento de aproximadamente 111% na produção de carotenóides,
concomitante ao aumento na acumulação lipídica, comparado com o modo
descontínuo.

Os presentes resultados são consistentes com os encontrado por outros

autores. Kot et al. (2017) estudaram a produção concomitante de carotenóides e
lipídios em processo em lote, com valores de 3500 μg L-1 e 2,2 g L-1 do total de
carotenóides e lipídios, respectivamente, para Rhodotorula glutinis cultivada em meio
de cultura contendo glicerol e água residual de batata. Por outro lado, a adição de
magnésio e o ajuste do pH do meio não levou a aumento dos carotenóides
sintetizados, ao contrário aos resultados obtidos por outros autores. Cheng e Yang
(2016) avaliou a produtividade de carotenóides por R. mucilaginosa em um processo
descontínuo e relatou 21,4 % de aumento na quantidade de carotenóides volumétricos
(3082,4 μg L-1) com a adição de magnésio.

Portanto, lipídios e carotenóides simultâneos produção pode ser uma

alternativa atraente, com a possibilidade de sintetizar dois bioprodutos de interesse
comercial no mesmo cultivo, agregando valor ao processo.

CONCLUSÕES

Este estudo demonstrou que o cultivo em lotes de R. mucilaginosa CCT 7688,

conforme bem como a adição de magnésio e o ajuste do pH inicial, levou a
incrementos expressivos no total de produção de lipídios (aumento de 19 vezes),
conteúdo lipídico (6- aumento de dobras) e conteúdo de carotenóides (aumento de 2
vezes) comparado com o cultivo em lote. Este inovador estratégia de cultivo constitui
uma técnica potencial para contribuir para a viabilidade econômica de óleos
microbianos em comparação com óleos vegetais, com a simultânea produção de
carotenóides de alto valor agregado.