BIOLOGIA MOLECULAR

BASES DA BIOLOGIA MOLECULAR

Claudio Gomes Salles Junior

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Olá!
Você está na unidade Bases da biologia molecular. Nessa unidade, será estudado o que é a genética molecular,

quais os objetos de estudo dessa ciência, ou seja, o DNA e o gene, suas estruturas, funções e mecanismos. Você

verá ainda como historicamente essa ciência foi crescendo até chegar no patamar de desenvolvimento que

observamos hoje. Entenderemos o mecanismo das mutações genéticas, e as principais técnicas usadas para

manipulação dos ácidos nucléicos e de separação de moléculas.

Bons estudos!

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1. Genética Molecular
A curiosidade humana em saber os mecanismos que levam à variabilidade dentro de uma espécie e como as

informações são passadas entre as gerações não vem de hoje. Os trabalhos de Mendel, a partir da segunda

metade do séc. XIX, desvendaram um pouco desses mecanismos, dando as bases para a ciência que conhecemos

hoje como Genética. Contudo, foi somente a partir da década de 1970 que um conjunto de descobertas e um

rápido avanço nos conhecimentos e técnicas da biologia molecular permitiram o surgimento dessa área

denominada genética molecular ou engenharia genética, focada no estudo de métodos e técnicas que

permitam a manipulação do DNA no nível molecular, ou seja, das moléculas que a formam (GARCIA, 1996).

Em geral, o campo da genética molecular se embasa em um conjunto de técnicas capazes de fragmentar o DNA,

isolar, purificar, manipular e examinar um gene em específico. Segundo Garcia (1996), os principais

conhecimentos e descobertas que alavancaram esse campo foram:

Principais descobertas que alavancaram a Genética

Enzimas capazes de clivar (hidrolisar/ ”cortar”) o DNA em locais ou sequencias específicas dos genes, essas

enzimas foram denominadas enzimas de restrição;

enzimas capazes de unir esses fragmentos do DNA, chamadas enzimas de ligação;

os plasmídeos, estruturas capazes de ser usadas como carreadores de fragmentos do DNA dentro de um

organismo.

Esses processos levaram à possibilidade de se produzir organismos geneticamente modificados: os

transgênicos, a tecnologia da clonagem, a criação de anticorpos monoclonais, marcadores genéticos, e uma gama

de kits para diagnóstico de doenças genéticas, infecciosas e parasitárias.

Assista aí

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1.1 Histórico da descoberta do material genético

A genética Mendeliana foi o pontapé inicial para o esclarecimento dos mecanismos que explicam a

hereditariedade e consequentemente a variabilidade entre os seres vivos. Os estudos de Mendel foram

realizados em 1868, mas, apenas a partir de 1900, suas leis começaram a ser aplicadas e validades, ganhando

grande notoriedade. Em 1902, o médico inglês Archibald Garrod fez a primeira conexão causal entre os genes e

um efeito fisiológico, observando uma patologia rara conhecida como alcaptonuria, cujo principal sintoma é a

cor da urina. Garrod observou que, embora raro, essa doença era mais comum em filhos de pais consanguíneos,

sendo essa observação compatível com que era explicado pelas leis de Mendel (STRACHAN, 2002). Esse parece

ter sido o primeiro exemplo de herança mendeliana, ao constatar-se que os genes de certa forma controlavam

processos metabólicos, sendo que um erro ou mudança poderia acarretar em uma alteração nesses processos

metabólicos. Desde então, muitas outras condições como essas foram descritas, e hoje são conhecidas mais de

5.000 heranças mendelianas organizadas da base de dados da base Online Mendelian Inheritance in Man

(OMIM) (STRACHAN, 2002).

A partir dos estudos da cepa causadora de pneumonia, realizado por Griffith em 1928, descobriu-se que ocorria

a “transformação” de um agente não patogênico em patogênico. Ele evidenciou que essa transformação estava

associada a um componente celular, que foi chamado de “princípio transformador” e ainda observou que essa

substância parecia ser resistente ao calor, diferentemente das proteínas.

Os estudos de Griffith impulsionaram os questionamentos e as investigações sobre a natureza química das

unidades hereditárias, o que permitiria que os fenômenos biológicos pudessem ser compreendidos pelas leis

físicas e químicas. Nessa investigação, as proteínas pareciam ser as únicas moléculas capazes de armazenar

informações tão complexas, também devido a sua complexidade, porém não se entendia os mecanismos de

transmissão.

Com o desenvolvimento da tecnologia de métodos e técnicas ao longo dos anos, a composição química do DNA

começou a ser desvendada, sendo então identificados os componentes químicos fundamentais do código

genético, denominadas de ácido nucleicos. Demonstrou-se que cada unidade dessas tinha natureza polimérica,

e eram compostas de açúcar, fosfato e bases nitrogenadas (STRACHAN, 2002).

O grande marco para a genética e para a biologia molecular foi o projeto Genoma Humano, que teve a missão

de fazer o sequenciamento dos genes humanos, ou seja, ler e ordenar os códigos determinados pelas sequências

dessas bases nitrogenadas que formam o genoma da nossa espécie. Os avanços surgidos com esse projeto

permitiram comparar o genoma de pacientes saudáveis com o de pessoas com diferentes patologias para

identificar a causa de doenças monogênicas, por exemplo. Nesse estudo, cerca de 1.900 doenças monogênicas

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foram descritas. Atualmente, são conhecidas 6.499 doenças, associadas a alterações em 4.147 genes, conforme

base OMIM. Os avanços nas técnicas de biologia molecular, genética molecular e bioinformática foram essenciais

para desenvolvimento dos métodos de sequenciamento do DNA, o que trouxe o nascimento de uma nova era na

genética, medicina e diversas outras áreas (ZORZETTO, 2019).

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1.2 Estrutura e função do DNA

O foco da ciência conhecida como Genética Molecular é o estudo das duas moléculas, DNA e RNA, que são as

estruturas da célula responsáveis pela transmissão de características biológicas entre os indivíduos. De acordo

com Alberts (2011, busca-se, através desses conhecimentos, desvendar em detalhes quais os mecanismos de

funcionamento e transmissão dessas duas moléculas, para que isso possa ser usado em favor da humanidade.

Hoje é bem estabelecido que o DNA guarda toda a informação hereditária da célula e do organismo e que

essas moléculas estão empacotadas nos cromossomos, no interior do núcleo das células. Sabe-se também que o

DNA é formado por nucleotídeos. Ao estudar a composição química desses nucleotídeos, os “tijolos” que

constroem o DNA humano, verificou-se uma composição bem simples, basicamente formada por açúcar, ácido

fosfórico e uma base nitrogenada, o ácido fosfórico confere características ácidas a essa molécula, que por isso

foi chamada de ácido desoxirribonucleico (DNA).

Em relação à estrutura molecular, é formada por duas longas fitas unidas por ligações químicas chamadas de

pontes de hidrogênio, cada fita dessas é construída através dos blocos, compostos por quatro nucleotídeos,

denominados de bases nitrogenadas, podem ser dividias em: purinas – adenina e guanina; e pirimidinas –

citosina e timina (A, T, C e G, respectivamente). Além disso, a uracila (U) que está presente apenas na molécula

de RNA.

Figura 1 - Molécula de DNA

Fonte: Svisio, Istock, 2020

#PraCegoVer: A imagem ilustra uma molécula de DNA.

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A descoberta da estrutura molecular do DNA permitiu que os cientistas respondessem as questões básicas sobre

esse tipo de estrutura molecular, o que se mostrou fundamental para entender como é caracterizada a

informação genética nos indivíduos. O resultado disso foi a explicação sobre quatro propriedades fundamentais

do material genético, segundo Griffiths (2009), as quais podemos ver a seguir:

Estrutura diversificada

Apesar de apenas quatro tipos de nucleotídeos serem existentes em um filamento de DNA, essas unidades

podem estar em qualquer ordem, sendo que o pedaço de DNA, que caracteriza um gene, pode ter qualquer

tamanho. Mesmo que um gene tenha apenas 100 bases de tamanho, sabe-se que pode ter bem mais, seriam mais
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de 1.000.000 de combinações possíveis, formando tipos diferentes de genes e codificando outro tipo de

informação biológica.

Habilidade de replicação

Como existe a ligação entre os nucleotídeos complementares, sempre A com T e C com G, cada filamento ou

ligação dessas contém as especificações detalhadas de seu ligante complementar, isso torna possível, após a

primeira etapa que é separar os dois filamentos de DNA, que seja produzido uma nova base a partir de cada fita

dessas, ou seja, onde existe um filamento molde de A será feito um novo filamento contendo T.

Mutabilidade

Nesse processo de replicação, pode acontecer de ser produzida uma base incorreta ou haver uma duplicação de

bases, ou ainda uma dessas bases ser perdida. Em um caso como esses, a nova cópia de DNA e todas as outras

vindas dela serão diferentes da molécula original, e essa diferença ou mudança pode ser passada aos

descendentes.

Tradução

De algum jeito, o DNA, ou mais especificamente, uma sequência especifica de nucleotídeos (A, T, C, G), é usada

pela célula para originar moléculas de proteínas com sequências específicas de aminoácidos e

consequentemente estruturas e funções especificas. Além disso, o DNA age enviando um sinal para as células

determinando quais proteínas devem se desenvolver e em quais fases do desenvolvimento do organismo

Para entender o fato de como as informações são passadas ao longo das células que estão constantemente se

dividindo, precisamos pontuar aqui sobre os cromossomos. Por exemplo, para fazer um organismo unicelular,

como uma bactéria, é necessária uma quantidade muito grande de informação, quando pensamos em

organismos pluricelulares essa quantidade de informação a ser codificada aumenta absurdamente. No

organismo humano, uma célula carrega cerca de 2m de fita de DNA em seu núcleo que tem apenas de 5 a 8 µm.

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Dessa forma, a célula teve que encontrar uma forma de acondicionar toda essa informação, criando então, as

estruturas chamadas de cromossomos, que são capazes de compactar toda essa informação contida nas fitas de

DNA.

O DNA é compactado de forma bem complexa, através de proteínas especializadas que dobram o DNA de

maneira altamente organizada, não permitindo que ele se entrelace, mas que fique acessível a todas as enzimas e

proteínas necessárias à sua replicação, expressão e reparo. Nos seres humanos, são encontrados 24
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cromossomos, carregando um total de 3,2x10 nucleotídeos. Cada cromossomo desses contém uma cópia de si

mesmo, uma herdada pelo pai e outro pela mãe, com exceção das células reprodutoras (espermatozoide, óvulos)

e de células como as sanguíneas que não contem DNA, esses pares de cromossomos são denominados

cromossomos homólogos. Os cromossomos humanos têm tamanhos diferentes e podem ser determinados por

diversas técnicas diferentes, sendo uma das mais bem estabelecidas a técnica de hibridização, onde é permitido

ligar corantes fluorescentes de cores diferentes na molécula de DNA para identificá-los a partir de microscópio

de luz direta.

A função mais marcante dos cromossomos é carregar os genes humanos, a unidade funcional da

hereditariedade. Um gene é caracterizado como uma sequência específica de DNA que contém orientações para

produzir uma determinada proteína, ou um conjunto de proteínas relacionadas, em suma os genes contêm as

informações para a fabricação de proteínas nos organismos. Portanto, podemos dizer que o DNA agrupa

informação de acordo com a ordem especifica dos nucleotídeos ao longo da fita, cada base, composta pelas bases

nitrogenadas, A – T – C – G, podem ser pensadas como letras de um alfabeto que são usadas para escrever

mensagens biológicas. As diferenças nessas sequências de nucleotídeos é que causam a diferença dos

organismos e resultam em diferentes mensagens biológicas. (ALBERTS, 2011).

O conjunto completo dessas informações genéticas em um organismo é conhecido como genoma e é organizado

de formas diferenciadas nos diversos organismos e vírus. O genoma está armazenado nos cromossomos; logo,

está localizado no núcleo das células. Ele pode ser observado através de técnicas de coloração, surgindo

geralmente em pares, chamados de cromossomos homólogos. A célula que contém o conjunto completo desses

cromossomos chamada de diploide. Dentro de um núcleo diplóide, onde encontramos os cromossomos

homólogos, as sequências de DNA (genes) desses pares são geralmente iguais, sendo encontrado pequenas

variações nas sequências dos nucleotídeos, já que essa é a base da variação de um indivíduo para o outro,

essencial para variabilidade dentro da espécie, fortalecendo-a. Esses pares de cromossomos idênticos carregam,

então, os mesmos genes, ou seja, sequências de DNA, nas mesmas posições relativas. Portanto, nos diplóides

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cada gene está presente aos pares e são chamados de genes alelos, sendo que quando o par de genes alelos são

idênticos denominamos homozigotos, no caso de genes alelos diferentes, os mesmos são chamados

heterozigotos (GRIFFITHS, 2009).

Com base em todas essas informações, podemos notar que a quantidade total dessas informações é incrível. Se

usássemos a analogia do genoma sendo pensado como um livro, a sequência nucleotídica de um gene humano

ocuparia apenas um quarto de página, ao passo que a sequência completa do genoma humano ocuparia as

páginas de mais de mil livros. Isso demonstra a complexidade da estrutura e organização desse código genético e

sua importante função na construção de moléculas como as proteínas. Sabendo que a sequência de nucleotídeos

determina a sequência dos aminoácidos, a estrutura tridimensional de uma proteína e consequentemente a

função da mesma, é possível afirmar que o gene é responsável pela hereditariedade e diversidade nas funções

biológicas.

Assista aí

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1.3 Transcrição e tradução do DNA

Conhecendo a estrutura do DNA, a forma como ele se compacta em cromossomos para armazenar quantidades

incríveis de informação, e o modo como essas informações são codificadas de acordo com as sequências

específicas dos nucleotídeos, surgem questionamentos relacionados à maneira como a célula é capaz de usar

essas informações codificadas pelos nucleotídeos para determinar as sequências especificas de aminoácidos

em proteína. As duas etapas estão diretamente ligadas ao processo de transformar informação genética em uma

sequência específica de aminoácidos, que posteriormente irão dobra-se em uma molécula de proteína

determinando sua função no organismo, e são chamadas de transcrição e tradução.

A transcrição é a primeira etapa para realizar essa transformação. Nela ocorre a transcrição da sequência de

nucleotídeos no DNA para uma molécula similar, denominada RNA mensageiro (mRNA), que também é formado

por uma estrutura de nucleotídeos, diferenciando que no lugar da timina (T) o RNA carrega a uracila (U). O

primeiro passo para isso acontecer é a separação do DNA em dois filamentos únicos, um deles servirá de molde

para construir a sequência de RNA.

Esse procedimento, que acontece no núcleo das células, origina um filamento de mRNA, a partir de uma fita

molde de DNA. O mRNA, que é uma cópia da molécula de DNA original, é chamado transcrito, este pode ser

alterado para produzir um mRNA final, sendo essas alterações capazes de remover trechos do transcrito original

que não codificam proteínas. A produção desses transcritos serve como uma “cópia funcional” do DNA, e atende

a três funções:

Aumentar o número de cópias da informação genética, a transcrição é capaz de gerar um grande número de

cópias funcionais de cada gene. Cada uma dessas cópias pode ser usada mais de uma vez pela célula na produção

de proteínas;

Resolver a questão de limitação no tráfego, já que pode deixar a localização onde os genes estão sendo

transcritos e podem acessar o citoplasma das células, onde ficará disponível ao maquinário celular para produzir

proteínas;

Garantir a estabilidade e tempo de vida dessas moléculas mensageiras, o que serve para controlar o quanto de

determinada proteína será produzida

O segundo momento, a partir da confecção das fitas de mRNA, é o processo denominado de tradução. A

princípio umas das problemáticas seria entender como uma sequência feita de apenas quatro tipos diferentes de

nucleotídeos poderia gerar uma sequência de aminoácidos com 20 diferentes tipos de aminoácidos? A explicação

para isso se encontra na maneira como são lidas as fitas de mRNA. A tradução dessas fitas acontece em grupos

sucessivos de três nucleotídeos, sendo cada grupo de três desses chamados de códon. São, então, 64 trincas de

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códons e apenas 20 aminoácidos, tornando possível mais de um códon codificar um aminoácido, por exemplo,

AUC, AUU e AUA, podem codificar o aminoácido leucina.

Essas trincas encontrarão as moléculas que contêm, de fato, o equivalente entre os códons e os aminoácidos,

denominadas RNA transportador (tRNA). Todo RNA transportador carrega um anticódon feito de três

nucleotídeos que é o complemento do códon apropriado no mRNA. Na outra ponta do tRNA, está o aminoácido

que está sendo codificado. Torna-se, então, necessário colocar o aminoácido carregado por diferentes tRNA na

ordem especificada pela mensagem. Esta etapa ocorre em uma estrutura celular responsável pela síntese

proteica, chamada de ribossomo.

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1.4 Genética molecular e manipulação dos genes

De acordo com Griffiths (2009), o conhecimento mais apurado da genética permitiu o desenvolvimento de

técnicas que possibilitassem obter, ampliar, manipular fragmentos específicos do DNA. O conjunto dessas

técnicas ficou conhecido como Tecnologia do DNA e foi bastante impulsionado a partir dos anos 1970,

revolucionando o mundo da Biologia e a sociedade como um todo. A genética molecular ou engenharia genética

está pautada em toda essa tecnologia do DNA e hoje é tida como uma das principais e mais promissoras áreas no

ramo da tecnologia, abrangendo campos como a medicina, agricultura, biologia, entre outros. A extensão desses

estudos e tecnologias à nível global é conhecido como Genômica e é altamente debatido na comunidade

cientifica, com grande número de publicações e investimentos.

Essas técnicas se aprimoram em formas e métodos para isolar e identificar os genes, sendo possível manipulá-

los. Em primeiro lugar, é necessário adquirir uma amostra do DNA contendo o gene que se pretende estudar,

sendo esse denominado DNA doador, lembrando sobre a importância da boa conservação das amostras de DNA.

Essas grandes moléculas de DNA, muitas vezes um genoma inteiro, precisam ser fragmentadas em tamanhos

muito menores, tarefa essa, realizada pelas enzimas de restrição. Curiosamente, toda molécula de DNA, não

importa sua origem, tem lugares alvos para essas enzimas, onde o corte será realizado. Assim, o DNA é

fragmentado em todos esses lugares e é obtido vários fragmentos de restrição, sendo cada segmento desses

denominado de palíndromo de DNA, significando que ambos têm a mesma sequência de nucleotídeos apenas

em polaridade inversa.

As enzimas de restrição são essas moléculas que descobriram serem capazes de ligar-se a esses alvos

específicos no DNA, clivando ou cortando o mesmo, e gerando pontas adesivas muito úteis para a produção de

DNA recombinante. Essas enzimas são usadas na geração de DNA recombinante, técnica utilizada, por exemplo,

processo de produção dos organismos geneticamente modificados. Para que haja a ligação desse DNA doador,

devidamente cortado, a um vetor capaz de carrega-lo para outros organismos, é necessário, um DNA plasmidial

bacteriano, que também é clivado por enzimas de restrição especificas. Quando os dois tipos de DNA, doados e

plasmidial, são misturados em condições fisiológicas adequadas eles podem se parear/unir, em um processo

chamado de hibridização.

Após a hibridização dessas moléculas, as ligações que unem as estruturas químicas dos nucleotídeos, como os

açucares e fosfato, ainda não foram estabelecias, sendo necessário para isso a utilização de outra enzima,

denominada DNA ligase, que cria ligações fosfodiéster nessas junções. Vale ressaltar que nessa etapa, para que o

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gene possa ser transcrito e traduzido no hospedeiro bacteriano de forma eficaz, ele deve ser inserido perto das

sequencias reguladores da bactéria. Por exemplo, para ser capaz de produzir insulina humana em bactérias, é

necessário inserir o gene humano para produção de insulina em sequencias reguladoras corretas das bactérias.

A partir do gene obtido do DNA doador e sua inserção em DNA plasmidial, ocorre uma amplificação desses

fragmentos no interior da bactéria, aproveitando os próprios processos biológicos e genéticos, como

crescimento de bacteriófagos e a replicação de plasmídeos, da própria bactéria. Um único fragmento

recombinante (vetor), inserido em uma bactéria se multiplicará em bilhões de cópias após o crescimento de uma

colônia. Esse é o princípio fundamental de uma das técnicas mais usadas em genética molecular, através dessa

técnica é possível, quase que indiscriminadamente, clonar genes. O uso de enzimas de restrição sobre um DNA

doador e a inserção de fragmentos únicos em vetores, como bactérias, capazes de ampliar grandemente o

número de copias desse gene ou ainda passá-los a outro organismo, é a técnica mais bem descrita e utilizada

para esse fim.

Através dessas técnicas, a genética molecular hoje é capaz analisar um gene em especifico usando clonagem

posicional; identificar um gene de doença humana e de que forma ele interage com outros; diagnosticar doenças

genéticas com muito mais especificidade; etc. Mas temos que sempre ressaltar as questões éticas relacionadas à

utilização de todas essas técnicas (GRIFFITHS, 2009).

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2. Histórico das mutações
Fazendo um breve histórico sobre o estudo das mutações genéticas, podemos constatar que esse conceito foi

se aperfeiçoando ao longo do tempo. Com advento de novas tecnologias e novos métodos de biologia molecular

para se investigar o DNA e os cromossomos, se tornou muito mais fácil observar as mudanças ou falhas

presentes nessa codificação.

O conceito de mudança biológica é bem antigo. De acordo com Campbell (2008), a ideia de transformação dos

organismos pode ser remontada desde a Grécia, mesmo não se detendo os conceitos de evolução. Na Idade

Média, sob o julgo da igreja, se fortaleceu o pensamento que os seres são fixos, criados por Deus, e que não

sofrem mudanças. Somente algum tempo depois, com a advento do Iluminismo, e a proliferação do racionalismo

científico e da intelectualidade, é que surgiram estudos sobre a relação existente entre mudanças nos

organismos e a evolução. Já no século XIX, cientistas como Lamarck, propuseram, a partir de evidências, que as

espécies mudam e que essas mudanças eram guiadas pelo ambiente (MARTINS, 1998).

De acordo com Futuyma (1993), foram os achados de Darwin, como base nos fósseis, distribuição geográfica das

espécies e embriologia ou anatomia comparada, analisadas por ele, que as bases para a afirmação que os seres

vivos eram de fato mutáveis foi concretizada. Apesar de tudo, a teoria de Darwin foi pouco aceita na época, muito

por não terem entendido o mecanismo de seleção natural e pela falta de conhecimento dos fatores que levam a

hereditariedade, ou seja, da genética. O autor aponta que pouco conhecimento havia sobre o material genético

até o início do século XX. Além disso, todas as investigações baseadas na Biologia Molecular eram pouco

compreensíveis na época, sendo elucidadas somente mais tarde com advento das técnicas e tecnologias

necessárias. Apenas com a retomada das Leis de hereditariedade propostas nos trabalhos de Mendel é que a

expressão mutação começou a ser utilizada, proposta pelo botânico Hugo De Vries.

Segundo Moore (1986), os apontamentos expostos por De Vries sobre as frequentes mutações sofridas pelas

espécies de plantas Onagraceae, impulsionaram muitos geneticistas a procurar por mutações em outros

organismos. Um desses casos foi o estudo de Morgan com as culturas de Drosophila melanogaster, a mosca da

fruta, onde ele observou milhares de indivíduos para identificar mutações como olhos e asas, constatando que as

mutações são um evento raro.

Diante desse fato, duas explicações foram pensadas. A primeira é que a taxa que determinado gene sofre

mutação é muito baixa; a segunda é que a característica recessiva encontrada na maioria desses alelos

recessivos, ou seja, grande parte deles se encontram em heterozigose, “escondidos” pelo alelo dominante.

Durante os anos subsequentes diversas tentativas foram feitas para induzir mutações e tentar aumentar suas

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taxas, na esperança de se obter novos mutantes. Injeção com substâncias químicas, radiação, eletrização,

contudo nada pareceu mostrar resultados positivos. A dedicação de pesquisadores como De Vrie e outros que

trabalhavam na “Sala das moscas” foi o impulso inicial para muitos avanços no estudo das mutações genéticas. A

partir disso, as causas e os processos pelo quais ocorriam as mutações despertaram muito interesse, em especial

dos geneticistas e evolucionistas (MORRE, 1986). Hoje se sabe que as diferenças genéticas entre os organismos

são normais e até esperadas, constituindo uma fonte rica de material para o estudo dos fundamentos da

hereditariedade e variabilidade entre as espécies.

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2.1 Mutações genéticas: tipos e consequências

Iremos agora abordar as variações excepcionais, as consideradas variantes anormais em uma característica,

chamadas mutações. Contudo, iremos discutir sobre a importância desse processo, que ocorre de forma natural,

na evolução e variabilidade das espécies. Um dos exemplos mais clássicos dessas variações ou mutações é o

albinismo. Essa mutação é consequência da codificação de duas copias idênticas de um gene mutante que

codificam uma forma inativa da enzima que produz melanina, ocasionando na ausência de produção desse

pigmento no corpo. Grande parte das características biológicas são afetadas por diversas vias fisiológicas que

interagem entre si, em um grande número de etapas. No caso do albinismo, por exemplo, existem enzimas que

operam em moléculas que fazem parte da produção de melanina, mas também existem processos celulares que

controlam o depósito de grânulos de melanina na pele e cabelos (GRIFFITHS, 2009).

Ao pensarmos no ambiente celular, as moléculas de DNA não são totalmente estáveis: os pares de bases na dupla

hélice de DNA têm uma certa probabilidade de mutar. O termo mutação abrange um amplo espectro de

diferentes tipos de mudanças, que variam de uma troca simples de um par de bases por outro, até o

desaparecimento de um cromossomo inteiro.

Há alterações que afetam cromossomos inteiros ou grande pedaços de um cromossomo. Mesmo a célula tendo

desenvolvido sofisticados sistemas para reparar o DNA danificado, impedindo a ocorrência de mutações, uma

baixa taxa de mutação é tolerada, para permitir a evolução dentro de uma espécie. Podemos imaginar o DNA

sendo submetido a um infinito cabo de guerra entre os mecanismos que danificam o DNA e originam mutações e

os mecanismos químicos de reparo celular que monitoram constantemente o DNA procurando danos e os

corrigindo. De acordo com Griffiths (2009), observou-se que os mesmos sistemas que reparem e replicam o DNA

podem induzir mutações que podem ter potencial devastador ou afetarem apenas um produto gênico. Como

exemplo, os mesmos mecanismos que causam a classe mais séria de danos ao DNA, conhecido como quebra

bifilamentar, também são os mecanismos de uma etapa intermediária no processo normal de recombinação

genética. Isso quer dizer que as ferramentas de reparo do DNA e de recombinação gênica tem características em

comum.

As mutações mais conhecidas, referem-se as alterações de um par de bases do DNA ou um pequeno número de

pares. Essas mutações podem ser divididas em dois tipos:

As substituições de bases, gerando a substituição de um par de bases por outro igual ou diferente;

as inserções ou deleções, ocorrendo a deleção ou inserção de pares de nucleotídeos.

Os efeitos desses tipos de mutação estão associados a mudanças nos códons de um aminoácido, seja por um

códon do mesmo aminoácido ou por um códon para outro aminoácido. No primeiro caso, é menos provável que a

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alteração afete gravemente a estrutura e função da proteína, já no segundo, muito provavelmente, esse tipo de

alteração afeta gravemente a estrutura e função de uma proteína.

Essas mutações nos genes podem surgir espontaneamente ou serem induzidas, sendo necessário fazer uma

distinção entre mutação e o efeito desse evento no organismo. Muitas das mutações nas sequências não

codificantes causam pouca ou nenhuma mudança biológica. As mutações espontâneas ocorrem normalmente

em todas as células e são até esperadas. As induzidas surgem pela ação de alguns agentes, denominados

mutagênicos, sendo capazes de serem induzidas em laboratório ou no ambiente por fatores capazes de induzir

mudanças no genoma, alterando, substituindo ou até danificando as bases.

Pode-se dizer, portanto, que o conhecimento sobre os mecanismos que produzem mutações nos organismos é

fundamental para entender tanto sua necessidade e importância na variabilidade e evolução das espécies, como

para entender de que forma essas mudanças causam alterações prejudiciais ao homem, causando doenças como,

por exemplo, o câncer. Ainda no campo da genética molecular, o avanço das técnicas e do conhecimento sobre as

mutações permitiram a criação de linhagens de animais que sofreram mutações para fins específicos. Isso

possibilitou o estudo de distúrbios ou doenças que afetam o ser humano, possibilitando a criação de terapias,

medicamentos ou métodos de identificação muito mais específicos e sensíveis.

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3. Técnica de Eletroforese
A Eletroforose constitui-se em uma técnica para separação de moléculas como proteínas e ácidos nucleicos. A

migração dessas moléculas acontece através da passagem de uma corrente elétrica e as diferenças nas cargas

elétricas e no peso molecular dessas partículas, que fazem com que elas se separem.

De acordo com Oliveira (2015), o histórico dessa técnica está associado aos estudos de Michaelis, que observou,

em 1909, que as proteínas se moviam na presença de um campo elétrico, podendo assim serem separadas em

frações. Mas a base para a técnica utilizada atualmente, foi pautada no método desenvolvido pelo bioquímico

sueco Arne Tiselius, em 1937. Apesar disso, ela se mostrou onerosa e acabou ficando restrita ao campo cientifico

nos institutos de pesquisa. A eletroforese em papel de filtro, estudada por Linus Pauling, em 1949, levava de 12 a

18 horas para fracionar proteínas, contudo, apresentou pouca reprodutibilidade, além da desvantagem de o

papel não ser transparente, dificultando observação das bandas.

Segundo Naoum (2012), em 1953, um método revolucionário foi proposto por dois imunologistas franceses: a

técnica consistia na separação das frações proteicas a partir da precipitação dos anticorpos, denominada de

imunoeletroforese. Ela se diferenciou das outras técnicas por utilizar uma camada bem fina de gel ágar sobre

laminas de vidro, o que permitiu alta reprodutibilidade, curto tempo, em média quatro horas, com excelente

sensibilidade, com a utilização hábil para diversos tipos de proteínas. Os problemas demonstrados por essa

técnica foram relacionados ao grau de impureza do gel de agarose que estavam interferindo os resultados, o que

levou a estudo para a padronização dos métodos industriais para purificação desse gel. A descoberta desse gel

impulsionou os avanços nas técnicas de eletroforese, e de outros tipos de géis como o de amido e o de

acrilamida, sendo que apenas o de acrilamida foi adaptado e melhorado.

A busca por novas técnicas mais praticas para a realização de eletroforese continuou, o que levou, em 1963, ao

desenvolvimento de um método para fracionar enzimas e proteínas por meio de um suporte de acetato de

celulose. Por ser simples, barata e permitir ótimo grau de separação e quantificação das bandas proteicas teve

bastante êxito a aplicabilidade no meio cientifico. Ainda na década de 1960, uma técnica baseada na mistura

entre gel ágar de poliacrilamida e uma substância chamada anfólito foi desenvolvida. Esse produto, ao ser

misturado ao gel, produzia faixas milimétricas que apresentam alto grau de resolução no fracionamento

proteico, tendo sido empregada nas pesquisas e rotinas laboratoriais em larga escala.

De acordo com Spudeit et al. (2012), no final da década de 1980, uma das últimas técnicas a ser desenvolvida, foi

a chamada eletroforese capilar, criada por Lauer e Mc Manigill. Essa técnica consistia na passagem de uma

corrente eletrosmótica dentro de um tubo capilar ligado a dois reservatórios com solução tampão, um

- 18 -
representando o ânodo e outro cátodo. Observou-se que sob ação de corrente elétrica a proteína se movimenta

no interior do tubo, pela interação das cargas elétricas das proteínas com os íons da solução tampão. Esse

processo permite o fracionamento da proteína, formando no tubo pequenas micelas que pode ser identificada

por detectores específicos que traduzem esses dados em forma de gráficos, além de permitir fracionar das

moléculas pequenas as mais volumosas e complexas de forma mais eficiente e rápida.

- 19 -
3.1 Funcionamento e função da Eletrofese

A Eletroforese é, portanto, uma definição para uma série de técnicas empregadas para a separação

/fracionamento e identificação de moléculas como proteínas, por exemplo. O deslocamento dessas partículas

depende da carga efetiva da molécula, da molaridade do tampão e da resistência do meio usado, seja ágar, gel,

acetato, capilar, sendo a mobilidade dessas partículas diretamente ligada a carga e inversamente à viscosidade

do meio (ECKERSALL, 2008).

Para a migração das proteínas, utiliza- se um polo positivo e outro negativo para geração de um potencial

elétrico, este potencial promove a migração das proteínas ou outra molécula, dependendo do peso molecular e

da carga elétrica essa molécula migrará em velocidades diferentes, percorrendo, então, distâncias diferentes.

Esse processo origina diferentes bandas que podem ser observadas através de um corante sensível a proteínas, a

quantificação pode ser feita por densitometria ou eluição e os resultados apresentados na forma de gráficos ou

percentagens (MCPHERSON, 2011).

Segundo Magalhães (2005), entre os fatores associados à resolução, deve-se considerar a concentração e volume

da solução tampão, quanto maior o volume de solução, maior a corrente elétrica gerada, o que causará alteração

na resolução da corrida. Com o aumento da corrente há o aumento de calor e a dificuldade de separação dos

fragmentos maiores da molécula. Em relação à concentração, quanto maior a concentração de agarose, melhor a

resolução na separação dos fragmentos moleculares, porém com maior tempo, já que o aumento da

concentração também interfere no tempo necessário para a separação das proteínas. Se a concentração estiver

muito baixa, pode haver uma separação não muito satisfatória, na rotina é utilizada uma concentração máxima

de 1,2 a 2%.

A temperatura é outro dos fatores que interfere na resolução da corrida. Quanto maior for a temperatura, mais

rápida a migração das moléculas e maior a chance de a resolução não sair adequada. A temperatura esperada

para esses tipos de ensaios está situada entre 8 a 15º C, sendo estas as mais utilizadas nos protocolos de rotina.

Outro fator de destaque é a qualidade da amostra preparada, seja DNA ou qualquer outro tipo de amostra.

Determina-se que moléculas grandes como DNA em solução sofrem danos crescentes, por isso é fundamental

assegurar a integridade dessas amostras que irão para a “corrida” na eletroforese.

A técnica de eletroforese depende de um conjunto de sistemas e materiais que envolvem, segundo Magalhães

(2005):

Sistemas e materiais da técnica de eletroforese

Um suporte de fracionamento, que pode ser gel de agarose, acrilamida, poliacrilamida, celulose, acetato ou tubos

capilares;

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uma cuba de eletroforese;

uma fonte de voltagem;

uma solução tampão.

Em relação aos métodos de funcionamento, a eletroforese trabalha com a formação de uma corrente elétrica

controlada, a partir de uma solução tampão acondicionada em uma cuba, que tem dois compartimentos, que

formam entre eles eletrodos positivos e negativos. É utilizado uma fonte de voltagem para transformar a

corrente alternada em contínua, mantendo a intensidade controlada e sendo uma fonte responsável por regular

a polaridade nos compartimentos da cuba. A troca de íons ocasionadas pelos grupos eletricamente carregados

do suporte e das partículas moleculares é o princípio físico-químico fundamental da eletroforese, causando um

movimento elétrico de baixa intensidade e sentido contrário ao da eletroforese. Esse movimento é denominado

eletroendosmose e tem importância nos procedimentos que usam poliacrilamida e ágar.

As técnicas eletroforéticas são amplamente utilizadas em diversas áreas. Hoje, uma das técnicas mais bem

aceitas e utilizada é a Eletroforese Capilar (EC). Essa técnica, segundo Queiroz (2001), pode ser aplicada a uma

série de amostras, como: proteínas, aminoácidos, ácidos orgânicos, hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas,

substâncias quirais, entre outros. Isso a torna uma técnica diferenciada, com alta capacidade de separação. A EC,

por suas características, tem sido muito utilizada em pesquisa cientifica, em biotecnologia e na indústria. No

projeto Genoma Humano, finalizado recentemente, era necessário separar nucleotídeos de alta massa molar, em

torno de 200 a 500 Daltons, processo só possível de ser feito em EC. Além disso, a sua velocidade permitiu o

sequenciamento de milhares de nucleotídeos em um único dia, ajudando na árdua missão de sequenciar os mais

de 3 bilhões de nucleotídeos do genoma humano.

Hoje, pelas técnicas de eletroforese, em especial a EC, são 70 tipos de proteínas, das 289 proteínas plasmáticas

descritas no homem, identificadas, validadas e estudadas. Isso permitiu a descoberta de diversos biomarcadores,

ou seja, proteínas produzidas em situações relacionadas a uma doença especifica e que indicam incidência dessa

doença, tornando possível diagnosticá-la com antecedência (STOCKHAM & SCOTT, 2011).

Fique de olho
As técnicas de eletroforese são utilizadas em uma gama de situações onde se faz necessário um
diagnóstico mais preciso e muito mais especializado. Exemplo disso, é o mieloma múltiplo, o
segundo câncer de sangue mais frequente hoje e que muitas vezes tem seus sintomas
confundidos com dores comuns da idade ou cansaço em decorrência de anemias. O diagnóstico
por eletroforese é uma técnica aconselhada para identificar a doença, visto que o mieloma
múltiplo produz uma proteína única no organismo, denominada proteína monoclonal, que

pode ser identificada através da utilização dessa técnica no sangue. A utilização dessas técnicas

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 pode ser identificada através da utilização dessa técnica no sangue. A utilização dessas técnicas
de biologia molecular permite um diagnóstico precoce de doenças graves como essa,
permitindo ao paciente uma chance muito maior de cura.

Assista aí

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/2ab3f75130bc46ce7ce2aed0689302c2

é isso Aí!
Nesta unidade, você teve a oportunidade de:
• entender o que genética molecular e quais as principais técnicas que a embasam, todas baseadas na
identificação, separação e manipulação dos genes;
• conhecer um pouco da história de como os conceitos de genética foram estabelecidos e a relação disso
com a genética molecular;
• conhecer a composição e a estrutura das moléculas de DNA e RNA, as duas moléculas objetos de estudo
da biologia molecular;
• refletir sobre a importância da ética na utilização dessas técnicas para o bem-estar da humanidade e não
o contrário;
• conhecer as etapas e moléculas responsáveis pela técnica do DNA recombinante, principal técnica usada
em genética molecular;
• conhecer os processos de mutação, as origens de seus estudos, e sua importância de descoberta de
doenças e nos processos naturais de evolução e variabilidade;
• analisar o que é eletroforese, quais os princípios utilizados no seu funcionamento, para fragmentar
proteínas, e a importância de sua utilização

Referências
ALBERTS, B. et al. Fundamentos da Biologia Celular, 3º Ed. Porto Alegre. Artmed, 2011.

CAMPBELL, G. “Empedocles”. Internet Encyclopedia of Philosophy, 2008. Disponível em: . Acessado em 06 mar.

2020.

ECKERSALL, P. D. Proteins, proteomics and the dysproteinemias. In: KANEKO J. J. et al. Clinical biochemistry of

domestic animals. 6th ed. Bu+rlington: Academic Press, p.117-155, 2008.

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GARCIA, S. E. et al. Genética molecular: avanços e problemas. Cad. Saúde Pública. Rio de Janeiro, 12(1): 103-107,

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GRIFFITHS, A. et al. Introdução à genética, 9º Ed. Rio de Janeiro. Guanabara, 2009.

QUEIROZ, S. C. N. Eletroforese capilar. Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. Chemkeys,

licenciado sob Creative Commons, 2001.

MAGALHÃES, V. D. et ,al. Eletroforese em campo pulsante em bacteriologia – uma revisão técnica. Revista

Instituto Adolfo Lutz, 64(2): 155-161, 2005.

MARTINS, L. A. P. A história da Ciência e o ensino da Biologia. Ciência & Ensino, Campinas, n. 5, pp. 18-21, 1998.

MCPHERSON, R. A. et al. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22. ed. Philadelphia, Pa:

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NAOUM, P. C. Eletroforese: Hemoglobinopatias, Proteínas Séricas, Lipoproteínas e DNA. São Paulo: Editora

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Disponível em: Acesso em 02 mar. 2020.

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