BIOLOGIA MOLECULAR

POLIMORFISMO GENÉTICO
Claudio Gomes Salles Jr.

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Olá!
Você está na unidade Polimorfismo genético. Conheça aqui a importância dos processos de variação genética

para a célula e para as espécies como um todo, quais tipos de variações podem ser considerados polimórficas e

quais os tipos de polimorfismo existem. Veremos ainda como alguns tipos de polimorfismos, em especial de

comprimento, tem uma aplicação muito grande da genética forense para identificação de pessoas ou

investigação de paternidade.

Bons estudos!

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1 Importância da variação genética
A variação genética tem se mostrado um fator fundamental para a corrente evolutiva, o fluxo constante de

variação no código genético, ou seja, da sequência de nucleotídeos que formam o DNA, tem garantido a

variabilidade genética dentro das espécies, assegurando a individualidade e a adaptação desses indivíduos as

mudanças do ambiente (ALBERTS, 2011).

Essas variações acontecem devido a difícil missão que a célula desempenha em manter a ordem em seu

conturbado ambiente interno no momento em que está havendo a duplicação de uma grande quantidade de

material genético. Nesse processo, denominado replicação celular, onde a célula está produzindo duas cópias

geneticamente idênticas é que as alterações ocorrem (ALBERTS, 2011).

Além disso, o DNA está sujeito a uma série de situações que podem causar danos na sua codificação, como

exemplo podemos citar as radiações, alguns tipos de compostos químicos ou até moléculas produzidas pela

própria célula. Esses fatores exigem da célula uma constante vigilância e reparação na informação do DNA, mas

apesar do complexo maquinário celular de reparação e proteção de erros no código genético eventualmente

acontecem alterações (ALBERTS, 2011).

Por esse motivo, é esperado a ocorrência de diferenças entre membros da mesma espécie, aproximadamente um

terço dos genes que codificam proteínas apresentam alguma variação nas sequências de aminoácidos, essas

mudanças denominadas polimorfismo genético é uma fonte rica para estudar e entender as bases da

variabilidade entre os indivíduos (ALBERTS, 2011).

Analisar a variabilidade entre as espécies e os indivíduos permite entender o genoma dos organismos, as funções

de genes específicos em uma diversidade de plantas, animais ou espécies microbianas. A observação das

variações genéticas também pode ser utilizada para especificar as vias de desenvolvimento normal de um

organismo (ALBERTS, 2011).

Hoje, a partir da compreensão dos mecanismos das diferenças existentes entre os indivíduos, foi possível

descrever como essas diferenças na forma e função entre os seres, assim como suas divergências evolutivas,

estão relacionados diretamente com as alterações no genoma de um indivíduo para o outro (GRIFFITHS, 2008).

Para a ciência, especialmente para a Genética, observar as diferentes formas e funções de um organismo e

investigar quais genes podem causar isso é denominado de genética direta. Em contraste a isso, hoje, a partir dos

avanços em biotecnologia e nas técnicas de biologia molecular, é possível se iniciar esse estudo partindo das

alterações biológicas para então buscar o gene causador, essa é a chamada genética reversa (GRIFFITHS, 2008).

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No contexto genético, dois processos são importantes na variação dos indivíduos: a recombinação gênica e a

mutação. Veja a seguir suas definições:

Mutação

A mutação é uma mudança na sequência de nucleotídeos, ou seja, uma mudança nos pares de bases que formam

o DNA. Esse tipo de mudança é especialmente relevante por ser a fonte primária da evolução dos organismos e

ainda criar novos alelos.

Recombinação gênica

Os alelos são as bases para um segundo tipo de variação chamada de recombinação gênica. Esse processo faz

com que os genes alelos diferentes se agrupem em combinações diferentes, se usássemos uma analogia com as

cartas de um baralho, as mutações seriam a criação de novas cartas, enquanto a recombinação genética seria o

ato de misturar as cartas e criar novos conjuntos.

O fato é que o acúmulo das alterações ocorridas no DNA por milhões de anos levou a uma variedade de

material genético que promoveu toda a variabilidade que nós vemos hoje. Por outro lado, as mutações também

podem causar prejuízos aos organismos, sendo as responsáveis por uma diversidade de doenças genéticas

hereditárias como, por exemplo, o câncer (ALBERTS, 2011).

As variações nas sequências do DNA entre um organismo e outro, impulsionadas pelas seleções específicas,

através de bilhões de anos e gerações, produziram espécies complexas como a nossa. Por isso, entender os

mecanismos dessas variações, sejam mutações, recombinações ou polimorfismos é essencial para tentar

esclarecer de que maneira se deu o desenvolvimento da nossa espécie e de todas as outras (ALBERTS, 2011).

A sobrevivência de uma espécie ou de uma célula, depende dessas pequenas alterações sofridas ao longo de suas

sucessivas replicações, sendo imprescindível a capacidade dessas células em manter essas alterações

controladas em um nível mínimo. Portanto, sem sistemas altamente sofisticados de proteção e reparo do DNA

danificado a existência da vida ficaria insustentável (ALBERTS, 2011).

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 Figura 1 - Sequência de DNA em um cromossomo
Fonte: Explode, Istock, 2020

#PraCegoVer: A imagem ilustra um cromossomo fragmentado e uma parte de sua sequência de DNA.

Assista aí

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1.1 Polimorfismo genético

É notório que as variações genéticas, dentro de um limite, são esperadas, estudadas e até necessárias. Muitas

dessas alterações no DNA causam pouco ou nenhum efeito nas funções biológicas externas, contudo outras estão

intimamente relacionadas a patologias humanas. Entre esses dois tipos de alterações, existem as alterações

responsáveis especialmente pela variabilidade genética de um organismo, que determina as diferenças na

fisiologia, anatomia, susceptibilidade a infecções, predisposição a doenças como câncer, intolerâncias

alimentares, responsividade terapêutica, entre outras (THOMPSON, 2002).

Para entender os polimorfismos é necessário relembrar que um segmento de DNA ocupa uma posição

específica no cromossomo, denominada locus ou loci, sendo que esse locus pode variar em relação ao tamanho.

Ao estudar um locus se observa grandes segmentos de DNA com muitos genes, segmentos compostos por apenas

um gene, ou ainda apenas uma base formadora do DNA, um nucleotídeo variante (THOMPSON, 2002).

Esses tipos alternativos de sequência de DNA, nos locus, são denominados alelos, em muitos dos genes existe

apenas um alelo predominante, em média presente em mais de 50% dos indivíduos de uma população,

chamados alelos selvagens ou comuns. Contudo, como a variação genética é comum, a existência de alelos

diferentes é esperada e e essas novas versões são chamadas de alelos variantes ou mutantes, ou seja, que

sofreram mutação. (THOMPSON e THOMPSON, 2002)

Observando a frequência desses alelos variantes é que podemos determinar um polimorfismo, em geral,

havendo dois ou mais alelos variantes, convencionado como tendo frequência alélica > 1%, em um locus na

população, pode-se dizer que aquele locus expressa um polimorfismo nessa população. Literalmente

polimorfismo significa “muitas formas”, porém a maioria das versões de alelos variantes não atinge essa

frequência na população (THOMPSON, 2002).

Em relação à sequência de DNA localizada em determinada região do genoma, pode-se afirmar que ela é

consideravelmente semelhante entre os cromossomos de uma diversidade de indivíduos por todo mundo. Por

exemplo, se pegarmos ao acaso qualquer segmento de DNA humano com aproximadamente 1.000 pares de bases

de comprimento, ele irá conter somente um par de bases diferente entre os dois cromossomos homólogos

recebidos dos pais (THOMPSON, 2002).

Ainda que esse seja o cenário, centenas de milhares de diferenças em um único nucleotídeo e mais de um milhão

de variantes mais complexas têm sido descritas e catalogadas em diversas populações humanas. Contudo, pelas

limitações existentes na amostragem desses estudos, é muito provável que esses números sejam ainda muito

maiores e que estejam subestimando a magnitude da diversidade genética na nossa espécie (THOMPSON, 2002).

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Além desse problema da amostragem, ou seja, um número de indivíduos analisados relativamente pequeno para

mostrar a maioria de variantes com frequência alélicas menores que 1% a 2%, ainda muitas populações do

mundo não foram estudadas. No momento que mais pessoas forem incluídas nos estudos de descoberta de

variações, com certeza outras variantes raras serão descobertas (THOMPSON, 2002).

Cabe ressaltar que um polimorfismo em um alelo não depende do tipo de mutação que o causou, nem do

tamanho do fragmento de genoma que foi afetado, mas somente se sua frequência em uma população ultrapassa

1%. A maioria dos polimorfismos de sequência estão localizados entre os genes em regiões irrelevantes para o

funcionamento dos mesmos, outros sim podem estar em regiões que codificam proteínas, originando variações

na síntese dessas proteínas e consequentemente diferenças nos indivíduos (THOMPSON, 2002).

Provavelmente porque muitas mutações que causam variações, como as mutações deletérias, sejam muito raras

para alcançar a frequência mínima na qual se determina um polimorfismo. Apesar de a maioria dos alelos

explicitamente hereditários, causadores de doenças humanas, serem relativamente raros, alguns deles

apresentam efeitos profundos sobre a saúde, como as mutações falciformes ou metabolizadoras de

medicamentos (THOMPSON, 2002).

Apesar dos polimorfismos estarem ligados à ocorrência de diferentes características nos organismos, ou, em

casos raros, à maior sensibilidade a doenças ou menor resposta a tratamentos específicos, são caracterizados

pelos seguinte critérios:

Quando existem diferentes versões de uma sequência do DNA em determinado locus (local do cromossomo),

esses são denominados alelos;

essas diferenças ocorrem naturalmente entre os indivíduos sem ocasionar obrigatoriamente em doenças ou

falhas em funções biológicas;

se essa variação na sequência de DNA alcançar mais de 1% de uma população, podemos determinar esse alelo

como polimórfico;

a coexistência de alelos múltiplos, ou seja, com três ou mais alelos para um mesmo locus é característico de

polimorfismo genético;

frequentemente as variações acontecem em um único nucleotídeo, mas podem ocorrer repetições em alguns

casos.

Portanto, o estudo dos polimorfismos é uma ferramenta essencial para o estudo da genética humana e médica,

ser capaz de evidenciar diferentes formas de heranças de um gene ou diferentes sequências do genoma

fornecem as bases para uma diversidade de aplicações em várias áreas seja na pesquisa, na medicina ou em

outros segmentos (THOMPSON, 2002).

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1.2 Classificação dos polimorfismos genéticos

Sem dúvida o desenvolvimento massivo da biotecnologia e das metodologias e técnicas em biologia molecular,

culminando no projeto Genoma Humano que sequenciou todo o genoma da nossa espécie, proporcionaram

uma quantidade de informação incrível sobre o DNA e as sequências de bases que o formam.

Essas ferramentas possibilitaram a ciência não só identificar, mas caracterizar os tipos e as frequências de

variações polimórficas situadas no nosso genoma e de outros organismos e a partir disso gerar catálogos das

diversas sequências de DNA das populações ao redor do mundo. Com esses dados, se observou que existiam

diferentes tipos de polimorfismos que podem ser classificados como polimorfismos de sequência e polimorfismo

de comprimento, analisando a forma como a sequência do DNA varia entre os alelos diferentes. (THOMPSON,

2002

Entre os polimorfismos os mais simples e comuns são os polimorfismos de sequência, denominados de SNP

(single nucleotide polymorphisms), ou seja, polimorfismo de nucleotídeo único. Os SNP’s são relativamente

comuns, sendo observados aproximadamente em uma a cada 1.000 pares de bases do genoma e se caracteriza

por apenas dois alelos, duas bases diferentes ocupando uma localização específica no cromossomo – locus

(THOMPSON, 2002).

Esse tipo de polimorfismos é causado pela alteração em uma única base de nucleotídeos (A, T, C, G), seja em

cromossomos homólogos de um indivíduo ou entre indivíduos diferentes dentro de uma espécie, contudo são

considerados também até três alelos e resultados de inserções ou deleções. Muitos desses polimorfismos são

observadas em regiões não codificantes do DNA ou em áreas distantes de genes conhecidos, mas um número

considerável delas acontece em áreas codificantes. (THOMPSON, 2002).

Os SNP’s são considerados polimorfismos bialélicos, muito por sua baixa frequência de substituição dos

nucleotídeos únicos, aproximadamente, 1x10-9 e 5x10-9 por nucleotídeo em regiões neutras por geração, por

essa razão esse tipo de polimorfismos são menos informativos quando se examina um locus, comparados com

outros tipos de polimorfismos denominados microssatélites ou SSR (Simples Sequence Repeats). Todavia os

SNP’s são extremamente abundantes, estando presentes em quase todos os loci gênicos de um genoma, tendo

grande importância para as análises e estudos genéticos (ZOLET, 2017).

Os polimorfismos de nucleotídeo único se mostraram universais, mesmo sendo observados, a princípio, em

humanos. Sabe-se que estão associadas a doenças, a respostas a medicamentos, etc., sendo por isso, utilizados

como marcadores genéticos em diversas áreas com o diagnóstico, tratamento de doenças, melhoramento

genético, evolução, filogenética, antropológica, entre outras (ZOLET, 2017).

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As alterações nas bases nucleotídicas podem acontecer quando um nucleotídeo é substituído, excluído ou

adicionado, as variações causadas por inserção ou deleção, denominadas in/del ou simplesmente indels, podem

acontecer em qualquer parte e também podem variar de um par de bases até 1.000 pares de bases, apesar de

serem descritas indels maiores. O estudo das indels já conseguiram identificar mais de um milhão de

polimorfismos desse tipo em genomas individuais (THOMPSON, 2002)

Alguns autores consideram essas indels como SNP’s, sendo claro, todavia que eles ocorram por mecanismos

diferentes. Fato é que, aproximadamente, metade das indels são determinadas como “simples” apresentando

apenas dois alelos, porém outras indels são denominadas de multialélicas, por causa do número variável de um

fragmento de DNA que é inserido em tandem em determinado local, esse tipo de polimorfismo é conhecido como

microssatélite (THOMPSON, 2002).

Essas regiões denominadas de DNA satélite são sequências repetitivas, em geral, não codificantes e com função

ainda desconhecida, essas sequências repetidas em tandem formam, em média, 10% do genoma variando de 5 a

250 pares de bases repetidas centenas de vezes. Isso dentro de um genoma com 3 bilhões de nucleotídeos de

informação, com aproximadamente 40.000 genes, sendo 70% a 80% constituem sequência únicas que podem

codificar proteínas (GOÉS, 2020).

Esses microssatélites formam os chamados polimorfismos de comprimento caracterizador por terem sequências

curtas repetidas em tandem, denominadas de STR (short tandem repeats), elas apresentam repetições entre 1

a 6 pares de base, sendo que a quantidade de repetições em um locus varia de forma polimórfica entre os

indivíduos e aprecem de maneira estável. Por esse motivo os microssatélites são uma classe de polimorfismos

muito uteis para uso como marcadores genéticos, sendo os STR’s o método de escolha, hoje, para impressão

digital de DNA nas práticas forenses (THOMPSON e THOMPSON, 2002).

O uso desse polimorfismo como marcador genético foi bastante impulsionado pela descrição da técnica de PCR

(Reação em Cadeia da Polimerase), devido à rapidez e especificidade dessa tecnologia. Um marcador genético

usando esse tipo de polimorfismo individual, está diretamente relacionado ao número de repetições diferentes

em uma sequência de DNA para um determinado indivíduo (ZOLET, 2017)

Essas características demonstradas por esse tipo de polimorfismos em STR determinaram um potencial de

aplicação em diversas áreas como na genética forense, parasitologia, mapeamento genético, genética de

populações, função biológica e aplicações, entre outros. Porém, apesar de tudo, esses marcadores apresentam

certa limitação quanto ao desenvolvimento e isolamento de primers específicos ou ter disponível esses primers

para cada espécie para que possa ser revelado com sucesso os loci de STR’s (ZOLET, 2017).

Outro tipo de polimorfismo de comprimento são os minissatélites ou repetição em tandem de número variável,

representados pela sigla VNTR (variable number of tandem repeats). Diferentemente do anterior, nesse caso

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as regiões de repetições são maiores, podem ter 9 a 100 pares de bases e exibem grande variabilidade em um

determinado locus. Os minissatélites são constituídos por sequências de vários nucleotídeos, que se repetem em

quantidades diferentes em cada indivíduo, isso faz com que uma região de VNTR tenha muitos alelos,

determinados pelo número de vezes em que essa estrutura se repete ao longo do DNA (DOLINSKY, 2007).

Essas propriedades altamente polimórficas tornam esse marcador bastante aplicável, semelhante aos outros

marcadores como o STR, através da identificação do número de repetições encontrados em um grupo e

comparando a outros, visto que a sequência de repetições irá variar de um indivíduo para outro, é possível

estabelecer um padrão individual de DNA para cada pessoa. Por esse motivo esses marcadores são aplicáveis em

diversas áreas como medicina, ciência forense, pesquisa, entre outros (DOLINSKY, 2007).

Os polimorfismos genéticos, principalmente os de comprimento, tem grande impacto no uso dos marcadores

genéticos e sofreram grandes avanços a partir da descoberta das técnicas de hibridização e PCR, que

permitiram a revelação de fragmentos do DNA com grande eficácia. A primeira técnica utilizando um marcador

genético foi a RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que é um marcador baseado nos diferentes

fragmentos polimórficos originados por enzimas de restrição, este marcador foi fundamental para o estudo do

primeiro mapa molecular em humanos (ZOLET, 2017).

Por sua grande capacidade de discriminação de genótipos individuais os RFLP’s são usados em diferentes

aplicações, ainda hoje. Essa técnica também foi essencial para a identificação das regiões tipo microssatélites,

todavia apresenta algumas limitações em relação a quantidade de amostras de DNA, que devem ser bem

grandes, o uso de radioatividade em alguns métodos, além de ser extremamente laboriosa e demorada, esses

fatores contribuíram para a substituição dessa técnica por outros tipos de marcadores moleculares (ZOLET,

2017).

Esse método para encontrar regiões polimórficas, como o próprio nome mostra, está baseado na clivagem ou

corte de todo o DNA da amostra com uma ou mais enzimas de restrição, os fragmentos obtidos a partir dos

cortes podem ser submetidos a técnica de eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida para separação das

sequências específicas que podem ser “reveladas” posteriormente com a adição de uma sonda marcada

radioativamente ou fluorescente que se liga de forma complementar a região polimórfica (ZOLET, 2017).

Apesar da técnica com marcadores RFPL’s ser menos utilizada hoje, em relação as outras técnicas que utilizam

PCR, ela foi fundamental para marcadores posteriores como os CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic

Sequences) denominados também de PCR- RFLP. A técnica de PCR permitiu detectar polimorfismos de forma

mais rápida e sensível, pois era possível usar primers para obter sequências específicas que poderiam ser

amplificadas centenas de vezes para depois serem clivadas por enzimas de restrição. (ZOLET, 2017)

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O uso de marcadores moleculares baseado em regiões polimórficas tem chamado cada vez mais atenção nas

áreas de genética e biologia molecular, pelo seu grande potencial e a expectativa de sua aplicação nos mais

distintos campos. Na atualidade com a evolução crescente da genômica o número de trabalhos e métodos

utilizando esses tipos de marcadores moleculares vem crescendo, ajudando em um entendimento maior dessas

ferramentas e da forma como podem ser utilizadas.

Assista aí

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2 O uso do DNA na Ciência Forense
Em princípio houve grande discussão sobre o uso de tecnologia do DNA como forma de obtenção de provas

periciais. Essas discussões levaram ao surgimento de normas e padrões rigorosos nas metodologias utilizadas

nos exames. Apesar disso, no Brasil ainda não existe uma normatização ou uma legislação específica para os

protocolos de utilização do DNA nas ciências forenses (ICPR, 2020).

O processo de empregar técnicas, métodos ou tecnologias para identificação civil não é atual. Em meados do séc.

XIX, já se falava em propostas para identificação através de tatuagem, ou ainda bem antes, em tempos sem

nenhum tipo de conhecimento científico ou métodos apropriados era usado marcação de indivíduos que

cometeram roubo ou algum delito através de ferro em brasa (ICPR, 2020).

Alguns séculos depois, a partir da descoberta de antígenos eritrocitários e a possibilidade de identificar

indivíduos através de análises sanguíneas, novos horizontes foram abertos. A descoberta de regiões variáveis no

DNA, denominadas de polimorfismo, responsáveis pelo sistema ABO no sangue humano, e a compreensão de que

essas variações poderiam ser usadas na identificação de pessoas trouxe, novos paradigmas para esse campo.

(BEIGUELMAN, 1972)

Landsteiner, em 1900 observou que anticorpos contidos no soro do sangue de indivíduos poderiam reagir a

antígenos correspondentes nas hemácias e que através desse processo seria possível separar em grupos pessoas

de acordo com a capacidade de seu soro aglutinar hemácias. Esses estudos, além de render o Prêmio Nobel ao

seu pesquisador, foi o ponta pé inicial para o uso científico do sangue como agente terapêutico (BEIGUELMAN,

1972)

A identificação de antígenos das hemácias através de testes de aglutinação tornou capaz a realização dos

estudos iniciais de parentesco. Esse sistema, basicamente composto por dois antígenos e suas diferentes

combinações se mostraram úteis na determinação de paternidade, apesar disso, a utilização do sistema ABO

para determinação de parentesco não é absolutamente eficaz, pois tem uma probabilidade de identificação de

paternidade de apenas 13% (SILVER, 1982).

O advento das técnicas de biologia molecular impulsionou o desenvolvimento de novos métodos de

identificação, pautados na análise de propriedades genéticas dos indivíduos através da observação e análise do

DNA. As tecnologias baseadas no DNA revolucionaram a ciência forense e, além de ocasionarem uma

substituição das técnicas que até então eram utilizadas, provocaram uma popularização muito maior dessa

ciência.

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Resultado da aplicação dessas técnicas foi a tipagem de DNA, que esclareceu que o DNA poderia estar presente

em quantidades suficientes em diversas amostras biológicas possíveis de serem testadas. Em 1984, com a

descoberta de regiões altamente variáveis em alguns locais específicos do cromossomo, chamadas de

minissatélites, foi possível produzir uma espécie de “impressão digital” do DNA tendo esse método grande

aplicabilidade para identificação de crimes, paternidade, etc. (JEFFREYS, 1985).

O grande impulsionador da ciência forense, sem dúvida, foi o desenvolvimento constante das técnicas de biologia

molecular, da tecnologia do DNA e dos projetos de sequenciamento como o Genoma Humano. O conhecimento

profundo sobre a organização e estrutura do código genético, possibilitou a ciência demonstrar os mecanismos

responsáveis pela variabilidade dos indivíduos e das espécies e como isso poderia ser usado para identificação

genética dos indivíduos (JOBLING, 2004).

Essas descobertas deram maior visibilidade e desenvolvimento para uma área da ciência conhecida como

Medicina Forense ou Ciência Forense, que se caracteriza pela multidisciplinaridade, ou seja, um conjunto de

disciplinas como a química, biologia, física e matemática trabalhando juntas para contribuir na elucidação de

casos na área criminal ou outras (BARBOSA, 2018).

Figura 2 - Cientista forense

Fonte: Sergey Nivens, Shuttetstock, 2020

#PraCegoVer: A imagem ilustra uma cientista forense analisando informações genéticas no seu laboratório

informatizado.

O registro do primeiro caso a ser solucionado usando essas técnicas modernas de exame de DNA foi feito na

Inglaterra, em 1983, no caso Lynda Mann, uma garota de 15 anos que teve o corpo achado com vestígios de

sêmen. Três anos depois, na mesma região outro corpo foi encontrado contendo amostras de sêmen, essas

amostras foram utilizadas para identificação do assassino dessas duas vítimas (BARBOSA, 2018) .

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A identificação do assassino foi feita por um médico geneticista que morava na mesma cidade, chamado Alec

Jeffreys, ele havia publicado um artigo na revista Nature demonstrando regiões no DNA chamadas de

minissatélites que poderiam identificar uma pessoa com aproximadamente 100% de eficácia, ele denominou

essas regiões de “impressões digitais do DNA”. A utilização desses estudos permitiu a Jeffreys, algum tempo

depois, encontrar o DNA compatível com aqueles vestígios encontrados no corpo das vítimas (BARBOSA, 2018).

Esse método descrito por Jeffreys, hoje conhecido como técnica do DNA firgersprint ou tipagem de DNA,

compara fragmentos de DNA para identificação de indivíduos e é amplamente utilizado na ciência forense, por

esse motivo Jeffreys é considerado o pai do teste de DNA. Em 1986 foi a primeira vez que o DNA foi aceito como

prova criminal em uma corte dos EUA e em 1987 o FBI juntamente a vários laboratórios de países diferentes

começaram a aceitar o uso de amostras biológicas como prova criminal (BARBOSA, 2018).

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2.1 Identificação de paternidade e de indivíduos

Dentro das ciências forenses um dos campos com maior destaque nos últimos anos tem sido a genética e a

biologia aplicada as perícias, em especial em casos de identificação de suspeitos e filiação, chamada Genética

Forense. A genética tem se mostrado fundamental, por sua eficácia e especificidade, para a resolução de crimes,

com a evolução das áreas genéticas a identificação de indivíduos alcançou um novo patamar (BARBOSA, 2018).

A identificação pericial com base na genética está intimamente ligada as técnicas de análise de vestígios

biológicos, o isolamento do DNA nesses vestígios e sua caracterização são os fundamentos da perícia criminal

atualmente. Basicamente a coleta e análise de vestígios anatômicos, humorais e biológicos são os métodos de

genética forense mais utilizados para identificar autores de crimes (BARBOSA, 2018).

Além disso, a identificação pelo DNA tem se mostrado uma forma muito eficaz em casos de paternidade, isso

porque o perfil de DNA é determinado pela sequência de letras denominadas de nucleotídeos, dispostas em um

cromossomo sempre na mesma ordem em um indivíduo. Quando mais diferentes são os indivíduos mais

diferente é a ordem dessas letras no genoma, consequentemente quando maior o grau de parentesco, por

exemplo, pai e filhos, maior o grau de similaridade na sequência dessas letras, ou seja, dos nucleotídeos

(DOLINSKY, 2007).

Com exceção de gêmeos idênticos que apresentam o mesmo código genético, outros indivíduos podem ser

identificados através da comparação de DNA extraído em evidencias biológicas nas cenas de crime ou ainda pode

ser identificada paternidade em processos cíveis. Para realização do perfil de DNA, somente algumas regiões são

estudadas, são locais no DNA que apresentam grande variação individual, conhecidos como marcadores

moleculares ou genéticos, são fragmentos que apresenta um padrão particular em certos indivíduos ou

populações (DOLINSKY, 2007).

Os polimorfismos de comprimento têm grande interesse e aplicabilidade na genética forense para identificação

de indivíduos, as regiões polimórficas conhecidas como STR (“short tandem repeat”) e VNTR (“variable number

of tandem repeat”) que se caracterizam por apresentarem sequências de nucleotídeos repetidas, passadas

adiante por várias cópias e que variam em relação ao número de repetições entre os indivíduos para cada locus,

são amplamente utilizadas nas técnicas de perícia forense (DOLINSKY, 2007).

O que diferencia esses dois marcadores é somente o tamanho da região (locus) de repetição, nas VNTR –

minissatélites há uma sequência maior de repetição, de 10 a 100 pares de bases, que se repetem em número

diferentes em cada indivíduo, permitindo assim individualizar um cidadão. Já as STR – microssatélites têm uma

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sequência menor de repetições, entre 1 a 4 pares de bases, variando também entre os indivíduos. Sendo assim,

devido a quantidade de repetições apresentadas, os indivíduos terão tamanhos diferentes nas regiões que

contém um STR ou VNTR em seu DNA (LIMA, 2006).

A análise dessas regiões constitui a essência da genética forense e dos testes de individualização e paternidade

utilizados hoje, sendo que quanto mais locus são testados, maior a chance de acerto, por exemplo, para testes

forenses ou de paternidade, em média são utilizados até 18 locus diferentes no teste. Usualmente os STR são

escolhidos por apresentarem grande polimorfismo e serem sequências menores, por isso facilmente tipadas

(JOBIM, 2006).

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2.2 Métodos para detecção em Genética Forense

O primeiro método de detecção ou identificação a ser realizado foi através da utilização de regiões de VNTR

clivados por enzimas de restrição, a técnica de RFLP (restriction fragmente length polymorphism) ou

polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição, que consiste em obter um fragmento polimórfico de

DNA de um comprimento determinado, usando enzimas de restrição. Esses fragmentos obtidos podem ser

analisados em relação aos seus polimorfismos, diferença entre as sequências, ou em relação aos comprimentos

diferentes em cada indivíduo (HENRY, 1998).

Para a aplicação desse método foi fundamental a criação de sondas de DNA que se ligasse nessas regiões de

VNTR, as primeiras sondas se ligavam a diversas sequências de DNA originando uma grande quantidade de

bandas difíceis de serem interpretadas. Uma segunda classe de sondas foi posteriormente desenvolvida para se

ligar a um único locus apenas, essas sondas foram amplamente utilizadas por terem mais específicas e de mais

fácil interpretação (THOMPSON, 2003).

O método de “Southern Blot” é usado para detecção de RFPL’s, pois pode identificar fragmentos de DNA com

sequências idênticas ou equivalentes à sonda utilizada, além disso pode ajudar no posicionamento de diferentes

fragmentos dentro de uma região maior do DNA. O uso de sondas radioativas permite revelação dos fragmentos

polimórficos de interesse através da radiografia das bandas. (MALACINSKEI, 2005).

As amostras biológicas após terem seu DNA extraído, passam pela restrição enzimática e os fragmentos obtidos

são submetidos a técnica de eletroforese, para a separação das regiões de interesse, em um gel com suporte que

pode ser nitrocelulose. Depois desse processo essas regiões ligadas a sondas radioativas podem identificar

sequências determinadas entre milhares de fragmentos de restrição, a radiografia das sondas revela fragmentos

de DNA de diferentes tamanhos e em diferentes quantidades (MALACINSKEI, 2005).

A análise das diferentes quantidades de repetições em tandem, que varia entre os indivíduos, é que permite a

identificação ou individualização, pois cada um terá um padrão bastante específico de fragmentos de DNA, esse

padrão é chamado fingerprint do DNA ou impressão digital do DNA, sendo essa uma técnica bem estabelecida na

área da genética forense (MALACINSKEI, 2005) .

A técnica de RFLP com o uso de sondas de locus único foi muito utilizada, apesar de atualmente ter aplicação

somente em testes de paternidade e em poucos laboratórios específicos, demonstra grande sensibilidade sendo

capaz de identificar um indivíduo entre centenas de milhares ou até bilhões de indivíduos. No entanto, é uma

técnica complexa, trabalhosa e que leva bastante tempo, podendo um teste levar até seis semanas para sua

conclusão (MALACINSKEI, 2005). Além disso, é necessária uma amostra de DNA em grande quantidade e

altamente preservada e pura, fato que, somado ao advento de novas técnicas de biologia molecular como a

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reação em cadeia da polimerase – PCR, fizeram com que a técnica de RFLP com uso de sondas para loci único

começasse a ser gradativamente substituída por outras técnicas de detecção (THOMPSON, 2003) ,

O final dos anos 1980 foi marcado por um rápido avanço dos estudos sobre o DNA em especial das técnicas de

biologia molecular, uma das técnicas descritas mais proeminentes foi a reação em cadeia da polimerase – PCR,

essa técnica foi um grande marco na análise do genoma e por sua capacidade de amplificar o DNA e usar

quantidade bem pequenas de amostras biológicas, praticamente tornando a técnica de RFLP pouco aplicável na

prática (DOLINSKY, 2007).

Essa técnica mostrou maior potencial para detecção de indivíduos por sua capacidade de produzir milhares de

cópias de fragmentos de DNA de um ou mais locus, sendo possível obter resultados com maior sensibilidade e

em muito menor tempo. Toda a técnica de PCR é realizada in vitro e por suas características, em especial a

possibilidade de usar quantidades extremamente pequenas de DNA, apresenta um ótimo potencial para ser

usada na genética forense (DOLINSKY, 2007).

O fato de poder utilizar somente algumas sequências intactas para fazer a amplificação, torna o DNA alvo

protegido de degradação. Diferente da técnica de RFPL que é extremamente sensível à degradação, sendo esse

um dos problemas centrais desse método, além disso a PCR elimina a necessidade de utilizar elementos

radioativos o que a torna também mais segura (WEEDN, 1998).

Na técnica de PCR para identificação de indivíduos, usa-se os microssatélites de STR, com fragmentos ou alelos

de DNA curtos. Como essas regiões polimórficas do genoma de cada indivíduo é diferente, é possível amplifica-

las para posterior análise. O uso de iniciadores específicos que se ligam a essas regiões permite que seja gerado

uma “impressão digital” característica de DNA para cada indivíduo, sendo necessário a utilização de outros

métodos para analisar os produtos de amplificação obtidos por PCR (DOLINSKY, 2007).

A metodologia de Dotblot constitui um exemplo de técnicas utilizadas para análise dessa amplificação, nessa

técnica são usadas sondas de DNA para detectar sequências específicas, a partir do momento em que um

fragmento é amplificado e fixado em uma membrana, essas regiões são ligadas a sondas e aquelas que não foram

ligadas são eliminadas através de lavagem. Os resultados são obtidos através de uma reação química que ocorre

na enzima ligada a essas sondas, a presença dessa reação determinará a identificação de uma sequência ou

genótipo específico (DOLINSKY, 2007).

Uma das técnicas de grande impacto atualmente para esse intuito é a PCR multiplex. Ela é capaz de amplificar

diversos fragmentos de STR no mesmo ensaio, nesse método é usado um grupo de iniciadores (primers)

diferentes. Quanto maior a quantidade de regiões amplificadas, maior a confiabilidade da técnica, ressaltando

que é necessário ter conhecimento prévio da região ou sequência de interesse, ou seja, que se deseja identificar

(DOLINSKY, 2007).

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Diversos métodos de detecção estão sendo empregados hoje, em geral com a utilização da PCR para se obter o

perfil de DNA, a análise desse perfil está pautada na comparação de sequências de DNA de dois ou mais

indivíduos. Esse exame tem sido utilizado em variadas aplicações como identificação de paternidade,

identificação de cadáveres, determinação de sucessão para bens e herança, controle de qualidade de linhagens

alteradas, entre outras (DOLINSKY, 2007).

O perfil do DNA se obtém através da análise do material genético de um indivíduo, mais especificamente do uso

de métodos de detecção para analisar um padrão de sequência em um determinado fragmento do DNA. De

acordo com Borém (2011), para realização desse exame algumas etapas são obedecidas seguindo uma

normatização bem rigorosa e criteriosa, sendo dividida da seguinte forma:

O DNA pode ser obtido em uma grande diversidade de vestígios biológicos como pelos,

sangue, saliva, sêmen, ossos ou qualquer outro tipo de tecido ou fluido. A qualidade da

obtenção dessas amostras, através da adoção de procedimentos como isolamento da cena

Coleta do
de crime, levantamento em bancos de dados, entre outros, é fundamental para
material
confiabilidade dos resultados. Ressaltando que fatores ambientais como altas
genético
temperaturas, luz, microrganismos, substâncias químicas ou mesmo manipulação errada

dessas amostras podem contaminar esse material comprometendo os resultados do

exame.

Obtenção A partir da obtenção das amostras é necessário extrair o DNA desses vestígios biológicos,

/isolamento de acordo com o método de detecção utilizado diferentes quantidades de DNA são

do DNA necessárias. Em técnicas mais especializadas pequenas quantidades de DNA são suficiente.

Nessa etapa, é realizada a fragmentação ou corte do DNA obtido através de enzimas de

Fragmentação restrição, esses cortes originam fragmentos específicos, ou seja, sequências de bases

do DNA curtas. Depois da clivagem do DNA uma grande quantidade de fragmentos de diferentes

tamanhos é originada.

No conjunto de fragmentos é feita a separação por tamanho através da técnica de

Separação
eletroforese (técnica de separação de moléculas com uma corrente elétrica). Nesse
d o s
método os fragmentos de DNA fixados em um gel são submetidos a um campo elétrico e
fragmentos
irão migrar de um polo a outro de acordo com o seu tamanho, os menores fragmentos vão
de DNA
migrar mais pois encontrarão menor resistência no gel.

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 Depois da separação de fragmentos do DNA, os mesmos são transferidos para membranas

onde poderão ser manipulados, nessas membranas são adicionadas sondas que podem ser

Hibridização radioativas ou fluorescentes, essas sondas se ligam de forma complementar aos

do DNA fragmentos de DNA específicos. Cada tipo de sonda específica vai se ligar e “revelar”

apenas alguns fragmentos presentes na membrana, aquelas que se pretende estudar ou

observar

As membranas hibridizadas estarão constituídas com diversas sondas que após revelação

Revelação do irão originar um padrão de bandas de diferentes tamanhos, variando de um indivíduo

perfil do DNA para outro de acordo com o tamanho e ordem de sequência, obtendo-se um padrão

individual de bandas ou impressão digital do DNA.

Esses procedimentos e técnicas de detecção de indivíduos são amplamente utilizados hoje na genética forense e

na ciência forense como um todo, sendo aplicadas e bem estabelecidas em diversas situações que envolvem

exame pericial. A análise comparativa do DNA é fundamental também para os sistemas de identificação, sendo

necessário o investimento em bancos de dados genéticos, além de tecnologias e mão de obra qualificada. O

exame comparativo de DNA se baseia nas mesmas etapas, desde a obtenção de amostras até o perfil genético,

sendo selecionados apenas trechos significativos dentro das amostras. São selecionados no mínimo 13 loci onde

se verifica o comprimento das sequências das bases e as similaridades existentes entre os alelos para se

comprovar algum grau de parentesco (DOLINSKY, 2007).

Em seguida, softwares são utilizados para o cálculo estatístico de modo a estimar a quantidade de vezes que esse

perfil aparece um uma população, sendo a probabilidade de que duas pessoas tenham as mesmas sequências nos

trechos de DNA analisados, aproximadamente uma em seis bilhões. Para análise comparativa é essencial o

desenvolvimento de bancos de dados, com a identificação de criminosos que já tenham passado pelo sistema de

detenção, nos EUA, hoje, existe um banco de dados baseado em 13 locis de STR utilizado pelo FBI (DOLINSKY,

2007).

Pode-se evidenciar que a utilização de técnicas de identificação de indivíduos baseadas na genética forense é

uma realidade atualmente e que foram uma grande mudança de patamar comparado as técnicas anteriores,

principalmente pelo fato da molécula de DNA apresentar grande estabilidade e grande possibilidade de obtenção

já que está presente em qualquer célula humana, podendo ser isolada de uma diversidade muito grande de

vestígios biológicos (DOLINSKY, 2007).

O avanço das técnicas de DNA na ciência forense tem grande confiabilidade e se mostram como ferramentas

poderosas para elucidação de crimes, tanto na esfera cível como na criminal, além de apresentarem grandes

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expectativas, já que as tecnologias do DNA continuam em grande avanço sempre. Contudo é preciso que os

laboratórios ou institutos que trabalham com essa demanda estejam constantemente investindo em controle de

qualidade, tecnologias e capacitação profissional (DOLINSKY, 2007).

Assista aí

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/1c64b577e97df105cf9aecfb2e314621

Fique de olho
Nos últimos anos, o Brasil tem pensado no aumento de investimentos em laboratório
genéticos. A Secretaria Nacional de Segurança tem voltado sua atenção na liberação de
recursos para a criação de laboratórios e a consolidação de um banco de dados genéticos
denominado Rede Integrada de Bancos de Perfis Genéticos (RIPBG). O ideal é que haja uma
expansão no uso dessas tecnologias em todo o país, atualmente são mais de 15 estados que
estão integrados a esse projeto e com a expectativa de que mais estados tenham seus
laboratórios de DNA nos próximos anos.

é isso Aí!
Nesta unidade, você teve a oportunidade de:
• entender como as variações genéticas são comuns e até esperadas na célula, num certo limite;
• entender como essas variações são causadas por mutações e recombinações gênicas, sendo fonte
fundamental da variabilidade das espécies;
• conhecer as regiões do DNA altamente variáveis denominadas de polimorfismo e os critérios para se
considerar um alelo polimórfico (frequência do alelo >1% na população);
• conhecer os diferentes tipos de polimorfismos baseados na diferença entre sequência ou comprimento;
• conhecer como os métodos de identificação evoluíram ao longo do tempo nas ciências forenses;
• conhecer os principais métodos utilizados hoje para identificação e testes de paternidade (análise das
STR e VNTR através de PCR);
• entender como funciona essa técnicas aplicadas aos exames periciais e de que forma impactaram na
genética forense.

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Referências
ALBERTS, B. E. C. Fundamentos da Biologia Celular. 3º Ed. Porto Alegre: Artmed, 2011

BEIGUELMAN, B. Dinâmica dos genes nas populações e nas famílias. 2 Ed. São Paulo: Edart, 1972.

BARBOSA, R. P. et al. História e importância da genética na área forense. Revista Saúde em Foco. Ed. 10, 2018.

DOLINSKY, L. C. et al. DNA forense. Artigo de revisão. Saúde e Ambiente em Revista, v.2, n.2, p.11-12, jul-dez,

2007.

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identificar restos mortais ou realizar perícias criminais. Revista do Biomédico. Ed. 65. Disponível em:

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http://www.ic.pr.gov.br/modules/conteudo/conteudo.php?conteudo=7 Acesso em: 23/03/20

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