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IX – ESPECTROFOTOMETRIA DO VISÍVEL E DO ULTRAVIOLETA (MOLECULAR)

9.1. INTRODUÇÃO

A espectrofotometria molecular (UV-Visível), mais comumente chamada de

espectrofotometria, é a medição do espectro da radiação eletromagnética, baseado no fato que todo
composto químico é capaz de absorver com intensidade, definidos comprimentos de onda da radiação
eletromagnética.
É utilizada para medir a concentração de uma substância colorida ou de um elemento capaz
de formar compostos coloridos em solução, e por isso também conhecida como colorimetria ou
espectrocolorimetria.
O termo colorimetria é utilizado para medidas com luz filtrada (colorímetros), enquanto o
termo espectrocolorimetria para medidas com luz monocromáticas (espectrofotômetros).
A espectrofotometria não se limita ao espectro do visível, absorvidas por soluções coloridas,
se utiliza também, para dosagens de compostos incolores capazes de absorver radiação fora do visível
(200 a 400 e 750 a 1000 nm – ultravioleta próximo e início do infravermelho, respectivamente). É de
uso generalizado; sensível para dosagens de traços; é rápida.
O efeito de íons interferentes pode ser reduzido, sem separação prévia, por técnicas adequadas:
formação de complexos, padronização do pH, escolha adequada do comprimento de onda, ou pela
utilização de “branco” (efeito matriz).
Uma reação de formação de compostos coloridos pode servir para a dosagem quantitativa
quando se cumprem as seguintes condições:

a) A reação forma compostos suficientemente estável para dar tempo para a leitura;

b) A intensidade da coloração deve crescer proporcionalmente com o aumento da concentração

do composto em solução.

9.2. Transmitância e Absorvância

A absorção é um processo específico relacionado com a estrutura da substância absorvente. A

absorção dos fótons (λ específico) é proporcional ao número de unidades absorventes encontradas
pela radiação em seu percurso através da solução.
A absorção não é medida diretamente. Mede-se a radiação transmitida, que é relacionada com
a concentração do composto em solução.
 2

Quando a energia radiante incide, com intensidade Ii, sobre uma cubeta contendo solução (ou
suspensão) homogênea, vários fenômenos ocorrem no seu percurso:
Ii = Ir + Ie + Ia + It
Onde: Ii = Intensidade do feixe luminoso incidente; I r = Intensidade do feixe luminoso que sofre
refração; Ie = intensidade do feixe luminoso que sofre reflexão (refletido, espalhado); I a = intensidade
do feixe luminoso absorvido; It = intensidade do feixe luminoso transmitido.

Nas dosagens convencionais, Ir é resultante da diferença do índice de refração (η) entre

absorvedor e ambiente, pode ser minimizado com o uso de cubetas com paredes homogêneas de
pequena espessura e com faces paralelas. Ie é desprezível, pois ao minimizar o índice de refração
menor será a fração do feixe de radiação que será refletida (espalhada). Assim em dosagens UV-
visível temos:
Ii = Ia + It
As intensidades dos feixes Ii e It podem ser medidas diretamente, logo:
Ia = Ii – It
Bouguer e Lambert (1729 e 1760) enunciaram as leis fundamentais da absorção:

 A intensidade da luz monocromática transmitida através de um corpo homogêneo é

proporcional à intensidade do feixe incidente:

𝑰𝒕 ∞𝑰𝒊

𝑰𝒕 = 𝒌𝟏 𝑰𝒊

 A intensidade da luz monocromática transmitida decresce exponencialmente com o aumento

da espessura do corpo absorvente (b):

𝑰𝒕 = 𝒆(−𝒌𝟐𝒃)

Combinando-se as duas equações temos (Figura 1):

𝑰𝒕 = 𝑰𝒊 𝒆(−𝒌𝟑𝒃)
 3

Figura 1: Relação entre a distância

percorrida pelo feixe luminoso e a luz
absorvida por uma solução. A solução
contida na cubeta com 3 cm absorve 3
vezes mais luz que a contida na cubeta de
1 cm.

FONTE: https://www.google.com/url?sa=i&url=http%3A%2F%2Fpaginapessoal.utfpr.edu.br%2Fterrile%2Fmetodos-instrumentais-em-analise-de-alimentos%2Fespectrofotometria-uv-

vis%2FAULA%25202%2520ESPECTROFOTOMETRIA%2520UV-VIS.pdf%2Fat_download%2Ffile&psig=AOvVaw2KdS9-

wrKKAUDBba8tHZrs&ust=1619271314457000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCOCsy_C9lPACFQAAAAAdAAAAABAD

k3 combinado com k1 e k2, é chamado de coeficiente de absorção e depende de:

 Natureza do meio;
 Concentração do composto;
 Comprimento de onda (λ) da radiação eletromagnética.
 Temperatura;
 Solvente.

Beer em 1852 em estudos da influência das concentrações de soluções coloridas sobre a

transmissão da luz chegou à conclusão de que I t, para definida substância absorvente, é proporcional
a sua concentração, decrescendo exponencialmente com o aumento da concentração (Figura 2).
𝑰𝒕 = 𝑰𝒊 𝒆(−𝒌𝟒𝒄)

Figura 2: Relação entre a concentração de uma

solução e a luz absorvida. A solução 20 g L -1
absorve o dobro da solução 10g L-1.
FONTE:
https://encrypted-
tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRiY321puRvtykfGgjye-
ze3gkrZE8PJbnqyA&usqp=CAU

Onde k4 depende de:

 Natureza da substância; Espessura do meio; Comprimento de onda (λ) da radiação
eletromagnética; Temperatura; Solvente.
 4

Combinando o efeito da espessura (percurso) e da concentração tem-se a lei de Bouguer-

Lambert-Beer, conhecida como Lei de Lambert-Beer.

𝑰𝒕 = 𝑰𝒊 𝒆(−𝒌𝟓 𝒃𝒄) 𝒐𝒖 𝑰𝒕 = 𝑰𝒊 1𝟎(−𝒌𝟔 𝒃𝒄)

Onde: k6 = k5 / 2,303; k5 ou k6 = -a ou –ε; K6 depende da natureza da substância e do comprimento de

onda (λ) da radiação eletromagnética.

O valor de a significa a absortividade ou coeficiente de extensão, quando a concentração (C)

é expressa em mg L-1 e “b” em centímetro. Caso utilizemos “b” em centímetro e C em mol L-1 chama-
se absortividade molar (ε) e se utiliza quando se conhece a natureza do material absorvente e sua
massa molar.
𝑰𝒕 = 𝑰𝒊 1𝟎−Ɛ𝒃𝒄
Onde: It = intensidade da luz transmitida; Ii = intensidade da luz incidente; ε = constante de absorção
do soluto ou absortividade; b = comprimento ou espessura da solução atravessada pela radiação,
expresso em centímetro; C = concentração do soluto.

A absortividade molar (ε) é utilizada quando se deseja comparar a absorção de várias

substâncias químicas, e depende:
 da natureza da substância absorvente; do λ da radiação eletromagnética; da temperatura; e do
solvente.
Por que a absortividade molar ( ε) independe nem concentração da substância nem da
espessura da cubeta (do caminho óptico da amostra)?

Porque essa grandeza ε é simplesmente um coeficiente de proporcionalidade entre a

absorvância e o produto bc. Quanto maior a absortividade molar, maior a absorvância. A absortividade
molar é característica de uma substância que nos indica a quantidade de luz absorvida num
determinado comprimento de onda. Portanto, a equação anterior pode ser reescrita como: A λ=ελbc
uma vez que A e ε dependem do comprimento de onda da luz.
Assim sendo, a lei de Lambert-Beer mostra que para uma dada substância e a um dado
comprimento de onda a absorvância é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente,
quando se fixa a espessura do meio e proporcional à espessura quando se fixa a concentração da amostra.
A lei de Lambert-Beer apresenta algumas limitações reais, uma vez que só se apresenta a soluções
muito diluídas, geralmente inferiores a 10-2 ou 10-3 M, o que é devido basicamente a dois motivos:
 5

1) Para que se cumpra a lei de Lambert-Beer pressupõe-se que os centros absorventes atuam
independentemente uns dos outros. Esta restrição da à lei um caráter de uma lei limite, aplicando-se
apenas às soluções diluídas. A distância média entre as espécies responsáveis pela absorção diminui
com o aumento da concentração, podendo chegar a um ponto que afeta a distribuição de carga das
espécies vizinhas. Esta interação, por sua vez, faz variar a possibilidade das espécies absorverem, a
um dado comprimento de onda da radiação. Como o grau de interação é dependente da concentração
a ocorrência deste fenômeno provoca desvios de linearidade da Lei de Lambert-Beer.

2) Para concentrações bastante elevadas há uma variação do índice de refração da solução. Como a
absortividade é função do índice de refração, observam-se desvios à lei de Lambert-Beer.

A relação It/Ii representa a transmitância (t), frequ\entemente expressa em % (T), e o valor

máximo que pode atingir é 100%. Caso uma determinada solução não absorva energia I t = Ii e
consequentemente t = 1 ou T = 100%. Assim sendo, pode-se concluir que uma solução que absorva
energia a transmitância será menor que 1 (T < 100%).

𝟏𝟎𝟎𝑰𝒕
𝑻=
𝑰𝒊
Aplicando-se a propriedade logarítmica à expressão It/Io, obtemos (Figura 3):

𝑰𝒕 𝑰𝒕
= 𝟏𝟎−𝜺𝒃𝒄  𝒍𝒐𝒈 = 𝒍𝒐𝒈𝟏𝟎−𝜺𝒃𝒄 
𝑰𝒊 𝑰𝒊

𝑰𝒕 𝑰𝒕
𝒍𝒐𝒈 = −𝜺𝒃𝑪  − 𝒍𝒐𝒈 = 𝜺𝒃𝑪 = 𝑨
𝑰𝒊 𝑰𝒊

𝐴 = 𝜺𝒃𝑪
Onde: A é a absorvância
 6

Figura 3: Linearização da relação It/Io em função da concentração pela aplicação de logaritmo.

FONTE: https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT7ZwGocQ9VLd1tuspd2gSR4m11GXJHTjW0zdKaDxXVf7b-
VzBkBtpzObxumwMk7SkGPOA&usqp=CAU.

Uma vez que It/Ii = 10-abC, onde a é a absortividade, b é a espessura do caminho óptico em cm
e C a concentração em mg/L, tem-se:
𝑰
%𝑻 = 𝟏𝟎𝟎 𝑰𝒕  𝒍𝒐𝒈%𝑻 = 𝒍𝒐𝒈(𝟏𝟎𝟎𝒙𝟏𝟎−𝒂𝒃𝑪 ) = 𝟐 − 𝒂𝒃𝑪 = 𝟐 − 𝑨
𝒊

Logo podemos substituir: log%T = 2 – A  A = 2 – log%T. Assim sendo, um valor de %T

lido em um fotocolorímetro pode ser transformado facilmente em absorvância.

OBS:
1- A absortividade é uma propriedade da substância, não depende da concentração da amostra,
enquanto a absorbância é uma propriedade de uma determinada amostra e variará com a concentração
e espessura da cubeta.

9.2.1. Confiabilidade das Leis

Para que se cumpram as Leis é necessário:

a) O feixe de luz de ser monocromático;
b) A solução apresentar valor de concentração que possa apresentar uma reta ao plotar absorbância
X concentração;
c) Não deve ter nenhuma ação ou fenômeno de absorção externo em relação ao composto a ser
medido.

9.2.2. Interferências

 Presença de compostos não absorventes, mas que atuam sobre o estado eletrônico da molécula
em análise;
 7

 Solventes que provocam variações na absortividade (ε);

 Presença de fluorescência;
 Coloides em suspensão;
 Dificuldade em se ter suficiente monocromaticidade da radiação eletromagnética (RE). Nos
fotômetros (colorímetros), pelo uso de filtros, as faixas de RE (visível) são relativamente
largas, com baixa pureza espectral (10 a 20 – 40 nm).

Nos espectrofotômetros, os monocromadores permitem isolar faixas muito estreitas, com boa
pureza espectral (decimais de nm, em UV-visível). Quanto mais estreita e pura a faixa espectral, tanto
mais ideais as condições analíticas, melhor se cumpre a Lei de L & B. Uma estreita faixa espectral
evita que outras moléculas, que absorvem fótons de um comprimento de onda (λ) próximo ao da
molécula em estudo, interfiram. Assim sendo, o emprego do λ de máxima absorbância garante maior
sensibilidade na leitura.

9.3. Componentes de um Espectrofotômetro

A diferença básica entre espectrofotômetros e fotômetros, é que os primeiros utilizam prismas

ou redes de difração na seleção do λ desejado, enquanto os últimos apresentam filtros. Assim sendo,
consegue-se obter bandas muito estreitas de λ, em qualquer zona do espectro, minimizando os erros
devido ao uso de radiação não monocromática.
Independente do modelo os espectrofotômetros apresentam cinco componentes básicos
(Figura 4):
a) Uma fonte estável de RE;
b) Um dispositivo para selecionar faixas espectrais específicas;
c) Cubetas transparentes ou células de absorção (área de amostra);
d) Um detector capaz de converter RE em um sinal elétrico mensurável;
e) Um indicador ou medidor de sinal.

     
Fonte Seletor Cubeta Detector Indicador
Figura 4: Esquema dos componentes básicos de um espectrofotômetro
Fonte: Meubles Borges Júnior.
 8

9.3.1. Fonte RE
 Deve fornecer um feixe de suficiente potência;
 Deve gerar radiação contínua (todos os λ dentro do intervalo de interesse);
 Deve ser estável, constante durante as leituras;
Na faixa de comprimento de onda do visível a fonte de energia é sempre uma lâmpada de
tungstênio de filamento incandescente com invólucro de vidro. O filamento opera a 2600 a 3000 K e
fornece RE contínua de 350 a 2500 nm. Contudo esta lâmpada emite muito pouca RE na zona do UV
e, portanto, não serve para λ < 375 nm.
As fontes de RE para UV são lâmpadas de descarga de hidrogênio ou deutério, com janela de
quartzo. Consiste num pequeno, mas intenso arco entre dois elétrodos contidos num tubo transparente,
cheio de hidrogênio, ou deutério gasoso, a baixa pressão e fornece desde 180 a 385 nm. A Radiação
espectral, característica da lâmpada de deutério, fornece muitas linhas espectrais ao longo do
comprimento de onda acima de 370nm, inclusive duas fortes linhas espectrais em 486.0 e 651.1nm,
que frequentemente são utilizados para checar a precisão do comprimento de onda.
A lâmpada de deutério apesar de produzir maior intensidade de radiação e ter vida mais longa
custa o dobro. Outras fontes podem ser utilizadas, como a lâmpada de xenônio, porém exige uma
fonte especial de alimentação e é relativamente cara.
A Lâmpada de Tungstênio e Tungstênio-Halogênio: O filamento da lâmpada de tungstênio
vaporiza-se e esses vapores fixam-se na face interna do bulbo da lâmpada. O efeito da evaporação
catódica ou sublimação reduz a transmissão de luz e deteriora o filamento. Já a lâmpada de tungstênio-
halogênio tem longa vida útil e previne a queda da intensidade provocada pela evaporação catódica.
Ela contém uma mistura de gás inerte e certa quantidade de traço de gás iodeto (halogênio), o que
retarda a vaporização do filamento de tungstênio através do ciclo halogênio sob condições de
aquecimento, resultando em maior vida útil e mantém uma forte radiação por maior período de tempo.
Lâmpada de Mercúrio: A lâmpada de mercúrio contém vapor de mercúrio a baixa pressão
(apenas alguns Torr). Emite muitas linhas espectrais, normalmente esses espectros são usados para
calibrar a escala do comprimento de onda de espectrofotômetros. As três linhas adjacentes ao redor
de 365nm (365.0, 365.5 e 366.3 nm) servem para checar a resolução do monocromador. A resolução
é definida como sendo o menor intervalo de comprimentos de onda, pelo qual duas linhas espectrais
adjacentes podem ser reconhecidas como espectros independentes.
 9

9.3.2. Seletores de RE

Após a fonte luminosa existe um diafragma que controla a intensidade de radiação incidente
através de uma fenda de tamanho variável. Após o diafragma uma banda de λ é selecionada através
de filtro ou de monocromador.

Filtros
Os filtros são dispositivos que transmitiram RE de alguns comprimentos de onda, mas que
absorvem outros. Os filtros utilizados na faixa do visível podem ser de vidro ou gelatina colorida,
estes últimos apesar de menos duráveis são mais baratos.

Monocromadores
Um monocromador é composto de fendas e lentes juntamente com o elemento que dispersa a
radiação, que pode ser um prisma ou uma rede de difração. A fenda de entrada define um feixe estreito
da radiação que incide no elemento dispersante (prisma ou rede de difração), abrindo-o em forma de
leque. Já a fenda de saída deixa passar uma banda estreita do comprimento de onda. Quanto mais
estreita for a fenda de saída e mais distante estiver localizada do prisma ou da rede de difração melhor
será a resolução do comprimento de onda.
Os prismas são elementos dispersantes, que em princípio podem ser obtidos por qualquer meio
transparente, mas sua utilidade é determinada por sua dispersão (Figura 5). Na região do ultravioleta
os materiais sólidos com transparência e dispersão adequados são a sílica e a alumina. A sílica pode
ser utilizada tanto como quartzo quanto na forma vítrea e a alumina na forma de safira artificial. Na
região do visível, a sílica e a safira são inferiores a vidros ópticos em relação à dispersão .

Figura 5: Esquema ilustrativo de um espectrofotômetro contendo fonte luz,

monocromador, cubeta, detector e indicador/leitor.
Fonte: https://cdn.goconqr.com/uploads/node/image/48106121/3e436944-b74a-46e6-b9a7-af2887982d40.jpg
 10

Uma rede de difração consiste numa peça de vidro, ou outro material transparente, na qual se
faz uma série de sulcos paralelos e igualmente distanciados. As redes usadas na zona do visível têm
aproximadamente 6000 sulcos por cm.

9.3.3. Cubetas ou Células de Absorção

A solução de leitura é introduzida em cubetas (Figura 6), que devem ser de material
transparente à radiação na região em que se realiza a leitura. Para análise na faixa de λ < 350 nm, estas
devem ser de quartzo ou sílica fundida. Na faixa do visível podem, também, ser usadas células de
vidro (faixa aplicável 350 nm a 2 ) que são mais baratas.

A B
Figura 6: Exemplos de Cubetas. A:Tamanhos e formas de cubetas. Fonte: https://docplayer.com.br/docs-
images/33/15795488/images/35-0.png; B: Cubeta de quartzo para espectrofotômetro. Fonte:
https://http2.mlstatic.com/D_NQ_NP_747475-MLB44211064674_112020-V.jpg.

Em geral as melhores cubetas são as retangulares de percurso de 1 a 10 cm. As cubetas

cilíndricas são mais econômicas, mas sua superfície curva necessita de cuidados na posição em que
estas são introduzidas no espectrofotômetro, pois pode haver variações na intensidade da radiação
transmitida por reflexão e alteração do percurso óptico ocasionando valores de leitura errados.
As medidas de absorvância são muito dependentes do modo como as cubetas são mantidas,
devendo ser rigorosamente limpas. Manchas (marcas de dedo, gorduras e outros) deverão ser evitadas,
bem como riscos. Nunca devem ser secas em estufas para não alterar o percurso óptico.

9.3.4. Detector

Os detectores são dispositivos fotossensíveis para medir a It convertendo a RE em sinal

elétrico. Deve ser sensível, responder rapidamente numa larga gama de λ, produzir um sinal elétrico
que possa ser facilmente amplificado e tenha um pequeno ruído de fundo.
Dois tipos de detectores da RE são utilizados:
 11

a) Fotoválvulas e Válvulas Fotomultiplicadoras

Segundo o efeito fotoelétrico clássico, fótons com alto conteúdo de energia, quando incidem
em uma superfície metálica provocam a liberação de elétrons, com geração de corrente proporcional
ao número de fótons. Assim sendo, as válvulas fotoemissoras consistem em dois eletrodos encaixados
em um envoltório transparente (tubo de vidro ou plástico), onde o cátodo é uma lamina de metal,
própria para receber a radiação transmitida a ser medida (Figura 7). Esse metal deve ter grande
tendência para perder elétrons. O ânodo é simplesmente um fio que funciona como coletor de elétrons.
A grande vantagem das fotoválvulas (válvulas fotoemissoras), comparadas a outros dispositivos, está
na sua sensibilidade a radiações na faixa do ultravioleta.

Figura 7: Desenho esquemático de

válvula fotoemissora.

As válvulas fotomultiplicadoras são um tipo de fotoválvula a vácuo, em que se consegue uma

ampliação do sinal com uma única válvula. Nestas válvulas os elétrons, após deixarem o cátodo por
ação da luz, são conduzidos para chocar-se com uma segunda superfície sensível (dínodo), potencial
mais positivo. No dínodo cada elétron, devido ao seu impacto, causa a liberação de vários elétrons
secundários. Os elétrons secundários são conduzidos a outro dínodo, onde o número de elétrons
liberados aumenta novamente. Esse processo pode ser repetido entre 10 e 15 vezes.

b) Celas Fotovoltaicas
As celas fotovoltaicas baseiam-se na geração de força eletromotriz em placa metálica recoberta
de material semicondutor (Figura 8). Consistem de um eletrodo plano de cobre ou ferro, sobre o qual
se deposita uma camada de um semicondutor (Se, Cu 2O). A camada semicondutora é recoberta com
película de prata ou outro metal nobre, tão delgada que é transparente à radiação incidente. Assim
sendo, a incidência da radiação faz com que o semicondutor fique com energia suficiente de modo
 12

que os elétrons conseguem passar com facilidade para o metal. Esse movimento produz corrente
elétrica que é transmitida através de um circuito externo no eletrodo metálico.

Figura 8: Placa solar utilizada para

produção de energia elétrica em uma casa.
FONTE: https://www.odebate.com.br/wp-
content/uploads/2019/04/17042019energia-
solar.jpg.

9.3.5. Indicadores

Os indicadores podem ser analógicos, tipo galvanômetro (Figura 9A), ou digitais (Figura 9B).
Existem espectrofotômetros que permitem ler em transmitância e, ou, absorvância e até mesmo em
concentração. Para indicadores analógicos tipo galvanômetros a leitura em %T tem a vantagem de se
obter valores numa escala entre 0 e 100, divididos em 100 partes iguais, tornando mais fáceis as leituras,
enquanto a escala de absorvância, dependendo do valor fracionário é de difícil medida.

A B

Figura 9: Desenho esquemático de um espectrofotômetro. A: Espectrofotômetro com indicador

analógico. Fonte: https://encrypted-
tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT3XHEgjgN9Xd2GlPpcUoKTUhjWkTDfBenDPM122xLaCLGHhS2pEyl4TG
TZD4kZj_l2Zh8&usqp=CAU; B: Espectrofotômetro com indicador digital. Fonte: http://3.bp.blogspot.com/-
jIUwPn6Df40/VTJpl3cusuI/AAAAAAAADww/ZWuBrENOOGg/s1600/componentes_clip_image002.jpg.

O Galvanômetro é o instrumento com que se medem pequenas correntes, ou pequenas tensões,

baseado na deformação que forças eletromagnéticas provocam num sistema mecânico elástico, e
geralmente oscilante.
 13

9.4. Análises Químicas

Uma vez que diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria
permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite também quantificá-
las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a concentração da substância.

9.4.1. Análises Qualitativas

A identificação de substâncias através de absorção de radiação, devida a transições eletrônicas,

faz-se comparando os espectros de absorção da amostra e de várias substâncias puras conhecidas até
que se encontrem dois espectros idênticos. Contudo, esta técnica só conduz a resultados concludentes
quando a substância que se pretende determinar possui numerosas frequências de absorção facilmente
resolúveis. Entretanto, a maioria das substâncias absorve muitas frequências de difícil resolução.
Outra limitação é devido às bandas de absorção, na espectrofotometria d/o visível e ultravioleta, serem
largas e, portanto, sem detalhes.
O conjunto das absorbâncias nos vários comprimentos de onda para um composto chama-se
espectro de absorção e varia de substância para substância. Se uma substância é verde, por exemplo,
então deixa passar ou reflete a cor nesse comprimento de onda, absorvendo mais a luz na região do
vermelho. A seguir podem ver-se espectros de várias substâncias diferentes (Figura 10).

Figura 10: Espectros de absorção de diferentes substâncias (1: bacterioclorofila; 2: clorofila a; 3:

clorofila b; 4: ficoeritrobilina; 5: beta-caroteno). A substância 1, por exemplo, absorve pouco na região
do visível, logo deve ser praticamente incolor para os nossos olhos. Fonte:
https://slidetodoc.com/presentation_image_h/9c9c45123340799f930ac00cd288b824/image-29.jpg.

Às vezes uma substância, quando alterada quimicamente, pode passar a apresentar um espectro
de absorção diferente. Quando isto acontece, temos uma maneira de detectar essas mesmas alterações.
 14

Por exemplo, o NADH1 reduzido absorve a 340 nm, enquanto que a forma oxidada não tem
absorvância significativa a esse comprimento de onda (Figura 11).

Figura 11: Espectros de absorção do NAD+ e do NADH.

Fonte: https://www.ufrgs.br/vitaminas-
b/img/espectro%20de%20absor%C3%A7%C3%A3o%20b3.jpg

Essas diferenças de espectro podem ser utilizadas laboratorialmente para seguir o percurso de
reações que se deseja estudar, por exemplo, reações metabólicas que envolvam a oxidação do NADH
ou a redução do NAD+.

9.4.2. Análises Quantitativas

O primeiro passo no desenvolvimento de uma técnica de análise espectrofotométrica é a

seleção da espécie absorvente, cuja absorvância será eventualmente determinada. Uma vez definida a
espécie absorvente, e adotados as condições (pH, desenvolvimento de coloração, etc) que garantam a
existência da espécie, a ser quantificada, em solução, identifica-se o comprimento de onda de máxima
absorção (λmax).
Contudo, há duas situações em que pode ser mais vantajoso medir a absorvância numa zona
diferente do λmax. Uma delas ocorre quando a substância contém algumas impurezas que absorvem

1
NAD é o acrónimo (do inglês Nicotinamide adenine dinucleotide) de nicotinamida adenina dinucleotídeo, difosfopiridina
nucleotídeo ou ainda dinucleótido de nicotinamida-adenina. É uma coenzima que apresenta dois estados de oxidação:
NAD+ (oxidado) e NADH (reduzido). A forma NADH é obtida pela redução do NAD+ com dois elétron e aceitação de um
próton (H+).
 15

no mesmo comprimento de onda. A outra é quando a substância a determinar apresenta-se em duas

formas, em equilíbrio uma com a outra.
Após localizar o λ apropriado, deve-se observar se o sistema segue a Lei de Lambert-Beer, o
que se consegue a partir da representação gráfica de valores de absorvância, para um conjunto de
soluções-padrão, em função das suas concentrações (Figura 12) . Em seguida, traça-se a melhor reta
que passa pelos pontos experimentais. Convém também determinar qual a probabilidade que os pontos
experimentais têm de estar em linha reta, o que nos dará uma indicação da relação linear existente.

FONTE: https://encrypted- FONTE:

tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRdXIIOVz4OlvoI4GqERb5
https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTv97jABWe6Djt4-
KJvVaww5Xd7o0OoJdetXmEtRcmCyVsGf4cA5e6ItK03FwpP8&us
qp=CAU OZZdyM2cJCtAQ-WGJjvEdtY9nntMvWQ_etaebh9oln0cFJJTrOn2lU&usqp=CAU

Figura 12: Exemplo gráfico de obtenção do comprimento de onda de máxima absorção.

Os métodos absolutos de análise, em que as concentrações são calculadas a partir da Lei de

Lambert-Beer (A = abC), com a ajuda de um valor de absortividade dado na literatura. Quase nunca
se usam em análise de absorção. Isto se deve ao fato de que espectrofotômetros diferentes, darem
valores que diferem sensivelmente no valor da absortividade.
É difícil, se não impossível, generalizar os valores de a ou ab da literatura, pois não é possível
operar com RE monocromática rigorosamente igual e de igual potência. Por isto se tem variações
entre aparelhos e entre séries de análise. É fundamental proceder à determinação de a para cada
aparelho e para cada série.
Assim sendo, os métodos geralmente utilizados empregam solução padrão, ou seja, uma ou mais
solução que apresentam concentração exatamente conhecida da substância em estudo. Numa série de
análises é também aconselhável repetir as medidas das absorvâncias das soluções-padrão a intervalos
regulares, para nos precavermos contra qualquer mudança das condições de operação do aparelho.
 16

a) Determinação por comparação com solução padrão

Considerando-se que a absorvância é diretamente proporcional à concentração do soluto, ao
se fazer a leitura da transmitância ou da absorvância de uma solução padrão e de uma amostra,
separadamente, ficará como icognita conhecer apenas a concentração da amostra. Exemplo:
Absorvância da solução em estudo (Ase = 0,301); Absorvância da solução padrão (Asp = 0,502)
Concentração da solução em estudo (Cse = ?); Concentração da solução padrão (Csp = 20 mg/L)
Cse/Csp = Ase/Asp  Cse = Ase.Csp/Asp
Cse = 0,301.20/0,502  Cse = 12 mg/L

Deve-se observar a faixa de concentração onde é obedecida a Lei de Lamberte-Beer.

b) Determinação utilizando-se uma curva de calibração
Preparam-se várias soluções-padrão (em média 3 a 5) dentro do intervalo de linearidade da
Lei de Lambert-Beer. Com os valores de transmitância ou absorvância obtidos no espectrofotômetro,
constrói-se a curva de calibração plotando-se estes valores no eixo da ordenada (Y) e a concentração
no eixo da abscissa (X). A curva traçada em papel milimetrado com as leituras em absorvância é linear
(Figura 11)

Figura 11: Cubetas contendo soluções com concentrações para o

preparo da curva de calibração.
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Este método é de grande precisão e a exatidão da análise depende da exatidão da solução

padrão “mãe” e da habilidade do analista em preparar as soluções-padrão.

c) Determinação utilizando adição de padrão

No método de adição padrão as leituras de absorvância são feitas em várias soluções, todas
elas contendo a mesma quantidade da amostra e concentrações diferentes do padrão adicionado, sendo
que uma delas conterá apenas a amostra, ou seja, zero da concentração padrão. Assim sendo, quando
se representa o valor da absorvância em função da concentração do padrão adicionado, na curva de
titulação, a reta obtida não passa pela origem, pois para zero do padrão temos a absovância da amostra.
Portanto a absorvância para a concentração nula de padrão adicionado corresponde ao valor da
amostra (Figura 12). A partir desse valor determina-se a concentração.

Figura 12: Gráfico para a determinação da concentração pelo método

da adição padrão.

O método de adição padrão elimina todo tipo de interferências que faz com que o coeficiente
de proporcionalidade entre a absorvância e a concentração torne-se constante pela adição de
quantidades idênticas de amostras aos padrões.
Sendo: Abs =abC
Considerando-se que:
AX+P = Absorvância relativa à concentração da amostra mais a concentração do padrão; AX =
Absorvância relativa à concentração da amostra; [P] = Concentração do padrão; [X] = Concentração
da amostra; K = ab = constante que considera a absortividade e a espessura da cubeta.
Tem-se:
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AX+P - AX = K1[P] ; AX = K2[X] ; K1 = K2, Logo:

A X P
 A X
 A X
 X   A  P
X

P X  A A
X P X

Exemplo: [P] = 0,4 mg/L; AX = 0,216; AX+P = 0,515; [X] = ?

0,216𝑥0,4
[𝑋] = = 0,289 𝑚𝑔/𝐿
0,515 − 0,216