Resumo

Células-tronco cancerígenas (CSCs) compõem uma pequena subpopulação de células

cancerígenas com capacidade de tumorigênese, autorenovação, diferenciação e metástase.
Foram identificadas em diversos tumores, incluindo neuroblastoma, e sua presença está
relacionada aos processos de progressão tumoral, resistência às terapias convencionais e
recidiva tumoral. Neuroblastoma é um tipo de câncer pediátrico que se forma principalmente
nas glândulas adrenais do sistema nervoso e é responsável por 10% de mortalidade por câncer
pediátrico com 50% dos casos com metástase no diagnóstico. Um estudo em modelo
xenográfico murino mostrou que o antagonismo do receptor purinérgico P2X7 inibiu a
metástase de neuroblastoma. Esse receptor ionotrópico tem como agonista o ATP extracelular
e atua na sinalização e transdução celulares. Já é conhecido que ele é superexpresso em diversos
tumores, promove o crescimento, a proliferação, a invasão e a metástase; além disso, tanto sua
expressão como sua atividade estão aumentadas na proliferação de células-tronco embrionárias
e abolidas sob a indução da diferenciação neural. Partindo disso, acreditamos que o P2X7 possa
estar envolvido na manutenção de CSCs na massa tumoral de neuroblastoma. A expressão de
suas isoformas A e B varia dependentemente dos níveis de ATP endógeno, mas foi mostrado
recentemente por nosso grupo que o tratamento de células de neuroblastoma com bradicinina
(BK) aumentou a expressão de ambas as isoformas, favorecendo a de P2X7B. Além disso, BK
aumentou o comportamento metastático dessas células. Portanto, hipotetizamos que a
superexpressão de P2X7 retém células na massa tumoral com um fenótipo tronco (células-
tronco cancerígenas ou CSCs), aumentando a agressividade do tumor, a resistência à
quimioterapia e à radioterapia e o potencial metastático. Com o objetivo de investigar a
contribuição das isoformas A e B na manutenção de CSC em neuroblastoma e sua interrelação
com o sistema cininérgico, utilizamos células ACN humanas de neuroblastoma scrambled
(P2X7+), silenciadas para P2X7A (P2X7A-) e para ambas as isoformas (P2X7A-B-) e testamos
a relação entre o silenciamento das isoformas com o enriquecimento in vitro de CSCs, a
capacidade quimiotática com ou sem BK, bem como a tumorigênese in vitro dessas células.
Além disso, utilizamos células HEK293 (de rim embrionário humano) que naturalemente não
expressam o receptor P2X7 (mock) e modificadas para superexpressar P2X7A e P2X7B para
verificar a relação das isoformas com a tumorigênese in vitro. Em primeiro lugar, observamos
por citometria de fluxo que essa linhagem expressa marcadores de pluripotência (SOX-2 e
CD133). Posteriormente, verificamos que o tempo de incubação é importante para o
enriquecimento in vitro, sendo 30 dias o tempo ideal. Depois, induzimos a formação de
tumoresferas em meios diferentes para a seleção da melhor condição in vitro para o
enriquecimento de CSCs. Curiosamente, as células suplementadas com EGF/bFGF/N2
resultaram no aumento da formação de tumoresferas e mais células marcadas para CD133 e
SOX-2, mostrando que esse fator de suplementação neural é essencial para uma maior
eficiência no enriquecimento de CSCs para a linhagem de neuroblastoma. Para verificar o efeito
do silenciamento das isoformas na resposta quimiotática à 1µM de ATP, submetemos essas
células ao ensaio de quimiotaxia in vitro e verificamos que P2X7A-B- apresentou um aumento
médio de cerca de 90% na capacidade de invasão, enquanto P2X7A- somente 63%. Uma vez
em condições de crescimento em suspensão (para o enriquecimento de CSCs), a resposta
quimiotática dessas células se modifica e P2X7A- apresenta um aumento na capacidade de
migração cerca de 12 vezes maior que P2X7A-B- para 18 dias de cultivo e cerca de 3 vezes
menor para 30 dias de cultivo e um aumento gradativo de P2X7A-B- em relação à linhagem
scrambled, indicando uma correlação entre a capacidade quimiotática de células de
neuroblastoma com o grau de enriquecimento de CSCs in vitro que é balanceado pelas
isoformas A e B do receptor P2X7. Uma vez tratadas com bradicinina, verificamos o aumento
na resposta quimiotática em basicamente todas as linhagens para todas as condições de cultura
(aderentes x tumoresferas de 18 dias x tumoresferas de 30 dias), com exceção de P2X7A- e
P2X7+ enriquecidas por 18 dias e 30 dias, respectivamente. Esses dados sugerem que BK pode
estar modulando não somente a atividade do receptor P2X7, mas também ambos podem estar
correlacionados com a formação de CSCs, bem como com a capacidade de invasão das células
de neuroblastoma in vitro. Nos ensaios de tumorigênese com células de neuroblastoma,
verificamos que P2X7A-B- foi capaz de formar mais colônias quando semeadas 100 ou 200
células. Na tumorigênese com as células HEK modificadas verificamos que P2X7A+ também
formaram mais colônias em relação às outras células. Esses resultados indicam, à primeiro
momento, que o silenciamento da isoforma A não favorece a ação proliferativa da isoforma B
e que a isoforma A está favorecendo a tumorigênese in vitro. No presente relatório,
apresentamos dados que estão nos auxiliando a desvendar os mecanismos moleculares que
correlacionam a tríade BK, isoformas do receptor P2X7 e a manutenção de CSCs com o
processo de metástase em células de neuroblastoma.
1 Introdução ........................................................................................................................... 6

1.1 Neuroblastoma ............................................................................................................. 6

1.2 Células-tronco cancerígenas (CSCs) ........................................................................... 6
1.3 P2X7 e câncer .............................................................................................................. 7
1.4 P2X7 e Bradicinina ...................................................................................................... 8
2 Objetivos ............................................................................................................................. 8

2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 8

2.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 9
3 Materiais e métodos ............................................................................................................ 9

3.1 Ensaios in vitro usando células de neuroblastoma humanas ....................................... 9

3.1.1 Linhagens celulares .............................................................................................. 9
3.1.2 Condições de cultura de células aderentes ......................................................... 10
3.1.3 Condições de cultura de células aderentes tratadas com BK.............................. 10
3.1.4 Condições de cultura de células em suspensão (formação de tumoresferas para
enriquecimento de CSCs in vitro) ..................................................................................... 10
3.1.5 Condições de cultura de células em suspensão (tumoresferas) tratadas com BK
11
3.2 Quantificação de formação de tumoresferas .............................................................. 11
3.3 Citometria de fluxo: quantificação dos marcadores de pluripotência em CSCs ........ 12
3.3.1 Marcação com CD133 ........................................................................................ 12
3.3.2 Marcação com Oct-4 .......................................................................................... 12
3.3.3 Marcação com e-caderina ................................................................................... 13
3.3.4 Marcação com SOX-2 ........................................................................................ 13
3.4 Ensaio de invasão (quimiotaxia) in vitro de células em condições aderentes ........... 13
3.5 Extração de RNA ....................................................................................................... 14
3.6 Quantificação em Nanodrop ...................................................................................... 14
3.7 Gel de eletroforese ..................................................................................................... 14
3.8 cDNA ......................................................................................................................... 14
3.9 PCR em tempo real .................................................................................................... 14
3.10 Tumorigênese com células ACN e células HEK ....................................................... 15
4 Resultados e Discussão ..................................................................................................... 16

4.1 Marcação com CD133, SOX-2 e Oct-4 ..................................................................... 16

4.2 Padronização do meio definido para enriquecimento in vitro de células-tronco
cancerígenas .......................................................................................................................... 17
 4.3 Influência do tempo de incubação na formação de tumoresferas .............................. 21
4.4 Efeito do silenciamento da isoforma A e das isoformas A e B do receptor P2X7 na
quimiotaxia de células de neuroblastoma. ............................................................................ 23
4.5 Efeito do silenciamento da isoforma A e das isoformas A e B do receptor P2X7 na
quimiotaxia de tumoresferas de neuroblastoma cultivadas por 18 e 30 dias. ....................... 23
4.6 Efeito preparador de BK na quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas 25
4.7 Extração de RNA ....................................................................................................... 28
4.8 Quantificação por Nanodrop ...................................................................................... 29
4.9 qPCR .......................................................................................................................... 30
4.10 Tumorigênese de células de neuroblastoma (ACN) .................................................. 30
4.11 Tumorigênese de células HEK .................................................................................. 31
5 Cronograma para o próximo período ................................................................................ 33

6 Participação em Congressos .............................................................................................. 34

6.1 Participação da comissão organizadora do congresso “Novas Vertentes

Biotecnológicas para o Desenvolvimento Tecnológico-social do Brasil”. ........................... 34
6.2 Resumo apresentado na forma de pôster no congresso Purines 2018 ....................... 34
6.3 Menção honrosa Pedro Muanis Persechini pelo trabalho em que fui co-autora
apresentado no congresso Purines 2018 ............................................................................... 36
7 Referências Bibliográficas ................................................................................................ 36
1 Introdução
1.1 Neuroblastoma
Neuroblastoma é um tumor neuroendócrino das glândulas adrenais e/ou gânglios
simpáticos que pode se formar em qualquer parte do sistema nervoso simpático, com 50% de
ocorrência na medula das glândulas adrenais. É a malignidade mais comum diagnosticada no
primeiro ano de vida, com 25 a 50 casos por um milhão de indivíduos no mundo todo
(“Neuroblastoma,” 2016). Representa 7 a 8% de todos os tumores pediátricos e 10% de
mortalidade por câncer pediátrico (Morandi, Corrias, & Pistoia, 2015).
No diagnóstico, cerca de 50% dos casos de neuroblastoma se apresenta com metástase
(Morandi et al., 2015), sendo 70,5% na medula óssea, 55,7% no osso, 30,9% nos linfonodos,
29,6% no fígado, 18,2% em sítios intracranianos e orbitais, 3,3% no pulmão e 0,6% no sistema
nervoso central (DuBois et al., 1999).
Apesar das recentes melhorias no tratamento de diversas malignidades pediátricas, o
neuroblastoma de alto risco ainda é um dos tumores mais difíceis de se curar, com apenas 40%
de sobrevivência prolongada mesmo após a terapia intensiva multimodal (Maris, 2010). A
apresentação clínica e a resposta à terapia do neuroblastoma de alto risco, que resulta em
recidiva e doença refratária após uma boa resposta na terapia inicial sugere que células-tronco
cancerígenas provavelmente têm um papel fundamental no resultado clínico desse tumor
(Pandian, Ramraj, Khan, Azim, & Aravindan, 2015).

1.2 Células-tronco cancerígenas (CSCs)

As células-tronco cancerígenas (CSCs) são células cancerígenas semelhantes às células-
tronco normais com pelo menos quatro características importantes: tumorigênese, potencial
metastático, capacidade de diferenciação celular e capacidade de auto renovação (Clevers,
2011) com formação de células-filhas idênticas (Kreso & Dick, 2014). As CSCs representam
uma pequena subpopulação de células cancerígenas, cuja existência é responsável pela
tumorigênese, recorrência (Gasch, 2017), resistência terapêutica (Todaro, Perez Alea,
Scopelliti, Medema, & Stassi, 2008) e está associada à capacidade de invasão tumoral e
metástase (Clevers, 2011).
Foram identificadas tanto em neoplasias malignas hematológicas (Furth & Kahn, 1937)
quanto em tumores sólidos, tais como: câncer de fígado (Ma et al., 2008), pulmão (Eramo et
al., 2008), pele (Fang et al., 2005), bexiga (Chan et al., 2009), mama (Ponti et al., 2005) e ovário
(Bapat, 2005); mieloma múltiplo (Huff & Matsui, 2008), pancreático (C. Li et al., 2007),

6
colorretal (Brien, Pollett, Gallinger, Dick, & O’Brien, 2007) e neuroblastoma (Ross &
Spengler, 2007).
As CSCs compartilham as principais vias regulatórias com as células-tronco normais,
entretanto, dependem de vias reprogramadas para manter as propriedades stemness (ou estado
de células-tronco (Kreso & Dick, 2014)) e contribuir com a progressão tumoral, além de
exibirem diferenciação e vias desreguladas e fenótipos anormais (H. Qiu, Fang, Luo, & Ouyang,
2015).

1.3 P2X7 e câncer

O P2X7 é o maior membro da família dos receptores purinérgicos (Rassendren et al.,
1997) e seu estímulo com baixas doses de ATP abre um canal reversível na membrana
plasmática que é permeável a pequenos cátions (Na+, Ca2+, K+), enquanto seu estímulo
sustentado com altas doses ou repetitivo com pulsos sequenciais de ATP induzem à formação
de um poro largo na membrana permeável a moléculas catiônicas de até 900Da (F Di Virgilio,
Bronte, Collavo, & Zanovello, 1989; Virginio, Mackenzie, North, & Surprenant, 1999), que
leva à morte celular (Adinolfi, 2005).
O fato de a formação dos poros levar à morte celular confirmou seu papel citotóxico ao
longo dos anos. Entretanto, dependendo do nível de ativação e do tipo celular em que o P2X7
está expresso, ele pode desencadear não somente morte, mas também crescimento celular
(Francesco Di Virgilio, Ferrari, & Adinolfi, 2009), conferindo plasticidade às células.
Vários estudos reportaram o aumento da expressão do P2X7 em tumores sólidos, tais
como: câncer de mama (Slater et al., 2004), próstata (Y. Qiu et al., 2014), cólon, rins (Adinolfi
et al., 2012), útero (X. Li, Zhou, Feng, Abdul-Karim, & Gorodeski, 2006), carcinoma papilar
tireoidiano (Kwon et al., 2014) e, importantemente, neuroblastoma (Raffaghello, 2006).
Dentre as isoformas humanas biologicamente ativas do P2X7, resultantes do splicing
alternativo, P2X7A é a isoforma completa, com 595 aminoácidos em comprimento, melhor
caracterizada e mais abundantemente expressa. A cauda carboxi-terminal medeia a interação
com a panexina-1, estrutura que leva à formação de largos poros na membrana causando
apoptose (Cheewatrakoolpong, 2005). P2X7B é a isoforma truncada com 364 aminoácidos em
comprimento, amplamente expressa nos tecidos e forma um canal iônico funcional, mas devido
à ausência da cauda C-terminal não forma poros largos na membrana, apresentando ausência
de atividade pro-apoptótica (Adinolfi, 2010; Cheewatrakoolpong, 2005).

7
 P2X7B expressa em células HEK 293 modula as funções de P2X7A, participa do
controle celular e talvez possa ajudar na elucidação do papel do receptor P2X7 no controle da
proliferação de células normais e tumorais (Adinolfi, 2010).

1.4 P2X7 e Bradicinina

A BK é um (nonapeptídeo Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) é principal cinina
do sistema calicreína-cininas, que uma vez no microambiente inflamatório, estimula a
proliferação celular, migração, angiogênese e aumentam a permeabilidade vascular,
provavelmente contribuindo para o comportamento biológico dos tumores (da Costa, 2014).
Nosso grupo mostrou, recentemente, que altas taxas de metástase in vivo foram induzidas
após o tratamento com BK em murganhos imunodeficientes e inibidas na presença do
antagonista do receptor P2X7, Brilliant Blue G (BBG). Portanto, foi sugerido que essas células
adquiriram um comportamento metastático por meio da indução da expressão do P2X7 por BK.
Concomitantemente, a taxa de proliferação de células de neuroblastoma tratadas com BK 10nM
foi reduzida na presença do antagonista específico do receptor P2X7 (A438079) confirmando
a existência de uma inter-relação entre os sistemas cininérgico e purinérgico necessária ao
processo de proliferação dependente de BK, bem como ao processo de metástase. Além disso,
no que se refere à quimiotaxia, células de neuroblastoma CHP-100 tratadas com BK 10nM por
24 horas apresentaram um aumento na capacidade invasiva quando ATP 1µM era usado como
agente quimioatrativo. Em células de neuroblastoma CHP-100 e SH-SY5Y, o tratamento de
BK também por 24 horas causou um aumento na expressão de diferentes receptores P2X, dentre
eles P2X7. Interessantemente, a expressão de ambas as isoformas do receptor P2X7 (P2X7A e
P2X7B) aumentou, sendo que a expressão da isoforma B foi maior em relação à da isoforma A
(Ulrich et al., 2018). Embora pouco seja conhecido sobre P2X7B em condições
fisiopatológicas, a retenção da atividade promotora do crescimento celular e a perda da função
apoptótica por essa isoforma, nos levou a hipótese de que sua expressão seja mais requerida do
que a de P2X7A na oncogênese e na manutenção de CSCs. Entender o mecanismo da BK in
vitro contribuirá para explicar o mecanismo de ação pró-metastático da BK in vivo e sua relação
com as funções desenvolvidas pelas isoformas do receptor P2X7.

2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
A primeira parte do trabalho teve como principal objetivo a caracterização de células-
tronco cancerígenas em linhagens de neuroblastoma silenciadas para a expressão das isoformas

8
A e B do receptor P2X7, a relação entre: o enriquecimento de CSCs, o pré-tratamento com BK
e o silenciamento das isoformas com a resposta quimiotática à 1µM de ATP; e a relação entre
o silenciamento/superexpressão das isoformas na tumorigênese in vitro.

2.2 Objetivos específicos

 Seleção do meio mais eficiente para o enriquecimento in vitro de CSCs em linhagens
de neuroblastoma (ACN) silenciadas para a expressão das isoformas A e B do receptor
P2X7 (P2X7+, P2X7A-B-, P2X7A-).
 Caracterização de CSCs formadas por ensaios de enriquecimento in vitro nessas
mesmas linhagens por meio da quantificação de tumoresferas formadas em tempos
diferentes de crescimento, bem como da quantificação de marcadores de pluripotência
(CD133, Oct-4, SOX-2 e e-caderina).
 Investigar se a BK tem efeito de induzir a expressão diferencial de P2X7 e VEGF nessas
linhagens, bem como se o pré-tratamento com BK (efeito preparador) afeta a resposta
quimiotática dessas linhagens cultivadas em condições aderentes e em suspensão
através de ensaios de invasão (quimiotaxia) in vitro.
 Investigar o efeito do silenciamento das isoformas e se o enriquecimento de CSCs afeta
a resposta quimiotática dessas células de neuroblastoma.
 Investigar o efeito do silenciamento ou da superexpressão das isoformas do P2X7 na
tumorigênese in vitro dessas células de neuroblastoma, bem como de células HEK 293
(de rim embrionário humano) modificadas ou não (mock, P2X7-) para superexpressar
P2X7A e P2X7B.

3 Materiais e métodos
3.1 Ensaios in vitro usando células de neuroblastoma humanas

3.1.1 Linhagens celulares

As linhagens celulares utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra.
Elena Adinolfi (Departamento de Patologia Geral, Universidade de Ferrara, Ferrara, IT).
Referem-se a linhagens celulares de neuroblastoma derivadas do sítio metastático da medula
óssea, ACN (RRID:CVCL_1068), que naturalmente expressam o receptor P2X7, e linhagens
celulares de rim embrionário humano, HEK293 (RRID:CVCL_0045), que naturalmente não
expressam o receptor P2X7. Ambas as linhagens são modificadas como segue: ACNshRNA1,
silenciadas tanto para a isoforma A quanto para a isoforma B do receptor P2X7 e nomeadas
aqui de P2X7A-B-, ACNshRNA2, silenciadas apenas para a isoforma A e nomeadas aqui de
9
P2X7A-, ACNshRNA ou scrambled, não silenciadas e nomeadas aqui de P2X7+, HEK293-
hP2X7A expressando a isoforma A, HEK293-hP2X7B expressando a isoforma B e HEK293-
mock não expressando o receptor P2X7, nomeadas aqui de P2X7A+, P2X7B+ e P2X7-,
respectivamente.

3.1.2 Condições de cultura de células aderentes

As linhagens celulares acima mencionadas foram cultivadas em condições aderentes em

meio completo. As ACNs foram mantidas em meio RPMI 1640, enquanto as HEKs em DMEM-
HAM’s F12, suplementados com 1% de NEAA (aminoácidos não essenciais), 10% de fetal
bovine serum (FBS), 100U/mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina em ambos os casos.
Todas as linhagens foram mantidas à 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e a manutenção feita
com troca de meios a cada dois dias e repique ao atingir aproximadamente 90% de confluência.

3.1.3 Condições de cultura de células aderentes tratadas com BK

As culturas celulares aderentes foram descoladas das garrafas com tripsina 0,25%,
inativadas com solução de PBS 1X e 10% de FBS, coletadas em tubos de centrífuga de 15mL,
centrifugadas a 1000rpm por 7 minutos, o sobrenadante descartado e as células ressuspendidas
em meio de cultura completo. As células foram contadas e 0,3x106 semeadas em placas de 6
poços pré-tratadas com poliestireno de alta aderência. Foram posteriormente incubadas em
estufa à 37°C e 5% de CO2 por 24h para adesão.
Após esse período, os meios foram removidos e os poços lavados com 1mL de PBS 1X.
Para a quantificação de expressão gênica por qPCR, as células foram tratadas com 10nM, 30nM
e 50nM de BK por 24h. Para os ensaios de quimiotaxia, as células foram tratadas com 10nM
de BK por 24h em meio de cultura completo e para os ensaios de tumorigênese, as células foram
tratadas com 10nM de BK no momento da semeadura e mantidas em cultura por sete dias.

3.1.4 Condições de cultura de células em suspensão (formação de tumoresferas para

enriquecimento de CSCs in vitro)

Testamos diferentes condições de cultura de células em suspensão com o intuito de

comparar a eficiência de formação de tumoresferas em cada um deles, através da quantificação
de formação de tumoresferas e análise da expressão de marcadores de pluripotência.
Portanto, ao meio mínimo: RPMI 1640 suplementado com 1% de aminoácidos não
essenciais, 100U/mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina, foram adicionados diferentes
fatores como listado a seguir:

10
Figura 1: Fatores adicionados ao meio mínimo para o enriquecimento in vitro de células-tronco cancerígenas.

3.1.5 Condições de cultura de células em suspensão (tumoresferas) tratadas com BK

Para os ensaios de quimiotaxia, as células tratadas com 10nM de BK ou células controle

(sem tratamento) foram cultivadas em placas de 12 poços em meio definido: meio RPMI 1640
suplementado com 20ng/mL de EGF, 20ng/mL de bFGF, N2 1X, 1 % de NEAA (aminoácidos
não essenciais), 100U/mL de penicilina, 100µg/mL de estreptomicina. As células foram
incubadas a 37°C e 5% de CO2 por 24h.
3.2 Quantificação de formação de tumoresferas
Para quantificação, as tumoresferas de cada poço foram coletadas separadamente em
microtubos de centrífuga e os poços lavados cuidadosamente com 1mL de PBS 1X, que também
foi adicionado aos microtubos. As tumoresferas foram deixadas decantar naturalmente por 10
a 15 minutos e o sobrenadante foi descartado cuidadosamente por aspiração com a pipeta,
deixando-se apenas 500µL. Após homogeneização, foram coletados 50µL de cada amostra e
adicionados à uma placa de 96 poços que teve a parte inferior dos seus poços dividida em quatro
quadrantes para facilitar a contagem, como no esquema abaixo:

Figura 2: Esquema da placa de 96 poços para a contagem de tumoresferas

Cada quadrante de cada poço teve então suas tumoresferas contadas com o auxílio da
câmara de Neubauer e um microscópio invertido no aumento de 4X.

11
Figura 3: Esquema da contagem de tumoresferas de um poço da placa de 96 poços

A concentração, bem como o número de esferas e a eficiência de formação de esferas

foi calculada de acordo com as equações a seguir:

Figura 4: Equações utilizadas para o cálculo da concentração de tumoresferas, do número de tumoresferas totais e da % de
eficiência de formação de tumoresferas.

3.3 Citometria de fluxo: quantificação dos marcadores de pluripotência em CSCs

As células da linhagem ACN scrambled (P2X7+) foram utilizadas para caracterização
das células quanto à marcação dos anticorpos anti-CD133, anti-SOX-2 e anti-Oct-4
(marcadores de pluripotência). Além desses, foi também utilizado o anticorpo anti-e-caderina
para os ensaios de padronização dos meios de enriquecimento in vitro de CSCs.

3.3.1 Marcação com CD133

Para a marcação com CD133 não foi necessário fixar as células previamente. Portanto,
as tumoresferas foram removidas da garrafa e dissociadas com EDTA 2mMEm seguida, foram
centrifugadas a 300g por 5 minutos, ressuspendidas em PBS 1X e incubadas com o anticorpo
anti-CD133-PE (Miltenyi Biotec. Cat 130.080-801) diluído 1:11 em 100µl de PBS 1X. A
incubação foi realizada a 4ºC por 10 minutos e após esse período foram centrifugadas a 800g
por 5 minutos, ressuspendidas em 500µl de PBS 1X e analisadas no citômetro de fluxo da
Attune (Life Technologies, CA).

3.3.2 Marcação com Oct-4

Para a marcação com Oct-4, as células foram fixadas previamente, com PFA 4% por 20
minutos em temperatura ambiente. Após o período de fixação, foram lavadas com 1000µl de
PBS 1X e centrifugadas a 800g por 5 minutos, o sobrenadante removido e o pellet

12
ressuspendido em tampão de bloqueio (4% SFB e 0,1% triton X-100 em PBS 1X) por 30 min,
para permeabilização da membrana celular. O anticorpo α-Oct4 (Millipore-rabbit AB3209)
diluído 1:10.000 foi adicionado e a incubação realizada em temperatura ambiente por 30
minutos. Após a incubação, as células foram lavadas com 500µl de PBS 1X, centrifugadas a
800g por 5 minutos e ressuspendidas em tampão de bloqueio. O anticorpo secundário Alexa488
(goat anti-rabbit IgG (H+L), Life Technologies, cat A11034) foi adicionado na diluição 1:1000
e a incubação realizada em temperatura ambiente por 30 minutos. Após o período de incubação,
as células foram lavadas com 500µl de tampão de bloqueio, centrifugadas a 800g por 5 minutos,
o sobrenadante descartado e as células ressuspendidas em 500µl de PBS 1X. Para a reação de
Oct-4 foi realizado um controle secundário seguindo todos os procedimentos de maneira
idêntica, apenas omitindo o anticorpo primário.

3.3.3 Marcação com e-caderina

O procedimento para marcação com e-caderina foi idêntico ao com Oct-4, porém o
anticorpo primário utilizado para a marcação foi anti-e-caderina (Imuny Biotechnology –
RheaBiotech, IM-0100) e a incubação realizada em temperatura ambiente por 30 minutos.

3.3.4 Marcação com SOX-2

O procedimento para marcação com SOX-2 foi idêntico ao com Oct-4, porém o
anticorpo utilizado para a marcação foi anti-SOX-2 (conjugado com o fluoróforo APC, da
Milnetyi Biotec., cat 130.104-995) diluído 1:11 (volume de 100µl) e a incubação ocorreu em
geladeira por 30 minutos.

3.4 Ensaio de invasão (quimiotaxia) in vitro de células em condições aderentes

Aproximadamente 2h antes da coleta das células, as partes superiores das câmaras dos
Transwell inserts (Costar Transwell; Corning Costar, Corning NY), compostas de membranas
de policarbonato com poros de 8μm para permitir a passagem das células, foram cobertas com
55μL de gelatina 0.5% e incubadas à 37°C por 1h e 30 minutos. Após esse período de tempo,
o excesso de gelatina foi removido cuidadosamente de cada poço. Às partes inferiores de cada
transwell foram adicionados 1µM de ATP (agente quimiotático) e os volumes completados para
500µL com meio mínimo suplementado com BSA 0,2%. Para os ensaios de quimiotaxia as
células foram coletadas e tratadas ou não (nos controles) conforme descrição do item 1.1.3 para
as culturas aderentes e 1.1.5 para as culturas em suspensão. Após as 24h de incubação, os meios
foram removidos, as células coletadas e as tumoresferas dissociadas como descrito no item
1.1.3, porém ressuspendidas em meio mínimo contendo BSA 0,2% e semeadas a uma densidade
13
de 5x104 (de 100 a 300μL no máximo) nas partes superiores das câmeras em duplicatas. As
câmaras foram então incubadas à 37°C e 5% de CO2 por 20h. Após decorrido o tempo, o
excesso de meio foi removido da parte superior dos insertos e estes foram fixados com 500 µL
de paraformaldeído (PFA) 4% por 10 minutos, lavados uma vez com 500µL de PBS 1X, o
excesso de líquido na parte superior mais uma vez removido e marcados com 500µL de solução
de DAPI (1:10.000) em PBS 1X por 10 minutos. Após a marcação, os insertos foram lavados
uma vez com 500µL de PBS 1X, o excesso de líquido da parte superior removido e as células
que permaneceram na parte superior foram removidas com hastes de algodão. Posteriormente,
cada inserto foi imergido em 100 µL de tampão de bloqueio para a permeabilização das células
por 30 minutos e marcadas com anti-SOX2 (conjugado com o fluoróforo APC, da Miltenyi
Biotec., cat 130.104-995) diluído 1:20 (volume de 100µl) por cerca de 10 minutos em geladeira.
As membranas foram escaneadas com o sistema microscópico de fluorescência TissueFAXS i
PLUS (Tissue Gnostics) no comprimento de onda emissão do azul (460nm) e as células que
atravessaram os insertos e que tiveram seus núcleos marcados com DAPI foram quantificadas
com o software StrataQuest (Tissue Gnostics).

3.5 Extração de RNA

A extração do RNA das amostras tratadas com BK e do controle foi feito conforme as
especificações do manual do reagente Brazol (LGC).
3.6 Quantificação em Nanodrop
A quantificação foi realizada com 1µL de cada amostra no equipamento Nanodrop.
3.7 Gel de eletroforese
O gel para análise da viabilidade das amostras de RNA extraídas das células aderentes
tratadas e não tratadas com BK foi preparado com 1% de agarose dissolvida em tampão TAE
1X e a corrida realizada em cuba de eletroforese de ácidos nucléicos a 80mV.
3.8 cDNA
Após a confirmação da viabilidade dos RNAs extraídos, 5µg de cada amostra de RNA
foram submetidas à inativação por DNAse I à 37°C por 30 minutos e posteriormente a DNAse
I foi inativada com 1µL de EDTA 50mM à 75°C por 10 minutos. O cDNA foi sintetizado
conforme especificações do fabricante (Thermo Scientific).
3.9 PCR em tempo real
Os níveis de transcritos dos genes P2X7 foram medidos por PCR em tempo real usando
ABI Step One Plus Instrument (Thermo Scientific). O PCR foi realizado em 25 μL de tampão

14
de reação contendo 1 μL cDNA, SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific) e 5 pmol de cada
sequência específica de primers como detalhado na Tabela 1.
As condições de ciclagem seguiram uma pré-incubação a 50ºC por 2 min, desnaturação
a 95ºC por 10 min e 40 ciclos de 95ºC por 15 min para desnaturação e 60ºC por 1 minuto para
anelamento/extensão. O nível de expressão gênica de GAPDH (Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase) foi usado para normalizar as diferenças no isolamento e degradação do RNA.
Os resultados foram analisados por quantificação relativa entre os grupos utilizando o método
2-ΔΔCT. (Livak e Schmittgen, 2001).

Tabela 1: Sequência de primers.

3.10 Tumorigênese com células ACN e células HEK

As células ACN foram tripsinizadas com solução de tripsina 0,25% por 5min à 37°C e
a reação neutralizada com 10% SFB em PBS 1X, enquanto as células HEK foram removidas
mecanicamente com o auxílio da pipeta. Posteriormente, foram centrifugadas à 1000 rpm por
7min, ressuspendidas em 1mL de meio RMPI completo, para as ACN e DMEM-HAM’s F12
completo, para as HEK e contadas em câmara de Neubauer. Foram semeadas 100 células e 200
células de ACN e 600 células de HEK em placa de 6 poços e o volume completado para 2mL
com meio completo. As placas foram incubadas em estufa à 37°C por sete dias para formação
das colônias.
Após esse período, o meio foi removido, os poços lavados com 1mL de PBS 1X e as
colônias foram fixadas e coradas com solução de glutaraldeído 6,0% (vol./vol.) e cristal violeta
0,5% (vol./vol.) em água destilada por 30min. Após esse período, a solução foi removida e as
placas cuidadosamente imersas em água para a remoção do excesso da solução. Após a secagem
completados poços, os poços foram escaneados, um a um, no microscópio TissueFAXS como
mostra o esquema abaixo:

15
Figura 5: Esquema do escaneamento dos poços da tumorigênese de células ACN.

Após o escaneamento, as colônias foram contadas para cada poço com auxílio do software
StrataQuest (TissueGnostics).

Figura 6: Esquema da contagem das colônias formadas na tumorigênese de células ACN.

4 Resultados e Discussão
4.1 Marcação com CD133, SOX-2 e Oct-4
Para a caracterização das células de neuroblastoma da linhagem ACN cultivadas em
condições aderentes, a expressão de três marcadores de pluripotência foram testados por
citometria de fluxo, CD133, SOX-2 e Oct-4. Conforme observa-se na Fig.7, apenas o anticorpo
anti-CD133 apresentou marcação significativa, cerca de 35% das células ACN, indicando que
SOX-2 e Oct-4 são pouco expressos por essas células.

Figura 7: Porcentagem de células de neuroblastoma scrambled (P2X7+) marcadas com os marcadores de pluripotência
(CD133, SOX-2 e Oct-4).

16
4.2 Padronização do meio definido para enriquecimento in vitro de células-tronco
cancerígenas
Uma das características fenotípicas importantes das CSCs é a sua habilidade de formar
esferas não aderentes em cultura (Fig. 8). Para tanto, são utilizados diferentes meios de cultura
definidos para cada linhagem celular a fim de otimizar o enriquecimento de CSCs in vitro.
Portanto, uma das metodologias utilizadas para a avaliação da eficiência de um meio definido
no enriquecimento de CSCs in vitro é a indução da formação de tumoresferas, bem como a
ausência de células aderidas em placas de cultura de baixa-ultra aderência.

Figura 8: Imagens de microscopia de campo claro das culturas de neuroblastoma. A: Culturas aderentes, B: Culturas em
suspensão para a formação de tumoresferas. Aumento de 10X.

Trabalhos recentes mostraram vários protocolos em diferentes condições para o

enriquecimento de CSCs in vitro em linhagens celulares de neuroblastoma (Cao, 2014;
Chikaraishi, 2017; Craig, 2016; Hämmerle et al., 2013; Ikegaki, 2013; Nishimura, 2012; Park,
Kim, & Kim, 2012; Takenobu, 2010; Zheng, 2013). Com o intuito de verificar a melhor e mais
eficiente condição a partir da cultura de células ACN, vários meios foram testados. Para isso,
foi induzida a formação de tumoresferas em placas de poliestireno de ultra-baixa aderência
(hidrofóbicas) de 12 poços com as células da linhagem ACN scrambled (P2X7+) e, ao
completar 9 dias (216h), essas tumoresferas foram coletadas, contadas e marcadas com
marcadores de pluripotência CD133 e SOX-2 e o marcador de transição epitélio-mesenquimal
e-caderina, por citometria de fluxo. Durante esses 9 dias as tumoresferas foram fotografadas
em microscópio invertido para a comparação morfológica entre as condições de cultura, como
pode ser observado na Fig. 9.

17
Figura 9: Imagens adquiridas por microscopia invertida de campo claro no aumento de 10x (com exceção da imagem de 216h
do meio C, aumento de 2x) a cada 24h das culturas de células em suspensão nos meios definidos testados para o enriquecimento
de CSCs in vitro.

O B27 é um suplemento composto por um coquetel de antioxidantes que ajudam a

reduzir o dano causado por espécies reativas de oxigênio e otimiza o crescimento de células
precursoras neurais (ou células-tronco neurais). Já o N2 é um suplemento quimicamente

18
definido livre de soro baseado na formulação de Bottenstein N-1 que otimiza a expansão de
células-tronco neurais, bem como o crescimento e a expansão de neuroblastomas (Liu, 2006).
O β-mercaptoetanol (BME) é um reagente químico com alto poder redutor que também auxilia
na redução do estresse oxidativo e proliferação das células-tronco cancerígenas (Cao, 2014).
Por último, a heparina é um mucopolissacarídeo (uma glicosaminoglicana) com propriedades
anticoagulantes que aumenta e estabilidade do bFGF por favorecer a ligação desse fator ao seu
receptor (Fannon, Forsten, & Nugent, 2000).
Os meios 1, 2, 6 e 7 que continham os fatores de crescimento suplementados com
B27/N2, B27/N2/Hep/BME, B27 e N2, respectivamente, apresentaram tumoresferas maiores e
mais irregulares. Nos dois primeiros meios, as tumoresferas tinham uma forma mais
arredondada, assemelhando-se a esferas bem compactas, porém no meio 1 a cultura
praticamente não apresentou células aderidas, enquanto no meio 2 ela apresentou várias,
indicando que a adição de heparina e β-mercaptoetanol manteve a capacidade de
enriquecimento de células-tronco in vitro, porém com uma eficiência menor que no meio 1. Em
contrapartida, os meios 6 e 7 suplementados apenas com B27 e N2, respectivamente,
apresentaram tumoresferas de formato bastante irregular e praticamente nenhuma célula
aderida, indicando que ambos os meios apesentaram uma eficiência maior no enriquecimento
de CSCs in vitro em relação aos dois meios citados anteriormente.
Ao final dos 9 dias, as células cultivadas no meio 3, que continha os fatores adicionados
de heparina e β-mercaptoetanol apenas, estavam mortas, provavelmente porque os suplementos
N2 e B27 possuem um efeito protetor maior para as células de neuroblastoma e sua ausência
levou as mesmas à morte, indicando a inviabilidade de se utilizar esse meio para a formação de
tumoresferas. Já os meios 4, 5 e 8, compostos dos fatores de crescimento apenas, sem os fatores
de crescimento suplementados com B27/N2 ou 10% de soro fetal bovino, respectivamente,
apresentaram capacidade de formação de tumoresferas. Essas tumoresferas eram razoavelmente
grandes, arredondadas e compactas, porém com um alto grau de células aderidas, indicando
que, apesar de possibilitarem a formação de tumoresferas, esses meios possuem baixa eficiência
no enriquecimento de células-tronco cancerígenas in vitro (Fig.9).

19
Figura 10: Número médio de tumoresferas totais/poço contadas para cada meio definido testado para o enriquecimento in vitro
de CSCs.

O número médio de tumoresferas também foi determinado para cada condição de

cultivo. De acordo com o teste de Turkey para múltiplas comparações, os meios que
apresentaram maior número de tumoresferas/poço foram os meios 2, 7, 5, 6 e 1, aqueles com
suplementação de B27/N2/Hep/BME, N2, B27/N2 sem EGF/bFGF, B27 e B27/N2, em ordem
decrescente (Fig. 10). Uma vez que a contagem por si só não garante que houve enriquecimento
de células-tronco, a etapa de quantificação dos marcadores de pluripotência por citometria de
fluxo foi fundamental para a decisão final do meio mais eficiente.
A quantificação da expressão dos marcadores de pluripotência (CD133 e SOX-2) e de
transição epitélio-mesenquimal (e-caderina) por citometria de fluxo apresentou os meios 5, 7 e
8 com a maior porcentagem de marcação para CD133 (cerca de 70 a 80%), já os meios 2, 4, 7
e 8 com maior marcação para e-caderina (cerca de 80%) e os meios 7 e 8 com maior marcação
para SOX-2 (cerca de 30 e 50%, respectivamente) (Fig.11).
SOX-2 é um fator de transcrição essencial para a manutenção do estado de auto-
renovação celular (ou estado indiferenciado) de células-tronco embrionárias indiferenciadas
(Wuebben & Rizzino, 2017), CD133 é uma glicoproteína de membrana também importante na
regulação do estado indiferenciado, tumorigênese, metástase, resistência, dentre outros (Jang,
2017); e por último, a e-caderina é uma proteína que desempenha papel importante no
crescimento, desenvolvimento e adesão celular, também envolvida na manutenção do estado
indiferenciado de células-tronco cancerígenas (Yang, Zhao, Cui, & Liang, 2017).

20
 Levando em consideração o aspecto visual das culturas (aspecto morfológico das
tumoresferas versus células aderidas), a contagem de tumoresferas por poço e as marcações
com diferenças significativas para os marcadores citados acima, o meio escolhido para o
enriquecimento de células-tronco in vitro que seria utilizado para os experimentos seguintes foi
o de número 7, suplementado com os fatores EGF/bFGF/N2.

Figura 11: Porcentagem de células marcadas com CD133, e-caderina e SOX-2 contadas por citometria de fluxo para cada
meio definido testado.

4.3 Influência do tempo de incubação na formação de tumoresferas

A influência do tempo de incubação na formação de tumoresferas foi analisada através
da incubação de células ACN modificadas no meio definido suplementado com bFGF/EGF/N2

21
(padronizado no item anterior) por 4, 9 e 30 dias. Como observado na Fig. 12, as linhagens
incubadas por 9 e 30 dias formaram um maior número de tumoresferas em relação àquelas
incubadas por 4 dias apenas. Indicando que o tempo de incubação é importante para o
enriquecimento in vitro de células-tronco cancerígenas.

Figura 12: Porcentagem de Eficiência de Formação de Esferas calculadas para as células de neuroblastoma modificadas
cultivadas por 4, 9 e 30 dias para o enriquecimento de CSCs in vitro.

Figura 13: Efeito do silenciamento das isoformas do receptor P2X7 na porcentagem de formação de tumoresferas das células
de neuroblastoma cultivadas por 4, 9 e 30 dias para o enriquecimento de CSCs in vitro.

No que diz respeito ao silenciamento das isoformas, as linhagens de ACN silenciadas não
apresentaram diferença significativa na % de formação de tumoresferas em relação à linhagem
que naturalmente expressa o receptor P2X7 (scrambled) quando cultivadas por 4 dias. Quando
cultivadas por 9 dias, a linhagem P2X7A-B- apresentou uma menor % de formação de
tumoresferas em relação às outras duas linhagens, enquanto P2X7A-B- não apresentou
diferença em relação à linhagem scrambled. Finalmente, no tempo de cultivo de 30 dias, cujo
grau de CSCs esperado é maior, ambas as linhagens silenciadas apresentaram maior % de
formação de tumoresferas em relação à linhagem scrambled, sugerindo que existe uma relação
entre a ausência das isoformas A e B do P2X7 com o estado de indiferenciação celular e,
portanto, com o enriquecimento de CSCs in vitro (Fig. 13).

22
4.4 Efeito do silenciamento da isoforma A e das isoformas A e B do receptor P2X7 na
quimiotaxia de células de neuroblastoma.

Figura 14: Quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas cultivadas em condições aderentes.

Com o intuito de examinar o efeito do silenciamento das isoformas do P2X7 na

quimiotaxia de células de neuroblastoma, as células de neuroblastoma silenciadas para a
isoforma A (P2X7A-) ou para as isoformas A e B (P2X7A-B-) do receptor foram submetidas ao
ensaio de quimiotaxia em resposta à 1µM de ATP e a resposta quimiotática contabilizada
através da contagem do número de células que tiveram seus núcleos marcados com DAPI que
atravessaram o transwell. Assim, pudemos observar que a linhagem P2X7A-B- apresentou um
aumento médio de cerca de 90% na quimiotaxia, enquanto a linhagem P2X7A- apresentou um
aumento médio de cerca de 63% em relação à linhagem scrambled, que apresenta expressão
constitutiva do receptor P2X7 (P2X7+) (Fig. 14).

4.5 Efeito do silenciamento da isoforma A e das isoformas A e B do receptor P2X7 na

quimiotaxia de tumoresferas de neuroblastoma cultivadas por 18 e 30 dias.
Da mesma forma que o ensaio de quimiotaxia descrito anteriormente, verificamos se o
tempo de cultivo (18 e 30 dias) para o enriquecimento de células-tronco cancerígenas
(tumoresferas) nas células dessas mesmas linhagens, bem como o silenciamento das isoformas
modificaria a resposta quimiotática em relação ao ATP.

Figura 15: Quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas cultivadas em condições de suspensão por 18 dias.

23
 Para as células da linhagem P2X7A-B- enriquecidas por 18 dias, a resposta quimiotática
sofreu um aumento de cerca de 39%, enquanto para as da linhagem P2X7A-, a resposta sofreu
um aumento de cerca de 470% em relação à linhagem scrambled (Fig. 15).

Figura 16: Quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas cultivadas em condições de suspensão por 30 dias.

Em contrapartida, para as células da linhagem P2X7A-B- enriquecidas por 30 dias, a

resposta quimiotática permaneceu a mesma, enquanto para as da linhagem P2X7A-, a resposta
sofreu uma diminuição de cerca de 33% em relação à linhagem scrambled (Fig. 16).
A Fig. 17 resume todos os resultados encontrados para a quimiotaxia dessas células nas
condições aderentes e em suspensão cultivadas por 18 e 30 dias. De posse desses dados,
podemos concluir que, com exceção da linhagem enriquecida por 30 dias onde P2X7A é
silenciada e P2X7B não, todas as outras linhagens cujos receptores são silenciados
apresentaram um aumento na resposta quimiotática em relação à linhagem scrambled.
Esperávamos ver uma redução na quimiotaxia devido ao silenciamento, por acreditar que a
isoforma A está envolvida com apoptose, enquanto a isoforma B com proliferação, bem como
na manutenção de células-tronco cancerígenas, que por sua vez seriam as protagonistas dos
processos necessários para a progressão tumoral, tal como a migração, invasão e metástase. Nós
verificamos que os resultados de quimiotaxia de tumoreferas de 30 dias corroboram com a nossa
hipótese, porém nenhum dos outros dados apresentou diferença significativa.

Figura 17: Efeito do silenciamento das isoformas do receptor P2X7 na quimiotaxia de células de neuroblastoma cultivadas em
diferentes condições de crescimento. (% de quimiotaxia em relação as células aderentes).

24
 Além disso, verificamos uma tendência linear no aumento/diminuição da quimiotaxia
dessas células em relação à condição de cultura em que o grau de células-tronco cancerígenas
esperada é menor ou ausente (condição aqui tomada como controle). Essa tendência acontece à
medida que comparamos a linhagem que possui o P2X7 com a que não possui nenhuma das
isoformas e, finalmente, com aquela que possui apenas P2X7B. Tumoresferas de 18 dias
apresentam uma redução na resposta quimiotática, sendo P2X7+<P2X7A-B-<P2X7A-, enquanto
as de 30 apresentam um aumento para as duas primeiras linhagens e, nenhuma modificação
para P2X7A-, sendo P2X7+>P2X7A-B->P2X7A- (onde a redução na resposta de P2X7A- com
18 dias é igual à resposta com 30 dias). Isso poderia indicar uma correlação entre a capacidade
quimiotática de células de neuroblastoma e o grau de enriquecimento de CSCs in vitro que é
balanceado pelas isoformas A e B do receptor P2X7.
4.6 Efeito preparador de BK na quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas

Em artigo recentemente publicado (Ulrich et al., 2018), o nosso grupo demonstrou num
estudo pioneiro a inter-relação de BK com P2X7 e a metástase do neuroblastoma. Nesse estudo,
a BK foi capaz de mediar a progressão do neuroblastoma através do aumento da adesão celular,
promoção da angiogênese e rearranjo do citoesqueleto, além da indução da proliferação e
aumento da capacidade de invasão devido à sensibilização dos receptores CXCR4 e P2X7B.
Interessantemente, todos esses processos que foram aumentados na presença de BK, foram
também neutralizados pelo bloqueio farmacológico do receptor P2X7, tanto in vitro quanto in
vivo. Além disso, o tratamento de BK aumentou os níveis de expressão das isoformas A e B do
receptor P2X7, favorecendo a regulação positiva de P2X7B e não reduzindo, porém, a
viabilidade celular e nem induzindo à atividade de poro do receptor P2X7 associada com a
isoforma A. Desse trabalho então, surgiu a necessidade de se verificar à fundo qual seria a
isoforma do P2X7 importante na quimiotaxia de células de neuroblastoma preparadas com
10nM de BK por 24horas em resposta à 1µM de ATP. Além disso, gostaríamos de verificar se
existia uma relação entre as condições de cultura (aderentes ou em suspensão) dessas células e
o tempo de enriquecimento de CSCs com a resposta quimiotática à ATP in vitro, o que nos
indica indiretamente a capacidade de invasão dessas células.
Para tanto, foram utilizadas células de neuroblastoma da linhagem ACN modificadas
(P2X7+ ou scrambled, P2X7A-B- e P2X7A-) em condições aderentes e em suspensão
(tumoresferas) enriquecidas por 18 e 30 dias. Para a quantificação das células que migraram
pelos transwells, os núcleos foram marcados com DAPI e contados. Além disso, para
verificação do estado tronco das células que migraram, estas foram marcadas com anticorpo
25
anti-SOX-2 e, curiosamente todas as células que migraram pelo transwell apresentaram
marcação positiva para SOX-2, indicando que as células capazes de migrar provavelmente
foram células num estado mais indiferenciado (Fig. 18 e Fig.19).

Figura 18: : Imagens adquiridas por microscopia invertida de fluorescência das quimiotaxias das células de neuroblastoma
modificadas crescidas em condições aderentes, marcadas com DAPI e SOX-2. Aumento de 20X.

Figura 19: Imagens adquiridas por microscopia invertida de fluorescência das quimiotaxias das células de neuroblastoma
modificadas crescidas em condições de suspensão por 18 dias, marcadas com DAPI e SOX-2. Aumento de 20X.

Na quimiotaxia com células aderentes, nossos resultados revelaram que a resposta

quimiotática de células tratadas com BK foi maior para todas as condições em relação ao
controle (células não tratadas), sendo que o número de células que transmigraram em favor do
gradiente de ATP foi 212%, 63% e 61% maior para P2X7+, P2X7A-B- e P2X7A-,
respectivamente, como mostrado na Fig. 20.

26
Figura 20: Quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas crescidas em condições aderentes tratadas ou não com BK
10nM e marcadas com DAPI.

No caso das tumoresferas cultivadas por 18 dias, o número de células que transmigraram
em favor do gradiente de ATP foi 115% e 180% maiores para P2X7+ e P2X7A-B-,
respectivamente; e 52% menor para P2X7A-, todas em relação ao controle, como mostrado na
Fig. 21.

Figura 21: Quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas crescidas em condições de suspensão por 18 dias, tratadas
ou não com BK 10nM e marcadas com DAPI.

Para as tumoresferas cultivadas por 30 dias, o número de células que transmigraram em

favor do gradiente de ATP foi 53% menor para P2X7+, 26% e 345% maiores para P2X7A-B- e
P2X7A-, respectivamente, em relação ao controle, como observado na Fig. 22.

Figura 22: : Quimiotaxia de células de neuroblastoma modificadas crescidas em condições de suspensão por 30 dias, tratadas
ou não com BK 10nM e marcadas com DAPI.

27
 Através desses dados foi possível confirmar que a BK, além de modular positivamente
a resposta quimiotática de células de neuroblastoma em condições de cultura aderentes, modula
também a resposta quimiotática dessas mesmas células em condições de cultura que favorecem
o enriquecimento de células-tronco cancerígenas in vitro, diminuindo a migração dessas células
num tempo de cultivo maior (30 dias) quando o P2X7 é expresso normalmente ou num tempo
de cultivo menor (18 dias), quando a isoforma A é silenciada. Esses dados sugerem que a BK
pode estar modulando não somente a atividade do receptor P2X7, mas também ambos podem
estar correlacionados com a formação de células-tronco cancerígenas, bem como com a
capacidade de migração das células de neuroblastoma in vitro. Ao primeiro momento, parece
que a bradicinina tem seu efeito potenciador da quimiotaxia no receptor P2X7 quando uma
menor quantidade de CSCs está presente. Efeito esse que diminui à medida em que
teoricamente mais CSCs são formadas. Além disso, intrigantemente, a bradicinina parece
possuir o mesmo efeito potenciador da quimiotaxia nas células de neuroblastoma silenciadas,
sendo a diminuição esperada devido à ausência do receptor; porém, uma vez que as culturas
são enriquecidas com CSCs, a bradicinina tem um efeito que claramente é balanceado pela
isoformas do P2X7. Isso porque, em 18 dias de enriquecimento o efeito potenciador da
bradicinina é 3 vezes maior quando A e B estão ausentes e cerca de 100% menor quando apenas
a isoforma A está ausente. Contrariamente, em 30 dias de enriquecimento a bradicinina reduz
pela metade o efeito causado na linhagem P2X7A-B- crescida em condições aderentes e
aumenta em mais de cinco vezes seu efeito potenciador para a linhagem P2X7A- também
crescida em condições aderentes.

4.7 Extração de RNA

As amostras de RNA extraído das culturas aderentes tratadas e não tratadas com BK
foram submetidas à eletroforese em gel de agarose para a verificação da integridade e pureza
do RNA. Como pode ser observado na Fig. 23, todas as amostras exceto 5 da extração 1, 4 e
11 da extração 2, apresentaram bandas fortes e RNA aparentemente íntegro e puro, sem indícios
de contaminações com DNA genômico ou RNA degradado.

28
Figura 23: Gel de agarose 1% resultante da corrida eletroforética para verificação da integridade das amostras de RNA
extraídas com Brazol.

4.8 Quantificação por Nanodrop

Na Tabela 2 encontram-se os valores das concentrações dos RNAs extraídos das amostras
de ACN modificadas tratadas com BK em três concentrações diferentes e os controles (não
tratados), além dos valores das razões OD260/280, OD260/230 e dos volumes calculados para
a pipetagem de 5µg de RNA para a síntese de cDNA de cada amostra. Nas amostras de P2X7A-
B- tratada com BK 10nM da extração 1, P2X7+ tratada com BK 10nM e P2X7+ tratada com BK
50nM da extração 2 (amostras em realce amarelo), as concentrações dos RNAs extraídos foram
muito baixas e o volume calculado para alíquotas maior do que o volume do material extraído,
além disso, somente essas amostras apresentaram relações de OD260/280 e OD260/230 muito
abaixo do ideal (aproximadamente 2,0 para um RNA “puro”), não tendo sido, portanto,
utilizadas para a síntese do cDNA.
Tabela 2: Concentrações dos RNAs extraídos com Brazol quantificadas em Nanodrop, bem como as razões OD260/280,
OD260/230 a o volume pipetado para 5µg de RNA por amostra para a síntese de cDNA.
Extração 1 Extração 2
Amostras Razão Razão 5µg de Razão Razão 5µg de
Concentração Concentração
OD260/ OD260/ RNA OD260/ OD260/ RNA
(ng/µL) (ng/µL)
280 230 (em µL) 280 230 (em µL)
P2X7A+/B+ controle 1,97 1,72 938,5 5,33 1,95 1,23 883,9 5,66
- -
P2X7A /B controle 1,97 1,5 1009,1 4,95 1,9 1,53 330,5 15,13
P2X7A-/B+ controle 1,86 1,44 330,6 15,12 2 1,84 1380,5 3,62
+ +
P2X7A /B + BK 10nM 1,99 1,78 1514,2 3,30 1,76 0,6 92,9 53,82
P2X7A-/B- + BK 10nM 1,66 0,68 16,5 303,03 1,92 1,17 717,5 6,97
P2X7A-/B+ + BK 10nM 1,98 1,84 1103,3 4,53 1,96 1,54 1110,4 4,50
P2X7A+/B+ + BK 30nM 1,97 1,83 898,9 5,56 1,76 1,15 272,2 18,37
P2X7A-/B- + BK 30nM 1,97 1,68 1285 3,89 1,88 1,22 252,3 19,82
P2X7A-/B+ + BK 30nM 1,97 1,96 1105 4,52 1,97 1,75 875,6 5,71
P2X7A+/B+ + BK 50nM 1,95 1,63 751,6 6,65 1,98 1,95 1009,7 4,95
P2X7A-/B- + BK 50nM 1,95 1,61 692,2 7,22 1,6 0,91 40,4 123,76
P2X7A-/B+ + BK 50nM 1,96 1,95 2369,8 2,11 1,88 1,84 327,6 15,26

29
4.9 qPCR
Os resultados do qPCR (Fig. 24) mostraram que BK 30nM exerceu um efeito
significativo no aumento da expressão do receptor P2X7 humano em células de ACN P2X7A-
em relação à P2X7A-B- e P2X7+. Entretanto, não esperávamos observar nenhuma amplificação
da amostra controle de P2X7A-B-, uma vez que nessas células a expressão de ambas as
isoformas A (completa) e B (truncada) do receptor P2X7 foi silenciada. Por outro lado, a
amostra controle de P2X7A- não apresentou amplificação. Nenhuma amostra tratada com BK
50nM apresentou amplificação significativa em relação ao controle. As amostras cujo gene alvo
era VEGF não apresentaram amplificação e acreditamos que isso pode ter ocorrido devido à
degradação dos primers. Acreditamos que será necessário um novo desenho dos primers,
padronização destes e repetição desses experimentos para confirmação do efeito que BK exerce
nessas linhagens e qual a relação com a expressão das isoformas do receptor P2X7, bem como
de gene-alvos envolvidos na metástase e renovação celular.

Figura 24: Efeito do tratamento de BK em três concentrações diferentes na expressão relativa de P2X7 humano nas linhagens
ACN modificadas em relação ao controle basal GAPDH humano.

4.10 Tumorigênese de células de neuroblastoma (ACN)

O ensaio de tumorigênese, também conhecido como ensaio de formação de colônias ou
clonogênico, é uma técnica que vem sido bastante utilizada na caracterização de células-tronco
cancerígenas in vitro. Esse ensaio verifica a capacidade de uma única célula crescer através da
expansão clonal, formando uma grande colônia (Fengzhi Liu, 2012; Franken, Rodermond, Stap,
Haveman, & van Bree, 2006).
Nos ensaios de tumorigênese com as células ACN, a linhagem na qual ambas as isoformas
A e B estão silenciadas (P2X7A-B-) apresentou maior formação de colônias tanto para 100
quanto para 200 células semeadas. Já a linhagem na qual somente a isoforma A está silenciada
(P2X7A-) apresentou um aumento na formação de colônias muito pequeno em relação à
linhagem em que ambas as isoformas estão presentes, não sendo estatisticamente significativa

30
(Fig. 25). Esses dados preliminares indicam que, na verdade, a ausência de ambas as isoformas
aumenta a capacidade de expansão clonal in vitro e que o silenciamento da isoforma A não
favorece a ação da isoforma B.
Esses dados corroboram fortemente com os dados da verificação da eficiência de
formação de tumoresferas in vitro, uma vez que, assim como na tumorigênese, as células de
neuroblastoma silenciadas para ambas as isoformas do P2X7 (P2X7A-B-) apresentaram maior
capacidade no enriquecimento de células-tronco cancerígenas in vitro, indicando que as
isoformas são importantes, de certa forma, na manutenção do estado diferenciado dessas
células.

Figura 25: Ensaio de tumorigênese com células de neuroblastoma modificadas. A: Imagens adquiridas por microscopia
invertida de campo claro das tumorigêneses nos aumentos de 2,5X; 10X e 20X. B: Contagem das colônias formadas quando
semeadas 100 e 200 células.

4.11 Tumorigênese de células HEK

Nos ensaios de tumorigênese in vitro para as células HEK, foi possível observar que as
células modificadas para a expressão da isoforma A do receptor P2X7 apresentaram maior
número de colônias do que a linhagem modificada para a expressão da isoforma B (Fig. 26),
sendo que ambas apresentaram maior número de colônias do que a linhagem mock, cuja
expressão do receptor P2X7 é naturalmente ausente. As colônias formadas por essas duas
linhagens discutidas acima se diferenciaram da linhagem não modificada pelo fato de serem
menores e mais compactas e arredondadas, enquanto a linhagem mock apresentou colônias

31
maiores e mais espaçadas. Assim como discutido no item 2.10, o ensaio de tumorigênese
oferece uma forma bastante sensível de caracterização in vitro do estado indiferenciado celular,
portanto, esses dados indicam que a isoforma A pode estar mais relacionada com a manutenção
das células num estado tronco.
As células HEK tratadas com bradicinina apresentaram redução proporcional para cada
linhagem modificada na formação de colônias, indicando que BK pode exercer um papel
importante no processo de diferenciação celular e, aparentemente não modulou diferentemente
as isoformas do P2X7 no processo de tumorigênese.
Nos ensaios com as células HEK, infelizmente não foi possível quantificar a formação de
colônias, porque é uma linhagem com baixa eficiência de adesão e a utilização de fixadores
acabou descolando várias colônias dos poços. Uma forma de solucionar esse problema seria
modificando o protocolo e utilizando uma camada fina de ágar para aumentar a eficiência de
adesão, bem como remover a etapa de fixação, procedimento que está contido no cronograma
para o próximo período. Além disso, da mesma forma que as células de neuroblastoma, essas
células HEK são modificadas e podem perder o fenótipo modificado com o tempo, sendo
necessário refazer a seleção clonal com puromicina antes dos próximos experimentos.

Figura 26: Ensaio de tumorigênese com células HEK modificadas. A: Imagens adquiridas por microscopia invertida de
campo claro das tumorigêneses de células não tratadas e B: de células tratadas com 10nM de BK. Aumentos de 2,5X; 10X e
20X.

32
A tabela 3 apresenta um resumo dos dados mais importantes observados até o presente
momento.

Tabela 3: Resumo dos dados

5 Cronograma para o próximo período

33
6 Participação em Congressos
6.1 Participação da comissão organizadora do congresso “Novas Vertentes
Biotecnológicas para o Desenvolvimento Tecnológico-social do Brasil”.

6.2 Resumo apresentado na forma de pôster no congresso Purines 2018

34
35
6.3 Menção honrosa Pedro Muanis Persechini pelo trabalho em que fui co-autora
apresentado no congresso Purines 2018

7 Lista de publicações
7.1 Co-autoria num artigo de revisão sobre a relação entre o sistema purinérgico,
macrófagos e câncer, que está em processo de elaboração (manuscrito para submissão
anexado no item “Outros documentos” do SAGE)

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