Sistemas Miméticos de Membrana

biológica
Reconstituição de Proteínas
• Introdução Geral

• Exemplos de reconstituição:
 Visão geral:

Sistemas miméticos de membranas

biológicas são estruturas organizadas
de fosfolipídeos e proteínas que
podem mimetizar a membrana
biológica natural.
Membranas biológicas ?

• O que são?
• Como são constituídas?
 Proteínas

• Periféricas

• Integrais

• Ancoradas
 Solubilização

Fração de Membrana
Incubada com diferentes
detergentes

concentração de detergente
concentração de proteína
tempo de incubação

Ultracentrifugação
100.000 x g
por 1 hora

"Pellet"
Ressuspenso Sobrenadante
proteínas proteínas solubilizadas
não solubilizadas
Reconstitution strategy
Liposomes-Proteoliposomes
Filmes Langmuir
Filmes Langmuir-Blogett - LB
Lipid or polimeric Microsphere
(carrier system – not mimetic)
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
 Metodologia Geral

• Como obter o sistema de membranas

– Fosfolipídeos:
• Adquirir comercialmente;
• Extração de lipídeos naturais.
– Proteínas:
• Adquirir comercialmente;
• Extração do tecido;
• Solubilização, purificação.
– Reconstituição do sistema.
 Vantagens

• Conhecer todos os componentes do sistema;

• Possibilidade de interpretar os resultados
mais facilmente;
• Possibilidade de se estudar transporte
quando o sistema reconstituído é vesicular;
• Sistema excelente como carreador de
drogas e/ou biomoléculas.
 Desvantagens

• Sistema pode ser reconstituído

eficientemente entretanto não ser funcional.

• Para cada sistema tem que ser planejada

uma estratégia de reconstituição.
Ciancaglini et al. / Biophys Rev (2012) 4: 67-81.
Lipossomos
 Preparação dos lipossomos

Home page: Avanti Polar Lipids

Preparation of lipid suspension

Phospholipids/chloroform

Nitrogen

Phospholipids films

buffer
[Detergent]

Phospholipids emulsion

1 hour / 60ºC 1 min. sonication

Shaker / 10 minutes 1 hour / 25ºC

Transparent suspension
Proteolipossomos
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Lipossomos por co-solubilização
Proteolipossomos por co-solubilização
 Turbidity

Mole fraction

[Monomeric detergent]w
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Cholate mediated reconstitution
Optimal reconstitution was obtained by the depletion of the ternary
mixed miceles.
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Triton X-100 mediated reconstitution
Optimal reconstitution obtained with protein transference from mixed
micelle to detergent satured liposomes
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Octylglucoside mediated reconstitution
Optimal reconstitution was obtained with direct insertion of protein in
preformed detergent-satured liposome.
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Rigaud et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246
Remoção de SDS

○ Diálise – 55%
● Biobeads – 94%
■ Calbiosorb – 99,5%
Sistemas alternativos