Catalase Activity Assay

Catalase é uma enzima antioxidante presente na maioria das células

aeróbicas e está envolvida na detoxificação do peróxido de hidrogênio (H 2O2),
uma espécie reativa de oxigênio (ROS), que é um produto tóxico tanto do
metabolismo aeróbico normal quanto da produção patogênica de ROS. Esta
enzima catalisa a conversão de duas moléculas de H 2O2 em oxigênio molecular
e duas moléculas de água (atividade catalítica). O H 2O2 não convertido pode
ser medido colorimetricamente a 240nm em espectrofotômetro, permitindo a
avaliação da atividade da enzima catalase.

Para isso, é necessário preparar 180μl de solução com Tris-HCL, EDTA,

H2O2 e lisado celular por poço. Para análise de 4 linhagens celulares (L929,
MB49, T24 e RT4), em quadruplicata, serão necessários 16 poços, bem como
4 poços controle (somente reagentes, sem lisado celular). Ajustando o volume
para mais, o cálculo dos reagentes será feito para 25 poços de 180μl,
totalizando 4500μl.

Tris-HCL (1M, pH 8,0):

Dissolver 1,211g em 10000μl de água destilada.

Para 1 poço, dissolver 0,021g em 180μl de água destilada.
Para 25 poços, dissolver 0,544g em 4500μl de água destilada.

EDTA (5mM, pH 7,0):

Dissolver 0,0146g em 10000μl de água destilada.

Solução Estoque Pronta = 74,25 g/L (0,254M):
 Para 1 poço:
C1 x V1 = C2 x V2 => 0,254M x V1 = 0,005M x 180μl;
V1 = 0,9 / 0,254 = 3,543μl.
Para 25 poços:
C1 x V1 = C2 x V2 => 0,254M x V1 = 0,005M x 4500μl;
V1 = 22,5 / 0,254 = 88,582μl.
Solução Estoque Pronta = 0,5M:
Para 1 poço:
C1 x V1 = C2 x V2 => 0,5M x V1 = 0,005M x 180μl;
V1 = 0,9 / 0,5 = 1,8μl.
Para 25 poços:
C1 x V1 = C2 x V2 => 0,5M x V1 = 0,005M x 4500μl;
V1 = 22,5 / 0,5 = 45μl.

Solução Tampão (Tris-HCL + EDTA, pH 7,0):

Adicionar 45μl de EDTA 0,5M em 4455μl de Tris-HCL. Após misturar,

ajustar o pH da solução para 7,0.

Solução Estoque de H2O2 (90mM):

Molaridade H2O2 a 30% = 9,79M.

Para 1000μl:
C1 x V1 = C2 x V2 => 9,79M x V1 = 0,09M x 1000μl;
V1 = 90 / 9,79 = 9,193μl.
Adicionar 9,193μl de H2O2 em 990,807μl de água destilada. Serão
pipetados apenas 20μl desta solução por poço. Com 1000μl, este estoque
rende 50 poços Sempre preparar momentos antes de usar (não guardar).

Lisado Celular:

Com base nos cálculos anteriores, foram definidos os seguintes grupos:

Grupo CTL: 4 poços com Solução Tampão + H2O2;
Grupo L929: 4 poços com Solução Tampão + Lisado de L929 + H 2O2;
Grupo MB49: 4 poços com Solução Tampão + Lisado de MB49 + H2O2;
 Grupo T24: 4 poços com Solução Tampão + Lisado de T24 + H 2O2;
Grupo RT4: 4 poços com Solução Tampão + Lisado de RT4 + H 2O2;
Total: 20 poços.

Após o preparo do H2O2 a 90mM, pipetar 150μl da Solução Tampão em

todos os 20 poços. Em seguida, pipetar 10μl do lisado celular por poço, com
exceção dos 4 poços controles.

H2O2 (10mM):

Solução estoque preparada previamente = 0,09M.

Para 1 poço:
C1 x V1 = C2 x V2 => 0,09M x V1 = 0,01M x 180μl;
V1 = 1,8 / 0,09 = 20μl.
Para 25 poços:
C1 x V1 = C2 x V2 => 0,09M x V1 = 0,01M x 4500μl;
V1 = 45 / 0,09 = 500μl.
Pipetar 20μl de solução de H2O2 a 90mM em todos os 20 poços, atingindo
assim a concentração de 10mM direto no poço.
Medir imediatamente após o término da pipetagem do H 2O2 em
espectrofotômetro a 240nm com intervalos de 1min, durante 10min ou até a
medida de absorbância atingir a constante.