Biologia molecular

IDENTIFICAO DO MATERIAL GENTICO

Em 1866 Mendel descreveu os genes atravs dos seus efeitos finais tais como os fentipos. Pelos experimentos de Mendel, e de outros pesquisadores, ficou definido que os genes levam a informao gentica de uma gerao para outra e, apesar de no ser visto ou delimitado fisicamente, deveriam apresentar as seguintes propriedades: - Replicao: processo que permite ao gene produzir outras unidades iguais a si prprio. - Transcrio: Processo pelo qual a informao gentica, transferida para o local apropriado (ribossomo) e traduzido. - Traduo: Processo pelo qual so produzidas as protenas a partir de uma seqncia de nucleotdeos. Aps Mendel, os genes foram definidos quimicamente e foram conhecidos pelo que realizam na sntese protica e no a nvel de expresso fenotpica. Miescher (1869-71) publicou metodologia, que permite separar o ncleo do citoplasma. Do ncleo ele extraiu uma substncia denominada nuclena, hoje conhecida por cido nuclico, que se caracterizava por ter alta acidez, apresentava grande quantidade de fsforo e no continha enxofre. Mais tarde descobriram que a nuclena estava associada, a vrios tipos de protenas formando a nucleoprotenas. Da poro protica foi constatado dois tipos de protenas: a. Protaminas: Protena de estrutura simples, consistindo na maioria das vezes de grupos do aminocido arginina. Esta protena est presente no esperma de peixes e aves. b. Histona: Protenas relativamente complexas de ocorrncia mais ampla. Embora os peixes e as aves no sejam as mais complexas das criaturas parece difcil aceitar a idia de que o material gentico destes organismos seja a protamina. Ela, constituda quase apenas de arginina, no deveria ser capaz de originar os outros 20 aminocidos conhecidos. Tambm pouco aceitvel que o material gentico seja a histona, at a formao de uma protamina. Griffith (1928) apresentou as primeiras evidncias de que o DNA o material gentico. As evidncias surgiram em experimentos realizados com bactrias do gnero Pneumococus. Muitas linhagens ou tipos de pneumococus (Diplococcuspneumoniae) podem ser distinguidos por diversas caractersticas:
Caracterizao Colnia Capa protica Virulenta Lisa (S) Presente Avirulenta Rugosa (R) Presente

O experimento realizado por Griffith resumido a seguir:

Tratamento Tipo II R injetado em ratos Tipo III S morto pelo calor injetado em rato Tipo III S morto pelo calor mais o tipo II R injetado em ratos Resultado ratos sobreviveram ratos sobreviveram ratos morreram

A mudana no poderia ter surgida por mutao pois um mutante deveria ser da mesma linhagem gentica do tipo III, entretanto foi o tipo II (com capa protica) que adquiriu a propriedade de causar a doena tal como o tipo III. Algum fator das bactrias do tipo III S estava aparentemente sendo transferido para os cocus vivos (tipo II) de tal forma que o tipo II avirulento, transformara-se em cocus virulentos. Este fenmeno foi

conhecido como "efeito Griffith" ou "transformao". Avery, MacLeod e McCarty (1944) publicaram resultados de extensas investigaes durante um perodo de 10 anos. Ele fizeram, em condies de laboratrio, experimentos semelhante ao de Griffith. Averyet al relataram que ao colocar em um tubo de ensaio bactrias II R (avirulenta), extrato de DNA do tipo III S (virulenta) mortas pelo calor e soro que precipitava as bactrias do tipo II R, foram recuperadas as colnias de bactrias do tipo III S. Estes experimentos identificaram o DNA como material gentico. Assim, quando o DNA extrado de uma linhagem introduzido em clulas de outra linhagem, os organismos receptores desenvolveram caractersticas da linhagem doadora. Desta forma, conclui-se que: - O DNA o material gentico em D. pneumoniae. - O DNA atua como agente que especifica produo de um produto final. DNA E RNA Constituio qumica do DNA e RNA Quando o cido nuclico foi separado da protena muitos pesquisadores, especialmente Levene, mostraram que ele poderia ser quebrado em pequenas partes denominadas de nucleotdeos. Cada nucleot deo contm:
Caracterizao 1. Acar 2. Grupo Fosfatro DNA Desoxiribose H3PO4 RNA Ribose H3PO4 Piridiminas: Citosinas e Uracil Purinas Adenina e Guanina

Piridiminas: Citosinas e Timinas 3. Bases nitrogenadas Purinas Adenina e Guanina

Chargaff, em seus estudos, apresentou vrias informaes a respeito da molcula de DNA. Identificou-se que ocorre ligaes entre a pirimidina citosina e purina guanina e entre a pirimidina timina e a purina adenina. As ligaes envolvem duas pontes ente A e T e trs entre G e C. Tambm constatou a seguinte relao: (C+A)/(G+T) =1 Diferenas entre DNA e RNA O DNA se diferencia do RNA nos seguintes aspectos: a. O acar do DNA a desoxiribose enquanto que o do RNA a ribose. b. O DNA contm a timina e o RNA a uracil. c. O DNA um filamento duplo e o RNA um monofilamento. d. O DNA apresenta uma molcula longa e o RNA uma molcula curta

Modelo do DNA segundo Watson e Crick

Watson e Crick propuseram um modelo de DNA cujos princpios fsicos derivaram das figuras de difrao de raios X produzidas por Wilkins e Astracan, usando DNA isolado. Os princpios qumicos derivaram principalmente dos trabalhos apresentados por Chargaff e seus associados. Segundo Watson e Crick, o DNA apresenta as seguintes caractersticas: a. O DNA uma hlice dupla helicoidal. b. O enrolamento da hlice para a direita. c. Os longos filamentos externos relativamente rgidos, so constitudos de fsforo (P) e acar (A).

d. No sentido transversal os filamentos menos rgidos so constitudos por bases orgnicas (purinas e pirimidinas) unidas, por pontes de hidrognio. e. O comprimento de uma volta completa, na espiral envolve cerca de 10 nucleotdeos (34 angstron) Associao entre DNA e Histonas As histonas formam um complexo juntamente com os grupos fosfatados do DNA carregados negativamente. As histonas so carregadas positivamente, sendo conhecidas por "protenas bsicas". As cargas positivas so fornecidas por uma alta proporo de aminocidos lisina e arginina. Algumas histonas so denominadas "rica. em lisina" e outras "ricas em arginina". Em geral so encontradas somente nos organismos em que a diferenciao celular ocorre (eucariotas). So distinguidos, em funo da proporo lisina/arginina, cinco diferentes tipos de histonas (H1, 2 H2A, 2 H2B e 2 H3). A complexao das histonas alm de causar um aumento do dimetro do DNA, de cerca de 20 a 30 angstron, muda tambm as propriedades fsicas do DNA. A temperatura de fuso (temperatura na qual os fios de DNA mudam da forma de hlice dupla regular para a forma de fio simples) bastante aumentada.

Replicao do material gentico O modelo de replicao do DNA dito ser semi-conservativo, ou seja, uma fita de DNA d origem a outras duas sendo que, cada uma delas apresenta um filamento da fita original. A replicao ocorre na intrfase da diviso celular e dirigida pela enzima DNA polimerase. Na replicao as pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas se rompem e a enzima DNA polimerase cataliza a adio de novos nucleotdeos complementares s bases expostas de tal maneira que duas novas fitas de DNA sejam formadas. . O RNA - cido ribonuclico O RNA encontrado tanto no ncleo quanto no citoplasma. Tem sido reconhecido vrios tipos de RNA: a. RNA mensageiro - mRNA o RNA envolvido pela transcrio da informao gentica contida no DNA, no ncleo, e conduo da mesma at os stios ribossmicos. b. RNA transportador - tRNA Caracteriza-se por ser um RNA pequeno, contendo cerca de 75 a 85 nucleotdeos e por assumir uma forma de trevo. Sua funo principal a de conduzir os aminocidos requeridos na sntese protica at as subunidades do ribossomo. c. RNA ribossmico - rRNA Entra na composio do Ribossomo. Sua funo no bem definida.

FUNO DO MATERIAL GENTICO Garrod (1900), mdico ingls, deu os primeiros passos para evidenciar a ao dos genes. Este pesquisador estudou a alcaptonria, uma doena hereditria caracterizada pela colorao escura na urina. Para esta doena foi observado que o escurecimento era conseqncia do acmulo de cido homozentzico (alcapton) o qual, nos indivduos normais, era decomposto atravs de reaes enzimticas, de tal maneira que havia excreo de cido actico. Constatou-se ainda que dietas com tirozina e fenilalaminaaumentava a manifestao de sintomas. Os trabalhos decisivos sobre a funo do gene foram apresentados por Beadle e Tatum que propuseram a teoria "um gene - uma enzima". As idias principais do trabalho realizado por estes autores foram: a. Todos os processos bioqumicos dos organismos esto sob controle gentico. b. Os processos bioqumicos ocorrem numa seqncia de reaes individuais. c. Cada reao simples controlada por um gene simples. d. Cada gene atua atravs do controle e produo de uma enzima especfica. Na atualidade esta teoria apresenta as seguinte falhas: a. Um gene pode especificar a sntese de uma cadeia polipeptdica que no apresenta nenhuma funo enzimtica (Ex.: Hemoglobina). b. Uma enzima pode ser constituda por mais de uma cadeia polipeptdica (Ex.: RNA polimerase constituda por vrias cadeias e, consequentemente, esta sob o controle de vrios genes. c. Um gene pode controlar a atividade de uma enzima especificada por outro gene (Ex.: stio operadores, repressores, etc.). BASES FISIOLGICAS DA DOMINNCIA E RECESSIVIDADE De acordo com a teoria "um gene - uma enzima" os genes agem atravs da produo de enzimas, sendo que cada gene responsvel pela produo de uma enzima especfica. Por este princpio podemos explicar as bases fisiolgicas da dominncia e recessividade segundo uma determinada via biossinttica. Assim, tem-se: Dominncia completa Neste caso a quantidade de enzimas produzidas pelo heterozigoto Aa, embora geralmente menor que a produzida pelo homozigoto AA, suficiente para produo do mesmo produto final de AA. Dominncia. incompleta Neste caso a menor quantidade de enzimas normal produzida pelo heterozigoto Aa, em relao ao homozigoto AA, resulta em uma menor quantidade de produto final que pelo efeito de dosagem confere um fentipo diferente do produzido pelo homozigoto AA. Codominncia Neste caso o complexo enzimtico produzido por Aa, dado a contribuio de A e de a, diferente da enzima produzida por AA e consequentemente o produto final ser diferente daquele produzido por AA. Neste caso a qualidade de enzima o fator crtico. CDIGO GENTICO Definio de cdigo gentico Sabe-se que o DNA, que se encontra no ncleo, tem a funo de prod uzir protenas cuja sntese ocorre no ncleo. O DNA uma seqncia de nucleotdeos e que existe apenas quatro tipos diferentes de nucleotdeos: os

nucleotdeos da adenina, da guanina, de timina e da citosina. Por outro lado, as protenas so polmero de subunidades (monmeros) denominadas de aminocidos. Cada aminocido engloba um grupo amino (NH2) numa extremidade e um grupo carboxila (COOH) na outra. Vinte tipos diferentes de aminocidos ocorrem nas protenas. Diante do exposto surge a seguinte pergunta: quantos nucleotdeos seriam necessrios para codificar um aminocido? Para responder a esta perguntas necessrio o seguinte raciocnio matemtico: - Se 1 nucleotdeo codificasse um aminocido s poderia existir 4 diferentes tipos de aminocidos na cadeia protica. - Se 2 nucleotdeos codificassem um aminocido s poderia existir 16 tipos de aminocidos diferentes na cadeia protica. - Se 3 aminocidos codificassem um aminocido seria possvel existir 64 tipos diferentes de aminocidos na cadeia protica logo, por matemtica, um cdigo trplice a menor unidade de codificao capaz de acomodar os 20 diferentes tipos de aminocidos que comumente ocorrem nas protenas. Atualmente definimos o CODON como sendo uma seqncia de trs nucleotdeos adjacentes no mRNA capaz de codificar um aminocido. Decifrao do cdigo gentico Estudos foram realizados permitindo constatar que o cdigo gentico representado por sessenta e quatro codonsmRNA, sessenta e um dos quais codificam para aminocidos e trs para terminao em cadeia. Trs dos que codificam aminocidos so identificados tambm como iniciadores. So evidenciadas as seguintes caractersticas do cdigo gentico: Cdigo gentico redundante ou degenerado O cdigo gentico dito degenerado pelo fato de existir, para um determinado aminocido, mais de uma trinca para codific-lo. Apenas a metionina (Met) e o triptofano (Trp) so codificados por um nico codon, representados por AUG e UGG, respectivamente. A glicina (GLY), por exemplo, codificada por GGG, GGC, GGA e GGU. Trincas sem sentido ou terminalizadoras So aquelas trincas que no codificam aminocidos e que tem por funo indicar o trmino da sntese protica. So tambm denominados trincas terminalizadoras. Ex.: UAG, UAA, UGA. Cdigo gentico universal O cdigo gentico dito universal devido ao fato da mesma trinca codificar o mesmo aminocido em qualquer organismo. Em alguns casos certas trincas so mais eficientemente utilizadas.

SNTESE DE CADEIA POLIPEPTDICA A sntese protica envolve as seguintes etapas: Transcrio e Traduo Transcries Processo que ocorre no ncleo da clula, no qual a mensagem gentica passada do DNA para uma fita de mRNA, com auxlio da ao cataltica da enzima RNA polimerase. A informao do DNA transcrita em uma seqncia codificada do mRNA, atravs do uso, com gabarito, de um filamento do DNA. At hoje, o mecanismo de seleo do filamento apropriado ainda desconhecido. O mRNA transcrito solta-se do modelo de DNA e desloca-se do ncleo para o citoplasma. Aps o mRNA se desacoplar, as pontes de hidrognio que haviam-se desfeitas voltam-se a ligar. A enzima RNA polimerase tem as seguintes funes: a. Reconhecer as bases do DNA. b. Selecionar os ribonucleotdeos apropriados. c.Catalizam a formao de ligaes entre os ribonucleotdeos. d. Escolhe o filamento correto a ser transcrito. A RNA polimerase constituda de 6 cadeias polipeptdicas (2 alfa, beta, beta', gama e sigma), sendo que o fator sigma o responsvel pela transcrio no local e fio correto. Traduo A traduo um processo que ocorre no citoplasma da clula, no qual a mensagem trazida pela fita de mRNA traduzida em uma seqncia de aminocidos. O processo de traduo envolve as seguintes etapas: a. Aps a chegada da fita de mRNA no citoplasma, ocorre a complexao das subunidades do ribossomo (nos procariotas o ribossomo 70 s = 50 s + 30 s, e nos eucariotas de 80 s = 50 s + 40 s) com esta fita. Polissomos a denominao que se d complexao de vrios ribossomos a uma mesma fita de mRNA. No caso da sntese da hemoglobina, os ribossomos reunem-se em 4 ou 5 polissomos. b. iniciado a leitura e traduo da fita de mRNA. Nos procariotas, em geral, a primeira trinca a ser lida (fator de inicializao) a AUG, que corresponde metionina formilada (As trincas GUU, GUC, GUA e GUG que corresponde metionina formilada (as trincas GU, GUC, GUA, GUG, que corresponde valina tambm so fatores iniciadores), enquanto que nos eucariotas o primeiro aminocido tambm a metionina mas no formilada. Nem todas as protenas iniciam com a metionina (ou valina) e isto se d pelo fato da protena final ser o resultado de uma reestruturao, incluindo quebras, da estrutura linear de aminocido. Aps a leitura da trinca ocorre a transferncia do aminocido requerido para os stios ribossmicos. Este transporte realizado pelo tRNA. No tRNA encontrado o anti-codon, que uma seqncia de trs bases adjacentes complementares ao codon do mRNA. c. O tRNA penetrando por uma abertura da subunidade 50S, ocupa o stio aminoacil. Pela ao da enzima translocase o tRNA ativado passa para o stio peptidil, permitindo a leitura, pelo complexo ribossomo-mRNA, da trinca consecutiva. d. Aps a leitura da nova trinca um novo tRNA ativado e deslocado do suco citoplasmtico para o stio aminoacil do complexo levando o aminocido requerido pela protena. e. Pela ao da enzima peptidiltransferase o aminocido (ou seqncia de aminocidos) que pertencia ao tRNA do stio peptidil transferido e ligado ao aminocido acoplado ao tRNA do stio aminoacil.

f. O tRNA desativado, que ocupa o stio peptidil, deixa o complexo ribossomo-mRNA podendo ser novamente ativado quando se fizer necessrio. g. Novamente, pela ao da enzima translocase, o tRNA ativado passa do stio aminoacil para o stio peptidil permitindo a leitura de uma nova trinca. A leitura da nova trinca implica em ativao de um outro tRNA. h. O processo continuado at que todos os aminocidos necessrios para a confeco da protena estejam ligados. A ltima trinca lida na fita de mRNA dever ser um fator de terminalizao (UAA, UAG ou UGA) que no codifica nenhum aminocido mas indica o trmino da sntese protica. i. A sntese protica termina com a desativao do complexo ribossomo-mRNA, a desativao do tRNA e formao da protena que ainda se encontra em forma linear. Para adquirir a especificidade necessrio que esta estrutura primria atinja uma estrutura terciria ou quaternria.

Frederick Griffith
Frederick Griffith foi um mdico militar britnico, especialista em microbiologia. Nasceu em 1881, em Hale e faleceu em 1941. conhecido pelo Experimento de Griffith, atravs do qual ele descobriu o Princpio Gentico da Transformao, que posteriormente ficou conhecido como DNA.

O Experimento de Griffith
Uma observao perturbadora foi feita por Griffith no decurso de experincias com a bactria Streptococcuspneumoniae em 1928 (que ele pesquisava em busca de uma vacina para a pneumonia, doena comum no perodo aps a 1 Guerra Mundial). Esta bactria, que causa pneumonia aos humanos, normalmente letal no caso dos ratos. No entanto, diferentes estirpes desta espcie bacteriana desenvolveram se de forma a terem diferente virulncia (capacidade de causar doena e/ou morte). Na sua experincia, Griffith usou duas estirpes que so distinguveis pela aparncia das suas colnias quando crescidas em culturas laboratoriais. Numa das estirpes, um tipo virulento normal, as clulas esto cobertas por uma cpsula de polissacrido, dando s colnias uma aparncia lisa (smooth): da chamar-se S a esta estirpe. Na outra estirpe estudada por Griffith, um tipo mutante, no virulento, que cresce nos ratos mas no letal, a cpsula est ausente, dando a estas colnias um aspecto rugoso (rough), sendo esta estirpe chamada de R. Griffith matou algumas clulas virulentas, fervendo-as, e injectou-as nos ratos. Os ratos sobreviveram, mostrando que as carcaas das clulas no causam a morte. No entanto, ratos injectados com uma mistura de clulas virulentas mortas pelo calor e clulas no virulentas vivas morreram. Mais surpreendente ainda, clulas vivas podiam ser recuperadas dos ratos mortos; estas clulas davam colnias lisas e eram virulentas aps injeco subsequente. De alguma forma, os destroos das clulas S mortas, converteram as clulas R vivas a clulas S vivas. Griffith chamou o processo de transformao.

Identificao do material hereditrio em bactrias

A descoberta da transformao bacteriana

A primeira evidncia de que o DNA era o material hereditrio foi obtida atravs de experimentos realizados com o pneumococo Streptococcuspneumoniae. Os pneumococos podem se apresentar de duas formas: 1. Forma virulenta que causa a morte em camundongos por pneumonia: bactrias encapsuladas, que crescem em meio de cultura slido e formam colnias convexas lisas, brilhantes, cremosas ecom bordos regulares, chamadas de colnias S (do ingls, smooth, liso).

2. Forma no virulenta, que no causa pneumonia em camundongos: Variante mutante, originada a partir da forma virulenta (S), mas que no apresentam cpsula e que crescem em meio slido formando colnias achatadas, rugosas, opacas, friveis e com bordos irregulares, chamadas de colnias R (do ingls, rough, rugoso). A diferena entre os dois tipos de bactrias a presena ou ausncia da cpsula, que composta de polissacardeos. A variao na composio qumica dos polissacardeos diferencia diversas linhagens de bactrias do tipo S, que chamamos de S-I, S-II, S-III, etc. As bactrias do tipo R, por no apresentarem cpsulas, no podem ser diferenciadas dessa maneira. No entanto, quando uma bactria do tipo R, sofre mutao reversa, ela ir originar uma bactria do tipo S, da mesma linhagem S que deu origem a ela.

linhagem S-I

linhagem S-I

Sobre a infeco de camundongos por essas bactrias, sabia-se que bactrias do tipo S (virulentas) mortas pelo calor, ao serem injetadas em camundongos, no lhes causavam pneumonia, assim como a injeo de bactrias R (no virulentas). Em 1928, o mdico sanitarista Fred Griffith1 (1877 1941), injetou em camundongos uma mistura de bactrias S mortas e bacterias R, e observou que os camundongos desenvolviam pneumonia. Alm disso, foi observado tambm que clulas S apareciam vivas nos animais mortos e que essas clulas S eram do mesmo tipo que as clulas S mortas injetadas. A seguir podemos ver um esquema do experimento de Griffith:

Deste fato, podia-se ter duas explicaes: 1. As bactrias S mortas haviamressucitado, o que seria um absurdo.

2. As bactrias R haviam sido transformadas em bactrias S por algum tipo de substncia liberada pelas bactrias mortas. Essa substncia foi chamada de princpio transformante e essa transformao das bactrias R em S, foi chamada de transformao bacteriana.
O princpio transformante

O experimento original de Griffith foi repetido com sucesso em vrios laboratrios. No entanto, sua elucidao s aconteceu em 1944, aps anos de estudos de Oswald Avery (1877 1955) e seus colaboradores. Eles descobriram que a transformao das bactrias ocorria tambm in vitro (em um meio de cultura, fora do corpo do camundongo), e que, em uma cultura com bactrias R e bactrias S (mortas pelo calor), apareciam clulas S vivas. Em 1933, James Alloway (1900 1954) descobriu que um extrato de bactrias S, tinha a capacidade de transformar bactrias R em S. Descobriu tambm que se lcool fosse adicionado ao extrato, um precipitado espesso e viscoso se formava retendo a capacidade transformante. Acreditava-se at o momento que o poder transformante era das protenas. A partir de ento, tinham-se novas perspectivas para a purificao do princpio transformante. Oswald Avery2, Colin Macleod3 (1909 1972) e Maclyn McCarty 4 (n.1911) isolaram, a partir de 75 litros de Streptococcus, 25 miligramas de um extrato com altssimo poder transformante. Eles trataram esse extrato com diferentes substncias: - amilase (enzima que degrada polissacardeos) - protease (enzima que degrada protenas) - ribonuclease (enzima que degrada RNA) - dnase (enzima que degrada DNA) O nico tratamento que fez o extrato perder completamente o seu poder transformante foi o tratamento com dnase. Assim, em 1944, Avery e seu colaboradores, chegaram concluso de que a substncia transformante era o DNA. A partir de ento, os pesquisadores comearam a levantar algumas hipteses. Alguns achavam que se o DNA era capaz de transformar as caractersticas hereditrias das bactrias, ento que ele mesmo era o prprio material hereditrio. Outros, no entanto, acreditavam que mesmo aps a purificao, poderiam restar quantidades mnimas de protenas e que essas eram as responsveis pela transformao. Por volta de 1952, conseguiu-se obter extratos que continham apenas 0,02% de protenas, o que eliminava a possibilidade das protenas serem as responsveis pela transformao das bactrias.