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SEQENCIAMENTO DE DNA: MTODOS E PRINCPIOS

Cristiane Kioko Shimabukuro Dias


Ps-doutorado - FAPESP E-mail: crisdias@ibb.unesp.br

Laboratrio de Biologia e Gentica de Peixes - Departamento de Morfologia Instituto de Biocincias UNESP Botucatu (SP)

DEFINIO DEFINI Determinar a seqncia de nucleotdeos

Seqenciamento de DNA

HISTRICO HIST 1953 - Watson e Crick

Modelo dupla hlice do DNA


Seqenciamento de DNA

HISTRICO HIST Dcada de 70

Seqenciamento de DNA

MTODOS CLSSICOS CL 1977 Seqnciamento de DNA Maxam e Gilbert - mtodo de degradao qumica
Tratamento com substncias qumicas que cortam a molcula de DNA em nucleotdeos especficos

Sanger et al. - mtodo enzimtico, dideoxi ou de trmino da cadeia


Sntese enzimtica de uma fita complementar, cujo crescimento interrompido pela adio de um dideoxinucleotdeo

Seqenciamento de DNA

MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU

enzima de restrio

X X

aquecimento e purificao

Seqenciamento de DNA

MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU

Especificidade de bases

Qumico usado para Qumico usado para Qumico usado para a alterao de bases remoo de bases clivagem da fita

G A+G C+T C A>C

Dimetilsulfato cido Hidrazina Hidrazina + lcali lcali

Piperidina cido Piperidina Piperidina Piperidina

Piperidina Piperidina Piperidina Piperidina Piperidina

Seqenciamento de DNA

MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU


G A+G C+T C

Seqenciamento de DNA

MTODO ENZIMTICO ENZIM

DNA fita simples

DNA polimerase primer

Animao

Seqenciamento de DNA

MTODO ENZIMTICO ENZIM X MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU

Seqenciamento de DNA

Mtodos de seqenciamento manual

Mtodo enzimtico mais utilizado, seqenciamento de genomas, automao

Mtodo de degradao qumica substncias qumicas, caracterizao de oligonucleotdeos ou no seqenciamento de estruturas ricas em GC

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO MANUAL SEQ

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM Anos 80 seqenciador semi-automtico


Substituio das tcnicas de deteco por radioatividade pelo uso de marcadores fluorescentes
Radioistopos danosos sade, dificuldade de automao Fluorfos sistema de deteco que permite a leitura automtica das seqncias

Preparao do gel e aplicao das amostras Utilizao ddNTPs durante a eletroforese fluorescentes lidos automaticamente

Corantes fluorescentes reaes no mesmo poo no gel

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM


Seqenciamento em ciclos ou por amplificao linear

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM

animao

Seqenciamento de DNA

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM

Anos 90 - Seqenciadores de capilares

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM Seqenciadores automticos avano para a genmica,


poucas centenas de pb

Seqenciadores de capilares completamente automatizados

duas vezes mais rpidos,

Associao de capilares preenchidos com gel a um sistema de deteco atravs de fluorescncia confocal excitada por laser

Seqenciamento de DNA

SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM

Seqenciamento de DNA

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Eliminao da montagem da placa e preparao do gel


Aplicao das amostras por eletroinjeo

Alta velocidade e resoluo na separao das amostras

Eliminao do retraqueamento

Seqenciamento de DNA

OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQ Piroseqenciamento Seqenciamento por hibridao Colnias da polimerase Seqenciamento por nanoporos Espectrometria de massa Massively Parallel Signature Seuqencing

Determinao de SNP, reseqenciamento, anlise da expresso gnica


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OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQ


Piroseqenciamento tempo real, seqenciamento por sntese

Mtodo rpido, seqncias menores, genotipagem de SNP, tipagem microbiana, reseqenciamento de genes para doenas e determinao da seqncia de DNA com estruturas secundrias complexas
Seqenciamento de DNA

OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQ


SBH complementariedade de pares de bases da molcula de DNA

(4n=5) = 1024
Seqenciamento de DNA, reseqenciamento de DNA, seqenciamento de novo e anlise da expresso gnica
Seqenciamento de DNA

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OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQ


Colnias da polimerase colnias de DNA de 1 m de dimetro que crescem numa lmina para microscopia
Produo das polnias Denaturao do DNA imobilizado Hibridao de um primer universal Primeira reao de extenso Microscpio de fluorescncia de
varredura

Fluorescncia removida Ciclos sucessivos Seqncia de cada polnia paralelo

Estgio inicial, reduo de custos; genotipagem e haplotipagem


Seqenciamento de DNA

APLICAES APLICA Anlise genmica

Haemophilus influenzae (1995)

Fago phiX174 (Sanger et al., 1977)

Homo sapiens (2003)

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APLICAES APLICA
Estudo sistemtico dos genomas

Avano das tcnicas de seqnciamento

Automao

Equipamentos sofisticados e precisos

Grande quantidade de dados


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APLICAES APLICA Genoma completo: 28 archebactrias, 357 bactrias e 22 eucariotos

Seqenciamento de DNA

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APLICAES APLICA

Cincia forense

Anlise filogentica
Seqenciamento de DNA

APLICAES APLICA
Conservao de espcies

Epidemias virais

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APLICAES APLICA

DNA barcoding

Genmica comparada

Descoberta de drogas

Screening gentico

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OBRIGADA!
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