CENTRO UNIVERSITÁRIO SANTO AGOSTINHO – UNIFSA

PRÓ-REITORIA DE ENSINO

DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA GERAL

PROF(a) Dra. DÉBORA ALENCAR

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

TERESINA
2022
 APRESENTAÇÃO DO LABORATÓRIO

OBJETIVOS:
❖ Apresentação do laboratório de microbiologia (atividades e normas).
❖ Equipamentos e materiais utilizáveis nas aulas práticas.
❖ Normas de Biossegurança no laboratório de microbiologia.

LEGISLAÇÃO APLICADA ÀS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS EM

LABORATÓRIOS DE ENSINO E PESQUISA

Lei nº 7.802, de 11.7.89 – Dispõe sobre a pesquisa, a experimentação, a produção, a

embalagem e rotulagem, o transporte, o armazenamento, a comercialização, a propaganda
comercial, a utilização, a importação, a exportação, o destino final dos resíduos e embalagens,
o registro, a classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização de agrotóxicos, seus
componentes e afins, e dá outras providências (www.senado.gov.br/legbras).

Lei Federal Nº 6938/81 - Lei de Política Nacional do Meio Ambiente de 31 de agosto de

1981.

Lei nº 9.605, de 12.2.98 - Dispõe sobre as sansões penais e administrativas derivadas de

condutas e atividades lesivas ao meio ambiente, e dá outras providências
(www.meusite.com.br/cobea/etica.htm.).

Lei nº 9.795, de 27.4.99 - Dispõe sobre a educação ambiental, institui a Política Nacional de
Educação Ambiental e dá outras providências (www.anvisa.gov.br/alimentos/tox/legis/geral).

Portaria nº 451/Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, de 19.9.97 –

Aprova os princípios gerais para estabelecimento de “Critérios e Padrões Microbiológicos
para Alimentos” (www.anvisa.gov.br/legis//portarias).
 SUMÁRIO

1 ATIVIDADES BÁSICAS......................................................................................................7

2 NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA........................7

3 BIOSSEGURANÇA...............................................................................................................8

4 UTILIZAÇÃO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.................................................14

5 MÉTODOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO..........................15

6 MEIOS DE CULTURA.......................................................................................................23

7 TÉCNICAS DE COLETA E SEMEIO DE AMOSTRAS PARA CULTIVO................29

8 TÉCNICAS DE SEMEADURA..........................................................................................30

9 TIPOS DE COLORAÇÃO..................................................................................................32

10 TÉCNICA DE COLORAÇÃO SIMPLES.......................................................................33

11 COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM..................................................................34

12 COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE ZIEHL NEELSEN (BAAR).............................35

13 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE STREPTOCOCCUS...................................36

14 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS................................39

15 MICRORGANISMOS DO AR E AMBIENTE...............................................................41

16 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS..................................................44

17 TIPAGEM SANGUÍNEA /SISTEMA ABO ..................................................................48

REFERÊNCIAS.................................................................................................................51
1
ATIVIDADES BÁSICAS

As atividades básicas de um laboratório de Microbiologia consistem em:

❖ Elaborar e viabilizar normas para coleta, conservação e transporte de material de interesse

clínico;
❖ Estabelecer e executar rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos
vigentes, que permitam o isolamento e identificação dos principais agentes infecciosos de
importância clínica;
❖ Determinar a sensibilidade aos antimicrobianos;
❖ Efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos de esterilização;
❖ Divulgar e pôr em prática normas de biossegurança.

2
NORMAS ADOTADAS NO LABORATÓRIO DE
MICROBIOLOGIA

❖ Os alunos somente poderão assistir ou participar dos experimentos práticos

protegidos com avental apropriado (uso obrigatório, longo com manga no mínimo ¾), pessoas
com cabelos compridos devem prendê-los;
❖ Deve-se manter sobre a bancada de trabalho apenas o material que será utilizado na
execução da prática;
❖ Os objetos pessoais, exceto aqueles utilizados em experimento da prática, devem ser
colocados no armário fora do laboratório ou em local apropriado onde se vai conduzir a
prática;
❖ O laboratório deve ser um recinto calmo. Os alunos devem ocupar sempre os mesmos
lugares indicados pelo professor, evitando falar em voz alta e de sair desnecessariamente de
seus lugares para minimizar a ocorrência de acidentes;
❖ Os alunos devem, de preferência, ocupar um lugar específico na bancada e mantê-lo fixo
por todo o curso;
❖ Em caso de acidente ou contaminação, comunicar imediatamente ao professor;
❖ Os materiais devem ser colocados nos suportes e nunca abandonados sobre a bancada;
❖ Pipetas, lâminas, lamínulas e outros materiais contaminados devem ser colocados em
recipientes apropriados, com solução desinfetante;
❖ Todo experimento deve ser efetuado com o máximo de cuidado e atenção;
❖ Não é permitido fumar, beber ou comer no laboratório;
❖ Ler atenciosamente o roteiro de prática antes de iniciar o trabalho experimental;
❖ As culturas semeadas devem ser devidamente identificadas antes de incubá-las na estufa;
❖ Ao final da aula prática envolvendo culturas microbianas, lavar as mãos com sabão
líquido contendo anti-sépticos e enxugar com papel toalha.

3
BIOSSEGURANÇA

Biossegurança, que significa Vida + Segurança, em sentido amplo é

conceituada como a vida livre de perigos. É um conjunto de medidas necessárias para a
manipulação adequada de agentes biológicos, químicos, genéticos e físicos (elementos
radioativos, eletricidade, equipamentos quentes ou de pressão, instrumentos de corte ou
pontiagudos, vidrarias, dentre outros) para prevenir a ocorrência de acidentes e
consequentemente reduzir os riscos inerentes às atividades desenvolvidas, bem como proteger
a comunidade e o ambiente e os experimentos.
A limpeza das áreas do laboratório (bancadas, pisos, equipamentos, instrumentos e
demais superfícies) deve ser realizada regular e imediatamente após o término de uma
atividade. Essa tarefa é essencial para reduzir os riscos de contaminação acidental.
A rotina do laboratório de microbiologia envolve riscos relacionados à exposição,
tanto com material clínico, reagentes químicos, como com potenciais agentes patogênicos
concentrados em meio de cultura. A adoção e prática de normas de biossegurança e uso de
equipamentos afins são considerados imprescindíveis.

A) Técnicas para uso das pipetas:

➢ São utilizadas para diluições, inoculações, distribuições de meio, etc. Em

microbiologia estas pipetas devem ser esterilizadas com uma porção de algodão hidrófobo na
parte superior.
Observações:
❖ É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico ou de suspensões
bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que possível, pipetas automáticas ou bulhos de
borracha;
❖ Os líquidos não devem ser eliminados das pipetas à força;
❖ A superfície da bancada deve ser coberta por pano ou papel absorvente embebido em
desinfetante, com o objetivo de evitar a dispersão do material infeccioso;
❖ As pipetas de vidro e as ponteiras contaminadas devem ser mergulhadas por completo
em um recipiente inquebrável contendo solução desinfetante, por tempo não inferior a
12 (doze) horas.

B) Técnicas destinadas a evitar a dispersão de micro-organismos

infecciosos:
❖ A alça bacteriológica deve formar sempre um círculo completo fechado;
❖ Evitar o risco de formação de salpicos, a qual ocorre quando material infeccioso é
colocado na chapa do bico de Bunsen;
❖ As amostras descartadas e as culturas a serem eliminadas devem ser colocadas em
recipientes à prova de vazamento;
❖ As superfícies das mesas de trabalho devem ser desinfetadas no final do experimento
com solução desinfetante apropriada.

C) Procedimentos em situações de Emergência

❖ Derramamento de material biológico: no caso de acidente ou derramamento de
produto biológico, deve-se evacuar o local se houver a possibilidade de formação de
aerossóis. Após 30 minutos, conter o produto derramado com material com boa
capacidade de absorção; aplicar um desinfetante no local do derramamento por tempo
previamente definido e, em seguida, limpá-lo adequadamente;
❖ Quebra de frascos com material biológico: os recipientes quebrados devem ser
cobertos com um pano embebido em desinfetante. Após 10 minutos, no mínimo,
devem-se recolher os pedaços quebrados e o pano com uma pá e esfregar o chão com
um desinfetante;
❖ Inoculação acidental, cortes e lesões: deve-se retirar a roupa de proteção, lavar as
mãos e a parte lesada, aplicar um desinfetante cutâneo e dirigir-se ao serviço de saúde,
onde informará ao médico sobre a causa da lesão e sobre o agente envolvido;
 ❖ Derramamento de produtos químicos: a área do acidente deve ser imediatamente
isolada e o professor ou o técnico comunicado. A contenção deve ser realizada o mais
rápido possível, empregando-se materiais absorventes ou areia seca;
❖ Quebra de tubos durante a centrifugação: interromper a operação e manter a
centrífuga fechada por pelo menos 30 minutos. Remover e descartar os fragmentos de
vidro em condições de seguras. Descontaminar a centrífuga, o rotor e as caçapas com
desinfetante adequado.

3.1 HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS

As mãos são consideradas ferramentas principais dos profissionais de saúde. Assim a
segurança do paciente nos serviços depende da higienização cuidadosa e frequente das mãos
dos profissionais.

PARA QUE HIGIENIZAR AS MÃOS

❖ Remoção de sujidade, suor, oleosidade, pêlos, células descamativas e da microbiota da

pele, interrompendo a transmissão de infecções veiculadas ao contato;
❖ Prevenção e redução das infecções causadas pelas transmissões cruzadas.
A eficácia da higienização das mãos depende da duração e da técnica empregada.

IMPORTANTE
Antes de iniciar a higienização das mãos, é necessário
retirar joias (anéis, pulseiras, relógio), pois sob tais objetos podem
acumular-se microrganismos. Estas podem ser recolocadas após
higienização das mesmas.

❖ Fazendo-se ou não uso de luvas, lavar as mãos sempre que houver mudança de
atividade e na saída do laboratório. A lavagem deve envolver mãos e antebraços,
usando-se água e sabão líquido;
❖ O tempo de lavagem das mãos é importante, não só pela ação mecânica, mas também
para obter o efeito desejado pela ação do anti-séptico.

PROCEDIMENTO (40 a 60 segundos)

 ❖ No caso de torneiras com contato manual para fechamento, sempre utilize papel-
toalha;
❖ O uso coletivo de toalhas de tecido é contra-indicado, pois estas permanecem úmidas,
favorecendo a proliferação bacteriana;
❖ Deve-se evitar água muito quente ou muito fria na higienização das mãos, a fim de
prevenir o ressecamento da pele.

INDICAÇÕES

❖ Sempre que entrar ou sair do laboratório de microbiologia;

❖ Sempre que estiverem sujas;
❖ Após contato com fonte de micro-organismos;
❖ No preparo de materiais ou equipamentos.

PASSO A PASSO

I. Abrir a torneira e molhar as mãos, evitando encostar-se à pia;

II. Aplicar na palma da mão quantidade suficiente de sabão líquido para cobrir todas as
superfícies das mãos;
III. Ensaboar as palmas das mãos, friccionando-as entre si;
IV. Esfregar a palma da mão direita contra o dorso da mão esquerda entrelaçando os dedos
e vice-versa;
V. Entrelaçar os dedos e friccionar os espaços interdigitais;
VI. Esfregar o dorso dos dedos de uma mão com a palma da mão oposta, segurando os
dedos, com movimento de vai-e-vem e vice-versa;
VII. Esfregar o polegar direito, com o auxílio da palma da mão esquerda, utilizando-se
movimento circular e vice-versa;
VIII. Friccionar as polpas digitais e unhas da mão esquerda contra a palma da mão direita,
fechada em concha, fazendo movimento circular e vice-versa;
IX. Esfregar o punho esquerdo, com o auxílio da palma da mão direita, utilizando
movimento circular e vice-versa;
X. Enxaguar as mãos, retirando os resíduos de sabão. Evitar contato direto das mãos
ensaboadas com a torneira;
XI. Secar as mãos com papel-toalha descartável, iniciando pelas mãos e seguindo pelos
punhos. Desprezar o papel-toalha na lixeira para resíduos comuns.
 FRICÇÃO ANTISSÉPTICA DAS MÃOS

FINALIDADE
Reduzir a carga microbiana das mãos (não há remoção de sujidades). A utilização de
gel alcoólico a 70% pode substituir a higienização com água e sabão quando as mãos não
estiverem visivelmente sujas.

PROCEDIMENTO (20 a 30 segundos)

❖ Para evitar ressecamento e dermatites, não higienize as mãos com água e sabão
imediatamente antes ou depois de usar uma preparação alcoólica;
❖ Depois de higienizar as mãos com preparação alcoólica, deixe que elas sequem
completamente (sem utilização de papel-toalha).

PASSO A PASSO

I. Aplicar na palma da mão quantidade suficiente do produto para cobrir todas as

superfícies das mãos;
II. Friccionar as palmas das mãos entre si;
III. Friccionar a palma da mão direita contra o dorso da mão esquerda entrelaçando os
dedos e vice-versa;
IV. Friccionar a palma das mãos entre si com os dedos entrelaçados;
V. Friccionar o dorso dos dedos de uma mão com a palma da mão oposta, segurando os
dedos e vice-versa;
VI. Friccionar o polegar esquerdo, com o auxílio da palma da mão direita, utilizando-se
movimento circular e vice-versa;
VII. Friccionar as polpas digitais e unhas da mão direita contra a palma da mão esquerda,
fazendo um movimento circular e vice-versa;
VIII. Friccionar os punhos com movimentos circulares;
IX. Friccionar até secar. Não utilizar papel-toalha.
PASSO A PASSO DA LAVAGEM DAS MÃOS
4
UTILIZAÇÃO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de micro-

organismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que
torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia
deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É
importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o
processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem
ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser
utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a
combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem).

PARA DISCUTIR
Exercício I

1. Quais as primeiras atitudes que o aluno deve tomar ao entrar no laboratório de microbiologia?

2. Dentre os equipamentos e vidrarias citados abaixo, quais serão utilizados cotidianamente nas aulas de
microbiologia.
( ) pipeta ( ) estufa
( ) destilador ( ) capela
( ) placa de petri ( ) tubo de ensaio
( ) Becker ( ) balão de fundo chato
( ) bico de Bunsen ( ) vidro de relógio
( ) autoclave ( ) destilador
( ) microscópio ( ) balança
( ) banho maria ( ) pinça

03. Que funções possuem os materiais que você assinalou acima?

04. Você está fazendo uma semeadura de bactérias na lâmina de vidro a partir de uma cultura feita em agar
na placa de petri, de repente alguém tirou a sua concentração e você derrubou e quebrou a toda a placa, o que
fazer nesse momento?

05. Por que é importante fazer uso da chama do bico de bunsen durante as práticas de microbiologia que
usam culturas de bactérias?

06. Como utilizar o bico de bunsen?

07. Qual a importância de ler atenciosamente o roteiro da aula prática antes de iniciar o trabalho
experimental?

08. Qual a importância da identificação das culturas antes de serem incubadas na estufa?

09. Quem é o responsável pela sua segurança no laboratório?

5
MÉTODOS DE CONTROLE DO CRESCIMENTO
MICROBIANO

5.1 ESTERILIZAÇÃO
É o processo que promove completa eliminação ou destruição de todas as formas de
micro-organismos presentes: vírus, bactérias, fungos, protozoários, esporos, para um aceitável
nível de segurança. O processo de esterilização pode ser físico, químico, físico-químico.
MÉTODOS DE
ALTERNATIVAS
ESTERILIZAÇÃO
Vapor saturado/autoclaves;
Métodos físicos Calor seco;
Raios Gama/Cobalto.
Glutaraldeído;
Métodos químicos Formaldeído;
Ácido peracético.
Esterilizadoras a Óxido de Etileno (ETO);
Plasma de Peróxido de Hidrogênio;
Plasma de gases (vapor de ácido peracético e
Métodos físico-químicos
peróxido de hidrogênio; oxigênio, hidrogênio e
gás argonio);
Vapor de Formaldeído.

A esterilização é o processo que inativa todos os micro-organismos presentes em

determinado material ou ambiente, portanto é o método indicado para uso em itens que de
forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminação, classificados
como “críticos”, ou seja, aqueles que durante o procedimento penetrarão em pele e mucosa,
ou serão introduzidos diretamente na corrente sanguínea, sendo portanto de alto risco.
A melhor maneira de garantirmos a destruição de micro-organismos presentes em
instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. As maiorias dos micro-organismos
que causam infecções em seres humanos desenvolvem-se em temperaturas próximas a do
corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que não
acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o micro-
organismo fica apenas inibido, e não é destruído.
Alguns micro-organismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo
permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infectividade.
Portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os
esporos. Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Mas
definitivamente os métodos de esterilização mais empregados são os que utilizam o calor, seja
este úmido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do
calor úmido (autoclave) é melhor.

5.1.1 Esterilização por Calor Seco (Estufa ou Forno de Pasteur)

Este tipo de esterilização é realizado a

temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de
exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas
equipadas com termostatos. O calor seco ou ar
quente em temperatura suficientemente alta levam
a desnaturação e oxidação das proteínas, que
resultam na morte dos micro-organismos.
A utilização do calor seco leva mais
tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no
calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de
corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais
impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.
Para ser eficiente, este processo depende de:
❖ Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do material;
❖ Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados;
❖ A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode
estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre as caixas;
❖ O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na
estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.

5.1.2 Esterilização por Calor Úmido

O calor úmido pode ser utilizado para destruir micro-organismos presentes em
materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu
ponto de ebulição.

Água fervente
É a água levada a ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os micro-
organismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos
contaminados não são esterilizados com segurança pois alguns esporos bacterianos podem
resistir a 100ºC por mais de 1 hora.

Vapor d’água
O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O
aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir
os micro-organismos e os esporos, que o calor seco.
A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A
penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos micro-organismos, e
por este motivo é mais rápido.

Funcionamento da autoclave
A autoclave é um aparelho muito utilizado em laboratórios de pesquisas e hospitais
para a esterilização de materiais. O processo de autoclavagem consiste em manter o material
contaminado em contato com um vapor de água em temperatura elevada, por um período de
tempo suficiente para matar todos os micro-organismos.

OBSERVAÇÕES

a) A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente

para remover todo o ar;
b) É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada
temperatura e pressão por um período específico de tempo. É
essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja
completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver
presente reduzirá a temperatura interna da autoclave;
c) A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol² , na
qual a temperatura do vapor é de 121ºC.

A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores:

❖ Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados;

❖ O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é
atingida;
❖ A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja
todo o material por igual;
 ❖ Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser
novamente esterilizado.

Controle da Esterilização

É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se

trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia,
conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for
negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente.
O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os
métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a
temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada
Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do
processo. Este controle deve fazer parte da rotina do laboratório para garantir a saúde de
pacientes e isolamento correto dos microorganismos, como também biossegurança
ocupacional.

Considerações importantes

❖ É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita dos instrumentais antes de
serem submetidos à esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus,
sangue, e outras secreções) protege o micro-organismo da ação esterilizante. É
adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e água morna antes da
esterilização;
❖ Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens
apropriadas, caso contrário, voltam a se recontaminar com micro-organismos
presentes no ambiente;
❖ Estudos recentes mostraram que os termômetros e termostatos embutidos nas estufas
em laboratórios não são confiáveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados
termômetros calibrados de acordo com as especificações do INMETRO. Se não for
possível, deve-se considerar que o termômetro de mercúrio tem uma incerteza na
medição da faixa de 5ºC a 10ºC;
❖ Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo, através de
profissionais preparados para tal procedimento.
5.2 DESINFECÇÃO
Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química
(Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário
ou de baixo nível, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados.

5.2.1 Desinfecção de alto nível

Inativa todos os micro-organismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis.
Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como “semi-críticos”, ou seja, que
entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra.

Glutaraldeído

É indicado qualquer objeto sensível ao

calor, e para rápida desinfecção de itens
reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH
alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.

Formaldeído

Pode ser encontrado na forma sólida

(pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-
40% (diluído em álcool ou água). A solução deve
ser usada por30 minutos sendo a concentração de
8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa.

Peróxido de Hidrogênio

Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em

solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.

Ácido Peracético

A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de

exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.
5.2.2 Desinfecção de nível intermediário

É aquela que inativa bactérias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a

maioria dos vírus. É indicada para uso em itens classificados como “não-críticos”, ou seja,
aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra. (p. ex. estetoscópios,
termômetros, gorro, máscara, refletor, etc.).

Compostos Clorados
Causa a inibição de reações enzimáticas intracelulares, desnaturação de proteínas, e
inativação de ácidos nucléicos. Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem
baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas,
fotossensível e volátil, além de ser corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de
vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma
líquida (ex: Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de
exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos.

Álcoois (Etílicos e Isopropílicos)

Seu mecanismo de ação é através da desnaturação de proteínas. São usados em
concentração de 70% peso por 10 minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas
substâncias é contra-indicado para materiais médico-cirúrgicos, borracha, plásticos e acrílico.

Fenólicos
Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular, precipitando
proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos sistemas enzimáticos
fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua concentração para uso é de 0,4-
5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso é
indicado para descontaminação de ambiente hospitalar, itens cirúrgicos e médicos não-
críticos, sendo que devem ser consideradas as limitações devido a toxicidade
(hiperbilirrubinemia – crianças – berçários), e ação residual em materiais porosos.

Iodóforos
Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular, levando a
ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou
igual a 10 minutos.
5.2.3 Desinfecção de baixo nível

Inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns

fungos e vírus. É indicada também para itens de uso “não-crítico”. Utiliza-se:

❖ Álcoois;
❖ Compostos Clorados;
❖ Fenólicos: em concentração menor que 5%;
❖ Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm;
❖ Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas,
desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentração
para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É indicado para a
limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies);
❖ Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e
emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de
Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e
Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e
lípases, e,portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras
(ex: Endozime®).

5.2.4 Desinfecção por agentes físicos

Pasteurização
É o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células
vegetativas de micro-organismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção
de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos. Temperaturas abaixo
de seu ponto de ebulição (100º C)

Água em ebulição ou fervura

É utilizada para desinfecção de alto nível em artigos termorresistentes. Consiste em
imergir totalmente o material em água fervente, com tempo de exposição de 30 minutos, após
o que o material é retirado com o auxílio de pinça desinfetada e luvas de amianto de cano
longo. Em seguida, deve ser seco e guardado em recipiente limpo ou desinfetado – ressalve-se
que esse procedimento é indicado apenas nas situações em que não se disponha de outros
métodos físicos ou químicos.

5.2.5 Desinfecção por agentes químicos

A desinfecção por processo químico é feita por meio de imersão em soluções germicidas.
Para garantir a eficácia da ação faz-se necessário:

❖ O artigo esteja bem limpo, pois a presença de matéria orgânica reduz ou inativa a ação
do desinfetante;
❖ Esteja seco, para não alterar a concentração do desinfetante;
❖ Esteja totalmente imerso na solução, sem a presença de bolhas de ar;
❖ Tempo de exposição recomendado seja respeitado; que durante o processo o recipiente
seja mantido tampado e o produto esteja dentro do prazo de validade.

5.3 ASSEPSIA
Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície
ou local.

5.4 ANTI-SEPSIA
Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas.

5.5 LIMPEZA
Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de
desinfecção ou esterilização.

PARA DISCUTIR
Exercício II

01. Ao terminar uma prática de microbiologia utilizando culturas de bactéria o material deverá ser descartado
e a vidraria deverá passar por:
( ) assepsia
( ) desinfecção
( ) esterilização
( ) limpeza com água e detergente

02. Antes de iniciar a prática, as bancadas deverão passar por uma:

( ) assepsia
( ) desinfecção
( ) esterilização
( ) limpeza com água e detergente

03. Quais os tipos de esterilização pelo calor úmido?

04. Onde geralmente é feita a esterilização por calor seco? Em que situação pode ser utilizada?
 05. Para que o processo de esterilização seja perfeito alguns cuidados devem ser tomados antes, durante e
após o processo. Cite estes cuidados básicos.

06. Estabeleça diferença entre a desinfecção de alto, intermediário e baixo nível.

07. Quais os principais métodos de desinfecção por agentes físicos e químicos?

08. O equipamento de autoclave é importante no laboratório de microbiologia? Justifique

6
MEIOS DE CULTURA

O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura

utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante
conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano
esperado para cada material.

6.1 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS EM MICROBIOLOGIA

❖ Agar-ágar, extratos e peptonas;

❖ Meios de cultura desidratado;
❖ Preparações e distribuições assépticas de caldo simples, ágar-sangue e ágar-chocolate.

6.2 OBJETIVOS

❖ Demonstrar a importância dos fatores relacionados ao desenvolvimento de micro-

organismos nos meios de cultura;
❖ Treinamento das técnicas de preparações de volumes determinados de meios de
cultura a partir de suas respectivas fórmulas gerais.

A maioria das bactérias podem ser cultivada em laboratório, utilizando-se meios

nutrientes. No entanto, diferentes espécies de bactérias, variam extensivamente quanto às
exigências mínimas de substâncias nutrientes. Os termos autotrófico e heterotrófico são
usados para descreverem as diferentes necessidades nutricionais de dois grandes grupos de
bactéria. As bactérias autotróficas podem ser cultivadas em soluções simples que contém,
basicamente, uma fonte de carbono (carbonato), considerando-se que esse tipo de bactéria
sintetiza os nutrientes necessários ao seu crescimento, a partir de substâncias inorgânicas
simples. Em contraposição, os organismos heterotróficos requerem componentes orgânicos
mais complexos, tais como: aminoácidos, carboidratos e fatores de crescimento, que o micro-
organismo, geralmente, não tem capacidade de sintetizar, e, assim, devem ser adicionados à
composição dos meios de cultura.
De uma maneira simplificada, pode-se definir meio de cultura como um conjunto de
substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de promover o crescimento bacteriano,
em condições de laboratório.

6.3 CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DOS MEIOS DE CULTURA

a) Fonte de carbono e nitrogênio – a partir dessa fonte, a bactéria pode sintetizar

compostos orgânicos;
b) Fonte de energia – geralmente é uma substância que, após oxidação ou fermentação,
fornece a energia que é utilizada para atividades biossintéticas, sendo armazenada sob
a forma de ATP;
c) Sais minerais – são requeridos em quantidades mínimas e, normalmente, existem na
própria água utilizada no preparo do meio de cultura;
d) Fatores de crescimento – são substâncias complexas indispensáveis que alguns
organismos heterotróficos não conseguem sintetizar, devendo ser adicionadas ao meio
básico;
e) Condições físicas – pH, osmolaridade, umidade, aeração e temperatura;
f) Esterilização – é essencial que o meio de cultura esteja estéril antes de sua utilização.
O método de esterilização utilizado deve ser selecionado de modo que os nutrientes do
meio de cultura não sejam destruídos ou alterados.

6.4 CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

De acordo com seu conteúdo químico, os meios de cultura podem ser

sintéticos, com composição química definida, ou complexos, cujos componentes são
primariamente extratos ou infusões de tecidos e de substâncias de origem biológica, tais
como: peptona, triptona, extrato de carne, extrato de leveduras, variando-se essa composição
ou adicionando-se outros elementos, de acordo com a finalidade.

6.4.1 Consistência
Relacionada com o estado físico, considerando-se o teor de ágar:
 ❖ Líquidos ou caldos - Não contém ágar. Ex.: caldo simples;
❖ Fluidos – porcentagem de agar  0,1%. Ex.: meio tioglicolato;
❖ Semi-sólido – teor de ágar de 0,3 - 0,5%. Ex.: meio de SIM. Esse meio contém
pequena concentração de agente solidificante, sendo, portanto, classificados como
semi-sólidos. São acondicionados em tubos de ensaio e também são empregados para
realização de provas bioquímicas para observar a motilidade bacteriana ou para
conservação de culturas;
❖ Solidificados – são meios de cultura que apesar de sólidos podem ser liquefeitos.
Contém de 1,5 – 2% de ágar. Ex.: ágar-sangue e ágar-simples;
❖ Sólidos – são aqueles que embora não contendo agar, apresentam-se naturalmente no
estado sólido. Ex.: fatias de batata ou frutas usadas ocasionalmente para cultivo
especial de bactérias ou fungos.

6.4.2 Procedência
De acordo com a origem os meios podem ser:
❖ Naturais – não sofrem alterações na sua composição. Ex.: batata, cenoura, leite, suco
de laranja;
❖ Artificiais – são os meios preparados pela mistura de diversos componentes. Ex.:
ágar-simples, ágar-sangue, ágar-chocolate ...

6.4.3 Composição
De acordo com os componentes da fórmula do meio de cultura eles podem ser:
❖ Simples – destinados ao cultivo de micro-organismos pouco exigentes ou servem de
base para outros meios de cultura. Ex.: solução aquosa de sais minerais, água
peptonada, caldo simples;
❖ Enriquecidos – meios de composição simples, adicionados de substâncias que
melhoram o seu valor nutritivo. Ex.: ágar-sangue, ágar-chocolate.

6.4.4 Finalidades
Refere-se às suas aplicações no laboratório de microbiologia:

❖ Meio de enriquecimento – é, geralmente, líquido, de composição química rica em

nutrientes, com a finalidade de permitir que as bactérias contidas em uma amostra
clínica aumentem em número. Um caldo de enriquecimento pode também possuir
 propriedades seletivas, conferidas por substâncias que inibam o desenvolvimento das
espécies sem importância clínica e favoreçam o crescimento de micro-organismos.
Ex.: Caldo BHI e Caldo Tetrationato;
❖ Meio de transporte – consiste em um meio isento de nutrientes, contendo um agente
redutor (tioglicolato ou cisteína) e uma substância com poder de tamponamento
(fosfatos). Geralmente mantém um pH favorável, previne a desidratação de secreções
durante o transporte e evita a oxidação e a auto-destruição enzimática dos micro-
organismos presentes. Ex.: Meio de Stuart, Cary-Blair e Caldo Tioglicolato;
❖ Meio seletivo – a finalidade desse tipo de meio é selecionar as espécies que se deseja
isolar e impedir o desenvolvimento de outros micro-organismos. Isso é conseguido
geralmente pela adição de componentes químicos específicos, como corantes,
antimicrobianos ou outras substâncias com capacidade inibitória para alguns micro-
organismos. Ex.: Agar-manitol-salgado, agar SS e Meio de Wilson-Blair;
❖ Meio diferencial – possibilita a distinção entre vários gêneros e espécies de micro-
organismos, por possuir, em sua composição, substâncias que permitem uma
diferenciação presuntiva, evidenciada na mudança de coloração ou na morfologia das
colônias. A maioria dos meios diferenciais é também seletiva, possuindo, desse modo,
vários tipos de agentes inibidores de crecimento. Ex.: EMB, Agar McConkey;
❖ Meio indicador – é utilizado no estudo das propriedades bioquímicas das bactérias,
auxiliando, assim, sua identificação. O tipo mais simples de meio indicador é aquele
usado no estudo de reações de fermentação ou na utilização de certos compostos.
Incorporam-se ao meio básico um carboidrato e uma substância indicadora. A partir da
mudança de coloração, detecta-se a positividade da reação pela produção de
compostos finais de pH definido. Ex.: TSI e Agar citrato de Simmons.

6.5 MATERIAL UTILIZADO

❖ Extrato de carne;
❖ Peptona;
❖ Cloreto de sódio;
❖ Agar;
❖ Água destilada;
❖ Espátulas;
❖ Papel impermeável para pesagem;
 ❖ Balão de fundo chato;
❖ Erlenmeyer;
❖ Provetas;
❖ Bastão de vidro;
❖ Solução de NaOH 20%;
❖ Papel indicador de pH.

6.6 CALDO SIMPLES

Pesar os seguintes ingredientes e misturar em balão de fundo chato:

❖ Extrato de carne...........................................4 g
❖ Peptona.......................................................10 g
❖ Cloreto de sódio...........................................5 g
❖ Água destilada.............................................1000 mL

6.6.1 Técnica de Preparo

❖ Ferver até dissolver todos os ingredientes em placa aquecedora;
❖ Esfriar e corrigir o pH com solução de NaOH (20 %) para 7,4 a 7,6;
❖ Filtrar em papel de filtro com auxílio de funil para balão de fundo chato;
❖ Com auxílio de pipeta distribuir em tubos de 5 mL.

6.7 AGAR-SIMPLES

❖ Acrescenta-se 30g de Agar-agar a cada 1000 mL de caldo;

❖ Em seguida autoclavamos por 15 minutos a 121 oC;
❖ Distribuir assepticamente em placas de Petri ou em tubos de ensaio previamente
estéreis (Agar-simples inclinado).

6.8 AGAR-SANGUE

❖ Acrescenta-se 5 % de sangue desfribinado de coelho, carneiro ou cavalo;

❖ O sangue deve ser adicionado após o Agar-simples ter sido esterilizado em autoclave e
resfriado a uma temperatura em torno de 45-48 oC;
❖ Observar se o sangue se distribui uniformemente por toda a base do Agar;
 ❖ Aguardar a solidificação do meio.

6.9 AGAR-CHOCOLATE

O Agar-chocolate é preparado do mesmo modo que o Agar-sangue. A diferença é

O
que o sangue deverá ser adicionado ao Agar-simples a uma temperatura de 80 C, após
esterilizado. Na temperatura de 80 oC, as hemácias são lisadas e a hemoglobina transformada
em hematina dando uma cor achocolatada ao meio.

6.9.1 Precauções no Preparo

O fato do sangue de carneiro ser um substrato rico, com alto potencial de
contaminação, torna o preparo do ágar sangue e do ágar chocolate em placas bastante
suscetível à contaminação. Passos como autoclavação da base, adição do sangue à base,
distribuição do meio nas placas e o uso de fluxo laminar são etapas críticas que devem ser
rigorosamente acompanhadas e validadas pelo profissional responsável pelo setor de
Microbiologia.
Dentre as causas mais comuns de contaminação destes meios incluem-se a falta de
cuidados e posterior contaminação com bactérias da microbiota (p.ex.: Estafilococos) do
responsável pelo preparo do meio; a contaminação com bactérias do ar (p.ex.: Bacillus) e
ainda a presença de ar residual na autoclave levando a um processo de esterilização
insatisfatório.

PARA DISCUTIR
Exercício III

01. O que são meios de cultura?

02. Por que é importante se fazer cultura de bactérias?

03. Quanto a consistência quais os tipos de meio de cultura?

04. Quais são os requisitos básicos que devem existir em um meio de cultura para que as bactérias possam
crescer?

05. Quanto a procedência quais os tipos de meio de cultura?

06. Você deseja isolar um grupo de bactérias, portanto deve impedir o desenvolvimento de outras. Que tipo
de meio deve utilizar, como conseguirá isso, dê exemplo desse tipo de meio.

07. Quando utilizar meios de cultura simples e enriquecidos?

08. Estabeleça diferença entre agar simples, agar-sangue e agar-chocolate.

7
TÉCNICAS DE COLETA E SEMEIO DE AMOSTRAS PARA
CULTIVO

7.1 OBJETIVOS
❖ Treinar a semeadura (repique) bacteriana a partir dos meios de cultura
sólidos;
❖ Observar os cuidados básicos com coleta, transporte e armazenamento
de amostras para cultivo;
❖ Demonstrar o isolamento de bactérias em cultura pura.

Todo o ambiente está contaminado por diversos tipos de micro-organismos. Portanto,

torna-se indispensável tomarmos alguns cuidados e medidas de assepsia durante a
manipulação de culturas microbianas.
A área de trabalho deve ser desinfetada com álcool iodado antes e após a realização
da prática. Antes do início das atividades práticas o operador deverá lavar as mãos com água e
sabão e depois desinfetá-las. O cuidado na manipulação do material microbiológico para
evitar contaminação com micro-organismos do meio ambiente é essencial, pois o isolamento
de um micro-organismo consiste na obtenção de sua cultura pura. Para isso, devemos observar
os seguintes itens:
a) Antes da retirada do material da placa de Petri ou tubo de ensaio, a alça
ou agulha de platina deve ser flambada no bico Bunsen. Do mesmo modo deverá ser
flambada a parte da alça (cabo do metal) que penetra no tubo;
b) Nunca abrir os tubos de ensaio ou frascos em posição vertical mesmo
na zona estéril do bico de Bunsen;
c) Nunca abrir as placas de Petri totalmente e sempre que abri-las (na
zona estéril), deverão ser fechadas imediatamente;
d) As pipetas devem ser usadas uma só vez e desprezadas dentro de
recipientes contendo soluções desinfetantes;
e) Em caso de ferimento acidental com material, desinfetar imediatamente
o local afetado, não esquecendo de comunicar ao professor que orienta a prática.

7.2 MATERIAL
 ❖ Placas de Agar-sangue;

❖ Placas de Agar-simples;
❖ Swabs;
❖ Alça de platina;
❖ Bico de Bunsen;
❖ Álcool iodado e algodão.

7.3 PROCEDIMENTO (SEMEIO)

❖ Utilizando manobras assépticas, coletar com o auxílio de swabs espécime de vários
locais do corpo, como: ouvido, garganta, nariz, pele ou ambiente;
❖ Flambar a alça de platina, esperar que esfrie, e proceder o repique por esgotamento por
toda a superfície do meio sólido;
❖ Após o semeio levar à estufa a 37oC, por 24 horas;
❖ No dia seguinte, observar as colônias crescidas isoladamente.

8
TÉCNICAS DE SEMEADURA

A escolha da técnica para o cultivo de micro-organismos varia de acordo

com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras
devem ser seguidas nas inoculações:

❖ A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem

ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-
las antes da coleta;
❖ Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen;
❖ Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada
durante o cultivo;
❖ Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o
Ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as
condições de crescimento bacteriano.

8.1 Técnica I (Meio Líquido)

 I. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe
é apresentada;
II. Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de
cultivo e agite a alça.

8.2 Técnica II (Meio semi-sólido)

I. Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é
fornecida;
II. Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-
sólido.

8.3 Técnica III (Meio sólido - Ágar inclinado)

I. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura
bacteriana que lhe é apresentada;
II. Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano
inclinado e suba fazendo estrias na superfície do Ágar.

8.4 Técnica IV (Meio sólido - Placa de Petri – Técnica do Esgotamento)

I. Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na
parte de baixo da placa;
II. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na
cultura bacteriana que lhe é apresentada;
III. Faça estrias em cada divisão, respeitando as
linhas e utilizando da melhor forma possível
toda a superfície da placa.

PARA DISCUTIR
Exercício IV

01. Faça uma descrição do que você observou 48 horas após as placas, com meio de culturas, terem
sido colocadas na estufa. Destaque as fases da curva de crescimento das bactérias.

02. Descreva os tipos de semeaduras mais utilizadas em meio líquido e sólido.

9
TIPOS DE COLORAÇÃO

A coloração é uma etapa fundamental para a identificação de bactérias e

tem a finalidade de facilitar a observação microscópica das células bacterianas,
diferenciando-as de acordo com suas propriedades tintoriais.
Por causa de sua transparência, as bactérias são difíceis de serem observadas em
preparações não coradas, sendo melhor visualizadas quando aplicados nelas corantes
especiais. A coloração das bactérias é possível em virtude da afinidade de certos grupos
ionizáveis do corante com determinados componentes químicos da célula bacteriana. Sendo a
carga elétrica da célula negativa, os corantes básicos, não só se ligam à célula, como também
vão corar seus componentes internos que são, primariamente, proteínas e ácidos nucléicos. As
preparações coradas são feitas em três tempos:

❖ ESFREGAÇO;

❖ FIXAÇÃO;

❖ COLORAÇÃO.

9.1 OBJETIVOS

❖ Observação da morfologia bacteriana;

❖ Observação diferencial da morfologia bacteriana;
❖ Treinamento de preparação de lâminas coradas.

9.2 TIPOS DE COLORAÇÃO

❖ Coloração simples com azul de metileno;
❖ Coloração diferencial de Gram;
❖ Coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR).

9.3 PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO

❖ Desengordurar as lâminas com um algodão embebido em álcool e deixar secar ao ar
livre;
 ❖ Com uma alça de platina usando manobras assépticas colher uma gota do meio e
depositá-la no centro da lâmina;
❖ Com movimentos suaves dispersar a gota de maneira uniforme para que as células
microbianas sejam regularmente distribuídas;
❖ Se o micro-organismo em estudo tiver sido cultivado em meio sólido, a colônia
“pescada” com alça de platina deverá ser emulcionada em uma gota de salina ou água
destilada estéril, depositada anteriormente no centro da lâmina e em seguida proceder
como no item anterior;
❖ Deixar a fina camada assim contida secar ao ar livre.

9.4 FIXAÇÃO DO MATERIAL

❖ Após o esfregaço ter secado ao ar livre deverá ser fixado na chama do bico de Bunsen.
Esta fixação é feita cortando a chama do bico de Bunsen por mais ou menos 3 vezes
com a lâmina, a fim de que o material fique bem aderente à lâmina.

10
TÉCNICA DE COLORAÇÃO SIMPLES

10.1 MATERIAL

❖ Lâminas;
❖ Salina;
❖ Corante;
❖ Bico de Bunsen;
❖ Suspensão de micro-organismos;
❖ Placa de agar-sangue e agar-simples com crescimento bacteriano;
❖ Suporte para coloração de lâminas;
❖ Microscópio ótico.

10.2 SOLUÇÃO DE AZUL DE METILENO

❖ Azul de Metileno......................................0,3g
 ❖ Água destilada..........................................100 mL

10.3 PROCEDIMENTO

❖ Colocar a lâmina previamente fixada sobre o suporte e cobri-la com solução de Azul
de Metileno;
❖ Escorrer e lavar em água corrente;
❖ Secar em papel de filtro.

11
COLORAÇÃO DIFERENCIAL DE GRAM

Esta coloração foi introduzida em 1884 por Christian Gram. É um

método de coloração e que além das características morfológicas, permite
evidenciar determinadas propriedades tintoriais das bactérias indispensáveis à sua
classificação. Através desta coloração as bactérias foram classificadas em dois grupos: Gram-
positivas (que retém os corantes de Gram) e as Gram-negativas (descoram-se quando tratadas
pelo álcool).

11.1 MATERIAL

❖ Lâminas;
❖ Salina;
❖ Corante;
❖ Bico de Bunsen;
❖ Suspensão de micro-organismos;
❖ Placa de agar-sangue e agar-simples com crescimento bacteriano;
❖ Suporte para coloração de lâminas;
❖ Microscópio ótico.

11.2 ESFREGAÇO
O mesmo procedimento feito para Coloração Simples.

11.3 PROCEDIMENTO
 ❖ Colocar a lâmina previamente fixada sobre o suporte e cobri-la com solução de
VIOLETA durante 1 minuto;
❖ Escorrer e lavar com água corrente;
❖ Cobrir com solução de LUGOL por 1 minuto;
❖ Escorrer e descorar com ÁLCOOL-ACETONA por aproximadamente 20 segundos;
❖ Lavar rapidamente com água;
❖ Escorrer o excesso de água e cobri-la com FUCSINA por 30 segundos;
❖ Escorrer, lavar com água corrente, secar ao ar ou com papel filtro.

12
COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN
(BAAR)

12.1 MATERIAL
❖ Lâmina com esfregaço de escarro de paciente;
❖ Suporte de Coloração;
❖ Swabs de algodão para aquecimento das lâminas;
❖ Papel de filtro para secagem das lâminas coradas.

12.2 PROCEDIMENTO
❖ Colocar sobre o suporte de coloração a lâmina com material, previamente fixada;
❖ Cobrir toda a lâmina com solução de FUCSINA;
❖ Aquecer a preparação com auxílio de um chumaço de algodão embebido em álcool até
e emissão de vapores, por 3 vezes consecutivas;
❖ Lavar com água corrente;
❖ Escorrer e descorar totalmente com ÁLCOOL-ÁCIDO;
❖ Lavar imediatamente com água corrente e contracorar com solução de AZUL DE
METILENO;
❖ Lavar com água corrente, secar ao ar ou com papel de filtro.
 Observação
Os bacilos álcool-ácido resistentes coram-se de
VERMELHO. Outras bactérias, células, resíduos celulares e muco
coram-se de AZUL.

PARA DISCUTIR
Exercício V

01. Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia bacteriana
e a reação tintorial.

02. Descreva a técnica de Gram.

03. É importante fazer coloração? Justifique

13
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
STREPTOCOCCUS

Com base em estudos de hibridação DNA-RNA ribossômico, os

micro-organismos anteriorrmente incluídos no gênero Streptococcus foram sub-divididos em
3 gêneros: Streptococcus, Enterococcus e Lactococcus. Os Streptococcus (crescimento a 25 a
37oC) no sentido amplo, abrange a maioria das diferentes espécies, incluindo estreptococcos
piogênicos, estreptococos do grupo D (não enterococos, estreptococos viridans e
pneumococos). O gênero Enterococcus inclui os antigos enterococos do grupo D (10 a 45oC),
e o gênero Lactococcus (10 a 30oC), também conhecidos como estreptococos do ácido lático,
inclui os estreptococos que possuem antigeno N (Lancefield).
Os estreptococos apresentam-se como cocos Gram positivos, catalase negativa,
anaeróbios facultativos (alguns crescem melhor em anaerobiose e aumento de CO2),
agrupando-se em cadeias de tamanho variável. Podem ser divididos em categorias hemolíticas
(α, β ou γ) ou segundo as características antigênicas de um polissacarídeo (carboidrato C)
localizado na parede celular. Este pode ser detectado por técnicas imunológicas sendo
divididos, dessa forma, em 20 grupos sorológicos designados por letras (grupo de Lancefield).

13.1 MATERIAL

❖ Placas de Ágar sangue e tubos para provas de bile esculina e NaCl 6,5%;
❖ Água oxigenada;
 ❖ Discos de antibióticos;
❖ Material para coloração de Gram.

13.2 PROCEDIMENTO

❖ Coletar as secreções assepticamente;

❖ Semear em placas com Ágar sangue e após incubação de 24 horas a 37ºC, as colônias
suspeitas serão submetidas às provas bioquímicas e coloração de Gram para
identificação da espécie.

13.2.1 Prova da Catalase

❖ Colocar algumas gotas de água oxigenada sobre a cultura em estudo e verificar a

ocorrência de bolhas.

13.2.2 Sensibilidade a Antimicrobianos

❖ Semear a cultura em meio MH com swab e colocar discos de bacitracina, optoquina e

SXT. Incubar por 48 horas a 37ºC.

13.2.3 Prova CAMP

❖ Fazer uma estria do Estreptococos a ser identificado, no sentido perpendicular a uma

cepa de S. aureus conhecida como produtora de β hemólise. As duas linhas não devem
se tocar. Incubar por 24 horas a 37ºC.

13.2.4 Prova da Bile Esculina

❖ Inocular a cultura em meio inclinado de bile esculina e incubar por 24 horas a 37ºC.

13.2.5 Prova do NaCl

❖ Inocular uma alçada da cultura em estudo no meio de NaCl 6,5% contendo púrpura de
bromocresol. Incubar por 24 horas a 37ºC.
13.3 RESULTADOS

a) Examinar as placas de Ágar sangue e descrever as características das colônias,

verificando-se a ocorrência de hemólise. Descrever as características das células
observadas ao microscópio.
b) Catalase: (+) presença de bolhas / (-) ausência de bolhas.
c) Sensibilidade a antimicrobianos: verificar a ocorrência de halos de inibição ao redor
dos discos de antibióticos.
d) Prova CAMP: a zona de intensificação da lise assume a forma de uma ponta de flecha
na intersecção das duas estrias.
e) Prova da Bile Esculina: a esculina sendo hidrossolúvel difunde-se para o meio e é
positiva quando se observa um enegrecimento difuso do ápice do Ágar.
f) Prova do NaCl: verificar a ocorrência de crescimento da cultura.
g) Determinar a espécie da cultura em estudo, segundo as características do gênero e da
espécie (Tabela III).

CARACTERÍSTICAS PARA A IDENTIFICAÇÃO PRELIMINAR DE

STREPTOCOCCUS E BACTÉRIAS SIMILARES
 PARA DISCUTIR
Exercício VI

01. Pesquisar o modo de ação dos antibióticos novobiocina, bacitracina, optoquima e sulfametoxazol.

02. Discuta os resultados observados nos diferentes testes.

14
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
STAPHYLOCOCCUS

O gênero Staphyloccus, o mais importante da família

Micrococcaceae, é composto de 27 espécies, sendo 24 coagulase negativas.
Morfologicamente apresentam-se como cocos GRAM positivos agrupados em “cachos” (ou
ainda em pares ou cadeias curtas), catalase positivos, sendo esta uma das provas para
diferenciá-los dos Streptococcus.
O Staphylococcus aureus é a única espécie já isolada em humanos. Produtor de
coagulase, sendo esta prova importante para confirmação de sua patogenicidade. Algumas
espécies produzem β hemólise em Ágar sangue. Outras características são utilizadas para sua
identificação como capacidade de fermentar o manitol e produção de DNAse.

14.1 MATERIAL

❖ Placas com Ágar sangue e Ágar manitol ou Vogel-Johnson;

❖ Tubos com BHI;
❖ Água oxigenada, sol. HCI 1N;
❖ Plasma-coagulase;
❖ Material para coloração de GRAM.

14.2 PROCEDIMENTO

❖ Coletar as secreções assepticamente;

❖ Semear as amostras em placas contendo Ágar sangue e incubar por 48 horas a 37ºC.
Colônias típicas serão colhidas e inoculadas em BHI e após crescimento, semeadas em
Ágar manitol, para a realização de provas morfológicas, bioquímicas e sorológicas.
14.2.1 Prova da catalase

❖ Colocar algumas gotas de água oxigenada sobre uma cultura crescida em BHI e
verificar a ocorrência de bolhas.

14.2.2 Sensibilidade a novobiocina

❖ Espalhar a cultura em estudo em meio MH com swab e colocar o disco de

novobiocina. Incubar a 37ºC por 24 horas.

14.2.3 Prova da coagulase

❖ Retirar uma colônia da bactéria em estudo e colocar em tubo com BHI. Incubar a 37ºC
por 18 a 24 horas;
❖ Retirar 0,1 mL dessa cultura e colocar em outro tubo contendo 0,5 mL de plasma-
coagulase;
❖ Agitar levemente e incubar a 37oC em banho-maria e observar durante 4 a 24 horas.

14.2.4 Prova da DNAse

❖ Inocular a cultura em placa com meio acrescido de DNA;

❖ Incubar a 37ºC por 24 horas;
❖ Verter ácido clorídrico 1N sobre a cultura e verificar a ocorrência de halos claros ao
redor das colônias.

14.3 RESULTADOS

a) Ágar manitol - as colônias de Staphylococcus fermentadoras de manitol aparecem

rodeadas de uma zona amarela.
b) Catalase: (+) presença de bolhas / (-) ausência de reação.
c) Sensibilidade a novobiocina: verificar a ocorrência de halos de inibição ao redor do
disco.
d) Coagulase: (+) coagulação do plasma / (-) a suspensão permanece inalterada.
e) DNAse: (+) quando houver um halo claro ao redor da colônia / (-) ausência de halo
claro.
 f) Determinar o gênero e a espécie da cultura em estudo, segundo as características da
tabela abaixo.

CARACTERÍSTICAS DAS ESPÉCIES STAFILOCOCCUS DE INTERESSE MÉDICO

OBSERVAÇÃO
O Ágar manitol diferencia o S. aureus de outros cocos Gram
positivos catalase positivos. O microorganismo cresce e fermenta o manitol
resultando na produção de ácido, o qual causa mudança de cor.

PARA DISCUTIR
Exercício VII

01. Discuta os resultados observados nos diferentes testes.

02. Por que se utilizou o BHI e agar manitol.

15
MICRO-ORGANISMOS DO AR E AMBIENTE

Os microrganismos se encontram praticamente em todos os

ambientes. No ar, água e principalmente no solo. Destes locais podem ser arrastados por
partículas de poeira e aerossóis. Do ar, passam para nossa superfície contaminando ainda a
água e alimentos. Uma vez que as condições que favorecem a sobrevivência e o crescimento
de muitos micro-organismos (nutriente, umidade e temperatura adequada) são as mesmas sob
as quais vivem as populações humanas, é inevitável que vivamos entre grande quantidade de
germes.

15.1 OBJETIVO

❖ Verificar a existência de micro-organismos em diferentes ambientes e superfícies.

15.2 MATERIAL
 ❖ Placas de Petri contendo Nutriente Ágar (NA);
❖ SWAB.

15.3 PROCEDIMENTO

15.3.1 Presença de micro-organismos no ar

❖ Retirar a tampa de placas contendo Nutriente Ágar e Ágar Sabouraud e deixar abertas
no ambiente durante 15 minutos;
❖ Incubar as placas por 3 a 5 dias a 30ºC.

15.3.2 Presença de micro-organismos no laboratório

Utilizando-se de placas contendo Nutriente Ágar, inocular da seguinte maneira:

I. Placa 1 - passar o swab estéril na superfície de qualquer objeto do laboratório e depois

na superfície do Ágar na placa. Tomar cuidado para não ferir o meio de cultura.
II. Placa 2 - tocar a superfície do Ágar em vários pontos com os dedos.
III. Placa 3 – colocar um fio de cabelo sobre a superfície do meio de cultura através do
uso de uma pinça estéril.

Incubar as placas por 3 a 5 dias a 30ºC.

PARA DISCUTIR
Exercício VIII

01. Descreva em termos gerais a aparência dessas colônias (tamanho, textura e cor)

02. Qual a finalidade prática de se conhecer os micro-organismos do ambiente? E do laboratório de

microbiologia?

03. Quais as precauções que devem ser tomadas para controlar os contaminantes do laboratório?

04. Neste experimento, houve influência do meio de cultura no aparecimento de bactérias? Justifique sua
resposta. Pesquise sobre fontes nutricionais requeridas por bactérias.
16
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBIÓTICOS

✓ INTRODUÇÃO

A necessidade de controle in vivo da população microbiana, no tratamento de doenças

infecciosas ampliou a discussão da utilização de agentes físicos, químicos e biológicos,
visando à diminuição ou a eliminação dos microrganismos em ambientes e instrumental
médico/hospitalar. Muitos agentes que poderiam ser utilizados como antissépticos em tecidos
vivos ainda sim eram altamente tóxicos para uma terapia sistêmica. Os conceitos de drogas
antimicrobianas vieram da observação do fenômeno da antibiose exercida pelos
microrganismos e outras espécies de animais e plantas na natureza.

Com a introdução dos antimicrobianos a partir da década de 1940 na terapia humana, a

resistência bacteriana se tronou evidente e surgiu a necessidade de desenvolvimento de
técnicas que pudessem ser aplicadas ao estudo da susceptibilidade bacteriana para avaliação
de risco e eficácia da antibioticoterapia.

A antibiose observada no antibiograma estabelece in vitro o perfil de susceptibilidade dos

microrganismos frente aos diferentes antibióticos de uso comercial. O resultado expressa uma
indicação para se conseguir a terapêutica racional em diferentes processos patológicos
causados por microrganismos. Entretanto, grande parte das bactérias relevantes do ponto de
vista clínico é capaz de responder à pressão seletiva exercida pelo uso contínuo, prolongado,
abusivo e até equivocado de antimicrobianos no sentido da aquisição/expressão de resistência
a estes agentes terapêuticos. Assim, quando um microrganismo é isolado em laboratório, sua
caracterização envolve frequentemente, a avaliação do perfil de susceptibilidade a drogas
antimicrobianas, ou seja, a realização de antibiograma. Os dados obtidos neste teste podem
nortear a escolha do agente antimicrobiano mais adequado a cada situação e predizer a chance
de sucesso de um esquema terapêutico específico. Como os padrões de resistência intrínseca
são geralmente conhecidos, o método visa à pesquisa de resistência adquirida, que é bem
menos previsível.

Entre as diversas abordagens para se avaliar a susceptibilidade bacteriana aos

antimicrobianos, diversas variáveis devem ser controladas. Entre elas, destacam-se: o
tamanho do inóculo, o meio de cultura e as condições de incubação. Além disto, deve-se
ressaltar que nem sempre os dados obtidos in vitro correspondem ao que se observa in vivo.
Neste caso, a ação das drogas é influenciada por inúmeros fatores como, por exemplo,
capacidade de atingir o local da infecção em concentrações adequadas. Existem ainda
variáveis que não podem ser controladas quando da administração de

agentes antimicrobianos a seres vivos.

De maneira geral a concentração inibitória mínima de um antimicrobiano (CIM) é

definida como a concentração mais baixa do agente necessária para inibir o crescimento de
um dado isolado microbiano. Além de informar sobre a relação da concentração e a
susceptibilidade microbiana (levando-se em consideração as concentrações terapêuticas de
utilização do fármaco), a CIM pode dar informações importantes sobre a possível resistência
microbiana ou efeitos bactericidas ou bacteriostáticos dose dependentes. A determinação da
CIM (método quantitativo) é considerada o padrão ouro para testes de susceptibilidade, porém
testes que requerem menor infraestrutura material e de pessoal, rotineiramente realizados nos
laboratórios de análises clinicas, como a discodifusão (método qualitativo) é mais utilizado
por ter um custo global mais baixo em comparação a outros métodos.

Nos dias de hoje, a realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) é

uma das principais tarefas executadas pelo laboratório de microbiologia. Além de orientar a
escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, o TSA representa uma importante
ferramenta no monitoramento da evolução da resistência bacteriana e age também como um
método auxiliar na implantação de medidas de controle que evitem a disseminação de
bactérias multirresistentes. A sensibilidade ou resistência a um agente antimicrobiano por um
dado microrganismo é baseada em manuais criados por órgãos reguladores distribuídos pelo
mundo, os quais realizaram testes clínicos prévios. A concentração do antimicrobiano
utilizado no teste e sua via de administração indicam aos médicos o tratamento mais eficaz
para cada infecção. Vários estudos demonstram que fornecer resultados rápidos de
suscetibilidade pode levar a mudanças consideráveis na terapia como redução de custos
atribuíveis a pedidos de menos testes laboratoriais, menor número de procedimentos invasivos
e menos tempo de permanência dos pacientes em unidades de internação.

Antibiograma: Método de Difusão em ÁGAR (Método de Kirby-

Bauer)

O antibiograma é um teste que permite a verificação “in vivo” da

sensibilidade de uma bactéria aos antibióticos. Esta sensibilidade é
demonstrada pela zona ou halo de inibição de crescimento que se forma em
volta do disco de antibiótico. De acordo com o DIÂMETRO do halo de inibição
diz-se que a bactéria é sensível ou resistente ao antimicrobiano testado.

Material:
• Cultura bacteriana crescida por 18 horas (105 células por mL);
 • Placas com meio de cultura Müller-Hinton;
• Discos de antibióticos;
• Cotonetes e pinças esterilizados.

Procedimento:
1. Agitar bem a cultura bacteriana (Staphylococcus aureus e Amostra A);
2. Umedecer o cotonete na suspensão bacteriana, retirando o
excesso ao apertar ocotonete contra a parede interna do tubo;
3. Espalhar a suspensão bacteriana em toda a superfície do meio
de cultura, de modohomogêneo, inclusive nas bordas;
4. Colocar os discos de antibióticos com auxílio da pinça sobre a
superfície do meio e de modo equidistante – usar 5 antibióticos
por placa;
5. Incubar as placas a 370C por 18 horas.
6. Utilizando um “Swab” aplicar por toda a superfície da placa
de Petri a culturabacteriana crescida;
7. Aplicar os discos de antibióticos na superfície da placa utilizando a pinça.

O teste de disco-difusão é um método prático, de fácil execução e idealizado para

bactérias de crescimento rápido. Os reagentes são relativamente econômicos, não há
necessidade de equipamentos especiais, além de apresentar grande flexibilidade na escolha do
número e tipo de antimicrobianos a serem testados. Entretanto, este método apresenta
algumas limitações, como a dificuldade na avaliação da suscetibilidade aos antimicrobianos
que se difundem mal através do ágar, como, por exemplo, a polimixina. O teste de bactérias
nutricionalmente exigentes requer suplementação dos meios de cultura para que seja
realizado.

Resultados
Leitura e interpretação: Verificar a presença ou ausência de halo de inibição ao
redor dos discos. Medir o DIÂMETRO dos halos, vide figura a seguir, e verificar
se o microorganismo é resistente ou sensível. A seguir tem uma tabela que
mostra alguns halos de inibição de crescimento para alguns antibióticos
testados em aula.
Tabela EuCast para Staphylococcus aureus ATCC 29213
β-lactamase-producing strain (weak) (NCTC 12973, CIP 103429, DSM 2569, CCUG 15915,
CECT 794)
Antibiótico Conc. Diâmetro de inibição
(mm)
Alvo Faixa
Calculado pelo EUCAST Validado pelo EUCAST
Ampicilina 2 ug 18 15 a 21
Cefoxitina 30 ug 27 24 a 30
Cloranfenicol 30 ug 24 20 a 28
Gentomicina 10 ug 22 19 a 25
Tetraciclina 30 ug 27 23 a 31
Tobramicina 10 ug 23 20 a 26
Referência (EUCAST QC Tables v. 8.0, valid from 2018-01-01)
17
TIPAGEM SANGUÍNEA- SISTEMA ABO

INTRODUÇÃO

A descoberta dos grupos sanguíneos teve grande importância médica, pois permitiu
realizar transfusões de sangue apenas entre pessoas de grupos sanguíneos compatíveis.
Se uma pessoa receber sangue de um tipo incompatível com o seu, as hemácias do sangue
recebido podem aglutinar-se e formar aglomerados, que entopem os capilares sanguíneos,
prejudicando a circulação e, dependendo do caso, causando a morte. Em 1930, Landsteiner
recebeu o Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina por seus trabalhos sobre grupos
sanguíneos da espécie humana.

Os grupos sanguíneos de maneira geral são constituídos por antígenos que são a
expressão de genes herdados da geração anterior. Quando um antígeno está presente, isto
significa que o indivíduo herdou o gene de um ou de ambos os pais, e que este gene poderá
ser transmitido para a próxima geração.

Há vários grupos sangüíneos herdados independentemente entre si sendo que são

conhecidos diversos sistemas de grupo sangüíneos. Entre eles podemos citar os sistemas
ABO, Rh, MNS, Kell, Lewis, etc. O sistema ABO é o de maior importância na prática
transfusional e no ensino por ser o mais imunogênico, ou seja, por ter maior capacidade de
provocar a produção de anticorpos, seguido pelo sistema Rh.

Os antígenos deste sistema estão presentes na maioria dos tecidos do organismo.

Fazem parte deste sistema três genes A, B e O podendo qualquer um dos três ocupar o loco
ABO em cada elemento do par de cromossomos responsáveis por este sistema.

O fator Rh é constituído de aproximadamente 40 antígenos e esta família gênica ainda

não é totalmente compreendida. Sabe-se que cada pessoa herda um gene ou um complexo
gênico Rh de cada um dos pais. No sistema descrito por Fisher e Race os pares alélicos
produzem 5 antígenos (“D”,”C”,”c”,”E” e “e”). Estes antígenos são lipoproteínas e estão
dispersamente distribuídas na superfície das hemácias. Quando dizemos que um indivíduo
é Rh Positivo, quer dizer que o antígeno D está presente na superfície de suas hemácias.

Este ensaio baseia-se na reação de aglutinação. Quando o antígeno está presente

numa superfície de uma partícula grande como, por exemplo, uma bactéria, ou um eritrócito,
os anticorpos, uma vez ligados, levam estas partículas a se agruparem num fenômeno
conhecido por aglutinação. O mesmo princípio aplica-se às reações utilizadas para
determinação dos grupos sanguíneos, onde os antígenos encontram-se na superfície das
hemácias e esta reação de aglutinação causada pela ligação do anticorpo é denominada
hemaglutinação (do grego ,haima, sangue).

Este procedimento é utilizado para determinar o grupo sanguíneo ABO e também pode
ser utilizado para o grupo Rh, mas deve-se levar em consideração que somente 75% dos
indivíduos Rh positivos (D positivos) podem ser tipados desta forma, já que existem os D
“fracos” que necessitam ser testados pela forma de aglutinação indireta (Coombs indireto).
Para a tipagem utiliza-se anticorpos (aglutininas) anti-A ou anti-B e anti-D que se ligarão
nos determinantes antigênicos A, B e D respectivamente presentes nas hemácias
(aglutinogênios).

OBJETIVOS: Determinar os tipos sanguíneos do sistema ABO e Fator Rh.

MATERIAL:

• Lâminas; ● Álcool;
• Lancetas; ● Algodão;
• Kit Anti-A, Anti-B e Anti-D; ● Palito.
• Recipiente para descarte de material biológico e/ou perfuro-cortante

PROCEDIMENTO:

1. Fazer um procedimento asséptico com algodão umedecido em álcool na

extremidade de um dos dedos da mão.
2. Fazer um pequeno furo com uma lanceta.
3. Colocar uma gota de sangue em cada circulo da lâmina de microscópio.
4. Pingar uma gota de Anti-A, Anti-B e Anti-D em cima de cada gota de sangue. (Cada
aluno que desejar fazer a determinação de seu grupo sanguíneo ABO e Rh deve
pegar uma lâmina de microscópio limpa no laboratório); Utilizando o próprio conta-
gotas dos anticorpos comerciais (e tomando o cuidado para não contaminar estes
conta-gotas com o sangue da lâmina), colocar uma gota de anticorpo monoclonal
anti-A (coloração azul) em uma gota de sangue, uma gota de anticorpo monoclonal
 anti-B (coloração amarela) na outra gota de sangue e uma gota do anticorpo anti-D
na terceira gota de sangue;
5. Mexer com um palito, com o cuidado de colocar um palito para cada círculo e
observe.
6. Verificar ou não a aglutinação, cuja positividade vai indicar a presença do antígeno
contra o qual o anticorpo está reagindo.
7. Construir uma tabela de resultados com a freqüência/prevalência dos tipos
sanguíneos encontradas com as coletas em sala de aula

GRUPO SORO DE TIPAGEM HEMÁCIAS DE ANTÍGENO ANTICORPO

SANGUÍNE TIPAGEM
O Anti-A Anti-B
A B

A + - - + A Anti-B

B - + + - B Anti-A

AB + + - - AeB Ausente

O - - + + - Anti-A e anti-B

Observando o quadro acima podemos perceber a presença dos antígenos e anticorpos em

cada grupo sanguíneo. É nesta presença ou ausência de antígenos e anticorpos que se
baseia a tipagem sanguínea.

RESULTADOS:

Obs: Construir uma tabela com a frequência da tipagem sanguínea dos alunos do Xº
Período do curso de XXX DO UNIFSA