Suellen Gomes Tese

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Caracterização química dos compostos bioativos e

obtenção de micropartículas a partir da torta da
prensagem da Castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa)
Suellen Gomes Moreira
2015
Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Ciência de Alimentos,
Instituto de Química, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciência de Alimentos.
Orientadores: Alexandre Guedes Torres

Priscilla Vanessa Finotelli
Marcelo Henrique Gualberto Pereira
Rio de Janeiro
Fevereiro, 2015.
G633
Gomes, Suellen Moreira.
Caracterização química dos compostos bioativos e obtenção de
micropartículas a partir da torta da prensagem da Castanha-do-
Brasil (Bertholletia excelsa)/ Suellen Gomes Moreira. Rio de
Janeiro: UFRJ/IQ, 2015.
151 f.:il.
Orientadores: Alexandre Guedes Torres, Priscilla Vanessa

Finotelli e Marcelo Henrique Gualberto Pereira.
Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio

de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em
Ciência de Alimentos, 2015.
1. Torta da castanha-do-Brasil. 2. Compostos bioativos. 3.

Microencapsulação. 4. LC-HRMS. I. Torres, Alexandre Guedes.
(Orient). II. Finotelli, Priscilla Vanessa. (Orient). III. Pereira,
Marcelo Henrique Gualberto. (Orient). IV. Universidade Federal do
Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação
em Ciência de Alimentos. V. Título
CDD: 664.001

Orientadores: Alexandre Guedes Torres
Priscilla Vanessa Finotelli
Marcelo Henrique Gualberto Pereira
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos,

Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.
Aprovada por:
_______________________________________
Dr. Alexandre Guedes Torres
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
______________________________________
Dra. Anna Paola Pierucci
______________________________________
Dra. Mariana Costa Monteiro
_______________________________________
Dra. Jane Mara Block
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC
______________________________________
Dra. Renata Valeriano Tonon
Embrapa Agroindústria de Alimentos
Fevereiro, 2015.
Ao meu exemplo de superação minha amada mãe
Amalia e ao meu amor Vitor Moreira, por serem meu
alicerce e estarem comigo me fortalecendo com seu
amor a cada etapa desta longa jornada!
AGRADECIMENTOS
À Deus primeiramente por ter me dado essa oportunidade de crescimento pessoal e
profissional, por me fortalecer nos momentos mais difíceis e me dá sabedoria e discernimento
para ter realizado essa longa jornada de quatro anos;
À minha mãe Amalia por me apoiar e por mais difícil que tenha sido sempre compreendeu a
minha ausência me acolhendo sempre com seu amor incondicional;
Ao meu amor Vitor Moreira, pois sem ele acredito que eu não conseguiria passar por tantos
momentos difíceis ao longo desses anos, obrigada por seu amor, paciência, conselhos e
compreensão que me ajudaram a chegar até aqui.
À minha família em especial minha avó que me agraciava com sua benção, à minha pequena
Fernanda, minha afilhada que mesmo sofrendo por eu estar distante me apoiou e me encheu
do seu carinho sempre.
À minha querida amiga Fabiana (Fabi), minha madrinha, pela sua amizade que nasceu no
LBNA e que sem dúvida será para sempre!
Aos amigos que o doutorado me deu companheiros de gargalhadas, choros, festas, conselhos
e troca de experiências na bancada: Fabricio, Nivea, Vanessa Rezende, Karla Leal, Emília,
Nathalia (Nath), Isabelle Santana (Isa), Genilton (Gê), Andressa e Ellen obrigada por fazerem
os dias no laboratório terem sido tão divertidos e proveitosos.
Aos mais novos que chegaram ao LBNA Kim, Lais, Vanessa Di Sarli, Aline, Isabelle,
Tamirys, André obrigada pela troca de experiência e pela amizade.
A Vanessa Naciuck, Juliana, Mariana e ao Prof. Daniel Perrone pela troca de experiência e
sugestões, especialmente durante as apresentações dos seminários do LBNA.
À toda família LNBA pelo companherismo e ensinamentos, por fazerem parte dessa etapa tão
importante.
Aos amigos que o doutorado me deu durante o desafio de aprender sobre proteômica Rosane,
Giselle, Noemi e Wilber aprendi muito com vocês! Obrigada por toda a ajuda e carinho em
me receberem!
Ao meu orientador Alexandre Torres pelos seis anos (mestrado e doutorado) de parceria
obrigada por toda a paciência, pelas conversas, ensinamentos e conselhos ao longo dessa
jornada de aprendizado.
À minha co-orientadora Priscilla Finotelli que me apresentou o mundo mágico da

encapsulação, obrigada por todos os ensinamentos e conselhos.
Ao meu co-orientado Henrique Pereira, obrigada pela oportunidade de trabalhar com você e
toda a equipe, por me abrir as portas do LBCD (Laboratório Brasileiro de Controle de
Dopagem).
Ao Vinícius por ter colaborado tanto, compartilhando seu conhecimento e me ajudado

arduamente na interpretação dos resultados do HRMS, obrigada por toda a paciência e ajuda.
A Julia e ao Rafael, meus secretarios favoritos, obrigada pela amizade pela ajuda sempre que
precisei.
Aos parceiros que possibilitaram o desenvolvimento deste estudo Prof. Suely Freitas (Lab de
Processamento de Matéria Primas Vegetais – EQ/ UFRJ ); Prof. Verônica Calado com o
tratamento estatístico dos resultados; Prof Anna Paola e a Carol sua técnica pelo uso do
Spray Dryer, Laboratório de Desenvolvimento de Alimentos para Fins Especiais e
Educacionais – DAFEE/ INJC-UFRJ); Prof. Marcia Soares pelas análises de proteômica (Lab
de Microbiologia Molecular e Proteômica - LaMMP –IQ/UFRJ).
As agência financiadoras FAPERJ, CAPES e CNPq.
Enfim foram muitas as pessoas que contribuiram para a realização deste trabalho e desta
conquista,
A todos muito obrigada!

“Lute com determinação, abrace a
vida com paixão, perca com classe e
vença com ousadia, porque o mundo
pertence a quem se atreve e a vida é
muito bela para ser insignificante.”
(Charles Chaplin)
RESUMO
Gomes, Suellen. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS COMPOSTOS BIOATIVOS E OBTENÇÃO DE
MICROPARTÍCULAS A PARTIR DA TORTA DA PRENSAGEM DA CASTANHA-DO-BRASIL
(BERTHOLLETIA EXCELSA). Rio de janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos).
Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
O resíduo sólido da obtenção de óleo da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) por

prensagem, chamado torta, apresenta alto valor energético e nutricional e compostos
bioativos. O presente trabalho teve como objetivo obter um extrato de grau alimentício rico
em compostos bioativos, a partir da torta da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e
determinar a sua composição química e, em seguida, microencapsular por spray-drying o
melhor extrato e determinar os componentes bioativos, visando futuras aplicações em
alimentos. As condições de extração dos compostos bioativos da torta de castanha-do-Brasil
foram otimizadas por planejamento experimental. Considerando fatores estatísticos,
econômicos e ambientais, as condições mais favoráveis para a extração de compostos
fenólicos antioxidantes foram as seguintes: etanol:água, 40:60; homogeneização com Ultra-
turrax® por 2,5 min; seguida por extração com agitação orbital por 1 h, a 60 °C. Nessas
condições, o teor de fenólicos totais, flavonóides totais e a capacidade antioxidante no extrato
foram (média±DP), respectivamente, 181 ± 12,3 mg EAG/ 100 g; 3,05 ± 0,41 mg de EC/100
g 520 ± 50,0 mmol Fe2+/100 g (ensaio de FRAP) e 0,399 ± 0,03 mmol ET/100 g (ensaio de
TEAC). No extrato, foram identificados e quantificados sete compostos fenólicos por CLAE-
DAD. O perfil detalhado dos compostos bioativos no extrato e na torta de castanha-do-Brasil
foi determinado. A composição de fenólicos foi determinada por Espectrometria de Massa de
Alta Resolução (EMAR), tocoferóis por CLAE-Fluo, minerais por ICP-OES e ICP-MS e
proteômica por eletroforese 2D e espectrometria de massas (MALDI-ToF/ToF). A
identificação dos compostos fenólicos foi confirmada por CLAE-EMAR, em abordagem
dirigida (target), e sete ácidos fenólicos foram identificados: 2,4- dihidroxibenzóico, gálico, 2,
hidroxibenzóico, p-cumárico, p-hidroxibenzóico, protocatecuico, sinápinico e cinco
flavonoides: (+)-catequina, (-) epicatequina, miricetina, quercetina e quercetina-3-β-D-
glucósidio. Além desses fenólicos identificados inequivocamente, trinta outros foram
tentativamente identificados por abordagem não-dirigida (non-target), com base nos dados de
massa exata (erro < 5 ppm) e perfil de fragmentação (MS²) dos fragmentos principais, destes
compostos sugeridos 13 pertencem a classe dos ácidos fenólicos e 17 a classe dos
flavonoides, incluindo alguns isômeros de posição. Os tocoferóis majoritários foram α e
tocoferol. Diversos minerais essenciais foram identificados e quantificados na seguinte
ordem de teores: P>K>Mg>Ca>Zn>Fe>Cu>Mn>Na>Se. O consumo de 1 g da torta contribui
para 9% da ingestão dietética de referência do selênio. As principais proteínas identificadas
por análise proteômica da torta de castanha-do-Brasil foram globulina 11S e a albumina 2S.
Quanto à microencapsulação, esta ocorreu por spray-drying a partir do extrato da torta de
castanha-do-Brasil e a melhor combinação da mistura dos agentes encapsulantes capsul ® e
inulina foi determinada através das propriedades químicas, físico-químicas e de estabilidade.
As micropartículas com capsul® e inulina (1:1) apresentaram propriedades mais favoráveis
para a estabilidade dos fenólicos totais e capacidade antioxidante durante 120 dias de
armazenamento. Foram identificados nas microcápartículas os mesmos compostos fenólicos
presentes no extrato da torta de castanha-do-Brasil por CL-EMAR. Todos os homólogos dos
tocoferóis foram identificados, porém o -tocoferol foi majoritário, e além deste componente
a micropartícula também apresentou um teor de selênio de 4.95 μg/g de pó. Portanto conclui-
se que a torta da castanha-do-Brasil e seu extrato apresentaram uma composição diversificada
de bioativos o que favorece a sua aplicação no desenvolvimento de alimentos funcionais,
como por exemplo, no preparo de micropartículas.
ABSTRACT
Gomes, Suellen.: CHEMICAL
CARACTERIZATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS AND PRODUCTION
OF MICROCAPSULES FROM PRESSING BRAZIL NUT CAKE (BERTHOLLETIA EXCELSA). Rio de
janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
The solid by product of Brazil nut (Bertholletia excelsa) cold-pressed oil, the cake, presents
high energy and nutritional value, and bioactive compounds. In the present work we aimed to
get a food grade extract rich bioactive compounds from the Brazil nut cake (Bertholletia
excelsa) and to determine their chemical composition and then microencapsulate by spray-
drying the best extract and determining the bioactive compounds, aiming future applications
in food. Extraction of bioactive compounds from Brazil nut cake was optimized by
experimental design. Taking into account statistical, ecconomical and environmental factors,
the most favourable extraction conditions were as follows: ethanol:water, 40%;
homogenization with Ultra-turrax® for 2.5 min; followed by extraction in an orbital shaker (1
hour, 60 °C). At this extraction conditions, total phenolic compounds, total flavonoids and
antioxidant capacity in the extract were (average±DP), respectivelly, 181 ± 12.3 GAE/100 g;
3.05 ± 0.41 mg CE/100 g 520 ± 50,0 mmol mmol Fe2+/100 g (FRAP assay) and 0.399 ± 0.03
mmol TE/100 g (TEAC assay). Seven phenolic compounds were identified and quantified in
Brazil nut cake extract by HPLC-PDA. The detailed profile of bioactive compounds was
determined in the extract and in Brazil nut cake. Phenolic compounds were determined by
high resolution mass spectrometry (HRMS), tocopherols by HPLC-FLUO, minerals by ICP-
OES and ICP-MS and proteomics by 2D electrophoresis and mass spectrometry (MALDI-
ToF/ToF). Twelve phenolic compounds were inequivocally identified in Brazil nut cake by
LC-HRMS using targeted strategy, follows: gallic acid, p-coumaric acid, 2,4-
dihydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, sinapic acid, 2-
hydroxybenzoic acid, (+)-catechin, (-)-epicatechin, myricetin, quercetin and quercetin-3-β-D-
glucoside. Besides these, thirty other phenolic compounds were tentativelly identified by non-
targeted HRMS, based exact mass data (error < 5 ppm) and fragmentation profile (MS²) of
major fragments. The phenolic compounds tentativelly identified were 13 suggested as
belonging to the phenolic acids and 17 in flavonoids classes, including positional isomers.
Major tocopherols were α and tocopherol. Several essential minerals were determined in
the following order of contents: P>K>Mg>Ca>Zn>Fe>Cu>Mn>Na>Se. The intake of 1 g of
Brazil nut cake would provide 9% of Recommended Dietary Allowances (RDAs) of Se. The
major proteins identified in Brazil nut cake by proteomics analysis were 11S globulin and 2S
albumin. Concerning micro-encapsulation of Brazil nut cake extract by spray drying, the best
combination was capsul® and inulin in a 1:1 ratio. This wall material combination presented
high stability of phenolic compounds during storage. The microparticles presented the same
phenolic compounds present in the Brazil nut cake extract by LC-HRMS analyses. All
tocopherol homologs were identified in the microcapsules, however -tocopherol was the
major. Besides tocopherols, microparticles showed 4.95 μg/ g Se. In conclusion, Brazil nut
cake presented a diversified composition in bioactives, which favors its use in developing
functinal foods, such as in preparation of microparticles by spray drying as a potential aditive
to functional foods.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1 Árvore da castanheira-do-Brasil (A), ouriço (fruto) (B) e as sementes 28

(C) que contém a amêndoa da castanha-do-Brasil (parte comestível).
Figura 2 Estrutura química dos tocoferóis e tocotrienóis. 33
Figura 3 Biossíntese dos compostos fenólicos (Naczk e Shahidi, 2004). 37
Figura 4 Estrutura química básica dos ácidos fenólicos: hidroxibenzóico (a) e 38
hidroxicinâmico (b) (Angelo e Jorge, 2006).
Figura 5 Estrutura química básica dos flavonoides (Balasundram et al., 2006). 39
Figura 6 Esquema representativo do analisador Orbitrap Qexactive (Michalski 45
et al., 2011).
Figura 7 Modelos das principais formas de encapsulação: microcápsula (A) e 46

micropartícula(B).
Figura 8 Estrutura química do Capsul® (amido modificado pela adição do 48
componente octenilsuccinato na molécula).
Figura 9 Estrutura química da inulina (Barclay et al., 2010). 49
CAPÍTULO 2
Figure 1 Response surface plots of total phenolic compounds in Brazil nut 63

cake, associated with Ultra-turrax® homogenization time (right axis)
and with: solvent content in water (A), extraction time (B), or
extraction temperature (C).
Figure 2 Response surface plots of antioxidant capacity by FRAP assay in 66
Brazil nut cake, associated with extraction temperature (left axis) and
with: Ultra-turrax® homogenization time (A), or solvent content in
water (B).
Figure 3 Representative chromatogram for the analysis of phenolic compounds 68
in Brazil nut cake extract, by HPLC-PDA (λ= 280 nm). Gallic acid
(1), protocatechuic acid (2), (+)-catechin (3), p-hydroxybenzoic acid
(4), 2,4-dihydroxybenzoic acid (5), p-coumaric acid (6), sinapic acid
(7).
CAPÍTULO 3
Figure 1 MS2 spectra of the phenolic compounds identified in the Brazil nut 90
cake extract by LC-HRMS/ESI-Orbitrap in full scan negative mode.
Gallic acid (1), protocatechuic acid (2), (+)-catechin (3), p-
hydroxybenzoic acid (4), (−)-Epicatechin (5), 2,4-dihydroxybenzoic
acid (6).
Figure 2 MS2 spectra of the phenolic compounds identified in Brazil nut cake 91
extract by LC-HRMS/ESI-Orbitrap in full scan negative mode. p-
coumaric acid (7), sinapic acid (8), Quercetin 3-β-D-glucoside (9), 2-
hydroxybenzoic acid (10), Myricetin (11) and Quercetin (12).
Figure 3 Representative total ion current (TIC) chromatogram, obtained in full 93
scan MS mode of the phenolic compounds from Brazil nut cake
extract by LC-HRMS.
Figure 4 Representative cromatogram of tocopherols from Brazil nut cake: α, 98
β,  e δ-tocoferol by HPLC-Fluorescence (Exc 290 e Emis. 330 nm).
Figure 5 2D SDS-PAGE electrophoresis gel (IPG strip of pH 3−11) image 103
revealed with Coomassie blue, representative sample of Brazil nut
cake. Gel orientation: horizontal, isoelectric focusing (pI); vertical,
PAGE (molecular weight kDa). Identical numbers refer to the same
spots identificaded by MALDI ToF-ToF. The Molecular weight
standards (kDa) of the protein are shown at the left of the images.
CAPÍTULO 4
Figura 1 Compostos fenólicos totais nas micropartículas dos extratos da torta 119
de castanha-do-Brasil, produzidas com diferentes proporções da
mistura de material de parede (Capsul® e Inulina). *Resultados
expressos como média ± desvio padrão, n=3. Letras diferentes
indicam diferença significativa entre as micropartículas (p< 0.05).
Figura 2 Capacidade antioxidante pelos ensaios de FRAP e TEAC nas 121
micropartículas dos extratos da torta de castanha-do-Brasil,
produzidas com diferentes proporções da mistura de material de
parede (Capsul® e Inulina). *Resultados expressos como média ±
desvio padrão, n=3. Letras diferentes indicam diferença significativa
entre as micropartículas (p< 0.05).
Figura 3 Morfologia das micropartículas do extrato de torta de castanha-do- 124
Brasil com diferentes proporções de material de parede. (A)
Ativo:Capsul®:Inulina (1:1:2); (B) Ativo:Capsul®:Inulina (1:2:1) e
(C) Ativo:Capsul®:Inulina (1:1:1). Com aumentos de 2000 e 5000
vezes.
Figura 4 Percentual de perdas dos compostos fenólicos (CFT) (A) e 128
capacidade antioxidante total (CAT) pelos ensaios de FRAP (B) e
TEAC (C), devido à influência das diferentes proporções dos
materiais de parede nas micropartículas do extrato de torta de
castanha-do-Brasil durante o armazenamento por 120 dias.
Figura 5 Correlação entre o conteúdo de fenólicos totais e a capacidade 129
antioxidante pelos ensaios de FRAP (azul) e TEAC (vermelho) das
micropartículas (1:1:1; 1:2:1; 1:1:2, ativo:Capsul:inulina,
respectivamente) durante o armazenamento por 120 dias.
Figura 6 Cromatograma representativo da análise de tocoferóis nas 132
micropartículas do extrato de torta de castanha-do-Brasil por HPLC-
FL (exc. 290, em. 330 nm).
Figura 7 Comparação dos tocoferóis nas micropartículas e na torta de 133
castanha-do-Brasil por HPLC-FL (exc. 290, em. 330 nm) em base
seca.
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1 Conteúdo de vitamina E de algumas oleaginosas (USDA, 2004). 34
CAPÍTULO 2
Table 1 Full factorial design with center points to optimize extraction of 57

phenolic compounds from Brazilnut cake.
Table 2 Calibration curves* of phenolic compounds from Brazil nut cake 60
extract analyzed by HPLC-DAD. 60
Table 3 Experimental design for optimized extraction of total phenolic 61

compounds from Brazil nut cake with acetone:water or
ethanol:water.
Table 4 Experimental design for optimized antioxidant capacity of 64

Brazil nut cake extracts, obtained with ethanol:water.
Table 5 Factors’ effects on antioxidant capacity (TEAC and FRAP assays) in 66

Brazil nut cake extract.
69
Table 6 Phenolic compounds in Brazil nut cake extract by HPLC-PDA
analysis (λ=280 nm).
CAPÍTULO 3
Table 1 Standard phenolic compounds analyzed by LC-HRMS 78
Table 2 Proximate composition of whole Brazil nut and Brazil nut cake 84
(g/100 g).
Table 3 Antioxidant components from Brazil nut cake extract by 86
spectrophotometric methods.
Table 4 Phenolic compounds identified in Brazil nut cake extract by targeted 89
LC-HRMS analysis, based on retention time and exact mass error (<
5ppm).
Table 5 Phenolic compounds tentatively identified in the Brazil nut cake 94
extract by LC-HRMS / ESI-Orbitrap analysis.
Table 6 Tocopherols contents (mg/100 g) from Brazil nut cake by HPLC- 98
Fluo.
Table 7 Minerals composition in Brazil nut cake by ICP-MS and ICP-OES 100
analyzed.
Table 8 Analysis protein from the Brazil nut cake by MALDI – ToF-ToF 104
CAPÍTULO 4
Tabela 1 Combinação de diferentes proporções do material encapsulante 112

(Capsul® e inulina) para obtenção das micropartículas, com base no
teor de sólidos totais do extrato.
Tabela 2 Recuperação do processo de atomização e retenção dos fenólicos 120

totais das diferentes micropartículas do extrato de torta de castanha-
do-Brasil.
Tabela 3 Propriedades físicas e físico-químicas das micropartículas do extrato 122

da torta de castanha-do-Brasil usando diferentes proporções de
material de parede.
Tabela 4 Influência da proporção de material de parede na estabilidade das 126

micropartículas de extrato da torta de castanha-do-Brasil: compostos
fenólicos totais e capacidade antioxidante pelos ensaios de FRAP e
TEAC
Tabela 5 Identificação dos compostos fenólicos na micropartícula de extrato 131

da torta de castanha-do-Brasil por CL-EMAR.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL 22
2. OBJETIVOS 25
2.1 Objetivos Geral 25
2.2 Objetivos Específicos 25
CAPITULO 1 REVISÃO DE LITERATURA 27

1. A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e seus co-produtos 28
1.1 Composição nutricional e funcional da castanha-do-Brasil e seus 30
co-produtos
2. Compostos bioativos em nozes e castanhas 33
2.1 Tocoferóis 33
2.2 Selênio 35
2.3 Compostos Fenólicos 36
3. Capacidade antioxidante 41
4. Espectrometria de Massas de Alta Resolução (CL-EMAR) na 43
determinação de compostos fenólicos
5. Encapsulamento 45
5.1 Agente encapsulante 47
5.2 Spray Drying 50
CAPITULO 2 Optimized extraction of polyphenolic antioxidant compounds 52

from Brazil nut (Bertholletia excelsa) cake, and identification of
polyphenols
1. INTRODUCTION 54
2. EXPERIMENTAL 55
2.1 Chemicals 55
2.2 Samples: Brazil nuts and preparation of Brazil nut cake 56
2.3 Experimental design 56
2.4 Extraction of phenolic compounds from Brazil nut cake 57
2.5 Determination of Total Phenolic Compounds (TPC) 58
2.6 Determination of antioxidant activity 64
2.7 Phenolic compounds profile by HPLC 59
2.8 Statistical analysis 60
3. RESULTS AND DISCUSSION 60
3.1 Total phenolic compounds 60
3.2 Antioxidant capacity 64
3.3 Phenolic compounds profile in Brazil nut cake extract by HPLC- 67
PDA
4. CONCLUSIONS 70
CAPITULO 3 Brazil nut cake is a rich source of phenolic compounds, 71

tocopherols, selenium and proteins determined by high resolution
analytical methods
1. INTRODUCTION 73
2. MATERIALS AND METHODS 74
2.1 Chemical 74
2.2 2.2 Samples: Brazil nuts and preparation of Brazil nut cake 75
2.3 Extraction of phenolics compounds from Brazil nut cake 75
2.3.1 Total Phenolic Compounds 75
2.3.2 Total flavonoids 76
2.3.3 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by 76
LC-HRMS
2.3.4 Antioxidant Capacity 78

2.4 Brazil nut cake composition 79
2.4.1 Proximate composition 79
2.4.2 Tocopherols in Brazil nut cake by HPLC 79
2.4.3 Proteomics 80
2.4.3.1 Extraction and determination of total proteins in Brazil nut cake 80
2.4.3.2 Protein profile by 2D electrophoresis 80
2.4.3.3 In-gel digestion and peptides extraction 81
2.4.3.4. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization and Sequential 81
Time-of-Flight (MALDI-ToF/ToF) mass spectrometric analysis
2.4.4 Determination of metals in Brazil nut cake by ICP-MS and ICP- 82
OES
2.7 Statistical Analysis 83
3 RESULTS AND DISCUSSION 84
3.1 Proximate composition of Brazil nut cake 84
3.2 Total phenolic compounds, total flavonoids and antioxidant 85
capacity from Brazil nut cake extract by spectrophotometric
methods
3.3 Detailed characterization of the phenolic compounds in Brazil nut 88

cake extract by LC-HRMS
3.3.1 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by 88

targeted LC-HRMS
3.3.2 Tentative identification of phenolic compounds in Brazil nut cake 92

extract by non-targeted LC-HRMS
3.4 Tocopherol from Brazil nut cake by HPLC 97

3.5 Minerals composition of the Brazil nut cake by ICP-OES and 100
ICP-MS
3.6 Analysis of Proteins from Brazil nut cake by MALDI/ ToF-ToF 102
4. CONCLUSION 106
CAPÍTULO 4 Microencapsulação do extrato da torta da Castanha-do-Brasil 107

(Bertholletia excelsa) por spray drying
1. INTRODUÇÃO 109
2. MATERIAL E MÉTODOS 111
2.1 Amostra 111
2.2 Obtenção da torta e do extrato da castanha-do-Brasil 111
2.3 Encapsulação do extrato da torta de castanha-do-Brasil 112
2.4 Influências das diferentes proporções de encapsulantes na 113
composição das micropartículas do extrato da torta de castanha-
do-Brasil
2.4.1 Rendimento da microencapsulação e retenção de compostos 113
fenólicos
2.4.1.1 Análise dos compostos fenólicos 113

2.4.1.2 Capacidade antioxidante 114
2.4.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas 114
2.4.2.1 Análise de umidade e atividade de água 114
2.4.2.2 Morfologia e tamanho das partículas 114
2.4.3 Estabilidade das micropartículas 115
2.5 Caracterização dos componentes fenólicos, tocoferóis e selênio 115
2.5.1 Determinação dos compostos fenólicos por CLAE-DAD e 115
CL-EMAR
2.5.2 Tocoferóis por CLAE-Fluorescência nas micropartículas 116

2.5.3 Determinação de Selênio por ICP-MS 117
2.6 Análise estatística 118
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 118
3.1 Influências do encapsulante nas características químicas, físico- 118
química e estabilidade das micropartículas do extrato da torta de
castanha-do-Brasil
3.1.1 Compostos fenólicos total e capacidade antioxidante das 119

micropartículas
3.1.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas 121

3.1.3 Influência da proporção de material de parede na estabilidade das 125
micropartículas de extrato da torta de castanha-do-Brasil
3.2 Caracterização dos componentes bioativos nas micropartículas do 130

extrato de torta de castanha-do-Brasil (1:1:1,ativo;
Capsul®:inulina): compostos fenólicos, tocoferóis e selênio
4. CONCLUSÕES 134
CONSIDERAÇÕES FINAIS 135
REFERENCIAS 137
Introdução
21
1. INTRODUÇÃO GERAL
O consumo de nozes e castanhas aumentou na última década, especialmente por sua

associação na prevenção de doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e certos tipos de câncer
(Fernández-Montero et al, 2014; Vadivel et al, 2012; Kornsteiner et al, 2006; Nishi et al,
2014). A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) destaca-se entre as oleaginosas por sua
composição de nutrientes e compostos bioativos, tais como o selênio, tocoferóis, ácidos
graxos insaturados, proteínas, aminoácidos, fibras e compostos fenólicos (Yang, 2009). A
castanheira-do-Brasil é nativa da região amazônica e sua forma de manejo é extrativista. O
fruto, conhecido como castanha-do-Brasil, possui um papel socioeconômico fundamental,
pois é um dos principais produtos de exportação da região amazônica (40.357 toneladas por
ano) (IBGE, 2010; Wadt et al, 2008).
Além da comercialização da amêndoa integral, a extração do óleo também possui
aplicações na indústria alimentícia e cosmética. O processo de prensagem a frio é o mais
utilizado para a obtenção do óleo, e esta extração resulta em um co-produto sólido chamado
de torta, com elevado valor energético e nutricional. As aplicações mais convencionais da
torta de castanha-do-Brasil são como constituinte da ração animal, além do enriquecimento de
grande variedade de alimentos como produtos de panificação, farinhas, snacks, cereais,
biscoitos, embutidos, sorvetes, chocolates, bebidas, laticínios, entre outros alimentos
(Menezes e Souza, 2004; Santos et al., 2013). No entanto, estas aplicações não investem
diretamente no potencial dos componentes bioativos hidrofílicos, tais como os compostos
fenólicos da torta de castanha-do-Brasil.
O consumo de alimentos ricos em compostos fenólicos antioxidantes (Fukuda et al,
2003; Wijeratne et al, 2006) tem sido associado com potenciais benefícios à saúde,
especialmente quanto à atividade anti-inflamatória, antimutagênica e anticarcinogênica (Chen
e Blumberg, 2008; Colpo et al, 2014). É possível que esses componentes sejam extraídos da
torta, levando à formação de extratos com teores de compostos bioativos, tais como fenólicos,
tocoferóis, proteínas solúveis e selênio (Yang, 2009). No entanto, estudos mais detalhados dos
componentes bioativos da torta de castanha-do-Brasil são relevantes, como a caracterização
dos compostos fenólicos por abordagens metabolômicas, e a determinação da composição de
proteínas por abordagens proteômicas para permitir um conhecimento mais detalhado deste
co-produdo. O conhecimento da composição bioativa da torta da castanha-do-Brasil
22
possibilitará a obtenção e aplicação dos extratos como potencial aditivo com bioatividade na
indústria de alimentos.
Dentre estas aplicações destaca-se o uso da tecnologia de encapsulamento, que visa
promover a estabilidade, proporcionar a liberação controlada dos componentes ativos e
conservar as propriedades fitoquímicas de compostos bioativos (Saenz et al., 2009; Çam et al.,
2014). A aplicação desta tecnologia nos extratos alimentícios concentrados extraídos da torta
da castanha-do-Brasil é uma alternativa para o reaproveitamento deste resíduo, uma vez que
pode preservar propriedades químicas dos extratos de castanha-do-Brasil, podendo
potencializar a bioatividade de seus componentes. Além disso, a encapsulação permite o
desenvolvimento de um novo produto, o qual poderá ser aplicado como aditivo, contendo os
compostos bioativos do extrato de castanha-do-Brasil, em uma maior variedade de produtos
alimentícios. A investigação desses processos, com base no conhecimento químico detalhado
dos componentes da torta da castanha, pode contribuir para a elaboração de alimentos
funcionais e com isto agregar valor à castanha-do-Brasil.
ESTRUTURA DA TESE
O desenvolvimento da tese foi dividido em um capitulo de revisão da literatura e três

capítulos no formato de artigos científicos dos quais dois estão em língua inglesa, de acordo
com as temáticas investigadas. No primeiro capítulo apresentamos uma breve revisão da
literatura sobre a castanha-do-Brasil e seus co-produtos. Abordamos os compostos bioativos
que foram investigados ao longo do estudo e algumas das principais técnicas aplicadas, além
do processo de microencapsulação e fatores que influenciam na obtenção das micropartículas.
No segundo capítulo, abordamos a otimização das condições de extração para obtenção
dos extratos hidroetanólicos contendo os compostos fenólicos da torta de castanha-do-Brasil.
Trabalhou-se com o planejamento de experimento fatorial completo com pontos centrais para
avaliar as variáveis independentes (tipo de solvente, tempo de extração, tempo de
homogeneização, temperatura de extração e proporção do solvente) tendo como variáveis de
resposta a composição de fenólicos totais e capacidade antioxidante. Este artigo foi submetido
ao Journal of Science of Food and Agriculture.
A seguir, o terceiro capítulo foi dedicado à caracterização química detalhada dos
compostos bioativos no extrato e na torta de castanha-do-Brasil. Devido há escassez de dados
23
publicados quanto à caracterização e quantificação desses componentes na torta da castanha-
do-Brasil. A maior parte das investigações científicas publicadas a respeito da composição
química da torta da castanha-do-Brasil bem como da forma in natura estão relacionadas com
os benefícios gerados pelo consumo do selênio e pouco se tem investigado a respeito de
outros componentes bioativos presentes na torta. Em nosso estudo foram utilizadas técnicas
hifenadas como cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas de alta resolução
(LC-HRMS) para investigar os compostos fenólicos, essa analise foi realizada de dois modos:
analise qualitativa dirigida (targeted), com o uso de padrões comerciais de compostos
fenólicos para realizar a identificação e analise qualitativa não-dirigida (non-targeted) onde os
compostos fenólicos dos quais não obtinhamos padrões comerciais foram tentativamente
identificados com o uso de uma estratégia de identificação. Foi realizada ainda através do uso
de técnicas cromatográficas a determinação de tocoferóis (CLAE-FL), selênio (por ICP-MS e
ICP-OES) e proteínas por proteômica (MALDI-ToF-ToF) na torta da castanha do Brasil.
Em seguida no quarto capítulo o extrato da torta de castanha-do-Brasil foi
microencapsulado por spray drying, e a influência de diferentes proporções dos materiais de
parede (Capsul® e inulina) no conteúdo de fenólicos totais, capacidade antioxidante e
características física, físico-química e estabilidade das micropartículas foram avaliadas, além
de caracterizar através de técnicas cromatográficas os compostos bioativos da formulação que
tenha apresentado maiores teores de compostos fenólicos, capacidade antioxidante e
estabilidade.
24
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Obter um extrato de grau alimentício rico em compostos bioativos, a partir da torta da

castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e determinar a sua composição química e, em
seguida, microencapsular o melhor extrato e determinar os componentes bioativos, visando
futuras aplicações em alimentos.
2.2 Objetivos Específicos
Capítulo 2:
a) Determinar as melhores condições de extração de compostos fenólicos da torta

de castanha-do-Brasil, pela aplicação do planejamento experimental investigando os
fatores: solvente, proporção do solvente: água, tempo de extração, temperatura de
extração e tempo de homogeneização; para a obtenção de extratos com teores
relevantes de compostos fenólicos e capacidade antioxidante.
Capítulo 3:
b) Caracterizar os compostos bioativos presentes no extrato da torta da castanha-

do-Brasil, por meio da determinação dos teores de fenólicos e flavonoides totais por
analises espectofotometricas; perfil de compostos fenólicos por cromatografia líquida
acoplada a espectrometria de massas de alta resolução (LC-HRMS) e capacidade
antioxidante in vitro.
c) Determinar os teores e perfil de tocoferóis por HPLC, minerais por ICP-OES e

ICP-MS e proteínas por abordargens proteômicas na torta da castanha-do-Brasil.
25
Capítulo 4:
d) Encapsular por spray-drying o extrato da torta de castanha-do-Brasil utilizando

como material de parede Capsul® e inulina, com vistas à aplicação em alimentos.
e) Investigar a influência da proporção da mistura de material de parede (Capsul ®

e inulina) sobre características químicas e físico-químicas, assim como aestabilidade
dos compostos bioativos microencapsulados durante o armazenamento por 120 dias.
f) Caracterizar as micropartículas obtidas a partir da melhor formulação

(melhores características químicas, físico-químicas e estabilidade), quanto aos
compostos bioativos: fenólicos, tocoferóis e selênio.
26
Capítulo 1
Revisão de Literatura
27
1. A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e seus co-produtos
A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.) pertence à família lecythidaceae, é

uma oleaginosa nativa da região Amazônica. A castanheira é uma árvore que chega a atingir
até 60 m de altura com uma base de até 2 m de diâmetro médio. Seu fruto é conhecido como
ouriço, possui forma esférica ou capsular, com cerca de 20 cm de diâmetro, com casca
lenhosa bastante rígida e rugosa (Muller et al., 1995). No seu interior apresenta cerca de 10 a
24 sementes que são altamente nutritivas. As sementes da castanha também são envolvidas
por uma casca dura e rugosa em formato triangular-anguloso de cor marrom escuro que
envolve a amêndoa, que é a parte comestível da castanha-do-Brasil (Figura 1) (Muller et a.,
1995). A amêndoa da castanha-do-Brasil também é conhecida como castanha-do-pará ou
castanha-da-amazônia, castanha, castanheira, castanha-verdadeira, castanheiro, amendoeira-
da-américa, castanha-mansa e castanha-do-Brasil (Muller et a., 1995).
A B
Fonte: comida.ig.com.br
Fonte: © Zig Koch/WWF-Brasil Fonte: Coleção Viva Saúde – Hipertensão
Figura 1: Árvore da castanheira-do-Brasil (A), ouriço (fruto) (B) e as sementes (C) que contém a
amêndoa da castanha-do-Brasil (parte comestível).
É distribuída em toda a Floresta Amazônica incluindo os estados de Rondônia, Acre,

Amazonas, Pará, Roraima, Tocantins e Mato Grosso, bem como na Venezuela, Colômbia,
28
Peru, Bolívia e Guianas (Souza et al., 2006). A castanha-do-Brasil é o produto vegetal
extrativo mais importante da Amazônia em valor ecológico, social, econômico e alimentar.
Por ser um produto extrativista, a produção da castanha-do-Brasil é considerada orgânica e
sua extração ambientalmente correta. Suas amêndoas são de grande valor comercial no
mercado internacional, e representam uma alternativa de renda para os seringueiros da
Amazônia (Souza et al., 2006).
A produção brasileira de castanha concentra-se principalmente nos estados do
Amazonas, Pará e Acre, responsáveis por 80% do volume produzido. A maior parte da
castanha brasileira é exportada in natura principalmente para a Alemanha, Inglaterra e
Estados Unidos e os países concorrentes são a Bolívia e o Peru (Enriquez, 2009; Silvertown,
2004). O Brasil era considerado até 1990 o líder no mercado mundial com uma produção de
cerca de 50 mil toneladas de castanha com 80% do comércio, porém este quadro econômico
mudou e atualmente a Bolívia passou à liderança com uma produção anual de cerca de 50 mil
toneladas (CONAB, 2009; IBGE, 2010).
No entanto, a produção mundial vem sofrendo queda desde a década de 1980 devido ao
desmatamento sofrido pela floresta amazônica, ocasionando a redução dos castanhais nativos.
Este problema colocou as castanheiras-do-Brasil na “Lista Oficial de Espécies da Flora
Brasileira Ameaçadas de Extinção” definida pela Instrução Normativa MMA n°6, de 23 de
setembro de 2008 (Peres et al., 2003, IBAMA, 2008). Fatores como preço baixo na
comercialização da castanha-do-Brasil, mercado pouco atrativo, falta de incentivo para
agregar valor ao produto e falta de uma política de incentivo à produção também tem
contribuído para a redução da produção (Souza et al., 2006).
Outro fator que tem impacto na comercialização das castanhas-do-Brasil são as
condições inadequadas de manipulação durante a colheita, que favorece a contaminação por
fungos produtores de aflatoxinas, e representa uma forte limitação na comercialização do
produto especialmente no mercado externo. As aflatoxinas são produzidas geralmente pelo
fungo Aspergillus flavus, quando expostas a condições favoráveis como umidade e
temperatura elevadas, e produzem as toxinas com efeitos carcinogênicos nocivos à saúde
humana (Pacheco e Scussel, 2007).
Contudo, estratégias para diminuir este impacto negativo na produção de castanha vêm
sendo adotadas. Uma parceria ente a Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária)
e os produtores extrativistas de castanha tem gerado medidas para minimizar os problemas de
29
contaminação, através da aplicação de Boas Práticas no manejo da castanha aplicando
procedimentos que começam no momento da coleta, dentro da floresta, e se estende até a fase
de beneficiamento do produto. As Boas Práticas agregam valor ao produto e ajudam a
estabelecer preços mais justos no mercado.
Além disto, devido às características nutricionais desta oleaginosa e a sua importância
econômico-social para a região Amazônica, tem aumentado o interesse na busca por
alternativas que beneficie não só a comercialização da castanha in natura, mas seus co-
produtos. A diversidade de componentes nutricionais e funcionais da castanha do-Brasil tem
aumentado o interesse em pesquisas na sua composição com o intuito de agregar valor a esta
oleaginosa pelo aproveitamento de seus componentes bioativos e seus co-produtos
possibilitando maiores aplicações na indústria alimentícia e cosmética (Yang et al., 2009,
Kornsteiner et al., 2006).
Os principais co-produtos da castanha-do-Brasil são o óleo e a torta, que é o resíduo
sólido obtido após a extração da fração lipídica. O óleo da castanha-do-Brasil é rico em
vitamina E, e ácidos graxos insaturados como o oléico e o linoléico (Santos et al., 2013). Tem
crescido a demanda pelo seu uso particularmente devido ao aumento do uso de produtos
naturais como insumos para a indústria cosmética tanto no mercado nacional quanto
internacional, além da sua aplicação na indústria alimentícia por ser um óleo considerado
gourmet. Com este maior consumo de óleo de castanha-do-Brasil tem aumentado a produção
da torta, porém poucas aplicações tem sido dadas a este co-produto.
1.1 Composição nutricional e funcional da castanha-do-Brasil e seus co-produtos
A amêndoa da castanha-do-Brasil apresenta elevado valor nutritivo com uma rica

composição em macronutrientes e compostos bioativos. Cerca de 60% de sua composição são
de lipídios e 17% de proteínas, além de fibras, vitaminas e minerais (Yang et al 2009). A
castanha-do-Brasil é uma boa fonte de ácidos graxos composta principalmente dos ácidos
linoleico (37%), oleico (33%), palmítico (14%) e esteárico (11%) (Santos et al., 2013).
A castanha-do-Brasil tem uma composição vasta em micronutrientes, como os minerais.
Comumente eles são encontrados na seguinte ordem crescente de abundância Mg> Ca> Fe>
Cu> Cr> As> Se; esses elementos agem como cofatores para muitas funções fisiológicas e
metabólicas no organismo humano (Pacheco e Scussel, 2007; Comineti et al., 2012). O
30
selênio é um importante antioxidante da dieta e a castanha-do-Brasil é considerada uma das
principais fontes alimentares deste mineral. No entanto a quantidade de Se varia
consideravelmente entre as amêndoas, principalmente devido à concentração encontrada no
solo (Pacheco e Scussel, 2007). O elevado conteúdo de proteínas nas amêndoas de castanha-
do-Brasil colabora para o alto conteúdo de aminoácidos sulfurados (em especial metionina e
cisteína) que favorecem a absorção do selênio e outros minerais no organismo (Sun et al.,
1987; Strunz et al., 2008).
O consumo de castanha-do-Brasil tem sido associado com inúmeros benefícios para a
saúde, especialmente com a redução do risco de doenças cardiovasculares relacionadas com a
redução das frações de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) e de Muito Baixa Densidade
(VLDL), responsáveis pelo aumento do colesterol sérico (Jenkins et al., 2002). Estes efeitos
benéficos são provenientes da sua composição em componentes bioativos como os compostos
fenólicos na sua forma livre e ligada, os tocoferóis, fitoesteróis e o selênio. Estes compostos
possivelmente apresentam efeitos benéficos à saúde devido as suas propriedades
antioxidantes, antiproliferativos, anticarcinogenico e antimutagenicas (Wu et al, 2004;
Kornsteiner et al., 2006). No entanto, os dados quantitativos de alguns destes compostos na
castanha-do-Brasil e nos co-produtos, como os fenólicos, ainda são limitados (Yang, 2009;
John e Shahidi, 2010).
A castanha-do-Brasil foi aprovada como um alimento que apresenta declaração de
saúde qualificada pela FDA (Food and Drug Administration) com a seguinte declaração para
as nozes e castanhas, incluindo a castanha-do-Brasil: “Evidências científicas sugerem, mas
não provam, que a ingestão de 1,5 gramas de castanhas por dia, para a maioria das nozes
como parte de uma dieta baixa em gordura saturada e colesterol, pode reduzir o risco de
doenças cardiovasculares” (FDA, 2008).
Estudos têm reportado os efeitos benéficos à saúde pelo consumo de nozes e castanhas,
incluindo a castanha-do-Brasil. Yang et al (2009) investigou a atividade antiproliferativa de
diferentes nuts na inibição da proliferação de células humanas de câncer HepG2 e Caco-2. As
células apresentaram significativa inibição em um padrão dose-dependente, após a exposição
aos extratos das nuts. A atividade antiproliferativa pode estar relacionada ao conteúdo de
compostos fenólicos presentes nos extratos um fenólico específico ou uma classe de
compostos fenólicos presentes nas nuts. Os compostos fenólicos podem agir sinérgica e/ou
31
antagonicamente com outros compostos bioativos, como tocoferóis e selênio presentes na
castanha-do-Brasil que também exercem atividade antioxidante.
No entanto, além dos beneficios a saúde conhecidos da castanha-do-Brasil em sua
forma in natura, especialmente pela sua composição em selênio, as castanhas podem dar
origem a co-produtos que possuem características nutricionais e funcionais específicas. O
processamento das amêndoas desta oleaoginosa, especialmente daquelas que sofreram algum
tipo de injúria mecânica durante o descascamento ou que não apresentam as características
adequadas para comercialização pelo mercado externo, são alternativamente utilizadas para
extração de óleo, devido à seu alto teor lipídico.
O óleo obtido por prensagem das amêndoas da castanha-do-Brasil é um dos principais
co-produtos desta oleaginosa, o óleo obtido retém as propriedades originais da castanha-do-
Brasil e, por isso, apresenta elevador valor agregado. Ele apresenta cerca de 80% de ácidos
graxos insaturados e teores de β-tocoferol e β-sitosterol (Costa et al 2010; Chunhieng et al.,
2008). O β-tocoferol apresenta elevada ação antioxidante e pode contribuir para a estabilidade
química do óleo, prevenindo a rancidez. Por outro lado, os fitoesteróis, além de apresentarem
atividade antioxidante, conferem à castanha interessantes propriedades de inibição da
absorção do colesterol, que ajuda na prevenção de hiper-colesterololemia e doenças
cardiovasculares (Chunhieng et al., 2008). O óleo da amêndoa da castanha-do-Brasil é
límpido, apresenta coloração amarelada e odor agradável, com potencial para uso em
preparações gourmet e nas formulações de cosméticos.
A extração do óleo da amêndoa da castanha-do-Brasil por prensagem fornece como co-
produto, um resíduo sólido chamado de torta, que apresenta elevado valor energético e
nutricional. As aplicações mais convencionais desse co-produto são variadas, tais como
enriquecimento de grande variedade de alimentos como produtos de panificação, farinhas,
snacks, cereais, biscoitos, embutidos, sorvetes, chocolates, bebidas, laticínios, entre outros
alimentos (Menezes e Souza, 2004). A torta de castanha do Brasil apresenta cerca de 50% de
proteínas, tendo um conteúdo proteico maior do que a carne de gado (26 a 31% de proteínas).
A proteína da castanha é rica em aminoácidos essenciais com elevado teor dos sulfurados
(metionina e cisteína). Além de apresentar conteúdos de selênio e fibra maiores do que os
encontrados na castanha in natura (Strunz et al., 2008; Yang et al,. 2009).
32
2. Compostos bioativos em nozes e castanhas
2.1 Tocoferóis
A vitamina E é representada por um grupo de oito compostos com semelhanças

estruturais, os tocoferóis e tocotrienóis e seus homólogos α, β, γ e δ-tocoferol, são
componentes característicos dos óleos da maioria das oleoaginosas.
Os tocoferóis são derivados do 6-cromanol, assim como os tocotrienóis. Apresentam
uma estrutura química formada por um anel fenólico (cromanol) e um heterocíclico, além de
uma cadeia lateral isoprenóide de 16 carbonos saturada ligada ao carbono 2 e se diferem pelo
número e posição dos grupos metil no anel cromanol formando os homólogos α, β, γ e δ-
tocoferol (Figura 2) (Wong et al., 2014).
Tocoferol/ tocotrienol R1 R2
α CH3 CH3
β CH3 H
 H CH3
δ H H
Figura 2: Estrutura química dos tocoferóis e tocotrienóis.
Os tocoferóis são encontrados em vegetais, principalmente em sementes oleaginosas

(Tabela 1) como em óleos de grãos, nozes, gérmen de trigo, folhas e partes verdes das
plantas. São encontrados em menor quantidade em alimentos de origem animal,
principalmente gema de ovo e fígado. Os homólogos γ e o α-tocoferol são os mais abundantes
33
na maioria dos alimentos. O α-tocoferol concentra-se, principalmente, nos cloroplastos de
células vegetais, enquanto β, γ, δ-tocoferol são normalmente encontrados fora dessas
organelas (Costa et al., 2010).
Tabela 1: Conteúdo de vitamina E de algumas oleaginosas (USDA, 2004).
Diferentes nuts Teor de Vitamina E

(mg/ 100 g)
Sementes de girassol 56,5
Amêndoas 26,2
Avelã 15,2
Amendoim 7,8
Castanha-do-Brasil 7,6
Noz-pecã 4,0
A atividade antioxidante dos tocoferóis esta relacionada ao grupo hidroxila do anel

cromanol, principalmente em sua habilidade de atuar como doador de elétrons ou aceptor de
radicais livres (Nogala et al., 2004). Nos óleos, os tocóis reagem rapidamente com os radicais
livres e inibem por competição a oxidação dos ácidos graxos insaturados, retardando
especialmente a etapa de propagação. Portanto, apresenta importante papel na proteção de
óleos vegetais contra oxidação (Nogala et al., 2004).
A atividade antioxidante dos homólogos de tocoferóis apresenta a seguinte ordem de
eficácia: δ > γ = β > α. Todavia, esta ordem pode sofrer interferência de diversos fatores, tais
como temperatura, disponibilidade de oxigênio, exposição à luz, interações entre os
compostos antioxidantes e com outros componentes do meio, como ácidos graxos
quimicamente ligados a fosfolipídios ou triacilgliceróis (Chun et al., 2006).
Alguns estudos indicam que o α-tocoferol é considerado o mais potente em sua ação
antioxidante, as diferentes atividades biológicas das diversas formas do α-tocoferol não são
devido somente a sua habilidade em sequestrar o radical livre, mas também na específica
afinidade do α-tocoferol com a proteína transferase (α-TTP). A α-TTP é uma proteína que
especificamente incorpora o α-tocoferol na partícula lipoprotéica das células do fígado para o
plasma (Birringer et al.,2001; Azzi et al., 2002).
34
O α-tocoferol está presente em maior concentração no plasma humano, o que leva a sua
maior bioatividade como vitamina E. O alto consumo de α-tocoferol tem sido associado com
a diminuição do risco de doenças cardiovasculares, diabetes tipo II, hipertensão e Alzheimer
(Schwartz et al., 2008). No entanto, relata-se que apesar das baixas concentrações
plasmáticas, outras formas de tocoferóis também são capazes de exercer atividades
antioxidantes e biológicas em humanos. O γ-tocoferol, por exemplo, tem apresentado
importantes efeitos benéficos no organismo humano como agente quimio preventivo e um
potente agente na prevenção de doenças cardiovasculares (Campbell et al., 2003; Mishima et
al., 2003).
Os tocoferóis (vitamina E), a vitamina C, o β-caroteno, o selênio e os compostos
fenólicos fazem parte de um grupo denominado nos últimos anos de antioxidantes
alimentares. A ingestão destes componentes tem sido frequentemente associada à prevenção
de doenças neurodegenerativas, aterosclerose, inflamação crônica, câncer e envelhecimento
precoce. Alimentos como as nozes, amêndoas e castanhas são ricos nesses compostos
bioativos e a sua ingestão tem sido associada com alguns efeitos benéficos à saúde (Halvorsen
et al, 2006; Kaliora et al, 2006). Os efeitos de combater os radicais livres dos tocoferóis foram
relacionados à prevenção das condições associadas com processos degenerativos mediados
por radicais livres, tais como o envelhecimento, o desencadeamento de algumas formas de
carcinogênese, artrite e agregação plaquetária (Freedman & Keaney, 2001).
2.2 Selênio
O selênio (Se) é um mineral essencial para o organismo e apresenta potencial ação

antioxidante. Acredita-se que sua ação redutora ocorra por meio da ligação covalente a
proteínas, formando as selenoproteínas, como a glutationa peroxidase e a tioredoxina
redutase, que possuem propriedades antioxidantes similares (Santos et al., 2013). A glutationa
peroxidase é uma selenoproteína que atua como uma enzima antioxidante no plasma, e esta
relacionada com a diminuição do processo de envelhecimento, estimulação do sistema
imunitário e a proteção contra a doença cardíaca e determinadas formas de câncer (Yang
2009). O selênio esta presente nos alimentos na forma de Se inorgânico ou ligado a
aminoácidos livres. A maior parte do Se liga-se covalentemente com aminoácidos sulfurados
35
formando o complexo selenometionina e selenocisteína (Kannamkumarath et al., 2002;
Chunhieng et al., 2004).
A dose de ingestão diária recomendada é 55 μg/dia de selênio para homens e mulheres
adultos, é baseado na quantidade necessária para maximizar a síntese da selenoproteína
glutationa peroxidase no organismo. Entretanto, o consumo de doses elevadas desse mineral
pode promover efeitos nocivos à saúde como o risco de selenose (toxicidade crônica). Frente
a isto, foi imposto um limite de ingestão máxima tolerável (UL) de 400 μg/dia de selênio para
adultos (IOM, 2000).
O teor de selênio encontrado nos alimentos é influenciado pela quantidade desse
mineral no solo onde o alimento esta sendo cultivado. Diferentes concentrações de selênio
(8,0-69,7 μg.g-1) foram encontradas na castanha-do-Brasil de acordo com diferentes regiões
da Amazonia de onde foram originadas (Pacheco e Scussel 2007). Outro fator que afeta o teor
de selênio nos alimentos é o teor de lipídio, pois com a redução dos lipídios ocorre o aumento
das proteínas e consequentemente o aumento na composição de selênio, já que o seu conteúdo
é associado com a fração de proteína na forma de selenometionina e selenocisteína (Santos et
al, 2010).
As funções biológicas do Se incluem defesa contra estresse oxidativo, regulação da ação
dos hormônios da tireoíde e regulação do potencial redox da vitamina C e de outras
moléculas. Os efeitos benéficos à saúde pelo consumo regular de castanha-do-Brasil têm sido
relacionados com a composição em macronutrientes, micronutrientes e compostos funcionais,
especialmente o selênio (Yang, 2009; Santos et al., 2013). Devido à alta quantidade de
proteínas ricas em aminoácidos presentes em sua composição o selênio tem maior facilidade
para formar um complexo orgânico, aumentando a sua biodisponibilidade. Com isto devido a
composição da castanha-do-Brasil ela é considerada uma das principais fontes de selênio,
especialmente por apresentar elevados teores deste mineral (Moodley et al., 2007;. Santos et
al., 2013; Yang, 2009).
2.3 Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário das plantas

produzidos como resposta a situações de estresse que são submetidas, como raios UV e
patógenos, entre outros (Ignat et al., 2011). Estes compostos apresentam considerável
36
importância fisiológica e morfológica em plantas, pois atua no crescimento, reprodução,
proteção contra agentes patogénicos e predadores (Bravo, 1998). Além disso, apresentam
importantes funções nas características sensoriais, como nas cores, de frutas e vegetais
(Alasalvar et al., 2001). Do mesmo modo, apresentam funções biológicas no organismo
humano, onde seu consumo tem sido relacionado com inúmeros efeitos benéficos à saúde.
Existem mais de cinco mil compostos fenólicos os quais englobam desde moléculas
simples até moléculas com alto grau de polimerização. Químicamente são compostos
fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina que possuem anel aromático com um ou mais
substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais (Nack e Shahidi, 2004;
Balasundram et al., 2006). A fenilalanina amônia-liase (PAL) é a enzima chave na regulação
da via metabólica de fenilpropanóides convertendo a L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico
e iniciando a biossíntese de fenólicos (Figura 3). Fatores genéticos irão determinar quais
classes e subclasses desses compostos serão sintetizadas (Nack e Shahidi, 2004).
Figura 3: Biossíntese dos compostos fenólicos (Naczk e Shahidi, 2004).
37
Os compostos fenólicos são classificados devido às diferenças em sua estrutura
química, de acordo com o número de anéis fenólicos e grupamentos que os ligam. As
principais classes de compostos fenólicos são os ácidos fenólicos, flavonóides, taninos
(hidrolisáveis e condensados), ligninas e estilbenos (Ignat et al, 2011).
Os ácidos fenólicos constituem cerca de um terço dos compostos fenólicos em
alimentos, os quais podem estar presentes nas plantas, nas formas livres ou ligadas, por
ligações éster, éter ou acetal (Robbins, 2003; Zadernowski et al., 2009). Consistem em dois
subgrupos, os ácido hidroxibenzóico e os ácido hidroxicinâmico (Figura 4). Os ácidos
hidroxicinâmicos têm a característica de ser compostos antioxidantes mais ativos do que os
ácidos benzóicos, devido à dupla ligação presente na molécula dos derivados do ácido
cinâmico participar da estabilidade do radical por ressonância de deslocamento do elétron
desemparelhado, enquanto que os derivados do ácido benzóico não apresentam essa
característica (Balasundram et al., 2006).
Figura 4: Estrutura química básica dos ácidos fenólicos: hidroxibenzóico (a) e hidroxicinâmico (b)
(Angelo e Jorge, 2006).
A estrutura química dos flavonóides consiste em dois anéis aromáticos denominados

anel A, derivado do ciclo acetato/malonato e B derivado da fenilalanina por meio da via do
chiquimato, unidos por três carbonos que formam um anel heterocíclico, denominado anel C
(Figura 5). Variações em substituição do anel C na estrutura dos flavonóides resultam em
importantes subclasses como flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanóis (ou catequinas),
isoflavonas e antocianidinas. E as substituições dos anéis A e B originam diferentes
compostos dentro de cada subclasse de flavonóides. Estas substituições podem acontecer por
38
reações de oxigenação, alquilação, glicosilação, acilação e sulfação (Balasundram et al.,
2006).
Figura 5: Estrutura química básica dos flavonoides (Balasundram et al., 2006).
Os compostos fenólicos, incluindo antocianinas, flavonóides e ácidos fenólicos, são

conhecidos por serem responsáveis pela capacidade antioxidante dos alimentos impedindo a
oxidação lipídica e combatendo o estresse oxidativo (Slusarczyk et al., 2009). Além disto, os
compostos fenólicos apresentam muitas aplicações industriais, devido às suas propriedades
como conservantes e corantes de alimentos. Os compostos fenólicos têm potenciais efeitos no
sistema biológico, estudos têm demonstrado que quando consumidos regularmente por seres
humanos, os compostos fenólicos têm sido associados com uma redução na incidência de
doenças, tais como ateroclerose, obesidade, diabete tipo 2, câncer e doenças cardiovasculares
(Luthria et al., 2006; Liu et al., 2008; Ross et al., 2009). O aumento dos efeitos benéficos a
saúde com o aumento do consumo de compostos fenólicos tem favorecido mais pesquisas que
caracterizem estes compostos em diferentes matrizes alimentares e investiguem a sua ação no
organismo humano.
As principais fontes de compostos fenólicos são as frutas, legumes e folhas, mas
ultimamente diferentes resíduos agrícolas e industriais têm sido investigados como potenciais
fontes destes compostos bioativos (Ignat et al, 2011; Roos et al., 2009). Os resíduos e
subprodutos, remanescentes após o processamento de frutas e vegetais na indústria de
processamento de alimentos, ainda contêm uma grande quantidade de compostos fenólicos
que na maioria das vezes acabam não sendo reaproveitados. Dentre estes resíduos destacam-
se os da casca e bagaço obtidos na indústria de suco e vinhos, considerados ricas fontes de
compostos bioativos (Lapornik et al., 2005 ), além dos coprodutos (torta) produzidos na
indústria de extração de óleos vegetais, como de azeite e óleo de soja, que também são uma
fonte potencial de compostos fenólicos.
39
O teor dos compostos fenólicos em muitos alimentos ainda é determinado através de
análises espectrofotométricas, onde são investigados os teores de compostos fenólicos totais
presentes na matriz alimentar. O método de Follin-Ciocalteu é o mais utilizado. Baseiam-se
na redução do ácido fosfomolíbdico e fosfotúngstico pelas hidroxilas fenólicas da amostra, o
número de grupos hidroxilas ou de grupos potencialmente oxidáveis, que forma o óxido de
tungstênio e molibdênio em meio alcalino, responsáveis pela coloração azulada formada nas
moléculas reduzidas (Tsao e Yang, 2003 e Lapornik et al., 2005). A intensidade da cor do
complexo produzido é medida pela absorvância da solução em 760 nm.
O teor de fenólicos totais é calculado geralmente utilizando uma curva de calibração de
equivalente de ácido gálico. Porém este método espectrofotométrico não é um método
específico, pois detecta todos os grupos fenólicos presentes na amostra, incluindo aquelas
proteínas extraíveis. Outra desvantagem é a interferência de reduzir substâncias como ácido
ascórbico. Estes interferentes podem levar à superestimação do conteúdo de fenólicos de
extratos de origem vegetal, devido à sobreposição de respostas espectrais (Naczk e Shahidi,
2004; Ignat et al., 2011).
No entanto, técnicas mais específicas como a cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) têm sido amplamente utilizadas para a separação e quantificação de compostos
fenólicos em alimentos. Esta técnica permite identificar e quantificar especificamente os
componentes que estão presentes na matriz alimentar. São amplamente utilizadas na
elucidação da estrutura quando usadas em combinação com a espectrometria de massas, bem
como outras técnicas relevantes (Naczk e Shahidi, 2004).
Além disto, a extração dos compostos fenólicos em alimentos vegetais é um passo
muito importante no isolamento, identificação e aplicação. Esta etapa é influenciada pela
natureza química dos fenólicos, o método de extração, tamanho de partícula da amostra, o
tempo, temperatura e as condições de armazenamento, assim como a presença de substâncias
interferentes (Bucić-Kojić et al., 2007). Embora nas duas últimas décadas tenha ocorrido um
aumento nas pesquisas sobre a composição de fenólicos em alimentos, ainda não existe um
procedimento padrão para preparação da amostra, extração e análise cromatográfica dos
compostos fenólicos (Ignat et al., 2011). Portanto, existe a necessidade de desenvolver
procedimentos analíticos mais robustos, seletivos e sensíveis para a determinação simultânea
das importantes classes e subclasses de compostos fenólicos nos alimentos (Tsao e Yang,
2003; Liu et al., 2008).
40
3. Capacidade antioxidante
A castanha-do-Brasil devido a sua elevada composição em minerais, especialmente o

selênio e os tocoferóis tem sido considerada um alimento com potencial efeito antioxidante
(Chunhieng et al., 2008; Costa et al., 2010; Santos et al., 2013). Os antioxidantes são
compostos naturais ou sintéticos que quando presentes mesmo em baixa concentração,
comparada à concentração do substrato oxidante, previne significativamente ou atrasa as
reações de oxidação e seus efeitos danosos aos alimentos ou organismo. Os antioxidantes
apresentam elevada estabilidade oxidativa e possuem a propriedade de prevenir a oxidação de
outras substâncias, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios (Perez-Jimenez et al., 2008).
Os alimentos como frutas, hortaliças e vegetais são as principais fontes naturais de
compostos antioxidantes devido a sua rica composição de compostos bioativos como os
compostos fenólicos, vitamina E, minerais como selênio e zinco, carotenoides entre outros
(Zuleta et al., 2009). A presença destes compostos nos alimentos tem sido relacionada com a
prevenção do estresse oxidativo, uma das principais causa de inúmeras doenças crônicas
como câncer, diabetes e doenças cardiovasculares.
O estresse oxidativo é resultado do desequilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio
(ERO) e o sistema de defesa antioxidante presente no organismo ameaçando a função normal
da célula ou do organismo. Inúmeros fatores colaboram para o aumento na produção das
EROs como uma resposta do organismo durante processo inflamatório, consequência de
doenças, por fatores externos e estilo de vida, como exposição a herbicidas, toxinas,
tabagismo, alcoolismo, poluentes ambientais e radiação (Valkon et al., 2007). O aumento na
produção das EROs no organismo ocorre quando o mecanismo de defesa esta comprometido
devido a redução dos principais agentes de defesa antioxidante enzimáticos, que são as
enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) (Gálvez,
2010). E pela ingestão reduzida de compostos antioxidantes provenientes da dietaerro
(Blomhoff, 2005). Causando danos moleculares e aos tecidos do organismo como no DNA,
proteínas, lipídios e genes. E consequentemente o organismo ficar mais suscetível ao
aumento do risco de doenças como diabetes, doenças neurodegenerativas, câncer e doenças
cardiovascular (Gutteridge e Halliwell, 2000; Blomhoff, 2005). As principais ERO
produzidas são hidroxila (OH•), íon superóxido (O2-•), alcoxila (RO•), peroxila (ROO•),
41
peróxido de hidrogênio (H2O2) e peridroxila (HOO•). Além de oxigênio singlete, complexos
de metais de transição, radicais de nitrogênio entre outros.
O sistema de defesa antioxidante para combater as EROs e manter o equilíbrio
oxidativo é formado pelos antioxidantes enzimáticos como as superóxido dismutase, catalase
e glutationa peroxidase, juntamente com os antioxidantes não enzimáticos, como as vitaminas
C e E, carotenoides e compostos fenólicos (Blomhoff, 2005). A capacidade antioxidante dos
compostos fenólicos esta relacionada com a sua estrutura química. O número e a configuração
de grupamentos hidroxil doadores de hidrogênio, assim como as duplas ligações conjugadas,
parecem ser os principais fatores estruturais a influenciar a atividade antioxidante (Wada et
al., 2007).
A capacidade antioxidante total (CAT) de diversos compostos nos alimentos pode ser
mensurada através de metodologias in vitro. Os métodos químicos para determinação da
atividade antioxidante estão divididos quanto à natureza da reação envolvida, em dois grupos
principais, os que envolvem transferência de elétrons e os que envolvem transferência de
átomos de hidrogênio. Eles se diferenciam quanto ao radical iniciador, à cinética da reação e
às reações laterais. (Huang e Prior, 2005).
Cada ensaio usado nos métodos se difere pelo grau de complexidade, sensibilidade,
mecanismos e espécies reativas envolvidas. Dentre os métodos baseados na transferência de
átomos de hidrogênio, estão o ORAC (oxygen radical absorbance capacity), o TRAP (total
radical trapping antioxidant parameter) e o LDL (lipoproteína de baixa densidade). A
maioria destas metodologias baseia-se na reação competitiva entre o antioxidante e o
substrato para formação do radical por decomposição de compostos azo, permitindo o
acompanhamento da reação por ultravioleta ou por fluorescência (ORAC) (Huang e Prior,
2005). Já entre os métodos que o mecanismo de ação envolve a transferência de elétrons,
destacam-se o ABTS expresso em TEAC (Trolox® equivalence antioxidant capacity), o
FRAP (ferric ion reducing antioxidante parameter) e o DPPH (diphenil-1-picryhydrazyl). As
metodologias que envolvem a transferência de elétrons baseiam-se na redução do substrato
por ação dos componentes antioxidantes presentes na amostra, que apresentam
comportamento espectral distinto no estado oxidado e reduzido (Re et al. 1999; Huang and
Prior, 2005). Porém é importante destacar que a atividade antioxidante medida in vitro sugere
a bioatividade do composto ou mistura que esta sendo analisada, não a determina. A avaliação
de atividade antioxidante baseada em metodologias in vitro deve ser feita com cautela uma
42
vez que as mesmas não consideram fatores como biodisponibilidade, estabilidade do
composto in vivo e retenção dos antioxidantes (Huang e Prior, 2005). Além disso, o efeito do
composto antioxidante numa matriz alimentar pode ser significativamente diferente da sua
atividade no extrato purificado, como geralmente é feita a medição da atividade antioxidante
dos alimentos (Brewer, 2011).
4. Espectrometria de Massas de Alta Resolução (EMAR) na determinação de compostos

fenólicos
A espectrometria de massa (EM) tem evoluído desde 1940 com a melhoria das
tecnologias de vácuo e fontes de íons e o desenvolvimento do analisador de massa quadrupolo
em 1953. Hoje, após um constante aprimoramento desta tecnologia um espectrômetro de
massa passou a ser um equipamento quase que padrão em um laboratório analítico moderno,
indispensável para a investigação científica em um nível elevado. Devido às diferentes
características instrumentais em ionização, resolução, velocidade de digitalização e
fragmentação MS é uma técnica versátil, com aplicações descritas a partir de estudos de
astronomia, geofísica, biologia e medicina.
Dentre as aplicações da espectrometria de massas destacamos a análise de metabólitos
secundários em plantas, pois esta é uma tarefa desafiadora devido à sua diversidade química,
geralmente baixa concentração e variabilidade, mesmo dentro da mesma espécie. A
espectrometria de massa possibilita a identificação com elevada precisão e especificidade das
moléculas além de possibilitar a elucidação das estruturas químicas de moléculas, tais como
peptídeos, polifenóis e os outros compostos químicos.
O princípio da EM consiste na ionização dos compostos químicos para gerar moléculas
carregadas ou fragmentos de moléculas e medir sua razão massa-carga (m/z) (Sparkman,
2000). As principais fontes utilizadas para analisar compostos fenólicos são: bombardeamento
atómico rápido (FAB), ionização por eletrospray (ESI), ionização a pressão atmosférica (API),
incluindo a ionização química a pressão atmosférica (APCI), pressão atmosférica foto-
ionização (APPI) e Ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) (Fulcrand et
al., 2008 ).
As técnicas de cromatografia de espectrometria de massa atualmente são consideradas
uma das melhores abordagens analíticas para estudar os polifenóis em amostras de vegetais, e
43
são a ferramenta mais eficaz no estudo da estrutura de flavonoides. A abordagem EM/EM é
uma ferramenta muito poderosa que permite a caracterização de molécula complexas como as
procianidinas, proantocianidinas, prodelphinidinas e taninos (Flamini, 2003).
A aplicação da técnica de High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS) ou no
português Espectometria de Massas de Alta Resolução (EMAR) tem crescido nos últimos
anos. Inicialmente suas principais aplicações eram no estudo de metabolismo de drogas com o
intuito de controle toxicológico de medicamentos e desenvolvimento de novas substâncias,
além do controle de doping. O EMAR é uma importante ferramenta analítica em
metabolômica esta técnica fornece a medição de massa exata, o que é útil na discriminação de
íons com a mesma massa nominal e fornece dados sobre a composição elementar de
compostos para posterior identificação. Apresenta alta sensibilidade em modo de aquisição de
varredura completa e de alta precisão em massa (Maurer et al., 2013). Com o mesmo
instrumento pode-se realizar uma variedade de funções: target (análise qualitativa dirigida) e
non-target (analise qualitativa não dirigida). A futura tendência no uso da EMAR é a
realização de um procedimento sistemático onde são analisados os analitos no modo target,
ou seja, com o uso de padrões de referência e no modo non-target onde é realizada uma
triagem investigando compostos que supostamente podem estar presentes na amostra sem o
uso de padrões de referência (Krauss et al., 2010). A análise non-target é bastante trabalhosa,
difícil e demorada especialmente quando não existem bancos de dados para os compostos
investigados. O procedimento de análise non-target é iniciado pela detecção automatizada
pela massa exata na corrida cromatográfica, seguido pela obtenção da fórmula elementar para
a massa exata de interesse, e posteriormente uma busca das possíveis estruturas para essa
massa exata em bancos de dados químicos disponíveis para determinar sua fórmula elementar
(Krauss et al., 2010). A utilização de grandes bibliotecas de espectros de massa (teórico e/ou
empírica) podem facilitar a identificação e detecção dos possíveis compostos.
O analisador de massa utilizado com a EMAR tem sido o Orbitrap. Este analisador
opera por armadilha de íons em torno de um eletrodo central e mede os valores de m/z a partir
da freqüência das oscilações harmónicas de iões (Figura 6). Este dispositivo tem alta
resolução de massa (> 100.000 FWHM) e alta precisão de massa (<5 ppm). Sua principal
desvantagem é a sua velocidade de varredura, que é inversamente proporcional à resolução de
massa. Apenas uma varredura por segundo pode ser adquirida ao selecionar a resolução de
100.000, o que afeta a reprodução do formato de pico cromatográfica. Assim é necessário
44
estabelecer um faixa ideal de trabalho entre a resolução e a faixa de varredura de m/z
estipulada (Makarov e Scigelova, 2010; Kellman et al., 2009).
HCD Collision Cell

C-Trap
Quadrupolo
Lentes
ESI
Figura 6: Esquema representativo do analisador Orbitrap Qexactive (Michalski et al., 2011).
Devido ao alto poder de resolução da EMAR estudos recentes tem aplicado esta técnica
para investigar a identidade de compostos fenólicos em amostras de alimentos. Hiffault et al.
(2014) utilizando a EMAR sugeriu a identificação de 60 compostos fenólicos presentes em
diferentes partes de Rosa hybrida cv. Outros estudos reportam a aplicação desta técnica na
identificação non-target de antocianinas, taninos e outros flavonóides em amostras complexas
de alimentos (Lin et al., 2011; Sun et al., 2012).
5. Encapsulamento
A encapsulação é a tecnologia utilizada para empacotar sólidos, gotículas de líquidos ou

material gasoso com finas coberturas poliméricas, formando pequenas partículas definidas de
acordo com o tamanho em macrocápsulas (>5000 μm), microcápsulas (0,2-5000 μm) e
nanocápsulas (<0,2 μm) (Reineccius, 2004; Dessai and Park, 2005). As cápsulas são formadas
pelo núcleo, também denominado material encapsulado, que pode ser uma mistura de
substâncias ou um material puro, que é o material ativo que se deseja encapsular . Já o material
que forma a cápsula conhecido como encapsulante, material de parede ou matriz, pode ser um
45
carboidrato, gomas, proteínas, polissacárideos naturais ou modificados, lipídios e polímeros
sintéticos (Gibbs et al., 1999; Mozafari, 2006; Wandrey et al., 2009).
Dependendo da técnica aplicada na obtenção das cápsulas e, do material de parede
utilizado, as partículas produzidas recebem diversas classificações de acordo com a
morfologia obtida. Dentre as morfologias mais comuns destacam-se as micropartículas,
quando apresentam um núcleo disperso na matriz encapsulante, e as microcápsulas, quando
apresenta um núcleo bem definido (Fang e Bhandari, 2010) (Figura 7).
Material de parede Material de parede
Núcleo Núcleo
(A) (B)
Figura 7: Modelos das principais formas de encapsulação: microcápsula (A) e micropartícula(B).
A encapsulação é aplicada na indústria alimentícia para melhoria nas características

sensoriais dos alimentos, desenvolvimento de novos produtos com propriedades funcionais e
melhoria na conservação de componentes, como vitaminas e aromas (Dessai and Park, 2005).
As cápsulas apresentam propriedades de reduzir a reatividade do núcleo com o ambiente,
diminuir a velocidade de evaporação ou transferência do material do núcleo para o meio,
facilitar a manipulação do encapsulado, promover a liberação controlada, mascarar odor e
sabor desagradáveis, além de promover a diluição homogênea do material encapsulado em um
produto alimentício (Shahidi and Han, 1993). O crescente uso da tecnologia de encapsulação
na indústria alimentícia tem ocorrido devido às novas necessidades em desenvolver produtos
com propriedades cada vez mais complexas nas formulações e a busca por adição de
substâncias que promovam a saúde, como a adição de vitaminas, minerais e componentes
bioativos que são aplicados mais facilmente pelo uso desta tecnologia (Gouin, 2004). A
encapsulação permite melhorar a aplicação de moléculas bioativas em alimentos (por
exemplo, antioxidantes, minerais, vitaminas, fitoesteróis, luteína, ácidos graxos, carotenoides)
e células vivas (por exemplo, probióticos) (Wandrey et al., 2009). Estes compostos bioativos
normalmente são instáveis e se degradam com uma maior facilidade devido às condições do
meio como, temperatura, luz, umidade e oxigênio ou as condições gastrointestinais após a
ingestão. O encapsulamento dessas substâncias promove uma proteção efetiva preservando
46
suas características sensoriais e funcionais, além de através da liberação controlada
proporciona maior biodisponibilidade destes compostos no organismo e com isto, potencializa
seus efeitos benéficos à saúde (Dessai and Park, 2005).
5.1 Agente encapsulante
A escolha do agente encapsulante é um dos principais critérios para definir as

características e aplicações das partículas desenvolvidas, relacionando-se à funcionalidade e a
estabilidade das partículas que se deseja obter. Algumas características que podemos destacar
para escolha do material de parede são: promover uma boa formação de filme, ter baixa
higroscopicidade, evitando a formação de aglomerados, baixa viscosidade, sabor e odor
suaves, ser de fácil reconstituição (solubilidade), não ter reatividade e ser insolúvel com o
núcleo, ser capaz de formar barreira e ter um baixo custo (Nedovic et al., 2011).
São inúmeros os critérios para a escolha de um material de parede ideal, e muitas vezes
um único material não engloba todas as características necessárias para obtenção da partícula,
havendo a necessidade do uso de misturas de agentes encapsulantes (Wandrey et al., 2009).
Além disso, um fator importante na determinação do agente encapsulante é o conhecimento
das regulamentações de segurança sobre a permissão da aplicação deste aditivo em alimentos,
um dos critérios é que eles sejam considerados GRAS (geralmente reconhecido como seguro)
pelas agências reguladoras, como a Food and Drug Administration (FDA) (Wandrey et al.,
2009; Nedovick et al., 2011).
Dentre os materiais encapsulantes, podemos citar a goma arábica, o alginato, amido,
amido modificado, dextrinas, sacarose, celuloses, mono e diacilgliceróis, óleos e gorduras,
caseína, gelatina e os materiais inorgânicos como sulfato de cálcio e silicatos (Jackson and
Lee, 1991) Entre todos os materiais, o mais amplamente usado para a encapsulação em
aplicações alimentares são os polissacarídeos.
Um agente encapsulante que tem sido bastante utilizado na indústria alimentícia, devido
ao seu baixo custo é o Capsul®; este é o nome comercial do amido modificado desenvolvido
pela National Starchand Chemical Corporation, dos Estados Unidos. Foi realizada uma
modificação química no amido de milho ceroso, através da adição de um componente
lipofílico, o octanil succinato (Aburto et al., 1998; Ruan et al., 2009). Este composto é ligado
47
covalentemente ao amido conferindo excelentes propriedades emulsificantes (Figura 8)
(Rocha et al., 2012).
Figura 8: Estrutura química do Capsul® (amido modificado pela adição do

componente octenilsuccinato na molécula).
A molécula de amido modificado produzida passa a ter as características de

hidrofobicidade do octenilsuccinato e mantém a hidrofilicidade do amido resultando com isto
em uma molécula com caráter anfipático (Wang et al., 2001; Sweedman et al., 2013). Isto
torna o Capsul® um interessante agente encapsulante já que além de seu baixo custo, passa a
ter maior propriedade emulsificante e baixa viscosidade. O Capsul ® tem sido considerado um
substituto de proteínas e da goma arábica, devido seu custo ser em media três vezes menor,
além de ser utilizado em menor quantidade no processo de encapsulação e ser facilmente
obtido de matérias primas comum, tais como mandioca, milho, batata e trigo (Cardello et al.,
1996; Finotelli, 2002).
Outro composto que apresenta características interessantes para ser aplicado como
agente encapsulante é a inulina, pois além de apresentar propriedade de encapsulante é um
ingrediente alimentar prebiótico. A inulina é um frutooligossacarídeo (FOS) formada por
ligações glicosídicas do tipo β(2-1) entre as unidades de D-frutose em cadeia linear a qual tem
no final da cadeia uma ligação terminal frutose-glicose (Figura 9) (Kelly et al., 2009;
Bakowska-Barczak and Kolodziejczyk, 2011).
48
α-D-Glicose
β-D-frutose
n
Figura 9: Estrutura química da inulina (Barclay et al., 2010).
As principais fontes de inulina na indústria de alimentos são a chicória (Cichorium

intybus) e a alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus) (Carabin e Flamm, 1999; Kaur e
Gupta, 2002). A inulina é obtida por extração com água quente, seguida de purificação e
cristalização. O grau de polimerização da inulina varia de 2 a 60 unidades de acordo com a
fonte de que é extraída e o processo de extração (Franck et al., 2002). O grau de
polimerização influência nas propriedades fisiológicas da inulina, pois dependendo do
comprimento da cadeia, a velocidade da reação metabólica vai ser mais lenta e isso influência
as funções fisiológicas (Roberfroid et al., 2007). Dentre as propriedades tecnológicas da
inulina destacam-se seu uso como substituinte da sacarose, como um adoçante de baixo valor
calórico podendo ser utilizado em alimentos para diabéticos, substituto de gorduras ou agente
de texturas (Stevens et al., 2001 Wada eta al., 2005; Bot et al., 2004).
Os prebióticos são componentes alimentares não digeríveis que estimulam
seletivamente a proliferação ou atividade de populações de bactérias da microbiota intestinal
no cólon. Adicionalmente, o prebiótico pode inibir a multiplicação de patógenos, garantindo
benefícios adicionais à saúde. Esses componentes atuam mais frequentemente no intestino
grosso, embora eles possam ter também algum impacto sobre os microrganismos do intestino
delgado (Stevens et al., 2001 Wada eta al., 2005; Bot et al., 2004). A inulina é caracterizada
como um prebiótico devido à sua composição em fibras alimentares solúveis não digeríveis
49
pelas enzimas do trato digestivo humano. A inulina é reconhecida como um ingrediente com
alegação de propriedade funcional quando o produto pronto para consumo apresentar
quantidade de 3% de fibra alimentar (ANVISA 2008).
Portanto a aplicação da combinação de inulina com Capsul ® é uma alternativa para o
desenvolvimento de alimentos com apelo funcional devido às propriedades prebióticas da
inulina, promovendo benefícios adicionais à saúde. Estudos têm aplicado estes materiais de
parede para o encapsulamento de compostos fenólicos com o intuito de proteger contra perdas
das propriedades funcionais e características sensoriais, como a cor de antocianinas durante o
armazenamento. Silva et al. (2013) utilizou Capsul como material de parede para encapsular
própolis e observou uma baixa perda (cerca de 7%) dos compostos fenólicos após 60 dias de
armazenamento a 25°C. Saénz et al. (2009) investigaram a microencapsulação com inulina ou
maltodextrina dos compostos bioativos da polpa e extrato etanólico de cactos (Opuntia ficus-
indica) em diferentes condições de armazenamento e observaram um aumento de compostos
fenólicos em todos os sistemas durante o armazenamento a 60 °C. Os autores descrevem que
as microcápsulas obtidas representam um aditivo alimentar interessante para incorporação em
alimentos funcionais, devido tanto ao efeito antioxidante quanto suas aplicações como corante
natural.
5.2 Spray Drying
O método de encapsulamento mais aplicado na indústria alimentícia é a atomização

(Spray drying), pois esta é uma técnica econômica, flexível, operada de modo contínuo
(permitindo produção em grande escala), e produz partículas de boa qualidade (Desai and
Park, 2005; Nedovic et al., 2011). As partículas são obtidas da seguinte forma: o material do
núcleo é homogeneizado com o agente encapsulante formando uma
solução/emulsão/suspensão estável (dispersão do material ativo, que pode ser de natureza
hidrofóbica, no meio que contém a matriz de encapsulamento); A mistura é em seguida
introduzida no spray dryer e atomizada e seca instantaneamente, pela evaporação do solvente
através de uma corrente de ar quente; obtendo-se assim partículas em pó esféricas com
tamanho médio de 10–100 μm. Característica de elevada importância do ponto de vista
sensorial e de textura do produto final para aplicação, por exemplo, na indústria alimentícia
(Gharsallaoui et al., 2007; Nedovic et al., 2011).
50
Esta técnica ainda tem a vantagem de possibilitar uma rápida evaporação (evitando a
perda por degradação de alguns compostos bioativos), boa retenção de compostos voláteis e
elevado rendimento devido à elevada eficiência de encapsulamento (Parra-Huertas, 2010). A
remoção de água e a diminuição da atividade da água por spray drying são frequentemente
utilizadas na indústria alimentar, assegurando a estabilidade microbiológica do produto final,
prevenindo degradações químicas e/ou biológicas e associando baixos custos ao
armazenamento e transporte. Esta técnica permite, ainda, obter produtos com propriedades
específicas, como por exemplo, a solubilidade instantânea (Fang and Bhandari, 2010).
Contudo, uma limitação da técnica de secagem por spray drying é a necessidade de que
o material encapsulante seja disperso em água, o que limita a quantidade de materiais de
parede que podem ser aplicados (Desai and Park, 2005). Além de haver dificuldade no
controle do tamanho e da forma das cápsulas, devido às condições não uniformes da câmara
de secagem, e também, da possibilidade de perda do material ativo pela aderência ao interior
da câmara de secagem (Gharsallaoui et al., 2007).
A microencapsulação dos compostos fenólicos possibilita uma maior estabilidade destes
compostos que são pouco estáveis quando presentes em solução, como no extrato da torta de
castanha-do-Brasil, estando mais suscetíveis a degradação e oxidação devido a efeitos do
oxigênio e da luz. Além disto, a transformação do conteúdo de fenólicos de extratos na forma
de pó possibilita uma maior aplicação dos fenólicos como aditivos em uma maior variedade
de alimentos.
A ingestão de compostos fenólicos em alimentos contribui para os benefícios a saúde
devido às funções biológicas destes componentes como atividade antioxidante, anti-
inflamatória, bactericida e funções antivirais (Bennick, 2002; Haslam, 1996). Tendo ação na
prevenção e diminuição do risco de inúmeras doenças como câncer, doenças cardiovasculares,
doenças neurodegenerativas, diabetes e osteoporose (Manach et al, 2004).
Frente aos inúmeros efeitos benéficos a saúde, causados pelo consumo de compostos
fenólicos, vários estudos têm aplicado a tecnologia de microencapsulação para melhorar a
estabilidade, promover uma liberação controlada do ativo, favorecer o aumento da
biodisponibilidade e facilitar a aplicação das micropartículas de fenólicos em diversas
matrizes alimentares (Bakowska-Barczaka and Kolodziejczyk, 2011; Balasubramani et al.,
2013).
51
Capítulo 2
Optimized extraction of polyphenolic antioxidant
compounds from Brazil nut (Bertholletia excelsa)
cake, and polyphenols profile by HPLC
Manuscript submitted to Journal of the Science of Food and Agriculture

(JSFA-15-0062)
52
ABSTRACT
BACKGROUND: The solid residue (cake) of pressed Brazil nut oil presents high energy
value, nutrients and bioactive compounds, such as polyphenols. However, little is known on
these components in this by-product. Extraction is the first step to start researching phenolic
compounds in Brazil nut cake, because extraction conditions might impact on yields of
phenolic compounds and antioxidant capacity. The aim of this study was to select the best
extraction conditions of phenolic compounds from Brazil nut cake, by means of factorial
experimental design, and to characterize the extract in its phenolic compounds.
RESULTS: The most favored extraction of antioxidant phenolic compounds from Brazil nut
cake was achieved with the following conditions: ethanol:water, 40:60 (v/v); 2.5 min
homogenization with Ultra-turrax®; one-hour extraction, at 60°C. Phenolic compounds
profile in Brazil nut cake extract from the optimized extraction was determined by HPLC-
PDA. Six phenolic acids (gallic acid, protocatechuic acid, 2,4-dihydroxybenzoic acid, p-
hydroxybenzoic acid, p-coumaric acid, sinapic acid) and one flavonoid ((+)-catechin) were
identified, and in contents (mg kg-1) varying from 70.0 to 421.
CONCLUSION: Knowledge concerning Brazil nut cake potential bioactivity might stimulate
its upgrading in the food industry, owing to this by-product’s bioactive properties.
Keywords: Brazil nut, Phenolic compounds, Extraction, Antioxidants, By-product
53
1. INTRODUCTION
The intake of nuts in general increased in the last decade in affluent societies
(Fernández-Montero et al., 2014; Vadivel et al., 2012) partly because nuts consumption is
related to reduced risk of cardiovascular diseases, type 2 diabetes and certain types of cancer
(Chen et al., 2006; Kornsteiner et al., 2006; Nishi et al., 2014). Among tree nuts, Brazil nut
(Bertholletia excelsa) stands out for its nutrients and bioactives composition, including
selenium, tocopherols, unsaturated fatty acids, proteins, amino acids, dietary fiber and
phenolic compounds (Yang, 2009). The Brazil nut tree is native from the Amazon rainforest
and it is obtained by extractive activity, having a fundamental socioeconomic role as a
sustainable economic activity in the region. Brazil nut is one of the main export products of
the Amazon rainforest (40,357 tons per year) due to increasing demands mainly related to
foreign trade (Wadt et al., 2008; IBGE, 2010).
Besides commercialization of the whole almond, oil extraction is an interesting use of
Brazil nut. Cold- or expeller-pressing are the major processes used for Brazil nut oil
extraction, and result in formation of an energy- and nutrient-dense solid by-product, the
Brazil nut cake. The most conventional applications of Brazil nut cake are as animal feed
component, nutrient-enricher and flavor additive for a variety of food products such as bakery
products, snacks, cereal-bars, cookies, ice-creams, chocolate bars, among other products
(Matthaus, 2002; Santos et al., 2013). However, these applications end up not taking
advantage of the potential hydrophilic bioactive compounds from Brazil nut, such as phenolic
compounds.
Intake of foods containing phenolic compounds has been associated with potential
beneficial health effects related to anti-inflammatory, antimutagenic and anticarcinogenic
activities (Chen and Blumberg, 2008; Colpo et al., 2014). In this context, nuts are good
sources of different classes of phenolic compounds such as phenolic acids, flavonoids,
stilbenes among other classes (Fukuda et al., 2003; Wijeratne et al., 2006). The extraction of
hydrophilic phenolic compounds before using Brazil nut cake as an ingredient in food and
feed may contribute in added-value product development.
Extraction of phenolic compounds is generally restricted by their diversity regarding
chemical structures and physical-chemical properties. Therefore, extraction conditions affect
extraction yield of phenolic compounds and antioxidant activity (Chan et al., 2009).
54
Extraction solvents selection is critical for complex food matrices, because physical-chemical
properties of solvents, especially their polarity, exert direct influence on the amounts and
types of phenolic compounds recovered (Wu et al., 2004; Balasundram et al., 2006). Solvents
most used for extraction of phenolic compounds are methanol, acetone, ethanol, propanol, and
ethyl acetate (Chan et al., 2009). The use of low-toxicity solvents obtained from renewable
resources is also a current concern related to sustainability of future applications (Nepote et
al., 2005). Besides solvents used, other factors such as temperature, extraction time and
homogenization also affect extraction, which exhibit different behavior according to the food
matrix under investigation (Luthria et al., 2006; Granger et al., 2011; Tomsone et al., 2012).
High temperatures might promote compounds’ degradation, loss of antioxidant properties and
solvent evaporation that might lead to loss of extraction efficiency (Zheng and Wang, 2001).
Therefore, moderate temperatures (40, 50 and 60 °C) are the most suitable to achieve a
satisfactory compromise for extraction of phenolic compounds from foods. Additionally, long
extraction times may lead to oxidation and chemical losses of the phenolic compounds,
promoted by extended exposure to oxygen and light that would lead to decreased antioxidant
activity. Therefore, optimized extraction time should be a compromise between the time
required for the partition equilibrium to occur promoting effective extraction of matrix
components, without harming the bioactive properties of target compounds (Zheng and Wang,
2001).
Investigations concerning phenolic compounds in Brazil nut cake are scarce and, to the
best of our knowledge, extraction of these bioactive compounds from this by-product was not
investigated. Knowledge concerning Brazil nut cake potential bioactivity might encourage
future technological applications of this sub-valued by-product. Therefore, the aims of this
work were to select the best extraction conditions of phenolic compounds from Brazil nut
cake, by means of factorial experimental design, and to characterize the extract in its phenolic
compounds.
2. EXPERIMENTAL
2.1 Chemicals
Folin-Ciocalteau reagent, 2,2’-azino-bis(2-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

diammonium salt (ABTS), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine (TPTZ), potassium persulfate,
55
fluorescein, 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride (AAPH) and ( )-6-
hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) were purchased from
Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO, USA). Sodium carbonate was purchased from Spectrum
Chemical Manufacturing Corp. (CA, USA). Iron (II) sulfate was purchased from Merck
KGaA (Darmstadt, Germany). Analytical standards (purity > 95%) of benzoic, p-coumaric,
2,4-dihydroxybenzoic, gallic, 2-hydroxybenzoic, 4-hydroxybenzoic, p-hydroxybenzoic,
protocatechuic, sinapic and syringic acids, and myricetin and quercetin were purchased from
Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO, USA), and (+)-catechin was from Indofine Chemical
Company Inc. (NJ, USA). All solvents used were HPLC grade from Tedia (OH, USA). HPLC
grade water (Milli-Q system, Millipore; MA, USA) was used throughout the experiments.
2.2 Samples: Brazil nuts and preparation of Brazil nut cake
Samples of shelled Brazil nut (Bertholletia excelsa) were acquired in a central food
market (CADEG, Rio de Janeiro, Brazil). Samples were selected, dried in an oven with forced
air circulation at 45 °C for 12 h, and stored in tightly closed containers at –20 °C.
For preparation of Brazil nut cake, Brazil nut kernels were coarsely grinded in a food
processor (Wallita, Brazil) and hydrated to 100 g kg-1 moisture. Hydrated Brazil nuts were
pressed in a continuous conveying screw expeller (OEKOTEC-IBG; Germany) to obtain
Brazil nut cake.
2.3 Experimental design
Extraction of phenolic compounds from Brazil nut cake was optimized through full
factorial experimental design with center points (2 5). The factors evaluated were solvent
content in water (v/v); homogenization time (min) in Ultra-turrax® homogenizer; extraction
time (h); and extraction temperature (°C). The response variables were contents of total
phenolic compounds and antioxidant capacity (Table 1).
56
Table 1: Full factorial design with center points to optimize extraction of phenolic compounds from
Brazil nut cake.
Extraction Extraction Solvent:water Homogenization Extraction Extraction
Experiment solvent ratio (v/v) time (min) time (h) temperature (°C)
1 Acetone 40:60 2.5 1 40
2 Acetone 70:30 2.5 1 40
3 Acetone 40:60 2.5 12 40
4 Acetone 70:30 2.5 12 40
5 Acetone 40:60 2.5 1 60
6 Acetone 70:30 2.5 1 60
7 Acetone 40:60 2.5 12 60
8 Acetone 70:30 2.5 12 60
9 Acetone 40:60 5.0 1 40
10 Acetone 70:30 5.0 1 40
11 Acetone 40:60 5.0 12 40
12 Acetone 70:30 5.0 12 40
13 Acetone 40:60 5.0 1 60
14 Acetone 70:30 5.0 1 60
15 Acetone 40:60 5.0 12 60
16 Acetone 70:30 5.0 12 60
17 Ethanol 40:60 2.5 1 40
18 Ethanol 70:30 2.5 1 40
19 Ethanol 40:60 2.5 12 40
20 Ethanol 70:30 2.5 12 40
21 Ethanol 40:60 2.5 1 60
22 Ethanol 70:30 2.5 1 60
23 Ethanol 40:60 2.5 12 60
24 Ethanol 70:30 2.5 12 60
25 Ethanol 40:60 5.0 1 40
26 Ethanol 70:30 5.0 1 40
27 Ethanol 40:60 5.0 12 40
28 Ethanol 70:30 5.0 12 40
29 Ethanol 40:60 5.0 1 60
30 Ethanol 70:30 5.0 1 60
31 Ethanol 40:60 5.0 12 60
32 Ethanol 70:30 5.0 12 60
33(C) Acetone 55:45 3.5 6.5 50
34(C) Acetone 55:45 3.5 6.5 50
35(C) Acetone 55:45 3.5 6.5 50
36(C) Acetone 55:45 3.5 6.5 50
37(C) Ethanol 55:45 3.5 6.5 50
38(C) Ethanol 55:45 3.5 6.5 50
39(C) Ethanol 55:45 3.5 6.5 50
40(C) Ethanol 55:45 3.5 6.5 50
2.4 Extraction of phenolic compounds from Brazil nut cake
Extraction procedures were performed randomly and in accordance with the conditions
set by the full factorial design. Thirty mL of extraction solvent (acetone:water or
ethanol:water) were added to 5 g of Brazil nut cake. The mixture was homogenized with an
Ultra-turrax® (T-18 Basic; IKA, Germany) mixer. Extraction of the homogenized samples
57
was conducted in a temperature-controlled orbital shaker (KS 4000ic control; IKA, Germany)
at 300 rpm, following temperature and time parameters pre-defined in the experimental
design. After extraction, samples were centrifuged (ST 16R Sorvall Centrifuge; Thermo
Scientific, Germany) at 3000  g/15 min, at room temperature. The supernatant was
quantitatively recovered and dried in a rotary evaporator (Rotavapor R-215, BÜCHI;
Switzerland) at 40 °C. The dried residue was reconstituted in 5 mL of methanol:water
solution (3:97, v/v) and stored at –20 °C in screw-caped amber flasks until analysis.
2.5 Determination of total phenolic compounds (TPC)
Total phenolic compounds in Brazil nut cake extracts were determined by the Folin-
Ciocalteu’s reagent assay, Singleton et al (1999) with modifications. Two-hundred µL of the
5-diluted Brazil nut cake extract reacted with 100 µL of Folin–Ciocalteu reagent after
alkalinization with 300 µL of 200 g L-1 Na2CO3 and vortex-mixing. After reacting for 30 min
at 40 °C, absorbance at 765 nm was determined in a microplate reader (Victor3 1420
multilabel counter; PerkinElmer; MA, USA). Total phenolic compounds were expressed as
mg of gallic acid equivalents per g (mg GAE g-1) of Brazil nut cake.
2.6 Determination of antioxidant activity
Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay
TEAC assay is based on samples activity toward scavenging of 2,20-azinobis(3-

ethylbenzothiazoline-6-sulphonate) radical cation (ABTS). A stock solution of ABTS was
prepared by mixing 2.45 mmol L-1 potassium persulfate with 7.0 mmol L-1 ABTS. The
mixture was kept in the dark at room temperature for 12–16 h. Before use, the ABTS
solution was diluted if necessary to give a 0.70 ± 0.05 Abs reading at λ= 720 nm. The ABTS
stock solution and samples of Brazil nut cake extract were diluted with ethanol. To determine
the TEAC values for the Brazil nut cake extracts, 10 µL of sample were mixed with 190 µL of
ABTS work solution. After 6 min at 37 °C, absorbance was read at 720 nm in a microplate
reader (Victor3 1420). The standard curve was prepared with Trolox standard (0.05-0.75
58
mmol L-1) and the results were expressed as milimoles of trolox equivalents per kg (mmol TE
kg-1) of Brazil nut cake (Re et al., 1999).
Ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) assay
A FRAP reagent solution was prepared by mixing 10 mmol L-1 TPTZ (2,4,6-tris(2-
pyridyl)-S-triazine) and 20 mmol L-1 ferric chloride in a 300 mmol L-1 acetate buffer. FRAP
values for the Brazil nut cake extracts were determined by mixing 20 µL of sample with 180
µL of FRAP reagent solution. After incubation at 37 °C, absorbance at λ= 595 nm was read in
a microplate reader (Victor³ 1420). The standard curve was prepared with ferrous sulphate
standard (50-600 µmol L-1) and the results were expressed as milimoles of Fe +2 equivalents
per kg (mmol Fe+2 kg-1) of Brazil nut cake (Benzie and Strain, 1996).
2.7 Phenolic compounds profile by HPLC
Phenolic compounds were determined in the best extraction conditions determined by

experimental design. The ethanolic extract was dried, dissolved in methanol:water (3:97, v/v)
and filtered through a 0.45 μm PTFE membrane filter (Millex, Millipore; Germany) before
HPLC analysis. Phenolic compounds were analyzed in a HPLC system (LC-10ADvp,
Shimadzu; Japan) equipped with a system controller (SCL-10Avp), degasser (DGU-14A), and
a photodiode array detector (PDA, SPD-M10Avp). Samples and standards solutions were
injected by a Rheodyne valve through a 20 µL loop. The phenolic compounds were eluted
from a reversed phase C18 column (5 µm × 150 mm × 4.6 mm; Kromasil; AkzoNobel;
Sweden). The mobile phase consisted of a gradient of 0.3% aqueous formic acid (eluent A),
methanol (eluent B) and acetonitrile (eluent C), at a flow rate of 0.8 mL/min. Mobile phase
gradient was as follows: 0 min, 14.3% B and 0.7% C; 7 min, 29.5 % B and 1.5 % C; 14 min,
44.6% B and 2.4% C; 21 min, 59.8% B and 3.2% C; 25 min, 90.3% B and 4.7 % C. The
column eluate was monitored at 280 nm and peak identities of phenolic compounds were
determined by comparison of relative retention times and PDA spectra (λ from 230 to 350
nm) of commercial standards and by sample spiking and co-elution with these same standards
(John and Shahidi, 2010). Data acquisition and analysis was processed by LC-Solution
software (Shimadzu). Quantitative analysis was performed according to external calibration
59
curves with each corresponding standard (Table 2). All analyzes were performed in triplicate,
and concentrations of individual phenolic compounds were expressed in mg kg-1.
Table 2: Calibration curves* of phenolic compounds from Brazil nut cake extract analyzed by
HPLC-DAD.
Phenolic Compound R² p-value LOD LOQ
Gallic acid 0.9984 0.0001 0.32 0.97
protocatechuic acid 0.9998 0.0001 0.64 1.29
(+)-catechin 0.9998 0.0001 1.44 4.36
p-hydroxybenzoic acid 0.9999 0.0001 3.07 9.21
2,4-dihydroxybenzoic acid 0.9999 0.0001 0.36 1.09
p-coumaric acid 0.9993 0.0001 0.14 0.42
sinapic acid 0.9988 0.0001 3.11 9.33
* 5-point calibration curves and R², for each regression model. LOD: limit of detection (mg L -1);
LOQ: limit of quantification (mg L-1).
2.8 Statistical analysis
Experimental design and data analysis was processed using STATISTICA v8.0 (Statsoft
Co., Dell Computers; OK, USA). Average and standard deviation were used as measures of
centrality and dispersion, respectively. ANOVA with Tukey’s post-hoc test was used for
comparing averages, and significance was established at p < 0.05 level.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Total phenolic compounds
Extracts of Brazil nut cake were obtained by solid-liquid extraction, which depends on
mass transfer. With this extraction method, analytes in a solid matrix migrate to the extraction
solvent following non-specific chemical interactions. Hence, the extraction of phenolic
60
compounds is influenced by numerous factors such as matrix complexity, solvent properties,
temperature and sample pre-processing (Ignat et al., 2011).
Extraction solvents selection is critical for complex food matrices such as Brazil nut
cake, since it will determine the amount and type of phenolic compounds recovered (Naczk
and Shahidi , 2004). The type of extraction solvent (ethanol or acetone) did not affect (p>
0.05) the highest contents of phenolic compounds extracted from Brazil nut cake (Table 3,
experiments 3 and 15 using, respectively, ethanol and acetone).
Table 3: Experimental design for optimized extraction of total phenolic compounds from Brazil nut cake
with acetone:water or ethanol:water.
Total Phenolic Compounds
Extraction
Extraction conditions* (mg GAE g-1)
Experiment
Acetone Ethanol
1 40:60; 2.5 min; 1 h; 40 °C 1.66  0.047 1.68 0.012
2 70:30; 2.5 min; 1 h; 40 °C 1.43 0.018 1.57 0.024
3 40:60; 2.5 min; 12 h; 40 °C 1.58 0.085 1.90 0.022
4 70:30; 2.5 min; 12 h; 40 °C 1.59 0.035 1.93 0.006
5 40:60; 2.5 min; 1 h; 60 °C 1.53 0.078 1.82 0.001
6 70:30; 2.5 min; 1 h; 60 °C 1.54 0.047 1.53 0.131
7 40:60; 2.5 min; 12 h; 60 °C 1.59 0.107 1.65 0.004
8 70:30; 2.5 min; 12 h; 60 °C 1.69 0.011 1.76 0.022
9 40:60; 5 min; 1 h; 40 °C 1.40 0.002 1.71 0.009
10 70:30; 5 min; 1 h; 40 °C 1.70 0.004 1.52 0.001
11 40:60; 5 min; 12 h; 40 °C 1.80 0.045 1.54 0.002
12 70:30; 5 min; 12 h; 40 °C 1.76  0.026 1.64 0.006
13 40:60; 5 min; 1 h; 60 °C 1.79  0.005 1.52 0.039
14 70:30; 5 min 1 h; 60 °C 1.50  0.032 1.48 0.058
15 40:60; 5 min; 12 h; 60 °C 1.97  0.017 1.62 0.008
16 70:30; 5 min; 12 h; 60 °C 1.95  0.004 1.54 0.090
17 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 1.61  0.017 1.75 0.005
18 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 1.68  0.042 1.66  0.081
19 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 1.67  0.016 1.73  0.079
20 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 1.57  0.014 1.60 0.013
*
Extraction conditions: solvent:water ratio (v/v); homogenization time (min) in Ultra-turrax® homogenizer;
extraction time (h); extraction temperature (°C).
The acetone:water and ethanol:water mixtures used in this study had similar polarities,
and this might explain the similar recoveries of phenolic compounds and antioxidant capacity
observed between these organic solvents. However, ethanol is more viscous than acetone, and
therefore solvent permeation in Brazil nut cake might have occurred faster with the later, but
61
this did not seem to have a prominent effect in this work. The efficacy of phenolic compounds
extraction depends on their solubility in the extraction solvent as well as on the chemical
interactions with other sample components (Naczk and Shahidi, 2004). Therefore, it is
difficult to determine a universal method for extracting phenolic compounds from a food
matrix. Jonh and Shahidi (2010) tested methanol or ethanol with water at 80:20 ratio (v/v), or
acetone:water 70:30 (v/v) for the extraction of soluble phenolic compounds from different
parts of Brazil nut. They found contents of total phenolic compounds from Brazil nut kernel
were highest in acetone extract and lowest in methanol extract (14.7 and 12.0 mg GAE g-1
defatted meal, respectively). Although in this case the most effective extraction solvent was
acetone, differences between acetone and ethanol were only minor. However, the search for
optimized extraction methods employing green solvents such as ethanol is presently
increasing. Water:ethanol (50:50, v/v) was highly effective for extraction of antioxidant
compounds from Cretan barberry herb residues (Kukula-Koch et al., 2013). Ethanol was more
effective than methanol for extraction of phenolic compounds from hazelnut shell, according
to response surface methods used to determine optimum extraction conditions (Stevigny et al.,
2007). Contents of phenolic compounds and antioxidant capacity did not differ between
sesame cake extracts obtained with methanol or ethanol (Mohdaly et al., 2010), and this
would favor the use of ethanol, especially for food applications. These results suggest that
organic solvents traditionally used for extraction of bioactives, such as methanol or acetone,
might be effectively replaced by mixtures of non-toxic solvents. Accordingly, in the present
work ethanol was selected for the extraction of phenolic compounds from Brazil nut cake
because this solvent is classified as GRAS (Generally Recognized as Safe), and is obtained
from renewable resources. Therefore, ethanol was selected aiming at future food applications
of the extracts, and acetone extracts were not further considered.
Solvent type was removed as factor in experimental design matrix and full factorial
design with center points (24) was re-run. In these new conditions, homogenization time was
the only factor with significant effect (ANOVA; p˂ 0.05), concerning total phenolic
compounds as response variable. The highest levels of total phenolics (> 1.80 mg GAE g -1)
were observed when extraction was performed with the lowest ethanol content, longest
extraction time (12 h), shortest homogenization time (2.5 min) and extraction temperature in
the range of 40-60 °C (Figures 1A; 1B and 1C). Mixtures of ethanol and water have been
shown to be more effective in extracting phenolic compounds than absolute ethanol (Delgado
62
et al., 2010). It is expected that polarity of extraction solvent mixtures increased
proportionally to water contents. Therefore, the use of solvent mixtures containing water
helps to create a moderately polar medium, favoring extraction of several polar phenolic
compounds (Spigno et al., 2007).
Figure 1. Response surface plots of total phenolic compounds in Brazil nut cake,
associated with Ultra-turrax® homogenization time (right axis) and with:
solvent content in water (A), extraction time (B), or extraction temperature (C).
Total phenolic contents in Brazil nut cake extracts of the present study were similar to
those reported for whole Brazil nut (from 1.12 to 4.0 mg GAE g-1 of defatted sample)
(Kornsteiner et al., 2006; Yang, 2009). These results confirm that the water soluble phenolic
compounds were retained in Brazil nut cake. Additionally, the extraction conditions presently
used extracted phenolic compounds with yields in the range of previous reports. Differences
in samples composition between reports might be related to biological variation in Brazil nut
contents and chemical profile of phenolic compounds. Besides, environmental factors such as
weather and seasonality, and harvesting practices influence contents of these secondary
63
metabolites. However, variations in analytical methods and extraction conditions applied
should not be discarded as explanations for the differences observed.
3.2 Antioxidant capacity
Antioxidant capacity of phenolic compounds in Brazil nut cake was assessed by TEAC
and FRAP assays, which are based on single electron transfer mechanism, and during reaction
the radical substrate is reduced by antioxidants present in the sample (Prior et al., 2005; Pérez-
Jiménez et al., 2008). There was not a single extraction experiment that favored the highest
values of both TEAC and FRAP assays. The highest antioxidant capacity values were
obtained in experiment nº 5 for TEAC assay and nº 11 for FRAP assay (Table 4).
Table 4: Experimental design for optimized antioxidant capacity of Brazil nut cake extracts, obtained
with ethanol:water.
Antioxidant capacity
Extraction * TEAC FRAP
Extraction conditions
Experiment (mmol TE kg-1) (mmol Fe+2 kg-1)
1 40:60; 2.5 min; 1 h; 40 °C 3.27  4893 
2 70:30; 2.5 min; 1 h; 40 °C 2.97 4236 
3 40:60; 2.5 min; 12 h; 40 °C 3.71  4.565 
4 70:30; 2.5 min; 12 h; 40 °C 2.97  4705 
5 40:60; 2.5 min; 1 h; 60 °C 4.07  6853 
6 70:30; 2.5 min; 1 h; 60 °C 3.16  4352 
7 40:60; 2.5 min; 12 h; 60 °C 4.00  5454 
8 70:30; 2.5 min; 12 h; 60 °C 3.32  6058 
9 40:60; 5 min; 1 h; 40 °C 3.69  4793 
10 70:30; 5 min; 1 h; 40 °C 3.21  5558 
11 40:60; 5 min; 12 h; 40 °C 3.66  6599 
12 70:30; 5 min; 12 h; 40 °C 3.58  5724 
13 40:60; 5 min; 1 h; 60 °C 3.74  4485 
14 70:30; 5 min 1 h; 60 °C 3.04  5840 
15 40:60; 5 min; 12 h; 60 °C 3.92  4557 
16 70:30; 5 min; 12 h; 60 °C 3.04  5593 
17 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 3.64  5533 
18 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 3.53  5242 
19 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 3.56  4979 
20 (C) 55:45; 3.5 min; 6.5 h; 50 °C 3.41  4588 
*
Extraction conditions: solvent:water ratio (v/v); homogenization time (min) in Ultra-turrax®
homogenizer; extraction time (h); extraction temperature (°C).
64
Direct comparisons of results from different antioxidant capacity assays are difficult and
possibly unreasonable, because they assess different substances and chemical reactions.
FRAP assay indicates antioxidant capacity based on the reduction of metal iron and TEAC
assess the sample's free radical scavenging capacity. Furthermore, comparisons are difficult
because of differences in sample preparation, compounds’ extraction and solvents used in the
assay, and in the way that results are expressed. Altogether, these factors reinforce the need to
use more than one method to assess antioxidant capacity of a given sample. Besides, it is
suggested that comparisons of antioxidant capacity values of a given sample shall only be
performed when using the same assay and extraction method (Prior et al., 2005).
The present results are consistent with previously published data of high antioxidant
capacity in Brazil nuts, hazelnuts, almonds, macadamias, pine kernels, cashew nuts, and
peanuts (Dragland et al., 2003; Blomhoff et al., 2005; Halvorsen et al., 2006; Blomhoff et al.,
2007). This suggests that expeller-pressing Brazil nut did not substantially degrade its
antioxidant compounds, potentially preserving bioactivity in the solid by-product.
The investigated factors (extraction time, homogenization time, solvent content in water
and extraction temperature) did not interfere significantly on antioxidant capacity by TEAC
assay (ANOVA, p>0.05). Therefore, only the results of FRAP assay were considered.
Interaction between extraction and homogenization time significantly (p < 0.05) affected
antioxidant capacity by FRAP assay in Brazil nut cake extracts (Table 5). The association of
shorter homogenization time (2.5 min) with higher temperature (60 °C) favored FRAP
antioxidant capacity in the extract (Figure 2A). Furthermore, we observed that the lowest
ethanol:water proportion (40:60, v/v) at 60 °C, lead to the most robust results, according to
relative variation in results presented by this combination (Figure 2B).
65
Table 5: Factors’ effects on antioxidant capacity (TEAC and FRAP assays) in
Brazil nut cake extract.
TEAC FRAP
Factors p-
Effect p-value Effect
value
(1) Extraction time 0.014 0.42 27.9 0.26
(2) Homogenization time 0.006 0.73 26.8 0.27
(3) Content ethanol:water -0.060 0.43 -12.6 0.57
(4) Extraction temperature 0.016 0.36 26.5 0.28
1 by 2 interaction** -0.025 0.15 -85.7 0.020
** Other interactions were not significant to the level of p< 0.05.
Figure 2. Response surface plots of antioxidant capacity by FRAP assay in Brazil nut
cake, associated with extraction temperature (left axis) and with: Ultra-turrax®
homogenization time (A), or solvent content in water (B).
Concerning extraction time, the longest extraction (12 h) presented the best responses to
both FRAP and total phenolic compounds. However, the selection of the most appropriate
extraction method should take into consideration not exclusively the statistical results. It is
important to consider other factors, such as analytical feasibility in laboratory scale, and
economic factors if larger-scales are of concern. Given these observations, a new set of
experiments has been performed, varying extraction time (1 and 12 h) and fixing the other
factors to confirm the need for applying the longest extraction time (12 h). The other factors
were fixed at the selected best levels, as follows: ethanol:water proportion, 40:60 (v/v);
homogenization time, 2.5 min; and extraction temperature, 60 °C. Total phenolic compounds,
66
FRAP and TEAC antioxidant capacity did not vary between one and 12 h extraction: 2.04 ±
0.027 and 1.96 ± 0.067 mg GAE g-1; 4350 ± 165.1 and 3341 ± 63.2 mmol Fe +2 kg-1; and 3.04
± 0.131 and 2.85 ± 0.076 mmol TE kg-1, respectively.
In general, longer extraction times favor degradation of bioactive compounds and loss
of antioxidant capacity of these compounds (Mané et al., 2007; Silva et al., 2007). Therefore,
because there were no significant differences between extractions for one or 12 h, the shortest
time stood out as more practical, and would probably contribute to preserve Brazil nut
bioactivity. Taking together all results of antioxidant capacity and levels of total phenolic
compounds, improved extraction of Brazil nut cake phenolic antioxidants was achieved with
the following conditions: ethanol:water 40:60 (v/v); 2.5 min homogenization with Ultra-
turrax®; 1 h extraction with orbital agitation (300 rpm), at 60 °C.
Antioxidant capacity in Brazil nut cake extract, with either assays tested, was not
correlated with total phenolic compounds. Possibly, other compounds potentially present in
Brazil nut cake and partially soluble in ethanol:water such as tocopherols, and proteins and
peptides rich in SH groups also influenced antioxidant capacity of Brazil nut cake extracts.
However, the aims of the present study were restricted to phenolic compounds, and therefore
this hypothesis was not investigated although it deserves future studies.
In most studies with Brazil nut, phenolic compounds were determined by the
spectrophotometric assay using Folin-Ciocalteu’s reagent. This assay presents several
limitations, especially due to interference by other sample components, such as proteins,
ascorbic acid and sugars, leading to overestimations of samples’ phenolics. Determination of
total phenolics by the Folin-Ciocalteau reagent assay is useful as a screening method, but its
limitations should be considered (Bonoli et al., 2004; Prior et al., 2005). Whenever possible,
phenolic compounds’ profile should be determined by selective and sensitive methods, such
as by HPLC (Ignat et al., 2011). In the present study, the total contents of phenolic
compounds from HPLC-PDA analysis (Table 6) was 30% lower than total phenolic
compounds from Folin Ciocalteau's reagent assay.
3.3 Phenolic compounds profile in Brazil nut cake extract by HPLC-PDA
Characterization of phenolic compounds was performed by HPLC-PDA in the extract

obtained by the improved conditions defined previously (extraction experiment nº 21, Table
67
1). Phenolic compounds’ peak identities were determined by comparison of corrected
retention times, UV-spectra from PDA and samples’ spiking with commercial standards.
Brazil nut cake extract presented (Figure 3) six phenolic acids (gallic, protocatechuic, 2,4-
dihydroxybenzoic, p-hydroxybenzoic, p-coumaric and sinapic acids) and one flavonoid ((+)-
catechin). Phenolic acids profile in Brazil nut cake extract (Table 6) was similar with those
found in other studies with nuts. The phenolic acids p-hydroxybenzoic, p-
hydroxyphenylacetic, vanillic, protocatechuic, syringic, gallic, caffeic and ferulic acids were
previously shown in several nuts.43 In addition, five phenolic acids were identified in hazelnut
and its byproducts, such as a derivative of benzoic acid (gallic acid) and four derivatives of
cinnamic acid (caffeic, p-coumaric, ferulic and sinapinic acids) (Shahidi et al., 2007).
Figure 3. Representative chromatogram for the analysis of phenolic compounds in Brazil nut
cake extract, by HPLC-PDA (λ= 280 nm). Gallic acid (1), protocatechuic acid (2), (+)-
catechin (3), p-hydroxybenzoic acid (4), 2,4-dihydroxybenzoic acid (5), p-coumaric
acid (6), sinapic acid (7).
68
Table 6: Phenolic compounds in Brazil nut cake extract by HPLC-PDA analysis (λ=280 nm).
rt Concentration
Elution order Phenolic Compounds
(min) *(mg kg-1)
1 gallic acid 3.97 70.0
2 protocatechuic acid 6.77 207
3 (+)-catechin 8.02 421
4 p-hydroxybenzoic acid 9.85 151
5 2,4-dihydroxybenzoic acid 11.9 168
6 p-coumaric acid 14.3 136
7 sinapinic acid 14.5 124
*Concentrations are average values from analytical triplicates.
The class of phenolic acids was predominant among phenolic compounds in Brazil nut
cake extract, but (+)-catechin was the major phenolic compound, corresponding to 30% of
total phenolics from HPLC-PDA analysis. The phenolic compounds profile might influence
the antioxidant capacity of the extract. Phenolic compounds structure determines their radical
scavenging and metal chelating activity, and this is referred to as structure–activity
relationships. For instance, antioxidant activity of phenolic acids depends on the number and
positions of hydroxyl groups in relation to the carboxyl functional group (Rice-Evans et al.,
1996; Robards et al., 1999). Antioxidant activity of phenolic acids increase with increasing
degree of hydroxylation, and gallic acid, for example, presents three hydroxyls and shows
high antioxidant activity. However, substitution of hydroxyl groups at the 3- and 5-position
with methoxyl groups reduce antioxidant activity (Rice-Evans et al., 1996). Hydroxycinnamic
acids exhibit higher antioxidant activity compared to the corresponding hydroxybenzoic acids
(Robards et al., 1999; Andreasen et al., 2001a). In contrast, determinants of the structure–
activity relationship of flavonoids are generally more complex than those of phenolics acids.
For instance, structural features and the nature of substitutions on rings B and C determine the
antioxidant activity of flavonoids (Balasundram et al., 2006).
Phenolic compounds might explain, at least in part, the beneficial effects of Brazil nut
consumption, such as of reducing blood glucose levels and blood pressure, beyond
anticarcinogenic, antimicrobial and anti-inflammatory effects (Cominetti et al., 2012; Yang et
al., 2009). Therefore, the study of these compounds in Brazil nut cake might add value to this
industrial by-product of Brazil nut pressed oil.
69
4. CONCLUSIONS
Best conditions for the extraction of antioxidant phenolic compounds from Brazil nut
cake were determined. Brazil nut cake phenolic acids and flavonoids presenting antioxidant
capacity were extracted with ethanol:water in quantities technologically interesting. These
results might stimulate Brazil nut cake upgrading in the food industry owing to its antioxidant
phenolics. The present work points to future technological investigations concerning added-
value destinations for Brazil nut cake, especially in the development of nutraceuticals and as
functional food ingredients.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors acknowledge the help of Prof. Verônica Calado with the experimental
design and statistical analysis; and Prof. Suely Pereira Freitas for her assistance with the
continuous conveying screw expeller. The financial support of FAPERJ, CNPq and CAPES
(Brazil) is greatly acknowledged. S. G. was a recipient of a FAPERJ scholarship for her
Doctorate studies.
70
Capítulo 3
Brazil nut cake is a rich source of phenolic
compounds, tocopherols, selenium and proteins
determined by high resolution analytical methods
Manuscript to be submitted to Journal of Functional Foods.
71
ABSTRACT
BACKGROUND: The solid residue (cake) of cold-pressed Brazil nut oil presents high
energy value, nutritional and bioactive compounds, such as polyphenols and the antioxidant
mineral selenium. However, little is known on the bioactive components in Brazil nut cake.
The aim of this study was to chemical characterization of bioactive compounds in Brazil nut
cake, through the determination of phenolic compounds, tocopherols, selenium, proteins and
antioxidant capacity in vitro.Furthermore, through applying non-targeted high resolution mass
spectrometry (HRMS), beyond the analysis of phenolic compounds, it was possible to infer
the molecular composition of the ethanolic extract of the Brazil nut cake, adding value
through new applications of this by-product in the food industry.
RESULTS: Brazil nut cake presented: 181 ± 12.3 mg GAE/100 g, total phenolics; 3.05 ±
0.41 mg CE/100 g, total flavonoids and high antioxidant capacity, by FRAP (525 ± 42.3
mmol Fe+2/100 g) and TEAC (0.399 ± 0.03 mmol TE/100 g) assays. Twelve phenolic
compounds were inequivocally identified in Brazil nut cake by LC-HRMS using targeted
strategy, follows: gallic acid, p-coumaric acid, 2,4-dihydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic
acid, protocatechuic acid, sinapic acid, 2- hydroxybenzoic acid, (+)-catechin, (-)-epicatechin,
myricetin, quercetin and quercetin-3-β-D-glucoside. In addition, LC-HRMS using the non-
targeted strategy were tentativelly identified phenolic compounds in Brazil nut cake extract,
without confirmation by analysis of standards. With this approach LC-HRMS data was
analyzed using Phenol Explorer 3.0 public database. Thirty phenolic compounds were
tentativelly identified based on exact mass data and of these 13 were suggested as belonging
to the phenolic acids and 17 in flavonoids classes, including positional isomers. Others
bioactive compounds were also identified in Brazil nut cake. The major tocols were  and α-
tocopherol. Brazil nut cake presented high levels of several essential minerals in the order
following: P> K> Mg> Ca> Zn> Fe> Cu> Mn> Na> Se. Regarding the composition of
proteins which were determined by 2D SDS-PAGE and MALDI-ToF-ToF major proteins in
Brazil nut cake were 11S globulin and 2S albumin.
CONCLUSION: Our results showed that Brazil nut cake is a by-product having a diversified
composition of bioactive compounds. This finding favors its utilization in the development of
value-added functional foods.
72
1. INTRODUCTION
The use of by-products from food processing has increased in recent years. An example
is the use of by-products from oilseeds used for oil extraction such as soybean, almond,
canola and Brazil nut, in a way that some of these are now by-products. Oil extraction
normally occurs by solvent extraction under high temperature or by expeller pressing.
Although the last one presents lower yield, it produces oil with higher quality, because it
preserves original characteristics of the oil potentially leading to retention of bioactive
components in the solid by-product (cake). The main applications observed for the Brazil nut
cake make use of its composition, which is high in contents of proteins (about 20%) and
fibers (15%), favoring its use in baked products, cereal bars or animal feed (Menezes and
Souza, 2004; Santos et al., 2013).
Brazil nut is a rich source of bioactive compounds such as tocopherols, phenolic,
selenium and essential amino acids (Yang, 2009; Sharma et al., 2010; John and Shahidi, 2010;
Costa et al., 2010; Santos et al., 2013). Supposedly, Brazil nut cake also presents some of
these components, in particular phenolic compounds. Few studies thoroughly characterized
the composition of bioactives in the Brazil nut cake. Knowledge of the composition of
bioactive substances in this by-product increases the possibilities of applications. Especially
because of the benefits that consumption of these substances might promote to human health.
Several health benefits might result from intake of phenolic compounds, such as the
prevention and protection against certain types of cancer, cardiovascular diseases,
inflammatory diseases, metabolic diseases and diabetes. These health benefits are attributed to
varied biological functions such as antimicrobial, antioxidant and antimutagenic actions
(Fernández-Montero et al., 2014). For instance, tocopherols are considered some of the most
powerful lipophilic antioxidants in foods and in biological systems, and their effects depend
on their antioxidant activity. Tocopherols antioxidant potential and functions at the molecular
level are believed to reduce the risk of cardiovascular diseases and certain types of cancer
(Campbell et al., 2003; Schwartz, et al., 2008; Costa et al., 2010).
Brazil nut cake is also a rich source of proteins, which are rich in essential and in sulfur
aminoacids and are of concern due the allergenic effects of 2S albumin (Sharma et al., 2010).
Therefore, aiming at utilizing chemical constituents in Brazil nuts cake, it is important to
know which proteins remain in the by-product after cold pressing. In addition the detailed
73
protein characterization of the Brazil nut cake using advanced analysis tools such as
proteomics could be interesting for the reutilization of the by-product for new applications in
food, pharmaceutical and cosmetic industries.
The Brazil nut cake is a complex matrix and the analysis of bioactive substances, in
particular the phenolic compounds, can be influenced by other constituents in the food matrix,
such as proteins and lipids (Alu’datt et al., 2013). The use of advanced analysis techniques
such as the hyphenated liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry
(LC-HRMS) can help determine more precisely and effectively the phenolic compounds, for
example. There are over 6000 phenolic compounds classified in various sub-classes such as
phenolic acids, flavonoids and tannins, some of which might be linked to sugar molecules,
forming the glycoside and aglycone forms (Abad-Garcia et al., 2009; Ignat et al., 2011).
Therefore, the aim of this study was to determine the detailed composition of bioactive
compounds in Brazil nut cake, through the determination of phenolic compounds,
tocopherols, selenium, proteins and antioxidant capacity in vitro. For the analysis of phenolic
compounds, both targeted and non-targeted approach were used, with based on high
resolution mass spectrometry (HRMS).
2. MATERIALS AND METHODS
2.1 Chemical
Folin-Ciocalteau reagent, 2,2’-azino-bis(2-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

diammonium salt (ABTS), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine (TPTZ), potassium persulfate,
fluorescein, 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride (AAPH) and ()-6-
hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) and standards of α-, β-, 
and tocopherols were purchased from Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO, USA). Sodium
carbonate was purchased from Spectrum Chemical Manufacturing Corp. (CA, USA). Iron (II)
sulfate was purchased from Merck KGaA (Darmstadt, Germany). Urea 5 mol/L, thiourea 2
mol/l, DTT (DL-Dithiothreitol) 65 mmol/L, Coomassie blue, acrylamide, α-cyano-4-
hydroxycinnamic acid were all from the best quality available. Analytical standards (purity >
95%) of phenolics compounds (Table 1) were purchased from Sigma Aldrich (MO, USA).
74
All solvents were HPLC grade from Tedia (OH, USA). HPLC grade water (Milli-Q system,
Millipore, MA, USA) was used throughout the experiments.
2.2 Samples: Brazil nuts and preparation of Brazil nut cake
Samples of shelled Brazil nut (Bertholletia excelsa) were acquired in a central

food market in Rio de Janeiro (CADEG-Brazil). Samples were selected, dried in an oven with
forced air circulation 45 °C for 12 h, and stored in tightly closed containers at 20 °C.
For preparation of Brazil nut cake, Brazil nut kernels were coarsely grinded in a food
processor (Wallita, Brazil) and hydrated to 10% moisture. Hydrated Brazil nuts were pressed
in a continuous conveying screw expeller (OEKOTEC-IBG, Germany) to obtain Brazil nut
cake.
2.3 Extraction of phenolic compounds from Brazil nut cake
The extraction condition of phenolic compounds in Brazil nut cake was determined
previously (Chapter 2; Gomes and Torres, 2015). Briefly, Thirty mL of extraction solvent
(ethanol:water, 40:60 v/v) were added to 5 g of Brazil nut cake. The mixture was
homogenized with an Ultra-turrax® (T-18 Basic; IKA, Germany) mixer for 2.5 min.
Homogenized samples were extracted in an orbital shaker (KS 4000ic control; IKA,
Germany) at 300 rpm for 1h, at 60 °C. After extraction, samples were centrifuged (ST 16R
Sorvall Centrifuge; Thermo Scientific, Germany) at 3000 g/15 min, room temperature. The
supernatant was quantitatively recovered and dried in a rotary evaporator (BÜCHI,
Switzerland) at 40 °C. The dried residue was reconstituted in 5 mL of methanol:water
solution (3:97 v/v) and stored at 20 ° C in amber flask until analysis.
2.3.1 Total Phenolic Compounds
Total phenolic compounds in Brazil nut cake extract were determined by the Folin-
Ciocalteu’s reagent assay (Singleton et al., 1999) with modifications. Two-hundred µL of the
diluted (5-diluted) Brazil nut cake extract reacted with 100 µL of Folin–Ciocalteu reagent
after alkalinization with 300 µL of 20% Na 2CO3 and vortex-mixing. After reacting for 30 min
75
at 40 °C, absorbance at 765 nm was determined in a microplate reader (Victor3 1420
multilabel counter; PerkinElmer, MA, USA). Total phenolic compounds were expressed as
mg of gallic acid equivalents (mg GAE/ 100 g) of Brazil nut cake.
2.3.2 Total flavonoids
Total flavonoids content in Brazil nut cake extract were determined

spectrophotometrically. Five-hundred µL of extract were mixed with 500 µL of 2% AlCl3 and
vortex-mixed. After reacting for 1 h at room temperature, the absorbance at 405 nm was
determined in a microplate reader (Victor3 1420) (Taie et al., 2008). Total flavonoids content
was expressed as mg of catechin equivalents (CE/100 g) of Brazil nut cake.
2.3.3 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by LC-HRMS
Phenolic compounds in Brazil nut cake extracts were identified by liquid

chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The LC-HRMS
system consisted of a QExactiveTM hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer (Thermo
Scientific, Bremen, Germany) operating in positive or negative ion modes, with electron spray
ionization (ESI) ion source with an Accela 1250 pump. Samples and standards solutions were
injected The phenolic compounds were eluted using a reversed phase C18 column (5 µm × 150
mm × 4.6 mm; Kromasil; AkzoNobel; Sweden). The mobile phase consisted of a gradient of
0.3% aqueous formic acid (eluent A), methanol (eluent B) and acetonitrile (eluent C), at flow
rate of 350 μL/min. Mobile phase gradient was as follows: 0 min, 14.3% B and 0.7% C; 7
min, 29.5 % B and 1.5 % C; 14 min, 44.6% B and 2.4% C; 21 min, 59.8% B and 3.2% C; 25
min, 90.3% B and 4.7 % C. The QExactive was adjusted to 35,000 mass resolution and mass
measurement accuracy close to 5 ppm to be achieved while the mass spectra were recorded in
a mass range 60–600 m/z in full scan mode. The ESI source was operated at a sheath gas flow
of 30 arb, auxiliary gas flow of 10 arb, ion spray voltage of 2.9 kV, capillary temperature of
300 °C, capillary voltage of 35 V and tube lens of 110 arb. Data acquisition and analyzis was
processed by Xcalibur 2.0 software (Thermo Scientific, Bremen, Germany). Identification of
compounds in Brazil nut cake extract followed two strategies, namely targeted and non-
targeted analysis.
76
A mixture of commercial standards of phenolic acids and flavonoids (Table 1) and the
Brazil nut cake extract were analyzed by LC-HRMS/ESI-Orbitrap. The identity of phenolic
compounds in Table 1 were confirmed in Brazil nut cake extract by comparing retention
times, and exact mass (m/z and error < 5 ppm) to peaks of standard compounds. Furthermore,
each standard peak was evaluated individually to identify characteristic MS 2 fragments, and
these were compared with theoretical fragmentation.
In addition, phenolic compounds in Brazil nut cake for which there were not
commercial standards were tentatively identified by the following systematic approach: 1)
obtaining possible nut phenolics from the Phenol Explorer 3.0 database
(www.phenolexplorer.com); 2) searching for these potential phenolics in the sample
according to accurate mass (from m/z data), accepting an error <5 ppm between the
experimental m/z value and the theoretical m/z value of the molecular ion (molar mass); and
3) on the intensity values of the most abundant fragments and fragmentation pattern (MS 2
data).
77
Table 1: Standard phenolic compounds analyzed by LC-HRMS.
Standard phenolic Molecular
Classes Molecular formule
compound weight
gallic acid 170 C7H6O5
3,4 dihydroxy-benzoic acid 154 C7H6O4
p-hydroxy-benzoic acid 138 C7H6O3
syringic acid 198 C9H10O5
2,4-dihydroxy-benzoic 154 C7H6O4
Phenolic acids
p-coumaric acid 164 C9H8O3
sinapinic acid 224 C11H12O5
m-coumaric 164 C9H8O3
salicylic acid 138 C7H6O3
trans-cinnamic acid 148 C9H8O2
2-hydroxy-cinnamic acid 164 C9H8O3
myricetin 318 C15H10O8

quercetin 302 C15H10O7
catechin 290 C15H14O6
(−)-epigallocatechin 306 C15H14O7
Flavonoids (−)-epigallocatechin gallate 458 C22H18O11
(−)-epicatechin 290 C15H14O6
(−)-epicatechin gallate 442 C22H18O10
kaempferol 286 C15H10O6
quercetin 3-β-D-glucoside 464 C21H20O12
2.3.4 Antioxidant Capacity
Antioxidant capacity of Brazil nut cake extract was determined by FRAP (Ferric
Reducing Ability of Plasma) and TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) assays.
TEAC assay was run according to RE et al. (1999) with modifications. A stock solution of
ABTS was prepared by mixing 2.45 mmol/L potassium persulfate with 7.0 mmol/L ABTS.
The mixture was kept in the dark at room temperature for 12–16 h. Before use, the ABTS
solution was diluted if necessary to give a 0.7 Abs at 720 nm. The ABTS stock solution and
samples of Brazil nut cake extract were diluted with ethanol. To determine the TEAC values
in Brazil nut cake extracts, 10 µL of sample were mixed with 190 µL of ABTS solution.
After incubation at 37 °C for 6 min, absorbance was measured at 720 nm in a microplate
reader (Victor³ 1420). The standard curve was prepared with Trolox standard (0.05-0.75
78
mmol/L) and the results were expressed as milimoles of trolox equivalents (TE)/100 g of
Brazil nut cake.
The FRAP assay was performed according to Benzie & Strain (1996), with slight
modifications. A FRAP reagent solution was prepared by mixing 10 mmol/L TPTZ (2,4,6-
tris(2-pyridyl)-S-triazine) and 20 mmol/L ferric chloride in a 300 mmol/L acetate buffer.
FRAP values for the Brazil nut cake extracts were determined by mixing 20 µL of sample
with 180 µL of FRAP reagent solution. After incubation at 37 °C, samples absorbance at 595
nm was determined in a microplate reader (Victor³ 1420). A standard curve was prepared with
ferrous sulphate standard (50-600 µmol/L) and the results were expressed as milimoles of
Fe+2 equivalents/100 g of Brazil nut cake.
2.4 Brazil nut cake composition
2.4.1 Proximate composition
Proximate composition of Brazil nut cake and whole Brazil nut were determined
according to official methods provided by AOAC (AOAC, 2005). Moisture (method Nº
920.151), total lipids (ether extract; method Nº 945.38), ash (method Nº 923.03), dietary fiber
(method Nº 985.29), and total nitrogen to determine crude protein (method Nº 920.123).
Protein content was estimated based on the average N to protein conversion factor of 5.46
(AOAC, 2005), while total carbohydrates were determined by difference.
2.4.2 Tocopherols in Brazil nut cake by HPLC
Tocopherols from Brazil nut cake were extracted according to the methods of the
AmericanOil Chemists' Society (AOCS, 2002). Contents of α, β,  and δ tocopherols in Brazil
nut cake were determined by HPLC analysis with Fluorescence detector (Exc. 290 nm and
Em. 330 nm). Separation by HPLC was carried out in a Shimadzu liquid chromatograph (LC-
20AT; Shimadzu, Japan) equipped with Fluorescence detector (RF 10AXL; Shimadzu,
Japan). Samples were injected through a manual injector valve with a 20μl sample loop, into a
unmodified silica column (250 × 4.6 mm, 5 m, ZORBAX Rx-Sil; Agilent Technologies,
CA, USA) and eluted isocratically with n-hexane:2-propanol (99:1, v/v) at a flow rate of 1.0
79
mL/min (Gimeno et al., 2000; Tan & Bbrzuskiewicz, 1989). The tocopherols in Brazil nut
cake were identified by comparison of retention times of commercial standards (α, β,  and δ
tocopherols). Quantification was performed by external calibration, according to standard
curves from these commercial standards. Results of tocopherols contents were expressed as
mg/100 g of Brazil nut cake.
2.4.3 Proteomics
2.4.3.1 Extraction and determination of total proteins in Brazil nut cake
Proteins from 10 mg of Brazil nut cake were extracted with an appropriate buffer (5 mol
urea, 2 mol thiourea and 65 mmol DTT). The mixture was submitted to sonication 100 W
(Ultrasonic Cleaner, 2510R- DTH, Branson) for 30 min in an ice bath, followed by
centrifugation (13,000 ×g/15 min, at -4 °C). Supernatants were collected and total proteins
content was determined spectrophotometrically by Bradford's assay (1976), using bovine
serum albumin as standard. Results were used to determine the volume (μL) of sample to be
applied in two-dimensional (2D) gel electrophoresis analysis.
2.4.3.2 Protein profile by 2D electrophoresis
Brazil nut cake protein extract was analyzed by 2D electrophoresis. The first dimension
of isoelectric focusing was followed by polyacrylamide gel electrophoresis, to separate
proteins (Ettan IPGphor-Amersham Biosciences, PA, USA). One volume of the Brazil nut
cake protein extract corresponding to 100 μg of protein was mixed with the rehydration buffer
plus 1.25 μL of ampholytes solution (Bio-Lyte 10/8, BIO-RAD), not exceeding the final
volume of 125 μL. This mixture containing the sample proteins was applied to 180 mm
commercial linear strips with an immobilized pH gradient (range of pH 3.0-11.0) using an
Ettan IPGphor delivery system (Amersham Biosciences, PA, USA) and isoelectric focusing
presented a total run time of approximately 12 hours. Following isoelectric focusing, the IPG
strips were incubated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS,
0.002% bromophenol blue, and 65 mM DTT for 15 min. The strips were alkylated with
iodoacetamide (25 mg/mL) and subsequently placed onto 15% polyacrylamide gels. The gels
80
were run in electrophoresis system (PowerPac TM Basic Power Supply, USA) at 200 mV for
40 min. After 2D gel electrophoresis, gels were stained for 12 h with coomassie blue and were
then destained with water for 24 h. The images of the gels were performed with photo
documenter (DNR Bio-Imaging Systems) and images were analyzed using Gel Capture
Acquisition Software.
2.4.3.3 In-gel digestion and peptides extraction
Each 2D gel spot was cut down into small pieces, and destained with a solution of 25
mmol NH4HCO3 and 50% acetonitrile (ACN) at pH 8.0. The washing solution was then
removed and the 2D gel pieces were dehydrated with 100% ACN for 5 min and dried
completely using a Speed-Vac system. The spots were rehydrated in 20 μL of digestion buffer
containing 10 ng/ μL trypsin (Promega, modified sequencing grade) in 25 mmol NH4HCO3 in
an ice-cold bath for 10 min. Samples were then digested for 20 h at 37 °C and centrifuged,
followed by addition of 5 μL of 1% formic acid to stop hydrolysis. The supernatant from each
protein spot containing the hydrolysate was transferred into a clean microcentrifuge tube. The
precipitate was re-extracted from the polyacrylamide gel twice more with 50% ACN in 5%
trifluoroacetic acid (TFA) for 30 min, followed by centrifugation. The supernatants containing
the peptides were pooled together and concentrated to near dryness in a Speed-Vac system.
Samples were reconstituted with 3 μL of 50% ACN in 5% TFA. The most intense spots were
diluted with matrix solution and were analyzed by mass spectrometry. In contrast, the less
intense spots were desalted using a mini-reversed phase column PerfectPure C-18 Tip
(Eppendorf). The tips were conditioned in 100% acetonitrile and washed three times with
0.1% TFA in water. The peptide solution was aspirated and expelled from the tips 10 times.
After three washings of the tip with 0.1% TFA in water, the peptides were eluted with 50%
ACN and 0.1% TFA in water.
2.4.3.4. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization and Sequential Time-of-Flight

(MALDI-TOF/TOF) mass spectrometric analysis
The peptides of the Brazil nut cake were analyzed by mass spectrometry (MS) and
tandem mass spectrometry (MS/MS). The solution of extracted peptides (0.5 μL) was mixed
81
with matrix solution (10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) (Aldrich, Milwaukee,
USA) in 50% ACN/0.1% TFA. Samples were placed on the target plate and allowed to dry at
room temperature. The experiments were performed using a 5800 Proteomics Analyzer
(Applied Biosystems, Foster City, CA). Both MS and MS/MS data were acquired with a
neodymium-doped yttrium aluminum garnet (Nd:YAG) laser with a 200 Hz repetition rate.
Typically, 1600 shots were accumulated for spectra in the MS mode and 2400 shots were
accumulated for spectra in the MS/MS mode. MS and MS/MS spectra were acquired in
reflector mode. Up to eight of the most intense ion signals with signal-to-noise ratios above
30 were selected as precursors for MS/MS acquisition. The external calibration in MS mode
was performed using a mixture of the following four peptides: des-Arg1-bradykinin (m/z
904.468), angiotensin I (m/z 1296.685), Glu1-fibrinopeptide B (m/z 1570.677), and
adrenocorticotropic hormone (18−39) (m/z 2465.199). MS/MS spectra were externally
calibrated using known fragment ion masses observed in the MS/MS spectrum of angiotensin
I. The acquired peak lists were analyzed by searching the National Center for Biotechnology
Information (NCBI) database using the MASCOT-Matrix Science search engine
(www.matrixscience.com) for identification based on the MS/MS ions. Under standard
thresholds (mass error tolerance, ±50 ppm for MALDI-ToF-ToF mass spectrometry analysis;
MS/MS tolerance, ±0.2 Da for MALDI-ToF-ToF mass spectrometry analysis; fixed
modifications, Cys-carbamidomethylation; variable modifications, methionine oxidation; one
tolerated missed cleavage), proteins with a MOWSE score of at least 54 were considered as
significantly identified. The functional classification of the identified proteins was performed
by searching the http://www.ncbi.nlm.nih.gov and http://www.uniprot.org databases.
2.4.4 Determination of metals in Brazil nut cake by ICP-MS and ICP-OES
Sample digestion was achieved in a digester block. Aliquots of 0.5 g Brazil nut cake
were transferred to acid-washed Kjeldahl tubes, then 10 mL of concentrated HNO3 was added
and the sample rested overnight. Subsequently, 5 mL of 30% H2O2 were added, and after
resting for 30 min the samples were heated in a block digester at 100 °C for 8 h. After
digestion, mineral solutions were filtered through filter paper (Whatman Nº 1) and diluted to
25 mL with ultrapure water and analyzed by ICP-MS and ICP-OES. Concentrations of
copper, iron, manganese, selenium and zinc in Brazil nut cake was determined by inductively
82
coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) (iCAP Qc, Thermo Fisher Scientific, Germany).
The ICP-MS spectrometer was equipped with a collision and reaction cell, sampling cones,
2.5 mm internal diameter Peltier quartz gun, an autosampler model 520 ASX (CETAC
Technologies, USA) and Qtegra operating software (version 2.4.1800.96) for data acquisition.
The operating conditions of the equipment were as follows: 1550 W incident power, 14 L
min-1 plasma gas flow, 0.80 L min-1 auxiliary gas flow, 1.0 L min -1 nebulizer gas flow, 10 ms
dwell time, using 1 channel per unit mass. Elements were determined in the forms of the
55 57 65 66 82
following isotopes standards Mn, Fe, Cu, Zn, and Se. To correct for transmission
interference from sample introduction and ionization, internal standardization was carried out
73 103 205
through addition and monitoring of the following isotopes, Ge, Rh and Tl, each at a
final concentration of 5 μg L-1. Analytes were quantified using standard curves with seven
standard solutions for calibration and quantification was performed by interpolation.
Concentrations of the elements calcium, phosphorus, magnesium, potassium and sodium were
determined by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) in a
iCAP 6300 (Thermo Scientific, England), with double view configuration (axial and radial),
equiped with a cyclonic nebulizing camera with a MiraMist type nebulizer (Mira Mist CE,
Burgener Research Inc., Canada) and a iTEVA 2.4 operating software for data acquisition.
Quantification was performed in the radial view using analytical calibration curves with five
standard solutions, and quantification by interpolation.Working solutions were prepared by
diluting standard monoelementar stock solutions SpecSol at 1000 mg L-1 (Quimlab Química
e Metrologia®, Brazil), to obtain the desired concentrations using ultrapure water from a
Milli-Q® system (Merck Millipore, USA). Analyses were performed in triplicate and the
results were expressed on a dry basis as mean ± standard deviation. Blank solutions
containing all reagents except the sample were analyzed in parallel in order to identify
possible contaminants from the reactants or the procedure.
2.5 Statistical Analysis
All the results are presented as mean ± SD. Datas were analyzed by ANOVA followed
by Tukey’s post-test. Results with p<0.05 were considered statiscally significant. All data
were analyzed with Graph Pad Prism 6.0. All analyses were carried out in triplicate, and the
analytical data were used for statistical comparisons.
83
3 RESULTS AND DISCUSSION
3.1 Proximate composition of Brazil nut cake
Brazil nut cake showed higher contents of protein, fiber, ash and moisture when
compared with whole Brazil nut, because lipid extraction by expeller pressing concentrated
the other components (Table 2). Proximate composition of Brazil nut cake and whole Brazil
nut were in agreement with previously reported data (Sathe, et al., 2009; Ferreira et al., 2006).
Several factors may interfere in the proximate composition of Brazil nut, such as
environmental factors (weather, soil, among other factors), maturity, genetic varieties, and
growth location (Srikantha et al., 1980; Singh and Bargale, 2000). Proximate composition of
Brazil nut cake might be further influenced by processing conditions that may interfere with
the amount of oil extracted.
Table 2: Proximate composition of whole Brazil nut and Brazil nut

cake (g/100 g).
Components Whole Brazil nut Brazil nut cake
Proteins 13.4 ± 1.31b 28.1± 0.608a

Lipids 50.8 ± 6.43b 14.7 ± 0.009a
Moisture 3.51 ± 0.071b 10.1 ± 0.001a
Fiber 9.45 ± 0.007b 18.5 ± 0.005a
Ash 3.21 ± 0.100b 7.25 ± 0.001a
Carbohydrate* 19.6 ± 0.025b 21.3 ± 0.123a
Results were expressed as mean ± SD, n = 3. Different superscript
letters in the same row indicate significant differences (p <0.05)
between samples. (*) Contents of carbohydrates were calculated by
difference.
The protein content of the Brazil nut cake increased 2-fold compared to whole Brazil
nut. Proteins in the Brazil nut cake are rich in sulfur amino acids, favoring this by-product’s
use as an interesting food source of vegetable proteins for humans. Santos et al (2013) also
noted increased protein contents in Brazil nut cake and related this difference to the reduction
in lipid contents and to an increase in sensitivity to nitrogen detection, because fat might
interfere with protein analysis. Brazil nut cake also showed high levels of dietary fibers, and
84
might be classified as a food with high content of dietary fiber (ANVISA, 1998). Fiber
consumption is associated with physiological benefits to the human organism, such as to
support the growth of colon microorganisms and to decrease fecal transit time, both of which
benefit the human organism (Roberfroid et al., 2007a). Besides protein and fiber, we observed
high ash content in Brazil nut cake (7.25 mg/100 g) which is an indication that this by-product
is rich in inorganic components, and possibly mineral nutrients.
We also observed moisture was increased in Brazil nut cake compared to whole Brazil
nut, probably because the kernels were hydrated before pressed. Brazil nut kernels with low
moisture content impaired the oil extraction. In contrast, high moisture contents reduces
friction and mechanical forces necessary for expelling the oil, causing low extraction yield
(Singh and Bargale, 2000). It should be emphasized that low moisture contents are important
to prevent microbial growth, contamination and the occurrence of undesirable biochemical
reactions favored by moisture (Sathe et al., 2009).
In addition to nutritional and functional properties, the contents of macronutrients in
Brazil nut cake interact with some bioactive compounds, such as phenolic compounds
investigated in this study. Protein-phenolic, lipid-phenolic or phenolic-carbohydrate
interactions (Papadopoulou e Frazier, 2004; Alu'datt et al., 2013) may interfere with the
bioactivity of these components in humans.
3.2 Total phenolic compounds, total flavonoids and antioxidant capacity from Brazil
nut cake extract by spectrophotometric methods
Total phenolic compounds and total flavonoids in Brazil nut cake were determined
spectrophotometrically (Table 3). Total phenolic contents in Brazil nut cake were similar to
previously reported, in the range of 169-312 mg/100 g of defatted Brazil nut flour (Yang et
al,. 2009 and Kornsteiner et al., 2006). However, contents of total flavonoids (Table 3) were
lower than reported by these same authors (Yang et al., 2009). Part of phenolic acids and
flavonoids are bound to other components, especially by ester or glycosidic bonds,
respectively. This bound fraction would not be extracted by simple solvent extraction, such as
in the procedure adopted in the present study, and would need alkaline and/or acid hydrolysis
for extraction. Both the contents of phenolic compounds and the fractional distribution of free
and bound forms might vary in Brazil nut according to intrinsic and environmental factors.
85
Nuts intake is associated to the prevention of cardiovascular diseases and cancer.
Knowledge of these beneficial health effects in large part come from epidemiological studies,
relating the composition of bioactive components in nuts, such as phenolic acids and
flavonoids. The possible beneficial effects of these compounds can be promoted by their
antioxidant, antiproliferative, and/or antiinflammatory activity.
Brazil nut cake extracts showed significant antioxidant capacity measured by FRAP and
TEAC assays, which determine samples' ability to donate electrons and to to react with and
neutralize free radicals, assesseing both lipophilic and hydrophilic antioxidants in the extract
(Table 3) (Halvorsen et al 2002; Blomhoff, 2005). The present results of high antioxidant
activity are consistent with previously published data (Halvorsen et al., 2002; Dragland et al.,
2003; Blomhoff, 2005; Blomhoff et al., 2007) for Brazil nuts, hazelnuts, almonds,
macadamias, pine kernels, cashew nuts, and peanuts. Antioxidant capacity values observed
for Brazil nut cake are higher than those of animal foods such as meat, milk and cheese
(Blomhoff, 2005).
Table 3: Antioxidant components from Brazil nut cake extract by

spectrophotometric methods.
Antioxidant components Mean ± SD
Phenolic compounds
Total phenolic compounds (mg GAE/100 g) 181.0 ± 12.3
Total favonoids (mg CE/100 g) 3.05 ± 0.41
Antioxidant Capacity assays
FRAP (mmol Fe+2/100 g) 520 ± 50.0
TEAC (mmol TE/100 g) 0.399 ± 0.03
The antioxidant activity of phenolic compounds is related to their ability to scavenge

free radicals, donate hydrogen atoms or electrons from to the hydroxyl groups bound to the
aromatic ring and possibly to chelate metal cations by carboxyl groups (Lindsay and Astley,
2002). These features allow these compounds to act in oxidative degradations by preventing
or reducing damages caused to living cells. This occurs in vegetables and animals, which
produce and consume these compounds, respectivelly. Oxidative stress might increase the risk
of developing several diseases with concurrent inflammatory processes, such as cancer,
Parkinson's disease, Alzheimer's disease, cardiovascular diseases (CVD), stroke, type 2
86
diabetes, hypercholesterolemia and atherosclerosis (Gutteridge and Halliwell, 2000; Bagatini
et al, 2011). The consumption of Brazil nut cake might help preventing numerous diseases,
and besides be used as a natural antioxidant in foods, for its high contents and varied
composition of natural antioxidants. The antioxidant capacity and contents of total phenolics
and flavonoids in Brazil nut cake indicate that the extract could be applied for functional
foods.
However, the measurement of antioxidant capacity in vitro provides only an indication
that a food has antioxidant function. These tests measure the antioxidant capacity of a food as
if it were consumed totally, but does not measure the antioxidant capacity in a biological
system, and therefore does not take into account the physiological reactions of the human
body and the bioavailability of bioactive components. However in vitro antioxidant capacity
is important to provide that particular food has antioxidant activity and from these results
begin more detailed investigations into the post absorption effects in vivo.
In vivo studies have demonstrated that the consumption of diets rich in fruits and
vegetables increased the antioxidant capacity of individuals due to polyphenols composition,
tocopherols, selenium and other bioactive components, resulting in a lower risk of
cardiovascular disease (Lepantalo et al., 2009). The consumption of polyphenols could induce
many beneficial effects in vivo by protecting from inflammation and DNA damage (Bisht et
al., 2010).
Knowledge of the specific composition of phenolic compounds in foods is related to
absorption, metabolism and bioavailability since the chemical structure of the polyphenols
determines their antioxidant activity and interactions with other food components in addition
to cellular receptors and enzymes (Scalbert and Williamson, 2000). The presence or absence
of glycosidic bonds, glycosylation site, and the number of hydroxyl groups and free and
esterified positions also interfere with the action of phenolic compounds in foods and the
human body (Halbwirth, 2010).
Most studies with Brazil nut cake consider only the content of phenolic compounds by
spectrophotometric method (Folin-Ciocalteu). However, this test has several limitations,
especially due to interference from other sample components such as proteins, ascorbic acid
and sugars, leading to erroneous estimates of phenolic compounds in the samples. The
determination of phenolic compounds by Folin-Ciocalteau assay reagent is useful as a method
of initial sample evaluation and screening, but its limitations must be considered (Bonoli et al,
87
2004). The use of specifics and sensitives methods such chromatographics are advisable
aiming for a detailed characterization of these components. Because of the complexity of the
chemical structure and the diversity of classes of phenolic compounds (Ignat et al., 2011).
Besides being able to suggest more safely what are the bioactive compounds or classes that
have, for example, antioxidant capacity on Brazil nut cake extract.
3.3 Detailed characterization of the phenolic compounds in Brazil nut cake extract by
LC-HRMS
Phenolic compounds in Brazil nut cake extract were determined by HPLC-PDA in the
study shown in chapter 2. Although the HPLC-PDA has enabled identification and
quantitation of seven phenolic compounds (Chapter 2), we observed others chromatographic
peaks that were not indentified (Figure 3; Chapter 2). Factors such a low resolution and
sensibility of detector used (PDA) mainly because of the sample complexity, and absence of
standards may have difficulted a separation and identification these compounds.
In order to identify a broader range of phenolic compounds in Brazil nut cake extract,
we applied high resolution mass spectrometry (HRMS) in an Orbitrap analyser, which
presents high resolution (typically from 100,000 to 1,000,000) and mass precision (1–2 ppm)
(Makarov et al., 2006). This technique offers excellent sensitivity, selectivity and high
resolution enabling elucidation or confirmation of phenolic compounds in Brazil nut cake
extract. Identification of phenolic compounds by LC-HRMS was performed by two different
approaches: targeted (based on analysis of commercial standards) and non-targeted (without
the aid of standards).
3.3.1 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by targeted LC-
HRMS
The targeted strategy was used to identify and confirmation of the phenolic compounds
in Brazil nut cake extract, using commercial standards by LC-HRMS. In this case, analysis of
reference standards allowed unequivocal identification of twelve phenolic compounds (Table
4), five of which not were detected in HPLC-PDA (Chapter 2). The identification by LC-
HRMS targeted strategy was based in retention time, measurement of the exact mass of
88
analytes (error <5 ppm) and fragmentation (MS²) of the three major fragments. Using this
targeted approach, identities of the following phenolic compounds were confirmed: gallic,
protocatechuic, p-hydroxybenzoic, 2,4-dihydroxybenzoic, 2-hydroxybenzoic, p-coumaric and
sinapic acids, and the flavonoids (+)-catechin, myricetin, quercetin, quercetin 3-β-D-glucoside
and (-)-epicatechin (Table 4). The retention time of the phenolics compounds identified
(Table 4) were very near, this may had difficulted the separation by HPLC-PDA. MS2 spectra
of the phenolic compounds (Figures 1 and 2) were obtained in the all ions fragmentation
mode. Phenolic compounds that have similar structures and same exact mass (eg. 2, 4-
dihydroxybenzoic and protocatechuic acids), showed characteristic mass spectra that assist in
identification these compounds, besides of different retention time (Figure 1).
Table 4: Phenolic compounds identified in Brazil nut cake extract by targeted LC-HRMS analysis, based on
retention time and exact mass error (< 5ppm).
Elution Erro Molecular

order Theoretical r Formula
Phenolic Compounds rt (min)
exact mass (ppm
)
1 Gallic acid 3.97 169.01315 -0.24 C7H6O5
2 Protocatechuic acid 6.77 153.01824 0.91 C7H6O4
3 (+)-Catechin 8.02 289.07066 4.36 C15H14O6
4 p-Hydroxybenzoic acid 9.85 137.02332 0.15 C7H6O3
5 (−)-Epicatechin 10.9 289.07066 4.21 C15H14O6
6 2,4-Dihydroxybenzoic acid 11.9 153.01824 0.72 C7H6O4
7 p-Coumaric acid 14.3 163.03897 0.80 C9H8O3
8 Sinapinic acid 14.5 223.06009 3.05 C11H12O5
9 Quercetin 3-β-D-glucoside 17.2 463.08710 3.23 C21H20O12
10 2-Hydroxybenzoic acid 18.7 137.02332 0.22 C7H6O3
11 Myricetin 18.8 317.02919 3.60 C15H10O8
12 Quercetin 21.6 301.03428 3.89 C15H10O7
89
Amostra_castanha_TPD1 #388 RT: 3.31 AV: 1 NL: 3.75E7 Amostra_castanha_TPD1 #742-781 RT: 6.41-6.72 AV: 10 NL: 1.63E7
F: FTMS - p ESI Full ms2 275.00@hcd35.00 [50.00-500.00] F: FTMS - p ESI Full ms2 275.00@hcd35.00 [50.00-500.00]
73.02815 68.99445
100
1 100
2
90 90
80 80
70 70
Relative Abundance
Relative Abundance
60 60
68.99445
50 50
40 87.00744 40
111.00755 30
30 85.02818
20 96.95885 20 118.96509
146.96011
61.98711 79.95603 79.95602
10 99.00752 120.99531 10 112.98440 144.04442
57.03334 169.01334 61.98709 152.01038
88.98673 135.04401 147.02884 157.01326 71.01253 87.92402 103.91903
123.94532 137.05967
57.03333
0 0
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
m/z m/z
Padrao_fenolicos_1ppm_20comp #907-934 RT: 7.95-8.16 AV: 7 NL: 1.94E7 Amostra_castanha_TPD1 #1132-1161 RT: 9.76-10.00 AV: 8 NL: 1.84E7
68.99446 68.99449
100 100
90 3 90 4
80 80
70 70
Relative Abundance
Relative Abundance
60 60
50 50
40 40
30 30
118.96510
289.07207 118.96511
20 146.96013 20
109.02832 245.08164 79.95605
125.02329 66.99331 116.92743 131.07030
79.95603 174.95524 203.07089 61.98712 85.02823
10 233.15429 250.14463 10 96.95889 110.97459 129.01826
87.92401 165.01853 187.03931 221.08163 71.01256 89.02315 103.91906
304.91415 59.01258 120.99537 136.03936
271.06137
0 0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 50 60 70 80 90 100 110 120 130
m/z m/z
Amostra_castanha_TPD1 #1262-1269 RT: 10.90-10.93 AV: 2 SB: 2 11.24-11.29 NL: 2.81E6
F: FTMS - p ESI Full ms2 275.00@hcd35.00 [50.00-500.00] Amostra_castanha_TPD1 #1354-1445 RT: 11.69-12.45 AV: 23 NL: 1.82E7
F: FTMS - p ESI Full ms2 275.00@hcd35.00 [50.00-500.00]
68.99448
100
220
90
200
180
5 80 6
160 70
Relative Abundance
Relative Abundance
140
60
120
50 109.02832
151.03900
100
269.10325
40
80
161.04452 30 118.96511
60 146.96014
61.98719 112.98447 20
40 68.99483 101.02325 129.05456 79.95605
89.02318 65.03839 135.00771
191.05533 10 112.98444 123.94536 153.01834
20
180.06572 263.12925 278.10427 61.98711 91.01766
137.02334 233.06630 102.98751 130.08628
85.02828 209.08135 247.02449 286.17748 71.01256 87.92404 144.04447
175.03914 59.01259 165.05477
0 0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
m/z m/z
2
Figure 1: MS spectra of the phenolic compounds identified in the Brazil nut cake extract by LC-HRMS/ESI-
Orbitrap in full scan negative mode. Gallic acid (1), protocatechuic acid (2), (+)-catechin (3), p-
hydroxybenzoic acid (4), (−)-Epicatechin (5), 2,4-dihydroxybenzoic acid (6).
90
Amostra_castanha_TPD1 #1638-1666 RT: 14.14-14.35 AV: 7 NL: 1.49E7 Amostra_castanha_TPD1 #1671-1691 RT: 14.42-14.56 AV: 5 NL: 1.41E7
100
68.99448 7 100
68.99448 8
90 90
80 80
70 70
Relative Abundance
Relative Abundance
60 60 73.02824
50 50
118.96511 118.96508
40 40
146.96014 146.96011
116.92746
30 30
79.95604
79.95605
20 20 122.95803 150.95301
174.95518
110.97459 110.97459
10 61.98712 121.02835 149.04451 10 61.98712 143.89782
102.98751 102.98750 166.90865
71.01256 89.02315 95.95103 130.98262 144.04446 87.92404 130.98260
158.95016 59.01260 158.95014 180.06572 201.11275 215.00947 233.15434
0 0
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230
m/z m/z
100
68.99449 9 100
68.99450 10
90 90
80 80
70 70
Relative Abundance
Relative Abundance
60 60 118.96514
118.96505
50 50
146.96013
79.95607
40 40
79.95606
30
30
174.95523 110.97460
110.97459
20
20
61.98713 93.03337
10
78.03381 95.95106 102.98753 112.98448
10 102.98750 182.95384 130.98264
66.99332 71.01259 81.95190 90.99692 99.92466 104.98533 121.02837
215.00941 272.08896 306.07664 335.17114 367.10681 395.19215 443.19300 465.27135 0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
m/z m/z
100
68.99448 11 100
68.99447 12
90 90
80 80
70 70
118.96509
Relative Abundance
Relative Abundance
60 118.96513 146.96012
60
146.96017
50 50 79.95602
79.95603
40 40
174.95520
89.02314
30 174.95527 30 110.97456
110.97458
20 20
93.03335 102.98748
10 10 130.98259
130.98263 304.91425 304.91417
158.95020 180.98857 215.00953 233.15437 158.97757 215.00946 230.98595
276.91960 330.98029 182.95385 255.05501 288.93670
0 0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z m/z
Figure 2: MS2 spectra of the phenolic compounds identified in Brazil nut cake extract by LC-HRMS/ESI-
Orbitrap in full scan negative mode. p-coumaric acid (7), sinapic acid (8), Quercetin 3-β-D-glucoside
(9), 2-hydroxybenzoic acid (10), Myricetin (11) and Quercetin (12).
91
The major class of phenolic compounds identified in Brazil nut cake extract was
phenolic acids. John and Shahidi (2010) identified in the whole Brazil nut the following
phenolic compounds: gallic acid, gallic acid derivative, protocatechuic acid, protocatechuic
acid derivative, protocatecaldeyde, vanillic acid, vanillic acid derivative, ellagic acid, and
ellagic acid derivative by HPLC-PDA and HPLC-MS. Some phenolic compounds were
similar with those identified in the present study. However, we identified a higher variety of
phenolic acids and flavonoids in Brazil nut cake extract, probably because of the analytical
techniques used. For instance, phenolic compounds’ profile might vary according to several
factors in plants and this might have contributed to the differences between our results and
previous reports.
Therefore, these results demonstrate that LC-HRMS technique provided the
unequivocal identification of phenolic compounds in Brazil nut cake that not were identified
by HPLC-PDA. This high resolution analytical method proved useful for the determination of
the detailed characterization of phenolic compounds in a complex food matrix with high
resolution and specificity.
3.3.2 Tentative identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by non-
targeted LC-HRMS
The unknown phenolic compounds in Brazil nut cake extract were tentatively identified
using non-targeted strategy. The samples were analyzed by LC-HRMS (Figure 3), which is a
highly sensitive tecnique, used to confirm identification of the phenolic compounds detected
and to suggest the identification of unknown phenolic compounds.
92
Figure 3: Representative total ion current (TIC) chromatogram, obtained in full scan MS mode of the
phenolic compounds from Brazil nut cake extract by LC-HRMS.
Phenol Explorer 3.0 database was used for auxiliary in select the possible phenolic
compounds in Brazil nut cake extract. We searched of the phenolic acid (hydroxybenzoic and
hydroxycinnamic acids) and flavonoids classes.This selection resulted in 120 phenolic
compounds, which had their exact theoretical mass determined in the negative mode
(deprotonated), with the help of the software Xcalibur. Then, these exact theoretical mass
were sought for in the sample that was analyzed by LC-HRMS in full scan mode. Phenolic
compounds with an error > 5 ppm and that not has presented the exact theoretical mass in
Brazil nut cake extract were excluded, resulting thirty phenolic compounds that could
possibly were present in Brazil nut cake extract (Table 5). The m/z of the three most abundant
MS2 fragments were selected. Because this fragmentation pattern denotes specific structural
characteristics of each compound after being ionized and fragmented in the collision chamber,
it was studied in order to allow peak assignment.
93
Table 5: Phenolic compounds tentatively identified in the Brazil nut cake extract by LC-HRMS / ESI-Orbitrap
analysis.
Exact
Suggested phenolic Molecular Error
rt (min) theoretical m/z MS2 (%)
compounds formula (ppm)
mass (-)
Phenolic acids
251.11352 (37)
Valoneic acid dilactone C21H10O13 3.82 469.11292 383.15606 (100) -1.53
433.13537 (39)
85.02825 (100)
4-Hydroxybenzoic acid 4-
C13H16O8 3.97 299.07614 125.0233 (31) 4.05
O-glucoside
251.11344 (57)
85.02824 (34)
Gallic acid 4-O-glucoside C13H16O10 4.25 331.06597 128.03421 (100) 3.90
251.11344 (19)
112.98444 (76)
Hydroxycaffeic acid C9H8O5 5.14 195.02879 151.03900 (54) 2.51
167.03400 (100)
112.9844(55)
Protocatechuic acid 4-O- 152.0104 (81)
C13H16O9 5.32 315.07105 -0.72
glucoside 315.0724 (52)
128.0344(26)
3.80
p-Coumaroyl tartaric acid C13H12O8 5.56 295.04484 259.0753 (36)
274.1411 (18)
109.02834 (25)
Gallic acid ethyl ester C9H10O5 6.91 197.04445 121.02832 (100) 2.49
135.0441 (16)
89.02317(44)
Cinnamic acid C9H8O2 8.99 147.04405 131.034 (21) -0.88
147.0441 (32)
179.0706(41)
p-Coumaric acid 4-O-
C15H18O8 9.33 325.09179 223.0609 (100) 4.34
glucoside
278.1037(31)
68.99368(30)
p-Coumaroyl malic acid C13H12O7 12.94 279.04993 109.0283(54) 4.37
131.0703(24)
112.9846(17)
p-Coumaroylquinic acid C16H18O8 14.09 337.09179 121.0284(100) 3.92
263.0774(37)
94
180.0658(27)
Caffeic acid 4-O-glucoside C15H18O9 14.81 341.10196 298.1086(24) 4.75
378.0657(100)
112.9845 (61)
Ellagic acid C14H6O8 18.36 300.99789 161.0446 (14) 4.12
263.1501 (100)
Flavonoids
87.00737(91)
(+)-Catechin 3-O-gallate C22H18O10 2.55 441.08162 111.007 (35) 4.31
272.0888 (37)
111.0076 (84)
Quercetin 3-O-(6"-
C24H22O15 3.53 549.08749 120.9953 (100) 1.17
malonyl-glucoside)
207.0867 (71)
85.02825 (100)
Hispidulin C16H12O6 3.97 299.07614 125.0233 (31) 3.88
251.11344 (57)
163.03900 (25)
Cirsilineol C18H16O7 5.84 343.08122 181.04980 (100) 4.58
221.10250 (25)
163.039(28)
(+)-Catechin 3-O-glucose C21H24O11 6.32 451.12348 181.0498 (100) 2.53
405.1415 (29)
443.1928 (100)
Kaempferol 3-O-rutinoside C27H30O15 7.98 593.15009 457.1718 (40) 0.39
459.1873 (27)
99.0076 (15)
Quercetin 3-O-acetyl-
C23H22O7 9.09 409.12818 149.0445 (44) 4.01
rhamnoside
191.0554 (25)
121.0283(65)
Rhoifolin C27H30O14 10.61 577.15518 249.0614 (30) 6.88
379.1609 (74)
109.02832 (60)
Dihydroquercetin C15H12O7 12.5 303.04993 121.02832 (37) 4.06
249.06144 (41)
180.0658(27)
Tetramethylscutellarein C19H18O6 14.81 341.10196 298.1086(24) 4.75
378.0657(100)
112.9841(60)
Myricetin 3-O-galactoside 15.40 479.08201 137.0233 (53) 1.42
C21H20O13
144.0444 (33)
95
112.9841(60)
Myricetin 3-O-glucoside 15.40 479.08201 137.0233 (53) 1.42
C21H20O13 144.0444 (33)
125.09611 (56)
Quercetin 3-O-glucuronide C22H22O12 16.10 477.06637 187.09695 (54) 2.60
427.16122 (100)
125.09611 (56)
Isorhamnetin 3-O- 187.09695 (54)
C22H22O12 16.10 477.06637 2.60
galactoside 427.16122 (100)
125.09611 (56)
Isorhamnetin 3-O- 187.09695 (54)
16.10 477.06637 2.60
glucoside C22H22O12 427.16122 (100)
125.09611 (33)
Hesperetin C16H14O6 16.73 301.07066 187.09697 (39) 4.35
267.07222 (31)
61.98707(14)
Isorhoifolin C27H30O14 22.27 577.15518 289.1657 (86) 2.29
421.2084 (100)
From these thirty phenolics compounds, 16 were suggested as belonging to the class of
phenolic acids and 14 of flavonoids. Some of these compounds were previously detected in
nuts, such as ellagic acid, Kaempferol-3-O-rutinoside, isorhamnetin 3-O-galactoside, valoneic
acid dilactone (Milbury et al., 2006; Li et al., 2006; Teets et al., 2009). Some of the suggested
compounds are positional isomers or differ by the glucoside form (Table 5). The most
commonly found sugar is glucose, but other sugars, such as galactose, rhamnose, xylose and
arabinose are found. However, glucoside forms with mannose, fructose, glucuronic and
galacturonic acids are rare (Abad-García et al., 2009). Flavonoids commonly occur as O-
glycosides, in which one or more hydroxyl groups of the aglycone are bound to the sugar
forming an acid labile glycosidic O-C bond.
Phenolic compounds have very similar structures these are usually distinguished by the
substitution of hydroxyl groups on the aromatic rings. In chromatographic analyses
identification is generally based on retention time compared to a known component, standard
co-elution and UV spectra. However in our study the analysis of unknown compounds by LC-
HRMS, it allowed creating an effective approach to identify tentatively the phenolic
compounds in Brazil nut cake. To the best of our knowledge, there are no analytical studies
suggesting a systematic approach for identification of phenolic compounds in Brazil
nuts.Current attempts to create a database containing metabolomic mass fragments from MS 2
96
analysis of polyphenois are mostly based on the analysis of pure substances individually.
Hooft et al (2011) identified several phenolic compounds patterns through MS n fragmentation
approach and found that it can be used for structural elucidation of polyphenol structures and
substructures in order to construct a MS/MS library of polyphenols. However this approach
can be influenced by the design of analytical tools (LTQ Orbitrap), might interfere with the
reproducibility and robustness of the results and thereby influence the MSn spectra, hindering
comparison with the literature.
The use of at least one good database of phenolic compounds is a necessary tool to
identification safely of phenolic compounds and their metabolites from several food matrices,
thus standardizing the method used to identify as occurs for example with peptide analysis for
proteomics. In the present study we applied a practical approach, along with high resolution
accurate mass provided by the Orbitrap analyzer, to identify phenolic compounds from a
complex matrix. This suggests that through a judicious approach polyphenols composition
might be determined without standards in a complex matrix, such a Brazil nut cake.
3.4 Tocopherol from Brazil nut cake by HPLC
The four homologues of tocopherols (α, β,  and δ) were identified in Brazil nut cake
(Figure 4). The total tocopherol content was 3.47 mg/ 100 g of Brazil nut cake and the -and
α-tocopherol were the main tocols (Table 6). Although a much of the lipophilic components
of the Brazil nut were transferred to the oil after pressed, we observed that the Brazil nut cake
also showed lipophillic components, as tocopherols. However is important to emphasize that
the contents of tocopherols depends on the amount of lipids which was retained in Brazil nut
cake.
97
Figure 4: Representative cromatogram of tocopherols from Brazil nut cake: α, β,  e δ-tocoferol by
HPLC-Fluorescence (Exc 290 e Emis. 330 nm).
Table 6: Tocopherols contents (mg/100 g) from Brazil

nut cake by HPLC-Fluo.
Tocopherol Brazil nut cake

α-tocopherol 0.99 ± 0.001
β-tocopherol 0.82 ± 0.007
-tocopherol 1.64 ± 0.079
tocopherol 0.024 ± 0.001
Total tocopherol 3.47 ± 0.039
*Values were expressed as mean ± standard
deviation (n= 3).
The results found in our study were similar with those on the tocopherols in the oil of
Brazil nut (Costa et al, 2010;. Maguire et al., 2004; Ryan et al., 2006). However, according
some results reported in the literature the type and contents tocopherols found in the oil of
Brazil-nut and Brazil nut cake may change. Chunhieng et al (2008) identified as β-tocopherol
being the major tocol in Brazil nut oil. But in a study with seven different types of nut was
observed that both β and tocopherol were the main tocols in the following order decreasing
pistachios> walnuts> pecans> Brazil nut> pines peanuts> cashews (Kornsteiner et al. 2006).
These variations in the content and type of homologues of tocopherols reported in the
literature may occur due to several factors such as the origin of the food matrix, processing,
98
storage time, type and sample preparation and use of different analytical methods (Chun et al.,
2006).
Brazil nut cake in our study showed 28.5% of of α-tocopherol in relation the total
tocopherol content. The α-tocopherol has the greatest biological activity of vitamin E due to
its absorption in the organism could be performed by transfer of a specific α-TPP protein that
recognizes only α-tocopherol and transports it to the plasma body. However, the other
homologous of tocopherols also show vitamin E activity where β,δ-tocopherol and have
approximately 50%, 10% and 3%, respectively, with respect to α-tocopherol (FAO, 2001;
Wagner, Kamal Eldin, and Elmadfa, 2004).
Tocopherols in foods are related to the antioxidant capacity of acting both present in the
biological system by preventing oxidative stress, such as directly into the food by inhibiting
lipid oxidation. Some studies describe a descending order of antioxidant capacity among the
homologous of tocopherols where δ> β = γ> α-tocopherol. However there is controversy
between the tocol with higher antioxidant capacity as order will depend on several factors
such as the concentration of tocopherols which is directly related with the type that will be
homologous of analysis. In addition to the influence of the food matrix, temperature, oxygen
availability and light exposure (Chung et al., 2006; Costa et al., 2010).
Knowledge of all isoforms of vitamin E in Brazil nut cake is important, as before only
the α-tocopherol was recognized for its high biological activity of vitamin E, however in
recent years studies of other homologous of vitamin E, separately has demonstrated its
biological importance and bioactivity in humans. An example of this is the γ-tocopherol
which, when present in higher concentration has shown higher antioxidant activity compared
to the α-tocopherol in foods of plant and animal origin. In the biological system, the γ-
tocopherol has been shown as a potential agent for the prevention of chemotherapy and
prevention of cerebral infarction.The vitamin E has both positive effects on human health and
in their application in the food industry due to its ability to inhibit lipid oxidation in foods due
to its antioxidant capacity (Shahidi and Zong, 2010).
Brazil nut cake showed all homologs of tocopherols with significant content which are
possibly related to the antioxidant activity found in the Brazil nut cake extracts in this work..
In addition, knowledge of α-, β- and δ-tocopherols in by-product favors its reuse and can
be applied as additives in food or through technological applications, since there are few
99
studies in the literature to investigate through a direct review the composition of vitamin E in
this by-product.
3.5 Minerals composition of the Brazil nut cake by ICP-OES and ICP-MS
Brazil nut cake presented considerable contents of several essential minerals in the
following order: P> K> Mg> Ca> Zn> Fe> Cu> Mn> Na> Se (Table 7). Our results were
similar to those reported in the literature for the whole Brazil nut (Yang, 2009). And were
similar to the mineral content found by Santos et al (2013) in the flour defatted of Brazil nut,
with the exception only for the selenium content which found a higher content than our study,
143 μg/ g selenium. However, the contents of minerals in particular selenium varies greatly
between Brazil nut, it suffers the influence of various factors such as soil type, pH, moisture
content, the maturity of the tree and the root system and the change in size almonds (Nassu,
Lima and Paiva, 2004; Moodley et al., 2007 ).
Table 7: Minerals composition in Brazil nut cake by ICP-MS and ICP-OES analyzed.
**Equivalent the
Minerals Contents *RDAs RDAs (%)
Se (μg/ g) 4.87 ± 0.89 55 μg/ day 8.92
Cu (μg/ g) 52.1 ± 0.96 900 μg/ day 5.81
Fe (mg/ g) 0.086 ± 0.35 8-18 mg/ day 0.47
Mn (mg/ g)a 0.029 ± 0.25 1.8-2.3 mg/ day 1.26
Zn (mg/ g) 0.121 ± 0.22 8-11 mg/ day 1.10
K (mg/ g) a 14.0 ± 0.43 4700 mg/ day 0.29
Mg (mg/ g) 12.9 ± 0.28 310- 420 mg/ day 3.09
Na (mg/ g) a 0.0069 ± 0.004 <2.3 mg/ day 0.30
P (mg/ g) 25.3 ± 0.10 700 mg/ day 3.61
Ca (mg/ g) 6.41 ± 0.068 1000-1200 mg/day 0.534
* Recommended Dietary Allowances (RDAs) for groups adults females and males (IOM,
2006). RDA is the average daily dietary intake level; sufficient to meet the nutrient
requirements of nearly all (97-98 percent) healthy individuals in a group.
**Percentage of the contents of minerals in Brazil nut cake equivalent the Recommended
Dietary Allowances (RDAs).
100
As previously described the reduction of lipid fraction has fostered increased protein
and we observe that also influenced the content of minerals in the cake, confirming the results
of ashes with the highest content of organic matter in the Brazil nut cake. Among the
macrominerals Na showed lower levels (0.0069 mg/ g) which favors the hydroelectrolytic
balance of the body. Already the phosphorus and potassium had the highest concentrations of
these minerals act in lowering the blood pressure in the body, and help to reduce the incidence
of stroke (Man, 2002; SEGURA et al., 2006). Representative contents of calcium and
magnesium were also found in the cake, these minerals are involved in many enzymatic
reactions in the body acting in important biological functions of metabolism, bones, muscles,
nerves, and heart (Saris et al. 2000; Casas-Agustench et al. 2011).
In relation to microminerals, the second highest level in Brazil nut cake was selenium,
where consumption of 1 g of the Brazil nut cake represented about 8.5% of the Recommended
Dietary Allowances (RDAs) (Table 7) (IOM, 2006). The selenium content is associated to
proteins of thisoilseeds because of sulfur amino acids such as methionine and cysteine. This
favors the formation of complexes selenomethionine or selenocysteine. Selenium acts on the
cellular defense mechanism against oxidative damage by acting as an antioxidant retarding
the cell aging process, in addition to action on physiological and metabolic functions in the
immune system and protection against heart disease and certain forms of cancer (Rayman,
2000; Yang 2009;). However selenium consumption should respect the recommended dietary
allowances (Table 7), since the intake above 55μg / day for adults can cause toxicity in the
individual causing diseases as selenose.
Others important minerals such iron, zinc, copper and manganese were also found in the
Brazil nut cake, it is also involved in several micronutrients enzymatic reactions, where some
have antioxidant capacity. Our results demonstrate that the Brazil nut cake is a rich source of
micro and macrominerals whereas the recommended dietary allowances (Table 7), and the
increase in the protein content of the cake and reduce the lipid fraction favored increased
levels of selenium and others the by-product minerals indicating consumption in balanced
doses may contribute to better health, for example acting on prevention of diabetes, coronary
heart disease and certain cancers.
101
3.6 Analysis of Proteins from Brazil nut cake by MALDI/ ToF-ToF
The proteins extraction methods in Brazil nut cake using the lysis buffer (urea, thiourea
and DTT) extracted a significant amount of total soluble protein (14.4 mg/ ml) measured by
the spectrophotometric method Bradford. Qualitative and quantitative analysis of proteins
may be influenced by various factors such as extraction time, ionic strength of the solvent to
the protein solubility and the method used to quantification of total protein content (Bradford,
Lowry and Kjeldhl), these factors can interfere in electrophoresis analysis and in the type of
proteins that are extracted (Sathe et al., 2009). In the present study was carried out
preliminary study to determine the extraction protocol that resulted in the extraction of higher
contents of total protein by the Bradford method. Extraction were tested using protein
precipitation (using Tris-HCl and TCA-acetone / β-mercaptoethanol overnight at -20° C and
extracted with lysis buffer); extracting only the addition of the lysis buffer and centrifugation,
and a third extraction using the lysis buffer and the sonication, the latter being the one that
showed the best results (data not shown) and was used throughout the study.
Proteins were separated by polyacrylamide gel electrophoresis in two dimensions (2D
SDS-PAGE). In the first dimension, the proteins were separated according to their pI
(isoelectric focusing) and the second by its molecular weight (kDa). Were detected
approximately 61 protein spots in 2D SDS-PAGE gel from Brazil nut cake. We observed
spots in a smaller amount in the acidic region, and in higher quantities between neutral and
basic regions. Moreover, the higher quantities of protein spots were observed in the molecular
weight region in the range 10 - 100 kDa (Figure 5).
102
Figure 5: 2D SDS-PAGE electrophoresis gel (IPG strip of pH 3−11) image revealed with
Coomassie blue, representative sample of Brazil nut cake. Gel orientation:
horizontal, isoelectric focusing (pI); vertical, PAGE (molecular weight kDa).
Identical numbers refer to the same spots identificaded by MALDI ToF-ToF. The
Molecular weight standards (kDa) of the protein are shown at the left of the
images.
The spots of proteins detected in 2D SDS-PAGE in Brazil nut cake were converted in
simple peptides for enzymatic digestion by the cleavage of the protein molecules by the
enzymatic action of trypsin. The peptides were analyzed by mass spectrometry which ionized
by Matrix-Assisted Laser Desporption Ionization (MALDI), and the ions formed are
separated and analyzed according to the relationship m /z through the analyzer Time-of-Flight
and Time-of-Flight (ToF-ToF) (Table 8). Twenty-two protein spots were identified in two-
dimensional gel. The identified proteins were: 11S globulin, 2S albulmin, the isoform of the
2S albulmin (sulfur-rich seed storage protein 1) and a spot with subunits of glycinin (Glycinin
G1) (Table 8). The others spots did not show characteristic peaks of peptides and were not
identified in Brazil nut cake. Some bidimensional bands observed in the gel (Figure 5) can be
derived from interactions between phenolic and/or lipids with proteins to form protein
complexes or phenolic-lipid-protein, which may interfere with the analysis by electrophoresis
(Saravanan and Rose, 2004). In addition to these interactions may occur protein-protein
interactions, which may for example arise between the albumins and globulins identified in
this study. Different strengths of bonds as ionic, hydrogen, hydrophobic interactions and
103
disulfide can promote this type of interaction because the experimental conditions (pH,
temperature and ionic strength) (Sathe, 2009). Large protein complexes (soluble and
insoluble) may be formed, which interfere with the analysis and identification difficult,
especially due to the variation in solubility caused the proteins.
Table 8: Analysis protein from the Brazil nut cake by MALDI – ToF-ToF
Spot nº in the gel Protein NCBI* kDa pI

1, 2, 3, 7, 8, 9, 15, 16, 17,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 39, 11S globulin gi|30313867 52663 6.14
41, 46, 52, 58, 60
2S sulfur-rich seed
60,61 gi|112754 17355 5.96
storage protein 1;
gi|8439533 17354
61 2S albumin 6.82
8 Glycinin G1; gi|121276 56299 5.89

* National Center for Biotechnology Information.
The proteins identified in the Brazil nut cake are characterized as storage proteins. The
2S albumin is a protein of low molecular weight 12-17 kDa, composed of two peptides chains
linked by disulfide bonds, can therefore be reduced to smaller masses 3 and 9 kDa with pIs
varying between 4.6 and 6.8. This protein has more than 20 isoforms and is characterized by
its composition rich in sulfur amino acids (methionine and cysteine). The albulmin 2S and
some of its isoforms have been found in whole Brazil nuts where similar to our study were
identified isoforms according to the NCBI gi | 8439533 and gi | 8439533 and another four that
were not identified in present study (Moreno et al., 2004). Already the 11S globulin consist of
higher molecular weight proteins subunits and in the presence majority subunits (53, 60, 66
and 70 kDa) which are reduced after being divided into smaller subunits (31, 36, 42 and 46
kDa) (Sathe et al., 2009). These different molecular weights which represent the 11S globulin
were observed in the 2D SDS-PAGE (Figure 5). The same protein can be detected in
different region of the gel, due to reactions that cause post-translational modifications as
phosphorylation and addition acetylation glycosidic groups that can alter the isoelectric point
or the action of protease and the interaction with others proteins that can alter the molecular
weight of the proteins (Giometti et al, 2002;. Lee et al. 2003).
Studies using two-dimensional electrophoresis and proteomics to identify the protein
composition in Brazil nuts identified the 11S glutelin, the 2S albulmin and 7S albulmin as the
104
major proteins present in this oilseed. In the present study didn’t detect the 7S albulmin in
Brazil nut cake, the absence of this protein by-product may be due to processing of pressing
suffered by almonds Brazil nuts that may possibly have influence on the protein composition
of the by-product generated. In addition to 7S albumin is found in a smaller proportion
compared to 11S and 2S proteins in plant organisms. Several factors, such as type of
extraction, almonds harvest conditions, type of solution used in the extraction of proteins
from others may also interfere in the proportion and type of proteins.
The 11S found in a higher proportion relative to 2S albumin, according to the number of
identified spots. Studies using the protein fractionation in defatted flour Brazil nut identified
the proteins 2S, 7S and 11S where the ratio was approximately 19%, 8% and 73%,
respectively (Sharma et al, 2010; Sun et al., 2010).
The characterization of the protein composition in Brazil nut cake is important since
many proteins have in recent years having bioactive properties. Studies have described not
only the functional importance of protein in relation to technological applications (emulsifier,
gelling etc.) or the need for knowledge of its allergenic potential, since this has been well
described in Brazil nut, especially due to the presence of proteins that have 2S albulmins
known as the major allergen Ber and 1 (Alocer et al., 2012). But it also has attracted the
interest of researchers because of the bioactive properties of proteins and peptides. The
albulmins and globulins were investigated by studying the isolated protein cumin and these
exhibited high antioxidant capacity has been related to the composition of amino acids present
in proteins. In the present study it was not individually evaluated the antioxidant power of
protein extract, to confirm its antioxidant properties. But probably the antioxidant capacity
values found can also be influenced by these proteins. Furthermore, proteins such as 2S
albumin contain various properties such as antinfungic action, antimicrobial, antibacterial and
inhibition of serine proteases (Agizzio et al. 2003; Genov et al., 1997). Therefore from the
knowledge of the protein composition of the Brazil nut cake performed in our study we noted
the need further studies on the bioactivity of proteins Brazil nut cake since this is a major
component of this oilseed.
105
4. CONCLUSIONS
Our results confirmed that the Brazil nut cake is composed by a variety of bioactive
components such as minerals, which are important for the functioning of the body, especially
selenium; tocopherols, important lipophilic antioxidant and proteins, which worth further
investigation because of possible presence of bioactive peptides. And the extract obtained
from this by-product showed a wide composition of phenolic compounds (phenolic acids and
flavonoids) with significant antioxidant capacity as measured by in vitro assays. In addition,
the use of hyphenated techniques such HRMS-ESI-Orbitrap secured an increased reliability
results. Since the chemical characterization of the Brazil nut cake had not yet been described
using this type of approach and investigated an ample amount of bioactive compounds such as
occurred in the present study. Our results demonstrate the potential of functional compounds
of the Brazil nut cake enabling the reuse of this by-product in new food applications, not only
because of its rich protein composition but also because of its bioactivity and thereby adding
value to Brazil nut.
106
Capítulo 4
Microencapsulação do extrato da torta da Castanha-
do-Brasil (Bertholletia excelsa) por spray drying
Manuscrito a ser submetido ao periódico Food Chemistry
107
RESUMO
A busca por novas alternativas que possibilitem o reaproveitamento de co-produtos da

indústria alimentícia tem crescido nos últimos anos. O extrato obtido da torta de castanha-do-
Brasil é rico em compostos bioativos como os fenólicos, tocoferóis e selênio. O uso de
tecnologias como o encapsulamento possibilita aumentar a aplicabilidade deste co-produto
com o desenvolvimento de novos alimentos com propriedades funcionais. O objetivo deste
estudo foi microencapsular por spray dryer o extrato da torta de castanha-do-Brasil e avaliar
qual a melhor combinação da mistura dos agentes encapsulantes Capsul ® e inulina pela
investigação de sua propriedade química, físico-químicas e sua estabilidade, além de
caracterizar os componentes bioativos da micropartícula que apresentou a melhor formulação.
A micropartícula encapsulada com Capsul ® e inulina (1:1) apresentou melhor características
mais favoráveis em relação as propriedades físico-quimicas e estabilidade dos fenólicos totais
e capacidade antioxidante durante 120 dias de armazenamento. Os compostos bioativos da
micropartícula com a formulação de ativo:Capsul®:inulina, 1:1:1 foram caracterizados por
análises cromatográficas. Foram identificados sete ácidos fenólicos: gálico, protocatecuico, p-
hidroxibenzóico, 2,4 dihidroxibenzóico, p-cumárico, sinapínico, 2-hidroxibenzóico e cinco
flavonóides: quercetina 3-β-D-glucoside, (+)-catequina, (−)-epicatequina, miricetina e
quercetina. Todos os homólogos dos tocoferóis foram identificados e o -tocoferol foi o
majoritário, além destes componentes as micropartículas também apresentaram um teor de
selênio de 4.95 μg/ g de pó. Todos os compostos bioativos identificados são caracterizados
por possuirem uma elevada capacidade antioxidante e já serem reconhecidos por contribuir
com seus efeitos benéficos a saúde humana. Portanto, a micropartícula do extrato de torta de
castanha-do-Brasil se mostrou um potente aditivo para formulação de alimentos funcionais
devido a diversificada composição de compostos bioativos identificados nas micropartículas.
108
1. INTRODUÇÃO
A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) é rica em componentes bioativos como:

fitoesteróis, compostos fenólicos, tocoferóis e selênio (Kornsteiner et al., 2006; Moodley et
al., 2007; Pacheco & Scussel, 2007; Yang, 2009). Portanto apresenta elevado potencial como
matéria-prima para a obtenção de produtos tecnologicamente beneficiados, com grau
alimentício e bioatividade. O resíduo sólido da obtenção por prensagem do óleo de castanha-
do-Brasil potencialmente apresenta componentes bioativos hidrofílicos. A caracterização dos
compostos bioativos na torta de castanha-do-Brasil investigada anteriormente (Capítulo 3)
mostrou o potencial que este co-produto apresenta em relação ao conteúdo de compostos
fenólicos e capacidade antioxidante dos extratos, além do conteúdo de tocoferol, minerais
(especialmente o selênio) e proteínas na torta.
Os compostos bioativos, como os fenólicos, são mais instáveis em solução e podem
sofrer reações de degradação como a oxidação podendo haver perda em sua bioatividade.
Técnicas de microencapsulamento como a atomização por spray drying promovem a retirada
do solvente e a transformação dos extratos líquidos em sólidos, conserva as propriedades
bioativas e possibilita uma maior estabilidade destes componentes (Çam et al., 2014). Além
disto, a microencapsulação de extratos contendo componentes bioativos favorece a
incorporação dos mesmos em diversos produtos alimentícios, enriquecendo e conferindo
propriedades funcionais (Fang e Bhandari, 2010).
A escolha do tipo e da quantidade de material encapsulante que será utilizada na
produção das micropartículas está relacionada com as características funcionais e tecnológicas
que se deseja obter. Diversos encapsulantes são utilizados na obtenção das micropartículas na
indústria alimentícia como maltodextrina, goma arábica, ciclodextrina e amido modificado
(Wandrey et al., 2009). Várias características são levadas em consideração na escolha do
agente encapsulante como boas propriedades de formação de filme; propriedades
emulsificantes, baixa higroscopicidade, baixa viscosidade a altas concentrações de sólidos,
sabor e odor suaves e baixo custo. No entanto, um único composto dificilmente irá englobar
todas as propriedades e, assim, utiliza-se misturas destes encapsulantes (Gibbs et al., 1999;
Trindade et al., 2008).
O Capsul® é um amido modificado quimicamente pela adição de um grupamento
lipofílico, o octenilsuccinato, que proporciona características anfipáticas e propriedades
109
emulsificantes. O que favorece seu uso como agente encapsulante, além de apresentar
características estabilizantes e um baixo custo. O Capsul® apresenta aprovação do Food and
Drug Administration (FDA) como um aditivo na indústria alimentícia desde que o conteúdo
de octenilsuccinato não exceda 3% (Rocha et al., 2012). Outro possível potencial agente
encapsulante é a inulina, usada na indústria alimentícia como um substituto de gordura ou
açúcares, como um adoçante com baixo valor calórico e fibras dietéticas solúveis (Ronkart,
2007; Toneli et al., 2008b). É considerado um alimento com propriedades de alegação
funcional devido seus efeitos prebióticos (ANVISA, 2008; Barclay et al., 2010). A inulina é
um frutooligossacarídeo, obtida comercialmente a partir das raízes de chicória (Cichorium
intybus), dália (Dahlia pinuata) e alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus)
(Roberfroid, 2007). Além das características funcionais, a inulina apresenta características
tecnológicas importantes como gelificante, espessante, estabilizante de espumas e emulsões,
agente de textura e material encapsulante (Hinrichs et al., 2001; Blecker et al., 2001; Franck et
al., 2002; Kelly et al., 2009). Estudos têm investigado a microencapsulação de compostos
fenólicos com inulina e avaliaram uma boa retenção e estabilidade das formulações em
relação à composição de fenólicos e capacidade antioxidante durante o tempo de
armazenamento em diferentes condições de secagem por spray drying (Bakowska-Barczak
and Kolodziejczyk, 2011; Saénz et al., 2009; Fernandes et al., 2014).
Portanto o objetivo deste estudo foi microencapsular por spray drying o extrato da torta
de castanha-do-Brasil investigando a melhor combinação da mistura dos agentes
encapsulantes Capsul® e inulina pela investigação de suas propriedades químicas, físico-
quimicas e sua estabilidade, além de caracterizar os componentes bioativos das
micropartículas, possibilitando assim o reaproveitamento deste co-produto, através do uso das
micropartículas como aditivo para o enriquecimento das propriedades funcionais de
alimentos.
110
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Amostra
As amostras de castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) com casca foram adquiridas no

Mercado Central de Alimentos do Rio de Janeiro (CADEG, Rio de Janeiro), oriundas de uma
cooperativa (RECA, Amazonas). As amostras foram selecionadas manualmente e secas em
estufa com circulação forçada de ar a 45 °C por 12 h, e armazenadas em frascos plásticos
fechados a -20 °C.
2.2 Obtenção da torta e do extrato da castanha-do-Brasil
As castanhas-do-Brasil foram descascadas manualmente e hidratadas até umidade de 7 a

10%. Em seguida, as castanhas foram trituradas em processador de alimentos (Walitta,
Brasil). A amostra foi prensada em prensa de rosca contínua (OEKOTEC-IBG; Alemanha)
em temperatura aproximada de 30 °C e para obter a torta (resíduo sólido) da castanha-do-
Brasil, esta foi armazenada a -20°C em embalagens metalizadas.
O extrato da torta de castanha-do-Brasil foi obtido pela extração com solvente de acordo
com as condições de extração otimizadas no Capítulo 2. A solução de etanol:água, 40:60 v/v
foi adicionada em 10 g da torta da castanha-do-Brasil. A mistura foi homogeneizada em
Ultra-turrax® (T-18 Basic; IKA, Alemanha) por 2,5 min e extraída em agitador orbital (KS
3000 IC Control; IKA, Alemanha) a 300 rpm por 1h a 60°C. Em seguida o extrato foi
centrifugado (ST 16R, Sorvall Centrifuge, Thermo Scientific, Alemanha) a 3000 g/15 min
em temperatura ambiente. O sobrenadante foi recolhido e o procedimento repetido por duas
vezes; os extratos foram combinados e avolumados para 50 mL. O extrato da torta de
castanha-do-Brasil foi caracterizado em nosso estudo anterior (Capítulo 3) em relação aos
compostos fenólicos e capacidade antioxidante. Os extratos foram armazenados a -20°C não
ultrapassando um período máximo de 24h, até serem encapsulados.
111
2.3 Encapsulação do extrato da torta de castanha-do-Brasil
O extrato da torta de castanha-do-Brasil foi microencapsulado por atomização

utilizando como material de parede a mistura de Capsul ® e inulina. Foram testadas três
proporções entre material ativo e as misturas de encapsulante (Tabela 1), para definir a mais
adequada. A matriz encapsulante foi adicionada ao extrato hidroalcoolico respeitando o limite
de menos 30% de etanol, o qual é adequado para a secagem no spray dryer, a dispersão foi
homogeneizada em placa de agitação e em seguida com ultrasonicador (Up 100 Hz;
Hielscher, Alemanha) com amplitude de 90% e 1 ciclo por 2 min. As secagens das suspensões
foram feitas imediatamente em Mini Spray Dryer (Buchi 290, Büchi Laboratoriums Technik
Flawil, Suíça) com temperatura de entrada de 180 ± 3,0 °C e de saída de 80 ± 3,0 °C e vazão
de alimentação de 6 mL/ min através do bico atomizador de 0,3 mm, com fluxo de ar de 0,3
bar e taxa de aspiração de 32,5 m3. Após secagem as micropartículas foram acondicionadas
em tubos de prolipropileno herméticos e armazenadas a –20 °C.
Tabela 1: Combinação de diferentes proporções do material encapsulante

(Capsul® e inulina) para obtenção das micropartículas, com base no
teor de sólidos totais do extrato.
Micropartículas Ativo (g)* Capsul ® (g) Inulina (g)

A (1:1:1) 3,24 3,19 3,20
B (1:2:1) 3,32 6,15 3,10
C (1:1:2) 3,12 3,32 6,21
*Teor de sólidos totais (g) no extrato da torta de castanha-do- Brasil em 100 mL.
A influência da proporção de material de parede foi investigada através das analises de

compostos fenólicos totais, capacidade antioxidante, caracterização física e físico-química e
tempo de armazenamento das micropartículas. Então, após a determinação da melhor
micropartícula do extrato da torta de castanha-do-Brasil esta foi caracterizada em relação à
composição de compostos fenólicos, tocoferóis e selênio.
112
2.4 Influências das diferentes proporções de encapsulantes na composição das
micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil
2.4.1 Rendimento da microencapsulação e retenção de compostos fenólicos
O rendimento da microencapsulação e a retenção dos compostos fenólicos do extrato de

torta de castanha-do-Brasil foram calculados de acordo com as equações 1 e 2,
respectivamente (Fang e Bhandari, 2011).
Equação 1
Recuperação (%) = Massa pó coletado

Massa do sólido na solução de alimentação
Equação 2
Retenção dos Compostos fenólicos totais (%) = FT* micropartículas x 100

FT* solução de alimentação
(*) FT: Fenólicos totais
2.4.2 Extração dos compostos fenólicos das micropartículas
Os compostos fenólicos das micropartículas foram extraídos com a adição de 5 mL de
água Milli-Q em 0,5 g do pó, a dispersão foi homogeneizada em agitador vórtex por 5 min
(Vortex 3, IKA, Alemanha) e colocada em banho de ultrassom por 15 min. As soluções
obtidas foram filtradas em membranas de 0,45 μm (SLCR013NL, Membrana PTFE – Millex,
Brasil) e armazenadas a –20 °C em frasco âmbar.
2.4.1.1 Análise dos compostos fenólicos
Os compostos fenólicos totais do extrato e das micropartículas foram determinados pelo

ensaio do reagente de Folin-Ciocalteau (Singleton et al., 1999). Os resultados foram expressos
em mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/100 g de micropartículas em base seca, de
acordo com curva de calibração padrão a 765 nm. Para evitar superestimação dos resultados
113
devido à interferência do material de parede nas leituras por espectrofotometria, foram
realizadas curvas de calibração usando os materiais de parede Capsul ® e inulina.
2.4.1.2 Capacidade antioxidante
A capacidade antioxidante do extrato e das micropartículas da torta de castanha-do-

Brasil, foi determinada pelos ensaios de capacidade antioxidante em equivalentes de Trolox
(TEAC) (Re et al., 2009) e poder antioxidante de redução do ferro (FRAP) (Benzie e Strain,
1996). Os resultados dos ensaios de TEAC e FRAP foram expressos em mmol ET/100 g e
mmol Fe+2/100 g de micropartículas em base seca, respectivamente. Para evitar
superestimação dos resultados devido a interferência do material de parede nas leituras, as
curvas de calibração foram feitas com os materiais de parede Capsul ® e inulina.
2.4.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas
2.4.2.1 Análise de umidade e atividade de água
O teor de umidade das micropartículas foi determinado em balança de umidade com

aquecimento por infravermelho (105 °C/ 90 min) (MA 35M, Metrohm Pensalab, Brasil). E a
atividade de água das micropartículas foi determinada em analisador específico (Lab Master;
Novasina, Suiça) a 25 °C. As análises foram feitas em triplicata.
2.4.2.2 Morfologia e tamanho das partículas
As micropartículas foram analisadas em Microscópio Eletrônico de Varredura (JSM

6460-LV; JEOL, Japão) a 20 kV com aumentos de 1000, 2000 e 5000 vezes. Pequenas
quantidades do pó foram depositadas na superfície de fita condutora dupla face de carbono.
Em seguida, as micropartículas foram metalizadas com uma fina camada de ouro para análise.
A distribuição de tamanho das partículas foi determinada por técnica de espalhamento
dinâmico da luz (SALD-2201; SHIMADZU, Japão). Dez mg do pó foi disperso em 30 mL de
álcool isopropílico, com ajuda de ultrassom (2 min). O diâmetro médio ponderado pelo
114
volume (d) foi medido, e a distribuição do tamanho das partículas do pó (Span) foi calculada
de acordo com a Equação 3:
Span = d (0,75) – d (0,25) Equação 3

d (0,50)
Onde os valores de d (0,75), (0,5) e (0,25) são equivalentes aos diâmetros nos percentis
dos 75%, 50% e 25%, respectivamente (Jinapong et al., 2008).
2.4.3 Estabilidade das micropartículas
As micropartículas (ativo:Capsul®:inulina – 1:1:1, 1:2:1 e 1:1:2) foram armazenados em

embalagens plásticas transparentes de polipropileno, sem o abrigo da luza 27 ± 3 °C, por 120
dias. As micropartículas foram avaliadas em relação aos teores de compostos fenólicos totais
e capacidade antioxidante nos tempos de 0, 30, 60, 90 e 120 dias.
2.5 Caracterização dos componentes fenólicos, tocoferóis e selênio
2.5.1 Determinação dos compostos fenólicos por CLAE-DAD e CL-EMAR
Os compostos fenólicos dos extratos e das micropartículas da torta de castanha-do-

Brasil foram secos em rota evaporador (Rotavapor R-215, BÜCHI; Suiça) a 40 °C. O resíduo
seco das amostras foram reconstituídos em 5 mL de metanol: água (3:97, v/v), filtrados
através de filtros de membranas PTFE de 0,45 μm (Millex, Millipore; Alemanha) e analisados
por CLAE-DAD. Os compostos fenólicos foram analisados em um sistema de CLAE (LC-
10ADvp, Shimadzu, Japão) equipado com um sistema controlador (SCL-10Avp),
degaseificador (DGU-14A), e um detector de Arranjo de Diodos (DAD) (SPD-M10Avp). As
amostras e as soluções padrões foram injetadas através de válvula Rheodyne com loop de 20
µL. Os compostos fenólicos foram eluidos em coluna de fase reversa C18 column (5 µm ×
150 mm × 4,6 mm; Kromasil; AkzoNobel; Suécia). A fase move consiste de um gradiente
formado por água acidificada com 0,3% de ácido fórmico (eluente A), metanol (eluente B) e
acetonitrila (eluente C) com um fluxo de 0.8 mL/min. Com o seguinte sistema de gradiente da
115
fase móvel: 0 min, 14,3% B e 0,7% C; 7 min, 29,5 % B e 1,5 % C; 14 min, 44,6% B e 2,4%
C; 21 min, 59,8% B e 3,2% C; 25 min, 90,3% B e 4,7 % C, com tempo de análise de 25 min
(John e Shahidi, 2010 com modificações). O eluato da coluna foi monitorado a 260, 280 e 320
nm. Os compostos fenólicos foram identificados pela comparação do tempo de retenção e
spectro dp DAD dos padrões comerciais. A quantificação foi realizada de acordo com curva
de calibração de cinco pontos dos compostos fenólicos padrões. Os dados foram processados
e analisados pelo software LC-Solution (Shimadzu, Japão). A analise quantitativa foi
realizada de acordo com curva de calibração externa de cada padrão correspondente. As
analises foram realizadas em triplicatas e os resultados foram expressos em mg/ 100g de
amostra em base seca.
A confirmação da identidade dos compostos fenólicos foi realizada por cromatografia
líquida com espectrometria de massas de alta resolução LC–EMAR (do inglês: High
Resolution Mass Spectrometry - HRMS). O sistema consistiu de um espectrômetro de massas
(Q ExactiveTM; Thermo Scientific, Alemanha) híbrido quadrupolo-Orbitrap (Thermo
Scientific, Bremen, Alemanha) com fonte de ionização por elétron spray (ESI) operando em
modo positivo [MH+] e negativo [MH-]. A separação dos analitos ocorreu em coluna C 18 (5
µm × 150 mm × 4,6 mm; Kromasil; AkzoNobel; Suécia), com fluxo de 350μL/ min. A fase
móvel e o sistema de gradiente foram os mesmos utilizados na analise por CLAE-DAD. Foi
utilizada uma resolução de massa de 35.000 e precisão da medição de massa de 5 ppm, os
espectros foram obtidos em um intervalo de massa de 60-600 m/z no modo Full scan com
energia de colisão de 35 V. Os dados foram processados pelo software Xcalibur 2.0 (Thermo
Scientific, Bremen, Alemanha). A Identificação dos compostos fenólicos ocorreu pela
comparação do tempo de retenção, massa exata m/z e erro (ppm) da amostra com os padrões.
2.5.2 Tocoferóis por CLAE-Fluorescência nas micropartículas
A extração dos tocoferóis das micropartículas da torta de castanha-do-Brasil foi

realizada de acordo com os métodos da American Oil Chemists’ Society (AOCS, 2002). As
soluções de tocoferóis (padrões e amostras) foram analisadas por CLAE-Fluorescência (exc.
290 nm e em 330 nm). Os tocoferóis foram separados em coluna de fase normal (Zorbax Rx-
Sil – Agilent, EUA) e eluídos com fase móvel isocrática binária (hexano:isopropanol; 99:1
v/v) em 1.0 mL/ min. A identificação e quantificação dos tocoferóis nas amostras foram
116
realizadas, respectivamente, pelo tempo de retenção e calibração externa dos padrões alfa,
beta, gama e delta-tocoferóis.
2.5.3 Determinação de Selênio por ICP-MS
O preparo das micropaticulas do extrato da torta de castanha-do-Brasil para a

determinação do teor de selênio foi realido por digestão ácida de acordo com os métodos
oficiais da Association of Official Agricultural Chemists - AOAC (AOAC, 2000). Foi
adicionado em 0,5 g da amostra 10 mL de ácido nítrico concentrado, em seguida a mistura
ficou em repouso em overnight a temperatura ambiente. Após foi adicionado 5 mL de
peróxido de hidrogênio 30%, aguardou-se 30 min e as amostras foram aquecidas a 100°C em
bloco digestor por 8 h. A solução resultante foi filtrada e avolumada para 25 mL com água
milli-Q e analisadas por ICP-MS.
A determinação das concentrações de selênio nos extratos ácidos das micropartículas da
torta de castanha-do-Brasil, foi realizada em espectrômetro de massa com fonte de plasma
indutivamente acoplado (ICP-MS) (iCAP Qc, Thermo Fisher Scientific, Alemanha), equipado
com célula de colisão e de reação, cones de amostragem (“sample cone”) e escuma
(“skimmer”) de níquel, câmara de nebulização ciclônica de duplo passo (“baffled”) de
quartzo, nebulizador concêntrico de Teflon® (FPA-ST), Peltier, injetor de quartzo de 2,5 mm
de diâmetro interno, amostrador automático (ASX 520,CETAC Technologies, USA) e
software operacional Qtegra (versão 2.4.1800.96) para a aquisição dos dados. As condições
de operação do equipamento foram: 1550 W de potência incidente, 14 L min -1 de vazão de
gás no plasma, 0,80 L min-1 de vazão de gás auxiliar, 1,0 L min-1 de vazão de gás do
nebulizador, dwell time de 10 ms e 1 canal por unidade de massa. O elemento foi determinado
na forma do isótopo 82Se em modo “padrão” (“Standard”). Para correção de interferências de
transporte na introdução de amostra e de ionização, foi realizada a padronização interna com a
adição e monitoramento dos isótopos 45Sc, 73Ge, 103Rh e 205Tl, todos na concentração final de
5 μg L-1. O analito foi determinado por curvas analíticas com sete soluções-padrão para a
calibração e a quantificação foi realizada por interpolação. As soluções foram geradas a partir
de diluição de solução-padrão estoque monoelementar SpecSol de concentração igual a 1000
mg L-1 (Quimlab Química & Metrologia®, Brasil), até obtenção das concentrações desejadas
117
utilizando agua ultrapura obtida de um sistema Milli-Q®, modelo Direct 8 (Merck Millipore,
Billerica, Massachusetts, EUA).
2.6 Análise estatística
Os resultados foram analisados por ANOVA one-way com medidas repetidas e pós-
teste de Tukey para investigar a estabilidade do ativo durante o armazenamento das
micropartículas. Para verificar a correlação entre os teores de compostos fenólicos totais e a
capacidade antioxidante, foi realizada a correlação de Pearson (Graph Pad Prism 6.0).
Resultados com valores de p< 0.05 foram considerados significativos.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Influência do encapsulante nas características química, físico-química e

estabilidade das micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil
O tipo de material de parede e a sua quantidade em relação ao ativo são alguns dos
principais fatores que influenciam o processo de encapsulamento dos compostos bioativos em
relação à proteção, estabilidade e aplicação do produto (Rosenberg, 1990). Nosso estudo
avaliou preliminarmente as formulações das micropartículas usando apenas Capsul ® ou
inulina como material de parede. No entanto, a encapsulação apenas com inulina apresentou
baixa recuperação no final do processo de secagem (menor que 5%), fazendo com que
desconsiderássemos essa formulação. Já as micropartículas com Capsul ® apresentaram uma
boa recuperação (>50%) e teores consideráveis de compostos fenólicos totais (2084 ± 86,6
mg/100 g EAG) e capacidade antioxidante (3131 ± 155 mmol Fe+2/ 100 g, FRAP; e 4,56 ±
0,36 mmol ET/ 100 g, TEAC). Porém, a inulina é reconhecida como um alimento com apelo
funcional (ANVISA, 2008), pois apresenta efeitos prebióticos pela sua composição de fibras,
além de estar relacionada com a biodisponibilidade do cálcio e alguns estudos reportam sua
importância como uso potencial em alimentos para diabéticos (Roberfroid et al., 2007; Kelly
et al., 2009). Então frente ao potencial funcional deste frutooligosacarídeo decidimos
investigar sua combinação com o amido modificado (Capsul ®) em diferentes proporções na
produção das micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil. Com isto, três
118
diferentes proporções dos encapsulantes (inulina e Capsul®) em relação ao material ativo
foram investigadas através da avaliação química por análises espectrofotométricas dos
compostos fenólicos totais e capacidade antioxidante. Além disso, foi avaliada a influência
destas diferentes formulações nas características físicas e físico-químicas e na estabilidade das
micropartículas. A partir da análise em conjunto, resultante dessas características
determinamos a micropartícula com melhores propriedades e a caracterizamos em relação aos
compostos bioativos avaliando: a composição de fenólicos, tocoferóis e selênio por métodos
cromatográficos.
3.1.1 Compostos fenólicos totais e capacidade antioxidante das micropartículas
Os teores de compostos fenólicos totais das três formulações das micropartículas do

extrato da torta de castanha-do-Brasil apresentaram diferença significativa em função das
diferentes proporções de material de parede utilizado. Variando de 2230 ± 12,1 (1:1:1); 2158
± 26,3 (1:2:1); e 2192 ± 80,8 (1:1:2) mg/ 100 g EAG, foi observado uma pequena diferença
entre os teores de compostos fenólicos totais e a micropartícula que apresentou os teores
maiores foi a formulação ativo:Capsul®:Inulina 1:1:1 (Figura 1). Os resultados foram
calculados com base no teor de sólidos totais do extrato. A interferência do material de parede
em cada ensaio foi eliminada pelo uso de curvas de calibração com o material de parede e a
correção foi aplicada aos cálculos de todas as análises espectrofotométricas.
2500 a b c
2000
mg EAG/ 100 g
1500
1000
500
0
1:1:1 1:2:1 1:1:2
®
Proporção ativo:Capsul :Inulina
Figura 1: Compostos fenólicos totais nas micropartículas dos extratos da torta de castanha-do-Brasil,
produzidas com diferentes proporções da mistura de material de parede (Capsul® e Inulina).
*Resultados expressos como média ± desvio padrão, n=3. Letras diferentes indicam diferença
significativa entre as micropartículas (p< 0.05).
119
A recuperação do processo de secagem por spray drying foi calculada de acordo com a
razão entre o total de pó gerado na secagem e o total de sólidos totais na solução de
alimentação. As micropartículas produzidas nas diferentes proporções ativo:Capsul ®:Inulina
apresentaram uma recuperação acima de 68% (Tabela 2). Uma secagem é considerada
eficiente quando a recuperação for superior a 50 % (Bhandari, et al., 1997), logo segundo a
faixa de recuperação obtida podemos considerar a secagem eficiente para todas as
micropartículas. Normalmente as perdas do pó durante a secagem ocorrem devido à aderência
das partículas na parede da câmara de secagem ou devido as partículas mais finas serem
levadas diretamente para o filtro do secador, não sendo recolhidas no coletor (Fang e
Bhandari, 2011). Além desses fatores, a composição das micropartículas em relação a
açúcares e lipídios também pode interferir na recuperação do pó, diminuindo o rendimento
final.
A retenção dos compostos fenólicos totais nas micropartículas foi calculada de acordo
com a equação 2 (seção 2.4.1). Após o processo de secagem por atomização a retenção dos
compostos fenólicos totais foi maior que 90% (Tabela 2) para todas as micropartículas. Estes
resultados demostram que as condições usadas na secagem por spray dryer, especialmente a
temperatura de entrada (180 ºC), não afetaram a composição de fenólicos totais das
micropartículas.
Tabela 2: Recuperação do processo de atomização e retenção dos fenólicos totais das

diferentes micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil.
Ativo:Capsul®:Inulina (m/m/m)
1:1:1 1:2:1 1:1:2
Recuperação do processo (%) 70,7 70,1 68,8

Retenção fenólicos totais (%) 93,7 90,7 92,1
A capacidade antioxidante total (CAT) das micropartículas foi determinada pelos

ensaios de eliminação dos radicais livres (TEAC) e da capacidade de reduzir os íons férricos
(FRAP) pelos agentes antioxidantes presentes nas amostras. Similarmente aos teores de
compostos fenólicos da micropartícula 1:1:1, ativo:Capsul®:inulina também apresentou
capacidade antioxidante (9,01 ± 0,19 mmol ET/ 100 g e 4238 ± 47,3 mmol Fe+2/ 100 g, nos
120
ensaios de TEAC e FRAP, respectivamente) relativamente maior em relação as outras duas
formulações das micropartículas (Figura 2).
Ensaio de FRAP Ensaio de TEAC
Figura 2: Capacidade antioxidante pelos ensaios de FRAP e TEAC nas micropartículas dos extratos da torta
de castanha-do-Brasil, produzidas com diferentes proporções da mistura de material de parede
(Capsul® e Inulina). *Resultados expressos como média ± desvio padrão, n=3. Letras diferentes
indicam diferença significativa entre as micropartículas (p< 0.05).
A capacidade antioxidante mensurada pelo ensaio de TEAC, descrita no presente

estudo, foi maior do que a reportada por Bakowska-Barczak e Kolodziejczyk, (2011), que
avaliaram a CAT em micropartículas de passas pretas com inulina e encontraram 7,1 mmol/
100 g. O estudo utilizou condições de secagem por spray drying (180 °C, temperatura de
entrada) e o método do ensaio de TEAC (também descrito por Re et al., 1999) semelhantes ao
nosso estudo. Nossos resultados indicam que as micropartículas do extrato da torta de
castanha-do-Brasil apresentaram potencial para aplicação em alimentos especialmente pela
sua capacidade antioxidante.
3.1.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas
A micropartícula ativo:Capsul®;inulina (1:1:1), apresentou menor teor de umidade em

relação às demais formulações (Tabela 3). A quantidade de material de parede nas
micropartículas em relação ao ativo pode influenciar no teor de umidade, as formulações com
as proporções de 1:2:1 e 1:1:2 de material de parede tenderam a apresentar um teor de
umidade relativamente maior. A umidade das micropartículas é afetada pelas condições
121
operacionais durante o processo de secagem como a temperatura de entrada do spray dryer
(Grabowski et al., 2006; Botrel et al, 2014).
A inulina pode favorecer a umidade dos pós, pois com a rápida secagem no processo de
spray drying, pode haver a formação de uma crosta que é favorecida pelas características
químicas da composição deste frutooligosacarídeo, isso pode dificultar a difusão e a
evaporação de água das micropartículas (Fernandes et al., 2014). Além disto, a variação da
umidade da inulina leva a alterações físicas nas características do pó como aglomeração ou
endurecimento das micropartículas (Schaller-Povolny, Smith e Labuza, 2000).
A atividade de água (Aw) afeta a capacidade de processamento, propriedades de
manuseamento e estabilidade do pó (Ross, 2002). No presente estudo, todas as
micropartículas apresentaram valores de Aw inferiores a 0,3 (Tabela 3), indicando baixa
quantidade de água livre nas amostras, o que consequentemente pode ser favorável para a
estabilidade durante o armazenamento das micropartículas (Tonon et al. 2009). Além de
diminuir o risco de contaminação microbiana.
Os resultados de tamanho de partícula foram expressos como diâmetro médio. A
distribuição do tamanho de partícula foi calculada de acordo com a expansão (Span) das
amostras (Equação 1). As três formulções de micropartículas apresentaram valores de Span <
2 (Tabela 3), o que indica que as micropartículas apresentam intervalo de distribuição de
tamanho de partículas normal e estreita (Dubey and Parikh, 2004; Gottlieb and Schwartzbach,
2004). O tamanho das micropartículas está relacionado com o teor de sólidos, as
micropartículas com menor proporção de material de parede apresentaram uma pequena
diminuição no diâmetro médio (Gharsallaoui et al. 2007).
Tabela 3: Propriedades físicas e físico-químicas das micropartículas do extrato da torta de castanha-

do-Brasil usando diferentes proporções de material de parede.
Proporção
Umidade (%) Aw d (µm)a Span
Capsul®:inulina
(1:1) 3,46 ± 0,23a 0,232 ± 0,003a 5,59 ± 0,45a 1,70
(2:1) 4,13 ± 0,06b 0,239 ± 0,001a 7,40 ± 0,49c 1,58
(1:2) 4,37 ± 0,07b 0,245 ± 0,008a 8,04 ± 0,51b 1,84
Resultados expressos como média ± desvio padrão (n= 3). d, diâmetro médio de partícula. *Letras
diferentes em uma mesma coluna indicam diferenças significativas entre as micropartículas (p<0,05).
122
A morfologia das micropartículas foi investigada por microscopia eletrônica de
varredura (MEV; Figura 3). As micrografias das três formulações das micropaticulas
apresentaram morfologias semelhantes. As superfícies externas das micropartículas não
apresentaram fissuras ou rupturas, o que é fundamental para garantir a maior proteção do
ativo. Em geral as micropartículas exibiram formas esféricas com tamanhos variados, algumas
partículas exibiram superfícies com invaginações, provavelmente atribuídas ao enrugamento
sofrido pelas partículas durante a secagem e resfriamento sofrido no processo de spray drying
(Peleg, 2005; Saénz et al., 2009), e outras partículas apresentaram superfície lisa.
A rugosidade das micropartículas vai depender da velocidade de secagem e das
propriedades viscoelásticas do material de parede (Botrel et al., 2012; Botrel et al., 2014). O
Capsul® apresenta característica de ser um plastificante, a presença de grupos
octenilsuccinatos em sua estrutura favorece a flexibilidade e isso contribui para redução do
enrugamento (invaginações), pois permite a expansão das micropartículas antes da secagem
pelo spray dryer e, provavelmente favorece a formação de uma superfície lisa e uniforme
(Teixeira et al., 2004; Fernandes et al., 2014). A inulina apresenta características de
elasticidade e também pode ter contribuído para a formação de micropartículas com superfície
lisa e pouca rugosidade (Botrel et al., 2014).
123
(A)
(B)
(C)
Figura 3: Morfologia das micropartículas do extrato de torta de castanha-do-Brasil com diferentes

proporções de material de parede. (A) Ativo:Capsul®:Inulina (1:1:2); (B)
Ativo:Capsul®:Inulina (1:2:1) e (C) Ativo:Capsul®:Inulina (1:1:1). Com aumentos de 2000
e 5000 vezes.
Similar aos nossos resultados Beirão-da-Costa et al (2013), descreveram em seu estudo

com microcápsulas usando como material de parede a inulina, que mesmo variando os teores
de sólidos totais e a temperatura de secagem por spray drying, obtiveram pequenas variações
no diâmetro médio de partícula (3-4,5 mm), e todas as formulações apresentaram morfologia
lisa, regular e sem lesões.
124
3.1.3 Influência da proporção de material de parede na estabilidade das micropartículas
de extrato da torta de castanha-do-Brasil
Foi investigada a influência das proporções de material de parede nas micropartículas

do extrato da torta de castanha-do-Brasil sobre os teores dos compostos fenólicos totais e a
capacidade antioxidante, mensuradas a cada 30 dias, durante o armazenamento por 120 dias.
A partir dos valores absolutos das variáveis de resposta fenólicos totais e capacidade
antioxidante (FRAP e TEAC) foram calculadas as quantidades remanescentes em
porcentagem ao longo do período de armazenamento. E avaliamos as perdas para cada
variável durante a variação do tempo (∆tempo = T0 dias – TXdias, onde X se refere aos
intervalos de 30, 60, 90 e 120 dias) a partir dos valores absolutos de cada variável (Tabela 4).
Avaliando os resultados em relação a quantidade de compostos fenólicos e capacidade
antioxidante observamos que a formulação 1:1:1 apresentou micropartículas com maiores
teores de fenólicos totais, por um período de 60 dias de armazenamento em relação as outras
duas formulações (Tabela 4). Porém, após esse período não houve diferença significativa no
conteúdo de fenólicos totais entre as três formulações avaliadas. O que possivelmente indica
que a partir desse período (60 dias) as micropartículas passaram a ter um comportamento
similar em relação ao conteúdo de fenólicos totais. Tambem foi observado a maior capacidade
antioxidante, por ambos os ensaios de FRAP e TEAC, para a formulação das micropartículas
1:1:1 durante os 60 dias de armazenamento em relação as demais formulações. Porém após
esse período apenas não houve diferença significativa entre a formulação 1:1:1 e a formulação
das micropartículas na proporção 1:1:2.
125
Tabela 4: Influência da proporção de material de parede na estabilidade das micropartículas de extrato da torta de castanha-do-Brasil: compostos fenólicos totais e
capacidade antioxidante pelos ensaios de FRAP e TEAC.
Compostos fenólicos totais

®
Capsul :inulina (1:1) Capsul®:inulina (2:1) Capsul®:inulina (1:2)
Remanescente Perdas Remanescente Perdas Remanescente Perdas
Tempo (dias) mg /100 g mg /100 g mg /100 g
(%) (%) (%) (%) (%) (%)
a a a
0 2231 ± 26,4 100 0,00 2158 ± 80,8 100 0,00 2192 ± 13,2 100 0,00
30 1969 ± 27,2a 88,3 11,7 1734 ± 46,2b 77,7 19,0 1758 ± 68,2c,b 78,8 19,4
a b b
60 1780 ± 51,1 79,8 20,2 1552 ± 108 69,6 27,2 1653 ± 75,0 74,1 24,2
90 1607 ± 49,6 a 72,0 27,9 1562 ± 77,6 a 70,0 26,7 1572 ± 31,2a 70,5 27,8
120 1604 ± 60,5 a 71,9 28,1 1592 ± 73,0 a
71,4 25,4 1551 ± 53,1 a
69,5 28,7
CAT ensaio FRAP
Capsul®:inulina (1:1) Capsul®:inulina (2:1) Capsul®:inulina (1:2)
mmol Remanescente Perdas mmol Remanescente Perdas mmol Remanescente Perdas
Tempo (dias)
Fe+2 /100 g (%) (%) Fe+2 /100 g (%) (%) Fe+2 /100 g (%) (%)
a b c
0 4239 ± 47,2 100 0,00 3083 ± 103 100 0,00 3245 ± 64,9 100 0,00
30 4114 ± 105 a 97,6 2,36 3083 ± 27,8 b 99,2 0,80 3369 ± 80,2 c 97,1 2,90
60 3686 ± 67,6 a 87,6 12,4 3082 ± 121 b 99,2 0,80 3212 ± 85,3 b,c 92,8 7,25
a b a,c
90 3193 ± 105 76,6 23,4 2764 ± 82,9 88,5 11,5 3251 ± 65,7 94,6 5,42
120 3244 ± 40,8 a 76,8 23,2 2798 ± 46,9 b 88,6 11,4 3162 ± 14,1 a,c 91,7 8,35
CAT ensaio TEAC
Capsul®:inulina (1:1) Capsul®:inulina (2:1) Capsul®:inulina (1:2)
Remanescente Perdas Remanescente Perdas Remanescente Perdas
Tempo (dias) mmol ET/100 g mmol ET/100 g mmol ET/100 g
(%) (%) (%) (%) (%) (%)
0 9,01 ± 0,19a 100 0,00 7,81 ± 0,08b 100 0,00 8,74 ± 0,07c 100 0,00
30 8,89 ± 0,18a 98,7 1,33 7,15 ± 0,24b 91,5 8,48 8,02 ± 0,24c 91,7 8,27
a b c
60 8,36 ± 0,06 92,4 7,37 6,90 ± 0,11 88,3 11,7 7,64 ± 0,14 87,3 12,6
90 7,58 ± 0,17a 84,1 15,9 6,40 ± 0,23b 81,9 18,0 7,38 ± 0,25a,c 84,4 15,5
a b a,c
120 7,51 ± 0,21 83,4 16,6 6,41 ± 0,03 82,1 17,9 7,26 ± 0,32 83,0 16,9
*Os valores com letras diferentes na mesma linha indicam que há diferença significativa entre as amostras.
126
Ao avaliarmos os resultados em relação a menores perdas durante o armazenamento
observamos que a micropartícula (1:1:1, ativo:capsul:inulina) apresentou as menores perdas
de compostos fenólicos totais e capacidade antioxidante pelo ensaio de TEAC, no início do
armazenamento até o período de ∆T de 60 (Figura 4A e 4C), após este período embora tenha
aumentado o percentual de perdas dessa formulação foi possível observar que houve uma
estabilização dos compostos fenólicos e capacidade antioxidante por ambos os ensaios . Já as
formulações 1:2:1 e 1:1:2, (ativo:Capsul:inulina, respectivamente) apresentaram inicialmente
uma perda de compostos fenólicos totais de aproximadamente de 20%, porém se mantiveram
estáveis ao logo do período de armazenamento apresentando comportamentos similares entre
si (p > 0.05) (Figura 4A).
A capacidade antioxidante total das diferentes formulações das micropartículas pelo
ensaio de FRAP apresentaram comportamentos distintos. A formulação 1:1:1 foi a que teve
maiores perdas ao longo do período de armazenamento e só teve estabilidade na CAT a partir
do ∆T de 90 dias. Já a formulação 2:1 apresentou comportamento distinto, pois não teve perda
significativa da CAT ate o ∆T de 60 dias, e após teve um aumento das perdas da CAT até ∆T
de 90 dias e voltou a se manter estável de 90 ate 120 dias de armazenamento (Figura 4B).
Esse comportamento foi diferente da formulação 1:1:2, onde apesentou baixas perdas < 5% ao
longo de todo o período de armazenamento, com pequenas oscilações de estabilidade com
tendência para um aumento da CAT após o período de 120 dias (Figura 4B). Já no ensaio de
TEAC, a micropartícula (1:1:1) apresentou as menores perdas de CAT, com estabilidade a
partir do ∆T de 90 dias. E as outras formulações (1:2:1 e 1:1:2) apresentaram comportamentos
similar para CAT pelo ensaio TEAC ao longo do armazenamento (Figura 4C). Esses
diferentes resultados estre as analises de CAT das três formulações das micropartículas
investigadas podem estar realionados com as características distintas de cada ensaio.
127
40
Perdas do teor CFT (%)

Capsul:inulina (1:1)
A Capsul:inulina (2:1)
30
20
10
30
60
90
0
12
Tempo (dias)
25
Perdas da CAT (%)
20 Capsul:inulina (2:1)
B Capsul:inulina (1:2)
15
10
0
30
60
90
0
12
 tempo (dias)
20
Perdas da CAT (%)
15
C Capsul:inulina (1:2)
10
0
30
60
90
0
12
 tempo (dias)
Figura 4: Percentual de perdas dos compostos fenólicos (CFT) (A) e capacidade antioxidante total (CAT)
pelos ensaios de FRAP (B) e TEAC (C), devido à influência das diferentes proporções dos
materiais de parede nas micropartículas do extrato de torta de castanha-do-Brasil durante o
armazenamento por 120 dias.
As perdas dos compostos fenólicos durante o período de armazenamento das

micropartículas têm sido reportadas em outros estudos, quanto maior o período e a
temperatura de armazenamento, menores retenções dos compostos fenólicos são observadas.
Foram observadas perdas entre 7-37% de fenólicos totais a 40°C e 6-9 % a 25°C em um
período de armazenamento de seis meses.
Houve um comportamento similar entre os resultados de TEAC e os encontrados para
os compostos fenólicos totais. De acordo com a Figura 5, as variações nos teores de fenólicos
128
totais durante o tempo de estabilidade das formulações tiveram uma correlação positiva forte
com a capacidade antioxidante total pelo ensaio de TEAC (r = 0.9252), porém para o ensaio
de FRAP não houve correlação (r = 0.3263).
110
FRAP (r = 0.3263)
(%) Remanescente CAT
TEAC (r = 0.9252)
100
90
80
70
60 70 80 90 100
Remanescentes de Fenólicos totais (%)
Figura 5: Correlação entre o conteúdo de fenólicos totais e a capacidade antioxidante pelos ensaios de
FRAP (azul) e TEAC (vermelho) das micropartículas (1:1:1; 1:2:1; 1:1:2,
ativo:Capsul:inulina, respectivamente) durante o armazenamento por 120 dias.
Analisando nossos resultados da estabilidade para as variáveis investigadas, podemos

concluir que as micropartículas que são formuladas com a proporção 1:1:1 apresentaram
maiores teores de fenólicos totais e maior capacidade antioxidante (ensaio de TEAC) ao longo
do período de armazenamento. Possivelmente devido esta formulação apresentar uma relação
ativo material de parede de 1:2, ou seja, ela possuía uma quantidade maior de ativo em
relação às demais formulações, porém foi possível observar que essa formulação favoreceu a
proteção do ativo, possivelmente devido uma maior sinergia que pode ter ocorrido entre os
materiais de parede quando estavam na mesma proporção na formação da micropartícula.
Estudos anteriores descrevem que a composição de antocianinas e fenólicos totais em
micropartículas contendo como material de parede inulina foi significativamente mais estável
do que maltodextrinas, após 12 meses de armazenamento (Bakowska-Barczak et al., 2011).
Além das propriedades relacionadas aos compostos bioativos provenientes do extrato da torta
de castanha-do-Brasil, a adição de inulina também apresentam a função de um produto com
alegação de funcional, pela sua característica de fibra alimentar. Segundo a ANVISA (2008),
é necessária uma quantidade de 3% de fibra alimentar no produto pronto para consumo para
129
declará-lo com alegação funcional. Com isto, as micropartículas provavelmente irão auxiliar
no funcionamento do intestino ou contribuir para o equilíbrio da flora intestinal.
Portanto, avaliando de maneira global os resultados tanto das características física,
físico-quimica, composição de fenólicos totais, capacidade antioxidante e estabilidade a
formulação das micropartículas 1:1:1 foi a que apresentou propriedades mais desejáveis para
ser usada como possível aditivo na formulação de alimentos funcionais.
3.2 Caracterização dos componentes bioativos nas micropartículas do extrato de torta

de castanha-do-Brasil (1:1:1, ativo; Capsul®:inulina): compostos fenólicos,
tocoferóis e selênio
As micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil encapsulada com Capsul®

e inulina (1:1:1) foram caracterizadas quanto a sua composição de compostos fenólicos,
tocoferóis e selênio. Foram identificados utilizando o método de Cromatografia Líquida com
Espectrometria de Massas de Alta Resolução (CL-EMAR), sete ácidos fenólicos: gálico,
protocatecuico, p-hidroxibenzóico, 2,4 dihidroxibenzóico, p-cumárico, sinapínico, 2-
hidroxibenzóico e cinco flavonóides: quercetina 3-β-D-glucoside, (+)-catequina (−)-
epicatequina, miricetina e quercetina (Tabela 5). A quantificação foi realizada por CLAE-
DAD. O composto fenólico majoritário foi a (+)-catequina (Tabela 5). O consumo das
catequinas em alimentos tem sido relacionado com a diminuição do risco de doenças crônicas,
como cardiovasculares e certos tipos de câncer (Boyer e Liu, 2004; Geetha et al. 2004).
130
Tabela 5: Identificação dos compostos fenólicos na micropartícula de extrato da torta de castanha-do-
Brasil por CL-EMAR.
Massa Erro
Compostos fenólicos mg/ 100g TR (min)
exata
(ppm)
Ácido gálico 169.01315 -0.71 1.59 4.08
Ácido protocatecuico 153.01824 0.91 5.64 6.76
(+)-Catequina 289.07066 3.46 19.0 7.82
Ácido p-Hidroxibenzoico 137.02332 0.15 8.94 9.88
(−)-Epicatechin 289.07066 4.21 * 10.9
Ácido 2,4 dihidroxi-benzoico 153.01824 0.72 1.46 10.4
Ácido p-cumárico 163.03897 0.8 3.27 14.3
Ácido sinapinico 223.06009 3.05 9.73 14.5
Quercetina 3-β-D-glucoside 463.08710 0.52 * 17.3
Ácido 2-Hidroxibenzoico 137.02332 -1.24 * 18.7
Miricetina 317.02919 1.58 * 18.8
Quercetina 301.03428 2.56 * 21.8
(*) Compostos estavam abaixo do limite de quantificação e identificação por CLAE-DAD, e só

foram identificados pela analise de CL/EMAR.
Além da composição de fenólicos as micropartículas do extrato da torta de castanha-do-

Brasil apresentaram um teor total de tocoferóis de 2,14 mg/100 g. O β-tocoferol foi o tocol
majoritário (1,74 ± 0.05 mg/100 g) nas micropartículas, que apresentaram menores teores de
α-tocoferol (0,17 ± 0.005 mg/100 g), -tocoferol (0,20 ± 0,001 mg/100 g) e -tocoferol (0,032
± 0,003 mg/100 g) (Figura 6).
131
Figura 6: Cromatograma representativo da análise de tocoferóis nas micropartículas do extrato
de torta de castanha-do-Brasil por HPLC-FL (exc. 290, em. 330 nm).
Comparando os resultados de tocoferóis nas micropartículas com os da torta de

castanha-do-Brasil obtidos em nosso estudo anterior (Capiítulo 3), observamos que após o
processo de obtenção do extrato e o processo de spray drying houve um aumento significativo
no teor de β-tocoferol (Figura 6), que possivelmente tenha ocorrido ao longo destas etapas.
Uma das razões para este aumento pode está relacionado com a solubilidade dos tocoferóis,
pois com a prensagem possivelmente uma parte dos tocoferóis mais solúveis na fração
lipídica foram extraídos, pode ser que o β-tocoferol tenha ficado mais retido na torta, e
durante o processo de extração com hexano para realização da analise ele tenha sido mais
solubilizado do que os demais, fazendo com que houvesse seu aumento (Rachid et al., 2012).
Esta mesma hipótese explicaria a maior concentração do β-tocoferol nas micropartículas,
devido este tocol ter uma maior afinidade em se solubilizar na solução de 40% de etanol
usada para obter os extratos que foram encapsulados, como observado na Figura 7.
132
Figura 7: Comparação dos tocoferóis nas micropartículas e na torta de castanha-do-
Brasil por HPLC-FL (exc. 290, em. 330 nm) em base seca.
As micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil apresentaram ainda uma

concentração de selênio de 4,95 μg.g-1 de pó. O processo de encapsulação conservou os teores
de selênio encontrados na torta de castanha do Brasil (4,85 μg.g-1 de torta). A presença de
selênio nas micropartículas demonstra que o processo usado na obtenção dos extratos
favoreceu não só a extração dos compostos fenólicos, mas também outros componentes
bioativos como o selênio e os tocoferóis. A presença deste mineral nas micropartículas reforça
a potencial bioatividade da micropartícula obtida. O selênio é considerado um potente agente
antioxidante o qual estudos epidemiológicos têm confirmado sua ação na prevenção e redução
do risco de câncer de próstata e colón (Clark et al., 1996; Wang et al., 2009).
No entanto, a biodisponibilidade deste mineral é dependente da dieta e algumas vezes
acabam não atingindo os valores necessários no organismo para apresentar efeito
antioxidante. Além disso, a ingestão em altas doses pode causar efeitos tóxicos ao organismo.
Alguns estudos têm reportado a aplicação da tecnologia de encapsulamento tanto através da
produção de micropartículas quanto de nanopartículas de selênio, com o intuído de melhorar
sua biodisponibilidade e facilitar a expressão de selenoproteínas quando os níveis de selênio
da dieta forem baixos. O encapsulamento deste mineral pode possibilitar o aumento da
especificidade e diminuição da toxidade permitindo sua aplicação em dietas e até mesmo
intervenções terapêuticas, pelo seu potencial efeito quimo preventivos (Zhang et al., 2011;
Wang et al., 2012).
133
Nossos resultados demonstraram que a micropartícula do extrato da torta de castanha-
do-Brasil representa um potencial aditivo para a formulação de novos alimentos com
propriedades funcionais, devido a presença dos compostos fenólicos, tocoferóis, selênio e
capacidade antioxidante.
4 CONCLUSÕES
As diferentes proporções de material de parede (inulina e Capsul®) interferiram na

composição de fenólicos totais e capacidade antioxidante das micropartículas do extrato da
torta de castanha-do-Brasil. A partir da análise das características físicas e físico-químicas,
juntamente com a estabilidade das três formulações investigadas, podemos concluir que as
micropartículas formadas com ativo:Capsul®:inulina na proporção 1:1:1 foi a que
apresentaram as melhores características para conservação dos compostos bioativos durante o
armazenamento. As micropartículas do extrato da torta de castanha-do-Brasil, devido a sua
rica composição em ácidos fenólicos, flavonóides, tocoferóis e selênio, se torna um potencial
aditivo com atividade antioxidante para a indústria de alimentos. Além disto, o uso da inulina
como agente encapsulante também acumula suas propriedades prebióticas, conferindo a
alegação funcional às micropartículas. Portanto a microencapsulação dos extratos da torta de
castanha-do-Brasil é uma alternativa para o reaproveitamento deste co-produto, uma vez que
pode preservar as propriedades bioativas dos extratos de castanha-do-Brasil sendo aplicado
como um potencial aditivo para formulação de diferentes alimentos funcionais.
134
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A constante busca pelo reaproveitamento dos co-produtos e resíduos gerados durante

a produção e processamento dos alimentos, juntamente com as mudanças de hábitos
alimentares têm crescido nas últimas décadas. O consumidor passou a exigir mais das
indústrias alimentícias, por produtos que não apenas satisfaçam suas necessidades básicas,
mas que ofereçam melhorias à saúde e proporcione seu bem estar. Além de atuar na
prevenção e diminuição do risco de doenças crônicas como diabetes, doenças
caridiovasculares, câncer e envelhecimento precoce. É neste panorama atual que o
reaproveitamento da torta da castanha-do-Brasil se apresenta como uma alternativa para
agregar valor a esse co-produto da extração do óleo da castnha-do-Brasil.
O Brasil se caracteriza por exportar a castanha e pouco se tem investigado a respeito de
processos aplicáveis para o beneficiamento e agregação de valor a produtos derivados da
castanha-do-Brasil. A investigação desses processos, com base no conhecimento químico
detalhado dos componentes da castanha e especialmente de seus co-produtos, pode contribuir
para a elaboração de produtos e/ou processos que irão agregar valor à castanha-do-Brasil.
Nossos resultados demonstraram que a torta da castanha-do-Brasil, além de ser uma

rica fonte proteíca, especialmente pela sua composição em aminoácidos sulfurados e de fibras
dietéticas, apresentou uma composição rica em compostos bioativos. Elevados teores de
selênio, tocoferóis e uma diversidade de compostos fenólicos, além das proteínas foram
encontrados na torta da castanha-do-Brasil. O processo que usamos para a extração com 40%
etanol possibilitou a obtenção de um extrato também rico nestes compostos bioativos. Pela
primeira vez na literatura foi realizada a caracterização química da torta da castanha-do-Brasil
utilizando métodos de analises com alta resolução. Em nosso estudo determinamos a
composição de fenólicos pela técnica de espectrometria de massas de alta resolução (EMAR),
a qual proporciona além da identificação de compostos fenólicos com o auxilio de padrões
comerciais, a identificação de possíveis fenólicos que estavam presentes no extrato da torta de
castanha-do-Brasil . Esse resultado só foi possível devido o uso dessa técnica que possui uma
alta sensibilidade, precisão e resolução.
Uma vez que obtivemos esse extrato com potencial atividade antioxidante devido a
sua elevada composição de compostos fenólicos, tocoferois e selênio a aplicação da
tecnologia de encapsulamento foi uma alternativa promissora para dar uma melhor aplicação
135
destes componentes na indústria alimentícia, uma vez que a transformação do extrato líquido
em um pó facilita sua dispersão em um maior número de alimentos. O encapsulamento por
spray drying possibilitou a conservação dos compostos bioativos durante o armazenamento, e
o uso de materiais de parede como a inulina favoreceu a obtenção de uma micropartícula com
potencial aplicação no desenvolvimento de alimentos com propriedades funcionais.
Os compostos bioativos encontrados na torta, extrato e micropartículas da castanha-
do-Brasil se relacionam para proporcionar seus efeitos benéficos a saúde. Diversos estudos
tem demonstrado a interação do selênio com os aminoácidos sulfurados, formando as
selenometionina e selenocisteína, que favorecem sua biodisponibilidade no organismo, além
de pontecializar sua atividade antioxidante. Interações também ocorrem entre a vitamina E
com o selênio, e com as proteínas e os compostos fenólicos. Isto demostra a importância da
composição da torta da castanha e das micropartículas produzidas em nosso estudo.
Contudo, mais investigações devem ser realizadas para avaliar a aplicação destas
micropartículas do extrato da torta da castanha-do-Brasil em uma matriz alimentar para
avaliar sua interação e estabilidade após sua dispersão no alimento. Além disto, estudos que
determinem a bioatividade e biodisponibilidade dos compostos bioativos presentes nas
micropartículas são investigações interessantes para confirmar sua ação benéfica à saúde,
especialmente devido sua atividade antioxidante in vivo.
Portanto este estudo possibilitou realizarmos a caracterização química detalhada dos
componentes bioativos da torta e extrato da castanha-do-Brasil, através da aplicação da
técnica de espectrometria de massas de alta resolução. Isto promove uma maior confiabilidade
nos resultados obtidos e a partir do conhecimento detalhado da composição do co-produto
desta oleaoginosa, a aplicação da tecnologia de encapsulamento favorece o desenvolvimento
de novos produtos possibilitando assim agregar valor a castanha-do-Brasil.
136
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151

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Caracterização química dos compostos bioativos e

Suellen Gomes Moreira

Suellen Gomes Moreira

Tese de Doutorado apresentada ao Programa

Orientadores: Alexandre Guedes Torres

Orientadores: Alexandre Guedes Torres, Priscilla Vanessa

Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio

1. Torta da castanha-do-Brasil. 2. Compostos bioativos. 3.

Suellen Gomes Moreira

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos,

À minha co-orientadora Priscilla Finotelli que me apresentou o mundo mágico da

Ao Vinícius por ter colaborado tanto, compartilhando seu conhecimento e me ajudado

As agência financiadoras FAPERJ, CAPES e CNPq.

A todos muito obrigada!

O resíduo sólido da obtenção de óleo da castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) por

Figura 1 Árvore da castanheira-do-Brasil (A), ouriço (fruto) (B) e as sementes 28

Figura 7 Modelos das principais formas de encapsulação: microcápsula (A) e 46

Figure 1 Response surface plots of total phenolic compounds in Brazil nut 63

Tabela 1 Conteúdo de vitamina E de algumas oleaginosas (USDA, 2004). 34

Table 1 Full factorial design with center points to optimize extraction of 57

Table 3 Experimental design for optimized extraction of total phenolic 61

Table 4 Experimental design for optimized antioxidant capacity of 64

Table 5 Factors’ effects on antioxidant capacity (TEAC and FRAP assays) in 66

Tabela 1 Combinação de diferentes proporções do material encapsulante 112

Tabela 2 Recuperação do processo de atomização e retenção dos fenólicos 120

Tabela 3 Propriedades físicas e físico-químicas das micropartículas do extrato 122

Tabela 4 Influência da proporção de material de parede na estabilidade das 126

Tabela 5 Identificação dos compostos fenólicos na micropartícula de extrato 131

CAPITULO 1 REVISÃO DE LITERATURA 27

CAPITULO 2 Optimized extraction of polyphenolic antioxidant compounds 52

CAPITULO 3 Brazil nut cake is a rich source of phenolic compounds, 71

2.3.4 Antioxidant Capacity 78

3.3 Detailed characterization of the phenolic compounds in Brazil nut 88

3.3.1 Identification of phenolic compounds in Brazil nut cake extract by 88

3.3.2 Tentative identification of phenolic compounds in Brazil nut cake 92

3.4 Tocopherol from Brazil nut cake by HPLC 97

CAPÍTULO 4 Microencapsulação do extrato da torta da Castanha-do-Brasil 107

2.4.1.1 Análise dos compostos fenólicos 113

2.5.2 Tocoferóis por CLAE-Fluorescência nas micropartículas 116

3.1.1 Compostos fenólicos total e capacidade antioxidante das 119

3.1.2 Caracterização física e físico-química das micropartículas 121

3.2 Caracterização dos componentes bioativos nas micropartículas do 130

CONSIDERAÇÕES FINAIS 135

O consumo de nozes e castanhas aumentou na última década, especialmente por sua

O desenvolvimento da tese foi dividido em um capitulo de revisão da literatura e três

Obter um extrato de grau alimentício rico em compostos bioativos, a partir da torta da

2.2 Objetivos Específicos

a) Determinar as melhores condições de extração de compostos fenólicos da torta

b) Caracterizar os compostos bioativos presentes no extrato da torta da castanha-

c) Determinar os teores e perfil de tocoferóis por HPLC, minerais por ICP-OES e

d) Encapsular por spray-drying o extrato da torta de castanha-do-Brasil utilizando

e) Investigar a influência da proporção da mistura de material de parede (Capsul ®

f) Caracterizar as micropartículas obtidas a partir da melhor formulação

A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.) pertence à família lecythidaceae, é

Fonte: © Zig Koch/WWF-Brasil Fonte: Coleção Viva Saúde – Hipertensão

É distribuída em toda a Floresta Amazônica incluindo os estados de Rondônia, Acre,

1.1 Composição nutricional e funcional da castanha-do-Brasil e seus co-produtos

A amêndoa da castanha-do-Brasil apresenta elevado valor nutritivo com uma rica

A vitamina E é representada por um grupo de oito compostos com semelhanças

Figura 2: Estrutura química dos tocoferóis e tocotrienóis.

Os tocoferóis são encontrados em vegetais, principalmente em sementes oleaginosas

Tabela 1: Conteúdo de vitamina E de algumas oleaginosas (USDA, 2004).