ATIVIDADE BACTERICIDA DA Copaifera sp. FRENTE a Staphylococcus spp.

ISOLADOS DE MASTITE BOVINA

Francklin Gimenes Rodrigues1; Noemila Débora Kozerski2; Zilda Cristiani Gazim3;

daniela Dib Gonçalves4; Lisiane de Almeida Martins4

1
Mestrando em Ciência Animal – UNIPAR – Umuarama – PR
2
Médica Veterinária – UNIPAR – Umuarama – PR
3
Docente da Pós graduação (Mestrado em Biotecnologia Aplicada a Agricultura) –
UNIPAR – Umuarama – PR
4
Docente do Curso de Medicina Veterinária e Pós Graduação (Mestrado em Ciência
Animal) – UNIPAR – Umuarama – PR.

Recebido em: 30/09/2013 – Aprovado em: 08/11/2013 – Publicado em: 01/12/2013

RESUMO

Para aperfeiçoar o estado sanitário da glândula mamária bovina, é essencial o

controle das mastites clínicas e subclínicas. A utilização de antimicrobianos é uma
das medidas realizadas para o tratamento da patogenia, mas estudos evidenciam
alta porcentagem de cepas resistentes, com seleção de micro-organismos, devido
ao uso inadequado e não monitoramento de antibióticos, tornando-se assim um risco
à saúde pública. O óleo-resina de copaíba é um produto natural e sua atividade
antimicrobiana tem sido relatada por vários pesquisadores. Considerando o
tratamento de mastites como segmento de um controle sanitário, objetivou-se avaliar
o potencial de atividade antimicrobiana in vitro dos extratos do óleo de copaíba,
frente ao gênero Staphylococcus spp. isoladas de mastite bovina, Foi utilizado óleo

Araujo Correa - Email: fabicorrea81@gmail.com

extraído da Copaíba em concentrações de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% e
1,56%, testados frente a três diferentes grupos de Staphylococcus que foram,
Staphylococcus coagulase negativa (STAPHCN), Staphylococcus aureus (STAPHA)
e Staphylococcus coagulase positiva (STACP), no qual pode-se observar resultados
satisfatórios em relação ao seu poder de inibição frente os micro-organismos
testados, destacando em especial os resultados obtidos com STACP onde
aproximadamente 50% das amostras demonstraram sensibilidade ao efeito inibidor
de crescimento do óleo de Copaíba em concentrações superiores a 25%,
ressaltando assim uma possível ação bactericida do óleo de Copaíba. O estudo
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ainda revelou que o óleo de Copaíba tem potencial para ser avaliado como uma
alternativa ou até complemento aos antibióticos para o tratamento da mastite nos
bovinos.

PALAVRAS-CHAVE: Atividade bactericida; Copaifera sp; Óleo-resina; pecuária

leiteira; Staphylococcus spp.
Fabiane
Licensed to Sueli Alves
Faria

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 293 2013
BACTERIAL ACTIVITY OF Copaifera sp. FROM Staphylococcus spp. ISOLATED
FROM BOVINE MASTITIS

ABSTRACT

To improve the health status of the mammary gland, is essential to the control of
clinical or subclinical mastitis. The use of antibiotics is one of the measures taken to
treat pathogenesis, but studies show a high percentage of resistant strains, with
selection of micro-organisms due to inappropriate use of antibiotics and not
monitoring, thus becoming a risk to public health . The oil-copal resin is a natural
product and antimicrobial activity has been reported by several researchers.
Considering the treatment of mastitis as segment of a sanitary control aimed to
evaluate the potential of in vitro antimicrobial activity of extracts of copaiba oil against
Staphylococcus spp isolated from bovine mastitis using it for oil extracted from
Copaíba in concentrations of 50% , 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125% and 1.56%, tested
against three different sets of Staphylococcus which were coagulase-negative
Staphylococcus (STAPHCN), Staphylococcus aureus (STAPHA) and coagulase-
positive staphylococci (STACP), which can be observed satisfactory results in
respect to its front inhibition of the microorganisms tested, highlighting in particular
the results obtained with STACP where approximately 50% of the strains were
susceptible to the growth inhibitory effect at concentrations copaiba oil greater than
25%, so emphasizing a possible bactericidal action of copaiba oil. The study also
revealed that copaiba oil has the potential to be evaluated as an alternative or
supplement to antibiotics for the treatment of mastitis in cattle.

KEYWORDS: Bactericidal activity, Copaifera sp., Dairy, Food, Oleoresin Poisoning,

Staphylococcus spp..

INTRODUÇÃO
Assim como demais segmentos da atual sociedade, a produção de leite tem
se mostrado cada vez mais competitiva. Portanto, é de suma importância qualificar e
quantificar os fatores que possam influenciá-la, visando ganhos efetivos na

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qualidade e quantidade do leite produzido, na tentativa de suprir a demanda nacional
(COLDEBELLA et al., 2004; PICOLI et al., 2013).
Entre os problemas sanitários mais frequentes observados na pecuária
leiteira, a mastite é uma enfermidade que se destaca, acarretando prejuízos
econômicos, e por determinar alterações sobre a composição e as características
físico-químicas do leite, acompanhadas por um aumento na contagem de células
somáticas (MULLER, 2002).
Bactérias do gênero Staphylococcus spp. estão entre os principais agentes
etiológicos da mastite bovina e são frequentemente resistentes aos antimicrobianos,
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em especial aos beta-lactâmicos, limitando assim, a escolha do antibiótico para o

tratamento das infecções causadas por este agente (DALL AGNOL et al., 2013)
Sendo assim, é de fundamental importância manter testes como análises
microbiológicas e perfil de resistência a antimicrobianos, para evitar resistência de
cepas, reforçando a importância do uso adequado e monitorado de antibióticos, já
que estes micro-organismos podem ser disseminados pelo leite e se transformarem
Alves

em sério problema de saúde pública (AGOSTINIS et al., 2012).

Faria

O óleo de copaíba é extraído de várias espécies do gênero Copaifera

Fabiane
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(Leguminosae-Caesalpinoideae), através de perfurações realizadas em seus
troncos. Além das inúmeras aplicações do óleo em cosméticos e outras indústrias,
ainda há uma série de indicações para seu uso terapêutico.Existem hoje descritas
algumas dezenas de propriedades medicinais diferentes, que vem sendo em alguns
casos comprovadas cientificamente, como atividade antimicrobiana, antiinflamatória,
anti-neoplásica, entre outras. Estudos recentes têm demonstrado também grande
potencial de uso do óleo de copaíba na odontologia, na composição de cimentos
endodônticos e na prevenção e combate da doença periodontal (PIERRE et al.,
2009).
Segundo ALENCAR (1982), o óleo é o produto da desintoxicação do
organismo vegetal, e que funciona como defesa da planta contra animais, fungos e
bactérias.
A utilização do óleo de copaíba originou-se da utilização empírica, pela
observação do comportamento de certos animais que, quando feridos, esfregavam-
se nos troncos das copaifeiras (MACIEL et al., 2002) e atualmente possui
comprovada ação anti-inflamatória, antibacteriana, antifúngica e antiedêmica
realizada em diversos estudos (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2002; OLIVEIRA et al.,
2006; RAMOS, 2006).
Quanto às características físico-químicas do óleo-resina da Copaifera
multijuga Hayne, podemos afirmar que trata-se de um líquido transparente, viscoso e
fluido, com cheiro forte e odor de cumarina, sabor acre e amargo. Pode ser
armazenado por até dois anos sem alterar as suas propriedades, podendo
transformar-se em resina, se exposto ao ar e à luz (MENDONÇA & ONOFRE, 2009).
Este período longo de armazenamento torna-se favorável, em se tratando da
utilização nas mastites, visto que há necessidade de estocagem nas propriedades
leiteiras.
Considerando todas estas atividades e benefícios já relatados por diferentes
pesquisadores quanto à utilização do óleo de Copaíba, este trabalho teve o objetivo
de analisar a atividade bactericida do óleo de Copaíba e verificar o mecanismo de
inibição do crescimento em Staphylococcus coagulase negativa, Staphylococcus
coagulase positiva e Staphylococcus aureus para estabelecer tratamentos
alternativos para a mastite bovina.

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MATERIAL E MÉTODOS

Material botânico

O óleo da Copaífera originário da região centro-oeste foi doado pelo

Laboratório de Farmacotécnica da Universidade Paranaense, Umuarama – PR, o
qual foi extraído diretamente de troncos das árvores através de pequenas
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perfurações. A incisão no tronco das árvores fornece o óleo de copaíba, na forma de

um óleo-resina de coloração amarela a marrom, que é utilizado industrialmente em
vernizes e lacas, na restauração de pinturas antigas, como fixador de odor em
fragrâncias e como aromatizante em alimentos (TAPPIN et al., 2004).

Micro-organismos
Alves
Faria

Após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo

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Experimentação Animal (CEPEEA/UNIPAR), com o número de registro 22559/2011,
foram utilizados Staphylococcus spp. isolados de animais com mastite clínica ou
subclínica, animais esses pertencentes a várias propriedades da região noroeste do
Paraná. Todas as amostras foram repicadas e padronizadas de acordo com o tubo
0,5 da escala McFarland correspondendo à concentração de aproximadamente 108
Unidades Formadoras de Colônias - (UFC/mL), compreendendo um total de 122
amostras analisadas, sendo 27 de Staphylococcus aureus, 23 de Staphylococcus
coagulase positiva e 72 de Staphyloccus coagulase negativa.

Preparação das soluções do óleo resina

Em um Becker 50 mL, adicionou-se 0,4g de Tween 80, em seguida, com

auxílio de um bastão de vidro foi acrescentado o óleo de copaíba de acordo com as
diluições, 50,0%, 25,0%, 12,5%, 6,3%, 3,1% e 1,6%, e adicionado água osmose
reversa estéril para atingir o volume final de 25 mL.

Atividade bactericida

Em cada microplaca, compostas por 96 poços de fundo chato, foram testados

quatro micro-organismos em triplicata e sendo ainda, em duplicata, testados os
controles negativos (as diferentes concentrações do óleo, o meio BHI, o Tween 80) e
os controles positivos (cada uma das amostras de micro-organismos testadas)
(GAZIM et al., 2010).
Em cada orifício foram dispostos 100µL do meio BHI, 100µL das diluições do
óleo de copaíba e 5µL da solução bacteriana, sempre em triplicata. As placas foram
homogeneizadas e incubadas a 37°C durante 24 horas (GAZIM et al., 2010).
A leitura foi procedida após a adição de 5µL de cloreto de trifeniltetrazólio,
diluído a 10% em água osmose reversa e incubado durante 10 minutos. Considerou-
se crescimento de bactérias na concentração inibitória mínima, os poços que
apresentavam qualquer intensidade da tonalidade rósea, após a incubação.

Análise Estatística

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Os resultados deste trabalho foram tabulados e submetidos à análise
estatística, onde as frequências de crescimento ou não dos diferentes micro-
organismos submetidos a diferentes concentrações do óleo foram comparadas,
entre os micro-organismos para uma mesma diluição e entre as diluições para um
mesmo micro-organismo, pelo teste de Qui-quadrado ou G de Williams, utilizando-se
o programa Biostat 5.0.
Diferenças significativas foram avaliadas entre as proporções pelo cálculo do
intervalo de confiança a 95% para a diferença entre proporções (diluições). Foram
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considerados significantes valores de P<0,05 e intervalos de confiança que não

incluíam o valor zero (AYRES et al., 2007).

RESULTADOS
Alves

Ao testar 122 isolados de Staphylococcus spp. de mastite subclínica, foi

Faria

possível verificar que houve atividade bactericida nas diferentes diluições frente
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aos três grupos de Staphylococcus testados, os quais consistiram em
Staphylococcus coagulase negativa (STAPHCN) (43,1% a 4,2%), Staphylococcus
aureus (STAPHA) (40,7% a 3,7%) e Staphylococcus coagulase positiva (STACP)
(47,8%), em diferentes diluições, como demonstra a Tabela 01.

Tabela 01. Frequência absoluta (N) e relativa (%) de amostras sem crescimento
(SC) segundo o micro-organismo e a diluição de óleo de copaíba
testados, Umuarama, PR, 2012.
STAPHCN (n=72) STAPHA (n=27) STACP (n=23)
Diluição
SC SC SC
(%)
N % N % N %
47,8A
50,0
31 43,1Aa 11 40,7Aa 11 a

47,8A
25,0
31 43,1Aa 11 40,7Aa 11 a

12,5 13 18,1Ba 4 14,8Ba 0 0,0Bb

Ba Ba
6,25 5 6,9 1 3,7 0 0,0Ba
3,12 4 5,6Ba 1 3,7Ba 0 0,0Ba
1,56 3 4,2Ba 1 3,7Ba 0 0,0Ba
*Lê-se: STAPHCN= Staphylococcus coagulase negativa; STAPHA= Staphylococcus aureus; STACP=
Staphylococcus coagulase positiva. Estatística: Para um mesmo micro-organismo e condição de
crescimento frequências relativas seguidas de letras maiúsculas diferentes indicam diferenças pelo
teste de diferença entre duas proporções (teste de Qui-quadrado ou G de Williams). Para uma
mesma diluição e condição de crescimento, frequências relativas seguidas de letras minúsculas
diferentes indicam diferenças pelo teste de diferença entre duas proporções.

O óleo de Copaíba nas concentrações de 25% e 50% inibiu o crescimento de

43,1% dos STAPHCN; 40,7% dos STAPHA e 47,8% dos STACP, porém não foram
detectadas variações na porcentagem de amostras inibidas quando comparadas nas
concentrações do óleo de 25% e 50%, obtendo sempre os mesmos resultados. Nas
demais diluições não foram detectadas inibições do crescimento bacteriano ou esta
foi muito reduzida.

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DISCUSSÃO

As propriedades terapêuticas dos princípios e medicamentos fitoterápicos

começam a ganhar cada vez mais espaço no tratamento veterinário, profissionais
adeptos da fitoterapia revelam alta frequência de sucessos em tratamento de
parasitoses e enfermidades infecciosas, inclusive em tratamentos de mastites
(AGOSTINIS et al., 2012), o que pôde ser confirmado no presente trabalho, onde
todos os grupos de Staphyloccocus testados apresentaram em maior ou menor grau
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resultados satisfatórios referentes ao poder de inibição das diferentes concentrações

do óleo de Copaíba, porém podemos destacar o poder inibitório do óleo quando
testado com STACP, onde na concentração de 25% mostrou-se satisfatório poder
inibitório, onde 47,8% das amostras testadas não apresentaram crescimento.
Por outro lado, STAPHCN e STAPHA apresentaram efeitos de inibição frente
ao óleo em suas concentrações mais baixas, de 1,56% e 3,12% onde uma pequena
Alves

parte das amostras testadas não apresentou crescimento. Resultados semelhantes

Faria

não foram encontrados nas amostras de STACP, onde só foi possível encontrar
Fabiane
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efeitos inibitórios a partir da concentração de 12,5% do óleo de copaíba.
Podemos destacar ainda que, em todas as subespécies de Staphylococcus
testadas não houve variação de crescimento, quando comparadas às concentrações
do óleo de 25% e 50%, obtendo resultado igual em ambas às concentrações de
acordo com cada grupo de bactéria.
Ao comparar os resultados encontrados no presente experimento com os
relatos da literatura sobre a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Copaíba,
pude-se encontrar resultados semelhantes, como os de PACHECO et al. (2006) que
relatam que o óleo resina de Copaifera spp. resulta em diferentes níveis de inibição
contra as bactérias Gram-positivas, mostrando atividade significativa contra Bacillus
subtilis e S. aureus, quando comparado com cloranfenicol usado como controle.
Vários trabalhos da literatura, também relatam resultados confirmando o
efeito bactericida do óleo essencial de Copaíba, quando testado com outros micro-
organismos (BASKARAN et al., 2009; LIMA, 2012; MENDONÇA & ONOFRE, 2009).
De acordo com PIERRI et al. (2012), o óleo de copaíba apresentou ação
antimicrobiana contra a estirpe bacteriana de Streptococcus mutans na
concentração de 10% e foram encontrados resultados favoráveis em concentrações
ainda mais baixas do óleo de Copaíba, quando comparado com o presente trabalho,
mas que são facilmente justificadas pelo fato de se tratarem de micro-oganismos
diferentes, porém deve ser salientado que ambos os micro-organismos
pertencentem ao grupo das bactérias Gram positivas.
Em estudo in vitro, realizado com objetivo de investigar o efeito
antimicrobiano de derivados de plantas, como moléculas de cinamaldeído, eugenol,
carvacrol, timol, contra S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. aureus e E. coli,
ou seja, principais patógenos da mastite, obtiveram-se concentrações baixas e
eficazes contra estes patógenos, com Concentração inibitória Mínima (MIC) de
0,05%, 0,4%, 0,45%, 0,45%e 0,1%, respectivamente (BASKARAN et al., 2009). Já
no presente estudo, observa-se uma inibição do crescimento, porém em
concentrações bem mais elevadas, acima de 12,5%. Esta variação deve-se
provavelmente ao fato do presente trabalho testar a atividade bactericida total dos
princípios ativos do óleo da copaíba.
Apesar de existir um grande número de trabalhos relatando na literatura a

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composição química do óleo essencial de Copaíba, ainda não se sabe ao certo qual
ou quais substâncias são responsáveis pelo efeito bactericida, provavelmente devido
a uma combinação de sesquiterpenos e diterpernos ácidos, o que se sabe é que
esses compostos quando isolados, não são capazes de apresentarem efeitos de
tamanha escala, quando comparados com o extrato bruto.
Ao se comparar o efeito bactericida do óleo de Copaíba, com outros óleos
essenciais, como o caso do óleo de Piper Amalogo, resultados semelhantes também
foram encontrados. Através da técnica de microdiluição em caldo (MIC), ficou
evidente o poder inibitório do óleo essencial de Piper amalago nas concentrações de
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5%(10µg/mL) e 10%(20µg/mL), destacando que que o óleo na menor concentração

(10µg/mL) apresentou maior efetividade frente às bactérias Gram-positivas, cerca de
50% (LIMA, 2012). Estes resultados mostram-se muito semelhantes ao encontrado
no presente trabalho quando testado o grupo STACP, obtendo 47,8% das amostras
testadas inibidas de seu crescimento quando em contato com óleo de Copaíba,
porém em concentrações maiores de 25% e 50%.
Alves

Atualmente, o grande problema relacionado à mastite bovina, não está só no

Faria

prejuízo econômico do pecuarista pela dificuldade na cura dos animais, está em

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casos extremos, ao fato da mastite bovina ser fatal acarretando assim grandes
perdas no setor. A mastite bovina também é um problema de saúde pública, visto
que o principal micro-organismo causador da patologia são os do grupo de
Staphylococcus spp. que tem a capacidade de produzir toxinas extracelulares, ainda
no processo de mastite pré-clínica. Estas toxinas ao serem consumidas pelo ser
humano através do leite contaminado podem causar severa intoxicação alimentar,
acarretando quadro de náuseas, vômitos, diarréia, dores abdominais, entre outros
(AGOSTINIS et al., 2012; MARQUES et al., 2013).
As infecções intramamárias causadas por Staphylococcus aureus apresentam
implicações importantes em Saúde Pública, tendo em vista que as toxinas podem
ser excretadas no leite e permanecer estáveis nos produtos oferecidos ao consumo.
A simples presença de cepas toxigênicas de Staphylococcus aureus no leite não
implica, necessariamente, a ocorrência de intoxicações em seres humanos, porém o
risco existe e é maior para crianças, principalmente de tenra idade (FAGUNDES &
LIVEIRA, 2004).
A dificuldade no controle e tratamento da mastite, aliada à existência de
estudos prévios que relatam a presença de substâncias em plantas nativas com
atividade antimicrobiana, torna promissora a pesquisa com extratos e compostos de
origem vegetal (RIOS & RECCIO, 2005), considerando que estes princípios
controlam a multiplicação de micro-organismos ou permite até sua eliminação total
do leite, sem a necessidade de desprezar o leite durante o tratamento, que tem um
aspecto vinculado à saúde pública muito relevante.
Ainda são necessários mais estudos para entender as causas da variação nos
resultados entre os diferentes grupos de Staphylococcus, e determinar a sua relativa
importância para estudos futuros, principalmente no que se refere à atividade
bactericida de cada um dos componentes do óleo.

CONCLUSÃO

Verificou-se que o óleo de Copaíba apresentou efeito inibidor de crescimento

quando testado in vitro, frente os três grupos de staphylococcus testados, ou seja,
Staphylococcus coagulase negativa, Staphylococcus aureus e Staphylococcus

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coagulase positiva, onde aproximadamente 45% das amostras foram inibidas de seu
crescimento natural em concentrações de 25% e 50% do óleo de Copaíba,
demonstrando que o mesmo apresenta potencial para o tratamento alternativo ou
até como droga quando associado aos antibióticos de uso comum no tratamento de
mastite bovina.

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Fabiane
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