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Avaliação do potencial antibacteriano, antifúngico e antioxidante do óleo essencial de Amyris balsamifera

contra isolados clínicos multirresistentes

Artigo no Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research · Outubro de 2013

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2 autores, incluindo:

Praveen Dahiya

Universidade Amity

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Vol 6, Supl 5, 2013 ISSN - 0974-2441

Artigo de Pesquisa

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIBACTERIANO, ANTIFÚNGICO E ANTIOXIDANTE DO ÓLEO ESSENCIAL DE

AMYRIS BALSAMIFERA CONTRA ISOLADOS CLÍNICOS RESISTENTES A MULTI MEDICAMENTOS

PRAVEEN DAHIYA1*, AKSHI MANGLIK1

Amity Institute of Biotechnology, Amity University- Noida, Uttar Pradesh, Índia E-mail: pdahiya@amity.edu/
praveen_sang@yahoo.com

Recebido: 30 de julho de 2013, revisado e aceito: 24 de agosto de 2013

ABSTRATO

Objetivo: Investigar os constituintes fitoquímicos, bioautografia por TLC e antioxidantes do óleo essencial de Amyris balsamifera . O potencial antimicrobiano também foi determinado contra vários
isolados clínicos multirresistentes.
Métodos: Foi realizada análise fitoquímica preliminar. O potencial antimicrobiano do óleo essencial de Amyris foi avaliado pelo método de difusão em ágar contra isolados clínicos multirresistentes.
O efeito antibacteriano foi investigado usando o método TLC-bioautográfico. Os antioxidantes analisados incluem catalase, peroxidase, superóxido dismutase, glutationa-S-transferase e glutationa
redutase.
Resultados: A análise dos fitoconstituintes demonstrou a presença de poucos fitoquímicos presentes, incluindo saponinas, terpenóides e flobataninas.
O óleo essencial de Amyris balsamifera foi investigado por sua atividade antimicrobiana contra doze bactérias patogênicas multirresistentes e três fungos, respectivamente. O óleo mostrou ampla
atividade antimicrobiana contra bactérias MDR Gram-positivas e bactérias Gram-negativas e isolados de fungos, como Staphylococcus aureus, Salmonella paratyphi, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Candida albicans. A maior atividade inibitória in vitro foi observada para Klebsiella pneumoniae com largos diâmetros de zona de inibição (20±0,11 mm), seguida por Staphylococcus
aureus (18±0,15) mm. Entre os isolados fúngicos, o crescimento de apenas Candida albicans foi inibido. O ensaio de bioautografia por cromatografia em camada fina demonstrou uma grande
zona de inibição de crescimento observada em valores de Rf de 0,63 contra Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus 1. O óleo essencial de Amyris balsamifera foi encontrado rico em
antioxidantes como superóxido dismutase, glutationa-S-transferase e glutationa redutase.

Conclusões: Pode-se concluir que o óleo essencial de Amyris com boa atividade antimicrobiana contra vários isolados clínicos multirresistentes e possuindo atividade antioxidante, pode ser usado
no tratamento de várias infecções microbianas.

Palavras-chave: Atividade antibacteriana; Atividade antifúngica; Potencial antioxidante; Amyris balsamifera; bioautografia TLC

INTRODUÇÃO

A disseminação de cepas de bactérias resistentes a antibióticos é uma das ameaças mais
sérias ao sucesso do tratamento de doenças microbianas, pois pode tornar os agentes
antimicrobianos atuais insuficientes para controlar as doenças. O surgimento contínuo de
organismos multirresistentes representa uma séria ameaça ao tratamento de doenças
infecciosas. Ao longo dos tempos, os óleos essenciais e outros extratos de plantas têm
despertado interesse como fontes de produtos naturais. Eles foram avaliados quanto ao
seu uso potencial como remédios alternativos para o tratamento de muitas doenças
infecciosas [1]. A Organização Mundial da Saúde (OMS) observou que a maioria da
população mundial depende da medicina tradicional para cuidados primários de saúde.
Várias doenças infecciosas são conhecidas por serem tratadas com remédios fitoterápicos
para a melhoria da humanidade em todo o mundo. Assim, os cientistas estão cada vez
mais voltando sua atenção para produtos naturais, seja como compostos puros ou como
extratos de plantas padronizados, procurando novas pistas para desenvolver melhores
drogas contra infecções microbianas [2].
amadeirado com um toque balsâmico. É muito mais barato que o óleo de sândalo e é
usado como fixador em perfumes. O óleo de Amyris é rico em álcoois sesquiterpênicos,
seis sesquiterpenos foram isolados e identificados 10-epi-ÿ-eudesmol, ÿ-agarofuran, 4-
hidroxidihidroagarofuran,
para ser
valerianol, ÿ-eudesmol e elemol [4].
O óleo de sândalo tem sido usado para tratar erupções cutâneas e doenças inflamatórias
na Índia há séculos. O óleo de Amyris tem sido historicamente associado a antissépticos,
limpadores de feridas, recuperação de parto, diarreia e gripe. Também é usado na medicina
chinesa para o alívio da dor de estômago, vômitos e gonorréia. Na Europa também foi
usado para o tratamento de dores, febres e 'fortalecimento do coração' [5].
O presente estudo teve como objetivo avaliar a triagem fitoquímica, a atividade
antimicrobiana in vitro e o potencial antioxidante do óleo essencial de Amyris balsamifera
contra isolados clínicos multirresistentes.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os óleos essenciais (também chamados de óleos voláteis) são os líquidos hidrofóbicos
concentrados que contêm compostos aromáticos voláteis das plantas. Eles são
naturalmente sintetizados pelas plantas por diferentes razões de acordo com suas
necessidades. Eles são chamados de "essenciais" - porque carregam a própria essência
e, sem dúvida, a parte mais importante da planta. Eles podem ser obtidos por expressão,
fermentação ou extração, mas o método de destilação a vapor é mais comumente usado
para produção comercial. Os óleos essenciais são uma rica fonte de compostos
biologicamente ativos [3]. Suas características antimicrobianas potenciais são devidas a
compostos sintetizados no metabolismo secundário das plantas.
Aquisição do óleo essencial de Amyris balsamifera
Marcas comerciais de óleo Amyris balsamifera (Amyris) foram compradas em Delhi, Índia.
Segundo informações do fabricante, foi preparado por destilação a vapor. O óleo foi ainda
destilado por evaporador rotativo. O óleo essencial foi dissolvido em metanol (0,3 ml de
óleo/ 2 ml de metanol). O óleo foi transferido para frascos estéreis e armazenados a 4oC
até análise posterior.
Culturas microbianas e condições de crescimento

As culturas microbianas incluíram isolados multirresistentes de Enterobacter sp, Salmonella

paratyphi, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella
Amyris balsamifera conhecida como maçarico pertence à família Rutaceae. A. balsamifera
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp. As culturas de bactérias foram
é uma pequena árvore perene que cresce na área do Caribe e ao longo do Golfo do
mantidas em suas inclinações de ágar apropriadas a 4°C durante todo o estudo e
México. Também é encontrado na Ásia tropical, especialmente na Índia, Sri Lanka,
subcultivadas em caldo nutriente por 24 h antes do teste. Três isolados fúngicos estudados
Malásia, Indonésia e Taiwan. O óleo de Amyris ou óleo de sândalo das Índias Ocidentais
incluem Candida albicans, Aspergillus niger e Rhizopus nigricans. As culturas foram
é obtido por destilação a vapor da madeira desta árvore que é agradavelmente
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mantidos em agar batata dextrose a 4°C. Esses isolados microbianos serviram como Tabela 1: Análise fitoquímica do óleo de Amyris balsamifera
patógenos de teste para o ensaio de atividade antimicrobiana.
Phytoconstituens Amyris oil
Análise fitoquímica taninos -

saponinas +
O óleo dissolvido em metanol (0,3 ml de óleo/ 2 ml de metanol) foi submetido à triagem -
Reduzindo açúcares
fitoquímica quanto à presença de saponinas, taninos, esteróides, flobataninas, Esteróides -
antraquinonas, glicosídeos cardíacos, alcaloides, açúcares redutores e flavonoides -
glicosídeos
usando reações úmidas [6-7 ]. +
Terpenoides
Flobatanina +
Flavonóides -
Ensaio de atividade antimicrobiana
-
Antraquinonas
O método de difusão em poço de ágar foi empregado com pequenas modificações para
determinar as atividades antibacterianas do óleo Amyris em metanol [8]. Cerca de 25 ml a) +: Positivo, b) ÿ: Negativo
de agar nutriente e agar batata dextrose foram vertidos em cada placa de Petri. Uma vez
que o ágar solidificou, o Tabela 2: Atividade antibacteriana e antifúngica do óleo essencial de
8 Amyris determinada por ensaio de difusão em poço de ágar
as culturas foram inoculadas na superfície das placas (1 × 10 ufc/ml). Posteriormente,
a superfície do ágar foi perfurada com poços de 6 mm de diâmetro. Cada poço foi Microrganismo de teste Zona de Inibição (em mm)
preenchido com 50 ÿl de óleo em metanol. A concentração dos extratos empregados foi Isolados bacterianos
de 20 mg/ml. Poços de controle contendo o mesmo volume de metanol foram feitos. Acinetobacter sp. 13±0,22
Após 24 h de incubação nas respectivas temperaturas, as placas foram observadas Escherichia coli 1 9±0,10
quanto a zonas de inibição de crescimento, e o diâmetro dessas zonas foi medido em Escherichia coli 2 9,6±0,12
milímetros. Todos os testes foram realizados em triplicata e a atividade antimicrobiana foi -
Enterobacter aerogenes
expressa como média de inibição. 20±0,11
Klebsiella pneumonia
-
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi 11±0,09
Staphylococcus aureus 1 18±0,15
Ensaio de bioautografia TLC
Staphylococcus aureus 2 9,2±0,085
O óleo essencial de Amyris exibindo potencial antimicrobiano significativo contra Klebsiella -
Pseudomonas aeruginosa
pneumoniae e Staphylococcus aureus 1, conforme determinado pelo método de difusão Isolados fúngicos
em poço de ágar (Tabela 2), foi analisado usando o ensaio de bioautografia TLC. Cerca Candida albicans 10,8±0,12
de 10 ÿl de óleo em metanol foram aplicados em placas de gel de sílica revestidas com -
Aspergillus niger
vidro. As placas foram desenvolvidas com tolueno e acetato de etila (93:7 v/v). As placas -
Rhizopus nigricans
de TLC foram executadas em duplicata. Uma das tiras foi visualizada sob luz ultravioleta
para ver se os pontos separados eram UV ativos, após o que foi pulverizada com A zona de inibição é expressa como média ± desvio padrão, -: sem inibição
reagente de ácido sulfúrico vanilina a 2%, a segunda tira foi usada para ensaio de
bioautografia. Rf individual para cada ponto foi medido. A bioautografia TLC foi realizada
usando as cepas selecionadas de bactérias. O óleo essencial de Amyris balsamifera foi investigado por sua atividade antimicrobiana
contra doze bactérias patogênicas multirresistentes e três fungos, respectivamente
As placas de TLC reveladas foram finamente cobertas com ágar nutriente fundido (Tabela 2). O óleo mostrou ampla atividade antimicrobiana contra bactérias MDR Gram-
inoculado com uma cultura de bactérias durante a noite. As placas foram incubadas em positivas e bactérias Gram-negativas e isolados de fungos, como Staphylococcus aureus,
câmara escura e úmida durante a noite a 37°C. Salmonella paratyphi, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Candida albicans. A
Posteriormente, o bioautograma foi pulverizado com uma solução aquosa de 2,3,5 maior atividade inibitória in vitro foi observada para Klebsiella pneumoniae com amplo
cloreto de trifenil tetrazólio e posteriormente incubado a 37°C por 4 h. A inibição do diâmetro de zona de inibição (20±0,11 mm), seguida por S. aureus 1 (18±0,15) mm e
crescimento microbiano apareceu como zonas claras contra um fundo rosa. Os valores Acinetobacter sp (13±0,22). O óleo apresentou baixa atividade antifúngica e inibiu apenas
de Rf dos pontos que mostram inibição foram determinados. o crescimento de Candida albicans. Nenhuma atividade inibitória foi observada contra os
isolados fúngicos Aspergillus niger e Rhizopus nigricans.

Atividade antioxidante do óleo essencial

O óleo Amyris foi avaliado quanto à presença de vários antioxidantes, incluindo

superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa s-transferase (GST), glutationa
O ensaio bioautográfico TLC é geralmente usado para rastrear a atividade antimicrobiana,
reduzida (GSH) e peroxidação lipídica. A atividade da superóxido dismutase foi medida
separando os componentes na superfície das placas cromatográficas e cobrindo a placa
pela redução do NBT [9]. A atividade da catalase foi estimada medindo a taxa de
TLC com ágar bacteriano fundido. A análise TLC revelou a presença de saponinas no
decomposição do peróxido de hidrogênio a 240 nm [10]. O ensaio de glutationa-s-
óleo essencial testado (dados não mostrados). A bioautografia por TLC foi realizada para
transferase foi feito de acordo com Habig et al. [11].
o óleo essencial de Amyris contra isolados de Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus
aureus 1. Uma grande zona inibitória com valor de Rf 0,63 foi observada contra o
A peroxidação lipídica foi medida usando o método TBA conforme Ohkawa et al. [12]. A
crescimento dos isolados Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus 1 nas placas
atividade da glutationa (GSH) foi avaliada com base na reação com DTNB [13]. Os dados
foram expressos como média±desvio padrão (DP). de TLC B e C como mancha branca sobre fundo rosa quando pulverizada com solução
aquosa de cloreto de 2, 3, 5 trifenil tetrazólio (Figura 1).

RESULTADOS

A análise fitoquímica preliminar do óleo essencial de Amyris demonstrou a presença de
alguns fitoquímicos, incluindo saponinas, terpenóides e flobataninas. A maioria dos
fitoquímicos testados, incluindo taninos, glicosídeos, esteróides, antraquinonas e
açúcares redutores, não foram observados no óleo de Amyris (Tabela 1).
Antioxidantes, nomeadamente SOD, CAT, GSH, GST e peroxidação lipídica no óleo de
Amyris balsamifera , foram analisados conforme relatado na Tabela 3. Descobriu-se que
Amyris possui alta quantidade de GSH (19,89±0,091µg/mg) e GST (14,2±0,132µg/mg )
seguido de SOD (10,2±0,035 U/mg). Observou-se pequena quantidade de CAT e
peroxidação lipídica.

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Tabela 3: Nível de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos no óleo essencial de Amyris balsamifera
Espécies Glutationa reduzida (ÿg/mg) Glutationa -S
transferase (ÿg/mg)
Amyris
balsamifera 19,89±0,091 14,2±0,132
Placa A) (Placa B) (Placa C)
Fig. 1: Cromatograma para (Placa A) e Bioautogramas (Placas B e C) para óleo
essencial de Amyris contra Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus 1
Placa A: a seta indica o ponto visualizado quando pulverizado com reagente de
vanilina ácido sulfúrico a 2%. As zonas de inibição (Placas B e C) são observadas como
pontos claros contra um fundo rosa. Fase móvel: tolueno/acetato de etila (93:7 v/v)
DISCUSSÃO
Os óleos essenciais de plantas têm imenso potencial para serem usados como compostos
antimicrobianos. Assim, podem ser utilizados no tratamento de doenças infecciosas
causadas pelos inúmeros microrganismos resistentes presentes. Tecnicamente, os óleos
essenciais não são óleos verdadeiros, pois não contêm nenhum teor de lipídios. O óleo
essencial é composto de uma variedade de compostos voláteis complexos, portanto, eles
são uma fonte rica de compostos biologicamente ativos. Portanto, é razoável esperar uma
variedade de compostos vegetais nesses óleos com atividade antimicrobiana específica e
geral e potencial antibiótico [14]. Estima-se que 3.000 óleos essenciais sejam conhecidos,
dos quais 300 são comercialmente importantes no mercado de fragrâncias [15]. Estes
também são usados em conservantes de alimentos, aromaterapia, como relaxante muscular
e como estimulante. Os óleos essenciais demonstraram possuir propriedades
antibacterianas, antifúngicas, inseticidas antivirais e antioxidantes [16-17].
Alguns óleos têm sido usados no tratamento do câncer [18]. No presente estudo, óleos
essenciais de Amyris balsamifera de importância medicinal foram avaliados quanto à
presença de fitoconstituintes, potencial antimicrobiano, separação e análise de compostos
bioativos por bioautografia TLC e análise de enzimas antioxidantes.
A análise dos fitoconstituintes do óleo de Amyris mostrou que o óleo contém poucos dos
fitoconstituintes, incluindo saponinas, terpenóides e flobataninas. Beek et ai. [19] relataram
que o óleo consistia em 17,5% de hidrocarbonetos sesquiterpênicos e 82,5% de
sesquiterpenos oxigenados. Os terpenóides abrangem uma diversidade de estruturas e
têm muitos papéis funcionais na natureza, incluindo a proteção contra pragas de artrópodes.
Os sesquiterpenos de ocorrência natural contidos nos óleos Amyris são significativamente
repelentes a um espectro de pragas de artrópodes e carrapatos [20-21].
Atividade antimicrobiana in vitro pelo método de difusão em poço de ágar de
O óleo essencial de Amyris foi avaliado quantitativamente com base na zona
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Catalase Superóxido Ensaio de peróxido
(ÿg/mg) dismutase (U/mg) lipídico
(ÿg/mg)
2,62±0,072 10,2±0,035 4,43±0,163
de inibição. O óleo de Amyris em metanol exibiu vários graus de efeito inibitório contra os
isolados clínicos de bactérias e fungos multirresistentes selecionados. Os resultados são
consistentes com os relatórios de investigadores anteriores. A atividade antimicrobiana do
óleo de Amyris contra a levedura Candida albicans, a bactéria Gram-positiva Staphylococcus
aureus e a bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebsiella
pneumonia também foi relatada por Jirovetz et al. [22]. Kloucek et ai. [23] e Setzer et al. [24]
relataram atividade antibacteriana contra óleo de Amyris contra S. aureus.
TLC foi realizada a fim de separar os componentes bioativos presentes. TLC é uma técnica
fácil e econômica usada na separação de componentes de misturas complexas, comumente
usadas para produtos naturais. Os principais benefícios dessa técnica incluem análise de
baixo custo, triagem de amostras de alto rendimento e preparação mínima de amostras
[25]. Um benefício adicional é que os cromatogramas podem ser rastreados quanto à
atividade antimicrobiana. Os componentes bioativos foram separados por TLC seguido de
bioautografia por TLC do óleo essencial de Amyris contra isolados clínicos K.
Pneumoniae e Staphylococcus aureus 1. Uma grande zona inibitória com valor de Rf 0,63
foi observada contra o crescimento tanto de K.
Pneumoniae e Staphylococcus aureus 1 nas placas de TLC B e C como mancha branca
em fundo rosa quando pulverizado com solução aquosa de cloreto de 2, 3, 5 trifenil
tetrazólio. É possível que a inibição observada provavelmente se deva a um ou mais
compostos ativos que se sobrepõem, possivelmente devido ao sistema de solvente usado
para triagem. O sinergismo pode desempenhar um papel importante nos extratos que
estavam ativos quando a MIC da mistura foi determinada, enquanto os componentes
separados não mostraram atividade antimicrobiana.
O óleo de Amyris balsamifera foi analisado quanto à presença de vários antioxidantes.
Verificou-se que Amyris possui alto nível de GST, GSH seguido de SOD e pequena
quantidade de CAT e peroxidação lipídica.
A catalase é considerada uma das enzimas antioxidantes mais importantes que podem
proteger as plantas eliminando os radicais livres e o H2O2.
Baixo nível de catalase foi observado em Amyris balsamifera enquanto quantidade
significativa de SOD foi registrada. SOD impede a formação de .OH e fornece defesa
essencial contra a toxicidade potencial do oxigênio. Altos níveis de GST e GSH são
observados no óleo essencial de Amyris. GST oferece proteção contra LPO pela conjugação
do efeito tóxico com GSH [26].
CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo apóiam parcialmente o uso do óleo essencial selecionado
na medicina tradicional, principalmente no tratamento de infecções microbianas. Um bom
composto antimicrobiano aliado a alta atividade antioxidante é um composto líder muito
interessante para combater o atual cenário de multirresistência. Teria um papel duplo para
inibir o crescimento de MRSA e reduzir a inflamação desencadeada por esse patógeno por
sua alta atividade antioxidante. No entanto, uma maior elucidação das estruturas químicas
dos compostos biologicamente ativos será necessária juntamente com estudos em modelo
animal para gerar uma droga potente.
RECONHECIMENTOS
Os autores agradecem ao Amity Institute of Biotechnology, Amity University, Noida, UP,
Índia, por fornecer as instalações de infraestrutura para a realização deste estudo.
Declaração de conflito de interesse
Nós declaramos que não temos conflito de interesse.
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